KR20220033444A - 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 치료용 조성물 - Google Patents
경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 항염증성인자 사이토카인을 다량 함유하고, 파골세포의 분화에 관여할 수 있는 인자들을 낮게 함유하거나 포함하지 않음으로써, 골질환, 염증질환 등의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 항염증성인자 사이토카인을 다량 함유하고, 파골세포의 분화에 관여할 수 있는 인자들을 낮게 함유하거나 포함하지 않음으로써, 골질환, 염증질환 등의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 경막외지방조직 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 포함하는, 염증성 질환 치료, 개선 또는 예방용 조성물 등에 관한 것이다.
성체줄기세포 중 가장 얻기 쉽고 풍부한 양을 얻을 수 있는 방법은 지방조직에서 유래하는 지방 줄기 세포를 분리하는 것이며, 이를 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell, AD-MSCs)라고 한다.
지방 조직 유래 줄기세포는 일반적으로 조직을 채취하기가 쉬우며, 연구에 충분한 양을 얻을 수 있어 줄기 세포를 이용한 재생 연구에 널리 이용되고 있다(Paschos and Sennett, 2017; Oberringer et al., 2018). 다만, AD-MSCs는 지방 조직이 존재하는 위치에 따라 형태가 이질적이고, 추출하는 과정, 공여자의 신체조건 등에 따라 다른 특성을 지니고 있는 것으로 알려져 있다(Reina et al., 2006). 특히, 채취된 지방 조직의 위치에 따라 AD-MSCs의 차별화된 재생 및 분화 능력이 확인되었으며, 예를 들어 피하 지방의 경우 동맥 경화의 예방과 관련된 연구에 이용되고, 내장 지방의 경우 인슐린 저항성 및 심혈관 질환과 연관된 연구에 이용되고 있다.
지방 줄기 세포는 위와 같이 타 유래에 비해 얻기 쉬운 장점이 있지만, 실제 임상적 적용이나 사용에 있어서는 많은 문제점을 가진다. 지방줄기세포의 배양을 개시하기 위해 지방 유래 SVF 세포의 bulk culture를 이용한다는 점, 이종세포의 혼합물임에도 불구하고, 이 세포들 중 작은 비율만이 계속해서 플라스틱 배양접시에 부착하고 증식한다는 점, 지방 줄기 세포를 포함하고 있기는 하지만 그것만으로 구성되지는 않은 혼합 세포군이 사용되었을 가능성이 높다는 점과 같이, 실제 임상적 적용이나 사용 상에서의 필요 요건을 만족하지 못하는 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해서, 우선 지방 유래 중간엽 줄기세포가 추출되는 부위가 매우 중요하게 고려되어야 한다. 지방조직의 경우 인체 내 다양한 조직으로부터 유래될 수 있는데, 이러한 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포가 유래하였다고 하더라도 이들의 특성이 동일할 수는 없다. 즉, 치료제를 목적하는 일정한 특성을 유지하면서 이종세포의 혼합이 적은 부위의 지방 조직으로부터의 중간엽 줄기세포의 추출이 치료제로의 이용 가능성을 높일 수 있다.
한편, 중간엽 줄기세포는 직접적인 항염증능, 면역조절능 뿐만 아니라 다계통으로의 분화능 때문에 환자 치료를 위한 치료방법으로 알려져 왔다. 그러나, 여러 연구들에 의하면, 중간엽줄기세포를 이용한 치료는 손상된 세포나 조직에 중간엽줄기세포가 직접 이동하여 치료 효과를 보이는 것 보다는, 최근 들어 중간엽줄기세포에서 분비하는 여러 인자들 즉, 주변 분비 효과(paracrine effect)에 의한 치료 효과가 다수 확인되고 이와 관련된 연구 개발의 필요성이 크게 대두되고 있다.
이에 따라, 다양한 세포 또는 기관 유래의 엑소좀에 대한 새로운 특성을 연구하고자 하는 연구 개발이 다수 진행되고 있으나, 특정 질환에 대해 적합하게 고려될 수 있는 우수한 엑소좀을 도출하는 것은 매우 어려운 것으로 고려되고 있다.
한편, 파골세포는 골 내에서 조골세포와의 불균형으로 인하여 비정상적인 골 조직의 파괴 및 흡수를 유발하고 이로 인하여, 골의 질량 및 골밀도가 감소하는 골다공증(osteoporosis), 뼈에서 석회가 탈실되는 골연화증 (osteomalacia), 골수가 섬유화되는 섬유성골염(fibrous ostitis), 관절의 파괴 및 변형을 초래하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 등의 원인이 되는것으로 알려져 있다.
따라서 파골세포에 의한 골 조직의 파괴 및 흡수를 효과적으로 억제할 수 있다면, 이로 인한 다양한 골 질환을 치료할 수 있을 것이라 예상되며, 이에 따라 파골세포에 대한 다양한 약물들과 치료법들이 활발히 연구되고 있다. 예를 들어, 골다공증과 같은 파골세포에 의한 골 손상 치료에 포사맥스(Fosamax, 성분명: aledronate), 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate), 조메타(Zometa, 성분명: zoledronate) 등과 같은 비스포스포네이트 (bisphosphonate) 계열의 치료제가 널리 이용되고 있다. 이러한 비스포스포네이트 제제들은 대부분 뼈를 파괴하는 파골세포의 기능을 약화시키고 파골세포의 사멸을 유도해 뼈의 손실을 지연시키거나 억제하는 작용을 한다.
그러나 비스포스포네이트 계열의 약제들을 복용하는 환자들에게서 턱뼈 괴사(osteonecrosis), 중증 심방 세동, 뼈 또는 관절의 무력화, 근골격의 통증 등 다양한 부작용이 발생하는 사례가 해마다 증가하고 있다. 또한 유방암, 전립선암 등에서 뼈로 전이된 암세포에 의해서도 파골세포의 형성이 촉진되어 심각한 골 질환들이 발생하는데 이를 치료하기 위한 약물은 개발되어 있지 않은 실정이다.
이와 같이, 기존의 제제들의 단점을 보완하고, 독성이 없으며, 파골세포에 의한 골 흡수를 효과적으로 억제할 수 있는 약제들의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀이 타 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래되는 엑소좀과 다른 특성을 가짐을 확인하였고, 이러한 특성을 기초로 골 질환에 대해 우수한 치료 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 발명자들은 경막외 지방 조직 유래 줄기 세포에서 유래한 엑소좀이 전 염증성 사이토카인 및 케모카인 발현을 낮게 발현하고, 항염증성 사이토카인 발현은 증가되어 있음을 확인하였다. 또한, hsa-miR-122-5p와 같이 골질환 환자에서 발현 수준이 낮은 것으로 알려져 있는 miRNA를 다량 함유하는 특징을 가진다. 이에 따라 본 발명에 따른 엑소좀이 골질환, 염증성 질환의 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 경막외지방조직 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 포함하는, 염증성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 경막외지방조직 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 포함하는, 염증성 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
경막 외 지방 조직이란 해부학적으로 척수 주위에 존재하는 지방조직으로, 피하지방에 비해 결합조직이 적고, 기능적으로 척수의 진자 운동시 운동을 원활하게 하는 점 이외에는 거의 알려져 있지 않은 부위이다. 본 발명에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포란 척수 주위의 경막 외 공간에 존재하는 지방에서 유래된 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다.
본 발명에 따른 경막외 지방 중간엽 줄기세포는 타 유래 줄기세포와 대비하여 수술 후 버려지는 경막외 지방 조직의 재활용이 가능하고 초기 수득율이 매우 높다는 점에서 주입해야 하는 엑소좀을 추출할 수 있는 조정 배지의 양을 자유롭게 조절할 수 있다. 특히, spine 수술시 필수로 제거되어야 하는 지방 조직임에도 불구하고, 이를 활용할 수 있다는 측면에서 장점이 강조될 수 있다.
또한, 타 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀과 달리 항염증성 사이토카인 및 hsa-miR-122-5p와 같은 파골세포 분화 억제에 효과와 관련성이 높은 miRNA를 높게 발현하는 특성을 나타내기 때문에, 골 질환의 개선 및 치료 측면에서 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 것을 포함하며, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 또는 식품으로 사용될 수 있는 엑소좀을 추출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포는 당업계에 알려진 방법에 따라 경막외 지방으로부터 추출가능하다.
경막외 지방 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 경막외 지방 중간엽 줄기세포를 배양하고 세포를 제거한 후, 수득된 배양액, 배양 상층액 또는 이의 농축물이거나 이의 동결건조물일 수 있다.
경막외 지방 중간엽 줄기세포는 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상적으로 배양될 수 있다. 경막외 지방 중간엽 줄기세포 배양액은 경막외 지방 조직으로부터 수득된 경막외 지방 중간엽 줄기세포를 혈청 또는 무혈철 배지에서 배양하여 수득된 것일 수 있다. 엑소좀 추출을 위한 조정 배지는 이를 원심분리나 필터를 이용한 여과에 의해 줄기세포 및 거대분자를 제거한 후에 수득된 상층액을 사용할 수 있다. 또한, 수득된 상층액은 그대로 사용하거나 또는 농축하여 수득된 농축물로 엑소좀 추출에 사용할 수 있다.
경막외 지방 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "엑소좀(exosome)"이란 진핵생물에 존재하는 세포 유래 베시클(vesicle)이며 다중 소관체(multivesicular bodies, MVBs)가 원형질막과 융합되거나 원형질막에서 직접 방출될 때 세포로부터 방출된다. 구체적으로, 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 말한다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 상기 엑소좀은 자연적으로 분비된 것이거나, 혹은 인공적으로 분비된 것을 포함한다.
본 발명에 따른 엑소좀은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀이다.
본 발명에 있어서, 상기 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀은 직경이 10 nm 내지 300 nm일 수 있다. 상기 엑소좀은 바람직하게는 직경이 40nm 내지 200nm, 더 바람직하게는 50 nm 내지 150nm일 수 있다.
상기 엑소좀(exosomes)은 40~200 nm 크기인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 엑소좀(exosomes)은 CD63 및 CD81 양성인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀은 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 하기의 단계를 포함하는 추출 방법에 의하여 수득할 수 있다:
1) 경막외 지방 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계;
2) 상기 경막외 지방 중간엽 줄기 세포 배양 상층액을 회수하는 단계;
3) 상기 회수한 세포 배양 상층액을 원심분리하여 세포 잔여물을 제거하는 단계; 및
4) 상기 세포 잔여물이 제거된 세포 배양 상층액을 TFF(tangential flow filtration), 초원심분리(ultracentrifugation), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 및 엑소좀 분리 키트(exosome isolation kit)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 이용하여 분리·정제된 엑소좀을 수득하는 단계.
상기 경막외 지방 중간엽 줄기세포의 배양에 있어서 산소 조건은 이에 제한되지는 않으나, 정상 산소 농도, 즉 21%의 산소(O2)가 공급되는 배양 조건일 수 있으며, 또는 저산소 세포 감작제(hypoxic cell sensitizer)를 세포 배양 배지에 첨가하지 않은 배양 조건일 수 있다.
상기 단계 1) 에서 일반 배양 배지는, 당업계에 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지는 모두 사용 가능하며, 이에 제한되지는 않으나, DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지, MEM(minimal essential medium)배지, 또는 RPMI 1640(Rosewell Park Memorial Institute 1640) 배지일 수 있다.
또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 이러한 보조성분으로는 태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G(penicilli G), 스트렙토마이신 설페이트(sterptomycin sulfate) 및 젠타마이신(gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B(amphotericin B) 및 니스타틴(nystatin) 등의 항진균제(antifungal agent) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 경막외 지방 중간엽 줄기세포로부터 엑소좀을 추출을 위한 배양에 있어서는 필요에 따라 무혈청(serum-free), 무항생제(antibiotic-free), 무페놀레드(phenol red-free)인 배지로 교체 및 배양을 추가로 더 포함할 수 있다. 즉 일반 배양 배지에서 배양을 수행한 후 무혈청 배지 등으로 배지를 교환하여 배양을 추가로 수행한 후에 단계 2)를 진행하는 것일 수 있다.
상기 단계 2)의 배양 상층액의 회수는 배양 배지, 즉 조건 배지를 회수하는 것일 수 있다. 회수한 세포 배양 상층액에는 세포 잔여물 및 줄기세포로부터 분비된 엑소좀이 포함되어 있으며, 상기 단계 3)에서 원심분리함에 따라 세포 배양 상층액에 포함되어 있는 세포 잔여물을 제거할 수 있다.
이러한 세포 잔여물을 제거한 후에, 세포 배양 상층액을 TFF(tangential flow filtration), 초원심분리(ultracentrifugation), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 및 엑소좀 분리 키트(exosome isolation kit)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 이용하여 분리·정제된 엑소좀을 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 엑소좀은 다른 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀과 달리 hsa-miR-122-5p 등을 다량함유한다. 즉, 본 발명에 따른 약학 조성물의 엑소좀은 hsa-miR-122-5p을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 엑소좀은 다른 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀과 달리 hsa-miR-122-5p 를 다량 포함함으로써 골 흡수 억제 효과, 골 개선 효과의 우수한 특성을 나타낼 수 있다. 골질환 환자의 혈청에서는 hsa-miR-122-5p이 낮게 발현되는 것으로 보고되어 있다. 그런데, 본 발명에 따른 엑소좀은 위 hsa-miR-122-5p 의 높은 발현량을 통해서 우수한 질환 치료 효과를 나타낼 수 있다.
hsa-miR-122-5p는 서열번호 1의 염기서열을 가진다: uggagugugacaaugguguuug
DAVID 분석을 통해 골질환에 조절의 기초가 될 수 있는 분자 메커니즘을 추가로 탐색하여, 추정되는 miR-145-5p 표적 서열을 예측한 결과, PPARG coactivator1 beta (PPARGC1B) 및 Transcription factor bindingto IGHM enhancer 3(TFE3)를 억제하는 것이 위 표적 서열 예측 결과를 통해 확인된다. 이러한 PPARG coactivator1 beta (PPARGC1B) 및 Transcription factor bindingto IGHM enhancer 3(TFE3)는 파골 세포 분화를 양성 조절하는 유전자로 알려져 있는바, 이의 억제를 통해 우수한 골질환 치료 효과가 있다.
본 발명에 따른 엑소좀은 항염증성 사이토카인을 다량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 엑소좀은 다른 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀과 달리 IL-4, 및 IL-13의 발현이 증가된 특징을 나타내어, 우수한 골 흡수 억제 효과, 골 개선효과 및 염증 개선 효과를 동시에 달성할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 엑소좀은 다른 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀과 달리 VEGF(Vascular endothelial growth factor), MMP-9(Matrix Metalloproteinase-9), MIP-1, GRO의 낮은 발현량을 통해 파골세포 형성을 억제함으로써 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 상기 언급된 인자들은 골질환을 가진 환자 그룹에서 파골 세포의 분화를 촉진하거나 자극하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 골흡수 작용 등으로 골 질환의 발병, 진행 등에 관여하는 것이 알려져 있다. 따라서, 통상의 줄기세포에서 포함되는 위 인자들을 거의 포함하지 않는 본 발명에 따른 엑소좀은 골질환의 예방, 치료 및 개선의 측면에서 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
또한, IL-5, GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)와 같은 염증성 인자의 낮은 발현을 통해서 질환 부위에서의 골형성 뿐만 아니라 염증 개선 측면(특히, pro-inflammatory factors로 이의 최소화 또는 감소는 염증 반응을 개선할 수 있음)에서도 우수한 효과를 함께 발휘할 수 있다.
본 발명에 따르면, 골 질환은 치주염, 치조골 결손, 골다공증, 골연화증, 구루병, 골감소증, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 골형성 부전증, 골위축, 파제트병(paget's disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 무혈성괴사, 삽입물주위 골용해증 (Periprosthetic osteolysis), 대사성 골질환 및 골경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 CD63 및 CD81 발현하여 엑소좀의 특성을 나타낸다.
본 발명에 따른 엑소좀은 다른 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀과 달리 IL-4 및/또는 IL-13을 다량으로 함유한다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 골 질환 동물 모델에서 몸무게 감소 및/또는 골 손실에 대한 회복 효과를 나타낸다.
본 발명에서 용어, "파골세포(osteoclast)"는 대식 세포 전구체(macrophage precursor)로부터 파생되는 세포로서 파골세포 전구 세포들은 대식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL) 등에 의해 파골세포로 분화되며 융합을 통해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclast)를 형성하는 것을 의미한다. 파골세포는 αvβ3 인테그린(integrin) 등을 통해 골(bone)에 결합하며 산성 환경을 조성하는 한편 각종 콜라게네이즈(collagenase) 및 프로테아제(protease)를 분비하여 골 흡수(bone resorption)를 일으킨다. 파골세포는 완전히 분화된 세포로 증식하지 않으며 약 2주간의 수명이 다하면 세포 사멸(apoptosis)를 일으킨다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 세포 독성이 낮아 안정적이며, 파골 세포의 분화를 억제하는 효과를 나타낸다. 구체적으로, 파골세포 분화 표지 인자인 TRAP(tarrate-resistant acid phosphate) 염색을 실시한 결과, 농도 의존적으로 TRAP 활성을 현저하게 저해시킴으로써, 파골세포 형성을 억제함을 확인하였다.
보다 더 구체적으로, 본 발명에 따른 엑소좀은 파골세포로 분화하는데 중요한 전사 인자인 NFATc1의 활성을 감소시키고 파골세포 분화기전(osteoclastogenesis)에 관여하는 TRAP, Cathepsine K, DC-STAMP의 발현을 감소시킨다. 또한, 파골세포 분화과정에서 형태학적 특징인 F-actin ring의 형성을 감소시킨다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 염증 반응, 특히 골질환에 있어서 부수적으로 함께 발생하는 염증 반응에 대하여 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일실시양태에 따르면, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 LPS 유발 염증 모델에서 TNF-α, IL-6 의 발현을 감소시키고, IL-10의 발현을 크게 증가시킴으로써 우수한 염증 개선 효과를 나타낸다.
본 발명에서의 용어, "조골세포(osteoblast)"는 골기질을 합성, 분비하고, 기질에 Ca2+, Mg2+ 이온 등의 무기염을 침착시킴으로써 골조직을 석회화시키는 능력을 갖고 있는 세포를 의미한다. 조골세포로 분화한 마우스 단핵구 세포에 본 발명에 따른 엑소좀의 처리는 조골세포 분화 표지 인자인 ALP(alkaline phosphatase) 염색을 실시한 결과에서 농도 의존적으로 ALP 활성을 현저하게 활성시킴으로써, 조골세포 형성을 촉진한다.
본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로션, 연고, 동결건조제 등 다양한 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제, 주입제 등이 바람직하다. 또한, 상기 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제로는 이에 한정되지 않으나, 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있다. 이외에도, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife®) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.
또한, 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 투여가 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 투여량은 농축 정도에 따라 그 투여량이 달라질 수 있으나 10 μl/kg 내지 1 ml/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 예를 들어 엑소좀은 본 발명의 조성물 내에 대략 1 ~ 150㎍/ml, 또는 1 ~ 100㎍/ml의 양으로 포함되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 엑소좀은 예를 들어 1 X 107~ 1 X 1012/ml의 입자 수로 포함되고 적용되는 대상체에 따라 적절히 이의 투여량이 변경되어 투여될 수 있다. 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 골 감소 억제 방법을 제공한다.
본 발명에 "경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀", "골 질환", "투여" 등의 용어는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 대상체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다. 또한 이와 같은 대상체들에는 골 질환의 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 골 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 골 질환의 치료에 사용하기 위한 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 골 질환의 치료를 위한 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 경막외지방조직 유래 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 포함하는, 염증성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 염증성 질환은 예를 들어, 골에서 발생하는 염증성 질환일 수 있다. 구체적으로, 골관절염, 골연골염, 변형성 골염, 낭성 섬유성 골염, 치골염, 치밀화 골염, 골수염 등의 골 관련 염증질환일 수 있다.
각각의 구성, 용도 방법에 대해서는 앞서는 내용이 본 약학 조성물에도 적절히 적용되어 이해될 수 있다.
본 발명은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 경막외지방조직 유래 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 포함하는, 염증성 질환 예방용 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 5 내지 90 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 암의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 경막외 지방 중간엽 줄기세포의 엑소좀, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 식품 조성물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명은 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 포함하는, 골질환, 염증성 질환 치료, 개선 또는 예방용 조성물 등에 관한 것으로, 엑소좀이 항염증성인자 사이토카인을 다량 함유하고, 파골 세포 분화를 억제할 수 있는 hsa-miR-122-5p등의 miRNA를 다량함유하고, 파골세포의 분화에 관여할 수 있는 인자들을 낮게 함유하거나 포함하지 않음으로써, 골질환, 염증질환 등의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 인간 피부상피세포 및 인간 경막외지방줄기세포의 배양 결과를 관찰한 것이다.
도 1b는 인간 경막외지방줄기세포의 표면 특이 항원 발현 양상을 나타낸 것이다(음성 발현 (CD14, CD34, CD45) 및 양성 발현 (CD73, CD90, CD105)).
도 2a는 인간 피부상피세포유래 엑소좀 및 인간 경막외지방줄기세포유래 엑소좀의 형태를 확인한 것이다.
도 2b는 인간 피부상피세포유래 및 인간 경막외지방줄기세포유래 엑소좀의 CD63 및 CD81 양성 발현을 확인한 것이다.
도 2c는 인간 피부상피세포유래 및 인간 경막외지방줄기세포유래 엑소좀의 크기 분포도와 평균 직경 및 농도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인간 피부상피세포 엑소좀 대비 인간 경막외지방줄기세포유래 엑소좀의 사이토카인 및 케모카인 발현 양상을 비교 분석한 것이다(*p-value < 0.05, ** ≤ 0.001).
도 4a는 인간 단핵구 THP-1 세포를 대식세포로 분화시키고 LPS 및/또는 EV 처리한 다음 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 대식세포에 LPS 및/또는 EV 처리한 다음 TNF-α, IL-6 및 IL-10 분비 레벨을 정량화한 것이다(* p-값 <0.05, *** <0.0001, n.s. non-significant).
도 5는 RANKL가 처리된 대식세포에서 파골세포로의 분화가 본 발명에 따른 엑소좀 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 TRAP 발색 기질 첨가를 통한 핵 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 RANKL가 처리된 대식세포에서 파골세포로의 분화가 본 발명에 따른 엑소좀 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 7은 파골세포 분화기전(osteoclastogenesis)에 관여하는 TRAP, Cathepsine K, DC-STAMP의 발현이 본 발명에 따른 엑소좀 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 RANKL가 처리된 대식세포에서 본 발명에 따른 엑소좀 처리에 의해 f-actin ring의 형성이 감소하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 인간 경막외지방줄기세포의 표면 특이 항원 발현 양상을 나타낸 것이다(음성 발현 (CD14, CD34, CD45) 및 양성 발현 (CD73, CD90, CD105)).
도 2a는 인간 피부상피세포유래 엑소좀 및 인간 경막외지방줄기세포유래 엑소좀의 형태를 확인한 것이다.
도 2b는 인간 피부상피세포유래 및 인간 경막외지방줄기세포유래 엑소좀의 CD63 및 CD81 양성 발현을 확인한 것이다.
도 2c는 인간 피부상피세포유래 및 인간 경막외지방줄기세포유래 엑소좀의 크기 분포도와 평균 직경 및 농도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인간 피부상피세포 엑소좀 대비 인간 경막외지방줄기세포유래 엑소좀의 사이토카인 및 케모카인 발현 양상을 비교 분석한 것이다(*p-value < 0.05, ** ≤ 0.001).
도 4a는 인간 단핵구 THP-1 세포를 대식세포로 분화시키고 LPS 및/또는 EV 처리한 다음 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 대식세포에 LPS 및/또는 EV 처리한 다음 TNF-α, IL-6 및 IL-10 분비 레벨을 정량화한 것이다(* p-값 <0.05, *** <0.0001, n.s. non-significant).
도 5는 RANKL가 처리된 대식세포에서 파골세포로의 분화가 본 발명에 따른 엑소좀 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 TRAP 발색 기질 첨가를 통한 핵 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 RANKL가 처리된 대식세포에서 파골세포로의 분화가 본 발명에 따른 엑소좀 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 7은 파골세포 분화기전(osteoclastogenesis)에 관여하는 TRAP, Cathepsine K, DC-STAMP의 발현이 본 발명에 따른 엑소좀 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 RANKL가 처리된 대식세포에서 본 발명에 따른 엑소좀 처리에 의해 f-actin ring의 형성이 감소하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예, 제조예를 제시한다. 하기의 실시예, 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1: 방법 및 재료>
실시예 1-1. 세포 분리 및 배양
인간 경막외지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 인간경막외지방조직으로부터 수득하였다. 요약하면, 경막외 지방 조직을 분리하고 70 % 에탄올(EtOH) 및 아이스-콜드 PBS로 세척한 다음, 0.45 μm로 필터된 콜라게나아제 I 형 2mg/mL (gibco)을 처리 후 37 °C 조건의 인큐베이터에서 30 분 동안 소화시켰다. 그 다음, 70 μm 스트레이너(strainer)에 상기 소화된 용액을 넣어, 여과된 용액을 3000 × g에서 5 분간 원심분리하였다.
상기 인간 진피섬유아세포 및 인간 경막외 AD-MSC(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell)를 10 % exosome-depleted FBS (gibco), 1 % 페니실린/스트렙토마이신 (gibco), 10ug/mL의 재조합 인간 FGF-basic (Peprotech), 10ug/mL의 재조합 인간 PDGF-BB (Peprotech) 및 25ug/mL 플라스모신(plasmocin)(InvivoGen)이 보충된 로우 글루코스-DMEM (gibco)에서 유지하였다. 모든 세포를 37 °C 및 5 % CO2 인큐베이터 조건에서 배양하였다.
실시예 1-2. 인간 진피섬유아세포 및 인간 경막외 AD-MSC 엑소좀의 분리
175 T-플라스크에서 성장한 AD-MSC의 배양 배지를 48 시간 배양 후 수집하였다. 엑소좀을 세포 배양배지에서 정제하고 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 제거하였다. 그 다음 상등액을 2500 x g에서 25 분 동안 다시 원심 분리하여 세포 파편 및 세포 사멸체를 제거하였다. 그 후, 90Ti 로터 (Beckman Coulter)를 사용하여 상등액을 100,000 x g에서 120 분 동안 초원심 분리하였다. 상등액을 버리고 펠릿을 0.22 μm 필터된 PBS 200 μL에 넣고 재현탁시켰다. 엑소좀 단백질 농도를 Pierce ™ BCA 분석 키트 (Thermo Fisher science 23225)로 측정하였다.
실시예 1-3. 유세포 분석
flow cytometry Galios(Beckman Coulter)를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 발현 줄기세포 마커를 결정하기 위해 CD105 (Bio-Rad, MCA1557), CD90 (BioLegend, 555596), CD73 (BioLegend, 344004), CD45 (BioLegend, 555482), CD34 (BioLegend, 343504) 및 CD14 (Bio-Rad, MCA1568)와 같은 항체로 세포를 염색하였다. 항체는 FITC 또는 PE 형광 염료와 접합되었다.
엑소좀 분석을 위해 분리된 엑소좀 200μL를 10μL의 알데히드 / 설페이트-라텍스 비드 4 % w/v (ThermoFishcer Scientific)와 함께 실온에서 15 분 동안 배양하였다. 그 다음 1 mL 부피의 PBS(0.1 % BSA로 보충)를 엑소좀 / 비드 혼합물에 추가하였다. 샘플를 밤새 회전시켜 배양하였다. 비드-커플링된 엑소좀을 2000 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 펠릿화하고 500 μL의 PBS로 세척하였다.
펠릿을 4 °C에서 1 시간 동안 항체 CD9 (NOVUS, NBP1-28364), CD81 (NOVUS, NBP1-44859)을 포함하는 PBS 50μL로 재현탁시켰으며 모든 항체를 FITC 형광 염료와 접합하였다. 500 μL의 PBS를 사용하여 샘플을 세척하고 10 분 동안 2000 x g 원심 분리하였다. 그 다음, 펠릿을 150 μL의 PBS로 재현탁시켰다. 직경 4 μm 비드로 처리된 엑소좀을 게이팅 및 분석하였다.
실시예 1-4. 투과 전자 현미경(TEM)
인간 진피섬유아세포 및 인간 경막외 AD-MSC로부터 새로 분리된 엑소좀을 차가운 증류수에 재현탁시켰다. 엑소좀 현탁액을 폼바 카본 코팅 그리드(Ted Pella Inc.)에 로딩하고 2 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 10 분 동안 고정한 다음 용액을 제거하고 샘플을 건조시켰다. 그리드를 bioTEM으로 관찰하였다(히타치 HT7700).
실시예 1-5. 나노 입자 추적 분석 (NTA).
NTA 분석은 제조업체의 권고에 따라 PMX120 (Particle Metrix) 기기로 수행되었다.
실시예 1-6. 사이토카인 분석
Quantibody® 사이토카인 어레이키트 (RayBiotech, QAH-CYT-1)를 이용하여 인간 진피섬유아세포 및 인간 경막외 AD-MSC 엑소좀 용액에서 사이토카인을 정량화하였다. 엑소좀 단백질을 각 어레이에 대해 300 μg / mL로 희석하고 총 샘플 부피의 100 μL를 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 신호는 Innopsys Innoscan의 Cy3 파장 (532nm)이 장착된 레이저 스캐너로 측정되었다. 데이터 분석은 Mapix 버전 7.2.0으로 정량화되었다.
실시예 1-7. THP-1 세포에 대한 LPS 및 EV 처리
인간 THP-1 세포를 24 시간 동안 100 nM PMA (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)에서 대식세포로 분화하였다. LPS 처리전에 THP-1 세포의 PMA를 세척하였다. 인간 진피섬유아세포 유래 EV와 인간 경막외지방 MSC 유래 EV (50 ㎍/mL)를 1 ㎍/mL LPS (Sigma-Aldrich)와 동시에 첨가하였다. 대조군으로 THP-1 유래 대식세포를 LPS 및 EV 없이 또는 50 ㎍/mL의 2개 세포 유래 EV와 함께 배양하였다.
실시예 1-8. 통계 분석
통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 처리되었다. 모든 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며 unpaired t-test를 사용하였다. p 값 <0.05는 유의미한 것으로 간주되었으며 도면의 설명에 기재되었다.
<실시예 2: 인간 경막외 AD-MSC의 특성 확인>
줄기세포와 섬유 아세포를 비교하기 위해 두 가지 세포 유형을 배양하였다. 인간 경막외 AD-MSC는 인간 경막외지방조직에서 분리되었으며, 분리된 인간 경막외 AD-MSC는 전형적인 중간엽 줄기세포 특성을 가졌다. 세포는 플라스틱 배양 플레이트에 부착되었으며, 세포 모양은 진피 섬유 아세포와 같이 길고 얇은 방추 모양이었다(도 1a 참조). 또한, 유세포 분석을 통해 인간 경막외 AD-MSC는 CD73, CD90 및 CD105의 경우 양성 세포 표면 마커 발현을 나타내고, CD14, CD34 및 CD45의 경우 음성 세포 표면 마커 발현을 나타냄을 확인하였다(도 1b 참조). 줄기세포의 증식 및 엑소좀의 분리를 위해 세포를 12회 계대배양하였다. 이러한 결과는 분리된 인간 경막외 AD-MSC가 중간엽 줄기 세포의 전형적인 특징을 가짐을 의미한다.
<실시예 3: 인간 진피섬유아세포 및 인간 경막외 AD-MSC 엑소좀 특성화>
일반 FBS의 혈청 알부민과 엑소좀은 분리된 엑소좀의 순도에 영향을 미치기 때문에 소 혈청 유래 엑소좀이 제거된 FBS를 포함한 세포배양배지를 사용하였다. TEM으로 정제된 엑소좀을 확인하기 위해, 특정 단백질에 대한 FACS 및 크기 분포 및 입자 수에 대한 NTA(Nanoparticles tracking analysis) 분석을 수행하였다. TEM 이미징 결과에 따르면, 분리된 엑소좀은 엑소좀의 고전적 형태를 나타냈으며 엑소좀의 크기는 직경 100 - 200 nm이고 구형임을 확인하였다.
또한 엑소좀 막은 지질 이중층으로 구성되어 TEM으로 어둡고 두꺼운 엑소좀 막을 관찰하였다(도 2a 참조). 다포체(multivesicular body, MVB)로 만든 엑소좀에는 테트라스파닌, 융합 단백질 및 MVB 생물 발생 마커와 같은 여러 바이오 마커가 있다. 특히 CD9, CD63 및 CD81과 같은 테트라 스파닌이 엑소좀 막에서 발현되었다. 이에 유세포 분석을 사용하여 테트라스파닌 CD63과 CD81을 검출하였다.
유세포분석은 일반적으로 세포에 대해 수행되지만 엑소좀은 일반 세포보다 매우 작기 때문에 약 4 μm 직경 크기의 알데히드 / 라텍스 비드를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 상기 비드 결합 엑소좀은 유세포 분석기에 의해 분석되었으며, 진피섬유아세포 및 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀은 각각 약 60 %와 90 %의 CD63, CD81의 발현을 나타내었다(도 2b 참조).
NTA 데이터는 엑소좀 크기 분포 및 농도를 나타낸다. 분리된 인간 진피섬유아세포 유래 엑소좀의 99.7 %는 평균 크기가 144.4 nm이고 농도는 1.06 x 1010 입자/mL였다. 분리된 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀의 99.1 %는 직경이 142.8 nm이고 농도는 1.27 x 1010 입자/mL였다(도 2c 참조).
<실시예 4: 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀의 면역 억제 효과 확인>
인간 진피섬유아세포 유래 엑소좀과 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀 간의 사이토카인 및 케모카인 수준을 비교하였다. 염증인자 수준의 정확한 측정을 비교하기 위해 사이토카인 어레이 매뉴얼에 따라 300 μg / mL의 단백질 농도로 조정하였다. GM-CSF, MIP-1 알파, MMP-9, IL-5, GRO 및 VEGF와 같은 전 염증 인자는 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀에서 낮은 발현 수준임을 확인하였다. 반면, 항염증인자인 IL-4, 및 IL-13은 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀에서 증가되었고 특히 IL-13 발현이 현저하게 증가되어 있음을 확인하였다(도 3). 상기 결과는 MSC 유래 엑소좀은 면역 방어에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.
더욱이, 본 발명에 따른 엑소좀은 파골 또는 골흡수에 영향을 미칠 수 있는 인자들을 최소한으로 발현하면서 항염증과 관련된 사이토카인의 분비가 높은 것임을 확인하였다.
<실시예 5: 인간 경막외지방 MSC 유래 EV의 항염증 효과 확인>
경막외지방 MSC 유래 EV가 항염증 효과를 유발하는지 확인하기 위해 THP-1 인간 단핵구 백혈병 세포주를 사용하였다. PMA 없이 배양된 THP-1 세포를 충분한 증식시키고, PMA를 배양 플레이트에서 성장한 THP-1 세포에 첨가하였다. PMA로 처리된 THP-1 세포는 증식을 멈추고 배양 접시의 바닥에 부착된 다음 대식세포와 유사한 세포로 분화되었다 (도 4a).
Lipopolysaccharides(LPS)는 그람 음성 박테리아의 외막을 구성하며 CD14 / TLR4와 상호 작용하고 세포 내 신호를 활성화하는 가장 특성화된 병원체 관련 분자 패턴 중 하나로 간주된다. THP-1 유래 대식세포를 LPS로 처리하면 염증 인자와 PGE2 및 PGF2α와 같은 아라키돈산 생성물이 방출되었다.
LPS 유발 염증 및 사이토카인 발현 변화를 감지하기 위해 LPS 자극을 시도하였다. EV-에서 LPS로 자극된 THP-1 유래 대식세포는 또한 대식세포에 대한 EV의 항염증 효과를 확인하기 위해 처리되었다 (도 4a). LPS 자극 후, 컨디셔닝된 배지의 TNF-α, IL-6 및 IL-10을 사이토카인 어레이 및 ELISA로 정량화하였다(도 4b). LPS는 THP-1 유래 대식세포에서 TNF-α (973.6 ± 0.69 pg / mL)를 유의하게 유도하였다. 반대로 LPS를 처리하지 않은 군과 EV를 처리한 군은 TNF-α 생산면에서 차이가 없었다. LPS와 함께 처리된 진피섬유아세포 및 경막외지방 MSC 유래 EV는 각각 68.55 ± 49.92 pg / mL 및 53.64 ± 33.20 pg / mL의 값으로, TNF-α 생성이 크게 감소한 것으로 나타났다.
LPS를 처리하지 않은 군에서는 사이토카인 IL-6가 생성되지 않았다. 그러나 IL-6 생산은 LPS 처리 그룹에서 증가하였다(1489.39 ± 121.92 pg / mL). 더욱이, LPS 처리된 진피섬유아세포 유래 EV는 IL-6 생산 수준을 증가시켰다 (1321.79 ± 203.60 pg / mL). 그러나 LPS와 경막외지방 MSC 유래 EV를 동시에 처리했을 때 IL-6 생산이 크게 차단되었다 (167.78 ± 7.69 pg / mL).
LPS와 경막외지방 MSC 유래 EV를 동시에 처리했을 때 IL-10 생산은 406.96 ± 67.94 pg / mL 값으로 확인되었다. 이는 LPS (77.49 ± 15.80 pg / mL) 만 처리한 경우와 LPS 및 진피섬유아세포 EV (133.23 ± 15.80 pg / mL)를 처리한 경우에 비해 증가된 값이다.
상기 결과는 EV가 THP-1 유래 대식세포에서 TNF-α 생산을 감소시켰음을 입증한다. 또한, 진피섬유아세포 유래 EV와 달리 경막외지방 MSC 유래 EV는 전 염증 인자 IL-6 생성이 감소한 것으로 나타났다. 또한, 알려진 항염증 인자인 IL-10의 생산은 경막외지방 MSC 유래 EV에서 증가했다. 즉, 경막외지방 MSC 유래 EV의 처리는 진피섬유아세포 유래 EV에 비해 THP-1 대식세포에서 LPS 유발 염증을 억제한다.
상기 결과들을 통해서, 본 발명에 따른 엑소좀이 염증 반응 억제에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
<실시예 6 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀의 파골세포 분화에 대한 억제 확인>
실시 예 6-1: 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀의 파골세포 분화에 대한 억제 평가 (TRAP staining)
마우스 대식세포를 12well plate에 2x105/well의 밀도로 24h 배양하였으며 FBS, 1% PS, M-CSF가 첨가된 배지로 교체해준 후 엑소좀 (1, 10, 100*108 particles/ml)을 2시간 동안 처리해 주었다. 이후 RANKL을 처리하여 24시간 동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 4일간 분화시켰다. 대식세포에 RANKL을 처리하면 RANK에 결합하며 TRAP 양성 세포로 분화하게 된다. 이후 파골세포의 세포 화학적 표지효소인 Tartrate resistance acid phosphatase (TRAP)에 발색성 기질을 첨가하여 핵을 염색을 하였고 핵이 3개 이상으로 다핵화된 세포를 관찰하고 이미지화 및 정량화 하였다.
도 5 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, 상기 대식세포에 RANKL을 처리했을 때 파골세포로의 분화가 증가하였고, 엑소좀을 처리한 경우 엑소좀 입자 농도 의존적으로 파골세포의 수가 현저히 감소하였음을 확인하였다. 이로부터 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀의 파골세포로의 분화를 억제시킴을 확인할 수 있었다.
실시 예 6-2: 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀의 파골세포 분화에 대한 유전자 발현 억제 평가 (Real-time PCR)
마우스 대식세포에 RANKL을 처리했을 때 파골세포 분화에 관련하는 유전자인 TRAP, Cathepsin K, DC-STAMP, NFATc1 에 대한 유전자 발현을 real-time PCR을 통해 확인하였다. 마우스 대식세포를 12well plate에 2x105/well의 밀도로 10% FBS, 1% PS 및 M-CSF가 첨가된 배지에 24 시간 배양 후, 같은 조성의 배지로 교체해준 후 엑소좀 (100*108 particles/ml)을 2 시간 동안 처리해주었다. 이후 RANKL을 처리하여 24 시간 동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 4일간 분화시킨 후 TRIzol (Thermo Fisher)용액을 이용하여 세포내 RNA를 분리하고 RNA 정량값을 토대로 RT premix를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 primer를 이용하여 real-time PCR을 통해 증폭시켰다. 사용된 primer는 mouse TRAP, Cathesin K, DC-STAMP, NFATc1 (표1)이고 control 유전자인 beta-actin과 비교하여 상대적 양을 비교하였다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5‘-3’) |
| 2 | TRAP 정방향 프라이머 | CTGGAGTGCACGATGCCAGCGACA |
| 3 | TRAP 역방향 프라이머 | TCCGTGCTCGGCGATGGACCAGA |
| 4 | DC-STAMP 정방향 프라이머 | CCAAGGAGTCGTCCATGATT |
| 5 | DC-STAMP 역방향 프라이머 | GGCTGCTTTGATCGTTTCTC |
| 6 | Cathepsin K 정방향 프라이머 | GGCCAACTCAAGAAGAAAAC |
| 7 | Cathepsin K 역방향 프라이머 | GTGCTTGCTTCCCTTCTGG |
| 8 | NFATc1 정방향 프라이머 | CTCGAAAGACAGTGGAGCAT |
| 9 | NFATc1 역방향 프라이머 | CGGCTGCCTTCCGTCTCATAG |
| 10 | beta-actin 정방향 프라이머 | AGGCCCAGAGCAAGAGAG |
| 11 | beta-actin 역방향 프라이머 | TCAACATGATCTGGGTCATC |
대식세포에 RANKL을 처리하면 RANK에 결합하여 TRAP 양성인 다핵화된 파골세포로 분화된다. 또한 파골세포로 분화하는데 중요한 전사 인자인 NFATc1를 활성화 시키고 파골세포 분화기전(osteoclastogenesis)에 관여하는 TRAP, Cathepsine K, DC-STAMP의 발현을 증가시킨다.
도 7 및 표 2 에서 확인할 수 있듯이, 대식세포에 RANKL을 처리했을 때 파골세포의 분화가 증가하였으며 엑소좀 처리에 의해서 파골세포의 수가 현저히 감소된 것을 확인했다. 이것으로 보아 인간 피하지방 조직 유래 줄기세포로부터 분리된 엑소좀은 파골세포로의 분화를 억제시킴을 확인할 수 있었다.
| 엑소좀 | - | - | + |
| RANKL | - | + | + |
| TRAP | 1 | 1156.8 | 103.8 |
| DC-STAMP | 1 | 22.07 | 1.3 |
| Cathepsin K | 1 | 2573.8 | 179.1 |
| NFATc1 | 1 | 3.2 | 0.9 |
실시 예 6-3: 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀의 파골세포 분화에 대한 F-actin ring formation 형성 조절 평가 (F-actin ring staining)
마우스 대식세포를 12well plate에 2x105/well의 밀도로 10% FBS, 1% PS 및 M-CSF가 첨가된 배지에 24h 배양 후, 같은 조성의 배지로 교체해준 후 엑소좀 (100*108 particles/ml)을 2시간 동안 처리해주었다. 이후 RANKL을 처리하여 24 시간 동안 반응시켰다. 대식세포에 RANKL을 처리하면 파골세포 분화과정에서 형태학적 특징인 F-actin ring을 형성한다. 이후 alexa phalloidin으로 cytoskeletal의 marker인 f-actin과 핵 (DAPI)을 염색하였고 형광 이미지화 하였다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, 대식세포에 RANKL을 처리했을 때 파골세포 분화와 함께 f-actin ring 형성이 증가하였으며, 엑소좀 처리에 의해서 파골세포 분화가 억제됨에 따라 f-actin ring 형성이 감소되었다. 이것으로 보아 인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀이 파골세포 분화를 억제시킴을 확인할 수 있었다.
<실시예 7: 엑소좀 내 miRNA 발현 변화 확인>
인간 경막외 AD-MSC 유래 엑소좀의 특성을 분석하기 위하여 miRNA 발현 패턴을 확인하였다. 구체적으로, 차세대 시퀀싱 (NGS)을 수행하였으며, 피부섬유아세포 유래 엑소좀과 대비하여 그 결과를 확인하고 이와 함께 이들의 비율을 표시하였다.
상기 결과를 표 3에 나타내었다.
| 발현값 순서 | miRNA 종류 | 발현값 | 비율 | |
| 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 | 피부섬유아세포유래 엑소좀 | 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 / 피부섬유아세포 유래 엑소좀 | ||
| 1 | hsa-miR-122-5p | 1437742 | 4063 | 354 |
| 2 | hsa-miR-3591-3p | 93041 | 440 | 211 |
| 3 | hsa-let-7b-5p | 30975 | 1737 | 18 |
| 4 | hsa-miR-10b-5p | 27786 | 200 | 139 |
| 5 | hsa-miR-151a-3p | 14070 | 561 | 25 |
| 6 | hsa-miR-27a-3p | 11377 | 489 | 23 |
| 7 | hsa-miR-181a-5p | 7460 | 60 | 124 |
| 8 | hsa-miR-514a-5p | 6690 | 55 | 122 |
| 9 | hsa-miR-412-5p | 4611 | 101 | 46 |
| 10 | hsa-miR-99b-5p | 3665 | 204 | 18 |
표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, NGS를 통해서 확인한 결과, 경막외 지방 줄기세포 엑소좀에서 miRNA가 많이 발현하는 상위 10개는 위 언급된 서열과 같다.
이 상위 10개 miRNAs 중 hsa-miR-122-5P가 가장 높게 발현되었다. 이러한, hsa-miR-122-5P는 파골 세포의 분화와 관련성이 높은데, 골질환을 가지는 환자들에서는 이의 발현이 상당이 낮은 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명에 따른 엑소좀은 위 miRNA를 다량 함유함으로써 파골세포의 분화 억제에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
<실시예 8 DAVID 분석을 통한 miR-122-5p 타겟 유전자 확인 >
파골 세포의 발현 변화에 영향을 미칠 수 있는 분자 메커니즘을 추가로 탐색하기 위해 데이터베이스 DAVID Bioinformatics Resources 6.8를 사용하여 추정되는 miR-122-5p 표적 서열을 예측하였다.
그 결과, PPARG coactivator1 beta (PPARGC1B) 및 Transcription factor bindingto IGHM enhancer 3(TFE3)를 억제하는 것이 위 표적 서열 예측 결과를 통해 확인되었다. 이러한 PPARG coactivator1 beta (PPARGC1B) 및 Transcription factor bindingto IGHM enhancer 3(TFE3)는 파골 세포 분화를 양성 조절하는 유전자로 알려져 있는바, 이의 억제를 통해 우수한 골질환 치료 효과를 확인할 수 있었다.
<실시예 9 골질환 모델에서의 엑소좀 처리에 따른 골질환 치료 효과 확인>
마우스 C57BL/6 암컷을 사용하여 22±2℃ 및 상대습도 50±10%, 12시간 명암 주기로 설정된 환경에서 플라스틱 케이지에 사육하였다. 마우스의 난소절제 이전에 동일 환경에서 약 1주 정도 사육 조건에 적응시켰다.
졸레틸(zoletil)과 럼펀(lumpun)을 근육 주사하여 마취한 후 난소 수술부위를 제모하고 소독하였다. 1cm 가량의 피부를 절개하고 다른 장기에 손상이 가해지지 않도록 주의하여 자궁을 따라 난소를 확인하여 봉합용 실로 난소를 결찰한 뒤 양측의 난소를 모두 절제하였다. 난소 절제 후 각 장기를 복강 내로 재위치 시킨 뒤 봉합용 실로 봉합한다. 10일 이후에 8주 동안 치료물질로 본 발명에 따른 엑소좀을 투여하였다.
실험군은 아래와 같이 설정하였다.
① 난소 비절제 대조군(sham), 10마리, PBS(대조군) 투여
② 난소 비절제 대조군(sham), 10마리, 엑소좀 고농도 투여
③ 난소 절제 실험군(OVX), 10마리, PBS(대조군) 투여
④ 난소 절제 실험군(OVX), 10마리, 엑소좀 저농도 투여
⑤ 난소 절제 실험군(OVX), 10마리, 엑소좀 중농도 투여
⑥ 난소 절제 실험군(OVX), 10마리, 엑소좀 고농도 투여
상기 결과들을 통해 본 발명에 따른 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀이 우수한 파골 세포 억제 효과 및 골 흡수 억제 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 추가적으로 우수한 염증 억제를 함께 가짐으로써 골질환, 염증성 질환(특히 골염증성질환)에 있어서 dual effect를 가질 수 있음을 또한 확인하였다.
이러한 결과를 바탕으로 본 발명에 따른 엑소좀이 골 질환 및/또는 염증성 질환의 치료제로 이용될 수 있음을 확인하였다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Yeungnam University
Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation
<120> A composition for treating Bone disease comprising Exosome
derived from epidural adipose tissue derived mesenchymal stem
cells
<130> P21115-DGMIF
<150> KR 2020-0115478
<151> 2020-09-09
<150> KR 2021-0053062
<151> 2021-04-23
<160> 11
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-122-5p
<400> 1
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAP Forward primer
<400> 2
ctggagtgca cgatgccagc gaca 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAP Reverse primer
<400> 3
tccgtgctcg gcgatggacc aga 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DC-STAMP Forward primer
<400> 4
ccaaggagtc gtccatgatt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DC-STAMP Reverse primer
<400> 5
ggctgctttg atcgtttctc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cathepsin K Forward primer
<400> 6
ggccaactca agaagaaaac 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cathepsin K Reverse primer
<400> 7
gtgcttgctt cccttctgg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NFATc1 Forward primer
<400> 8
ctcgaaagac agtggagcat 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NFATc1 Reverse primer
<400> 9
cggctgcctt ccgtctcata g 21
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-actin Forward primer
<400> 10
aggcccagag caagagag 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-actin Reverse primer
<400> 11
tcaacatgat ctgggtcatc 20
Claims (15)
- 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 hsa-miR-122-5p를 포함하는 것인 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 IL-4, IL-13 또는 이들 모두를 포함하는 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 골 질환은 치주염, 치조골 결손, 골다공증, 골연화증, 구루병, 골감소증, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 골형성 부전증, 골위축, 파제트병(paget's disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 무혈성괴사, 삽입물주위 골용해증 (Periprosthetic osteolysis), 대사성 골질환 및 골경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질환인 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 10nm 내지 300 nm의 직경을 가지는 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 파골 세포의 분화를 억제하는 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 조성물은 엑소좀을 1 X 107~ 1 X 1012/ml의 입자 수로 포함하는 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 hsa-miR-122-5p를 를 포함하는 것인 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 IL-4, IL-13 또는 이들 모두를 포함하는 것인, 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 골 질환은 치주염, 치조골 결손, 골다공증, 골연화증, 구루병, 골감소증, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 골형성 부전증, 골위축, 파제트병(paget's disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 무혈성괴사, 삽입물주위 골용해증 (Periprosthetic osteolysis), 대사성 골질환 및 골경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질환인 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 염증성 질환은 골관절염, 골연골염, 변형성 골염, 낭성 섬유성 골염, 치골염, 치밀화 골염 및 골수염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물. - 제12항에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 hsa-miR-122-5p를 포함하는 것인 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
상기 염증성 질환은 골관절염, 골연골염, 변형성 골염, 낭성 섬유성 골염, 치골염, 치밀화 골염 및 골수염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 식품 조성물. - 제14항에 있어서, 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 hsa-miR-122-5p를 포함하는 것인 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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