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KR20220009960A - 재조합 고전적 돼지 열병 바이러스 - Google Patents

재조합 고전적 돼지 열병 바이러스 Download PDF

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KR20220009960A
KR20220009960A KR1020217037478A KR20217037478A KR20220009960A KR 20220009960 A KR20220009960 A KR 20220009960A KR 1020217037478 A KR1020217037478 A KR 1020217037478A KR 20217037478 A KR20217037478 A KR 20217037478A KR 20220009960 A KR20220009960 A KR 20220009960A
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샤오홍 쟝
후안후안 리우
차오 통
자잉 왕
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베링거 잉겔하임 베트메디카 (차이나) 코포레이션 리미티드
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Abstract

본 발명은 동물 건강 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 에피토프 내에 적어도 하나의 치환을 포함하는 재조합 고전적 돼지 열 바이러스에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 CSFV를 포함하는 면역원성 조성물 및 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 상기 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 CSFV로 감염된 동물을 본 발명의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하기 위한 방법 또는 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 약독화된 고전적 돼지 열 바이러스를 제공한다.

Description

재조합 고전적 돼지 열병 바이러스
본 발명은 동물 건강 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 고전적 돼지 열병 바이러스에 관한 것이며, 여기서, 상기 (비변형된) 6B8 에피토프는 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 CSFV를 포함하는 면역원성 조성물 및 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 상기 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 CSFV로 감염된 동물을 본 발명의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하기 위한 방법 또는 키트를 제공한다.
고전적 돼지 열병 (classical swine fever: CSF)은 심각한 경제적 손실을 초래하는 돼지와 멧돼지의 높은 전염성 질병이다. 상기 질병의 병원체는 고전적 돼지 열병 바이러스 (classical swine fever virus: CSFV)이다. 중국에서는 CSF 발병을 통제하기 위해 예방 접종과 살처분 방식 전략의 조합을 실시한다. 그러나, 산발적인 CSF 발병과 지속적인 감염이 여전히 중국 대부분의 지역에서 보고되고 있다.
현재 이용 가능한 CSFV 백신은 토끼의 연속 계대 배양에 의해 약독화되고 CSF에 대해 안전하고 효과적인 것으로 입증된 C 변종을 기반으로 한다. 확실한 방어를 제공하는 강력한 면역 반응이 백신 접종 후 5일 이내에 유도된다. 그러나, 한계점 중 하나는 필드 변종에 의해 감염된 동물을 표준 혈청학적 수단으로 백신 접종된 동물과 구별할 수 없다는 점이다.
백신 접종된 동물을 야생형 필드 변종에 의해 감염된 동물과 구별할 수 있는 방법 및 안전하고 효과적인 신규 CSFV 백신이 여전히 당해 분야에 필요하다.
본 발명의 간단한 설명
하나의 양태에서, 본 발명은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV)를 제공하며, 여기서, 상기 (비변형된) 6B8 에피토프는 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되고, 상기 6B8 단클론 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나, 상기 6B8 단클론 항체는 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나, 상기 6B8 단클론 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나, 상기 6B8 단클론 항체는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있거나 포함할 수 없는 약독화된 CSFV를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 Erns 단백질 내의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 약독화를 유발하는 Npro 단백질 내의 돌연변이를 갖는 약독화된 CSFV를 제공한다. 바람직하게, 상기 Erns 단백질 내의 돌연변이는 79번 아미노산 위치의 결실 및/또는 171번 아미노산 위치의 결실이고, 상기 Npro 내의 돌연변이는 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 본 출원에서 개시된 바와 같은 Erns 단백질 내의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 약독화를 유발하는 Npro 단백질 내의 돌연변이 및 본 출원에서 제공되는 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 돌연변이를 갖는 약독화된 CSFV를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있거나 포함할 수 없는 본 발명에 따른 약독화된 CSFV는 C 변종 또는 QZ07 또는 GD18 필드 변종으로부터 유래된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 CSFV를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 CSFV를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 CSFV에 도입하는 단계를 포함하는, CSFV 백신을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 (비변형된) 6B8 에피토프는 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되고, 상기 6B8 단클론 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나, 상기 6B8 단클론 항체는 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나, 상기 6B8 단클론 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나, 상기 6B8 단클론 항체는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 a) 동물로부터 샘플을 수득하는 단계; 및 b) 상기 샘플을 면역 테스트로 분석하는 단계를 포함하는, CSFV로 감염된 동물을 본 발명의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서, 상기 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나, 상기 항체는 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나, 상기 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나, 상기 항체는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CSFV로 감염된 동물을 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하기 위한 키트를 제공한다.
도 1: 이중 결실 또는 단일 결실을 갖는 약독화 후보 바이러스의 성장 특성
도 2: mAb 6B8은 대부분의 CSFV 변종을 인식하지만 BVDV 바이러스와 반응하지 않는다.
도 3: CSFV 분리주, BVDV 변종 및 일부 다른 페스티바이러스 (Pestivirus)의 서열 정렬.
도 4: 14번, 22번 또는 24/25번 위치의 아미노산 잔기가 mAb 6B8 결합에 중요하다는 것을 도시하는 IFA 결과.
도 5: 다양한 DIVA 돌연변이를 갖는 GD18-ddNpro-ErnsH의 회수 바이러스의 IFA 결과.
도 6: 다양한 DIVA 돌연변이를 갖는 GD18-ddNpro-ErnsH P10 바이러스의 성장 곡선. 다양한 6B8 에피토프 돌연변이는 시험관내에서 생존 가능한 GD18 후보를 산출하였으며, 원래의 약독화된 GD18-ddNpro-ErnsH 후보에 필적하는 성장 능력을 나타냈다.
도 7: DIVA 돌연변이 KARD를 갖는 다양한 약독화 후보의 회수 바이러스의 IFA 결과. 4개의 아미노산 돌연변이 KARD를 포함하는 후보는 시험관 내에서 감염성이며 6B8 mAb와 반응하지 않았다.
도 8: 안전성 실험에서의 체온 (평균).
도 9: 효능 실험에서의 체온 (평균).
도 10: 효능 실험에서의 총 임상 점수 (평균).
도 11: 6B8 에피토프, 다양한 돌연변이 형태의 RD, KRD 및 KARD가 모두 DIVA 옵션으로서 실현 가능하다는 것을 도시하는 6B8 dcELISA 결과.
도 12: DIVA에 대한 cELISA와 dcELISA의 비교. 과용량 백신 접종 혈청과 시험 감염 (challenge) 혈청의 구별이 DIVA dcELISA에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 양태들을 기재하기 전에, 본 출원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태는 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는다면 복수형에 대한 언급도 포함한다는 것에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "에피토프"에 대한 언급은 복수의 에피토프를 포함하며, "바이러스"에 대한 언급은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 1종 이상의 바이러스 및 이의 등가물 등에 대한 언급이다. "및/또는"이라는 용어는 모든 조합을 개별적으로 나열하는 것과 동일하게 당해 용어에 의해 연결된 항목의 모든 조합을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "A, B 및/또는 C"는 "A", "B", "C", "A 및 B", "A 및 C", "B 및 C" 및 "A 및 B 및 C"를 포함한다. 달리 정의되지 않는다면, 본 출원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 출원에서 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법들 및 물질들이 본 발명의 실시 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들, 장치들 및 재료들은 이하에서 기재될 것이다. 본 출원에 언급된 모든 간행물들은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 보고된 바이러스 변종들, 세포주들, 벡터들 및 방법들을 기재하고 개시할 목적으로 본 출원에 참조로 포함된다. 본 출원에서 그 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 개시 내용보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석해서는 안된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV)를 제공하며, 여기서, 상기 (비변형된) 6B8 에피토프는 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 CSFV는 E2 단백질에서 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 6B8 에피토프를 갖는 야생형 CSFV로부터 유래된다. 하나의 양태에서, 상기 6B8 단클론 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나, 상기 6B8 단클론 항체는 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나, 상기 6B8 단클론 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나, 상기 6B8 단클론 항체는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "CSFV"라는 용어는 플라비비리대 (Flaviviridae) 과 내의 페스티바이러스 속의 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV) 종에 속하는 모든 바이러스를 지칭한다.
"재조합"이라는 용어는 유전 공학에 의해 변경, 재배열 또는 변형된 CSFV를 지칭한다. 그러나, 상기 용어는 자연 돌연변이와 같이 자연 발생 사건으로 인해 발생하는 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 변경을 지칭하지 않는다.
본 출원에서의 "E2 단백질의 6B8 에피토프"는 또한 본 출원에서 정의된 바와 같은 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 에피토프를 지칭한다. 상기 6B8 에피토프는 적어도 STNEIGPLGAEG (서열 번호 11) 또는 STDEIGLLGAGG (서열 번호 12) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
"6B8 단클론 항체"라는 용어는 6B8 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭하며, 여기서, 상기 6B8 단클론 항체는 6B8 에피토프, 특히, 적어도 STNEIGPLGAEG (서열 번호 11) 또는 STDEIGLLGAGG (서열 번호 12) 아미노산 서열을 포함하는 6B8 에피토프를 특이적으로 인식한다. 바람직하게, 6B8 단클론 항체라는 용어는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단클론 항체를 지칭한다. 보다 바람직하게, 6B8 단클론 항체라는 용어는 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단클론 항체를 지칭한다. 보다 바람직하게, 6B8 단클론 항체라는 용어는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체를 지칭한다.
"6B8 단클론 항체의 항원 결합 단편"이라는 용어는 6B8 단클론 항체의 단편을 지칭하거나, 적어도 6B8 에피토프, 특히, 적어도 STNEIGPLGAEG (서열 번호 11) 또는 STDEIGLLGAGG (서열 번호 12) 아미노산 서열을 포함하는 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직하게, 상기 용어는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 및/또는 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 코딩하는 아미노산 단편을 추가로 포괄한다. 더욱이, 상기 용어는 또한 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 아미노산 단편을 포괄한다. 보다 바람직하게, 상기 용어는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체에 의해 인코딩된 아미노산 단편을 포괄하며, 여기서, 아미노산 단편은 6B8 에피토프에 특이적으로 결합한다.
"돌연변이"라는 용어는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 돌연변이라는 용어는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 당해 분야의 통상의 기술자는 지체 없이 돌연변이를 생성할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 상기 적어도 하나의 돌연변이는 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 단클론 항체의 결합의 특이적 억제를 초래한다.
"특이적으로 억제한다" 또는 "특이적 억제"라는 용어는 6B8 항체가 비변형된 6B8 에피토프, 특히, STNEIGPLGAEG (서열 번호 1) 또는 STDEIGLLGAGG (서열 번호 2) 아미노산 서열을 갖는 비변형된 6B8 에피토프와 비교하여 돌연변이된 6B8 에피토프에 적어도 2배, 바람직하게는 5배, 보다 바람직하게는 10배, 보다 더 바람직하게는 50배 더 낮은 친화도로 결합한다는 것을 의미한다. "친화도"는 항체 분자 상의 단일 항원 결합 부위와 단일 에피토프 사이의 상호 작용이다. 이것은 결합 상수 KA = kass/kdiss 또는 해리 상수 KD = kdiss/kass로 표현된다. 보다 바람직하게, "특이적으로 억제한다" 또는 "특이적 억제"라는 용어는 본 출원에서 정의된 바와 같은 6B8 단클론 항체, 특히, 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체가 특정 면역 형광 검정, 바람직하게는 실시예 6에 기재된 바와 같은 특정 면역 형광 검정에서 본 발명에 따른 돌연변이된 6B8 에피토프에 검출 가능하게 결합하지 않는다는 것을 의미한다.
"치환"이라는 용어는 아미노산이 동일한 위치에서 또 다른 아미노산으로 대체된다는 것을 의미한다. 따라서, "치환"이라는 용어는 아미노산의 제거/결실에 이어서 동일한 위치에서 또 다른 아미노산의 삽입을 포함한다.
"E2 단백질"이라는 용어는 CSFV의 폴리단백질 (Npro-C-Erns-E1- E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)로부터 최종 절단 산물로서 생성되는 가공된 E2 단백질을 지칭한다. 예를 들어, QZ07 필드 변종의 E2 단백질은 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖고, GD18 필드 변종의 E2 단백질은 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖고, C 변종의 E2 단백질은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 하나의 양태에서, 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프는 적어도 E2 단백질의 14번 위치, 22번 위치, 24번 위치, 및/또는 24번 및 25번 (24/25번) 위치에서의 아미노산 잔기에 의해 정의된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프는, 예를 들어, QZ07, GD18 또는 GD191 분리주에 대한, 적어도 E2 단백질의 S14, G22, E24, 및/또는 E24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프는, 예를 들어, C 변종에 대한, 적어도 E2 단백질의 S14, G22, G24, 및/또는 G24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의된다.
아미노산 잔기의 넘버링은 N-말단으로부터 가공된 E2 단백질의 아미노산 위치, 예를 들어, 예시적인 방식으로 서열 번호 7에 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 지칭한다. 그러나, 아미노산 위치는 폴리단백질 (Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 함유)과 관련하여 추가로 정의될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프는 적어도 STNEIGPLGAEG (서열 번호 11) (예를 들어, QZ07, GD18 또는 GD191 분리주의 경우) 또는 STDEIGLLGAGG (예를 들어, C 변종의 경우) 아미노산 서열에 의해 정의된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프는 적어도 STNEIGPLGAEG (서열 번호 11) (예를 들어, QZ07, GD18 또는 GD191 분리주의 경우) 아미노산 서열에 의해 정의된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프는 적어도 STDEIGLLGAGG (서열 번호 12) (예를 들어, C 변종의 경우) 아미노산 서열에 의해 정의된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, E2 단백질의 24/25번 아미노산 위치에서의 치환, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환 및 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환 및 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환 및 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환 및 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환 및 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV에서, E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고/되거나, E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고 25번 위치에서의 아미노산은 각각 D로 치환되고/되거나, E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고/되거나, E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV에서, E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV에서, E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV에서, E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환되고, E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV에서, E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV에서, E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환되고, E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV에서, E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고, E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV에서, E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환되고, E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고, E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환 및 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV의 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 돌연변이된 6B8 에피토프 서열인 KTNEIGPLGARD (서열 번호 13) 또는 KTNEIGPLAARD (서열 번호 14) 또는 STNEIGPLGARD (서열 번호 31) 또는 STDEIGLLGARD (서열 번호 32) 또는 KTDEIGLLGARD (서열 번호 33) 또는 KTDEIGLLAARD (서열 번호 34)를 초래한다. 본 발명의 하나의 양태에서, E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 돌연변이된 6B8 에피토프 서열인 KTNEIGPLGARD (서열 번호 13)를 초래한다. 본 발명의 하나의 양태에서, E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 돌연변이된 6B8 에피토프 서열인 KTNEIGPLAARD (서열 번호 14)를 초래한다. 본 발명의 하나의 양태에서, E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 돌연변이된 6B8 에피토프 서열인 STNEIGPLGARD (서열 번호 31)를 초래한다. 본 발명의 하나의 양태에서, E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 돌연변이된 6B8 에피토프 서열인 STDEIGLLGARD (서열 번호 32)를 초래한다. 본 발명의 하나의 양태에서, E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 돌연변이된 6B8 에피토프 서열인 KTDEIGLLGARD (서열 번호 33)를 초래한다. 본 발명의 하나의 양태에서, E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 돌연변이된 6B8 에피토프 서열인 KTDEIGLLAARD (서열 번호 34)를 초래한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 CSFV의 E2 단백질은 서열 번호 7, 8 및 35 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만, 본 출원에 상기에서 정의된 바와 같은 6B8 에피토프 내에 돌연변이를 함유한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 출원에서 개시된 바와 같은 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 E2 단백질은 면역원성이며, 바람직하게는 CSFV에 대한 방어 면역을 부여한다. 상기 E2 단백질은 A, B, C 및 D 도메인의 4가지 항원 도메인을 함유하며, 이들 도메인은 모두 E2 단백질의 N-말단에 위치한다. 4개의 도메인은 2개의 독립적인 항원 단위를 구성하며, 하나는 B/C 도메인의 단위이고, 다른 하나는 A/D 도메인을 포함한다. 상기 B/C 도메인은 1번부터 84/111번까지의 아미노산 위치이며, D/A 도메인은 77번부터 111/177번까지의 아미노산 위치에 위치한다. 또한, 상기 B/C 도메인은 아미노산 4C와 48C 사이에 추정되는 이황화 결합에 의해 연결되는 반면, D/A 단위는 2개의 이황화 결합, 즉, 아미노산 103C와 167C 사이의 하나와 아미노산 129C와 아미노산 139C 사이의 다른 하나로 형성된다. 이러한 시스테인 잔기는 E2 단백질의 입체 형태 항원 구조에 중요하다. 항원 모티프 (82-85LLFD)는 회복기 혈청 결합을 위한 E2 단백질의 항원 구조에 중요하다. 또 다른 모티프 (RYLASLHKKALPT, 64 내지76번 아미노산 위치)도 또한 E2 단백질의 입체 형태 에피토프 인식의 구조적 완전성에 중요한 것으로 확인되었다. 또한, 상기에서 언급된 항원 도메인 중 하나만을 포함하는 E2 단백질은 면역원성을 유지하고 감염성 CSFV 시험 감염으로부터 돼지를 방어할 수 있는 것으로 보고되었다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 양태에서, 본 출원에서 기재된 바와 같은 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 변형을 갖는 E2 단백질은 적어도 하나, 바람직하게는 상기에서 기재된 바와 같은 항원 도메인 중 적어도 하나를 보유한다. 바람직하게, 본 발명의 E2 단백질은 CSFV에 대한 방어 면역을 부여할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 출원에서 정의된 바와 같은 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이는 CSFV에 대한 E2 단백질의 방어 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 도입될 수 있다.
2개의 폴리펩타이드 서열들 사이의 "서열 동일성"은, 이들 서열들 사이에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열들 사이의 서열 동일성 수준을 평가하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 분석 소프트웨어는 종종 아미노산 서열의 동일성을 결정하는데 사용된다. 예를 들어, 동일성은 NCBI 데이터베이스에서 BLAST 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 동일성의 결정에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987] 및 [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]을 참조한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 안정한 아미미노산 치환이다 상기 안정한 아미노산 치환은 본 발명에 따른 안정한 재조합 CSFV를 초래한다.
"안정한 아미노산 치환"이라는 용어는 세포 배양에서 CSFV 바이러스의 수회 계대 후에도 여전히 존재하는 아미노산 치환을 치환을 지칭한다. 바람직하게, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 세포 배양에서 CSFV의 적어도 3회 계대 후에, 보다 바람직하게는 적어도 6회 계대 후에, 보다 더 바람직하게는 적어도 9회 계대 후에, 보다 더 바람직하게는 적어도 12회 계대 후에, 보다 더 바람직하게는 적어도 15회 계대 후에, 보다 더 바람직하게는 적어도 20회 계대 후에, 보다 더 바람직하게는 적어도 30회 계대 후에, 보다 더 바람직하게는 적어도 50회 계대 후에, 보다 더 바람직하게는 100회 계대 후에, 가장 바람직하게는 250회 계대 후에도 여전히 존재한다. "세포 배양물" 또는 "세포 배양물에서의 계대"라는 용어는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 상기 용어는 유기체 외부에서 배양된 세포에서 바이러스의 증식에 관한 것이다. 상기 용어는 또한 세포 시스템에서 유기체 외부에서의 세포 증식을 지칭한다. 이러한 세포 시스템은 숙주 세포 (예를 들어, SK-6 세포, ST 세포 또는 PK-15 세포 등) 및 유기체 외부에서의 이러한 세포의 증식에 적합한 세포 배양 배지를 포함한다. 적합한 세포 배양 배지는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 상업적으로 입수 가능하다. 이들은 영양소, 염, 성장 인자, 항생제, 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청) 및 pH 지지약 (예를 들어, 페놀 레드)를 포함할 수 있다. 아미노산이 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 여전히 존재하는지 여부는 지체 없이 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 추가로, "안정한 아미노산 치환"이라는 용어는 또한 본 발명의 CSFV로 이전에 백신 접종된 백신 접종 동물로부터 CSFV를 재단리한 후에도 여전히 존재하는 아미노산 치환을 지칭한다. 바람직하게, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 본 발명의 CSFV로 이전에 백신 접종된 백신 접종 동물로부터 재단리된 CSFV에서 백신 접종 후 적어도 3일, 보다 바람직하게는 적어도 4일, 보다 더 바람직하게는 적어도 5일, 보다 더 바람직하게는 적어도 6일, 보다 더 바람직하게는 적어도 7일, 보다 더 바람직하게는 적어도 8일, 보다 더 바람직하게는 적어도 9일, 보다 더 바람직하게는 적어도 10일, 보다 더 바람직하게는 적어도 12일, 보다 더 바람직하게는 적어도 15일, 보다 더 바람직하게는 적어도 20일, 보다 더 바람직하게는 적어도 25일, 보다 더 바람직하게는 적어도 35일, 보다 더 바람직하게는 적어도 50일, 가장 바람직하게는 적어도 100일 동안 여전히 존재한다. 백신 접종, CSFV의 재단리, 및 아미노산이 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 여전히 존재하는지 여부의 결정은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있다.
놀랍게도, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 치환은 상기 치환의 안정성으로 인해 마커 또는 DIVA 백신을 생성하는데 매우 적합한 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따른 6B8 에피토프 내의 상기 치환은 세포 배양에서 본 발명에 따른 CSFV 바이러스의 수회 계대 후에도 안정하다. 더욱이, 본 발명에 따른 6B8 에피토프 내의 치환은 상기 E2 단백질의 온전한 (야생형) 6B8 에피토프에 대해 특이적인 항체에 의해 인식될 수 없는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 6B8 에피토프 내의 치환은 마커 또는 DIVA 백신을 생성하기 위한 음성 마커로서 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 치환은 상기 E2 단백질에 대한 6B8의 결합을 억제한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 약독화된다.
"약독화된"이라는 용어는 상기 CSFV의 병독성이 감소되었다는 것을 의미한다. 본 발명에서, "약독화"는 "무독성"과 동의어이다. 본 발명에서, 약독화된 CSFV는, 비약독화된 CSFV로 감염되고 약독화된 바이러스를 투여받지 않은 동물의 "대조군"과 비교하여, 병독성이 감소하여 CSFV 감염의 임상 징후를 일으키지 않지만 표적 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 약독화된 CSFV로 감염된 동물에서 임상 징후의 발병률 또는 중증도가 감소한다는 것을 의미할 수도 있는 것이다. 이러한 문맥에서, "감소한다/감소된"이라는 용어는, 상기에서 정의된 바와 같은 대조군과 비교하여, 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 보다 더 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 100% 초과의 감소를 의미한다. 따라서, 약독화된 CSFV 변종은 면역원성 조성물 내에 도입하기에 적합한 것이다.
CSFV의 약독화는 연속 계대 배양에 의해 수행될 수 있다. 세포 배양에서 CSFV의 연속 계대 배양에 의한 약독화는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며 지체 없이 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있다.
또한, 약독화는 CSFV를 돌연변이시켜 달성될 수 있다. 약독화된 CSFV 변종은 Erns 유전자의 돌연변이에 의해 (국제공개공보 WO 99/64604, WO2005/111201, WO 2009/156448 A1, 문헌 [Mayer et a I., 2003. Virus Res. 98: 105-16], [Meyers et al., 1999. J. Virol. 73: 10224-10235], [Widjojoatmodjo et al., 2000. J. Virol. 74: 2973-80]), CSFV 병독성 변종 유래 Npro의 결실에 의해 (문헌 [Tratschin, J., et al., 1998. J. Virol. 72: 7681-7684]), Erns의 돌연변이와 Npro의 결실의 조합에 의해 (국제공개공보 WO 2005/111201, WO 2009/156448 A1), Erns 및 E2의 돌연변이의 조합에 의해 (문헌 [van Gen nip et al. 2004. J. Virol, 78: 3812-3823]), E1 유전자의 돌연변이에 의해 (문헌 [Risatti et al., 2005. Virology 343: 116-127]) 및 E2 유전자의 돌연변이에 의해 (문헌 [Risatti et al., 2007. Virology 364: 371-82]) 생성될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 Erns 단백질의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 Npro 단백질의 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 하나의 양태에서, 상기 Erns 단백질의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 Npro 단백질의 적어도 하나의 돌연변이는 재조합 CSFV의 약독화를 초래한다. Npro 및 Erns의 서열 내의 돌연변이는 상기에서 제시된 바와 같이 종래 기술에서 이미 기재되었다 (예를 들어, 국제공개공보 WO 99/64604, WO 2005/111201 A, WO 2009/156448 A1 참조).
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 Erns 단백질의 돌연변이는 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및/또는 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 Npro 단백질의 돌연변이는 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실이다. 상기 아미노산 위치는 각각 가공된 Erns 단백질에서의 위치 (예를 들어, 예시적인 방식으로 서열 번호 16에 제공된 바와 같은 아미노산 위치) 또는 가공된 Npro 단백질에서의 위치 (예를 들어, 예시적인 방식으로 서열 번호 15에 제공된 바와 같은 아미노산 위치)를 지칭한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실을 갖는다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 결실을 갖는다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실, Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 결실을 갖는다.
본 출원에서 이해되는 바와 같은 "Npro"라는 용어는, 바이러스 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩되고 합성 폴리단백질의 나머지로부터 자신을 절단하는 제1 단백질에 관한 것이다 (문헌 [Stark, et al., J. Virol. 67:7088-7093 (1993)]; [Wiskerchen, et al., Virol. 65:4508-4514 (1991)]). 문맥에 따라, 상기 용어는 또한 상기 단백질 자체에 대한 서열의 돌연변이 후 나머지 "Npro" 아미노산에 관한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 GD18 필드 변종의 Npro 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 15에 제시되며, 상기 QZ07 필드 변종의 Npro 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 18에 제시된다.
본 출원에서 사용되는 "Erns"는 페스티바이러스 비리온의 구조적 성분을 나타내는 당단백질 Erns에 관한 것이다 (문헌 [Thiel et al., 1991. J. Virol. 65: 4705-4712]). Erns는 대표적인 멤브레인 앵커가 결여되어 있고 감염된 세포로부터 상당한 양으로 분비되며, 이러한 단백질은 RNase 활성을 나타내는 것으로 보고되었다 (문헌 [Hulst et al., 1994. Virology 200: 558-565]; [Schneider et al., 1993. Science 261: 1169-1171]; [Windisch et al., 1996. J. Virol. 70: 352-358]). E0 당단백질이라는 용어는 간행물에서 Erns 당단백질과 동의어로 자주 사용된다는 점에 유의해야 한다. 문맥에 따라, 상기 용어는 또한 돌연변이된 "Erns" 단백질에 관한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 GD18 필드 변종의 Erns 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 16에 제시되며, 상기 QZ07 필드 변종의 Erns 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 19에 제시된다.
본 출원에서 사용되는 "처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실"이라는 용어는 거의 완전한 Npro 코딩 영역의 결실을 지칭하지만, 4개의 아미노 말단 아미노산은 남아 있다.
당해 분야의 통상의 기술자는, 6B8 에피토프가 다양한 CSFV 변종 중에서 진화적으로 보존되기 때문에, 본 발명의 재조합 CSFV가 다양한 CSFV 분리주로부터 유래될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 CSFV는 유전자군 2.1의 분리주로부터 유래된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는, 예를 들어, GD18 또는 QZ07 필드 변종으로부터 유래된다. QZ07 필드 변종은 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 전장 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 서열 번호 20에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리단백질을 포함하거나 발현한다. GD18 필드 변종은 서열 번호 2에 나타낸 바와 같은 전장 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 서열 번호 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리단백질을 포함하거나 발현한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 CSFV는 유전자군 1의 분리주로부터 유래된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 당해 분야에 널리 공지된 C 변종으로부터 유래된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 돌연변이를 포함하는 재조합 CSFV를 제공한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는, 예를 들어, QZ07 필드 변종으로부터 유래되며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실, E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 서열 번호 3에 나타낸 바와 같은 전장 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 서열 번호 21에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리단백질을 포함하거나 발현한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 돌연변이를 포함하는 재조합 CSFV를 제공한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는, 예를 들어, QZ07 필드 변종으로부터 유래되며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실, Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실, E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 서열 번호 4에 나타낸 바와 같은 전장 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 서열 번호 22에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리단백질을 포함하거나 발현한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실 및 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 또 다른 돌연변이를 포함하는 재조합 CSFV를 제공한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는, 예를 들어, GD18 필드 변종으로부터 유래되며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실, 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실, E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 서열 번호 5에 나타낸 바와 같은 전장 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 서열 번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리단백질을 포함하거나 발현한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는, 예를 들어, GD18 필드 변종으로부터 유래되며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실, Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실, E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 재조합 CSFV는 서열 번호 6에 나타낸 바와 같은 전장 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 서열 번호 24에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리단백질을 포함하거나 발현한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 CSFV를 코딩하는 핵산을 제공한다.
"핵산"이라는 용어는 DNA 분자, RNA 분자, cDNA 분자 또는 유도체를 비롯한 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다. 본 발명의 핵산은 단리된 폴리뉴클레오타이드 (즉, 자연 환경으로부터 단리됨) 및 유전적으로 변형된 형태를 포괄한다. 더욱이, 글리코실화되거나 메틸화된 폴리뉴클레오타이드와 같은 자연 발생적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드, 또는 바이오티닐화된 폴리뉴클레오타이드와 같은 인위적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드를 비롯하여 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드도 또한 포함된다. 또한, 본 발명의 CSFV는 축퇴성 유전 코드로 인해 다수의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 CSFV를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
"벡터"라는 용어는 파지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 뿐만 아니라 인공 염색체, 예를 들어, 세균 또는 효모 인공 염색체를 포괄한다. 더욱이, 상기 용어는 또한 게놈 DNA로의 표적화 작제물의 무작위 또는 부위 지정 통합을 가능하게 하는 표적화 작제물에 관한 것이다. 이러한 표적 작제물은 바람직하게는 하기에 상세히 기재된 바와 같이 상동 또는 이종 재조합에 충분한 길이의 DNA를 포함한다. 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터는 바람직하게는 숙주에서 증식 및/또는 선택을 위한 선택 가능한 마커를 추가로 포함한다. 상기 벡터는 당해 분야에 널리 공지된 다양한 기법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 벡터는 인산 칼슘 침전물 또는 염화 루비듐 침전물과 같은 침전물, 또는 하전된 지질과의 복합체 또는 풀러렌과 같은 탄소계 클러스터로 도입될 수 있다. 대안으로, 플라스미드 벡터는 열 충격 또는 전기 천공 기법에 의해 도입될 수 있다. 상기 벡터가 바이러스인 경우, 숙주 세포에 적용하기 전에 적절한 팩킹 세포주를 사용하여 시험관 내에서 팩킹될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 능력이 있거나 복제 결함이 있을 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 보완 숙주/세포에서만 발생한다. 더욱 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오타이드는 원핵 또는 진핵 세포 또는 이의 단리된 분획에서 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현은 폴리뉴클레오타이드의 바람직하게는 번역 가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포에서 발현을 보장하는 조절 요소는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이들은 바람직하게는 전사의 개시를 보장하는 조절 서열, 및 임의로 전사의 종결 및 전사물의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가의 조절 요소는 전사 및 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 발현을 허용하는 가능한 조절 요소는, 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)에서 lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하며, 진핵 숙주 세포에서 발현을 허용하는 조절 요소의 예는 효모에서 AOX1 또는 GAL1 프로모터, 또는 포유 동물 및 기타 동물 세포에서 CMV 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV 인핸서, SV40 인핸서 또는 글로빈 인트론이다. 또한, 유도성 발현 제어 서열은 본 발명에 포함되는 발현 벡터에서 사용될 수 있다. 이러한 유도성 벡터는 tet 또는 lac 작동 유전자 서열, 또는 열 충격 또는 기타 환경 요인에 의해 유도될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 기법들은 문헌 [Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.] 및 [Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)]에 기재되어 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 CSFV 또는 본 발명에 따른 재조합 CSFV를 코딩하는 핵산 또는 본 발명에 따른 재조합 CSFV를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 일부인 재조합 CSFV는 바람직하게는 본 출원에서 기재된 바와 같이 약독화된다.
본 출원에서 사용되는 "면역원성 조성물"이라는 용어는, 면역원성 조성물이 투여되는 숙주에서 면역 반응을 유도하는, 적어도 1종의 항원을 포함하는 조성물을 지칭한다. 이러한 면역 반응은 본 발명의 면역원성 조성물에 대한 세포성 및/또는 항체 매개성 면역 반응일 수 있다. 상기 숙주는 또한 "대상체"로도 기재된다. 바람직하게, 본 출원에서 기재되거나 언급된 임의의 숙주 또는 대상체는 동물이다.
일반적으로, "면역 반응"은 다음 효과들 중 하나 이상을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다: 본 발명의 면역원성 조성물에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 감마-델타 T 세포의 생성 또는 활성화. 바람직하게, 상기 숙주는 방어 면역 반응 또는 치료 반응을 나타낼 것이다.
"방어 면역 반응"은 감염된 숙주에 의해 일반적으로 나타나는 임상 징후의 감소 또는 결여, 보다 신속한 회복 시간 및/또는 감염력의 저하된 지속 기간, 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 분비물의 저하된 병원체 역가에 의해 입증될 것이다.
본 출원에서 사용되는 "항원"은 이러한 항원 또는 이의 면역학적 활성 성분을 포함하는 관심 대상의 면역원성 조성물 또는 백신에 대해 숙주에서 면역 반응을 유도하는 성분을 지칭하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 항원 또는 면역학적 활성 성분은 온전한 (불활성화 또는 변형된 살아있는 형태)인 미생물, 또는 숙주에 투여되는 경우에 숙주에서 면역 반응을 유발할 수 있는 이의 임의의 단편 또는 분획일 수 있다. 상기 항원은 원래 형태이거나 소위 변형된 생백신 (modified live vaccine: MLV)의 약독화된 유기체로서의 완전한 살아있는 유기체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 상기 항원은 상기 유기체의 적절한 요소 (서브 유닛 백신)를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 이들 요소는 온전한 유기체 또는 이러한 유기체의 성장 배양물의 파괴, 및 목적하는 구조(들)를 제공하는 후속 정제 단계에 의해, 또는, 세균, 곤충, 포유 동물 또는 다른 종 (이들에 한정되는 것은 아님)과 같은 적합한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도되는 합성 공정, 및 임의로 후속 단리 및 정제 절차에 의해, 또는 적합한 약제학적 조성물을 사용하는 유전 물질의 직접 도입 (폴리뉴클레오타이드 백신 접종)에 의해 백신을 필요로 하는 동물에서 상기 합성 공정의 유도에 의해 생성된다. 상기 항원은 소위 사백신 (killed vaccine: KV)으로 적절한 방법에 의해 불활성화된 온전한 유기체를 포함할 수 있다.
상기 숙주가 방어 면역 반응을 나타내어 신규한 감염에 대한 내성이 증진될 것이고/이거나 질병의 임상 중증도가 감소될 것인 경우, 상기 면역원성 조성물을 "백신"으로 기재한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 백신이다.
본 출원에서 이해되는 "백신"이란 용어는 항원 물질을 포함하는 수의학적 용도를 위한 변형된 백신이며, CSFV 감염에 의해 유발된 질병에 대해 특이적인 능동 면역을 유도할 목적으로 투여된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 백신은, 숙주 동물에서 방어 면역 반응을 유도하지만 이의 게놈의 돌연변이로 인해 바이러스 질병을 유발하지 않는, 바람직하게는 본 출원에서 기재된 바와 같은 약독화된 생 CSFV를 포함하는 약독화된 생 CSFV 백신이다. 상기 약독화된 생백신은 불활성화 백신에 비해 자연 감염을 보다 가깝게 모방하는 이점을 갖는다. 결과적으로, 이들은 불활성화 대응물 보다 일반적으로 더 높은 수준의 방어를 제공한다. 본 출원에서 기재되는 약독화된 CSFV는, 함유하는 면역원에 대해 및 때로는 항원 관련 유기체에 대해서도 또한 모체 항체를 통해 수동적으로 전달될 수 있는 능동 면역을 부여한다. 본 발명의 백신은 상기에서 정의된 바와 같은 백신을 지칭하며, 여기서, 하나의 면역학적 활성 성분은 CSFV 또는 페스티바이러스 기원의 CSFV이거나 임의의 공지된 페스티바이러스 서열 (센스 또는 안티센스)과 70% 초과 상동인 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된다. 그러나, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 불활성화 CSFV를 포함하는 백신에 관한 것이다.
백신은 약제학적 조성물에 전형적인 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
면역 반응을 증진시키기 위한 추가의 성분은, 백신에 첨가되거나 인터페론, 인터루킨 또는 성장 인자 (이들에 한정되는 것은 아님)와 같은 추가의 성분에 의해 각각 유도된 후 신체에 의해 생성되는 "아쥬반트"로서 일반적으로 지칭되는 성분, 예를 들어, 수산화 알루미늄, 미네랄 또는 기타 오일 또는 보조 분자이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 출원에서 정의된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이, 예를 들어, E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, E2 단백질의 24/25번 아미노산 위치에서의 치환, E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환이 마커로서 사용된다.
본 출원에서 사용되는 "마커"라는 용어는 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프를 지칭한다. 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프) 서열과 상이하다. 따라서, 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프는 예시적인 면역 테스트 및/또는 게놈 분석 테스트에 의해 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프를 갖는 백신 접종된 동물과 비-돌연변이된 6B8 에피토프를 갖는 자연 감염 동물의 구별을 가능하게 한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 마커 백신 또는 DIVA (감염된 동물과 백신 접종된 동물의 구별) 백신이다.
"마커 백신" 또는 "DIVA (감염된 동물과 백신 접종된 동물의 구별)"이라는 용어는 상기에서 제시된 바와 같은 마커를 갖는 백신을 지칭한다. 따라서, 마커 백신은 백신 접종된 동물을 자연 감염 동물과 구별하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은, 야생형 CSFV 감염과 대조적으로 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프가 본 발명의 CSFV로 백신 접종된 동물에서 특이적으로 검출될 수 있기 때문에, 마커 백신으로서 역할을 한다. 예시적인 면역 테스트 및/또는 게놈 분석 테스트에 의해, 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프) 서열과 구별될 수 있다. 마지막으로, 상기 마커 에피토프는 가축에서 나타날 수 있는 다른 유기체에 의해 유도되는 위양성 혈청학적 결과를 회피하기 위해 병원체에 대해 특이적이어야 한다. 그러나, 실시예에서 나타낸 바와 같이, 6B8 에피토프는 진화적으로 보존되고 (서열 정렬) CSFV에 대해 특이적이다 (6B8 mAb는 BVDV에 결합하지 않음). 따라서, 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프는 마커 백신에 사용하기에 매우 적합하다.
바람직하게, 본 발명에 따른 마커 백신은, 숙주 동물에서 방어 면역 반응을 유도하지만 이의 게놈의 돌연변이로 인해 바이러스 질병을 유발하지 않는 약독화된 생 CSFV를 포함하는 약독화된 생백신이다. 상기 약독화된 생백신은 불활성화 백신에 비해 자연 감염을 보다 가깝게 모방하는 이점을 갖는다. 결과적으로, 이들은 불활성화 대응물 보다 일반적으로 더 높은 수준의 방어를 제공한다. 본 발명에 따른 적합한 약독화된 CSFV 마커 생백신은 각각 본 출원에서 개시된 바와 같은 Erns 및/또는 Npro 단백질 내의 돌연변이 및 돌연변이체 6B8 에피토프를 포함한다.
그러나, 이것은 백신이 백신으로서 역할을 하기 위해 표적 동물에서 복제되어야 한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 본질적으로 이의 마커 특징 (예를 들어, 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프)을 보유한다. 그러므로, 상기 바이러스는 표적 동물에서의 복제 여부에 관계 없이 표적 동물에서 마커 백신으로서 기능한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 불활성화 CSFV를 포함하는 마커 백신에 관한 것이다.
CSFV의 (비-마커) 약독화된 생 바이러스는 당해 분야에 기술되어 있으며 심지어 상업적으로 입수 가능하다. 따라서, 이러한 바이러스는 본 발명에 따른 바이러스, 즉, 본 발명에 따른 6B8 에피토프의 돌연변이를 갖는 복제 가능한 CSFV의 작제물을 위한 매우 적합한 출발 물질을 구성한다. 이러한 바이러스는 야생형 대응물과 비교하여 본질적으로 약독화된 행동을 하므로, 마커 백신에서 마커 바이러스의 기초로서 사용될 수 있다.
효과적인 마커 백신의 주요 이점은, 백신 접종된 동물 집단에서 샘플을 채취하기 전에 급성 감염되거나 일정 기간 (예를 들어, 적어도 약 3주) 감염된 돼지의 감지를 가능하게 하므로, 돼지 집단에서 CSFV의 확산 또는 재유입을 모니터링할 가능성을 제공한다는 점이다. 따라서, 이것은 실험실 테스트 결과를 기반으로 백신 접종된 돼지 집단에 CSFV가 없다는 것을 특정 신뢰도로 공표하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 마커 백신은 돼지 열병 검출 또는 발생의 경우에 긴급 백신 접종에 이상적으로 적합하다. 마커 백신은 신속하고 효과적인 투여를 용이하게 하고, 야생형 바이러스로 감염된 (질병과 연관된) 동물과 백신 접종된 동물의 구별을 가능하게 한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물로 처리된 동물은 면역 테스트 및/또는 게놈 분석 테스트를 사용하여 상기 동물로부터 수득된 샘플의 분석을 통해 자연 발생 돼지 열병 바이러스로 감염된 동물과 구별될 수 있다.
"샘플"이라는 용어는 체액의 샘플, 분리된 세포의 샘플 또는 조직 또는 장기의 샘플을 지칭한다. 체액의 샘플은 널리 공지된 기술들에 의해 수득될 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청 또는 뇨 샘플, 보다 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플을 포함한다. 조직 또는 장기 샘플은, 예를 들어, 생검에 의해 임의의 조직 또는 장기로부터 수득될 수 있다. 분리된 세포는 원심 분리 또는 세포 분류와 같은 분리 기술에 의해 체액 또는 조직 또는 장기로부터 수득될 수 있다.
"수득된"이라는 용어는 바람직하게는 침전, 컬럼 등을 사용하여 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 분리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다.
"면역 테스트" 및 "게놈 분석 테스트"라는 용어는 하기에서 구체화된다. 상기 "면역 테스트" 및 "게놈 분석 테스트"의 분석은 각각 본 발명에 따른 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물을 자연 발생 (질병 관련) 돼지 열병 바이러스로 감염된 동물과 구별하기 위한 기초이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 단일 용량 투여를 위해 제형화된다.
유리하게, 본 발명에 의해 제공된 실험 데이터는 본 발명의 면역원성 조성물의 단일 용량 투여가 방어 면역 반응을 확실하게 효과적으로 자극하였다는 것을 개시한다. 따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 단일 용량 투여에 의해 확실하게 효과적으로 제형화된다.
또한, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 양태에서, CSFV와 관련된 질병은 CSF이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 임의의 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물을 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 임의의 면역원성 조성물을 동물에게 단일 투여하는 단계를 포함하는, 동물을 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 동물을 면역화시키는 방법은 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 이러한 동물에게 단일 투여함으로써 효과적이다.
"면역화시키는"이라는 용어는 면역화되는 동물에게 면역원성 조성물을 투여하여 이러한 면역원성 조성물 중에 포함된 항원에 대해 면역 반응을 유발시키는 능동 면역화에 관한 것이다.
상기 면역화는 한무리에서 특정 CSFV 감염의 발생률 감소, 또는 특정 CSFV 감염에 기인하거나 이와 관련된 임상 징후의 중증도 감소를 초래한다. 바람직하게, 상기 면역화는 한무리에서 특정 CSFV 감염의 발생률 감소, 또는 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 단일 투여에 의한 특정 CSFV 감염에 기인하거나 이와 관련된 임상 징후의 중증도 감소를 초래한다.
본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본 출원에서 제공된 바와 같은 면역원성 조성물에 의한 이를 필요로 하는 동물의 면역화는 바람직하게는 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 단일 투여에 의한 CSFV 감염에 의한 대상체의 감염의 예방을 초래한다. 보다 더 바람직하게, 면역화는 CSFV 감염에 대해 효과적이면서 장기간 지속되는 면역 반응을 초래한다. 상기 기간은 2 개월 이상, 바람직하게는 3 개월 이상, 보다 바람직하게는 4 개월 이상, 보다 바람직하게는 5 개월 이상, 보다 바람직하게는 6 개월 이상 지속될 것으로 이해될 것이다다. 면역화는 면역화된 모든 동물에서 효과적이지 않을 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 그러나, 상기 용어는 한 집단의 동물들 중 상당 부분이 효과적으로 면역화되어야 함을 필요로 한다.
바람직하게, 일반적으로, 즉, 면역화 없이, 일반적으로 CSFV 감염에 기인하거나 이와 관련된 임상 징후를 발생시킬 한무리의 동물이 이러한 맥락에서 예상된다. 한무리의 동물이 효과적으로 면역화되는지 여부는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 지체 없이 결정될 수 있다. 바람직하게, 주어진 한무리의 동물 중 적어도 33%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%에서의 임상 징후가, 면역화되지 않거나 본 발명 이전에 이용 가능했던 면역원성 조성물로 면역화되지만 후속적으로 CSFV에 의해 감염된 동물과 비교하여, 발병률 또는 중증도에서 적어도 10%까지, 보다 바람직하게는 적어도 20%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 30%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 40%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 60%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 80%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%까지, 가장 바람직하게는 적어도 95%까지 감소되는 경우, 상기 면역화는 효과적일 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 동물은 돼지이다. 하나의 양태에서, 상기 동물은 새끼 돼지이다. 새끼 돼지는 일반적으로 3 내지 4 주령 미만이다. 하나의 양태에서, 상기 새끼 돼지는 1 내지 4 주령에 백신 접종된다. 하나의 양태에서, 상기 동물은 암퇘지이다. 하나의 양태에서, 상기 동물은 임신 암퇘지이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 진피내, 기관내, 질내, 근육내, 비강내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 경구, 척추강내, 피하, 피내, 심장내, 폐엽내, 골수내, 폐내 및 이들의 조합으로 투여된다. 그러나, 화합물의 성질과 작용 방식에 따라, 상기 면역원성 조성물은 다른 경로로도 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 동물에서 CSF와 관련된 하나 이상의 임상 징후의 발생률 또는 중증도를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 임상 징후의 발생률 또는 중증도의 감소는 상기 면역원성 조성물을 투여받지 않은 동물에 대해 상대적이다. 바람직하게, 상기 방법은 상기 면역원성 조성물의 단일 용량 투여를 포함하며, 상기 면역원성 조성물의 이러한 단일 투여에 의해 상기 하나 이상의 임상 징후의 발생률 또는 중증도의 감소에서 효과적이다.
본 출원에서 사용되는 "임상 징후"라는 용어는 CSFV로 인한 동물의 감염 징후를 지칭한다. 상기 임상 징후는 하기에서 추가로 정의된다. 그러나, 상기 임상 징후는 살아 있는 동물로부터 직접적으로 관찰 가능한 임상 증상을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 살아있는 동물로부터 직접 관찰 가능한 임상 징후의 예로는 콧물 및 안구 분비물, 기면, 기침, 천명, 울렁울렁 (thumping), 고열, 체중 증가 또는 감소, 탈수, 설사, 관절 종창, 파행, 쇠약, 창백한 피부, 수척 등을 포함한다. Mittelholzer 등 (문헌 [Mittelholzer et al., Vet.Microbiol., 2000. 74(4): p. 293-308])은 CSF 동물 실험에서 임상 점수의 결정을 위한 체크리스트를 개발하였다. 이러한 체크리스트는 활기, 신체 긴장 상태, 체형, 호흡, 보행, 피부, 안구/결막, 식욕, 배변 및 먹이통의 남은 음식의 평가 변수를 포함한다.
바람직하게, 임상 징후는, 처리되지 않거나 본 발명 이전에 이용 가능했던 면역원성 조성물로 처리되지만 후속적으로 CSFV에 의해 감염되는 대상체와 비교하여, 발생률 또는 중증도에서 적어도 10%까지, 보다 바람직하게는 적어도 20%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 30%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 40%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 60%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 80%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%까지, 가장 바람직하게는 적어도 95%까지 감소된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 1회만 투여되며 이러한 단일 용량 투여에 의해 효과적이다.
실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 출원에 제공된 바와 같은 면역원성 조성물은 이의 투여를 필요로 하는 동물에 대한 상기 면역원성 조성물의 단일 용량의 투여 후에 효과적인 것으로 입증되었다.
그러나, 상기 단일 용량 투여가 바람직하지만, 상기 면역원성 조성물은 또한 2회 또는 수회 투여될 수 있으며, 제1 용량은 제2 (부스터 (booster)) 용량의 투여 전에 투여된다. 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 후 적어도 15일째에 투여된다. 보다 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 15일 내지 40일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 후 적어도 17일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 17일 내지 30일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 후 적어도 19일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 19일 내지 25일째에 투여된다. 가장 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 후 적어도 21일째에 투여된다. 2회 투여 요법의 바람직한 양태에서, 상기 면역원성 조성물의 제1 용량과 제2 용량 둘 다는 동일한 양으로 투여된다. 상기 제1 용량 및 제2 용량 요법에 추가하여, 대체 실시 형태는 추가의 후속 용량을 포함한다. 예를 들어, 제3, 제4 또는 제5 용량이 이러한 양태에서 투여될 수 있다. 바람직하게, 후속 제3, 제4 및 제5 용량 요법은 제1 용량과 동일한 양으로 투여되며, 상기 용량들 사이의 기간은 상기에서 언급된 제1 용량과 제2 용량 사이의 시기와 일치한다.
투여될 CSFV의 양은, 바이러스의 용량이 투여되는 동물에서 면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있는 바이러스의 양일 수 있다. 불활성화된 바이러스 또는 변형된 생 바이러스 제제가 사용되는 경우, 용량 당 약 102 내지 약 109 TCID50 (조직 배양 감염 용량 50% 종료점), 보다 바람직하게는 104 내지 약 108 TCID50, 보다 더 바람직하게는 약 104 내지 약 106 TCID50을 함유하는 백신의 용량이 권장될 수 있다.
바람직하게, 단일 용량의 총 부피는 약 0.5 ml 내지 2.5 ml, 보다 바람직하게는 약 0.6 ml 내지 2.0 ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.7 ml 내지 1.75 ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.8 ml 내지 1.5 ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.9 ml 내지 1.25 ml이며, 단일 1.0 ml 용량이 가장 바람직하다.
본 발명의 하나의 양태에서, 하나 이상의 임상 징후는 호흡 곤란, 노작성 호흡 (labored breathing), 기침, 재채기, 비염, 빈호흡, 호흡 장애, 폐렴, 귀 및 외음부의 적색/청색 변색, 황달, 림프구성 침윤, 림프절 병증, 간염, 신염, 식욕 부진, 발열, 기면증, 무유증, 설사, 코 압출물 (nasal extrudate), 결막염, 진행성 체중 감소, 체중 증가 감소, 피부 창백, 위궤양, 장기 및 조직 상의 육안 및 현미경 병변, 림프구성 병변, 사망률, 바이러스 유발 유산, 사산, 새끼 돼지 기형, 미이라화 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 또한 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이를 CSFV에 도입하는 단계를 포함하는, CSFV 백신을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 (비변형된) 6B8 에피토프는 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식된다. 하나의 양태에서, 상기 6B8 단클론 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나, 상기 6B8 단클론 항체는 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나, 상기 6B8 단클론 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나, 상기 6B8 단클론 항체는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이된 6B8 에피토프는 본 출원에서 개시된 바와 같은 변형된 6B8 에피토프 중 하나이다.
하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 24/25번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환이다.
하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 24/25번 위치에서의 아미노산은 R/D 또는 K/D로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다. 하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환된다. 하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환된다. 하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환되고, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환된다.
하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다. 하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환되고, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다. 하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환되고, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환 및 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다.
하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다.
본 출원에서 사용되는 "마킹"이라는 용어는 CSFV 또는 CSFV 백신에 상기에서 정의된 바와 같은 "마커"의 도입을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 방법은 또한 CSFV의 마킹을 지칭하며 CSFV 백신을 제조하는 방법에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 상기에서 정의된 바와 같은 "마커 백신" 또는 "DIVA 백신"은 본 발명의 방법에 따른 CSFV 백신을 마킹함으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 CSFV 백신은 약독화된 백신이다.
약독화된 CSFV 백신은 이미 상기에서 정의되었다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 약독화된 CSFV 백신의 생산에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 대조적으로, 상기에서 제시된 바와 같이, 바이러스는 표적 동물에서의 복제 여부에 관계 없이 표적 동물에서 마커 백신으로서 기능한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 불활성화 CSFV를 포함하는 마커 백신에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, CSFV로 감염된 동물을 본 발명의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하는 방법을 제공한다:
a) 샘플을 수득하는 단계, 및
b) 상기 샘플을 면역 테스트 및/또는 게놈 분석 테스트로 테스트하는 단계.
"면역 테스트"라는 용어는 CSFV의 E2 단백질의 6B8 에피토프에 대해 특이적인 항체를 포함하는 테스트를 지칭한다. 상기 항체는 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대해 특이적일 수 있다. 그러나, "면역 테스트"라는 용어는 또한 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 펩타이드 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 펩타이드 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)를 포함하는 테스트를 지칭한다. 면역 테스트의 예로는 임의의 효소 면역학적 또는 면역화학적 검출 방법, 예를 들어, 효소 결합 면역 흡착 검정 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 효소 면역 검정 (enzyme immunoassay: EIA), 방사능 면역 검정 (radioimmunoassay: RIA), 샌드위치 효소 면역 테스트, 형광성 항체 테스트 (fluorescent antibody test: FAT), 전기화학 발광 샌드위치 면역 검정 (electrochemiluminescence sandwich immunoassay: ECLIA), 해리 증진된 란탄 계열 플루오로 면역 검정 (dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay: DELFIA) 또는 고체상 면역 테스트, 면역 형광 테스트 (immunofluorescent test: IFT), 면역 조직 염색, 웨스턴 블롯 분석 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 이용 가능한 임의의 다른 적절한 방법이 포함된다. 사용된 검정에 따라, 상기 항원 또는 항체는 효소, 형광단 또는 방사성 동위원소로 라벨링될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994)]; 및 [Frye et al., Oncogen 4: 1153-1157, 1987]을 참조한다.
바람직하게, 야생형 CSFV의 6B8 에피토프에 대해 특이적인 항체는 야생형 CSFV에 감염된 것으로 의심되거나 본 발명에 따른 재조합 CSFV를 포함하는 백신으로 백신 접종된 동물 (예를 들어, 돼지) 유래의 혈청 세포 (예를 들어, 백혈구)에서 또는 분리된 장기 (예를 들어, 편도선, 비장, 신장, 림프절, 회장 원위부)의 냉동 절편에서 CSFV 항원을 검출하는데 사용된다. 이러한 경우, 야생형 CSFV로 감염된 동물의 샘플만이 상기 6B8 에피토프 특이적 항체에 의해 양성 결과를 나타낼 것이다. 대조적으로, 본 발명의 재조합 CSFV를 포함하는 백신으로 백신 접종된 동물의 샘플은 본 발명에 따른 6B8 에피토프 내의 돌연변이로 인해 상기 6B8 에피토프 특이적 항체에 의한 결과를 나타내지 않을 것이다. 대체 테스트에서, CSFV는, 예를 들어, 야생형 CSFV로 감염되거나 감염된 것으로 의심되는 장기 (예를 들어, 동물의 편도선) 또는 혈청 세포 (예를 들어, 백혈구) 또는 백신 접종된 동물로부터 분리되고, 바이러스에 의한 세포의 감염에 적합한 세포주 (예를 들어, SK-6 세포 또는 PK-15 세포)와 함께 인큐베이션된다. 이후에, 상기 복제된 바이러스는 본 발명에 따른 필드 (야생형, 질병 관련) CSFV와 재조합 CSFV 사이를 구별하는 6B8 에피토프 특이적 항체를 사용하여 세포에서 검출된다. 또한, 펩타이드는 비특이적 교차 반응성을 차단하는데 사용될 수 있다. 또한, 야생형 CSFV의 다른 에피토프에 대해 특이적인 항체를 양성 대조군으로서 사용할 수 있다.
보다 바람직하게, ELISA를 사용하는데, 여기서, 상기 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대해 특이적인 항체는 본 발명에 따른 백신으로 백신 접종된 돼지로부터 감염된 돼지들 사이를 구별하기 위해 마이크로웰 분석 플레이트에 가교 결합된다. 상기 가교 결합은 바람직하게는, 예를 들어, 폴리-L-라이신과 같은 앵커 단백질을 통해 수행된다. 이러한 가교 결합을 이용하는 ELISA는 일반적으로 수동 코팅 기술을 이용하는 ELISA와 비교할 때 더 민감하다. 상기 야생형 (질병 관련) CSFV는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대해 특이적인 항체에 결합한다. 상기 야생형 CSFV의 6B8 에피토프에 대해 특이적인 항체에 대한 상기 야생형 CSFV의 결합의 검출은 CSFV에 대해 특이적인 추가의 항체에 의해 수행될 수 있다. 이러한 경우, 감염된 돼지의 샘플만이 상기 6B8 에피토프 특이적 항체에 의해 양성 결과를 나타낼 것이다. 대조적으로, 본 발명에 따른 백신으로 백신 접종된 돼지의 재조합 CSFV는 돌연변이체 6B8 에피토프만을 발현할 것이므로, 마이크로 웰 검정 플레이트에 가교 결합된 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대해 특이적인 항체에 결합하지 않을 것이다. 또한, 펩타이드는 비특이적 교차 반응성을 차단하는데 사용될 수 있다. 또한, 야생형 CSFV의 다른 에피토프에 대해 특이적인 항체를 양성 대조군으로서 사용할 수 있다.
대안으로, 상기 마이크로 웰 검정 플레이트는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대해 특이적인 항체 이외의 다른 CSFV에 대해 특이적인 항체와 가교 결합될 수 있다. 상기 야생형 (질병 관련) CSFV는 가교 결합된 항체에 결합한다. 상기 가교 결합된 항체에 대한 상기 야생형 CSFV의 결합의 검출은 상기 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대해 특이적인 항체에 의해 수행될 수 있다.
상기에서 이미 설명된 바와 같이, 상기 6B8 에피토프는 진화적으로 보존되며, 야생형 CSFV에 대해 특이적이다.
그러므로, 보다 바람직하게, ELISA는 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대해 지시된 항체를 샘플에서 검출하는데 사용된다. 이러한 테스트는 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 펩타이드 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 펩타이드 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)를 포함한다.
이러한 테스트는, 예를 들어, 마이크로 웰 검정 플레이트에 가교 결합된 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)를 함유하는 웰을 포함할 수 있다. 상기 가교 결합은 바람직하게는, 예를 들어, 폴리-L-라이신과 같은 앵커 단백질을 통해 수행된다. 돌연변이체 또는 야생형 6B8 에피토프를 수득하기 위한 발현 시스템은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 대안으로, 상기 6B8 에피토프는 화학적으로 합성될 수 있다. 이와 같은 상기 돌연변이체 또는 야생형 6B8 에피토프를 본 발명에 따른 테스트에서 사용할 수 있지만, 이와 같은 상대적으로 짧은 에피토프 대신에 완전한 E2 단백질을 포함하는 단백질 또는 상기 6B8 에피토프를 포함하는 E2 단백질의 단편을 사용하는 것이 편리할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 특히 상기 에피토프가, 예를 들어, 표준 ELISA 테스트에서 웰의 코팅에 사용될 때, 코팅 단계를 위해 에피토프를 포함하는 보다 큰 단백질을 사용하는 것이 보다 효율적일 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 CSFV를 포함하는 백신으로 백신 접종된 동물은 야생형 6B8 에피토프에 대해 항체를 형성하지 않았다. 그러나, 이러한 동물은 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프에 대해 항체를 형성하였다. 그 결과, 어떠한 항체도 야생형 6B8 에피토프로 코팅된 웰에 결합하지 않는다. 대조적으로, 웰이 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프로 코팅된 경우, 항체는 상기 돌연변이체 6B8 에피토프에 결합한다.
그러나, 야생형 CSFV로 감염된 동물은 CSFV의 야생형 에피토프에 대해 항체를 생성할 것이다. 그러나, 이러한 동물은 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프에 대해 항체를 형성하지 않았다. 그 결과, 어떠한 항체도 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프로 코팅된 웰에 결합하지 않는다. 대조적으로, 웰이 야생형 6B8 에피토프로 코팅된 경우, 항체는 상기 야생형 6B8 에피토프에 결합한다.
본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 (유전적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대한 항체의 결합은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게, 상기 ELISA는 샌드위치형 ELISA이다. 보다 바람직하게, 상기 ELISA는 경쟁적 ELISA이다. 가장 바람직하게, 상기 ELISA는 이중 경쟁적 ELISA이다. 그러나, 상기 상이한 ELISA 기법들은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, ELlSA는 벤스부르트(Wensvoort) G. 등 (Vet. Microbiol. 17(2): 129-140, 1988), 로비올로(Robiolo) B. 등 (J. Virol. Methods. 166(1-2): 21-27, 2010) 및 콜리즌(Colijn), E.O. 등 (Vet. Microbiology 59: 15-25, 1997)에 의해 기술된 바 있다.
"게놈 분석 테스트"라는 용어는 폴리머라아제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응 (reverse transcription polymerase chain reaction: RT-PCR), 실시간 PCR (real-time PCR: r-PCR) 또는 실시간 역전사 PCR (real time reverse transcription PCR: rRT-PCR), 템플렉스-PCR, 핵산 서열 기반 증폭 (nucleic-acid sequence based amplification: NASBA) 및 폴리머라아제와 프라이머로서 특이적 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 등온성 증폭법에 기반한 게놈 분석 방법을 지칭한다. 상기 언급된 증폭 방법들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
바람직하게, 야생형 CSFV로 감염되거나 본 발명의 재조합 CSFV로 백신 접종된 동물을 구별하기 위한 테스트는 CSFV의 RNA 단리 및 역전사에 이어서 cDNA의 증폭에 의해 제공된다. 그 다음, 상기 cDNA는 6B8 에피토프가 온전하고 야생형 CSFV를 나타내는지 여부를 검출하기 위해 서열 분석된다. 이러한 경우, 상기 돼지는 야생형 CSFV로 감염된다. 그러나, 6B8 에피토프의 서열이 본 발명에 따라 치환되는 경우, 상기 동물은 본 발명의 백신으로 백신 접종되었다.
또한, 임의의 실시간 기반 기술을 사용할 때, 프라이머 및/또는 프로브는 6B8 에피토프의 변형된 (본 발명에 따른 돌연변이체) 및/또는 질병 관련 (야생형) 바이러스 뉴클레오타이드 서열을 인식하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 방법들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 면역 테스트는 상기 CSFV E2 단백질의 온전한 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 상기 샘플 중의 상기 CSFV E2 단백질에 결합하는지 여부를 테스트하는 것을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 면역 테스트는 상기 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 상기 샘플 중에 존재하는지 여부를 테스트하는 것, 및/또는 상기 CSFV E2 단백질의 돌연변이된 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 상기 샘플 중에 존재하는지 여부를 테스트하는 것을 포함한다. 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프는 본 출원에서 개시된 바와 같은 6B8 에피토프에 돌연변이(들)를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 면역 테스트는 EIA (효소 면역 검정) 또는 ELISA (효소 결합 면역 흡착 검정)이다. 본 발명의 한 양태에서, 상기 ELISA는 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA 또는 이중 경쟁적 ELISA, 바람직하게는 이중 경쟁적 ELISA이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 게놈 분석 테스트는 PCR (폴리머라아제 연쇄 반응), RT-PCR (역전사 폴리머라아제 연쇄 반응) 또는 실시간 PCR (폴리머라아제 연쇄 반응)이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 샘플은 혈청 샘플이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 동물은 돼지이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 항체는 본 출원에 상기에서 정의된 바와 같은 6B8 에피토프를 특이적으로 인식한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된다. 하나의 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 항체는 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 항체는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
상기 항체는 또한 "6B8" 또는 "6B8 단클론 항체"로 명명될 수 있으며, 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV)의 E2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있으므로, CSFV에 대한 마커 또는 DIVA 백신을 개발하는데 사용될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "항체"는 전장 면역글로불린의 결합
특이성 능력을 보유하는 면역글로불린 분자의 가변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이의 임의의 단편을 비롯하여, 자연 또는 부분 또는 전체 합성으로, 예를 들어, 재조합으로 생산된 면역글로불린 및 면역글로불린 단편을 지칭한다. 따라서, 항체는 면역글로불린 항원 결합 도메인 (항체 결합 부위)과 상동 또는 실질적으로 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 항체에는 항체 단편을 포함한다. 따라서, 본 출원에서 사용되는 항체라는 용어는 합성 항체, 재조합 생산 항체, 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체), 사람 항체, 비-사람 항체, 사람화 항체, 키메라 항체, 인트라바디 및 항체 단편을 포함한다. 본 출원에서 제공되는 항체는 임의의 면역글로불린 유형 (예를 들어, IgG, IgM, IgD, IgE IgA 및 IgY), 임의의 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 클래스 (예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)의 구성원을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "가변 영역"이라는 용어는 당해 분야 및 이하에서 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"로서; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"로서; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"으로서; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로서 각각 지칭되는 4개의 "프레임워크 영역"으로 필수적으로 이루어지는 면역글로불린 도메인을 의미하며; 상기 프레임워크 영역은 당해 분야 및 이하에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"로서; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"로서; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로서 각각 지칭되는 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 중단된다. 따라서, 면역글로불린 가변 영역의 일반적인 구조 또는 서열은 다음과 같이 표시될 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. VH 또는 VH는 중쇄 가변 영역을 지칭하며, VL 또는 VL은 경쇄 가변 영역을 지칭한다. 유사하게, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 지칭한다. VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 항체의 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은, 전장 미만이지만 항원에 결합하는 항체의 가변 영역의 적어도 일부 (예를 들어, 하나 이상의 CDR 및/또는 하나 이상의 항체 결합 부위)를 함유하므로, 결합 특이성, 및 전장 항체의 특이적 결합 능력의 적어도 일부를 보유하는 전장 항체의 임의의 부분을 지칭한다. 따라서, 항원 결합 단편은 항체 단편이 유래된 항체와 동일한 항원에 결합하는 항원 결합 부분을 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 항체 단편은 전장 항체의 효소 처리 뿐만 아니라 합성으로, 예를 들어, 재조합으로 생산된 항체 유도체를 포함한다. 항체 단편은 항체 중에 포함된다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 단일 쇄 Fv(scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편 및 기타 단편, 예를 들어, 변형된 단편이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다 (예를 들어, 문헌 [Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov] 참조). 상기 단편은, 예를 들어, 이황화 가교 및/또는 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 다중 쇄를 포함할 수 있다. 항원 결합 단편은, (예를 들어, 상응하는 영역을 대체함으로써) 항체 프레임워크 내로 삽입될 때, 항원에 면역 특이적으로 결합하는 (즉, 적어도 또는 적어도 약 107~108 M-1의 Ka를 나타내는) 항체를 초래하는 임의의 항체 단편을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 또한 상기 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 CSFV의 돌연변이체 E2 단백질을 제공한다. 상기 6B8 에피토프는 이미 상기에서 정의되어 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 24/25번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 24/25번 위치에서의 아미노산은 R/D 또는 K/D로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환된다.
하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환된다. 하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환되고, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환된다.
하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다. 하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환되고, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다. 하나의 양태에서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산은 R 또는 K로 치환되고, 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산은 D로 치환되고, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산은 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환된다.
하나의 양태에서, 상기 돌연변이체 E2 단백질은 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다.
하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환이다.
하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환 및 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환이다.
하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다.
하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R로의 치환, 상기 E2 단백질의 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환이다.
본 발명의 돌연변이체 E2 단백질은, 예를 들어, 이중 경쟁적 ELISA를 통해 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기에 특히 적합하다.
하나의 양태에서, 본 발명의 DIVA 방법에 사용하기 위한 CSFV의 돌연변이체 E2 단백질은 전장 E2 단백질의 절단물일 수 있고, 예를 들어, 막 관통 영역이 결실될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CSFV로 감염된 동물을 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 발명의 돌연변이체 E2 단백질, 및/또는 본 출원에서 정의된 바와 같은 6B8 에피토프를 포함하는 CSFV의 야생형 E2 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 사용 설명서를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 약독화된 CSFV를 제공하며, 여기서, 상기 약독화된 CSFV는 QZ07 필드 변종 또는 GD18 필드 변종 또는 C 변종으로부터 유래한다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 Erns 단백질에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
상기 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이는 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및/또는 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실일 수 있다. 상기 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이는 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실일 수 있다. 상기 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이는 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실일 수 있다. 상기 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이는 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실일 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 Npro 단백질에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
상기 Npro 단백질에서의 이러한 돌연변이는 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실이다. 다른 변형이 또한 약독화를 위해 도입될 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 Erns 단백질의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 Npro 단백질의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 QZ07 필드 변종으로부터 유래하며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산 결실을 포함한다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 QZ07 필드 변종으로부터 유래하며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실을 포함한다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 QZ07 필드 변종으로부터 유래하며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실을 포함한다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 QZ07 필드 변종으로부터 유래하며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실, Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 결실을 갖는다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 GD18 필드 변종으로부터 유래하며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실을 포함한다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 GD18 필드 변종으로부터 유래하며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실을 포함한다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 약독화된 CSFV는 GD18 필드 변종으로부터 유래하며, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실, Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서의 아미노산 결실 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 결실을 갖는다. 바람직하게, 이러한 약독화된 CSFV는 본 출원에서 개시된 바와 같은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
다음 항목들은 또한 본 출원에서 기재되며 본 발명의 개시 내용의 일부이다:
항목 1. E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV)로서, 비변형된 6B8 에피토프가 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는, 재조합 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV).
항목 2. 항목 1에 있어서, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이가 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 단클론 항체의 결합의 특이적 억제를 초래하는, 재조합 CSFV.
항목 3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체가,
i) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나,
ii) 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
iii) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나,
iv) 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 재조합 CSFV.
항목 4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 상기 E2 단백질의 14번 위치, 22번 위치, 24번 위치 및/또는 24/25번 위치에서의 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 재조합 CSFV.
항목 5. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 상기 E2 단백질의 S14, G22, E24 및/또는 E24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의되거나, 적어도 상기 E2 단백질의 S14, G22, G24 및/또는 G24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 재조합 CSFV.
항목 6. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 STNEIGPLGAEG 또는 STDEIGLLGAGG 아미노산 서열에 의해 정의되는, 재조합 CSFV.
항목 7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 24/25번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV.
항목 8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산이 R 또는 K로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 24/25번 위치에서의 아미노산이 R/D 또는 K/D로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산이 K, Q 또는 R로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산이 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환되는, 재조합 CSFV.
항목 9. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV.
항목 10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환이 서열 번호 13~14 및 31~34 중 어느 하나의 돌연변이된 6B8 에피토프 서열을 초래하는, 재조합 CSFV.
항목 11. 항목 1 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 약독화되어 있는, 재조합 CSFV.
항목 12. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 Erns 단백질에서 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 Npro 단백질에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이가 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실 및/또는 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실이고, Npro 단백질에서의 상기 돌연변이가 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실인, 재조합 CSFV.
항목 13. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 C 변종 또는 QZ07, GD191 또는 GD18 필드 변종으로부터 유래되는, 재조합 CSFV.
항목 14. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 QZ07 필드 변종으로부터 유래되고,
(i) Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, 및
(ii) 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함하는, 재조합 CSFV.
항목 15. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 QZ07 필드 변종으로부터 유래되고,
(i) Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, 및
(ii) 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함하는, 재조합 CSFV.
항목 16. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고,
(i) Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 결실, 및
(ii) 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함하는, 재조합 CSFV.
항목 17. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고,
(i) Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, 및
(ii) 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함하는, 재조합 CSFV.
항목 18. 항목 1 내지 17 중 어느 한 항목에 따른 재조합 CSFV를 코딩하는 단리된 핵산.
항목 19. 항목 18의 핵산을 포함하는 벡터.
항목 20. 항목 1 내지 16 중 어느 한 항목에 따른 재조합 CSFV, 항목 17에 따른 재조합 CSFV를 코딩하는 단리된 핵산, 또는 제19항에 따른 벡터를 포함하는 면역원성 조성물.
항목 21. 항목 20에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 마커 백신 또는 DIVA (감염된 동물과 백신 접종된 동물의 구별) 백신인, 면역원성 조성물.
항목 22. 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 항목 20 또는 21에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 방법이 항목 20 또는 21에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물.
항목 23. 항목 20 또는 21에 있어서, 항목 20 또는 21에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 돼지인, 면역원성 조성물.
항목 24. 항목 20 또는 21에 있어서, 항목 20 또는 21에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 새끼 돼지인, 면역원성 조성물.
항목 25. 항목 20 또는 21에 있어서, 항목 20 또는 21에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 1 내지 4 주령의 새끼 돼지인, 면역원성 조성물.
항목 26. 항목 20 또는 21에 있어서, 항목 20 또는 21에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 암퇘지인, 면역원성 조성물.
항목 27. 항목 20 또는 21에 있어서, 항목 20 또는 21에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 임신 암퇘지인, 면역원성 조성물.
항목 28. 항목 20 또는 21에 있어서, 항목 20 또는 21에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 면역원성 조성물이 1회만 투여되는, 면역원성 조성물.
항목 29. 항목 20 또는 21에 있어서, 항목 20 또는 21에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 면역원성 조성물이 상기 동물에게 1회만 투여되고 상기 면역원성 조성물의 상기 단일 투여 후에 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는데 효과적인, 면역원성 조성물.
항목 30. 항목 20 또는 21에 있어서, 항목 20 또는 21에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 면역원성 조성물이 1회 또는 수회 투여되는, 면역원성 조성물.
항목 31. 항목 20 또는 21에 있어서, 항목 20 또는 21에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 면역원성 조성물이 상기 동물에게 1회 또는 수회 투여되고 상기 면역원성 조성물의 상기 단일 또는 다중 투여 후에 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는데 효과적인, 면역원성 조성물.
항목 32. 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 항목 20 또는 21에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
항목 33. 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이를 CSFV에 도입하는 단계를 포함하는, CSFV 백신을 마킹하는 방법.
항목 34. 항목 33에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체가,
i) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나,
ii) 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
iii) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나,
iv) 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 방법.
항목 35. 항목 24 또는 25에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 상기 E2 단백질의 14번 위치, 22번 위치, 24번 위치 및/또는 24/25번 위치에서의 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 예를 들어, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 상기 E2 단백질의 S14, G22, E24 및/또는 E24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의되거나, 적어도 상기 E2 단백질의 S14, G22, G24 및/또는 G24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 방법.
항목 36. 항목 33 또는 34에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 STNEIGPLGAEG 또는 STDEIGLLGAGG 아미노산 서열에 의해 정의되는, 방법.
항목 37. 항목 33 또는 34에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 24/25번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환인, 방법.
항목 38. 항목 33 또는 34에 있어서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산이 R 또는 K로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산이 R 또는 K로 치환되고 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산이 각각 D로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산이 K, Q 또는 R로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산이 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환되는, 방법.
항목 39. 항목 33 또는 34에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환인, 방법.
항목 40. 항목 33 또는 34에 있어서, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 돌연변이가 서열 번호 13~14 및 31~34 중 어느 하나의 돌연변이된 6B8 에피토프 서열을 초래하는, 방법.
항목 41. 항목 33 또는 34에 있어서, 상기 CSFV 백신이 약독화된 백신인, 방법.
항목 42. 항목 33 또는 34에 있어서, 상기 CSFV가 C 변종 또는 QZ07 또는 GD18 필드 변종으로부터 유래되는, 방법.
항목 43. 하기 단계를 포함하는, CSFV로 감염된 동물을 항목 20 또는 21의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하는 방법:
a) 샘플을 수득하는 단계, 및
b) 상기 샘플을 면역 테스트로 테스트하는 단계.
항목 44. 항목 43에 있어서, 상기 면역 테스트가, 상기 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 상기 샘플 중의 상기 CSFV E2 단백질에 결합할 수 있는지 여부를 테스트하는 것을 포함하는, 방법.
항목 45. 항목 43에 있어서, 상기 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가,
i) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나,
ii) 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
iii) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나,
iv) 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 재조합 CSFV.
항목 46. 항목 43에 있어서, 상기 면역 테스트가, 상기 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 상기 샘플 중에 존재하는지 여부를 테스트하는 것, 및/또는 상기 CSFV E2 단백질의 돌연변이된 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 상기 샘플 중에 존재하는지 여부를 테스트하는 것을 포함하는, 방법.
항목 47. 항목 43 내지 46 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역 테스트가 효소 면역 검정 (EIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 검정 (ELISA), 바람직하게는 이중 경쟁적 ELISA인, 방법.
항목 48. 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나, 상기 항체가 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나, 상기 항체가 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나, 상기 항체가 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
항목 49. CSFV로 감염된 동물을 항목 39의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항목 20 또는 21의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하기 위한 키트.
항목 50. 약독화된 재조합 CSFV로서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 Erns 단백질에서 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 Npro 단백질에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이가 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실 및/또는 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실이고, Npro 단백질에서의 상기 돌연변이가 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실인, 약독화된 재조합 CSFV.
항목 51. 항목 50에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 C 변종 또는 QZ07 또는 GD18 필드 변종으로부터 유래되는, 약독화된 재조합 CSFV.
항목 52. 항목 51에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 QZ07 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실을 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV.
항목 53. 항목 51에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 QZ07 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산 결실 및 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산 결실을 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV.
항목 54. 항목 51에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산 결실 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 결실을 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV.
항목 55. 항목 51에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산 결실 및 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산 결실을 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV.
항목 56. 항목 51 내지 55 중 어느 한 항목에 따른 약독화된 재조합 CSFV를 코딩하는 단리된 핵산.
항목 57. 항목 56의 핵산을 포함하는 벡터.
항목 58. 항목 50 내지 55 중 어느 한 항목에 따른 약독화된 재조합 CSFV, 항목 56에 따른 약독화된 재조합 CSFV를 코딩하는 단리된 핵산, 또는 항목 57에 따른 벡터를 포함하는 면역원성 조성물.
항목 59. 항목 58에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 방법이 항목 58에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물.
항목 60. 항목 58 또는 59에 있어서, 항목 58 또는 59에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 돼지인, 면역원성 조성물.
항목 61. 항목 58 또는 59에 있어서, 항목 58 또는 59에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 새끼 돼지인, 면역원성 조성물.
항목 62. 항목 58 또는 59에 있어서, 항목 58 또는 59에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 1 내지 4 주령의 새끼 돼지인, 면역원성 조성물.
항목 63. 항목 58 또는 59에 있어서, 항목 58 또는 59에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 암퇘지인, 면역원성 조성물.
항목 64. 항목 58 또는 59에 있어서, 항목 58 또는 59에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 동물이 임신 암퇘지인, 면역원성 조성물.
항목 65. 항목 58 또는 59에 있어서, 항목 58 또는 59에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 면역원성 조성물이 1회만 투여되는, 면역원성 조성물.
항목 66. 항목 58 또는 59에 있어서, 항목 58 또는 59에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 면역원성 조성물이 상기 동물에게 1회만 투여되고 상기 면역원성 조성물의 상기 단일 투여 후에 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는데 효과적인, 면역원성 조성물.
항목 67. 항목 58 또는 59에 있어서, 항목 58 또는 59에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 면역원성 조성물이 1회 또는 수회 투여되는, 면역원성 조성물.
항목 68. 항목 58 또는 59에 있어서, 항목 58 또는 59에 따른 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 면역원성 조성물이 상기 동물에게 1회 또는 수회 투여되고 상기 면역원성 조성물의 상기 단일 또는 다중 투여 후에 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는데 효과적인, 면역원성 조성물.
항목 69. 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 항목 58에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
항목 70. 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 항목 59에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
항목 71. Erns 단백질에서의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 Npro 단백질에서의 적어도 하나의 돌연변이를 CSFV에 도입하는 단계를 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV 백신을 제조하는 방법으로서, 바람직하게는 상기 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이가 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실 및/또는 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실이고, Npro 단백질에서의 상기 돌연변이가 처음 4개의 아미노산 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실인, 방법.
항목 72. 항목 71에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 C 변종 또는 QZ07 또는 GD18 필드 변종으로부터 유래되는, 방법.
항목 73. 항목 72에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 QZ07로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산이 결실되는, 방법.
항목 74. 항목 72에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 QZ07로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 및 171번 아미노산 위치에서의 아미노산이 결실되는, 방법.
항목 75. 항목 72에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 아미노산이 결실되는, 방법.
항목 76. 항목 72에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 및 171번 아미노산 위치에서의 아미노산이 결실되는, 방법.
실시예
후속 실시예는 예시된 방식으로 본 발명을 추가로 설명한다. 본 발명은 하기에서 기재되는 바와 같은 임의의 실시예에 한정되지 않는 것으로 이해된다. 당해 분야의 통상의 기술자는 이러한 실시예의 성능, 결과 및 발견이 본 발명의 일반적인 설명을 고려하여 보다 넓은 의미로 조정되고 적용될 수 있다는 것을 이해한다.
실시예 1: Npro 및/또는 Erns에서의 결실에 의한 CSFV 약독화
PK/WRL 세포 배양에 적응되고 낮은, 중간 및 높은 병독성의 변종을 나타내는 것으로 결정된 CSFV, QZ07, GD18 및 GD191의 유전자군 2.1의 3개 필드 분리주를 사용하여 GMO 약독화를 위한 감염성 클론을 작제하였다. QZ07 및 GD18 필드 분리주의 전체 게놈 서열은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 나타나 있다.
간단히 말하자면, 전체 12 kb 게놈의 5'-말단 2 kb 단편을 먼저 pACYC에 클로닝하고, 이러한 플랫폼을 통해 결실 (Npro 단백질의 5번 내지 168번 위치의 Npro 유전자 결실 및 79번 위치의 Erns 단백질에서의 아미노산 (히스티딘) 결실)를 수행하였다. 그 다음, 전체 12 kb 게놈의 다른 부분을 커버하는 2개의 DNA 분절 (게놈의 3' 말단에 2 kb 위치)을 각각의 필드 분리주의 cDNA로부터 증폭시키고, BAC 플라스미드 pBeloBAC에 삽입하였다. RED 재조합 방법을 통해 CSFV 감염성 클론을 조립하기 위해 2개의 추가의 분절과 함께 CSFV 게놈의 돌연변이된 처음 2kb를 pBeloBAC에 삽입하였다. 생성된 감염성 클론은 GD18-ddNpro-ErnsH, GD191-ddNpro-ErnsH, QZ07-sdErnsH 및 QZ07-ddNpro-ErnsH로 명명되었다. QZ07-sdErnsH는 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 단일 히스티딘 결실만을 포함한다. 결실을 갖는 생 바이러스를 3개의 필드 분리주의 감염성 클론으로부터 회수하였다.
회수된 생 바이러스의 10회 계대 후, 4개의 P10 바이러스의 구조 서열을 증폭시키고 서열 분석하였다. 구체적으로, QIAamp 바이러스 키트를 사용하여 p10 바이러스 스톡으로부터 바이러스 RNA를 추출한 다음, SuperScript III Platinum 1단계 RT-PCR 키트를 사용하여 구조 유전자(1~4 kb)를 증폭시켰다. 그 다음, 증폭된 DNA를 정제하고, 서열 분석하고, 정렬 후 모체 바이러스 서열 (야생형)과 비교하였다. 서열 분석 결과는 상기 결실이 10회 계대 후에도 안정한 것으로 나타났다.
계대 배양된 각각의 바이러스의 피크 역가를 알아보기 위해, 0.01의 MOI에서 감염 후 24 시간 마다 샘플링하여 각각의 바이러스의 성장 곡선을 플로팅하였다. 구체적으로, PK/WRL 세포를 포함하는 T25 플라스크를 0.001의 MOI에서 각각의 P10 스톡 바이러스로 감염시켰다. 1 ml의 MEM 감염 배지에 희석된 상응하는 양의 바이러스로 상기 감염을 수행하였다. 1 시간 인큐베이션 후, 상기 감염 배지를 폐기하고, 상기 플라스크를 5 ml의 새로운 배지로 보충하였다. 감염 후 최대 120 시간까지 24 시간 간격으로 200 μl의 샘플을 채취하였다. 그 다음, 상기 샘플을 적정하여 성장 곡선을 도 1에서 도시된 바와 같이 플로팅하였다. 상기 데이터는 피크 역가가 10회 계대 후 목적하는 기준을 충족한다는 것을 시사하였다.
엄격한 안전성 고려 (복귀 돌연변이 방지)를 위해서만, 병독성이 높은 GD191도 또한 유망한 후보이지만, 추가의 분석에서 이를 제외하였다. 또한, Npro에서의 결실을 QZ07로부터 제외하였다. 그리고, 171번 위치에서 Erns 단백질의 추가의 아미노산 (시스테인) 결실을 GD18 또는 QZ07에 도입하여, 예를 들어, 임신 암퇘지에 사용하기 위한 안전성 프로파일을 증가시켰다.
마지막으로, 다음 4개의 후보는 약독화를 위한 돌연변이로 이해된다: QZ07-sdErnsH, QZ07-ddErnsHC, GD18-ddNproErnsH 및 GD18-ddErnsHC.
Figure pct00001
실시예 2: DIVA 부위의 식별 및 통합
목적하는 새로운 백신의 핵심 기능은 백신 접종된 동물을 감염된 동물 (DIVA)과 구별하는 능력이다. DIVA 특징은 전통적인 가토화 C 변종의 필수적인 개선 사항일 것이며 중요한 기술적 이점을 갖는다. DIVA 특징을 도입하는 전략은 면역 우세한 E2 단백질 표면에서 하나 이상의 중요한 에피토프를 변경하고 ELISA를 사용하여 백신 접종의 표시로서 야생형 에피토프를 인식하는 항체의 부재를 입증하는 것이다 (음성 DIVA).
이러한 전략을 실시하기 위해, 본 발명자들은 강력한 중화 마우스 mAb 6B8을 선택하였다. 단클론 항체 6B8을 생산하는 하이브리도마는 저장 대학교로부터 입수되었으며, 2018년 6월 13일자로 중화인민공화국 우한 430072 우한 대학교 차이나 센터 포 타입 컬쳐 컬렉션 (CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION: CCTCC)에 기탁 번호 CCTCC C2018120으로 기탁되었다. 단클론 항체 6B8의 서열 분석에 따르면, 이것은 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 항체의 CDR을 Kabat 방법과 같은 당해 분야에 공지된 다양한 방법으로 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, mAb 6B8은 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열의 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열의 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열의 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열의 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열의 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열의 VL CDR3을 포함한다.
1. 6B8 mAb의 특성화
mAb 6B8이 대부분의 CSFV에 사용될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 대조군으로서의 2개의 BVDV와 함께 그룹 1 (Shimen 변종 및 C 변종 포함) 및 그룹 2 (QZ07 및 GD18 포함)의 CSFV와 같은 다양한 CSF 바이러스와 mAb 6B8의 결합을 테스트하였다. 그 결과는 도 2에 도시되어 있다. 유전자형 그룹 2의 추가의 8개 CSFV 필드 분리주도 또한 6B8 mAb에 대해 양성으로서 테스트하였다 (데이터는 도시되지 않음). 이들 데이터는 6B8이 대부분의 CSF 바이러스에 존재하는 보존된 에피토프를 인식하지만 BVDV 바이러스와 반응하지 않는다는 것을 나타낸다.
2. 6B8 결합에 대한 중요한 아미노산의 식별
mAb 6B8의 존재하에 PK/WRL 세포 배양에서 C 변종 바이러스의 연속 계대 후, 회피 돌연변이체가 출현하였으며 중화 농도의 6B8 항체의 존재하에도 성장할 수 있다. 이러한 회피 돌연변이체의 4개 클론이 수득되었으며, 이들은 모두 6B8 결합을 회피하였다. 이들의 E2 유전자를 서열 분석하였으며, 서열 분석 결과는 2개의 코돈에서 2개의 뉴클레오타이드 돌연변이 (GGAGGT에서 AGAGAT로)를 나타냈다. 이러한 변화는 연속 위치 24 및 25 (Gly-Gly에서 Arg-Asp로, 또는 GG에서 RD로)에서 2개의 아미노산 돌연변이로 번역되었다.
그 다음, E2 서열 정렬 (QZ07, GD18, GD191 및 C 변종)을 BVDV 및 기타 페스티바이러스 E2로 수행하여 6B8 결합에 대한 다른 잠재적인 중요한 아미노산을 식별하였다 (도 3). 이러한 접근법에 의해, 14번 위치와 22번 위치의 아미노산과 같은 추가의 잠재적인 중요한 아미노산을 식별하였다.
이러한 모든 잠재적 돌연변이 (S14K, G22A, E24R/G25D)를 E2 발현 벡터에 개별적으로 도입하여 6B8 결합에 대한 효과를 테스트하였다. E2 유전자를 pCI-neo-Tag 벡터 (Promega, cat#E1841)에 클로닝하여 발현 벡터를 생성하였다. E2 단백질의 올바른 발현을 확인한 후, 모든 돌연변이를 E2 발현 벡터에 도입하였다. 그 다음, Lipofectamine3000 (Invitrogen, cat#L3000015)을 사용하여 이러한 벡터를 24웰 플레이트 중의 PK/WRL 세포에 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 24 시간에, 상기 세포를 4% 포름알데하이드로 고정한 다음, 0.1% Triton X-100으로 처리하였다. 그 다음, 면역 형광 검정 (immunoinfluoscent assay: IFA) 테스트에서 세포를 mAb 6B8 또는 CSFV에 대한 토끼 다클론성 항체 (변형된 6B8 에피토프를 갖는 CSFV를 검출하기 위해 양성 대조군으로서 사용) 및 상응하는 Alexa Fluor®488 컨쥬게이트된 이차 항체 (Invitrogen cat#21206)로 염색하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 현미경 검사는 S14K, G22A, E24R/G25D 돌연변이가 6B8 결합을 제거하는데 중요하다는 것을 나타냈다. 본 발명자들은 또한 6B8 항체와의 결합에 대한 14, 22, 24 및 25번 위치에서의 다른 돌연변이의 효과를 개별적으로 테스트하였다. 도 4b에 도시된 바와 같이, S14Q, S14R 및 G22R 돌연변이는 6B8의 결합을 완전히 제거하는 반면, G22E 및 G22Q는 6B8의 결합에 부분적으로 영향을 미치며, 14 및 22번 위치가 6B8 결합에 중요하다는 것을 추가로 나타낸다. 도 4C에 도시된 바와 같이, 단일 돌연변이 G24K (C 변종의 경우)는 6B8의 결합을 완전히 제거하였는데, 이는 또한 24번 위치가 6B8 결합에 중요하다는 것을 뒷받침한다. G25S 단독은 6B8의 결합을 제거할 수 없다. 그러나, 25번 위치에 Gly의 Asp로의 돌연변이가 24번 위치의 돌연변이와 함께 나타나므로, 2개의 돌연변이를 하나의 돌연변이 (24/25 돌연변이)로 간주할 수 있다.
상기 결과는 14, 22, 24 및/또는 24/25번 위치의 돌연변이가 DIVA에 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 상기 결과는 또한 돌연변이된 E2 단백질이 CSFV에 대한 다클론 항체에 의해 여전히 인식될 수 있기 때문에 6B8 에피토프의 돌연변이가 E2 단백질의 전체 면역원성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 시사한다.
그 다음, 이러한 6B8 에피토프 돌연변이를 감염성 클론 GD18-ddNpro-ErnsH에 도입하여 3개의 감염성 클론 (GD18-ddNpro-ErnsH-S14K, GD18-ddNpro-ErnsH-G22A, GD18-ddNpro-ErnsH-EG24/25RD)을 생성하였다 이들 3개의 감염성 클론으로부터 생 바이러스를 회수하고, IFA에 의해 mAb 6B8 또는 다클론 혈청 항체에 대한 이들의 결합 특성을 확인하였다 (도 5). 이들 바이러스의 특성화는 이들 돌연변이가 10회 계대에 걸쳐 안정하고 각각의 바이러스의 피크 역가가 모체 GD18-ddNpro-ErnsH 바이러스의 역가와 유사하다는 것을 나타냈다 (도 6). 결과적으로, S14K, G22A, E24R/G25D 돌연변이가 DIVA 발생에 적절하였다.
3. DIVA 후보 바이러스의 작제
성공 가능성을 높이기 위해, 잠재적 DIVA 돌연변이의 조합을 실시예 1의 4개의 이중 결실 또는 단일 결실 감염성 클론에 도입하여 다음 4개의 최종 DIVA 감염성 클론을 생성하였다: QZ07-sdErnsH-KARD, QZ07-ddErnsHC-KARD, GD18-ddNproErnsH-KARD 및 GD18-ddErnsHC-KARD (KARD는 S14 K , G22 A 및 E24 R /G25 D 돌연변이를 의미함). 4개의 감염성 클론으로부터 생 바이러스를 회수하고, 계대하고, IFA를 통해 특성화하였다 (도 7). 상기 결과는 4개의 아미노산 돌연변이 KARD를 포함하는 후보가 시험관내에서 감염성이고 6B8 mAb와 반응하지 않는다는 것을 나타낸다. RD (E24 R /G25 D ), KRD (S14 K 및 E24 R /G25 D )와 같은 DIVA 돌연변이의 다른 조합도 또한 실시예 1의 4개의 이중 결실 또는 단일 결실 감염성 클론에 도입하였고, 유사한 결과를 나타냈다.
실시예 3: 4개의 후보 재조합 바이러스의 안전성 검증
본 실시예의 목적은 DIVA 돌연변이를 갖는 4개의 CSFV 약독화된 바이러스, 즉, QZ07-sdErnsH-KARD, QZ07-ddErnsHC-KRD, GD18-ddNproErnsH-KRD 및 GD18-ddErnsHC-KARD의 안전성을 3 주령의 새끼 돼지에서 평가하는 것이었다.
총 29 마리의 새끼 돼지를 5개 그룹에 배정하였다. 5 마리의 새끼 돼지를 음성 대조군 (그룹 5)으로 사용하는 반면, 나머지 24 마리의 새끼 돼지를 그룹 당 6 마리의 새끼 돼지로 4개의 그룹 (그룹 1, 2, 3 및 4)에 무작위로 나누었다. 0 일차에, 표 2에 표시된 바와 같이, 그룹 1, 2, 3 및 4의 동물의 좌측 목에 QZ07-sdErnsH-KARD, QZ07-ddErnsHC-KRD, GD18-ddNproErnsH-KRD 및 GD18-ddErnsHC-KARD을 새끼 돼지 당 1 mL (5 log TCID50/mL)로 각각 접종하였다. 모든 새끼 돼지는 임상적으로 건강했고 CSFV 및 PRRSV 항체가 없었고 0일째에 BVDV, PRV를 포함한 항원이 없었습니다. 모든 동물은 접종 당시에 건강하였다.
Figure pct00002
연구 절차
체온
모든 동물에 대해 체온을 D-4에서 D21까지 매일 2회 측정하였다. 체온을 섭씨 단위로 기록하였다. D0 전 4일 및 백신 접종 전 D0의 평균 체온 (총 9개 측정 지점)을 각각의 새끼 돼지에 대한 정상 체온으로 설정하였다. 다음 온도 설명을 정상으로 간주한다: a) 온도가 0.5°C 이내에서 상승하고; b) 온도가 4개 이하의 연속 시점 동안 0.5~1°C 상승하고; c) 온도가 2개 이하의 연속 시점 동안 한 동물에 대해 1~1.5°C 상승한다. D0의 체온을 임상 시험용 동물 제품 (Investigational Veterinary Products: IVP; 즉, 특정량으로 테스트될 재조합 바이러스) 투여 전과 IVP 투여 후 4 시간에 측정하였다. D21의 체온을 부검 전에 1회만 측정하였다.
임상 관찰
모든 동물에 대해 임상 관찰을 D4에서 D21까지 매일 2회 수행하였다. 임상 관찰은 표 3에 나타낸 바와 같은 점수 시스템을 사용하여 활기, 식욕 및 기타 이상에 대한 평가로 이루어진다. 0은 임상 징후가 없음을 나타내며, 증가된 임상 점수는 임상 징후의 중증도의 증가 정도를 나타낸다. 개별 동물이 3개의 연속 관찰 지점에서 1 초과의 임상 점수를 나타내는 경우, CSF 관련 임상 징후로 간주된다. D0의 임상 관찰을 IVP 투여 전 및 IVP 투여 후 4 시간에 수행하였다. D21의 임상 관찰을 부검 전에 1회만 수행하였다.
Figure pct00003
주사 부위 반응
모든 동물에 대해 주사 부위 반응을 D0에서 D21까지 매일 2회 평가하였다. 주사 부위 반응은 표 4에 나타낸 바와 같은 점수 시스템를 사용하여 발적, 부기, 열 및 통증의 평가로 이루어진다. 0은 주사 부위 반응 없음을 나타내며, 증가된 점수는 주사 부위 반응의 증가 정도를 나타낸다. 주사 부위 반응의 총점이 3개의 연속 관찰 지점에서 1 초과를 나타내는 경우, 백신 관련 주사 부위 반응으로 간주된다. D0의 주사 부위 반응을 IVP 투여 전 및 IVP 투여 후 4 시간에 수행하였다. D21의 주사 부위 반응을 부검 전에 1회만 수행하였다.
Figure pct00004
백혈구 수
D0, 3, 5, 7, 10 및 21에 각각의 새끼 돼지로부터 대략 1 mL의 혈액 샘플을 수집하였다. 적합한 바늘과 주사기를 사용하여 샘플을 수집하고, EDTA 코팅된 튜브로 옮겼다. 혈액 샘플 유래의 백혈구를 Exigo-61812 자동 혈액 기기로 즉시 분석하였다. 각각의 샘플을 2회 테스트하였다.
부검
모든 생존 새끼 돼지를 인도적으로 사망시키고, D21에 부검하였다. 주요 표적 조직/장기, 예를 들어, 편도선, 신장, 비장, 림프절, 회장/직장 등을 CSF 관련 병원성에 대해 검사하였다. 가능한 미래 평가를 위해 임상 징후 관련된 CSF 관련 육안 병소를 포르말린에 고정하였다 (그룹 1~4만). CSFV 바이러스 단리를 위해 각각의 새끼 돼지로부터 새로운 편도선을 수집하였다.
비장 경색, 직장 및 회장의 장 점막 궤양, 신장, 림프절, 점상 피하 조직 및 방광 점막의 출혈은 CSFV 감염의 육안적 병리학적 소견이다. 전술한 3개의 소견을 갖는 돼지는 CSFV에 의핸 감염된 것으로 간주되었다. 전술한 소견의 부재는 CSFV에 의핸 감염되지 않은 것으로 간주되었다. CSFV 바이러스가 양성으로 단리된 경우, 전술한 1개 또는 2개의 소견을 갖는 동물은 CSFV에 의해 양성 감염된 것으로 간주되었다.
바이러스 단리
D0, 3, 5, 7, 10 및 21에 각각의 새끼 돼지로부터 비강 면봉을 수집하였다. 멸균 면봉을 비강에 삽입하고 부드럽게 회전하여 분비물을 수집하고, 또 다른 비강에 대해 샘플 절차를 반복하였다. 수집 후, 2개의 비강 면봉을 보관 완충액 (10% FBS 및 1% 항생제를 함유하는 4 mL MEM)을 함유하는 멸균 튜브에 풀링하였다. 각각의 비강 면봉 샘플을 3개의 튜브에 600 μl/튜브로 분취하였다. CSFV 바이러스 단리를 위해 바이러스 단리를 위한 모든 샘플을 -40°C 미만에서 보관하였다.
편도선 균질화를 위해, 편도선 조직을 0.4~0.5 g의 작은 조각으로 절단하고, 막자사발과 막자를 사용하여 소량의 세포 배양 배지 중에서 균질한 페이스트로 분쇄하였다. 대안으로, 적절한 파쇄기 또는 자동 균질화기를 사용하고, Hank의 최소 필수 배지 (minimal essential medium: MEM)를 첨가하여 10% (w/v) 현탁액을 제조한 후, 3회 동안 동결-해동하여 세포를 용해시켰다. 마지막으로, 상기 샘플을 4°C에서 9000 g의 속도로 15분 동안 원심 분리하고, 0.45 μm 필터를 사용하여 정화된 균질액을 여과하였다.
비강 면봉 샘플의 경우, 바이러스 수송 배지 (viral transport medium: VTM) 중의 면봉을 VTM으로부터 제거하였다. 냉동 면봉 샘플을 먼저 해동해야 한다. 상기 면봉을 유체 중에서 부드럽게 와동시키거나 소용돌이치게 하고, 튜브 측면에 닿게 하였다. 상기 현탁액을 새로운 원심 분리관으로 옮기고, 4°C에서 8,000X g의 속도로 10분 동안 원심 분리하고, 추가의 접종을 위해 상청액을 취하였다. 샘플이 오염된 경우, 주사기 필터 (0.45 μm 또는/및 0.22 μm)를 사용하여 멸균 여과를 수행하였다.
예정된 검정 전 24 시간에 48웰 평저 마이크로플레이트를 설치하였다. PK/WRL 세포를 웰 당 500 μL로 0.7~1.0 X 105/mL의 농도로 설치하였다. 하루 동안 인큐베이션 후, 웰 중의 배양 배지를 피펫으로 폐기하고, 세포 단층이 건조되는 것을 방지하기 위해 잔류량의 MEM만을 남겼다. 200 μL의 테스트 샘플과 양성 대조군을 즉시 PK/WRL 단층에 이중으로 접종하고, 37°C에서 1~2 시간 동안 흡착시켰다. 접종물을 피펫으로 폐기하고, 50 X Pen Strep (Life-tech, Cat# 15140-122) 및 250 X 겐타마이신/암포테리신 (Invitrogen, Cat# R01510)을 함유하는 새로운 성장 배지를 웰 당 500 μL로 웰에 분배하였다. 상기 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
감수성을 향상시키기 위해, 바이러스 단리를 하기에서 기재되는 바와 같이 1회 계대에 걸쳐 수행하였다. 상기 마이크로플레이트를 플레이트 주위에 테이프로 밀봉하고, -80°C에서 적어도 1 시간 동안 동결한 다음, 실온에서 2회 해동하여 세포를 용해시켰다. 상기에서 제조된 상청액 200 μL를 세포 배양 48웰 플레이트에 이중으로 접종하였다. 상기에서 기재된 바와 같이 Pen Strep 및 겐타마이신/암포테리신을 상기 세포에 배치하였다. 배양물을 CO2 인큐베이터에서 37°C에서 3일 동안 인큐베이션하고, 계대를 1회 더 반복하였다. 계대 3 플레이트를 IFA로 분석하였다.
면역 형광 (IFA) 방법
바이러스 감염 웰 및 모의 웰의 배지를 흡인하였다. 상기 웰을 세척 당 5분 동안 1x PBS로 2회 세척한 다음, 4% 포름알데하이드를 첨가하여 30분 동안 고정하였다. 고정 후, 상기 웰을 상기에서 기재된 바와 같이 세척하고, 0.1% Triton X-100을 15분 투과화를 위해 첨가하였다. 그 다음, 모든 웰을 세척하고, 적절하게 희석된 일차 다클론 항체 (CSFV에 대한 토끼 혈청)를 각각의 웰에 첨가한 다음, 37°C에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 1x PBS로 3회 세정한 후, 200배 희석된 항-토끼 이차 항체 (예를 들어, 당나귀 항-토끼 IgG Alexa Fluor®488 컨쥬게이트됨, Invitrogen cat# 21203)를 각각의 웰에 첨가하였다. 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 상기 웰을 1x PBS로 2회 세척하고, 최종적으로 IFA 양성 웰에 대해 형광 현미경 검사로 관찰하였다.
연구 결과
체온
각각의 그룹의 체온 평균은 도 8에서 도시된 바와 같이 모든 측정 지점에서 37.5~39.5°C (생리학적 범위) 사이이었다. 발열 정의에 따르면, IVP (임상 시험용 동물 제품)의 투여 후 모든 그룹에서 어떠한 발열도 감지되지 않았다.
임상 관찰
IVP 투여 후 모든 그룹에서 어떠한 치료 관련 임상 징후도 관찰되지 않았다.
주사 부위 반응
IVP 투여 후 백신 접종된 모든 동물에서 어떠한 비정상적인 주사 부위 반응 관찰도 없었다.
육안 병리학
모든 새끼 돼지를 연구 종료시에 부검하였다. IVP 투여 후 모든 동물에서 어떠한 육안 병변도 관찰되지 않았다.
백혈구 수
백혈구는 연구 전반에 걸쳐 0 일차와 비교하여 안정적으로 유지되었으며, IVP 투여 그룹과 대조군 사이에 어떠한 차이도 발견되지 않았다.
편도선의 CSFV 분리
모든 편도선 샘플을 바이러스 단리 (virus isolation: VI) 음성이었다.
비강 바이러스 배출
모든 비강 면봉은 VI 음성이었다.
결론
안전성 연구 결과를 표 5에 요약하였다.
Figure pct00005
안전성 연구는 백신 접종된 모든 그룹에서 발열, 임상 징후, 백혈구 감소증 또는 육안 병리학을 나타내지 않았다. 또한, DPI 21에 편도선에서 어떠한 바이러스도 단리되지 않았으며, 어떠한 바이러스도 환경으로 배출되지 않았다. 결론적으로, 4개의 모든 재조합 바이러스는 3 주령의 새끼 돼지에서 안전하다.
실시예 4: 4개의 후보 재조합 바이러스의 효능 검증
본 실시예의 목적은 4개의 재조합 바이러스, 즉, QZ07-sdErnsH-KARD, QZ07-ddErnsHC-KRD, GD18-ddNproErnsH-KRD 및 GD18-ddErnsHC-KARD의 효능을 3 주령의 새끼 돼지에서 평가하는 것이었다.
총 55 마리의 새끼 돼지를 6개 그룹 (그룹 1, 2, 3, 4, 5 및 6)에 배정하고, 그룹 1, 2, 3, 4 중의 각각 10 마리의 새끼 돼지를 재조합 바이러스 테스트에 사용하고, 그룹 5 중의 또 다른 10 마리의 새끼 돼지는 시험 감염 대조군의 역할을 하였다. 그룹 6 중의 나머지 5 마리 새끼 돼지는 음성 대조군의 역할을 하였다. 0 일차에, 표 6에 표시된 바와 같이, 그룹 1, 2, 3 및 4의 동물의 좌측 목에 QZ07-sdErnsH-KARD, QZ07-ddErnsHC-KRD, GD18-ddNproErnsH-KRD 및 GD18-ddErnsHC-KARD을 새끼 돼지 당 1 mL (3 log TCID50/mL)로 각각 접종하였다. 그룹 5의 좌측 목에 0 일차에 1 mL PBS로 접종하였고, 시험 감염 대조군의 역할을 하였다. 백신 접종 후 14일에 ≥105 MLD/mL의 용량으로 CSFV Shimen 변종을 그룹 1, 2, 3, 4 및 5 중의 동물의 좌측 목에 접종하였다. 모든 새끼 돼지는 임상적으로 건강했고 CSFV 및 PRRSV 항체가 없었고 0일째에 BVDV, PRV를 포함한 항원이 없었습니다. 모든 동물은 면역화 당시에 건강하였다.
Figure pct00006
체온 및 임상 점수를 D12에서 D30까지 매일 수집하였다. 시험 감염 후 (days post challenge: DPC) 0, 3, 5, 7 및 16일에, 모든 동물의 전혈 샘플을 백혈구 수를 위해 수집하였다. D0의 모든 혈청 샘플을 연구 유효 테스트를 위해 수집하였다. DPC 16에, 모든 생존 새끼 돼지를 인도적으로 사망시키고, 육안 병리 소견에 대해 점수를 매겼다.
시험 감염 대조군 및 음성 대조군은 시험 감염 당일 (DPC0)까지 CSFV 항체 음성이었고, 음성 대조군은 연구의 나머지 기간 (DPC16) 동안 CSFV 항체 음성을 유지하였고, 이환율 및 사망률은 시험 감염 대조군에서 100% 및 90%이므로, 연구를 검증하였다.
연구 절차
체온
모든 동물에 대해 체온을 DPC -2에서 DPC 16까지 매일 1회 측정하였다. 체온을 섭씨로 기록하였다. 시험 감염 전 3일 (DPC-2에서 DPC 0까지)의 평균 체온을 각각의 새끼 돼지에 대한 정상 체온으로 설정하였다. 개별 동물이 다음 기준을 충족하는 경우, 발열로 간주된다: 1°C < 체온 및 3개 (≥) 연속 측정 지점; 1.5°C < 체온 및 2개 (≥) 연속 측정 지점.
임상 관찰
모든 동물에 대해 임상 관찰을 DPC 0에서 DPC 16까지 매일 1회 수행하였다. 임상 관찰은 표 6에 표시된 바와 같이 활기, 신체 긴장 상태 (경직, 경련), 체형 (신체 상태, 야윈 근육), 호흡, 보행, 피부, 결막 외관, 식욕 및 배변의 평가로 이루어진다. 0은 임상 징후가 없음을 나타내며, 증가된 임상 점수는 임상 징후의 중증도의 증가 정도를 나타낸다. 개별 동물이 3개의 연속 관찰 지점에서 2 초과의 총 임상 점수를 나타내는 경우, CSF 관련 임상 징후로 간주된다.
Figure pct00007
Figure pct00008
백혈구 수
DPC 0, 3, 5, 7 및 16에 각각의 새끼 돼지로부터 대략 1 mL의 혈액 샘플을 수집하였다. 적합한 바늘과 주사기를 사용하여 샘플을 수집하고, EDTA 코팅된 튜브로 옮겼다. 혈액 샘플 유래의 백혈구를 Exigo-61812 자동 혈액 기기로 즉시 분석하였다. 각각의 샘플을 2회 테스트하였다.
부검
조사자 또는 피지명자가 임의의 인도적으로 사망된/발견된 사망 동물을 부검하였다. 모든 생존 새끼 돼지를 인도적으로 사망시키고, DPC 16에 부검하였다. 주요 표적 조직/장기, 예를 들어, 편도선, 신장, 비장, 림프절, 회장/직장 등을 CSF 관련 병원성에 대해 검사하였다. 가능한 미래 평가를 위해 임상 징후 관련된 CSF 관련 육안 병소를 포르말린에 고정하였다. CSFV 바이러스 단리를 위해 각각의 새끼 돼지로부터 새로운 편도선을 수집하였다.
비장 경색, 직장 및 회장의 장 점막 궤양, 신장, 림프절, 점상 피하 조직 및 방광 점막의 출혈은 CSFV 감염의 육안적 병리학적 소견이다. 전술한 3개의 소견을 갖는 돼지는 CSFV에 의핸 감염된 것으로 간주되었다. 전술한 소견의 부재는 CSFV에 의핸 감염되지 않은 것으로 간주되었다. CSFV 바이러스가 양성으로 단리된 경우, 전술한 1개 또는 2개의 소견을 갖는 동물은 CSFV에 의해 양성 감염된 것으로 간주되었다.
이환율 및 사망률
이환율: 개별 동물이 다음 기준을 충족하는 경우, 병적 상태로 간주된다. A) 발열 기간 (발열 전 1일 + 발열 당일 + 발열 후 1일) 내의 CSF 관련 임상 징후 및 B) CSF 관련 육안 병변.
사망률: CSF 감염과 관련된 사망.
연구 결과
체온
개별 정상 체온은 시험 감염 전 3일 (D12~D14)의 평균 체온이었다. 직장 온도 결과는 도 9에 도시되어 있다.
QZ07-ddErnsHC-KRD 그룹 중의 1 마리 동물과 GD18-ddNpro-ErnsH-KRD 그룹 중의 2 마리 동물은 시험 감염 후 열이 발생했지만, 3 마리의 새끼 돼지 모두는 곧 회복되었다. 다른 2개 처리 그룹에서는 어떠한 발열도 관찰되지 않았다.
임상 관찰
전체 임상 결과는 도 10에 도시되어 있다. 시험 감염 대조군에서, 동물은 DPC 2부터 CSFV 감염과 관련된 임상 징후를 발생시키고, 이후 극적으로 증가하고, DPC 4에서 연구 종료까지 최대 21점을 득점하였다. 대표적 CSFV 징후로는 일어서지 못함, 경련, 보행 및 식사 불가능, 결막염, 매우 건조한 대변 바닥이 포함된다. QZ07-ddErnsHC-KRD 그룹에서, 2 마리의 동물이 징후를 나타냈다. GD18-ddNpro-ErnsH 그룹-KRD에서, 3 마리의 동물이 징후를 나타냈다. 다른 2개 처리 그룹에서는 어떠한 임상 징후도 관찰되지 않았다.
백혈구 수
시험 감염 그룹 중의 동물의 백혈구 수는 DPC 0에서 DPC 5까지 극적으로 감소하고, 연구 종료시까지 낮게 유지되었다. 대조적으로, 모든 IVP 그룹 중의 동물의 백혈구 수는 DPC 0에서 DPC 5까지 약간 감소하고, 연구 전반에 걸쳐 안정적이고 일관되게 8*109 /L 이상이었다.
육안 병리학
모든 새끼 돼지를 사망시에 또는 연구 종료시에 부검하였다. 그룹 육안 병리학적 관찰은 표 8에 존재하였다. 시험 감염 대조군 중의 모든 동물은 적어도 3개의 대표적 CSF 병변을 나타냈다. 편도선 홍반, 비장 경색, 신장 출혈, 피하 조직 출혈 및 림프절 출혈이 이러한 그룹의 동물에서 일반적으로 관찰되었다. 모든 처리 그룹에서는 어떠한 육안 병리학적 변화도 관찰되지 않았다.
이환율, 사망률 및 추가의 효능 평가 변수
효능 평가 결과를 표 8에 요약하였다.
Figure pct00009
시험 감염 대조군과 비교하여, 모든 재조합 바이러스는 유의한 방어를 제공한다. 테스트 백신이나 시험 감염 야생형 CSFV 물질 중 어느 것도 투여받지 않은 "음성 대조군"의 모든 동물은 건강한 상태를 유지하였다.
결론
효능 연구는 각각의 후보로부터 방어를 나타냈으며, 각각의 그룹에서는 어떠한 사망도 관찰되지 않았다. 적은 수의 새끼 돼지만이 시험 감염 후 일시적 발열과 임상 징후를 나타냈지만, 곧 회복되었다.
실시예 5: mAb 6B8 특이적 에피토프에 기반하는 DIVA ELISA 개발
본 실시예의 목적은 감염된 동물을 mAb 6B8 에피토프 기반 후보 DIVA 백신으로 백신 접종된 동물과 구별할 수 있는 CSFV DIVA ELISA 방법을 개발하는 것이다.
DIVA ELISA를 위한 재료 및 시약
96웰 ELISA 플레이트: Corning; Cat. No. 42592.
96웰 세포 배양 플레이트: Corning; Cat. No. 3595.
코팅 완충액 (CBS): 0.05 M Na2CO3, 0.05 M NaHCO3; pH9.6.
기질 용액: TMB, Invitrogen; Cat. No. 002023.
스톡 용액: 1 N HCl.
세척 완충액: 0.1% Tween-20을 함유하는 PBST.
차단 완충액: 5% 탈지유를 함유하는 PBST.
희석 완충액: 5% 탈지유를 함유하는 PBST.
코팅 항원: QZ07-spE2-delTM (4.22 mg/ml)로 명명되고 본 발명자들에 의해 생산 및 정제된 CSFV E2 단백질 (QZ07 유래의 E2, 전장)
경쟁 단백질: 본 발명자들에 의해 생산 및 정제된 6B8 에피토프에 KARD 돌연변이를 갖는 CSFV E2 단백질 (전장) (QZ07-spE2-delTM-6B8-KARD로 명명됨, 0.549 mg/ml).
테스트될 돼지 혈청 샘플: QZ07-sdErnsH-KARD의 안전성 및 효능 연구로부터의 혈청.
차단 항체: 단클론 항체 6B8.
이차 항체: HRP 컨쥬케이트됨, 염소 항-마우스 IgG: Santa Cruze; Cat No. SC-2005.
경쟁적 ELISA (cELISA)
코팅 항원을 코팅 완충액으로 2.0 μg/ml의 최종 농도까지 희석하고, 희석된 코팅 항원을 웰 당 100 μl씩 96웰 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 밀봉하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척한 후, 200 μl/웰의 차단 완충액으로 37°C에서 1 시간 동안 차단하였다. 차단 후, 상기 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 50 μl의 희석 완충액과 혼합된 50 μl의 혈청 샘플을 37°C에서 2 시간 동안 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 차단 항체 mAb 6B8을 희석 완충액으로 1:800 희석하고, 100 μl/웰을 플레이트에 첨가하고, 37°C에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 그 다음, 희석 완충액으로 1:10000 희석된 이차 항체를 100 μl/웰로 첨가하고, 37°C에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 100 μl의 기질 용액 (TMB)을 각각의 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 직사 광선에 두지 않고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 100 μl의 스톡 용액 (1 N HCl)을 각각의 웰에 첨가하였다. OD450을 판독하고, 차단율을 하기 공식에 따라 계산하였다:
Figure pct00010
이중 경쟁적 ELISA (dcELISA)
코팅 항원을 코팅 완충액으로 2.0 μg/ml의 최종 농도까지 희석하고, 희석된 코팅 항원을 웰 당 100 μl씩 96웰 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 밀봉하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다.
ELISA 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척한 후, 200 μl/웰의 차단 완충액으로 37°C에서 1 시간 동안 차단하였다. 차단 후, 상기 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척하였다.
혈청 샘플을 경쟁 단백질로 전처리하였다. 간단히 말하자면, 경쟁 단백질을 희석 완충액으로 1 μg/60 μl 희석하였고, 한편, 60 μl의 희석 완충액을 대조군으로서 사용하였다. 60 μl의 희석된 경쟁 단백질을 60 μl의 혈청 샘플과 배합하고, 96웰 세포 배양 플레이트에서 37°C에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.
100 μl의 전처리된 혈청 샘플을 37°C에서 2 시간 동안 차단된 ELISA 플레이트에 옮겼다. 상기 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 차단 항체 mAb 6B8을 희석 완충액으로 1:800 희석하고, 100 μl/웰을 ELISA 플레이트에 첨가하고, 37°C에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 그 다음, 희석 완충액으로 1:10000 희석된 이차 항체를 100 μl/웰로 첨가하고, 37°C에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 300 μl/웰의 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 100 μl의 기질 용액 (TMB)을 각각의 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 직사 광선에 두지 않고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 100 μl의 스톡 용액 (1 N HCl)을 각각의 웰에 첨가하였다. OD450을 판독하고, 차단율을 하기 공식에 따라 계산하였다:
Figure pct00011
6B8 에피토프의 DIVA 돌연변이의 다양한 조합은 DIVA에 실현 가능하다.
다양한 양의 경쟁 단백질로 전처리된 상기에서 기재된 dcELISA를 사용하여, 상이한 약독화 배경 (QZ07-sdErnsH 또는 GD18-ddNpro-ErnsH)에 대한 6B8 에피토프의 RD (24 및 25번 위치), KRD (14, 24 및 25번 위치) 또는 KARD (14, 22, 24 및 25번 위치) 돌연변이를 갖는 후보의 과용량 안전성 연구로부터의 혈청을 테스트하였다.
결과를 도 11에 도시하였다. RD, KRD 또는 KARD 후보 백신 접종으로부터 유래된 과용량 회복기 혈청은 낮은 차단율 (40% 미만)을 나타낸 반면, WT 유래된 혈청은 높은 차단율 (50% 이상)을 유지하였다. 따라서, 6B8 에피토프 돌연변이의 각각의 조합은 DIVA 후보를 생성할 실현 가능성을 나타냈다.
DIVA에 대한 cELISA와 dcELISA의 비교
후보 QZ07-sdErnsH-KARD의 이전 안전성 평가 연구 (백신 접종 후 0, 7, 14 및 21일) 및 이전 효능 평가 연구 (0, DPC0 및 DPC16) 으로부터의 혈청 샘플을 사용하여 DIVA에 대한 cELISA 및 dcELISA의 효과를 비교하였다.
결과를 도 12에 도시하였다. dcELISA 결과는 안전성 평가 연구에서 QZ07-sdErnsH-KARD 후보로 백신 접종된 동물의 혈청 샘플에서 6B8에 대한 낮은 차단율을 나타냈다. 효능 평가 연구에서, 높은 차단율이 Shimen 필드 변종 시험 감염 후에 관찰된 반면, 낮은 차단율이 시험 감염 전 (DPC0) 혈청에서 관찰되었다. 따라서, dcELISA에 의해 CSFV로 감염된 동물을 QZ07-sdErnsH-KARD DIVA 백신 후보로 백신 접종된 동물과 잘 구별할 수 있었다.
그러나, cELISA를 사용함으로써, 높은 차단율이 또한 시험 감염되지 않은 안전성 평가 연구로부터의 혈청 샘플에서 관찰되었다 (백신 접종 후 21일). 따라서, cELISA는 본 후보의 DIVA에 적합하지 않다.
실시예 6: 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 mAb의 결합을 결정하기 위한 면역 형광 검정 (IFA)
돌연변이된 6B8 에피토프 (테스트 샘플)에 대한 6B8 mAb의 결합을 하기 단계에 따라 면역 형광 검정 (IFA)에 의해 결정한다:
1. 96웰 미세 역가 플레이트에서, 약 1.1 x 104개 세포/웰의 PK-15 세포를 씨딩하고, 0.001 내지 0.01의 MOI로 하기 CSFV로 각각 이중으로 감염시킨다:
(i) 테스트 샘플: 변형된 6B8 에피토프를 갖는 E2 단백질을 함유하는 CSFV;
(ii) 양성 대조군: 야생형 6B8 에피토프를 갖는 E2 단백질을 함유하는 CSFV (예를 들어, 약독화된 필드 변종 QZ07-dErnsH 또는 GD18-ddNrpo-ErnsH);
(iii) 음성 대조군: 본 출원에서 기재된 바와 같은 6B8 에피토프 내에 KARD 돌연변이를 갖는 E2 단백질을 함유하는 CSFV (예를 들어, QZ07-sdErnsH-KARD).
CSFV 접종된 세포를 37°C, CO2 (4~6%)하의 인큐베이터에서 유체 교체 또는 배지 첨가 없이 3일 동안 유지한다.
2. 배양 배지를 폐기하고, 상기 세포를 1x PBS (200 내지 250 μL/웰)로 2회 세정한다.
3. CSFV 감염된 세포의 고정을 위해, 4% 포름알데하이드를 검정 플레이트에 첨가한다 (50 μL/웰).
4. 상기 플레이트를 실온에서 30~40분 동안 인큐베이션한다. 흄 후드에서 포름알데하이드를 조심스럽게 폐기하고, 상기 세포를 1x PBS (200 내지 250 μL/웰)로 1회 세척한다.
5. CSFV 감염된 세포의 세포막 투과화를 위해, 0.1% Triton X-100을 각각의 웰에 50 μL/웰로 첨가한다. 상기 검정 플레이트를 실온에서 15~20분 동안 인큐베이션한다. 상기 검정 플레이트를 1x PBS (200 내지 250 μL/웰)로 2회 세척한다.
6. 6B8 특이적 mAb (예를 들어, 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체)를 5% BSA를 함유하는 PBS로 1:500 내지 1:1000 희석한 다음, 상기 검정 플레이트에 50 μL/웰로 첨가한다. 상기 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 37°C에서 1~2 시간 동안 인큐베이션한다.
7. 검정 플레이트를 1x PBS (250 μL/웰)로 3회 세정한다.
8. 6B8 항체에 특이적으로 결합하는 이차 항체 Alexa Fluor®488 컨쥬게이트된 당나귀 항-마우스 항체 (ThermoFisher, Invitrogen, cat#21202)를 5% BSA를 함유하는 PBS로 400배 희석하고, 상기 검정 플레이트에 50 μL/웰로 첨가한다. 상기 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 37°C에서 1~2 시간 동안 인큐베이션한다.
9. 검정 플레이트를 1xPBS PBS (250 μL/웰)로 3회 세정한다. 마지막으로, 1xPBS를 100 μL/웰로 첨가한다. 최종 형광 신호를 도립 형광 현미경 검사로 판독한다.
본 IFA에서 테스트 샘플의 음성 결과 (두 복제 모두에서)는 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 하나 이상의 돌연변이가 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 단클론 항체의 결합을 특이적으로 억제한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 임신 암퇘지의 안전성 연구
동일한 연령 및 기원의 암퇘지를 임신 55 일차에 하기 표 10에 따라 백신 접종을 하고, 임신 100 일차에 부검하였다.
Figure pct00012
모든 암퇘지는 연구 시작 전에 페스티바이러스에 대한 항체에 대해 음성이었다. 음성 대조군의 모든 암퇘지는 연구 종료시까지 CSFV에 대해 항체 및 항원 음성 상태를 유지하였다.
어떠한 백신 접종 관련 이상도 본 연구에서 관찰되지 않았다: i) 어떠한 주사 부위 반응도 임의의 동물에서 관찰되지 않았고; ii) 어떠한 동물도 임의의 시점에서 38.8°C 이상의 온도를 나타내지 않았고; iii) 어떠한 백신 접종 관련 임상 징후도 4개의 백신 접종 그룹에서 없었고; iv) 어떠한 바이러스혈증도 4개의 백신 접종 그룹의 암퇘지에서 검출되지 않은 반면, 바이러스혈증이 양성 대조군에서 7~14 dpi로 검출되었다.
표 11에 나타낸 바와 같이, 백신 접종은 생식 성능에 어떠한 영향도 미치지 않았다.
Figure pct00013
상기 예비 결과에 근거하여, 4개의 후보의 백신 접종은 임신 암퇘지에서 안전하다.
차이나 센터 포 타입 컬쳐 컬렉션 CCTCCC2018120 20180613
<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica (China) Co. Ltd. <120> Recombinant Classical Swine Fever Virus <130> P20193023 <160> 35 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QZ07-wt <400> 1 gtatacgagg ttagttcgtt ctcgtgtaca atattggaca aaacaaaatt ccgatttggc 60 ctagggcacc cctccagcga cggccgaact gggctagcca tgcccacagt aggactagca 120 aacggaggga ctagccgtag tggcgagctc cctgggtggt ctaagtcctg agtacaggac 180 agtcgtcagt agttcgacgt gagcaggagc ccacctcgag atgctatgtg gacgagggca 240 tgcccaagac acaccttaac cctggcgggg gtcgccaggg tgaaatcaca ccatgtgatg 300 ggggtacgac ctgatagggc gctgcagagg cccactaaca ggctagtata aaaatctctg 360 ctgtacatgg cacatggagt tgaatcattt tgaactattg tataaaacaa acaaacaaaa 420 accaatggga gtggaggaac cggtgtatga catcgcaggg agaccattat ttggggaccc 480 aagtgaggta cacccacaat caacactgaa gctaccacac gacaggggaa gaggtaatat 540 cagaactaca ctgaaggacc tacctaggaa aggcgactgc aggagtggaa accacctagg 600 accagttagt gggatatacg taaagcctgg ccctgtcttc tatcaggact acatgggccc 660 tgtctaccat agagccccat tagagttttt tggtgaggcc 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Trp Glu Glu Leu Glu 3215 3220 3225 Arg Gly Ile Asn Arg Lys Gly Ala Ala Gly Phe Phe Glu Arg Lys 3230 3235 3240 Asn Ile Gly Glu Val Leu Asp Ser Glu Lys Tyr Lys Val Glu Glu 3245 3250 3255 Ile Ile Asp Ser Leu Lys Lys Gly Arg Ser Ile Lys Tyr Tyr Glu 3260 3265 3270 Thr Ala Ile Pro Lys Asn Glu Lys Arg Asp Val Asn Asp Asp Trp 3275 3280 3285 Thr Ala Gly Asp Phe Val Asp Glu Lys Lys Pro Arg Val Ile Gln 3290 3295 3300 Tyr Pro Glu Ala Lys Thr Arg Leu Ala Ile Thr Lys Val Met Tyr 3305 3310 3315 Lys Trp Val Lys Gln Lys Pro Val Val Ile Pro Gly Tyr Glu Gly 3320 3325 3330 Lys Thr Pro Leu Phe Gln Ile Phe Asp Lys Val Lys Lys Glu Trp 3335 3340 3345 Asn Gln Phe Gln Asn Pro Val Ala Val Ser Phe Asp Thr Lys Ala 3350 3355 3360 Trp Asp Thr Gln Val Thr Thr Arg Asp Leu Glu Leu Ile Arg Asp 3365 3370 3375 Ile Gln Lys Phe Tyr Phe Lys Lys Lys Trp His Lys Phe Ile Asp 3380 3385 3390 Thr Leu Thr Met His Met Ser Glu Val Pro Val Ile Ser Ala Asp 3395 3400 3405 Gly Glu Val Tyr Ile Arg Lys Gly Gln Arg Gly Ser Gly Gln Pro 3410 3415 3420 Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met Leu Asn Val Leu Thr Met Val 3425 3430 3435 Tyr Ala Phe Cys Glu Ala Thr Gly Val Pro Tyr Lys Ser Phe Asp 3440 3445 3450 Arg Val Ala Lys Ile His Val Cys Gly Asp Asp Gly Phe Leu Ile 3455 3460 3465 Thr Glu Arg Ala Leu Gly Glu Lys Phe Ala Ser Arg Gly Val Gln 3470 3475 3480 Ile Leu Tyr Glu Ala Gly Lys Pro Gln Lys Ile Thr Glu Gly Asp 3485 3490 3495 Asn Met Lys Val Ala Tyr Gln Phe Asp Asp Ile Glu Phe Cys Ser 3500 3505 3510 His Thr Pro Val Gln Val Arg Trp Ser Asp Asn Thr Ser Ser Tyr 3515 3520 3525 Met Pro Gly Arg Asn Thr Thr Thr Ile Leu Ala Lys Met Ala Thr 3530 3535 3540 Arg Leu Asp Ser Ser Gly Glu Arg Gly Thr Ile Ala Tyr Glu Lys 3545 3550 3555 Ala Val Ala Phe Ser Phe Leu Leu Met Tyr Ser Trp Asn Pro Leu 3560 3565 3570 Ile Arg Arg Ile Cys Leu Leu Val Leu Ser Thr Glu Met Gln Val 3575 3580 3585 Arg Pro Gly Lys Ser Thr Thr Tyr Tyr Tyr Glu Gly Asp Pro Ile 3590 3595 3600 Ser Ala Tyr Lys Glu Val Ile Gly His Asn Leu Phe Asp Leu Lys 3605 3610 3615 Arg Thr Ser Phe Glu Lys Leu Ala Lys Leu Asn Leu Ser Met Ser 3620 3625 3630 Thr Leu Gly Val Trp Thr Arg His Thr Ser Lys Arg Leu Leu Gln 3635 3640 3645 Asp Cys Val Asn Val Gly Thr Lys Glu Gly Asn Trp Leu Val Asn 3650 3655 3660 Ala Asp Arg Leu Val Ser Ser Lys Thr Gly Asn Arg Tyr Ile Pro 3665 3670 3675 Gly Glu Gly His Thr Gln Gln Gly Lys His Tyr Glu Glu Leu Val 3680 3685 3690 Leu Ala Arg Lys Pro Thr Ser Asn Phe Glu Gly Thr Asp Arg Tyr 3695 3700 3705 Asn Leu Gly Pro Ile Val Asn Val Val Leu Arg Arg Leu Arg Val 3710 3715 3720 Met Met Met Ala Leu Ile Gly Arg Gly Val 3725 3730 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 25 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 26 Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Phe Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Met Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 27 Gly Asp Leu Pro Phe Ala Tyr 1 5 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 28 Lys Ala Ser Gln Ala Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 29 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 30 His Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated 6B8 epitope with RD for GD18 or QZ07 or GD191 <400> 31 Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Arg Asp 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated 6B8 epitope with RD for C-strain <400> 32 Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Arg Asp 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated 6B8 epitope with KRD for C-strain <400> 33 Lys Thr Asp Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Arg Asp 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated 6B8 epitope with KARD for C-strain <400> 34 Lys Thr Asp Glu Ile Gly Leu Leu Ala Ala Arg Asp 1 5 10 <210> 35 <211> 373 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C strain-E2 <400> 35 Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asp 1 5 10 15 Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu 20 25 30 Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ser Cys 35 40 45 Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg 50 55 60 Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Lys Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe 65 70 75 80 Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp 85 90 95 Asp Phe Arg Ser Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys 100 105 110 Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val 115 120 125 Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro 130 135 140 Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro 145 150 155 160 Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp 165 170 175 Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu 180 185 190 Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Val Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly 195 200 205 Phe Asp Phe Asp Gly Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys 210 215 220 Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp 225 230 235 240 Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Ser His Glu Cys 245 250 255 Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu 260 265 270 Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro 275 280 285 Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Lys Asn 290 295 300 Arg Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys 305 310 315 320 Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Ala Thr Asp Arg His Ser 325 330 335 Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Val Val Leu Val Val Val Ala Leu Leu Gly 340 345 350 Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Ile Val Thr Tyr Val Val Leu Thr Glu 355 360 365 Gln Leu Ala Ala Gly 370

Claims (57)

  1. E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 고전적 돼지 열병 바이러스 (classical swine fever virus: CSFV)로서, 비변형된 6B8 에피토프가 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는, 재조합 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV).
  2. 제1항에 있어서, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이가 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 단클론 항체의 결합의 특이적 억제를 초래하는, 재조합 CSFV.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체가,
    i) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나,
    ii) 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
    iii) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나,
    iv) 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 재조합 CSFV.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 상기 E2 단백질의 14번 위치, 22번 위치, 24번 위치 및/또는 24/25번 위치에서의 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 재조합 CSFV.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 상기 E2 단백질의 S14, G22, E24 및/또는 E24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의되거나, 적어도 상기 E2 단백질의 S14, G22, G24 및/또는 G24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 재조합 CSFV.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 STNEIGPLGAEG 또는 STDEIGLLGAGG 아미노산 서열에 의해 정의되는, 재조합 CSFV.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 24/25번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산이 R 또는 K로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 24/25번 위치에서의 아미노산이 R/D 또는 K/D로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산이 K, Q 또는 R로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산이 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환되는, 재조합 CSFV.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환이 서열 번호 13~14 및 31~34 중 어느 하나의 돌연변이된 6B8 에피토프 서열을 초래하는, 재조합 CSFV.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 약독화되어 있는, 재조합 CSFV.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 Erns 단백질에서 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 Npro 단백질에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이가 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실 및/또는 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실이고, Npro 단백질에서의 상기 돌연변이가 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실인, 재조합 CSFV.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 C 변종 또는 QZ07, GD191 또는 GD18 필드 변종으로부터 유래되는, 재조합 CSFV.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 QZ07 필드 변종으로부터 유래되고,
    (i) Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, 및
    (ii) 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함하는, 재조합 CSFV.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 QZ07 필드 변종으로부터 유래되고,
    (i) Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, 및
    (ii) 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함하는, 재조합 CSFV.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고,
    (i) Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 결실, 및
    (ii) 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함하는, 재조합 CSFV.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고,
    (i) Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실, 및
    (ii) 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환, 또는 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환을 포함하고, 임의로, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환을 추가로 포함하는, 재조합 CSFV.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 재조합 CSFV를 코딩하는 단리된 핵산.
  19. 제18항의 핵산을 포함하는 벡터.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 CSFV, 제17항에 따른 재조합 CSFV를 코딩하는 단리된 핵산, 또는 제19항에 따른 벡터를 포함하는 면역원성 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 마커 백신 또는 감염된 동물과 백신 접종된 동물의 구별 (differentiation between infected and vaccinated animals: DIVA) 백신인, 면역원성 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 방법이 제20항 또는 제21항에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물.
  23. 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제20항 또는 제21항에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이를 CSFV에 도입하는 단계를 포함하는, CSFV 백신을 마킹하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체가,
    i) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나,
    ii) 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
    iii) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나,
    iv) 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 상기 E2 단백질의 14번 위치, 22번 위치, 24번 위치 및/또는 24/25번 위치에서의 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 예를 들어, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 상기 E2 단백질의 S14, G22, E24 및/또는 E24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의되거나, 적어도 상기 E2 단백질의 S14, G22, G24 및/또는 G24/G25 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 6B8 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 STNEIGPLGAEG 또는 STDEIGLLGAGG 아미노산 서열에 의해 정의되는, 방법.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 24/25번 아미노산 위치에서의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서의 치환인, 방법.
  29. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산이 R 또는 K로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 24번 위치에서의 아미노산이 R 또는 K로 치환되고 상기 E2 단백질의 25번 위치에서의 아미노산이 각각 D로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 14번 위치에서의 아미노산이 K, Q 또는 R로 치환되고/되거나, 상기 E2 단백질의 22번 위치에서의 아미노산이 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로 치환되는, 방법.
  30. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환, 상기 E2 단백질의 24번 아미노산 위치에서 E 또는 G의 R 또는 K로의 치환 및 25번 아미노산 위치에서 G의 D로의 치환, 상기 E2 단백질의 14번 아미노산 위치에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환 및/또는 상기 E2 단백질의 22번 아미노산 위치에서 G의 A, R, Q 또는 E, 바람직하게는 A 또는 R로의 치환인, 방법.
  31. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 돌연변이가 서열 번호 13~14 및 31~34 중 어느 하나의 돌연변이된 6B8 에피토프 서열을 초래하는, 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CSFV 백신이 약독화된 백신인, 방법.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CSFV가 C 변종 또는 QZ07 또는 GD18 필드 변종으로부터 유래되는, 방법.
  34. 하기 단계를 포함하는, CSFV로 감염된 동물을 제20항 또는 제21항의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하는 방법:
    a) 샘플을 수득하는 단계, 및
    b) 상기 샘플을 면역 테스트로 테스트하는 단계.
  35. 제34항에 있어서, 상기 면역 테스트가, 상기 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 상기 샘플 중의 상기 CSFV E2 단백질에 결합할 수 있는지 여부를 테스트하는 것을 포함하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가,
    i) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나,
    ii) 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
    iii) 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나,
    iv) 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 면역 테스트가, 상기 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 상기 샘플 중에 존재하는지 여부를 테스트하는 것, 및/또는 상기 CSFV E2 단백질의 돌연변이된 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 상기 샘플 중에 존재하는지 여부를 테스트하는 것을 포함하는, 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 테스트가 효소 면역 검정 (enzyme immunoassay: EIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 검정 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 바람직하게는 이중 경쟁적 ELISA인, 방법.
  39. 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되거나, 상기 항체가 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나, 상기 항체가 수탁 번호 CCTCC C2018120으로 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체의 CDR을 포함하거나, 상기 항체가 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  40. CSFV로 감염된 동물을 제39항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제20항 또는 제21항의 면역원성 조성물로 백신 접종된 동물과 구별하기 위한 키트.
  41. 약독화된 재조합 CSFV로서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 Erns 단백질에서 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 Npro 단백질에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이가 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실 및/또는 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실이고, Npro 단백질에서의 상기 돌연변이가 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실인, 약독화된 재조합 CSFV.
  42. 제41항에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 C 변종 또는 QZ07 또는 GD18 필드 변종으로부터 유래되는, 약독화된 재조합 CSFV.
  43. 제42항에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 QZ07 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실을 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV.
  44. 제42항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 QZ07 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산 결실 및 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산 결실을 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV.
  45. 제42항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산 결실 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 결실을 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV.
  46. 제42항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산 결실 및 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산 결실을 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 약독화된 재조합 CSFV를 코딩하는 단리된 핵산.
  48. 제47항의 핵산을 포함하는 벡터.
  49. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 약독화된 재조합 CSFV, 제46항에 따른 약독화된 재조합 CSFV를 코딩하는 단리된 핵산, 또는 제48항에 따른 벡터를 포함하는 면역원성 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 방법이 제49항에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물.
  51. 동물에서 CSFV와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제48항에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. Erns 단백질에서의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 Npro 단백질에서의 적어도 하나의 돌연변이를 CSFV에 도입하는 단계를 포함하는, 약독화된 재조합 CSFV 백신을 제조하는 방법으로서, 바람직하게는 상기 Erns 단백질에서의 이러한 돌연변이가 Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실 및/또는 Erns 단백질의 171번 아미노산 위치에서 아미노산의 결실이고, Npro 단백질에서의 상기 돌연변이가 처음 4개의 아미노산 말단 아미노산을 제외한 Npro 단백질의 결실인, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 C 변종 또는 QZ07 또는 GD18 필드 변종으로부터 유래되는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 QZ07로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산이 결실되는, 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 QZ07로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 및 171번 아미노산 위치에서의 아미노산이 결실되는, 방법.
  56. 제53항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 아미노산 위치에서의 아미노산 및 처음 4개의 아미노 말단 아미노산을 제외한 상기 Npro 단백질의 아미노산이 결실되는, 방법.
  57. 제53항에 있어서, 상기 약독화된 재조합 CSFV가 GD18 필드 변종으로부터 유래되고, Erns 단백질의 79번 및 171번 아미노산 위치에서의 아미노산이 결실되는, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20240350610A1 (en) * 2020-10-19 2024-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica (China) Co., Ltd. Recombinant classical swine fever virus e2 protein
CN113512098B (zh) * 2021-07-15 2022-08-23 武汉大学 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接elisa方法及其应用
JP2024539145A (ja) * 2021-10-19 2024-10-28 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ （チャイナ） カンパニー リミテッド Ｂ／ｃドメインスワッピングを有する組換え古典的豚熱ウイルスｅ２タンパク質

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0965639A1 (en) * 1998-06-05 1999-12-22 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuated pestiviruses
UY31930A (es) * 2008-06-25 2010-01-29 Boheringer Ingelheim Pharma Kg Pestivirus atenuados recombinantes, en particular a csfv, bvdv o bdv atenuado recombinante
EP2202298A1 (en) * 2008-12-23 2010-06-30 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Recombinant classical swine fever virus (CSFV) comprising a modified E2 protein and methods for generating said recombinant CSFV
EP3084441B1 (en) * 2013-12-19 2018-03-28 Intervet International B.V. Improved diagnostic test for csfv antibodies
US9993544B2 (en) * 2014-05-23 2018-06-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Recombinant classical swine fever virus (CSFV) comprising substitution in the TAV epitope of the E2 protein
CN108395996B (zh) * 2018-01-31 2021-07-23 复旦大学 一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和用途

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