KR20220001106A

KR20220001106A - 고농도 항-ｖｅｇｆ 항체 제제 및 이에 사용하기 위한 항-ｖｅｇｆ 항체

Info

Publication number: KR20220001106A
Application number: KR1020200079001A
Authority: KR
Inventors: 김근수; 전승철; 안동현; 김희정
Original assignee: (주)메디톡스
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2022-01-05
Also published as: WO2022005100A1

Abstract

항-VEGF 항체를 고농도로 함유하는 안정한 수성 제약 조성물 및 상기 조성물에 사용하기에 적합한 항-VEGF 항체가 개시된다.

Description

고농도 항-ＶＥＧＦ 항체 제제 및 이에 사용하기 위한 항-ＶＥＧＦ 항체{High concentration anti-VEGF antibody formulation and anti-VEGF antibody for use in the same}

본 개시는 고농도 항체 제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항-VEGF 항체를 고농도로 함유하는 안정한 수성 제약 조성물 및 상기 조성물에 사용하기에 적합한 항-VEGF 항체에 관한 것이다.

혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF)는 혈관 형성을 촉진하는 세포에 의해 생성되는 신호 단백질로서, 혈관 형성(vasculogenesis)과 혈관신생(angiogenesis)에 관여한다. VEGF의 정상적인 기능은 배아 발생 동안 새로운 혈관을 만들거나 외상 후 또는 막힌 혈관을 우회하기 위하여 새로운 혈관을 만드는 것이지만, 질환에 기여하기도 한다. 암세포는 VEGF를 발현하여 성장과 전이를 일으키며, VEGF의 과잉발현은 눈의 망막에서 혈관성 질환을 유발할 수 있다. VEGF는 저산소증에 빠진 망막 상피세포에서 분비되어 혈관 내피세포의 분화와 망막 혈관의 투과성을 증가시킴으로써 나이-관련 황반변성(age-related macular degeneration; AMD)에 동반된 신생혈관의 생성이나 이상혈관의 투과성 증가에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 나이-관련 황반변성에서 혈관 내피 성장인자를 막는 것은 중요한 치료법으로, 여러 혈관 내피 성장인자 길항제가 사용되고 있다. 대표적으로 베바시주맙(Bevacizumab, Avastin®), 라니비주맙(Ranibizumab, Lucentis®), 아플리버셉트(Aflibercept, Eylea®) 등을 들 수 있다.

액상 제약 제제에서 치료 항체의 농도는 예를 들어 투여경로에 따라 크게 상이하다. 고농도 제제는 유리체내 주사(intravitreal injection)에 바람직할 수 있다. 그러나, 항체 농도가 높은 제제는 보관 수명이 짧을 수 있고, 제제화된 항체는 보관 동안 화학적 및 물리적 불안정성에 의해 생물학적 활성을 잃을 수 있다. 응집, 탈아미드화 및 산화는 항체 분해의 가장 흔한 원인으로 알려져 있다. 특히, 응집(aggregation)은 잠재적으로 환자의 면역 반응을 증가시켜 안전 문제를 일으킬 수 있으므로, 최소화하거나 예방되어야 한다.

고농도 VEGF 길항제 제제를 제조하는 방법들이 개시되어 있다. 국제공개특허 WO2013/063510호는 베바시주맙, 라니비주맙 등을 비롯한 항체, 항체를 안정화하기 위한 아미노산으로서, 발린; 세린, 트레오닌, 알라닌 및 글리신으로 구성된 군에서 선택된 추가적인 아미노산; 및 이소류신, 아스파라긴, 글루타민 및 아스파르트산으로 구성된 군에서 선택된 추가적인 아미노산을 포함하는, 아미노산; 및 제제의 점도를 감소시키기 위한 아미노산으로서, 프롤린을 포함하는, 아미노산을 포함하는 안정한 약학적 제제로서, 점도는 100 cP 미만이고, 아르기닌 및 히스티딘을 포함하지 않는, 안정한 약학적 제제를 개시하고 있다. 한국공개특허 제2020-0029374호는 아플리버셉트, 폴리올 및 당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 안정화제, 및 계면활성제를 포함하고, pH 4 내지 8인 액상 조성물을 개시하고 있다. 한국공개특허 제2017-0076781호는 적어도 50 ㎎/㎖의 항-VEGF 항체인 브롤루시주맙(Brolucizumab), 수크로스 또는 트레할로스, 시트레이트 또는 히스티딘 완충제, 및 계면활성제로서의 폴리소르베이트 80을 포함하는 수성 제약 조성물을 개시하고 있다.

상기 문헌들의 개시에도 불구하고, 항-VEGF 항체를 고농도로 함유하면서도 낮은 점도를 갖는 안정한 수성 제약 조성물에 대한 요구가 있어 왔다.

국제공개특허 WO2013/063510호 한국공개특허 제2020-0029374호 한국공개특허 제2017-0076781호

본 개시의 목적은 항-VEGF 항체를 고농도로 함유하는 안정한 수성 제약 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 개시의 다른 목적은 상기 조성물에 사용하기에 적합한 항-VEGF 항체를 제공하기 위한 것이다.

본 개시의 일 측면은 유효성분으로 혈관 내피 성장인자(VEGF)에 대한 인간화 항체를 150 ㎎/㎖ 이상의 농도로 포함하는, 안정한 수성 제약 조성물을 제공한다.

본 개시의 다른 측면은 상기 조성물에 사용하기에 적합한 항-VEGF 항체로서, 하기 항체 중 하나 이상을 제공한다:

ⅰ) 서열번호 39의 HFR1, 서열번호 40의 HFR2, 서열번호 41의 HFR3, 및 서열번호 42의 HFR4로 이루어지는 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 및 서열번호 43의 LFR1, 서열번호 44의 LFR2, 서열번호 45의 LFR3, 및 서열번호 46의 LFR4로 이루어지는 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는, 인간화 항-VEGF 항체;

ⅱ) 서열번호 53의 HFR1, 서열번호 54의 HFR2, 서열번호 55의 HFR3, 및 서열번호 42의 HFR4로 이루어지는 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 및 서열번호 43의 LFR1, 서열번호 56의 LFR2, 서열번호 45의 LFR3, 및 서열번호 46의 LFR4로 이루어지는 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는, 인간화 항-VEGF 항체; 및,

ⅲ) 서열번호 35, 서열번호 36 또는 서열번호 37의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 34의 경쇄 가변부위를 포함하는, 인간화 항-VEGF 항체.

본 개시에 따르면, 항-VEGF 항체를 고농도로 함유하면서도 낮은 점도를 갖는 안정한 수성 제약 조성물 및 상기 조성물에 사용하기에 적합한 항-VEGF 항체가 제공된다.

도 1은 토끼 및 인간화 항-VEGF 항체의 아미노산 서열을 비교한 도면이다.
도 2는 라니비주맙 및 변이 라니비주맙의 아미노산 서열을 비교한 도면이다.
도 3은 항-VEGF 항체의 VEGF 결합능을 보여주는 그래프이다.
도 4는 항-VEGF 항체의 HUVEC 세포에서 VEGF에 의해 유도되는 칼슘 억제 효능을 보여주는 그래프이다.
도 5는 항-VEGF 항체의 응집체 함량 분석 결과를 보여주는 도면이다.
도 6은 항-VEGF 항체의 고농도에서의 점도 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 항-VEGF 항체의 FcγRⅠ, Ⅱ, Ⅲ에 대한 결합능을 보여주는 도면이다.

본 개시의 일 측면에 따르면, 유효성분으로 혈관 내피 성장인자(VEGF)에 대한 인간화 항체를 고농도로 포함하는, 안정한 수성 제약 조성물이 제공된다.

본원에서, 용어 "수성 제약 조성물"은 수성 담체를 함유하는 제약 용도에 적합한 조성물을 가리킨다. 제약 용도에 적합한 조성물은 멸균, 균질 및/또는 등장성일 수 있다. 수성 제약 조성물은 예를 들어, 액체 제제 또는 재구성되는 동결건조된 제제를 의미한다.

용어 "안정한" 제약 조성물은 물리적 안정성을 포함한 안정성을 보존하는 제제를 의미한다. 다양한 분석 기술이 당업계에 이용가능하며, 예를 들어 육안 검사, SDS-PAGE, IEF, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 모세관 전기이동, 광산란, 입자계수, 탁도 등 하나 이상의 방법에 의해 결정될 수 있다. 구체예에서, 안정성은 응집체 형성에 대하여 평가된다. 예를 들어, 안정한 수성 제약 조성물은 겔 여과 크로마토그래피로 측정 시 5% 미만, 4.5% 이하, 4% 이하, 3.5% 이하, 3% 이하, 2.5% 이하, 2% 이하, 1.5% 이하, 1% 이하의 응집체를 형성하는 것일 수 있다.

구체예에서, 수성 제약 조성물 내의 항-VEGF 항체의 농도는 150 ㎎/㎖ 이상, 예를 들어 150 내지 300 ㎎/㎖일 수 있다. 수성 제약 조성물은 예를 들어, 약 150 ㎎/㎖, 약 160 ㎎/㎖, 약 170 ㎎/㎖, 약 180 ㎎/㎖, 약 190 ㎎/㎖, 약 200 ㎎/㎖, 약 210 ㎎/㎖, 약 220 ㎎/㎖, 약 230 ㎎/㎖, 약 240 ㎎/㎖, 약 250 ㎎/㎖, 약 260 ㎎/㎖, 약 270 ㎎/㎖, 약 280 ㎎/㎖, 약 290 ㎎/㎖ 또는 약 300 ㎎/㎖의 항-VEGF 항체를 포함하는 것일 수 있다.

본원에서, 용어 "항체"는 전체 항체(whole antibody) 및 임의의 항원 결합 단편 또는 그의 단일쇄를 포함한다. "항체"는 디설파이드(disulfide) 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부위(VH 또는 HV) 및 중쇄 불변부위로 구성된다. 중쇄 불변부위는 3개의 영역, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부위(VL 또는 LV) 및 경쇄 불변부위로 이루어진다. 경쇄 불변부위는 하나의 영역, 즉 CL로 이루어진다. VH 및 VL 부위는 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 잘 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변부위로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(VH의 경우 HFR1, HCDR1, HFR2, HCDR2, HFR3, HCDR3, HFR4; VL의 경우 LFR1, LCDR1, LFR2, LCDR2, LFR3, LCDR3, LFR4)의 순서로, 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변부위는 항원과 상호작용하는 결합 영역을 함유한다. 불변부위는 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터(effector) 세포) 및 전통적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 비롯하여 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에서, 용어 "인간화 항체"는 분자의 항원 결합부는 실질적으로 비인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래한 반면, 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초하는 것인 분자를 가리킨다. 항원-결합 부분은 불변부위 상에 융합된 완전한 가변부위를 포함할 수도 있고 가변부위 내의 적절한 프레임워크 부분에 그래프트된 상보성 결정부(CDR)만을 포함할 수도 있다. 항원-결합 부분은 야생형이거나 1 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있는데, 예컨대, 인간 면역글로불린에 보다 더 밀접히 닮도록 변형될 수 있다. 인간화 항체들 중 몇몇 유형은 모든 CDR 서열을 보존한다(예컨대 토끼 항체로부터의 모든 6개의 CDR을 함유하는 인간화된 토끼 항체). 다른 유형들은 하나 이상의 CDR이 오리지널 항체와 다를 수 있다.

구체예에서, 항체는 인간 생식계열(germ-line) 면역글로불린과 비교하여 카밧 번호(Kabat numbering) 13Q, 37I, 74S, 77T 및 105Q 중 하나 이상을 갖는 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 22T, 43A, 83F 및 100Q 중 하나 이상을 갖는 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위; 또는 이들의 결합을 포함하는 것일 수 있다.

추가로, 중쇄 프레임워크는 49A 및 73D 중 하나 이상을 갖는 것일 수 있다.

예를 들면, 항체는 서열번호 39 또는 서열번호 53의 HFR1, 서열번호 40 또는 서열번호 54의 HFR2, 서열번호 41 또는 서열번호 55의 HFR3, 및 서열번호 42의 HFR4 중 하나 이상의 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 서열번호 43의 LFR1, 서열번호 44 또는 서열번호 56의 LFR2, 서열번호 45의 LFR3, 및 서열번호 46의 LFR4 중 하나 이상의 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위; 또는 이들의 결합을 포함하는 것일 수 있다.

예를 들면, 항체는 서열번호 47 또는 서열번호 57의 HCDR1, 서열번호 48 또는 서열번호 58의 HCDR2, 및 서열번호 49 또는 서열번호 59의 HCDR3 중 하나 이상의 중쇄 CDR을 갖는 중쇄 가변부위; 서열번호 50 또는 서열번호 60의 LCDR1, 서열번호 51 또는 서열번호 61의 LCDR2, 및 서열번호 52 또는 서열번호 62의 LCDR3 중 하나 이상의 경쇄 CDR을 갖는 경쇄 가변부위; 또는 이들의 결합을 포함하는 것일 수 있다.

예를 들면, 항체는 서열번호 30의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 31의 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.

예를 들면, 항체는 서열번호 33의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 34의 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 항체는 이펙터(effector) 기능이 감소 또는 제거된 것일 수 있다. 예를 들면, 항체는 FcγRⅠ, FcγR Ⅱ, FcγR Ⅲ, 및 FcRn 중 하나 이상에 대한 결합능이 감소 또는 제거된 것일 수 있다. 예를 들면, 항체는 L234A, L235A, P331G, I253A 및 H310A 중 하나 이상의 변이를 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 항체는 서열번호 32 또는 서열번호 38의 중쇄를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 항체는 VEGF에 대해 K_D 100 pM 이하의 결합 친화도를 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 항체는 VEGF에 대해 K_D 50 pM 이하, 30 pM 이하, 20 pM 이하, 15 pM 이하, 10 pM 이하, 5 pM 이하, 1~50 pM, 1~30 pM, 1~20 pM, 1~15 pM, 1~10 pM, 1~5 pM의 결합 친화도를 갖는 것일 수 있다.

구체예에서, 항체는 Tm 70 ℃ 이상의 열 안정성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 항체는 Tm 71 ℃ 이상, Tm 72 ℃ 이상, Tm 73 ℃ 이상, Tm 74 ℃ 이상, Tm 75 ℃ 이상, Tm 76 ℃ 이상, Tm 77 ℃ 이상, Tm 70~80 ℃, Tm 75~80 ℃, Tm 75~77 ℃의 열 안정성을 갖는 것일 수 있다.

구체예에서, 수성 제약 조성물은 상기 유효성분 이외에, 완충제 및 등장화제(tonicity agent)를 포함할 수 있다.

완충제는 예를 들어, pH를 5.0 내지 7.5 범위로 유지시키는 것으로서, 예를 들어, 수성 제약 조성물의 pH는 5.0 내지 7.5, 5.0 내지 7.0, 5.0 내지 6.5, 5.0 내지 6.0, 5.0 내지 5.5일 수 있다. 완충제의 예들은 당업계에 알려진 통상적인 것들 중 하나 이상으로서, 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염과 같은 유기산 염; 트리스, 트로메타민 히드로글로라이드 또는 포스페이트 완충제, 히스티딘과 같은 아미노산 완충제를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 완충제는 히스티딘 버퍼(histidine buffer)일 수 있다. 예를 들어, 완충제는 1~50 mM, 5~50 mM, 5~40 mM, 5~30 mM, 5~20 mM, 5~15 mM 범위의 농도를 가질 수 있다.

예를 들어, 등장화제는 염(salt)일 수 있다. 염은 NaCl, KCl, NaF, KBr, NaBr, Na₂SO₄, NaSCN, 및 K₂SO₄로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 특히 NaCl일 수 있다. 예를 들어, 염은 50~200 mM, 75~175 mM, 100~150 mM 범위의 농도를 가질 수 있다. 특정 예에서, 등장화제는 당 또는 당 알코올, 또는 폴리올이 아닌 것일 수 있다. 당 또는 당 알코올, 또는 폴리올의 예들은 트레할로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 글루코스, 글리세롤 등을 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 수성 제약 조성물은 안정화제, 계면활성제 또는 둘 다를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있으며, 예를 들어, 폴리소르베이트류(예컨대, 폴리소르베이트 20(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트), 폴리소르베이트 40(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트), 폴리소르베이트 60(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노스테아레이트), 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트); 상기 폴리옥시에틸렌 뒤의 수치(20)은 옥시에틸렌기(-(CH₂CH₂O)-)의 총 개수를 의미함), 폴록사머(PEO-PPO-PEO 공중합체; PEO: poly(ethylene oxide), PPO: poly(propylene oxide)), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 화합물(예컨대, 폴리옥시에틸렌-스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(알킬: C₁-C₃₀), 폴리옥시에틸렌 모노라우릴 에테르, 알킬페닐 폴리옥시에틸렌 코폴리머(알킬: C₁-C₃₀) 등), 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulphate, SDS) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트류(예컨대, 폴리소르베이트 20)일 수 있다. 상기 안정화제는 하나 이상의 아미노산 또는 그의 염, 예를 들어 히스티딘을 제외한 아미노산 또는 그의 염을 포함하는 것일 수 있다. 상기 아미노산의 예들은 발린, 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신, 이소류신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 프롤린을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 수성 제약 조성물은 프롤린을 포함하지 않을 수 있다. 다른 특정 예에서, 수성 제약 조성물은 프롤린을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 수성 제약 조성물은 항-VEGF 항체와 함께 5~50 mM의 히스티딘 버퍼 및 50~200 mM의 NaCl을 포함하거나(comprising) 이들을 필수성분으로 하여 이루어지거나(consisting essentially of) 이들로 이루어지는(consisting of) 것일 수 있다.

구체예에서, 수성 제약 조성물은 25 ℃에서 20 cP 이하의 점도를 가질 수 있다. 상기 점도는 25 ℃에서 1~20 cP, 2~18 cP, 2~15 cP, 3~15 cP, 2~10 cP, 3~10 cP, 5~15 cP, 5~10 cP 범위 내의 것일 수 있다.

구체예에서, 항-VEGF 항체를 포함하는 수성 제약 조성물은 다양한 질병 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 항-VEGF 항체를 포함하는 제약 조성물은 대상 또는 환자에서 혈관신생 질환, 특히 혈관신생 안 질환을 치료하는데 유용하다. 본 개시에 따른 수성 제약 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 "혈관신생 안 질환"은 비정상적인 혈관신생, 맥락막 혈관신생(CNV), 망막 혈관 투과성, 망막 부종, 당뇨병성 망막병증(특히 증식성 당뇨병성 망막병증), 당뇨 황반 부종, nAMD (신생혈관성 나이 관련 황반변성(AMD))와 관련된 CNV를 포함하는 신생혈관성 (삼출성) 나이 관련 황반변성(AMD), 망막 허혈과 연관된 후유증, 중심성 망막 정맥 폐색 (CRVO) 및 후안부 혈관신생(posterior segment neovascularization)을 포함하고 이로 제한되지 않는, 안 혈관신생과 관련된 병태, 질환 또는 장애를 포함한다.

구체예에서, 수성 제약 조성물은 항-VEGF 항체 이외에 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다. 추가의 약리학적 작용제는 예를 들어 안 질환 치료에 유용한 다른 항체를 포함할 수 있다.

구체예에서, 수성 제약 조성물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것일 수 있다. 비경구 투여(예컨대, 주사)인 경우에는 안구 내 투여(예컨대, 유리체내 투여), 정맥내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강내 투여, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 또는 종양내 투여 등일 수 있으며, 특히 유리체내 투여로 투여할 수 있다. 특정 예에서, 수성 제약 조성물은 항-VEGF 항체를 포함하는 안약 조성물일 수 있고, 이 경우, 눈의 유리체내로 투여되는 주사제일 수 있다.

구체예에서, 본 개시에 따른 제약 조성물은 나이, 건강상태, 질환의 중증도 등을 포함한 환자의 상태에 따라 안과 의사와 같은 전문가의 판단에 따라 적절한 투여 주기 및/또는 용량으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 항-VEGF 항체를 고농도로 함유할 수 있으므로, 한번에 투여되는 유효성분의 양을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 덜 빈번하게, 즉 보다 긴 주기로 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 3 개월 이상 마다 1회, 4개월 마다 1회, 5개월 마다 1회, 6개월 이상 마다 1회의 투여주기로 투여할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 부피당 투여되는 유효성분의 양을 증가시킬 수 있는바, 예를 들어 2~30 mg 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약 2 mg, 5 mg, 7.5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 또는 30 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 안내 투여에 적합한 다양한 부피, 예컨대 100 ㎕ 이하, 50 내지 100 ㎕, 50 ㎕ 이하로 투여될 수 있다.

구체예에서, 수성 제약 조성물은 용액 또는 동결건조 분말 형태일 수 있다. 상기 조성물은 바이알, 앰플, 또는 프리필드 시린지(pre-filled syringe)에 함유되어 있는 것일 수 있다. 특정 예에서, 본 개시의 수성 제약 조성물을 제공하기 위해 동결건조가 고려된다. 동결건조 기술은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 동결건조물은 환자에게 투여하기 전에, 수성 재구성제로 재구성해야 한다. 이 단계는 동결건조물 내의 항체 및 다른 성분을 재용해시켜 환자에게 주사하기 적합한 용액을 제공할 수 있게 한다. 재구성을 위해 사용되는 수성 매질의 부피는 생성된 제약 조성물 내의 항체의 농도를 결정한다. 동결건조 전 부피보다 작은 부피의 재구성제를 사용한 재구성은 동결건조 전보다 더 농축된 조성물을 제공한다. 재구성 인자(동결건조 후의 제제의 부피:동결건조 전 제제의 부피)는 1:0.5 내지 1:6일 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 동결건조물은 재구성되어 적어도 150 ㎎/㎖, 예를 들어 150~300 ㎎/㎖의 항-VEGF 항체 농도를 갖는 수성 조성물을 제공할 수 있고, 재구성제의 부피는 이에 따라 선택될 것이다. 필요한 경우, 재구성된 제제는 의도된 투여량을 전달하기에 적절할 때 환자에게 투여하기 전에 희석될 수 있다. 통상적인 재구성제는 임의로 보존제를 함유하는 멸균수 또는 완충제를 포함한다. 동결건조물이 완충제를 포함하는 경우, 재구성제는 추가의 완충제(동결건조물의 완충제와 동일하거나 상이할 수 있음)를 포함할 수 있거나 완충제(예를 들어, WFI(주사용수) 또는 생리 염수)를 포함하지 않을 수 있다.

본 개시의 수성 제약 조성물에 포함될 수 있는 다른 부형제의 예들은 항균제, 항산화제, 정전기 방지제, 지질, 예컨대 인지질 또는 지방산, 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤, 단백질 부형제, 예컨대 혈청 알부민(인간 혈청 알부민), 재조합 인간 알부민, 젤라틴, 카제인, 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨 등을 제한 없이 포함한다.

본 개시의 다른 측면은 항-VEGF를 고농도로 함유하는 수성 제약 조성물에 사용하기에 적합한 인간화 항-VEGF 항체가 제공된다.

상기 항체는 서열번호 39의 HFR1, 서열번호 40의 HFR2, 서열번호 41의 HFR3, 및 서열번호 42의 HFR4로 이루어지는 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 및 서열번호 43의 LFR1, 서열번호 44의 LFR2, 서열번호 45의 LFR3, 및 서열번호 46의 LFR4로 이루어지는 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항체는 서열번호 30의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 31의 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항체는 서열번호 32의 중쇄를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항체는 서열번호 53의 HFR1, 서열번호 54의 HFR2, 서열번호 55의 HFR3, 및 서열번호 42의 HFR4로 이루어지는 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 및 서열번호 43의 LFR1, 서열번호 56의 LFR2, 서열번호 45의 LFR3, 및 서열번호 46의 LFR4로 이루어지는 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항체는 서열번호 33의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 34의 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항체는 서열번호 38의 중쇄를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항체는 서열번호 35, 서열번호 36 또는 서열번호 37의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 34의 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.

본 개시의 또 다른 측면은 상기 수성 제약 조성물 또는 상기 인간화 항-VEGF 항체를 치료학적 유효량(therapeutically effective amount)으로 대상 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, VEGF에 의해 매개되는 질환 또는 장애, 예를 들어 혈관신생 질환, 예를 들어 혈관신생 안 질환, 특히 나이 관련 황반변성을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

용어 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 치료를 필요로 하는 대상 또는 환자에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다.

용어 "치료(treating 또는 treatment)"는 대상, 예컨대 사람을 포함한 포유류에서 질환 또는 의학적 증상을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다:

(a) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 대상에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는

(b) 대상에서 질환 또는 의학적 증상을 경감.

본원에서, "대상" 또는 "환자"라는 용어는 영장류, 토끼, 돼지, 말, 개, 고양이, 양 및 소를 포함하고 이로 제한되지 않는 인간 및 비-인간 포유동물을 지칭한다. 예를 들어, 대상 또는 환자는 인간이다.

본 개시의 추가적인 측면은 상기 수성 제약 조성물 또는 상기 인간화 항-VEGF 항체를 대상 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상 또는 인간에게 항-VEGF 항체를 전달하는 방법을 제공한다.

추가적인 다른 측면은 VEGF에 의해 매개되는 질환 또는 장애, 예를 들어 혈관신생 질환, 예를 들어 혈관신생 안 질환, 특히 나이 관련 황반변성을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서 상기 수성 제약 조성물 또는 상기 인간화 항-VEGF 항체의 용도를 제공한다.

추가적인 또 다른 측면은 상기 수성 제약 조성물 또는 상기 인간화 항-VEGF 항체를 사용하여 VEGF에 의해 매개되는 질환 또는 장애, 예를 들어 혈관신생 질환, 예를 들어 혈관신생 안 질환, 특히 나이 관련 황반변성을 치료하기 위한 약제를 제조하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1> 토끼 면역화 및 면역 라이브러리 제조

토끼(New Zealand White) 4마리에게 VEGF165(Sino biological, CA)를 4차에 걸쳐 복강 투여하여 VEGF로 면역화하였다. 면역화된 토끼 4마리의 비장 및 골수 추출물을 받아 RNA를 분리하였다. GoScripts 키트(Promega, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 cDNA를 합성하였다. 이때 사용한 mRNA는 2 ㎍이었다.

상기 cDNA를 주형으로 하여 토끼 항체의 가변부위(VL와 VH) 유전자를 증폭하였다. 먼저, 토끼 항체의 경쇄 가변부위(VL)를 증폭하기 위하여, 상기 cDNA를 주형으로 토끼 경쇄 가변부위의 서열번호 1, 2, 3, 7로 기재되는 5' 특이적 프라이머들과 서열번호 4, 5, 6, 8로 기재되는 3' 특이적 프라이머들을 각각 쌍으로 사용하여 PCR을 수행하여 토끼 항체 경쇄 유전자를 선택적으로 증폭하였다. 또한, 토끼 항체의 중쇄 가변부위(VH)를 증폭하기 위하여, 상기 cDNA를 주형으로 토끼 중쇄 가변부위의 서열번호 9, 10, 11, 12로 기재되는 5' 특이적 프라이머들과 서열번호 13, 14로 기재되는 3' 특이적 프라이머들을 각각 쌍으로 사용하여 PCR을 수행하여 토끼 항체 중쇄 유전자를 선택적으로 증폭하였다. 마지막으로, scFv 링커 부분을 증폭하기 위하여, pCom3XSS-scFv DNA를 주형으로 서열번호 15, 16, 17로 기재되는 5' 특이적 프라이머들과 서열번호 18, 19, 20, 21로 기재되는 3' 특이적 프라이머들을 각각 쌍으로 사용하여 PCR을 수행하여 링커 유전자를 선택적으로 증폭하였다.

상기 PCR에서 증폭된 각각의 VL과 링커 그리고 VH 유전자를 주형으로 연장(extension) PCR을 수행하였다. 먼저, VL 유전자의 연장 PCR을 위하여, 상기 PCR에서 증폭된 100 ng의 VL, 링커, VH 유전자와, 서열번호 22로 기재되는 프라이머와 서열번호 23으로 기재되는 프라이머를 이용하였다. 이들 PCR 반응조건은 95 ℃에서 5 분간 예비변성 후, 95 ℃에서 50 초, 55 ℃에서 50 초, 72 ℃에서 1 분으로 Ex-Taq DNA 중합효소(Takara사)를 사용하여 30회 반복 수행하였다.

위에서 얻은 VL-Linker-VH(scFv) 유전자와 pCom3XSS 벡터를 각각 제한효소 SfiⅠ으로 절단한 후 정제하고 절단된 두 DNA 단편을 접합(ligation)시킨 후 효소를 불활성화시켰다. 그 후에 XXPC DNA 농축 칼럼을 이용하여 증류수로 용출한 후, 상기 라이브러리 DNA를 E. coli ER2738에 전기충격유전자전달법(electroporation)으로 형질전환시켰다.

그 후 SOC 배지에서 배양한 후 500 ㎖ SB + 카르베니실린(50 ㎍/㎖)과 M13K07 헬퍼 파지(MOI: 1:20)가 있는 2 L 플라스크에 넣고 37 ℃ 30 분간 정치하고 카나마이신을 50 ㎍/㎖이 되도록 넣고 30 ℃에서 하룻밤 동안 진탕배양하였다. 다음날 배양액을 원심분리하여 세포를 침전시키고, 상층액에 있는 라이브러리 파지만을 수거하였다.

<실시예 2> 파지 라이브러리 스크리닝

위에서 제조한 토끼 면역 라이브러리 파지를 이용하여 패닝(panning) 및 스크리닝을 수행하였다. 5 ㎍/㎖ 재조합 인간 VEGF 융합 단백질로 코팅된 Immunotube(Immuno™tube)로 3회의 바이오 패닝을 수행하여, 인간 VEGF에 반응성을 가지는 클론을 선별하였다. 아웃풋 플레이트에서 자란 콜로니에서 무작위로 96개의 파지 클론을 선별하여, 파지 효소 면역어세이를 통해 인간 VEGF에 대한 반응성을 테스트하였다.

최종 선별된 클론에 대하여 DNA를 시퀀싱하여, 상이한 상보성 결정부위 서열을 가지는 것으로 확인된 6개의 scFv 클론으로 분류하였다. 이후 VEGF 결합능을 확인하기 위한 효소 면역에세이를 통하여 최종 1종의 2-19 클론을 선별하였으며, 이것이 서열번호 24 및 서열번호 25로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 26 및 서열번호 27로 기재되는 염기서열을 코딩하고 있음을 확인하였다.

<실시예 3> 토끼 항-VEGF 항체에 대한 인간화 항체 제조

인간화 항체 디자인을 위하여 IMGT/V-QUEST에서 2-19 클론의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위와 가장 유사한 인간 생식계(germ-line) 서열을 확인하였다. 중쇄 가변부위의 경우 IGHV3-21 및 IGHV3-53이며, 경쇄의 경우 IGKV1-27이 가장 높은 유사성을 보임을 확인하였다. 이 서열을 토대로 대부분의 프레임워크 부분은 인간 서열로 바꾸고 항원 결합에 영향을 줄 수 있는 중쇄 서열, 카밧 번호 D28, D30의 경우 토끼 서열로, V24의 경우 V 또는 A, V37의 경우 V 또는 I, G49의 경우 G 또는 A, S73의 경우 S 또는 D, F91의 경우 F 또는 Y로 토끼 서열 및 인간 서열이 들어가도록 하였으며, T63의 경우 CDR 내에 당화가 생성되므로 A로 치환하는 것으로 디자인하였다. 경쇄의 경우 카밧 번호 N22의 경우 N 또는 T, P43의 경우 P 또는 A, L48의 경우 L 또는 I, A83의 경우 V 또는 F, F91의 경우 F 또는 Y로 토끼 서열 및 인간 서열이 들어가도록 디자인하였다. 도 1에 토끼 및 인간화 항-VEGF 항체의 아미노산을 비교하여 나타내었다. 도 1에서 굵은 체가 인간 서열이고, 밑줄친 부분이 용해도 증대에 기여한 아미노산이다.

인간화 서열로 변환하고자 하는 중쇄 및 경쇄 부분 및 2-19 scFv 형태를 전체 IgG 형태로 변환하기 위하여 서열번호 26 및 서열번호 27을 주형으로 하여 합성 올리고 프라이머를 조합시킨 PCR(assembly PCR)을 수행하였다. 동물 발현 벡터 pCEP6-WPRE (Fc 부분이 삽입되어 있는 벡터)에 대한 TAKARA사 인퓨전 키트(Infusion kit) 내의 지시사항에 따라 인간화 항체 경쇄 발현벡터 및 중쇄 발현벡터 2-19에 대해 동일한 방법으로 제조한 후 DNA 서열분석을 통하여 확인하였다. 서열번호는 다음과 같다: Hz1 HV; 서열번호 28, Hz1 LV; 서열번호 29, Hz2 HV; 서열번호 30, Hz2 LV; 서열번호 31.

<실시예 4> 라니비주맙의 활성 증대 및 친수성 향상을 위한 변이 항-VEGF 항체 제조

라니비주맙(루센티스) Fab 형태에서 전체 항체 형태로 전환, 활성증대 및 친수성 향상을 위하여 Hz2 항체의 중쇄 가변부위의 프레임워크 부분 서열로 교체하기 위하여 파지 라이브러리를 제조하였다. 중쇄 가변부위의 프레임워크 부분의 경우 Hz2 서열을 토대로 카밧 번호 A24, V27, G49, F69, L71, T73, S76, A78, K94 서열을 V, I, A, F, L, T, S, A, R로 치환될 수 있도록 프라이머를 제조하여 실시예 2의 방법으로 라이브러리 제조 및 스크리닝을 수행하였다. 그 결과 10개의 후보군을 확보하였으며, 그 중 결합력이 좋은 4개의 클론, Lu007(서열번호 33, 서열번호34), F8(서열번호 35, 서열번호34), E9(서열번호 36, 서열번호34), H2(서열번호 37, 서열번호34)를 선별하였다. 도 2에 루센티스와 변이 루센티스의 아미노산 서열을 비교하여 나타내었다. 도 2에서 굵은 체는 Hz2 서열을, 밑줄 친 부분은 Hz2 아미노산, HCDR3 변형 아미노산을 나타낸다.

<실시예 5> 항체 발현 및 정제

인간화 항체 발현은 ExpiCHO-S 시스템(Thermo 사)을 사용하였다. 햄스터 자궁세포 ExpiCHO-S의 일반 배양은 제조사의 지사에 따라 수행하였다. 12일 후에 배양액을 회수한 후 5000 rpm, 15 분, 실온에서 원심분리한 후 0.22 ㎛ Amicon Ultra-15(Millipore사) 필터를 통과시켜 세포 찌꺼기를 제거한 후, AKTA pure 기기 및 Mabselectsure(GE사) 컬럼을 사용하여 정제하였다.

<실시예 6> VEGF 결합능 확인을 위한 ELISA 수행

VEGF에 대한 결합능을 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다. 먼저 hVEGF를 500 ng/㎖의 농도로 하여 이뮤노플레이트에 100 ㎕를 첨가하여 상온에서 1 시간 동안 반응하였다. 2% 스킴 밀크를 PBST에 녹여 제조한 후 VEGF 코팅이 끝난 웰에 200 ㎕를 첨가하여 2 시간 상온에서 반응하였다. 반응 후 PBST 300 ㎕를 사용하여 3번 웰을 씻어 준 후 위에서 정제된 Hz1(서열번호 28, 서열번호 29로 제조된 인간화 항체), Hz2(서열번호 30, 서열번호 31로 제조된 인간화 항체), RIgG1(서열번호 24, 서열번호 25로 제조된 토끼 항체), Lu007(서열번호 33, 서열번호 34), F8(서열번호 35, 서열번호 34), E9(서열번호 36, 서열번호34), H2(서열번호 37, 서열번호 34) 100 ng/㎖의 농도로 시작하여 2배씩 희석하여 총 11개 시료를 만들어 VEGF 코팅된 웰에 넣고 상온에서 20 분간 반응하였다. 반응 후 PBST 300 ㎕를 사용하여 3번 웰을 씻어 준 후 100 ㎕/웰로 항-hIgG-Fc HRP(1:3000, Thermo사)를 첨가한 후 30 분간 반응하고 다시 위와 같이 3번 씻어 준 후 TMB(BioFx사) 용액을 100 ㎕/웰로 넣고 5 분간 실온에서 발색하였다. 발색이 끝나면 2 M 황산 50 ㎕/웰로 첨가하여 발색을 중단하고 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, Hz1, Hz2와 토끼 항체인 RigG1의 VEGF 결합능에 차이가 없이 모두 VEGF에 결합함을 확인하였다. 또한 도 3에서 보는 바와 같이 변이체가 루센티스-Ig 보다 동등하거나 Lu007의 경우 더 좋은 결합능을 보임을 확인하였다.

<실시예 7> 옥텟을 이용한 항체 친화도 결정

VEGF에 대한 친화도 결정은 다음과 같이 수행하였다. Octet red96E를 사용하였으며, 바이오센서 AR2G에 고정화한 인간 VEGF와 애널라이트로서 사용한 RigG1, Hz1, Hz2, Lu007, 루센티스-Ig를 상호작용시켜 그 결합 및 해리 값을 비교하여 측정하였다. 인간 VEGF는 재조합 인간 VEGF165(Sino biological, CA)를 사용하였으며, 아민 커플링법에 의해 AR2G 센서칩에 VEGF를 고정화하였다. 이때 사용된 VEGF의 양은 10 ㎍/㎖이며, 5 ㎚ 파장으로 코팅 정도를 확인하였다. 각각 농도에 따른 반응성을 확인하기 위하여 항체 농도를 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56, 0.78 nM로 하여 측정하였다. 측정시 회전 속도는 100으로 설정하였으며, 온도는 30 ℃에서 측정하였다. 시료는 키네틱 버퍼(Molecular Device사)를 사용하여 농도를 조절하였다. 각각 농도의 항체 용액으로 5 분간 결합상으로 하고 그 후 키네틱 버퍼로 전환하여 30 분간 해리상으로 하였다. 각 항체에 대한 측정값은 표 1에 나타내었다. 그 결과 RigG1, Hz1과 Hz2 모두에서 5 pM 이하의 아주 우수한 친화도를 나타냄을 확인하였으며, Lu007 및 루센티스-Ig 또한 12, 14 pM 수준으로 우수한 친화도를 나타냄을 확인하였다.

옥텟을 이용하여 측정한 친화도

Replicate Group	K_D(M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
RigG1	3.98E-12	7.75E+05	3.08E-06
Hz1	4.71E-12	6.85E+05	3.22E-06
Hz2	1.93E-12	5.05E+05	9.73E-07
Hz2-F	3.98E-12	7.75E+05	3.08E-06
Lu007	1.22E-11	2.37E+05	2.89E-06
Lucentis-Ig	1.48E-11	4.00E+05	5.92E-06

<실시예 8> 항-VEGF 항체의 HUVEC 세포에서 VEGF에 의해 유도되는 칼슘 억제 효능 비교

항체의 VEGF 억제 효능을 비교하기 위하여 HUVEC 세포 내에서 VEGF에 의한 칼슘 증가 양을 비교하였다. 시료는 Hz1, Hz2, 아플리버셉트(아일리아), 베바시주맙(아바스틴), 루센티스-Ig, Lu007을 사용하여 비교 시험을 수행하였다. EGM-2 SingleQuots(Lonza-Clonetics, Walkersville, MD, #CC-4176)를 넣은 EBM-2(Lonza-Clonetics, Walkersville, MD)에서 계대 2~7로 유지한 HUVEC(LONZA, C2519AS) 세포를 사용하였으며, HUVEC 세포를 0.1% 콜라겐으로 코팅된 흑색 96-웰 플레이트(NUNC, 165305) 상에 30,000 세포/웰로 분주하여 하루 배양 후 칼슘 분석을 진행하였다. 정제된 물질을 넣지 않거나, 0.078125, 0.15625, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 또는 20 nM을 VEGF165(R&D systems, 293-VE-500) 1.5 nM과 섞은 후 상온에서 30 분 인큐베이팅하여 항체-항원간 결합을 유도하였다. 세포 내의 칼슘양 측정은 칼슘 분석 키트(BD, #640176)를 제조사 지시에 따라 이용하였으며, 칼슘 인디케이터 염료를 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 항온 처리를 하였다. 혼합물질 처리와 변화하는 HUVEC 세포내의 칼슘양 측정은 플렉스스테이션(Flexstation Ⅲ ROM v2.1.28, Molecular Devices)를 이용하였으며, 세포 플레이트에 50 ㎕의 처리물을 자동기계장치로 가한 후 칼슘 지시인자 염료로부터 수득되는 형광성(여기=485 ㎚; 방출=525 ㎚)을 150 초의 기간에 걸쳐 매 3초마다 기록하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, Hz1, Hz2 및 Lu007, 루센티스-Ig의 경우 상용화 되어 시판되고 있는 아플리버셉트와 거의 유사한 0.8-0.87 nM 범위로 동등한 IC50 값을 갖는 것을 확인하였으며, 이것은 1.2 nM인 아바스틴 보다는 좋은 것이었다.

<실시예 9> Hz1 및 Hz2의 고농도 농축 시 점도 측정 및 응집체 측정

고농도로 단백질을 농축 시 가장 문제가 되는 것이 급격한 점도 상승을 들 수 있다. 이런 점에서 농축 후 점도의 중요성을 확인할 수 있다. 일반적으로 단백질 제제의 허용 점도 범위는 20 cP 이하라고 알려져 있다. 고농도 농축 후 점도 측정 및 응집체 형성은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

정제 완료된 Hz1, Hz2를 10 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 6.2의 용액에서 한외여과막에 의해 농축을 시행하였으며, 최종 200 ㎎/㎖의 농도까지 농축하였다. 농축과정의 시간을 비교해 보면 Hz1의 경우 Hz2 보다 오랜 시간 농축이 필요하다는 것을 확인하였다. 농축 완료 후 먼저 겔 여과 크로마토그래피법을 이용하여 응집체의 형성 유무를 확인하였다. 조건은 다음과 같다. Waters Alliance 기기에 SEC-3 300A, 7.8X300 ㎜(Agilent사) 컬럼을 사용하였으며, 이동상은 1X PBS pH 7.4 버퍼를 사용하였으며, 유속은 1.0 ㎖/min의 조건으로 시험을 진행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, Hz1의 경우 응집체 형성이 5%로서 Hz2의 0.85 보다 5.8배 응집체 형성이 높게 나타남을 확인하였으며, Lu007의 경우 응집체 형성은 1.1%로 높지 않음을 확인하였다.

점도 측정은 다음과 같이 수행하였다. m-VROC 미소유동 점도계(RheoSense) 를 사용하였으며 25 ℃에서 온도 평형 후 점도를 각 농도에서 3 회 측정하고, 평균 점도(Viscosity, mPa·s)를 산출하였다. 0.5 ㎖ 헤밀턴 시린지에 0.3 ㎖ 시료를 주입한 후 시린지를 칩 봉입대에 장착하고 열 재킷 내에 안착시킨 후 시료를 측정하였다. m-VROC 점도계는 50 마이크론 채널로 제조된 B05 칩이 장착되었으며 칩의 최대 압력의 대략 20%, 40% 및 60%인 다중 유속에서 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, 점도 또한 Hz2가 Hz1보다 두배 낮은 12 cP로 나타남을 확인하였다.

두 결과를 종합해 볼 때, 고농도에서 Hz2가 응집 형성이 낮고 점도가 낮은 이점을 갖는 것으로 보이며, 이는 두 항체간 프레임워크 부분의 서열의 차이에서 기인한다고 할 수 있으며, Hz2의 서열이 응집체 형성 및 점도를 낮추는데 기여한다고 생각되었다.

<실시예 10> Tm 값 측정을 통한 항-VEGF 항체의 열 안정성 평가

안정한 항체 제제를 조제하기 위하여 높은 열 안정성을 갖는 것이 바람직하다. 안정성의 평가방법으로서 열변성 중간온도(Tm 값)의 평가를 수행하였으며, 일반적으로 열변성 중간온도는 높은 것이 바람직하다. 각 항체의 열안정성은 단백질의 접힌 상태에서 단백질의 내부에 위치하는 소수성 부분이 노출되면서 소수성 부분과 결합력을 갖는 염료가 도입됨에 따라 온도 증가에 의한 염료의 형광을 측정함으로써 수행되는 열이동분석법(PTS)을 사용하였다. 프로틴 써멀 시프트 다이 키트(Protein Thermal Shift Dye Kit)(Catalog No. 4461146, Applied Biosystems)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 PTS 어세이를 수행하였다. 구체적으로는, 각 항체 5 ㎍를 프로틴 써멀 시프트 다이와 버퍼로 20 ㎕가 되게 혼합한 후 RT-PCR(C1000 thermal cycler equipped with a CFX96 optical reaction module, Bio-Rad)에서 20 ℃에서부터 60 초당 1 ℃씩 온도를 증가시키면서 95 ℃까지 ROX 시그널을 모니터링하였다. 용융 곡선을 바탕으로 각 항체의 용해점(melting temperature, T_m)을 결정하였다. 상기 항체의 용해점을 표 2에 나타내었다.

열이동분석법을 이용한 Hz1 밑 Hz2의 열안정성 시험

시료	T _m (℃)
Hz1	74
Hz2	75
Lu007	77
Lucentis-Ig	72
Avastin	71

결과를 보면 Hz1 및 Hz2가 열안정성에서는 크게 다르지 않는 것을 확인하였으며, 약 1 ℃의 차이를 나타냄을 확인하였다. 대조군으로 사용한 아바스틴의 경우 보다는 4 ℃ 정도 차이가 나는 것을 볼 때 열 안정성이 좋다고 할 수 있다. Lu007의 경우 대조군인 루센티스-Ig에 비하여 5 ℃ 이상 차이를 보였다.

<실시예 11> Hz2, Hz2-F, Lu007의 FcγR Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ에 대한 결합 평가

항원 중화능만이 목적인 항체 의약품의 경우 Fc 영역이 갖는 ADCC 등의 이펙터 기능은 필요하지 않으며, 더욱이 눈과 같은 특정 부분에서 작용하는 항체의 경우 시스템에서 오래 지속되는 것은 바람직하지 않기 때문에 Fc 영역의 Fcγ 수용체 및 FcRn의 결합은 불필요하다.

가변부위 서열로는 중쇄 서열번호 30과 경쇄 서열번호 31을 사용하였으며, Fc 부분에 대한 Fcγ 수용체 결합을 저하시키기 위해 L234A, L235A, P331G의 변이를 도입하고 FcRn 결합을 저해시키기 위해 I253A, H310A의 변이를 도입한 Hz2-F 발현벡터를 제작하였다. 발현벡터 제조는 실시예 2의 방법으로 제작하고 중쇄는 Hz2-F HC(서열번호 32)를 사용하고 경쇄는 Hz2 LV를 사용하여 실시예 2의 방법으로 배양 및 정제를 수행하였다. 동일한 방법으로 Lu007-F(서열번호 38)를 제조하였다.

FcγRⅠ, Ⅱ, Ⅲ에 대한 결합평가는 이하와 같이 행하였다. Octet red96E를 사용하였으며, 항-펜타 his 바이오센서에 100 mM FcγRⅠ(R&D system사, 1257-Fc), FcγRⅡ(R&D system사, 1597-CF), FcγRⅢ(R&D system사, 1257-Fc)로 5 ㎚ 정도의 코팅 정도를 확인하였다. FcγRⅠ, FcγRⅡ, FcγRⅢ에 대한 Hz2(서열번호 30과 서열번호 31을 갖는 항체)와 Hz2-F(서열번호 32와 서열번호 31을 갖는 항체)의 반응성을 확인하기 위하여 항체 농도를 100 nM의 농도를 아날라이트로 하여 결합력을 측정하였다. 측정시 rpm은 100으로 설정하였으며, 온도는 30 ℃에서 측정하였다. 시료는 키네틱 버퍼(Molecular Device사)를 사용하여 희석하였다. 각각 농도의 항체 용액으로 2 분간 결합상으로 하고 그 후 키네틱 버퍼로 전환하여 2 분간 해리상으로 하였다. Fcγ 수용체와 항체의 결합력은 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, Hz2는 정상적으로 Fcγ 수용체와 결합을 하는 것으로 보이며, Fcγ 수용체와의 결합력을 약화시킨 Hz2-F 및 Lu007-F의 경우 예상한대로 결합이 약한 것을 확인하였다.

<실시예 12> Hz2, Hz2-F, Lu007-F의 FcRn에 대한 결합 평가

FcRn(R&D system사, 8639-Fc)에 대한 결합평가는 이하와 같이 행하였다. Octet red96E를 사용하였으며, FAB2G(anti-Fab 2^nd generation) 바이오센서에 10 ㎍/㎖의 Hz2, Hz2-F 항체를 코팅하여 약 5 ㎚ 정도의 코팅 정도를 확인하였다. FcRn의 반응성을 확인하기 위하여 FcRn 농도를 400 nM가 되도록 FcRn 결합 버퍼(100 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH 6.0)로 희석하여 아날라이트로 사용하였으며, 측정시 rpm은 100으로 설정하였으며, 온도는 30 ℃에서 측정하였다. 시료는 FcRn 결합 버퍼를 사용하여 희석하였다. 400 mM FcRn 농도의 용액으로 2 분간 결합상으로 하고 그 후 FcRn 결합 버퍼로 전환하여 2 분간 해리상으로 하였다. FcRn과 항체의 결합력은 도 8에 나타내였다. 도 8에 나타난 바와 같이, Hz2는 정상적으로 FcRn과 결합을 하는 것으로 보이며, FcRn과의 결합력을 약화시킨 Hz2-F, Lu007-F의 경우 예상한대로 결합이 약한 것을 확인하였다.

<실시예 13> Hz1, Hz2-F, Lu007-F에 대한 고농축 제제 제조

고농도로 단백질을 농축할 때 가장 문제가 되는 것이 급격한 점도 상승을 들 수 있다. 이런 점에서 농축 후 점도의 중요성을 확인할 수 있다. 일반적으로 단백질 제제의 허용 점도 범위는 20 cP 이하라고 알려져 있다. 이러한 고농축 시 문제가 되는 점도의 증가를 개선하고자 세 가지 제제를 사용하여 고농축 항체를 제조하고 점도를 측정 비교하였다.

	제제 1	제제 2	제제 3
Histidine	10 mM	10 mM	10 mM
NaCl	135 mM	135 mM	135 mM
Proline	-	200 mM	200 mM
pH	5.5	5.0	5.5

Hz1의 경우 150, 180, 200 ㎎/㎖의 농도로 제제 1과 제제 2를 사용하여 한외여과막을 이용하여 농축을 수행하였다. Hz2-F의 경우 150, 180, 200, 230, 300 ㎎/㎖의 농도로 위와 같은 방법으로 농축을 수행하였다. 루센티스-Ig의 경우 제제 3을 이용하여 농도를 150, 180, 200 ㎎/㎖까지 농축을 수행하였으며, Lu007의 경우 제제 2와 3을 이용하여 150, 180, 200, 230, 300 ㎎/㎖의 농도로 농축하였다.

농축이 완료된 후 점도 측정은 다음과 같이 수행하였다. m-VROC 미소유동 점도계(RheoSense)를 사용하였으며 25 ℃에서 온도 평형 후 점도를 각 농도 3회 측정하고, 평균 점도(Viscosity, mPa·s)를 산출하였다. 0.5 ㎖ 헤밀턴 시린지에 0.3 ㎖ 시료를 주입한 후 시린지를 칩 봉입대에 장착하고 열 재킷 내에 안착시킨 후 시료를 측정하였다. m-VROC 점도계는 50 마이크론 채널로 제조된 B05 칩이 장착되었으며 칩의 최대 압력의 대략 20%, 40% 및 60%인 다중 유속에서 측정하였다. 그 결과를 표 4 및 5에 나타내였다.

Hz1 및 Hz2-F에 대한 고농축 후 점도확인 시험

시료명	항체 농도(㎎/㎖)	제제1의 점도(cP)	제제2의 점도(cP)
Hz1	150	3.8	2.8
	180	5.6	7.2
	200	10.0	12
Hz2-F	150	3.0	2.8
	180	4.5	3.8
	200	5.1	8.0
	230	6.9	10.0
	300	15.0	20.2

루센티스-Ig 및 Lu007-F에 대한 고농축 후 점도확인 시험

시료명	항체 농도(㎎/㎖)	제제2의 점도(CP)	제제3의 점도(CP)
Lucentis-Ig	150	-	4.6
	180	-	7.8
	200	-	11.0
Lu007-F	150	3.0	3.3
	180	4.4	4.2
	200	5.3	7.8
	230	6.9	9.0

표 4에서 보는 바와 같이, Hz1의 경우 버퍼 안의 프롤린의 첨가 유무와 상관없이 농도가 높아질수록 점도가 증가하는 것을 확인하였다. Hz2-F의 경우 제제 1의 경우 농도가 높아질수록 점도가 증가하는 것을 확인하였으나 300 ㎎/㎖에서도 점도 허용치인 20 cP 보다 낮은 15 cP를 나타냄을 확인하였다. 그러나 프롤린의 첨가에 따른 효과는 나타나지 않았으며, 오히려 점도가 높아짐을 확인하였다. 300 ㎎/㎖의 농도에서 15 cP 점도를 갖는 Hz2-F의 경우 히스티딘 및 NaCl을 이용해도 고농도 제형의 항체 제조에 적합하다고 할 수 있다.

Lu007-F의 경우, 표 5에서 보는 바와 같이 버퍼 안의 프롤린의 첨가 유무와 상관없이 농도가 높아질수록 점도가 증가하는 것으로 보였으며, pH가 낮을수록 점도가 낮아지는 것을 확인하였다. 즉 Lu007-F의 경우 프롤린의 첨가보다는 pH를 낮춤으로 해서 좀 더 점도 증가를 줄일 수 있을 것으로 생각되었다.

<110> Medytox Inc. <120> High concentration anti-VEGF antibody formulation and anti-VEGF antibody for use in the same <130> 37-KR-GN-1 <160> 62 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gggcccaggc ggccgagctc gtgmtgaccc agactcca 38 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gggcccaggc ggccgagctc gatmtgaccc agactcca 38 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gggcccaggc ggccgagctc gtgatgaccc agactgaa 38 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tctagaggaa ccacctagga tctccagctc ggtccc 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tctagaggaa ccacctttga tttccacatt ggtgcc 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tctagaggaa ccacctttga csaccacctc ggtccc 36 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gggcccaggc 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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 caatgtggaa atcaaaggtg gttcctctag atct 34 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cgaggtggts gtcaaaggtg gttcctctag atct 34 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 actcctccac cgactgccca ccaccgcc 28 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 actccttcac cgactgccca ccaccgcc 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 actcctccar cgactgccca ccaccgcc 28 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tccaycagct gctsctgccc accaccgcc 29 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgag 38 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gaggaggagg aggaggagcc tggccggcct ggcctgag 38 <210> 24 <211> 116 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 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Claims

유효성분으로 혈관 내피 성장인자(VEGF)에 대한 인간화 항체를 150 ㎎/㎖ 이상의 농도로 포함하는, 안정한 수성 제약 조성물.
제1항에 있어서, 항체는 인간 생식계열(germ-line) 면역글로불린과 비교하여 카밧 번호 13Q, 37I, 74S, 77T 및 105Q 중 하나 이상을 갖는 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 22T, 43A, 83F 및 100Q 중 하나 이상을 갖는 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위; 또는 이들의 결합을 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 중쇄 프레임워크는 49A 및 73D 중 하나 이상을 추가로 갖는 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호 39 또는 서열번호 53의 HFR1, 서열번호 40 또는 서열번호 54의 HFR2, 서열번호 41 또는 서열번호 55의 HFR3, 및 서열번호 42의 HFR4 중 하나 이상의 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 서열번호 43의 LFR1, 서열번호 44 또는 서열번호 56의 LFR2, 서열번호 45의 LFR3, 및 서열번호 46의 LFR4 중 하나 이상의 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위; 또는 이들의 결합을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호 47 또는 서열번호 57의 HCDR1, 서열번호 48 또는 서열번호 58의 HCDR2, 및 서열번호 49 또는 서열번호 59의 HCDR3 중 하나 이상의 중쇄 CDR을 갖는 중쇄 가변부위; 서열번호 50 또는 서열번호 60의 LCDR1, 서열번호 51 또는 서열번호 61의 LCDR2, 및 서열번호 52 또는 서열번호 62의 LCDR3 중 하나 이상의 경쇄 CDR을 갖는 경쇄 가변부위; 또는 이들의 결합을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호 30의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 31의 경쇄 가변부위를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호 33의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 34의 경쇄 가변부위를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 이펙터(effector) 기능이 감소 또는 제거된 것인 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 FcγRⅠ, FcγRⅡ, FcγR Ⅲ, 및 FcRn 중 하나 이상에 대한 결합능이 감소 또는 제거된 것인 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 L234A, L235A, P331G, I253A 및 H310A 중 하나 이상의 변이를 갖는 것인 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호 32 또는 서열번호 38의 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 농도는 150~300 ㎎/㎖인 것인 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 VEGF에 대해 K_D 100 pM 이하의 결합 친화도를 갖는 것인 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Tm 75 ℃ 이상의 열 안정성을 갖는 것인 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제 및 등장화제(tonicity agent)를 포함하는 조성물.
제15항에 있어서, 완충제는 pH를 5.0 내지 7.5 범위로 유지시키는 것인 조성물.
제15항 또는 제16항에 있어서, 완충제는 히스티딘 버퍼(histidine buffer)인 것인 조성물.
제15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제는 5~50 mM 범위의 농도를 갖는 것인 조성물.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 등장화제는 염(salt)인 것인 조성물.
제19항에 있어서, 염은 NaCl, KCl, NaF, KBr, NaBr, Na₂SO₄, NaSCN, 및 K₂SO₄로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 조성물.
제19항 또는 제20항에 있어서, 염은 50~200 mM 범위의 농도를 갖는 것인 조성물.
제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 등장화제는 당 또는 당 알코올, 또는 폴리올이 아닌 것인 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제, 계면활성제 또는 둘 다를 포함하지 않는 조성물.
제23항에 있어서, 계면활성제는 폴리솔베이트를 포함하는 것인 조성물.
제23항 또는 제24항에 있어서, 안정화제는 하나 이상의 아미노산 또는 그의 염을 포함하는 것인 조성물.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 5~50 mM의 히스티딘 버퍼 및 50~200 mM의 NaCl을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 25 ℃에서 20 cP 이하의 점도를 갖는 조성물.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관신생 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
제28항에 있어서, 혈관신생 질환은 안 질환인 것인 조성물.
제29항에 있어서, 안 질환은 비정상적인 혈관형성, 맥락막 혈관신생(CNV), 망막 혈관 투과성, 망막 부종, 당뇨병성 망막병증, 당뇨 황반 부종, 신생혈관성 나이 관련 황반변성(AMD), 신생혈관성(삼출성) 나이 관련 황반변성(AMD), 망막 허혈과 연관된 후유증, 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO) 및 후안부 혈관신생(posterior segment neovascularization)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 조성물.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 비경구로 투여하기 위한 조성물.
제31항에 있어서, 유리체 내로 주사하기 위한 조성물.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 3 개월 이상 마다 1회 투여주기로 투여하기 위한 조성물.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 2~30 ㎎ 범위의 용량으로 투여하기 위한 조성물.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 또는 동결건조 분말 형태인 조성물.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 바이알, 앰플, 또는 프리필드 시린지에 함유되어 있는 조성물.
서열번호 39의 HFR1, 서열번호 40의 HFR2, 서열번호 41의 HFR3, 및 서열번호 42의 HFR4로 이루어지는 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 및 서열번호 43의 LFR1, 서열번호 44의 LFR2, 서열번호 45의 LFR3, 및 서열번호 46의 LFR4로 이루어지는 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는, 인간화 항-VEGF 항체.
제37항에 있어서, 서열번호 30의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 31의 경쇄 가변부위를 포함하는 항체.
제37항 또는 제38항에 있어서, 서열번호 32의 중쇄를 포함하는 항체.
서열번호 53의 HFR1, 서열번호 54의 HFR2, 서열번호 55의 HFR3, 및 서열번호 42의 HFR4로 이루어지는 중쇄 프레임워크를 갖는 중쇄 가변부위; 및 서열번호 43의 LFR1, 서열번호 56의 LFR2, 서열번호 45의 LFR3, 및 서열번호 46의 LFR4로 이루어지는 경쇄 프레임워크를 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는, 인간화 항-VEGF 항체.
제40항에 있어서, 서열번호 33의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 34의 경쇄 가변부위를 포함하는 항체.
제40항 또는 제41항에 있어서, 서열번호 38의 중쇄를 포함하는 항체.
서열번호 35, 서열번호 36 또는 서열번호 37의 중쇄 가변부위; 및 서열번호 34의 경쇄 가변부위를 포함하는, 인간화 항-VEGF 항체.