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KR20210149734A - Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용한 dna 작제물의 통합을 위한 개선된 방법 - Google Patents

Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용한 dna 작제물의 통합을 위한 개선된 방법 Download PDF

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KR20210149734A
KR20210149734A KR1020217032629A KR20217032629A KR20210149734A KR 20210149734 A KR20210149734 A KR 20210149734A KR 1020217032629 A KR1020217032629 A KR 1020217032629A KR 20217032629 A KR20217032629 A KR 20217032629A KR 20210149734 A KR20210149734 A KR 20210149734A
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KR
South Korea
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donor
nucleotides
seq
donor dna
cells
Prior art date
Application number
KR1020217032629A
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English (en)
Inventor
베이베이 딩
웬중 궈
옌량 장
Original Assignee
소렌토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

유전학적으로 가공된 세포를 개발하기 위해 개선되고, 보다 안전하고 효율적인 공정이 기재된다. 보다 구체적으로, 공여자 DNA 작제물, 가이드 RNA, 및 RNA 가이드된 뉴클레아제를 형질감염될 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 상기 3개의 성분들을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 기재된다. CAR (키메라 항원 수용체)를 숙주 세포의 한정된 게놈 부위로 삽입하기 위해 디자인된 공여자 DNA 작제물이 추가로 기재된다. 추가로, 본원의 개시내용은 안전성 문제가 존재할 수 있는 바이러스 벡터가 부재인 CAR로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 본원의 개시내용은 CAR 작제물을 발현하도록 T 세포를 가공하기 위해 보다 효율적이고 보다 저렴한 방법을 제공한다.

Description

RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용한 DNA 작제물의 통합을 위한 개선된 방법
관련 출원
본 출원은 2019년 3월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/816,836호 및 2019년 9월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/901,735호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 문헌 둘다는 그 내용 전체가 본원에 참고로 인용된다.
본원의 개시내용은 cas 단백질과 같은, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용하여, 관심 대상의 DNA 서열을 표적 DNA 분자, 예를 들어, 숙주 게놈에 효율적으로 통합시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
외인성 DNA 서열의 게놈 유전자좌로의 표적화된 통합은 매우 요구되고 있다. CRISPR-Cas 게놈 가공은 유전자 기능을 녹아웃시키거나 유전자 보정 또는 유전자 태그 부착(tagging)을 위해 DNA 서열을 정확하게 녹인시키기 위한 신속하고 상대적으로 단순한 방법이다. 표적화된 유전자 녹아웃은 Cas9 뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)을 사용한, DNA 내 이중 가닥 절단 (DSB)의 생성을 통해 성취된다. DSB는 이어서 흔히 내인성 비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 복구 경로를 통한 무작위 삽입 또는 결실 (삽입-결실)에 의해 불완전하게 복구된다. 녹인 실험을 위하여, Cas9 뉴클레아제 및 gRNA에 추가로, DNA 공여자 주형이 요구되고 DSB는 전형적으로 상동성-지시된 복구 (HDR) 경로를 통해 공여자 주형을 사용하여 복구된다.
단일 가닥 DNA (ssDNA) 공여자 올리고 또는 공여자 플라스미드 (dsDNA)인 공여자 주형을 사용한 녹인은 흔히 1 내지 10% 범위의 상대적으로 낮은 효율을 갖는다. 따라서, 성공적인 HDR-매개된 녹인 실험은 중요한 디자인 고려 및 실험 최적화를 필요로 한다. 짧은 상동성 아암을 갖는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 사용하여, 여러 그룹은 SNP 보정 또는 에피토프 태그 첨가와 같은 정확한 DNA 편집을 성취하였다. 공여자 플라스미드(dsDNA)는 보다 긴 외인성 DNA를 통합시킬 수 있지만 효율은 매우 낮다. 여러 그룹은 AAV (바이러스) 벡터를 사용하여 HDR 공여자 ssDNA를 제공하고 CRISPR/Cas9와 조합하여 40-60%의 유전자 녹인 효율을 성취하였다. 그러나, 이들 방법은 여전히 시간 소모적이고 임상적 적용을 위해 cGMP 생성과 양립할 필요가 있는 고역가의 AAV 벡터를 생성할 필요가 있다.
에스. 피오게네스(S. Pyogenes)와)와 같은 일부 세균의 II형 원핵 CRISPR ((클러스터링된 정기적 상호 공간 이격된 짧은 팔린드롬 반복체) 후천성 면역계의 성분을 기반으로 하는 게놈 가공 도구가 개발되었다. RNA-가이드된 Cas 뉴클레아제 시스템으로서 또는 보다 단순하게 CRISPR로서 언급되는 상기 다중-성분 시스템은 가이드 RNA에 의해 표적화된 특정 서열에서 게놈 DNA 내 이중 가닥 절단을 생성하는 능력을 갖는 가이드 RNA 분자와 커플링된 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. RNA-가이드된 Cas 엔도뉴클레아제는 DNA를 절단하는 능력을 갖고, 여기서, 상기 RNA 가이드는 게놈 서열에 하이브리드화한다. 추가로, Cas9 뉴클레아제는 단지 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)으로서 공지된 특정 서열이 게놈 내 표적 서열의 바로 다운스트림에 존재하는 경우 DNA를 절단한다. 에스. 피오게네스(S. Pyogenes)) 내 카노니칼 PAM 서열은 5′-NGG-3′이고, 여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드를 언급한다.
본래의 II형 CRISPR 시스템에서 정상적으로 2개의 상이한 RNA로서 발현되는 단일 키메라 crRNA:tracrRNA 전사체의 발현이 Cas9 뉴클레아제가 표적 DNA 서열을 서열 특이적으로 절단하도록 지시하기에 충분한 것으로 입증되었다. 추가로, 여러 돌연변이체 형태의 Cas9 뉴클레아제가 개발되었다. 예를 들어, 하나의 돌연변이체 형태의 Cas9 뉴클레아제는 닉카제로서 기능하여 야생형 Cas9과 같이 2개의 가닥 보다는 DNA의 상보적 가닥에서 절단을 생성한다. 이것은 NHEJ 보다는 고충실도 경로를 사용한 DNA 주형의 복구를 가능하게 하여 표적화된 유전자좌에서 및 능히 게놈 내 다른 위치에서 삽입-결실의 형성을 차단하여 상동성 재조합을 진행하는 능력을 유지하면서 가능한 오프-표적/독성 효과를 감소시킨다. 쌍 형성 닉킹은 세포주에서 50- 내지 1,500-배까지 오프-표적 활성을 감소시킬 수 있고 온-표적 절단 효율을 상실시키는 것 없이 마우스 접합자에서 유전자 녹아웃을 촉진시킬 수 있다.
추가로, cas 단백질은 다양한 세균으로부터 단리되었고, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9와는 상이한 PAM 서열을 사용하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, Cas12a와 같은 일부 cas 단백질은 천연적으로 단일 RNA 가이드를 사용하고-, 즉, 이들은 표적 서열에 하이브리드화하는 crRNA를 사용하지만 tracrRNA를 사용하지 않는다.
입양 면역치료요법은 생체외 생성된 자가 항원-특이적 세포의 전달을 포함하고, 바이러스 감염 및 암을 치료하기 위해 전망있는 전략이다. 입양 면역치료요법을 위해 사용되는 세포는 항원-특이적 세포의 확장 또는 유전학적 가공을 통한 세포의 재지시에 의해 생성될 수 있다.
CAR은 단일 융합 분자 내 하나 이상의 신호전달 도메인과 연합된 표적화 모이어티로 이루어진 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 가요성 링커에 의해 연결된 모노클로날 항체의 경쇄 및 가변 단편을 포함하는, 단일쇄 항체 (scFv)의 항원-결합 도메인으로 이루어진다. 수용체 또는 리간드 도메인을 기반으로 하는 결합 모이어티는 또한 성공적으로 사용되어 왔다. 제1 세대 CAR을 위한 신호전달 도메인은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마쇄의 세포질 영역으로부터 유래한다. 제1 세대 CAR은 T 세포 세포독성을 성공적으로 재지시하는 것으로 나타났지만, 이들은 생체내 장기적 확장 및 항-종양 활성을 제공하지 못하였다. CD28, OX-40 (CD134), 및 4-1BB (CD137)을 포함하는 동시 자극 분자로부터의 신호전달 도메인은 단독으로 부가되거나 (제2 세대) 조합으로 부가되어 (제3 세대) CAR 변형된 T 세포의 생존율을 증진시키고 이의 증식을 증가시켰다. CAR은 성공적으로 T 세포가 림프종 및 고체 종양을 포함하는 다양한 악성종양으로부터의 종양 세포의 표면에서 발현되는 항원에 대해 재지시되도록 하였다.
CAR (키메라 항원 수용체) 세포 면역치료요법은 환자의 혈액으로부터 T-세포를 제거하는 단계, 유전자 전달을 통해 CAR을 첨가하는 단계 및 유전학적으로 가공된 세포를 다시 체내로 주입하는 단계를 포함하고 암을 치료하는데 가장 전망있는 방법 중 하나이다. 현재, 유전자 전달 기술은 감마-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용한 바이러스 기반 유전자 전달 방법을 포함한다. GMP(FDA 요구 우수 제조 관리 기준) 수준의 바이러스 벡터가 되기 위해서는 바이러스 벡터가 복제 불능, 낮은 유전자 독성, 및 낮은 면역원성과 같은 임상 안전 기준을 준수해야 한다. 이들 통상적인 접근법은 사용이 간편하고 합리적인 발현을 갖지만 T 세포로의 바이러스 게놈 통합으로 인한 원치 않는 혈액암 및 기타 사건과 같은 2차 형질전환 사건을 일으킬 수 있다.
검토 논문(Ren and Zhao, Protein Cell 8(9):634-643, 2017)은 CRISPR/Cas9의 임의의 사용이 여전히 CAR (키메라 항원 수용체) 작제물을 T 세포 게놈으로 삽입하기 위한 녹킹인 공정을 위한 바이러스 벡터의 용도를 포함함을 지적한다. “비-통합 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 및 아데노바이러스-연합된 바이러스 (AAV)에 의해 암호화된 CRISPR을 사용한 유전자 편집이 또한 보고되었다.” 추가로, 2016년 11월 4일자로 온라인에 공개된 문헌(참조: Ren et al., Clin. Cancer Res. 16:1300)은 CD19 CAR 작제물을 사용하였고, T 세포에서 유전자 파괴가 렌티바이러스 및 아데노바이러스 CRISPR을 사용해서는 매우 효율적이지 않음을 밝혔다.
최근에 이량체 항원 수용체 또는 “DAR”은 기재되었다(WO 2019/173837). 이들 가공된 수용체는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 쇄 중 하나는 경쇄 항체 가변 및 불변 영역을 포함하고, 이의 다른 하나는 중쇄 항체 가변 및 불변 영역, 및 막관통 영역 및 세포내 영역을 포함한다. CAR과 같이, DAR은 암 세포 표면 항원에 결합하도록 가공될 수 있다. 작제물 암호화는 통상의 프로모터로부터 폴리펩타이드 둘다를 발현하도록 구성될 수 있다.
RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas9/CRISPR 시스템은 일부 포유동물 세포를 유전학적으로 가공하기 위해 매력적인 접근법인 것으로 보이지만, 1차 세포에서, 특히 T 세포에서 Cas9/CRISPR은 하기 이유 때문에 유의적으로 보다 어렵다: (1) T-세포는 이들의 세포질 내 DNA의 도입에 의해 악영향을 미치고: 높은 비율의 아폽토시스는 세포를 DNA 벡터를 형질전환시키는 경우 관찰되고; (2) CRISPR 시스템은 세포에서 Cas9의 안정한 발현을 필요로 하지만 생세포에서 Cas9의 지속적인 발현은 염색체 결함을 유도할 수 있고; (3) 현재 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제의 특이성은 단지 11개 뉴클레오타이드를 포함하는 서열 (N12-20NGG, 여기서, NGG는 PAM을 나타낸다)에 의해서만 결정되고, 이는 게놈 내 특유한 목적하는 유전자좌에서 표적 서열을 동정하기가 매우 어렵게 한다. Cas9에 추가로 다른 뉴클레아제는 Cas12a, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 TAL 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)이다.
본원의 개시내용은 숙주 세포, 예를 들어, T 세포에서 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 효율적으로 수행하기 위해 이들 한계에 대한 해결책을 제공하는 것을 목적으로 한다. 당업계에서는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입을 포함하지 않지만 대신 형질감염 기술을 사용할 수 있는 키메라 항원 수용체 작제물에 대해 보다 안전한 형질도입 기술이 요구된다. 이것은 환자에게 투여되는 형질도입된 세포에 의해 잠재적으로 표현되는 바이러스 유전자를 갖는 위험을 회피하면서, CAR 작제물 형질감염 효율을 증가시킴을 포함한다. 본원의 개시내용은 당업계에서 상기 필요성을 해결하기 위해 이루어졌다.
발명의 개요
본원의 개시내용은 면역치료요법을 위한 세포를 포함하는, 유전학적으로 가공되고 형질도입된 세포를 개발하기 위해 개선되고, 보다 안전하고 상업적으로 효율적인 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 방법은 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA, 및 공여자 DNA 작제물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 가이드 RNA는 이것이 복합체화된 cas 단백질을 숙주 게놈의 표적화된 부위로 지시하도록 가공된다. RNA-가이드된 엔도뉴클레아제에 의한 표적 부위에서 게놈 DNA의 절단, 및 상동성-지시된 복구 (HDR)에 의해 상동성 아암을 포함하는 공여자 단편을 사용한 이중 가닥 절단의 후속적 복구는 상동성 아암 사이에 위치한 공여자 DNA 분자의 서열의 통합을 유도한다. 상기 방법을 사용하여 동시에, 표적 유전자좌에서 유전자를 녹아웃시키고 파괴된 유전자좌에서 공여자 DNA 분자에 제공된 전이유전자를 삽입하거나 “녹인”시킬 수 있다. 추가로, 제1 유전학적 유전자좌에서 유전학적 작제물을 삽입하기 위한 방법이 제공되고, 여기서, 유전하적 작제물의 삽입은 제1 유전자좌에서 유전자를 녹아웃시키고, 동시에 제2 유전자좌에서 유전자를 녹아웃시킨다. 녹인/이중 녹아웃은 2개의 RNP를 표적 세포에 도입함에 의해 성취되고, 제1 RNP는 제1 유전학적 유전자좌를 표적화하는 가이드를 갖고, 제2 RNP는 제2 유전학적 유전자좌를 표적화하는 가이드를 갖는다. 2개의 RNP는 동일하거나 (예를 들어, Cas12a) 상이한(예를 들어, Cas12a 및 Cas9) cas 단백질을 포함할 수 있다. 상기 방법은 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 임의의 세포에 대해 사용될 수 있고, 사람 세포와 같은 포유동물 세포와 함께 사용될 수 있다. 상기 방법은 사용의 용이함, 효율 및 임상 적용을 포함하는 많은 적용에서 바람직하지 않을 수 있는 선택가능한 마커 또는 바이러스 벡터의 사용을 필요로 하지 않는 게놈 변형을 생성하는 능력에서의 이점을 갖는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 예를 들어, T 세포와 같은 조혈 세포이다.
본원의 개시내용은 또한 공여자 DNA의 진핵 세포의 게놈의 유전자좌로의 표적화된 통합을 위한 시스템을 제공한다. 또한 공여자 DNA 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 공여자 DNA 분자는 하나의 공여자 DNA 가닥의 뉴클레오타이드에 대해 하나 이상의 변형을 포함한다. 공여자 DNA는 숙주 게놈으로의 이의 통합이 요구되는 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 상동성 아암은 표적 서열의 어느 측면 상에서 숙주 게놈내 존재하는 서열과 상동성인 서열을 갖는다. 일부 구현예에서 공여자 DNA는 이중 가닥 또는 실질적으로 이중 가닥이다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA는 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단에 인접한, 예를 들어, 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 또는 5개 뉴클레오타이드 내에 존재하는 1 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단에서 1 내지 10개 뉴클레오타이드의 적어도 2개 유형의 핵산 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단에서 1 내지 10개 뉴클레오타이드의 2개 유형의 핵산 변형을 갖는다. 변형은 예를 들어, 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 (PS) 연결일 수 있거나, 공여자 DNA 분자의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 데옥시리보스의 2’-O-메틸화일 수 있다. 예를 들어, 공여자 DNA 분자는 변형된 가닥의 5’ 말단으로부터 처음 5개, 처음 6개 또는 처음 7개 뉴클레오타이드 내에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 PS 결합을 가질 수 있고 또한 변형된 가닥의 5’ 말단으로부터 처음 5개, 처음 6개 또는 처음 7개 뉴클레오타이드 내에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 2’-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥이고 하나의 가닥은 5’ 말단에 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥이고 하나의 가닥은 5’ 말단으로부터 임의의 처음 10개 또는 처음 5개 뉴클레오타이드 상에 2개 이상의 변형을 갖고, 반대 가닥은 말단 5’ 포스페이트를 갖는다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥이고, 공여자 DNA의 하나의 가닥 상에 적어도 2개의 PS 결합 및 적어도 2개의 2’O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 갖고, 여기서, 상기 PS 및 2’-O 메틸 변형은 변형된 가닥의 5’ 말단으로부터 처음 5개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥 또는 실질적으로 이중 가닥이고, 공여자 DNA의 하나의 가닥 상에 3개의 PS 결합 및 3개의 2’O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 갖고, 여기서, 상기 PS 및 2’-O 메틸 변형은 변형된 가닥의 5’ 말단으로부터 처음 5개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 이들 구현예의 일부 예에서, 반대 가닥은 말단 5’ 포스페이트를 포함한다. 공여자 DNA는 이중 가닥 또는 실질적으로 이중 가닥 분자로서 세포에 도입될 수 있다.
본원의 개시내용은 추가로 CAR (키메라 항원 수용체) 또는 DAR (이량체 항원 수용체)를 숙주 세포로 삽입하기 위해 디자인된 공여자 DNA 작제물을 제공한다. CAR 작제물은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(참조: Zhang et al. (2017) Biomarker Res. 5:22)에서 검토되었다. 2개의 폴리펩타이드 수용체를 암호화하는 DAR 작제물은 예를 들어, WO 2019/173837에 기재되어 있다. 추가로, 본원 개시내용은 바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 또는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터의 서열과 같은 이의 성분이 부재인 CAR이 형질도입된 숙주 세포를 제공한다. 본원의 개시내용은 CAR 또는 DAR 작제물을 발현하도록 T 세포를 가공하기 위해 보다 효율적이고 보다 저렴한 방법을 제공한다. CAR 또는 DAR 작제물은 상기 작제물을, 비제한적인 예로서 CAR 작제물의 녹인 및 TCR, PD-1, TIM3, GM-CSF, CD7 또는 기타 유전자의 녹아웃을 동시에 수행하기 위해 T 세포 수용체 유전자, PD-1 유전자, CD7 유전자, 또는 TIM3 유전자에 표적화하는 상동성 아암을 포함할 수 있다.
추가의 양상에서, 본원에서는 적어도 하나의 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자; 적어도 하나의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자; 및 공여자 DNA 분자를 포함하는, 게놈 변형을 위한 시스템이 제공되고, 여기서, 상기 공여자 DNA 분자는 5’ 말단의 20개 뉴클레오타이드 내, 10개 뉴클레오타이드 내 또는 5개 뉴클레오타이드 내에 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 이중 가닥 또는 실질적으로 이중 가닥이고, 이중 가닥 공여자 분자의 하나 가닥의 10개 뉴클레오타이드 내 또는 5개 뉴클레오타이드 내 존재하는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 뉴클레오타이드 상에 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 변형을 포함한다. 상기 변형은 예를 들어, 뉴클레오타이드의 당의 포스포로티오에이트 결합 및/또는 2’-O 메틸화와 같은 골격 변형일 수 있다. 공여자 DNA는 적어도 250 nt 또는 bp의 길이일 수 있고, 적어도 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 nt 또는 bp의 길이일 수 있고, 일부 구현예에서, 2000nt 또는 bp의 길이 초과일 수 있고, 예를 들어, 비제한적인 예로서, 약 0.5 및 4 kb 길이, 또는 약 1 kb 내지 3.5 kb 길이, 또는 약 1.5 kb 내지 약 2.8 kb 길이, 또는 약 1.8 kb 내지 약 3 kb길이일 수 있다. 공여자 DNA는 게놈으로 통합될 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암(HA)을 가질 수 있다. 관심 대상의 서열은 예를 들어, 하나 이상의 항체 또는 수용체 도메인을 포함하는 작제물의 발현을 위한 발현 카세트일 수 있다. 상동성 아암은 약 50 내지 약 5000개 뉴클레오타이드 길이, 또는 약 100 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 약 120 내지 약 800개 뉴클레오타이드 길이, 또는 약 140개 및 약 600개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 시스템 및 방법에 사용되는 RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, CasX, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA 둘다의 서열을 갖는 키메라 가이드일 수 있거나 crRNA일 수 있고, 임의로 포스포로티오에이트 (PS) 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 하나 이상의 핵산 변형을 포함할 수 있다. 가이드가 crRNA이고, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제가 tracrRNA를 사용하는 경우, 상기 시스템은 또한 tracrRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, Cas9은 crRNA 및 tracrRNA와 함께 사용될 수 있거나, crRNA와 tracrRNA의 구조적 특성을 조합한 키메라 가이드 RNA (때로는 단일 가이드 또는 “sgRNA”로 불리우는)와 함께 사용될 수 있다. 한편, Cas12a는 천연적으로 crRNA 만을 사용하고 연합된 tracrRNA를 갖지 않는다. 다양한 구현예에서, RNA-가이드 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA (crRNA 또는 키메라 가이드 RNA일 수 있는) 및 포함되는 경우, tracr RNA는 세포에 도입된 리보뉴클레오단백질 복합체로서 복합체화될 수 있다. 공여자 DNA는 RNA와 함께, 또는 별도로, 예를 들어, 별도의 전기천공 또는 형질감염으로 표적 세포에 도입될 수 있다.
또한 본원에서는 공여자 DNA의 표적 DNA 분자로의 부위-특이적 통합을 위한 방법이 제공되고, 여기서, 상기 방법은 세포에 적어도 하나의 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 분자; 적어도 하나의 가공된 가이드 RNA 또는 가공된 가이드 RNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자; 및 적어도 하나의 핵산 변형을 포함하는 공여자 DNA 분자를 도입함을 포함하고; 여기서, 상기 가이드 RNA는 표적 DNA에서 표적 부위 서열과 하이브리드화하도록 디자인된 표적 서열을 포함하고, 상기 공여자 DNA는 표적 부위에서 표적 DNA 분자로 삽입된다. 공여자 DNA는 예를 들어, 적어도 250개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍 길이, 적어도 500개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 적어도 1000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 적어도 1500개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 적어도 2000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 적어도 2500개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 또는 적어도 3000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍 (bp) 길이일 수 있고, 여기서, 상기 공여자 단편은 이중 가닥 또는 실질적으로 이중 가닥 분자로서 세포에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 단백질로서 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 RNA 분자로서 세포에 도입된다. 예시적인 구현예에서, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA, 및 경우에 따라, tracrRNA은 리보뉴클레오단백질 복합체 (RNP)로서 세포에 도입된다. 다양한 예에서, 상기 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 Cas12a 엔도뉴클레아제이고, Cas12a의 경우에, crRNA인 가이드 RNA와 복합체화된 RNP로서 세포에 전달된다(예를 들어, 전기천공 또는 리포좀 전달에 의해).
추가로, 제2 표적 유전자좌의 표적화된 녹아웃과 조합된 제1 표적 유전자좌로의 공여자 DNA의 부위-특이적 통합을 위한 방법이 제공된다. 제1 유전자좌에서 녹인/녹아웃 및 제2 유전자좌의 녹아웃은 하나의 형질전환에서 공여자 DNA, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 제1 유전자좌를 표적화하는 가이드, 및 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 및 제2 유전자좌를 표적화하는 가이드를 도입하는 단일 형질감염 이벤트에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법은 세포에 제1 유전자좌를 표적화하는 제1 가공된 가이드 RNA와 복합체화된 제1 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제; 제2 유전자좌를 표적화하는 제2 가공된 가이드 RNA와 복합체화된 제2 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제; 및 공여자 DNA 분자를 동시에 도입하는 단계를 포함하고; 여기서, 상기 제1 가이드 RNA는 상기 표적 DNA에서 제1 표적 부위와 하이브리드화하도록 디자인된 표적 서열을 포함하고, 상기 공여자 DNA는 상기 제1 표적 부위에서 표적 DNA 분자에 삽입되고, 상기 제2 유전자좌는 상기 제2 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제에 의한 변형에 의해 붕괴된다. 공여자 DNA는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개의 핵산 변형을 가질 수 있고, 예를 들어, 적어도 250개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍 길이, 적어도 500개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 적어도 1000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 적어도 1500개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 적어도 2000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 적어도 2500개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍, 또는 적어도 3000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍 (bp) 길이일 수 있고, 여기서, 상기 공여자 단편은 이중 가닥 또는 실질적으로 이중 가닥 분자로서 세포에 전달될 수 있다. 상기 공여자 DNA는 유전자를 발현하기 위한 작제물과 같은 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 갖고, 여기서, 상기 상동성 아암은 숙주 게놈에서 제1 표적 부위에 근접한 서열과 상동성을 갖는다. 제2 유전자좌는 바람직하게 이의 녹아웃이 요구되는 유전자 내 부위이다. 공여자 DNA의 제1 유전자좌로의 혼입 및 제2 유전자좌의 녹아웃은 형질감염된 세포 집단의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%로 존재할 수 있다.
본원에서는 세포에 2개의 RNP: 제1 유전학적 유전자좌를 표적화하기 위한 가이드 RNA를 포함하는 제1 RNP 및 제2 유전학적 유전자좌를 표적화하기 위한 가이드 RNA를 포함하는 제2 RNP를 전달함에 의해 2개의 상이한 유전학적 유전자좌에서 포유동물 세포, 예를 들어, 사람 세포, 예를 들어, 1차 사람 T 세포를 유전학적으로 변형시키기 위한 방법이 제공된다. 제1 및 제2 RNP는 동일하거나 상이한 cas 단백질을 포함할 수 있고, 상기 세포에 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 RNP는 cas9 단백질을 포함할 수 있고, 제2 RNP는 cas12a 단백질을 포함할 수 있거나, 그 반대일 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 RNA 둘다는 cas12a 단백질을 포함할 수 있다. 제1 유전학적 유전자좌에 대해 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA는 또한 제1 RNP와 동시에 또는 후기 또는 조기 시점에 세포에 전달될 수 있다. 공여자 DNA가 전달되는 구현예에서, 상기 방법은 비-고유 유전학적 작제물의 세포의 제1 유전학적 유전자좌로의 삽입을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 제1 유전학적 유전자좌는 비-고유 유전학적 작제물의 삽입에 의해 및 제2 RNA에 의해 표적화된 세포의 제2 유전학적 유전자좌의 cas-매개된 붕괴에 의해 붕괴될 수 있다. 이들 방법에 의해 변형된 세포는 비-고유 작제물, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, CAR 또는 DAR 작제물을 발현할 수 있고, 제1 및 제2 유전학적 유전자좌에서 내인성 유전자의 감소된 발현을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 유전학적 유전자좌는 세포에 전달되는 cas 단백질 및 복합체화된 가이드 RNA에 의해 돌연변이될 수 있다. 제1 및 제2 유전자좌에서 유전자는 붕괴되어 유전자 발현을 크게 감소시키거나 제거(녹아웃)할 수 있다. 공여자 DNA는 적어도 하나의 가닥에 대한 적어도 2개의 핵산 변형을 갖는 이중 가닥 공여자 DNA와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 임의의 공여자 DNA일 수 있다. 공여자 DNA는 바람직하게 유전학적 작제물 (예를 들어, CAR 또는 DAR 암호화 서열)을 플랭킹하는 제1 유전학적 유전자좌의 서열을 포함하는 상동성 아암을 갖는다.
본원에 제공된 상기 시스템, 조성물 및 방법의 다양한 구현예에서, 공여자 DNA는 적어도 2개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 이는 동일하거나 상이한 변형을 가질 수 있고, 바람직하게 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 또는 5개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 이중 가닥이고, 하나 이상의 뉴클레오타이드 변형은 공여자 DNA 분자의 단일 가닥 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 이중 가닥이고, 하나 이상의 뉴클레오타이드 변형은 변형된 가닥의 5’ 말단의 20개 뉴클레오타이드, 10개 뉴클레오타이드 또는 5개 뉴클레오타이드 내의 공여자 DNA 분자의 단일 가닥 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 포스포르아미디트 또는 포스포로티오에이트 변형과 같은 골격 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 뉴클레오타이드의 당 모이어티의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 이중 가닥이고, 공여자 DNA 준자의 단일 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 적어도 1개, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 포스포로티오에이트 변형을 포함하고 추가로 공여자 DNA 분자의 단일 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 2’-O-메틸화된 뉴클레오타이드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA는 예를 들어, 발현 카세트와 같은 관심 대상의 DNA 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함하고, 여기서, 상기 상동성 아암은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 표적 부위의 어느 한 측면 상의 표적 게놈 내 부위와 상동성을 갖는다. 상동성 아암은 약 50 내지 약 2000 nt 길이일 수 있고, 예를 들어, 100 내지 1000개 nt 길이 또는 150 내지 650 nt 길이, 예를 들어, 150 내지 350 nt 길이 또는 150 내지 200 nt 길이일 수 있다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 변형된 가닥 상에 2개 이상의 뉴클레오타이드 변형을 갖고 반대 가닥은 말단 포스페이트를 포함한다.
RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 cas 단백질일 수 있고, 비제한적인 예로서 Cas9, Cas12a, 또는 casX 단백질일 수 있다. 상기 방법의 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 적어도 하나의 RNA 가이드는 하나 이상의 리보뉴클레오단백질 복합체 (RNP)로서 세포에 도입된다. 다양한 구현예에서, 제1 RNP는 cas 단백질 및 제1 가이드 RNA와 함께 형성되고, 제2 RNP는 cas 단백질 및 제2 가이드 RNA의 별도의 항온처리에서 형성된다. 각각의 RNP에 대한 cas 단백질은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 RNP는 cas9와 함께 형성될 수 있고, 제2 RNP는 cas12와 함께 형성될 수 있다. cas9 단백질을 포함하는 하나 이상의 RNP는 일부 구현예에서 tracrRNA를 추가로 포함할 수 있다. 2개의 RNP, 및 임의로 공여자 DNA는 다중 부위 유전자 편집을 위해 세포에 첨가될 수 있고, 여기서, 상기 편집된 부위 중 적어도 하나는 임의로 DNA 공여자를 혼입한다. RNP는 예를 들어, 전기천공 또는 리포좀 전달을 포함하는 임의의 실행가능한 수단에 의해 표적 세포에 도입될 수 있다. 공여자 DNA는 하나 이상의 RNP와 동시에 또는 별도로 세포에 전달될 수 있다.
상기 방법을 사용하여 조류, 어류, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 동물의 세포를 포함하는 진핵 세포의 게놈을 변형시킬 수 있다. 다양한 구현예에서, 이의 게놈이 본원에 제공된 방법 및 시스템을 사용하여 조작된 세포는 포유동물 세포이고, 사람 세포일 수 있다. 본원에 제공된 방법에 사용되는 세포는 세포주일 수 있거나, 예를 들어, T 세포 및 NK 세포를 포함하는 줄기 세포 또는 조혈 세포와 같은 1차 세포일 수 있다.
본원에서 추가로 사람 1차 T 세포일 수 있는 가공된 1차 T 세포가 포함되고, 여기서, 상기 세포는 RNA 가이드된 뉴클레아제의 제1 표적 부위를 포함하는 제1 유전학적 유전자좌에서 게놈으로 통합된 비-고유 유전학적 작제물 및 RNA-가이드된 뉴클레아제의 제2 표적 부위를 포함하는 제2 유전학적 유전자좌에서 돌연변이를 포함한다. 제2 게놈 유전자좌에서 돌연변이는 예를 들어, cas 뉴클레아제 활성의 결과로서 및 세포에 의한 잘못된 복구의 결과로서 제2 표적 부위에 삽입된 삽입 또는 결실에 의해 녹아웃 돌연변이일 수 있다. 제2 표적 부위는 이의 감소된 발현이 요구되는 유전자에 있을 수 있다. 비-고유 유전학적 작제물을 포함하는 공여자 단편이 삽입된 제1 표적 부위는 또한 이의 감소된 발현이 요구되는 유전자에 있을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 “표적 부위”는 RNA-가이드된 뉴클레아제에 의해 인지되는 PAM 서열에 인접한 서열을 의미한다. 상기 PAM-인접한 서열(예를 들어 17-22개 뉴클레오타이드 길이의)은 가이드 RNA에서 표적 서열로서 사용되어 cas9 또는 cas12a와 같은 cas 뉴클레아제의 활성을 지시하여 게놈 DNA의 표적 부위를 절단할 수 있다.
비-고유 유전학적 작제물은 본원에 제공된 cas-매개된 방법을 사용한 통합을 위해 공여자 단편 상에 도입된 세포에 천연적으로 존재하지 않는 유전학적 작제물이다. 가공된 1차 T 세포는 비-고유 유전학적 작제물을 발현할 수 있고, 제2 유전학적 유전자좌에서 유전자의 감소된 발현을 가질 수 있고, 또한 제1 유전자학적 유전자좌에서 유전자의 감소된 발현을 가질 있고, 여기서, 제1 유전학적 유전자좌에서 유전자는 비-고유 유전학적 작제물의 삽입에 의해 붕괴될 수 있다.
비-고유 유전학적 작제물은 하나 이상의 면역글로불린 도메인을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전학적 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-고유 유전학적 작제물은 CAR 또는 DAR을 암호화하는 작제물이다. 따라서, 일부 구현예에서, 1차 사람 T 세포가 제공되고 상기 세포는 게놈으로 통합된 CAR 또는 DAR-암호화 작제물과 같은 비-고유 유전학적 작제물을 포함하고, 여기서, 상기 세포는 작제물을 발현하고 (예를 들어, CAR 또는 DAR 분자를 발현한다), CAR 또는 DAR (또는 기타) 작제물의 삽입에 의해 붕괴된 유전자의 감소된 발현을 가질 수 있고, 세포가 제2 유전자의 감소된 발현을 유도하는 제2 부위 돌연변이를 가질 수 있다. 유전학적 작제물의 삽입에 의해 붕괴될 수 있는 유전자는 제한 없이, TCR, TRAC, PD-1, CTL4-A, TIM3, LAG3, GM-CSF, 및 CD7을 암호화하는 유전자를 포함한다. CAR 또는 DAR은 이에 제한되지 않지만 BCMA, CD19, CD20, CD38, CD123, 또는 임의의 다른 종양 세포 표면 항원과 같은 종양 세포 표면 항원에 결합하도록 디자인된 CAR 또는 DAR일 수 있다. 다양한 예에서, 본원에 제공된 세포 집단의 적어도 25%는 CAR, DAR, 또는 다른 도입된 작제물을 발현할 수 있고 제2 유전학적 유전자좌에서 유전자의 감소된 발현을 나타낼 수 있다. 다양한 예에서, 본원에 제공된 바와 같은 세포 집단의 적어도 25%는 CAR, DAR, 또는 다른 도입된 작제물을 발현할 수 있고, 비-고유 작제물이 도입된 제1 유전학적 유전자좌에서 유전자의 감소된 발현을 나타내고, 제2 유전학적 유전자좌에서 유전자의 감소된 발현을 나타낼 수 있다. 세포는 본원에 제공된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
여전히 또는 양상에서는 본원에 입증된 바와 같이 CD7 유전자에 삽입된 CAR 또는 DAR 작제물을 갖는 사람 1차 T 세포가 제공된다. CD7 유전자 내 CAR 또는 DAR 삽입을 갖는 T 세포 집단은 CAR 또는 DAR 발현, 및 CD7의 감소된 발현을 입증할 수 있다.
도 1 A)는 우측 구조에서 이들이 프라이머에 존재할 수 있는 바와 같이 뉴클레오타이드 간 결합의 포스포로티오에이트 (PS) 변형을 보여주는 화학적 도식을 제공한다. 좌측 상에 올리고뉴클레오타이드에서 보여주는 뉴클레오타이드는 (비변형된) 포스포디에스테르 결합을 통해 부착된다. B)는 2개의 PS 결합을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 화학적 도식을 제공하고, 상기 결합은 5’-최외곽 뉴클레오타이드를 상기 올리고뉴클레오타이드 내 “다운스트림”의 다음 뉴클레오타이드에 연결시키고, 이는 이어서 PS 결합에 의해 상기 올리고뉴클레오타이드의 이어지는 다운스트림 뉴클레오타이드에 부착된다. 올리고뉴클레오타이드의 5’-최외곽 뉴클레오타이드는 2’ O-메틸 변형을 포함한다.
도 2 A)는 단일쇄 가변 단편 (scFv)에 이어서 CD8a 리더 펩타이드에 이어서 CD28 힌지-CD28 막관통-세포내 영역에 이어서 CD3 제타 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 갖는 개방 판독 프레임을 포함하는 CAR 공여자 DNA 작제물의 다이아그램이다. 암호화 서열은 JeT 프로모터(서열번호 3)에 이어지고 작제물은 이 경우에 프로모터 및 암호화 서열을 플랭킹하는, 사람 TRAC 유전자좌의 서열과 매칭하는 상동성 아암(HA)을 포함한다. 이는 공여자 DNA 작제물의 구조 (상부) 및 올바른 녹인을 확인하기 위한 프라이머 디자인 (하부)을 보여준다. 이것은 공여자 DNA를 생성하기 위해 사용되는 주형 DNA의 다이아그램을 제공한다. 항-CD38A2는 CD38 CAR 전이유전자를 함유하고, 이의 발현은 JeT 프로모터에 의해 구동되고 5’ 및 3’ 측면 상에서 상동성 아암에 의해 플랭킹되어 있어 표적화된 통합을 가능하게 한다. B)는 CAR내 위치한 하나의 프라이머 및 5’ 및 3’ 말단 둘다에서 상동성 아암의 외부의 TRAC 내 하나의 프라이머를 사용한 증폭으로 각각의 통합이 표적화된 통합 부위에 있는 경우 1371-bp 및 1591-bp 생성물을 생성시키는 CAR 통합을 확인하기 위해 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 지적하는 동일한 다이아그램을 보여준다.
도 3 A)는 항-CD38 CAR, 및 TRAC 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는 RNP를 발현하기 위한 작제물을 포함하는 공여자 DNA로 형질전환시킨 후 8일째 PBMC의 유동 세포측정 플롯을 제공한다. CAR 카세트는 TRAC 유전자의 엑손 1에서 통합 표적 부위를 플랭킹하는 TRAC 유전자좌 서열과 상동성을 갖는 상동성 아암에 의해 플랭킹되어 있다. Y 축은 세포 크기를 보여준다. 항-CD38 작제물 발현은 x 축에 따른다. 음성 대조군: 어떠한 공여자 DNA로 표적 세포가 형질전환되지 않음; 변형 부재- 공여자 DNA는 어떠한 화학적 변형을 갖지 않음; PS 변형: 3개의 포스포로티오에이트 결합이 5’ 최외곽 5개의 뉴클레오타이드 골격 위치 내에 존재함; PS + 2’-OMe: 포스포로티오에이트 결합에 추가로, 공여자의 5’ 최외곽 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 뉴클레오타이드는 PS 변형 외에 2’-OMe를 포함함; TCR Ko/레트로바이러스 작제물: 세포는 공여자 DNA의 부재하에 RNP로 형질감염시켜 TCR 유전자를 녹아웃시키고 레트로바이러스를 형질도입하여 항-CD38 CAR을 발현함. B)는 형질감염 후 10일째에 A)에서와 동일한 배양물에 대해 수행된 유동 세포측정의 결과를 제공한다. C)는 형질감염 후 20일째에 이중으로 변형된 공여자 DNA 및 대조군 (단지 TRAC 녹아웃 및 레트로바이러스를 사용한 TRAC 녹아웃)을 제공받은 배양물에 대해 수행된 유동 세포측정의 결과를 제공한다.
도 4는 표적화된 TRAC (엑손1) 부위에서 공여자 DNA의 통합을 보여주는 PCR 생성물의 겔을 보여준다. 1차 사람 T 세포는 단독으로 또는 ssDNA와 함께 TRAC RNP를 사용하여 전기천공하였다. PCR을 사용하여 전기천공 2주 후에 TRAC 유전자좌에서 통합된 항-CD38A2 CAR 전이유전자의 존재를 확인하였다(5’ 및 3’ 통합 영역으로부터의 생성물을 도시하는, 레인 3 및 6). 어떠한 밴드도 형질전환되지 않은 ATC (레인 1 및 4) 또는 RNP를 표적화하는 TRAC 엑손 1으로 형질전환되었지만 공여자 DNA를 제공받지 않은 T 세포 (레인 2 및 5)에서 관찰되지 않았다.
도 5는 대조군으로서 활성화된 T 세포 (ATC, 별표), TCR 녹아웃 ATC, 항-CD38A2 레트로바이러스 형질도입된 CART 세포 RV CART(검정선), TRAC 녹아웃 레트로바이러스 형질도입된 CART 세포(점), 포스포로티오에이트 변형된 ss 공여자 DNA 녹인과 함께 TRAC 녹아웃(점선), 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸 변형된 ssDNA 녹인과 함께 TRAC 녹아웃 (점선 및 점)을 사용한 세포독성 검정 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 플롯은 CD38을 발현하지 않는 RPE-표지된 K562 세포를 향하여 관찰된 세포독성을 보정한 후 GFP-표지된 RPMI8226 CD38-발현 세포를 향한 퍼센트 세포독성을 제공한다.
도 6은 K52 또는 RPMI18226 세포와 함께 동시 배양된 항-CD38 CART 세포 및 대조군을 사용한 사이토킨 분비 검정 결과의 그래프를 제공한다. 시험된 T 세포 배양물은 도 5에 제공된 바와 같다.
도 7은 상이한 길이의 상동성 아암 (HA)을 갖는 공여자 DNA를 시험한 결과를 제공한다. 배양물은 TCR (CD3) 발현 (Y 축) 및 항-CD38 발현 (X 축)의 상실에 대한 유동 세포측정에 의해 평가하였다.
도 8은 공여자 DNA 분자의 하나의 가닥의 5’ 말단에 근접하게 3개의 PS 결합 및 3개의 2’O 메틸 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 변형된 이중 가닥 공여자 DNA를 시험한 결과를 제공한다. 배양물은 TCR 발현 (Y 축) 및 항-CD38 발현 (X 축)의 상실에 대한 유동 세포측정에 의해 평가하였다.
도 9는 항-CD19 CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 공여자는 RNA로 동시 형질감염에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD19 CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 10은 항-BCMA CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 공여자는 RNA로 동시 형질감염에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-BCMA CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 11은 항-CD38 CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 공여자는 RNA로 동시 형질감염에 의해 TRAC 엑손 3 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD38 CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 12는 항-CD19 CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 하나의 배양물에서, TRAC 엑손 3으로부터 유래된 상동성 아암을 갖는 공여자는 엑손 3 가이드 RNA (2번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 TRAC 엑손 3 유전자좌로 지시되었다. 또 다른 배양물에서, TRAC 엑손 1로부터 유래된 상동성 아암을 갖는 공여자는 엑손 1 가이드 RNA (2번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD19 CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 13은 항-C38 CAR을 발현하기 위한 카세트 및 TRAC 유전자 또는 PD-1 유전자로부터 유래된 상동성 아암을 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 하나의 배양물에서, TRAC 엑손 1으로부터 유래된 상동성 아암을 갖는 공여자는 엑손 1 가이드 RNA (3번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. 또 다른 배양물에서, 공여자는 PD-1 유전자좌로부터 유래된 상동성 아암을 갖고 PD-I 유전자 가이드 RNA (4번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 PD-1 유전자로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD38 또는 PD-1 발현에 대해 결정되었다.
도 14는 항-CD38 CAR 작제물을 포함하는 이중으로 변형된 (PS 및 2’-OMe) 공여자 단편으로 형질감염된 T 세포 배양물을 사용한 세포독성 검정의 결과를 제공하고 PD-1 유전자-유래된 상동성 아암은 PD-1 유전자로부터 표적 서열을 갖는 가이드 RNA를 포함하는 RNP에 의해 PD-1 유저자에 표적화되었다.
도 15는 Cas9 단백질 (패널 4) 또는 Cas12a RNP (패널 5)를 포함하는 RNP와 함께, 항-CD38 DAR 작제물을 포함하는 공여자 DNA로 형질감염시킨 세포의 유동 세포측정의 결과를 제공한다. T 세포 수용체 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD38 DAR 작제물의 발현에 대해 도시된다. 패널 2 및 3은 공여자 단편의 부재하에, Cas9 단백질 및 Cas12a 단백질 각각을 포함하는 RNP로 T 세포를 형질감염시킨 결과를 제공한다.
도 16은 항-CD38 DAR 작제물 및 Cas9 RNP 또는 Cas12a RNP로 형질감염된 T 세포를 사용하는 세포독성 검정 결과의 그래프를 제공한다.
도 17은 비변형된 활성화된 T 세포 (ATC) (좌측 패널), Tim3 유전자를 표적화하는 Cas12a RNP로 형질감염된 T 세포 (중앙 패널), 또는 항-CD38 DAR 작제물을 포함하는 공여자 DNA와 함께 Tim3 유전자를 표적화하는 Cas12a RNP로 형질감염된 T 세포(우측 패널)의 유동 세포측정의 결과를 제공한다.
도 18은 Cas9 RNP와 함께 항-CD38 CAR의 TRAC 유전자좌로의 삽입 동안에 생성된 오프-표적 돌연변이의 게놈 위치 및 비율을 제공하는 표이다.
도 19는 TRAC 유전자좌를 표적화하는 Cas9 RNP에 추가로 GM-CSF 유전자를 표적화하는 Cas9 RNP 및 TRAC 유전자좌로의 삽입을 위한 항-CD38 DAR 공여자 DNA로 형질감염된 T 세포 뿐만 아니라 TRAC 유전자좌를 표적화하는 Cas9 RNP 및 항-CD38 DAR 공여자 DNA로 형질감염된 T 세포의 유동 세포측정 데이터이다. 패널 E 및 H에서 또한 TRAC 유전자좌를 표적화하는 Cas12a RNP에 추가로 GM-CSF 유전자를 표적화하는 Cas12a RNP 및 TRAC 유전자좌로의 삽입을 위한 항-CD38 DAR 공여자 DNA로 형질감염된 T 세포의 유동 세포측정 데이터를 나타낸다.
도 20 A)는 공여자 DNA 없이, TRAC 유전자좌를 표적화하는 Cas12a RNP로 형질감염된 T 세포의 유동 세포측정 데이터를 제공하고, B) TRAC 유전자좌를 표적화하는 Cas12a RNP 및 항-CD20 DAR 작제물 공여자 DNA로 형질감염된 T 세포의 유동 세포측정 데이터를 제공한다.
도 21은 이펙터:표적 세포 비율의 함수로서, 항-CD20 DAR 작제물 및 항-CEA DAR 작제물로 형질감염된 T 세포의 퍼센트 세포독성의 그래프이다. 상기 검정에서 표적 세포는 Daudi 세포이다.
도 22는 A) 인터페론 감마 및 B) 항원 자극 후 항-CD20 DAR 작제물 및 항-CD19 CAR 작제물로 형질감염된 T 세포에 의해 분비된 GMCSF의 양을 보여주는 막대 챠트이다. T 세포는 K562 세포 또는 Daudi 세포로 자극하였다. Daudi 세포 자극만이 막대에 의해 지적된 바와 같이 유의적인 반응을 유도하였다. 어떠한 사이토킨 방출도 비자극된 세포로부터 검출되지 않았다.
도 23은 가공된 T 세포에 의한 T 세포 수용체 (CD3) 및 항-CEA CAR 작제물의 발현을 평가한 유동 세포측정의 결과를 제공한다: A) CD3 (TCR) 발현 및 항-CEA CAR 발현에 대해 평가된 공여자 단편 없이, TRAC 유전자좌를 표적화하는 RNP로 형질감염된 T 세포; B) TRAC 유전자좌를 표적화하는 RNP 및 CD3 (TCR) 발현 및 항-CEA CAR 발현에 대해 평가된 항-CEA CAR 작제물을 포함하는 공여자 단편으로 형질감염된 T 세포; C) CD7 발현 및 항-CEA CAR 발현에 대해 평가된 어떠한 공여자 단편 없이, TRAC 유전자좌를 표적화하는 RNP로 형질감염된 T 세포; 및 D) CD7 유전자좌를 표적화하는 RNP 및 CD7 발현 및 항-CEA CAR 발현에 대해 평가된 항-CEA CAR 작제물을 포함한 공여자 단편으로 형질감염된 T 세포.
도 24는 CD7 유전자좌에 표적화된 항-CEA CAR 작제물로 형질감염된 T 세포, TRAC 유전자좌에 표적화된 항-CEA CAR 작제물로 형질감염된 T 세포; 및 TRAC 유전자좌에서 녹아웃된 T 세포를 사용한 세포독성 검정의 결과를 제공한다. X 축은 상기 검정에서 이펙터 대 표적 세포 비율을 제공한다.
도 25는 TRAC 유전자좌에 표적화된 항-CEA CAR 작제물로 형질감염된 T 세포 및 CD7 유전자좌에 표적화된 항-CEA CAR로 형질감염된 T 세포에 의한 IFNγ 분비의 막대 그래프를 제공한다.
정의
달리 구체적으로 지적되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 추가로, 본원에 기재된 방법 또는 물질과 유사하거나 균등한 임의의 방법 또는 물질은 본원의 개시내용의 수행에 사용될 수 있다. 본원에 인용된 모든 공보는 이들의 전문이 참조로 인용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "a," "an," 또는 "the"는 하나의 구성원과의 양상 뿐만 아니라 하나 초과의 구성원과의 양상을 포함한다. 예를 들어, 단수형("a," "an" 및 "the")은, 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수형의 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포 (a cell)"에 대한 언급은 복수의 상기 세포를 포함하고 "상기 제제(The agent)”에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 제제 등에 대한 언급을 포함한다.
참조 수치와 관련하여 용어 "약"은 상기 값으로부터 + 또는 - 10%의 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, "약 10"의 양은 9, 10 및 11의 참조 수치를 포함하는, 9 내지 11의 양을 포함한다. 참조 수치와 관련하여 용어 "약"은 또한 상기 값으로부터 + 또는 - 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 값의 범위를 포함할 수 있다.
용어 "1차 세포"는 다중세포 유기체로부터 직접적으로 단리된 세포를 언급한다. 1차 세포는 전형적으로 집단 증가가 거의 일어나지 않고, 따라서 연속 (종양 또는 인공적으로 불멸화된) 세포주와 비교하여, 이들이 유래된 조직의 주요 기능성 성분을 보다 잘 나타낸다. 일부 경우에, 1차 세포는 단리되고 이어서 즉시 사용되는 세포이다. 다른 경우에, 1차 세포는 무한으로 분열할 수 없고 따라서 시험관내에서 장기간 동안 배양될 수 없다.
용어 "게놈 편집"은 하나 이상의 뉴클레아제를 사용하여, DNA가 삽입되거나, 대체되거나 표적 DNA, 예를 들어, 세포의 게놈으로부터 제거된 유전학적 가공의 하나의 유형을 언급한다. 뉴클레아제는 게놈 내 목적하는 위치에서 특이적 이중 가닥 절단(DSB)을 생성하고, 세포의 내인성 기전을 사용하여 상동성-지시된 복구 (DHR) (예를 들어, 상동성 재조합)에 의해 또는 비상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해 유도된 절단을 복구한다. 임의의 적합한 뉴클레아제는 세포에 도입되어 CRISPR-연합된 단백질 (Cas) 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 다른 엔도- 또는 엑소-뉴클레아제, 이의 변이체, 이의 단편 및 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표적 DNA 서열의 게놈 편집을 유도할 수 있다. 표적 DNA 서열의 뉴클레아제-매개된 게놈 편집은 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 폴리펩타이드 또는 Cas9 mRNA)와 조합된 본원에 기재된 변형된 단일 가닥 RNA (sgRNA)를 사용하여 상동성-지시된 복구 (HDR)를 통한 정확한 게놈 편집의 효율을 개선시키기 위해 "유도된" 또는 "조절된"일 수 있다.
용어 "상동성-지시된 복구" 또는 "HDR"은 복구를 가이드하기 위한 상동성 주형을 사용하여 이중 가닥 DNA 절단을 정밀하게 및 정확하게 복구하기 하기 위한 세포 내 기전을 언급한다. 가장 통상적인 형태의 HDR은 뉴클레오타이드 서열이 2개의 유사하거나 동일한 DNA 분자 간에 교환되는 일종의 유전학적 재조합인 상동성 재조합(HR)이다.
용어 "비상동성 말단 연결" 또는 "NHEJ"는 절단된 말단이 상동성 주형에 대한 필요 없이 직접적으로 연결되는 이중 가닥 DNA 절단을 복구하는 경로를 언급한다.
용어 "핵산", "뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA) 및 이의 중합체를 언급한다. 상기 용어는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-DNA 하이브리드 또는 퓨린 및/또는 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비-천연, 합성 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA, RNA 및 이의 유사체의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 참조 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 이의 변이체 (예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오톨로그, 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 및 상보성 서열 및 명백하게 지적된 서열을 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 대체된 서열을 생성함에 의해 성취될 수 있다(문헌참조: Batzer et al, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상호교환적으로 사용된다.
핵산 분자의 길이를 참조하는 경우, 용어 뉴클레오타이드 및 염기쌍은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "뉴클레오타이드 유사체" 또는 "변형된 뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드의 질소성 염기(예를 들어, 시토신 (C), 티민 (T) 또는 우라실 (U), 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)) 내 또는 이의 상에, 뉴클레오사이드의 당 모이어티(예를 들어, 리보스, 데옥시리보스, 변형된 리보스, 변형된 데옥시리보스, 6원 당 유사체 또는 개방쇄 당 유사체), 또는 포스페이트 내 또는 이의 상에 하나 이상의 화학적 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 뉴클레오타이드를 언급한다.
용어 “유전자” 또는 “폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 폴리펩타이드 쇄를 생성하는데 관여하는 DNA의 분절을 의미한다. DNA 분절은 유전자 생성물의 전사/해독 및 전사/해독의 조절에 관여하는 암호화 영역 (리더 및 트레일러), 및 개별 암호화 분절 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론)의 전방 및 후방 영역을 포함할 수 있다.
용어 “폴리펩타이드,” “펩타이드” 및 “단백질”은 아미노산 잔기들의 중합체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-천연적으로 존재하는 아미노산 중합체 뿐만 아니라 상응하는 천연적으로 존재하는 아미노산의 인공 화학적 모사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 전장 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함하고, 여기서, 상기 아미노산 잔기는 공유 펩타이드 결합에 의해 연결된다.
용어 "변이체"는 천연에 존재하는 것으로부터 이탈한 유기체, 균주, 유전자, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 특징의 형태를 언급한다.
용어 "상보성"은 통상적인 왓슨-클릭 또는 다른 비-통상적인 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 언급한다. 퍼센트 상보성은 제2 핵산 서열과 수소 결합을 형성(예를 들어, 왓슨-클릭 염기쌍 형성)할 수 있는 핵산 분자 내 잔기의 퍼센트 (예를 들어, 10개중 5, 6, 7, 8, 9, 10개로서 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100%의 상보성)를 지적한다. "완벽하게 상보성"은 핵산 서열의 모든 연속 잔기가 제2 핵산 서열 내 동일한 수의 연속 잔기와 수소 결합함을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 "실질적으로 상보성"은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%인 상보성 정도를 언급한다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오타이드의 영역 상에 97%, 98%, 99%, 또는 100%는 엄중 조건하에서 하이브리드화하는 2개의 핵산을 언급한다.
하이브리드화에 대한 용어 "엄중 조건"은 표적 서열과 상보성을 갖는 핵산이 대부분 표적 서열과 하이브리드화하고 실질적으로 비-표적 서열과는 하이브리드화하지 않는 조건을 언급한다. 엄중 조건은 일반적으로 서열-의존성이고 다수의 인자에 의존하여 다양하다. 일반적으로, 서열이 길면 길수록 서열이 특이적으로 이의 표적 서열에 하이브리드화하는 온도는 보다 높아진다. 엄중 조건의 비제한적인 예는 문헌(참조: Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology -Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.)에 상세히 기재되어 있다.
용어 "하이브리드화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여 뉴클레오타이드 잔기의 염기 간에 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 언급한다. 수소 결합은 왓슨 클릭 염기쌍 형성에 의해, 후그슈타인 결합 (Hoogstein binding)에 의해 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 일어날 수 있다. 상기 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥의 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-하이브리드화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
"재조합 발현 벡터"는 숙주 세포에서 특정 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 작제물이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 게놈 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동적으로 연결된, 전사될 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
"작동적으로 연결된"은 암호화 서열의 전사를 지시하는 프로모터와 같은 요소들의 적당한 생물학적 기능을 허용하는 상대적 위치에 위치하는 폴리뉴클레오타이드 암호화 서열 및 프로모터와 같은 2개 이상의 유전학적 요소를 의미한다.
용어 “비-고유”는 세포에 내인성이 아님을 의미하고, 즉, 작제물은 이것이 비-고유인 세포에 천연적으로 존재하지 않는다.
용어 "프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열의 어레이를 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 프로모터는 폴리머라제 II형 프로모터의 경우에서와 같이 전사의 개시 부위 근처에 필요한 핵산 서열, TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 전사의 개시부위로부터 수천개의 염기쌍 정도의 원거리에 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 리프레서를 임의로 포함한다. 발현 벡터에 존재할 수 있는 다른 요소들은 발현 벡터로부터 생성된 재조합 단백질에 대한 특정 결합 친화성 또는 항원성을 부여하는 것들 뿐만 아니라 전사를 증진시키고 (예를 들어, 인핸서) 전사를 종결시키는 (예를 들어, 터미네이터) 것들을 포함한다.
“재조합체"는 유전학적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 세포, 조직, 또는 유기체를 언급한다. 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오타이드(또는 재조합 폴리뉴클레오타이드의 카피 또는 상보체)는 널리 공지된 방법을 사용하여 조작된 것이다. 제2 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 암호화 서열)에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 카세트는 사람 조작 (예를 들어, 문헌(참조: Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989) or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)에 기재된 방법에 의해)의 결과로서 제2 폴리뉴클레오타이드와 이종성인 프로모터를 포함할 수 있다. 재조합 발현 카세트 (또는 발현 벡터)는 전형적으로 천연에서 발견되지 않는 조합의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 사람 조작된 제한 부위 또는 플라스미드 벡터 서열은 다른 서열로부터 프로모터를 플랭킹하거나 분리할 수 있다. 재조합 단백질은 재조합 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 것이고, 재조합 세포, 조직 및 유기체는 재조합 서열 (폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드)를 포함하는 것들이다.
용어 "단일 뉴클레오타이드 다형태" 또는 "SNP"는 대립유전자 내에 포함하는 폴리뉴클레오타이드에서 단일 뉴클레오타이드의 변화를 언급한다. 이것은 단일 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입 뿐만 아니라 하나의 뉴클레오타이드의 또 다른 뉴클레오타이드로의 대체를 포함할 수 있다. 대부분 전형적으로, SNP는 트리- 및 테트라-대립유전자 마커가 또한 존재할 수 있지만 바이대립유전자 마커이다. 비-제한적인 예로서, SNP A\C를 포함하는 핵산 분자는 다형태 위치에서 C 또는 A를 포함할 수 있다.
용어 “배양한다”, “배양하는”, “성장한다”, “성장하는”, “유지한다”, “유지하는”, “확장한다”, “확장하는” 등은 세포 배양 자체를 언급하거나 배양 공정을 언급하는 경우, 세포 (예를 들어, 1차 세포)가 제어된 조건하에서, 예를 들어, 생존을 위해 적합한 조건하에서 이의 정상 환경 외부에서 유지되는 것을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 배양된 세포는 생존하도록 방치하고 배양은 세포 성장, 정지, 분화 또는 분열을 유도할 수 있다. 용어는 배양물 중에 모든 세포가 생존하거나, 성장하거나 분열함을 의미하지 않고 일부는 천연적으로 죽거나 뇌쇠할 수 있다. 세포는 전형적으로 배지에서 배양하고, 상기 배지는 배양 과정 동안에 갈아줄 수 있다.
용어 "대상체", "환자" 및 "개체"는 본원에서 사람 또는 동물을 포함하도록 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 동물 대상체는 포유류, 영장류(예를 들어, 몽키), 가축 동물(예를 들어, 말, 소, 양, 돼지, 또는 염소), 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이), 연구 시험 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 기니아 피그, 새), 수의학적으로 중요한 동물 또는 경제적으로 중요한 동물일 수 있다.
용어 "투여하는"은 경구 투여, 국소 접촉, 좌제로서의 투여, 대상체에게 정맥내, 복막내, 근육내, 병변내, 척수강내, 비강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 비경구 및 경점막 (예를 들어, 협측, 설하, 구개, 잇몸, 비강, 질, 직장 또는 경피)을 포함하는 임의의 경로에 의한 것이다. 비경구 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피내, 피하, 복막내, 뇌실내, 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식은 리포좀 제형의 사용, 정맥내 주입, 경피 패치 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "치료하는"은 치료학적 이득 및/또는 예방학적 이득을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이로운 또는 목적하는 결과를 수득하기 위한 접근법을 언급한다. 치료학적 이득이란 치료 하의 하나 이상의 질환, 병태 또는 증상에서의 임의의 치료학적 관련 개선 또는 이에 대한 효과를 의미한다. 예방학적 이득을 위해, 조성물은 특정 질환, 병태 또는 증상을 발병할 위험에 처한 대상체에게 또는 질환, 병태 또는 증상이 아직 나타나지 않을 수 있지만 질환의 생리학적 증상 중 하나 이상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 “유효량” 또는 “충분한 양”은 이롭거나 목적하는 결과를 수행하기에 충분한 제제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제, 변형된 단일 가이드 RNA 등)의 양을 언급한다. 치료학적 유효량은 치료 중인 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 의존하여 다양할 수 있고, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특정 양은 선택된 특정 제제, 표적 세포 유형, 대상체 내 표적 세포의 위치, 후속 투여 용법, 이것이 다른 제제와 조합하여 투여될 지의 여부, 투여 시기 및 이것이 운반되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 의존하여 다양할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 제제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제, 변형된 단일 가이드 RNA 등)의 세포, 유기체 또는 대상체로의 투여를 보조하는 물질을 언급한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 조성물 또는 제형에 포함될 수 있고, 환자에 대해 어떠한 유의적인 독성학적 효과를 유발하지 않는 담체 또는 부형제를 언급한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예는 물, NaCl, 정규 식염수 용액, 락테이트화된 링거, 정규 슈크로스, 정규 글루코스, 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅, 감미제, 향제 및 색제 등을 포함한다. 당업자는 다른 약제학적 담체가 본 발명에 유용함을 인지할 것이다.
CRISPR 시스템의 성분과 관련하여 용어 "증가하는 안정성"은 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 구조를 안정화시키는 변형을 언급한다. 상기 용어는 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 분해를 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나 저하시키는 변형을 포함한다.
CRISPR 시스템과 관련된 용어 "증가하는 특이성"은 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 특이적 활성 (예를 들어, 온-표적 활성)을 증가시키는 변형을 언급한다. 상기 용어는 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 비-특이적 활성(예를 들어, 오프-표적 활성)을 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나 저하시키는 변형을 포함한다.
CRISPR 시스템의 성분과 관련하여 용어 "감소하는 활성"은 세포, 유기체, 대상체 등에 대한 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 독성 효과를 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나 저하시키는 변형을 언급한다.
CRISPR 시스템의 성분과 관련하여 및 유전자 조절 관점에서 용어 “증진된 활성”은 게놈 편집 및/또는 유전자 발현을 유도하거나, 조정하거나, 조절하거나 제어하는 효율 및/또는 빈도에서의 증가 또는 개선을 언급한다.
본원에서 방법 및 조성물은 이의 발현이 요구되는 유전자의 효율적인 녹아웃 및 동시 녹인을 위한 CRISPR/cas 시스템을 사용한다. CRISPR/Cas 시스템은 현재 표적화된 유전학적 변경 (게놈 변형)을 유도하기 위해 광범위하게 사용되고 있다. Cas9와 같은 cas 단백질에 의한 표적 인지는 가이드 RNA (gRNA) 내 “씨드” 서열, 및 표적 DNA, 예를 들어, 숙주 세포 게놈에서 gRNA-결합 영역의 업스트림에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 함유하는 보존된 멀티뉴클레오타이드를 필요로 한다. 본원에 사용된 바와 같이, “표적 서열”은 게놈 내 PAM에 인접하고 (Cas9 CRISPR 시스템에서) 이의 업스트림에 바로 있는 서열이다. 표적 서열(또는 실질적으로 동일한 서열)은 가이드 RNA로 가공되고, 때로는 당업계에서 가이드 RNA의 “가이드 서열”로서 언급된다. 본원 개시내용의 목적을 위해, 문헌(Ran et al. (2013) Nature Protocols 8:2281-2308)에 따라, 가이드 RNA의 “표적 서열” (또는 가이드 서열)은 게놈 내 표적 서열의 반대 가닥과 하이브리드화한다.
Cas/CRISPR RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 시스템은 RNA-가이드된 Cas9 엔도뉴클레아제를 사용하는 영구적 유전자 붕괴를 유도하여 오류 성향 복구 경로가 프레임 전환 돌연변이를 유도하도록 촉발시키는 DNA 이중 가닥 절단을 도입한다. 게놈을 변형시키기 위해 사용되는 CRISPR/Cas 시스템의 예는 예를 들어, 미국 특허 제8,697,359호, 제10,000,772호, 제9,790,490호, 및 미국 특허 출원 공개 번호 제US 2018/0346927홍 기재되어 있고 이 모두는 본원에 이들의 전문이 참조로 인용된다. Cas9, Cas12a, CasX, 또는 기타 Cas 엔도뉴클레아제가 또한 사용될 수 있고, 이는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cash, Cas7, Cas8, Cas9 (또한, Csn1 및 Csx12로서 공지된), Cas10, Cas12a (또한, Cpf1으로서 공지된), CasX, CasY, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, T7, Fok1, 당업계에 공지된 다른 뉴클레아제, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 버전을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
CRISPR/Cas 유전자 붕괴는 표적 유전자에 특이적인 gRNA 서열 및 Cas 엔도뉴클레아제가 복합체로서 또는 Cas 엔도뉴클레아제가 표적 유전자좌에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있게 하는 복합체를 형성하도록 세포에 도입되는 경우 일어난다. 일부 경우에, CRISPR 시스템은 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열 및 표적 유전자에 특이적인 가이드 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함한다. 가이드 핵산 서열은 관심 대상의 유전자에 특이적이도록 디자인되고 (유전자 내 표적 서열과의 상동성에 의해) cas 엔도뉴클레아제-유도된 이중 가닥 절단을 위해 상기 유전자를 표적화한다. 따라서, 전형적으로 RNA 분자이고 변형된 RNA 분자일 수 있는 가이드 핵산 분자는 표적화된 유전자의 유전자좌 (표적 부위 또는 표적 서열)에서 발견되는 가이드 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 핵산 서열은 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 경우에, 2개의 가이드 RNA는 cas 단백질, 상기 가이드 서열을 포함하는 cRNA 및 crRNA와 cas 단백질과 복합체를 형성하는 tracrRNA와 함께 사용된다. 일부 경우에, 예를 들어, Cas9의 경우에 키메라 가이드일 수 있는 단일 가이드 RNA가 사용될 수 있다. 일부 cas 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas12a는 tracrRNA를 사용하지 않고, 즉, 이들은 천연적으로 단지 단일 가닥 RNA (crRNA)를 사용한다.
다양한 구현예에서, cas 단백질은 도입된 유전자 또는 RNA 분자로부터 세포에서 발현될 수 있다. cas 단백질은 또한 임의로 하나 이상의 가이드 RNA와 함께 도입될 수 있거나, cas 단백질은 단일 가이드 RNA 또는 2개의 복합체화된 가이드 RNA (예를 들어, crRNA 및 tracrRNA)와의 리보뉴클레오단백질 복합체로서 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 표적 세포로 형질감염된 유전자로부터 발현되거나, 하나 이상의 가이드 RNA는 RNA 분자로서 세포에 도입될 수 있다. 2개 이상의 상이한 가이드 RNA에 대한 유전자는 동일하거나 상이한 벡터 상에서 표적 세포에 도입될 수 있다. 2개 이상의 가이드 RNA는 상이한 가이드 서열을 갖는 가이드 RNA (예를 들어, 상이한 유전자좌를 표적화하는)일 수 있다. 본원에 제공된 방법의 다양한 구현예에서, 가이드 RNA는 키메라 가이드(sgRNA)일 수 있거나, crRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 tracrRNA는 숙주 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제 및 sgRNA (키메라 가이드 RNA), sgRNA를 포함하는 RNP이거나, sgRNA를 암호화하는 작제물은 세포에 도입된다. 대안적으로, crRNA 및 tracrRNA (또는 crRNA 및 tracrRNA를 암호화하는 작제물)는 Cas9 매개된 게놈 변형을 위해 세포 또는 RNP에 제공될 수 있다. 추가의 구현예, 예를 들어, tracrRNA를 요구하지 않는 엔도뉴클레아제로서 Cas12a를 사용한 구현예에서, crRNA, 또는 crRNA를 암호화하는 작제물은 tracrRNA 없이 도입될 수 있다. cas 엔도뉴클레아제를 위한 가이드 RNA는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 공개 공보 US 2018/066242, 및 이의 모두의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제8,697,359호, 제10,000,772호, 제9,790,490호, 및 미국 특허 출원 공개 공보 제US 2018/0346927호에서 광범위하게 논의되었다.
오류-성향 복구 경로, 예를 들어, 비-상동성 말단-연결 (HHEJ)을 통해 발생하는 돌연변이를 생성시키는데 이들의 용도에 추가로, 예를 들어, Cas9, Cas12a, 또는 CasX와 같은 cas 단백질은 관심 대상의 DNA 서열을 표적화된 유전자좌로 삽입하기 위해 사용될 수 있고, 여기서, cas 단백질 및 하나 이상의 가이드 RNA, 또는 cas 단백질 및/또는 하나 이상의 가이드 RNA를 발현하기 위한 작제물에 추가로,　 표적 세포는 또한 상동성-지시된 복구를 통해 cas 엔도뉴클레아제의 활성 후 유전자좌로의 삽입을 위해 공여자 DNA 분자로 형질감염시킨다. 다양한 구현예에서, 표적 부위로의 삽입을 위한 DNA 분자는 예를 들어, 발현 작제물과 같은 관심 대상의 DNA 서열을 포함하고, 예를 들어, DAR 작제물은 숙주 게놈 내 표적 부위의 어느 하나의 측면 상에서 게놈 서열에 상동성을 갖는 서열에 의해 플랭킹된다. 상기 상동성 아암은 (HA)은 예를 들어, 약 50 bp 길이 내지 약 2500 bp의 길이, 또는 약 100 bp 내지 약 2000 bp 길이, 또는 약 150 bp 내지 약 1500 bp 길이일 수 있다. 본 발명의 조성물, 방법 및 세포에 사용하기 위해 본원에 제공된 공여자 DNA 분자는 예를 들어, 약 250bp 미만의 길이, 약 200 bp 미만, 약 190 bp 미만, 약 180 bp 미만, 약 160 bp 미만, 또는 약 150 bp 미만의 길이, 예를 들어, 약 50 bp 내지 약 1500 bp 미만의 길이, 약 50 bp 내지 약 1000 bp의 길이, 약 50 bp 내지 약 800 bp의 길이, 약 50 bp 내지 약 600 bp의 길이, 약 50 bp 내지 약 350 bp의 길이, 약 50 bp 내지 약 180 bp의 길이, 또는 약 100 bp 내지 약 1000 bp의 길이, 약 140 bp 내지 약 800 bp의 길이, 약 140 bp 내지 약 600 bp의 길이, 약 100 bp 내지 약 350 bp의 길이, 약 100 bp 내지 약 200 bp의 길이, 약 140 bp 내지 약 800 bp의 길이, 약 140 bp 내지 약 600 bp의 길이, 약 140 bp 내지 약 350 bp의 길이, 또는 약 140 bp 내지 약 200 bp의 길이인 HA를 가질 수 있다.
공여자 DNA는 예를 들어, 적어도 50 뉴클레오타이드, 적어도 100 뉴클레오타이드, 적어도 200 뉴클레오타이드, 적어도 225 뉴클레오타이드, 적어도 250 뉴클레오타이드, 적어도 300 뉴클레오타이드, 적어도 400 뉴클레오타이드, 적어도 500 뉴클레오타이드, 적어도 600 뉴클레오타이드, 적어도 700 뉴클레오타이드, 적어도 800 뉴클레오타이드, 적어도 900 뉴클레오타이드, 적어도 1000 뉴클레오타이드, 적어도 1100 뉴클레오타이드, 적어도 1200 뉴클레오타이드, 적어도 1300 뉴클레오타이드, 적어도 1400 뉴클레오타이드, 적어도 1500 뉴클레오타이드, 적어도 1600 뉴클레오타이드, 적어도 1700 뉴클레오타이드, 적어도 1800 뉴클레오타이드, 적어도 1900 뉴클레오타이드, 적어도 2000 뉴클레오타이드, 적어도 2200 뉴클레오타이드, 적어도 2400 뉴클레오타이드, 적어도 2500 뉴클레오타이드, 적어도 2600 뉴클레오타이드, 적어도 2800 뉴클레오타이드, 적어도 3000 뉴클레오타이드, 적어도 3200 뉴클레오타이드, 적어도 3400 뉴클레오타이드, 적어도 3500 뉴클레오타이드, 적어도 3600 뉴클레오타이드, 적어도 3800 뉴클레오타이드, 적어도 4000 뉴클레오타이드, 적어도 4200 뉴클레오타이드, 적어도 4400 뉴클레오타이드, 적어도 4500 뉴클레오타이드, 적어도 4600 뉴클레오타이드, 적어도 4800 뉴클레오타이드, 적어도 5000 뉴클레오타이드, 적어도 5200 뉴클레오타이드, 적어도 5400 뉴클레오타이드, 적어도 5500 뉴클레오타이드, 적어도 5600 뉴클레오타이드, 적어도 5800 뉴클레오타이드, 적어도 6000 뉴클레오타이드, 적어도 6200 뉴클레오타이드, 적어도 6400 뉴클레오타이드, 적어도 6500 뉴클레오타이드, 적어도 6600 뉴클레오타이드, 적어도 6800 뉴클레오타이드, 적어도 7000 뉴클레오타이드, 적어도 7500 뉴클레오타이드, 적어도 8000 뉴클레오타이드, 적어도 8500 뉴클레오타이드, 적어도 9000 뉴클레오타이드, 적어도 9500 뉴클레오타이드, 또는 적어도 10,000 뉴클레오타이드, 또는 공여자 단편이 이중 가닥 또는 실질적으로 이중 가닥인 상응하는 수의 염기쌍 (bp)의 길이일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 시스템에서 제공된 바와 같은 공여자 DNA는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 실질적으로 이중 가닥일 수 있다. 공여자 DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 이는 실질적으로 이중 가닥 분자를 포함하고, 여기서, 상기 실질적으로 이중 가닥 공여자 DNA는 짧은 (예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하 또는 3개 이하) 스트레치의 뉴클레오타이드가 단편의 말단에 또는 내부적으로 존재하는 반대 가닥과 염기쌍을 형성하지 않는 이중 가닥일 수 있고, 상기 짧은 스트레치는 단편의 뉴클레오타이드 길이의 50% 미만, 30% 미만 또는 5% 미만이다.
공여자 DNA 분자는 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 포스포디에스테르 골격에서 변형될 수 있다. 변형은 전형적으로 상동성 아암에 의해 플랭킹된 게놈의 표적 유전자좌에 삽입될 작제물을 포함하는 주형의 PCR 증폭에 의해 간편하게 도입될 수 있다. 공여자 주형의 PCR 증폭은 공여자 DNA 분자를 생성하고, 여기서, 상기 증폭은 공여자 DNA 생성물에 혼입되는 목적하는 변형을 갖는 프라이머를 사용한다.
핵산 변형은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 2'O 메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2' 플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 잠금(locked) 핵산 (LNA) 변형된 뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산 (PNA) 변형된 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 연결을 갖는 뉴클레오타이드, 및 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡 (m7G)). 핵산 변형은 예를 들어, 데옥시티미딘에 대한 데옥시우리딘 치환, 데옥시시티딘에 대한 5-메틸-2'-데옥시시티딘 또는 5-브로모-2'-데옥시시티딘 치환을 포함할 수 있다. 당 모이어티의 변형은 리보스 당의 2’ 하이드록실의 변형으로 2'-O-메틸 또는 2'-O-알릴 당을 형성함을 포함할 수 있다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오사이드에 대해, 포스페이트 그룹은 당의 2', 3', 또는 5’ 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다.
뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유적으로 연결된 포스페이트 그룹을 포함하여 핵산 분자의 “뉴클레오사이드 상호 골격”을 형성하는 뉴클레오사이드이다. 천연적으로 존재하는 RNA 및 DNA 분자는 골격 전반에 걸쳐 3’에서 5’의 포스포디에스테르 연결을 갖는다. 데옥시리보스 포스페이트 골격은 모르폴리노 핵산을 생성하도록 변형될 수 있고, 여기서, 각각의 염기 모이어티는 6원 모르폴리노 환, 또는 데옥시포스페이트 골격이 슈도펩타이드 골격으로 대체되고, 4개의 염기가 보유된 펩타이드 핵산에 연결된다. 예를 들어, 문헌(Summerton and Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195 and Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chain. 4:5-23)을 참조한다. 추가로, 데옥시포스페이트 골격은 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 골격, 포스포로아미디트 또는 알킬 포스포트리에스테르 골격으로 대체될 수 있다. 포스포로티오에이트 (PS) 결합(즉, 포스포로티오에이트 연결)은 핵산의 포스페이트 골격에서 비-브릿징 산소를 황 원자로 치환한다. 상기 변형은 뉴클레오타이드 간 연결이 뉴클레아제 분해에 내성이 되게 한다.
변형은 변형된 골격 또는 비-천연 뉴클레오타이드 간 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 변형된 골격을 갖는 핵산은 골격 내 인 원자를 보유하는 것들 및 골격 내 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 인 원자를 함유하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 골격은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3’-알킬렌 포스포네이트, 5’-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3’-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 정상 3’-5’ 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5’ 연결된 유사체, 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 간 연결이 3'에서 3'로, 5'에서 5'로 또는 2'에서 2' 연결인 역위 극성을 갖는 것들을 포함한다. 역위 극성을 갖는 핵산은 3’ 최외곽 뉴클레오타이드 간 연결에서 단일 3’에서 3’ 연결, 즉, 염기성일 수 있는 단일 역위 뉴클레오사이드 잔기를 포함한다(핵염기는 상실되어 있거나 이 대신 하이드록실 그룹을 갖는다).
일부 구현예에서, 공여자 DNA는 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 헤테로원자 뉴클레오사이드 간 연결을 포함한다. MMI 유형의 뉴클레오사이드 간 연결은 미국 특허 제5,489,677호에 기재되어 있고, 상기 개시내용은 이의 전문이 참조로 인용된다. 적합한 아미드 뉴클레오타이드 간 연결은 미국 특허 제5,602,240호에 기재되어 있고, 상기 개시내용은 이의 전문이 참조로 인용된다.
여기서 인 원자를 포함하지 않는 추가의 변형된 폴리뉴클레오타이드 골격은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드 간 연결에 의해 형성된 골격을 갖는다. 이들은 모르폴리노 연결 (부분적으로 뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 형성된); 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 리보아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타의 것들을 갖는 것들을 포함한다. 모르폴리노 골격 구조는 예를 들어, 미국 특허 제5,034,506호에 기재되어 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 데옥시리보스 환 대신 6원 모르폴리노 환을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이들 구현예의 일부에서, 포스포로디아미데이트 또는 기타 비-포스포디에스테르 뉴클레오타이드 간 연결은 포스포디에스테르 연결을 대체한다.
2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드(도 1b 참조)는 전사 후 변형으로서 발생하는, tRNA 및 다른 소형 RNA에서 발견되는 RNA의 천연적으로 존재하는 변형이다. 2’-O-메틸 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드가 직접적으로 합성될 수 있다. 2' 플루오로 변형된 뉴클레오타이드(예를 들어, 2' 플루오로 염기)는 불소 변형된 당을 갖고 이는 결합 친화성(Tm)을 증가시키고 또한 일부 상대적 뉴클레아제 내성을 부여할 수 있다.
일부 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드인 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 2’ 플루오로 변형된 뉴클레오타이드인 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 하나 이상의 LNA, PNA, pPNA, 또는 pHypPNA 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 포스포로티오에이트 결합에 의해 연결된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖는다(즉, 공여자 DNA는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결을 갖는다). 일부 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 변형된 뉴클레오타이드의 조합을 갖는다. 예를 들어, 공여자 DNA는 다른 변형 (예를 들어, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드 및/또는 2' 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 LNA 염기)을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 것에 추가로 1개, 2개, 3개 이상의 포스포로티오에이트 연결을 가질 수 있다. 이들 변형은 바람직하게 이중 가닥 DNA 분자의 단지 하나의 가닥 상에 존재하고 가장 유리하게는 이중 가닥 DNA 분자의 하나의 가닥의 5’ 말단에, 예를 들어, 이중 가닥 DNA 분자의 5’ 말단의 20개, 10개 또는 5개 뉴클레오타이드 내에 존재한다.
공여자 DNA의 도입은 예를 들어, 전기천공, 핵감염 또는 지질감염과 같은 숙주 세포로 DNA를 도입하는 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 공여자 DNA는 바이러스 형질도입을 통해 도입되지 않는다. 예를 들어, 공여자는 전기천공되거나, cas 단백질, 및 선택된 삽입 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는 하나 이상의 RNP와 함께, 세포를 형질감염시키는 다른 수단에 의해 합성된 DNA 분자로서 제공될 수 있다. 표적화된 삽입 유전자좌는 임의로 발현 작제물의 삽입과 동시에 유전자의 발현을 제거하도록 이의 붕괴 (“녹아웃”)가 요구되는 유전자일 수 있다. 공여자 DNA는 표적 부위에서 숙주 게놈에 상동성인 서열을 포함하여 cas 뉴클레아제에 의한 표적 부위의 절단 후 HDR을 촉진시킬 수 있다. 대안적으로, 공여자 DNA는 cas 뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA, 또는 cas 뉴클레아제, 및/또는 가이드 RNA를 발현하기 위한 작제물이 세포에 도입되기 전 또는 후에 세포에 도입될 수 있다.
본원에서는 고효율의 표적화된 유전자 통합 접근을 제공하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 임의의 세포 유형의 게놈 가공을 위해 사용될 수 있고, 예를 들어, 가공된 세포가 환자에게 도입되는 적용에 사용될 수 있다.
본원에서는 제1 부위에서 고효율의 표적화된 유전자 통합을 제공하는 방법이 제공되고, 상기 제1 부위에서 내인성 유전자가 붕괴되어 있고 이와 함께 제2 부위에서 유전자가 동시 녹아웃되어 있다. 예를 들어, CAR 또는 DAR 작제물은 TRAC 또는 TRBC 유전자좌에 삽입함으로써 TRAC 또는 TRBC 유전자를 불활성화시킬 수 있고, 동시에 관문 억제제 또는 면역 조절인자 유전자, 예를 들어, 비제한적인 예로서, GM-CSF, PD-1, TIM3, CTLA-4, PDCD1, LAG3, 등을 암호화하는 유전자를 녹아웃시킬 수 있다. 제2 유전자좌의 동시 녹아웃과 함께 제1 유전자좌에서 녹아웃/녹인 방법은 세포에 제1 유전자좌를 표적화화는 제1 가이드 RNA와 복합체화된 제1 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 제1 RNP, 제2 유전자좌를 표적화하는 제2 가이드 RNA와 복합체화된 제2 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 제2 RNP, 및 본원에 기재된 바와 같이 변형되고 제1 유전자좌에서 게놈 서열과 상동성을 갖는 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA를 도입하는 단계를 포함한다. 제1 및 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제1 및 제2 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 둘다 cas9 뉴클레아제이다. 다른 예에서, 제1 및 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제는 둘다 cas12a 뉴클레아제이다. 추가의 예에서, 제1 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제는 cas9이고, 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제는 cas12a이다. 추가의 예에서, 제1 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제는 cas12a이고, 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제는 cas9이다. 상기 방법은 세포의 변형을 유도하고, 여기서, 공여자 DNA는 제1 유전자좌에 삽입되고, 제2 유전자좌에서 유전자는 붕괴된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 예를 들어, 임의의 CD38, CD19, CD20, CD123, BCMA 등에 대한 암 치료 작제물, 예를 들어, CAR을 T 세포에 적용하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 전달의 효율은 40-80%에 도달할 수 있다. 표적화된 유전자 통합을 사용한 상기 접근법은 자가 및 동종이계 접근법 둘다를 위해 사용될 수 있고, 중요하게는 가공된 세포가 환자에게 도입되는 경우 2차 및 원치 않는 세포 형질전환 위험을 갖지 않음에 따라서 현재의 통상적인 접근법 보다 안전하다. 추가의 이점은 변형된 가이드 가닥, 신뢰할 수 있는 유전자 통합, 대형 유전자의 통합, CAR의 유전자 통합, 및 높은 발현과 함께 CAR의 유전자 통합을 포함한다.
실시예는 포스포로티오에이트, 및 PCR에 의해 합성된 2’ O-메틸 변형된 단일-가닥 또는 이중-가닥 공여자 DNA를 사용하는 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집을 통해 CAR-T 세포를 제조하는 것을 기재한다. 바람직하게, 상기 변형된 단일-가닥 (ss) 또는 이중 가닥 (ds) DNA는 3개의 PS 결합을 하나의 프라이머의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 또는 5개 뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드에 부가함에 의해 생성된다. 본 발명을 임의의 특정 기전으로 제한하는 것 없이, 상기 PS 변형은 공여자 DNA의 변형된 가닥의 엑소뉴클레아제 분해를 억제하는 것으로 사료된다. 프라이머의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 또는 5개 뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드는 또한 2’ O-메틸로 변형시켜 포스포로티오에이트 결합에 의해 유발되는 비-특이적 결합을 회피한다. 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸 변형된 ds 공여자 DNA 및 ss 공여자 DNA는 PCR, 비대칭 PCR 또는 역 전사를 통해 제조될 수 있다. 대안적으로, 합성의 최종 ds DNA 생성물은 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸로 변형시킬 수 있고 dsDNA는 하나의 가닥 상에서만 변형을 갖도록 제조될 수 있다.
추가로, 즉, CAR (키메라 항원 수용체)를 숙주 세포의 한정된 게놈 부위로 삽입하기 위해 디자인된 CAR 작제물을 포함하는 포스포로티오에이트 및 2’O-메틸과 같은 화학적 변형을 갖는 공여자 DNA 작제물과 같은 공여자 DNA 작제물이 기재된다. 추가로, 본원의 개시내용은 안전성 문제가 존재할 수 있는 바이러스 벡터가 부재인 CAR로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
하나의 가닥 상에 변형을 갖는 공여자 DNA를 사용한 상기 공정은 녹-인(knock-in) 효율을 적어도 2배 증가시킬 수 있고, 이는 바이러스 벡터 방법에 상응하고, 통합의 부위 특이성을 위해 이점을 갖고 통상적인 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 접근법과 비교하여 T 세포에서 CAR 발현을 위해 매우 안정하다. 포스포로티오에이트 및/또는 2’O-메틸을 사용한 하나의 공여자 쇄의 적어도 이중 변형은 녹-인 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 1단계 녹-아웃/녹-인 방법은 다중 암 치료요법을 위한 보다 신속하고 보다 저렴한 CAR-T 생성 공정을 제공한다. 이중 가닥 DNA를 사용하고 노동적이고 수율을 감소시키는, 공여자 작제물의 뉴클레아제 처리 및 단일 가닥의 회수를 회피하는 능력은 상기 방법의 또 다른 이득이다.
상기 적용에서, 본원 발명자들은 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸 변형을 갖는 변형된 dsDNA 또는 ssDNA 공여자에 의해 긴 dsDNA 또는 ssDNA (예를 들어, ~3kb 항-CD38 CAR 및 CD19 CAR)를 녹인시키기 위한 단순하고 강력한 방법을 제공한다. 본원 발명자는 변형된 긴 dsDNA 및 ssDNA 서열이 CAR의 1차 T 세포로의 통합을 위해 고도로 효율적인 HDR 주형임을 보여준다. 추가로, 본원 발명자는 상기 방법이 통합의 부위 특이성에 대한 이점을 갖고 통상적인 레트로바이러스 또는 렌티-바이러스 접근법과 비교하여 T 세포에서 CAR 발현을 위해 매우 안정함을 입증한다.
본원의 개시내용은 1차 세포에서 CAR 유전자를 발현시키기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 1차 세포에 (a) 선택된 녹아웃 핵산에 상보적인 제1 뉴클레오타이드 서열 및 CRISPR-연합된 단백질 (Cas) 폴리펩타이드와 상호작용하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)로서, 상기 sgRNA 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 임의로 변형된 뉴클레오타이드인, 단일 가이드 RNA; 및 (b) Cas 폴리펩타이드, Cas 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, 및/또는 Cas 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 또는 Cas 폴리펩타이드(여기서, 상기 변형된 sgRNA는 Cas 폴리펩타이드를 녹아웃 핵산의 부위로 가이드한다), (c) 5’ HA 서열, 프로모터 서열, CAR 작제물, 및 3’HA 서열을 포함하는 공여자 표적 DNA로서, 상기 공여자 표적 DNA가 바람직하게 이중 가닥이고, 바람직하게 5’ 엑소뉴클레아제 절단을 감소시키기 위해 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 적어도 하나의 포스포티오에이트 결합으로 변형된 2개의 가닥 또는 바람직하게 하나의 가닥을 갖고, 임의로 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 1개, 2개, 3개 또는 4개의 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 공여자 표적 DNA를 도입하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 변형된 가닥에 대한 반대 가닥은 5’ 말단 포스페이트를 갖는다. 프로모터는 예를 들어, T 세포일 수 있는 1차 세포에서 작동가능하다.
본원의 개시내용은 1차 세포에서 CAR 유전자의 유전자 발현을 유도하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 1차 세포에 (a) 선택된 표적 핵산에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 crRNA로서, 상기 가이드 RNA 내 뉴클레오타이드의 하나 이상이 임의로 변형된 뉴클레오타이드인, crRNA; 및 (b) Cas 폴리펩타이드, Cas 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, 및/또는 Cas 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 (여기서, 상기 crRNA는 Cas 폴리펩타이드를 녹아웃 핵산의 부위로 가이드한다), 및 (c) 5’ HA 서열, 프로모터 서열, CAR 작제물, 및 3’ HA 서열을 포함하는 공여자 표적 DNA로서, 상기 공여자 표적 DNA가 바람직하게 이중 가닥이고, 5’ 엑소뉴클레아제 절단을 감소시키기 위해 공여자의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 적어도 하나의 포스포티오에이트 결합으로 변형된 2개의 가닥 또는 바람직하게 하나의 가닥을 갖고, 임의로 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 1개, 2개, 3개 또는 4개의 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 공여자 표적 DNA를 도입하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 변형된 가닥에 대한 반대 가닥은 5’ 말단 포스페이트를 갖는다. 프로모터는 임의로, T 세포일 수 있는 1차 세포에서 작동가능하다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 세포 기반 치료요법을 위해 변형된다. 세포는 비제한적인 예로서 줄기 세포, 섬유아세포, 신경교 세포, 근세포, 또는 조혈 세포일 수 있고, 본원에 기재된 방법을 사용하여 변형되고, 환자에게 전달될 수 있다. 상기 세포는 환자와 관련하여 자가이거나 동종이계일 수 있다. 동종이계인 경우, 세포는 하나 또는 다수의 공여자로부터 기원할 수 있다.
실시예
실시예는 공여자 DNA를 녹킹인하고 T 세포 수용체 (TCR)와 같은 표적화된 내인성 유전자 또는 PD-1 유전자를 녹킹 아웃하기 위해 바이러스 벡터를 사용하지 않고 높은 형질감염 효율을 제공하는 기재된 공정의 이점을 보여준다. 또한 예시된 것은 제1 유전자좌에서 동시 유전자 녹아웃 및 유전자 녹인, 및 단일 형질감염으로부터 비롯된 제2 유전자좌에서 유전자 녹아웃이 예시된다.
건강한 자원 봉사자 공여자의 버피 코트는 샌디에고 혈액 은행으로부터 수득하였다. 일부 새로운 전혈 또는 백혈구성분채집 생성물은 제조원(StemCell Techologies (Vancouver, Canada))으로부터 수득하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. PBMC는 mL 당 106 세포의 밀도로, 300 U/mL의 IL-2 (Proleukin)와 함께 5% 태아 소 혈청 (Sigma, St. Louis, Mo)이 보충된 AIM-V 배지(ThermoFisher Scientific, Waltham, Ma)에서 2일 동안 CD3 항체(BioLegend, San Diego, CA) 100ng/mL로 활성화시켰다. 배지는 2 내지 3일마다 갈아주고 세포는 mL 당 106으로 재분주하였다. 상기 처리는 배양물 중에서 T 세포를 선택적으로 증폭시킨다. 일부 실험에서, 세포는 mL 당 106 세포의 밀도로, 300 U/mL의 IL-2 (Proleukin)와 함께 5% CTS™ 면역 세포 SR (Thermofisher scientific)이 보충된 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM (ThermoFisher Scientific)에서 배양하였다. 일부 실험에서, T 세포는 제조업자의 지침에 따라 EasySep™ 사람 T 세포 단리 키트 또는 CD3 양성 선택적 키트(Stemcell Technology Inc.) 또는 Dynabeads™ 사람 T-확장기 CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific)를 사용한 자기 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 단리하였다.
세포독성 검정에 사용하기 위해, CD38을 발현하는 RPMI-8226 (다발성 골수종 세포주) 세포는 녹색 형광성 단백질 (GFP)을 발현하도록 형질도입하였고, CD38을 발현하지 않는 K562 (사람 불멸화된 골수성 백혈병) 세포는 R-피코에리트린(RPE)을 발현하도록 형질도입하였다. 세포주 둘다는 10% 태아 소 혈청(Sigma)이 보충된 RPMI1640 배지(ATCC)에서 배양하였다. CAR 플라스미드는 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Takara Bio USA, Inc, Mountain View, CA)를 사용하여 생성하였다. 골격 플라스미드 pAAV-MCS (Cell Biolabs (San Diego, Ca))는 공여자 단편을 생성하기 위한 PCR 주형으로서 사용된 유전학적 작제물을 생성하기 위해 사용되었다.
일부 실험에서, 레트로바이러스-형질도입된 T 세포는 cas-매개된 녹-인 세포와 비교하였다. 레트로바이러스 작제물을 사용한 T 세포의 형질도입은 필수적으로 문헌(참조: Ma et al., (2004) The Prostate 61:12-25; and Ma et al., The Prostate 74(3):286-296, (2014), The Prostate 74(3):286-296, 이의 개시내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 항-CD38 CAR (또는 다른 작제물) 플라스미드 DNA로 FuGene 시약(Promega, Madison, Wi)을 사용하여 Phoenix-Eco 세포주 (ATCC)를 형질감염시켜 에코트로픽 레트로바이러스를 생성시킴에 이어서 수거된 일과성 바이러스 상등액 (에코트로픽 바이러스)을 사용하여 GaLV 외피 단백질을 갖는 PG13 팩키징 세포를 형질도입하여 사람 세포를 감염시키기 위해 레트로바이러스를 생성하였다. PG13 세포로부터의 바이러스 상등액을 사용하여 CD3 또는 CD3/CD28 활성화 후 2 내지 3일에 활성화된 T 세포 (또는 PBMC)를 형질도입하였다. 활성화된 사람 T 세포는 2일 동안 제조업자의 매뉴얼에 따라 정상의 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 100 ng/ml의 마우스 항-사람 CD3 항체 OKT3 (Orth Biotech, Rartian, NJ) 또는 항-CD3, 항-CD28 T-세포 TransAct 시약 (Miltenly Biotech, San Diego, CA), 및 5% FBS가 보충된 AIM-V 성장 배지 (GIBCO-Thermo Fisher scientific, Waltham, MA) 중 300-1000 U/ml의 IL-2로 활성화시킴에 의해 생성하였다. 5×106 활성화된 사람 T 세포는 10 mg/ml의 레트로넥틴 (Takara Bio USA) 예비-코팅된 6-웰 플레이트에서 3ml의 바이러스 상등액으로 형질도입하였고, 32 ℃에서 1시간 동안 1000g에서 원심분리하였다. 형질도입 후, 형질도입된 T 세포는 5% FBS 및 300-1000 U/ml IL2가 보충된 AIM-V 성장 배지에서 확장시켰다.
[표 1]
공여자 DNA를 생성하기 위해 사용된 프라이머:
별표는 포스포로티오에이트 (PS) 연결; Am, 2’-O-메틸화된 데옥시아데노신;
Cm, 2’-O-메틸화된 데옥시시토신; Gm, 2’-O-메틸화된 데옥시구아노신을 지적한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 1. 사람 T 세포에서 T-세포 수용체 유전자의 동시 녹아웃 및 항-CD38 CAR의 녹인.
상기 실시예에서, T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 유전자 (Entrez Gene ID: 28755)는 공여자 DNA로서 항-CD38 CAR 직제물로 표적화하였다. pAAV-TRAC-항-CD38 작제물은 게놈에서 표적 서열(CAGGGTTCTGGATATCTGT (서열번호 1))을 플랭킹하는 T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC)의 대략 1.3kb의 게놈 DNA 서열과 함께 디자인하였다. 표적 서열은 Cas9-매개된 유전자 붕괴 및 공여자 작제물의 삽입을 위한 TRAC 유전자의 엑손 1에서 Cas9 PAM (GGG)의 업스트림의 부위로서 동정되었다. 항-CD38 CAR 유전자 작제물 (서열번호 2)은 사람 CD38에 특이적인 단일쇄 가변 단편 (scFv)에 이어서 CD8 및 CD28 힌지 도메인-CD28 막관통 도메인-CD28 세포내 영역 및 CD3 제타 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 포함하였다. 외인성 JeT 프로모터 (미국 특허 제6,555,674호; 서열번호 3)를 사용하여 항-CD38 CAR의 전사를 개시하였다.
공여자 DNA 단편 게놈 편집을 생성하기 위한 PCR 주형으로서 사용된 pAAV-항-CD38A2 공여자 플라스미드를 작제하기 위해, 650-660 bp 상동성 아암을 갖는 항-CD38A2 CAR 작제물(서열번호 4)은 통합된 DNA 기술(IDT, Coralville, IA)에 의해 합성하였다. 인-융합(in-fusion) 클로닝 반응은 실온에서 수행하였고, Mlul 및 BstEII (50ng)으로 이중 분해된 pAAV-MCS 벡터, 플랭킹 상동성 아암을 갖는 항-CD38A2 CAR 단편(서열번호 4) (50ng), 1ul 5X의 인-융합 HD 효소 프레믹스(Enzyme Premix) (Takara Bio), 및 뉴클레아제 부재 물을 함유한다. 반응물을 간략하게 볼텍싱하고 50 ℃에서 30분 동안 항온처리 전에 원심분리하였다. Stellar™ 컴피턴트 세포 (Takara Bio USA)는 이어서 인-융합 생성물로 형질전환시키고, 암피실린-처리된 한천 플레이트 상에 분주하였다. 다수의 콜로니는 생거 서열분석(Genewiz, South Plainfield, Nj)을 위해 선택하여 서열분석 프라이머 CTTAGGCTGGGCATTAGCAG (서열번호 5), CATGGAATGGTCATGGGTCT (서열번호 6), 및 GGCTACGTATTCGGTTCAGG (서열번호 7)을 사용하여 올바른 클론을 동정하였다. 올바른 클론을 배양하고 이들 클론으로부터의 DNA 플라스미드를 정제하였다.
TCR 알파 (TRAC) 유전자의 RNA 가이드-지시된 표적화를 위해, tracr RNA (ALT-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA) 및 crRNA (ALT-R® CRISPR-Cas9 crRNA)는 IDT (Coralville, IA)로부터 구입하였고, 여기서, 상기 crRNA는 TRAC 유전자의 제1 엑손 내 Cas9 PAM 서열 (GGG)의 바로 업스트림에 존재하는 표적 서열 CAGGGTTCTGGATATCTGT (서열번호 1)을 포함하도록 디자인하였다.
공여자 단편 DNA를 제조하기 위해, PrimeSTAR 맥스 프레믹스 (Takara Bio USA)는 PCR 반응을 위해 사용하였다. 상기된 AAV 공여자 플라스미드 pAAV-항-CD38A2는 주형으로서 사용하였다. 660nt (서열번호 44) 및 650nt (서열번호 45)의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하기 위해, 정배향 프라이머는 서열: TGGAGCTAGGGCACCATATT (서열번호 36)을 갖고, 역배향 프라이머는 서열: CAACTTGGAGAAGGGGCTTA (서열번호 9)를 갖는다. 상이한 상동성 아암 길이의 효과를 시험하기 위한 다양한 실험에서, pAAV-항-CD38A2 작제물의 상동성 아암 내 특정 위치에 하이브리드화하는 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 목적하는 길이의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하였다. 포스포로티오에이트 결합(도 2a)은 정배향 프라이머 (서열번호 36)의 5’ 말단에서 말단 3개의 뉴클레오타이드에 도입하여 엑소뉴클레아제 분해 (5’ 말단으로부터 첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 및 세번째와 네번째 뉴클레오타이드 사이에)를 억제하였다. 정배향 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 5’ 말단으로부터 두번째, 세번째 및 네번째 위치에서 뉴클레오타이드는 또한 2'-O-메틸 변형시켰다(도 2b) (서열번호 8, 표 1 참조). 역배향 프라이머(서열번호 9)는 5'-말단 포스페이트를 포함하였다. 공여자 DNA 단편을 생성하기 위해, 열순환기 세팅은 다음과 같다: 30s 동안 98 ℃의 1회 사이클, 10s 동안 98℃, 5 내지 15s 동안 64 내지 66℃, 30s 동안 72 ℃의 35회 사이클 및 7 내지 10분동안 72 ℃의 1회 사이클. 단일 가닥 주형을 생성하기 위한 스트랜다제를 사용한 분해는 Guide-it™ 롱 ssDNA 제조 시스템(Long ssDNA Production System) 키트 (Takara Bio USA)를 사용하여 제조업자의 지침(Takara Bio USA)에 따라 수행하였고, ssDNA는 뉴클레오스핀 겔(NucleoSpin Gel) 및 PCR 클린-업 키트(Clean-Up kits) (Takara Bio USA)를 사용하여 정제하였다. ssDNA의 농도는 NanoDrop (Denovix, Wilmington, De)에 의해 결정하였다. 대조군으로서, 공여자 단편은 수득한 공여자 단편이 어떠한 화학적 변형을 갖지 않도록 (PS 또는 2’-O-메틸 그룹 부재) 변형되지 않은 프라이머 또는 단지 PS 변형 (2’-O-메틸 그룹 부재)을 갖는 정배향 프라이머로 생성하였다.
TCR 녹아웃/항-CD38 CAR 녹인을 생성하기 위해, T 세포는 CD3을 배양물에 첨가함에 의해 활성화시켰다. CD3을 사용한 T-세포 활성화 개시 후 대략 48 내지 72시간에, 활성화된 T 세포를 포함하는 PBMC 배양물을 Neon® 형질감염 시스템(ThermoFisher Scientific) 및 10-μl의 팁 또는 100-μl 팁을 사용하여 SpCas9 단백질(핵 국소화 서열을 포함하는; IDT) + crRNA(가이드 서열 서열번호 1을 포함하는) 및 tracrRNA을 포함하는 SpCas9 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)와 함께 전기천공하였다. 간략하게, Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA 및 Alt-R tracrRNA (둘다 IDT로부터)는 먼저 혼합하고 95 ℃에서 5분동안 가열하였다. 혼합물을 이어서 가열로부터 제거하고 약 20분동안 벤치 탑 (bench top) 상에서 실온(15-25 ℃)으로 냉각되도록 방치하여 crRNA:tracrRNA 듀플렉스를 제조한다. 각각의 형질감염을 위해, 10 μg SpCas9 단백질 (IDT)은 200 pmol의 crRNA:tracrRNA 듀플렉스와 혼합하고, 30분동안 4℃에서 함께 항온처리하여 RNP를 형성하였다. 1 x 106 세포를 RNP와 혼합하고 1700 V, 20 ms 펄스 폭, 1 펄스로 전기천공하였다. 1 내지 2시간 후에, 10ug의 단일-가닥의 공여자 DNA를 1600 V, 20ms 펄스 폭, 1 펄스로 세포에 전기천공하였다. 일부 경우에, T 세포는 RNP 및 공여자 DNA와 혼합하고 RNP + 공여자 DNA를 동시에 세포에 전기천공하였다. 전기천공 후, 세포는 배양 배지에 희석시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다.
FACS에 의한 형질전환된 세포의 CAR 발현을 검출함에 의한 녹-인 효율을 결정하기 위해, 형질감염되거나 레트로바이러스적으로 형질도입된 PBMC는 DPBS/5% 사람 혈청 알부민으로 세척하고, 이어서 항-CD3-BV421 항체 SK7 (BioLegend) 및 PE 접합된 항-CD38-Fc 단백질(Chimerigen Laboratories, Allston, MA)로 4 ℃에서 30 내지 60분 동안 염색시켰다. CD3 및 항-CD38 CAR 발현은 iQue 스크리너 플러스 (Intellicyte Co.)를 사용하여 분석하였다. 항-CD38 작제물 녹-인을 위한 음성 대조군은 하이브리드화된 tracrRNA 및 TRAC 유전자의 제1 엑손을 표적화하는 crRNA와 복합체화된 Cas9 단백질을 포함하는 RNP로 형질감염시켰지만 항-CD38 CAR 공여자 DNA로 형질감염되지 않은 세포이다. 녹-인 세포에 의한 항-CD38 CAR 작제물의 발현을 위한 대조군으로서, 항-CD38 CAR-발현 PBMC는 비-Cas9 방법에 의해 생성하였다. TRAC 유전자좌를 표적화하는 가이드를 포함하지만 (TCR 녹아웃 세포) 어떠한 공여자 DNA가 없는 RNP로 형질감염된 PBMC에는 CRISPR/Cas9 표적화에 사용된 공여자 단편을 제조하기 위해 사용된 동일한 항-CD38A2 발현 카세트 (서열번호 2)를 갖는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 레트로바이러스를 형질도입하였다.
도 3a는 형질감염 후 8일째에 항-CD38 작제물의 발현이 항-CD38 CAR의 발현을 위한 공여자 단편의 부재하에 RNP (TRAC 유전자를 녹킹아웃하기 위해) RNP로 형질감염된 세포에서 검출되지 않았음을 보여준다(최좌측 패널). 한편, TRAC 녹아웃을 갖고 후속적으로 항-CD38 CAR을 발현하기 위해 작제물을 포함하는 레트로바이러스가 형질도입된 PBMC는 형질감염 후 8일째에 세포의 약 70%에서 항-CD38 CAR의 발현을 보여주었다(도 3a의 최우측 패널). TRAC 유전자의 RNP 표적화 엑손 1에 추가로 항-CD38 CAR ss 공여자 DNA로 형질전환된 배양물에 대해, 어떠한 화학적 변형을 갖지 않은 ss 공여자 DNA를 수용한 집단의 대략 12% 및 공여자 DNA의 5’ 말단 근처의 뉴클레오타이드 상에 PS 골격 변형만을 갖는 (5’ 말단으로부터 넘버링되는 뉴클레오타이드 1과 2, 2와 3 및 3과 4 사이에 PS 결합을 갖는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 도입된) ss 공여자 DNA가 형질도입된 배양물의 대략 13%는 항-CD38 작제물의 발현을 입증하였다. 또한 PS 변형을 포함하는 (PCR에 의해 공여자 DNA를 생성하기 위해 이들 변형을 포함하는 서열번호 8의 프라이머를 사용함에 의해) 공여자 단편 가닥의 5’ 말단으로부터 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드에서 3개 뉴클레오타이드의 2’ 산소로의 메틸 그룹의 부가는 형질감염된 집단에서 항-CD38 CAR의 유의적으로 보다 높은 발현을 유도하였고, 여기서, 항-CD38 CAR의 발현은 8일째에 ‘이중 변형된 (2’-O-메틸 및 PS) 단일 가닥의 공여자 단편을 수용한 세포의 대략 20%에서 나타났다. 현저하게, 공여자 DNA의 화학적 변형은 형질감염된 배양물의 생존률에 영향을 미치지 않았다.
항-CD38 CAR의 증가된 발현은 항-CD38 CAR 공여자 단편 + 상기 TRAC 유전자를 표적화하는 RNP로 형질감염된 배양물에서 시간 경과에 따라서 관찰되었고, 반대로 레트로바이러스가 형질도입된 배양물에 대해서도 사실이다. 형질감염 후 10일째에(도 3b), 유동 세포측정은 모두 TRAC-표적화 RNP로 형질감염된 배양물 모두에 대해, 상기 세포의 적어도 80%가 TCR을 발현하지 않았음을 입증하였다. 더욱이, TRAC-표적화 RNP에 추가로 항-CD38 CAR 공여자 단편으로 형질감염된 배양물에서, TCR을 발현하지 않은 세포의 적어도 42%는 형질감염 후 10일째에 항-CD38 작제물을 발현하였다(도 3b, 패널 2-4). 5’-근접 뉴클레오타이드 상에 PS 및 2’-O-메틸 그룹 둘다를 갖는 항-CD38 CAR 공여자 단편으로 형질감염된 배양물에 대해, 세포의 57%는 10일까지 임의의 시험 배양물 중 최고의 퍼센트로 항-CD38 작제물을 발현하였다(도 3b, 패널 4). 동시에, 레트로바이러스로 형질도입된 배양물 중에 항-CD38 CAR의 발현은 8일째에 나타났던 것의 약 절반으로, 형질도입 후 10일째에 세포의 대략 34%까지 떨어졌다 (도 3b. 패널 5). 20일째에 이중으로 변형된 ss 공여자로 형질감염된 배양물 및 레트로바이러스 형질도입된 배양물의 분석(도 3c)은 배양물 중에 항-CD38 작제물의 발현이 안정화되고, 5’ 말단에서 PS 및 2’-O-메틸 변형 둘다를 갖는 ss 공여자로 형질감염된 Cas9-변형된 배양물은 TCR-음성 세포의 54%가 작제물을 발현함(중간 패널)을 입증하고 레트로바이러스가 형질도입된 배양물은 TCR-음성 세포의 31%가 작제물을 발현함(우측 패널)을 입증함을 보여주었다.
TRAC 유전자의 엑손 1에서 표적화된 유전자좌에서 상동성 지시된 복구 (HDR)의 존재를 확인하기 위해, PCR은 공여자 단편이 가이드 RNA에 의해 표적화된 TRAC 부위로 삽입되었는지를 입증하기 위해 배양물로부터 단리된 DNA에 대해 수행하였다. 게놈 DNA는 비-형질감염된 활성화된 T 세포(ATC), TRAC 엑손 1 가이드 RNA를 포함한 RNP로 형질전환된 TRAC 녹아웃 세포, 및 RNP + 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸 변형된 공여자 DNA로 형질감염된 T 세포로부터 증폭시켜 TRAC 유전자좌로의 항-CD38 CAR 전이유전자의 표적화된 삽입을 검출하였다. 게놈 내 공여자 DNA의 위치를 확인하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 TRAC 상동성 아암의 외부이지만 게놈 내 상동성 아암 서열에 인접한 (이의 외부) 서열에 표적화하였다. 총 1 x 105 세포를 30 μL의 퀵 추출 용액(Quick Extraction solution) (Epicenter)에 재현탁시켜 게놈 DNA를 추출하였다. 세포 용해물을 5분동안 65 ℃에서 및 이어서 2분동안 95 ℃에서 항온처리하고 -20 ℃에서 저장하였다. 게놈 DNA의 농도는 NanoDrop (Denovix)에 의해 결정하였다. TRAC 표적 부위를 함유하는 게놈 영역은 하기의 프라이머 세트를 사용하여 PCR-증폭시켰다: TRAC 상에 5’ PCR 정배향 프라이머: CCTGCTTTCTGAGGGTGAAG (서열번호 10), CAR 상에 역배향 프라이머: CTTTCGACCAACTGGACCTG (서열번호 11); CAR 상에 3’ 정배향 프라이머: CGTTCTGGGTACTCGTGGTT (서열번호 12), TRAC 상에 3’ 역배향 프라이머: GAGAGCCCTTCCCTGACTTT (서열번호 13) (도 1b 참조). 프라이머 세트 둘다는 상동성 아암의 외부를 어닐링함에 의해 HDR 주형의 증폭을 회피하도록 디자인하였다.
게놈 DNA의 농도는 NanoDrop (Denovix)에 의해 결정하였다. 프라이머 세트 둘다는 쌍의 하나의 프라이머가 상동성 아암의 외부의 게놈 내 부위에 어닐링하도록 하고 상기 쌍의 다른 프라이머가 작제물의 암호화 영역 (즉, 상동성 아암에서의 영역이 아닌) 내 부위로 어닐링하도록 디자인하였다. PCR은 400ng의 게놈 DNA 및 Q5 고충실도 2X 믹스 (New England Biolabs)를 함유하였다. 열순환기 세팅은 2분동안 98 ℃에서 1 사이클, 10s 동안 98 ℃에서, 15s 동안 65 ℃에서, 45s 동안 72 ℃에서 35 사이클 및 10분동안 72 ℃에서 1 사이클로 이루어졌다. PCR 생성물은 SYBR Safe를 함유하는 1% 아가로스 겔 (Life Technologies) 상에서 정제하였다. PCR 생성물은 이어서 아가로스 겔로부터 용출시키고 NucleoSpin® 겔 및 PCR 클린-업 키트(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. Kg)를 사용하여 단리하였다. PCR 생성물은 생거 서열분석 (Genewiz)을 위해 제출하였다. 도 4는 겔 분리 PCR 생성물의 사진을 제공한다. 작제물의 5’ 및 3’ 말단에서 게놈 내 상동성 아암에 인접한 게놈 서열에 인접한 항-CD38 작제물에 상응하는 양성 밴드는 공여자 DNA로 형질감염된 세포 (레인 3 및 6)에서 나타났고 비-형질감염된 ATC (레인 1 및 4) 또는 TRAC 녹아웃 유일 세포 (레인 2 및 5)에서 나타나지 않았다. 이들 PCR 생성물의 서열분석은 예측된 부위에 삽입된 항-CD38 CAR 작제물이 예측된 부위에 삽입됨을 확인시켜주었고, 여기서, 상동성 아암의 영역 외부에 게놈 서열 및 작제물의 5’ 및 3’ 말단 둘다에서 상동성 아암 서열 내부에서 작제물 서열에 어닐링하는 프라이머를 사용한 통합된 항-CD38 CAR 작제물을 갖는 세포의 게놈 DNA로부터 생성된 상기 PCR 단편들은 표적화된 부위에 통합된 작제물에 대해 예측된 서열을 가졌다. 삽입 유전자좌를 진단하기 위해 프라이머를 사용하여 생성된 PCR 생성물의 서열분석(도 1b 참조)은 TRAC 유전자의 엑손 1에 통합된 항-CD38 CAR 공여자 단편을 입증하는 서열을 제공하였다. PCR 생성물 서열(예를 들어, 서열번호 39 및 서열번호 40)은 게놈 내 상동성 아암 (의 외부)에 인접한 서열, 공여자 단편내에 존재하는 상동성 아암에 인접한 서열 및 단일 PCR 생성물 내 항-CD38 CAR의 일부를 포함하였고, 이는 예상된 부위에서의 삽입을 입증한다.
형질감염된 세포의 기능에 대해 시험하기 위해, 전기천공 3주 후에, TRAC 유전자좌에 표적화된 항-CD38 CAR로 형질감염된 활성화된 T 세포는 밤새 IL-2로 단식시키고, 특이적 사멸 검정에서 시험하였다. 활성화된 T 세포는 CD38 양성 RPMI-8226/GFP 세포 및 CD38 음성 K562/RPE 세포의 표적 세포 혼합물과 동시 배양하였다. 항온처리 이펙터-대-표적 세포 비율은 10:1 내지 0.08:1 범위였다. 밤새 항온처리 후, 세포는 유동 세포측정에 의해 분석하여 GFP-양성 및 RPE-양성 세포 집단을 측정하여 항-CD38A2 CART 세포에 의한 특이적 표적 세포 사멸을 결정하였다. 도 5는 CD38-발현 RPMI8226 세포에 대한 각각의 세포 집단의 특이적 세포독성의 그래프를 제공한다(CD38을 발현하지 않는 K562 세포에 대한 관찰된 세포독성으로부터 공제한 후 CD38-발현 RPMI8226에 대해 관찰된 세포독성). 상기 그래프는 비-형질감염된 ATC 세포가 최고의 이펙터 대 표적 비율에서 일부 독성을 보여주었지만, TRAC 녹아웃 세포는 이펙터 대 표적 세포 비율에 상관 없이 실질적으로 어떠한 사멸을 보여주지 않았음을 보여준다. 항-CD38A2 CART 세포는 그러나 CD38 양성 세포- RPMI8226에 대해 강력하고 특이적인 사멸 활성을 나타냈지만 CD38 음성 세포 - K562에 대해서는 활성이 나타나지 않았다(도 5). 항-CD38 CAR 카세트를 함유한 화학적으로 변형된 공여자를 통합한 T 세포는 항-CD38 CAR 작제물을 포함하는 레트로바이러스가 형질도입된 세포의 것과 유사하게 표적 세포에 대한 세포독성을 입증하였다.
형질감염된 활성화된 T 세포 (ATC)는 또한 사이토킨 분비에 대해 시험하였다(도 6). T 세포는 밤새 IL-2 부재 배지에서 단식시켰다. 항-CD38 CAR-T 세포 또는 ATC 대조군은 이어서 CD38 음성 K562 또는 CD38 양성 RPMI8226 세포와 동시 배양하였다. 항온처리 이펙터 대 표적 세포 비율은 2:1이었다. 밤새 항온처리 후, 세포는 제조업자의 지침에 따라 원심분리하고 상등액을 수거하여 사이토킨 IL-2, IFN-감마 및 TNF 알파(Affymetrix eBioscience)를 정량하였다. 유전자-편집된 TCR 녹아웃 항-CD38A2 CART 세포는 또한 CD38 음성 세포 (K562)가 아닌 CD38 양성 종양 세포 (RPMI8226)와 동시 배양하는 경우 유사한 양의 IFN-γ 및 다른 염증 촉진 사이토킨을 방출하였다.
요약하면, 시험관내 세포 기능성 연구는 특이적 사멸 검정 (도 5) 및 사이토킨 분비 검정(도 6) 둘다의 측면에서, 상기 신규 및 효율적인 공정에 의해 성취된 TRAC-부위-특이적 통합된 항-CD38A2 CAR과 바이러스-매개된 무작위로 통합된 항-CD38A2 CAR 간에 임의의 현저한 차이를 밝히지 못했다.
실시예 2. 공여자 DNA의 상동성 아암의 길이의 감소
항-CD38 CAR 작제물의 녹-인을 위해, 상이한 길이의 상동성 아암 (HA)을 갖는 공여자 단편을 생성하고 시험하였다. 항-CD38 카세트 + 660과 650nt의 TRAC 엑손 1 상동성 아암을 포함한 실시예 1에서 기재된 pAAV-TRAC-항-CD38 작제물은 주형(서열번호 4)으로서 사용하였다. 프라이머, 서열번호 8 및 서열번호 9의 제1 세트를 사용하여 실시예 1에 제공된 바와 같은 상기 주형으로부터 660 nt 및 650 nt의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하였다. 제2 세트의 프라이머, 서열번호 14 및 서열번호 15를 사용하여 대략 350nt (375 및 321 뉴클레오타이드)의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하였고, 여기서, 서열번호 14의 프라이머는 5’ 말단으로부터 제1과 제2, 제2와 제3, 및 제3과 제4 뉴클레오타이드 사이에 PS 연결을 갖고 위치 2, 3, 및 5에서 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 가졌다. 제3 세트의 프라이머, 서열번호 18 및 서열번호 19를 사용하여 대략 165nt (171 및 161nt)의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하였고, 여기서, 서열번호 18의 프라이머는 5’ 말단으로부터 제1과 제2, 제3과 제4, 및 제4와 제5 뉴클레오타이드 사이에 PS 연결을 갖고 위치 3, 4 및 5에서 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 가졌다. 각각의 경우에, 정배향 프라이머 (서열번호 8, 14, 및 18)는 5’말단 최외곽 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 연결 (예를 들어, 프라이머의 5’ 말단으로부터 임의의 제1과 제2, 제2와 제3, 제3과 제4, 및 제4와 제5 뉴클레오타이드 사이에) 및 임의의 5개의 5’ 말단 최외곽 뉴클레오타이드에 존재하는 3개의 2’-O-메틸 그룹을 갖도록 디자인하였다. 각각의 경우에, 역배향 프라이머(서열번호 9, 15, 및 17)는 5’ 말단 포스페이트를 가졌다(표 1 참조).
프라이머 세트 각각은 공여자의 하나의 가닥의 5’ 말단에 근접한 다중 PS 및 2’-O 메틸 변형 및 공여자의 반대 가닥의 5’ 말단에서 5’ 포스페이트를 갖는 공여자 DNA 분자를 생성하기 위해 주형으로서 pAAV CD38 DAR 작제물과 함께 사용하였다. RNP는 실시예 1에 기재된 바와 같은 tracr 및 crRNA를 포함하도록 어셈블리하였고, 여기서, 상기 crRNA는 TRAC 유전자의 엑손 1에 발견된 서열인 서열번호 1의 표적 서열을 포함하였다. PCR에 의해 공여자 DNA를 합성하는 경우, 단일 가닥의 공여자 단편을 생성하기 위한 뉴클레아제 반응 및 상기 단일 가닥의 DNA의 후속 정제는 시간 소모적이고 전형적으로 형질감염에 대한 공여자 단편의 수율에서 유의적 상실을 유도한다. 추가로, 뉴클레아제 반응은 공여자 단편의 말단이 분해될 수 있어 제어하기가 어려울 수 있다. 지시된 유전자 녹아웃 및 항체 작제물 녹인의 효율을 시험하는 추가의 실험에서, 이중 가닥 공여자 DNA는 PCR 합성된 공여자의 뉴클레아제 분해 및 단일 가닥 정제를 제거하기 위해 형질감염에서 시험하였다.
길이가 대략 665, 350 및 165 염기쌍인 상동성 아암을 갖는 이중 가닥 공여자 분자는 독립적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 활성화된 T 세포에 형질감염시켰고, 단, 공여자 단편 및 RNP는 RNP를 전기천공시키기 위한 (Neon® 형질감염 시스템(ThermoFisher Scientific) 1700 V, 20 ms 펄스 폭, 1 펄스) 조건하에서 동일한 전기천공으로 형질감염시켰다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 공여자 DNA 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. T 세포 수용체 및 항-CD38 CAR 작제물의 발현에 대해 시험하기 위해, 유동 세포측정은 실시예 1에 제공된 바와 같이 수행하였다. 도 7은 예상된 바와 같이, 단지 RNP로 형질감염된 T 세포 배양물이 T 세포 수용체의 저수준의 발현을 가짐을 보여주고 또한 항-CD38 CAR이 발현되지 않음을 입증하였다. RNP + 상이한 크기의 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA로 형질감염된 T 세포는 그러나 배양물에서 저수준의 T 세포 수용체 발현 및 항-CD38 CAR의 양호한 발현을 보여주고, 이는 이중 가닥 DNA의 형질감염이 표적화된 녹-인을 위해 매우 효과적임을 입증한다. 추가로, 놀랍게도, 시험된 최단 HA 길이 161/171 nt는 보다 긴 HA 길이 보다 양호하게 작동하였고, 도입된 작제물을 발현하는 녹아웃 세포의 퍼센트는 대략 665 nt 아암에 대해 대략 24%, 대략 350nt 아암에 대해 대략 30% 및 대략 165 nt 아암에 대해 대략 38%이다. 짧은 상동성 아암은 다라서 이중 가닥 DNA 공여자를 사용한 표적화된 녹-인 게놈 변형에 매우 효과적인 것으로 밝혀졌고, 이는 보다 작은 작제물을 가능하고/하거나 작제물 내 보다 높은 용량을 가능하게 하여 공여자 DNA에 포함될 추가의 또는 보다 긴 서열의 내포를 가능하게 한다는 이득을 갖는다.
실시예 3. 변형된 것 대 비-변형된 이중 가닥 공여자 DNA
항-CD38 CAR을 포함하고 상기 실시예 2에 제시된 바와 같이 대략 165 nt TRAC 엑손 1 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA는 HDR을 촉진시키는데 이들의 상대적 효과를 시험하기 위해 뉴클레오타이드 변형의 존재 및 부재하에 프라이머를 사용하여 합성하였다. 첫번째의 경우에, 프라이머 서열번호 18은 프라이머(뉴클레오타이드 위치 3, 4 및 5에서) 및 프라이머 서열번호 19의 처음 5개 뉴클레오타이드 내 제1과 제2, 제3과 제4 및 제4와 제5의 뉴클레오사이드, 및 3개의 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드 사이에 존재하는 3개의 PS 연결을 갖고, 프라이머 서열번호 19는 5’ 말단 포스페이트를 갖는다(표 1). 이들 프라이머를 사용하여 각각 171 bp 및 161 bp의 HA를 갖고, 상응하는 뉴클레오타이드 변형 (즉, 공여자 DNA 생성물의 제1 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 연결 및 3개의 2’-O-메틸 그룹, 및 공여자 DNA 생성물의 제2 가닥의 5’ 말단 상에 포스페이트)을 갖는 공여자 DNA를 생성하였다. 제2의 경우에, 프라이머 서열번호 37은 프라이머 서열번호 18과 동일하고, 단, 프라이머 서열번호 37은 화학적 변형이 부재이다(표 1 참조). 5’ 말단 포스페이트가 부재인 서열번호 37 프라이머 및 서열번호 19 프라이머를 사용하여 항-CD38 CAR 카세트를 갖는 어떠한 뉴클레오타이드 변형을 갖지 않는 공여자 DNA를 생성하였다. 이들 공여자 DNA는 활성화된 T 세포에 서열번호 1의 표적 서열 (TRAC 유전자의 엑손 1 내)을 포함하는 trRNA 및 crRNA를 포함하는 RNP와 함께 이중 가닥 DNA 분자 (어느 한 가닥의 변성 또는 뉴클레아제 분해가 없음)로서 형질감염시켰다. 공여자로서 이중 가닥의 DNA를 사용한 전기 천공에서, 5ug의 dsDNA를 사용하여 100만개의 활성화된 T 세포를 형질감염시켰다.
실시예 2에서와 같이, 대조군 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP를 형질감염시키고, 이는 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. T 세포 수용체 및 항-CD3 CAR 작제물의 발현에 대해 시험하기 위해, 유동 세포측정은 필수적으로 실시예 1에 제공된 바와 같이 수행하였다. 도 8에 나타낸 결과는 RNP 및 변형된 이중 가닥 공여자를 사용한 형질감염이 항-CD38 CAR을 발현하는 세포의 50% 초과를 유도하였음을 보여주고, 이는 TCR 발현 부재, RNP 및 비변형된 이중 가닥 공여자 (22%)로 형질감염된 배양물에서 관찰된 바와 같이 항-CD38 작제물을 발현하는 TCR 음성 세포 퍼센트의 적어도 2배를 입증한다.
실시예 4. 동시 TCR 녹아웃과 함께 항-CD19 및 항-BCMA CAR 작제물의 HDR-매개된 녹인
항-CD19 CAR 및 항-BCMA CAR 발현 작제물을 포함한 추가의 공여자 DNA는 또한 TRAC 유전자좌로의 삽입에 대해 시험하였다.
Jet 프로모터 (서열번호 3), 및 인트론, 항-CD19 CAR 작제물 및 SV40 폴리A 서열을 포함하는 항-CD19 CAR 카세트(서열번호 22)를 포함하는 항-CD19 CAR 작제물은 필수적으로 실시예 1에 기재된 항-CD38 CAR pAAV 작제물에 대해 기재된 바와 같이 제조하였고, 서열번호 20 및 서열번호 21의 TRAC 유전자 엑손 1 상동성 아암(HA)에 의해 플랭킹된 벡터에 클로닝하였다. HA pAAV 작제물을 갖는 항-CD19 CAR은 대략 170개 및 160개 뉴클레오타이드의 HA를 갖는 변형된 공여자 DNA의 생성을 유도하는 서열번호 18 및 서열번호 19로서 제공된 프라이머를 사용하여 실시예 1에 제공된 바와 같은 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다(표 1 참조). 정배향 프라이머(서열번호 18)는 첫번째와 두번째, 세번째와 네번째, 및 네번째와 다섯번째 뉴클레오사이드 사이에 3개의 PS 결합 및 프라이머의 5’ 말단으로부터 넘버링하는 경우 뉴클레오타이드 3, 4 및 5에서 3개의 2’-O-메틸 변형을 갖고, 역배향 프라이머(서열번호 19)는 5’ 말단 포스페이트를 가졌다(표 1). 따라서, 수득한 이중 가닥 공여자 DNA는 상응하는 변형을 갖도록 합성하였고, 제1 가닥은 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 및 3개의 2’-O-메틸 변형을 가졌고, 제2 가닥은 5’ 말단 포스페이트를 가졌다.
도입된 상기된 프라이머 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 변형을 갖는서열번호 38의 서열을 갖는 이중 가닥의 화학적으로 변형된 공여자 단편을 사용하여 실시예 1에 제공된 방법에 따라 생성된 RNP와 함께 세포를 형질감염시키고, 여기서, 상기 RNP의 crRNA는 TRAC 유전자의 엑손 1을 표적화하는 서열번호 1의 표적 서열을 포함하였다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. 유동 세포측정은 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하여 상이한 작제물의 TRAC 유전자좌로의 도입 효율을 평가하였고, 단, 항-CD19 CAR 발현은 CD19-Fc (Speed Biosystem)에 이어서 APC 항-사람 IgG Fcγ (Jackson Immunoresearch)에 의해 검출하였다. 상기 결과는 도 9에 나타내고, 여기서, 항-CD19 CAR이 배양물 중의 세포의 대략 42%에서 T 세포 수용체 발현의 부재하에 발현됨을 알 수 있다.
항-BCMA CAR 작제물은 항-CD38 CAR을, 실시예 1에 기재된 항-CD38 CAR pAAV 작제물을 기초로 하는 항-BCMA CAR로 대체함에 의해 생성하였다. 항-BCMA CAR 단편은 IDT에 의해 합성하였다. 삽입체의 서열은 서열번호 23으로서 제공된다. 항-BCMA CAR 작제물은 대략 160개 -170개 뉴클레오타이드의 TRAC 엑손 1 유전자좌 HA를 갖는 공여자 DNA의 생성을 유도하는 서열번호 18 및 서열번호 19로서 제공된 프라이머를 사용하여 실시예 1에 제시된 바와 같은 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다(표 1 참조). 정배향 프라이머(서열번호 18)는 프라이머의 5’-말단의 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 및 3개의 2’-O-메틸 변형을 가졌다. 역배향 프라이머 (서열번호 19)는 5’ 말단 포스페이트를 가졌다. 따라서, 수득한 이중 가닥 공여자 DNA는 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 및 3개의 2’-O-메틸 변형을 갖는 제1 가닥 및 5’ 말단 포스페이트를 갖는 제2 가닥을 갖도록 합성하였다.
상기 제공된 바와 같은 화학적으로 변형된 프라이머의 도입에 의해 변형된 뉴클레오타이드 변형을 갖는 서열번호 37의 서열을 갖는 이중 가닥의 공여자 단편을 사용하여 실시예 1에 제공된 방법에 따라 생성된 RNP와 함께 세포를 형질감염시키고, 여기서, 상기 RNP의 crRNA는 TRAC 유전자의 엑손 1을 표적화하는 서열번호 1의 표적 서열을 포함하였다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. 유동 세포측정은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하여 상이한 작제물의 TRAC 유전자좌로의 도입 효율을 평가하였고, 단, 항-BCMA CAR 발현은 PE 또는 APC 접합된 BCMA-Fc (R&D)에 의해 검출하였다. 상기 결과는 도 10에 나타내고, 여기서, 항-BCMA CAR이 배양물 중의 세포의 대략 66%에서 T 세포 수용체 발현의 부재하에 발현됨을 알 수 있다.
실시예 5. TRAC 엑손 3을 표적화하는 HDR 매개된 녹인
본원에 제공된 공여자 삽입을 위한 방법을 사용하여 추가의 유전자좌에 공여자 DNA를 삽입하는 효율을 시험하기 위해, 항-CD38 CAR 작제물은 TRAC 유전자의 엑손 3으로부터의 HA를 갖는 공여자 DNA를 생성하기 위해 제조하였다. 상기 경우에, 작제물은 필수적으로 TRAC 엑손 1 표적화 작제물에 대해 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였고, 단, HA (5’ HA 서열번호 24 (183 nt) 및 3’ HA 서열번호 25 (140 nt))는 엑손 3 표적 부위 주변의 서열 (서열번호 26)이다. 이어서 TRAC 유전자 엑손 3 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA로서 생성된 pAAV 작제물의 삽입체의 서열은 서열번호 27로서 제공된다. 공여자 단편을 생성하기 위해, 정배향 프라이머 (서열번호 28)는 제1과 제2, 제2와 제3, 제3과 제4 뉴클레오타이드 사이에 PS 연결, 및 5’ 말단으로부터 제2, 제4 및 제5 위치 상에 2’-O-메틸 변형을 포함하였고, 역배향 프라이머(서열번호 29)는 5’-말단 포스페이트를 가졌다. 프라이머가 혼입된 수득한 이중 가닥 공여자 DNA는 5’ 말단 최외곽 뉴클레오타이드 상에 상응하는 PS 및 2’-O-메틸 변형을 갖는 제1 가닥 및 5’ 말단 포스페이트를 갖는 제2 가닥을 가졌다.
상기 프라이머의 도입에 의해 변형된 뉴클레오타이드를 갖고 서열번호 27의 서열을 갖는 이중 가닥의 공여자 단편을 사용하여 실시예 1에 제공된 방법에 따라 생성된 RNP와 함께 세포를 형질감염시키고, 여기서, crRNA는 TRAC 유전자의 엑손 3을 표적화하는 서열번호 26의 표적 서열을 포함하였다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. 추가의 대조군은 비-형질감염된 활성화된 T 세포 (ATC)였다. 유동 세포측정은 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 상기 결과는 도 11에 나타내고, 여기서, RNP 또는 RNP + 공여자 DNA를 사용한 형질감염이 배양물에 걸쳐 80% 초과의 세포가 TCR 발현을 상실시킴을 알 수 있다. 추가로, 항-CD38 CAR은 표적화 RNA + TRAC 유전자 엑손 3으로부터 유래된 HA를 갖는 공여자 DNA로 형질감염된 배양물에서 세포의 대략 42%에서 T 세포 수용체 발현의 부재하에 발현되었다.
PCR 생성물은 삽입 유전자좌를 진단하도록 디자인된 프라이머를 사용하여 생성하였다(도 2b 참조): 5’- CTCCTGAATCCCTCTCACCA-3’ (서열번호 64, TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 5’ 상동성 아암에 걸쳐 서열분석을 위한 정배향 프라이머) 및 5’-GCGGATCCAGCTCATGTAGT-3’ (서열번호 65, TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 5’ 상동성 아암에 걸쳐 서열분석하기 위한 역배향 프라이머) 및 반대 연결을 위해, 5’-CGTTCTGGGTACTCGTGGTT -3’ (서열번호 66, TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 3’ 상동성 아암에 걸쳐 서열분석을 위한 정배향 프라이머) 및 5’- GGAGCACAGGCTGTCTTACA-3’ (서열번호 67, TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 3’ 상동성 아암에 걸쳐 서열분석을 위한 역배향 프라이머). 수득한 PCR 생성물을 서열분석하였다. PCR 생성물 서열(예를 들어, 서열번호 41 및 서열번호 42)은 게놈 내 상동성 아암에 인접한 서열, 공여자 단편내에 존재하는 상동성 아암에 인접한 서열 및 단일 PCR 생성물 내 항-CD38 CAR의 일부를 포함하였고, 이는 예상된 삽입을 입증한다.
도 12는 항-CD19 CAR의 TRAC 유전자의 엑손 3 및 엑손 1로의 표적화를 비교한다. 엑손 3으로 지시된 항-CD19 CAR 공여자 DNA는 상기 실시예에 제시된 바와 같이 항-CD19 CAR 카세트 (서열번호 22)를 포함하도록 합성하였고, 여기서, 상기 항-CD19 발현 카세트는 상기 제시된 바와 같이 엑손 3 유전자좌로부터의 서열 (서열번호 24 및 서열번호 25)에 의해 플랭킹된다. 엑손 1 (서열번호 38의 서열을 갖는)로 지시된 항-CD19 CAR 공여자는 실시예 4에 제공된다. 이들 작제물 각각 - TRAC 엑손 1 HA (서열번호 18 및 서열번호 19)에 의해 플랭킹된 항-CD19 CAR 카세트 (서열번호 22)를 갖는 작제물 및 TRAC 엑손 3 HA (서열번호 24 및 서열번호 25)에 의해 플랭킹된 항-CD19 CAR 카세트 (서열번호 22)를 갖는 다른 작제물을 사용하여 3개의 5’ 말단의 최외곽 뉴클레오타이드 상에 PS 및 2’-O-메틸 변형을 갖는 변형된 정배향 프라이머를 사용한 공여자 단편을 생성하였다. 역배향 프라이머는 5’-말단 포스페이트를 가졌다. 엑손 1 HA에 의해 플랭킹된 항-CD19 CAR 공여자를 제조하기 위한 프라이머는 서열번호 18 및 서열번호 19이고, 여기서, 서열번호 18 프라이머는 제1과 제2, 제3과 제4, 및 제4와 제5 뉴클레오사이드 사이에 PS 연결 및 5’ 말단으로부터 위치 3, 위치 4 및 위치 5에 2’-O 메틸 그룹을 포함하였다. 엑손 3 HA에 의해 플랭킹된 항-CD19 CAR 공여자를 제조하기 위한 프라이머는 서열번호 28 및 서열번호 29이고, 여기서, 서열번호 28 프라이머는 5’ 말단으로부터 제1과 제2, 제2와 제3, 및 제3과 제4 뉴클레오사이드 사이에 PS 연결 및 5’ 말단으로부터 위치 2, 위치 4 및 위치 5에 2’-O 메틸 그룹을 가졌다. 따라서 수득한 이중 가닥 공여자 DNA는 5’ 말단 뉴클레오타이드 상에 상응하는 PS 및 2’-O-메틸 변형을 갖는 제1 가닥 및 5’ 말단 포스페이트를 갖는 제2 가닥을 가졌다.
공여자 단편을 독립적으로 RNP와 함께 활성화된 T 세포에 형질감염시켰다. RNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였고, 여기서, TRAC 유전자 엑손 1을 표적화하기 위한 crRNA의 표적 서열은 서열번호 1이고, TRAC 유전자 엑손 3을 표적화하기 위한 crRNA의 표적 서열은 서열번호 26이었다. 도 12에서 알 수있는 바와 같이, TRAC 유전자의 엑손 3을 표적화하는 RNP 및 항-CD19 CAR을 발현시키기 위한 공여자 단편으로 형질감염된 배양물의 대략 41%는 둘다 항-CD19 CAR에 대해 TCR 음성 및 양성이었고, TRAC 유전자의 엑손 1을 표적화하는 RNP 및 항-CD19 CAR을 발현하기 위한 공여자 단편으로 형질감염된 배양물의 대략 20%는 둘다 항-CD19 CAR에 대해 TCR 음성 및 양성이었다. 항-CD19 CAR 발현 카세트를 포함하는 레트로바이러스가 형질도입된 T 세포 배양물은 보다 높은 퍼센트의 항-CD19 CAR 발현 세포를 입증하였지만, 이들 세포는 TCR 녹아웃을 갖지 않았다.
실시예 6. PD-1 유전자를 표적화하는 HDR 매개된 녹-인
PD-1 유전자좌는 또한 CAR 작제물로 표적화하였다. 이 경우에, 항-CD38 CAR 카세트 (서열번호 2)는 공여자 DNA를 생성하기 위한 주형을 제공하기 위해 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 표적 부위 (서열번호 32)를 둘러싸는 PD-1 유전자좌의 서열을 갖는 상동성 아암(서열번호 30 및 서열번호 31)에 바로 인접해있다.
공여자 DNA는 5’ 포스페이트를 포함하는 정배향 프라이머 (서열번호 34) 및 5’ 말단으로부터 제1, 제2 및 제4 뉴클레오사이드 (서열번호 35) 상에 2’-O-메틸 그룹 뿐만 아니라 5’ 말단으로부터 제1과 제2, 제2와 제3, 및 제3과 제4 뉴클레오사이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 역배향 프라이머를 사용하여 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다. 표 1을 참조한다.
상기 이중 가닥의 화학적으로 변형된 공여자 단편 (서열번호 33)을 사용하여 실시예 1에 제공된 방법에 따라 생성된 RNP와 함께 세포를 형질감염시키고, 여기서, crRNA는 PD-1 유전자를 표적화하는 서열번호 32의 표적 서열을 포함하였다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 CAR 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 생성한다. 추가의 대조군은 비-형질감염된 활성화된 T 세포 (ATC)였다. 유동 세포측정은 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였고, 여기서, 비형질감염된 활성화된 T 세포 (ATC)의 추가의 제어가 포함되었다. PD-1에 대한 BV421-접합된 항체(EH12.2H7, BioLegend)를 사용하여 PD-1 발현을 검출하였다.
상기 결과는 도 13에 나타내고, 여기서, PD-1을 발현하는 세포의 퍼센트는 ATC에서 대략 19%로부터 PD-1 유전자좌를 표적화하는 RNP (PD-1 RNP)로 형질감염된 배양물의 세포에서 대략 4%로 하강함을 알 수 있다. 항-CD38 CAR은 PD-1 표적화 RNA + PD-1 유전자좌와 상동성을 갖는 HA를 갖는 공여자로 형질감염된 배양물에서 세포의 대략 27%에서 T 세포 수용체 발현의 부재하에 발현시켰다. 비교로서, 배양물의 세포의 약 32%는 TCR의 엑손 1을 표적화하는 RNP 및 TRAC 유전자의 엑손 1의 서열과 상동성을 갖는 HA를 갖는 항-CD38 CAR 공여자 단편으로 형질감염시켰다.
삽입 유전자좌를 진단하기 위해 프라이머를 사용하여 생성된 PCR 생성물의 서열분석(도 2b 참조)은 PD-1 유전자에 통합된 항-CD38 CAR 공여자 단편을 입증하는 서열을 제공하였다. 연결 서열을 수득하기 위해, 총 1 x 107 세포를 500 μL의 퀵 추출 용액(Quick Extraction solution) (Epicenter)에 재현탁시켜 게놈 DNA를 추출하였다. 세포 용해물을 5분동안 65 ℃에서 및 이어서 2분동안 95 ℃에서 항온처리하고 -20 ℃에서 저장하였다. 게놈 DNA의 농도는 NanoDrop (Denovix)에 의해 결정하였다. 표적 부위를 함유하는 게놈 영역은 PCR 증폭시켰다. 5’ 연결 및 3’ 연결 둘다를 위한 프라이머 세트는 상동성 아암의 외부에서 어닐링하도록 디자인하였다. PCR 생성물은 삽입 유전자좌를 진단하도록 디자인된 프라이머를 사용하여 생성하였다(도 2b 참조): 5’- GTGTGAGGCCATCCACAAG-3’ (서열번호 68, TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 5’ 상동성 아암에 걸쳐 서열분석을 위한 정배향 프라이머) 및 5’-ACACACTTGCGACCCATTC-3’ (서열번호 69, TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 5’ 상동성 아암에 걸쳐 서열분석하기 위한 역배향 프라이머) 및 반대 연결을 위해, 5’-CGTTCTGGGTACTCGTGGTT -3’ (서열번호 70, TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 3’ 상동성 아암에 걸쳐 서열분석을 위한 정배향 프라이머) 및 5’- GGGACTGTCTTAGGCTTGG-3’ (서열번호 71, TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 3’ 상동성 아암에 걸쳐 서열분석을 위한 역배향 프라이머).
PCR은 400ng의 게놈 DNA 및 Q5 고충실도 2X PCR 믹스 (New England Biolabs)를 함유하였다. 열순환기 세팅은 2분동안 98 ℃에서 1 사이클, 10s 동안 98 ℃에서, 15s 동안 65 ℃에서, 45s 동안 72 ℃에서 35 사이클 및 10분동안 72 ℃에서 1 사이클로 이루어졌다. PCR 생성물은 SYBR Safe를 함유하는 1% 아가로스 겔 (Life Technologies) 상에서 정제하였다. PCR 생성물은 이어서 NucleoSpin® 겔 및 PCR 클린-업 키트(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. Kg)를 사용하여 아가로스 겔로부터 용출시켰다. PCR 생성물은 생거 서열분석 (Genewiz)을 위해 제출하였다. PCR 생성물 서열은 게놈 내 상동성 아암에 인접한 서열, 공여자 단편에 존재하는 상동성 아암 및 단일 PCR 생성물 내 항-CD38 CAR의 일부를 포함하였고, 이는 예상된 삽입을 입증한다.
도 14는 항-CD38 CAR을 발현하고, PD-1 유전자에서 녹아웃된 세포의 기능을 결정하기 위해, PBMC, 및 항-CD38 CAR 공여자 단편 및 PD-1 유전자좌를 표적화하는 RNP로 형질감염된 배양물로부터 단리된 T 세포(각각 “PD-1 KOKI PBMC” 및 “PD-1 KOKI T세포”)를 사용하여 수행된 세포독성 검정의 결과를 제공한다. 이들 변형된 세포는 PD-1 유전자 녹아웃을 갖지만 CAR 작제물을 수용하지 않은 대조군 세포(“PD-1 KO”) 및 TRAC 유전자 녹아웃을 갖지만 CAR 작제물을 수용하지 않은 대조군 세포 (“TRAC-1 KO”)와 관련하여 검정에서 표적 세포에 대해 고수준의 세포독성을 보여주었고 관찰된 PD-1 부위에서 능히 공여자 CAR 작제물 통합의 보다 낮은 효율로 인해 항-CD38 CAR 공여자 단편 및 TRAC 유전자좌를 표적화하는 RNP(“TRAC KOKI”)로 형질감염된 세포에 의해 어느정도 능가되었다(도 13).
실시예 7. Cas9 및 Cas12a를 사용한 항-CD38 이량체 항체 수용체 (DAR) 작제물의 TRAC 엑손 1 유전자좌로의 표적화된 삽입.
추가의 실험에서, 합성 항체-수용체의 추가의 구성은 T 세포에서 발현시켰다. 작제물은 이량체 항체 수용체의 발현을 위해 제조하였고(DAR, 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 WO 2019/173837을 참조한다), 여기서, 상기 DAR 작제물은 단일 개방 판독 프레임으로부터 2개의 폴리펩타이드를 생성하기 위해 사용된 “자가-말단” 2A 서열에 의해 연결된 2개의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하였다. 제1 암호화된 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역 및 제1 중쇄 불변 영역 (CH1), 힌지 영역, CD28의 막관통 도메인 및 4-1BB 및 CDζ의 세포질 도메인을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드이다. 이에 이어서, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 T2A 펩타이드 암호화 서열 (서열번호 46)이 있고 이어서 상기 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 있고, 여기서, 상기 제2 폴리펩타이드는 N 말단에서 C-말단으로 진행하여 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) + 불변 영역 (람다)을 포함하였다. 중쇄 폴리펩타이드 서열, 2A 펩타이드, 및 경쇄 서열을 암호화하는 핵산 서열은 DAR-암호화 서열의 5’ 말단에서 JeT 프로모터 (서열번호 3) 및 DAR-암호화 서열의 3’ 말단에서 SV40 폴리A 첨가 서열(서열번호 47)에 작동적으로 연결되어 있다. 전체 항-CD38 DAR 작제물 (JeT 포로모터, 힌지, CD28 막관통 도메인, 및 4-1BB 및 CDζ의 세포질 도메인, T2A, 경쇄, 및 SV40 서열(서열번호 48)을 갖는 중쇄 암호화 서열)은 벡터 내 660 bp (서열번호 44)와 650 bp (서열번호 45)의 상동성 아암 사이에 클로닝하였다. 상동성 아암은 표적 서열의 어느 한 측면 상에 TRAC 엑손 1 유전자좌의 서열을 포함하였다. 형질감염 실험에 사용하기 위한 공여자 단편은 첫번째와 두번째, 세번째와 네번째, 네번째와 다섯번째 뉴클레오타이드 사이에 3개의 PS 결합 및 프라이머의 5’ 말단으로부터 넘버링하는 경우 뉴클레오타이드 3, 4 및 5에 2’-O-메틸 변형을 포함하는 정배향 프라이머(서열번호 18), 및 5’ 말단 포스페이트를 포함하는 역배향 프라이머 (서열번호 19)를 사용하는 PCR에 의해 합성하였다(표 1). 수득한 PCR 생성물(서열번호 49)은 항-CD38 DAR-암호화 작제물 (서열번호 48)을 플랭킹하는 상동성 아암 (서열번호 20 및 서열번호 21)을 포함하였고, 제1 가닥 및 5’ 말단 포스페이트에 혼입되었지만 반대 가닥, 제2 가닥에 첨가된 화학적 변형이 도입되지 않은 서열번호 18의 프라이머 변형을 가졌다.
녹아웃/녹인 (“KOKI”) 전략은 또한 tracrRNA를 사용하지 않고 서열 TTTV를 갖는 PAM을 인지하는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제인 Cas12a와 함께 시험하였고, 여기서, V는 A, C, 또는 G이고, PAM은 표적 부위의 바로 업스트림에 있다. 이들 실험에서, 동일한 항-CD38 DAR 작제물(서열번호 48)은 상동성 아암 사이에 클로닝하였고, 여기서, 상기 상동성 아암 서열 (서열번호 50 및 서열번호 51)은 TRAC 유전자의 엑손 1에서 Cas12a 표적 부위 (서열번호 52)의 어느 한 측면 상의 게놈 서열과 상동성을 가졌다. 이들 상동성 서열(서열번호 53)에 의해 플랭킹된 항-CD38 DAR 작제물은 항-CD38 CAR 작제물에 대해 실시예 1에 기재된 바와 같이 벡터에 클로닝하였고, 수득한 클론은 5’ 말단 포스페이트를 포함하는 정배향 프라이머 서열번호 20, 및 5’ 말단 2’-O-메틸화된 (2’-O-메틸 데옥시구아노신, 2’-O-메틸 데옥시시티딘, 및 2’-O-메틸 데옥시아데노신)으로부터 처음 3개의 뉴클레오타이드를 갖고, 상기 처음 3개의 뉴클레오타이드가 PS 결합을 통해 다음 뉴클레오타이드에 연결되어 있는 역배향 프라이머 서열번호 54 (즉, 5’ 말단으로부터 첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 세번째와 네번째 뉴클레오타이드 사이에 PS 연결이 있다)를 사용한 PCR 반응을 위해 주형으로서 사용하였다(표 1 참조). PCR은 192 및 159nt (서열번호 55 및 서열번호 56)의 상동성 아암에 의해 플랭킹된 항-CD38 DAR 작제물 (서열번호 48)을 갖는 이중 가닥 공여자 DNA 분자를 생성하기 위해 플랭킹 상동성 서열 서열번호 50 및 서열번호 51 내 하이브리드화하는 정배향 프라이머 (서열번호 20) 및 변형된 역배향 프라이머 (서열번호 54)를 사용하여 실시예 1에 제공된 바와 같이 필수적으로 수행하였다. 수득한 이중 가닥 항-CD38 DAR 공여자 DNA 단편 (서열번호 57)은 3킬로베이스 크기이고, 표적 서열 (서열번호 52)을 포함하는 crRNA (가이드 RNA)와 복합체화된 Cas12a 단백질과 함께 이중 가닥 분자로서 활성화된 PBMC를 형질감염시키기 위해 사용된 공여자 DNA 분자에 역배향 프라이머 (서열번호 54)의 2’-O-메틸 및 PS 변형 및 정배향 프라이머 (서열번호 20)의 5’ 말단 포스페이트를 혼입시켰다. crRNA는 IDT (Coralville, IA)로부터 구입한 AltR® RNA였다. Cas12a 및 가이드 RNA RNP의 형성은 필수적으로 Cas9 RNP에 대해 실시예 1에 기재된 바와 같이 필수적으로 수행하였고, 단, 어떠한 tracrRNA도 사용되지 않았고, RNA 종의 사전 하이브리드화는 없었다. Cas12a RNP 및 이중 가닥 공여자 DNA의 T 세포로의 전기천공은 또한 필수적으로 실시예 1에 따라 수행하였다. 대조군으로서, 하나의 T 세포 집단은 Cas9 RNP로 형질전환시켰지만 어떠한 공여자 단편으로는 형질전환시키지 않았고, 또는 T 세포 집단은 Cas12a RNP로 형질전환시켰지만 어떠한 공여자 단편으로는 형질전환시키지 않았다. 공여자 단편의 부재하에, RNP는 표적화된 유전자를 붕괴시키는 것으로 예측되고, 어떠한 발현 작제물은 삽입되지 않았다. 따라서, 형질감염된 세포는 녹아웃(KO) 대조군으로서 언급된다.
형질감염 후 14일에, Cas9 RNP + Cas9 표적 부위 (서열번호 49)를 표적화하기 위해 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA 또는 Cas12a RNP 및 Cas12a 표적 부위 (서열번호 57)를 표적화하기 우한 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA 중 어느 하나로 형질감된 T 세포 집단은 실시예 1에 기재된 바와 같이 녹아웃 대조군과 함께 유동 세포측정에 의해 분석하였다(도 15). 공여자 단편의 부재하에 TRAC 유전자를 표적화하는 Cas9 RNA로 형질감염된 세포 집단의 단지 약 32% 및 공여자 단편의 부재하에 TRAC 유전자 (“TRAC KO”)를 표적화하는 Cas12a RNP로 형질감염된 세포 집단의 약 22%는 TCR을 발현하였다. 대조적으로, 도 15의 최좌측 패널에 나타낸 필수적으로 모든 비변형된 활성화된 T 세포 (활성화된 T 세포 “ATC”)는 TCR을 발현하였다. 예상된 바와 같이, 공여자 DNA를 받지 않은 세포의 어떠한 것도 항-CD38 작제물에 대해 양성이 아니었다(도 15, 제2 및 제3 패널). 한편, Cas9 또는 Cas12a RNP에 추가로 항-CD38 DAR 작제물 공여자 DNA로 형질감염된 세포 집단의 유의적 퍼센트는 DAR 작제물의 발현을 입증하였다: Cas9 RNP와 함께 항-CD38 DAR 작제물 공여자 DNA로 형질감염된 집단의 대략 54%(도 15, 네번째 패널)는 항-CD38 DAR을 발현하였고, Cas12a RNP와 함께 항-CD38 DAR 작제물 공여자 DNA로 형질감염된 세포 집단의 대략 77%(도 15, 다섯번째 패널)도 발현하였다.
항-CD38 DAR 작제물의 TRAC 유전자의 엑손 1의 Cas9 표적 부위로의 삽입, 및 항-CD38 DAR 작제물의 TRAC 유전자의 엑손 1의 Cas12a 표적 부위로의 삽입은 둘다, 형질감염된 세포 집단 둘다로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행된 PCR 및 연결 단편의 서열분석에 의해 확인하였다. Cas9 매개된 삽입을 위해, 5’ 상동성 아암 영역의 PCR은 정배향 프라이머로서 서열번호 72 및 역배향 프라이머로서 서열번호 73을 사용하였다. 3’ 상동성 아암 영역의 PCR은 정배향 프라이머로서 서열번호 74 및 역배향 프라이머로서 서열번호 75를 사용하였다. 수득한 PCR 단편의 서열분석은 항-CD38 DAR 작제물이 표적화된 Cas9 표적 부위에 삽입되었음을 입증하였다. Cas12a 매개된 삽입을 위해, 5’ 상동성 아암 영역의 PCR은 정배향 프라이머로서 서열번호 76 및 역배향 프라이머로서 서열번호 77을 사용하였다. 3’ 상동성 아암 영역의 PCR은 정배향 프라이머로서 서열번호 78 및 역배향 프라이머로서 서열번호 79를 사용하였다. 수득한 PCR 단편의 서열분석은 항-CD38 DAR 작제물이 표적화된 Cas12a 표적 부위에 삽입되었음을 입증하였다.
RPMI8226 세포와 동시 배양된 형질감염된 집단을 사용한 세포독성 검정의 결과는 도 16에 제공되고, Cas9 또는 Cas12a 시스템을 사용함에 의해 DAR 작제물로 형질감염된 T 세포가 예상된 생리학적 거동을 가짐을 입증하였다. Cas9 RNP + 항-CD38 DAR 작제물 공여자 DNA (서열번호 49) 및 Cas12a RNP + 항-CD38 DAR 작제물 공여자 DNA (서열번호 57)로 형질감염된 세포 둘다는 녹아웃된 TCR 유전자를 갖지만, 항-CD38 DAR 작제물 공여자 DNA로 형질감염되지 않은 대조군 집단과 실제로 동일하고, 이 보다 급격하게 높은 RPMI88226 세포의 사멸을 보여주었다.
실시예 8. 오프-표적 돌연변이의 분석.
본원에 제공된 바와 같은 RNP 및 공여자 단편으로 배양물의 형질감염으로부터 비롯된 오프-부위 돌연변이의 빈도를 결정하기 위해, TRAC 유전자의 cas9 RNP 표적화 엑손 1 및 서열번호 7에 제공된 바와 같이 변형된 프라이머 (서열번호 18 및 서열번호 19)를 사용하여 합성된 171 및 161bp의 HA를 갖는 이중 가닥 항-CD38 DAR 공여자 DNA로 PBMC의 형질감염으로부터 비롯된 세포로부터 단리된 DNA는 서열분석되었다.　
게놈 DNA는 제조업자의 지침에 따라 QIAamp® DNA 소형 키트 (QIAGEN 51104)를 사용하여 T 세포로부터 추출하였다.　 간략하게, 200 μL PBS 중에 총 5 x 106 세포는 20 μl QIAGEN 프로테아제 및 200 μl 완충액 AL에 첨가하고, 56℃에서 10분동안 항온처리하였다. 게놈 DNA는 에탄올에 의해 침전시키고 소형-컬럼으로부터 용출하였다. 게놈 DNA의 농도는 Qubit dsDNA HS 검정 키트 (Thermofisher)를 사용하여 Qubit 4 형광측정기에 의해 결정하였다.　
DNA 샘플의 전체 게놈 서열분석은 Novagene (Sacramento, Ca)에 의해 수행하였다. 상기 결과는 도 17 및 표 2에 요약한다. 총 4개의 삽입결실이 검출되었다. 검출된 삽입결실의 어느 것도 유전자의 암호화 영역 내에 있는 것으로 밝혀지지 않았고, 오프-부위 돌연변이 중 2개는 유전자 간 영역에서 발견되었고, 오프-부위 돌연변이 중 2개는 인트론에 존재한다.
Cas9로 생성된 항-CD38 DAR-T 세포 내 오프-표적 돌연변이의 개요
돌연변이의 유형 이벤트의 수
CDS: 0
· 판독전환 결실 0
· 판독전환 삽입 0
· 비판독전환 결실 0
· 비판독전환 삽입 0
· 정지 획득(Stopgain) 0
· 정지 상실(Stoploss) 0
· 공지되지 않음 0
인트론 1
UTR3 0
UTR5 0
스플라이싱 0
ncRNA 엑손 0
ncRNA 인트론 1
ncRNA 스플라이싱 0
업스트림 0
다운스트림 0
유전자간 2
합계 4
실시예 9. Cas12a를 사용한 항-CD38 이량체 항체 수용체 (DAR) 작제물의 TIM3 유전자좌로의 표적화된 삽입.
추가의 실험에서, 항-CD38 DAR 작제물은 T 세포 소진에서의 역할을 수행할 수 있는 Tim-3 유전자를 동시 녹아웃시키고 Cas12a를 사용한 항-CD38 DAR을 녹인시키기 위한 Tim-3 유전자좌로부터 유래된 플랭킹 서열 사이에 클로닝하였다. 항-CD38 DAR 작제물 (서열번호 48)은 TIM3 유전자좌로부터 유래되고, Cas12a PAM 서열의 바로 다운스트림에 있는 Cas12a 표적 부위 (서열번호 60)의 어느 하나의 측면에 존재하는 DNA 서열(5’ 플랭킹 서열, 서열번호 58; 3’ 플랭킹 서열, 서열번호 59) 사이에 클로닝하였다. 클로닝된 DAR 작제물 + 플랭킹 서열은 정배향 프라이머 5’-p-TGGAATACAGAGCGGAGGTC (서열번호 60) 및 5’ 말단으로부터 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 상에 2’-O-메틸 그룹을 포함하도록 변형되고, 5’ 말단으로부터 첫번째와 두번째, 두번째와 세번째 및 세번째와 네번째 뉴클레오타이드 사이에 PS 결합: 하나의 가닥의 5’ 말단으로 역배향 프라이머 (서열번호 61)의 변형을 혼입시키는 공여자 DNA 분자 (서열번호 62)를 생성하기 위한 mG*mC*mA*TGCAAATGTCCACTCAC (서열번호 61)을 갖는 역배향 프라이머를 사용한, PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였다.
T 세포의 형질감염은 실시예 1에 수행된 바와 같이 수행하였고, 단, Cas12a 형질감염에서, Cas12a 단백질은 AltR crRNA와 복합체화되어 있고 어떠한 tracr RNA를 사용하지 않았다. 공여자 단편은 Cas12a RNP와 함께 전기천공하였다. 대조군으로서, 형질감연은 또한 공여자 DNA의 부재 (TRAC 녹아웃 대조군) 하에 RNP로 수행하였다.
Tim-3 유전자좌로 표적화된 DAR 작제물로 형질감염된 T 세포 집단의 유동 세포측정 분석의 결과는 도 18에 제공된다. 대조군으로서 포함된, 비-형질감염된 활성화된 T 세포 (ATC)는 항-CD38 DAR 작제물을 발현하지 않으면서 형질감염된 세포의 대략 84%까지 Tim-3 유전자의 발현을 입증하였다. 녹아웃/녹인 세포에 대해, 집단의 대략 17%는 Tim-3 유전자 생성물을 발현하지 않으면서 CD38 DAR 작제물을 발현하였다.
실시예 10. Cas9 및 Cas12a를 사용한 GM-CSF 유전자의 제2 부위 녹아웃과 함께 항-CD38 이량체 항체 수용체 (DAR) 작제물의 TRAC 유전자좌로의 표적화된 삽입.
T 세포에 의한 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF)의 방출은 사이토킨 방출 증후군 및 신경독성에 기여할 수 있어, 이는 CAR-T 치료요법의 치료학적 이득을 제한할 수 있다(문헌참조: Sterner et al. 2018 Blood 132:961). T 세포 수용체 대신 항-CD38 DAR을 발현하고, GM-CSF의 발현이 감소된 T 세포의 집단을 제공하기 위해, 본원 발명자들은 동일한 세포 집단에서 1) 내인성 T 세포 수용체 유전자를 녹아웃시키고 (TRAC 유전자좌에서) 항-CD38 DAR 작제물을 녹인시키고, 또한 2) GM-CSF 유전자를 녹아웃시키고자 하였다.
실시예 7에 기재된 항-CD38 DAR 작제물은 TRAC 녹아웃 및 항-CD38 DAR 발현을 위한 공여자 단편을 생성하기 위해 PCR용 주형으로서 사용하였다. 상기 작제물은 힌지, CD28 막관통 도메인, 및 4-1BB 및 CD3ζ 세포질 도메인를 갖는 중쇄 폴리펩타이드 서열, 및 이어서 2A 펩타이드, 및 이어서 경쇄 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 JeT 프로모터 (서열번호 3)를 포함하였고, 또한, DAR-암호화 서열 (서열번호 48에 제공된 항-CD38 DAR-암호화 어셈블리)의 3’ 말단에서 SV40 폴리A 첨가 서열을 포함하였고, 플라스미드 벡터 pAAV-MCS에서 660 bp (서열번호 44) 및 650 bp (서열번호 45)의 TRAC 유전자좌 상동성 아암 사이에 클로닝하였다. 형질감염 실험에 사용하기 위한 공여자 단편은 첫번째와 두번째, 세번째와 네번째, 네번째와 다섯번째 뉴클레오타이드 사이에 3개의 PS 결합 및 프라이머의 5’ 말단으로부터 넘버링하는 경우 뉴클레오타이드 3, 4 및 5에 3개의 2’-O-메틸 변형을 포함하는 정배향 프라이머(서열번호 18), 및 5’ 말단 포스페이트를 포함하는 역배향 프라이머 (서열번호 19)를 사용하는, 실시예 7에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 합성하였다(표 1). 수득한 PCR 생성물(서열번호 49)은 항-CD38 DAR-암호화 작제물 (서열번호 48)을 플랭킹하는 대략적으로 170bp 및 160bp의 상동성 아암(서열번호 20 및 서열번호 21)을 포함하였고, 제1 가닥 및 5’ 말단 포스페이트에 혼입되었지만 반대 가닥, 또는 제2 가닥에 첨가된 화학적 변형이 도입되지 않은 서열번호 18의 프라이머 변형을 가졌다.
TRAC 유전자좌를 녹아웃시키기 위한 가이드 RNA는 에스. 피오게네스(S. pyogenes)(Sp) cas9 단백질과 함께 사용하기 위해 가공된 2개의 RNA: 서열번호 1의 표적 서열을 포함한 TRAC 유전자의 엑손 1을 표적화하기 위한 crRNA 및 tracrRNA로 이루어져 있고, 이들 둘다는 Spcas9과 함께 사용하기 위해 가공되고, IDT (Coralville, IA)에 의해 합성된 “AltR” RNA이다.
GM-CSF 유전자좌를 녹아웃시키기 위해, 사람 GM-CSF 유전자 (표적 서열 TACAGAATGAAACAGTAGAAG, 서열번호 80)에 특이적인 Cas12a 가이드를 사용하였다. Cas12a (Cpf1) 뉴클레아제와 함께 사용하기 위해 디자인된 crRNA는 IDT에 의해 합성하였다.
2개의 구분된 부위에서 게놈을 변형시키기 위해, 2개의 RNP를 생성하였다. 제1 RNP는 Cas9 단백질을 하이브리드화된 TRAC 유전자좌-가이드된 crRNMA (표적 서열 서열번호 1을 갖는) 및 Cas9 tracrRNA와 항온처리함에 의해 형성된 Cas9 RNP이었다. Cas9 crRNA와 tracrRNA의 하이브리드화 및 이어서 Cas9 단백질과 TRAC 유전자의 하이브리드화된 crRNA:tracrRNA 표적화 엑손 1의 항온처리는 실시예 1에 제공된 바와 같이 수행하였다. 제2 RNP는 동일한 방식(4℃에서 30분 항온처리)으로 Cas12a 단백질(단백질 IDT의 N-말단 및 C-말단 영역 각각에서 NLS를 포함하는)을 GM-CSF-표적화 crRNA (표적 서열 서열번호 80을 갖는)로 항온처리함에 의해 형성된 Cas12a RNP이었다.
항-CD38 DAR 작제물의 녹인 및 GM-CSF 유전자의 녹아웃과 함께 TCR 수용체 유전자의 녹아웃을 위한 T 세포의 단일 형질감염은 TRAC 유전자로의 삽입을 위한 HA를 갖는 공여자 단편과 함께, TRAC 유전자를 표적화하는 가이드 RNA 및 GM-CSF 유전자를 표적화하는 Cas12a RNP와 어셈블리된 Cas9 RNP를 사용하여 수행하였다. 형질감염은 실시예 1에 제공된 바와 동일한 조건을 사용한 전기천공에 의해 수행하였다.
실시예 7에 기재된 프라이머 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 변형과 함께 서열번호 48의 서열을 갖는 이중 가닥의 화학적으로 변형된 공여자 단편을 사용하여 RNP와 함께 세포를 형질감염시켰다. 이중 가닥 공여자 단편은 171 및 161 bp의 HA를 가졌다.
3개의 T 세포 집단을 생성하였다. 제1 형질감염에서, 활성화된 T 세포는 TRAC 유전자-표적화 Cas9 RNP 및 항-CD38 DAR을 암호화하고 TRAC HA를 갖는 이중 가닥 공여자 단편으로 형질감염시켰다. 제2 형질감염은 TRAC 유전자-표적화 Cas9 RNP, 항-CD38 DAR을 암호화하고 TRAC HA를 갖는 이중 가닥 공여자 단편, 및 추가로, the Cas12a RNP targeting the GM-CSF 유전자를 표적화하는 Cas12a RNP를 포함하였다. 최종적으로, 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 TRAC-특이적 Cas9 RNP로 형질감염시키고, 이는 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. 전기천공은 실시예 1에 상세히 기재된 바와 같이 수행하였고, 여기서, 각각의 경우에, 단일 전기천공을 수행하였고, 각각 3개의 집단에 대해, 1) TRAC-표적화 RNP 및 항-CD38 공여자 단편; 2) TRAC-표적화 RNP 및 항-CD38 공여자 단편에 추가로 GM-CSF-표적화 RNP; 및, 3) TRAC 녹아웃 유일 대조군을 위해, TRAC-표적화 RNP 단독을 포함하였다.
유동 세포측정은 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하여 상이한 작제물을 TRAC 유전자좌에 도입하는 효율을 평가하였고, 여기서, 세포내 GM-CSF는 eBioscience™ 세포내 고정화 & 투과 완충액 세트 (ThermoFisher, 88-8824-00)를 사용하여 검출하였고, PE-GM-CSF 항체[BioLegend, 502306]로 염색시켰다. CD3 (T 세포 수용체)는 항-CD3-BV421 항체 SK7 (BioLegend)으로 검출하였고, 항-CD38 DAR 발현은 PE 접합된 항-CD38-Fc 단백질(Chimerigen Laboratories, Allston, Ma)로 검출하였다.
배양물이 GM-CSF 발현을 유도하기 위해 자극된 경우, 배양물은 DMSO 중에 포르볼-12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, 40.5 μM), 이오노마이신(669.3 μM), 및 브레펠딘 A (2.5 mg/ml)를 함유하는 세포 활성화 칵테일 (BioLegend, 423304)로 6시간 동안 처리하였다.
도 19는 패널 A 및 B에서, TRAC-표적화 RNP 및 항-CD38 DAR 공여자 작제물로 형질감염된 T 세포의 대략 2%만이 PMA 및 이오노마이신으로 자극되지 않는 경우 GM-CSF를 발현하는 반면, 상기 형질감염된 세포의 이들 약물로의 자극은 GM-CSF를 생성하는 세포의 대략 53%를 유도한다. 한편, 패널 C에 나타낸 바와 같이, TRAC-표적화 RNP 및 항-CD38 DAR 공여자 작제물에 추가로 GM-CSF 표적화 RNP로 형질감염된 T 세포의 대략 29%만이 자극시 GM-CSF를 생성하고, 이는 제2 유전자의 동시 녹아웃이 상기 경우에 45% (52.78-29.07/52.78)로 평가되는 빈도로 수행됨을 입증한다.
동일한 세포 집단은 도 19의 패널 E-G에서 T 세포 수용체 및 항-CD38 DAR 발현에 대해 분석되었다. 패널 D는, 항-CD38 DAR 공여자 단편의 부재하에 TRAC 표적화 RNP로 형질감염되는 경우, 세포의 거의 80% (78.57%)가 T 세포 수용체를 발현하지 않았고, 예상된 바와 같이 항-CD38 DAR 작제물의 발현도 검출되지 않았음을 보여준다. 대조적으로, 세포가 항-CD38 DAR 공여자 단편과 함께 TRAC 표적화 RNP로 형질감염되는 경우, 세포 집단의 대략 70%는 고유 T 세포 수용체의 발현의 부재하에 항-CD38 DAR의 발현을 입증하였다(패널 E). 최종적으로, 제2 유전자 표적화 RNP, GM-CSF 표적화 RNP의 첨가는 TCR 녹아웃/녹인 비율을 급격히 저하시키지 않았고, 여기서, RNP (항-TRAC 및 항-GM-CSF) + 항-CD38 DAR 작제물 둘다로 형질감염된 세포의 대략 50%는 내인성 T 세포 수용체를 발현하는데 실패하면서 항-CD38 DAR 작제물을 발현하였다(패널 F). 이들 배양물에서, 집단의 고비율(~45%)이 형질감염에 대한 항-GM-CSF RNP의 내포로부터 비롯되는 GM-CSF 녹아웃인 것으로 계산된다.
실시예 11. Cas12a를 사용한 GM-CSF 유전자의 제2 부위 녹아웃과 함께 항-CD38 이량체 항체 수용체 (DAR) 작제물의 TRAC 유전자좌로의 표적화된 삽입.
항-CD38 DAR의 TRAC 유전자좌로의 이중 녹아웃 및 동시 녹인이 또한 이의 각각이 상이한 가이드 RNA (crRNA)를 포함하는 2개의 Cas12a RNP를 사용하여 시도되었다.
항-CD38 DAR 공여자 단편은 첫번째와 두번째, 세번째와 네번째, 네번째와 다섯번째 뉴클레오타이드 사이에 3개의 PS 결합 및 프라이머의 5’ 말단으로부터 넘버링하는 경우 뉴클레오타이드 3, 4 및 5에 3개의 2’-O-메틸 변형을 포함하는 정배향 프라이머(서열번호 18), 및 5’ 말단 포스페이트를 포함하는 역배향 프라이머 (서열번호 19)를 사용하여 상기 실시예 7 및 10에 기재된 바와 같이 생성하였다(표 1). 수득한 PCR 생성물(서열번호 49)은 항-CD38 DAR-암호화 작제물 (서열번호 48)을 플랭킹하는 대략적으로 170bp 및 160bp의 상동성 아암(서열번호 20 및 서열번호 21)을 포함하였고, 제1 가닥 및 5’ 말단 포스페이트에 혼입되었지만 반대 가닥, 또는 제2 가닥에 첨가된 화학적 변형이 도입되지 않은 서열번호 18의 프라이머 변형을 가졌다.
TRAC 유전자좌를 녹아웃시키기 위한 가이드 RNA는 TRAC 유전자의 엑손 1을 표적화하기 위한 Cas12a (Cpf1)에 대해 가공된 crRNA이었고 서열번호 26의 표적 서열을 포함하였다. TRAC 유전자를 녹아웃시키기 위한 가이드 RNA는 TRAC 유전자의 엑손 1을 표적화하기 위한 Cas12a (Cpf1)에 대해 가공된 crRNA이었고 서열번호 52의 표적 서열을 포함하였다. GM-CSF 유전자를 녹아웃시키기 위한 가이드 RNA는 서열번호 80의 표적 서열을 포함하는 Cas12a (Cpf1)에 대해 가공된 crRNA이었다. Cas12a crRNA 둘다는 IDT (Coralville, Ia)에 의해 합성하였다.
2개의 RNP는 단백질 (IDT)의 N-말단 및 C-말단 영역 각각에서 NLS를 포함하는 Cas12a 단백질과 함께 제조하였다. 제1 RNP는 상기 Cas12a 단백질을 TRAC 유전자좌를 표적화하고 서열번호 52 방식의 표적 서열(4℃에서 30분 항온처리)을 갖는 crRNA로 항온처리함에 의해 형성되었다. 제2 RNP는 동일한 방식으로 Cas12a 단백질을 GM-CSF-표적화 crRNA (표적 서열 서열번호 80을 갖는)로 항온처리함에 의해 형성되었다.
항-CD38 DAR 작제물의 녹인 및 GM-CSF 유전자의 녹아웃과 함께 TCR 수용체 유전자의 녹아웃을 위한 T 세포의 단일 형질감염은 TRAC 유전자로의 삽입을 위한 HA를 갖는 공여자 단편과 함께, 2개의 어셈블리된 Cas12a RNP를 사용하여 수행하였다. 형질감염은 실시예 1에 제공된 바와 동일한 조건을 사용한 전기천공에 의해 수행하였다.
실시예 7에 기재된 프라이머 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 변형과 함께 서열번호 48의 서열을 갖는 이중 가닥의 화학적으로 변형된 공여자 단편을 사용하여 RNP와 함께 세포를 형질감염시켰다. 이중 가닥 공여자 단편은 171 및 161 bp의 HA를 가졌다.
유동 세포측정은 필수적으로 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행하여 상이한 작제물을 TRAC 유전자좌에 도입하는 효율을 평가하였고, 여기서, 세포내 GM-CSF는 eBioscience™ 세포내 고정화 & 투과 완충액 세트 (ThermoFisher, 88-8824-00)를 사용하여 검출하였고, PE-GM-CSF 항체[BioLegend, 502306]로 염색시켰다. CD3 (T 세포 수용체)는 항-CD3-BV421 항체 SK7 (BioLegend)으로 검출하였고, 항-CD38 DAR 발현은 PE 접합된 항-CD38-Fc 단백질(Chimerigen Laboratories, Allston, Ma)로 검출하였다.
도 19는 패널 A 및 B에서, TRAC-표적화 RNP 및 항-CD38 DAR 공여자 작제물로 형질감염된 T 세포의 대략 2%만이 자극되지 않는 경우 GM-CSF를 발현하는 반면, 상기 형질감염된 세포의 이들 약물로의 자극은 GM-CSF를 생성하는 세포의 대략 53%를 유도한다. 한편, 패널 D에 나타낸 바와 같이, TRAC-표적화 RNP 및 항-CD38 DAR 공여자 작제물에 추가로 GM-CSF 표적화 RNP로 형질감염된 T 세포의 대략 15%만이 자극시 GM-CSF를 생성하고, 이는 제2 유전자의 동시 녹아웃이 상기 경우에 72% (52.78-14.9/52.78)로 평가되는 빈도로 수행됨을 입증한다.
동일한 세포 집단은 도 19의 패널 H에서 T 세포 수용체 및 항-CD38 DAR 발현에 대해 분석되었다. 패널 E는, 항-CD38 DAR 공여자 단편의 부재하에 TRAC 표적화 RNP로 형질감염되는 경우, 세포의 거의 80% (78.57%)가 T 세포 수용체를 발현하지 않았고, 예상된 바와 같이 항-CD38 DAR 작제물의 어떠한 발현도 검출되지 않았음을 보여준다. 대조적으로, 세포가 항-CD38 DAR 공여자 단편과 함께 TRAC 표적화 RNP로 형질감염되는 경우, 세포 집단의 대략 70%는 고유 T 세포 수용체의 발현의 부재하에 항-CD38 DAR의 발현을 입증하였다(패널 F). 최종적으로, 제2 유전자 표적화 RNP, GM-CSF 표적화 RNP의 첨가는 TCR 녹아웃/녹인 비율을 급격히 저하시키지 않았고, 여기서, RNP (항-TRAC 및 항-GM-CSF) + 항-CD38 DAR 작제물 둘다로 형질감염된 세포의 대략 60%는 내인성 T 세포 수용체를 발현하는데 실패하면서 항-CD38 DAR 작제물을 발현하였다(패널 H). 이들 배양물에서, 집단의 고비율(~49%)이 형질감염에 대한 항-GM-CSF RNP의 내포로부터 비롯되는 GM-CSF 녹아웃인 것으로 계산된다.
실시예 12. Cas12a를 사용한 항-CD20 이량체 항체 수용체 (DAR) 작제물의 TRAC 유전자로의 표적화된 삽입.
T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 유전자는 또한 공여자 DNA로서 항-CD20 DAR 작제물로 표적화하였다. 항-CD20 DAR 작제물 (서열번호 81)은 단일 개방 판독 프레임으로부터 2개의 폴리펩타이드를 생성하기 위해 사용된 “자가-절단” 2A 서열에 의해 연결된 2개의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하였다. 제1 암호화된 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 제1 중쇄 불변 영역 (CH1), 힌지 영역, CD28의 막관통 도메인 및 4-1BB 및 CD3ζ의 제3 ITAM의 세포질 도메인을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드이다. 이에 이어서, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 T2A 펩타이드 암호화 서열 (서열번호 46)이 있고 이어서 상기 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 있고, 여기서, 상기 제2 폴리펩타이드는 N 말단에서 C-말단으로 진행하여 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) + 불변 영역 (카파)을 포함하였다. 중쇄 폴리펩타이드 서열, 2A 펩타이드, 및 경쇄 서열을 암호화하는 핵산 서열은 DAR-암호화 서열의 5’ 말단에서 JeT 프로모터 (서열번호 3) 및 DAR-암호화 서열의 3’ 말단에서 SV40 폴리A 첨가 서열(서열번호 47)에 작동적으로 연결되어 있다. 전체 항-CD20 DAR 작제물 (JeT 프로모터, 힌지, CD28 막관통 도메인, 및 4-1BB 및 CDζ의 세포질 도메인을 갖는 중쇄 암호화 서열에 이어서, T2A, 경쇄, 및 SV40 서열(서열번호 48))은 pAAV 벡터 내 645 bp (서열번호 50)와 600 bp (서열번호 51)의 상동성 아암 사이에 클로닝하였다. 상동성 아암(HA)은 TRAC 유전자의 엑손 1에서 표적 서열(서열번호 52)의 어느 한 측면 상에 TRAC 엑손 1 유전자좌의 서열이다.
형질감염 실험에 사용하기 위한 공여자 단편은 플랭킹 TRAC HA를 포함하는 pAAV 항-CD20 DAR 벡터 작제물을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 합성하였다. 사용된 프라이머는 5’ 인산화된 서열번호 82 (정배향 프라이머) 및 프라이머의 3개의 5’ 최외곽 뉴클레오타이드 상에 2’-O-메틸 변형 및 프라이머의 5’ 말단으로부터 첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 및 세번째와 네번째 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 서열번호 54 (역배향 프라이머)이다(표 1). 이들 프라이머는 벡터 작제물 내 645 bp 내지 600bp 상동성 아암 내 하이브리드화하여 DAR 작제물을 플랭킹하는 192bp 및 159 bp의 상동성 아암을 갖는 단편을 생성하였다. 수득한 PCR 생성물인, 이중 가닥 항-CD20 DAR 공여자 DNA 단편 (서열번호 83)은 2.8 kb크기이고, 2.457 kb 항-CD20 DAR 작제물 (서열번호 81), 192 bp 상동성 아암(서열번호 55), 및 항-CD20 DAR-암호화 작제물 (서열번호 81)을 플랭킹하는 159 bp 상동성 아암 (서열번호 56)을 포함하고, 공여자 DNA 분자에 역배향 프라이머 (서열번호 54)의 2’-O-메틸 및 PS 변형 및 정배향 프라이머 (서열번호 82)의 5’ 말단 포스페이트를 혼입시켰다. 제1 가닥에 혼입되지만 어떠한 화학적 변형을 갖지 않는 서열번호 54의 프라이머 변형은 프라이머의 5’ 말단 포스페이트를 포함하는, 반대, 또는 제2 가닥 상에 도입하였다. 공여자 분자를 사용하여 표적 서열 (서열번호 52)을 포함하는 crRNA (가이드 RNA)와 복합체화된 Cas12a 단백질과 함께 이중 가닥 분자로서 활성화된 T 세포를 형질감염시켰다.
TCR 알파 (TRAC) 유전자의 RNA 가이드-지시된 표적화를 위해, crRNA (ALT-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA)는 IDT (Coralville, IA)로부터 구입하였고, 여기서, 상기 crRNA는 TRAC 유전자의 제1 엑손 내 Cas12a PAM 서열 (TTTA)의 바로 다운스트림에 존재하는 표적 서열 (서열번호 52)을 포함하도록 디자인하였다.
Cas12a 및 가이드 RNA RNP의 형성은 필수적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. Cas12a RNP 및 이중 가닥 공여자 DNA의 T 세포로의 전기천공은 또한 필수적으로 실시예 7에 따라 수행하였다. 대조군으로서, 하나의 T 세포 집단은 Cas12a RNP로 형질감염시켰지만, 어떠한 공여자 단편으로는 형질감염시키지 않았고, TRAC 녹아웃 (KO) 대조군으로서 언급된다. 형질감염 후, T 세포는 확장을 위해 완전한 세포 배양 배지에 옮겼다.
10일 후, 배양물은 실시예 1에 기재된 바와 같이 TRAC 녹아웃 대조군 집단과 함께 유동 세포측정에 의해 분석하였고, 단, CD20 DAR 발현은 항-리툭시맙 항체(Acro)에 의해 검출되었다(도 20a 및 b). 공여자 단편 (“TRAC KO”)의 부재하에 TRAC 유전자를 표적화하는 Cas12a RNP로 형질감염된 세포 집단의 약 16.6%만이 TCR을 발현하였다. 심지어 보다 작은 퍼센트로서, CD20 DAR 공여자 단편(“CD20 DAR-T”)과 함께 TRAC 유전자를 표적화하는 Cas12a RNP 유전자로 형질감염된 세포 집단의 약 3.5%는 TCR을 발현하였다. 예상된 바와 같이, 공여자 DNA를 받지 않은 세포의 어떠한 것도 항-CD20 작제물에 대해 양성이 아니었다(도 20a). 한편, Cas12a RNP와 함께 항-CD20 DAR 작제물 공여자 DNA로 형질감염된 집단의 28.7% (도 20b)는 TCR을 발현하지 않으면서 항-CD20 DAR을 발현하였다.
세포는 필수적으로 실시예 1에서와 같이 수행된 세포독성 검정에서 시험하였고, 단, 상기 항-CD20 DAR 세포는 2일 동안 표적으로서 CD20+ Daudi 세포로 항온처리하였다. 도 21은 사멸 수준이 매우 높아 0.625:1 내지 5:1 범위의 이펙터:표적 비율에 대해 90%에 근접하여 매우 높고, 심지어 0.16:1의 최저 이펙터:표적 비율에서 대략 70%임을 보여준다. 도 22는 항-CD20 CAR-T 세포가 CD20+ Daudi 세포에 의해 자극되는 경우 고수준의 인터페론 감마 (IFNγ) 및 GM-CSF을 분비함을 입증하였다. 항-CD19 CAR-T 세포에 의한 사이토킨의 분비(실시예 4 참조)를 또한 나타낸다.
실시예 13. Cas12a를 사용한 항-CEA CAR 작제물의 TRAC 및 CD7 유전자로의 표적화된 삽입.
항-CEA CAR 작제물은 또한 Cas12a를 사용하여 TRAC 유전자에 삽입하였다. CAR 암호화 서열의 5’ 말단에서 JeT 프로모터 (서열번호 3) 및 CAR-암호화 서열의 3’ 말단에서 SV40 폴리A 첨가 서열 (서열번호 47)을 포함하는 항-CEA CAR 작제물 (서열번호 84)은 pAAV 벡터에서 645 bp (서열번호 50) 및 600 bp (서열번호 51)의 상동성 아암 사이에 클로닝하였다. 상동성 아암은 TRAC 유전자의 엑손 1에서 표적 서열(서열번호 52)의 어느 한 측면 상에 TRAC 엑손 1 유전자좌의 서열이다.
형질감염 실험에 사용하기 위한 공여자 단편은 실시예 1에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 합성하였다. 사용된 프라이머는 5’ 인산화된 서열번호 82 (정배향 프라이머) 및 프라이머의 3개의 5’ 최외곽 뉴클레오타이드 상에 2’-O-메틸 변형 및 프라이머의 5’ 말단으로부터 첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 및 세번째와 네번째 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 서열번호 54 (역배향 프라이머)이다(표 1). 이들 프라이머는 벡터 작제물 내 645 bp 내지 600bp 상동성 아암 내 하이브리드화하여 DAR 작제물을 플랭킹하는 192bp 및 159 bp의 상동성 아암을 갖는 작제물을 생성하였다. 수득한 PCR 생성물인, 이중 가닥 항-CEA CAR 공여자 DNA 단편 (서열번호 85)은 2.4 kb크기이고, 2.077 kb 항-CEA CAR 작제물 (서열번호 84), 192 bp 상동성 아암(서열번호 55), 및 항-CEA CAR 작제물을 플랭킹하는 159 bp 상동성 아암 (서열번호 56)을 포함하고, 공여자 DNA 분자에 역배향 프라이머 (서열번호 54)의 2’-O-메틸 및 PS 변형 및 정배향 프라이머 (서열번호 82)의 5’ 말단 포스페이트를 혼입시켰다. 서열번호 54의 프라이머 변형은 이중 가닥 공여자 DNA의 제1 가닥에 혼입하였지만, 어떠한 화학적 변형도 프라이머의 5’ 말단 포스페이트를 포함하는, 반대, 또는 제2 가닥 상에 도입하지 않았다. 공여자 분자를 사용하여 표적 서열 (서열번호 52)을 포함하는 crRNA (가이드 RNA)와 복합체화된 Cas12a 단백질과 함께 이중 가닥 분자로서 활성화된 T 세포를 형질감염시켰다.
TCR 알파 (TRAC) 유전자의 RNA 가이드-지시된 표적화를 위해, crRNA (ALT-R® CRISPR-Cas12a crRNA)는 IDT (Coralville, IA)로부터 구입하였고, 여기서, 상기 crRNA는 TRAC 유전자의 제1 엑손 내 Cas12a PAM 서열 (TTTA)의 바로 다운스트림에 존재하는 표적 서열 (서열번호 52)을 포함하도록 디자인하였다.
Cas12a 및 가이드 RNA RNP의 형성 및 Cas12a RNP 및 이중 가닥 공여자 DNA의 T 세포로의 전기천공은 또한 실시예 7에 따라 필수적으로 수행하였다. 대조군으로서, 하나의 T 세포 집단은 Cas12a RNP로 형질전환시켰지만, 어떠한 공여자 단편으로는 형질감염시키지 않았고, TRAC 녹아웃 (KO) 대조군으로서 언급된다.
별도의 실험에서, 동일한 항-CEA CAR 작제물은 Cas12a를 사용하여 CD7 유전자에 삽입하였다. 상기 경우에 항-CEA CAR 작제물 (서열번호 84)은 pAAV 벡터 내 CD7 표적 부위 (서열번호 86) 주변의 서열을 포함하는 상동성 아암 사이에 클로닝하였다.
CD7 유전자 내 표적 부위를 선택하기 위해, Cas12a PAM 서열의 업스트림에 2개의 잠재적 부위를 조사하였고, 이들 각각은 Cpf1(Cas12a)에 대한 온라인 가이드 분석 도구를 사용하여 녹아웃을 성취하기 위해 높은 스코어를 받았다. 제1 표적 부위 (서열번호 86)를 사용하여 RNA 가이드 “crRNA-1”을 디자인하였고; 상기 표적 서열은 표적화된 CD7 유전자좌의 외부의 사람 게놈에 단지 하나의 부위 매칭을 가졌고 상기 게놈 내 추가의 부위는 엑손 내에 있지 않았다. Cas12a PAM 부위의 업스트림에 있는 것으로서 CD7 유전자에서 동정된 제2 표적 서열(서열번호 87)을 사용하여 가이드 RNA “crRNA-2”를 디자인하였다. 상기 부위는 사람 게놈내 103개 매칭 서열을 가졌고, 이중 5개는 엑손에 존재하였다. 흥미롭게도, 2개의 가이드 및 유동 세포측정 분석을 사용한 녹아웃 실험 (어떠한 공여자도 전기천공에 포함되지 않음)은 가이드로서 crRNA-2의 사용이 형질감염된 집단의 약 80%가 CD7 발현을 상실하도록 하는 반면, 가이드로서 crRNA-1은 형질감염된 집단의 대략 96%가 CD7 발현을 상실하도록 함을 보여주었다. 표적 서열 (서열번호 86)에 지시된 crRNA-1 가이드 RNA는 따라서 CD7 유전자 내 녹아웃/녹인에 대해 선택되었다.
CD7 유전자좌로의 삽입을 위한 공여자 단편은 실시예 1에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 합성하였다. 사용된 프라이머는 프라이머의 5’ 말단으로부터 첫번째, 세번째 및 네번째 뉴클레오타이드 상에 2’-O-메틸 변형, 및 5’ 말단으로부터 첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 및 세번째와 네번째 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 서열번호 88 (정배향 프라이머) 및 5’ 인산화된 서열번호 89 (역배향 프라이머)이다(표 1). 이들 프라이머는 CD7 표적 부위 (서열번호 86)을 플랭킹하는 연장된 상동성 아암에 의해 플랭킹된 항-CEA CAR 작제물 (서열번호 84)을 포함하는 벡터 작제물 내 상동성 아암내에서 하이브리드화하여 CAR 작제물을 플랭킹하는 212 bp (서열번호 90) 및 170 bp (서열번호 91)의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하였다. 수득한 PCR 생성물인, 이중 가닥 항-CEA CAR 공여자 DNA 단편 (서열번호 92)은 2.46 kb크기이고, 2.077 kb 항-CEA CAR 작제물 (서열번호 84), 212 bp 상동성 아암(서열번호 90), 및 170 bp 상동성 아암 (서열번호 91)을 포함하고, 공여자 DNA 분자에 정배향 프라이머 (서열번호 88)의 2’-O-메틸 및 PS 변형 및 역배향 프라이머 (서열번호 89)의 5’ 말단 포스페이트를 혼입시켰다. 서열번호 88의 프라이머 변형은 제1 가닥에 혼입되지만 어떠한 화학적 변형도 프라이머의 5’ 말단 포스페이트를 포함하는, 반대, 또는 제2 가닥 상에 도입되지 않았다. 공여자 DNA를 사용하여 표적 서열 (서열번호 87)을 포함하는 crRNA (가이드 RNA)와 복합체화된 Cas12a 단백질과 함께 이중 가닥 분자로서 활성화된 T 세포를 형질감염시켰다.
CD7 유전자의 RNA 가이드-지시된 표적화를 위해, crRNA (ALT-R® CRISPR-Cas12a crRNA)는 IDT (Coralville, IA)로부터 구입하였고, 여기서, 상기 crRNA는 TRAC 유전자의 제1 엑손 내 Cas12a PAM 서열 (TTTA)의 바로 다운스트림에 존재하는 표적 서열 (서열번호 86)을 포함하도록 디자인하였다.
Cas12a 및 가이드 RNA RNP의 형성 및 Cas12a RNP 및 이중 가닥 공여자 DNA의 T 세포로의 전기천공은 또한 실시예 7에 따라 필수적으로 수행하였다. 대조군으로서, 하나의 T 세포 집단은 Cas12a RNP로 형질전환시켰지만, 어떠한 공여자 단편으로는 형질전환시키지 않았고, TRAC 녹아웃 (KO) 대조군으로서 언급된다.
형질감염된 배양물은 상기된 바와 같이 TRAC 녹아웃 대조군 집단과 함께 유동 세포측정에 의해 분석하였다(도 23a-d). 도 23a는 공여자 DNA로 형질감염되지 않은 세포에서 CEA CAR의 어떠한 검출된 발현도 없었지만, TRAC 가이드-RNP로 전기천공된 집단의 89%는 TRAC 유전자의 발현을 상실시켰음 (녹아웃)을 보여준다. 그러나, 공여자가 전기천공에 포함되는 경우, 집단의 대략 28.7%는 항-CEA CAR을 발현하지만 TCR을 발현하는데 실패하였다(도 23b). 항-CEA CAR 공여자 및 Cas12a RNP를 사용한 CD7 유전자좌의 표적화는 보다 더 효율적이었다: 집단의 대략 38%는 녹인/녹아웃 세포(CD7 발현의 부재하에 항-CEA CAR의 발현) (도 23d)이다. 도 23c는 세포에서 CD7 발현의 비교를 위한 기초를 제공하고, 여기서, 상기 CD7 유전자좌는 표적화되지 않았다(상기 세포에는 TRAC 유전자좌를 표적화하는 RNP로 형질감염시켰다). 상기 집단에서, 세포 집단의 약 65%는 CD7 유전자좌가 RNP로 표적화된 집단의 단지 약 8%와 비교하여 CD7을 발현하였다(도 23d).
상기 세포는 표적으로서 CEA 양성 LS174T 세포를 사용하여 실시예 1에서와 같이 필수적으로 수행된 세포독성 검정에서 시험하였다. 도 24는 예상된 바와 같이, 항-CEA CAR을 발현하지 않은 TRAC 녹아웃 세포가 표적을 사멸시키지 않음을 보여준다. 한편, TRAC 유전자좌에서 항-CEA CAR의 Cas12a-매개된 녹인은 이펙터:표적 비율에 의존하는 세포독성을 유도하였고, 2.5:1 초과의 이펙터:표적 비율에서 60% 사멸 수준에 이른다. 놀랍게도, CD7 유전자좌에서 항-CEA CAR 녹인은 특히 낮은 표적:이펙터 비율에서 TRAC 유전자좌에서 녹인 보다 표적을 사멸시키는데 보다 효과적이고, 이는 최저 표적 대 이펙터 비율 0.625:1에서 대략 80% 사멸을 입증한다.
도 25는 Cas12a-매개된 항-CEA CAR 녹인/CD7 녹아웃 및 항-CEA CAR 녹인/TRAC 녹아웃 T 세포 둘다가 인터페론 감마를 분비하였고, CD7 녹아웃/항-CEA CAR 녹인 T 세포가 TRAC 녹아웃/항-CEA CAR 녹인 T 세포 보다 약간 적은 인터페론 감마를 분비함을 보여준다.
서열
서열번호 1
DNA
호모 사피엔스
TRAC 유전자 (엑손 1) 내 표적 서열
CAGGGTTCTGGATATCTGT
서열번호 2
DNA
인공
TRAC 유전자좌로의 삽입을 위한 항-CD38 CAR 작제물은: JeT 포로모터에 이어서 CD8a 리더 펩타이드에 이어서 항-CD38 CAR (사람 CD38에 특이적인 단일쇄 가변 단편 (scFv))에 이어서 CD28 힌지-막관통-세포 내 영역 및 CD3 제타 세포내 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. GAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAATGGTCATGGGTCTTTCTCTTTTTTCTCAGCGTGACCACCGGAGTCCACTCCCAGGTAGAGCAGAAATTGATCTCTGAGGAAGACCTGCAGGTCCAGTTGGTCGAAAGTGGCGGCGGATTGGTGAAACCAGGCGGATCTTTGAGGCTTAGTTGCGCGGCTTCCGGATTTACGTTCAGTGATGACTACATGAGCTGGATAAGGCAAGCACCTGGTAAGGGCCTGGAATGGGTCGCAAGTGTGTCTAATGGAAGGCCCACTACCTACTATGCTGATTCCGTCCGCGGACGCTTTACTATTTCAAGAGATAATGCTAAGAATAGTCTGTACCTGCAGATGAACAGTCTGCGCGCGGAAGATACCGCAGTATATTACTGTGCACGAGAGGATTGGGGTGGGGAGTTCACGGATTGGGGCAGGGGAACTCTTGTAACGGTGTCTAGCGGAGGAGGTGGGTCAGGTGGAGGTGGCAGTGGAGGTGGAGGCTCTCAGGCCGGCTTGACCCAACCGCCATCTGCGTCAGGAACATCAGGCCAGAGGGTGACTATCAGTTGTTCTGGCAGTTCATCCAATATTGGGATCAATTTCGTGTACTGGTATCAGCACCTGCCAGGTACCGCGCCGAAGCTGCTGATCTATAAGAATAATCAACGCCCATCAGGCGTTCCAGATAGGTTCAGTGGGAGCAAGTCCGGAAACTCCGCGTCACTCGCGATCTCAGGTCTGCGGTCTGAGGATGAAGCTGATTATTACTGCGCGGCGTGGGATGATTCTCTGTCAGGCTACGTATTCGGTTCAGGGACTAAGGTAACTGTGTTGGCGAAACCGACCACGACACCGGCTCCAAGACCTCCGACGCCAGCTCCAACGATAGCGTCACAGCCATTGTCTCTCCGCCCTGAAGCCTGCCGGCCCGCTGCGGGCGGCGCGGTTCATACCCGGGGATTGGACTTTGCCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTCGATCTAAGCGAAGCCGCTTGTTGCATTCTGACTACATGAATATGACGCCAAGACGGCCAGGGCCAACAAGAAAGCATTACCAACCGTACGCCCCCCCGCGAGACTTCGCGGCCTACCGCAGCAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACGGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCGCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
서열번호 3
DNA
인공
Jet 프로모터
GAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACA
서열번호 4
DNA
인공
상동성 아암을 갖는 항-CD38A2 CAR 카세트
GGCACCATATTCATTTTGCAGGTGAAATTCCTGAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAATGGTCATGGGTCTTTCTCTTTTTTCTCAGCGTGACCACCGGAGTCCACTCCCAGGTAGAGCAGAAATTGATCTCTGAGGAAGACCTGCAGGTCCAGTTGGTCGAAAGTGGCGGCGGATTGGTGAAACCAGGCGGATCTTTGAGGCTTAGTTGCGCGGCTTCCGGATTTACGTTCAGTGATGACTACATGAGCTGGATAAGGCAAGCACCTGGTAAGGGCCTGGAATGGGTCGCAAGTGTGTCTAATGGAAGGCCCACTACCTACTATGCTGATTCCGTCCGCGGACGCTTTACTATTTCAAGAGATAATGCTAAGAATAGTCTGTACCTGCAGATGAACAGTCTGCGCGCGGAAGATACCGCAGTATATTACTGTGCACGAGAGGATTGGGGTGGGGAGTTCACGGATTGGGGCAGGGGAACTCTTGTAACGGTGTCTAGCGGAGGAGGTGGGTCAGGTGGAGGTGGCAGTGGAGGTGGAGGCTCTCAGGCCGGCTTGACCCAACCGCCATCTGCGTCAGGAACATCAGGCCAGAGGGTGACTATCAGTTGTTCTGGCAGTTCATCCAATATTGGGATCAATTTCGTGTACTGGTATCAGCACCTGCCAGGTACCGCGCCGAAGCTGCTGATCTATAAGAATAATCAACGCCCATCAGGCGTTCCAGATAGGTTCAGTGGGAGCAAGTCCGGAAACTCCGCGTCACTCGCGATCTCAGGTCTGCGGTCTGAGGATGAAGCTGATTATTACTGCGCGGCGTGGGATGATTCTCTGTCAGGCTACGTATTCGGTTCAGGGACTAAGGTAACTGTGTTGGCGAAACCGACCACGACACCGGCTCCAAGACCTCCGACGCCAGCTCCAACGATAGCGTCACAGCCATTGTCTCTCCGCCCTGAAGCCTGCCGGCCCGCTGCGGGCGGCGCGGTTCATACCCGGGGATTGGACTTTGCCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTCGATCTAAGCGAAGCCGCTTGTTGCATTCTGACTACATGAATATGACGCCAAGACGGCCAGGGCCAACAAGAAAGCATTACCAACCGTACGCCCCCCCGCGAGACTTCGCGGCCTACCGCAGCAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACGGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCGCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTT
서열번호 5
DNA
인공
pAAV-MCS 벡터 내 항-CD38 CAR-TRAC 상동성 아암 삽입체를 갖는 클론을 서열분석하기 위한 프라이머
CTTAGGCTGGGCATTAGCAG
서열번호 6
DNA
인공
pAAV-MCS 벡터 내 항-CD38 CAR-TRAC 상동성 아암 삽입체를 갖는 클론을 서열분석하기 위한 프라이머
CATGGAATGGTCATGGGTCT
서열번호 7
DNA
인공
pAAV-MCS 벡터 내 항-CD38 CAR-TRAC 상동성 아암 삽입체를 갖는 클론을 서열분석하기 위한 프라이머
GGCTACGTATTCGGTTCAGG
서열번호 8
DNA
인공
pAAV 항-CD38 CAR-TRAC 작제물(660 & 650 HA)로부터 공여자 DNA PCR 단편을 생성하기 위한 정배향 프라이머
첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 및 세번째와 네번째 뉴클레오사이드 사이에 포스포로티오에이트 결합; 위치 2 및 3에서 G 및 위치 4에서 A는 2’-O-메틸화됨
T gm gm am GCTAGGGCACCATATT
서열번호 9
DNA
인공
pAAV 항-CD38 CAR-TRAC 작제물 (660 및 650 HA)로부터 공여자 DNA PCR 단편을 생성하기 위한 역배향 프라이머, 5’-최외곽 뉴클레오사이드 (C)는 5’ 포스페이트를 가짐
CAACTTGGAGAAGGGGCTTA
서열번호 10
DNA
인공
항-CD38 CAR의 부위-특이적 삽입(업스트림 접합)을 입증하기 위한 TRAC 유전자좌에 대해 상동성을 갖는 PCR 정배향 프라이머
CCTGCTTTCTGAGGGTGAAG
서열번호 11
DNA
인공
항-CD38 CAR의 부위-특이적 삽입(업스트림 접합)을 입증하기 위한 CAR 작제물에 대해 상동성을 갖는 PCR 역배향 프라이머
CTTTCGACCAACTGGACCTG
서열번호 12
DNA
인공
항-CD38 CAR의 부위-특이적 삽입(다운스트림 접합)을 입증하기 위한 CAR 유전자좌에 대해 상동성을 갖는 PCR 정배향 프라이머
CGTTCTGGGTACTCGTGGTT
서열번호 13
DNA
인공
TRAC 유전자좌에 대한 상동성을 갖는 PCR 역배향 프라이머(다운스트림 접합)
GAGAGCCCTTCCCTGACTTT
서열번호 14
DNA
인공
300nt HA를 갖는 공여자 단편을 생성하기 위한 정배향 프라이머
첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 및 세번째와 네번째 뉴클레오사이드 사이에 포스포로티오에이트 결합; 위치 2에서 C, 위치 3에서 A 및 위치 5에서 G는 2’-O-메틸화됨
C cm am T gm CCTGCCTTTACTCTG
서열번호 15
DNA
인공
300 nt HA를 갖는 공여자 단편을 생성하기 위한 역배향 프라이머, 5’-최외곽 뉴클레오사이드(T)는 5’ 포스페이트를 가짐
TCCTGAAGCAAGGAAACAGC
서열번호 16
DNA
호모 사피엔스
375 nt
5’ 상동성 아암, 엑손 1 TRAC 유전자
CCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACA
서열번호 17
DNA
호모 사피엔스
321 nt
3’ 상동성 아암, 엑손 1 TRAC 유전자
GATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGA
서열번호 18
DNA
인공
150nt HA를 갖는 공여자 단편을 생성하기 위한 정배향 프라이머
첫번째와 두번째, 세번째와 네번째 및 네번째와 다섯번째 뉴클레오사이드 사이에 포스포로티오에이트 연결; 위치 3에서 C, 위치 4에서 A 및 위치 5에서 G는 2’-O-메틸화됨
AT cm am cm GAGCAGCTGGTTTCT
서열번호 19
DNA
인공
150 nt HA를 갖는 공여자 단편을 생성하기 위한 역배향 프라이머, 5’-최외곽 뉴클레오사이드(G)는 5’ 포스페이트를 가짐
GACCTCATGTCTAGCACAGTTTTG
서열번호 20
DNA
호모 사피엔스
5’ 171 nt 상동성 아암, 엑손 1 TRAC 유전자
ATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACA
서열번호 21
DNA
호모 사피엔스
3’ 161 nt 상동성 아암, 엑손 1 TRAC 유전자
GATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTC
서열번호 22
DNA
인공
JeT 프로모터, 인트론, 항-CD19 CAR, SV40 서열을 포함하는 항-CD19 CAR 카세트
GAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAATGGTCATGGGTCTTTCTCTTTTTTCTCAGCGTGACCACCGGAGTCCACTCCGATATCCAGATGACACAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGAGTGACTATCAGCTGCCGGGCATCCCAGGATATTTCTAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACTGTCAAACTGCTGATCTACCACACCAGTAGACTGCATTCAGGGGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGATCTGGCAGTGGGACTGACTACTCCCTGACCATCTCTAACCTGGAGCAGGAAGATATTGCCACCTATTTCTGCCAGCAGGGCAATACACTGCCTTACACTTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATCACTGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAGGATCAGAGGTGAAACTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTCGCACCTTCACAGAGCCTGTCCGTGACATGTACTGTCTCCGGAGTGTCTCTGCCCGATTACGGCGTCTCTTGGATCCGGCAGCCCCCTAGAAAGGGACTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGAAGTGAAACTACCTACTATAATAGTGCTCTGAAATCAAGACTGACCATCATTAAGGACAACTCTAAAAGTCAGGTGTTTCTGAAGATGAATTCCCTGCAGACCGACGATACAGCAATCTACTATTGCGCCAAACACTACTATTACGGCGGGAGCTATGCCATGGATTACTGGGGGCAGGGAACTTCCGTCACCGTGAGCAGCgcTAAGCCGACCACGACACCGGCTCCAAGACCTCCGACGCCAGCTCCAACGATAGCGTCACAGCCATTGTCTCTCCGCCCTGAAGCCTGCCGGCCCGCTGCGGGCGGCGCGGTTCATACCCGGGGATTGGACTTTGCCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTCGATCTAAGCGAAGCCGCTTGTTGCATTCTGACTACATGAATATGACGCCAAGACGGCCAGGGCCAACAAGAAAGCATTACCAACCGTACGCCCCCCCGCGAGACTTCGCGGCCTACCGCAGCAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCGCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
서열번호 23
DNA
인공
JeT 프로모터, 인트론, 항-BCMA CAR 작제물, SV40 서열을 포함하는 항-BCMA CAR 작제물
GAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAGTGGTCCTGGGTGTTCCTGTTCTTTCTGTCCGTGACCACCGGTGTCCACTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTCCAGTACCGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGCAAAAGTGATGGTGGGACAACAGACTACGCTGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAAAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCAAGGGAGGCGGGACCTACGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCCGGCGGCGGCGGCAGCGGTGGCGGTGGCTCAGGTGGTGGTGGTTCTTCCTATGTGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGGTGGTGGTCACACCTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCATGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGANGACGAGGCTGATTATTACTGCGGCTCATATACAAGCAGCGNCTCTTATGTCTTCGGAACTGGNACCAAGCTGACCGTCCTGGCTAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCCCTAGGAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
서열번호 24
DNA
호모 사피엔스
5’ 상동성 아암, TRAC 유전자 엑손 3, 183 nt
TATGCACAGAAGCTGCAAGGGACAGGAGGTGCAGGAGCTGCAGGCCTCCCCCACCCAGCCTGCTCTGCCTTGGGGAAAACCGTGGGTGTGTCCTGCAGGCCATGCAGGCCTGGGACATGCAAGCCCATAACCGCTGTGGCCTCTTGGTTTTACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTC
서열번호 25
DNA
호모 사피엔스
3’ 상동성 아암, TRAC 유전자 엑손 3
140 nt
AGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGAGGTGAGGGGCCTTGAAGCTGGGAGTGGGGTTTAGGGACGCGGGTCTCTGGGTGCATCCTAA
서열번호 26
DNA
호모 사피엔스
엑손 3 표적 서열 (가이드 서열)
TTCGGAACCCAATCACTGAC
서열번호 27
DNA
인공
전체 공여자 DNA 항-CD38 CAR + 양 말단 상에 엑손 3 HA
TATGCACAGAAGCTGCAAGGGACAGGAGGTGCAGGAGCTGCAGGCCTCCCCCACCCAGCCTGCTCTGCCTTGGGGAAAACCGTGGGTGTGTCCTGCAGGCCATGCAGGCCTGGGACATGCAAGCCCATAACCGCTGTGGCCTCTTGGTTTTACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAATGGTCATGGGTCTTTCTCTTTTTTCTCAGCGTGACCACCGGAGTCCACTCCCAGGTAGAGCAGAAATTGATCTCTGAGGAAGACCTGCAGGTCCAGTTGGTCGAAAGTGGCGGCGGATTGGTGAAACCAGGCGGATCTTTGAGGCTTAGTTGCGCGGCTTCCGGATTTACGTTCAGTGATGACTACATGAGCTGGATAAGGCAAGCACCTGGTAAGGGCCTGGAATGGGTCGCAAGTGTGTCTAATGGAAGGCCCACTACCTACTATGCTGATTCCGTCCGCGGACGCTTTACTATTTCAAGAGATAATGCTAAGAATAGTCTGTACCTGCAGATGAACAGTCTGCGCGCGGAAGATACCGCAGTATATTACTGTGCACGAGAGGATTGGGGTGGGGAGTTCACGGATTGGGGCAGGGGAACTCTTGTAACGGTGTCTAGCGGAGGAGGTGGGTCAGGTGGAGGTGGCAGTGGAGGTGGAGGCTCTCAGGCCGGCTTGACCCAACCGCCATCTGCGTCAGGAACATCAGGCCAGAGGGTGACTATCAGTTGTTCTGGCAGTTCATCCAATATTGGGATCAATTTCGTGTACTGGTATCAGCACCTGCCAGGTACCGCGCCGAAGCTGCTGATCTATAAGAATAATCAACGCCCATCAGGCGTTCCAGATAGGTTCAGTGGGAGCAAGTCCGGAAACTCCGCGTCACTCGCGATCTCAGGTCTGCGGTCTGAGGATGAAGCTGATTATTACTGCGCGGCGTGGGATGATTCTCTGTCAGGCTACGTATTCGGTTCAGGGACTAAGGTAACTGTGTTGGCGAAACCGACCACGACACCGGCTCCAAGACCTCCGACGCCAGCTCCAACGATAGCGTCACAGCCATTGTCTCTCCGCCCTGAAGCCTGCCGGCCCGCTGCGGGCGGCGCGGTTCATACCCGGGGATTGGACTTTGCCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTCGATCTAAGCGAAGCCGCTTGTTGCATTCTGACTACATGAATATGACGCCAAGACGGCCAGGGCCAACAAGAAAGCATTACCAACCGTACGCCCCCCCGCGAGACTTCGCGGCCTACCGCAGCAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACGGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCGCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGAGGTGAGGGGCCTTGAAGCTGGGAGTGGGGTTTAGGGACGCGGGTCTCTGGGTGCATCCTAA
서열번호 28
인공
서열번호 27의 공여자 단편을 생성하기 위한 정배향 프라이머
첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 및 세번째와 네번째 뉴클레오사이드 사이에 포스포로티오에이트 연결; 위치 2에서 A, 위치 4에서 G 및 위치 5에서 C는 2’-O-메틸화됨
T am T gm cm CACAGAAGCTGCAAGG
서열번호 29
인공
서열번호 27의 공여자 단편을 생성하기 위한 역배향 프라이머, 5’-최외곽 뉴클레오사이드(T)는 5’ 포스페이트를 가짐
TTAGGATGCACCCAGAGACC
서열번호 30
DNA PD-1 유전자좌 5’ HA
호모 사피엔스
326 nt
CTCCCCATCTCCTCTGTCTCCCTGTCTCTGTCTCTCTCTCCCTCCCCCACCCTCTCCCCAGTCCTACCCCCTCCTCACCCCTCCTCCCCCAGCACTGCCTCTGTCACTCTCGCCCACGTGGATGTGGAGGAAGAGGGGGCGGGAGCAAGGGGCGGGCACCCTCCCTTCAACCTGACCTGGGACAGTTTCCCTTCCGCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTA
서열번호 31
DNA PD-1 유전자좌 3’ HA
호모 사피엔스
380 nt
GGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCGAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGGCCCCAACTCCTCCCCTGGCCCAAGTCCCCTCTTTGCTCCTGGGCAGGCAGGACCTCTGTCCCCTCTCAGCCGGTCCTTGGGGCTGCGTGTTTCTGTAGAATGACGGGTCAGG
서열번호 32
DNA
호모 사피엔스
PD-1 표적 부위
GGCCAGGATGGTTCTTAGGT
서열번호 33
DNA
인공
PD-1 HA에 의해 플랭킹된 CD38 카세트(서열번호 2)를 갖는 공여자 DNA 단편
CTCCCCATCTCCTCTGTCTCCCTGTCTCTGTCTCTCTCTCCCTCCCCCACCCTCTCCCCAGTCCTACCCCCTCCTCACCCCTCCTCCCCCAGCACTGCCTCTGTCACTCTCGCCCACGTGGATGTGGAGGAAGAGGGGGCGGGAGCAAGGGGCGGGCACCCTCCCTTCAACCTGACCTGGGACAGTTTCCCTTCCGCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAATGGTCATGGGTCTTTCTCTTTTTTCTCAGCGTGACCACCGGAGTCCACTCCCAGGTAGAGCAGAAATTGATCTCTGAGGAAGACCTGCAGGTCCAGTTGGTCGAAAGTGGCGGCGGATTGGTGAAACCAGGCGGATCTTTGAGGCTTAGTTGCGCGGCTTCCGGATTTACGTTCAGTGATGACTACATGAGCTGGATAAGGCAAGCACCTGGTAAGGGCCTGGAATGGGTCGCAAGTGTGTCTAATGGAAGGCCCACTACCTACTATGCTGATTCCGTCCGCGGACGCTTTACTATTTCAAGAGATAATGCTAAGAATAGTCTGTACCTGCAGATGAACAGTCTGCGCGCGGAAGATACCGCAGTATATTACTGTGCACGAGAGGATTGGGGTGGGGAGTTCACGGATTGGGGCAGGGGAACTCTTGTAACGGTGTCTAGCGGAGGAGGTGGGTCAGGTGGAGGTGGCAGTGGAGGTGGAGGCTCTCAGGCCGGCTTGACCCAACCGCCATCTGCGTCAGGAACATCAGGCCAGAGGGTGACTATCAGTTGTTCTGGCAGTTCATCCAATATTGGGATCAATTTCGTGTACTGGTATCAGCACCTGCCAGGTACCGCGCCGAAGCTGCTGATCTATAAGAATAATCAACGCCCATCAGGCGTTCCAGATAGGTTCAGTGGGAGCAAGTCCGGAAACTCCGCGTCACTCGCGATCTCAGGTCTGCGGTCTGAGGATGAAGCTGATTATTACTGCGCGGCGTGGGATGATTCTCTGTCAGGCTACGTATTCGGTTCAGGGACTAAGGTAACTGTGTTGGCGAAACCGACCACGACACCGGCTCCAAGACCTCCGACGCCAGCTCCAACGATAGCGTCACAGCCATTGTCTCTCCGCCCTGAAGCCTGCCGGCCCGCTGCGGGCGGCGCGGTTCATACCCGGGGATTGGACTTTGCCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTCGATCTAAGCGAAGCCGCTTGTTGCATTCTGACTACATGAATATGACGCCAAGACGGCCAGGGCCAACAAGAAAGCATTACCAACCGTACGCCCCCCCGCGAGACTTCGCGGCCTACCGCAGCAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACGGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCGCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCGAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGGCCCCAACTCCTCCCCTGGCCCAAGTCCCCTCTTTGCTCCTGGGCAGGCAGGACCTCTGTCCCCTCTCAGCCGGTCCTTGGGGCTGCGTGTTTCTGTAGAATGACGGGTCAGG
서열번호 34
DNA
인공
서열번호 33의 공여자 단편을 생성하기 위한 정배향 프라이머, 5’-최외곽 뉴클레오사이드(C)는 5’ 포스페이트를 가짐
CTCCCCATCTCCTCTGTCTC
서열번호 35
DNA
인공
서열번호 33의 공여자 단편을 생성하기 위한 역배향 프라이머, 첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 및 세번째와 네번째 뉴클레오사이드 사이에 포스포로티오에이트 연결; 위치 1에서 C, 위치 2에서 C, 위치 4에서 G는 2’-O-메틸화됨
cm cm T gm GACCCGTCATTCTACAG
서열번호 36
DNA
호모 사피엔스
pAAV 항-CD38 CAR-TRAC 작제물(660 & 650 HA)로부터 공여자 DNA PCR 단편을 생성하기 위한 정배향 프라이머
TGGAGCTAGGGCACCATATT
서열번호 37
DNA
인공
5’ 및 3’ TRAC 유전자 엑손 1 상동성 아암을 갖는, JeT 프로모터, 인트론, 항-BCMA CAR 작제물, SV40 서열을 포함하는 항-BCMA CAR 작제물 공여자 단편 서열
ATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAGTGGTCCTGGGTGTTCCTGTTCTTTCTGTCCGTGACCACCGGTGTCCACTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTCCAGTACCGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGCAAAAGTGATGGTGGGACAACAGACTACGCTGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAAAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCAAGGGAGGCGGGACCTACGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCCGGCGGCGGCGGCAGCGGTGGCGGTGGCTCAGGTGGTGGTGGTTCTTCCTATGTGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGGTGGTGGTCACACCTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCATGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGANGACGAGGCTGATTATTACTGCGGCTCATATACAAGCAGCGNCTCTTATGTCTTCGGAACTGGNACCAAGCTGACCGTCCTGGCTAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCCCTAGGAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTC
서열번호 38
DNA
인공
JeT 프로모터, 인트론, 항-CD19 CAR, 서열번호 20 및 서열번호 21의 5’ 및 3’ TRAC 유전자 엑손 1 상동성 아암에 의해 플랭킹된 SV40 서열을 포함하는 항-CD19 CAR 카세트
ATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAATGGTCATGGGTCTTTCTCTTTTTTCTCAGCGTGACCACCGGAGTCCACTCCGATATCCAGATGACACAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGAGTGACTATCAGCTGCCGGGCATCCCAGGATATTTCTAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACTGTCAAACTGCTGATCTACCACACCAGTAGACTGCATTCAGGGGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGATCTGGCAGTGGGACTGACTACTCCCTGACCATCTCTAACCTGGAGCAGGAAGATATTGCCACCTATTTCTGCCAGCAGGGCAATACACTGCCTTACACTTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATCACTGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAGGATCAGAGGTGAAACTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTCGCACCTTCACAGAGCCTGTCCGTGACATGTACTGTCTCCGGAGTGTCTCTGCCCGATTACGGCGTCTCTTGGATCCGGCAGCCCCCTAGAAAGGGACTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGAAGTGAAACTACCTACTATAATAGTGCTCTGAAATCAAGACTGACCATCATTAAGGACAACTCTAAAAGTCAGGTGTTTCTGAAGATGAATTCCCTGCAGACCGACGATACAGCAATCTACTATTGCGCCAAACACTACTATTACGGCGGGAGCTATGCCATGGATTACTGGGGGCAGGGAACTTCCGTCACCGTGAGCAGCgcTAAGCCGACCACGACACCGGCTCCAAGACCTCCGACGCCAGCTCCAACGATAGCGTCACAGCCATTGTCTCTCCGCCCTGAAGCCTGCCGGCCCGCTGCGGGCGGCGCGGTTCATACCCGGGGATTGGACTTTGCCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTCGATCTAAGCGAAGCCGCTTGTTGCATTCTGACTACATGAATATGACGCCAAGACGGCCAGGGCCAACAAGAAAGCATTACCAACCGTACGCCCCCCCGCGAGACTTCGCGGCCTACCGCAGCAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCGCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTC
서열번호 39
DNA
인공
공여자 DNA의 5’ 말단의 서열분석된 PCR 생성물 + 항-CD38 CAR 작제물 및 660nt 상동성 아암 부분을 포함하는 인접한 TRAC 유전자 엑손 1 게놈 서열
NNNNNNNNNNNNNNNGCNNGACTCACTAGCACTCTATCACGGCCATATTCTGGCAGGGTCAGTGGCTCCAACTAACATTTGTTTGGTACTTTACAGTTTATTAAATAGATGTTTATATGGAGAAGCTCTCATTTCTTTCTCAGAAGAGCCTGGCTAGGAAGGTGGATGAGGCACCATATTCATTTTGCAGGTGAAATTCCTGAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGCGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGNNNGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGANTATATNANNACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGN
서열번호 40
DNA
인공
공여자 DNA의 3’ 말단의 서열분석된 PCR 생성물 + 항-CD38 CAR 작제물 및 650nt 상동성 아암 부분을 포함하는 인접한 TRAC 유전자 엑손 1 게놈 서열
NNNNNNNNNNNNNNNNTTCTGCTCTACCTGGGAGTGGACTCCGGTGGTCACGCTGAGAAAAAAGAGAAAGACCCATGACCATTCCATGGTGGCGGCCTCGAGGCCTGTCAGGAGAGGAAAGAGAAGAAGGTTAGTACAATTGTCTAGATGCATTCCTAGGGCTGCAGGGTTCATAGTGCCACTTTTCCTGCACTGCCCCATCTCCTGCCCACCCTTTCCCAGGCATAGACAGTCAGTGACTTACTGTCAAGTGACGATCACAGGGATCCACAAACAAGAACCGCGACCCAAATCCCGGCTGCGACGGAACTAGCTGTGCCACACCCGGCGCGTCCTTATATAATCATCGGCGTTCACCGCCCATTCTCCGCCCAGCCATAAAAGGCAACTTTCGGAACGGCGCACGCTGATTGGCTCCGCCCTAACTCCGCCCGAATTCTGTGGGACAAGAGGATCAGGGTTAGGACATGATCTCATTTCCCTCTTTGCCCCAACCCAGGCTGGAGTCCAGATGCCAGTGATGGACAAGGGCGGGGCTCTGTGGGGCTGGCAAGTCACGGTCTCATGCTTTATACGGGAAATAGCATCTTAGAAACCAGCTGCTCGTGATGGACTGGGACTCAGGGACAGGCACAAGCTATCAATCTTGGCCAAGAGGCCATGATTTCAGTGAACGTTCACGGCCAGGCCTGGCCTGCCACTCAAGGAAACCTGAAATGCAGGGCTACTTAATAATACTGCTTATTCTTTTATTTAATAGGATCTTCTTCAAAACCCCAGCAATATAACTCTGGCAGAGTAAAGGCAGGCATGGGAAAAAGGCCCAGCAAAGCAAACTGTACATCTTGGAATCTGGAGTGGTCTCCCCAACTTAGGCTGGGCATTAGCAGAATGGGAGGTTTATGGTATGTTGGCATTAAGTTGGGAAATCTATCACATTACCAGGAGATTGCTCTCTCATTGATAGAGGTTTTGAACTATAAATCANAACACCTGCGTCTAAGCCCCAGCGCTA
서열번호 41
DNA
인공
공여자 DNA의 5’ 말단의 서열분석된 PCR 생성물 + 항-CD38 CAR 작제물 및 660nt 상동성 아암 부분을 포함하는 인접한 TRAC 유전자 엑손 3 게놈 서열
엑손3 5HA F 서열 결과:
CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTTTGAGGANGAGTTTCTAGCTTCAATAGACCAAGGACTCTCTCCTAGGCCTCTGTATTCCTTTCAACAGCTCCACTGTCAAGAGAGCCAGAGAGAGCTTCTGGGTGGCCCAGCTGTGAAATTTCTGAGTCCCTTAGGGATAGCCCTAAACGAACCAGATCATCCTGAGGACAGCCAAGAGGTTTTGCCTTCTTTCAAGACAAGCAACAGTACTCACATAGGCTGTGGGCAATGGTCCTGTCTCTCAAGAATCCCCTGCCACTCCTCACACCCACCCTGGGCCCATATTCATTTCCATTTGAGTTGTTCTTATTGAGTCATCCTTCCTGTGGTAGCGGAACTCACTAAGGGGCCCATCTGGACCCGAGGTATTGTGATGATAAATTCTGAGCACCTACCCCATCCCCAGAAGGGCTCAGAAATAAAATAAGAGCCAAGTCTAGTCGGTGTTTCCTGTCTTGAAACACAATACTGTTGGCCCTGGAAGAATGCACAGAATCTGTTTGTAAGGGGATATGCACAGAAGCTGCAAGGGACAGGAGGTGCAGGAGCTGCAGGCCTCCCCCACCCAGCCTGCTCTGCCTTGGGGAAAACCGTGGGTGTGTCCTGCAGGCCATGCAGGCCTGGGACATGCAAGCCCATAACCGCTGTGGCCTCTTGGTTTTACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCNTNNNN
서열번호 42
DNA
인공
공여자 DNA의 3’ 말단의 서열분석된 PCR 생성물 + 항-CD38 CAR 작제물 및 650nt 상동성 아암 부분을 포함하는 인접한 게놈 TRAC 유전자 엑손 3 서열
NNNNNNNNNNNNNNNNNNGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCTCCAGGCTTGACCAAGCCTCCCCCAGACTCCACCAGCTGCACCTGAGAGTGGACACCGGTGGTCACGGACAGAAAGAACAGGAACACCCAGGACCACTCCATGGTGGCGGCCTCGAGGCCTGTCAGGAGAGGAAAGAGAAGAAGGTTAGTACAATTGTCTAGATGCATTCCTAGGGCTGCAGGGTTCATAGTGCCACTTTTCCTGCACTGCCCCATCTCCTGCCCACCCTTTCCCAGGCATAGACAGTCAGTGACTTACTGTCAAGTGACGATCACAGGGATCCACAAACAAGAACCGCGACCCAAATCCCGGCTGCGACGGAACTAGCTGTGCCACACCCGGCGCGTCCTTATATAATCATCGGCGTTCACCGCCCATTCTCCGCCCAGCCATAAAAGGCAACTTTCGGAACGGCGCACGCTGATTGGCTCCGCCCTAACTCCGCCCGAATTCGACAGGTTTTGAAAGTTTAGGTTCGTATCTGTAAAACCAAGAGGCCACAGCGGTTATGGGCTTGCATGTCCCAGGCCTGCATGGCCTGCAGGACACACCCACGGTTTTCCCCAAGGCAGAGCAGGCTGGGTGGGGGAGGCCTGCAGCTCCTGCACCTCCTGTCCCTTGCAGCTTCTGTGCATATCCCCTTACAAACAGATTCTGTGCATTCTTCCAGGGCCAACAGTATTGTGTTTCAAGACAGGAAACACCGACTAGACTTGGCTCTTATTTTATTTCTGAGCCCTTCTGGGGATGGGGTAGGTGCTCAGAATTTATCATCACAATACCTCGGGTCCAGATGGGCCCCTTAGTGAGTTCCGCTACCACAGGAAGGATGACTCAATAAGAACAACTCAAATGGAAATGAATATGGGCCCAGGGTGGGTGTGAGGAGTGGCAGGGGATTCTTGANAGACAGGACCATTGCCCACAGCCTATGTGAGTACTGTTGCTTGTCTTGAAAGAANGCAAAACCTCTTGGCTGTCCTCN
서열번호 43
DNA
인공
공여자 DNA의 3’ 말단의 서열분석된 PCR 생성물 + 항-CD38 CAR 작제물 및 660nt 상동성 아암 부분을 포함하는 인접한 PD-1 게놈 서열
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCNTGCTGGTGANGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTCGATCTAAGCGAAGCCGCTTGTTGCATTCTGACTACATGAATATGACGCCAAGACGGCCAGGGCCAACAAGAAAGCATTACCAACCGTACGCCCCCCCGCGAGACTACGCGGCCTACCGCAGCAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCGCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCAAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGNNCCCNACTCNNCCCCTGNCCCNAGTCCCCTCTTTNNTCCTGGGCANGCNNNANCTCTNNNCCCTNNCAGCCGGNCCTTGGGGCTGCNNGN
서열번호 44
DNA
호모 사피엔스
TRAC 유전자의 엑손 1로부터의 5’ 상동성 아암, 660nt
GGCACCATATTCATTTTGCAGGTGAAATTCCTGAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACA
서열번호 45
DNA
호모 사피엔스
TRAC 유전자의 엑손 1로부터의 3’ 상동성 아암, 650nt
GATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTT
서열번호 46
DNA
인공
토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스의 T2A 펩타이드 서열을 암호화함
GGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCT
서열번호 47
DNA
SV40
폴리A 첨가 서열
AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
서열번호 48
DNA
인공
CD38 DAR 삽입체 2652 nt
GAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAGTGGAGCTGGGTGTTTCTGTTCTTCCTCTCCGTCACAACCGGCGTGCATAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGCGGCCTGGTGAAACCTGGCGGATCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCTAGCGGATTCACCTTCAGCGACGACTACATGAGCTGGATCAGGCAGGCTCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCTAGCGTGAGCAATGGCCGGCCCACAACCTACTATGCCGACTCCGTGCGGGGCAGGTTTACCATCTCCAGGGATAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAAGATACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGAGGATTGGGGCGGCGAGTTCACAGACTGGGGAAGGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCCGGAGGCACCGCCGCCCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTCACCGTGTCCTGGAATAGCGGCGCCCTCACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCCGGACTGTACAGCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCTAGCTCCTCCCTCGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAACGGGTGGAGCCCAAGTCCTGCGACAAAACCCACACCAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGTCCGTCCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGATGCTAGATGCCAGTCCGTTCTGACCCAGCCTCCTTCCGCCTCTGGCACATCCGGCCAGAGAGTGACCATCTCCTGCAGCGGCTCCAGCTCTAACATCGGCATCAATTTCGTGTACTGGTATCAGCACCTGCCAGGCACAGCTCCCAAGCTGCTGATCTACAAGAACAATCAGAGGCCTTCCGGCGTGCCAGACCGGTTCTCTGGCTCCAAGAGCGGCAACTCTGCCTCCCTGGCTATCTCCGGCCTGCGCAGCGAGGACGAGGCTGATTACTATTGCGCCGCTTGGGACGATAGCCTGTCTGGCTACGTGTTCGGCAGCGGCACAAAGGTGACCGTGCTGGGACAGCCAAAGGCTGCTCCTTCTGTGACACTGTTTCCCCCTTCCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAATAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTATCCTGGAGCTGTGACCGTGGCTTGGAAGGCTGATTCTTCCCCAGTGAAGGCTGGCGTGGAGACAACAACCCCCAGCAAGCAGTCTAACAATAAGTACGCCGCTAGCTCTTATCTGTCTCTGACCCCAGAGCAGTGGAAGTCCCATAGGTCCTATAGCTGTCANGTCACCCACGAAGGGAGCACAGTCGAAAAAACCGTCGCACCAACCGAGTGTTCCTGATAAGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
서열번호 49
DNA
인공
5’ 171 nt 및 3’ 161 nt TRAC 엑손 1 상동성 아암에 의해 플랭킹된 CD28 DAR 삽입체 2652 nt
ATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAGTGGAGCTGGGTGTTTCTGTTCTTCCTCTCCGTCACAACCGGCGTGCATAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGCGGCCTGGTGAAACCTGGCGGATCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCTAGCGGATTCACCTTCAGCGACGACTACATGAGCTGGATCAGGCAGGCTCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCTAGCGTGAGCAATGGCCGGCCCACAACCTACTATGCCGACTCCGTGCGGGGCAGGTTTACCATCTCCAGGGATAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAAGATACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGAGGATTGGGGCGGCGAGTTCACAGACTGGGGAAGGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCCGGAGGCACCGCCGCCCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTCACCGTGTCCTGGAATAGCGGCGCCCTCACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCCGGACTGTACAGCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCTAGCTCCTCCCTCGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAACGGGTGGAGCCCAAGTCCTGCGACAAAACCCACACCAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGTCCGTCCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGATGCTAGATGCCAGTCCGTTCTGACCCAGCCTCCTTCCGCCTCTGGCACATCCGGCCAGAGAGTGACCATCTCCTGCAGCGGCTCCAGCTCTAACATCGGCATCAATTTCGTGTACTGGTATCAGCACCTGCCAGGCACAGCTCCCAAGCTGCTGATCTACAAGAACAATCAGAGGCCTTCCGGCGTGCCAGACCGGTTCTCTGGCTCCAAGAGCGGCAACTCTGCCTCCCTGGCTATCTCCGGCCTGCGCAGCGAGGACGAGGCTGATTACTATTGCGCCGCTTGGGACGATAGCCTGTCTGGCTACGTGTTCGGCAGCGGCACAAAGGTGACCGTGCTGGGACAGCCAAAGGCTGCTCCTTCTGTGACACTGTTTCCCCCTTCCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAATAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTATCCTGGAGCTGTGACCGTGGCTTGGAAGGCTGATTCTTCCCCAGTGAAGGCTGGCGTGGAGACAACAACCCCCAGCAAGCAGTCTAACAATAAGTACGCCGCTAGCTCTTATCTGTCTCTGACCCCAGAGCAGTGGAAGTCCCATAGGTCCTATAGCTGTCANGTCACCCACGAAGGGAGCACAGTCGAAAAAACCGTCGCACCAACCGAGTGTTCCTGATAAGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTC
서열번호 50
DNA
5’ 엑손 1 TRAC 유전자 상동성 플랭킹 서열, 645 bp
TGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCT
서열번호 51
DNA
3’ 엑손 1 TRAC 유전자 상동성 플랭킹 서열, 엑손 1 TRAC 유전자 600bp
GTACCAGCTGAGAGACTCACTATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTT
서열번호 52
DNA
TRAC 유전자의 엑손 1에서 Cas12a 표적 부위
GAGTCTCTCAGCTGGTACACG
서열번호 53
DNA
인공
TRAC 유전자좌로부터 645 bp 및 600 bp 상동성 서열에 의해 플랭킹된 항-CD38 DAR 작제물
TGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAGTGGAGCTGGGTGTTTCTGTTCTTCCTCTCCGTCACAACCGGCGTGCATAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGCGGCCTGGTGAAACCTGGCGGATCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCTAGCGGATTCACCTTCAGCGACGACTACATGAGCTGGATCAGGCAGGCTCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCTAGCGTGAGCAATGGCCGGCCCACAACCTACTATGCCGACTCCGTGCGGGGCAGGTTTACCATCTCCAGGGATAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAAGATACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGAGGATTGGGGCGGCGAGTTCACAGACTGGGGAAGGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCCGGAGGCACCGCCGCCCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTCACCGTGTCCTGGAATAGCGGCGCCCTCACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCCGGACTGTACAGCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCTAGCTCCTCCCTCGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAACGGGTGGAGCCCAAGTCCTGCGACAAAACCCACACCAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGTCCGTCCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGATGCTAGATGCCAGTCCGTTCTGACCCAGCCTCCTTCCGCCTCTGGCACATCCGGCCAGAGAGTGACCATCTCCTGCAGCGGCTCCAGCTCTAACATCGGCATCAATTTCGTGTACTGGTATCAGCACCTGCCAGGCACAGCTCCCAAGCTGCTGATCTACAAGAACAATCAGAGGCCTTCCGGCGTGCCAGACCGGTTCTCTGGCTCCAAGAGCGGCAACTCTGCCTCCCTGGCTATCTCCGGCCTGCGCAGCGAGGACGAGGCTGATTACTATTGCGCCGCTTGGGACGATAGCCTGTCTGGCTACGTGTTCGGCAGCGGCACAAAGGTGACCGTGCTGGGACAGCCAAAGGCTGCTCCTTCTGTGACACTGTTTCCCCCTTCCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAATAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTATCCTGGAGCTGTGACCGTGGCTTGGAAGGCTGATTCTTCCCCAGTGAAGGCTGGCGTGGAGACAACAACCCCCAGCAAGCAGTCTAACAATAAGTACGCCGCTAGCTCTTATCTGTCTCTGACCCCAGAGCAGTGGAAGTCCCATAGGTCCTATAGCTGTCANGTCACCCACGAAGGGAGCACAGTCGAAAAAACCGTCGCACCAACCGAGTGTTCCTGATAAGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGTACCAGCTGAGAGACTCACTATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTGTACCAGCTGAGAGACTCACTATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTT
서열번호 54
DNA
cas12a를 사용한 TRAC 엑손 1로의 삽입을 위한 공여자 DNA를 생성하기 위한 역배향 프라이머
mG*mC*mA*CTGTTGCTCTTGAAGTCC
서열번호 55
DNA
PCR 합성된 5’ 상동성 아암, 192 nts
ATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCT
서열번호 56
DNA
PCR 합성된 3’ 상동성 아암, 159 nts
GTACCAGCTGAGAGACTCACTATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGC
서열번호 57
DNA
인공
항-CD38 DAR 공여자 DNA, 30003 뉴클레오타이드
ATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAGTGGAGCTGGGTGTTTCTGTTCTTCCTCTCCGTCACAACCGGCGTGCATAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGCGGCCTGGTGAAACCTGGCGGATCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCTAGCGGATTCACCTTCAGCGACGACTACATGAGCTGGATCAGGCAGGCTCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCTAGCGTGAGCAATGGCCGGCCCACAACCTACTATGCCGACTCCGTGCGGGGCAGGTTTACCATCTCCAGGGATAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAAGATACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGAGGATTGGGGCGGCGAGTTCACAGACTGGGGAAGGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCCGGAGGCACCGCCGCCCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTCACCGTGTCCTGGAATAGCGGCGCCCTCACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCCGGACTGTACAGCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCTAGCTCCTCCCTCGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAACGGGTGGAGCCCAAGTCCTGCGACAAAACCCACACCAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGTCCGTCCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGATGCTAGATGCCAGTCCGTTCTGACCCAGCCTCCTTCCGCCTCTGGCACATCCGGCCAGAGAGTGACCATCTCCTGCAGCGGCTCCAGCTCTAACATCGGCATCAATTTCGTGTACTGGTATCAGCACCTGCCAGGCACAGCTCCCAAGCTGCTGATCTACAAGAACAATCAGAGGCCTTCCGGCGTGCCAGACCGGTTCTCTGGCTCCAAGAGCGGCAACTCTGCCTCCCTGGCTATCTCCGGCCTGCGCAGCGAGGACGAGGCTGATTACTATTGCGCCGCTTGGGACGATAGCCTGTCTGGCTACGTGTTCGGCAGCGGCACAAAGGTGACCGTGCTGGGACAGCCAAAGGCTGCTCCTTCTGTGACACTGTTTCCCCCTTCCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAATAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTATCCTGGAGCTGTGACCGTGGCTTGGAAGGCTGATTCTTCCCCAGTGAAGGCTGGCGTGGAGACAACAACCCCCAGCAAGCAGTCTAACAATAAGTACGCCGCTAGCTCTTATCTGTCTCTGACCCCAGAGCAGTGGAAGTCCCATAGGTCCTATAGCTGTCANGTCACCCACGAAGGGAGCACAGTCGAAAAAACCGTCGCACCAACCGAGTGTTCCTGATAAGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGTACCAGCTGAGAGACTCACTATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGC
서열번호 58
DNA
호모 사피엔스
5’HA 645bp, Tim3 유전자좌
GTTAGGAGAGCCTCCCTTTGTTGATGAACAAGCAAGTAGCCCAGATGGGCGGGCCGTTTCCTGGCTGACCATGACTAATTTTCTGATTGTCTGTTTCCATCAGCCCTGTTCTCCCGTGTTCACAGAATTGGGCCACAATTCTCTCCTAGGGCAGTGTTTCTGAAAGTGAGGTTCTGAGACCAGCCACTTCAGCAACACTTGAGAACTTGTTAGAAATAAAAGTTCTCAGGCTCTACCACAGGCCAACTGAGTCAGGAACTCTAGCAGTTGAGCCCAGCAATCTGTGTTTTCGCAAGGCTTCCCAGTGATTCTGATGGCCTTCACATCTGAGAAGCATTGTCACAGCGAATCATCCTCCAAACAGGACTGCAGCAGTAGCTTCCTCTTTATTCTGTAAGACATGGCTTGCAGTTTTCCTGAAATGGAGTAACCTCACTCACCGCTTGAGTCTTGGCTCTCCTTCTCTCTCTATGCAGGGTCCTCAGAAGTGGAATACAGAGCGGAGGTCGGTCAGAATGCCTATCTGCCCTGCTTCTACACCCCAGCCGCCCCAGGGAACCTCGTGCCCGTCTGCTGGGGCAAAGGAGCCTGTCCTGTGTTTGAATGTGGCAACGTGGTGCTCAGGACTGATGAAAGGGATGTGAA
서열번호 59
DNA
호모 사피엔스
3’HA 600bp, Tim3 유전자좌
GGACATCCAGATACTGGCTTCTTGGGGATTTCCGCAAAGGAGATGTGTCCCTGACCATAGAGAATGTGACTCTAGCAGACAGTGGGATCTACTGCTGCCGGATCCAAATCCCAGGCATAATGAATGATGAAAAATTTAACCTGAAGTTGGTCATCAAACCAGGTGAGTGGACATTTGCATGCCATCTTTATGAATAAGATTTATCTGTGGATCATATTAAAGGTACTGATTGTTCTCATCTCTGACTTCCCTAATTATAGCCCTGGAGGAGGGCCACTAAGACCTAAAGTTTAACAGGCCCCATTGGTGATGCTCAGTGATATTTAACACCTTCTCTCTGTTTTAAAACTCATGGGTGTGCCTGGGCGTGGTGGCTCACACCTCTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCCGGTGGATCATGAGGTCAGGAATTCGAGACCAGCCTGGCCAACATAGTAAAACCTTGTCTCCACTAAAAATACAAAAAATTAGCCAGGCATGGTTACGGGAGCCTGTAATTCTAGCTACTTGGGGGGCTGAAGCAGGAGAATCACTTGAACCTGGGAGTCGGAGGTTGTGGTAAGCCAAGATCTCGCC
서열번호 60
DNA
호모 사피엔스
TIM-3 cas12a 표적 부위
GCCAGTATCTGGATGTCCAAT
서열번호 61
DNA
호모 사피엔스
공여자 DNA를 제조하기 위한 TIM3 정배향 프라이머
5’-p-TGGAATACAGAGCGGAGGTC
서열번호 62
DNA
호모 사피엔스
공여자 DNA를 제조하기 위한 TIM3 역배향 프라이머
mG*mC*mA*TGCAAATGTCCACTCAC
서열번호 63
DNA
인공
TIM3 공여자 DNA
TGGAATACAGAGCGGAGGTCGGTCAGAATGCCTATCTGCCCTGCTTCTACACCCCAGCCGCCCCAGGGAACCTCGTGCCCGTCTGCTGGGGCAAAGGAGCCTGTCCTGTGTTTGAATGTGGCAACGTGGTGCTCAGGACTGATGAAAGGGATGTGAAGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAGTGGAGCTGGGTGTTTCTGTTCTTCCTCTCCGTCACAACCGGCGTGCATAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGCGGCCTGGTGAAACCTGGCGGATCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCTAGCGGATTCACCTTCAGCGACGACTACATGAGCTGGATCAGGCAGGCTCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCTAGCGTGAGCAATGGCCGGCCCACAACCTACTATGCCGACTCCGTGCGGGGCAGGTTTACCATCTCCAGGGATAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAAGATACCGCCGTCTACTATTGCGCCAGGGAGGATTGGGGCGGCGAGTTCACAGACTGGGGAAGGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCCGGAGGCACCGCCGCCCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTCACCGTGTCCTGGAATAGCGGCGCCCTCACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCCGGACTGTACAGCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCTAGCTCCTCCCTCGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAACGGGTGGAGCCCAAGTCCTGCGACAAAACCCACACCAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGTCCGTCCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGATGCTAGATGCCAGTCCGTTCTGACCCAGCCTCCTTCCGCCTCTGGCACATCCGGCCAGAGAGTGACCATCTCCTGCAGCGGCTCCAGCTCTAACATCGGCATCAATTTCGTGTACTGGTATCAGCACCTGCCAGGCACAGCTCCCAAGCTGCTGATCTACAAGAACAATCAGAGGCCTTCCGGCGTGCCAGACCGGTTCTCTGGCTCCAAGAGCGGCAACTCTGCCTCCCTGGCTATCTCCGGCCTGCGCAGCGAGGACGAGGCTGATTACTATTGCGCCGCTTGGGACGATAGCCTGTCTGGCTACGTGTTCGGCAGCGGCACAAAGGTGACCGTGCTGGGACAGCCAAAGGCTGCTCCTTCTGTGACACTGTTTCCCCCTTCCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAATAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTATCCTGGAGCTGTGACCGTGGCTTGGAAGGCTGATTCTTCCCCAGTGAAGGCTGGCGTGGAGACAACAACCCCCAGCAAGCAGTCTAACAATAAGTACGCCGCTAGCTCTTATCTGTCTCTGACCCCAGAGCAGTGGAAGTCCCATAGGTCCTATAGCTGTCANGTCACCCACGAAGGGAGCACAGTCGAAAAAACCGTCGCACCAACCGAGTGTTCCTGATAAGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGGACATCCAGATACTGGCTTCTTGGGGATTTCCGCAAAGGAGATGTGTCCCTGACCATAGAGAATGTGACTCTAGCAGACAGTGGGATCTACTGCTGCCGGATCCAAATCCCAGGCATAATGAATGATGAAAAATTTAACCTGAAGTTGGTCATCAAACCAGGTGAGTGGACATTTGCATGC
서열번호 64
DNA
TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 5’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 정배향 프라이머
CTCCTGAATCCCTCTCACCA
서열번호 65
DNA
TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 5’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 역배향 프라이머
GCGGATCCAGCTCATGTAGT
서열번호 66
DNA
TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 3’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 정배향 프라이머
CGTTCTGGGTACTCGTGGTT
서열번호 67
DNA
TRAC 엑손 3 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 3’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 역배향 프라이머
GGAGCACAGGCTGTCTTACA
서열번호 68
DNA
PD-1 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 5’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 정배향 프라이머
GTGTGAGGCCATCCACAAG
서열번호 69
DNA
PD-1 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 5’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 역배향 프라이머
ACACACTTGCGACCCATTC
서열번호 70
DNA
PD-1 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 3’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 정배향 프라이머
CGTTCTGGGTACTCGTGGTT
서열번호 71
DNA
PD-1 유전자좌에서 항-CD38 CAR의 3’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 역배향 프라이머
GGGACTGTCTTAGGCTTGG
서열번호 72
DNA
TRAC 엑손 1 유전자좌에서 항-CD38 DAR의 5’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 정배향 프라이머
CCTGCTTTCTGAGGGTGAAG
서열번호 73
DNA
TRAC 엑손 1 유전자좌에서 항-CD38 DAR의 5’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 역배향 프라이머
CAGCTCATGTAGTCGTCGCT
서열번호 74
DNA
TRAC 엑손 1 유전자좌에서 항-CD38 DAR의 3’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 정배향 프라이머
GGAATGAAAGGGGAGAGGAG
서열번호 75
DNA
TRAC 엑손 1 유전자좌에서 항-CD38 DAR의 3’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 역배향 프라이머
GAGAGCCCTTCCCTGACTTT
서열번호 76
DNA
Cas12a 표적 부위에서 TRAC 엑손 1 유전자좌에서 항-CD38 DAR의 5’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 정배향 프라이머
CCTGCTTTCTGAGGGTGAAG
서열번호 77
DNA
Cas12a 표적 부위에서 TRAC 엑손 1 유전자좌에서 항-CD38 DAR의 5’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 역배향 프라이머
CAGCTCATGTAGTCGTCGCT
서열번호 78
DNA
Cas12a 표적 부위에서 TRAC 엑손 1 유전자좌에서 항-CD38 DAR의 3’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 정배향 프라이머
GGAATGAAAGGGGAGAGGAG
서열번호 79
DNA
TRAC 엑손 1 유전자좌에서 항-CD38 DAR의 3’ 상동성 아암에 걸친 서열분석을 위한 역배향 프라이머
GAGAGCCCTTCCCTGACTTT
서열번호 80
DNA
GM-CSF
cas12a 표적 부위
TACAGAATGAAACAGTAGAAG
서열번호 81
DNA
항-CD20 DAR 작제물
GAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAGTGGAGCTGGGTGTTTCTGTTCTTCCTCTCCGTCACAACCGGCGTGCATAGCCAAGTGCAATTGCAGCAGCCCGGTGCCGAACTCGTGAAACCAGGAGCAAGCGTAAAGATGTCCTGTAAGGCATCAGGTTATACCTTTACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAACAAACGCCGGGGCGGGGCCTCGAATGGATAGGCGCGATATATCCCGGAAATGGCGATACCAGTTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAAGCGACACTGACAGCTGATAAGTCTTCAAGCACCGCCTATATGCAACTTTCTAGCCTGACCAGCGAAGACTCCGCCGTTTATTACTGTGCTCGGTCCACATACTACGGAGGCGATTGGTACTTTAATGTGTGGGGTGCGGGCACCACTGTCACTGTATCAGCGGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCCGGAGGCACCGCCGCCCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTCACCGTGTCCTGGAATAGCGGCGCCCTCACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCCGGACTGTACAGCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCTAGCTCCTCCCTCGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAACGGGTGGAGCCCAAGTCCTGCGACAAAACCCACACCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGTCCGTCCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGATGCTAGATGCCAGATAGTCCTGAGCCAATCACCGGCCATCTTGTCTGCCTCTCCTGGCGAAAAGGTGACGATGACTTGCAGAGCCAGTAGCTCTGTAAGCTATATACACTGGTTCCAGCAAAAACCGGGCTCTTCTCCGAAGCCGTGGATATACGCAACTTCAAACCTGGCGTCTGGGGTTCCTGTAAGGTTTAGCGGCAGCGGTTCAGGCACGAGCTACAGCCTTACTATCTCCCGGGTTGAGGCTGAAGATGCAGCCACATACTACTGTCAGCAGTGGACTTCAAATCCACCTACATTCGGGGGAGGCACGAAGCTGGAGATTAAACGAACCGTTGCGGCGCCTAGTGTGTTCATATTCCCGCCGTCTGATGAACAACTCAAGTCTGGAACGGCAAGTGTGGTGTGTCTCCTGAATAATTTTTATCCTAGGGAAGCAAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCATTGCAAAGCGGTAACAGTCAAGAATCTGTAACTGAACAAGATTCTAAAGATTCTACCTACAGTCTCTCCTCCACATTGACCCTGTCAAAAGCAGATTATGAGAAGCACAAGGTGTACGCATGTGAGGTAACACATCAAGGACTCAGCAGCCCAGTTACAAAAAGTTTCAATCGCGGGGAATGTTGATAAGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
서열번호 82
DNA
공여자 DNA를 생성하기 위한 정배향 프라이머는 5’포스페이트를 포함한다
5’-p-ATCACGAGCAGCTGGTTTCT-3’
서열번호 83
DNA
5’상동성 아암, 항-CD20 DAR 작제물 및 3’상동성 아암을 포함하는 항-CD20 DAR 공여자 DNA
ATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGAGTGGAGCTGGGTGTTTCTGTTCTTCCTCTCCGTCACAACCGGCGTGCATAGCCAAGTGCAATTGCAGCAGCCCGGTGCCGAACTCGTGAAACCAGGAGCAAGCGTAAAGATGTCCTGTAAGGCATCAGGTTATACCTTTACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAACAAACGCCGGGGCGGGGCCTCGAATGGATAGGCGCGATATATCCCGGAAATGGCGATACCAGTTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAAGCGACACTGACAGCTGATAAGTCTTCAAGCACCGCCTATATGCAACTTTCTAGCCTGACCAGCGAAGACTCCGCCGTTTATTACTGTGCTCGGTCCACATACTACGGAGGCGATTGGTACTTTAATGTGTGGGGTGCGGGCACCACTGTCACTGTATCAGCGGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCCGGAGGCACCGCCGCCCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTCACCGTGTCCTGGAATAGCGGCGCCCTCACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCCGGACTGTACAGCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCTAGCTCCTCCCTCGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAACGGGTGGAGCCCAAGTCCTGCGACAAAACCCACACCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGTCCGTCCCTACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGATGCTAGATGCCAGATAGTCCTGAGCCAATCACCGGCCATCTTGTCTGCCTCTCCTGGCGAAAAGGTGACGATGACTTGCAGAGCCAGTAGCTCTGTAAGCTATATACACTGGTTCCAGCAAAAACCGGGCTCTTCTCCGAAGCCGTGGATATACGCAACTTCAAACCTGGCGTCTGGGGTTCCTGTAAGGTTTAGCGGCAGCGGTTCAGGCACGAGCTACAGCCTTACTATCTCCCGGGTTGAGGCTGAAGATGCAGCCACATACTACTGTCAGCAGTGGACTTCAAATCCACCTACATTCGGGGGAGGCACGAAGCTGGAGATTAAACGAACCGTTGCGGCGCCTAGTGTGTTCATATTCCCGCCGTCTGATGAACAACTCAAGTCTGGAACGGCAAGTGTGGTGTGTCTCCTGAATAATTTTTATCCTAGGGAAGCAAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCATTGCAAAGCGGTAACAGTCAAGAATCTGTAACTGAACAAGATTCTAAAGATTCTACCTACAGTCTCTCCTCCACATTGACCCTGTCAAAAGCAGATTATGAGAAGCACAAGGTGTACGCATGTGAGGTAACACATCAAGGACTCAGCAGCCCAGTTACAAAAAGTTTCAATCGCGGGGAATGTTGATAAGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGTACCAGCTGAGAGACTCACTATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGC
서열번호 84
DNA
항-CEA CAR 작제물
GAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTTCTGTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACTGGACATCCACCCGGCACACTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAATATAGCCTCTATCGGTCGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAGGTGGCTCAGGATCGGGTGGATCCGGCTCTGGTGGCTCAGGATCGGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGTGTTGTGCAACCTGGCCGGTCCCTGCGCCTGTCCTGCTCCGCATCTGGCTTCGATTTCACCACATATTGGATGAGTTGGGTGAGACAGGCACCTGGAAAAGGTCTTGAGTGGATTGGAGAAATTCATCCAGATAGCAGTACGATTAACTATGCGCCGTCTCTAAAGGATAGATTTACAATATCGCGAGACAACGCCAAGAACACATTGTTCCTGCAAATGGACAGCCTGAGACCCGAAGACACCGGGGTCTATTTTTGTGCAAGCCTTTACTTCGGCTTCCCCTGGTTTGCTTATTGGGGCCAAGGGACCCCGGTCACCGTCTCCAGTGCTAAGCCGACCACGACACCGGCTCCAAGACCTCCGACGCCAGCTCCAACGATAGCGTCACAGCCATTGTCTCTCCGCCCTGAAGCCTGCCGGCCCGCTGCGGGCGGCGCGGTTCATACCCGGGGATTGGACTTTGCCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTCGATCTAAGCGAAGCCGCTTGTTGCATTCTGACTACATGAATATGACGCCAAGACGGCCAGGGCCAACAAGAAAGCATTACCAACCGTACGCCCCCCCGCGAGACTTCGCGGCCTACCGCAGCAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCGCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
서열번호 85
DNA
5’ 상동성 아암, 항-CD20 DAR 작제물 및 3’ 상동성 아암을 포함하는 항-CD20 DAR 공여자 DNA
ATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACAGTAAGTCACTGACTGTCTATGCCTGGGAAAGGGTGGGCAGGAGATGGGGCAGTGCAGGAAAAGTGGCACTATGAACCCTGCAGCCCTAGGAATGCATCTAGACAATTGTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTCTCCTGACAGGCCTCGAGGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTTCTGTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACTGGACATCCACCCGGCACACTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAATATAGCCTCTATCGGTCGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAGGTGGCTCAGGATCGGGTGGATCCGGCTCTGGTGGCTCAGGATCGGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGTGTTGTGCAACCTGGCCGGTCCCTGCGCCTGTCCTGCTCCGCATCTGGCTTCGATTTCACCACATATTGGATGAGTTGGGTGAGACAGGCACCTGGAAAAGGTCTTGAGTGGATTGGAGAAATTCATCCAGATAGCAGTACGATTAACTATGCGCCGTCTCTAAAGGATAGATTTACAATATCGCGAGACAACGCCAAGAACACATTGTTCCTGCAAATGGACAGCCTGAGACCCGAAGACACCGGGGTCTATTTTTGTGCAAGCCTTTACTTCGGCTTCCCCTGGTTTGCTTATTGGGGCCAAGGGACCCCGGTCACCGTCTCCAGTGCTAAGCCGACCACGACACCGGCTCCAAGACCTCCGACGCCAGCTCCAACGATAGCGTCACAGCCATTGTCTCTCCGCCCTGAAGCCTGCCGGCCCGCTGCGGGCGGCGCGGTTCATACCCGGGGATTGGACTTTGCCCCCAGAAAGATAGAGGTGATGTACCCTCCCCCCTACTTGGACAACGAAAAGTCTAATGGCACTATCATTCACGTAAAGGGCAAACACCTTTGTCCAAGTCCTTTGTTCCCAGGCCCATCTAAGCCGTTCTGGGTACTCGTGGTTGTGGGGGGCGTGCTCGCTTGTTACTCACTGCTGGTGACGGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTTCGATCTAAGCGAAGCCGCTTGTTGCATTCTGACTACATGAATATGACGCCAAGACGGCCAGGGCCAACAAGAAAGCATTACCAACCGTACGCCCCCCCGCGAGACTTCGCGGCCTACCGCAGCAGGGTAAAATTTAGCAGGTCTGCAGATGCGCCTGCGTATCAACAGGGTCAGAATCAGCTCTATAATGAGCTGAACCTCGGGCGGCGGGAAGAGTATGATGTTCTCGATAAAAGGAGAGGACGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAACCGAGACGCAAAAATCCTCAGGAGGGGCTCTACAATGAACTTCAAAAAGACAAAATGGCCGAAGCATACTCAGAAATCGGAATGAAAGGGGAGAGGAGACGCGGGAAGGGCCATGATGGACTGTATCAGGGACTTTCCACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTCCACATGCAGGCGCTGCCGCCTAGATGATAAAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGTACCAGCTGAGAGACTCACTATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGC
서열번호 86
DNA
CD7 유전자좌 Cas12a 표적 부위
CTACGAGGACGGGGTGGTGCC
서열번호 87
DNA
CD7 유전자좌 Cas12a 대안적 표적 부위
CTTCTCAGAGGAACAGTCCCA
서열번호 88
DNA
CD7 유전자좌로의 삽입을 위한 공여자 단편을 생성하는 정배향 프라이머
mC*T*mG* mCAG GGA GGA CAT TCT CT
서열번호 89
DNA
CD7 유전자좌로의 삽입을 위한 공여자 단편을 생성하는 역배향 프라이머
5’-p-TTCCCTA CTGTCACCAGGA
서열번호 90
DNA
CD7 유전자좌 삽입을 위한 5’상동성 아암
CTGCAGGGAGGACATTCTCTGTCCTTCTGGCCAGACTGATGGTGACAGCCCAGGTCCTCCCCAGAGGTGCAGCAGTCTCCCCACTGCACGACTGTCCCCGTGGGAGCCTCCGTCAACATCACCTGCTCCACCAGCGGGGGCCTGCGTGGGATCTACCTGAGGCAGCTCGGGCCACAGCCCCAAGACATCATAGTCTACGAGGACGGGGTGGT
서열번호 91
DNA
CD7 유전자좌 삽입을 위한 3’ 상동성 아암
CTACGGACAGACGGTTCCGGGGCCGCATCGACTTCTCAGGGTCCCAGGACAACCTGACTATCACCATGCACCGCCTGCAGCTGTCGGACACTGGCACCTACACCTGCCAGGCCATCACGGAGGTCAATGTCTACGGCTCCGGCACCCTGGTCCTGGTGACAGGTAGGGAA
SEQUENCE LISTING <110> SORRENTO THERAPEUTICS, INC. <120> IMPROVED PROCESS FOR INTEGRATION OF DNA CONSTRUCTS USING RNA-GUIDED ENDONUCLEASES <130> 087735.0131 <140> PCT/US2020/022056 <141> 2020-03-11 <150> US 62/816,836 <151> 2019-03-11 <150> US 62/901,735 <151> 2019-09-17 <160> 91 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Target sequence in TRAC gene (exon 1) <400> 1 cagggttctg gatatctgt 19 <210> 2 <211> 2119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: anti-CD38 CAR Construct for insertion into TRAC locus <220> <221> misc_feature <223> includes the JeT promoter followed by a DNA sequence encoding CD8a leader peptide followed by anti-CD38 CAR (single chain variable fragment (scFv) specific for human CD38) <220> <221> misc_feature <223> followed by CD28 hinge-transmembrane-intracellular regions and CD3 zeta intracellular domain <400> 2 gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60 atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120 gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180 gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 240 ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 300 ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggaatg 360 gtcatgggtc tttctctttt ttctcagcgt gaccaccgga gtccactccc aggtagagca 420 gaaattgatc tctgaggaag acctgcaggt ccagttggtc gaaagtggcg gcggattggt 480 gaaaccaggc ggatctttga ggcttagttg cgcggcttcc ggatttacgt tcagtgatga 540 ctacatgagc tggataaggc aagcacctgg taagggcctg gaatgggtcg caagtgtgtc 600 taatggaagg cccactacct actatgctga ttccgtccgc ggacgcttta ctatttcaag 660 agataatgct aagaatagtc tgtacctgca gatgaacagt ctgcgcgcgg aagataccgc 720 agtatattac tgtgcacgag aggattgggg tggggagttc acggattggg gcaggggaac 780 tcttgtaacg gtgtctagcg gaggaggtgg gtcaggtgga ggtggcagtg gaggtggagg 840 ctctcaggcc ggcttgaccc aaccgccatc tgcgtcagga acatcaggcc agagggtgac 900 tatcagttgt tctggcagtt catccaatat tgggatcaat ttcgtgtact ggtatcagca 960 cctgccaggt accgcgccga agctgctgat ctataagaat aatcaacgcc catcaggcgt 1020 tccagatagg ttcagtggga gcaagtccgg aaactccgcg tcactcgcga tctcaggtct 1080 gcggtctgag gatgaagctg attattactg cgcggcgtgg gatgattctc tgtcaggcta 1140 cgtattcggt tcagggacta aggtaactgt gttggcgaaa ccgaccacga caccggctcc 1200 aagacctccg acgccagctc caacgatagc gtcacagcca ttgtctctcc gccctgaagc 1260 ctgccggccc gctgcgggcg gcgcggttca tacccgggga ttggactttg cccccagaaa 1320 gatagaggtg atgtaccctc ccccctactt ggacaacgaa aagtctaatg gcactatcat 1380 tcacgtaaag ggcaaacacc tttgtccaag tcctttgttc ccaggcccat ctaagccgtt 1440 ctgggtactc gtggttgtgg ggggcgtgct cgcttgttac tcactgctgg tgacggtggc 1500 ctttattatt ttctgggttc gatctaagcg aagccgcttg ttgcattctg actacatgaa 1560 tatgacgcca agacggccag ggccaacaag aaagcattac caaccgtacg cccccccgcg 1620 agacttcgcg gcctaccgca gcagggtaaa atttagcagg tctgcagatg cgcctgcgta 1680 tcaacagggt cagaatcagc tctataatga gctgaacctc gggcggcggg aagagtatga 1740 tgttctcgat aaaaggagag gacgagaccc cgaaatgggc ggcaaaccga gacgcaaaaa 1800 tcctcaggag gggctctaca atgaacttca aaaagacaaa atggccgaag catactcaga 1860 aatcggaatg aaaggggaga ggagacgcgg gaagggccat gatggactgt atcagggact 1920 ttccacggcc accaaggaca cctatgacgc tctccacatg caggcgctgc cgcctagatg 1980 ataaaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 2040 gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 2100 aactcatcaa tgtatctta 2119 <210> 3 <211> 195 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Jet promoter <400> 3 gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60 atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120 gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180 gatcgtcact tgaca 195 <210> 4 <211> 3429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: anti-CD38A2 CAR cassette with homology arms <400> 4 ggcaccatat tcattttgca ggtgaaattc ctgagatgta aggagctgct gtgacttgct 60 caaggcctta tatcgagtaa acggtagtgc tggggcttag acgcaggtgt tctgatttat 120 agttcaaaac ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta atgtgataga tttcccaact 180 taatgccaac ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc cagcctaagt tggggagacc 240 actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct ttttcccatg cctgccttta 300 ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc tattaaataa aagaataagc 360 agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt ggcaggccag gcctggccgt 420 gaacgttcac tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 480 tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 540 cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 600 ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 660 gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 720 atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 780 gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 840 gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 900 ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 960 ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggaatg 1020 gtcatgggtc tttctctttt ttctcagcgt gaccaccgga gtccactccc aggtagagca 1080 gaaattgatc tctgaggaag acctgcaggt ccagttggtc gaaagtggcg gcggattggt 1140 gaaaccaggc ggatctttga ggcttagttg cgcggcttcc ggatttacgt tcagtgatga 1200 ctacatgagc tggataaggc aagcacctgg taagggcctg gaatgggtcg caagtgtgtc 1260 taatggaagg cccactacct actatgctga ttccgtccgc ggacgcttta ctatttcaag 1320 agataatgct aagaatagtc tgtacctgca gatgaacagt ctgcgcgcgg aagataccgc 1380 agtatattac tgtgcacgag aggattgggg tggggagttc acggattggg gcaggggaac 1440 tcttgtaacg gtgtctagcg gaggaggtgg gtcaggtgga ggtggcagtg gaggtggagg 1500 ctctcaggcc ggcttgaccc aaccgccatc tgcgtcagga acatcaggcc agagggtgac 1560 tatcagttgt tctggcagtt catccaatat tgggatcaat ttcgtgtact ggtatcagca 1620 cctgccaggt accgcgccga agctgctgat ctataagaat aatcaacgcc catcaggcgt 1680 tccagatagg ttcagtggga gcaagtccgg aaactccgcg tcactcgcga tctcaggtct 1740 gcggtctgag gatgaagctg attattactg cgcggcgtgg gatgattctc tgtcaggcta 1800 cgtattcggt tcagggacta aggtaactgt gttggcgaaa ccgaccacga caccggctcc 1860 aagacctccg acgccagctc caacgatagc gtcacagcca ttgtctctcc gccctgaagc 1920 ctgccggccc gctgcgggcg gcgcggttca tacccgggga ttggactttg cccccagaaa 1980 gatagaggtg atgtaccctc ccccctactt ggacaacgaa aagtctaatg gcactatcat 2040 tcacgtaaag ggcaaacacc tttgtccaag tcctttgttc ccaggcccat ctaagccgtt 2100 ctgggtactc gtggttgtgg ggggcgtgct cgcttgttac tcactgctgg tgacggtggc 2160 ctttattatt ttctgggttc gatctaagcg aagccgcttg ttgcattctg actacatgaa 2220 tatgacgcca agacggccag ggccaacaag aaagcattac caaccgtacg cccccccgcg 2280 agacttcgcg gcctaccgca gcagggtaaa atttagcagg tctgcagatg cgcctgcgta 2340 tcaacagggt cagaatcagc tctataatga gctgaacctc gggcggcggg aagagtatga 2400 tgttctcgat aaaaggagag gacgagaccc cgaaatgggc ggcaaaccga gacgcaaaaa 2460 tcctcaggag gggctctaca atgaacttca aaaagacaaa atggccgaag catactcaga 2520 aatcggaatg aaaggggaga ggagacgcgg gaagggccat gatggactgt atcagggact 2580 ttccacggcc accaaggaca cctatgacgc tctccacatg caggcgctgc cgcctagatg 2640 ataaaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 2700 gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 2760 aactcatcaa tgtatcttag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 2820 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 2880 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc 2940 tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc 3000 aaacgccttc aacaacagca ttattccaga ggacaccttc ttccccagcc caggtaaggg 3060 cagctttggt gccttcgcag gctgtttcct tgcttcagga atggccaggt tctgcccaga 3120 gctctggtca atgatgtcta aaactcctct gattggtggt ctcggcctta tccattgcca 3180 ccaaaaccct ctttttacta agaaacagtg agccttgttc tggcagtcca gagaatgaca 3240 cgggaaaaaa gcagatgaag agaaggtggc aggagagggc acgtggccca gcctcagtct 3300 ctccaactga gttcctgcct gcctgccttt gctcagactg tttgcccctt actgctcttc 3360 taggcctcat tctaagcccc ttctccaagt tgcctctcct tatttctccc tgtctgccaa 3420 aaaatcttt 3429 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: primer for sequencing clones with anti-CD38 CAR-TRAC homology arms insert in pAAV-MCS vector <400> 5 cttaggctgg gcattagcag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: primer for sequencing clones with anti-CD38 CAR-TRAC homology arms insert in pAAV-MCS vector <400> 6 catggaatgg tcatgggtct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: primer for sequencing clones with anti-CD38 CAR-TRAC homology arms insert in pAAV-MCS vector <400> 7 ggctacgtat tcggttcagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Forward primer for generating donor DNA PCR fragment from pAAV anti-CD38 CAR-TRAC construct (660 & 650 HAs) <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(3) <223> 2'-O-methylated <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-O-methylated <400> 8 tggagctagg gcaccatatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Reverse primer for generating donor DNA PCR fragment from pAAV anti-CD38 CAR-TRAC construct (660 & 650 HAs), the 5'-most nucleoside (C) has a 5' phosphate <220> <221> misc_feature <223> 5' phosphate <400> 9 caacttggag aaggggctta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: PCR forward primer with homology to TRAC locus for verifying site-specific insertion of anti-CD38 CAR (upstream junction) <400> 10 cctgctttct gagggtgaag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: PCR reverse primer with homology to CAR construct for verifying site-specific insertion of anti-CD38 CAR (upstream junction) <400> 11 ctttcgacca actggacctg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: PCR forward primer with homology to CAR locus for verifying site-specific insertion of anti-CD38 CAR (downstream junction) <400> 12 cgttctgggt actcgtggtt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: PCR reverse primer with homology to TRAC locus (downstream junction) <400> 13 gagagccctt ccctgacttt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Forward primer for generating donor fragment with 300 nt HAs <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(3) <223> 2'-O-methylated <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-O-methylated <400> 14 ccatgcctgc ctttactctg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Reverse primer for generating donor fragment with 300 nt HAs, the 5'-most nucleoside (T) has a 5' phosphate <220> <221> misc_feature <223> 5' phosphate <400> 15 tcctgaagca aggaaacagc 20 <210> 16 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(375) <223> 5' homology arm, exon 1 TRAC gene <400> 16 ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat attgctgggg ttttgaagaa gatcctatta 60 aataaaagaa taagcagtat tattaagtag ccctgcattt caggtttcct tgagtggcag 120 gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa tcatggcctc ttggccaaga ttgatagctt 180 gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg agcagctggt ttctaagatg ctatttcccg 240 tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc ccacagagcc ccgcccttgt ccatcactgg 300 catctggact ccagcctggg ttggggcaaa gagggaaatg agatcatgtc ctaaccctga 360 tcctcttgtc ccaca 375 <210> 17 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> 3' homology arm, exon 1 TRAC gene <400> 17 gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 60 tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 120 gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 180 agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc 240 attattccag aggacacctt cttccccagc ccaggtaagg gcagctttgg tgccttcgca 300 ggctgtttcc ttgcttcagg a 321 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Forward primer for generating donor fragment with 150 nt HAs <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (3)..(5) <223> 2'-O-methylated <220> <221> modified_base <222> (4)..(5) <223> Phosphorothioate linkage <400> 18 atcacgagca gctggtttct 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Reverse primer for generating donor fragment with 150 nt HAs, the 5'-most nucleoside (G) has a 5' phosphate <220> <221> misc_feature <223> 5' phosphate <400> 19 gacctcatgt ctagcacagt tttg 24 <210> 20 <211> 171 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(171) <223> 5' 171 nt homology arm, exon 1 TRAC gene <400> 20 atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60 ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120 ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac a 171 <210> 21 <211> 161 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(161) <223> 3' 161 nt homology arm, exon 1 TRAC gene <400> 21 gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 60 tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 120 gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt c 161 <210> 22 <211> 2080 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: anti-CD19 CAR cassette including JeT promoter, intron, anti-CD19 CAR, SV40 sequence <400> 22 gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60 atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120 gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180 gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 240 ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 300 ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggaatg 360 gtcatgggtc tttctctttt ttctcagcgt gaccaccgga gtccactccg atatccagat 420 gacacagacc accagcagcc tgagcgccag cctgggcgac cgagtgacta tcagctgccg 480 ggcatcccag gatatttcta agtatctgaa ctggtaccag cagaagcccg acggcactgt 540 caaactgctg atctaccaca ccagtagact gcattcaggg gtgcctagca ggttctccgg 600 atctggcagt gggactgact actccctgac catctctaac ctggagcagg aagatattgc 660 cacctatttc tgccagcagg gcaatacact gccttacact tttggcgggg gaacaaagct 720 ggagatcact ggcggaggag gatctggagg aggaggaagt ggaggaggag gatcagaggt 780 gaaactgcag gaaagcggac caggactggt cgcaccttca cagagcctgt ccgtgacatg 840 tactgtctcc ggagtgtctc tgcccgatta cggcgtctct tggatccggc agccccctag 900 aaagggactg gagtggctgg gcgtgatctg gggaagtgaa actacctact ataatagtgc 960 tctgaaatca agactgacca tcattaagga caactctaaa agtcaggtgt ttctgaagat 1020 gaattccctg cagaccgacg atacagcaat ctactattgc gccaaacact actattacgg 1080 cgggagctat gccatggatt actgggggca gggaacttcc gtcaccgtga gcagcgctaa 1140 gccgaccacg acaccggctc caagacctcc gacgccagct ccaacgatag cgtcacagcc 1200 attgtctctc cgccctgaag cctgccggcc cgctgcgggc ggcgcggttc atacccgggg 1260 attggacttt gcccccagaa agatagaggt gatgtaccct cccccctact tggacaacga 1320 aaagtctaat ggcactatca ttcacgtaaa gggcaaacac ctttgtccaa gtcctttgtt 1380 cccaggccca tctaagccgt tctgggtact cgtggttgtg gggggcgtgc tcgcttgtta 1440 ctcactgctg gtgacggtgg cctttattat tttctgggtt cgatctaagc gaagccgctt 1500 gttgcattct gactacatga atatgacgcc aagacggcca gggccaacaa gaaagcatta 1560 ccaaccgtac gcccccccgc gagacttcgc ggcctaccgc agcagggtaa aatttagcag 1620 gtctgcagat gcgcctgcgt atcaacaggg tcagaatcag ctctataatg agctgaacct 1680 cgggcggcgg gaagagtatg atgttctcga taaaaggaga ggacgagacc ccgaaatggg 1740 cggcaaaccg agacgcaaaa atcctcagga ggggctctac aatgaacttc aaaaagacaa 1800 aatggccgaa gcatactcag aaatcggaat gaaaggggag aggagacgcg ggaagggcca 1860 tgatggactg tatcagggac tttccacagc caccaaggac acctatgacg ctctccacat 1920 gcaggcgctg ccgcctagat gataaaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 1980 atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 2040 attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 2080 <210> 23 <211> 2083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: anti-BCMA CAR construct including JeT promoter, intron, anti-BCMA CAR construct, SV40 sequence <220> <221> misc_feature <222> (1057)..(1057) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1098)..(1098) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1120)..(1120) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60 atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120 gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180 gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 240 ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 300 ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggagtg 360 gtcctgggtg ttcctgttct ttctgtccgt gaccaccggt gtccactctc aggtgcagct 420 ggtggagtct gggggaggct tggtaaagcc tggggggtcc cttagactct cctgtgcagc 480 ctctggattc acttccagta ccgcctggat gagctgggtc cgccaggctc cagggaaggg 540 gctggagtgg gttggccgta ttaaaagcaa aagtgatggt gggacaacag actacgctgc 600 acccgtgaaa ggcagattca ccatctcaag agatgattca aaaaacacgc tgtttctgca 660 aatgaacagc ctgaaaaccg aggacacagc cgtgtattac tgtgccaagg gaggcgggac 720 ctacggctac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tccggcggcg gcggcagcgg 780 tggcggtggc tcaggtggtg gtggttcttc ctatgtgctg actcagcctg cctccgtgtc 840 tgggtctcct ggacagtcag tcaccatctc ctgcactgga accagcagtg atggtggtgg 900 tcacacctat gtctcctggt accaacagca cccaggcaaa gcccccaaac tcatgattta 960 tgatgtcagt aatcggccct catgggtttc taatcgcttc tctggctcca agtctggcaa 1020 cacggcctcc ctgaccatct ctgggctcca ggctgangac gaggctgatt attactgcgg 1080 ctcatataca agcagcgnct cttatgtctt cggaactggn accaagctga ccgtcctggc 1140 taagcccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca 1200 gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag 1260 ggggctggac ttcgccccta ggaaaattga agttatgtat cctcctcctt acctagacaa 1320 tgagaagagc aatggaacca ttatccatgt gaaagggaaa cacctttgtc caagtcccct 1380 atttcccgga ccttctaagc ccttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg 1440 ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag 1500 gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca 1560 ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccagag tgaagttcag 1620 caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa 1680 tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat 1740 ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga 1800 taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg 1860 gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca 1920 catgcaggcc ctgccgccta gatgataaaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt 1980 ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 2040 tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc tta 2083 <210> 24 <211> 183 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(183) <223> 5' homology arm, TRAC gene exon 3, 183 nt <400> 24 tatgcacaga agctgcaagg gacaggaggt gcaggagctg caggcctccc ccacccagcc 60 tgctctgcct tggggaaaac cgtgggtgtg tcctgcaggc catgcaggcc tgggacatgc 120 aagcccataa ccgctgtggc ctcttggttt tacagatacg aacctaaact ttcaaaacct 180 gtc 183 <210> 25 <211> 140 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(140) <223> 3' homology arm, TRAC gene exon 3 <400> 25 agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg tttaatctgc tcatgacgct 60 gcggctgtgg tccagctgag gtgaggggcc ttgaagctgg gagtggggtt tagggacgcg 120 ggtctctggg tgcatcctaa 140 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Exon 3 target sequence (guide sequence) <400> 26 ttcggaaccc aatcactgac 20 <210> 27 <211> 2442 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Entire donor DNA anti-CD38 CAR plus exon 3 HAs on both ends <400> 27 tatgcacaga agctgcaagg gacaggaggt gcaggagctg caggcctccc ccacccagcc 60 tgctctgcct tggggaaaac cgtgggtgtg tcctgcaggc catgcaggcc tgggacatgc 120 aagcccataa ccgctgtggc ctcttggttt tacagatacg aacctaaact ttcaaaacct 180 gtcgaattcg ggcggagtta gggcggagcc aatcagcgtg cgccgttccg aaagttgcct 240 tttatggctg ggcggagaat gggcggtgaa cgccgatgat tatataagga cgcgccgggt 300 gtggcacagc tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc ggttcttgtt tgtggatccc 360 tgtgatcgtc acttgacagt aagtcactga ctgtctatgc ctgggaaagg gtgggcagga 420 gatggggcag tgcaggaaaa gtggcactat gaaccctgca gccctaggaa tgcatctaga 480 caattgtact aaccttcttc tctttcctct cctgacaggc ctcgaggccg ccaccatgga 540 atggtcatgg gtctttctct tttttctcag cgtgaccacc ggagtccact cccaggtaga 600 gcagaaattg atctctgagg aagacctgca ggtccagttg gtcgaaagtg gcggcggatt 660 ggtgaaacca ggcggatctt tgaggcttag ttgcgcggct tccggattta cgttcagtga 720 tgactacatg agctggataa ggcaagcacc tggtaagggc ctggaatggg tcgcaagtgt 780 gtctaatgga aggcccacta cctactatgc tgattccgtc cgcggacgct ttactatttc 840 aagagataat gctaagaata gtctgtacct gcagatgaac agtctgcgcg cggaagatac 900 cgcagtatat tactgtgcac gagaggattg gggtggggag ttcacggatt ggggcagggg 960 aactcttgta acggtgtcta gcggaggagg tgggtcaggt ggaggtggca gtggaggtgg 1020 aggctctcag gccggcttga cccaaccgcc atctgcgtca ggaacatcag gccagagggt 1080 gactatcagt tgttctggca gttcatccaa tattgggatc aatttcgtgt actggtatca 1140 gcacctgcca ggtaccgcgc cgaagctgct gatctataag aataatcaac gcccatcagg 1200 cgttccagat aggttcagtg ggagcaagtc cggaaactcc gcgtcactcg cgatctcagg 1260 tctgcggtct gaggatgaag ctgattatta ctgcgcggcg tgggatgatt ctctgtcagg 1320 ctacgtattc ggttcaggga ctaaggtaac tgtgttggcg aaaccgacca cgacaccggc 1380 tccaagacct ccgacgccag ctccaacgat agcgtcacag ccattgtctc tccgccctga 1440 agcctgccgg cccgctgcgg gcggcgcggt tcatacccgg ggattggact ttgcccccag 1500 aaagatagag gtgatgtacc ctccccccta cttggacaac gaaaagtcta atggcactat 1560 cattcacgta aagggcaaac acctttgtcc aagtcctttg ttcccaggcc catctaagcc 1620 gttctgggta ctcgtggttg tggggggcgt gctcgcttgt tactcactgc tggtgacggt 1680 ggcctttatt attttctggg ttcgatctaa gcgaagccgc ttgttgcatt ctgactacat 1740 gaatatgacg ccaagacggc cagggccaac aagaaagcat taccaaccgt acgccccccc 1800 gcgagacttc gcggcctacc gcagcagggt aaaatttagc aggtctgcag atgcgcctgc 1860 gtatcaacag ggtcagaatc agctctataa tgagctgaac ctcgggcggc gggaagagta 1920 tgatgttctc gataaaagga gaggacgaga ccccgaaatg ggcggcaaac cgagacgcaa 1980 aaatcctcag gaggggctct acaatgaact tcaaaaagac aaaatggccg aagcatactc 2040 agaaatcgga atgaaagggg agaggagacg cgggaagggc catgatggac tgtatcaggg 2100 actttccacg gccaccaagg acacctatga cgctctccac atgcaggcgc tgccgcctag 2160 atgataaaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 2220 atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 2280 ccaaactcat caatgtatct taagtgattg ggttccgaat cctcctcctg aaagtggccg 2340 ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg aggtgagggg ccttgaagct 2400 gggagtgggg tttagggacg cgggtctctg ggtgcatcct aa 2442 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Forward primer for generating donor fragment of SEQ ID NO:27 <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-O-methylated <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (4)..(5) <223> 2'-O-methylated <400> 28 tatgccacag aagctgcaag g 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Reverse primer for generating donor fragment of SEQ ID NO:27, the 5'-most nucleoside (T) has a 5' phosphate <220> <221> misc_feature <223> 5' phosphate <400> 29 ttaggatgca cccagagacc 20 <210> 30 <211> 326 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(326) <223> DNA PD-1 locus 5' HA <400> 30 ctccccatct cctctgtctc cctgtctctg tctctctctc cctcccccac cctctcccca 60 gtcctacccc ctcctcaccc ctcctccccc agcactgcct ctgtcactct cgcccacgtg 120 gatgtggagg aagagggggc gggagcaagg ggcgggcacc ctcccttcaa cctgacctgg 180 gacagtttcc cttccgctca cctccgcctg agcagtggag aaggcggcac tctggtgggg 240 ctgctccagg catgcagatc ccacaggcgc cctggccagt cgtctgggcg gtgctacaac 300 tgggctggcg gccaggatgg ttctta 326 <210> 31 <211> 380 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(380) <223> DNA PD-1 locus 3' HA <400> 31 ggtaggtggg gtcggcggtc aggtgtccca gagccagggg tctggaggga ccttccaccc 60 tcagtccctg gcaggtcggg gggtgctgag gcgggcctgg ccctggcagc ccaggggtcc 120 cggagcgagg ggtctggagg gacctttcac tctcagtccc tggcaggtcg gggggtgctg 180 tggcaggccc agccttggcc cccagctctg ccccttaccc tgagctgtgt ggctttgggc 240 agctcgaact cctgggttcc tctctgggcc ccaactcctc ccctggccca agtcccctct 300 ttgctcctgg gcaggcagga cctctgtccc ctctcagccg gtccttgggg ctgcgtgttt 360 ctgtagaatg acgggtcagg 380 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> PD-1 target site <400> 32 ggccaggatg gttcttaggt 20 <210> 33 <211> 2825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Donor DNA fragment having CD38 cassette (SEQ ID NO:2) flanked by PD-1 Has <400> 33 ctccccatct cctctgtctc cctgtctctg tctctctctc cctcccccac cctctcccca 60 gtcctacccc ctcctcaccc ctcctccccc agcactgcct ctgtcactct cgcccacgtg 120 gatgtggagg aagagggggc gggagcaagg ggcgggcacc ctcccttcaa cctgacctgg 180 gacagtttcc cttccgctca cctccgcctg agcagtggag aaggcggcac tctggtgggg 240 ctgctccagg catgcagatc ccacaggcgc cctggccagt cgtctgggcg gtgctacaac 300 tgggctggcg gccaggatgg ttcttagaat tcgggcggag ttagggcgga gccaatcagc 360 gtgcgccgtt ccgaaagttg ccttttatgg ctgggcggag aatgggcggt gaacgccgat 420 gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt 480 cgcggttctt gtttgtggat ccctgtgatc gtcacttgac agtaagtcac tgactgtcta 540 tgcctgggaa agggtgggca ggagatgggg cagtgcagga aaagtggcac tatgaaccct 600 gcagccctag gaatgcatct agacaattgt actaaccttc ttctctttcc tctcctgaca 660 ggcctcgagg ccgccaccat ggaatggtca tgggtctttc tcttttttct cagcgtgacc 720 accggagtcc actcccaggt agagcagaaa ttgatctctg aggaagacct gcaggtccag 780 ttggtcgaaa gtggcggcgg attggtgaaa ccaggcggat ctttgaggct tagttgcgcg 840 gcttccggat ttacgttcag tgatgactac atgagctgga taaggcaagc acctggtaag 900 ggcctggaat gggtcgcaag tgtgtctaat ggaaggccca ctacctacta tgctgattcc 960 gtccgcggac gctttactat ttcaagagat aatgctaaga atagtctgta cctgcagatg 1020 aacagtctgc gcgcggaaga taccgcagta tattactgtg cacgagagga ttggggtggg 1080 gagttcacgg attggggcag gggaactctt gtaacggtgt ctagcggagg aggtgggtca 1140 ggtggaggtg gcagtggagg tggaggctct caggccggct tgacccaacc gccatctgcg 1200 tcaggaacat caggccagag ggtgactatc agttgttctg gcagttcatc caatattggg 1260 atcaatttcg tgtactggta tcagcacctg ccaggtaccg cgccgaagct gctgatctat 1320 aagaataatc aacgcccatc aggcgttcca gataggttca gtgggagcaa gtccggaaac 1380 tccgcgtcac tcgcgatctc aggtctgcgg tctgaggatg aagctgatta ttactgcgcg 1440 gcgtgggatg attctctgtc aggctacgta ttcggttcag ggactaaggt aactgtgttg 1500 gcgaaaccga ccacgacacc ggctccaaga cctccgacgc cagctccaac gatagcgtca 1560 cagccattgt ctctccgccc tgaagcctgc cggcccgctg cgggcggcgc ggttcatacc 1620 cggggattgg actttgcccc cagaaagata gaggtgatgt accctccccc ctacttggac 1680 aacgaaaagt ctaatggcac tatcattcac gtaaagggca aacacctttg tccaagtcct 1740 ttgttcccag gcccatctaa gccgttctgg gtactcgtgg ttgtgggggg cgtgctcgct 1800 tgttactcac tgctggtgac ggtggccttt attattttct gggttcgatc taagcgaagc 1860 cgcttgttgc attctgacta catgaatatg acgccaagac ggccagggcc aacaagaaag 1920 cattaccaac cgtacgcccc cccgcgagac ttcgcggcct accgcagcag ggtaaaattt 1980 agcaggtctg cagatgcgcc tgcgtatcaa cagggtcaga atcagctcta taatgagctg 2040 aacctcgggc ggcgggaaga gtatgatgtt ctcgataaaa ggagaggacg agaccccgaa 2100 atgggcggca aaccgagacg caaaaatcct caggaggggc tctacaatga acttcaaaaa 2160 gacaaaatgg ccgaagcata ctcagaaatc ggaatgaaag gggagaggag acgcgggaag 2220 ggccatgatg gactgtatca gggactttcc acggccacca aggacaccta tgacgctctc 2280 cacatgcagg cgctgccgcc tagatgataa aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc 2340 ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 2400 actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttaggtag gtggggtcgg 2460 cggtcaggtg tcccagagcc aggggtctgg agggaccttc caccctcagt ccctggcagg 2520 tcggggggtg ctgaggcggg cctggccctg gcagcccagg ggtcccggag cgaggggtct 2580 ggagggacct ttcactctca gtccctggca ggtcgggggg tgctgtggca ggcccagcct 2640 tggcccccag ctctgcccct taccctgagc tgtgtggctt tgggcagctc gaactcctgg 2700 gttcctctct gggccccaac tcctcccctg gcccaagtcc cctctttgct cctgggcagg 2760 caggacctct gtcccctctc agccggtcct tggggctgcg tgtttctgta gaatgacggg 2820 tcagg 2825 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Forward primer for generating donor fragment of SEQ ID NO:33, the 5'-most nucleoside (C) has a 5' phosphate <220> <221> misc_feature <223> 5' phosphate <400> 34 ctccccatct cctctgtctc 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Reverse primer for generating donor fragment of SEQ ID NO:33, Phosphorothioate linkage between first and second, second and third, and third and fourth nucleosides; C at position 1, C at position 2, and G at position 4 are 2'-O-methylated <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> 2'-O-methylated <220> <221> modified_base <222> (2)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-O-methylated <400> 35 cctggacccg tcattctaca g 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Forward primer for generating donor DNA PCR fragment from pAAV anti-CD38 CAR-TRAC construct (660 & 650 HAs) <400> 36 tggagctagg gcaccatatt 20 <210> 37 <211> 2415 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: anti-BCMA CAR construct donor fragment sequence, including JeT promoter, intron, anti-BCMA CAR construct, SV40 sequence, with 5' and 3' TRAC gene exon 1 homology arms <220> <221> misc_feature <222> (1228)..(1228) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1269)..(1269) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1291)..(1291) <223> n is a, c, g, or t <400> 37 atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60 ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120 ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agaattcggg 180 cggagttagg gcggagccaa tcagcgtgcg ccgttccgaa agttgccttt tatggctggg 240 cggagaatgg gcggtgaacg ccgatgatta tataaggacg cgccgggtgt ggcacagcta 300 gttccgtcgc agccgggatt tgggtcgcgg ttcttgtttg tggatccctg tgatcgtcac 360 ttgacagtaa gtcactgact gtctatgcct gggaaagggt gggcaggaga tggggcagtg 420 caggaaaagt ggcactatga accctgcagc cctaggaatg catctagaca attgtactaa 480 ccttcttctc tttcctctcc tgacaggcct cgaggccgcc accatggagt ggtcctgggt 540 gttcctgttc tttctgtccg tgaccaccgg tgtccactct caggtgcagc tggtggagtc 600 tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc tcctgtgcag cctctggatt 660 cacttccagt accgcctgga tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg 720 ggttggccgt attaaaagca aaagtgatgg tgggacaaca gactacgctg cacccgtgaa 780 aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg ctgtttctgc aaatgaacag 840 cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtgccaag ggaggcggga cctacggcta 900 ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctccggcggc ggcggcagcg gtggcggtgg 960 ctcaggtggt ggtggttctt cctatgtgct gactcagcct gcctccgtgt ctgggtctcc 1020 tggacagtca gtcaccatct cctgcactgg aaccagcagt gatggtggtg gtcacaccta 1080 tgtctcctgg taccaacagc acccaggcaa agcccccaaa ctcatgattt atgatgtcag 1140 taatcggccc tcatgggttt ctaatcgctt ctctggctcc aagtctggca acacggcctc 1200 cctgaccatc tctgggctcc aggctganga cgaggctgat tattactgcg gctcatatac 1260 aagcagcgnc tcttatgtct tcggaactgg naccaagctg accgtcctgg ctaagcccac 1320 cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc 1380 cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga 1440 cttcgcccct aggaaaattg aagttatgta tcctcctcct tacctagaca atgagaagag 1500 caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg 1560 accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt 1620 gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca 1680 cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc 1740 ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc 1800 agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg 1860 aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa 1920 gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc 1980 ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg 2040 cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc 2100 cctgccgcct agatgataaa attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt 2160 acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 2220 gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttagatatc cagaaccctg accctgccgt 2280 gtaccagctg agagactcta aatccagtga caagtctgtc tgcctattca ccgattttga 2340 ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg tatatcacag acaaaactgt 2400 gctagacatg aggtc 2415 <210> 38 <211> 2217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: anti-CD19 CAR cassette including JeT promoter, intron, anti-CD19 CAR, SV40 sequence flanked by 5' and 3' TRAC gene exon 1 homology arms of SEQ ID NO:20 and SEQ ID NO:21 <400> 38 atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60 ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120 ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agtaagtcac 180 tgactgtcta tgcctgggaa agggtgggca ggagatgggg cagtgcagga aaagtggcac 240 tatgaaccct gcagccctag gaatgcatct agacaattgt actaaccttc ttctctttcc 300 tctcctgaca ggcctcgagg ccgccaccat ggaatggtca tgggtctttc tcttttttct 360 cagcgtgacc accggagtcc actccgatat ccagatgaca cagaccacca gcagcctgag 420 cgccagcctg ggcgaccgag tgactatcag ctgccgggca tcccaggata tttctaagta 480 tctgaactgg taccagcaga agcccgacgg cactgtcaaa ctgctgatct accacaccag 540 tagactgcat tcaggggtgc ctagcaggtt ctccggatct ggcagtggga ctgactactc 600 cctgaccatc tctaacctgg agcaggaaga tattgccacc tatttctgcc agcagggcaa 660 tacactgcct tacacttttg gcgggggaac aaagctggag atcactggcg gaggaggatc 720 tggaggagga ggaagtggag gaggaggatc agaggtgaaa ctgcaggaaa gcggaccagg 780 actggtcgca ccttcacaga gcctgtccgt gacatgtact gtctccggag tgtctctgcc 840 cgattacggc gtctcttgga tccggcagcc ccctagaaag ggactggagt ggctgggcgt 900 gatctgggga agtgaaacta cctactataa tagtgctctg aaatcaagac tgaccatcat 960 taaggacaac tctaaaagtc aggtgtttct gaagatgaat tccctgcaga ccgacgatac 1020 agcaatctac tattgcgcca aacactacta ttacggcggg agctatgcca tggattactg 1080 ggggcaggga acttccgtca ccgtgagcag cgctaagccg accacgacac cggctccaag 1140 acctccgacg ccagctccaa cgatagcgtc acagccattg tctctccgcc ctgaagcctg 1200 ccggcccgct gcgggcggcg cggttcatac ccggggattg gactttgccc ccagaaagat 1260 agaggtgatg taccctcccc cctacttgga caacgaaaag tctaatggca ctatcattca 1320 cgtaaagggc aaacaccttt gtccaagtcc tttgttccca ggcccatcta agccgttctg 1380 ggtactcgtg gttgtggggg gcgtgctcgc ttgttactca ctgctggtga cggtggcctt 1440 tattattttc tgggttcgat ctaagcgaag ccgcttgttg cattctgact acatgaatat 1500 gacgccaaga cggccagggc caacaagaaa gcattaccaa ccgtacgccc ccccgcgaga 1560 cttcgcggcc taccgcagca gggtaaaatt tagcaggtct gcagatgcgc ctgcgtatca 1620 acagggtcag aatcagctct ataatgagct gaacctcggg cggcgggaag agtatgatgt 1680 tctcgataaa aggagaggac gagaccccga aatgggcggc aaaccgagac gcaaaaatcc 1740 tcaggagggg ctctacaatg aacttcaaaa agacaaaatg gccgaagcat actcagaaat 1800 cggaatgaaa ggggagagga gacgcgggaa gggccatgat ggactgtatc agggactttc 1860 cacagccacc aaggacacct atgacgctct ccacatgcag gcgctgccgc ctagatgata 1920 aaattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 1980 tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 2040 tcatcaatgt atcttagata tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc 2100 taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt gattctcaaa caaatgtgtc 2160 acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact gtgctagaca tgaggtc 2217 <210> 39 <211> 1001 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequenced PCR product of 5' end of donor DNA plus adjacent TRAC gene exon 1 genomic sequence that included portion of anti-CD38 CAR construct and 660 nt homology arm <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (790)..(792) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (925)..(925) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (931)..(931) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (933)..(934) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1001)..(1001) <223> n is a, c, g, or t <400> 39 nnnnnnnnnn nnnnngcnng actcactagc actctatcac ggccatattc tggcagggtc 60 agtggctcca actaacattt gtttggtact ttacagttta ttaaatagat gtttatatgg 120 agaagctctc atttctttct cagaagagcc tggctaggaa ggtggatgag gcaccatatt 180 cattttgcag gtgaaattcc tgagatgtaa ggagctgctg tgacttgctc aaggccttat 240 atcgagtaaa cggtagcgct ggggcttaga cgcaggtgtt ctgatttata gttcaaaacc 300 tctatcaatg agagagcaat ctcctggtaa tgtgatagat ttcccaactt aatgccaaca 360 taccataaac ctcccattct gctaatgccc agcctaagtt ggggagacca ctccagattc 420 caagatgtac agtttgcttt gctgggcctt tttcccatgc ctgcctttac tctgccagag 480 ttatattgct ggggttttga agaagatcct attaaataaa agaataagca gtattattaa 540 gtagccctgc atttcaggtt tccttgagtg gcaggccagg cctggccgtg aacgttcact 600 gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat 660 cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc 720 agccccacag agccccgccc ttgtccatca ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg 780 caaagagggn nngagatcat gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga attcgggcgg 840 agttagggcg gagccaatca gcgtgcgccg ttccgaaagt tgccttttat ggctgggcgg 900 agaatgggcg gtgaacgccg atgantatat nannacgcgc cgggtgtggc acagctagtt 960 ccgtcgcagc cgggatttgg gtcgcggttc ttgtttgtgg n 1001 <210> 40 <211> 1015 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequenced PCR product of 3' end of donor DNA plus adjacent TRAC gene exon 1 genomic sequence that included portion of anti-CD38 CAR construct and 650 nt homology arm <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (988)..(988) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 nnnnnnnnnn nnnnnnttct gctctacctg ggagtggact ccggtggtca cgctgagaaa 60 aaagagaaag acccatgacc attccatggt ggcggcctcg aggcctgtca ggagaggaaa 120 gagaagaagg ttagtacaat tgtctagatg cattcctagg gctgcagggt tcatagtgcc 180 acttttcctg cactgcccca tctcctgccc accctttccc aggcatagac agtcagtgac 240 ttactgtcaa gtgacgatca cagggatcca caaacaagaa ccgcgaccca aatcccggct 300 gcgacggaac tagctgtgcc acacccggcg cgtccttata taatcatcgg cgttcaccgc 360 ccattctccg cccagccata aaaggcaact ttcggaacgg cgcacgctga ttggctccgc 420 cctaactccg cccgaattct gtgggacaag aggatcaggg ttaggacatg atctcatttc 480 cctctttgcc ccaacccagg ctggagtcca gatgccagtg atggacaagg gcggggctct 540 gtggggctgg caagtcacgg tctcatgctt tatacgggaa atagcatctt agaaaccagc 600 tgctcgtgat ggactgggac tcagggacag gcacaagcta tcaatcttgg ccaagaggcc 660 atgatttcag tgaacgttca cggccaggcc tggcctgcca ctcaaggaaa cctgaaatgc 720 agggctactt aataatactg cttattcttt tatttaatag gatcttcttc aaaaccccag 780 caatataact ctggcagagt aaaggcaggc atgggaaaaa ggcccagcaa agcaaactgt 840 acatcttgga atctggagtg gtctccccaa cttaggctgg gcattagcag aatgggaggt 900 ttatggtatg ttggcattaa gttgggaaat ctatcacatt accaggagat tgctctctca 960 ttgatagagg ttttgaacta taaatcanaa cacctgcgtc taagccccag cgcta 1015 <210> 41 <211> 1035 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequenced PCR product of 5' end of donor DNA plus adjacent TRAC gene exon 3 genomic sequence that included portion of the anti-CD38 CAR construct and 660 nt homology arm Exon3 5HA F sequence results <220> <221> misc_feature <222> (2)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1030)..(1030) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1032)..(1035) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nctttgagga ngagtttcta gcttcaatag accaaggact 60 ctctcctagg cctctgtatt cctttcaaca gctccactgt caagagagcc agagagagct 120 tctgggtggc ccagctgtga aatttctgag tcccttaggg atagccctaa acgaaccaga 180 tcatcctgag gacagccaag aggttttgcc ttctttcaag acaagcaaca gtactcacat 240 aggctgtggg caatggtcct gtctctcaag aatcccctgc cactcctcac acccaccctg 300 ggcccatatt catttccatt tgagttgttc ttattgagtc atccttcctg tggtagcgga 360 actcactaag gggcccatct ggacccgagg tattgtgatg ataaattctg agcacctacc 420 ccatccccag aagggctcag aaataaaata agagccaagt ctagtcggtg tttcctgtct 480 tgaaacacaa tactgttggc cctggaagaa tgcacagaat ctgtttgtaa ggggatatgc 540 acagaagctg caagggacag gaggtgcagg agctgcaggc ctcccccacc cagcctgctc 600 tgccttgggg aaaaccgtgg gtgtgtcctg caggccatgc aggcctggga catgcaagcc 660 cataaccgct gtggcctctt ggttttacag atacgaacct aaactttcaa aacctgtcga 720 attcgggcgg agttagggcg gagccaatca gcgtgcgccg ttccgaaagt tgccttttat 780 ggctgggcgg agaatgggcg gtgaacgccg atgattatat aaggacgcgc cgggtgtggc 840 acagctagtt ccgtcgcagc cgggatttgg gtcgcggttc ttgtttgtgg atccctgtga 900 tcgtcacttg acagtaagtc actgactgtc tatgcctggg aaagggtggg caggagatgg 960 ggcagtgcag gaaaagtggc actatgaacc ctgcagccct aggaatgcat ctagacaatt 1020 gtactaaccn tnnnn 1035 <210> 42 <211> 1030 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequenced PCR product of 3' end of donor DNA plus adjacent genomic TRAC gene exon 3 sequence that included portion of the anti-CD38 CAR construct and 650 nt homology arm <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (952)..(952) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1007)..(1007) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1030)..(1030) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 nnnnnnnnnn nnnnnnnngc tgcacaggag agtctcaggg accctccagg cttgaccaag 60 cctcccccag actccaccag ctgcacctga gagtggacac cggtggtcac ggacagaaag 120 aacaggaaca cccaggacca ctccatggtg gcggcctcga ggcctgtcag gagaggaaag 180 agaagaaggt tagtacaatt gtctagatgc attcctaggg ctgcagggtt catagtgcca 240 cttttcctgc actgccccat ctcctgccca ccctttccca ggcatagaca gtcagtgact 300 tactgtcaag tgacgatcac agggatccac aaacaagaac cgcgacccaa atcccggctg 360 cgacggaact agctgtgcca cacccggcgc gtccttatat aatcatcggc gttcaccgcc 420 cattctccgc ccagccataa aaggcaactt tcggaacggc gcacgctgat tggctccgcc 480 ctaactccgc ccgaattcga caggttttga aagtttaggt tcgtatctgt aaaaccaaga 540 ggccacagcg gttatgggct tgcatgtccc aggcctgcat ggcctgcagg acacacccac 600 ggttttcccc aaggcagagc aggctgggtg ggggaggcct gcagctcctg cacctcctgt 660 cccttgcagc ttctgtgcat atccccttac aaacagattc tgtgcattct tccagggcca 720 acagtattgt gtttcaagac aggaaacacc gactagactt ggctcttatt ttatttctga 780 gcccttctgg ggatggggta ggtgctcaga atttatcatc acaatacctc gggtccagat 840 gggcccctta gtgagttccg ctaccacagg aaggatgact caataagaac aactcaaatg 900 gaaatgaata tgggcccagg gtgggtgtga ggagtggcag gggattcttg anagacagga 960 ccattgccca cagcctatgt gagtactgtt gcttgtcttg aaagaangca aaacctcttg 1020 gctgtcctcn 1030 <210> 43 <211> 1015 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Sequenced PCR product of 3' end of donor DNA plus adjacent PD-1 genomic sequence that included portion of the anti-CD38 CAR construct and 660 nt homology arm <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (925)..(926) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (930)..(930) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (935)..(936) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (943)..(943) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (947)..(947) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (960)..(961) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (971)..(971) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (974)..(976) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (978)..(978) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (983)..(985) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (990)..(991) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (999)..(999) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1012)..(1013) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1015)..(1015) <223> n is a, c, g, or t <400> 43 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt cntgctggtg anggtggcct ttattatttt ctgggttcga 60 tctaagcgaa gccgcttgtt gcattctgac tacatgaata tgacgccaag acggccaggg 120 ccaacaagaa agcattacca accgtacgcc cccccgcgag actacgcggc ctaccgcagc 180 agggtaaaat ttagcaggtc tgcagatgcg cctgcgtatc aacagggtca gaatcagctc 240 tataatgagc tgaacctcgg gcggcgggaa gagtatgatg ttctcgataa aaggagagga 300 cgagaccccg aaatgggcgg caaaccgaga cgcaaaaatc ctcaggaggg gctctacaat 360 gaacttcaaa aagacaaaat ggccgaagca tactcagaaa tcggaatgaa aggggagagg 420 agacgcggga agggccatga tggactgtat cagggacttt ccacagccac caaggacacc 480 tatgacgctc tccacatgca ggcgctgccg cctagatgat aaaattgttg ttgttaactt 540 gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 600 agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttaggt 660 aggtggggtc ggcggtcagg tgtcccagag ccaggggtct ggagggacct tccaccctca 720 gtccctggca ggtcgggggg tgctgaggcg ggcctggccc tggcagccca ggggtcccgg 780 agcgaggggt ctggagggac ctttcactct cagtccctgg caggtcgggg ggtgctgtgg 840 caggcccagc cttggccccc agctctgccc cttaccctga gctgtgtggc tttgggcagc 900 tcaaactcct gggttcctct ctggnncccn actcnncccc tgncccnagt cccctctttn 960 ntcctgggca ngcnnnanct ctnnnccctn ncagccggnc cttggggctg cnngn 1015 <210> 44 <211> 660 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(660) <223> 5' homology arm from exon 1 of TRAC gene, 660 nt <400> 44 ggcaccatat tcattttgca ggtgaaattc ctgagatgta aggagctgct gtgacttgct 60 caaggcctta tatcgagtaa acggtagtgc tggggcttag acgcaggtgt tctgatttat 120 agttcaaaac ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta atgtgataga tttcccaact 180 taatgccaac ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc cagcctaagt tggggagacc 240 actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct ttttcccatg cctgccttta 300 ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc tattaaataa aagaataagc 360 agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt ggcaggccag gcctggccgt 420 gaacgttcac tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 480 tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 540 cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 600 ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 660 <210> 45 <211> 650 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(650) <223> 3' homology arm from exon 1 of TRAC gene, 650 nt <400> 45 gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 60 tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 120 gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 180 agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc 240 attattccag aggacacctt cttccccagc ccaggtaagg gcagctttgg tgccttcgca 300 ggctgtttcc ttgcttcagg aatggccagg ttctgcccag agctctggtc aatgatgtct 360 aaaactcctc tgattggtgg tctcggcctt atccattgcc accaaaaccc tctttttact 420 aagaaacagt gagccttgtt ctggcagtcc agagaatgac acgggaaaaa agcagatgaa 480 gagaaggtgg caggagaggg cacgtggccc agcctcagtc tctccaactg agttcctgcc 540 tgcctgcctt tgctcagact gtttgcccct tactgctctt ctaggcctca ttctaagccc 600 cttctccaag ttgcctctcc ttatttctcc ctgtctgcca aaaaatcttt 650 <210> 46 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Encodes T2A peptide sequence of Thosea asigna virus <400> 46 ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60 cct 63 <210> 47 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: SV40 polyA addition sequence <400> 47 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120 ta 122 <210> 48 <211> 2652 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CD38 DAR insert 2652 nt <220> <221> misc_feature <222> (2467)..(2467) <223> n is a, c, g, or t <400> 48 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ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 2580 aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 2640 caatgtatct ta 2652 <210> 49 <211> 2984 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CD38 DAR insert 2652 nt flanked by 5' 171 nt and 3' 161 nt TRAC exon 1 homology arms <220> <221> misc_feature <222> (2638)..(2638) <223> n is a, c, g, or t <400> 49 atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60 ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120 ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agaattcggg 180 cggagttagg gcggagccaa tcagcgtgcg ccgttccgaa agttgccttt tatggctggg 240 cggagaatgg gcggtgaacg ccgatgatta tataaggacg cgccgggtgt ggcacagcta 300 gttccgtcgc agccgggatt tgggtcgcgg ttcttgtttg tggatccctg tgatcgtcac 360 ttgacagtaa gtcactgact gtctatgcct gggaaagggt gggcaggaga tggggcagtg 420 caggaaaagt ggcactatga accctgcagc cctaggaatg catctagaca attgtactaa 480 ccttcttctc tttcctctcc tgacaggcct cgaggccgcc accatggagt 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1380 ctgggtactc gtggttgtgg ggggcgtgct cgcttgttac tcactgctgg tgacggtggc 1440 ctttattatt ttctgggtta aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc 1500 atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga 1560 agaagaagaa ggaggatgtg aactgagggt aaaatttagc aggtctgcag atgcgcctgc 1620 gtatcaacag ggtcagaatc agctctataa tgagctgaac ctcgggcggc gggaagagta 1680 tgatgttctc gataaaagga gaggacgaga ccccgaaatg ggcggcaaac cgagacgcaa 1740 aaatcctcag gaggggctct acaatgaact tcaaaaagac aaaatggccg aagcatactc 1800 agaaatcgga atgaaagggg agaggagacg cgggaagggc catgatggac tgtatcaggg 1860 actttccaca gccaccaagg acacctatga cgctctccac atgcaggccc tgccccctcg 1920 cggaagcgga gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg 1980 acctatgtcc gtccctaccc aggtgctggg cctgctgctg ctgtggctga ccgatgctag 2040 atgccagtcc gttctgaccc agcctccttc cgcctctggc acatccggcc agagagtgac 2100 catctcctgc agcggctcca gctctaacat cggcatcaat ttcgtgtact ggtatcagca 2160 cctgccaggc acagctccca agctgctgat ctacaagaac aatcagaggc cttccggcgt 2220 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<221> misc_feature <222> (3112)..(3112) <223> n is a, c, g, or t <400> 53 tgtaaggagc tgctgtgact tgctcaaggc cttatatcga gtaaacggta gtgctggggc 60 ttagacgcag gtgttctgat ttatagttca aaacctctat caatgagaga gcaatctcct 120 ggtaatgtga tagatttccc aacttaatgc caacatacca taaacctccc attctgctaa 180 tgcccagcct aagttgggga gaccactcca gattccaaga tgtacagttt gctttgctgg 240 gcctttttcc catgcctgcc tttactctgc cagagttata ttgctggggt tttgaagaag 300 atcctattaa ataaaagaat aagcagtatt attaagtagc cctgcatttc aggtttcctt 360 gagtggcagg ccaggcctgg ccgtgaacgt tcactgaaat catggcctct tggccaagat 420 tgatagcttg tgcctgtccc tgagtcccag tccatcacga gcagctggtt tctaagatgc 480 tatttcccgt ataaagcatg agaccgtgac ttgccagccc cacagagccc cgcccttgtc 540 catcactggc atctggactc cagcctgggt tggggcaaag agggaaatga gatcatgtcc 600 taaccctgat cctcttgtcc cacagatatc cagaaccctg accctgaatt cgggcggagt 660 tagggcggag ccaatcagcg tgcgccgttc cgaaagttgc cttttatggc tgggcggaga 720 atgggcggtg aacgccgatg attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca gctagttccg 780 tcgcagccgg gatttgggtc gcggttcttg tttgtggatc cctgtgatcg tcacttgaca 840 gtaagtcact gactgtctat gcctgggaaa gggtgggcag gagatggggc agtgcaggaa 900 aagtggcact atgaaccctg cagccctagg aatgcatcta gacaattgta ctaaccttct 960 tctctttcct ctcctgacag gcctcgaggc cgccaccatg gagtggagct gggtgtttct 1020 gttcttcctc tccgtcacaa ccggcgtgca tagccaggtg cagctggtgg agtccggagg 1080 cggcctggtg aaacctggcg gatccctgag gctgtcctgc gccgctagcg gattcacctt 1140 cagcgacgac tacatgagct ggatcaggca ggctcccgga aagggcctgg agtgggtcgc 1200 tagcgtgagc aatggccggc ccacaaccta ctatgccgac tccgtgcggg gcaggtttac 1260 catctccagg gataacgcta agaactccct gtacctgcag atgaacagcc tgcgggccga 1320 agataccgcc gtctactatt gcgccaggga ggattggggc ggcgagttca cagactgggg 1380 aaggggcacc ctggtgaccg tgagcagcgc ttccaccaag ggcccctccg tgttccctct 1440 ggcccccagc agcaagagca catccggagg caccgccgcc ctcggatgtc tggtgaagga 1500 ctacttcccc gagcctgtca ccgtgtcctg gaatagcggc gccctcacct ccggcgtgca 1560 caccttcccc gctgtcctgc agtcctccgg actgtacagc ctgtcctccg tcgtgaccgt 1620 gcctagctcc tccctcggca cccagaccta catctgcaac gtgaaccaca agccttccaa 1680 cacaaaggtg gacaaacggg tggagcccaa gtcctgcgac aaaacccaca ccaagataga 1740 ggtgatgtac cctcccccct acttggacaa cgaaaagtct aatggcacta tcattcacgt 1800 aaagggcaaa cacctttgtc caagtccttt gttcccaggc ccatctaagc cgttctgggt 1860 actcgtggtt gtggggggcg tgctcgcttg ttactcactg ctggtgacgg tggcctttat 1920 tattttctgg gttaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat 1980 gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga 2040 agaaggagga tgtgaactga gggtaaaatt tagcaggtct gcagatgcgc ctgcgtatca 2100 acagggtcag aatcagctct ataatgagct gaacctcggg cggcgggaag agtatgatgt 2160 tctcgataaa aggagaggac gagaccccga aatgggcggc aaaccgagac gcaaaaatcc 2220 tcaggagggg ctctacaatg aacttcaaaa agacaaaatg gccgaagcat actcagaaat 2280 cggaatgaaa ggggagagga gacgcgggaa gggccatgat ggactgtatc agggactttc 2340 cacagccacc aaggacacct atgacgctct ccacatgcag gccctgcccc ctcgcggaag 2400 cggagagggc agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc gaggagaatc ctggacctat 2460 gtccgtccct acccaggtgc tgggcctgct gctgctgtgg ctgaccgatg ctagatgcca 2520 gtccgttctg acccagcctc cttccgcctc tggcacatcc ggccagagag tgaccatctc 2580 ctgcagcggc tccagctcta acatcggcat caatttcgtg tactggtatc agcacctgcc 2640 aggcacagct cccaagctgc tgatctacaa gaacaatcag aggccttccg gcgtgccaga 2700 ccggttctct ggctccaaga gcggcaactc tgcctccctg gctatctccg gcctgcgcag 2760 cgaggacgag gctgattact attgcgccgc ttgggacgat agcctgtctg gctacgtgtt 2820 cggcagcggc acaaaggtga ccgtgctggg acagccaaag gctgctcctt ctgtgacact 2880 gtttccccct tccagcgagg agctgcaggc caataaggcc accctggtgt gcctgatcag 2940 cgacttctat cctggagctg tgaccgtggc ttggaaggct gattcttccc cagtgaaggc 3000 tggcgtggag acaacaaccc ccagcaagca gtctaacaat aagtacgccg ctagctctta 3060 tctgtctctg accccagagc agtggaagtc ccataggtcc tatagctgtc angtcaccca 3120 cgaagggagc acagtcgaaa aaaccgtcgc accaaccgag tgttcctgat aagttaactt 3180 gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 3240 agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttagta 3300 ccagctgaga gactcactat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc 3360 tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca aaactgtgct 3420 agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca acaaatctga 3480 ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaggacacct tcttccccag 3540 cccaggtaag ggcagctttg gtgccttcgc aggctgtttc cttgcttcag gaatggccag 3600 gttctgccca gagctctggt caatgatgtc taaaactcct ctgattggtg gtctcggcct 3660 tatccattgc caccaaaacc ctctttttac taagaaacag tgagccttgt tctggcagtc 3720 cagagaatga cacgggaaaa aagcagatga agagaaggtg gcaggagagg gcacgtggcc 3780 cagcctcagt ctctccaact gagttcctgc ctgcctgcct ttgctcagac tgtttgcccc 3840 ttactgctct tctaggcctc attctaagcc ccttctccaa gttgcctctc cttatttgta 3900 ccagctgaga gactcactat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc 3960 tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca aaactgtgct 4020 agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca acaaatctga 4080 ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaggacacct tcttccccag 4140 cccaggtaag 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192 nts <400> 55 atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60 ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120 ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agatatccag 180 aaccctgacc ct 192 <210> 56 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: PCR synthesized 3' homology arm, 159 nts <400> 56 gtaccagctg agagactcac tatccagtga caagtctgtc tgcctattca ccgattttga 60 ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg tatatcacag acaaaactgt 120 gctagacatg aggtctatgg acttcaagag caacagtgc 159 <210> 57 <211> 3003 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Anti-CD38 DAR donor DNA, 30003 nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (2659)..(2659) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60 ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120 ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agatatccag 180 aaccctgacc ctgaattcgg 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<211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: reverse primer for sequencing across 3' homology arm of anti-CD38 CAR in PD-1 locus <400> 71 gggactgtct taggcttgg 19 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: forward primer for sequencing across 5' homology arm of anti-CD38 DAR in TRAC exon 1 locus <400> 72 cctgctttct gagggtgaag 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: reverse primer for sequencing across 5' homology arm of anti-CD38 DAR in TRAC exon 1 locus <400> 73 cagctcatgt agtcgtcgct 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: forward primer for sequencing across 3' homology arm of anti-CD38 DAR in TRAC exon 1 locus <400> 74 ggaatgaaag gggagaggag 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: reverse primer for sequencing across 3' homology arm of anti-CD38 DAR in TRAC exon 1 locus <400> 75 gagagccctt ccctgacttt 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: forward primer for sequencing across 5' homology arm of anti-CD38 DAR in TRAC exon 1 locus at Cas12a target site <400> 76 cctgctttct gagggtgaag 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: reverse primer for sequencing across 5' homology arm of anti-CD38 DAR in TRAC exon 1 locus at Cas12a target site <400> 77 cagctcatgt agtcgtcgct 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: forward primer for sequencing across 3' homology arm of anti-CD38 DAR in TRAC exon 1 locus at Cas12a target site <400> 78 ggaatgaaag gggagaggag 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: reverse primer for sequencing across 3' homology arm of anti-CD38 DAR in TRAC exon 1 locus <400> 79 gagagccctt ccctgacttt 20 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: GM-CSF cas12a target site <400> 80 tacagaatga aacagtagaa g 21 <210> 81 <211> 2457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Anti-CD20 DAR construct <400> 81 gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60 atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120 gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180 gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 240 ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 300 ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggagtg 360 gagctgggtg tttctgttct tcctctccgt cacaaccggc gtgcatagcc aagtgcaatt 420 gcagcagccc ggtgccgaac tcgtgaaacc aggagcaagc gtaaagatgt cctgtaaggc 480 atcaggttat acctttacca gctacaacat gcactgggtg aaacaaacgc cggggcgggg 540 cctcgaatgg ataggcgcga tatatcccgg aaatggcgat accagttaca atcagaagtt 600 caaaggcaaa gcgacactga cagctgataa gtcttcaagc accgcctata tgcaactttc 660 tagcctgacc agcgaagact ccgccgttta ttactgtgct cggtccacat actacggagg 720 cgattggtac tttaatgtgt ggggtgcggg caccactgtc actgtatcag cggcttccac 780 caagggcccc tccgtgttcc ctctggcccc cagcagcaag agcacatccg gaggcaccgc 840 cgccctcgga tgtctggtga aggactactt ccccgagcct gtcaccgtgt cctggaatag 900 cggcgccctc acctccggcg tgcacacctt ccccgctgtc ctgcagtcct ccggactgta 960 cagcctgtcc tccgtcgtga ccgtgcctag ctcctccctc ggcacccaga cctacatctg 1020 caacgtgaac cacaagcctt ccaacacaaa ggtggacaaa cgggtggagc ccaagtcctg 1080 cgacaaaacc cacaccccca gaaagataga ggtgatgtac cctcccccct acttggacaa 1140 cgaaaagtct aatggcacta tcattcacgt aaagggcaaa cacctttgtc caagtccttt 1200 gttcccaggc ccatctaagc cgttctgggt actcgtggtt gtggggggcg tgctcgcttg 1260 ttactcactg ctggtgacgg tggcctttat tattttctgg gttaaacggg gcagaaagaa 1320 actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga 1380 tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gggtaaaatt 1440 tagcaggtct gcagataaag gggagaggag acgcgggaag ggccatgatg gactgtatca 1500 gggactttcc acagccacca aggacaccta tgacgctctc cacatgcagg ccctgccccc 1560 tcgcggaagc ggagagggca gaggaagtct gctaacatgc ggtgacgtcg aggagaatcc 1620 tggacctatg tccgtcccta cccaggtgct gggcctgctg ctgctgtggc tgaccgatgc 1680 tagatgccag atagtcctga gccaatcacc ggccatcttg tctgcctctc ctggcgaaaa 1740 ggtgacgatg acttgcagag ccagtagctc tgtaagctat atacactggt tccagcaaaa 1800 accgggctct tctccgaagc cgtggatata cgcaacttca aacctggcgt ctggggttcc 1860 tgtaaggttt agcggcagcg gttcaggcac gagctacagc cttactatct cccgggttga 1920 ggctgaagat gcagccacat actactgtca gcagtggact tcaaatccac ctacattcgg 1980 gggaggcacg aagctggaga ttaaacgaac cgttgcggcg cctagtgtgt tcatattccc 2040 gccgtctgat gaacaactca agtctggaac ggcaagtgtg gtgtgtctcc tgaataattt 2100 ttatcctagg gaagcaaagg tgcagtggaa agtcgataac gcattgcaaa gcggtaacag 2160 tcaagaatct gtaactgaac aagattctaa agattctacc tacagtctct cctccacatt 2220 gaccctgtca aaagcagatt atgagaagca caaggtgtac gcatgtgagg taacacatca 2280 aggactcagc agcccagtta caaaaagttt caatcgcggg gaatgttgat aagttaactt 2340 gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 2400 agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatctta 2457 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: forward primer for generating donor DNA, includes 5' phosphate <220> <221> misc_feature <223> 5' phosphate <400> 82 atcacgagca gctggtttct 20 <210> 83 <211> 2808 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Anti-CD20 DAR donor DNA including 5' homology arm, anti-CD20 DAR construct, and 3' homology arm <400> 83 atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60 ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120 ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agatatccag 180 aaccctgacc ctgaattcgg gcggagttag ggcggagcca atcagcgtgc gccgttccga 240 aagttgcctt ttatggctgg gcggagaatg ggcggtgaac gccgatgatt atataaggac 300 gcgccgggtg tggcacagct agttccgtcg cagccgggat ttgggtcgcg gttcttgttt 360 gtggatccct gtgatcgtca cttgacagta agtcactgac tgtctatgcc tgggaaaggg 420 tgggcaggag atggggcagt gcaggaaaag tggcactatg aaccctgcag ccctaggaat 480 gcatctagac aattgtacta accttcttct ctttcctctc ctgacaggcc tcgaggccgc 540 caccatggag tggagctggg tgtttctgtt cttcctctcc gtcacaaccg gcgtgcatag 600 ccaagtgcaa ttgcagcagc ccggtgccga actcgtgaaa ccaggagcaa gcgtaaagat 660 gtcctgtaag gcatcaggtt atacctttac cagctacaac atgcactggg tgaaacaaac 720 gccggggcgg ggcctcgaat ggataggcgc gatatatccc ggaaatggcg ataccagtta 780 caatcagaag ttcaaaggca aagcgacact gacagctgat aagtcttcaa gcaccgccta 840 tatgcaactt tctagcctga ccagcgaaga ctccgccgtt tattactgtg ctcggtccac 900 atactacgga ggcgattggt actttaatgt gtggggtgcg ggcaccactg tcactgtatc 960 agcggcttcc accaagggcc cctccgtgtt ccctctggcc cccagcagca agagcacatc 1020 cggaggcacc gccgccctcg gatgtctggt gaaggactac ttccccgagc ctgtcaccgt 1080 gtcctggaat agcggcgccc tcacctccgg cgtgcacacc ttccccgctg tcctgcagtc 1140 ctccggactg tacagcctgt cctccgtcgt gaccgtgcct agctcctccc tcggcaccca 1200 gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc ttccaacaca aaggtggaca aacgggtgga 1260 gcccaagtcc tgcgacaaaa cccacacccc cagaaagata gaggtgatgt accctccccc 1320 ctacttggac aacgaaaagt ctaatggcac tatcattcac gtaaagggca aacacctttg 1380 tccaagtcct ttgttcccag gcccatctaa gccgttctgg gtactcgtgg ttgtgggggg 1440 cgtgctcgct tgttactcac tgctggtgac ggtggccttt attattttct gggttaaacg 1500 gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac 1560 tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact 1620 gagggtaaaa tttagcaggt ctgcagataa aggggagagg agacgcggga agggccatga 1680 tggactgtat cagggacttt ccacagccac caaggacacc tatgacgctc tccacatgca 1740 ggccctgccc cctcgcggaa gcggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt 1800 cgaggagaat cctggaccta tgtccgtccc tacccaggtg ctgggcctgc tgctgctgtg 1860 gctgaccgat gctagatgcc agatagtcct gagccaatca ccggccatct tgtctgcctc 1920 tcctggcgaa aaggtgacga tgacttgcag agccagtagc tctgtaagct atatacactg 1980 gttccagcaa aaaccgggct cttctccgaa gccgtggata tacgcaactt caaacctggc 2040 gtctggggtt cctgtaaggt ttagcggcag cggttcaggc acgagctaca gccttactat 2100 ctcccgggtt gaggctgaag atgcagccac atactactgt cagcagtgga cttcaaatcc 2160 acctacattc gggggaggca cgaagctgga gattaaacga accgttgcgg cgcctagtgt 2220 gttcatattc ccgccgtctg atgaacaact caagtctgga acggcaagtg tggtgtgtct 2280 cctgaataat ttttatccta gggaagcaaa ggtgcagtgg aaagtcgata acgcattgca 2340 aagcggtaac agtcaagaat ctgtaactga acaagattct aaagattcta cctacagtct 2400 ctcctccaca ttgaccctgt caaaagcaga ttatgagaag cacaaggtgt acgcatgtga 2460 ggtaacacat caaggactca gcagcccagt tacaaaaagt ttcaatcgcg gggaatgttg 2520 ataagttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 2580 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 2640 tgtatcttag taccagctga gagactcact atccagtgac aagtctgtct gcctattcac 2700 cgattttgat tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga 2760 caaaactgtg ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgc 2808 <210> 84 <211> 2077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Anti-CEA CAR construct <400> 84 gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60 atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120 gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180 gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 240 ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 300 ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatgggatg 360 gagctgtatc atcctcttct tggtagcaac agctacaggt gtccactccg acatccagct 420 gacccagagc ccaagcagcc tgagcgccag cgtgggtgac agagtgacca tcacctgtaa 480 ggccagtcag gatgtgggta cttctgtagc ttggtaccag cagaagccag gtaaggctcc 540 aaagctgctg atctactgga catccacccg gcacactggt gtgccaagca gattcagcgg 600 tagcggtagc ggtaccgact tcaccttcac catcagcagc ctccagccag aggacatcgc 660 cacctactac tgccagcaat atagcctcta tcggtcgttc ggccaaggga ccaaggtgga 720 aatcaaacga ggtggctcag gatcgggtgg atccggctct ggtggctcag gatcggaggt 780 ccaactggtg gagagcggtg gaggtgttgt gcaacctggc cggtccctgc gcctgtcctg 840 ctccgcatct ggcttcgatt tcaccacata ttggatgagt tgggtgagac aggcacctgg 900 aaaaggtctt gagtggattg gagaaattca tccagatagc agtacgatta actatgcgcc 960 gtctctaaag gatagattta caatatcgcg agacaacgcc aagaacacat tgttcctgca 1020 aatggacagc ctgagacccg aagacaccgg ggtctatttt tgtgcaagcc tttacttcgg 1080 cttcccctgg tttgcttatt ggggccaagg gaccccggtc accgtctcca gtgctaagcc 1140 gaccacgaca ccggctccaa gacctccgac gccagctcca acgatagcgt cacagccatt 1200 gtctctccgc cctgaagcct gccggcccgc tgcgggcggc gcggttcata cccggggatt 1260 ggactttgcc cccagaaaga tagaggtgat gtaccctccc ccctacttgg acaacgaaaa 1320 gtctaatggc actatcattc acgtaaaggg caaacacctt tgtccaagtc ctttgttccc 1380 aggcccatct aagccgttct gggtactcgt ggttgtgggg ggcgtgctcg cttgttactc 1440 actgctggtg acggtggcct ttattatttt ctgggttcga tctaagcgaa gccgcttgtt 1500 gcattctgac tacatgaata tgacgccaag acggccaggg ccaacaagaa agcattacca 1560 accgtacgcc cccccgcgag acttcgcggc ctaccgcagc agggtaaaat ttagcaggtc 1620 tgcagatgcg cctgcgtatc aacagggtca gaatcagctc tataatgagc tgaacctcgg 1680 gcggcgggaa gagtatgatg ttctcgataa aaggagagga cgagaccccg aaatgggcgg 1740 caaaccgaga cgcaaaaatc ctcaggaggg gctctacaat gaacttcaaa aagacaaaat 1800 ggccgaagca tactcagaaa tcggaatgaa aggggagagg agacgcggga agggccatga 1860 tggactgtat cagggacttt ccacagccac caaggacacc tatgacgctc tccacatgca 1920 ggcgctgccg cctagatgat aaaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg 1980 gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 2040 ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatctta 2077 <210> 85 <211> 2428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Anti-CD20 DAR donor DNA including 5' homology arm, anti-CD20 DAR construct, and 3' homology arm <400> 85 atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60 ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120 ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agatatccag 180 aaccctgacc ctgaattcgg gcggagttag ggcggagcca atcagcgtgc gccgttccga 240 aagttgcctt ttatggctgg gcggagaatg ggcggtgaac gccgatgatt atataaggac 300 gcgccgggtg tggcacagct agttccgtcg cagccgggat ttgggtcgcg gttcttgttt 360 gtggatccct gtgatcgtca cttgacagta agtcactgac tgtctatgcc tgggaaaggg 420 tgggcaggag atggggcagt gcaggaaaag tggcactatg aaccctgcag ccctaggaat 480 gcatctagac aattgtacta accttcttct ctttcctctc ctgacaggcc tcgaggccgc 540 caccatggga tggagctgta tcatcctctt cttggtagca acagctacag gtgtccactc 600 cgacatccag ctgacccaga gcccaagcag cctgagcgcc agcgtgggtg acagagtgac 660 catcacctgt aaggccagtc aggatgtggg tacttctgta gcttggtacc agcagaagcc 720 aggtaaggct ccaaagctgc tgatctactg gacatccacc cggcacactg gtgtgccaag 780 cagattcagc ggtagcggta gcggtaccga cttcaccttc accatcagca gcctccagcc 840 agaggacatc gccacctact actgccagca atatagcctc tatcggtcgt tcggccaagg 900 gaccaaggtg gaaatcaaac gaggtggctc aggatcgggt ggatccggct ctggtggctc 960 aggatcggag gtccaactgg tggagagcgg tggaggtgtt gtgcaacctg gccggtccct 1020 gcgcctgtcc tgctccgcat ctggcttcga tttcaccaca tattggatga gttgggtgag 1080 acaggcacct ggaaaaggtc ttgagtggat tggagaaatt catccagata gcagtacgat 1140 taactatgcg ccgtctctaa aggatagatt tacaatatcg cgagacaacg ccaagaacac 1200 attgttcctg caaatggaca gcctgagacc cgaagacacc ggggtctatt tttgtgcaag 1260 cctttacttc ggcttcccct ggtttgctta ttggggccaa gggaccccgg tcaccgtctc 1320 cagtgctaag ccgaccacga caccggctcc aagacctccg acgccagctc caacgatagc 1380 gtcacagcca ttgtctctcc gccctgaagc ctgccggccc gctgcgggcg gcgcggttca 1440 tacccgggga ttggactttg cccccagaaa gatagaggtg atgtaccctc ccccctactt 1500 ggacaacgaa aagtctaatg gcactatcat tcacgtaaag ggcaaacacc tttgtccaag 1560 tcctttgttc ccaggcccat ctaagccgtt ctgggtactc gtggttgtgg ggggcgtgct 1620 cgcttgttac tcactgctgg tgacggtggc ctttattatt ttctgggttc gatctaagcg 1680 aagccgcttg ttgcattctg actacatgaa tatgacgcca agacggccag ggccaacaag 1740 aaagcattac caaccgtacg cccccccgcg agacttcgcg gcctaccgca gcagggtaaa 1800 atttagcagg tctgcagatg cgcctgcgta tcaacagggt cagaatcagc tctataatga 1860 gctgaacctc gggcggcggg aagagtatga tgttctcgat aaaaggagag gacgagaccc 1920 cgaaatgggc ggcaaaccga gacgcaaaaa tcctcaggag gggctctaca atgaacttca 1980 aaaagacaaa atggccgaag catactcaga aatcggaatg aaaggggaga ggagacgcgg 2040 gaagggccat gatggactgt atcagggact ttccacagcc accaaggaca cctatgacgc 2100 tctccacatg caggcgctgc cgcctagatg ataaaattgt tgttgttaac ttgtttattg 2160 cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 2220 tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttag taccagctga 2280 gagactcact atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat tctcaaacaa 2340 atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg ctagacatga 2400 ggtctatgga cttcaagagc aacagtgc 2428 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CD7 locus Cas12a target site <400> 86 ctacgaggac ggggtggtgc c 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CD7 locus Cas12a alternate target site <400> 87 cttctcagag gaacagtccc a 21 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: forward primer producing donor fragment for insertion into CD7 locus <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methylated <220> <221> modified_base <222> (2)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> 2'-O-methylated <400> 88 ctgcagggag gacattctct 20 <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: reverse primer producing donor fragment for insertion into CD7 locus <220> <221> misc_feature <223> 5' phosphate <400> 89 ttccctactg tcaccagga 19 <210> 90 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 5' homology arm for CD7 locus insertion <400> 90 ctgcagggag gacattctct gtccttctgg ccagactgat ggtgacagcc caggtcctcc 60 ccagaggtgc agcagtctcc ccactgcacg actgtccccg tgggagcctc cgtcaacatc 120 acctgctcca ccagcggggg cctgcgtggg atctacctga ggcagctcgg gccacagccc 180 caagacatca tagtctacga ggacggggtg gt 212 <210> 91 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 3' homology arm for CD7 locus insertion <400> 91 ctacggacag acggttccgg ggccgcatcg acttctcagg gtcccaggac aacctgacta 60 tcaccatgca ccgcctgcag ctgtcggaca ctggcaccta cacctgccag gccatcacgg 120 aggtcaatgt ctacggctcc ggcaccctgg tcctggtgac aggtagggaa 170

Claims (75)

  1. 2개의 상이한 유전학적 유전자좌에서 1차 사람 T 세포를 유전학적으로 변형시키기 위한 방법으로서, 상기 방법이 1차 사람 T 세포에
    제1 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 및 제1 가이드 RNA를 포함하는 제1 리보뉴클레오단백질 (RNP);
    제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 및 제2 가이드 RNA를 포함하는 제2 RNP; 및
    적어도 2개의 핵산 변형을 포함하는 공여자 DNA 분자를 도입하는 단계를 포함하고;
    상기 제1 가이드 RNA가 상기 표적 DNA 내 제1 유전학적 유전자좌에서 제1 표적 부위와 하이브리드화하도록 디자인된 표적 서열을 포함하고, 상기 공여자 DNA가 상기 제1 표적 부위에서 상기 표적 DNA 분자에 삽입되고;
    추가로, 상기 제2 가이드 RNA가 상기 표적 DNA에서 제2 유전학적 유전자좌에서 제2 표적 부위와 하이브리드화하도록 디자인되어 상기 제2 표적 부위에서 돌연변이를 유도하는 제2 표적 서열을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 2개의 핵산 변형이 상기 공여자 DNA 분자의 단일 가닥 상에 있는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 상기 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 연결의 변형인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 골격(backbone) 변형인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 포스포로티오에이트 변형 또는 포스포르아미디트 변형 또는 이의 조합인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 핵염기의 변형 또는 치환인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 당의 변형 또는 치환인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 데옥시리보스의 2’-O-메틸 그룹 변형인, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 이중 가닥 DNA 분자인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 상기 변형된 가닥의 반대편 가닥 상에 5’ 말단 포스페이트를 갖는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 공여자 분자가 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’말단의 10개 뉴클레오타이드 내 골격 상에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 변형 및 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’말단의 10개 뉴클레오타이드 내 1 내지 3개의 2’-O-메틸 뉴클레오타이드 변형을 갖는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 공여자 분자가 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 골격 상에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 변형 및 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 1 내지 3개의 2’-O-메틸 뉴클레오타이드 변형을 갖는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 게놈으로의 통합을 위한 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 50 내지 2000개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 140 내지 660개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 140 내지 250개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 변형된 가닥 및 반대편 가닥을 포함하고, 상기 변형된 가닥이 2개 이상의 핵산 변형을 포함하고, 상기 반대편 가닥이 말단 포스페이트를 포함하는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 약 500 내지 약 5000 bp 길이인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 약 500 내지 약 3500 bp 길이인, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 이량체 항원 수용체 (DAR) 작제물을 포함하는, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas9인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas12a인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 및 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas12a인, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 제1 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas12a이고, 상기 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas9이거나, 상기 제1 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas9이고, 상기 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas12a인, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 제1 RNP 및 상기 공여자 DNA가 동시에 도입되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제1 RNP, 상기 공여자 DNA 및 상기 제2 RNP가 동시에 상기 세포에 도입되는, 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 제1 RNP 및 상기 공여자 DNA가 동시에 상기 세포에 도입되고, 상기 제2 RNP가 상이한 시점에 상기 세포에 도입되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 RNP가 전기천공 또는 리포좀 전달에 의해 상기 세포에 도입된, 방법.
  29. RNA 가이드된 뉴클레아제의 제1 표적 부위를 포함하는 제1 유전학적 유전자좌에서 게놈으로 통합된 비-고유 유전학적 작제물 및 RNA 가이드된 뉴클레아제의 제2 표적 부위를 포함하는 제2 유전학적 유전자좌에서 돌연변이를 포함하는 가공된 1차 T 세포로서, 상기 가공된 1차 T 세포가 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는, 가공된 1차 T 세포.
  30. 유전학적 작제물로 형질감염된 1차 사람 T 세포 집단으로서, 상기 세포 집단이 제1 유전학적 유전자좌에서 게놈으로 통합된 비-고유 유전학적 작제물을 갖는 세포를 포함하고, 제2 유전학적 유전자좌에서 유전자 내 돌연변이를 추가로 갖고, 상기 집단 세포의 적어도 25%가 상기 유전학적 작제물을 발현하고, 상기 제2 유전학적 유전자좌에서 상기 유전자의 감소된 발현을 나타내는, 1차 사람 T 세포 집단.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제1 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 표적 부위 및 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 부위가 Cas12a 표적 부위인, 1차 사람 T 세포 집단.
  32. 제30항에 있어서, 상기 제1 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 표적 부위가 Cas12a 표적 부위이고, 상기 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 부위가 Cas9 표적 부위인, 사람 T 세포 집단.
  33. 제30항에 있어서, 상기 제1 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 표적 부위가 Cas9 표적 부위이고, 상기 제2 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 부위가 Cas12a 표적 부위인, 사람 T 세포 집단.
  34. 공여자 DNA의 표적 DNA 분자로의 부위-특이적 통합을 위한 방법으로서, 상기 방법이
    Cas12a 엔도뉴클레아제 및 가공된 가이드 RNA를 포함하는 RNP; 및
    적어도 2개의 핵산 변형을 포함하는 공여자 DNA 분자를 세포에 도입하는 단계를 포함하고;
    상기 가이드 RNA가 상기 표적 DNA 내 표적 부위와 하이브리드화하도록 디자인된 표적 서열을 포함하고, 상기 공여자 DNA가 상기 표적 부위에서 상기 표적 DNA 분자에 삽입되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 적어도 2개의 핵산 변형이 상기 공여자 DNA 분자의 단일 가닥 상에 있는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 상기 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 연결의 변형인, 방법.
  37. 제34항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 골격 변형인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 포스포로티오에이트 변형 또는 포스포르아미디트 변형 또는 이의 조합인, 방법.
  39. 제33항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 핵염기의 변형 또는 치환인, 방법.
  40. 제33항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 당의 변형 또는 치환인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 데옥시리보스의 2’-O-메틸 그룹 변형인, 방법.
  42. 제34항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 이중 가닥 DNA 분자인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 상기 변형된 가닥의 반대편 가닥 상에 5’ 말단 포스페이트를 갖는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 공여자 분자가 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 골격 상에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 변형 및 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 1 내지 3개의 2’-O-메틸 뉴클레오타이드 변형을 갖는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 공여자 분자가 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 골격 상에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 변형 및 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 1 내지 3개의 2’-O-메틸 뉴클레오타이드 변형을 갖는, 방법.
  46. 제34항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 게놈으로의 통합을 위한 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 50 내지 2000개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 140 내지 660개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 140 내지 250개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
  50. 제34항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 변형된 가닥 및 반대편 가닥을 포함하고, 상기 변형된 가닥이 2개 이상의 핵산 변형을 포함하고, 상기 반대편 가닥이 말단 포스페이트를 포함하는, 방법.
  51. 제34항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 약 500 내지 약 5000 bp 길이인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 약 500 내지 약 3500 bp 길이인, 방법.
  53. 제34항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 이량체 항원 수용체 (DAR) 작제물을 포함하는, 방법.
  54. 제34항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 crRNA인, 방법.
  55. 제54항에 있어서, tracrRNA를 상기 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제34항에 있어서, 상기 RNP가 전기천공 또는 리포좀 전달에 의해 상기 세포에 도입된, 방법.
  57. 제34항에 있어서, 상기 공여자 DNA 및 상기 RNP가 동시에 또는 별도로 상기 세포에 도입되는, 방법.
  58. 공여자 DNA의 표적 유전자좌로의 표적화된 통합을 위한 시스템으로서,
    Cas12a 엔도뉴클레아제; 가이드 RNA; 및 이중 가닥 공여자 DNA 분자를 포함하고, 상기 공여자 DNA 분자가 상기 이중 가닥 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 상기 이중 가닥 DNA 분자의 단일 변형된 가닥 상에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 시스템.
  59. 제58항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 상기 이중 가닥 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 상기 변형된 가닥의 당 모이어티 또는 핵염기의 적어도 하나의 변형을 추가로 포함하는, 시스템.
  60. 제58항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 게놈으로의 통합을 위한 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 갖는, 시스템.
  61. 제58항에 있어서, 상기 이중 가닥 DNA 분자의 단일 변형된 가닥 상에 상기 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이 상기 이중 가닥 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 있는, 시스템.
  62. 제61항에 있어서, 상기 변형된 가닥의 당 모이어티 또는 핵염기의 상기 적어도 하나의 변형이 상기 이중 가닥 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 있는, 시스템.
  63. 제61항에 있어서, 당 모이어티의 상기 적어도 하나의 변형이 2’-O 메틸화를 포함하는, 시스템.
  64. 제60항에 있어서, 상기 관심 대상의 서열이 발현 카세트를 포함하는, 시스템.
  65. 제64항에 있어서, 상기 발현 카세트가 하나 이상의 항체 또는 수용체 도메인을 포함하는 작제물을 포함하는, 시스템.
    [청구항 63]
    제60항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 50 내지 2000개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
    [청구항 64]
    제63항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 140 내지 660개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
    [청구항 65]
    제63항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 140 내지 250개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
  66. 제61항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 변형된 가닥 및 반대편 가닥을 포함하고, 상기 변형된 가닥이 2개 이상의 핵산 변형을 포함하고, 상기 반대편 가닥이 말단 포스페이트를 포함하는, 방법.
  67. 제58항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 약 500 내지 약 5000 bp 길이인, 방법.
  68. 제58항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 약 500 내지 약 3500 bp 길이인, 방법.
  69. 제64항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 이량체 항원 수용체 (DAR) 작제물을 포함하는, 방법.
  70. 제58항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 crRNA인, 시스템.
  71. 제58항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 하나 이상의 포스포로티오에이트 (PS) 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 시스템.
  72. 제8항에 있어서, 상기 Cas12a 엔도뉴클레아제 및 상기 가이드 RNA를 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체를 포함하는, 시스템.
  73. CD7 유전자에 삽입된 CAR 또는 DAR 작제물을 갖는 1차 사람 T 세포.
  74. 제73항에 있어서, 상기 CAR 또는 DAR 작제물이 CEA CAR 또는 DAR 작제물인, 1차 사람 T 세포.
  75. 제73항에 따른 T 세포 집단.
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