KR20210143868A

KR20210143868A - 암 치료용 다중특이성 제제

Info

Publication number: KR20210143868A
Application number: KR1020217034519A
Authority: KR
Inventors: 마크 맥카미쉬
Original assignee: 포티 세븐, 인코포레이티드
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2021-11-29
Also published as: AU2020245486B2; EP3947460A4; EP3947460A1; CA3134006A1; WO2020198353A1; US20220185905A1; AU2020245486A1; JP2023096181A; CN113631576A; JP2022527761A

Abstract

본 발명은 CD47에 결합하는 하나의 아암, 및 CD24에 결합하는 제2 아암을 갖는 다중특이성 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 SIRPα에 결합하는 하나의 아암 및 siglec-10에 결합하는 제2 아암을 갖는 다중특이성 제제를 제공한다.

Description

암 치료용 다중특이성 제제

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 3월 26일자로 출원된 US 62/824,213호의 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된다.

서열 목록

본 출원은, 참고로 포함된, 2020년 3월 25일자로 생성된, 20-03-25 544571SL로 명명된 7 kbyte의 txt 서열 목록에 포함된 서열을 개시한다.

CD47은 단일 Ig-유사 도메인 및 5개의 막관통 영역을 갖는 광범위하게 발현되는 막관통 당단백질이며, 이는 SIRPα의 NH2-말단 V-유사 도메인을 통해 매개되는 결합으로 SIRPα에 대한 세포 리간드로서 기능한다. SIRPα는 주로 대식세포, 과립구, 골수 수지상 세포(DC), 비만 세포를 포함하는 골수 세포, 및 조혈 줄기 세포를 포함하는 그들의 전구체에서 발현된다. CD47은 백혈구 부착 및 이동, T-세포 활성화, 세포사멸 및 식세포작용을 포함하는 다양한 생물학적 과정을 매개한다.

숙주 표적 세포에서 발현되는 CD47에 대한 대식세포 상의 SIRPα의 결합은 식세포작용을 음성 조절하는 SHP-1에 의해 매개되는 억제 신호를 생성한다. SIRPα는 숙주 세포에 대한 선천 면역 이펙터 기능을 음성 조절하는 역할을 한다.

CD47은 또한 조혈 암 및 고형 종양을 포함하는 다수의 암에 대해 본질적으로 상향조절된다. CD47의 과발현은 암 세포가 식세포작용을 회피하도록 함으로써 암의 병원성(pathogenicity)을 증가시킨다. CD47이 암 치료의 표적이기는 하지만, 정상 세포, 특히 적혈구 상에서의 CD47의 발현은 비표적(off-target) 효과를 초래할 수 있다.

CD47과 같이, CD24는 많은 정상 조직에서 발현되며, 많은 암에서 상승된 수준으로 발현된다. CD24에 대한 상대 수용체(counterreceptor) 중 하나는 siglec G(마우스) 또는 siglec-10(인간)으로 알려져 있다. Siglec G/10은 주로 B 세포, 단핵구 계통의 세포 및 호산구에서 발현된다. CD24-siglec G/10 경로는 DAMP에 대한 숙주 반응의 선택적 억제에 의해 손상 관련 분자 패턴(Danger Associated Molecular Pattern, DAMP)과 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)을 구별한다. PAMP가 아닌 DAMP는 CDS24 Siglec G/10을 TLR/NLR에 근접하게 하므로, SHP1과 같은 siglec G/10-관련 포스파타제가 DAMP-개시 TLR/NLR 신호 전달을 억제할 수 있다. CD24의 가용성 형태가 자가면역 질환의 치료를 위해 개발 중에 있다.

시스(cis) 또는 트랜스(trans)에서 siglec G/10에 대한 CD24의 결합은 염증 경로의 SHP-1 억제를 유발하는 siglec G/10의 ITIM 모티프를 통한 신호 전달을 초래한다. 따라서, CD24와 siglec G/10의 상호작용은 CD47과 SIRPα의 상호작용과 유사한 항염증 효과를 초래한다.

본 발명은 CD47에 특이적으로 결합하는 제1 결합 아암 및 CD24에 특이적으로 결합하는 제2 결합 아암을 포함하는 다중특이성 제제를 제공한다. 선택적으로, 제1 결합 아암은 SIRPα에 대한 CD47 결합을 길항하고 제2 결합 아암은 siglec-10에 대한 CD24 결합을 길항한다. 선택적으로, 제1 결합 아암은 항체 VH-VL 쌍 또는 SIRPα 세포외 도메인이고, 제2 결합 아암은 항체 VH-VL 쌍 또는 siglec-10 세포외 도메인이다. 선택적으로, 다중특이성 제제는 단일 제1 결합 아암 및 단일 제2 결합 아암을 갖는다. 선택적으로 다중특이성 제제는 2 카피의 제1 결합 아암 및 2 카피의 제2 결합 아암을 갖는다. 선택적으로, 다중특이성 제제는 암 항원에 특이적으로 결합하는 제3 결합 아암을 추가로 포함한다. 선택적으로, 암 항원은 CD20이다. 선택적으로, 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암은 CD47 및 CD24에 대한 친화도가 서로에 대해 4배 이내이다. 선택적으로, 제2 결합 아암은 제1 결합 아암이 CD47에 대해 갖는 것보다 적어도 5배만큼 더 높은 친화도를 CD24에 대해 갖는다. 선택적으로, 다중특이성 제제는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 선택적으로, Fc 도메인은 인간 IgG4 동종형을 갖는다. 선택적으로, Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG4 동종형을 갖는다. 선택적으로, 다중특이성 제제는 이펙터 기능을 감소시키도록 돌연변이된 인간 IgG1 동종형을 갖는다.

본 발명은 또한 다중특이성 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 선택적으로, 암은 CD24 및 CD47을 발현한다. 선택적으로, 다중특이성 제제는 암 항원에 특이적으로 결합하는 제3 결합 아암을 추가로 포함하고, 여기서 암은 암 특이적 항원을 발현한다. 선택적으로, 암은 선암종이다. 선택적으로, 암은 림프종이다. 선택적으로, 본 방법은 암의 세포에서 CD24 및 CD47의 발현을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 SIRPα에 특이적으로 결합하는 제1 결합 아암 및 siglec-10에 특이적으로 결합하는 제2 결합 아암을 포함하는 다중특이성 제제를 제공한다. 선택적으로, 제1 결합 아암은 SIRPα에 대한 CD47 결합을 길항하고 제2 결합 아암은 siglec-10에 대한 CD24 결합을 길항한다. 선택적으로, 제1 결합 아암은 항체 VH-VL 쌍 또는 SIRPα 세포외 도메인이고, 제2 결합 아암은 항체 VH-VL 쌍 또는 siglec-10 결합 도메인이다. 선택적으로, 다중특이성 제제는 단일 제1 결합 아암 및 단일 제2 결합 아암을 갖는다. 선택적으로, 다중특이성 제제는 2 카피의 제1 결합 아암 및 2 카피의 제2 결합 아암을 갖는다. 선택적으로, 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암은 SIRPα 및 siglec-10에 대한 친화도가 서로에 대해 4배 이내이다. 선택적으로, 제2 결합 아암은 제1 결합 아암이 SIRPα에 대해 갖는 것보다 적어도 5배만큼 더 높은 친화도를 siglec-10에 대해 갖는다. 선택적으로, 다중특이성 제제는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 선택적으로, Fc 도메인은 인간 IgG4 동종형을 갖는다. 선택적으로, Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG4 동종형을 갖는다. 선택적으로, Fc 도메인은 이펙터 기능을 감소시키도록 돌연변이된 인간 IgG1 동종형을 갖는다.

본 발명은 또한 SIRPα에 특이적으로 결합하는 제1 결합 아암 및 siglec-10에 특이적으로 결합하는 제2 결합 아암을 포함하는 다중특이성 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 선택적으로, 다중특이성 제제는 암 항원에 특이적으로 결합하는 제3 결합 아암을 추가로 포함하고, 여기서 암은 암 특이적 항원을 발현한다.

도 1은 암 및 조직 매칭된 정상 조직에서의 CD24의 발현을 보여준다.
도 2는 림프종에서의 CD24의 발현을 보여준다.
도 3은 암 및 조직 매칭된 정상 조직에서의 siglec-10의 발현을 보여준다.
도 4는 다양한 항체에 의한 결직장 선암종의 대식세포 식세포작용을 보여준다.
도 5는 다양한 항체에 의한 난소 선암종의 대식세포-매개 식세포작용을 보여준다.
정의
본 발명의 다중특이성 제제는 전형적으로 단리된 형태로 제공된다. 이는 다중특이성 제제가 전형적으로 이의 생산 또는 정제로부터 발생하는 간섭 단백질 및 기타 오염물질에 대해 50% w/w 이상 순수하다는 것을 의미하지만, 다중특이성 제제가 그의 사용을 용이하게 하도록 의도된 과량의 약제학적으로 허용되는 담체(들) 또는 기타 비히클(vehicle)과 조합될 가능성을 배제하지는 않는다. 때때로 다중특이성 제제는 생산 또는 정제로부터의 간섭 단백질 및 오염물질에 대해 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% w/w 이상 순수하다. 종종 다중특이성 제제는 그의 정제 후에 남아 있는 우세한 거대분자 종이다.
다중특이성 제제의 그의 표적 항원에 대한 특이적 결합은 적어도 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 또는 10¹⁰M^-1의 친화도를 의미한다. 친화도는 상이한 표적에 대해 상이할 수 있다. 특이적 결합은 검출 가능하게 더 큰 규모이며 적어도 하나의 관련되지 않은 표적에 대해 발생하는 비특이적 결합과 구별될 수 있다. 특이적 결합은 특정 작용기들 사이의 결합의 형성 또는 특정 공간 맞춤(spatial fit)(예를 들어, 자물쇠와 열쇠 유형)의 결과일 수 있지만 비특이적 결합은 보통 반 데르 발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 다중특이성 제제가 이들 2개의 결합 부위에 대한 표적에만 결합한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다.
기본 항체 구조 단위는 서브유닛의 사량체이다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 이러한 가변 영역은 초기에 발현되고, 절단가능한 신호 펩티드에 연결된다. 신호 펩티드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙 가변 영역으로 지칭된다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩티드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 그러나, 가변 영역에 대한 언급은 신호 서열이 반드시 존재함을 의미하지는 않으며; 실제로 일단 본 발명의 다중특이성 제제가 발현되고 분비되면 신호 서열이 절단된다. 한 쌍의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 항체의 결합 영역을 한정한다. 경쇄 및 중쇄의 카르복시-말단 부분은 각각 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역을 한정한다. 중쇄 불변 영역은 주로 이펙터 기능을 담당한다. IgG 항체에서, 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 영역으로 나뉜다. IgA에서, 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3으로 나뉜다. IgM은 불변 영역 도메인 Cμ1, Cμ2, Cμ3, Cμ4, 및 20개 아미노산의 테일피스(tailpiece)를 포함한다. CH1 영역은 이황화 및 비공유 결합에 의해 경쇄 불변 영역에 결합한다. 힌지 영역은 항체의 결합 영역과 이펙터 영역 사이에 유연성을 제공하고 또한 사량체 서브유닛에서 2개의 중쇄 불변 영역 사이의 분자간 이황화 결합을 위한 부위를 제공한다. CH2 영역 및 CH3 영역은 이펙터 기능 및 FcRn 결합의 주요 부위이다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, α, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 항체의 동종형을 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 세그먼트에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 세그먼트를 포함한다. (일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7] 참조)(모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함됨).
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 성숙 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 가지며, 즉, 2가이다. 천연 항체에서, 결합 부위들은 동일하다. 그러나, 이중특이성 항체에서, 이들 결합 부위는 포맷에 따라 동일하거나 상이할 수 있다(예를 들어, 문헌[Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321(1990)]; 문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)] 참조). 가변 영역은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어, 특이적 에피토프에 대한 결합을 가능하게 한다. N-말단부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 모두는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)], 또는 문헌[Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; 문헌[Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다. Kabat는 또한, 상이한 중쇄 가변 영역들 사이 또는 상이한 경쇄 가변 영역들 사이의 상응하는 잔기들이 동일한 번호를 할당받는 널리 사용되는 넘버링 규약(Kabat 넘버링)을 제공한다. Kabat 넘버링이 항체 불변 영역에 사용될 수 있지만, 본 출원에서의 경우와 같이, EU 인덱스(EU 넘버링으로도 불림)가 더 일반적으로 사용된다.
용어 "에피토프"는 다중특이성 제제의 아암이 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접 아미노산, 또는 하나 이상의 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프(선형 에피토프로도 알려짐)는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시에 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프(입체구조적 에피토프로도 알려짐)는 전형적으로 변성 용매로 처리 시 손실된다. 일부 항체는 말단 특이적 에피토프에 결합하는데, 이는 다른 폴리펩티드에 융합된 동일한 폴리펩티드에 비해 자유 말단을 갖는 폴리펩티드에 항체가 우선적으로 결합하여 자유 말단의 손실을 초래함을 의미한다. 에피토프는 전형적으로 특유의 공간 입체구조로 적어도 3개, 더욱 일반적으로는 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 입체구조를 결정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.
용어 "항원" 또는 "표적 항원"은 다중특이성 제제의 하나의 결합 부위에 의해 결합된 표적 분자를 나타낸다. 항원은 분자들 중에서도 임의의 길이의 단백질(천연, 합성 또는 재조합 발현), 핵산 또는 탄수화물일 수 있다. 항원은 수용체, 리간드, 상대 수용체, 및 외피 단백질을 포함한다.
동일하거나 중첩하는 에피토프를 인식하는 항체는 하나의 항체가 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합과 경쟁하는 능력을 보여주는 단순 면역검정에서 확인될 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 확인하기 위해 그의 항원에 결합된 항체의 X-선 결정학으로 규정될 수 있다. 대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 항원 내의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우에 두 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우에 두 항체는 중첩하는 에피토프를 갖는다.
항체 간의 경쟁은 시험 하의 항체가 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에 의해 결정된다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990] 참조). 경쟁적 결합 검정에서 측정할 때 과량의 시험 항체(예를 들어, 적어도 2배, 5배, 10배, 20배 또는 100배)가 참조 항체의 결합을 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 99%만큼 억제하는 경우에 시험 항체는 참조 항체와 경쟁한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 장애가 발생하도록 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
용어 "대상체"는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 기타 포유류 대상체를 포함한다.
아미노산 치환을 보존적 치환 또는 비보존적 치환으로 분류하기 위해, 아미노산은 하기와 같이 그룹화된다: 그룹 I (소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II (중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III (산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV (염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V (사슬 배향에 영향을 주는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI (방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류의 아미노산들 사이의 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것으로 이루어진다.
서열 동일성 백분율은 가변 영역에 대한 Kabat 넘버링 규약 또는 불변 영역에 대한 EU 넘버링에 의해 최대로 정렬된 항체 서열을 사용하여 결정된다. 정렬 후, 대상 항체 영역(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 참조 항체의 동일한 영역과 비교되는 경우, 대상 항체 영역과 참조 항체 영역 사이의 서열 동일성 백분율은 대상 항체 영역 및 참조 항체 영역 둘 모두에서 동일한 아미노산에 의해 점유된 위치의 수를 두 영역의 정렬된 위치의 총 수로 나눈 것이며, 이때 갭은 계수되지 않고, 100을 곱하여 백분율로 전환된다.
하나 이상의 언급된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 포함하는 조성물은 항체를 단독으로 또는 다른 성분들과 조합하여 함유할 수 있다.
용어 "항체-의존성 세포 세포독성", 또는 ADCC는 항체-코팅된 표적 세포(즉, 결합된 항체를 갖는 세포)와 용해 활성을 갖는 면역 세포(이펙터 세포로도 지칭됨)의 상호작용에 의존하는 세포 사멸을 유도하는 메커니즘이다. 이러한 이펙터 세포는 자연 살해 세포, 단핵구/대식세포 및 호중구를 포함한다. ADCC는 호중구, 대식세포 및 자연 살해 세포와 같은 면역 이펙터 세포 상에서 세포에 결합된 항체의 Fc 영역과 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 및 FcγRIII 사이의 상호작용에 의해 촉발된다. 표적 세포는 매개 이펙터 세포의 종류에 따라 식세포작용 또는 용해에 의해 제거된다. 항체-코팅된 표적 세포의 사멸은 이펙터 세포 활성의 결과로서 일어난다.
"항체-의존성 세포 식세포 작용" 또는 ADCP로도 알려진 옵소닌화라는 용어는 항체-코팅된 세포가 면역글로불린 Fc 영역에 결합하는 식세포 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포)에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 내재화되는 과정을 지칭한다.
용어 "보체-의존성 세포독성" 또는 CDC(CMC로도 불림)는 표적-결합 항체의 Fc 이펙터 도메인(들)이 표적 세포막에서의 구멍 형성에 이르게 하는 일련의 효소 반응을 활성화하는 세포 사멸을 유도하는 메커니즘을 지칭한다. 전형적으로, 항체-코팅된 표적 세포 상의 것과 같은 항원-항체 복합체는 보체 성분 C1q에 결합하고 활성화하고, 이는 다시 보체 캐스케이드를 활성화하여 표적 세포 사멸을 유도한다. 보체의 활성화는 또한 백혈구 상의 보체 수용체(예를 들어, CR3)에 결합함으로써 ADCC를 촉진하는 표적 세포 표면 상의 보체 성분의 침착을 초래할 수 있다.

I. 일반

본 발명은 제1 포식 금지 수용체(don't eat me receptor)에 특이적으로 결합하는 제1 결합 아암 및 제2 포식 금지 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 아암을 포함하는 다중특이성 제제를 제공한다. 이러한 제제는 각각 CD47 및 CD24에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 아암을 갖는 다중특이성 제제, 및 각각 SIRPα 및 siglec-10에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 아암을 갖는 다중특이성 제제에 의해 예시된다. CD47 및 CD24 둘 모두를 표적화하는 것은 2개의 포식 금지 신호를 제거하는 데 유리한데, 2개의 포식 금지 신호 중 하나는 이펙터 세포에 의한 표적 세포(예를 들어, 암성 세포)의 제거를 감소시킬 것이다. 동일한 제제로부터의 CD47 및 CD24 둘 모두를 표적화하는 것은 CD47 및 CD24 둘 모두를 발현하는 표적 세포 및 이들 분자 중 하나만을 발현하는 비-표적 세포의 결합 사이의 더 높은 구별을 초래하여, 예를 들어 CD24가 아니라 CD47을 발현하는 적혈구에 대한 치료제의 결합을 감소시킨다. 다중특이성 제제로부터의 CD47 및 CVD24, SIRPα 및 siglec-10의 상대 수용체를 표적화하는 것이 유사한 이점을 갖는다.

II. 표적

다중-특이성 제제의 결합 아암을 결합하기 위한 표적은 포식 금지 수용체 또는 그의 상대 수용체이다. 포식 금지 수용체는 세포가 전형적으로 존재하는 유기체의 면역계로부터 수용체를 발현하는 세포를 보호하는 수용체이다. 수용체는 선천 면역계 또는 적응 면역계 또는 둘 모두로부터 세포를 보호할 수 있다. CD47 및 CD24는 선천 면역계에 대해 보호한다.

CD24(스위스 프로트(Swiss Prot) P25063)는 성숙 단백질 내의 16개의 잠재적인 O- 및 N-글리코실화 부위(인간에서)를 갖는 31개의 아미노산을 갖는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-고정 세포 표면 단백질이다. 측쇄는 α2, 3 및 α2, 6 시알산, 루이스 × 항원 및 HNK-1 탄수화물을 포함한다. 인간 CD24는 먼저 80개의 아미노산 전구체로서 발현되며, 이로부터 잔기 1 내지 26을 차지하는 신호 펩티드 및 잔기 60 내지 80에 상응하는 프로펩티드가 성숙한 형태로부터 제거된다. CD24에 대한 항체는 단백질 코어 또는 시알산 측쇄 또는 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있다. siglec-10과의 CD24 상호작용은 적어도 부분적으로는 α2, 3 및 α2, 6 시알산에 의해 매개되는 것으로 생각된다.

CD47(스위스 프로트 Q08722)은 5개의 막관통 도메인, 3개의 세포질(잔기 163 내지 176, 229 내지 235, 및 290 내지 323) 및 3개의 세포외 도메인(잔기 19 내지 141, 198 내지 207 및 257 내지 268)을 포함하는 막 결합 글리코실화 수용체이다. 잔기 1 내지 18은 신호 펩티드이다. 수용체는 글리코실화 및 인산화 부위를 갖는다.

SIRPα(스위스 프로트 P78324)는 496개 아미노산의 수용체이고, 그 중 잔기 1 내지 20은 신호 펩티드이고, 잔기 31 내지 373은 세포외 도메인이고, 잔기 374 내지 394는 막관통 도메인이고, 잔기 395 내지 504는 세포질이다. 수용체는 글리코실화 및 인산화 부위를 갖는다.

Siglec-10(스위스 프로트 Q96LC7)은 697개 아미노산의 수용체이고, 그 중 잔기 1 내지 16은 신호 펩티드이고, 잔기 17 내지 550은 세포외 도메인이고, 잔기 551 내지 571은 막관통 도메인이고, 잔기 572 내지 697은 세포질이다. 수용체는 이황화 결합, 및 글리코실화 및 인산화 부위를 포함한다.

문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 특정 표적에 대한 언급은 인간 형태, 특히 제공된 스위스 프로트 수탁 번호의 인간 형태를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 그러나, 비인간 형태, 예컨대 실험실의 비인간 형태(예를 들어, 마우스, 래트), 반려 동물 또는 농장 동물이 또한 사용될 수 있다.

다중특이성 제제에 의한 표적화를 위한 포식 금지 수용체 또는 그의 상대 수용체의 페어링(pairing)과 관련된 인자는 비표적 분자의 비견되는 크기의 싱크의 존재(다시 말해, 표적이 암 세포인 경우, 비표적 분자는 치료 중인 대상체의 정상 세포 중 임의의 것에서 발현된 것임) 및 SHP-1 경로를 통한 것과 같은 동일한 메커니즘에 의한 면역 반응 억제를 포함한다.

선택적으로, 다중특이성 제제는 다른 결합 아암에 의해 표적화된 포식 금지 수용체와 함께 암 세포 상에서 공동-발현되는 암-관련 항원에 특이적으로 결합하는 제3 결합 아암을 포함한다. 제3 아암의 존재는 면역 이펙터 세포에 의한 암 세포의 사멸을 촉진한다. 종양 세포 항원의 예는, 예를 들어 CD19, CD96, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52, CD123, CD44, EGFR, VEGFR, BRCA1 및 -2, PSMA, PD-L1, PSA, CEA, HER-2, Mart1/MalanA, Erbb2, IL-17R, PDGFR-α, SLMF7, GD2, CTLA-4, RANKL, 및 EpCAM을 포함한다.

III. 예시적인 항체 또는 ECD

다중특이성 제제는 구성 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 쌍, 및/또는 포식 금지 수용체의 ECD로부터 형성된다. 다중특이성 제제의 결합 아암들은 그의 표적에 대해 대략 동일한 친화도(예를 들어, 2, 3 또는 4배 이내) 또는 상이한 친화도(5배 또는 10배 초과의 차이)를 가질 수 있다. 표적 세포에 대한 수용체의 온(on) 및 오프(off)의 비율이 상이한 제1 및 제2 포식 금지 수용체에 대해 표적화된 다중-특이성 제제에 대해, 비표적 분자에 대한 표적의 비율이 더 높은 수용체에 결합하는 결합 아암은 다른 수용체에 결합하는 결합 아암보다 더 높은 친화도를 가져서 제제의 비표적 결합을 최소화하는 것이 바람직하다.

구성 항체는 특히 설치류 항체, 키메라 항체, 베니어화(veneered) 항체, 인간화 항체, 영장류화(primatized) 항체, 영장류 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 구성 항체는 동일하거나 상이한 유형의 것일 수 있으며; 예를 들어, 하나는 인간화 항체일 수 있고 다른 하나는 인간 항체일 수 있다.

항원에 대한 다른 비인간, 예를 들어, 쥣과, 기니피그, 영장류, 토끼 또는 래트 단일클론 항체의 생산은, 예를 들어, 동물을 항원 또는 이의 단편, 또는 항원을 보유하는 세포로 면역화함으로써 달성될 수 있다. 문헌[Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988)](모든 목적을 위해 참고로 포함됨)을 참조한다. 이러한 항원은 천연 공급원으로부터, 펩티드 합성에 의해, 또는 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다. 선택적으로, 항원은 담체 단백질과 융합되거나 그렇지 않으면 복합체를 형성하여 투여될 수 있다. 선택적으로, 항원은 어쥬번트(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 몇몇 유형의 어쥬번트가 하기에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 완전 프로인트 어쥬번트 후의 불완전 어쥬번트가 실험실 동물의 면역화에 바람직하다.

인간화 항체는 비인간 "공여자"(donor) 항체로부터의 CDR이 인간 "수용자"(acceptor) 항체 서열로 이식되는 유전자 조작된 항체이다(예를 들어, Queen의 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호; Winter의 미국 특허 제5,225,539호, Carter의 미국 특허 제6,407,213호, Adair의 미국 특허 제5,859,205호, Foote의 미국 특허 제6,881,557호 참조). 수용자 항체 서열은, 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합체, 인간 항체 서열의 공통 서열, 또는 생식세포계열 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 전체적으로 또는 실질적으로 공여자 항체로부터의 일부 또는 모든 CDR 및 존재하는 경우, 전체적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화 중쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 공여자 항체 중쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 보통 3개 모두의 CDR, 및 존재하는 경우, 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 유사하게, 인간화 경쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 공여자 항체 경쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 보통 3개 모두의 CDR, 및 존재하는 경우, 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 나노바디 및 dAb 이외에, 인간화 항체는 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄를 포함한다. 인간화 항체 내의 CDR은 상응하는 잔기(Kabat에 의해 정의된 바와 같음)의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각각의 CDR 사이에서 동일한 경우에 비인간 항체 내의 상응하는 CDR로부터 실질적으로 유래된다. 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 영역은 Kabat에 의해 정의된 상응하는 잔기의 적어도 85, 90, 95 또는 100%가 동일한 경우에 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터 실질적으로 유래된다.

인간화 항체는 종종 마우스 항체로부터의 6개의 CDR 모두(바람직하게는 Kabat에 의해 정의된 바와 같음)를 포함하지만, 전체 CDR보다 적은 수(예를 들어, 마우스 항체로부터의 적어도 3, 4 또는 5개의 CDR)로 만들어질 수도 있다(예를 들어, 문헌[Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002]; 문헌[Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002]; 문헌[Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999]; 문헌[Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000]).

키메라 항체는 비인간 항체(예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합된 항체이다. 이러한 항체는 마우스 항체의 결합 특이성을 실질적으로 또는 전체적으로 보유하며, 인간 서열의 약 2/3이다.

베니어화 항체는, 비인간 항체의 일부 및 보통 모든 CDR 및 비인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부를 보유하지만 B- 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들어 노출된 잔기(문헌[Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991])를 인간 항체 서열의 상응하는 위치의 잔기로 대체하는 인간화 항체의 유형이다. 결과는 CDR이 전체적으로 또는 실질적으로 비인간 항체로부터 유래되고 비인간 항체의 가변 영역 프레임워크가 치환에 의해 더 인간과 유사하게 만들어지는 항체이다.

인간 항체는 인간으로부터 단리될 수 있거나, 그렇지 않으면 인간 면역글로불린 유전자의 발현(예를 들어, 트랜스제닉 마우스에서, 시험관 내에서, 또는 파지 디스플레이에 의해)의 결과일 수 있다. 인간 항체를 생산하는 방법은 문헌[Oestberg et al., Hybridoma 2: 361-367(1983)]; Oestberg의 미국 특허 제4,634,664호; 및 Engleman 등의 미국 특허 제4,634,666호의 트리오마(trioma) 방법, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스의 사용(예를 들어, Lonberg 등의 WO93/12227호(1993)); 미국 특허 제5,877,397호, 제5,874,299호, 제5,814,318호, 제5,789,650호, 제5,770,429호, 제5,661,016호, 제5,633,425호, 제5,625,126호, 제5,569,825호, 제5,545,806호, 문헌[Nature 148, 1547-1553 (1994)], 문헌[Nature Biotechnology 14, 826 (1996)], Kucherlapati의 WO 91/10741호(1991) 참조) 및 파지 디스플레이 방법(예를 들어, Dower 등의 WO 91/17271호 및 McCafferty 등의 WO 92/01047호, 미국 특허 제5,877,218호, 제5,871,907호, 제5,858,657호, 제5,837,242호, 제5,733,743호 및 제5,565,332호 참조)을 포함한다.

항체는 의도된 표적(예를 들어, CD47, CD24, SIRPα 또는 siglec-10)에 대한 특이적 결합에 대해 스크리닝된다. 항체는 표적의 특정 영역에 대한 결합, 참조 항체와의 경쟁, 리간드 또는 상대 수용체에 대한 표적 결합을 갖는 세포의 길항작용(예를 들어, SIRPα에 대한 CD47 결합 또는 siglec-10에 대한 CD24 결합의 길항작용)에 대해 추가로 스크리닝될 수 있다. 일부 항체는 SIRPα에 대한 CD47 결합 또는 siglec-10에 대한 CD24 결합을 10, 5 또는 1 ug/ml 미만의 IC50으로 길항한다. 비인간 항체는 상기에 기재된 바와 같이 키메라, 베니어화 또는 인간화 형태로 전환될 수 있다.

다른 항체는 Kabat, 또는 대안적인 정의, 예컨대 Chothia, Chothia와 Kabat의 복합, AbM 또는 Contact(월드 와이드 웹 bioinf.org.uk/abs 참조)에 의해 정의된 것과 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 동일한 6개의 CDR을 갖거나, 동일한 에피토프에 대한 결합, 또는 표적 단백질에 대한 이들 항체 중 임의의 것과의 결합에 대한 경쟁이 또한 사용될 수 있다.

적합한 항-CD47 항체의 예는 클론 B6H12, 5F9, 8B6, C3(예를 들어, WO 2011/143624호에 기재된 바와 같음) CC9002(문헌[Vonderheide, Nat Med 2015; 21: 1122-3., 2015]), SRF23(서피스 온콜로지(Surface Oncology)) 및 ZF1(문헌[Zeng et al., Oncotarget. 2016 Dec 13; 7(50): 83040-83050])을 포함한다. 적합한 항-CD47 항체는 이러한 항체의 인간, 인간화 또는 키메라 버전, 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체, 또는 이러한 항체의 6개 CDR, 및 CD47에 대한 결합에 대해 동일한 에피토프에 결합하거나 이와 경쟁하는 항체를 포함한다. 인간화 항체(예를 들어, hu5F9-IgG4-WO2011/143624 또는 마그롤리맙(magrolimab))는 그의 낮은 항원성으로 인해 인간에서의 생체내 응용에 특히 유용하다. 일부 인간화 항체는 각각 WO2011/143624호의 서열 번호 20, 21 및 22에 제시된 VH 상보성 영역, CDR1, CDR2 및 CDR3을 함유하는 가변 중쇄(VH) 영역; 및 각각 서열 번호 23, 24 및 25에 제시된 VL 상보성 영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 함유하는 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 인간 CD47(본 명세서에서 서열 번호 1 내지 6)에 특이적으로 결합한다. 일부 인간화 항체는 WO2011/143624호에 제시된 서열번호 36, 서열번호 37 및 서열번호 38로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 41 및 서열번호 42 및 서열번호 43으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함한다(본 명세서에서 서열번호 7 내지 12). 유사하게, 개화(caninized), 고양이화(felinized) 항체 등은 각각 개, 고양이, 및 다른 종에서의 응용에 특히 유용하다.

적합한 항-SIRPα 항체는 (식세포작용을 억제하기 위한 신호전달 반응을 충분히 활성화/자극하지 않고서) SIRPα에 특이적으로 결합하고, SIRPα와 CD47 사이의 상호작용을 억제한다. 적합한 항-SIRPα 항체는 이러한 항체의 완전 인간, 인간화 또는 키메라 버전을 포함한다. 예시적인 항체는 KWAR23(문헌[Ring et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2017 Dec 5; 114(49): E10578-E10585], WO/2015/138600호), MY-1, Effi-DEM (문헌[Zhang et al., Antibody Therapeutics, Volume 1, Issue 2, 21 September 2018, Pages 27-32])이다. 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 동일한 6개의 CDR을 공유하거나, SIRPα에 대한 결합 또는 이들 항체 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다.

인간화 항체는 그의 낮은 항원성으로 인해 인간에서의 생체내 응용에 특히 유용하다. 유사하게, 개화, 고양이화 항체 등은 각각 개, 고양이, 및 다른 종에서의 응용에 특히 유용하다.

SIRPα에 특이적으로 결합하고 암 세포 상의 CD47과 식세포 상의 SIRPα 사이의 상호작용을 감소시키는 가용성 CD47 폴리펩티드가 SIRPα 항체 대신에 사용될 수 있다(예를 들어, WO2016179399호 참조). 이러한 폴리펩티드는 전체 ECD 또는 상기 기능을 갖는 그의 부분을 포함할 수 있다. 적합한 가용성 CD47 폴리펩티드는 SIRPα의 활성화가 식세포작용을 억제할 것이기 때문에 SIRPα를 통한 신호전달을 활성화하거나 자극하지 않고 SIRPα에 특이적으로 결합한다. 대신에, 적합한 가용성 CD47 폴리펩티드는 암 세포의 식세포작용을 촉진한다. 가용성 CD47 폴리펩티드는 Fc에 융합될 수 있다(예를 들어, US20100239579호에 기재된 바와 같음).

마찬가지로, 가용성 SIRPα 폴리펩티드는 CD47에 대한 항체 대신에 사용될 수 있다. 예시적인 제제는 ALX148(문헌[Kauder et al., Blood 2017 130:112]) 및 TTI-622 및 TTI-661 트릴리움(Trillium)을 포함한다. 이러한 제제는 전체 SIRPα ECD 또는 상기 기능을 갖는 그의 임의의 부분을 포함할 수 있다. SIRPα 시약은 보통 SIRPα의 적어도 d1 도메인을 포함할 것이다. 가용성 SIRPα 폴리펩티드는 Fc 영역에 융합될 수 있다. SIRPα-유도된 폴리펩티드 및 그의 유사체(예를 들어, CV1-hlgG4, 및 CV1 단량체)를 포함하는 "고친화성 SIRPα 시약"으로 명명된 예시적인 SIRPα 폴리펩티드가 WO2013/109752호에 기재되어 있다. 고친화성 SIRPα 시약은 천연 SIRPα 단백질의 변이체이다. 증가된 친화도를 제공하는 아미노산 변화는 d1 도메인에 국한되며, 따라서 고친화성 SIRPα 시약은 d1 도메인 내의 야생형 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 변화를 갖는 인간 SIRPα의 d1 도메인을 포함한다. 이러한 고친화성 SIRPα 시약은 선택적으로 추가의 아미노산 서열, 예를 들어 항체 Fc 서열; 천연 단백질의 잔기 150 내지 374 또는 이의 단편, 보통 d1 도메인과 인접한 단편을 제한 없이 포함하는, d1 도메인 이외의 야생형 인간 SIRPα 단백질의 부분 등을 포함한다. 고친화성 SIRPα 시약은 단량체성 또는 다량체성, 즉 이량체, 삼량체, 사량체 등일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 고친화성 SIRPα 시약은 가용성이고, 여기서 폴리펩티드는 SIRPα 막관통 도메인이 없고 야생형 SIRPα 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 변화를 포함하며, 아미노산 변화는 예를 들어 오프율(off-rate)을 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 또는 그 이상만큼 감소시킴으로써 CD47에 대한 SIRPα 폴리펩타이드 결합의 친화도를 증가시킨다.

CD24에 대한 항체는 단백질 코어 내의 에피토프 또는 하나 이상의 시알산 측쇄 내의 에피토프 또는 단백질 코어 및 하나 이상의 시알산 측쇄 둘 모두가 기여하는 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 항체는 정제된 CD24 단백질 또는 이의 펩티드 성분인 면역원, 또는 CD24가 포스파티딜이노시톨 링커를 통해 세포 표면에 연결된 CD24를 발현하는 세포를 사용하여 생성될 수 있다. 세포가 사용되는 경우, 세포는 암에 대해 치료될 특정 대상체로부터의 세포를 포함하는 암 세포일 수 있거나, CD24를 발현하는 세포주일 수 있다. 암에 대해 활성을 갖는 CD24 항체는 WO2009063461호 및 WO2008002112호에 기재되어 있다. CD24에 대한 다수의 항체가 구매가능하다(월드 와이드 웹 biocompare.com/pfu/110447/soids/3585/Antibodies/CD24O 참조). 인간 C24에 특이적으로 결합하는 이러한 항체의 예는 MAB5248 및 AF5247(알앤디 시스템즈(R&D Systems)), 32D12(스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies)) 및 SN3(바이오래드(BioRad))을 포함한다. 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 동일한 6개의 CDR을 공유하거나, CD24에 대한 결합 또는 이들 항체 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다.

선택적으로, Fc 융합 단백질에 연결된 CD24의 가용성 형태가 자가면역 질환의 치료와 관련하여 몇몇 특허 간행물에 기재되어 있다. 이들 특허 간행물은 WO2001072355호, WO2011113047호, WO2018217659호, WO2018213266호 및 WO2018105204호를 포함한다.

siglec-10에 대한 항체는 siglec-10 단백질, 그의 세포외 도메인 또는 세포외 도메인으로부터의 펩티드 또는 siglec-10을 발현하는 세포로 면역화함으로써 생성될 수 있다. 항체는 siglec-10에 대한 특이적 결합에 대해 그리고 선택적으로 다른 siglec(예를 들어, siglec 1 내지 9 및 11 내지 16)에 대한 특이적 결합의 결여에 대해 스크리닝될 수 있다. 이어서, 항체는 CD24 또는 시알산 변형된 CD24에 대한 결합의 억제에 대해 스크리닝될 수 있다. siglec-10에 특이적으로 결합하고 다른 siglec에는 결합하지 않고 시알산에 대한 siglec-10의 결합을 억제하는 항체의 예가 WO2017085166호에 기재되어 있다. 인간 siglec-10에 대한 항체가 또한 구매가능하다(월드 와이드 웹 biocompare.com/pfu/110447/soids/331695/Antibodies/SIGLEC10 참조). 이러한 항체의 예는 알앤디 시스템즈로부터의 AF2130, 바이오-래드로부터의 5G6, 및 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals)로부터의 NBP1-59247을 포함한다. 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 동일한 6개의 CDR을 공유하거나, siglec-10CD24에 대한 결합 또는 이들 항체 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다.

IV. 다중특이성 제제를 위한 포맷

이중특이성 또는 다중특이성 제제에 대해 100개 초과의 포맷이 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Kontermann et al., Drug Discovery Today 20, 838-847 (2015)]; 문헌[Sedykh et al., Drug Des. Devel. Ther. 2, 195-209 (2018)]). 이러한 포맷은 2개의 표적의 각각에 대해 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 일부 포맷은 각각의 표적에 대해 2개 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 포맷은 적어도 3개의 표적의 각각에 대해 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.

일부 포맷은 2개의 표적의 각각에 대해 하나씩, 2개의 상이한 결합 영역을 갖는 정상 항체와 유사한 사량체 구조를 갖는다. 각각의 결합 영역은 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 각각 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 쌍으로부터 형성된다. 이러한 이중특이성 항체는 2개의 결합 부위 및 이를 형성하는 중쇄 및 경쇄 쌍이 상이하다는 점에서 정상 항체와 상이하다. 따라서, 이러한 항체는 중쇄 및 경쇄의 2개의 상이한 쌍의 회합을 필요로 한다.

"노브-인투-홀(knob-into-hole)" 접근법은, 하나의 항체의 CH3 도메인 내의 작은 아미노산을 큰 아미노산으로 치환하고("노브") 다른 항체에 대해 그 반대로 함으로써("홀") 중쇄의 페어링 오류(mispairing) 및 동종이량체의 형성을 감소시키기 위해 채택되었다(문헌[Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-21, 1996]; 문헌[Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997]; 및 미국 특허 제7,695,936호). 이러한 포맷의 경쇄 페어링 오류는 다수의 전략에 의해 감소될 수 있다. 하나의 전략은 2개의 상이한 중쇄 가변 영역에 대해 공통 경쇄 가변 영역을 사용하는 것이다. 그러나, 이는 일부 항체들에만 적용가능하다. 다른 접근법은 상이한 박테리아에서 노브- 및 홀-함유 반-분자(half-molecule)를 별도로 발현시키는 것이었다. 크로스맙(CrossMab)으로 지칭되는 다른 접근법은 중쇄 중 하나의 CH1 도메인을 상응하는 경쇄의 불변 CL 도메인과 교환하여 경쇄의 올바른 페어링을 유도한다. 문헌[Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:11187-92, 2011]; WO 2009/080251호; WO 2009/080252호; WO 2009/080253호. 다른 접근법은 VH-VL 및 CH1-CL 경계에 추가의 돌연변이를 도입하는 것이었다. 문헌[Lewis et al., Nat. Biotechnol. 32, 191-198 (2014)]. 이러한 돌연변이는 중쇄가 경쇄와 우선적으로 쌍을 이루도록 한다. 다른 접근법은 단백질 A 결합을 촉진하는 돌연변이를 Fc 영역 중 하나에 도입하고 친화도 크로마토그래피에 의해 더 높거나 더 낮은 단백질 A 결합을 갖는 동종이량체로부터 중간 단백질 A 결합을 갖는 이종이량체 쌍을 선택하는 것이었다(문헌[Tusdian et al, MAbs. 8(4):828-38 (2016)]).

다른 이중특이성 항체는 동일한 중쇄 경쇄 쌍 내에서 다수의 결합 특이성을 조합함으로써 페어링 오류 문제를 회피한다. 이중 가변 도메인으로 지칭되는, 이를 수행하기 위한 하나의 접근법은 2개의 상이한 중쇄 가변 영역을 중쇄 불변 영역에 나란히 연결하고 2개의 상이한 경쇄 가변 영역을 경쇄 불변 영역에 나란히 연결하는 것이다. 문헌[Correia et al., MAbs. 2013 May 1; 5(3): 364-372]. 이러한 항체는 2개의 동일한 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄의 회합에 의해 사량체로서 조립될 수 있다. 조립된 항체는 각각의 표적에 대해 2개의 상이한 결합 부위를 포함한다.

다른 접근법은 scFv를 중쇄 불변 영역의 C-말단에 연결함으로써 제2 결합 특이성을 통합하는 것이다. 이러한 이중특이성은 표준 항체에서와 같이 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 N-말단에 부착된 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 의해 형성된 제1 결합 부위를 포함한다. 중쇄의 C-말단은 제2 결합 부위를 제공하는 scFv에 부착된다. scFv는 일반적으로 링커를 통해 부착되며, 추가의 링커는 scFv 내의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 연결한다. scFv는 그의 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역 말단을 통해 링커를 통해 Fc 영역에 부착될 수 있다. 2개의 동일한 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄의 복합화에 의해 조립될 때, 이러한 이중특이성은 2개의 상이한 특이성의 각각을 위한 2개의 결합 부위를 포함한다. 각각의 표적에 대한 항체는 어느 한 배향으로 부착될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 N-말단에 부착되는 아암은 별도의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로서 제공되고, C-말단에 부착되는 아암은 scFv 단편으로서 제공된다.

다른 포맷은 제1 표적에 특이적으로 결합하는 scFv를 중쇄 불변 영역에 연결하고 또 다른 표적에 특이적으로 결합하는 scFv를 경쇄 불변 영역에 연결한다. 이러한 항체는 각 결합 부위의 2개의 카피를 포함하는 사량체로 조립된다(Bs(scFv)4-IgG). (문헌[Zuo et al., Protein Eng 13: 361-367, 2000]).

다른 포맷은 불변 영역 없이 단일 사슬 상에서 scFv 결합 영역을 연결한다. 예를 들어, BiTe 포맷은 링커를 통해 2개의 scFv 단편을 연결한다(예를 들어, 문헌[Ross et al., PLoS ONE 12(8): e0183390, 2017] 참조). 이러한 포맷은 이펙터 기능이 결여되어 있고 짧은 반감기를 갖는 경향이 있지만, 그들의 작은 크기로 인해 접근성 및 제조 용이성의 이점을 가질 수 있다. 다른 포맷은 2개 이상의 상이한 scFv를 Fc 도메인에, 보통 그의 N-말단에 연결한다.

상기 포맷들 중 임의의 것에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 결합 아암은 포식 금지 수용체 또는 그의 상대 수용체의 ECD로 대체될 수 있다. 보통, ECD는 이러한 포맷으로 Fc 도메인에 융합된다.

포맷들 중 다수는 3개 이상의 결합 아암을 갖는 다중특이성으로 확장될 수 있다(예를 들어, 문헌[Rune et al., Mol. Med 24, 50(2018)], 문헌[Steinhardt et al., Nature Communications 9, 877(2018)], 문헌[Hu et al., Cancer Res, 75, 159-170(2015)] 참조). 예를 들어, 정상 항체와 동일한 사량체 구조를 갖는 이중특이성 포맷은 중쇄 또는 경쇄 상에 또는 Fc 단편의 C-말단 상에 scFv를 포함함으로써 삼량체 이상으로 확장될 수 있다. 대안적으로, 제3 결합 아암을 인코딩하는 별도의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 사량체 항체 구조의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 융합될 수 있다. 마찬가지로, BiTe 포맷은 3개 이상의 scFv를 나란히 융합시킴으로써 확장될 수 있다.

상대 수용체의 ECD는 수용체에 대한 항체와 유사하게 거동하고, 수용체의 ECD는 상대 수용체에 대한 항체와 유사하게 거동한다. ECD는 수용체의 리간드 또는 상대 수용체에 결합하는 능력을 보유하기 위해 수용체의 세포외 부분으로부터의 충분한 서열을 포함해야 한다.

상기 포맷들 중 다수는 중쇄 및 경쇄 가변 영역들 사이에 또는 가변 영역과 불변 영역 사이에 링커 펩티드를 포함한다. 링커는 종종 주로 gly, ala 및/또는 ser에 의해 점유되는 유연성을 부여하는 짧은 펩티드이다. 일부 예시적인 링커는 Gly-Gly-Ala-Ala, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Leu-Ala-Ala-Ala-Ala 및 이들의 다량체이다.

V. 불변 영역의 선택

다중특이성 제제에 대한 포맷들 중 다수는 인간 불변 영역 또는 그의 Fc 부분의 적어도 일부를 포함한다. 불변 영역의 선택은 항체-의존성 세포-매개 세포독성, 항체 의존성 세포 식세포작용 및/또는 보체 의존성 세포독성이 요구되는지 여부에 따라 부분적으로 좌우된다. 예를 들어, 인간 동종형 IgG1 및 IgG3은 보체-의존성 세포독성을 갖지만 인간 동종형 IgG2 및 IgG4는 갖지 않는다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매개 이펙터 기능을 유도한다. 본 발명의 다중특이성 제제의 경우, IgG4, IgG2 또는 이펙터 기능이 감소된 약화된 IgG1이 일반적으로 바람직한데, 그 이유는 여기에서 ADCC, ADCP 및 CDC가 다중특이성 제제의 하나의 아암에 의해 결합된 암 세포에 대한 추가 작용 메커니즘을 제공하는 데 유용할 수 있지만, 또한 비표적 세포에 대한 독성을 증가시키기 때문이다. 따라서, 인간 IgG4, IgG2 또는 이펙터 기능이 감소된 돌연변이된 IgG1이 일부 다중특이성 제제에 바람직하다.

중쇄의 C-말단 라이신과 같은 경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에 있는 하나 이상의 아미노산은 분자의 일부 또는 전부에서 누락되거나 유도체화될 수 있다. 불변 영역에서 치환이 이루어져서 보체-매개 세포독성 또는 ADCC와 같은 이펙터 기능을 감소 또는 증가시키거나 글리코실화 부위를 제거하거나(예를 들어, Winter 등의 미국 특허 제5,624,821호; Tso 등의 미국 특허 제5,834,597호; 및 문헌[Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조), 인간에서의 반감기를 연장할 수 있다(예를 들어, 문헌[Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조). 예를 들어, FcRn 결합을 증가시키는 IgG Fc에 많은 공지된 돌연변이가 있다. 예시적인 치환은 위치 250에서의 Gln 및/또는 위치 428에서의 Leu, 위치 434에서의 Ser 또는 Asn, 위치 252에서의 Tyr, 위치 254에서의 Thr, 및 위치 256에서의 Glu, 및 위치 434에서의 Ala를 포함한다(EU 넘버링). 증가된 FcRn 결합은 본 발명의 하이브리드 단백질이 FcRn에 대한 결합에 대해 내인성 IgG와 더 강하게 경쟁하도록 하는 데 유리하다. 또한, ADCC, ADCP 또는 CMC 중 임의의 것을 감소시키기 위한 다수의 돌연변이가 알려져 있다. (예를 들어, Winter 등의 미국 특허 제5,624,821호; Tso 등의 미국 특허 제5,834,597호; 및 문헌[Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조). 예를 들어, 위치 234, 235, 236 및/또는 237 중 임의의 것의 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화도를 감소시킨다(예를 들어, US 6,624,821호 참조). 선택적으로, 인간 IgG2 내의 위치 234, 236 및/또는 237이 알라닌으로 치환되고 위치 235가 글루타민 또는 글루탐산으로 치환된다. (예를 들어, US 5,624,821호 참조) 이펙터 기능을 감소시키는 다른 치환은 위치 268에서의 Ala, 위치 297에서의 Gly 또는 Ala, 위치 309에서의 Leu, 위치 322에서의 Ala, 위치 327에서의 Gly, 위치 330에서의 Ser, 위치 331에서의 Ser, 위치 238에서의 Ser, 위치 268에서의 Ala, 위치 309에서의 Leu를 포함한다.

인간 불변 영역은 상이한 개체 간의 동종이형(allotypic) 변이 및 아이소동종이형(isoallotypic) 변이를 보여주며, 즉, 불변 영역은 하나 이상의 다형성(polymorphic) 위치에서 상이한 개체에서 상이할 수 있다. 아이소동종이형은, 아이소동종이형을 인식하는 혈청이 하나 이상의 다른 동종형의 비-다형성 영역에 결합한다는 점에서 동종이형과는 상이하다.

VI. 재조합 다중특이성 제제의 발현

다중특이성 제제는 전형적으로 재조합 발현에 의해 생산된다. 포맷에 따라, 1개, 2개 또는 그 이상의 항체 사슬 및/또는 ECD 도메인에 대해 발현이 요구될 수 있다. 다수의 사슬이 발현되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 벡터로부터 발현될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드 작제물은 전형적으로 자연적으로 회합되거나 이종인 발현 조절 요소, 예컨대 프로모터를 포함하는 항체 사슬의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함한다. 발현 조절 서열은 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 프로모터 시스템일 수 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현 및 다중특이성 제제의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지된다.

이들 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수적인 부분으로서 복제가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포를 검출할 수 있도록 선택 마커, 예를 들어, 암피실린 내성 또는 하이그로마이신 내성을 포함한다.

이. 콜라이(E. coli)는 항체, 특히 항체 단편을 발현시키는 데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 효모와 같은 미생물이 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스는 원하는 대로 발현 조절 서열, 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 갖는 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는, 특히, 알코올 탈수소효소, 아이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.

포유류 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 세그먼트를 발현하는데 사용될 수 있다. 문헌[Winnacker, From to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]을 참조한다. 온전한 이종 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었으며, 이는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포, 및 Sp2/0 및 NS0을 포함하는 비-항체-생산 골수종을 포함한다. 세포는 비인간 세포일 수 있다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 인핸서(문헌[Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)]), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스(splice) 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은 내인성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종바이러스 등으로부터 유래된 프로모터를 포함할 수 있다. 문헌[Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)]을 참조한다.

대안적으로, 다중특이성 제제를 인코딩하는 서열은 트랜스제닉 동물의 게놈 내로의 도입 및 트랜스제닉 동물의 젖에서의 후속 발현을 위해 트랜스진(transgene)에 포함될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,741,957호; 미국 특허 제5,304,489 호; 및 미국 특허 제5,849,992호 참조). 적합한 트랜스진은 카제인 또는 베타 락토글로불린과 같은 유선 특이적 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동가능하게 연결된 ECD, 또는 경쇄 및/또는 중쇄에 대한 코딩 서열을 포함한다.

관심 DNA 세그먼트를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따른 방법에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 일반적으로 원핵 세포에 사용되는 반면, 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션(lipofection), 유전자총법(biolistics) 또는 바이러스-기반 형질감염은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. 포유류 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포좀, 전기천공 및 미세주입의 사용을 포함한다. 트랜스제닉 동물의 생성을 위해, 트랜스진은 수정된 난모세포 내로 미세주입될 수 있거나 배아 줄기 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있으며, 이러한 세포의 핵은 제핵된 난모세포로 전달된다.

항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 벡터(들)를 세포 배양물 내로 도입하면, 세포 풀(pool)을 무혈청 배지에서 성장 생산성 및 생산물 품질에 대하여 스크리닝할 수 있다. 이어서, 최고 생산 세포 풀에 FACS-기반 단일 세포 클로닝을 적용하여 단일 클론 계통을 생성할 수 있다. 7.5 g/L 초과의 배양물의 생산물 역가에 상응하는, 1일에 세포당 50 pg 또는 100 pg 초과의 비생산성(specific productivity)을 사용할 수 있다. 단일 세포 클론에 의해 생성된 항체를 또한 탁도, 여과 특성, PAGE, IEF, UV 스캔, HP-SEC, 탄수화물-올리고당 맵핑, 질량 분석법, 및 결합 검정, 예컨대 ELISA 또는 비아코어(Biacore)에 대해 시험할 수 있다. 이어서, 선택된 클론을 다수의 바이알에 보관(banking)하고, 후속 사용을 위해 동결저장할 수 있다.

일단 발현되면, 다중특이성 제제는 단백질 A 포획, HPLC 정제, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비롯한 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조).

코돈 최적화, 프로모터의 선택, 전사 요소의 선택, 종결자의 선택, 무혈청 단일 세포 클로닝, 세포 보관, 카피수의 증폭을 위한 선택 마커의 사용, CHO 종결자, 또는 단백질 역가의 개선을 포함하는, 항체 또는 Fc 융합 단백질의 상업적 생산을 위한 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, US 5,786,464호; US 6,114,148호; US 6,063,598호; US 7,569,339호; W02004/050884호; W02008/012142호; W02008/012142호; W02005/019442호; W02008/107388호; W02009/027471호; 및 US 5,888,809호 참조).

VII. 핵산

본 발명은 전술된 임의의 항체 또는 ECD 사슬을 인코딩하는 핵산을 추가로 제공한다. 선택적으로, 이러한 핵산은 신호 펩티드를 추가로 인코딩하고, 불변 영역에 연결된 신호 펩티드와 함께 발현될 수 있다. 핵산의 코딩 서열은 코딩 서열의 발현을 보장하기 위한 조절 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 리보좀 결합 부위, 전사 종결 신호 등과 작동가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 또는 ECD를 인코딩하는 핵산은 단리된 형태로 발생할 수 있거나 하나 이상의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 핵산은, 예를 들어, 중첩되는 올리고뉴클레오티드의 고상 합성 또는 PCR에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은, 예를 들어, 발현 벡터 내의 하나의 인접 핵산으로서 연결될 수 있거나, 별도로 존재하여, 예를 들어, 그 자신의 발현 벡터 내로 각각 클로닝될 수 있다.

VIII. 치료 방법 및 약제학적 조성물

본 발명의 다중특이성 제제는 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 암은 다중특이성 제제의 각각의 표적, 예컨대 CD24 및 CD47을 동시에 발현하는 세포를 갖는다. 그러나, 예를 들어, SIRPα 및 siglec-10에 대한 일부 다중특이성 제제는 또한 암성 세포에 대해 SIRPα 및 siglec-10을 발현하는 이펙터 세포의 작용을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 다중특이성 제제는 고형 종양 및 혈액학적 악성종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 혈액학적 악성종양은 백혈병(예를 들어, 급성 또는 만성 골수(myeloid) 또는 골수성(myelogenous) 백혈병, 급성 림프모구성 또는 림프구성 백혈병), 림프종(호지킨 또는 비-호지킨), 또는 다발성 골수종을 포함한다. 고형 종양 암종, 육종, 선암종. 고형 종양은 피부(예를 들어, 흑색종), 난소, 자궁내막, 신장, 간, 췌장, 방광, 유방, 난소, 전립선, 직장, 결장, 위, 장, 췌장, 폐, 흉선, 갑상선, 신장, 뇌, 뼈에서 발생할 수 있다. 매칭된 정상 조직보다 CD24의 더 높은 발현을 나타내는 암의 예는 자궁 경부 편평 세포 암종, 담관암종, 신장 유두 세포 암종, 간세포 암종, 폐 선암종, 폐 편평 세포 암종, 크롬 친화 세포종 및 부신경절종, 및 자궁 체부 자궁내막 암종을 포함한다. 몇몇 림프종은 또한, siglec-1이 또한 상향조절되는 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL)을 포함하는 조직 매칭된 비암성 세포보다 CD24의 더 높은 발현을 보인다. 정상 조직보다 더 높은 수준으로 CD47을 발현하는 암의 예는 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 급성 림프모구성 백혈병(ALL)), 및 고형 종양 암, 예를 들어, 유방, 방광, 결장, 난소, 교모세포종, 평활근육종, 및 두경부 편평세포 암종을 포함한다.

다중특이성 제제는 발병을 지연시키고/시키거나, 중증도를 감소시키고/시키거나, 추가 악화를 억제하고/하거나, 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 개선하는 투여량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 효과적인 요법으로 투여된다. 대상체가 이미 장애를 앓고 있는 경우, 요법은 치료적으로 효과적인 요법으로 지칭될 수 있다. 대상체가 일반 집단에 비해 질환의 위험이 높지만 아직 증상을 경험하지 않은 경우, 요법은 예방적으로 효과적인 요법으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 치료적 또는 예방적 효능은 동일한 대상체에서 과거 대조군 또는 과거 경험과 비교하여 개별 대상체에서 관찰될 수 있다. 다른 경우에, 치료적 또는 예방적 효능은 치료되지 않은 대상체의 대조군 집단과 비교하여 치료된 대상체의 집단에서의 전임상 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다.

바람직하게는 다중특이성 제제는 개별적으로 그의 성분 결합 아암과 비교하여 암에 대해 적어도 상가적 및 더욱 바람직하게는 상승적 활성을 나타낸다. 상승작용은 바람직하게는, 문헌[Tallarida, Genes Cancer. 2011 Nov; 2(11): 1003-1008]에 의해 논의된 바와 같이 정량적으로 평가된다. 바람직하게는 다중특이성 제제는 또한, 각각 다중특이성 제제와 등몰 농도의, 그의 성분 결합 아암들의 혼합물과 비교하여 증가된 활성을 나타낸다. 이러한 활성은, 예를 들어 다중특이성 제제의 상대 수용체를 발현하는 면역 세포의 존재 하에 다중특이성 제제의 아암에 특이적으로 결합된 포식 금지 수용체를 발현하는 암 세포 또는 감염된 세포에 대한 세포독성으로 측정될 수 있다

다중특이성 제제에 대한 예시적인 투여량은 0.01 내지 20, 또는 0.5 내지 5, 또는 0.01 내지 1, 또는 0.01 내지 0.5 또는 0.05 내지 0.5 mg/㎏ 체중(예를 들어, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5 mg/㎏) 또는 고정 용량으로서 10 내지 1500 mg이다. 투여량은, 기타 요인들 중에서도, 환자의 상태 및 이전 치료에 대한 반응(있는 경우), 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부 및 장애가 급성인지 또는 만성인지의 여부에 따라 좌우된다.

투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 국소, 비강내 또는 근육내일 수 있다. 정맥내 또는 피하 투여에 의한 전신 순환으로의 투여가 바람직하다. 정맥내 투여는, 예를 들어, 30 내지 90분과 같은 기간에 걸친 주입(infusion)에 의해 이루어질 수 있다.

투여 빈도는 기타 요인들 중에서도 순환 중 다중특이성 제제의 반감기, 대상체의 상태 및 투여 경로에 따라 다르다. 빈도는 매일, 매주, 매달, 분기마다, 또는 환자 상태의 변화 또는 치료 중인 장애의 진행에 따른 불규칙한 간격일 수 있다. 정맥내 투여에 대한 예시적인 빈도는 치료의 지속적인 원인에 대해 매주 및 분기마다이지만, 다소 빈번한 투여도 가능하다. 피하 투여의 경우, 예시적인 투여 빈도는 매일 내지 매달이지만, 다소 빈번한 투여도 가능하다.

투여량의 투여 횟수는 장애가 급성인지 또는 만성인지의 여부 및 치료에 대한 장애의 반응에 따라 좌우된다. 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화의 경우, 1 내지 10회의 용량이 종종 충분하다. 때때로, 선택적으로 분할된 형태의, 단일 볼루스 용량이 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애 또는 급성 악화의 재발에 대해 반복될 수 있다. 만성 장애의 경우, 다중특이성 제제는 적어도 1, 5 또는 10년 동안, 또는 환자의 수명 동안 규칙적인 간격으로, 예를 들어, 매주, 격주, 매달, 분기마다, 6개월마다 투여될 수 있다.

약제학적 조성물은 바람직하게는 (예를 들어, FDA의 표준에 따라) 인간에 대한 비경구 투여에 적합하다. 비경구 투여용 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균성이고 실질적으로 등장성이며 GMP 조건 하에서 제조된다. 약제학적 조성물은 단위 투여 형태(즉, 단일 투여를 위한 투여량)로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제형화될 수 있다. '약제학적으로 허용가능한'은 인간 투여에 적합함(예를 들어, FDA에 의해 승인되거나 승인될 수 있음)을 의미한다. 제형은 선택된 투여 경로에 따라 좌우된다. 주사의 경우, 항체는 (주사 부위의 불편함을 줄이기 위해) 수용액 중에서, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충제, 예컨대 행크 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution), 또는 생리식염수 또는 아세테이트 완충제 중에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제(formulatory agent), 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열원-무함유 물(sterile pyrogen-free water)을 사용하여 구성하기 위한 동결건조된 형태일 수 있다.

본 발명의 다중특이성 제제를 사용한 치료는 치료되는 장애에 대해 효과적인 다른 치료와 병용될 수 있다. 암 치료에 사용되는 경우, 다중특이성 제제는 화학요법, 방사선, 줄기세포 치료, 수술 또는 다른 생물제제(biologics), 예컨대 HER2 항원에 대한 허셉틴(Herceptin)™(트라스투주맙(trastuzumab)), VEGF에 대한 아바스틴(Avastin)™(베바시주맙(bevacizumab)), 또는 EGF 수용체에 대한 항체, 예컨대 얼비툭스(Erbitux)™(세툭시맙(cetuximab)), 및 벡티빅스(Vectibix)™ (파니투무맙(panitumumab))를 사용한 치료와 병용될 수 있다. 화학요법제는 클로람부실, 사이클로포스파마이드 또는 멜팔란, 카르보플라티늄, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 및 미톡산트론, 메토트렉세이트, 플루다라빈, 및 시타라빈, 에토포시드 또는 토포테칸, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함한다.

IX. 다른 방법들

본 발명의 다중특이성 제제는 또한 진단, 예후 및 실험실 방법에서 사용된다. 항원의 측정 가능하거나 상승된 수준과 관련된 암은 암에 결합하는 아암을 포함하는 다중특이성 제제로 치료하는 데 가장 민감하기 때문에, 본 발명의 다중특이성 제제는 암에 의해 또는 암 환자의 순환에서 발현되는 항원의 수준을 측정하고, 그 수준이 측정 가능하거나 심지어 상승되었는지 결정하므로, 암 치료를 따르고 안내하는 데 사용될 수 있다. 다중특이성 제제는 특히 ELISA 검정, 방사면역검정 또는 면역조직화학에 사용될 수 있다. 다중특이성 제제는 형광 분자, 스핀-표지된 분자, 효소 또는 방사성 동위원소로 표지될 수 있으며, 검정을 수행하기 위해 필요한 모든 시약을 갖는 키트의 형태로 제공될 수 있다.

상기 또는 하기에 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 기타 간행물, 수탁 번호 등은, 각각의 개별 항목이 참조로 그렇게 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된다. 한 서열의 상이한 버전이 상이한 시간에 한 수탁 번호와 관련되어 있는 경우, 본 출원의 유효 출원일에서의 수탁 번호와 관련된 버전을 의미한다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 적용가능한 경우 수탁 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 중 빠른 날짜를 의미한다. 마찬가지로, 한 간행물, 웹사이트 등의 상이한 버전이 상이한 시간에 공개된 경우, 달리 표시되지 않은 한, 본 출원의 유효 출원일에 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 구체적으로 달리 표시되지 않은 한, 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 실시형태, 또는 양태는 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명이 명료함 및 이해를 목적으로 예시 및 예를 통해 다소 상세히 기재되어 있지만, 특정 변경 및 수정이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 실시될 수 있음이 명백할 것이다.

실시예

실시예 1: CD24 및 siglec-10의 발현

이 실시예는 매칭된 비암성 조직과 비교하여 다양한 조직의 암에서의 CD24 발현을 비교한다. 정상 조직에 비해 암에서 CD24의 가장 높은 차등적 발현은 자궁 경부 편평 세포 암종, 담관암종, 신장 유두 세포 암종, 간세포 암종, 폐 선암종, 폐 편평 세포 암종, 크롬 친화 세포종 및 부신경절종, 자궁 체부 자궁내막 암종에서 관찰되었다(도 1). CD24는 또한 몇몇 림프종, 특히 CLL, DLCSBL, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종 및 PMBCL에서 다양한 수준으로 발현된다(도 2). Siglec-10의 발현은 주로 정상 대상체의 조혈 세포 및 림프 조직에서 일어난다. Siglec-10은 몇몇 암, 특히 DLBCL에서 차등적으로 발현된다(도 3).

실시예 2: 도 4 및 도 5는 다양한 항체에 의해 유도된 암성 세포의 대식세포 포식(eating)을 나타낸다. 5F9는 CD47에 대한 단일클론 항체이다. ML5(노부스), SN3 및 SN3B(써모 피셔(Thermo Fisher)) 및 SC20(문헌[Uchid, PNAS 97,14720(2000)])이 CD24에 대한 항체이다.

SEQUENCE LISTING <110> FORTY SEVEN, INC. MCCAMISH, MARK V0LKMER, JENS-PETER <120> MULTISPECIFIC AGENTS FOR TREATMENT OF CANCER <130> 063673-544571 <150> US 62/824,213 <151> 2019-03-26 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9 heavy chain CDR1 <400> 1 Asn Tyr Asn Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9 heavy chain CDR2 <400> 2 Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9 heavy chain CDR3 <400> 3 Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9 light chain CDR1 <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9 light chain CDR2 <400> 5 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9 light chain CDR3 <400> 6 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody hu5F9-vh1 <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody hu5F9-vh2 <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody hu5F9-vh3 <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody hu5F9-vl1 <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody hu5F9-vl2 <400> 11 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody hu5F9-vl3 <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Claims

CD47에 특이적으로 결합하는 제1 결합 아암 및 CD24에 특이적으로 결합하는 제2 결합 아암을 포함하는, 다중특이성 제제.
제1항에 있어서, 상기 제1 결합 아암은 SIRPα에 대한 CD47 결합을 길항하고 상기 제2 결합 아암은 siglec-10에 대한 CD24 결합을 길항하는, 다중특이성 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 결합 아암은 항체 VH-VL 쌍 또는 SIRPα 세포외 도메인이고, 제2 결합 아암은 항체 VH-VL 쌍 또는 siglec-10 세포외 도메인인, 다중특이성 제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 제1 결합 아암 및 단일 제2 결합 아암을 갖는, 다중특이성 제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 2 카피의 제1 결합 아암 및 2 카피의 제2 결합 아암을 갖는, 다중특이성 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암 항원에 특이적으로 결합하는 제3 결합 아암을 추가로 포함하는, 다중특이성 제제.
제6항에 있어서, 상기 암 항원은 CD20인, 다중특이성 제제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 아암 및 상기 제2 결합 아암은 CD47 및 CD24에 대한 친화도가 서로에 대해 4배 이내인, 다중특이성 제제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 아암은 상기 제1 결합 아암이 CD47에 대해 갖는 것보다 적어도 5배만큼 더 높은 친화도를 CD24에 대해 갖는, 다중특이성 제제.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인을 추가로 포함하는, 다중특이성 제제.
제10항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG4 동종형을 갖는, 다중특이성 제제.
제10항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG4 동종형을 갖는, 다중특이성 제제.
제10항에 있어서, 이펙터 기능을 감소시키도록 돌연변이된 인간 IgG1 동종형을 갖는, 다중특이성 제제.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 다중특이성 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 암은 CD24 및 CD47을 발현하는, 방법.
제13항 또는 제15항에 있어서, 상기 다중특이성 제제는 암 항원에 특이적으로 결합하는 제3 결합 아암을 추가로 포함하고, 여기서 상기 암은 암 특이적 항원을 발현하는, 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 선암종인, 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 림프종인, 방법.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암의 세포에서 CD24 및 CD47의 발현을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
SIRPα에 특이적으로 결합하는 제1 결합 아암 및 siglec-10에 특이적으로 결합하는 제2 결합 아암을 포함하는, 다중특이성 제제.
제20항에 있어서, 상기 제1 결합 아암은 SIRPα에 대한 CD47 결합을 길항하고 상기 제2 결합 아암은 siglec-10에 대한 CD24 결합을 길항하는, 다중특이성 제제.
제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 제1 결합 아암은 항체 VH-VL 쌍 또는 SIRPα 세포외 도메인이고, 제2 결합 아암은 항체 VH-VL 쌍 또는 siglec-10 결합 도메인인, 다중특이성 제제.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 제1 결합 아암 및 단일 제2 결합 아암을 갖는, 다중특이성 제제.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 2 카피의 제1 결합 아암 및 2 카피의 제2 결합 아암을 갖는, 다중특이성 제제.
제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 아암 및 상기 제2 결합 아암은 SIRPα 및 siglec-10에 대한 친화도가 서로에 대해 4배 이내인, 다중특이성 제제.
제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 결합 아암은 상기 제1 결합 아암이 SIRPα에 대해 갖는 것보다 적어도 5배만큼 더 높은 친화도를 siglec-10에 대해 갖는, 다중특이성 제제.
제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인을 추가로 포함하는, 다중특이성 제제.
제27항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG4 동종형을 갖는, 다중특이성 제제.
제27항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG4 동종형을 갖는, 다중특이성 제제.
제27항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 이펙터 기능을 감소시키도록 돌연변이된 인간 IgG1 동종형을 갖는, 다중특이성 제제.
제20항 내지 제30항 중 어느 한 항의 다중특이성 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 다중특이성 제제는 암 항원에 특이적으로 결합하는 제3 결합 아암을 추가로 포함하고, 여기서 상기 암은 암 특이적 항원을 발현하는, 방법.