KR20210133390A - 피부 및 점막 세라미드를 증가시키는 스핑고미엘리나제 함유 국소부위용 화장품 조성물 - Google Patents

Abstract

국소 투여에 적합한 스핑고미엘리나제를 포함하는 외피용약 및 화장품 조성물 뿐 아니라, 스핑고미엘리나 제의 피부 및 점막 세라미드의 값을 증가시키는 용도가 밝혀졌다.

Description

피부 및 점막 세라미드를 증가시키는 스핑고미엘리나제 함유 국소부위용 화장품 조성물{Dermatological and cosmetic compositions suitable for topical application containing sphingomyelinase to increase the levels of skin and mucosal ceramides}

본 발명은 피부 및 점막 세라미드 값을 증가시키기 위한 스핑고미엘리나제의 용도와 국소 투여에 적합한, 스핑고미엘리나제를 포함하는 외피용약 및 화장품 조성물에 관련한다.

세라미드(N-아실스핑고신)는 여러 가지 시약의 자극으로 몇 시간 안에 세포내에 퍼지는 중요한 셀내부 전 달자로서 또는 혈청 탈취의 결과물로서 최근에 제시된 지질 대사물질이며, G0/G1 상의 세포 차단과 고사 에 관련한다. 세라미드는 일반적으로 스핑고미엘린 신호 전달 통로와 관련해서 두 번째 전달자로 여 겨진다. 세라미드는 스핑고미엘리나제 효과의 결과로서 스핑고미엘린에 의해 퍼지며, 스핑고미엘리나 제는 스핑고미엘린에 특이적인 포스포리파제 C의 형태이다. 세라미드는 세포내에서 성장과 분화에 영 향을 미치고, 단백질 분비를 조절하며, DNA 분열과 고사를 유도하고, 시토킨의 합성과 분비를

증가시킨다. 아직까지 이러한 여러 가지 다른 작용에 기초가 되는 분자의 기작, 전부가 알려져 있는 것은 아니다. 한편, 세라미드의 방출을 일으키는 세포외 촉진제에 대한 많은 사항이 알려져 있다. 세포가 외생의 스핑고미엘리나제 또는 내생의 스핑고미엘리나제를 활성화하는 촉진제에 노출되면 빠르게 스핑고미엘린의 가수분해가 일어난다. 이러한 촉진제는 TNF-α, 파스리간드(Fas ligand), 인터루킨

(interleukin) 1-β, IFN-γ, 1α, 25-다이하이드록시비타민 D 3 및 NGF를 포함한다.

우리는 놀랍게도, 스핑고미엘리나제가 또한 세라미드를 피부로 또는 점막으로 방출되도록 하는 촉진제로 서 작용한다는 것을 발견하였다.

피부 신진대사에서 세라미드의 중요성은 다음에 제시한 것으로 자명해질 것이다.

표피의 주요 세포 구성성분은 케라틴 세포, 멜라닌 세포, 랑게르한스 세포, 섬유모세포, 내피세포 및 대 식세포이다. 단핵 또는 다핵 백혈구는 염증이나 종양 과정에서 피부에 침투할 수 있다. 한편, 세 포내 공간은 주로 중성 지질, 당단백질, 단백질 분해 생성물, 결합소체, 활성 효소, 피지선의 생성물 및 세라미드로 구성된다. 이런 "벽돌 및 모르타르" 구조가 완전하기만 하다면, 피부에 보호층과 선택적 으로 투과되는 필터가 부여된다.

기저층에서의 세포 분열로 출발하여 케라틴세포의 사멸과 지질 장벽의 형성으로 끝나는 표피의 분화 과정 동안, 세포는 그의 지질 합성능을 개선한다. 표피의 기저층은 인산지방질과 콜레스테롤에 의해 특징 지어지며, 반면에 최외각층은 콜레스테롤, 자유 지방산, 및 무엇보다도 세라미드에 의해 특징지어지는 결 과를 보인다. 중요 성분이 스핑고리피드로 구성된 각질층의 지질은 물에 대한 표피의 투과 장벽을 유 지하는데 결정적인 역할을 한다. 스핑고리피드는 표피의 입자상 세포의 박막층체로부터 배제된다. 각질층의 43 ∼ 46 %를 구성하는 세라미드(스핑고리피드)는 각질층의 주요 극성 지질이며, 세포 부착과 표피의 분화에서 물의 누수에 대해 피부가 장벽기능을 하는데 있어 근본적인 역할을 수행한다. 세라 미드는 인산지질 같은 중간체를 통해 표피에서 신생합성된다고 문헌에 제시되어 있다. 세라미드는 각 질층에 상당히 높은 농도로 존재한다(전체 지질의 40 %까지).

피부 표면의 생김새와 같이, 피부의 기능성도 또한 나이에 따라 변화를 겪는다. 나이 든 피부는 감소 된 물의 경피 누수와 각질층의 감소된 수분 함량으로 특징지어진다. 세라미드 2:스핑고리피드의 비는 나이에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 노화에 따라 관찰되는 피부의 탈수는 노화에 따른 세라미드 의 감소 때문이다.

더욱이, 비정상적 세라미드 값(결핍)은 아토피성 습진, 피부병 및 피부염, 특히 아토피성 피부염, 및 건 선에서 발견된다. 최근에는, 세라미드 1의 선천적 결핍이 상염색체의 열성 스핑고리피도시스에서 발 견되었다. 그와 동시에, 패브리(Fabry)질병, 가우셔(Gaucher)질병 및 테이-작스(Tay-Sachs)질병과 같 이 스핑고리피도시스의 일반적인 형태도 잘 알려져 있다. 스제그렌-라슨(Sjogren-Larsson) 증후군은 보통 피부 장벽의 부수 파괴와 함께 세라미드 1 및 6의 결핍과 관련된다.

앞서 언급한 바에 따르면, 피부에 세라미드 값을 높이 유지하는 것이 유용하다는 것은 분명하다. 추 가적으로 스핑고미엘리나제의 사용은 점막 값에 또한 유리하다는 것을 알 수 있을 것이다.

추출 방법 또는 합성에 의해 얻어지며 외피용약 및 화장품에 사용되는 세라미드를 포함하는 여러 가지 생 성물은 시장에서 손쉽게 구할 수 있다. 노화로 인해 또는 약이나 세제, 물리적 시약 등에 인해 변하 는 피부의 지질 장벽을 재구성하기 위해 세라미드의 국소 외부 투여가 제시되었다. 이러한 외생 투여 는 나이와 해부학적 이유, 계절적 인자 및 질병에 기인한 세라미드의 질적 및/또는 양적 다양성이 있을 가능성을 부여하지 않는다. 분명히 세라미드의 외생 투여는 조정적 의미(계절, 해부학적 이유, 진행 중인 가능한 질병 과정 등에서 다양성)가 아니라, 단지 부가적 의미(내생+외생 세라미드)로 작용할 뿐이 다.

놀랍게도, 산성이 아닌 중성의 스핑고미엘리나제 값이 세포에서 높게 나타나며 또한 스핑고미엘리나제가 피부 및 점막에서 세라미드의 생성을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다.

결과적으로, 본 발명의 목적 중 하나는 스핑고미엘리나제의 용도를 제공하여, 국소 투여에 적합하며 피부 및 점막에서 세라미드 값을 증가시키기 위한 외피용약 또는 화장품용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 스핑고미엘리나제는 바람직하게는 그램-양성 박테리아, 그램-음성 박테리아, 젖산 박 테리아 또는 이들의 혼합물로부터 추출한다. 젖산 박테리아는 바람직하게는 다음 중에서 선택된다: 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실 러스 카테나포메(Lactobacillus catenaforme), 락토바실러스 셀로비오수스(Lactobacillus cellobiosus), 락토바실러스 크리스패터스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 쿠배터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락 토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 레크마니(Lactobacillus leichmanii), 락토바 실러스 미누터스(Lactobacillus minutus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러 스 로고재(Lactobacillus rogosae), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 안구래텀(Bifidobacterium angulatum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium

breve), 비피도박테리움 캐테뉴래텀(Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 덴튬

(Bifidobacterium dentium), 비피도박테리움 에릭소니(Bifidobacterium eriksonii), 비피도박테리움 인판 티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 플랜태 룸(Bifidobacterium plantarum), 비피도박테리움 슈도캐테뉴래텀(Bifidobacterium pseudocatenulatum), 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum), 스텝토코커스 락티스(Steptococcus lactis),

스트렙토코커스 라피노락티스(Streptococcus raffinolactis) 및 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 세포는 동결 건조 또는 초음파 처리된 세포 형태로 사용된다. 본 발명에 따르면, 경피 투여에 적합한 약제학적 또는 화장품 조성물을 제조하기 위하여, 스핑고미엘리나 제는 피부 침투 또는 흡수 증강제로, 단독으로 사용되거나 또는 다른 증강제와의 혼합물로 훨씬 많이 사 용될 수 있다.

본 발명은 국소 투여에 적합한 스핑고미엘리나제를 포함하는 외피용약 및 화장품 조성물 뿐 아니라, 스핑 고미엘리나제의 피부 및 점막 세라미드의 값을 증가시키는 용도를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 세포는 동결 건조 또는 초음파 처리된 세포 형태로 사용된다. 본 발명에 따르면, 경피 투여에 적합한 약제학적 또는 화장품 조성물을 제조하기 위하여, 스핑고미엘리나 제는 피부 침투 또는 흡수 증강제로, 단독으로 사용되거나 또는 다른 증강제와의 혼합물로 훨씬 많이 사 용될 수 있다.

본 발명의 또다른 목적은 피부 또는 점막에 세라미드 값을 증가시키는데 효과적인 스핑고미엘리나제의 일 정량을 포함하는 것을 특징으로 하는 외피용약 또는 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 조성물에 함유하는 스핑고미엘리나제는 바람직하게는 그램-양성 박테리아, 그램- 음성 박테리아, 젖산 박테리아 또는 이들의 혼합물로부터 추출한다. 젖산 박테리아는 바람직하기로는 다음으로부터 선택된다: 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 카테나포메(Lactobacillus catenaforme), 락토바실러스 셀로비오수 스(Lactobacillus cellobiosus), 락토바실러스 크리스패터스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 쿠 배터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼 멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 레크마니 (Lactobacillus leichmanii), 락토바실러스 미누터스(Lactobacillus minutus), 락토바실러스 플랜타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 로고재(Lactobacillus rogosae), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테 리움 안구래텀(Bifidobacterium angulatum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박 테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 캐테뉴래텀(Bifidobacterium catenulatum), 비피 도박테리움 덴튬(Bifidobacterium dentium), 비피도박테리움 에릭소니(Bifidobacterium eriksonii), 비피 도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도 박테리움 플랜태룸(Bifidobacterium plantarum), 비피도박테리움 슈도캐테뉴래텀(Bifidobacterium pseudocatenulatum), 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum), 스텝토코커스 락티스 (Steptococcus lactis), 스트렙토코커스 라피노락티스(Streptococcus raffinolactis) 및 스트렙토코커스

써모필러스(Streptococcus thermophilus).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 조성물에 포함된 세포는 동결 건조 또는 초음파 처리된 세포 형태 이다.

2 15

본 발명의 외피용약 또는 화장품 조성물은 바람직하게는 조성물 g당 젖산 박테리아 1×10 ∼ 1×10 CFU 를 포함한다.

본 발명의 외피용약 또는 화장품 조성물은 외생 세라미드 또는 외생 세라미드, 스핑고미엘린, 지방산, 콜 레스테롤, 세라미다제 억제제, 프로테아제 억제제, 면역조절물질, 비타민, 성장 인자, 계면활성제, 유화 제, 안정제, 지질, 레올로지 첨가제, 습윤제, 항산화제, 보호제, 색체 시약, 불용성안료, 안료, 보조 물 질(예를 들어 산, 염기, 추진제) 및 기능성 물질(수렴제, 항지루(antiseborrhoeic) 시약, 항비듬 시약, 탈취제, 피부 정화제, 케라토지너스(keratogenous) 시약, 보습제, 항건조 시약, 평활 시약, 차단제, 태양 차단제, 도료 시약, 항탈색 시약, 점활약, 복원제, 부영양화 시약, 항주름 시약, 항라디칼제, 보강재, 항 -연신-흔적 시약, 바소프로텍터(vasoprotectors), 항-피부-발진 시약, 진정제, 항-세포염 시약, 강화 시 약, 자극제, 과다용출 시약, 탈모약, 손톱 보호제)을 함유하는 생성물을 또한 포함한다.

최근에는, 본 발명의 외피용약 또는 화장품 조성물은 액체, 반액체, 반고체, 고체 또는 분말 생성물, 예 를 들어, 크림, 연고, 로션, 캡슐, 진주, 소란(ovules), 마스카라, 세안액, 치약, 구강세척제, 립스틱, 리포솜, 비누, 면도용 비누, 강장제, 세액, 고위관장 용액, 샴푸, 항비듬 조제, 함유된 및/또는 약입 붕 대 또는 거즈, 패치, 약입 에멀젼, 경피 겔 또는 패치 등의 형태로 제형된다.

이 박테리아가 피부에 세라미드의 생성을 유도하는 능력을 확인하기 위해, 사람 피부에서 세라미드를 생 성시키는 효소인 중성 스핑고미엘리나제의 검출에 기초하여 다음과 같은 실험이 수행되었다.

실시예 방법

젖산 박테리아에서 중성 및 산성 스핑고미엘리나제의 시험

HEPES 20 mM, pH 7.4, MgCl 2 10 mM, EDTA 2 mM, DTT 5 mM, NA 3 VO 4 0.1 mM, Na 2 MoO 4 0.1 mM, p-니트로페닐포 스페이트 30 mM, β-글리세로포스페이트 10 mM, ATP 750 mM, PMSF 1 μM, 루펩틴(leupeptin) 10 μM, 펩 스타틴(pepstatin) 10 μM(시그마 케미칼사) 및 0.2 % Triton X-100(중성 SM아제(SMase) 활성 시험을 위 한)을 함유하는 완충용액 500 ㎕ 또는 0.2 % Triton X-100(산성 SM아제(SMase) 활성 시험을 위한) 500 ㎕ 에 동결 건조된 스트렙토코커스 써모필러스 10 mg을 다시 부유화시킨다. 그 다음에 상기 준비된 시료 를 제공하여, 바이브라셀(Vibracell) 초음파 처리기(Sonic and Materials Inc., Danbury, CT)로 초음파 처리하여 분리되도록 한다(10 초간 초음파 처리, 10 초간 휴식을 반복하여 1 분 50 초 동안 처리).

초음파 처리된 시료는 30 분간 14,000 rpm으로 4 ℃에서 원심분리하여, 부유물을 제거하고 단백질 농도는 Bio-Rad 실험실 키트(리치몬드, CA)를 사용하여 결정하였다.

14

HEPES 20 mM, MgCl 2 1 mM, pH 7.4 및 [N-메틸- C]스핑고미엘린(SM)(0.2 μCi/㎖, a.s. 56.6 mCi/mmol, 아 머샴) 2.25 ㎕를 함유하는 완충액(최종 부피 50 ㎕)에 시료 100 μg을 넣고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양 하였다.

산성 스핑고미엘리나제의 활성을 측정하기 위해, 소듐 아세테이트 250 mM, EDTA 1 mM, pH 5.0 및 [N-메틸

14

- C]SM 2.25 ㎕를 함유하는 완충액(최종 부피 50 ㎕)에 박테리아 여액(lysate) 100 μg을 넣고 2 시간 동 안 37 ℃에서 배양하였다. 반응은 클로로포름:메탄올:아세트산(4:2:1) 250 ㎕의 첨가로 봉쇄되었다. 인산지질이 추출되었으며, TLC로 플레이트에서 분석되었고, SM의 가수분해는 자기방사법과 액체 섬광을 이용하여 정량화하였다. 초음파 처리된 박테리아에 존재하는 SM아제는 단백질 mg당 단위(단위/단백질 (mg))로 나타내었다. 중성 SM아제 한 단위는 pH 7.4, 37 ℃에서 매분 1 μmole의 스핑고미엘린을 가 수분해하였다. 산성 SM아제 한 단위는 pH 5.0, 37 ℃에서 매시간 1 nmole의 SM을 N-아세틸스핑고신 및 콜린으로 가수분해하였다.

크림의 제조와 처리(지속기간 및 양식)

12

초음파 처리된 젖산 박테리아[염기 크림 20 g 튜브 2개 + 초음파 처리된 젖산 박테리아(1×10 CFU)를 물 20 ㎖에 넣은 1개의 바이알]를 함유하는 크림(탈수 염기 크림을 이용)을 제조하였고, 표 1에 나타낸 8 명 의 지원자에게 크림을 연일 바르게 하여, 팔뚝 표피의 각질층의 세라미드 값에 어떤 효과를 미치는지를

시험하였다.

[표 1]

실험 대상자들은 콘트롤 크림 및 젖산 박테리아를 함유하는 실험 크림을 매일 2 회(대략 1 ㎖, 아침 및 저녁) 스스로 바르도록 교육받았다. 콘트롤 크림은 매일 오른쪽 팔뚝에 발랐고, 반면에 실험 크림은 왼쪽 팔뚝에 발랐다. 두가지 크림 모두 문질러서 충분히 흡수되도록 하였다. 표피의 각질층의 지 질은 크림을 바르기에 앞서 99.5 % 에탄올 250 ㎖로 씻음으로써 팔뚝으로부터 모아서 측정하였고(T0), 처 리를 시작한 후 일주 후에 모아서 측정하였다(T1). 에탄올 추출물은 회전 증발기로 농축되었으며, 증 발시켜 건조하였다. 건조된 시료를 2 ㎖ 클로로포름에 녹이고, 질소로 말리고, 세라미드의 측량(아머 샴, 버킹검샤이어, 영국)을 위하여 DAG 키나제 시험을 수행하였다. 세 번의 추출을 거친 다음, 지질 은 다시 질소로 건조되었고, 클로로포름 100 ㎕에 녹인 후, 클로로포름:메탄올:아세트산(65:15:5, v/v/ v)를 진행 용매로 얇은막 크로마토그래피(TLC)를 수행하였다. 가인산 세라미드는 자기방사법으로 측 정되었다. 세라미드-1-포스페이트에 부합하는 패치는 쪼개졌고, β-카운터에서 섬광 액체를 사용하여 존재하는 방사능 수를 얻었다. 존재하는 세라미드의 수는 인증된 세라미드(Ⅲ 형태; 소 뇌; 시그마 케미칼사, St. Louis, MO)로 얻어진 표준 곡선을 기준으로 결정되었다. 결과

젖산 박테리아에서 스핑고미엘리나제의 활성

초음파 처리된 젖산 박테리아 시료에서 중성 스핑고미엘리나제 활성 값은 대략 2×10 -7 단위/박테리아

(mg)였다. 산성 스핑고미엘리나제의 활성은 검출되지 않았다.

초음파 처리된 락토바실러스가 피부의 세라미드 값에 미치는 영향

"방법" 부분에서 설명한 바와 같은 방법으로 얻어진 에탄올 추출물에서 세라미드 값은 다음 표 2에 제시 하였으며, 각각의 자기방사그래프는 도 1에 제시되어 있다. 본질적인 실험 대상자의 기본적 다양성과 는 무관하게, 두 가지 크림 모두 분석 대상 모두의 팔뚝 피부의 세라미드 값을 증가시켰다는 것이 주목된 다. 그러나, 젖산 박테리아를 포함한 크림을 발랐을 때 증가량이 더욱 두드려졌으며, 현저하였다. 더욱이, 실험 크림이 세라미드 값에 미치는 영향을 기초 크림에 의해 유도되는 것과 비교하였으며, 전자 가 더 빠른 반응을 나타내었다.

Claims (4)

1. 피부 및 점막의 세라미드 값을 증가시키기 위한, 국소투여용 외피용약 및/또는 화장품 조성물 제조에 사 용되는 스핑고미엘리나제의 용도.
   
2. 아토피성 습진, 피부병 및 피부염, 특히 아토피성 피부염, 건선, 비늘버즘, 패브리(Fabry)질병, 가우셔 (Gaucher)질병, 테이-작스(Tay-Sachs)질병 및 스제그렌-라슨(Sjogren-Larsson) 증후군의 예방 또는 치료
   
   를 위한 국소투여용 외피용약 조성물 제조에 사용하는 스핑고미엘리나제의 용도.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 스핑고미엘리나제는 그램-양성 박테리아, 그램-음성 박테리아, 젖 산 박테리아 또는 이들의 혼합물로부터 얻은 것임을 특징으로 하는 스핑고미엘리나제의 용도.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 젖산 박테리아는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토 바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러 스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 카테나포메(Lactobacillus catenaforme), 락토바실러스 셀로비오수스(Lactobacillus cellobiosus), 락토바실러스 크리스패터스(Lactobacillus crispatus), 락토 바실러스 쿠배터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbrueckii), 락토 바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러 스 레크마니(Lactobacillus leichmanii), 락토바실러스 미누터스(Lactobacillus minutus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 로고재(Lactobacillus rogosae), 락토바실러스 살리바