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KR20210110323A - 개선된 세포 표적화 결합 분자 - Google Patents

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KR20210110323A
KR20210110323A KR1020217022975A KR20217022975A KR20210110323A KR 20210110323 A KR20210110323 A KR 20210110323A KR 1020217022975 A KR1020217022975 A KR 1020217022975A KR 20217022975 A KR20217022975 A KR 20217022975A KR 20210110323 A KR20210110323 A KR 20210110323A
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KR
South Korea
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molecule
proteinaceous molecule
tumor
saponin
cell
Prior art date
Application number
KR1020217022975A
Other languages
English (en)
Inventor
루벤 포스텔
헨드릭 푸치스
Original Assignee
사프렘 테크놀로지스 비.브이.
샤리떼 우니베지테츠메디친 베를린
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사프렘 테크놀로지스 비.브이., 샤리떼 우니베지테츠메디친 베를린 filed Critical 사프렘 테크놀로지스 비.브이.
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Abstract

본 발명은 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프에 결합하기 위한 제1 결합 부위를 포함하는 제1 단백질성 분자로서, 상기 제1 단백질성 분자는 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 결합된 적어도 하나의 사포닌과 함께 제공되는, 제1 단백질성 분자를 포함하며, 그리고 제1 단백질성 분자와 상이한 제2 단백질성 분자를 포함하는 제2 약학 조성물로서, 제2 단백질성 분자는 제1 세포 표면 분자와 상이한 제2 세포 표면 분자의 제2 에피토프에 결합하는 제2 결합 부위를 포함하고, 이펙터 모이어티를 포함하고, 여기서 제2 에피토프가 제1 에피토프와 상이한, 제2 약학 조성물을 포함하는, 치료 조합물에 관한 것이다. 본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 제2 단백질성 분자를 포함하는 조성물이다. 본 발명은 또한 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 이펙터 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 본 발명의 일 견지는 본 발명의 조성물 또는 항체-약물 접합체를 포함하며, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 치료 조합물 또는 조성물 또는 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 치료 조합물에 관한 것이다.

Description

개선된 세포 표적화 결합 분자
본 발명은 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위를 포함하는 제1 단백질성 분자에 관한 것으로, 상기 제1 단백질성 분자는 적어도 하나의 링커 및/또는 올리고머 또는 중합체(polymeric) 스캐폴드를 통해 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 결합된 적어도 하나의 사포닌을 제공하거나, 또는 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 직접 공유 결합한다. 본 발명은 또한 치료 조합물에 관한 것으로, 여기서 치료 조합물은 본 발명의 제1 단백질성 분자를 포함하는 제1 약학 조성물 및 상기 제1 단백질성 분자와 상이한 제2 단백질성 분자를 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하며, 상기 제2 단백질성 분자는 상기 제1 세포 표면 분자와 상이한 제2 세포 표면 분자의 제2 에피토프에 결합하는 제2 결합 부위를 포함하고, 이펙터 모이어티를 포함하며, 여기서 제2 에피토프는 제1 에피토프와 상이하다. 또한, 본 발명은 치료 조합물에 관한 것으로, 여기서 치료 조합물은 (a) 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자를 포함하고, 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위를 포함하는 본 발명의 제1 약학 조성물; 및 (b) 제3 단백질성 분자를 포함하는 제3 약학 조성물로서, 제3 단백질성 분자는 (a)의 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위 및 이펙터 모이어티를 포함하는 제3 약학 조성물을 포함하며, 여기서 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위 및 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 동일하며, 그리고 여기서 제1 단백질성 분자가 결합할 수 있는 제1 세포 표면 분자 및 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프와, 제3 단백질성 분자가 결합할 수 있는 제1 세포 표면 분자 및 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프는 동일하다. 본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제2 단백질성 분자를 포함하는 조성물이다. 본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제3 단백질성 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산 중 어느 하나 이상, 바람직하게는 벡터, 유전자, 세포 자살 유도 트랜스진, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), DNA 압타머, RNA 압타머, mRNA, 미니-서클 DNA, 펩티드 핵산(PNA), 포스포아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), 잠금(locked) 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노 핵산(FANA), 2'-0-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-O,4'-아미노에틸렌 가교 핵산, 3'-플루오로 헥시톨 핵산(FHNA), 플라스미드, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스(threose) 핵산(TNA), 또는 이의 유도체 중 적어도 하나로부터 선택된, 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 이펙터 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체에 관한 것이다. 본 발명의 일 견지는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 본 발명의 리간드-약물 접합체를 포함하며, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 치료 조합물 또는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다.
치료적 생물학적 활성을 갖는 분자는 이를 필요로 하는 인간 환자에서 암과 같은 질병의 치료를 위한 효과적인 치료약으로서 많은 경우에 이론적으로 적합하다. 전형적인 예는 소분자 생물학적 활성 모이어티이다. 그러나, 다 그러한 것은 아니지만 다수의 모든 잠재적인 약물-유사 분자 및 임상에서 현재 사용되 치료제는 과잉의 단점 및 결점 중 적어도 하나로부터 고통을 받고 있다. 인체에 투여되었을 때, 치료적 활성 분자는 치료 대상 질환 또는 건강 문제를 기초로 하는 양상에 관한 생물학적 활성에 부가적으로, 오프-타겟 영향(off-target effects)을 발휘할 수 있다. 이러한 오프-타겟 영향은 바람직하지 않으며, 투여된 분자의 건강- 또는 심지어 수명을 위협하는 부작용의 유도에 대한 위험을 갖는다. 이는 많은 약물-유사 화합물 및 치료 모이어티가 3상 임상 시험 또는 심지어 4상 임상 시험(포스트-마켓 진입 후속)에 실패하는 것을 유발하는 것과 같은 유해 사례의 발생이다. 따라서, 약물 분자의 치료 효과가, 예를 들어, (1) 질병을 드라이빙하는 생물학적 인자 또는 생물학적 프로세스에 대해 고도로 특이적이며, (2) 충분히 안전하며, (3) 충분히 효과적이며, (4) 병들지 않은 세포에 대한 오프-타겟 활성이 거의 없거나 전혀 없이 병든 세포에 충분히 지시되고, (5) 충분히 적시에 작용하는 활성 모드를 가지며(예를 들어, 투여된 약물 분자는 특정 시간 프레임 내에 인간 환자에서 표적 부위에 도달해야 하고, 특정 시간 프레임 동안 표적 부위에 유지되어야 하며), 그리고/또는 (6) 환자의 신체에서 충분히 오래 지속되는 치료 활성을 갖는. 소-분자 치료제와 같은 약물 분자를 제공하기 위한 강한 욕구가 존재한다. 불행히도, 전술한 이로운 특성 중 많은 또는 심지어 모든 유익한 특징을 갖는 '이상적' 치료제는, 이미 장기간 지속적이고 집약적인 연구에도 불구하고, 그리고 각각 제기된 직면한 어려움과 결점의 여러 영역에서 행해진 인상적인 경과에도 불구하고, 환자에게 이용가능하지 않다.
화학요법은 암 치료를 위한 가장 중요한 치료 옵션 중 하나이다. 그러나, 이는 종종 건강한 조직에서 세포를 분할하는 것에 비해 암 세포에 대한 특이성을 갖지 않기 때문에 낮은 치료 윈도우와 연관된다. 모노클로날 항체의 본 발명은 정상 세포를 살포하면서 암세포에 대한 세포독성제의 표적화된 전달을 위한 메커니즘으로서 이들의 특이적 결합 특성을 이용하는 가능성을 제공하였다. 이는 항체-약물 접합체(ADCs)를 생성하기 위해 항체에 세포독성 이펙터(페이로드(paloads) 또는 워헤드(warheads)로도 알려짐)의 화학적 컨쥬게이션에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, 이들의 비접합 형태로 제한된 치료 지수(유효한 투여량에 대해 독성 투여량 비교하는 비율)를 갖는 엠탄신(emtansine)(DM1)과 같은 매우 강력한 페이로드가 사용된다. 또한, DM1 대 트라스투주맙(trastuzumab)의 접합체(ado-trastuzumb emtansine)(Kadcyclia로도 알려짐)은 원숭이에서 DM1의 허용가능한 투여량을 적어도 2배 증가시킨다. 과거의 수십년에는 치료 ADC를 개발하기 위한 노력 및 투자가 이루어졌다. 그러나, 유망한 전임상 데이터에도 불구하고, ADC를 임상으로 가져오는 것은 여전히 도전으로 남아있다. 임상적 사용을 위해 승인된 제1 ADC는 2000년도의 재발된 급성 골수성 백혈병(AML)을 위한 gemtuzumb ozgame(Mylotarg, CD33 targeted, Pfizer/Wyeth)이었다. 그러나, Mylotarg는 이의 안정성 프로파일을 포함한 다수의 우려에 기인하여, 미국 식품의약국(FDA)의 요청으로 시장에서 철회되었다. Mylotarg로 치료받은 환자들은 종종 통상적인 화학요법으로 치료받은 환자들보다 더 사망하는 것으로 발견되었다. Mylotarg는 더 낮은 권장 투여량으로, 화학요법과 병용하여 또는 그 자체 상의 상이한 스케쥴로, 그리고 새로운 환자 집단에 대해 2017년에 다시 시장에 승인되었다. 현재까지, 단지 5개의 ADC만이 임상적 사용을 위해 승인되었고, 한편 대략 55개의 ADC의 임상 개발이 중지되었다. 그러나, 관심은 높고 대략 80개의 ADC가 여전히 현재 거의 6백 임상 시험에서 임상 개발 중에 있다.
통상적으로 환자들에 의해 허용되지 않는 독성 페이로드들을 사용하기 위한 잠재성에도 불구하고, 낮은 치료 지수(유효 투여량에 대한 독성 투여량을 비교하는 비율)는 임상 개발에서 많은 ADC의 중단을 나타내는 주요 문제이며, 이는 정상 세포에 대한 오프-타겟 독성, 세포독성제에 대한 저항성 발달 및 순환에서 약물의 조기 방출과 같은 여러 메커니즘에 의해 야기될 수 있다. ADC의 FDA에 의한 체계적인 리뷰 결과, 대부분의 ADC의 독성 프로파일이, 사용된 항체가 아니라, 사용된 페이로드에 따라 분류될 수 있는 것으로 발견되었으며, 이는 독성이 페이로드의 조기 방출에 의해 대부분 결정된다는 것을 제시한다. 중단된 대략 55개의 ADC 중에서, 적어도 23개는 부족한 치료 지수로 인한 것으로 추정된다. 예를 들어, 트라스투주맙(trastuzumab) 테시린(tesirine) 접합체(ADCT-502, HER-2 표적화된, ADC 치료제)의 개발은 아마도 최근 HER2의 상당한 수준을 발현하는 폐 조직에서 정확한(on-target), 오프-조직 효과(off-tissue effect)로 인한, 좁은 치료 지수로 인해 최근에 중단되었다. 또한, 3상 시험에서 몇몇 ADC는 누락된 1차 종점에 기인하여 중단되었다. 예를 들어, 새롭게 진단된 교모세포종을 갖는 환자에서 시험된 데파투시주맙(depatuxizumab) 마포도틴(mafodotin) 접합체(ABT-414, EGFR 표적화된, AbbVie)의 3상 시험, 및 백금-저항성 난소암을 갖는 환자에서 시험된 미베툭시맙(mirvetuximab) 소라브탄신(soravtansine) 접합체(IMGN853, 엽산 수용체 α(FRa) 표적화된, ImmunoGen)를 최근에 중단되었으며, 생존 이점을 나타내지 않았다. 일부 ADC의 임상적으로 사용된 투여량은 이의 완전한 항암 활성에 충분하지 않을 수 있다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 예를 들어, 아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumb emtansine)은 인간에서의 3.6mg/kg의 MTD를 갖는다. 유방암의 전임상 모델에서, 아도-트라스투주맙 엠탄신은 3mg/kg 이상의 투여량 수준에서 종양 퇴행을 유도하였으나, 더 강력한 효능은 15mg/kg에서 관찰되었다. 이는 임상적으로 투여된 투여량에서, 아도-트라스투주맙 엠탄신이 이의 최대 잠재적인 항-종양 효과를 발휘할 수 없다는 것을 제시한다.
ADC는 주로 항체, 페이로드(payload)와 같은 세포독성 모이어티, 및 링커(linker)를 포함하여 구성된다. DC의 각 성분들을 표적으로 하는 기존의 문제들을 극복하기 위해 새로운 ADC의 설계 및 개발에서, 여러 새로운 전략이 제안되고 수행되었다. 예를 들어, 종양내에서 높은 발현 수준을 갖고 정상 조직에서는 발현이 거의 없거나 전혀 없는 항원, 순환 ADC에 접근할 수 있도록 세포 표면에 존재하는 항원, 및 결합 후 ADC를 세포내로 내재화할 수 있는 항원; 및 대안적인 활성 메커니즘을 선택함으로써, 항체 성분에 대한 적절한 항원 표적의 식별 및 검증에 의해, ADC의 용해도 및 약물-대-항체 비율(DAR)을 증가시키고 화학요법제를 세포 밖으로 운반할 수 있는 단백질에 의해 유도된 저항성을 극복하는 링커를 설계 및 최적화하고; 보다 많은 페이로드를 포함시킴으로써 DAR 비율을 증가시키고, 항체 균일성 및 발달성을 개선시키기 위해 항체를 선택하고 최적화한다. ADC의 기술적 발달에 부가적으로, 새로운 임상 및 번역 전략은 또한 예를 들어, 분별 투약을 통한 투여 스케줄의 변경하고; 생물분배 연구를 수행하며; 응답 신호를 조기에 포착하고, 응답의 지속기간 및 깊이를 모니터하기 위해 환자 선택을 최적화하기 위한 바이오마커를 포함하는 것과 같이 치료 지수를 최대화하도록, 그리고 조합 연구를 통지하도록 배치된다.
임상 포텐셜을 갖는 ADC의 예는 림프구 악성종양 및 다수의 골수종(myeloma)에 대한 치료 옵션으로서 평가되는 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 이노투주맙 오조가마이신(inotuzumb ozogamicin), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox), 및 폴라투주맙 베도틴(polatuzumab vedotin)과 같은 ADC이다. (악성) B-세포 상의 CD79b에 결합하는 폴라투주맙 베도틴(Polatuzumab vedotin), 및 CD22에 결합하는 피나투주맙 베도틴(pinatuzumab vedotin)은 임상 시험에서 시험되었으며, 여기서 ADC 각각은 공동-투여된 리툭시맙, CD20에 결합하는 모노클로날 항체와 조합되었으며, 패이로드가 제공되지 않았다[B. Yu and D. Liu, Antibody-drug conjugates in clinical trials for lymphoid malignancies and multiple myeloma; Journal of Hematology & Oncology (2019) 12:94]. 이러한 예와 같은 모노클로날 항체의 조합은 앞서 언급한 ADC의 원하는 특성을 많이 또는 심지어 모두 결합하는 '특효약(magic bullet)'에 도달하려는 추가 접근 방식이며 시도이다.
한편, 과거의 수십 년 동안, 핵산-기반 치료제가 개발 중이다. 치료 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASOs, AONs), 및 짧은 간섭 RNA(siRNAs), 예를 들어, RNA 간섭(RNai)과 같은 접근을 위한 마이크로 RNAs, 및 DNA 및 RNA 앱타머에 기초할 수 있다. 이들 중 다수는 DNA 또는 RNA 발현의 억제에 의한 작용의 동일한 기본적인 기초를 공유하여, 이에 의해 질병-관련 비정상적 단백질의 발현을 억제한다. 가장 많은 수의 임상 시험이 유전자 치료의 분야에서 수행되고, 거의 2600개의 진행중인 또는 완전한 임상 시험이 전세계적으로 있지만, 단지 약 4%만이 3상에 진입한다. 이는 ASO를 이용한 임상 시험이 뒤따른다. ADC와 유사하게, 다수의 기술이 조사되고 있음에도 불구하고, 치료 핵산은 임상 개발 동안 2개의 주요 이슈를 공유한다: 세포내로의 전달 및 오프-타겟 효과. 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA), 포스포아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), 잠금 핵산(LNA) 및 가교 핵산(BNA)과 같은 ASO는 특히 표적 유전자 및 특히 소분자 억제제 또는 중화 항체를 표적화하기 어려운 유전자들을 억제하기 위한 매력적인 전략으로서 연구되고 있다. 현재, 다양한 ASO들의 효능이 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 근위축성 측삭경화증과 같은 많은 신경퇴행성 질환에서 연구되고 있으며, 또한 몇몇 암 단계에도 연구되어 있다. 잠재적인 치료제로서 ASO의 적용은 표적 세포 및 조직의 세포질 및/또는 핵으로의 전달을 위한 안전하고 효과적인 방법을 필요로 한다. ASO의 임상적 관련성이 입증되었을지라도, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 비효율적인 세포 흡수(cellular uptake)는 ASO의 효능을 제한하며, 치료 개발에 대한 장벽이 되어 왔다. 세포 흡수는 효과적이고 지속적인 결과를 위한 활성 부위에서 너무 낮은 ASO 농도를 초래하는 투여량의 < 2% 일 수 있다. 이는 결과적으로 오프-타겟 효과를 유도하는 투여량의 증가를 요구한다. 대부분의 통상적인 부작용은 보체 케스케이드의 활성화, 응고 캐스케이드의 억제 및 면역 시스템의 톨-유사 수용체 매개 자극(toll-like receptor mediated stimulation)의 억제이다.
화학요법은 가장 일반적으로 소분자이지만, 이들의 효능은 심각한 오프-타겟 측면 독성뿐만 아니라 이들의 저조한 용해도, 신속한 클리어런스 및 제한된 종양 노출에 의해 제한된다. 중합체-약물 접합체(PDC)와 같은 스캐폴드-소분자 약물 접합체는 약학적으로 활성을 갖는 거대분자 구조물이며, 이는 캐리어 스캐폴드(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG))에 결합된 소분자 약물의 하나 이상의 분자를 포함한다.
이러한 컨쥬게이트 원리는 많은 관심을 끌고 수십년 동안 조사되었다. 전-임상 또는 임상 개발 하에서 소분자 약물의 대다수의 접합체는 종양학적 징후를 위한 것이다. 그러나, 지금까지 암과 관련되지 않은 단지 하나의 약물만이 2014년에 비종양학 징후인 만성 통증을 가진 환자에서 오피오이드-유도된 변비에 대해 승인되었다(Movantik, 오피오이드 안타고니스트 날록손의 PEG 올리고먼 접합체, AstrataZeneca). 약물-스캐폴드 접합체를 인간 대상자의 치료로 적용을 옮기는 것은 지금까지 임상적으로 거의 성공하지 못했다. 예를 들어, PK1(N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드(HPMA) 공중합체 독소루비신; Pharmacia, Pfizer에 의해 개발됨)은 뮤린 모델에서 고형 종양 및 백혈병 모두에서 큰 항암 활성을 나타내었고, 종양학적 징후를 위한 임상 조사 하에 있었다. 비특이적 독성의 현저한 감소 및 사람에서 개선된 약동학을 입증하였음에도 불구하고, 항암 효능의 개선은 환자에서 미미한 것으로 드러났고, 결과적으로 PK1의 추가 개발은 중단되었다.
스캐폴드-소분자 약물 접합체의 실패는 적어도 부분적으로 종양 부위에서 이의 저조한 축적에 기인한다. 예를 들어, 쥐 모델에서 PK1은 건강한 조직(간, 신장, 폐, 비장 및 심장)에서보다 종양에서 45-250배 더 높은 축적을 보여주었지만, 종양에서의 축적은 임상 시험에서 환자의 작은 부분집합에서만 관찰되었다.
전술한 문제들에 대한 잠재적인 해결책은 리포솜과 같은 약물 전달을 위한 나노입자 시스템의 적용이다. 리포솜은 인지질이 물에 분산될 때 자발적으로 형성되는 하나 이상의 인지질 이중층으로 구성된 구형 소포(spherical-shaped vesicles)이다. 인지질의 양친매성 특성은 자가-어셈블리, 유화 및 습윤 특성의 특성을 제공하며, 이러한 특성은 새로운 약물 및 새로운 약물 전달 시스템의 설계에 사용될 수 있다. 리포솜 전달 시스템에 캡슐화된 약물은 약동학 및 약동역학, 조직 표적화 특성, 감소된 독성 및 증가된 약물 활성을 통한 개선 및 제어와 같은 약물의 직접 투여에 비해 몇 가지 이점을 전달할 수 있다. 이러한 성공의 예는 소분자 화학요법제 독소루비신(Doxil: 독소루비신의 페길화된(pegylated) 리포솜-캡슐화 형태; Mycoet: 비-페길화된(non-pegylated) 리포솜 독소루비신)의 리포좀-캡슐화된 형태이다.
따라서, 원하는 경우 비-전신성 용도에 적용될 수 있는 항-종양 치료와 같은 약물 치료법으로서, 여기서 약물은 예를 들어 허용가능한 안전 프로파일, 거의 없는 오프-타겟 활성, 충분한 효능, 환자의 신체 등으로부터 충분히 낮은 클리어런스 속도를 갖는 약물 치료법을 허용하는 것이 여전히 발견될 필요가 있다.
본 발명의 일 구현에 있어서, 제1 목적은 개선된 생물학적 활성 화합물 또는 이러한 개선된 생물학적 활성 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구현들의 몇몇 목적 중 하나는 이를 필요로 하는 인간 환자에게 소분자 치료학적 활성 화합물을 투여할 때 직면하는 비-특이성의 문제에 대한 해결책을 제공하는 것이다. 본 발명의 구현들의 몇몇 목적 중 하나는 질병을 구동하는 생물학적 인자 또는 생물학적 프로세스에 대한 비-최적 특이성을 갖는 약물의 문제에 대한 해결책을 제공하는 것이다. 본 발명의 구현들의 몇몇 목적 중 하나는, 이를 필요로 하는 인간 환자에게 투여될 때, 현재 약물의 불충분한 안전 특성의 문제에 대한 해결책을 제공하는 것이다. 본 발명의 구현들의 몇몇 목적 중 하나는, 이를 필요로 하는 인간 환자에게 투여될 때, 원하는 것보다 덜 효과적인 현재 약물의 문제에 대한 해결책을 제공하는 것이다. 본 발명의 구현들의 몇몇 목적 중 하나는, 이를 필요로 하는 인간 환자에게 투여되는 경우, 병들지 않은 세포에 대한 오프-타겟 활성을 거의 나타내지 않으면서 병든 세포에 충분히 지향되지 않는 현재 약물의 문제에 대한 해결책을 제공하는 것이다. 본 발명의 구현들의 몇몇 목적 중 하나는, 이를 필요로 하는 인간 환자에게 투여되는 경우, 현재 약물이 충분히 적시에 작용 모드를 갖지 않는 문제에 대한 해결책을 제공하는 것이다(예를 들어, 투여된 약물 분자는 특정 시간 프레임내에 인간 환자의 표적화된 부위에 도달해야 하고, 특정 시간 프레임에 대해 표적화된 부위에 남아있어야 한다). 본 발명의 구현들의 몇몇 목적 중 하나는, 이를 필요로 하는 인간 환자에게 투여되는 경우, 현재 약물이 환자의 신체내에서 치료 활성을 충분히 오래 지속하지 못하는 문제에 대한 해결책을 제공하는 것이다.
본 발명의 구현들의 상기 목적 중 적어도 하나는 세포 표적화 모이어티 및 적어도 하나의 사포닌을 포함하는, 본 발명의 제1 단백질성 분자를 제공함으로써 달성되며, 상기 제1 단백질성 분자는 또한 의약으로서 사용하기에 적합하거나 또는 본 발명에 따른 약학 조합물에서 영향을 주기에 적합하며, 본 발명에 따른, 본 발명의 ADC 또는 항체-올리고뉴클레오티드 접합체(AOC)의 제조에 있어서 반제품으로서 사용하기에 적합하다. 치료 조합물은 공유 결합된 사포닌을 포함하는 제1 단백질성 분자를 포함하며, 이펙터 모이어티로 지칭되는 이펙터 분자를 포함하는 제2 단백질성 분자를 포함하며, 여기서, 제1 및 제2 단백질성 분자는 표적 세포의 상이한 세포 표면 분자 상에 노출된 상이한 에피토프에 대한 상이한 결합 부위를 포함하며, 여기서 상이한 세포 표면 분자는 동일한 표적 세포에 의해 발현되고 동일한 표적 세포의 표면에 노출된다.
본 발명은 특정 구현과 관련하여 설명될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고 단지 청구범위에 의해서만 한정된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 구현들은 달리 명시되지 않는 한, 조합 및 공동으로 동작할 수 있다.
본 발명의 일 견지는 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프에 결합하기 위한 제1 결합 부위를 포함하는 제1 단백질성 분자에 관한 것으로, 제1 단백질성 분자는 적어도 하나의 링커를 통해 및/또는 올리고머성 또는 중합체 스캐폴드를 통해 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 결합된, 또는 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 직접 공유 결합된 적어도 하나의 사포닌과 함께 제공된다. 본 발명에 따르면, 제1 단백질성 분자는 예를 들어, 이에 공유 커플링된 사포닌을 갖는 제1 단백질성 분자(공유 커플링된 사포닌(들)을 갖는 제1 단백질성 분자를 포함하는 제1 접합체)를 포함하는 제1 약학 조성물을 포함하는 치료 조합물에 적용되는 완제품이다. 둘째로, 공유 커플링된 사포닌을 갖는 제1 단백질성 분자는 또한 반제품이다. 제1 단백질성 분자는, 예를 들어, 효소, 독소, 예컨대 단백질 독소, BNA와 같은 올리고뉴클레오티드와 같은 적어도 하나의 이펙터 모이어티와 연결될 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 ADC 또는 AOC를 함께 제공하며, ADC 또는 AOC는 하나 이상의 공유 결합된 사포닌, 선택적으로 링커 및/또는 올리고머 또는 중합체 스캐폴드를 통해 함께 제공된다. 따라서, 본 발명의 일 견지는 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위를 포함하는 제1 단백질성 분자를 포함하거나 또는 이로 구성되는 접합체에 관한 것으로, 적어도 하나의 사포닌이 적어도 하나의 링커를 통해 제1 단백질성 분자에 공유 결합되어 있으며 그리고/또는 적어도 하나의 사포닌이 올리고머 또는 중합체 스캐폴드를 통해 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 결합되거나, 또는 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 직접 공유 결합되어 있다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자이며, 여기서 제1 결합 부위는 면역글로불린, 또는 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 도메인 및/또는 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 단편을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자이며, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 트리테르페노이드(triterpenoid) 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기(function)를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인(12,13-dehydrooleanane)의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜(bisdesmosidic triterpene) 사포닌이고, 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산(glucuronic acid) 작용기를 포함하는 것이며, 그리고/또는 집소필라(Gypsophila) 종 및/또는 사포나리아(Saponaria) 종 및/또는 아그로스템마(Agrostemma) 종 및/또는 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria)와 같은 퀼라자(Quillaja) 종으로부터 분리된 사포닌이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자이며, 여기서 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위가 결합하는 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프는 바람직하게는 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린(integrin), 신데칸(syndecan)-1, 혈관 인테그린(vascular integrin) 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트(Folate) 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, PSMA, CanAg, 인테그린-알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토(Cripto), CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2으로부터 선택된, 보다 바람직하게는 CD71, EGFR, HER2로부터 선택된 종양-세포 특이적 수용체의 종양-세포 특이적 제1 에피토프이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자이며, 여기서 종양 세포-특이적 제1 에피토프, 제1 종양-세포 표면 분자 또는 제1 종양-세포 특이적 수용체는 본 발명의 제1 단백질성 분자의 제1 에피토프 또는 제1 분자 또는 제1 수용체와의 결합 후 종양 세포에 의해 내재화되는 제1 에피토프 또는 제1 분자 또는 제1 수용체이며, 그리고 여기서 바람직하게 제1 단백질성 분자는, 제1 에피토프, 종양-세포 표면 분자 또는 종양-세포 특이적 수용체를 포함하는 세포 표면 분자에 결합될 때, 예를 들어 엔도사이토시스, 또는 종양-세포 표면 분자 매개된 내재화를 통해, 예를 들어 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해, 종양-세포 수용체-매개 내재화를 받는다.
본 발명의 일 견지는 치료 조합물에 관한 것으로, 여기서 치료 조합물은 (a) 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제1 약학 조성물; 및 (b) 제1 단백질성 분자와 상이한 제2 단백질성 분자를 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하며, 제2 단백질성 분자는 제1 세포 표면 분자와 상이한 제2 세포 표면 분자의 제2 에피토프에 결합하는 제2 결합 부위를 포함하며, 그리고 이펙터 모이어티를 포함하며, 제2 약학 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하며, 여기서 제2 에피토프는 제1 에피토프와 상이하다.
본 발명의 일 견지는 (a) 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자를 포함하고, 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위를 포함하는 본 발명의 제1 약학 조성물로서, 상기 제1 약학 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 제1 약학 조성물; 및 (b) 제3 단백질성 분자를 포함하는 제3 약학 조성물로서, 상기 제3 단백질성 분자는 (a)의 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위 및 이펙터 모이어티를 포함하는 제3 약학 조성물을 포함하며, 상기 제3 약학 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하며, 여기서 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위 및 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 동일하며, 그리고 여기서 제1 단백질성 분자가 결합할 수 있는 제1 세포 표면 분자 상의 제1 세포 표면 분자 및 제1 에피토프, 및 제3 단백질성 분자가 결합할 수 있는 제1 세포 표면 분자 상의 제1 세포 표면 분자 및 제1 에피토프는 동일하다.
일 구현은 적어도 하나의 사포닌에 접합된 ADC의 제조를 위한 반제품이거나, 또는 적어도 하나의 사포닌에 접합된 AOC의 제조를 위한 반제품인, 본 발명의 제1 단백질성 분자 및/또는 제2 단백질성 분자이며, 적어도 하나의 사포닌은 공유 결합을 통해, 바람직하게는 적어도 하나의 링커를 통해, 그리고 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌이 공유 커플링된, 바람직하게는 링커를 통해 공유 결합된 올리고머 또는 중합체 스캐폴드를 통해 ADC 또는 AOC에 커플링된다(도 91, 92).
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자, 및/또는 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 제1 결합 부위 및/또는 제2 결합 부위는 모노클로날 항체 또는 이의 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 단편 및/또는 -도메인이거나 포함하며, 바람직하게는 세툭시맙(cetuximab), 다라투무맙(daratumumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 이노투주맙(inotuzumab), 목세투모맙(moxetumomab), 폴라투주맙(polatuzumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), IgG 유형의 OKT-9 항-CD71 모노클로날 항체, 페르투주맙(pertuzumab), 리툭시맙(rituximab), 오파투무맙(ofatumumab), 헤르셉틴(Herceptin), 알렘투주맙(alemtuzumab), 피나투주맙(pinatuzumab), OKT-10 항-CD38 모노클로날 항체, 및 표 A4의 항체, 바람직하게 세툭시맙(cetuximab) 또는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 OKT-9, 또는 이의 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 단편 또는 -도메인 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되며, 단, 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위와 상이하다.
일 구현은 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 제2 단백질성 분자에 의해 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되는 이펙터 모이어티는 올리고뉴클레오티드, 핵산, 제노 핵산 중 어느 하나 이상을 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현은 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 제2 단백질성 분자에 의해 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되는 이펙터 모이어티는 적어도 하나의 단백질성 분자, 바람직하게는 펩티드, 단백질, 우레아제 및 Cre-리콤비네이즈와 같은 효소, 리보솜-불활성화 단백질, 단백질성 독소 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는, 적어도 하나의 단백질성 분자를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현은 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 제2 단백질성 분자에 의해 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함된 이펙터 모이어티는 적어도 하나의 페이로드, 바람직하게는 독소 표적화 리보솜, 독소 표적화 신장 인자, 독소 표적화 튜뷸린, 독소 표적화 DNA 및 독소 표적화 RNA 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는, 적어도 하나의 페이로드를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현은 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 제1 단백질성 분자는 하나 이상의 사포닌, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 또는 1-100개의 사포닌을 포함하거나, 또는 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기, 바람직하게는 시스테인 및/또는 리신에 직접 공유 결합된, 및/또는 적어도 하나의 링커를 통해 공유 결합된 및/또는 적어도 하나의 절단가능한(cleavable) 링커를 통해 및/또는 적어도 하나의 중합체 또는 올리고머 스캐폴드, 바람직하게 1-8개의 이러한 스캐폴드 또는 2-4개의 이러한 스캐폴드를 통해 공유 결합된, 7, 9, 12개의 사포닌과 같이 이들 사이에 있는 임의의 수의 사포닌을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 스캐폴드는 선택적으로 덴드론에 기초하며, 여기서 1-32개의 사포닌, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32개의 사포닌, 또는 7, 9, 12개의 사포닌과 같이 이들 사이에 있는 임의의 수의 사포닌이 적어도 하나의 스캐폴드에 공유 결합된다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제2 단백질성 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제3 단백질성 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일 구현은 제1 단백질성 분자와 함께, 제2 또는 제3 단백질성 분자를 포함하는 본 발명의 조성물로서, 여기서 제2 단백질성 분자에 의해 또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되는 이펙터 모이어티는 본 발명에 따른 이펙터 모이어티 중 어느 하나이며, 바람직하게는 BNA이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자, 그리고 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산 중 어느 하나 이상, 바람직하게는 벡터, 유전자, 세포 자살 유도 트랜스진, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), DNA 압타머, RNA 압타머, mRNA, 미니-서클 DNA, 펩티드 핵산(PNA), 포스포아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), 잠금(locked) 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노 핵산(FANA), 2'-0-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-O,4'-아미노에틸렌 가교 핵산, 3'-플루오로 헥시톨 핵산(FHNA), 플라스미드, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스(threose) 핵산(TNA), 또는 이의 유도체 중 적어도 하나로부터 선택된, 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산 중 어느 하나 이상, 보다 바람직하게는 예를 들어 HSP27 단백질 발현을 침묵시키기 위한 BNA와 같은 BNA를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 이펙터 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체에 관한 것이다.
일 구현은 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체로서, 여기서 항체는 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린(integrin), 신데칸(syndecan)-1, 혈관 인테그린(vascular integrin) 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트(Folate) 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, PSMA, CanAg, 인테그린-알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토(Cripto), CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, 바람직하게는 CD71, HER2, EGFR 중 어느 하나에 결합할 수 있으며, 그리고/또는 여기서 항체는 세툭시맙(cetuximab), 다라투무맙(daratumumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 이노투주맙(inotuzumab), 목세투모맙(moxetumomab), 폴라투주맙(polatuzumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), IgG 유형의 OKT-9 항-CD71 모노클로날 항체, 페르투주맙(pertuzumab), 리툭시맙(rituximab), 오파투무맙(ofatumumab), 헤르셉틴(Herceptin), 알렘투주맙(alemtuzumab), 피나투주맙(pinatuzumab), OKT-10 항-CD38 모노클로날 항체, 표 A2 또는 표 A3 또는 표 A4의 항체, 바람직하게 세툭시맙(cetuximab) 또는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 OKT-9, 또는 이의 적어도 하나의 종양-세포 수용체 결합-단편 및/또는 이의 적어도 하나의 종양-세포 수용체 결합-도메인이거나 이를 포함하며, 그리고/또는 여기서 항체-약물 접합체는 겜투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 트라스투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine), 이노투주맙 오조가마이신(Inotuzumb ozogamicin), 목세투모맙 파수도톡스(Moxetumomab pasudotox) 및 폴라투주맙 베도틴(Polatuzumab vedotin) 및 표 A2 및 표 A3의 항체-약물 접합체 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 여기서 리간드-약물 접합체는 EGF 또는 사이토카인과 같은 세포 표면 분자에 결합하기 위한 적어도 하나의 리간드를 포함한다.
일 구현은 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체로서, 여기서 이펙터 모이어티는 본 발명에 따른 이펙터 모이어티 중 어느 하나 이상이다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 본 발명의 리간드-약물 접합체를 포함하며, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
일 구현은 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 치료 조합물 또는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 견지는 하기의 ADC 및 AOC 중 어느 것, 및 이들의 반제품 접합체로서 본 발명의 제1 단백질성 분자 및/또는 본 발명의 제2 단백질성 분자 및/또는 본 발명의 제3 단백질성 분자 그리고 본 발명의 적어도 하나의 이펙터 분자를 포함하거나 또는 본 발명의 적어도 하나의 사포닌을 포함하거나, 또는 이들 모두를 포함하는 이들의 반제품 접합체에 관한 것이다:
항-EGFR 항체 - 사포닌;
항-EGFR 항체-트리테르페노이드 사포닌 및/또는 위치 C-23에서 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인(12,13-dehydrooleanane)의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜(bisdesmosidic triterpene) 사포닌으로서 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산(glucuronic acid) 작용기를 포함함;
항-EGFR 항체 - SO1861;
항-EGFR 항체 - GE1741;
항-EGFR 항체 - SA1641;
항-EGFR 항체 - Quil-A;
항-EGFR 항체 - QS-21;
항-EGFR 항체 - 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획물 중의 사포닌;
세툭시맙 - 사포닌;
세툭시맙 - 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것;
세툭시맙 - SOI 861;
세툭시맙 - GE1741;
세툭시맙 - SA1641;
세툭시맙 - Quil-A;
세툭시맙 - QS-21;
세툭시맙 - 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌
항-HER2 항체 - 사포닌;
항-HER2 항체 - 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것;
항-HER2 항체 - SO1861;
항-HER2 항체 - GE1741;
항-HER2 항체 - SA1641;
항-HER2 항체 - Quil-A;
항-HER2 항체 - QS-21;
항-HER2 항체 - 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌;
트라스투주맙 - 사포닌;
트라스투주맙 - 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것;
트라스투주맙 - SO1861;
트라스투주맙 - GE1741;
트라스투주맙 - SA1641;
트라스투주맙 - Quil-A;
트라스투주맙 - QS-21;
트라스투주맙 - 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌;
항-CD71 항체 - 사포닌;
항-CD71 항체 - 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것;
항-CD71 항체 - SO1861;
항-CD71 항체 - GE1741;
항-CD71 항체 - SA1641;
항-CD71 항체 - Quil-A;
항-CD71 항체 - QS-21;
항-CD71 항체 - 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌;
OKT-9 - 사포닌;
OKT-9 - 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것;
OKT-9 - SO1861;
OKT-9 - GE1741;
OKT-9 - SA1641;
OKT-9 - Quil-A;
OKT-9 - QS-21;
OKT-9 - 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌;
항-EGFR 항체 - 올리고뉴클레오티드;
항-EGFR 항체 - 안티센스 올리고뉴클레오티드;
항-EGFR 항체 - siRNA;
항-EGFR 항체 - 안티센스 BNA;
항-EGFR 항체 - 안티센스 BNA(HSP27);
항-EGFR 항체 - 단백질성 독소;
항-EGFR 항체 - 리보솜 불활성화 단백질;
항-EGFR 항체 - 디안틴;
항-EGFR 항체 - 사포린;
세툭시맙 - 올리고뉴클레오티드;
세툭시맙 - 안티센스 올리고뉴클레오티드;
세툭시맙 - siRNA;
세툭시맙 - 안티센스 BNA;
세툭시맙 - 안티센스 BNA(HSP27);
세툭시맙 - 단백질성 독소;
세툭시맙 - 리보솜 불활성화 단백질;
세툭시맙 - 디안틴
세툭시맙 - 사포린;
항-HER2 항체 - 올리고뉴클레오티드;
항-HER2 항체 - 안티센스 올리고뉴클레오티드;
항-HER2 항체 - siRNA;
항-HER2 항체 - 안티센스 BNA;
항-HER2 항체 - 안티센스 BNA(HSP27);
항-HER2 항체 - 단백질성 독소;
항-HER2 항체 - 리보솜 불활성화 단백질;
항-HER2 항체 - 디안틴;
항-HER2 항체 - 사포린;
트라스투주맙 - 올리고뉴클레오티드;
트라스투주맙 - 안티센스 올리고뉴클레오티드;
트라스투주맙 - siRNA;
트라스투주맙 - 안티센스 BNA;
트라스투주맙 - 안티센스 BNA(HSP27);
트라스투주맙 - 단백질성 독소;
트라스투주맙 - 리보솜 불활성화 단백질;
트라스투주맙 - 디안틴;
트라스투주맙 - 사포린;
항-CD71 항체 - 올리고뉴클레오티드;
항-CD71 항체 - 안티센스 올리고뉴클레오티드;
항-CD71 항체 - siRNA;
항-CD71 항체 - 안티센스 BNA;
항-CD71 항체 - 안티센스 BNA(HSP27);
항-CD71 항체 - 단백질성 독소;
항-CD71 항체 - 리보솜 불활성화 단백질;
항-CD71 항체 - 디안틴;
항-CD71 항체 - 사포린;
OKT-9 - 올리고뉴클레오티드;
OKT-9 - 안티센스 올리고뉴클레오티드;
OKT-9 - siRNA;
OKT-9 - 안티센스 BNA;
OKT-9 - 안티센스 BNA(HSP27);
OKT-9 - 단백질성 독소;
OKT-9 - 리보솜 불활성화 단백질;
OKT-9 - 디안틴;
OKT-9 - 사포린;
항-EGFR 항체 (- 올리고뉴클레오티드)(- 사포닌), 여기서 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 안티센스 BNA, 및 안티센스 BNA(HSP27) 중 어느 하나 이상이고, 그리고 여기서 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21, 및 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌 중 어느 하나 이상이고, 여기서 항-EGFR 항체는 바람직하게 세툭시맙임;
항-EGFR 항체 (- 단백질성 독소)(- 사포닌), 여기서 단백질성 독소는 리보솜 불활성화 단백질, 디안틴 및 사포린 중 어느 하나 이상이고, 그리고 여기서 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21, 및 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌 중 어느 하나 이상이고, 여기서 항-EGFR 항체는 바람직하게 세툭시맙임;
항-HER2 항체 (- 올리고뉴클레오티드)(- 사포닌), 여기서 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 안티센스 BNA 및 안티센스 BNA(HSP27) 중 어느 하나 이상이고, 그리고 여기서 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21, 및 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌 중 어느 하나 이상이고, 여기서 항-EGFR 항체는 바람직하게 트라스투주맙임;
항-HER2 항체 (- 단백질성 독소)(- 사포닌), 여기서 단백질성 독소는 리보솜 불활성화 단백질, 디안틴 및 사포린 중 어느 하나 이상이고, 그리고 여기서 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21, 및 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌 중 어느 하나 이상이고, 여기서 항-EGFR 항체는 바람직하게 트라스투주맙임;
항-CD71 항체 (- 올리고뉴클레오티드)(- 사포닌), 여기서 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 안티센스 BNA, 및 안티센스 BNA(HSP27) 중 어느 하나 이상이고, 그리고 여기서 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21, 및 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌 중 어느 하나 이상이고, 여기서 항-CD71 항체는 바람직하게 OKT-9임;
항-CD71 항체 (- 단백질성 독소)(- 사포닌), 여기서 단백질성 독소는 리보솜 불활성화 단백질, 디안틴 및 사포린 중 어느 하나 이상이고, 그리고 여기서 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21, 및 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌 중 어느 하나 이상이고, 여기서 항-CD71 항체는 바람직하게 OKT-9임.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자, 본 발명의 반-제품 접합체 또는 본 발명의 접합체이며, 여기서 제1 단백질성 분자는 세툭시맙, 트라스투주맙, OKT-9 로부터 선택되고, 그리고/또는 여기서 이펙터 분자는 디안틴, 사포린 및 안티센스 BNA(HSP27)로부터 선택되고, 그리고/또는 여기서 사포닌은 SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21, 및 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌으로부터 선택된다.
일 구현은 본 발명에 따른 접합체이며, 여기서 제1 단백질성 분자는 세툭시맙, 트라스투주맙, OKT-9 로부터 선택되고, 그리고/또는 여기서 이펙터 분자는 디안틴, 사포린 및 안티센스 BNA(HSP27)로부터 선택되고, 그리고/또는 여기서 사포닌은 SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21, 및 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌으로부터 선택된다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자를 포함하고 그리고/또는 본 발명의 적어도 하나의 이펙터 분자를 포함하고 그리고/또는 본 발명의 적어도 하나의 사포닌을 포함하는, 구조 C의 ADC 또는 AOC 또는 반제품의 ADC 접합체 또는 반제품의 AOC 접합체에 관한 것이다:
본 발명의 제 1 단백질성 분자 및/또는 본 발명의 하나 이상의 사포닌을 포함하는 반-마무리된 ADC 컨쥬게이트 또는 반-마무리된 AOC 결합체에 관한 것이다:
A(- S)b(- E)c
구조 C,
여기서 A는 제1 결합 부위이고;
S는 사포닌이고;
E는 이펙터 분자이고;
b = 0-64, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 8, 16, 32, 64 또는 그 사이의 임의의 정수 또는 분수이며;
c = 0-8, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 또는 그 사이의 임의의 정수 또는 분수이며;
여기서 S는 A 및/또는 E에 커플링되고, E는 A 및/또는 S에 커플링되고, 바람직하게 S는 A에 커플링되고, E는 A에 커플링된다.
일 구현은 본 발명의 구조 C이며, 여기서 A는 세툭시맙과 같은 항-EGFR 항체, 트라스투주맙과 같은 항-HER2 항체, OKT-9와 같은 항-CD71 항체이며, 그리고/또는 여기서 S는 사포닌, 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌 및 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 포함하는 것, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21, 및 퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획 중의 사포닌 중 어느 하나 이상이고, 그리고/또는 E는 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 안티센스 BNA 및 안티센스 BNA(HSP27) 중 하나 이상, 및/또는 단백질성 독소, 리보솜 불활성화 단백질, 디안틴 및 사포린 중 어느 하나 이상이다.
일 구현은 본 발명의 구조 C, 본 발명의 접합체 또는 본 발명의 반-제품 접합체 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자에 관한 것으로, 여기서 존재하는 경우, 사포닌, 및/또는 존재하는 경우, 이펙터 분자는 예컨대 절단가능한 링커와 같은 적어도 하나의 링커를 통해, 및/또는 N-ε-말레이미도카프론산 히드라지드(EMCH) 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 또는 3-(2-피리딜디티오)프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(SPDP), 및 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)에 기초한 링커와 같은, 및 G4-덴드론과 같은 덴드론에 기초한 스캐폴드와 같은 적어도 하나의 올리고머 또는 중합체 스캐폴드 또는 스킴 II의 3작용성 링커와 같은 3작용성 링커를 통해 공유 커플링되며, 그리고/또는 제1 단백질성 분자, 바람직하게 모노클로날 항체 또는 이의 단편 또는 도메인의 제1 결합 부위의 적어도 리신 측쇄 및/또는 시스테인 측쇄는 사포닌 및/또는 이펙터 분자 및/또는 링커 및/또는 절단가능한 링커 및/또는 스캐폴드와 공유 결합에 관여하며, 여기서 바람직하게는 사포닌 및/또는 이펙터 분자는 제1 단백질성 분자, 바람직하게 항체의 제1 결합 부위에 공유 결합되며, 여기서 공유 결합은 아미드 결합, 히드라존 결합, 이황화 결합을 포함하거나 구성된다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 전술한 접합체 또는 본 발명의 반-제품 접합체 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자 중 어느 것을 의약으로서 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 접합체 또는 본 발명의 반-제품 접합체 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자를 암 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
도 91 및 도 92는 공유 커플링된 사포닌(들)을 갖는 본 발명의 ADC 및 공유 커플링된 사포닌(들)을 갖는 본 발명의 OAC의 예들을 보여준다.
정의
용어 "링커"는 이의 표준적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 분자 또는 원자를 다른 분자, 예를 들어 리간드 또는 이펙터 분자 또는 스캐폴드에 부착하는, 펩티드 결합을 통해 복합체화된 아미노산 잔기의 선형 스트레치 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 전형적으로 링커는 화학 결합으로 연결된 원자의 사슬을 포함한다. 당 업계에 공지된 임의의 링커 분자 또는 링커 기술이 본 개시사항에 사용될 수 있다. 지시된 경우, 링커는 링커와의 공유 연결(covalent linkage) 또는 결합(bond)을 형성하기에 적합한 이러한 분자상의 화학기(chemical group)를 통해 분자를 공유 결합하기 위한 링커이다. 링커는 절단 불가능한(non-cleavable) 링커일 수 있으며, 예를 들어 링커는 생리학적 조건에서 안정하다. 링커는 예를 들어 절단 가능한 링커일 수 있으며, 예를 들어 링커는 효소의 존재 또는 특정 pH 범위 또는 값에서, 또는 생리학적 조건, 예컨대 후기 엔도솜(late endosomes)과 엔도솜 및 인간 세포와 같은 포유류 세포의 리소좀에서의 세포내 조건과 같은 생리학적 조건 하에서 절단 가능하다. 본 개시사항의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 링커는 N-ε- 말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH), 숙신이미딜 3-(2- 피리딜디티오)프로피오네이트 또는 3-(2- 피리딜디티오)프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(SPDP) 및 1- [비스(디메틸 아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로 [4,5-b] 피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로 포스페이트(HATU)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "3작용성 링커"는 이의 표준적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 3개의 분자 각각의 화학기를 통해 3개의 분자를 부착하는 링커를 지칭한다. 당업자는 본 개시사항 및 통상의 일반적인 지식에 기초하여 이러한 3작용성 링커를 설계할 수 있다. 이러한 3작용성 링커는, 예를 들어 티올-엔 반응을 수행하는 티올기를 나타내는 표적 리간드(targeting ligand)에 접합하는데 사용될 수 있는 말레이미도기를 나타낼 수 있다. 또한, 3작용성 링커는 아지도 함유 사포닌과 함께 소위 변형-촉진 알킨-아지드 고리화첨가(cycloaddition)(SPAAC, 클릭 화학)를 수행하는 디벤조사이클로옥틴(DBCO) 기를 나타낼 수 있다. 마지막으로, 3작용성 링커는 테트라진(Tz) 베어링 이펙터 분자와 소위 역 전자 요구 다이엘-앨더(IEDDA, inverse electron demand Diels-Alder) 반응을 수행하는 트랜스-시클로옥텐(TCO) 그룹과 같은 제 3 작용기를 획득할 수 있다. 당업자는 3작용성 링커의 화학기가 3개 모두 동일하거나 상이할 수 있거나, 링커가 분자를 3작용성 링커에 연결하기 위한 동일한 화학기 중 2 개를 포함 할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 3작용성 링커 사이에 형성된 결합은 공유 또는 비공유 일 수 있으며, 공유 결합이 바람직하다. 각각의 화학기를 통한 3작용성 링커와 1개 또는 2개 또는 3개의 결합된 분자 사이에 형성된 결합은 인간 세포와 같은 포유류 세포의 리소좀 및 엔도솜과 같은 세포 내부의 산성 조건 하에서 절단 가능한 것과 같이 절단 가능한(불안정한) 결합일 수 있거나, 또는 절단 불가능한(non-cleavable) 결합일 수 있다. 물론, 3작용성 링커는 공유 결합을 형성하기 위한 1개 또는 2개의 화학기를 포함 할 수 있는 반면, 추가의 2개 또는 1개의 화학기(들)는 각각 비공유 결합을 형성하기 위한 것이다. 물론, 3작용성 링커는 절단 가능한 결합을 형성하기 위한 1개 또는 2개의 화학기를 포함할 수 있는 반면, 추가의 2개 또는 1개의 화학기(들)는 각각 절단 불가능한 결합을 형성하기 위한 것이다.
용어 "절단 가능한 링커" 또는 "절단 가능한 결합"에 사용된 것과 같은 용어 "절단 가능한(cleavable)"은 이의 표준적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 산성 조건, 환원성 조건, 효소 조건 또는 광-유도 조건 하에서 절단되는 것을 의미한다. 예를 들어, 절단 가능한 링커는 산성 조건 하에서 절단 될 수 있으며, 바람직하게는 상기 절단 가능한 링커는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포의 엔도솜 및/또는 리소좀에 존재하는 산성 조건, 바람직하게는 pH 4.0 내지 6.5, 그리고 보다 바람직하게는 pH ≤ 5.5 하에서 생체내 절단될 수 있다. 또 다른 예로서, 절단 가능한 링커는 효소, 예를 들어, 카텝신에 의해 절단될 수 있다. 더욱이, 환원성 조건 하에서 절단 가능한 공유 결합의 예는 이황화(disulphide) 결합이다.
올리고머 또는 중합체 스캐폴드의 맥락에서 용어 "올리고머" 및 "중합체"는 이의 표준적인 과학적 의미를 갖는다. 본원에서 중합체는 서로 결합된 다수의 동일하거나 유사한 단위으로부터 주로 또는 완전히 축조된(built up) 분자 구조를 갖는 물질을 지칭하며; 본원에서 올리고머는 분자가 상대적으로 적은 반복 단위로 구성된 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 5-10 개 이하의 동일하거나 유사한 단위(unit)를 포함하는 구조를 올리고머 구조라고 할 수 있고, 10-50 개 모노머 단위 이상을 포함하는 구조를 중합체 구조라고 할 수 있는 반면, 10 개 모노머 단위의 구조는 올리고머 또는 중합체로 지칭될 수 있다.
용어 "결합 부위"는 표준적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 분자상의 영역 또는 에피토프, 예를 들어, 다른 분자가 결합할 수 있는 단백질, DNA 또는 RNA를 지칭한다.
용어 "스캐 폴드"는 규칙적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 하나 이상의 분자, 예를 들어 리간드 분자, 이펙터 분자가 직접적으로 또는 절단 가능한 링커와 같은 링커를 통해 공유 결합될 수 있는 올리고머 또는 중합체 템플레이트 또는 캐리어 또는 염기(염기 분자 또는 염기 구조)를 지칭한다. 스캐 폴드는 중합체, 올리고머, 덴드리머, 덴드론화된 중합체 또는 덴드론화된 올리고머와 같은 구조적으로 정렬된 형성물(formation)을 가질 수 있거나 하이드로겔, 마이크로겔, 나노겔, 안정화된 중합체 미셀 또는 리포좀과 같은 에셈블리된 중합체 구조를 가질 수 있지만, 콜레스테롤/인지질 혼합물과 같은 단량체의 비공유 어셈블리로 구성되는 구조는 제외한다. 스캐 폴드는 중합체 또는 올리고머 구조, 예컨대 폴리- 또는 올리고(아민), 예를 들어 폴리에틸렌이민 및 폴리(아미도 아민); 또는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리- 또는 올리고(에스테르), 예컨대 폴리(락티드), 폴리(락탐), 폴리락티드-코-글리콜라이드 공중합체와 같은 구조; 또는 폴리(덱스트린), 폴리- 또는 올리고당류, 예컨대 사이클로덱스트린 또는 폴리덱스트로스; 또는 천연 및/또는 인공 폴리- 또는 올리고 아미노산, 예컨대 폴리-리신 또는 펩티드 또는 단백질, DNA 올리고- 또는 중합체, 안정화된 RNA 중합체 또는 PNA(펩티드 핵산) 중합체와 같은 구조를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 중합체 또는 올리고머 구조는 생체 적합성(biocompatible)이며, 여기서 생체 적합성은 중합체 또는 올리고머 구조가 유기체에서 실질적인 급성 또는 만성 독성을 나타내지 않고 그대로 배설되거나 신체 대사에 의해 배설 및/또는 생리학적 화합물로 완전히 분해될 수 있음을 의미한다.
용어 "리간드"는 표준적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 표적 세포 표면 분자 또는 표적 세포, 예를 들어, 표적 암세포 또는 표적 자가-면역 세포에서 발현되는 표적 세포 표면 수용체 또는 표적 세포 표면 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자들을 지칭한다. 리간드는 표적 세포상의 다른 항원 또는 수용체로 구성된 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 세포-결합 리간드는 항체이다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 이는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD(또는 이의 임의의 서브클래스) 클래스에 속하는 단백질로 정의 된 면역글로불린(Ig), 또는 면역글로불린의 기능적 결합 단편 또는 결합 도메인울 지칭할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 면역글로불린의 "결합 단편" 또는 "결합 도메인"은 이러한 모 면역글로불린의 항원 결합 활성을 본질적으로 유지하는 모 면역글로불린의 항원-결합 단편 또는 -도메인 또는 기타 유도체로 정의된다. 기능성 단편 및 기능성 도메인은 항원에 대한 친화성이 모 면역글로불린보다 낮더라도 본 발명의 의미에서 항체이다. 본 발명에 따른 "기능성 단편 및 -도메인"은 F(ab')2 단편, Fab'단편, Fab 단편, scFv, dsFv, 단일-도메인 항체(sdAb), 1가 IgG, scFv-Fc, 환원된 IgG(rIgG), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fc 융합 단백질, 나노바디, 가변 V 도메인, 예컨대 VHH, Vh, 및 면역글로불린 단편 및 도메인을 인식하는 다른 타입의 항원을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단편 및 도메인은 CH1 및 CL 도메인 사이에서 발생하는 분자간 디설파이드 상호 작용을 최소화하거나 완전히 제거하도록 조작될 수 있다. 기능성 단편 및 -도메인은 크기가 작기 때문에 더 큰 종양 침투의 이점을 제공한다. 또한 기능성 단편 또는 -도메인은 전체 면역글로불린에 비해 종양 덩어리 전체에 더 고르게 분포될 수 있다.
본 발명의 항체(면역글로불린)는 2 작용성 또는 다작용성(multifunctional)일 수 있다. 예를 들어, 2 작용성 항체는 하나의 수용체 또는 항원에 대한 특이성을 갖는 한쪽 팔을 가지고 있는 반면 다른 팔은 다른 수용체 또는 항원을 인식한다. 대안적으로, 2 작용성 항체의 각각의 팔은 표적 세포의 동일한 수용체 또는 항원의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 가질 수 있다.
본 발명의 항체 (면역글로불린)는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재표면화 항체(resurfaced antibodies), 항-이디오타입 항체(항-idiotypic antibodies), 마우스 항체, 랫트 항체, 랫트/마우스 하이브리드 항체, 라마 항체, 라마 중쇄 전용 항체, 중쇄 전용 항체 및 수의학 항체일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체(면역글로불린)는 모노클로날 항체이다. 재표면화, 키메라, 인간화 및 완전 인간 항체는 또한 인간에서 면역원성을 유발할 가능성이 적기 때문에 보다 바람직하다. 본 발명의 ADC의 항체는 바람직하게는 암 세포, 자가 면역 세포, 병든 세포, 비정상 세포의 표면에서 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 반면, 임의의 건강한 세포는 본질적으로 변하지 않은 상태로 남겨둔다(예, 이러한 정상 세포에 결합하지 않음으로써, 또는 이러한 건강한 세포에 대한 수 및/또는 친화성이 더 적은 정도로 결합함으로써).
본 발명의 ADC에 사용될 수 있는 특정한 항체는 항-HER2 모노클로날 항체 예컨대 트라투주맙 및 페르투주맙, 항-CD20 모노클로날 항체 예컨대 리투시맙, 오파투무맙, 토시투모맙 및 이부리투모맙, 항-CA125 모노클로날 항체 예컨대 오레고보맙, 항-EpCAM (17-1A) 모노클로날 항체 예컨대 에드레콜로맙, 항-EGFR 모노클로날 항체 예컨대 세투시맙, 파니투무맙 및 니오모투주맙, 항-CD30 모노클로날 항체 예컨대 브렌투시맙, 항-CD33 모노클로날 항체 예컨대 겜투주맙 및 huMy9-6, 항-혈관 인테그린 알파-v 베타-3 모노클로날 항체 예컨대 에타라시주맙, 항-CD52 모노클로날 항체 예컨대 알렘투주맙, 항-CD22 모노클로날 항체 예컨대 에프라투주맙, 항-CEA 모노클로날 항체 예컨대 라베투주맙, 항-CD44v6 모노클로날 항체 예컨대 비바투주맙, 항-FAP 모노클로날 항체 예컨대 시브로투주맙, 항-CD19 모노클로날 항체 예컨대 huB4, 항-CanAg 모노클로날 항체 예컨대 huC242, 항-CD56 모노클로날 항체 예컨대 huN901, 항-CD38 모노클로날 항체 예컨대 다라투무맙, 항-CA6 모노클로날 항체 예컨대 DS6, 항-IGF-IR 모노클로날 항체 예컨대 시수투무맙 및 3B7, 항-인테그린 모노클로날 항체 예컨대 CNTO 95, 및 항-신데칸-1 모노클로날 항체 예컨대 B-B4를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
표적 세포의 항원 또는 세포 수용체에 결합하는 항체 이외의 임의의 다른 분자도 본 발명의 리간드-약물 접합체 및 본 발명에 따른 공유 결합된 사포닌이 제공되는 리간드에 대한 세포 결합 리간드로서 사용될 수 있다. 이들 리간드는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 소분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 비-항체 리간드의 예는 인터페론(예, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ), 트랜스페린, 렉틴, 표피(epidermal) 성장 인자(EGF) 및 EGF-유사 도메인, 가스트린-방출 펩티드(GRP), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 형질 전환 성장 인자 (TGF), 우두(vaccinia) 성장 인자(VGF), 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자(IGF, 예, IGF-1 및 IGF-2), 기타 적합한 호르몬, 예컨대 티로트로핀 방출 호르몬(TRH), 멜라닌 세포-자극 호르몬(MSH), 스테로이드 호르몬(예, 에스트로겐 및 안드로겐), 소마토스타틴, 림포카 인(예, IL-2, IL-3, IL-4 및 IL-6), 집락 자극 인자(CSF, 예, G-CSF, M-CSF 및 GM-CSF), 봄베신, 가스트린, Arg-Gly-Asp 또는 RGD, 앱타머(예, AS-1411, GBI-10, HIV 당단백질에 대한 RNA 앱타머), 소분자(예, 엽산, 아니사미드 페닐보론산), 비타민(예, 비타민 D), 카보하이드레이트(예, 히알루론산, 갈락토오스)이다.
"이펙터 분자" 또는 "이펙터 모이어티" 또는 "페이로드"는 규칙적인 과학적 의미를 가지며, 본 발명의 맥락에서 세포내 이펙터 분자 표적과의 상호 작용에 의해 세포의 대사에 영향을 미치는 임의의 물질이며, 여기서 이 이펙터 분자 표적은 엔도사이틱(endocytic) 및 재순환(recycling) 경로의 소포(vesicles) 및 구획(compartments)의 루멘을 제외하지만, 이들 소포 및 구획의 막을 포함하는 세포 내부의 임의의 분자 또는 구조이다. 따라서 세포 내부의 상기 구조는 핵, 미토콘드리아, 엽록체, 소포체, 골지체, 기타 수송 소포, 원형질막의 내부 부분 및 세포질을 포함한다.
이펙터 분자 또는 -모이어티는 단백질성 독소, 약물, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 독소와 같은 약학적 활성 물질이다. 본 발명에서 약학적 활성 물질은 유기체, 바람직하게는 척추 동물, 보다 바람직하게는 비인간 대상체 또는 인간/대상체와 같은 포유 동물에서 유익한 결과를 달성하기 위해 사용되는 이펙터 분자 또는 -모이어티이다. 혜택은 질환 및/또는 증상 및/또는 건강 문제의 진단, 예후, 치료, 처리 및 방지(예방)를 포함한다. 약학적 활성 물질은 또한 바람직하지 않고 때로는 심지어 해로운 부작용 (임상 시험 중에 관찰되는 것과 같은 부작용)을 유발할 수도 있다. 이 경우, 약학적 활성 물질이 특정 경우에 적합한지 여부를 결정하기 위해 장단점을 고려해야 한다. 세포 내부의 약학적 활성 물질의 효과가 전체적으로 유기체에 주로 유익한 경우, 세포를 표적 세포라고 한다. 세포 내부의 영향이 전체적으로 유기체에 주로 해로운 경우, 세포를 표적 외(off-target) 세포라고 한다. 세포 배양 및 바이오 반응기와 같은 인공 시스템에서, 표적 세포와 표적 외 세포는 목적에 따라 다르며 사용자에 의해 정의된다. 이펙터 분자 및 -모이어티의 예는 약물, 독소, 폴리펩티드 (예, 효소), 폴리뉴클레오티드 (비천연 아미노산 또는 핵산을 포함하는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 포함) 및 이들의 임의 조합이다.
약물인 이펙터 분자 또는 이펙터 모이어티는 항암제, 항염증제 및 항 감염 제 (예 : 항진균제, 항균제, 항 기생충 제, 항 바이러스제)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 약물 분자는 항암제 또는 항 자가면역제이다. 적합한 항암제는 알킬화제, 대사길항제(antimetabolites), 방추 독 식물(spindle poison plant) 알칼로이드, 세포 독성 / 항 종양 항생제, 토포이소머라 제 억제제, 광감작제 및 키나제 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한 "항암제"의 정의에 포함되는 것은: 예를 들어, (i) 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제; (ii) 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마 타제를 억제하는 아로마타제 억제제; (iii) 항-안드로겐; (iv) 단백질 키나제 억제제; (v) 지질 키나제 억제제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식과 관련된 신호 전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것들; (vii) VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제와 같은 리보자임; (viii) 유전자 치료 백신과 같은 백신; 토포이소머라제 1 억제제; (ix) 항-혈관형성제(anti-angiogenic agents); 및 상기한 것 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산, 용매화물 및 유도체이다.
독소인 이펙터 분자 또는 -모이어티는 단백질성 독소 (예 : 박테리아-유래 독소 및 식물-유래 독소), 튜불린 필라멘트를 표적화하는 독소, DNA를 표적화하는 독소, RNA를 표적화하는 독소를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 단백질성 독소의 예는 사포린, 디안틴, 리신(ricin), 모데신, 아브린, 볼켄신, 비스큐민, 시가 독소, 시가-유사 독소, 슈도모나스 엑소톡신 (PE, 엑소톡신 A로도 알려짐), 디프테리아 독소 (DT) 및 콜레라 독소이다. 튜불린 필라멘트-표적 독소의 예는 메이탄시노이드 (예 : DM1 및 DM4), 아우리스타틴 (예 : 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)), 톡소이드, 튜불리신, 크립토피신, 리족신이다. DNA-표적 독소의 예는 칼리케아미신: N-아세틸-γ-칼리케아미신, CC-1065 유사체, 듀오카르마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 벤조디아제핀, 캄프토테신 유사체 및 안트라사이클린이다. DNA-표적 독소의 예는 아마니틴, 스플리세오 스타틴 및 타이란스타틴이다. 본 발명에서 사용되는 독소는 세포를 죽이거나 비활성화시킬 수 있는 약학적 활성 물질로 정의된다. 바람직하게는, 표적 독소는 표적 세포에 대해서만 또는 적어도 우세하게 독성이지만 표적 외 세포에는 독성이 없는 독소이다. 표적 독소의 순 효과는 바람직하게는 유기체 전체에 유익하다.
폴리펩티드인 이펙터 분자 또는 -모이어티는 예를 들어 효소 대체, 유전자 조절 기능 또는 독소와 같은 상실된 기능을 회복하는, 예를 들어 폴리펩티드일 수 있다. 이펙터 분자로서 폴리펩티드의 예는 예를 들어 Cas9; 독소 (예 : (예, 사포린, 디안틴, 겔로닌, (디)보우가닌, 아그로스틴, 리신 (독소 A 체인); 위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 아폽틴, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소) 대사 효소 (예 : 아르기니노숙시네이트 리아제, 아르기니노숙시네이트 합성 효소), 응고 캐스케이드의 효소, 복구 효소; 세포 신호 전달을 위한 효소; 세포주기 조절 인자; 유전자 조절 인자 (NF-KB와 같은 전사 인자 또는 메티오닌 리프레서와 같은 유전자 리프레서)이다.
폴리뉴클레오티드인 이펙터 분자 또는 이펙터 모이어티는 예를 들어, 유전자 또는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임과 같은 코딩 정보를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이는 또한 조절 정보, 예를 들어, 프로모터 또는 조절 요소 결합 영역, 또는 마이크로 RNA를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 천연 및 인공 핵산을 포함할 수 있다. 인공 핵산은 예를 들어 펩티드 핵산(PNA), 모노폴리노 및 잠김 핵산(LNA, locked nucleic acid) 뿐만 아니라 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)을 포함할 수 있다. 이들 각각은 분자 골격의 변화에 의해 자연 발생 DNA 또는 RNA와 구별된다. 이펙터 분자로서 뉴클레오티드의 예는 예를 들어 DNA: 단일 가닥 DNA (예, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제에 대한 DNA); 선형 이중 가닥 DNA(예, 응고 인자(clotting factor) IX 유전자); 원형 이중 가닥 DNA(예, 플라스미드); RNA : mRNA (예, TAL 이펙터 분자 뉴클레아제), tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, 안티센스 RNA; 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON, 예를 들어 PNA, PMO, LNA 및 BNA)이지만 이에 제한되지 않는다.
예를 들어 "단백질성 분자"및 "단백질성 독소"에 사용된 용어 "단백질성(proteinaceous)"은 단일 mRNA로부터의 발현 생성물로 수득될 수 있는 적어도 여러 개의(a string of) 아미노산 잔기를 포함하는 분자 및 독소이다. 이러한 분자 또는 독소는 임의의 번역 후 변형(modification)의 결과로 임의의 번역 후 변형, N- 또는 O-연결 카보하이드레이트와 같은 카보하이드레이트, 디설파이드 결합, 인산화, 황산염화 등을 추가로 포함할 수 있고/있거나 화학적 변형(예, 예를 들어 아미노산 측쇄에 직접, 또는 단백질성 분자를 화학적으로 변형시키기 위해 분자에 (공유적으로) 결합된 및 단백질성 분자에 화학적으로 (공유적으로) 결합된 적어도 하나의 링커를 통한 이펙터 모이어티, 사포닌, 스캐 폴드, 리간드 등의 연결)에 기인한 것과 같은 임의의 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다. 용어 "단백질성"은 또한 이러한 분자의 어셈블리, 예를 들어, 동종이량체, 이종삼량체, 이종육량체 또는 리보솜과 같은 복합 어셈블리를 또한 망라하고 포함한다.
예를 들어, "특이적 결합" 및 "종양 세포의 표면에 특이적으로 존재하거나 발현되는 수용체 또는 분자 표적" 등의 맥락에서 용어 "특이적" 및 "특이적으로"는 당해 분야에 공지된 통상의 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 예를 들어, 제 2 분자와 상이한 추가 분자에 대한 제 1 분자의 임의의 추정 결합에 비하여 더 높은 친화도로 일어나는 제 1 분자와 제 2 분자의 결합 상호 작용, 또는 예를 들어, 발현 또는 건강한 세포와 같은 제 2 타입의 세포에서 동일한 수용체 또는 분자 표적의 발현 정도에 비하여 종양 세포, 자가 면역 세포, 병든 세포, 비정상 세포와 같은 제1 타입의 세포 표면상의 세포 표면 수용체 또는 분자 표적의 더 높은 정도의 발현(예, 수용체 또는 분자 표적으로 수가 고려될 때)을 지칭하며, 여기서 제 2 타입 세포에서의 발현은 종양 세포 등의 임의의 발현 정도에 비해 완전히 없거나 매우 낮을 수 있다. 또한, 예를 들어 "특이적 결합"에서 용어 "특이적"은 당업계에 공지된 통상의 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 분자 간의 백그라운드 상호 작용보다 더 높은 결합 친화도를 갖는 다른 분자와 상호 작용할 수 있는 분자를 나타내는 의미를 갖는다. 유사하게, 용어 "특이성(specificity)"은 예를 들어 두 분자 간의 또는 세포와 분자 간의 상호 작용을 지칭하며, 이는 분자 간의 백그라운드 상호 작용보다 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 면역글로불린과 같은 결합 분자는 면역글로불린의 면역글로불린 가변 영역과 같은 이들의 결합 부위를 통해 분자 간의 배경 상호 작용보다 더 높은 결합 친화도로 에피토프, 세포 표면 수용체 등과 같은 분자의 결합 부위에 결합한다. 본 발명의 맥락에서, 백그라운드 상호 작용은 전형적으로 10E-4 M의 KD보다 낮은 친화도를 갖는 상호 작용이다. 유사하게, "특이적 결합 도메인"은 분자 간의 백그라운드 상호 작용보다 더 높은 결합 친화도로 에피토프, 세포 표면 수용체 등과 같은 분자상의 결합 부위에 우선적으로 결합하는 도메인이다. 본 발명의 맥락에서, "백그라운드 상호 작용"은 전형적으로 10E-4 M의 KD보다 낮은 친화도를 갖는 상호 작용이다. 바람직하게는, 특이적 결합 도메인은 약 10E-5 M의 KD 보다 높은 친화도로 결합한다.
용어 "결합(binding)"은 백그라운드 상호 작용과 구별 될 수 있는 분자 간의 상호 작용으로 정의된다.
명세서 전체에서, 용어 "단편"은 단백질 도메인의 일부이거나 온전한 단백질 도메인을 구축하는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명에 따른 결합 단편은, 예를 들 종양 세포와 같은 병든 세토의 표면 상의 세포 표면 수용체와 같은 각각의 표적에 대해 결합 특이성을 가져야 한다.
용어 "ADC" 또는 "항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)"는 당업자에게 공지된 표준적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 예를 들어, 암 치료를 위한 표적 요법으로 설계된 생물 약제학 약물의 부류를 지칭한다. 화학 요법과 달리, ADC는 건강한 세포를 아끼면서 종양 세포를 표적으로 하여 죽이기 위한 것이다. ADC는 생물학적 활성 세포 독성 (항암) 페이로드 또는 약물에 연결된 항체로 구성된다. ADC는 모노클로날 항체의 표적화 능력과 세포 독성 약물의 암 살해 능력을 결합한다. 이들은 건강한 세포와 종양의 종양 세포와 같은 병든 조직을 구별하도록 설계된다.
용어 "사포늄 앨범(Saponinum album)"은 일반적인 의미를 가지며 본원에서는 지포필라 파니큘레이트(Gypsophila paniculata) 및 지포필라 아로스티(Gypsophila arostii)의 사포닌을 포함하는 Merck KGaA (Darmstadt, Germany)에서 생산된 사포닌의 혼합물을 의미하며, SA1 657 및 주로 SA1 641을 함유한다.
용어 "퀼라자사포닌(Quillajasaponin)" 이의 일반적인 의미를 가지며 본원에서는 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria)의 사포닌 분획, 그리고 따라서, 주로 QS-18 및 QS-21을 포함하는 다른 모든 QS 사포닌에 대한 공급원을 지칭한다.
"QS-21" 또는 "QS21"은 표준적인 과학적 의미를 가지며 본원에서는 QS-21 A-apio (~ 63 %), QS-21 A-xylo (~ 32 %), QS-21 B-apio (~ 3.3 %) 및 QS-21 B-xylo (~ 1.7 %)의 혼합물을 지칭한다.
마찬가지로, "QS-21A"는 이의 표준적인 과학적 의미를 가지며 본원에서는 QS-21 A-apio (~ 65 %)와 QS-21 A-xylo (~ 35 %)의 혼합물을 지칭한다.
마찬가지로, "QS-21B"는 이의 표준적인 과학적 의미를 가지며 본원에서는 QS-21 B-apio (~ 65 %)와 QS-21 B-xylo (~ 35 %)의 혼합물을 지칭한다.
용어 "Quil-A"는 퀼라자 사포나리아에서 상업적으로 입수할 수 있는 반정제 추출물을 지칭하며 50 개 이상의 별개의 사포닌을 다양한 양으로 함유하며, 이들 중 다수는 QS-7, QS-17, QS18, QS-21에서 발견되는 C-3베타-OH 그룹에 트리테르펜-트리사카라이드 하위 구조 Gal-(1
Figure pct00001
2)-[Xyl-(1
Figure pct00002
3)]-GlcA-를 포함한다. Quil-A에서 발견된 사포닌은 van Setten (1995), 표 2 [Dirk C. van Setten, Gerrit van de Werken, Gijsbert Zomer and Gideon F. A. Kersten, Glycosyl Compositions and Structural Characteristics of the Potential Immuno-adjuvant Active Saponins in the Quillaja saponaria Molina Extract Quil A, RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY, VOL. 9,660-666 (1995)]에 열거되어 있다. Quil-A 및 또한 퀼라자사포닌은 퀼라자 사포나리아로 부터의 사포닌의 분획이며 둘 모두 내용(content)이 대부분 중복되는 다른 사포닌을 매우 다앙햐게 함유한다. 두 분획은 서로 다른 정제 절차에 의해 얻어지므로 두 분획은 특정 조성이 다르다.
용어 "QS1861" 및 용어 "QS1862"는 QS-7 및 QS-7 api를 지칭한다. QS1861의 분자 질량(molecular mass)은 1861 달톤이고 QS1862의 분자 질량은 1862 달톤이다. QS1862는 Fleck 등 (2019)에, 표 1의 행 번호. 28 [Juliane Deise Fleck, Andresa Heemann Betti, Francini Pereira da Silva, Eduardo Artur Troian, Cristina Olivaro, Fernando Ferreira and Simone Gasparin Verza, Saponins from Quillaja saponaria and Quillaja brasiliensis: Particular Chemical Characteristics and Biological Activities, Molecules 2019, 24, 171; doi:10.3390/molecules24010171]에 기재되어 있다. 기술된 구조는 QS-7의 api-변종(variant) QS1862이다. 분자 질량은 글루쿠론산에서 양성자를 포함하는 공식 질량(formal mass)으로서 1862 달톤이다. 중성 pH에서, 분자는 탈양성자화된다. 음이온 모드에서 질량 분석법으로 측정할 때, 측정된 질량은 1861 달톤이다.
설명 및 청구 범위에서 용어 제 1, 제 2, 제 3 등은 유사한 구성요소를 구별하기 위해 사용되며 반드시 순차적 또는 연대순을 설명하기 위해 사용되는 것은 아니다. 상기 용어는 적절한 상황 하에서 상호 교환 가능하다. 본 발명의 구현예는 본원에서 설명되거나 예시된 것과 다른 순서로 작동할 수 있다.
더욱이, "바람직한" 또는 "예" 또는 "예를 들어" 또는 "특히"로 언급되었지만, 다양한 구현예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 본 발명이 구현될 수 있는 예시적인 방식으로 해석되어야 한다.
청구 범위에 사용된 용어 "포함하는"은 이후에 열거된 구성요소 또는 단계로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며; 이는 다른 구성요소 또는 단계를 제외하지 않는다. 이는 언급된 대로 명시된 특징, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 지정하는 것으로 해석되어야 하지만 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 성분 또는 이의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지는 않는다. 따라서, 표현 "A 및 B를 포함하는 약학적 조성물"의 범위는 성분 A 및 B로만 구성된 약학적 조성물로 제한되어서는 안되며, 오히려 본 발명과 관련하여, 약학적 조성물의 열거된 성분이 단지 A 및 B이며, 나아가 청구범위는 이들 성분의 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 표현 "단계 A 및 단계 B를 포함하는 방법"의 범위는 단계 A 및 B로만 구성된 방법으로 제한되어서는 안되며, 오히려 본 발명과 관련하여, 방법의 열거된 단계가 단지 A 및 B이며, 나아가 청구범위는 이들 단계의 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 특징에 대한 언급은 문맥이 하나 그리고 특징 중 단지 하나 만 있는 것이 요구되는 것이 명백하지 않는 한, 예를 들어, 성분, 부형제, 사포닌 등과 같은 특징이 하나 보다 많을 수 있는 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정 관사 "a" 또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
도 1. 항체-단백질 독소 + 비접합된 S01861 생체 연구. 다양한 농도의 트라스투주맙-사포린(i.v.) + 1.5mg/kg 비접합된 S01861로 처리된 Bbt474 종양 함유 마우스(트라스투주맙-사포린 처리 1시간 전에 subQ 주사).
도 2. 비접합된 사포닌-매개된 엔도솜 탈출 및 표적 세포 사멸 증강. A) 1.5pM EGF디안틴과 함께 또는 함께 하지 않고 SO1861, SO1832, SO1862(SO1861의 이성질체) 또는 SO1904로 처리된 Hela 세포(EGFR+)의 세포 생존능 분석 B) EGF디안틴 및 고정된 농도의 SO1861, SO1832, SO1862(SO1861의 이성질체) 또는 SO1904로 처리된 Hela 세포(EGFR+)의 세포 생존능 분석 A) 및 B)의 축 및 범례는 동일하다. C) 1.5pM EGF디안틴과 함께 또는 함께 하지 않고 SO1861 또는 GE1741로 처리된 Hela 세포(EGFR+)의 세포 생존능 분석. D) 1.5pM EGF디안틴과 함께 또는 함께 하지 않고 다양한 Qsmix(Quillaia Saponaria의 사포닌 혼합물)로 처리된 Hela 세포(EGFR+)의 세포 생존능 분석. C) 및 D)의 Y축은 동일하다.
도 3. 비접합된 S01861 대 S01861-EMCH 활성. 본 발명에 따른, 암 세포에서 EGFR 표적 안티센스 BNA 올리고 전달 및 유전자 침묵. A, B, C) 1.5pM EG 디안틴과 함께 또는 함께 하지 않고 SO1861 또는 SO1861-EMCH로 처리된 A431(EGFR++), Hela(EGFR+) 또는 A2058(EGFR-) 세포의 세포 생존능 분석. D, E) 1.5pM EGF디안틴과 함께 또는 함께 하지 않고 SO1861 또는 SO1861-N3로 처리된 A431(EGFR++) 또는 HeLa (EGFR+)의 세포 생존능 분석. A), B), C), D) 및 E)의 축 및 범례는 동일하다. 즉, 도 3A 내지 도 3C에 대한 범례는 도 3C에 이어서 표시되며; 도 3D 및 3E에 대한 범례는 도 3E에 이어서 표시된다.
도 4. 비접합된 S01861 대 S01861-EMCH(불안정한) 대 S01861-S(안정한). EGF디안틴과 함께 또는 함께 하지 않고 SO1861, SO1861-S(S=HATU, 안정한 링커) 및 SO1861-EMCH(불안정한 링커)로 처리된 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존능 분석.
도 5. EGFR 표적 안티센스 BNA 올리고뉴클레오티드 전달 및 유전자 침묵. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.9 또는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.9 + 100nM HSP27BNA로 처리된 A431(EGFR++) 및 A2058(EGFR-) 세포의 HSP27 mRNA 발현 분석. A) 및 B)의 축 및 범례는 동일하고, 범례는 도 5B에 이어서 표시된다. C) 및 D)의 Y축은 동일하다.
도 6. 종양 함유 마우스에서 종양 표적 안티센스 BNA 올리고뉴클레오티드 전달 및 유전자 침묵. A431 종양 함유 마우스에서 HSP27BNA + 세툭시맙(Cys-L-S01861)3,9로 처리된 마우스는 대조군과 비교하여 효율적인 종양 표적 유전자 침묵을 나타낸다.
도 7. 1T2C 생체내 활성. A431 종양 함유 마우스에서 50mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 + 25 mg/kg 세툭시맙-(-L-HSP27BNA)4 의 1T2C 조합은 대조군과 비교하여 강한 종양 표적 유전자 침묵을 나타낸다.
도 8. 1T2C 생체내 활성. PDX 종양 마우스 모델(고 HER2 발현)에서 40mg/kg 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4 + 0.02/0.03mg/kg 트라스투주맙-사포린의 1T2C 조합은 효과적인 종양 성장 억제를 나타낸다.
도 9. 1-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 A431 세포(EGFR++)(A, C) 및 CaSKi 세포(EGFR+)(B, D)에서 EGFR 표적 세포 사멸. A, B) A431(A) 및 CaSKi(B) 세포 상에서 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 적정 + 고정 농도 10 pM 세툭시맙-사포린 및 대조군. C, D) A431(C) 및 CaSKi(D) 세포 상에서 세툭시맙-사포린 적정 + 고정 농도 75nM 세툭시맙-(Cys-L-S01861)3,7 및 대조군.
도 10. 1-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 HeLa 세포(EGFR+/-)(A, C) 및 A2058 세포(EGFR-)(B, D)에서 EGFR 표적 세포 사멸. A, B) HeLa(A) 및 CaSKi(B) 세포 상에서 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 적정 + 고정 농도 10pM 세툭시맙-사포린 및 대조군. C, D) Hela(C) 및 A2058(D) 세포 상에서 세툭시맙-사포린 적정 + 고정 농도의 75nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 및 대조군.
도 11: 1-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 SKBR3 세포(HER2++)(A, B)에서 HER2 표적 세포 사멸. A) SKBR3 세포 상에서 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4 적정 + 고정 농도 50pM 트라스투주맙-사포린 및 대조군. B) SKBR3 세포 상에서 트라스투주맙-사포린 적정 + 고정 농도의 2.5nM 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4 및 대조군.
도 12. 1-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 JIMT-1 세포(HER2+/-)(A, C) 및 MDA-MB-468 세포(HER2-)(B, D)에서 HER2 표적 세포 사멸. A, B) JIMT-1(A) 및 MDA-MB-468(B) 세포 상에서 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4 적정 + 고정 농도의 50pM 트라스투주맙-사포린 및 대조군. C, D) JIMT-1(c) 및 MDA-MB-468(D) 세포 상에서 트라스투주맙-사포린 적정 + 고정 농도의 2.5nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 대조군.
도 13: 클로로퀸은 1-표적 2-성분을 억제한다. 본 발명에 따른 치료 조합물 + 클로로퀸에 의한 SK-BR-3(HER2++) 및 A431 세포(EGFR++)에서 HER2 및 EGFR 표적 세포 사멸. A) SK-BR-3 세포 상에서 트라스투주맙-사포린 적정 + 고정 농도의 5nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 0.5μM 클로로퀸 및 대조군. B) A431 세포 상에서 세툭시맙-사포린 적정 + 고정 농도의 5nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 + 0.5μM 클로로퀸 및 대조군.
도 14: 1-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 A431 세포(EGFR++) 및 A2058 세포(EGFR-)에서 EGFR 표적 유전자 침묵. A, B) A431 세포(A) 및 A2058 세포(B) 상에서 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 적정 + 고정 농도의 100nM 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4 및 대조군. C, D) A431 세포(C) 및 A2058 세포(D) 상에서 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4 적정 + 고정 농도의 77nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 및 대조군.
도 15: 2-표적 2-성분. A) 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 MDA-MB-468 세포(EGFR++)에서 EGFR 및 HER2 표적 세포 사멸 및 SK-BR-3 세포(HER2++) 및 JIMT-1 세포(HER2+/-)에서 HeLa 세포(EGFR+/-) 및 HER2 표적 세포 사멸. A) MDA-MB-468 세포(A) 및 HeLa 세포(B) 상에서 세툭시맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)3,9 적정 + 고정 농도 10 pM 세툭시맙-사포린 및 대조군. C, D) SK-BR-3 세포(C) 및 JIMT-1 세포(D) 상에서 트라스투주맙-(Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4 적정 + 고정 농도 50pM 트라스투주맙-사포린 및 대조군.
도 16. 1-표적 2-성분. SK-BR-3 세포(HER2+/-)는 본 발명에 따른 치료 조합물, 트라스투주맙-사포린 + 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4으로 효율적으로 사멸될 수 있지만, T-DM1의 적정 + 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4은 이러한 낮은 독소 농도에서 효과적이지 않다. T-DM1은 항체(DAR3.5) 당 ~3.5 엠탄신(DM1) 독소 분자를 운반하는 트라스투주맙-엠탄신(Kadcyla®)이다.
도 17. 1-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 A431 세포(EGFR++)(A) 및 CaSKi 세포(EGFR+)(B) 및 A2058 세포(EGFR-)에서 EGFR 표적 세포 사멸. A, B, C) A431 세포(A), CaSKi 세포(B) 및 A2058 세포(C)에서 세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1 적정 + 고정 농도 10pM 세툭시맙-사포린 또는 10pM 세툭시맙-디안틴 및 대조군. Qsimix는 추출물 퀼라자 사포나리아(Quillaja saporia)로부터의 사포닌의 혼합물이다.
도 18: 1-표적 2-성분 개념: mAb1-S01861 + mAb1-단백질 독소. S01861 및 독소(리보솜 불활성화 단백질)는 각각 독립적으로 표적 세포로의 전달 및 내재화를 위해 항체(mAb1)에 접합된다. 1) mAb1-S01861 및 mAb1-단백질 독소는 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 모든 접합체의 수용체-매개 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis)가 일어나고, 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, S01861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하며, 4) 독소를 세포질로 방출하고, 5) 독소가 세포 사멸을 유도한다.
도 19: 1-표적 2-성분 개념: mAb1-S01861 + mAb2-BNA 올리고. S01861 및 안티센스 BNA 올리고 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 표적 세포로의 전달 및 내재화를 위해 항체(mAb1)에 접합된다. 1) mAb1-S01861 및 mAb1-BNAoligo는 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 모든 접합체의 수용체-매개 엔도사이토시스가 일어나고, 3) 낮은 엔도솜 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도솜 탈출을 가능하게 하며, 4) BNA 올리고를 세포질로 방출하고, 5) 유전자 침묵을 표적한다.
도 20: 1-표적 2-성분 개념: mAb1-(스캐폴드(-S01861) n ) n + mAb1-단백질 독소. 덴드론(-S01861)n 및 단백질 독소(리보솜 불활성화 단백질)는 각각 독립적으로 표적 세포로의 전달 및 내재화를 위해 항체(mAb1)에 접합된다. 1) mAb1-덴드론(-S01861)4 및 mAb1-단백질 독소는 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 모든 접합체의 수용체-매개 엔도사이토시스가 일어나고, 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하며, 4) 독소를 세포질로 방출하고, 5) 독소가 세포 사멸을 유도한다.
도 21: 항체-(-L-S01861) 4 대 항체-(-L-S01861) 2 . 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 A431 세포(EGFR++) 및 SK-BR-3(HER2++)에서 HER2 및 EGFR 표적 세포 사멸. A) A431 세포에서 세툭시맙-(-L-SO1861)2 + 10pM 세툭시맙-사포린과 비교한 세툭시맙-(-L-SO1861)4 + 10pM 세툭시맙-사포린. B) SK-BR-3 세포에서 트라스투주맙-(-L-S-SO1861)2 + 50pM 트라스투주맙-사포린과 비교한 트라스투주맙-(-L-SO1861)4 + 50pM 트라스투주맙-사포린.
도 22: 항체-(-L-SO1861) 4 대 항체-(-S-SO1861) 4 . 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 SK-BR-3 (HER2++)에서 HER2 표적 세포 사멸. B) SK-BR-3 세포에서 트라스투주맙-(-S-SO1861)4 + 50pM 트라스투주맙-사포린과 비교한 트라스투주맙-(-L-SO1861)4 + 50pM 트라스투주맙-사포린.
도 23. A431 종양 함유 마우스 모델에서 시험된 2T2 성분 시스템은 종양 퇴행을 나타낸다.
도 24. A431 종양 함유 마우스 모델에서 시험된 2T2 성분 시스템은 종양 퇴행 및 박멸을 나타낸다.
도 25: 2-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 A431 세포(EGFR++/HER2+/-)(A, C) 및 CaSKi 세포(EGFR++/HER2+/-)(B, D)에서 EGFR/HER2 표적 세포 사멸. A, B) A431 세포 상에서 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 적정 + 고정된 농도 50pM 트라스투주맙-사포린 및 대조군. C, D) Caski 세포 상에서 트라스투주맙-사포린 적정 + 고정 농도의 75nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 및 대조군. 축 및 범례는 A) 및 B), 및 C) 및 D)에 대해 동일하다. 즉, 도면 25A 및 B에 대한 범례는 도 25B 에 이어서 표시되며; 도 25C 및 도 25D에 대한 범례는 도 25D에 이어서 표시된다.
도 26. 2-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 HeLa 세포(EGFR+/-/HER2+/-)(A, C) 및 A2058 세포(EGFR-/HER2+/-)(B, D)에서 EGFR/HER2 표적 세포 사멸. A, B) HeLa 세포 상에서 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 적정 + 고정된 농도 50pM 트라스투주맙-사포린 및 대조군. C, D) A2058 세포 상에서 트라스투주맙-사포린 적정 + 고정된 농도의 75nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 및 대조군.
도 27: 2-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 SKBR3 세포(HER2++/EGFR+/-)(A, B)에서 HER2/EGFR 표적 세포 사멸. A SKBR3 세포 상에서 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 적정 + 고정된 농도 1.5 pM EGF디안틴 및 대조군. B) SKBR3 세포 상에서 EGF디안틴 적정 + 고정된 농도의 2.5nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 대조군.
도 28. 2-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 JIMT-1 세포(HER2+/-EGFR+/-)(A, C) 및 MDA-MB-468 세포(HER2-/EGFR++)(B, D)에서 HER2/EGFR 표적 세포 사멸. A, B) JIMT-1 세포 상에서 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 적정 + 고정된 농도 1.5 pM EGF디안틴 및 대조군. C, D) MDA-MB-468 세포 상에서 EGF디안틴 적정 + 고정된 농도의 2.5nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 대조군. 도 28A 및 B에 대한 범례는 도 28B에 이어서 표시되며; 도 28C 및 28D에 대한 범례는 도 28D에 이어서 표시된다.
도 29: 2-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 SKBR3 세포(HER2++/EGFR+/-)(A, B)에서 HER2/EGFR 표적 세포 사멸. A) SKBR3 세포 상에서 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 적정 + 고정된 농도 10 pM 세툭시맙-사포린 및 대조군. B) SKBR3 세포 상에서 세툭시맙-사포린 + 고정된 농도의 2.5nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 대조군.
도 30. 2-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 JIMT-1 세포(HER2+/-EGFR+/-)(A, C) 및 MDA-MB-468 세포(HER2-/EGFR++)(B, D)에서 HER2/EGFR 표적 세포 사멸. A, B) JIMT-1 세포 상에서 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 적정 + 고정된 농도 10pM 세툭시맙-사포린 및 대조군. C, D) MDA-MB-468 세포 상에서 세툭시맙-사포린 적정 + 고정된 농도의 2.5nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 대조군. 축 및 범례는 A) 및 B), 및 C) 및 D)에 대해 동일하다. 즉, 도 30A 및 B 에 대한 범례는 도 30B에 이어서 표시되며; 도 30C 및 30D에 대한 범례는 도면 30D에 이어서 표시된다.
도 31: 클로로퀴닌은 2-표적 2-성분을 억제한다. 본 발명에 따른 치료 조합물 + 클로로퀸에 의한 A431 세포(EGFR++/HER2+/-/CD71+)(A, B), MDA-MB-468 세포(EGFR++/HER2-/CD71+)(C) 또는 SK-BR-3(HER2++/EGFR+/-/CD71+)에서 EGFR/HER2, EGFR/CD71 또는 HER2/CD71 표적 세포 사멸. A) A431 세포 상에서 트라스투주맙-디안틴 또는 트라스투주맙-사포린 적정 + 고정된 농도의 75nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 + 800 nM 클로로퀸 및 대조군. B) A431 세포 상에서 CD71mab-사포린 적정 + 고정된 농도의 10.5nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 + 500 nM 클로로퀸 및 대조군. C) MDA-MB-468 세포 상에서 CD71mab-사포린 적정 + 고정된 농도의 10.5nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 + 500nM 클로로퀸 및 대조군. D) SK-BR-3 세포 상에서 CD71mab-사포린 적정 + 고정된 농도의 5nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,9 + 500nM 클로로퀸 및 대조군.
도 32: 2-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 A431 세포(EGFR++/HER2+/-)(A) 및 A2058 세포(EGFR-/HER2+/-)에서 EGFR/HER2 표적 유전자 침묵. A) A431 세포(A) 및 A2058 세포(B) 상에서 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 적정 + 고정된 농도의 100 nM 트라스투주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 및 대조군. C, D) A431 세포(A) 및 A2058 세포(B) 상에서 트라스투주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 적정 + 고정된 농도의 77nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 및 대조군. 축 및 범례는 A) 및 B), 및 C) 및 D)에 대해 동일하다. 즉, 도 32A 및 B에 대한 범례는 도 32B에 이어서 표시되며; 도 32C 및 32D에 대한 범례는 도 32D에 이어서 표시된다.
도 33: 2-표적 2-성분. A) 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 MDA-MB-468 세포(EGFR++/CD71+)(A) HeLa 세포(EGFR+/-/CD71+), SK-BR-3 세포(HER2++/CD71+)(B) 및 JIMT-1 세포(HER2+/-/CD71+)에서 EGFR/CD71 또는 HER2/CD71 표적 세포 사멸. A) MDA-MB-468 세포 상에서 세툭시맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)3,9 적정 + 고정된 농도 10 pM CD71mab-사포린 및 대조군. B) HeLa 세포 상에서 세툭시맙-Cys-(덴드론 (-L-SO1861)4)3,9 적정 + 고정된 농도 10 pM CD71mab-사포린 및 대조군. C) SK-BR-3 세포 상에서 트라스투주맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4 적정 + 고정된 농도 10 pM CD71mab-사포린 및 대조군. D) JIMT-1 세포 상에서 트라스투주맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4 적정 + 고정된 농도 10 pM CD71mab-사포린 및 대조군.
도 34. 2-표적 2-성분 대 T-DM1. A431 세포(EGFR++/HER2+/-)는 본 발명에 따른 치료 조합물, 트라스투주맙-사포린 + 75nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9으로 효율적으로 사멸될 수 있으나, T-DM1 + 75nM 세툭시맙-(Cys-L-S01861)3,9의 적정은 이러한 낮은 독소 농도에서 효과적이지 않다. T-DM1은 항체 당 ~3.5 엠탄신(DM1) 독소 분자를 운반하는 트라스투주맙-엠탄신(Kadcyla®)이다.
도 35: 모든 세포주에 대한 대조군 처리. A-D) 트라스투주맙(A), 세툭시맙(B), T-DM1,(C) 유리 독소: 사포닌 및 디안틴(D) 또는 무세포 결합 IgG에 커플링된 사포린(D)이 세포주 SK-BR-3, JIMT-1, MDA-MB-468, A431, CaSki, HeLa, A2058, BT-474로 처리된 경우의 세포 생존능.
도 36. 2-표적 2-성분. 본 발명에 따른 치료 조합물에 의한 A431 세포(EGFR+++/HER2+/-)(A) 및 CaSKi 세포(EGFR++/HER2+/-)(B) 및 A2058 세포(EGFR-/HER2+/-)에서 EGFR/CD71 및 EGFR/HER2 표적 세포 사멸. A, B, C) A431 세포(A), CaSKi 세포(B) 및 A2058 세포(C) 상에서 세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1 적정 + 고정된 농도 10pM 트라스투주맙-사포린 또는 10pM CD71mab-사포린 및 대조군. QSmix는 추출물 퀼라자 사포나리아(Quillaja saporia)로부터의 사포닌 혼합물이다. 도 36A 및 36B에 대한 범례는 도 36B에 이어서 표시된다.
도 37: 2-표적 2-성분 개념: mAb1-S01861 + mAb2-단백질 독소. S01861 및 독소(리보솜 불활성화 단백질)는 각각 개별적으로, 표적 세포로의 전달 및 내재화를 위해 항체(mAb)에 접합된다. 1) mAb1-S01861 및 mAb2-단백질 독소는 이들의 상응하는 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체-매개 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis)가 일어나고, 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, S01861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하며, 4) 독소의 세포질로의 방출이 일어나고, 5) 독소가 세포 사멸을 유도한다.
도 38: 2-표적 2-성분 개념: mAb1-S01861 + mAb2-BNA 올리고. S01861 및 안티센스 BNA 올리고 뉴클레오티드는 각각 개별적으로, 표적 세포로의 전달 및 내재화를 위해 항체(mAb)에 접합된다. 1) mAb1-S01861 및 mAb2-BNA 올리고는 이들의 상응하는 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체-매개 엔도사이토시스가 일어나고, 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하며, 4) 세포질로의 BNA 올리고의 방출이 일어나고, 5) 표적 유전자 침묵이 일어난다.
도 39: 2-표적 2-성분 개념: mAb1-(스캐폴드(-S01861) n ) n + mAb2-단백질 독소. 덴드론(-S01861)n 및 단백질 독소(리보솜 불활성화 단백질)는 각각 개별적으로, 표적 세포로의 전달 및 내재화를 위해 항체(mAb)에 접합된다. 1) mAb1-(덴드론(- S01861)4)1) 및 mAb2-단백질 독소는 이들의 상응하는 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체-매개 엔도사이토시스가 일어나고, 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하며, 4) 세포질로의 독소의 방출이 일어나고, 5) 독소가 세포 사멸을 유도한다.
도 40. 종양 표적 단백질 독소 전달은 종양 함유 마우스에서 종양 부피 감소 및 종양 성장 억제를 초래한다. A) A431 종양 함유 마우스에서 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-디안틴)2의 투여량 확대(복강내, i.p.)는 대조군과 비교하여 종양 부피 감소를 나타낸다. B, C) A431 종양 함유 마우스에서 세툭시맙(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-디안틴)2의 투여량 확대(복강내, i.p.(B) 또는 정맥내 i.v.(C))는 대조군과 비교하여 종양 성장 감소를 나타낸다.
도 41. 종양 함유 마우스에서 종양 표적 안티센스 BNA 올리고 뉴클레오티드 전달 및 유전자 침묵. A431 종양 함유 마우스에서 30mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8은 대조군과 비교하여 유도된 효율적인 종양 표적 유전자 침묵을 나타낸다.
도 42. 종양 함유 마우스에서 종양 표적 안티센스 BNA 올리고 뉴클레오티드 전달 및 유전자 침묵. A431 종양 함유 마우스에서 30mg/kg 세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3 작용성 링커-L-HSP27BNA)3,7은 대조군과 비교하여 유도된 효율적인 종양 표적 유전자 침묵을 나타낸다.
도 43: 본 발명에 따른, 암 세포에서 HER2 또는 EGFR 표적 단백질 독소 전달 및 세포 사멸. A, B) SK-BR-3 세포(HER2++) 및 MDA-MB-468 세포(HER2-) 상에서 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-디안틴)1,7 또는 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-디안틴)1,7 처리 및 대조군. C, D) A431 세포(EGFR++) 및 A2058 세포(EGFR-) 상에서 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-디안틴)1,7 또는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-디안틴)1,7 처리 및 대조군. 도 43A 및 B는 동일한 범례를 가지며, 도 43B에 이어서 표시된다. 도 43C 및 D는 동일한 범례를 가지며, 도 43D에 이어서 표시된다.
도 44: 본 발명에 따른, 암 세포에서 EGFR 표적 안티센스 BNA 올리고 전달 및 유전자 침묵. A, B) A431 세포(EGFR++) 및 A2058 세포(EGFR-) 상에서 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)1,7 처리 및 대조군. 도 44A 및 B는 동일한 범례를 가지며, 도 44B에 이어서 표시된다.
도 45: 본 발명에 따른, 암 세포에서 HER2 표적 안티센스 BNA 올리고 전달 및 유전자 침묵. SK-BR-3 세포(HER2++) 상에서 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5 처리 및 대조군.
도 46: 본 발명에 따른, 암 세포에서 EGFR 표적 안티센스 BNA 올리고 전달 및 유전자 침묵. A, B) A431 세포(EGFR++) 및 A2058 세포(EGFR-) 상에서 세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3 작용성 링커-L-HSP27BNA)3,7 처리 및 대조군.
도 47: (S)n - (L)(E) 개념: mAb-(SO1861) n (단백질 독소) n . 시스테인 잔기(Cys)에서 S01861 및 리신 잔기에서 단백질 독소(리보솜 비활성화 단백질), 모두가 표적 세포로의 전달 및 내재화를 위해 동일한 항체(mAb)에 접합된다. 1) mAb-(Cys-L-SO1861)4(Lys-단백질 독소)2는 이의 상응하는 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 접합체의 수용체-매개 엔도사이토시스가 일어나고, 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출이 가능하게 되고, 4) 독소의 세포질로의 방출이 일어나고, 5) 독소는 세포 사멸을 유도한다.
도 48: (S)n -(L)(E) 개념: mAb-(SO1861) n (안티센스 BNA 올리고) n . 시스테인 잔기(Cys)에서 S01861 및 리신 잔기에서의 안티센스 BNA 올리고 뉴클레오티드, 모두가 표적 세포로의 전달 및 내재화를 위해 동일한 항체(mAb)에 접합된다. 1) mAb-(Cys-L-SO1861)4(Lys-BNA 올리고)2는 이의 상응하는 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체-매개 엔도사이토시스가 일어나고, 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출이 가능하게 되고, 4) BNA 올리고의 세포질로의 방출이 일어나고, 5) 표적 유전자 침묵이 유도된다.
도 49: (S)n -(L)(E) 개념: mAb-(SO1861-스캐폴드-안티센스 BNA 올리고) n . (SO1861-3 작용성 링커-BNA 올리고)n가 표적 세포로의 전달 및 내재화를 위해 항체(mAb)에 접합된다. 1) mAb-(SO1861-3 작용성 링커-BNA 올리고)n는 이의 상응하는 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체-매개 엔도사이토시스가 일어나고, 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출이 가능하게 되고, 4) BNA 올리고의 세포질로의 방출이 일어나고, 5) 표적 유전자 침묵이 유도된다.
도 50. 항체-SO1861 접합 절차. 식물 유래 사포닌 S01861의 4개의 모이어티를 항체의 경쇄내의 4개의 시스테인에 연결시키는 커플링 반응이 도시되어 있다. 먼저, IgG의 이황화 결합은 TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀)에 대한 노출의 영향 하에서 붕괴되고; 둘째, 이에 결합된 화학적 링커를 포함하는 사포닌 S01861은 트리플루오로 아세트산과 함께 첨가되고, 4개의 사포닌 모이어티가 IgG에 연결된다. 절단 가능한 '접합 준비된(ready to conjugate)' 사포닌을 제조하기 위해, S01861 의 알데히드기는 EMCH(ε-maleimidazocaproic acid hydrazide) 링커와 반응되었다. EMCH의 히드라지드기는 SOI861의 알데히드와 산 절단성 히드라존 결합을 형성한다. 동시에 EMCH 링커는 티올(설프히드릴기) 반응성인 말레이미드기를 제시하며, 따라서 IgG, 즉 리간드 모이어티의 티올에 접합될 수 있다. 이과 함께, 본 발명의 엔도솜 탈출 증진 접합체가 제공되고, 그리고/또는 본 발명의 제1 결합 분자가 제공된다.
도 51. SO1861-EMCH 합성
도 52. 덴드론-(-L-SO1861)4 합성
도 53. 덴드론-(-L-SO1861)8 합성
도 54, S0181-L-3 작용성 링커-L-HSP27BNA 합성
도 55. HSP27BNA-덴드론-(-L-S01861)4 합성
도 56. 덴드론(NEM)4 합성 합성
도 57: 사포닌 결합을 위한 4개의 아미노기 및 클릭 화학(click chemistry)을 위한 아지드기를 갖는 스캐폴드 전구체
도 58: 모델 스캐폴드에 사포닌의 커플링에 대한 증거. 삽도는 커플링된 사포닌에 대한 이론적으로 예상되는 피크 및 강도 분포를 나타낸다. LC-MS/ESI-MS에 의해 얻어진 실험 데이터는 m/z 758-760 Da에서 거의 동일한 피크를 나타내며, 이는 성공적인 사포닌 커플링을 입증한다.
도 59: 표적화된 독소 디안틴-표피 성장 인자(디안틴-EGF)를 이용한 세포독성 분석. 미처리 세포를 1로 정규화하였다. 중합체 구조(Pentrimer)는 중합체 구조의 내재적 세포독성을 나타내지 않는 디안틴-EGF 및 사포닌(SA1641)의 존재 또는 부재하에 세포 생존성에 영향을 미치지 않는다. 클릭가능한 표적화된 독소(디안틴-EGF-알킨)는 현저히 감소된 활성을 가지며, 이는 독소 변형의 결과이지만 스캐폴드와 어떠한 관련도 갖지 않는다. 작용화된 중합체 구조는 클릭되지 않은 표적화된 독소와 동일한 활성을 가지며, 이는 스캐폴드의 작용화가 이펙터 분자 활성을 손상시키지 않는다는 것을 나타낸다. 사포닌의 효과는 중합체 구조의 존재 및 부재 하에서 동일하며, 이는 중합체 구조가 2-성분 시스템에서 사포닌의 효능을 손상시키지 않는다는 것을 나타낸다.
도 60: (A) S01861 및 (B) S01861-EMCH(EMCH = N-ε-말레이미도카프론산 히드라지드)의 H-NMR 스펙트럼. (A) 9.43ppm(Ha)에서의 피크는 SO1861의 알데히드 프로톤에 대응한다. (B) 6.79ppm(Hc)에서의 피크는 SO1861-EMCH의 말레이미드 프로톤에 대응하고, 7.68ppm(Hb)에서의 피크는 히드라존 프로톤에 대응한다. 9.43ppm에서의 신호의 부재는 알데히드기의 정량적 전환을 나타낸다.
도 61: (A) SO1861-EMCH 및 (B) S01861-EMCH-메르캅토에탄올의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼. (A) RP 모드: m/z 2124 Da ([M+K]+, 사포닌-EMCH), m/z 2109 Da ([M+K]+, SO1861-EMCH), m/z 2094 Da ([M+Na]+, SO1861-EMCH). (B) RP 모드: m/z 2193 Da ([M+K]+, 사포닌-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2185 Da ([M+K]+, SO1861-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2170 Da ([M+Na]+, SO1861-EMCH-메르캅토에탄올).
도 62: 엔도솜 탈출 강화 스포닌의 중합체 구조와의 접합을 위해 하이라이트된 화학기를 갖는 S01861 구조. 하이라이트된 기는 알데히드(흑색 원), 카르복실산(점선 원), 알켄(점선 오각형), 및 알콜(점선 박스)이다. 알데히드기(화살표)는 화학 선택성 및 가역적 접합 반응에 가장 적합한 기이다.
도 63: (A) 안정하고 (B) 절단 가능한 '접합 준비된' 엔도솜 탈출 인핸서 사포닌을 제조하기 위한 전략.
도 64: 산성 조건 하에서 SO1861-EMCH의 히드라존 결합의 가수분해.
도 65: S01861-EMCH 구조. (A) 표준 분자 구조 및 (B) 3D 모델. 말레이미드기는 원으로 표시된다.
도 66: (A) S01861-EMCH 합성 스킴. 네가티브 리플렉터 모드에서 (B) S01861(m/z 1861 Da) 및 (C) SO1861-EMCH (m/z 2068 Da)의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼. TFA: 트리플루오로아세트산, r.t: 실온, h: 시간, 및 MW: 분자량.
도 67: pH 3에서 HCI 용액내에서 가수분해 전(A) 및 후(B)의 S01861-EMCH의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 68: 임의의 아민-함유 중합체 구조에 대한 SO1861-EMCH 접합의 반응 스킴.
도 69: (A) BSA-S01861(m/z 70.0 kDa,72.1 kDa, 74.2 kDa) 및 (B) BSA(m/z 66.6 kDa)의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 70: 시아닌 3 염료 표지된 폴리아미도아민(PAMAM) G5 덴드리머에 대한 (A) S01861-EMCH 및 (B) S01861-HATU(HATU = 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트)접합의 반응 스킴.
도 71: (B)에서부터 바닥(D)까지 SO1861-EMCH 공급 등가물을 증가시키면서 행한 (A) Cy3-PAMAM,(B-D) Cy3-PAMAM-S01861의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼. (B)는 PAMAM 당 부착된 5개의 S01861을 갖는 Cy3-PAMAM-S01861에 대응되고, (C)는 PAMAM 당 부착된 13개의 S01861을 갖는 Cy3-PAMAM-S01861에 대응되고, (D)는 PAMAM 당 부착된 51개의 S01861을 갖는 Cy3-PAMAM-S01861에 대응된다.
도 72: (A) 5 당량 공급 S01861-EMCH를 갖는 Cy3-PAMAM-SO1861 및 30 당량 공급 S01861-EMCH를 갖는 Cy3-PAMAM-SO1861의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 73: Cy3-PAMAM-NC-SO1861(NC = 안정한 결합("절단 가능하지 않음"))의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 74: (B) Cy3-PAMAM-NC-SO1861-디벤조시클로옥타인(DBCO), (C) Cy3-PAMAM-(SO1861)5-DBCO, 및 (D) Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO의 (A) 반응 스킴 및 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 75: (A) 디안틴-EGF-Alexa488 및 (B) 디안틴-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3의 반응 스킴. (C) 디안틴-EGF, (D) 디안틴-EGF-Alexa488, 및 (E) 디안틴-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼; Alexa488: Alexa Fluor 488 염료.
도 76: (A) 디안틴-Alexa488 및 (B) 디안틴-Alexa488-SS-PEG-N3의 반응 스킴. (C) 디안틴, (D) 디안틴-Alexa488, 및 (E) 디안틴-Alexa488-SS-PEG-N3의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼; Alexa488: Alexa Fluor 488 염료.
도 77: VersaDoc 이미징 시스템 상에서 수행된 SDS-PAGE 겔의 형광 이미지. M = 마커, P = Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO, D = 디안틴-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3, C1 = Cy3-PAMAM-(SO1861)5-디안틴-EGF-Alexa488, C2 = Cy3-PAMAM-NC-SO1861-디안틴-EGF-Alexa488, 및 C3 = Cy3-PAMAM-(SO1861)27-디안틴-EGF-Alexa488.
도 78: (A) 환원성 아민화를 통한 Cy3-PAMAM-NC-SO1861의 합성 방법.(B, 및 C) 각각의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 79: 단량체로서 SO1861-EM0H, 중합 개시제로서 APS/TMEDA 시스템, 및 라디칼 켄쳐(Quencher)로서 아미노프로판티올을 사용한 폴리(S01861)의 생성을 위한 반응 스킴.
도 80: 폴리(S01861) 반응 배치의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼. (A)60℃에서 SO1861-EM0H, (B)60℃에서 SO1861-EMCH + 11-3 당량 APS, (C) 60℃에서 SO1861-EMCH + 11-3 당량 APS/TMEDA
도 81: DNA 접근법. 글리코시드 분자를 접합시키고 방출할 수 있는 DNA 기반 스캐폴드를 생성하기 위한 DNA-오리가미(origami)의 원리의 사용. 또한, DNA 스트랜드들 중 하나는 기능화된 스캐폴드(bp:base pair)를 형성하기 위해 표적화된 독소에 대한 접합을 위해 사용될 수 있는 클릭 화학 모이어티를 획득한다.
도 82: 폴리(펩티드-S01861) 접근법. 글리코시드 분자를 접합 및 방출할 수 있고 그 자체와 반응하여 폴리(펩티드-S01861) 구조물을 형성할 수 있는 펩티드 서열의 사용. 폴리(펩티드)사슬 말단은 독소에 대한 접합을 위해 사용될 수 있는 클릭 화학 모이어티(예, BCN-NHS 링커)로 추가로 변형될 수 있다.
도 83. (A) 천연(native) 펩티드, (B) 펩티드-S01861 접합체의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼을 나타낸다
도 84. 보호된 아미노기를 갖는 G4-덴드론의 분자 구조.
도 85. 덴드론 기반 스캐폴드 및 기능성 스캐폴드의 생성을 위한 합성 스킴.
도 86. (A) G4-덴드론의 부분 염료 표지 및 탈보호에 대한 반응 스킴.(B) 탈보호되고 부분 염료 표지된 G4-덴드론의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 87. (A) 22 공급 당량의 SO1861-EMCH, (B) 10 공급 당량의 SO1861-EMCH, 및 (C) 3 공급 당량의 SO1861-EMCH를 갖는 G4-덴드론-SO1861 스캐폴드의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 88. (A) HeLa 세포의 FACS 분석에 의해 측정된 EGFR 세포 표면 발현으로 처리된 Hela 세포의 세포 생존능 곡선(B, 표 19 참조), S01861 + 디안틴-EGF(Dia-EGF), SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM 클로로퀸, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM PAMAM, SO1861 + 디안틴-EGF + 667 nM 덴드론으로 처리된 Hela 세포의 세포 생존능, (C) SO1861 + 디안틴-EGF, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM 클로로퀸, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM PAMAM, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM PAMAM-(SH)16, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM PAMAM-(SH)65, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM PAMAM-(SH)108 로 처리된 Hela 세포의 세포 생존능 (D) SO1861 + 디안틴-EGF, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM 클로로퀸, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM PAMAM, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM PAMAM-(mPEG)3, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM PAMAM-(mPEG)8, SO1861 + 디안틴-EGF + 500 nM PAMAM-(mPEG)18으로 처리된 Hela 세포의 세포 생존능.
도 89. (A) 티올화 시약 2-이미노티올란을 사용한 PAMAM의 티올화의 반응 스킴. (B) 천연 PAMAM, (C) 티올화 PAMAM-(SH)16, (D) 티올화 PAMAM-(SH)65, 및 (E) ㅌ티올화 PAMAM-(SH)108의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 90. (A) peg화 시약 mPEG2k-NHS를 사용한 PAMAM의 PEG화의 반응 스킴.(B)천연 PAMAM, (C) PEG화 PAMAM-(mPEG2k)3, (D) PEG화 PAMAM-(mPEG2k)8, 및 (E) PEG화 PAMAM-(mPEG2k)18의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 91: 임의의 원하는 이펙터 분자를 결합하기 위한 클릭 화학 기능을 갖는 베이직 스캐폴드. 사용자는 이펙터 분자의 클릭 화학 위치의 위치 및 예를 들어 임의의 리간드의 선택 및 위치와 같은 이펙터 분자의 추가적인 모든 특성을 측정한다.

도 92: 예비-결합된 이펙터 분자 및 임의의 원하는 리간드를 연결하기 위한 클릭 화학 기능을 갖는 작용화된 스캐폴드. 선택적으로, 엔도솜에 도달한 후 스캐폴드로부터 이펙터 분자를 방출하기 위해 pH-민감성 연결이 제공될 수 있다.
생활성 분자가 작용하도록 하기 위하여, 분자는 예를 들어 혈액 혈청에서, 세포 표면의 외부에서 또는 세포 또는 세포 소기관(organelle)의 내부에서, 이의 표적과 인게이징될 수 있어야 한다. 거의 모든 단백질-기반 표적화된 독소의 활성 모이어티는, 예를 들어, 표적 세포의 세포질(cytosol)에 진입하여 이의 표적 조절 효과를 매개해야 한다. 많은 컨스텔레이션들에서, (1) 표적화 모이어티(targeting moiety)가 빈약하게 내재화(internalized)되고 세포의 외부에 결합된 채로 남아있기 때문에, (2) 내재화 후에 세포 표면으로 다시 재순환되거나 또는 (3) 엔도리소좀으로 수송되고 여기서 분해되기때문에, 독소는 비효과적으로 남아 있게 된다. 이러한 기본적인 문제들이 수십년 동안 공지되어 있었고, 500개의 표적화된 독소가 과거의 수십년동안 조사되었음에도 불구하고, 문제들은 아직 해결되지 않았고 단지 하나의 항체-표적화된 단백질 독소, 목세투모맙 슈도톡소-tdfk(LUMOXITI®, AstraZeneca Pharmaceuticals LP)만이 지금까지 FDA에 의해 재발된 또는 난치성 모발 세포 백혈병에 대해 승인되었다.
이러한 문제점들을 극복하기 위해, 소포체내의 생합성 경로의 내인성 세포 막 수송 복합체(endogenous cellular membrane transport complexes)에 독소를 다시 보내기(redirect) 위한 접근법 및 엔도솜)의 막 완전성(membrane integrity)을 파괴하거나 약화시키는 기술, 즉 세포에서의 엔도사이토시스 경로의 구획(compartment), 및 이에 따라 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 용이하게 하는 기술을 포함하는 많은 전략들이 기술되었다. 이는 리소모트로픽 아민, 카르복실산 이오노포어, 칼슘 채널 안타고니스트, 바이러스, 박테리아, 식물, 동물, 사람 및 합성 기원의 다양한 세포 투과성 펩티드, 다른 유기 분자 및 광-유도 기술의 사용을 포함한다. 표적화된 독소의 효능은 전형적으로 세포 배양물에서 백- 또는 천-배, 예외적인 경우 백만-배 초과 증가됨에도 불구하고, 다른 물질들과의 동시 투여 엔도솜 탈출 인핸서에 대한 요건은 추가적인 부작용, 표적 특이성의 손실, 치료 윈도우 및 세포 유형-의존적 변화를 측정하는 것에 대한 어려움을 포함한다.
물리화학적 기술을 포함하는 모든 전략은 막과 다소 직접적으로 상호작용하며 필수적으로 작은 화학적 분자, 2차 대사산물, 펩티드 및 단백질을 포함하는 인핸서 분자를 필요로 한다. 이들 모든 물질의 일반적인 특징은 이들이 표적 세포 특이성이 아니고 표적화된 독소와 다른 동역학(kinetics)으로 분배되는 것이다. 이는 현재의 접근법의 주요한 한 결점이다.
본 발명은 특정 구현들과 관련하여 설명될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고 단지 청구범위에 의해서만 한정된다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 구현들은 달리 명시되지 않는 한, 조합 및 협력하여 동작할 수 있다.
본 발명이 몇몇 구현들에 관하여 기술되었지만, 대안, 수정, 치환 및 그 등가물은 본 명세서를 읽고, 도면 및 그래프를 연구할 때 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 예시된 구현들로 어떠한 방식으로도 한정되지 않는다. 첨부된 청구범위들에 의해 정의된 범위를 벗어나지 않고 변화가 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 견지는 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위를 포함하는 제1 단백질성 분자에 관한 것으로, 제1 단백질성 분자는 적어도 하나의 링커를 통해 및/또는 올리고먼 또는 중합체 스캐폴드를 통해 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 결합된 적어도 하나의 사포닌이 함께 제공된다. 따라서, 본 발명은 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위를 포함하는 제1 단백질성 분자를 포함하거나 또는 이로 구성되는 접합체의 제공에 관한 것으로, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 제1 단백질성 분자에 적어도 하나의 링커를 통해 및/또는 올리고머 또는 중합체 스캐폴드를 통해 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 결합되거나, 또는 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 직접 공유 결합되어 있다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 제1 결합 부위는 항체, IgG, Vhh 도메인 또는 Vh 도메인, Fab, scFv, Fv, dAb, F(ab)2, Fcab 단편을 포함하거나 또는 이로 구성되는 분자와 같은, 면역글로불린, 또는 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 도메인 및/또는 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 단편을 포함하거나 또는 이로 구성되며, 그리고/또는 EGF 또는 사이토카인과 같은 세포 표면 분자에 결합하기 위한 적어도 하나의 리간드를 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프는 제1 종양-세포 표면 분자의 종양-세포 특이적 제1 에피토프이고, 보다 바람직하게는 종양 세포 상에 특이적으로 존재하는 제1 종양-세포 표면 수용체의 종양-세포 특이적 제1 에피토프이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 트리테르페노이드(triterpenoid) 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인(12,13-dehydrooleanane)의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜(bisdesmosidic triterpene) 사포닌이고, 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산(glucuronic acid) 작용기를 포함하는 것이며, 그리고/또는 집소필라(Gypsophila) 종 및/또는 사포나리아(Saponaria) 종 및/또는 아그로스템마(Agrostemma) 종 및/또는 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria)와 같은 퀼라자(Quillaja) 종으로부터 분리된 사포닌이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 표 A1 또는 스킴 I의 사포닌들, SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 퀼라자사포닌(Quillajasaponin), 사포늄 알붐(Saponinum album), QS-18, Quil-A, Gyp1, 글리코시드 A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, 또는 이들의 어느 입체 이성질체 및/또는 이들의 조합의 하나 이상과 같은, 단일 특이적 사포닌이거나, 또는 둘 이상의 상이한 사포닌들의 혼합물이며, 바람직하게 사포닌은 S01861 및/또는 GE1741 및/또는 SA1641 및/또는 QS-21 및/또는 퀼라산(quillaic acid) 아글리콘 코어, C-3베타-OH기에 Gal-(1
Figure pct00003
2)-[Xyl-(1
Figure pct00004
3)]-GlcA　카보하이드레이트 치환체 및 C-28-OH기에 Glc-(1
Figure pct00005
3)-Xyl-(1
Figure pct00006
4)-Rha-(1
Figure pct00007
2)-[Xyl-(1
Figure pct00008
3)-4-OAc-Qui-(1
Figure pct00009
4)]-Fuc　카보하이드레이트 치환체를 갖는 사포닌이며, 그리고/또는 3-O-베타-D-갈락토피라노실-(1
Figure pct00010
2)-[베타-D-자일로피라노실-(1
Figure pct00011
3)]-베타-D-글루쿠로피라노실 퀼라산 28-O-베타-D-글루코피라노실-(1
Figure pct00012
3)-베타-D-자일로피라노실-(1
Figure pct00013
4)-알파-L-람노피라노실-(1
Figure pct00014
2)-[베타-D-자일로피라노실-(1
Figure pct00015
3)-4OAc-베타-D-퀴노보피라노실-(1
Figure pct00016
4)]-베타-D-푸코피라노시드이며, 보다 바람직하게 사포닌은 SO1861 및/또는 QS-21이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 적어도 1.500달톤의 분자량을 가지며, C-23 위치에 알데히드기를 함유하는 올레아닌-유형 트리테르펜을 포함하며, 그리고 선택적으로 제1 분지형 카보하이드레이트 측쇄가 선택적으로 글루쿠론산을 함유하는 C-3 위치에 제1 분지형 카보하이드레이트 측쇄와 함께, C-16 위치에 히드록실기를 포함하는 비스데스모시딕 사포닌이며, 여기서 사포닌은 제2 분지형 카보하이드레이트쇄가 바람직하게 적어도 4개의 카보하이드레이트 유닛을 포함하는 C-28 위치에 제2 분지형 카보하이드레이트 측쇄를 갖는 에스테르기를 함유하며, 선택적으로 2개의 아세틸 잔기와 같은 적어도 하나의 아세틸 잔기를 함유하며, 그리고/또는 선택적으로 데옥시 카보하이드레이트를 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 퀴노보스(quinovose)를 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 글루코오스를 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 4-메톡시신남산을 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노산을 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 에스테르 결합을 통해 카보하이드레이트에 결합된 5-O-[5-O-Rha-(1
Figure pct00017
2)-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노산을 포함하거나, 또는 여기서 적어도 하나의 사포닌은 QS-21이거나, 또는 QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS-18, QS1861, 양성화된(protonated) QS1861(QS1862), Quil-A 중 어느 하나 이상이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 위치 C-23에서 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스스모시딕 트리테르펜 사포닌이고, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 사포닌내의 알데히드 작용기를 통해, 바람직하게 위치 C-23에서 상기 알데히드 작용기를 통해, 바람직하게 적어도 하나의 링커를 통해, 보다 바람직하게 적어도 하나의 절단 가능한 링커를 통해 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 커플링되며, 여기서 아미노산 잔기는 바람직하게 시스테인 및 리신으로부터 선택된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 C-23 위치에서 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스스모시딕 트리테르펜 사포닌이고, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 상기 사포닌의 C-3베타-OH기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산(glucuronic acid) 작용기를 통해 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에, 바람직하게 적어도 하나의 링커를 통해, 공유 커플링되며, 여기서 아미노산 잔기는 바람직하게 시스테인 및 리신으로부터 선택된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 사포닌의 위치 C-23에서의 알데히드 작용기는 링커 N-ε-말레이미도카프론산 히드라지드에 공유 커플링되고, 여기서 링커는 시스테인의 설프히드릴기와 같은 제1 단백질성 분자내의 설프히드릴기에 티오-에테르 결합을 통해 공유 커플링된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 사포닌의 C-3베타-OH기의 카보하이드레이트 치환체에서의 글루쿠론산 작용기는 링커 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]- 1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트에 공유 커플링되며, 여기서 링커는 리신의 아민기 또는 제1 단백질성 분자의 N-말단과 같은 제1 단백질성 분자내의 아민기에 아미드 결합을 통해 공유 커플링된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위가 결합하는 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프는 바람직하게는 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린, 신데칸-1, 혈관 인테그린 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, PSMA, CanAg, 인테그린 알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2로부터 선택된, 보다 바람직하게는 CD71, EGFR, HER2로부터 선택된 종양-세포 특이적 수용체의 종양-세포 특이적 제1 에피토프이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 종양 세포-특이적 제1 에피토프, 제1 종양-세포 표면 분자 또는 제1 종양-세포 특이적 수용체는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자를 제1 에피토프 또는 제1 분자 또는 제1 수용체에 결합한 후에 종양 세포에 의해 내재화되는 제1 에피토프 또는 제1 분자 또는 제1 수용체이며, 그리고 여기서 바람직하게, 제1 단백질성 분자는, 제1 에피토프, 종양 세포 표면 분자 또는 종양-세포 특이적 수용체를 포함하는 세포 표면 분자에 결합되는 경우에, 예를 들어, 엔도사이토시스, 또는 종양-세포 표면 분자 매개된 내재화를 통해, 예를 들어 엔도사이토시스를 통해 종양-세포 수용체-매개 내재화를 받는다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 세툭시맙(cetuximab), 다라투무맙(daratumumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 이노투주맙(inotuzumab), 목세투모맙(moxetumomab), 폴라투주맙(polatuzumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), IgG 유형의 OKT-9 항-CD71 모노클로날 항체, 페르투주맙(pertuzumab), 리툭시맙(rituximab), 오파투무맙(ofatumumab), 헤르셉틴(Herceptin), 알렘투주맙(alemtuzumab), 피나투주맙(pinatuzumab), OKT-10 항-CD38 모노클로날 항체, 표 A2 또는 표 A3 또는 표 A4의 항체, 바람직하게 세툭시맙(cetuximab) 또는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 OKT-9, 또는 이의 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 단편 또는 적어도 하나의 종양-세포 수용체 결합-도메인 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되며, 바람직하게 이의 적어도 하나의 종양-세포 특이적 수용체 결합-단편 및/또는 이의 적어도 하나의 종양-세포 특이적 수용체 결합-도멘인을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 일 견지는 치료 조합물에 관한 것으로, 여기서 치료 조합물은 (a) 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제1 약학 조성물; 및 (b) 제1 단백질성 분자와 상이한 제2 단백질성 분자를 포함하는 제2 약학 조성물로서, 제2 단백질성 분자는 제1 세포 표면 분자와 상이한 제2 세포 표면 분자의 제2 에피토프에 결합하는 제2 결합 부위를 포함하고, 이펙터 모이어티를 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하며, 제2 약학 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하고, 여기서 제2 에피토프는 제1 에피토프와 상이하다.
일 구현은 본 발명의 치료 조합물로서, 치료 조합물은 (a) 본 발명의 제1 단백질성 분자를 포함하는 본 발명의 제1 약학 조성물로서, 여기서 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프는 제1 종양 세포-특이적 표면 분자 상의 종양-세포 특이적 제1 에피토프, 바람직하게는 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제1 세포 표면 수용체 상의 종양-세포 특이적 제1 에피토프인, 제1 약학 조성물; 및 (b) 본 발명의 제2 약학 조성물로서, 여기서 제2 세포 표면 분자는 제1 종양 세포-특이적 표면 분자와 상이한 제2 종양 세포-특이적 표면 분자이며, 바람직하게는 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제2 세포 표면 수용체는 상기 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제1 세포 표면 수용체와 상이하며, 그리고 여기서 제2 에피토프는 종양-세포 특이적 제2 에피토프인, 제2 약학 조성물을 포함한다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 치료 조합물에 관한 것으로, 여기서 치료 조합물은 (a) 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자를 포함하고, 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위를 포함하는 본 발명의 제1 약학 조성물로서, 제1 약학 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 제1 약학 조성물; 및 (b) 제3 단백질성 분자를 포함하는 제3 약학 조성물로서, 제3 단백질성 분자는 (a)의 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하기 위한 제1 결합 부위 및 이펙터 모이어티를 포함하며, 제3 약학 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 제3 약학 조성물을 포함하며, 여기서 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위 및 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 동일하며, 그리고 여기서 제1 세포 표면 분자 및 이에 제1 단백질성 분자가 결합할 수 있는 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프, 및 제1 세포 표면 분자 및 이에 제3 단백질성 분자가 결합할 수 있는 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프는 동일하다.
일 구현은 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 치료 조합물은 (a) 본 발명의 제1 약학 조성물; 및 (b) 본 발명의 제3 약학 조성물을 포함하며, 여기서 제1 세포 표면 분자는 종양 세포 표면 상에 발현되고, 바람직하게 제1 세포 표면 분자는 종양 세포 특이적 표면 분자이며, 바람직하게 제1 에피토프는 제1 종양-세포 특이적 에피토프이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자 또는 본 발명의 치료 조합물이며, 여기서 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하기 위한 제1 결합 부위는 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제1 세포 표면 수용체 상의 종양-세포 특이적 제1 에피토프에 대한 결합 부위이다.
본 발명자들은 본 발명의 제2 또는 제3 약학 조성물 중의 제2 및 제3 단백질성 분자와 같은 항체 약물 접합체의 치료 윈도우가, 제1 약학 조성물이 투여된 종양-함유 포유류(마우스)에 투여될 때, 각각 증가한다는 것을 확립하였다. 제1 단백질성 단백질은 바람직하게는 공유적으로, 더욱 바람직하게는 절단가능한 링커를 통해 공유 결합된 사포닌과 같은 적어도 하나의 글리코시드(glycoside)를 갖는다. 사포닌은, 아마도 이펙터 모이어티의 활성이 요구되는 세포질내로 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 증가시키는 것에 의해, 제2 및 제3 단백질성 분자에 결합된 이펙터 모이어티의 치료 효능을 증강킨다. 이러한 방식으로, ADC, 즉 제2 또는 제3 단백질성 분자의 통상적인 투여량보다 낮은 투여량에서, 이미 치료 효과는 표적 세포 근처, 표적 세포에서 및/또는 표적 세포 내부에 사포닌을 포함하는 제1 단백질성 분자의 존재에 대한 영향 하에서 확립된다. 표적화된 세포는, 예를 들어 종양 세포 또는 자가-면역 세포 또는 B-세포 질병 관련 B-세포 등과 같은 병든 세포이고, 이펙터 모이어티는, 예를 들어 본 발명에 따른 AOC의 일부로서 ADC 또는 BNA와 같은 올리고뉴클레오티드의 일부로서 독소이다.
일 구현은 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위 및/또는 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 면역글로불린, 항체, IgG, Vhh 도메인 또는 Vh 도메인, Fab, scFv, Fv, dAb, F(ab)2, Fcab 단편을 포함하거나 이로 구성된 분자와 같은 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 도메인 및/또는 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 단편을 포함하거나 또는 이로 구성되며, 그리고/또는 EGF 또는 사이토카인과 같은 세포 표면 분자에 결합하기 위한 적어도 하나의 리간드를 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일 구현은 제2 약학 조성물을 포함하는 본 발명의 치료 조합물이고, 여기서 제2 에피토프에 결합하기 위한 제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위는 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제2 세포 표면 수용체 상의 종양-세포 특이적 제2 에피토프에 대한 제2 결합 부위이며, 여기서 제2 결합 부위는 제1 결합 부위와 상이하다.
제1 및 제2 단백질성 분자와 상이한 (2개의) 세포 표면 분자를 표적함으로써, 상기 세포 표면 상의 두 상이한 세포 표면 분자를 노출시키는, 동일한 표적 세포의 세포질에서 그리고 내부에서 사포닌 및 이펙터 분자의 전달은, 세포-표적 사포닌(제1 단백질성 분자)의 존재 없이, ADC 또는 AOC와 같은 제2 단백질성 분자에만 이러한 세포를 노출시키는 것과 비교하여, 개선되고 보다 특이적이다. 제1 단백질성 분자의 결합 부위에 의해 그리고 제2 단백질성 분자의 결합 부위에 의해 개별적인 표적화를 위해 선택된 이상 세포로서, 결합 부위가 상이하며, 제1 및 제2 단백질성 분자가 결합하는 에피토프가 상이하며, 2개의 상이한 수용체와 같은 상이한 종류 및 유형의 세포 표면 분자내/상에 위치하는, 이상 세포는, 이상적으로는 제1 세포 표면 분자 및 제2 세포 표면 분자 상에 제1 에피토프 및 제2 에피토프를 높은 정도로 함유하며(즉, 예를 들어, 건강한 세포와 같은 비-표적 세포 상에서의 발현에 비해, 예를 들어, 종양 세포 또는 자가면역 세포와 같은 표적 세포 상에서의 2개의 구별되며 상이한 세포 표면 분자의 상대적으로 더 높은 발현), 그리고/또는 제1 및 제2 세포 표면 분자, 특히 환자의 (이웃하는) 건강한 세포가 고려된 경우에, 제1 및 제2 세포 표면 분자에 노출시킨다. 바람직하게는, 제1 및 제2 결합 부위에 의해 표적화된 두 세포 표면 분자는 건강한 세포와 비교하여 표적화된(병든, 종양) 세포 상에서 비교적 높게 및/또는 특이적으로 발현된다. 일 구현은 약학 조합으로서, 여기서 제1 및 제2 결합 부위 중 적어도 하나, 및 이에 따라 제1 및 제2 종양-세포 수용체와 같은 제1 및 제2 세포 표면 분자 중 적어도 하나는 건강한(이웃) 세포의 표면 상의 제1 세포 표면 분자 및/또는 제2 세포 표면 분자의 발현과 비교할 때 특이적으로 또는 비교적 높은 정도로 발현된다. 따라서, 제1 에피토프 또는 제2 에피토프, 바람직하게는, 표적 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 표적화된 병든 세포에 이상적으로 고유하며, 표적화된 세포의 표면에 적어도 특이적으로 존재하며 노출된다. 표적 세포 상의 각각의 제1 및 제2 에피토프에 대한 제1 및 제2 단백질성 분자의 결합 다음에는 제1 단백질성 분자와 제1 표적 세포 표면 분자 및 제2 단백질성 분자와 제2 표적 세포 분자의 복합체의 엔도사이토시스가 후속한다. 제1 및 제2 단백질성 분자는, 표적화되지 않아야 하는 건강한 세포와 비교하여 표적화된 세포 상에 충분한 정도로 또는 유일하게 모두 발현되는 두 개의 상이한 세포 표면 분자와의 결합 상호작용을 통해 동일한 표적 세포에 도입되어야 하기 때문에, 표적 세포내의 제1 및 제2 단백질성 분자의 치료적 활성 양의 축적은, 두 개의 별개의 표적 세포 표면 분자의 발현 수준이 모두 특정 최소 발현 역치을 넘을 경우에만 가능하고 일어날 수 있다. 이와 동시에, 제1 및 제2 단백질성 분자 모두가 충분히 노출되고 발현된 제1 및 제2 세포 표면 분자에 결합하여 충분한 양으로 표적 세포에 진입할 수 있는 경우에만, 공유 결합된 사포닌을 함유하는 제1 단백질성 분자의 존재 하에, 제2 단백질성 분자에 결합된 이펙터 모이어티가 단지 이의 세포내(예, 세포질 또는 유전자 침묵) 활성에 영향을 미칠 수 있다는 사실은, 또한 예를 들어 표적화되는 것을 의미하지 않으며, 적어도 제1 및 제2 세포 표면 분자 상에서의 발현이 건강한 세포에서 충분히 낮은 경우에, 바람직하게는 제1 및 제2 표적 세포 표면 분자 모두의 발현이 건강한 세포에서 충분히 낮은 경우에, 이펙터 모이어티에 의해 영향받는, 건강한 세포 및 건강한 조직에 대해 이펙터 모이어티의 부정적이며 원하지 않는 부작용에 대한 보호장치(safeguard)를 제공한다. 즉, 제1 및 제2 세포 표면 분자에 대해 노출된 제1 및 제2 세포 표면 분자, 및 제1 및 제2 단백질성 분자의 제1 및 제2 결합 부위에 의해 각각 결합된 제1 세포 표면 분자 또는 제2 세포 표면 분자 중 적어도 하나의 충분히 낮은 발현 또는 심지어 부재는, 제1 단백질성 분자에 결합된 사포닌의 영향 하에서 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 협력하여 초래할 수 있는 양으로 제1 및 제2 단백질성 분자 모두의 (비표적화된) 건강한 세포로의 진입을 이상적으로 허용하지 않는다. ADC 또는 AOC는 제1 단백질성 분자가 치료 요법에 첨가되지 않을 때와 비교하여 더 낮은 투여량으로 사용될 수 있기 때문에, 건강한 세포로의 낮은 정도 ADC 또는 AOC 진입은, 예를 들어 종양 세포 및 자가면역 세포와 같은 표적 병든 세포의 표적화 및 사멸이 고려될 때 원하지 않는 부작용의 발생에 대한 보다 낮은 위험성을 이미 보유한다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자 또는 제2 약학 조성물을 포함하는 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 상기 제1 및 제2 단백질성 분자는 각각 제1 및 제2 종양-세포 특이적 수용체 상의 제1 및 제2 종양-세포 특이적 에피토프에 결합하는 제1 및 제2 결합 부위를 포함하며, 상기 수용체들은 상이하고 동일한 종양 세포에 존재하며, 여기서 제1 및 제2 결합 부위는 상이하고, 제1 및 제2 종양 세포 특이적 에피토프는 상이하다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자 또는 제3 약학 조성물을 포함하는 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 상기 제1 및 제3 단백성 분자는 제1 종양-세포 특이적 수용체 상의 제1 종양-세포 특이적 에피토프에 결합하기 위한 동일한 제1 결합 부위를 포함한다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자 또는 제2 약학 조성물을 포함하는 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 제1 수용체 및/또는 제2 수용체는 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린, 신데칸-1, 혈관 인테그린 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, PSMA, CanAg, 인테그린 알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2로부터 선택된, 보다 바람직하게는 CD71, EGFR, HER2로부터 선택되며, 바람직하게는 CD71, EGFR 및 HER2로부터 선택된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자 또는 제2 약학 조성물을 포함하는 본 발명의 치료 조합물로서, 치료 조합물이 제2 약학 조성물을 포함하는 경우, 여기서 제1 및 제2 종양-세포 특이적 수용체는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및/또는 본 발명의 제2 단백질성 분자에 대한 결합 후 종양 세포에 의해 내재화되고, 그리고 여기서 바람직하게는 제1 단백질성 분자 및/또는 제2 단백질성 분자의 제1 및 제2 종양-세포 특이적 수용체에 각각 결합하는 것은 예를 들어, 제1 단백질성 분자 및 제1 종양-세포 특이적 수용체의 복합체 및 제2 단백질성 분자 및 제2 종양세포 특이적 수용체의 복합체의 엔도사이토시스를 통해 종양-세포 수용체-매개된 내재화를 초래한다.
일 구현은 본 발명의 제3 약학 또는 본 발명에 따른 제1 약학 조성물을 포함하는 치료 조합물로서, 여기서 제1 종양-세포 수용체, 바람직하게는 제1 종양-세포 특이적 수용체는 본 발명의 제1 단백질성 분자와 결합 후 및/또는 본 발명의 제3 단백질성 분자와 결합 후 종양 세포에 의해 내재화되며, 그리고 여기서 바람직하게는 제1 종양-세포 특이적 수용체와 같은 제1 종양-세포 수용체에 대한 제1 단백질성 분자 및/또는 제3 단백질성 분자의 결합에 이어서 예를 들어, 제1 단백질성 분자 및 제1 종양-세포 수용체의 복합체 및 제3 단백질성 분자 및 제1 종양-세포 수용체의 복합체의 엔도사이토시스를 통해 종양-세포 수용체-매개 내재화가 후속된다.
동기화(synchronization)는 마우스에 대한 성공적인 전달 전략과 인간에서의 그의 응용에 대한 미싱 링크(missing link)이다. 실제로, 본 발명자들은 유리 사포닌의 투여량 및 ADC(본 발명에 따른 제2 또는 제3 단백질성 분자)의 투여량을 마우스에 개별적으로 투여하는 일련의 생체내 마우스 종양 모델에서, ADC 및 유리 사포닌으로 처리되지 않은 대조군 동물에 비해, 지연된 종양 성장, 종양 회귀, 감소 및 더 느린 종양 성장과 같은 임의의 바람직한 항-종양 활성을 초래하지 않았다는 것을 확립하였다. 유리 사포닌을 다양한 투여 경로를 사용하여 그리고 ADC 투여 순간에 비해 유리 사포닌을 투여하는 다양한 시점을 사용하여 투여하였다(ADC 투여 전, 도중 및 후에 유리 사포닌 투여). 생체내 종양 모델에서 시험된 ADC는 세툭시맙-디안틴(유리 S01861을 가짐), 또는 트라스투주맙-사포닌(유리 S01861을 가짐)이었다. 유리 사포닌의 투여량을 변화시키는 것은 효과적인 항종양 활성을 제공하지 않았다. 본 명세서에서 언급되는 ADC는 종양-함유 동물에 대해 그 자체가 어떠한 유익한 항-종양 효과를 입히지 않는 투여량으로 투여되었다. 놀랍게도, 본 발명자들은 다양한 시험관내 포유류 세포-기반 생물학적 분석에서 및/또는 다양한 생체내 동물 종양 모델에서 본 발명에 따른 접합체를 이용하여, 선택적으로, 본 발명에 따른 스캐폴드, 즉 본 발명의 제1 및 제2 또는 제1 및 제3 단백질성 분자의 조합물을 포함하는 것을 처리함으로써 유익한 항-종양 활성이 달성될 수 있다는 것을 이제 확립하였다. 예를 들어 스캐폴드는 절단 가능한 또는 절단 불가능한 결합을 통해 및/또는 공유 결합된 사포닌(예를 들어, S01861, QS-21)을 갖는, 및/또는 절단 불가능한 또는 절단 가능한 결합을 통해 공유 결합된 이펙터 모이어티(예, 디안틴, 침묵 BNA(HSP27))를 갖는, 및/또는 세툭시맙, 트라스투주맙, OKT-9와 같은 공유 결합된 모노클로날 항체를 갖는 3중-작용성 링커이거나, 또는 스캐폴드는 예를 들어 4개의 사포닌 분자와 같이 4개의 모이어티가 결합할 수 있는 덴드론, 또는 예를 들어 2개의 사포닌과 2개의 이펙터 분자의 결합을 위한 덴드론과 같은 덴드론이며, 덴드론은 리간드 또는 항체 또는 이의 단편 또는 도메인에 (공유) 커플링하기 위한 화학 기를 포함한다. 예를 들어 단백질성 독소에 의해 발휘된 세포 독성이 고려될 때 또는 종양 세포에서 유전자 침묵이 고려될 때 생체내 및/또는 시험관내 항-종양 세포 활성을 나타내는, 본 발명에 따른 다양한 이러한 스캐폴드를 예시하는 레퍼런스가 실시예 항목에서 이루어진다.
어느 이론에 얽매이지 않고, 유리 사포닌과 함께 ADC를 이용한 종양-함유 동물의 치료시 관찰된 실패의 관점에서, 예를 들어, 종양 세포 또는 자가면역 세포와 같은 표적 세포의 엔도사이틱 경로의 구획(compartment)또는 소포체(vesicles)에서, 적어도 하나의 사포닌, 및 이펙터 모이어티, 바람직하게는 독소 또는 올리고뉴클레오티드의 모두의 존재를 동기화(synchronize) 하는 것이 바람직하다. ADC 및 유리 사포닌을 가지고, 생체내 시너지 효과를 얻기 위해 후기 엔도솜내에 상기 분자들의 존재를 동기화하는 것은 본 발명자의 시도에 따라 유리하게 얻을 수 없었다. 일 견지에서, 본 발명은 바람직하게는 제2 단백질성 분자에 의해 포함된 이펙터 모이어티 및 제1 단백질성 분자에 의해 포함된 사포닌을 결합하는 것과 관련하여 적어도 다음의 문제를 해결한다: 어느 이론에 의해 제한되지 않고, 예를 들어, (공유적으로) 특히 단일이면서 절단 가능한, 보유 가능한 커플링에 사용될 수 있는 사포닌이 엔도솜 탈출 활성에 요구된다. 예를 들어, 표 A1 및 스킴 I에 열거된 사포닌들의 두드러진 엔조솜 탈출 강화 효과가 10년 이상 알려져 있음에도 불구하고, 공지된 제한은 아마도 사포닌이 임상적 연구에서, 면역-증강 보조 물질의 사용이 포함된 백신 요법시 사포닌의 적용보다는 약학적으로 활성적인 물질들과 조합하여 사용되지 않은 가장 큰 이유인 것으로 보인다. 예를 들어, 공유 결합된 스캐폴드를 갖는 본 발명의 제1 단백질성 분자를 제공하는 것은 이러한 어려움을 적어도 부분적으로 해결한다. 놀랍게도, 보조 성분으로서 사포닌을 포함하는 백신 접종 상황에서 이들의 면역 증강 활성을 위해 이전에 적용된 사포닌도 이제 또한 시험관내 및 생체내 항-종양 활성을 위한 본 발명의 제1 단백질성 분자에 대한 (공유) 커플링에 적절하다.
본 발명에 유용한 이펙터 모이어티는 바람직하게는 그의 효과를 발휘하기 위해 후기 엔도솜 탈출(late endosomal escape)에 의존한다. 예를 들어, 슈도모나스 외독소(pseudomonas extoxin)와 같은 일부 이펙터는 "후기 엔도솜 단계(late endosomal stage)" 이전에 다른 소기관에 경로변경(rerouted)되고, 따라서 본 발명에 따른 제2 단백질성 분자에 대한 결합으로부터 일반적으로 유익하지 않다. 그러나, 이러한 독소는, 예를 들어 경로변경을 담당하는 신호 펩티드를 제거함으로써 본 발명과 함께 사용하도록 적응될 수 있다. 매우 독성적이며, 세포 사멸을 위해 엔도솜을 탈출하는데 단지 하나의 분자만을 요구하는 특정 독소는 아미도 효력이 감소되도록 변형된다. 적어도 2, 더욱 바람직하게는 적어도 5, 더욱 바람직하게는 적어도 10, 더욱 바람직하게는 적어도 20, 더욱 바람직하게는 적어도 50, 가장 바람직하게는 적어도 100개의 독소 분자가 엔도솜을 탈출하는 경우, 세포를 사멸시키는 독소를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 제2 단백질성 분자는 공유 결합된 작용화된 스캐폴드, 종양 세포 또는 자가-면역 세포주와 같은 표적 세포에 결합된 이펙터 모이어티(들)을 포함하는 스캐폴드를 표적하기 위해 공유 결합된 이펙터 모이어티(들)을 포함하는 스캐폴드를 포함한다. 또한, 오프-타겟 독성을 감소시키기 위해, 세포막 비투과성 소 분자 독소가 세포막 투과성 독소에 비해 바람직한 이펙터 분자이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "리간드"는 이의 일반적인 의미를 가지며, 바람직하게는 표적 세포의 세포 표면 상의 다른 분자 또는 구조에 결합할 수 있는 분자 또는 구조를 의미하며, 여기서 세포 표면 상의 분자 또는 구조는 엔도사이토즈될 수 있으며, 바람직하게는 오프-타겟 세포 상에 존재하지 않거나 덜 두드러진다. 바람직하게는, 세포 표면 상의 상기 분자 또는 구조는 구성적으로 엔도사이토즈된다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 리간드는 상기 분자 또는 구조에 결합된 후 표적 세포의 세포 표면 상의 상기 분자 또는 구조의 엔도사이토시스(endocytosis)를 유도한다. 이는 예를 들어, 다양한 암 세포의 표면 상에 존재하는 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)에 대한 경우이다. 구성적으로 엔도사이토즈되는 표적 세포의 세포 표면 상의 분자 또는 구조의 예는, 예를 들어, 클라우딘-1(Claudin-1) 또는 주요 조직 적합성 복합체 클래스 II 당단백질이다. 리간드는, 예를 들어 항체, 성장 인자 또는 사이토카인일 수 있다. 캐리어 분자에서 독소를 리간드와 결합하는 것은 표적화된 독소를 생성하는 한 가지 가능성이다. 표적 세포에서 발생하는 프로세스들과 간섭하기 때문에 표적 세포에서만 독성적인 독소는 또한 표적 독소로서 보여질 수 있다(오프-타겟 세포에서와 같이, 이는 그것의 독성적 작용, 예를 들어, 아폽틴(apoptin))을 가할 수 없다). 바람직하게는, 표적화된 독소는 리간드와 결합된 독소이거나, 또는 예를 들어, (표적 세포에 대해서만 결합하고 엔도사이토즈됨에 따라) 표적 세포내에서 활성적이며 오프-타겟 세포에서는 그렇지 않도록 하기 위해 모노클로날 항체와 결합된 독소이다. 리간드 및 이펙터 모이어티(즉, 제2 또는 제3 단백질성 분자)를 포함하는 캐리어 분자를 포함하는 작용화된 스캐폴드에서, 리간드 또는 모노클로날 항체는 이펙터 모이어티 및 스캐폴드를 타겟 세포로 가이드한다. 내재화 후, 적어도 하나의 글리코시드, 바람직하게는 제1 단백질성 분자의 컨쥬게이트 및 사포닌에 의해 포함된 사포닌은 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 매개한다. 사포닌은 전형적으로 표 A1 및 스킴 I에 열거된 사포닌이고, 바람직하게 사포닌은 S01861 및/또는 QS-21, 및/또는 SA1641 및/또는 GE1741이다
바람직하게, 제2 및 제3 단백질성 분자에 결합된 이펙터 모이어티는 그 효과가 제1 단백질성 분자에 결합된 사포닌에 의해 증강되고, 엔도사이토즈될 경우 예를 들어, 항체와 같은 제2 또는 제3 단백질성 분자로부터 분리된다. 이는 예를 들어 산성, 환원성, 효소 또는 광-유도 조건 하에서 파괴되는 절단 가능한 결합에 의해 달성될 수 있다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자, 및/또는 제2 약학 조성물을 포함하는 본 발명의 치료 조합물로서, 여기서 제1 결합 부위 및/또는 제2 결합 부위가 모노클로날 항체 또는 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 단편 및/또는 그의 -도메인이거나 포함하며, 그리고 바람직하게 세툭시맙(cetuximab), 다라투무맙(daratumumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 이노투주맙(inotuzumab), 목세투모맙(moxetumomab), 폴라투주맙(polatuzumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), IgG 유형의 OKT-9 항-CD71 모노클로날 항체, 페르투주맙(pertuzumab), 리툭시맙(rituximab), 오파투무맙(ofatumumab), 헤르셉틴(Herceptin), 알렘투주맙(alemtuzumab), 피나투주맙(pinatuzumab), OKT-10 항-CD38 모노클로날 항체, 표 A4의 항체, 바람직하게 세툭시맙(cetuximab) 또는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 OKT-9, 또는 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 단편 또는 이의 -도메인 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되며, 단, 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위와 상이하다.
일 구현은 본 발명의 제2 또는 제3 약학 조성물을 포함하는 치료 조합물로서, 여기서 제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위 및/또는 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 모노클로날 항체 또는 이의 적어도 하나의 세포 표면 결합 단편 또는 -도메인이거나 또는 이를 포함하며, 바람직하게 겜투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 트라스투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine), 이노투주맙 오조가마이신(Inotuzumb ozogamicin), 목세투모맙 파수도톡스(Moxetumomab pasudotox) 및 폴라투주맙 베도틴(Polatuzumab vedotin) 및 표 A2 및 표 A3의 항체-약물 접합체 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 구성된다.
본 발명자들은 이러한 면역글로불린, 이의 도메인, 리간드 등이 제1 결합 부위를 포함하는 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위 (및 제3 단백질성 분자의 동일한 결합 부위)로서 적용하기에 특히 적합하다는 것을 확립하였다. 유사하게, 본 발명자들은 이러한 면역글로불린, 이의 도메인, 리간드 등이 제2 결합 부위를 포함하는 제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위로서 적용하기에 특히 적합하다는 것을 확립하였다. 예를 들어, 항체 및 항체의 결합 도메인은 선택된 세포 표면 분자의 노출된 표면 상의 에피토프를 표적화하는데 적합하며, 이는 제1 및 제3 단백질성 분자에 의해 표적되는 세포 표면 분자를 발현하는 세포를 표적하기 위해 및/또는 제2 단백질성 분자에 의해 표적되는 제2 세포 표면 분자를 또한 발현하는 세포를 표적하기 위해, 제1 및 제3 (및 별도로 제2) 단백질성 분자를 표적하며, 이들 세포들은 또한 (동일한 세포 표면 분자인) 제1 및 제3 세포 표면 분자를 발현하며, 그리고 이들의 세포 표면 상에 상기 세포 표면 분자를 갖는다. 유사하게, 표적 세포 상의 EGFR을 표적으로 하는 EGF와 같은 리간드는 제1 및 제3 단백질성 분자내의 결합 부위로서, 또는 제2 단백질성 분자내의 제2 결합 부위로서 적용하기에 적합하고, 단, 제2 결합 부위는 제1 및 제3 결합 부위가 동일한 제1 및 제3 결합 부위 모두와 상이하다. 제1 세포 표면 분자에 제1 및 제3 단백질성 분자의 결합을 위해, 그리고/또는 제2 세포 표면 분자에 제2 단백질성 분자의 결합을 위해 특이적인, 제1 및 제3 에피토프를 위한 또는 제2 에피토프를 위한 결합 부위가 바람직하며, 제1 및 제2 세포 표면 분자는 동일한 표적 세포 상에 노출된다. 항체 또는 이의 도메인 또는 결합 단편에 기초한 결합 부위는 예를 들어, 병든 세포, 종양 세포, 자가-면역 세포 등과 같이 표적을 위해 선택된 세포의 선택된 제1 또는 제2 세포 표면 분자 상에 선택된 제1, 제2, 제3 에피토프에 대해 이러한 원하는 특이성을 제공한다. 따라서, 항체 또는 결합 분자(단편, 도메인)에 기초한 제1, 제2 및 제3 결합 부위는 제1 및 제2 및 제3 단백질성 분자에 대해 바람직하다.
제1 및 제3 단백질성 분자와 동일한 세포 표면 분자를 표적함으로써, 바로 그 동일한 표적 세포의 세포질에서 그리고 내부에서 사포닌 및 이펙터 모이어티의 전달은 개선되고 더욱 특이적이다. 제1 및 제3 단백질성 분자의 결합 부위에 의한 표적화를 위해 선택된 이상 세포는, 환자에서 (이웃하는) 건강한 세포가 고려될 경우, 이상적으로는 세포 표면 분자를 높은 정도 그리고/또는 특이적으로 함유한다. 따라서, 표적화된 세포 표면 분자 상의 에피토프는 이상적으로는 표적화된 질병 세포에 고유하고, 표적화된 세포의 표면에서 적어도 특이적으로 존재하며 노출된다. 제1 및 제3 단백질성 분자의 결합에 이어서 제1 단백질성 분자와 표적 세포 표면 분자 및 제3 단백질성 분자와 표적 세포 표면 분자의 복합체의 엔도사이토시스가 후속한다. 제1 및 제3 단백질성 분자는 동일한 세포 표면 분자와의 결합 상호작용을 통해 동일한 표적 세포내로 진입해야 하며, 표적 세포내의 제1 및 제 3단백질성 분자의 치료적 활성 양의 축적은, 표적 세포 표면 분자의 발현 수준이 특정 최소 발현 역치을 넘는 경우에만 가능하고 일어날 수 있다. 동시에, 제1 및 제3 단백질성 분자 모두가 충분히 노출되고 발현된 세포 표면 분자에 결합하여 충분한 양으로 표적 세포에 진입할 수 있었던 경우에만, 제3 단백질성 분자에 결합된 이펙터 모이어티가 공유 결합된 사포닌을 함유하는 제1 단백질성 분자의 존재하에 이의 세포내(예를 들어, 세포독성 또는 유전자 침묵) 활성을 나타낼 수 있다는 사실은, 또한 예를 들어 표적화된 세포 표면 분자의 발현이 건강한 세포에서 충분히 낮은 경우에, 이펙터 모이어티에 의해 표적되고 영향받는 것을 의미하지 않는 건강한 세포 및 건강한 조직에 대해 이펙터 모이어티의 부정적이며 원하지 않는 부작용에 대한 보호장치(safeguard)를 제공한다. 즉, 제1 및 제3 단백질성 분자의 결합 부위에 의해 결합된 세포 표면 분자의 낮은 발현은, 제1 단백질성 분자에 결합된 사포닌의 영향 하에서 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 협력하여 초래할 수 있는 양으로 제1 및 제3 단백질성 분자 모두의 진입을 허용하지 않는다. ADC 또는 AOC는 제1 단백질성 분자가 치료 요법에 첨가되지 않을 때와 비교하여 더 낮은 투여량으로 사용될 수 있기 때문에, 건강한 세포로의 낮은 정도 ADC 또는 AOC 진입은, 예를 들어 종양 세포 및 자가면역 세포와 같은 표적 병든 세포의 표적화 및 사멸이 고려될 때 원하지 않는 부작용의 발생에 대한 보다 낮은 위험성을 이미 보유한다.
명세서 및 청구항들(전체 적용) 전반에 걸쳐, 용어 '제1' 및 '제3'은 제1 및 제3 에피토프, 제1 및 제3 결합 부위, 제1 및 제3 세포 표면 분자가 고려될 때 동일한 의미를 갖는다. 즉, 제1 및 제3 단백질성 분자에 대해, 표적화된 에피토프는 동일하며, 결합 부위는 동일하며, 종양-세포 (특이적) 수용체와 같은 표적화된 세포 표면 분자는 동일하다.
표 A2, A3 및 A4는 제1 및 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위에 대한 제1 에피토프를 포함하는 제1 세포 표면 분자의 바람직한 예이다. 또한, 표 A2, A3 및 A4는 또한 제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위에 대한 제2 에피토프를 포함하는 제2 세포 표면 분자의 바람직한 예를 열거한다. 제1 및/또는 제2 세포 표면 분자가, 바람직하게는 제1 및 제2 세포 표면 분자 모두가 표적 세포 상에서 특이적으로 발현될 때, 및 제1 결합 부위 및/또는 제2 결합 부위가 각각 결합할 수 있는 제1 및 제2 세포 표면 분자 상에 제1 및 제2 에피토프가 제1 및/또는 제2 세포 표면 분자에 특이적으로 존해할 때, 제1 및 제2 종양-세포 표면 분자를 노출시키는 종양 세포와 같은 동일한 원하는 표적 세포에 대한 제1, 제3 및/또는 제2 단백질성 분자의 특이적인 표적이 용이하게 되며, 반면에 제1 및/또는 제2 세포 표면 분자를 발현하지 않거나 제1 및/또는 제2 세포 표면 분자를 보다 낮은 정도로 발현하는, 바람직하게는 제1 및 제2 세포 표면 분자를 발현하지 않거나 표적(이상) 세포 상에서 세포 표면 분자(들)의 발현에 비해 제1 및 제2 세포 표면 분자를 보다 낮은 정도로 발현하는 건강한 세포들과 같은 다른 세포들은 제1, 제3 및 제2 단백질성 분자에 의해 표적화되지 않거나 보다 낮은 정도로 표적화된다.
일 구현은 본 발명의 제2 또는 제3 약학 조성물을 포함하는 치료 조합물로서, 여기서 제2 단백질성 분자 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되는 이펙터 모이어티는 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산 중 어느 하나 이상, 바람직하게는 벡터, 유전자, 세포 자살 유도 트랜스진, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), DNA 압타머, RNA 압타머, mRNA, 미니-서클 DNA, 펩티드 핵산(PNA), 포스포아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), 잠금(locked) 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노 핵산(FANA), 2'-0-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-O,4'-아미노에틸렌 가교 핵산, 3'-플루오로 헥시톨 핵산(FHNA), 플라스미드, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스(threose) 핵산(TNA), 또는 이의 유도체 중 적어도 하나로부터 선택된, 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산 중 어느 하나 이상, 보다 바람직하게는 예를 들어 HSP27 단백질 발현을 침묵런싱시키기 위한 BNA와 같은 BNA를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현은 본 발명의 제2 또는 제3 약학 조성물을 포함하는 치료 조합물로서, 여기서 제2 단백질성 분자 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되는 이펙터 모이어티는 적어도 하나의 단백질성 분자, 바람직하게는 우레아제 및 Cre-리콤비네이즈, 리보솜-불활성화 단백질, 단백질성 독소와 같은 펩티드, 단백질, 효소 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질성 분자, 보다 바람직하게 표 A5로부터 선택된 단백질 독소 및/또는 아폽틴(apoptin)과 같은 바이러스 독소, 쉬가 독소(Shiga toxing), 쉬가-유사 독소, 슈도모나스 에어루지노사 외독소(Pseudomonas aeruginosa exxtoxin, PE) 또는 PE의 외독소 A, 전장 또는 절단된 디프테리아 독소(DT), 콜레라 독소와 같은 박테리아 독소; 알파-사신(alpha-sarcin)과 같은 균류 독소; 예를 들어, 디안틴-30 또는 디안틴-32와 같은 디안틴, 예를 들어, 사포린-S3 또는 사포린-S6와 같은 사포린, 보우가닌(bouganin) 또는 보우가닌의 면역제거된 유도체 디보우가닌, 쉬가-유사 독소 A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 리신(ricin), 리신 A쇄, 모데신(modeccin), 모데신 A쇄, 아브린(abrin), 아브린 A쇄, 볼켄신(volkensin) A 쇄, 비스커민(viscumin) A쇄와 같은 리보솜-불활성화 단백질 및 유형 2 리보솜-불활성화 단백질의 A쇄를 포함하는 식물 독소; 또는 프로그 RNase, 또는 인간의 그란자임 B 또는 안지오게닌, 또는 이의 어느 단편 또는 유도체와 같은 동물 또는 인간 독소로부터 선택된 단백질 독소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질성 분자를 포함하거나 이로 구성되며; 바람직하게 단백질 독소는 디안틴 및/또는 사포린이다.
일 구현은 본 발명의 제2 또는 제3 약학 조성물을 포함하는 치료 조합물로서, 여기서 제2 단백질성 분자 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함된 이펙터 모이어티는 적어도 하나의 페이로드, 바람직하게는 리보솜을 표적하는 독소, 신장 인자를 표적하는 독소, 튜뷸린을 표적하는 독소, DNA를 표적하는 독소 및 RNA를 표적하는 독소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된, 적어도 하나의 페이로드, 보다 바람직하게는 엠탄신, 슈도톡스, 메이탄시노이드 유도체 DM1, 메이탄시노이드 유도체 DM4, 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE, 베도틴), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF, 마포도틴), 칼리케마이신, N-아세틸-γ-칼리케마이신, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 벤조디아제핀, CC-1065 유사체, 두오카마이신, 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 에토포시드, 도세탁셀, 5-플루오로우라실(5-FU), 미톡산트론, 튜뷸리신, 인돌리노벤조디아제핀, AZ13599185, 크립토피신, 리족신, 메토트렉세이트, 안트라사이클린, 캄프토테신 유사체, SN-38, DX-8951f, 엑사테칸 메실레이트, 절단된 형태의 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소(PE38), 듀오카마이신 유도체, 아만틴, α-아만틴, 스플라이스오스타틴(spliceostatin), 테일란스타틴(thailanstatin), 오조가마이신, 테시린, Amberstatin269 및 소라브탄신, 또는 이의 유도체 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 페이로드를 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명에서 약학적 활성 물질은 유기체, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 암 환자 또는 자가면역 환자와 같은 인간에서 유익한 결과를 달성하기 위해 사용되는 이펙터 모이어티이다. 이익은 질환 및/또는 증상의 진단, 예후, 치료, 치유 및/또는 예방을 포함한다. 약학적 활성 물질은 또한 바람직하지 않은 유해한 부작용을 초래할 수 있다. 이 경우, 장단점(pros and cons)은 약학적 활성 물질이 특정 경우에 적합한지의 여부를 결정하기 위해 평가되어야 한다. 세포내 약학적 활성 물질의 효과가 전체 유기체에 주로 유익하다면, 세포는 표적 세포라고 불린다. 세포내의 효과가 전체 유기체에 대해 주로 유해하면, 세포는 오프-타겟 세포라고 불린다. 세포 배양물 및 생물반응기(bioreactor)와 같은 인공 시스템에서, 표적 세포 및 오프-타겟 세포는 목적에 따라 달라지며, 사용자에 의해 정의된다.
폴리펩티드인 이펙터 모이어티는, 예를 들어, 효소 대체, 유전자 조절 기능, 또는 독소와 같은 손실된 기능을 회복하는 폴리펩티드일 수 있다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 제1 단백질성 분자는 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기, 바람직하게는 시스테인 및/또는 리신에 직접 공유 결합된, 및/또는 적어도 하나의 링커를 통해 공유 결합된 및/또는 적어도 하나의 절단가능한(cleavable) 링커를 통해 및/또는 적어도 하나의 중합체 또는 올리고머 스캐폴드, 바람직하게 1-8개의 이러한 스캐폴드 또는 2-4개의 이러한 스캐폴드를 통해 공유 결합된 하나 이상의 사포닌, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 또는 1-100개의 사포닌, 또는 7, 9, 12개의 사포닌과 같이 이들 사이에 있는 임의의 수의 사포닌을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 스캐폴드는 선택적으로 덴드론에 기초하며, 여기서 1-32개의 사포닌, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32개의 사포닌, 또는 7, 9, 12개의 사포닌과 같이 이들 사이에 있는 임의의 수의 사포닌이 적어도 하나의 스캐폴드에 공유 결합된다.
표 A1 및 스킴 I 및 상기 구현들은 일련의 사포닌들이 제2 분자(예, 독소, 올리고뉴클레오티드와 같은 이펙터 모이어티 또는 이펙터 분자)와 함께 유리 형태로 포유류 세포, 특히 인간 종양 세포와 접촉되는 경우에 이들의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대해 확인된 일련의 사포닌들을 요약한다. 실제로, 인간 종양 세포를 이용한 세포-기반 생물학적 분석에서, 본 명세서에 기술된 표 A1에 표로 작성된 사포닌들 및 스킴 I 및 본 발명의 다양한 구현들의 사포닌들에 대해 , 이들 사포닌들의 영향 하에, 제1 단백질성 분자에 결합된 경우, 제2 또는 제3 단백질성 분자에 결합된, 핵산과 같은 제2 분자(이펙터 모이어티) 및/또는 단백질 독소(예, 표 A5에 열거된 단백질 독소들 중 하나 이상)와 같은 독소가, 아마도 (후기(late)) 엔도솜 및 리소좀으로부터 세포내 방출을 통해, 증가된 효율 및/또는 효능으로 세포질내로 전달되는 것이 확립되었다. 즉, 예를 들어, 핵산 및/또는 독소와 같은, 이러한 제2 분자(본 발명의 제2 또는 제3 단백질성 분자에 결합된 이펙터 모이어티)의 엔도솜 및/또는 리소좀 탈출은 사포닌의 부재하에서 덜 효율적이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 QS-21 및 이의 패밀리 구성원들, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, QS-18 및 Quil-A를 포함하는 퀼라자 사포나리아로부터의 수용성 사포닌 분획이, 또한, 이펙터 모이어티(상술한 제2 및/또는 제3 단백질성 분자) 및 공유 접합체로서 제1 단백질성 분자에 의해 포함된, 이러한 QS-21 제조물(예, 퀼라자 사포나리아의 수용성 분획)에 포괄된 QS-21 및 이의 패밀리 구성원 사포닌들과 같은 적어도 하나의 글리코시드를 포함하는 제2 및/또는 제3 단백질성 분자와 함께, 모노클로날 항체(본 발명의 제1 단백질성 분자)를 포함하며, 여기서 이펙터 분자 및 예를 들어 퀼라자 사포나리아의 사포닌 분획, QS-21, SO1861, SA1641, GE1741과 같은 글리코시드가 예를 들어 상기 단백질성 분자에 직접적으로 또는 링커를 통해 공유 결합되거나, 또는 직접적으로 또는 적어도 하나의 링커를 통해 중합체 또는 올리고머 스캐폴드를 통해 공유 결합되어 있는, 공유 접합체의 형태로 포유류 종(인간)의 종양 세포에 투여될 경우에, 모노클로날 항체에 결합된 핵산 또는 모노클로날 항체에 결합된 단백질 독소(공유 결합된 올리고뉴클레오티드 또는 (단백질) 독소와 같은 페이로드를 포함하는 본 발명의 제2 및/또는 제3 단백질성 분자의 예들)의 시험관내 생물학적 효과를 증강시키는 능력을 나타냄을 이제 입증한다. 임의의 이론에 의해 구속되고자 하는 것은 아니며, 시험관내에서 퀼라자 사포나리아로부터 유래된 사포닌들의 존재하에, 예를 들어 종양-세포 HSP27 발현의 안티센스 BNA 매개된 감소(HSP27 유전자 침묵)의 관찰된 자극 또는 강화작용(potentiation)은 사포닌에 의한 종양 세포에서의 인플라마솜(inflammasome)의 활성화와 (또한) 관련될 수 있으며, 이는 예를 들어 종양 세포 돌출(pyroptosis)을 초래한다. 본 발명자들은, 예를 들어 안티센스 BNA 또는 디안틴에 접합된 제2 및 제3 단백질성 분자가, 사포닌을 포함하는 본 발명의 제1 단백질성 분자의 존재하에, 그리고 제2 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 표적화된 세포 표면 분자와 동일한 (종양) 세포에 표적화된 경우에, 바이오-기반(bio-based) 세포 분석에서 세포들과 접촉시, 시험관내에서 모두 어느 항종양 세포 활성을 발휘하거나 항종양 세포 활성을 개선시켰으나, 반면에 제1 단백질성 분자의 부재하에서 그리고 이에 따라 사포닌의 부재하에서는 종양 세포에 대해 이러한 활성이 관찰되지 않았음을 확립하였다.
QS-21, 및 또한 퀼라자 사포나리아로부터의 QS-21을 포함하는 수용성 사포닌 분획은 이미 오랜 기간 공지되어 있었으며, 이의 면역 증강 능력을 위해 예를 들어 서브-단위 백신에서 보조제로서와 같이 이미 집중적으로 적용되었다. 예를 들어, QS-21은 QS-21(Glaxo-Smith-Kline, MAGRIT trial, DERMA study)을 포함하는 보조제와 혼합된 서브-단위 백신으로 백신접종된 인간 환자에서 2개의 3상 임상 시험에 적용되고, 여기서 서브-단위는 MAGE-A3 단백질이고, 이는 구체적으로 종양 세포에 의해 발현되고 제시된다. 항-종양 백신접종은 QS-21로 증강되었고, 암 환자(흑색종; 비-소세포성 폐암)의 질병-없는 생존 연장을 목적으로 하였다. 또한, QS-21은, 항암 백신 치료 개발을 위해, HIV-1 감염에 대한 백신의 개발을 위해, B형 간염에 대한 백신의 개발에서, 및 Glaxo-Smith-Kline의 보조제 AS01 및 AS02를 포함하는 QS-21을 이용한 항-말라리아 백신 개발을 위해, 임상 시험에서 보조제로 시험되었다. 이전 연구는 보조제(AS15; GSK)를 포함하는 QS-21 사포닌의 영향 하에서, 암 세포 표면에서 제시된 MAGE-A3 펩티드에 대해 유도된 면역 반응을 나타내었다. 본 발명자들은 놀랍게도, 퀼라자 사포나리아, 및 이에 따라 (퀼라자 사포나리아의 수용성 사포닌 분획의 일부로서) 이와 유사한 QS-21의 사포닌 분획물은, 예를 들어 제2 단백질성 분자(예, 리간드 EGF)에 결합된 단백질 독소(디안틴)와 같은 페이로드의 항종양 세포 활성을 증강시킨다.
본 발명자들은 BNA(HSP27)와 같은 공유 커플링된 안티센스 BNA와 함께 제공되며, 공유 커플링된 사포닌(예, SO1861, QS-21)을 갖는 본 발명의 제1 단백질성 분자와 함께 종양 세포와 접촉된 종양-세포 표적화 모노클로날 항체, 및 절단 가능한 결합을 통해 제1 및 제3 단백질성 분자의 각 항체(예, 세툭시맙)에 커플링된 BNA 및 사포닌 모두는, 대조군에 비해, 그리고 결합된 사포닌을 갖는 제1 단백질성 분자가 단지 존재하지 않는 AOC(제3 단백질성 분자)에 비해, 생체내 종양에서 HSP27을 침묵시킬 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, ADC 또는 항체-BNA 접합체와 같은 항체-올리고뉴클레오티드 접합체(AOC)를, 사포닌을 갖는 제1 단백질성 분자와 함께 공동투여하는 것은, ADC 또는 AOC에 동일한 투여량에서 ADC 단독 또는 AOC 단독에서는 나타나지 않은 항종양 활성을 부여한다. 주목할 만하게, AOC(제2 또는 제3 단백질성 분자) 및 공유 커플링된 사포닌을 갖는 모노클로날 항체(제1 단백질성 분자)는, 개별의 마우스 그룹에서 종양 함유 마우스에 개별적으로 투여한 경우, 대조군(오직 비히클만 투여됨)에 비해 종양 세포에서 HSP27 발현을 증가시킨다. 본 발명의 이펙터 모이어티를 포함하는 AOC(제2 또는 제3 단백질성 분자) 및 공유 커플링된 사포닌을 갖는 제1 단백질성 분자의 동시 투여만이 대조군에 비해 감소된 HSP27 발현을 나타낸다. 안티센스 BNA(HSP27)는 문헌[Zhang et al. (2011) [Y Zhang, Z Qu, S Kim, V Shi, B Liao1, P Kraft, R Bandaru, Y Wu, LM Greenberger and ID Horak, Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection, Gene Therapy (2011) 18, 326-333]에 따른 올리고 핵산 서열 5'-GGCacagccagtgGCG-3'을 갖는 BNA이었다. 주목할 만하게, 본 발명자들이 아는 지식으로, BNA는 유리 핵산으로서 적용되도록 설계된다. 본 발명자들은 이제, 유전자-침묵 활성이 시험관내 및 보다 중요하게는 종양-함유 동물의 종양 세포에서 보유되는 방식으로, 안티센스 BNA가 (비-)절단가능한 링커를 통해 리간드 또는 항체와 공유 커플링될 수 있다는 것을 처음으로 입증한다. BNA 기반 AOC를 제공하는 이러한 접근법은 표적된 BNA를 이를 필요로 하는 인간(암)환자에게 투여하기 위한 새로운 길을 연다.
본 발명자들은 퀼라자 사포나리아, QS-21, SA1641, SO1861, 표 A1, 스킴 I의 수용성 분획의 사포닌과 같은 사포닌을, 예를 들어, 스킴 II 및 구조 B의 3작용성 링커와 같은 3작용성 링커를 통해, 또는 공유 결합된 사포닌을 포함하는 올리고머 또는 중합체 구조의 스캐폴드를 통해서와 같이, 제1 단백질성 분자에 공유 커플링시키는 것이, 제1 단백질성 분자내에 공유 커플링된 사포닌의 영향 하에, 제2 및 제3 단백질성 분자에 의해 포함된 독소와 같은 이펙터 모이어티에 의해 가해지는 개선된 세포 독성을 초래한다는 것을 본 명세서에 개시한다.
일 구현은 스킴 I에서 구조 A의 사포닌의 표시된 구조적 특징 중 하나 또는 몇몇 또는 모두를 포함하는 사포닌을 포함하는 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 구조 A의 사포닌은, 엔도솜 탈출 증진 활성이 제1 단백질성 분자와 접촉되는 세포의 엔도솜내에 존재하는 이펙터 모이어티, 및/또는 스킴 I에서 추가의 사포닌들 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 사포닌 쪽으로 향한 경우에 '이상적' 구조를 갖는 사포닌으로 언급된다.
스킴 I
Figure pct00018
스킴 I(계속)
Figure pct00019
스킴 I(계속)
Figure pct00020
Figure pct00021
스킴 I(계속)
Figure pct00022
스킴 I(계속)
Figure pct00023
본 발명에 따라, 본 발명의 제2 또는 제3 단백질성 분자에 결합된 이펙터 분자의 엔도솜 탈출을 증진시키는 목적을 위해 '이상적인' 구조를 갖는, 본 발명의 제1 단백질성 분자에 결합된, 본 발명에 따른 사포닌과 같은 글리코시드는 스킴 I의 구조 A에 따른 비스데스모시딕 사포닌이고, 이는 적어도 1.500달톤의 분자량을 가지며, 그리고 C-23 위치에 알데히드기를 함유하는 올레아난-유형 트리테르펜을 포함하며, 그리고 선택적으로 제1 분지형 카보하이드레이트 측쇄가 선택적으로 글루쿠론산을 함유하는 C-3 위치에 제1 분지형 카보하이드레이트 측쇄와 함께, C-16 위치에 히드록실기를 포함하는 비스데스모시딕 사포닌이며, 여기서 사포닌은 제2 분지형 카보하이드레이트쇄가 바람직하게 적어도 4개의 카보하이드레이트 유닛을 포함하는 C-28 위치에 제2 분지형 카보하이드레이트 측쇄를 갖는 에스테르기를 함유하며, 선택적으로 2개의 아세틸 잔기와 같은 적어도 하나의 아세틸 잔기를 함유하며, 그리고/또는 선택적으로 데옥시 카보하이드레이트를 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 퀴노보스(quinovose)를 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 글루코오스를 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 4-메톡시신남산을 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노산을 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 에스테르 결합을 통해 카보하이드레이트에 결합된 5-O-[5-O-Rha-(1
Figure pct00024
2)-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노산을 포함한다.
SO1861은 퀴노보스에 단지 하나의 아세틸 잔기를 가지며, 그리고 부가적인 자일로오스를 갖는 점에서만 스킴 I, 구조 A에 나타낸 "이상적인 구조(ideal structure)"와 상이하다. 이펙터 분자 또는 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 증진시키기 위한 사포닌의 '이상적인 구조'는 바람직하게는 스킴 I의 구조 A를 갖는 사포닌이고, 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타내는 사포닌들은 스킴 I의 구조 A에 표시된 구조적 특징들 중 하나 이상을 갖는다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 스킴 I의 구조 A가 엔도솜 탈출 증진 활성을 위한 "이상적인 사포닌" (및 최소 요건 사포닌이 아님)을 나타내는 것으로 믿으며, 이는 모든 구조(화학 기)가 세포질내의 이펙터 모이어티의 축적을 촉진시키기 위해 적어도 충분한 엔도솜 탈출 증진 활성을 갖는 각각의 사포닌에 존재할 수 있거나 존재해야만 한다는 것을 의미하는 것은 아니며, 이는 일부 사포닌들이 아실쇄와 같은 다른 구조 엘리먼트를 가질 수 있으며, 그리고/또는 다른 사포닌들은 여전히 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타내며, 당은 스킴 I에 표시된 당과 상이할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, QS-21 사포닌 및 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponins; Quil-A)의 수용성 분획 중의 사포닌들의 일부는 스킴 I에서 구조 A의 이상적인 구조가 고려될 경우에 C-28에서 카보하이드레이트 변형에 있어서 상이하다: 예를 들어 QS-21에서 아실쇄의 존재. 퀼라자 사포나리아의 수용성 분획 중의, QS-7, QS1862와 같은 사포닌들은 이상적인 구조 A와 유사하며, SO1861과 유사하다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 링커는 절단 불가능한 링커 또는 절단 가능한 링커이고, 여기서 절단 가능한 링커는 예를 들어 산성 조건, 환원성 조건, 효소 조건 또는 광-유도 조건 하에서 절단이 이루어지며, 바람직하게 절단 가능한 링커는 사포닌에 결합될 경우 산성 조건 하에서 절단이 이루어지도록 히드라존 결합 또는 히드라지드 결합을 포함하며, 그리고/또는 예를 들어 카텝신(Cathepsin) B에 의한 단백질분해와 같이 단백질분해에 민감한 결합을 포함하며, 그리고/또는 사포닌에 결합될 경우 이황화 결합과 같이 환원성 조건 하에서 절단에 민감한 결합이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 절단 가능한 링커는, 절단가능한 링커가 사포닌에 결합될 경우, 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포의 엔도솜 및/또는 리소좀에 존재하는 하는 산성 조건 하에서, 바람직하게는 pH 4.0 내지 6.5, 보다 바람직하게는 pH ≤ 5.5에서의 산성 조건 하에서 생체내에서 절단을 받는다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 올리고머 또는 중합체 스캐폴드는 중합체 또는 올리고머 구조를 포함하고, 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 스캐폴드의 공유 커플링을 위한 화학기를 포함한다.
본 발명에 따르면, 전형적으로 사포닌은 표 A1, 스킴 I에 열거된 사포닌이다. 이는 예를 들어, 사포닌이 히드라존 결합, 및/또는 히드라지드 결합, 및/또는 이황화 결합과 관련된 제1 단백질성 분자에 공유 커플링될 경우에, 세포내로의 진입 및 제2 또는 제3 단백질성 분자에 공유 커플링된 이펙터 모이어티의 세포질 내부에의 축적이 고려될 경우, 세포 내부의 엔도솜 탈출 증진 활성과 같은 사포닌의 활성에 유익한 것으로 입증되었다. 이러한 결합 유형은 인간 세포와 같은 포유동물 세포의 (후기) 엔도솜 및 리소좀 내부의 산성 조건 하에서, 및/또는 환원성 조건 하에서 쉽게 절단된다. 대안적으로, 본 발명자들은 또한, 예를 들어, (후기) 엔도솜, 리소좀, 세포질과 같은 세포 내부의 생리학적 조건 하에서 쉽게 절단될 수 없는 결합을 통해 제1 단백질성 분자에 대한 사포닌의 공유 커플링이 또한 예를 들어, 핵산(예, BNA 침묵 HSP27)과 같은 이펙터 모이어티 및 사포린과 같은 단백질성 독소의 생물학적 효과에 대한 사포닌의 강화 활성에 유익하다는 것을 입증한다. 청구범위를 포함하는 출원서 전체에 걸쳐, 예를 들어, 링커를 통해 및/또는 히드라존 결합 또는 이황화 결합을 통한 스캐폴드를 통해 제1 단백질성 분자에 커플링된 사포닌을 갖는 스캐폴드를 선택적으로 포함하는 제1 단백질성 분자와 같은 본 발명의 접합체가 언급될 경우에, (후기) 엔도솜 및/또는 리소좀내의 이러한 결합 또는 링커의 절단 상황에서와 같이, 용어 '절단 가능한 링커', '절단 가능한 결합' 등은 또한 '불안정한 링커(labile linker)'('L') 및 '불안정한 결합(labile bond)'으로 지칭된다. 예를 들어, 도 6 및 도 7은 마우스에서 인간 종양의 생체내 HSP27 유전자 침묵을 보여준다. 종양-함유 마우스는 본 발명에 따른 불안정한 링커(히드라존 결합)를 통해 결합된 사포닌을 갖는 모노클로날 항체로 구성된 제1 단백질성 분자로 처리되었으며, 반면에 제3 단백질성 분자는 이황화 결합을 통해 모노클로날 항체(제1 모노클로날 항체와 동일한 유형)에 공유 커플링된 종양 세포에서 HSP27 유전자를 침묵시키기 위한 결합된 안티센스 BNA 를 포함하였다. 즉, 어느 이론에 얽매이지 않고, 히드라존 결합 및 이황화 결합은, 본 발명의 치료 조합물이 예를 들어 엔도사이토시스에 의해 내재화되면, 세포 표면에서 표적 세포 표면 분자, 여기서는 EGFR 상에서 에피토프를 발현하는 표적화된 종양 세포의 (후기)엔도솜 및/또는 리소좀에서 절단된다. 상기 결합의 절단은 엔도솜 및/또는 리소좀으로부터의 BNA가 세포질내로 진입하는 것이 고려될 경우, 사포닌의 엔도솜 탈출 증진 활성에 기여할 가능성이 있지만, 이러한 절단은 본 발명의 세툭시맙-S01861 접합체 및 세툭시맙-BNA 접합체의 조합의 유전자 침묵 효과를 관찰하기에 필수적인 것은 아니다.
당업자는 3작용성 링커가 1개, 2개 또는 3개의 사포닌 모이어티를 공유 커플링하는데 적합한 본 발명의 스캐폴드임을 이해할 것이다. 1개 또는 2개의 사포닌 모이어티의 3작용성 링커 공유 커플링이 바람직하다. 제2 및/또는 제3 결합 부위는 예를 들어 제1 단백질성 분자와 같은 단백질성 리간드를 공유 커플링하는데 적합하다. 전형적인 단백질성 리간드는 세포 표면에서 EGFR을 발현하는 (종양)세포를 표적하기 위한 EGF, 및 종양 세포 또는 자가면역 세포를 표적하기 위한 사이토카인이다. 또한, 3작용성 링커의 제2 또는 제3 결합 부위는 모노클로날 항체, 즉, 종양 세포 표면 분자, 바람직하게 종양세포 특이적 분자, 보다 바람직하게 종양세포의 표면에서 특이적으로 (과-)발현되는 종양세포 수용체와 같은 세포 표면 분자에 결합하기 위한 제1 단백질성 분자와 같은 면역글로불린의 공유 커플링에 적합하다. 유사하게, 면역글로불린, 또는 면역글로불린의 결합 특이성을 포함하는 임의의 단편(들) 및/또는 이의 도메인(들)은 자가면역 세포의 표면에서 발현되는 수용체와 같은 세포 표면 분자에 결합하는데 적합하다. 따라서, 일 구현에서, 제1 단백질성 분자는 3작용성 링커를 포함하며, 상기 링커는 QS-21, SO1861와 같은 공유 결합된 사포닌, 및 종양세포, 자가면역 세포, 병든 세포, 이상 세포, 건강하지 않은 세포, B 세포 질환에 대한 (특이적) 결합을 위한 리간드 또는 항체와 같은 세포 표적 모이어티와 같은 공유 결합된 결합 부위를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현은 스킴 II에 따라, 스캐폴드 코어 구조체로서 올리고머 3작용성 링커를 포함하는 본 발명의 제1 단백질성 분자이다:
Figure pct00025
스킴식 II,
여기서, 사포닌은 불안정한, 절단 가능한 히드라존 링커(산 민감성)를 통해 및/또는 결합을 포함하는 말레이미드를 통해 3작용성 링커 스캐폴드에 공유 결합되어 있는 반면, 항체와 같은 결합 부위에 대한 스캐폴드의 결합은 불안정한, 절단 가능한 히드라존 링커(산 민감성)를 통해 및/또는 1, 2, 3 또는 4개의 시스테인과 같은 결합 부위에서 시스테인과의 결합을 포함하는 말레이미드를 통해 확립되어, 이와 함께 구조 B를 형성한다:
Figure pct00026
구조 B,
1-4 스캐폴드가 예를 들어 모노클로날 항체와 같은 단일의 항체에 공유 결합된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 글리코시드 분자는 사포닌이고, 사포닌과 제1 단백질성 분자 사이의 결합은 바람직하게는 pH 7.4에서 안정한 산-불안정성 결합을 통해 일어나며, 바람직하게 pH 6.5 미만, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 내지 5.08 사이에서 사포닌을 방출한다. 이는, 예를 들어,사포닌과 제1 단백질성 분자를 연결하는 링커의 아미노기 및 사포닌의 알데히드기에 의해 형성된 이민을 통해 실현된다. pH-조건을 충족시키는 다른 화학적 결합은 또한 알데히드 커플링, 예를 들어, 상기 링커의 작용기로서 히드라지드 및 히드록실기를 각각 필요로 하는 특정 히드라존 또는 아세탈에 대해 사용될 수 있다. 결합이 절단 가능한 결합인 경우, 사포닌은 바람직하게는 알데히드 작용기를 통해 또는 사포닌의 카르복실기 중 하나를 통해, 더욱 바람직하게는 알데히드 작용기, 바람직하게는 위치 23에서 알데히드 작용기를 통해 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조에 부착된다. 대안적으로, 사포닌은 바람직하게는 글리코시드 분자, 즉 사포닌의 알데히드 작용기를 통해 또는 카르복실산 작용기를 통해 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조를 연결하는 링커를 통해 스캐폴드의 중합체 또는 올리고먼 구조를 통해 제1 단백질성 분자에 부착된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 안정한 결합을 통해 제1 단백질성 분자에 결합된다. 더욱 바람직한 구현에서, 사포닌 제1 단백질성 분자 사이의 안정한 결합은 바람직하게는 아미드 커플링 또는 아민 형성을 통해 일어난다. 이는 예를 들어 사포닌 및 제1 단백질성 분자를 함께 연결하는 중합체 또는 올리고머 스캐폴드 구조의 아미노기에 의한 카르보디이미드 매개 아미드 결합 형성, 및 사포닌의 활성화된 글루쿠론산기를 통해 실현된다. 안정한 결합 정의를 충족시키는 화학적 결합은 또한 스캐폴드 또는 링커의 중합체 또는 올리고머 구조의 작용기로서 일차 아미노기를 필요로 하는 환원성 아민화 후 유도된 특정 아민과 같은 알데히드 커플링을 위해 사용될 수 있다. 결합이 안정한 결합인 경우, 사포닌은 바람직하게는 사포닌의 카르복실기, 제1 단백질성 분자에 추가 결합된 링커 또는 스캐폴드 중 하나를 통해 링커 또는 스캐폴드에 부착된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 사포닌은 본 발명에 따른 스캐폴드를 통해 결합 부위에 커플링되고, 여기서 결합 부위에 대한 스캐폴드의 공유 커플링을 위한 화학기는 클릭 화학기(click chemistry group)이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 사포닌은 본 발명에 따른 스캐폴드를 통해 결합 부위에 커플링되며, 여기서 클릭 화학기는 테트라진, 아지드, 알켄 또는 알킨, 또는 이들 기들 중 어느 사이클릭 유도체, 바람직하게는 아지드이다. 클릭 화학기는 클릭 화학에 적합한 기능적 화학기이며, 클릭 화학은 모듈식이며, 범위가 넓은 반응으로서 매우 높은 수율을 제공하며, 해롭지 않은 부산물만을 생성하며, 고 선택성을 제공하며, 다른 작용기들에 비해 높은 용인성을 제공하며, 입체특이적인 반응으로 정의된다. 요구되는 프로세스 특성은 간단한 반응 조건, 용이하게 이용가능한 출발 물질 및 시약을 포함하며, 용매 또는 양성(물 등)인 용매를 사용하지 않거나 쉽게 제거될 수 있고, 간단한 제품 분리를 포함한다. 선택적으로 스캐폴드 또는 링커를 통해 제1 단백질성 분자내의 결합 부위에 사포닌을 커플링하는 클릭 화학기는 바람직하게는 테트라진, 아지드, 알켄 또는 알킨, 또는 이들의 반응성 유도체, 예컨대 메틸-테트라진 또는 말레이미드(알켄), 더욱 바람직하게는 알킨, 또는 이들 기의 사이클릭 유도체, 예컨대 사이클로옥타인(예를 들어, 아자-디벤조사이클로옥타인, 디플루오로시클로옥타인, 바이사이클로[6.1.0]비-4-인, 디벤조사이클로옥신)이다.
따라서, 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자는 적어도 하나의 사포닌을 포함한다. 이러한 맥락에서 "적어도 하나"는, 제1 단백질성 분자가 하나의 사포닌 분자를 포함하지만, 사포닌의 커플링(예를 들어, 2, 3 또는 4) 또는 다중의(예를 들어, 10, 20 또는 100) 사포닌을 포함할 수도 있다는 것을 의미한다. 용도에 따라, 제1 단백질성 분자는 공유 결합된 사포닌을 갖는 공유 결합된 스캐폴드를 포함할 수 있으며, 여기서 스캐폴드는 정의된 수의 사포닌을 포함하도록 설계될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자는 난수보다는 한정된 수 또는 범위의 사포닌을 포함한다. 이는 특히 마케팅 인가(marketing authorization)와 관련하여 약물 개발에 유리하다. 이와 관련하여 정의된 수는 제1 단백질성 분자가 이전에 정의된 수의 사포닌을 포함하는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어 부착시키기 위한 사포닌(들)에 대한 특정 수의 가능한 모이어티를 갖는 중합체 구조를 포함하는 스캐폴드를 설계함으로써 달성된다. 이상적인 환경하에서, 이들 모이어티들 모두는 사포닌 및 스캐폴드에 커플링되며, 이는 이전에 정의된 수의 사포닌을 포함한다. 예를 들어, 2개, 4개, 8개, 16개, 32개, 64개 등의 사포닌을 포함하는 스캐폴드의 표준 세트를 제공하여 최적의 수가 사용자의 필요에 따라 사용자에 의해 용이하게 시험될 수 있도록 하는 것이 예상된다. 일 구현은 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 사포닌은 예를 들어 중합체 구조에 존재하는 모든 부분이 사포닌과 결합하지는 않은 비-이상적인 환경하에서, 정의된 범위로 존재한다. 이러한 범위는 예를 들어 스캐폴드 당 2-4 사포닌 분자, 스캐폴드 당 3-6 사포닌 분자, 스캐폴드 당 4-8 사포닌 분자, 스캐폴드 당 6-8 사포닌 분자, 스캐폴드 당 6-12 사포닌 분자 등일 수 있다. 이러한 경우, 본 발명에 따른 스캐폴드를 포함하는 제1 단백질성 분자는 이에 따라 상기 범위가 2-4로 정의되는 경우 2, 3 또는 4 사포닌을 포함한다.
스캐폴드(scaffold)는 근본적으로 스캐폴드에 공유결합된 사포닌의 유형과 독립적이며, 스캐폴드는 제1 단백질성 분자에 후속적으로(순차적인 순서로) 공유 커플링되어 있다. 따라서, 스캐폴드를 포함하는 제1 단백질성 분자는 새로운 플랫폼 기술에 대한 베이시스 산물이다. 적어도 하나의 공유 결합된 사포닌은 제2 단백질성 분자에 결합된 이펙터 모이어티의 세포내 전달을 매개하기 때문에, 본 발명에 따른 스캐폴드 기술은 사포닌에 의한 제어된 세포내 이펙터 모이어티 전달을 매개하는 것으로 알려진 첫번째 시스템이다. 스캐폴드는 사포닌(들)에 결합될 수 있으며 그리고 단일의 정의된 위치에서 예를 들어 리간드, 항체 등과 같은 제1 단백질성 분자에 의해 포함된 결합 부위에 결합될 수 있는 최적화되고 기능적으로 활성적인 유닛을 제공한다.
일 구현은 본 발명에 따른 스캐폴드를 포함하는 제1 단백질성 분자로서, 여기서 중합체 또는 올리고머 구조의 단량체의 수는 정확히 정의된 수 또는 범위이다. 바람직하게는, 중합체 또는 올리고머 구조는 예를 들어, 폴리에틸렌이민 및 폴리(아미도아민)과 같은 폴리(아민)과 같은 구조, 또는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락티드), 폴리(락탐), 폴리락티드-코-글리콜라이드 코중합체와 같은 폴리(에스테르), 폴리(덱스트린), 또는 펩티드 또는 단백질과 같은 구조, 또는 예를 들어, 폴리-리신, DNA 중합체, 안정화된 RNA 중합체 또는 선형, 분지형 또는 고리형 중합체, 올리고머, 덴드리머, 덴드론, 덴드론화 중합체, 덴드론화 올리고머 또는 이러한 구조의 어셈블리를 나타내거나, 순수 또는 혼합된 PNA(펩티드 핵산) 중합체와 같은 천연 및/또는 인공 폴리아미노산과 같은 구조를 포함한다. 바람직하게, 중합체 또는 올리고머 구조는 생체적합성(biocompatible)이며, 여기서 생체적합성이란 중합체 또는 올리고머 구조가 유기체에서 실질적인 급성 또는 만성 독성을 나타내지 않으며, 그대로 배설되거나 또는 신체 대사에 의해 완전히 분해되어 배설될 수 있거나 그리고/또는 생리학적 화합물로 분해될 수 있는 것을 의미한다. 어셈블리는 공유 가교결합 또는 비공유 결합 및/또는 인력에 의해 형성될 수 있다. 따라서, 이들은 또한 나노겔, 마이크로겔 또는 하이드로겔을 형성할 수 있거나, 또는 이들은 콜레스테롤 및/또는 인지질을 포함하는 무기 나노입자, 콜로이드, 리포좀, 미셀 또는 입자-유사 구조와 같은 캐리어에 부착될 수 있다. 상기 중합체 또는 올리고머 구조는 바람직하게는 글리코시드 분자 (및/또는 이펙터 분자 및/또는 리간드, 모노클로날 항체 또는 이의 단편과 같은 캐리어 분자)의 커플링을 위한 정확히 정의된 수 또는 범위의 커플링 모이어티를 보유한다. 중합체 또는 올리고머 구조내에 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 정확하게 정의된 수 또는 범위의 커플링 모이어티가 본 발명에 따른 스캐폴드에서 글리코시드 분자에 의해 차지된다.
바람직하게, 덴드론은 포컬 포인트(focal point)라 불리는 가지의 원점에서 단일 화학적으로 어드레스가능한 기를 갖는 분지형의, 명확하게 정의된 가지-성(tree-like) 중합체이다. 덴드리머는 포컬 포인트에서의 2개 이상의 덴드론이 연결된 것이다. 덴드론화 중합체는 중합체에 하나 이상의 덴드론의 포컬 포인트가 연결된 것이다. 바람직한 구현에서, 본 발명에 따른 스캐폴드가 제공되며, 중합체 또는 올리고머 구조는 선형, 분지형 또는 시클릭 중합체, 올리고머, 덴드리머, 덴드론, 덴드론화 중합체, 덴드론화 올리고머 또는 순수 또는 혼합으로 이들 구조의 어셈블리를 포함하며, 여기서 어셈블리는 공유 가교결합 또는 비공유 인력에 의해 구축될 수 있고, 나노겔, 마이크로겔 또는 하이드로겔을 형성할 수 있고, 그리고 여기서, 바람직하게, 중합체는 예를 들어, 폴리에틸렌이민 및 폴리(아미도아민)과 같은 폴리(아민)의 유도체, 및 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락티드), 폴리(락탐), 폴리락티드-코-글리콜라이드 코중합체와 같은 폴리(에스테르), 및 폴리(덱스트린)과 같은 구조, 및 폴리-리신, 또는 펩티드 또는 단백질 또는 DNA 중합체, 안정화된 RNA 중합체 또는 PNA(펩티드 핵산) 중합체와 같은 천연 및/또는 인공 폴리아미노산과 같은 구조이다. 바람직하게, 중합체 또는 올리고머 구조는 생체적합성(biocompatible)이다.
일 구현은 본 발명의 치료 조합물 또는 본 발명에 따른 용도를 위한 치료 조합물로서, 여기서 제1 단백질성 분자는 하나 이상의 공유 결합된 사포닌, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64, 128 또는 1-100 사포닌, 또는 7, 9, 12 사포닌과 같은 이들 사이의 어느 수의 사포닌을 포함한다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 본 발명에 따른 적어도 하나의 절단 가능한 링커를 통해 올리고머 또는 중합체 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조에 공유 결합된다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 대한 올리고머 또는 중합체 스캐폴드의 공유 커플링을 위한, 올리고머 또는 중합체 스캐폴드의 화학기는 클릭 화학기이고, 바람직하게는 테트라진, 아지드, 알켄 또는 알킨, 또는 이들 기의 사이클릭 유도체로부터 선택되고, 보다 바람직하게 상기 화학기는가 아지드이다.
일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자로서, 여기서 올리고머 또는 중합체 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조는 선형, 분지형 및/또는 시클릭 중합체, 올리고머, 덴드리머, 덴드론, 덴드론화 중합체, 덴드론화 올리고머, DNA, 폴리펩티드, 폴리-리신, 폴리-에틸렌 글리콜, 또는 이들 중합체 또는 올리고머 구조의 어셈블리를 포함하며, 이 어셈블리는 바람직하게는 공유 가교에 의해 형성된다.
본 발명자들은 본 명세서에서 상기 어느 구현에 따른, 제1 단백질성 분자에 대한 사포닌의, 바람직하게는 절단 가능한 결합 또는 링커를 통한, 공유 커플링이 제2 및 제3 단백질성 분자에 결합된 이펙터 모이어티의 활성의 효율적이고 세포-표적화된 강화작용을 제공하며, 여기서 제1 및 제3 단백질성 분자는 동일한 제1 결합 부위를 포함하고, 그리고 여기서 제1 및 제2 단백질성 분자는 상이한 제1 및 제2 결합 부위를 포함한다. 모노클로날 항체와 같은 제1 단백질성 분자의 시스테인 측쇄 또는 리신 측쇄에 사포닌을 직접적으로 또는 링커를 통해 커플링하는 것은, 제1 및 제2 단백질성 분자가 고려되는 경우, 제3 단백질성 분자가 고려되고 각각 상이한 제1 및 제2 결합 부위를 포함하는 경우, 또한 이펙터 모이어티가 제1 단백질성 분자와 동일한 제1 결합 부위를 포함하는 제2 및/또는 제3 단백질성 분자를 사용하여 동일한 표적 세포로 전달되는 경우에, 표적 세포내에서 이펙터-모이어티 강화작용 활성의 특이적이고 효율적인 전달의 유익한 방법인 것으로 입증되었다.
본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해, (임의의 이론에 의해 한정되는 것을 본 발명자들이 바라지 않음에도 불구하고) 물질의 세포 흡수의 프로세스 및 본 발명의 사용된 용어가 기술된다. 소포(vesicle) 버딩에 의한 세포내로의 세포외 물질의 흡수는 엔도사이토시스(endocytosis)라고 불린다. 상기 소포 버딩은 (1) 세포질 단백질 클라트린(clathrin)에 의해 매개되는 수용체 의존성 리간드 흡수, (2) 콜레스테롤 결합 단백질 카베올린(caveolin)에 의해 매개된 리피드-라프트(lipid-raft) 흡수, (3) 비특이적 유체 흡수(피노사이토시스), 또는 (4) 비특이적 입자 흡수(파고사이토시스)에 의해 특징지워질 수 있다. 소포 수송 및 물질 선별의 다음 세포 프로세스들로의 모든 유형의 엔도사이토시스는 엔도사이토시스 경로라 불린다. 엔도사이토시스 경로는 복잡하고 완전히 이해되지 않는다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 소기관(organelle)은 데노보(de novo)로 형성될 수 있고, 엔도사이토시스 경로를 따라 다음 소기관으로 성숙될 수 있다. 그러나, 이제는 엔도사이토시스 경로가 소포성 트래픽에 의해 연결된 안정한 구획을 포함하는 것으로 가정된다. 구획(compartment)은 세포에 대한 필수 기능의 특정 세트에 특화된 복합, 다기능 막 소기관(organolle)이다. 소포는 과도적인 소기관(transient organelle)인 것으로 간주되고, 조성이 더 간단하고, 기존의 구획으로부터 버딩에 의해 데노보(de novo)를 형성하는 막-밀폐된 컨테이너로서 정의된다. 구획과 대조적으로, 소포는 생리적으로 비가역적인 일련의 생화학적 변화인 성숙을 겪을 수 있다. 초기 엔도솜 및 후기 엔도솜(late endosomes)은 엔도사이토시스 경로에서 안정한 구획을 나타내지만, 일차 엔도사이토시스 소포, 파고솜(phagosomes), 다소포체(multivesicular body)(또한 엔도솜 캐리어 소포(endosome carrier vesicles)라고도 함), 분비 그래뉼(secretory granules), 및 심지어 리소좀(solesomes)은 소포를 나타낸다. 클라트린-코팅된 피트(clathrin-coated pits)로부터 가장 두드러지게, 플라즈마막에서 발생하는 엔도사이토시스 소포는 초기 엔도솜과 일차 융합되며, 이는 약 pH 6.5의 주요 분류 구획이다. 내재화된 카르고(cargo) 및 막의 대부분은 재순환 소포(재순환 경로)를 통해 원형질막으로 다시 재순환된다. 분해되어야 하는 성분들은 다소포체(multivesicular body)를 통해 산성 후기 엔도솜(6 보다 낮은 pH)으로 수송된다. 리소좀은 성숙한 리소좀 효소를 저장할 수 있고, 필요한 경우 이들을 후기 엔도솜 구획에 전달할 수 있는 소포이다. 그 결과 형성된 소기관은 하이브리드 소기관 또는 엔도리소좀으로 불린다. 리소좀은 리소좀 재형성이라고 하는 프로세스에서 하이브리드 소기관을 버드 오프(bud off)시킨다. 후기 엔도솜, 리소좀 및 하이브리드 소기관은 매우 동역학적 소기관이며, 그들 사이의 구별은 종종 어렵다. 세포내 이입된(endocytosed) 분자의 분해는 엔도리소좀 또는 리소좀 내부에서 일어난다. 엔도솜 탈출은 엔도사이토시스 경로로부터, 바람직하게는 클라트린-매개 엔도사이토시스로부터, 또는 세포질로의 재순환 경로로부터, 어느 종류의 구획 또는 소포의 내부강(inner lumen)으로부터의 물질의 적극적 또는 수동적 방출이이다. 따라서, 엔도솜 탈출은 이들의 중간체 및 하이브리드 소기관을 포함하는 엔도솜, 엔도리소좀(endolysosomes)또는 리소좀으로부터의 방출을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 특히 본 발명의 사포닌과 같은 글리코시드 분자의 엔도솜 탈출 메커니즘에 관한 경우, 본 명세서에 단어 "엔도솜" 또는 "엔도솜 탈출"이 사용될 때마다, 이는 또한 엔도리소좀 및 리소좀, 그리고 각각 엔도리소좀 및 리소좀으로부터의 탈출을 포함한다. 세포질에 진입 후, 상기 물질은 핵과 같은 다른 세포 유닛으로 이동할 수 있다.
정식 용어에 있어서, 글리코시드는 당기가 이의 아노머(anomeric) 탄소를 통해 다른 기에 글리코시드 결합을 통해 결합된 임의의 분자이다. 본 발명의 맥락에서, 사포닌과 같은 글리코시드 분자는, 임의의 이론에 얽매이지 않고, 특히 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 용이하게 함으로써, 이펙터 모이어티의 효과를 향상시킬 수 있는 그러한 분자이다. 임의의 이론에 의해 얽매이지 않고, 글리코시드 분자들(표 A1에 열거된 것들과 같은 사포닌들)은 엔도사이토시스 및 재순환 경로의 구획 및 소포의 막과 상호작용하고, 이들을 상기 이펙터 모이어티에 대해 누출되도록 하여, 증가된 엔도솜 탈출을 초래한다. 용어 "스캐폴드는 엔도솜 탈출을 증가시킬 수 있다"는 것은 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조에 커플링된 적어도 하나의 사포닌(글리코시드 분자)이, 두 분자 모두 예를 들어 후기 엔도솜과 같은 엔도솜내에 있는 경우, 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 증가시킬 수 있으며, 선택적으로 그리고 바람직하게 사포닌과 같은 적어도 하나의 글리코시드가 상기 제1 단백질성 분자에 의해 포함된 링커 또는 중합체 또는 올리고머 분자로부터와 같이, 예를 들어, 적어도 하나의 글리코시드(사포닌)와 제1 단백질성 분자 사이의 절단 가능한 결합의 절단에 의해(예를 들어, 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조를 통해 및/또는 링커를 통해) 제1 단백질성 분자로부터 방출된 후에, 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 사포닌과 같은 적어도 하나의 글리코시드와 제1 단백질성 분자 사이의 결합, 선택적으로 링커 또는 스캐폴드를 통한, 결합은 "안정한 결합'일 수 있으며, 이는 예를 들어 효소들에 의해 엔도솜에서 이러한 결합이 절단될 수 없다는 것을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, 글리코시드 또는 사포닌, 선택적으로 링커 또는 스캐폴드의 올리고머 또는 중합체 구조의 일부와 함께 글리코시드 또는 사포닌은 남아있는 링커 단편 또는 올리고머 또는 중합체 구조로부터 절단될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제는 (단백질성) 링커 또는 단백질성 중합체 구조, 예를 들어 알부민을 절단하고, 이에 의해 적어도 하나의 글리코시드, 사포닌을 방출시킬 수 있다. 그러나, 글리코시드 분자 (바람직하게는 사포닌)는 활성 형태로 방출되며, 바람직하게는 선택적으로 링커 및/또는 올리고머 또는 중합체 스캐폴드를 통해 제1 단백질성 분자에 커플링되어 있기(결합되도록 제조되기) 전에, 가지고 있었던 원래 형태로 방출되며; 따라서, 글리코시드(사포닌)는 이러한 절단 후에 그의 본래 구조를 가지거나, 또는 글리코시드(사포닌)는 이러한 절단 후, 이에 결합된 화학기 또는 링커(의 일부)를 가지며, 반면에 동일한 엔도솜 또는 리소좀에 존재하는 이펙터 모이어티에 대한 엔도솜/리소좀 탈출 증강 활성은, 글리코시드(사포닌)과 캐리어 분자, 즉, 제1 단백질성 분자, 선택적으로 본 발명의 링커 및/또는 스캐폴드를 포함하는 제1 단백질성 분자 사이의 결합의 상기 절단시 유지되거나 복원된다. 본 발명과 관련하여, 예를 들어 사포닌과 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기, 링커, (스캐폴드의) 중합체 또는 올리고머 구조, 리간드, (모노클로날) 면역글로불린 또는 이의 결합 도메인 또는 -단편, 및/또는 이펙터(이펙터 모이어티, 이펙터 분자) 사이의 결합과 관련된 용어 "안정한"은, 그 결합이 쉽게 깨지지 않거나 또는 적어도 예를 들어 pH 차이, 염 농도, 또는 UV-광, 환원성 조건에 의해 쉽게 깨지지 않도록 설계되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 예를 들어 사포닌과 제1 단백질성 분자, 링커, 아미노산 잔기, 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조, 리간드, 항체 및/또는 이펙터 사이의 결합과 관련하여 "절단 가능한"이란 용어는, 그 결합이 예를 들어, pH 차이, 염 농도, 환원성 조건 하에서 쉽게 파괴되도록 설계되는 것을 의미한다. 당업자는 이러한 절단 가능한 결합 및 이를 제조하는 방법을 잘 알고 있다.
본 발명 이전에 ADC 및 AOC를 시장에 도입하는 것의 주요 장애물 중 하나가 작은 치료 윈도우였다: ADC 또는 AOC의 치료 유효 투여량은 ADC를 이용한 환자의 치료에 있어서 (수용할 수 없는) 부작용, 햄퍼링(hampering) 발달 및 영향을 동반한다. 본 발명의 제1 단백질성 분자의 적용에 의해, 본 발명에 따른 BNA와 같은 올리고뉴클레오티드(즉, 본 발명의 특정 제2 또는 제3 단백질성 분자)와 접합된 페이로드를 운반하는 ADC와 함께, 또는 (모노클로날) 항체와 함께, 하나 또는 다수의 글리코시드 분자(사포닌)를 (표적) 세포로 안내하는 것이 이제 가능하게 되었다. 특히, 제2 또는 제3 단백질성 분자의 이펙터 모이어티 및 이펙터 모이어티 당 (미리 정의된, 제어 가능한) 특정 수 또는 범위의 글리코시드 분자(사포닌)를 세포, 예를 들어 세포의 엔도사이토시스 경로를 통해서와 같이 세포의 세포질로 동시에 특이적으로 안내하는 것이 이전에는 불가능하였다.
본 발명에 의해 제공되는 용액은 제1 단백질성 분자에 적어도 하나의 사포닌의 공유 결합을 포함한다. 본 발명에 의해 제공되는 추가의 용액은 (우선) 올리고머 또는 중합체 스캐폴드를 사용하여 글리코시드 분자(사포닌)를 중합하고, 공유 결합된 사포닌의 클러스터로 제1 단백질성 분자를 제공하는 단계를 포함하며, 이는 사포닌의 작용 모드가 요망되는 세포내 부위에서, 예를 들어 엔도사이토시스 후에, 하나 이상의 사포닌의 재-단량체화를 가능하게 한다. 이러한 정황에서 "중합화(polymerizes)"는 링커(linker)를 통해, 또는 직접적으로 또는 중합체 또는 올리고머 구조를 통해 제1 단백질성 분자에 사포닌 분자의 가역적 및/또는 비가역적 다중 접합하여 스캐폴드를 형성하거나, 또는 이에 의해 (변형된) 사포닌의 가역적 및/또는 비가역적 다중 접합이 중합체 또는 올리고머 구조를 형성하여 스캐폴드를 형성하는 것을 의미한다. 이러한 정황에서, "재-단량체화"는 제1 단백질성 분자로부터의 사포닌의 절단, 예를 들어, 엔도사이토시스 후에, 제1 단백질성 분자에 대해 사포닌(들)을 결합하는 링커로부터 또는 스캐폴드로부터, 사포닌의 절단, 그리고 결합되지 않은 사포닌들의 (본래의) 화학적 상태를 다시 얻는 것을 의미하며, 여기서 결합되지 않은 사포닌들은 링커, 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기 또는 스캐폴드에 사포닌을 결합시키기 위한 화학기, 및/또는 알데히드기 또는 카르복실산기와 같은 사포닌의 화학기에 결합된 (화학적) 링커와 같은 부가적인 화학기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 사포닌의 복잡한 화학에 기인하여, 예를 들어 스캐폴드 또는 다른 연결 링커에서 사포닌의 '중합' 및 예를 들어, 엔도사이토시스 후에, 세포내와 같이 원하는 위치에서, 이들의 '재-단량체화'는 도전적인 임무이었다. 특히, 링커 및 예를 들어 트리테페노이드 사포닌과 같은 제1 단백질성 분자에 공유 결합시키기 위해 공유 결합된 글리코시드를 포함하는 스캐폴드를 제공하기 위해 사용된 화학 반응(글리코시드의 중합)은 일반적으로 무수(water-free) 유기 용매에서 일어나지만, 사포닌 및 예를 들어 결합된 사포닌을 함유하기 위한 스캐폴드로서 적용된 생체적합성 중합체는 수용성 분자이다. 이펙터 분자(약물, 독소, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)가 전형적으로 충분한 결합 부위를 제공하지 못하며, 그리고 커플링 생성물은 상당히 이질적이며 그리고/또는 사포닌과 같은 생물학적으로 활성적인 분자들 및 예를 들어 펩티드, 독소, 핵산을 함께 커플링시키는 것은 이러한 사포닌-함유 접합체에 함께 결합된 하나 또는 심지어 두 분자들 모두의 활성에 영향을 주고 방해할 위험을 갖기 때문에, 자체로 중합이 더욱 금지된 변형되지 않은 사포닌, 및 이펙터 분자에 (직접적으로) 다중 사포닌들을 결합시키기 위한, 하나의 다른 가능한 용액의 화학적 특성들은 매우 유망하지 않을 것으로 추정되었다. 또한, 제2 또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함된 이펙터 잔기가, 예를 들어 ADC 또는 항체-올리고뉴클레오티드 접합체(AOC)에 사포닌이 커플링한 후에 이의 기능을 상실하는 상당한 위험이 있었다. 본 발명의 구현들은 이러한 결점들 중 적어도 하나를 해결한다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제2 단백질성 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 제 단백질성 분자 및 본 발명의 제3 단백질성 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일 구현예는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제2 단백질성 분자를 포함하는 조성물이거나, 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제3 단백질성 분자를 포함하는 조성물로서, 여기서 제2 단백질성 분자에 의해 또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되는 이펙터 모이어티는 본 발명에 따른 이펙터 모이어티들 중 어느 하나, 바람직하게는 BNA이다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 임의의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산, 바람직하게는 벡터, 유전자, 세포 자살 유도 트랜스진, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), DNA 압타머, RNA 압타머, mRNA, 미니-서클 DNA, 펩티드 핵산(PNA)), 포스포아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA)이다), 가교 핵산(BNA), 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노 핵산(FANA), 2'-0-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-O,4'-아미노에틸렌 가교 핵산, 3'-플루오로 헥시톨 핵산(FHNA), 플라스미드, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스(threose) 핵산(TNA), 또는 이의 유도체 중 적어도 하나로부터 선택된, 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산 중 어느 하나 이상, 보다 바람직하게 BNA, 예를 들어 HSP27 단백질 발현을 위한 BNA(안티센스 BNA(HSP27))를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 이펙터 분자, 또는 이펙터 모이어티는 세포내 이펙터 분자 표적과의 상호작용에 의해 세포의 대사에 영향을 미치는 어느 물질로서, 여기서 이 이펙터 분자 표적은 엔도사이토시스 및 재순환 경로의 구획 및 소포의 루멘을 제외한, 하지만 이들 구획 및 소포의 막을 포함하는 세포내 어느 분자 또는 구조이다. 따라서, 세포내 상기 구조는 핵, 미토콘드리아, 클로로플라스트(chloroplasts), 소포체, 골지체, 다른 운반 소포(transport vesicles), 플라즈마막의 내부 부분 및 세포질(cytosol)을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 이펙터 모이어티의 세포질 전달은 바람직하게는 이펙터 모이어티가 또한 엔도솜(및/또는 리소좀)을 빠져나갈 수 있고, 이는 이전에 정의된 바와 같이 엔도리소좀 및 리소좀을 탈출하는 것을 포함한다는 것을 의미하며, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 이펙터 모이어티 표적에 도달할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명은 또한, 이펙터 모이어티가 제2 또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되고, 사포닌이 제1 단백질성 분자에 의해 포함되는 경우에, 이펙터 모이어티 및 본 발명의 사포닌과 같은 적어도 하나의 글리코시드 분자 모두를 미리-정의된 비율로 동시에 엔도솜으로 가져오는 것을 제공하는 스캐폴드로 지칭되는 새로운 유형의 분자를 포함한다. 본 발명의 정황에서, 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조는 중합체, 올리고머, 덴드리머, 덴드론화된 중합체, 또는 덴드론화된 올리고머와 같은 구조적으로 정렬된 형태이거나, 또는 이는 하이드로젤, 마이크로겔, 나노겔, 안정화된 중합체 마이셀 또는 리포솜과 같은 조립된 중합체 구조이지만, 콜레스테롤/인지질 혼합물과 같은 모노머들의 비공유 어셈블리들을 포함하여 구성된 구조들을 배제한다. 용어 "중합체, 올리고머, 덴드리머, 덴드론화된 중합체, 또는 덴드론화된 올리고머"는 이들의 일반적인 의미를 갖는다. 특히, 중합체는 함께 결합된 대다수의 동일하거나 유사한 유닛으로부터 주로 또는 완전하게 형성된 분자 구조를 갖는 물질이며, 올리고머는 분자들이 비교적 적은 반복 단위로 이루어지는 중합체이다. 각각, 중합체 및 올리고머의 상기 정의에서 사용된 "다수(many)" 및 "몇몇(a few)"에 대한 하나의 특정 컷-오프(cut-off)에 대한 합의(consensus)는 없다. 그러나, 스캐폴드가 중합체 또는 올리고머 구조, 또는 둘 다를 포함할 수 있기 때문에, 함께 결합된 유사한 단위의 수의 전체 범위는 이러한 구조, 즉 2개의 단량체 단위 내지 100개의 단량체 단위, 1000개의 단량체 단위 및 보다 많은 단량체 단위로 적용된다. 예를 들어, 5 이하의 구조를 포함하는 구조가 올리고머 구조라고 불릴 수 있는 반면, 50개의 단량체 단위를 포함하는 구조는 중합체 구조라고 불릴 수 있다. 10개의 단량체 단위의 구조는 올리고머 또는 중합체라고 불릴 수 있다. 본원에 정의된 스캐폴드는 본 발명의 사포닌과 같은 적어도 하나의 글리코시드 분자를 추가로 포함한다. 스캐폴드는 바람직하게 예를 들어, 폴리에틸렌이민 및 폴리(아미도아민)과 같은 폴리- 또는 올리고(아민), 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 생체적합성 구조, 폴리(락티드), 폴리(락탐), 폴리락티드-코-글리코라이드 코중합체, 및 폴리(덱스트린)과 같은 폴리- 또는 올리고(에스테르), 시클로덱스트린 또는 폴리덱스트로즈와 같은 폴리- 또는 올리고사카라이드, 및 폴리-리신 또는 펩티드 또는 단백질과 같은 폴리- 또는 올리고아미노산, 또는 DNA 올리고- 또는 중합체와 같은 중합체 또는 올리고먼 구조를 포함한다. 본원에 정의된 바와 같은 어셈블리된 중합체 구조는 적어도 하나의 스캐폴드 및 선택적으로, 다른 개별 중합체 또는 올리고머 구조를 포함한다. 상기 어셉블리의 다른 개별 중합체 또는 올리고머 구조는 (a) 스캐폴드 (이에 따라 본 발명의 사포닌과 같은 적어도 하나의 글리코시드 분자를 포함함), (b) 작용화된 스캐폴드 (이에 따라 사포닌과 같은 적어도 하나의 글리코시드 분자 및 제1 단백질성 분자로서 리간드, 항체 등), (c) 제1 단백질성 분자로서 리간드, 항체 등이 없는 본 발명의 사포닌과 같은 글리코시드 분자가 없는 중합체 또는 올리고머 구조(예를 들어, 표 A1 참조)일 수 있다. 작용화된 어셈블리된 중합체 구조는 (a) 적어도 하나의 작용화된 스캐폴드 또는 (b) 적어도 하나의 스캐폴드 및 제1 단백질성 분자로서 적어도 하나의 리간드, 항체 등을 포함하는 적어도 하나의 중합체 구조를 함유하는 어셈블리된 중합체 구조이다. 상기 언급된 분자들 중 어느 것을 포함하지 않는(즉, 사포닌과 같은 글리코시드가 없는, 리간드, 항체와 같은 제1 단백질성 분자가 없는) 어셈블리된 중합체 구조내의 중합체 또는 올리고먼 구조는 특히 어셈블리된 구조의 구조적 성분으로서 추가되며, 이는 어셈블리된 구조("접착제-유사(glue-like)"를 형성하거나 안정화시키는데 도움을 준다. 어느 이론으로 한정하려는 것은 아니나, 산성 환경은 글리코시드(사포닌)와 이펙터 모이어티 사이의 상승 작용(synergistic action)을 위한 전제조건(prerequisite)인 것으로 보인다.
하나 이상의 (절단가능한) 링커 및/또는 선택적으로 스캐폴드를 추가로 포함하거나 포함하지 않더라도, 산성 환경을 방해할 수 있고, 적어도 하나의 글리코시드(사포닌)의 엔도솜 탈출 기능을 저해할 수 있는 사포닌을 포함하는 제1 단백질성 분자가 실시예 3에 기재된 바와 같은 그리고 당해 기술분야에 알려진 바와 같은 어세이로 쉽게 검출될 수 있다. 저해는 "유도된 50% 세포 사멸에 필요한 글리코시드의 배량 증가(fold amount increases of glycoside necessary to induced 50% cell killing)"로서 기술된다. 스캐폴드(scaffold)는 적어도 양성 대조군으로서 클로로퀸(Chloroquine)을 사용할 경우 관찰되는 50% 세포 사멸을 얻는데 필요한 글리코시드 분자(사포닌)의 증가인 증가를 유도하지 않는 것이 바람직하다. 대안적으로, 그리고 바람직하게는, 하나 이상의 (절단 가능한) 링커 및/또는 선택적으로 스캐폴드를 포함하거나 포함하지 않는 사포닌을 포함하는 제1 단백질성 분자는 50% 세포 사멸을 유도하는데 글리코시드 분자의 적어도 4배 이상의 증가를 일으키지 않으며, 보다 바람직하게 적어도 2배 증가를 일으키지 않는다. 배 증가는 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같은 어세이로 측정되는 것이며, 여기서, 클로로퀸은 양성 대조군으로서, 50% 세포 사멸을 관찰하기 위한, 글리코시드 양, 바람직하게 사포닌 양에 있어서 2배 증가를 유도하며, 여기서 사포닌은 본 발명의 사포닌들(표 A1, 스킴 I, 이전 구현들 참조) 중 어느 하나 이상이다.
"이펙터 모이어틴의 효과를 개선 또는 향상시키는 것(improving or enhancing an effect of an effector moiety)"이란, 글리코시드 분자, 바람직하게는 본 발명의 사포닌이 이펙터 모이어티의 기능적 효능(예를 들어, 독소 또는 약물 또는 BNA와 같은 올리고뉴클레오티드의 치료 지수; 생명공학적 프로세스에서 개질제의 대사 효과; 세포 배양 연구 실험에서 유전자의 형질감염 효능)을, 바람직하게 이의 표적 인게이지먼트를 가능하게 하거나 향상시킴으로써, 증가시키는 것을 의미한다. 항원-특이적 면역 반응의 촉진, 연장, 또는 증강은 바람직하게는 포함되지 않는다. 치료 효능은 바람직하게는 더 낮은 투여량 및/또는 더 적은 부작용(side effects)으로 더 강한 치료 효과를 포함한다. "이펙터 모이어티의 효과 향상"이란 또한 효과의 부재 때문에 사용될 수 없었던 (그리고 예를 들어, 이펙터 모이어티로 알려지지 않았던) 이펙터 모이어티가 본 발명과 결합하여 사용될 경우에 효과적이게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은, 이펙터 모이어티 및 제2 또는 제3 단백질성 분자의 조합에 유익하거나 바람직하며 기여할 수 있는 어느 다른 효과는 "개선된 효과"인 것으로 간주된다. 일 구현으로, 결합된 사포닌(들)을 포함하며 그리고 제1 단백질성 분자에 의해 포함된 스캐폴드는 의도된 및/또는 원하여 지는 제2 단백질성 분자에 의해 포함된 이펙터 모이어티의 효과를 증가시킨다. 단백질성 스캐폴드에 결합된 사포닌을 포함하는 제1 단백질성 분자의 경우, 이러한 스캐폴드의 단백질성 중합체 구조는, 예를 들어 혈류내 콜로이드 삼투압에 대한 영향을 가질 수 있다. 이러한 효과가 제1 단백질성 분자에 의해 포함되는 이러한 작용화된 스캐폴드의 의도된 또는 목적하는 효과가 아니라면, 스캐폴드의 단백질성 구조는 본 발명에 정의된 바와 같은 이펙터 모이어티가 아니다. 또는, 예를 들어, 결합된 사포닌을 운반하고 제1 단백질성 분자에 의해 포함되는 DNA- 또는 RNA-기반 스캐폴드의 경우, 그 DNA 또는 RNA의 일부는 예를 들어 발현을 간섭함으로써 (의도되지 않은) 기능을 가질 수 있다. 이러한 간섭이 궁극적인 기능화된 스캐폴드의 의도된 또는 목적하는 효과가 아닌 경우, 스캐폴드의 DNA- 또는 RNA 중합체 구조는 본 발명에 정의된 바와 같은 이펙터 모이어티가 아니다.
다수의 바람직한 특징은 제1 단백질성 분자, 즉 글리코시드 또는 사포닌, 바람직하게는 본 발명에 따른 사포닌에 의해 포함된 엔도솜 탈출 증강제(endosomal escape enhancer)를 위해 제형화될 수 있다: (1) 이들은 바람직하게는 독성 및 면역 반응을 유발하지 않으며, (2) 이들은 바람직하게는 이펙터 모이어티의 세포질 흡수를 오프-타겟 세포로 매개하지 않으며, (3) 작용의 부위에서 이들의 존재는 바람직하게는 이펙터 모이어티의 존재와 동기화되며, (4) 이들은 바람직하게는 생분해성 또는 배설 가능하며, (5) 이들은 바람직하게는 엔도솜 탈출 증강제(endosomal escape enhancer)가 결합된 이펙터 분자의 생물학적 활성과 관련되지 않은 유기체의 생물학적 프로세스를 실질적으로 저해하지 않으며, 예를 들어 호르몬과 상호작용하지 않는다. 전술한 기준을 충족하는 본 발명의 사포닌과 같은 글리코시드 분자의 예는, 적어도 일부 정도로, 비스데스모시딕 트리테르펜, 바람직하게는 SO1861, SA1641, QS-21, GE1741 및 표 A1, 스킴 I의 사포닌들과 같은 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌이다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 이펙터 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 리간드-약물 접합체에 관한 것이다.
일 구현은 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 리간드-약물 접합체이며, 여기서 항체는 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린, 신데칸-1, 혈관 인테그린 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, PSMA, CanAg, 인테그린 알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, 바람직하게는 CD71, EGFR, HER2 중 어느 것에 결합할 수 있으며, 그리고/또는 세툭시맙(cetuximab), 다라투무맙(daratumumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 이노투주맙(inotuzumab), 목세투모맙(moxetumomab), 폴라투주맙(polatuzumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), IgG 유형의 OKT-9 항-CD71 모노클로날 항체, 페르투주맙(pertuzumab), 리툭시맙(rituximab), 오파투무맙(ofatumumab), 헤르셉틴(Herceptin), 알렘투주맙(alemtuzumab), 피나투주맙(pinatuzumab), OKT-10 항-CD38 모노클로날 항체, 표 A2 또는 표 A3 또는 표 A4의 항체, 바람직하게 세툭시맙(cetuximab) 또는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 OKT-9 중 어느 하나에, 또는 이들의 적어도 하나의 종양 세포 수용체 결합-단편 및/또는 이들의 적어도 하나의 종양세포 수용체 결합 도메인에 결합될 수 있으며, 그리고/또는 여기서 항체-약물 접합체는 겜투주맙, 오조가마이신, 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가마이신, 목세투모맙 및 폴라투주맙 베도틴 및 표 A2 및 표 A3의 항체-약물 접합체 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 여기서 리간드-약물 접합체는 EGF 또는 사이토카인과 같은 세포 표면 분자에 대한 결합을 위한 적어도 하나의 리간드를 포함한다.
일 구현은 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 리간드-약물 접합체로서, 여기서 이펙터 모이어티는 본 발명에 따른 이펙터 모이어티들 중 어느 하나 이상이다.
본 발명의 일 견지는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제2 단백질성 분자를 포함하거나, 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제3 단백질성 분자를 포함하거나, 또는 본 발명의 항체-약물 접합체를 포함하거나, 본 발명의 항체-올리고뉴클레오티드 접합체를 포함하거나, 본 발명의 리간드-약물 접합체를 포함하며, 그리고 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 견지는, 의약으로서 사용하기 위한, 제2 약학 조성물을 포함하거나 제3 약학 조성물을 포함하거나, 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제2 단백질성 분자를 포함하거나, 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제3 단백질성 분자를 포함하거나, 또는 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 항체-올리고뉴클리오티드 접합체 또는 리간드-약물 접합체 또는 본 발명의 약학 조성물을 포함하는, 본 발명의 치료 조합물에 관한 것이다.
본 발명의 일 견지는, 암 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제2 약학 조성물을 포함하거나 제3 약학 조성물을 포함하거나, 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제2 단백질성 분자를 포함하거나, 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자 및 본 발명의 제3 단백질성 분자를 포함하거나, 또는 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 항체-올리고뉴클리오티드 접합체 또는 리간드-약물 접합체 또는 본 발명의 약학 조성물을 포함하는, 본 발명의 치료 조합물에 관한 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자에 의해 포함된 적어도 하나의 사포닌은 본 발명에 정의된 바와 같이 적어도 현재의 그리고 새로운 이펙터 모이어티의 효능을 증가시킨다. 효능의 저하없이, 제2 또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함된 이펙터 모이어티의 투여량의 감소로 인해 잠재적인 부작용(potential side-effects)이 감소될 것이다. 따라서, 본 발명은 약제에 사용되거나 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 일 견지는 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자에 관한 것으로, 제1 단백질성 분자는 적어도 사포닌을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자를 의약 제조를 위해 사용하는 용도가 제공된다. 특히, 암 약제, 특히 고전적 화학요법 약제는 이들의 부작용에 대해 평판이 안좋은 것으로 널리 알려져 있다. 제2 또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함된 약학적으로 활성적인 물질 및 제1 단백질성 분자에 의해 포함된 사포닌 모두의 표적화 및 시간 및 위치적으로의 동기화 때문에, 제1 및 제3 단백질성 분자는 동일한 세포 표면 분자 상에 동일한 에피토프에 대한 동일한 결합 부위를 보유하거나 또는 제1 및 제2 단백질성 분자는 각각 제1 및 제2 세포 표면 분자 상에 상이한 제1 및 제2 에피토프에 대한 상이한 결합 부위를 보유하므로, 본 발명에 따른 치료 조합물은 특히 의약으로서, 특히 암 치료 방법에 사용하기에 가치가 있다. 따라서, 본 발명은 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 치료 조합물 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 후천적 또는 선천적 질환, 특히 단발성 결핍증 질환(monogenic deficiency disorders)을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 치료적 조합 또는 본 발명의 제1 단백질성 분자를 제공한다. 따라서, 상기 치료 조합물은 제1 및 제2 단백질성 분자를 포함하며 및/또는 제1 및 제3 단백질성 분자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 일 견지는 본 발명에 따른 치료 조합물에 관한 것으로, 여기서 제2 또는 제3 단백질성 분자는 암 또는 자가-면역 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 공유 결합된 이펙터 부분을 포함한다.
의약에서 본 발명의 제1, 제2 및 제3 단백질성 분자의 또 다른 적용은, 불충분한 양 또는 불충분한 기능으로 세포내 효소를 생산하는 표적 세포에서의 세포내 효소의 대체이다. 결과적으로 형성되는 질병은 선천성(유전성)이거나 후천적일 수 있다. 대부분의 경우, 단지 증상적인 치료만이 가능하고, 많은 희귀 질환에 대해, 불충분한 치료 옵션은 관련된 환자의 단축된 수명을 초래한다. 이러한 질병에 대한 예는 페닐케토우리아(phenylketonuria)이며, 이는 아미노산 페닐알라닌의 대사(metabolism)를 감소시키는 선천적인 대사 장애이다. 이 질병은 간 효소 페닐알라닌 히드록실라아제에 대한 유전자의 돌연변이에 의해 특징지어진다. 페닐케토우리아(phenylketonuria)는 현재까지 치료 불가능하다. 그 발병률은 약 1:10,000으로, 터키에서 1:2,600의 가장 높은 발병률이 알려져 있다. 제2 또는 제3 단백질성 분자, 바람직하게는 결합된 페닐알라닌 하이드록실라제를 갖는 항체, 또는 페닐알라닌 하이드록실라제를 코딩하는 결합된 폴리뉴클레오티드를 갖는 항체가 적절한 특이적 항체를 사용하여 간세포를 표적하는데 사용될 수 있고, 간세포에서 결함 효소를 대체하는데 사용될 수 있다. 이는 사포닌이 결합된 제1 단백질성 분자 및 본 발명에 따른 효소 또는 올리고뉴클레오티드가 결합된 제2 또는 제3 단백질성 분자를 포함하는 본 발명의 치료 조합물을 대체(substitution) 또는 유전자 치료를 위해 사용하는 용도의 예이다. 바람직한 구현으로, 유전자 치료 또는 대체 치료의 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 치료 조합물이 제공된다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 치료 조합물을 포함하는 의약을, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 바람직하게는, 인간 암 환자인, 이를 필요로 하는 환자에게 상기 의약의 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
투여에 적합한 형태에 관한 고려 사항은 당업계에 공지되어 있으며, 독성 효과, 용해도, 투여 경로, 및 유지 활성을 포함한다. 예를 들어, 혈류내로 주입되는 약학 조성물은 가용성이어야 한다.
적합한 투여 형태는, 예를 들어 경피 또는 주사에 의한 진입 경로 또는 사용 경로에 일부 달라진다. 이러한 제형은 표적 세포가 다세포 숙주에 존재하는지 여부에 따라 화합물이 표적 세포에 도달하도록 허용해야 한다. 다른 인자는 당해 분야에 공지되어 있으며, 화합물 또는 조성물을 이의 효과를 발휘하는 것을 지연시키는 독성 및 투여 형태와 같은 고려 사항을 포함한다.
일 구현은 적어도 하나의 공유 결합된 사포닌을 포함하는 제1 단백질성 분자를 포함하는 본 발명에 따른 엔도솜 탈출 증진 접합체와, 결합 모이어티의 조합으로서, 여기서 결합 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 모이어티를 포함하고, 결합 모이어티는 결합된 이펙터 모이어티를 포함하는 제2 또는 제3 단백질성 분자이고, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 결합 모이어티는 서로 독립적으로 표적 세포-특이적 표면 분자 또는 구조에 특이적으로 결합할 수 있어, 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 표적 세포-특이적 표면 분자의 복합체의 수용체-매개 엔도사이토시스를 유도하며, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 결합 모이어티는 이들의 동일한 결합 부위를 통해 동일한 표적 세포-특이적 표면 분자에 결합할 수 있거나, 또는 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 결합 모이어티는 이들의 결합 부위를 통해 상이한 표적 세포-특이적 표면 분자에 결합할 수 있다. 일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체는 표적 세포-특이적 표면 분자 또는 구조에 결합하기 위한 결합 모이어티와 경합할 수 있다. 일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 결합 모이어티는 서로 독립적으로 동일한 에피토프에, 또는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 구현은 암과 같은 비정상을 치료하기 위한 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 조합 조합으로서, 여기서 상기 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 상기 결합 모이어티는 동시에 또는 순차적으로, 바람직하게는 동시에 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 견지는 본 발명에 따른 엔도솜 탈출 증진 접합체(즉, 제1 단백질성 분자)를 함유하는 제1 용기 및 본 발명에 따른 결합 모이어티(즉, 제2 및/또는 제3 단백질성 분자)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 결합 분자(즉, 제1 및 제2 또는 제1 및 제3 약학 조성물을 포함하는 치료 조합물)를 사용하기 위한 설명서)를 추가로 포함한다.
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본 발명의 일부로서, 본 발명의 치료 조합물, 제1 약학 조성물, 제1 단백질성 분자, 제2 또는 제3 약학 조성물 또는 제2 또는 제3 단백질성 분자는 결합 분자 또는 결합 모이어티 및 사포닌의 공유 접합체(복합체)와 추가로 조합되거나, 또는 이와 함께 사포닌에 결합되거나 결합되지 않은, 그리고 표적 면역글로불린과 같은 리간드, 이의 도메인 또는 단편에 커플링되거나 커플링되지 않은, 약제와 추가로 결합된, 이펙터 분자와 복합체화된 결합 모이어티와 조합된, 예를 들어 본 발명의 접합체(제1 단백질성 분자 및/또는 제2 또는 제3 단백질성 분자)와 같은 3개 이상의 인핸서, 약학적으로 활성적인 성분 등을 포함하는 조성물을 제공하는 약학 화합물, 항체 등과 추가로 조합된다. 또한, 일 구현은 본 발명의 치료 조합물, 제1 약학 조성물, 제1 단백질성 분자, 제2 또는 제3 약학 조성물 또는 제2 또는 제3 단백질성 분자로서, 여기서 제2 또는 제3 단백질성 분자는 독소 또는 면역독소와 같은 2개 이상의 이펙터 모이어티와 함께 제공되며, 여기서 2개 이상의 이펙터 모이어티는 동일하거나 상이하다.
예시적인 구현
일 구현은 본 발명의 엔도솜 탈출 증진 접합체로서, 여기서 사포닌은 위치 23에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스스모시딕 트리테르펜 사포닌이고, 그리고 여기서 사포닌은 집소필라(Gypsophila) 또는 사포나리아(Saponaria) 종으로부터 분리된 사포닌이며, 보다 바람직하게 사포닌은 사포닌 SO1861 또는 이의 어느 부분입체이성질체이다.
일 구현은 본 발명의 엔도솜 탈출 증진 접합체로서, 여기서 결합 부위는 적어도 하나의 이펙터 모이어티가 이에 결합되어 있는 면역글로불린과 같은 적어도 하나의 리간드이다.
일 구현은 본 발명의 엔도솜 탈출 증진 접합체로서, 여기서 결합 부위는 세포 표면 분자에 결합하기 위한 면역글로불린 또는 적어도 하나의 이의 결합 도메인이며, 여기서 바람직하게 세포 표면 분자는 HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L, PSMA, CanAg, 인테그린-알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토(Cripto), CD3, CD30, CD33, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD71 중 어느 것으로부터 선택된다.
일 구현은 본 발명의 엔도솜 탈출 증진 접합체로서, 여기서 링커는 절단 가능한 결합을 통해 글리코시드에 커플링되고, 그리고 여기서 리간드는 면역글로불린이고, 여기서 바람직하게는 절단 가능한 결합은 산성, 환원성, 효소 또는 광-유도 조건 하에서 절단되고, 그리고 바람직하게는 절단 가능한 결합은 공유 결합, 바람직하게는 이민 결합, 히드라존 결합, 옥심 결합, 1,3-디옥솔란 결합 또는 에스테르 결합이며, 여기서 바람직하게 절단 가능한 결합은 이황화 결합 또는 펩티드 결합이다.
일 구현은 본 발명의 엔도솜 탈출 증진 접합체로서, 여기서 사포닌 모이어티는 말단 사포닌, 바람직하게는 사포닌 SO1861이고, 링커는 사포닌을 제1 단백질성 분자의 결합 부위에 공유 결합하는 화학적 링커이고, 그리고 제3 및 제1 단백질성 분자의 동일한 제1 결합 부위는 트라스투주맙 또는 세툭시맙과 같은 면역글로불린이며, 링커는 바람직하게 말단 사포닌 모이어티와 제1 및 제3 단백질성 분자에 의해 포함된 제1 결합 부위 사이에 절단 가능한 결합을 제공한다.
일 구현은 본 발명에 따른 엔도솜 탈출 증진 접합체(즉, 제1 단백질성 분자)와 결합 모이어티(즉, 제2 또는 제3 단백질성 분자)의 조합으로서, 여기서 결합 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 모이어티를 포함하고, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 결합 모이어티는, 서로 독립적으로, 표적 세포-특이적 표면 분자 또는 구조에 특이적으로 결합할 수 있어, 엔도솜 탈출 증진 접합체와 표적 세포-특이적 표면 분자의 복합체, 및 결합 모이어티와 표적 세포-특이적 표면 분자의 복합체의 수용체-매개 엔도사이토시스를 유도한다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 결합 모이어티는, 결합 모이어티가 제3 단백질성 분자인 경우, 동일한 표적 세포-특이적 표면 분자 또는 구조에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체는, 결합 모이어티가 제3 단백질성 분자인 경우, 표적 세포-특이적 표면 분자 또는 구조에 결합하기 위한 결합 모이어티와 경합할 수 있다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 결합 모이어티는 서로 독립적으로 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구현은 본 발에 따른 조합으로서, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체는, 결합 모이어티가 제3 단백질성 분자인 경우, 결합 모이어티가 특이적으로 결합할 수 있는 제1 에피토프와 동일한 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체 및 결합 모이어티는, 결합 모이어티가 제2 단백질성 분자인 경우, 상이한 표적 세포-특이적 표면 분자 또는 구조에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 표적 세포 특이적 표면 분자 또는 구조는 HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L, PSMA, CanAg, 인테그린-알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토(Cripto), CD3, CD30, CD33, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD71으로부터 선택된다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 글리코시드 분자는 비스데스모시딕 트리테르펜, 바람직하게는 사포닌이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 글리코시드 분자는 비스데스모시딕 트리테르펜 사포닌이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 사포닌은 위치 23에서 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아노의 유형에 속하는 비스데스스모시딕 트리테르펜 사포닌이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 사포닌은 집소필라(Gypsophila) 또는 사포나리아(Saponaria) 종으로부터 분리될 수 있는 사포닌이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 사포닌은 S01861 또는 이의 부분입체이성질체이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 적어도 하나의 글리코시드는 절단 가능한 결합을 통해 리간드(세포 표면 분자 상의 에피토프에 대한 결합 부위)에 결합되며, 여기서 바람직하게 절단 가능한 결합은 산성, 환원성, 효소 또는 광-유도 조건 하에서 절단되어지며, 그리고 여기서 절단 가능한 결합은 바람직하게는 이황화 결합 또는 펩티드 결합이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 절단 가능한 결합은 공유 결합, 바람직하게는 이민 결합, 히드라존 결합, 옥심 결합, 1,3-디옥솔란 결합 또는 에스테르 결합이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체는 정의된 수의 글리코시드 또는 정의된 범위를 포함한다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 정의된 범위는 1-30 글리코시드(들), 바람직하게는 1-20, 더욱 바람직하게는 1-10, 더욱 바람직하게는 1-6, 더욱 바람직하게는 2-6, 더욱 바람직하게는 2-5, 더욱 바람직하게는 3-5, 더욱 바람직하게는 3-4 글리코사이드이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서,이펙터 모이어티는 단백질성 독소와 같은 독소, 약물, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 약학적으로 활성인 물질이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 표적 세포는 병든 세포 또는 질병-관련 세포, 바람직하게는 종양 세포 또는 종양-관련 세포(예를 들어, 종양 혈관 세포), 또는 면역 세포(예를 들어, T 조절 세포), 또는 자가면역 세포이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 적어도 하나의 이펙터 모이어티는 절단 가능한 결합을 통해 결합 모이어티(제2 또는 제3 단백질성 분자)에 결합하며, 여기서 바람직하게 상기 절단가능한 결합은 산성, 환원성, 효소 또는 광-유도 조건 하에서 절단되어 지며, 그리고/또는 절단 가능한 결합은 이황화 결합 또는 펩티드 결합이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합으로서, 여기서 글리코시드(사포닌)는 이펙터 분자의 엔도솜 탈출을 증가시킬 수 있다.
일 구현은 약제로 사용하기 위한 본 발명에 따른 조합이다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합(이전 구현) 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.
일 구현은 본 발명에 따른 약학 조성물로서, 추가의 면역글로불린과 같은 적어도 하나의 추가의 활성 약학적 성분을 추가로 포함한다.
일 구현은 암 또는 자가면역 질환의 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 용도를 위한 조합, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물이다.
일 구현은 본 발명에 따른 용도를 위한 조합으로서, 여기서 엔도솜 탈출 증진 접합체(제1 단백질성 분자) 및 결합 모이어티(제2 또는 제3 단백질성 분자)는 동시에 또는 순차적으로, 바람직하게는 동시에 투여된다.
일 구현은 본 발명에 따른 조합을, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법이다.
일 구현은 본 발명에 따른 약학 조성물을, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법이다.
일 구현은 본 발명에 따른 엔도솜 탈출 증진 접합체를 함유하는 제1 용기 및 본 발명에 따른 결합 모이어티를 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트로서, 상기 키트는 결합 분자를 사용하기 위한 설명서를 더 포함한다.
제1 단백질성 분자는 작용화된 ADC 또는 작용화된 AOC의 제조를 위한 반제품으로서 사용하기에 적합하며, 여기서 작용화된 ADC 또는 작용화된 OAC는 본 발명의 적어도 하나의 공유 커플링된 사포닌 및 본 발명의 적어도 하나의 이펙터 모이어티를을 포함한다. 일 구현은 본 발명의 제1 단백질성 분자에, 직접 또는 본 발명의 링커를 통해, 바람직하게 본 발명의 절단 가능한 링커를 통해, 및/또는 본 발명에 따른 올리고머 또는 중합체 스캐폴드를 통해, 공유 결합된 독소 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 본 발명의 페이로드 또는 이펙터 모이어티를 추가로 포함하는, 본 발명의 제1 단백질성 분자이다. 예를 들어, 이러한 작용화된 ADC 또는 OAC는, 리간드 또는 항체(단편)와 같은 제1 단백질성 분자내의 시스테인 측쇄에, 직접 또는 (절단 가능한) 링커를 통해, 공유 커플링된 2-4 사포닌을 포함하거나, 또는 예를 들어, 이에 결합된 1-16 공유 커플링된 사포닌을 포함하는 덴드론을 포함하며, 덴드론은 예를 들어 본 발명에 따른 제1 단백질성 분자의 시스테인 측쇄 및/또는 리신 측쇄에 공유 커플링된다.
또한, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 더욱 설명되며, 이는 어느 방식으로 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 A - ADC와 조합된 본 발명의 접합체를 이용한 포유류 종양-함유 동물(MAMMALIAN TUMOR-BEARING ANIMAL) 치료는 생존 및 종양 퇴화를 일으킨다.
암컷 Balb/c 누드 마우스에 인간 A431 종양 세포의 현탁액을 피하 주사하였다. 마우스의 피부 아래에, 이종이식 동물 종양 모델에서 인간 상피세포암(epidermal carcinoma)이 발달되었다. 종양 세포의 주입 후, 이종이식 종양이 약 170-180 ㎣의 크기로 발달되도록 하였다. A431 종양 세포는 다음과 같은 특징을 갖는다: 높은 EGFR 발현자, 중간 CD71 발현자, 낮은 HER2 발현자.
표 A에서, 대조군 마우스 및 종양-함유 마우스의 치료의 결과가 제시된다. 종양-함유 마우스는 인간 Her2/neu, 인간 EGFR 또는 인간 CD71에 대한 표시된 항체로 처리되었고, 이들은 이종이식 종양 상의 세포 표면 수용체들이다. 세툭시맙(Cetuximab)은 사포닌 S01861과 공유 결합되었다. S01861은 먼저 링커 EMCH(N-ε-말레이미도카프론산 히드라지드)와 함께 제공되었으며, EMCH는 카보닐(알데히드 또는 케톤; 여기서 사포닌의 위치 C-23에서 알데히드의 카보닐)에 설프히드릴(항체의 환원된 시스테인)을 공유 결합시키기 위한 말레이미드-와-히드라지드(maleimide-and-hydrazide) 가교제이다. 사포닌-EMCH는 세툭시맙의 환원된 시스테인에 공유 커플링되어 EMCH와 시스테인 측쇄 사이에 공유 티오-에테르 결합을 형성하였다. ADC 트라스투주맙-사포닌(공유 접합체) 및 항-CD71 mAb(OKT-9, IgG) - 사포닌(공유 접합체)를 마우스에서 이들의 종유-어택킹 효능에 대해 시험하였으며, ADC를 이용한 처리의 시작 후 시간에 따른 종양 부피로 측정되었다. ADC의 투여량은 종양 모델에서 차선(sub-optimal)이었다. 즉, 이전의 실험으로부터, 종양-퇴화 또는 종양 성장의 저지가 전혀 관찰될 수 없었던 ADC의 차선 투여량에서 확립되었다.
Figure pct00053
이러한 결과는 ADC 단독을 이용한 종양-함유 마우스의 치료가 고려된 경우에 효과적이지 않은(종양 성장, 마우스의 사망이 방지되지 않음) 투여량에서 ADC와, 사포닌, 즉 SO1861에 공유 결합된 항체를 표적하는 종양-세포 특이적 수용체로 구성된 본 발명의 접합체의 조합 치료가, 암으로 고통받는 마우스에 투여된 공유 접합체가 단독으로 투여될 경우에 비효과적인(종양 성장, 마우스의 사망은 방지되지 않음(안락사)) 투여량에서, 처리된 동물의 종양 퇴화 및 생존 연장(실험의 지속기간을 넘김)으로 표현되는 효율적이고 효과적인 치료 요법을 제공한다는 것을 입증한다. 단독으로 투여될 경우 항-종양 활성을 갖지 않는 본 발명의 공유 결합된 사포닌-함유 결합체와 결합된 ADC의 차선 투여량은, 이에 따라 암 환자에 대한 효과적인 치료 옵션을 제공하며, 여기서 ADC의 상대적인 낮은 투여량이 효과적이다. ADC의 보다 낮은 투여량은 부작용에 대해 덜 위험한 약속을 가지며, 또는 심지어 부작용이 전혀 없다. 또한, ADC의 효능이 고려될 때, ADC 효능은 현재의 실시예가 입증한 바와 같이 조합 치료 환경에서 개선되므로, 본 발명의 사포닌-함유 접합체의 자극 효과는 종양 환자 치료가 관련된 경우 효능이 없는 것으로 이전에 입증된 ADC가 새로운 주목 및 가치를 얻을 수 있음을 보여준다. 인간 임상 환경에서 이전에 조사되었지만, 일부 ADC들이 추가의 임상 조사로부터 철회된 ADC들에 대해 요약한 표 A2 및 표 A3에 대해서 레퍼런스가 이루어진다. 특히, 효능 부족으로 인해 및/또는 수용 불가능한 부작용 보고의 발생으로 인해 임상 개발이 종료된 ADC들은, 시험된 세툭시맙-사포닌과 같이 본 발명의 공유 결합된 사포닌-함유 접합체와 결합될 경우, 암 환자에 새로워진 가치를 얻을 수 있는 ADC들이다.
실시예 B - 엔도솜/리소좀 탈출 증진 활성을 갖는 QS-21을 포함하는 퀼라자 사포나리아(Quillaja saporia)의 사포닌 혼합물
스킴 I은 일련의 QS-21 사포닌의 공통 분자 구조를 나타낸다(부분적으로 다음 문헌으로부터 알려짐: Conrado Pedebos, Laercio Pol-Fachin, Ramon Pons, Cilaine V. Teixeira Hugo Verli, Atomic Model and Micelle Dynamics of QS-21 Saponin, Molecules 2014, 19, 3744-3760). 퀼라자 사포나리아로부터 얻어진 수용성 사포닌들의 혼합물(Sigma-Aldrich, product No. S4521; Roth, Item No. 6857; InvivoGen, product 'Quil-A')이, 예를 들어, QS-21과 같은 혼합물에 존재하는 적어도 하나의 개별 사포닌의 엔도솜/리소좀 탈출 증진 특성에 기초하여, 또는 QS-21 및 QS-7과 같은 혼합물에 의해 포함된 둘 이상의 사포닌들의 조합에 기초하여, 본 발명의 엔도솜/리소좀 탈출 증진 접합체, 조성물, 조합에 적용될 수 있다.
본 발명자들은 2,5 마이크로그램/ml 투여량의 퀼라자 사포나리아로부터의 사포닌 혼합물을 세포-기반 바이오 분석에서 포유류 종양 세포를 이용하여 시험하였을 경우, 디안틴의 엔도솜 탈출을 증진시킬 수 있음을 입증하였다. 세포에 노출된 이펙터 모이어티는 리간드 EGF:EGF-디안틴에 공유 커플링된 디안틴이었다. 시험된 세포는 유리 사포닌들에 대해서는 종양 세포주 HeLa 이었으며, 그리고 세툭시맙에 공유 커플링된 경우의 사포닌을 시험하기 위해서는 A431, MDA-MB-468, CaSki 및 A2058이었다.
실시예 1
다양한 농도의 트라스투주맙-사포린(HER2 표적된 단백질-독소 접합체; 정맥내)을 1.5 mg/kg SO1861(항체-독소 주입 1시간 전; 피하)과 조합하여 BT474 (HER2++) 이종이식 마우스 모델에서 증진된 효능에 대해 시험하였다. 종양이 약 ~150㎣에 도달하였을 때 13일째에 투여를 시작하고, 모든 처리 후에 종양 부피를 측정하였다. 종양 성장 억제가 1 mg/kg 및 0.3 mg/kg 트라스투주맙-사포린으로 처리된 마우스에서 관찰되었음에도 불구하고, 트라스투주맙-사포린 + SO1861의 조합으로 처리된 마우스에서 증진된 종양 성작 억제는 관찰되지 않았다. 이는 접합되지 않은 S01861이 현재의 환경(current setting) 및 마우스 모델에서 항체-단백질 독소를 증진시킬 수 없다는 것을 보여준다.
실시예 2
재료:
QSmix (1): S4521 (Sigma Aldrich); QSmix (2) : 6857.1 (Carl Roth) QSmix (3): Quil-A® Adjuvant: vac-quil (InvivoGen/Brenntag).
이전에, 다양한 사포닌들(S01861, S01642)의 효능은 리간드 독소 융합체(예를 들어, EGF디안틴) 또는 항체-단백질 독소 결합체와 조합하여 세포에 '유리' 비접합 분자로서 공동 투여되었으며, 이는 표적 발현 세포의 향상된 세포 사멸 활성을 초래하였다. 여기서, 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis)의 뿌리 추출물로부터 분리된 3개의 상이한 사포닌 분자(SO1861, SO01862(SO1861의 이성질체), S01832 및 SO1904)를 HeLa(EGFR+) 세포 상에서 비-유효 고정 농도의 1.5 pM EGFR디안틴의 존재 및 부재하에 적정하였다. 이는 EGFR디안틴을 이용하지 않은 처리에 비해, 시험된 모든 사포닌 변이체(IC50 = 300 nm; 도 2A)에 대한 세포 사멸 활성의 강한 증진을 보여주었다. 그 다음, EGFR디안틴은 고정된 농도의 사포닌(~ 1000 nM)으로 적정되었고, 낮은 pM 농도의 EGF디안틴 (IC50= 0.4 pM; 도 2B)에서 강한 표적 세포 사멸 증진을 보여주었으며, 이는 사용된 모든 사포닌들 SO1861, SO1862(S01861의 이성질체), S01832 및 SO1904에 대해 관찰되었다. EGF-디안틴 단독은 매우 높은 농도(IC50 = 10.00 pM)에서만 세포 사멸을 유도할 수 있었다. 이는 이러한 특정 유형의 사포닌들 모두가 이용가능한 매우 적은 양의 표적화된 독소만을 이용하여 엔도솜 탈출을 효율적으로 유도하는 고유 용량을 갖는 것을 보여준다.
이 시험을 확장하기 위해, 다른 공급원들의 사포닌들을 분석하였다. 집소필라 엘레간스(Gypsophila elegans) M.Bieb. (GE1741)의 뿌리 추출물로부터 정제된 사포닌을 1.5 pM EGF디안틴의 존재 및 부재하에서 HeLa 세포 상에 적정하고, 정제된된 S01861과 비교하였다. GE1741은 또한 EGF디안틴 유도된 HeLa 세포 사멸을 증진시키지만, S01861에 비해 약간 적은 효능을 나타내며(GE1741 IC50 = 800 nM; 도 2C), 또한 더 높은 일반 독성을 나타낸다(EGF디안틴의 부재하에서 IC50= 5,000 nM; 도 1C). 다른 부분적으로 정제된 퀼라자 사포나리아 사포닌들의 혼합물(QSmix 1-3)이 HeLa 세포 상에 1.5 pM EGF디안틴과 함께 공동-투여된 유사한 시험이 수행되었으며, 이는 3개 중 2개에 대해 SO1861와 유사한 활성을 나타내었다(IC50 QSmix/QSmix3=300nM; 도 1D). QSimix(2)는 1.5 pM EGF디안틴 유도 세포 사멸을 증진시키는데 덜 효율적이나(IC50 = 2000 nM; 도 2D), 일반적인 독성이 관찰되지 않았다. 이는 또한 QS 추출물에서, 특정 유형의 사포닌을 이용하여 표적화 리간드 독소 EGF디안틴의 엔도솜 탈출을 효율적으로 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 3
본 발명에 따라, S01861 분자를 항체에 접합시키기 위하여, 불안정성/산 민감성 링커(-EMCH 또는 -N3)를 알데히드기를 통해 S01861에 접합시켜, S01861-EMCH 또는 S01861-N3를 생성하였다(도 60-66 참조). S01861-EMCH의 활성을 입증하기 위해, EGFR 발현(A431, HeLa) 및 비-발현 세포(A2058) 상에 고정된 비-효능(1.5 pM) EGF디안틴 농도의 존재 및 부재하에서 상기 분자를 적정하였다. 3가지 모든 세포주에서 SO1861 단독은 강한 세포 생존능 감소를 보여주었으나, 단일 화합물로서 SO1861-EMCH는 25.000 nM 까지 독성을 보여주지 않았다(도 3A-C). S01861-EMCH를 1.5 pM EGF디안틴과 결합시킨 경우, EGFR + A431 및 HeLa 세포에서 강한 표적 특이적 세포 생존능 감소가 관찰되지만((IC50 = 3.000 nM; 도 2A,B), EGFR-A2058 세포는 전혀 영향을 받지 않는다(도 3C). 유사한 결과를 S01861-N3에 대해서 얻었다. 1.5 pM EGF디안틴과 공동-투여된 S01861-N3 또한 A431 및 HeLa 세포 상에서 효율적인 세포 사멸을 나타내지만(IC50 = 3,000 nM), EGFR디안틴이 없는 경우, 일반적인 독성은 10,000 nM 넘어서 관찰된다(도 3D, 2E).
본 발명에 따라, S01861의 항체에 대한 안정한 접합을 위해, 안정한 링커(HATU, 도 70)가 S01861의 카복실산기를 통해 S01861에 접합되어, S01861-(S)를 생성하였다. 활성을 측정하기 위해, 상이한 농도의 S01861-(S)를 1.5 pM EGFㄷdia디l시험하였다. S01861-(S)는 S01861과 유사한 활성을 나타내었으며, 이는 카르복실산에 대한 접합이 S01861-EMCH(도 4)에서 관찰되는 바와 같이 상기 분자의 엔도솜 탈출 증진 효능에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
도 19에 도시된 바와 같이, 1 표적 2-성분 시스템(1T2C)은 mAb1-단백질 독소 및 mAb1-S01861의 조합 치료이다. S01861-EMCH는 시스테인 잔기(Cys)를 통해 접합되었고, HSP27BNA oligo는 리신 잔기를 통해 세툭시맙(인간 EGFR을 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 접합되었으며, 둘 모두 DAR 4로 접합되었으며, 이는 2개의 접합체: 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 및 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4을 생성하였다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4(복강내 투여, (ip)) 및 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4(정맥내 투여, (i.v.))의 조합은 EGFR 종양 표적화 유전자 침묵 활성에 대한 A431 이종이식 마우스 종양 모델에서 시험되었다. 종양이 ~150㎣의 크기에 도달한 경우 12일째에 투여를 시작하였으며, 종양 샘플은 1차 투여 후 72시간에 수집하였고, 대조군 유전자 mRNA 발현 수준(레퍼런스 유전자)과 비교하여 HSP27 유전자 발현에 대해 분석하였다. 이는 50 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-S01861)4 + 25 mg/kg 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4의 1회 투여가 세툭시맙-(Cys-L-S01861)4 또는 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4 단일 치료의 단일 투여에 비해 A431 종양에서 HSP27 유전자 발현을 50% 감소시킨 것으로 나타났다(도 7). 비히클 대조군 종양과 비교하여, 40% HSP27 유전자 침묵의 감소가 관찰되었다. 이는 1T2C 발명에 따른 세툭시맙-접합된 SO1861 + 세툭시맙-접합된 HSP27BNA oligo의 조합이 고형 종양 세포의 세포질내에서 치료 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 효율적인 표적화된 전달을 유도하여, 생체내 종양 표적화된 유전자 침묵을 유도함을 보여주고 가능하게 한다.
다음으로, S01861-EMCH를 시스테인 잔기(Cys)를 통해 DAR 4로 트라스투주맙(인간 HER2를 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 접합되었으며, 이는 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4을 생성하였다. 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 트라스투주맙-사포린(트라스투주맙 단백질 독소 접합체)의 조합은 높은 HER2 발현 수준을 가지며 트라스투주맙 단일 치료에 저항적인 마우스 종양 모델(환자 유래 이종이식 종양 모델, PDX)에서 시험되었다. 40 mg/kg 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 (복강내 투여, (i.p.)) + 0.03 (1일째, 8)/ 0.02 (15, 22, 30, 36, 43일째) mg/kg 트라스투주맙-사포린(정맥내 투여, (i.v.))의 1T2C 발명에 따른, 조합은 비히클 대조군 및 40 mg/kg 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 또는 0.03/0.02 mg/kg 트라스투주맙-사포린 단일 치료에 비해 강한 종양 성장 저해를 나타내었다(도 8). 게다가, 보다 낮은 투여량으로 조합(40 mg/kg 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 0.01 mg/kg 트라스투주맙-사포린)으로 처리한 종양 함유 마우스에서, 종양 성장 저해 활성은 관찰되지 않았다(도 8). 이는 트라스투주맙 접합된 SO1861 + 트라스투주맙 접합된 단백질 독소의 1T2C 조합이 고형 종양 세포의 세포질내에서 치료 단백질 독소의 효율적인 표적화된 전달을 유도하여, 생체내 종양 세포 사멸 및 종양 성장 저해를 유도함을 보여주고 가능하게 한다.
1 표적 2-성분 시스템(1T2C)은 mAb1-SOI(861)와 mAb1-단백질 독소의 조합 치료이다(도 19).
S01861-EMCH를 시스테인 잔기(Cys)를 통해 DAR 3,7로 세툭시맙(인간 EGFR을 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 접합되었다(세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7). 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7은 10 pM 세툭시맙-사포린(단백질 독소, 사포린에 접합된 세툭시맙)의 고정 농도에 적정되고, EGFR 발현 세포(A431, EGFR++; CaSKi, EGFR+) 상에서 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 낮은 농도의 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7(A431: IC50= 0,6 nM 및 Caski IC50= 1 nM; 도 9A, 9B)에서 강한 세포 사멸을 나타내었으나, 반면에 세툭시맙, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 또는 세툭시맙 + 10 pM 세툭시맙-사포린은 EGFR 발현 세포에서 어떠한 세포 사멸 활성을 유도할 수 없었다. 이는 세툭시맙 접합된 SO1861이 (비효과적인 농도에서) 세툭시맙 접합된 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 증진시켜, EGFR 발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 보여준다. A431에서 세포 사멸 활성은 CaSki에 비해 더 효과적이며, 이는 이러한 세포주에서 EGFR 발현 수준과의 상관성을 보여준다. 1T2C내의 두 접합체들 사이의 EGFR 수용체 결합 경합은 또한, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 농도가 증가할 경우에 관찰되며, 세툭시맙-사포린의 경쟁에서 우월한 수용체 결합 및 내재화에 기인하여 세포 사멸 활성이 감소한다(도 9A, 9B).
다음으로, 세툭시맙-사포린을 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-S01861)3,7의 고정 농도에 적정하고, EGFR 발현 세포 상에서 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도 세툭시맙-사포린과 조합된 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-S01861)3'7이 EGFR 발현 세포에서 이미 효율적인 세포 사멸을 유도하였으나(A431: IC50= 0.4 pM; 및 CaSKi: (IC50= 2 pM; 도 9C 및 9D), 반면에 세툭시맙-사포린 단독 또는 세툭시맙-사포린 + 75 nM 세툭시맙은 두 세포주 모두에서 고농도 세툭시맙-사포린에서만 세포 사멸을 보여주는 것으로 나타났다(각각, IC50= 40 pM, IC50= 1000 pM)(도 9C, 9D). 이 모든 것은 높은 EGFR 발현 세포에서 낮은 세툭시맙-S01861 농도와 조합된 경우에만 비교적 낮은 농도의 세툭시맙-사포린이 효과적일 수 있고, 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 1T2C 시스템내의 두 접합체 간의 수용체 경합은 75 nM 세툭시맙을 함유한 그리고 함유하지 않은 세툭시맙-사포린의 세포 사멸 활성을 비교하였을 때 세툭시맙-독소 적정 처리에서 또한 관찰된다(도 9C, 9D).
다음으로, 세툭시맙-(Cys-L-S01861)3,7을 10 pM 세툭시맙-사포린의 고정 농도에 적정하고 낮은 EGFR 발현 세포 또는 EGFR을 발현하지 않는 세포(HeLa, EGFR+/-; A2058, EGFR-) 상에서 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. EGFR 발현이 낮거나(HeLa) 또는 발현하지 않는(A2058) 세포는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 + 10 pM 세툭시맙-사포린의 어느 조합에 대해서 전혀 민감하지 않았다(HeLa: IC50> 1000 nM; A2058: IC50> 1000 nM; 도 10A, 10B). 이는 충분한 EGFR 수용체 발현의 부재시, 효과적인 세포내 전달 S01861 농도가 엔도솜 단백질 독소 탈출 및 독소-매개 세포 사멸을 유도하기에 최적(역치)이 아님을 보여준다. 다음으로, 세툭시맙-사포린을 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 의 고정 농도에 적정하고, EGFR 발현이 낮은 세포(HeLa) 또는 EGFR을 발현하지 않는 세포(A2058) 상에서 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 저 EGFR 발현 세포(HeLa)는 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7과 조합시 높은 세툭시맙-사포린 농도에서만 세포 사멸을 보였으며(HeLa: IC50= 60 pM, 도 10C), 반면에 A2058 세포(EGFR-)는 시험된 어느 농도에서도 민감하지 않았다(A2058: IC50> 10.000 pM; 도 10D). 이 모든 것은 EGFR 수용체를 낮게 발현하거나 전혀 발현하지 않는 세포는, 단백질 독소의 탈출을 용이하게 하기 위해, 엔도리소좀 구획내의 충분한 SO1861의 항체-매개 전달을 용이하게 하는 충분한 EGFR 수용체의 부재로 인해, 세툭시맙(Cys-L-SO1861)3,7 + 세툭시맙-사포린의 조합에 대해 민감하지 않음을 보여준다.
다음으로, S01861-EMCH를 시스테인 잔기(Cys)를 통해 DAR 4로 트라스투주맙(인간 HER2를 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 접합되었다(트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4). 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4는 50 pM 트라스투주맙-사포린(단백질 독소, 사포린에 접합된 트라스투주맙)의 고정 농도에 적정되고, HER2 발현 세포(SK-BR-3, HER2++) 상에서 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 낮은 농도의 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4에서 강한 세포 사멸을 나타내었으나(SK-BR-3: IC50= 0,8 nM; 도 11A), 반면에 등량 농도 트라스투주맙, 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 또는 트라스투주맙 + 50 pM 트라스투주맙-사포린은 HER2 발현 세포에서 어떠한 세포 사멸 활성을 유도할 수 없었다. 이는 트라스투주맙 접합된 SO1861이 (비효과적인 농도에서) 트라스투주맙 접합된 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 증진시켜, HER2 발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 보여준다. 1T2C내의 두 접합체 간의 수용체 경합은 또한, 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 농도가 증가할 경우에 관찰되며, 트라스투주맙-사포린의 경쟁에서 우월한 수용체 결합 및 내재화에 기인하여 세포 사멸 활성이 감소한다(도 11A).
다음으로, 트라스투주맙-사포린을 본 발명에 따른 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4의 고정 농도에 적정하고, HER2 발현 세포 상에서 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도 트라스투주맙-사포린과 조합된 2,5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4가 HER2 발현 세포에서 이미 효율적인 세포 사멸을 유도하였으나(SK-BR-3:IC50 = 2 pM; 도 11B), 반면에, 트라스투주맙-사포린 단독 또는 트라스투주맙-사포린 + 2.5 nM 트라스투주맙은 고 농도 트라스투주맙-사포린에서만 세포 사멸을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 11B). 이 모든 것은 높은 HER2 발현 세포에서 낮은 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4 농도와 조합시에만 비교적 낮은 농도의 트라스투주맙-사포린이 효과적일 수 있고, 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것을 보여준다.
다음으로, 본 발명에 따른 50 pM 트라스투주맙-사포린의 고정된 농도에서 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4를 적정하고, HER2를 낮게 발현하는 세포(A431 HER2+/-) 또는 HER2를 발현하지 않는 세포(JIMT-1: HER2+; MDA-MB-468: HER2-) 상에서 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. HER2 발현을 낮게 하거나 발현하지 않는 세포들은 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 50 pM 트라스투주맙-사포린의 어느 조합에 대해 전혀 민감하지 않았다(JIMT-1: IC50> 1000 nM; MDA-MB-468: IC50> 1000 nM; 도 13A, 13B). 이는 충분한 HER2 수용체 발현의 부재시, 효과적인 세포내 전달된 SO1861 농도가 엔도솜 단백질 독소 탈출 및 독소-매개 세포 사멸을 유도하기에 최적(역치)이 아님을 보여준다. 다음으로, 트라스투주맙-사포린을 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4의 고정 농도에 적정하고, HER2 발현이 낮은 세포 또는 HER2를 발현하지 않는 세포 상에서 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 저 HER2 발현 세포(JIMT-1)는 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4와 조합시 높은 트라스투주맙-사포린 농도에서만 세포 사멸을 보였으나(JIMT-1: IC50> 10.000 pM; 도 13C), 반면에 MDA-MB-468 세포(HER2-)는 시험된 어느 농도에서도 민감하지 않았다(MDA-MB-468: IC50> 10.000 pM; 도 13D).
이 모든 것은 단백질 독소의 탈출을 용이하게 하기 위해, 엔도리소좀 구획내의 충분한 S01861의 항체-매개 전달을 용이하게 하는 충분한 HER2 수용체의 부재로 인해, HER2 수용체를 낮게 또는 전혀 발현하지 않는 세포가 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)3,7 + 트라스투주맙-사포린의 조합에 민감하지 않다는 것을 보여준다.
1T2C 시스템의 활성이 엔도리소좀 구획의 산성화에 의해 구동되는 것을 나타내기 위해, 본 발명에 따른 1T2C 시스템은 엔도솜 산성화 억제제, 클로로퀸(chloroquine)과 조합하여 시험되었다. 트라스투주맙-사포린을 클로로퀴틴과 조합하거나 조합하지 않고, 5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4와 조합하여 적정하였다. 트라스투주맙-사포린 + 5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4는 높은 HER2 발현 세포에서 강한 세포 사멸 활성을 나타내었지만(SK-BR-3, HER2++; IC50= 0.2 pM), 트라스투주맙-사포린 + 5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4 + 0.5 μM 클로로퀸은 SK-BR-3(HER2++) 세포에서 1T2C 세포 사멸 활성을 강하게 저해하였다(IC50 = 40 pM). 이는 엔도리소좀의 산성화가 억제되는 경우에 항체 저합된 S01861의 활성이 감소/차단된다는 것을 보여준다(도 14A). 동일한 결과는 EGFR 발현 세포(A431, EGFR++; 도 14B)에서 세툭시맙-사포린 + 5 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 + 0.5 μM 클로로퀸(IC50= 200 pM)과 비교한, 세툭시맙-사포린 + 5 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 의 본 발명에 따른 1T2C 조합(IC50= 1 pM)으로 유도되었다.
1 표적 2-성분 시스템(1T2C)은 또한 도 20에 예시된 바와 같이 mAb1-S01861 및 mAb1-안티센스 BNA 올리고 뉴클레오티드의 조합 치료일 수 있다. 본 발명자들은 (암 세포에서 상향조절된) 암 특이적 표적 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 BNA 올리고뉴클레오티드, 열 충격 단백질 27(HSP27)를 사용하였다, 세포질내로 방출시, 안티센스 BNA는 HSP27를 코딩하는 mRNA를 인식하고 결합하여, 파괴를 위해 mRNA를 표적하여, 암 세포내에서 HSP27 mRNA 발현을 고갈시킨다. 본 발명에 따라, HSP27BNA를 DAR4로 세툭시맙과 접합시키고(세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4), EGFR 발현 세포(A431, EGFR++) 및 비-발현 세포(A2058, EGFR)에서 향상된 HSP27 유전자 침묵 활성을 위해 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8과 조합하여 시험하였다(도 20). 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 + 100 nM 세툭시맙-(Lys-L-SO1861)4는 EGFR 발현 세포에서 강한 HSP27 유전자 침묵을 나타내었으나(A431: IC50= nM, 도 15A), 반면에 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 단독은 어떠한 유전자 침묵 활성을 나타내지 않았다. A2058 세포(EGFR)에서, 유전자 침묵 활성은 1T2C 조합에서 관찰되지 않았다(도 15B). 그 다음, 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4 + 76.9 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8은 EGFR 발현 세포에서 강한 HSP27 유전자 침묵 활성을 나타내었으며(A431:IC50 = 4 nM, 도 15C), 반면에 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4 또는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 또는 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4 + 77 nM 세툭시맙의 조합은 어느 현저한 유전자 침묵 활성을 나타내지 않았다(IC50 > 100 nM). 실험이 EGFR 비-발현 세포(A2058)에서 수행된 경우, 1T2C 조합에서 유전자 침묵 활성은 관찰되지 않았다(IC50 > 100 nM; 도 15D). 이 모두는 1T2C 시스템이 높은 EGFR 발현 세포의 세포질로 안티센스 BNA 올리고를 효율적으로 전달하여, BNA 표적 mRNA의 mRNA 분해를 유도시켜, 표적 유전자 침묵을 초래하는 것을 나타낸다.
1 표적 2-성분 시스템(1T2C)은 또한 도 21에 도시된 바와 같이 mAb1-(스캐폴드(-S01861)n)n 및 mAb1-단백질 독소의 조합 치료일 수 있다. 덴드론(-L-S01861)4는 DAR 3.9로 시스테인 잔기(Cys) 접합을 통해 세툭시맙에 접합되었으며, 세툭시맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)3,9은 EGFR 발현 세포(MDA-MB-468)에서 항-EGFR 항체-단백질 독소 접합체(세툭시맙-사포린)와 조합하여 향상된 세포 사멸 활성을 위해 시험되었다. 세툭시맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)3,9 + 10 pM 세툭시맙-사포린은 고 EGFR 발현 세포에서 독소-매개 세포 사멸을 효율적으로 유도하였으나((IC50= 0.4 nM; 도 16A), 반면에 이는 세툭시맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)3,9 또는 세툭시맙 + 10 pM 세툭시맙-사포린 또는 세툭시맙에 의해서는 유도되지 않았다(도 16A). 이는 1T2C 발명에 따라, 세툭시맙 접합된 덴드론(-L-SO1861)4 이 (비-유효 농도에서) 세툭시맙 접합된 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 증진시켜, 고 HER2 발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 보여준다. 유사한 1T2C 실험은 낮은 수준의 EGFR를 발현하는 세포(HeLa, EGFR+/-)에서 수행되었으며, 이는 본 발명에 따른 1T2C 조합이 사용된 경우 세포 사멸 활성을 보이지 않았으며(IC50> 100pM; 도 16B), 이는 충분한 EGFR 수용체 발현의 부재하에서, 효과적인 세포내 SO1861 농도가 독소-매개 세포 사멸을 초래하는 단백질 독소의 세포질 전달을 유도하기 위한 최적(역치)이 아님을 나타낸다.
다음으로, 덴드론(-L-S01861)4를 DAR4로 시스테인 접합(Cys)을 통해 항-HER2 항체, 트라스투주맙에 접합하고, 트라스투주맙-Cys-(덴드론(-L-S01861)4)4를 HER2 발현 세포(SK-BR-3, HER2++)에서 항-HER2 항체-단백질 독소 접합체(트라스투주맙-사포린)와 조합하여 증진된 세포 사멸 활성에 대해 시험하였다. 트라스투주맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4 + 50 pM 트라스투주맙-사포린은 독소-매개 세포 사멸을 효율적으로 유도하였으나(IC50= 2 nM, 도 16C), 반면에 이는 트라스투주맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4 또는 트라스투주맙 + 50nM 트라스투주맙-사포린 또는 트라스투주맙에 의해서는 유도되지 않았다(도 16C). 이는 트라스투주맙 접합된 덴드론(-L-SO1861)4 이 (비-유효 농도에서) 트라스투주맙 접합된 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 증진시켜, 고 HER2 발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 보여준다. 낮은 수준의 HER2(JIMT-1, HER2+/-)를 발현하는 세포에서 유사한 실험은 트라스투주맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4 + 50 pM 트라스투주맙-사포린의 활성을 보이지 않았으며(IC50> 200 nM; 도 16D), 이는 충분한 HER2 수용체 발현의 부재하에서, 효과적인 SO1861 농도가 엔도솜 단백질 독소 탈출 및 독소-매개 세포 사멸을 유도하기 위한 최적(역치)이 아님을 나타낸다.
임상적으로 승인된 ADC, 트라스투주맙-엠탄신(T-DM1)은 항-Her2 항체, 트라스투주맙 및 소분자 독소 엠탄신의 접합체(DAR3.5)이다. T-DM1은 트라스투주맙--(Cys-L-SO1861)4과 조합하여 적정되었고, 본 발명에 따른 항체 단백질 독소 접합체, 트라스투주맙-사포린 + 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4와 비교하였다. 트라스투주맙-사포린 + 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-S01861)4는 트라스투주맙-사포린 + 2.5 nM 트라스투주맙 또는 트라스투주맙-사포린 단독에 비해 증진된 활성을 나타내었으나(IC50= 2 pM, 도 17), T-DM1 + 25.6 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4는 증진된 세포 사멸 활성을 보이지 않았다(IC50> 100 pM; 도 17). 이는 소분자들이 이미 (엔도리소좀)막을 수동적으로 횡단할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 1T2C 시스템이 항체 소분자 접합체의 전달을 향상시킬 수 없음을 보여준다.
1 표적 2-성분 시스템(1T2C)은 또한 mAb1-QSmix(퀼라자 사포나리아로부터의 사포닌 혼합물) 및 mAb1-단백질 독소의 조합 치료일 수 있다.
QSmix-EMCH를 DAR 4.1로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 세툭시맙(인간 EGFR을 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 접합하였다(세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1). 세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1을 10 pM 세툭시맙-사포린 또는 10 pM 세툭시맙-디안틴의 고정 농도에 적정하고, A431(EGFR++), CaSKi(EGFR+) 및 A2058(EGFR-) 세포 상에서 표적 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 A431(EGFR++) 및 CaSKi(EGFR+) 세포에서 저농도의 세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4.1 + 10 pM 세툭시맙-사포린 또는 10pM 세툭시맙-디안틴에서 강한 세포 사멸을 나타내었으나(A431: IC50=3 nM, 도 18A; CaSKi: IC50=1nM, 도 18B), 모든 대조군 처리에서는 EGFR 발현 세포에서 어떠한 세포 사멸을 유도할 수 없는 것으로 나타났다. EGFR을 발현하지 않는 세포(A2058; EGFR-)에서, 본 발명에 따른 조합으로 HSP27 유전자 침묵이 관찰되지 않았다(IC50> 1000 nM; 도 18C). 이는 세툭시맙 접합된 QS21mix가 (비-유효 농도에서) 세툭시맙 접합된 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 증진시켜, EGFR 발현 세포에서만 세포 사멸을 유도함을 보여준다.
실시예 4
불안정한 S01861은 DAR3.9로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 항-EGFR 항체 세툭시맙(인간 EGFR을 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 접합하고(세툭시맙--(Cys-L-SO1861)3.9), 증진된 표적 유전자 침묵을 초래하는 안티센스 BNA 올리고 뉴클레오티드의 증진된 전달에 대해 시험하였다. 본 연구에서, 본 발명자들은 암 특이적 표적 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 BNA 올리고뉴클레오티드, 열 충격 단백질 27(HSP27)을 사용하였다. 세포 HSP27BNA의 세포질내에서 HSP27을 코딩하는 mRNA 를 결합시키고, 파괴를 위해 mRNA를 표적하여, 암 세포내에서 HSP27 발현을 감소시킨다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.9를 EGFR++(A431) 및 EGFR-(A2058) 세포 상에서 100 nM HSP27BNA의 고정 농도에 적정하였다. 본 발명에 따른 조합은 A431에서 효과적인 HSP27 침묵을 나타내었으나(IC50= 2 nM; 도 5A), 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.9 단독에 대해서는 침묵이 관찰되지 않았다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.9 + 100nM HSP27BNA는 EGFR- 세포(A2058)에서 유전자 침묵 활성을 나타내지 않았다(도 5B). 이는 낮은 농도의 항체-접합된 S01861이 안티센스 BNA 올리고 뉴클레오티드의 세포질 전달 및 엔도리소좀 탈출을 효율적으로 증진시킬 수 있어, 표적 발현 세포에서 효율적인 유전자 침묵을 유도할 수 있음을 보여준다.
그 다음, HSP27BNA를 고정된 농도의 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.9과 조합된 EGFR++(A431) 및 EGFR-(A2058) 세포 상에서 적정하였다. 이는 28.6 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.9 또는 77 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.9과 조합된 HSP27BNA가 A431 세포에서 HSP27 유전자 침묵을 매우 효율적으로 증진시킨다는 것을 보여준다(IC50 = 10 nM; 도 5C). HSP27BNA 단독 또는 77 nM 세툭시맙의 고정된 등가물과의 조합은 덜 효과적이다(IC50= 1.000 nM; 도 12C). HSP27BNA + 77 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.9의 조합 치료가 또한 EGFR- 세포(A2058) 상에서 시험되었고, 이는 HSP27 유전자 침묵 증진을 나타내지 않았다(IC50=1,000 nM; 도 5D). 이는 EGFR 수용체 발현이 낮거나 전혀 없는 세포는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 + HSP27BNA의 조합에 대해 민감하지 않으나, 세툭시맙 표적화된 SO1861은 고 EGFR 세포에서 저농도의 비표적화된 HS27BNA에서 효율적으로 HSP27 유전자 침묵을 증진시킬 수 있음을 보여준다.
다음으로, S01861-EMCH를 DAR 3.8로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 세툭시맙(인간 EGFR을 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 접합하였다. 본 발명에 따른 조합, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 + HSP27BNA(암세포에서 온코-표적 hsp27 mRNA를 표적하고 분해(유전자 침묵)를 유도하는 안티센스 HSP27BNA 올리고 뉴클레오티드)를 A431 이종이식 '누드' 마우스 종양 모델에서 EGFR-매개 종양 표적화된 HSP27 유전자 침묵에 대해 시험하였다. 종양이 ~150㎣의 크기에 도달한 12일째에 투여를 시작하고, HSP27 mRNA 발현을 측정하였다. 이를 위해, 1차 투여 후 72h에 종양 샘플을 수집하고, 세포 대조군 mRNA 발현 수준(레퍼런스 유전자)과 비교한 HSP27 유전자 발현 수준을 분석하였다. 종양 함유 마우스(n=3)를 12일째에 25 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 + 25 mg HSP27BNA로 치료하고, 15일째에 25 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 + 10 mg HSP27BNA로 치료하였으며, 이는 비히클 대조군 또는 25 mg/kg HSP27BNA의 단일 투여에 비교하여 종양에서 HSP27 mRNA 발현의 25% 감소를 나타내었다(도 6). 이는 본 발명에 따른, S01861 대 표적화 항체의 접합체가 종양 함유 마우스의 고형 종양에서 치료 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 SOI861-매개 강화된 세포질 전달을 효율적으로 유도하여, 생체내에서 종양 표적화된 유전자 침묵을 유도함을 보여준다.
DAR2 vs DAR4
S01861-EMCH(불안정성 링커, L)를 DAR3.7(세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.7) 또는 DAR2(세툭시맙-(Cys-L-SO1861)2)로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 세툭시맙에 접합하였다. 이들 세툭시맙-SO1861 접합체들은 고 EGFR 발현 세포(A431, EGFR++) 상에서 10 pM 세툭시맙-사포린과 조합하여 증진된 세포 사멸 활성에 대해 시험되었다. 이는 세툭시맙 접합된 SO1861, DAR2 및 DAR4에 대해 동일한 세포 사멸 효능을 나타내었다(도 22A). 동일한 결과가, 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)2.1을 고 HER2 발현 세포(SK-BR-3, HER2++) 상에서 50 pM 트라스투주맙-사포린과의 조합과 비교한 경우에 얻어졌으며, 이는 본 발명에 따른 접합된 SO1861의 양을 낮추는 것은 효과적인 엔도솜 탈출 및 독소 매개 세포 사멸에 대한 효능을 감소시키는 것으로 나타났다.
안정한 vs 불안정한
S01861-HATU(안정한 링커, S)를 DAR3.7로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 항-EGFR 항체 세툭시맙에 접합하였다(세툭시맙--(Cys-S-SO1861)3.7). 세툭시맙-SO1861 접합체는 고정된 농도의 10 pM의 항-EGFR 항체-단백질 독소 접합체(세툭시맙-사포린)와 조합되고, 불안정한 접합체(세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3.7과 비교하여, 고 EGFR 발현 세포(MDA-MB-468, EGFR++) 상에서 증진된 세포 사멸 활성에 대해 시험되었다. 이는 본 발명에 따른, 안정한 또는 불안정한 항체-접합된 SO1861이 비-유효 농도의 항체-단백질 독소 접합체와 조합될 경우, 동일한 증진된 세포 사멸 활성을 나타내는 것을 보여주었다(도 23A). 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4를 SK-BR-3 세포(HER2++)에서 50 pM 트라스투주맙-사포린과 조합된 트라스투주맙-(Cys-S-SO1861)4과 비교한 경우에, 동일한 데이터가 나타났다(도 23B). 이 모든 것은 본 발명에 따른 안정한 또는 불안정한 접합된 SO1861이 효과적으로 작용하여, 항체-접합된 독소의 엔도솜 탈출을 유도함을 나타낸다.
2 표적 2-성분 시스템(생체내)
2 표적 2-성분 시스템(2T2C)은 mAb1-SO1861 및 mAb2-단백질 독소의 조합 처리이다(도 37). SO1861-EMCH는 DAR 4로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 세툭시맙(인간 EGFR을 인식하고 결합하는 모노클로날 항체)에 접합되어, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 생성물로 되었다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 및 트라스투주맙-사포린 또는 CD71mab-사포린의 조합은 도 37에 도시된 바와 같이 EGFR 종양 표적화된 세포 사멸을 위한 A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+) 이종이식 '누드' 마우스 종양 모델에서 테스트되었다. 치료 효능을 결정하기 위해 용량 증량을 수행했다(9일: 0.3mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.1mg/kg CD71mab-사포린 + 5mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861) 4 ; 14일, 18일: 0.1 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.05 mg/kg CD71mab-사포린 + 5 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861) 4 , 21일: 0.05 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.05 mg/kg CD71mab-사포린 + 15 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861) 4 ; 28일: 0.02 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.02 mg/kg CD71mab-사포린 + 15 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861) 4 트라스투주맙-사포린/세툭시맙-SO1861. 대조군은 각각 동일한 투여 계획이었으며, 세툭시맙(i.v.)만 치료일마다 25mg/kg이 제공되었다). 32일(점선), 35일 및 39일에 우리는 25 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4의 2T2C 발명에 따라, 조합을 시작하였으며 (복강내 주사(i.p.) + 0.02 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.02 CD71mab-사포린(정맥내 투여, (i.v.))), 이는 비히클 대조군, 25 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 또는 0.02 mg/kg 트라스투주맙-사포린/CD71mab-사포린 단일 요법에 비교하여 두 2T2C 조합 그룹 모두에 대해 강력한 종양 퇴화를 나타냈다 (도 24). 2T2C 시스템은 EGFR에 대해 임상적으로 사용되는 모노클로날 항체인, 세툭시맙을 심지어 능가한다. 다음으로 우리는 동일한 실험을 수행했지만 우리는 9일 및 14일에 투여 및 이후 주당 1회 투여의 처리로 25 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4로 시작했다(복강내 주사 (i.p.) + 0.03 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.03 CD71mab-사포린 (정맥내 투여, (i.v.)). 본 발명에 따른 2T2C 시스템은 모든 마우스에서 종양 퇴화를 보였고, 심지어 두 2T2C 그룹 모두에서 1마리의 마우스에서도 완전한 종양 소거(eradication)(종양 부피 = 0 mm3)을 나타냈다(도 25). 또한 여기에서 대조군은 종양 부피의 강한 증가를 보인 반면, 이 A431 마우스 모델에 대한 양성 대조군인, 세툭시맙은 종양 성장 억제만을 나타내었지만 퇴화는 나타내지 않았다(도 25). 이는, 종양 함유 마우스의 고형 종양의 세포질에서 치료 단백질 독소의 고효율 표적화된 전달을 유도하는 세툭시맙 접합된 SO1861 + 트라스투주맙 접합된 단백질 독소 또는 CD71mab 접합된 단백질 독소의, 본 발명에 따른 2T2C 시스템 접근을 보여주고 가능하게 하며, 따라서 일부 마우스에서는 심지어 완전한 종양 소거를 유도하고 다른 마우스에서는 큰 크기의 종양(2000mm3)에서도 강력한 종양 퇴화를 유도한다.
2 표적 2성분 시스템(시험관내)
결과
2 표적 2-성분 시스템(2T2C)은 mAb1-SO1861 및 mAb2-단백질 독소의 조합 처리이다(도 37. SO1861-EMCH는 DAR 3,7로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 세툭시맙(인간 EGFR을 인식하고 결합하는 모노클로날 항체)에 접합되어 (세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7)로 되었다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7은 50pM의 트라스트주맙-사포린(단백질 독소에 접합된 트라스투주맙, 사포린)의 고정 농도에 적정되었고 EGFR/HER2 발현 세포(A431, EGFR++/HER2+/-, CaSKi, EGFR+/HER2+/-)에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸은 도 37에 도시되 바과 같이 결정되었다. 이는 낮은 농도의 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7에서 강력한 세포 사멸을 나타내는(A431: IC50= 3 nM 및 CaSKi IC50= 10 nM; 도 26A, 26B) 반면, 등가 농도(equivalent concentration)의 세툭시맙, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 또는 세툭시맙 + 50 pM 트라스투주맙-사포린은 EGFR/HER2 발현 세포에서 임의의 세포 사멸 활성을 유도할 수 없었다. 이는 상대적으로 낮은 농도의 세툭시맙-SO1861 접합체가 트라스투주맙 접합된 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 향상시켜(비-유효 농도에서), 이에 의해 높은 EGFR/낮은 HER2 발현 세포의 효율적인 세포 사멸을 유도한다는 것을 나타낸다.
다음으로, 트라스투주맙-사포린을 75nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7의 고정 농도에 적정하고 EGFR/HER2 발현 세포에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 결정하였다. 이는 낮은 농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7이 EGFR/HER2 발현 세포에서 이미 효율적인 세포 사멸을 유도함을 나타내었으며(A431:IC50= 5 pM; 및 CaSKi:IC50= 1 pM; 도 26C 및 26D), 반면 트라스투주맙-사포린 단독 또는 트라스투주맙-사포린 + 75 nM 세툭시맙은 두 세포주에서 유의한 세포 사멸 활성(IC50> 10.000 pM)을 나타내지 않았다(도 26C, 26D). 이 모두는 상대적으로 낮은 농도의 트라스투주맙-사포린이 효과적일 수 있고 높은 EGFR/낮은 HER2 발현 세포에서 낮은 세툭시맙-SO1861 접합체 농도와 조합하여 세포 사멸을 유도할 수 있음을 나타낸다.
다음으로, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7을 50pM 트라스트주맙-사포린의 고정 농도에 적정하고 HeLa(EGFR+/-/HER2+/-) 또는 A2058(EGFR-/HER2+/-)에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸은 도 37에 도시된 바와 같이 결정되었다. HeLa(EGFR+/-/HER2+/-) 및 A2058(EGFR-/HER2+/-) 세포 모두 낮은 농도의 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 + 50 pM 트라스투주맙-사포린에서 세포 사멸을 나타내지 않는다 (HeLa: IC50= 400nM, A2058: IC50> 400nM, 도 27A, 27B). 이는 충분한 수용체 발현이 없는 경우에 효과적인 세포내 전달된 SO1861 농도가 단백질 독소의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 유도하는데 (역치에) 도달되지 않음을 나타낸다. 다음으로, 트라스투주맙-사포린은 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7의 고정된 농도에 적정되었고 HeLa(EGFR+/-/HER2+/-) 또는 A2058(EGFR-/HER2+/-)에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸이 결정되었다. HeLa(EGFR+/-/HER2+/-) 및 A2058(EGFR-/HER2+/-) 세포 모두는 세포 사멸 활성을 나타내지 않았다(HeLa: IC50> 10.000 pM; A2058: IC50> 10.000 pM; 도 27C, 27D). 이 모두는, 세포의 세포질내 독소의 엔도솜 탈출을 보장하기에 충분한 SO1861(역치)의 항체-매개 전달을 촉진하는 충분한 EGFR 수용체의 부족으로 인하여, EGFR 수용체 발현이 낮거나 없는 세포가 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 + 트라스투주맙-사포린의 조합에 민감하지 않음을 나타낸다.
다음으로, SO1861-EMCH는 DAR4로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 트라스트주맙(인간 HER2를 인식하고 결합하는 모노클로날 항체)에 접합되어 (트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4)를 형성하였다. 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4는 고정 온도의 1.5pM EGF디안틴(EGFR 표적화된 리간드 독소 융합 단백질)에 적정되었고 HER2/EGFR 발현 세포(SK-BR-3: HER2++/EGFR+/-)에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸이 결정되었다. 이는 낮은 농도의 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 1.5pM EGF디안틴에서 강력한 세포 사멸을 나타내었으며(SK-BR-3: IC50= 1nM; 도 28A), 반면 등가 농도(equivalent concentration)의 트라스트주맙, 트라스트주맙-(Cys- L-SO1861)4 또는 트라스트주맙 + 1.5pM EGF디안틴은 HER2++/EGFR+/- 발현 세포에서 임의의 세포 사멸 활성을 유도할 수 없었다. 이는 트라스투주맙 접합된 SO1861이 EGF 융합 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 향상시켜(비효과적인 농도에서), 높은 HER2/낮은 EGFR 발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 나타낸다.
다음으로, EGF디안틴은 2.5nM 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4의 고정 농도에 적정되었고 SK-BR-3(HER2++/EGFR+/-) 발현 세포에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸이 결정되었다. 이는 낮은 농도의 EGF디안틴과 조합된 2.5nM 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4가 HER2/EGFR 발현 세포에서 이미 효율적인 세포 사멸을 유도하였으며(SK-BR-3: IC50=1pM)(도 28B), 반면에 EGF디안틴 단독 또는 EGF디안틴 + 2.5 nM 트라스트주맙은 세포 사멸 활성을 나타내지 않음(IC50>10.000 pM)(도 5-6B)을 나타낸다. 이 모두는 상대적으로 낮은 농도의 EGF디안틴이 효과적일 수 있고 높은 HER2/낮은 EGFR 발현 세포에서 낮은 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4 농도와 조합하여만 세포 사멸을 유도할 수 있음을 나타내었다.
다음으로, 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4는 1.5pM EGF디안틴의 고정 농도에 적정되었고 JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-) 또는 MDA-MB-468: HER2-/EGFR++)에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸이 결정되었다. 두 세포주는 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 1.5pM EGF디안틴(JIMT-1: IC50> 1000nM; MDA-MB-468: IC50> 1000nM; 도 29A, 29B)의 임의의 조합에 대해 민감하지 않았다. 이는 충분한 HER2 수용체 발현이 없는 경우, 엔도솜 탈출 및 단백질 독소의 세포질 전달을 유도하기에 효과적인 세포내 전달된 SO1861 농도에 (역치에) 도달하지 않음을 나타낸다.
다음으로, EGF디안틴은 2.5nM 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4의 고정 농도에 적정되었고 JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-) 또는 MDA-MB-468(HER2-/EGFR++)에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸이 결정되었다. 두 세포주 모두 2,5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4의 유무에 관계없이 높은 EGF디안틴 농도에서 세포 사멸을 나타내었다 (JIMT-1: IC50= 10.000 pM; MDA-MB-468: IC50= 200 pM, 도 29C, 29D).
이 모두는 세포의 세포질내 독소의 엔도솜 탈출을 보장하기에 충분한 SO1861(역치)의 항체-매개 전달을 촉진하는 충분한 HER2 수용체의 부족으로 인하여, HER2 수용체 발현이 낮거나 없는 세포가 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 + 1.5pM EGF디안틴의 조합에 민감하지 않음을 나타낸다.
다음으로, SO1861-EMCH는 DAR 4로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 트라스투주맙(인간 HER2를 인식하고 결합하는 모노클로날 항체)에 접합되었다(트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4). 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4는 5pM 세툭시맙-사포린(EGFR 표적화 항체-단백질 독소 접합체)의 고정 농도에 적정되었으며, HER2/EGFR 발현 세포(SK-BR-3: HER2++/EGFR+/-)에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸이 도 37에 도시된 바와 같이 결정되었다.
이는 낮은 농도의 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 5 pM 세툭시맙-사포린에서 강력한 세포 사멸을 나타내는(SK-BR-3: IC50= 1 nM; 도 30A) 반면, 등가 농도의 트라스투주맙, 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 또는 트라스투주맙 + 5 pM 세툭시맙-사포린은 HER2++/EGFR+/- 발현 세포에서 임의의 세포 사멸 활성을 유도할 수 없었다. 이는 트라스투주맙 접합된 SO1861이 세툭시맙 접합된 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 향상시켜(비효과적인 농도에서), HER2++/EGFR+/- 발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 나타낸다.
다음으로, 세툭시맙-사포린은 2.5nM 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 75nM 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4의 고정 농도에 적정되었고 HER2/EGFR 발현 세포 (SK-BR-3: HER2++/EGFR+/-)에 대한 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸이 결정되었다. 이는 낮은 농도의 세툭시맙-사포린과 조합된 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4가 SK-BR-3 세포에서 이미 효과적인 세포 사멸을 유도했음을 나타내는(SK-BR-3: IC50= 1 pM; 도 30B) 반면, 세툭시맙-사포린 단독 또는 세툭시맙-사포린 + 2.5nM 트라스투주맙은 고농도 트라스투주맙-사포린에서만 세포 사멸을 나타내었다(SK-BR-3: IC50> 4000 pM; 도 30B). 이 모두는 상대적으로 낮은 농도의 세툭시맙-사포린이 효과적일 수 있고 HER2++/EGFR+/- 발현 세포에서 낮은 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 농도와의 조합에서만 세포 사멸을 유도할 수 있음을 나타낸다.
다음으로, 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4는 5 pM 세툭시맙-사포린의 고정 농도에 적정되었고 JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-) 및 MDA-MB-468 (HER2-/EGFR++) 세포에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸이 결정되었다. 두 세포주는 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 5pM 세툭시맙-사포린의 조합에 대해 민감하지 않았다 (JIMT-1: IC50> 1000 nM; MDA-MB-468: IC50> 1000nM; 도 31A, 31B). 이는 충분한 HER2 수용체 발현이 없는 경우, 엔도솜 탈출 및 단백질 독소의 세포질 전달을 유도하기에 효과적인 세포내 전달된 SO1861 농도에 (역치에) 도달하지 않음을 나타낸다.
다음으로, 세툭시맙-사포린은 2.5nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4의 고정 농도에 적정되었고 JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-) 및 MDA-MB-468 (HER2-/EGFR++) 세포에 대한 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸이 결정되었다. 두 세포주는 2.5nM 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4의 유무에 관계없이 유사한 세툭시맙-사포린 농도에서 세포 사멸을 나타내었다(JIMT-1: IC50= 80pM; MDA-MB-468: IC50= 100pM; 도 31C, 31D).
이 모두는, 세포의 세포질내 독소의 엔도솜 탈출을 보장하기에 충분한 SO1861(역치)의 항체-매개된 전달을 촉진하는 충분한 HER2 수용체가 없기 때문에, HER2 수용체 발현이 낮거나 없는 세포가 트라스트주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 세툭시맙-사포린의 조합에 민감하지 않음을 나타낸다.
접합된 SO1861의 활성이 엔도솜 구획의 산성화에 의해 유도된다는 것을 보여주기 위해, 본 발명에 따른 2T2 성분 시스템을 엔도솜 산성화 억제제인 클로로퀸과 조합하여 테스트하였다. 트라스트주맙-사포린 + 77 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 또는 트라스트주맙-디안틴 + 77 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9는 A431(EGFR++/HER2+/-) 세포에서 강한 세포 사멸을 나타내었으나, 반면 본 발명에 따른 이러한 2T2C 활성은, 800 nM 클로로퀸이 두 조합에 동시 투여될 때 억제되었다(도 32A). CD71mab-사포린 + 10.5 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 + 500 nM 클로로퀸이 A431(EGFR++/CD71+) 및 MDA-MB-468(EGFR++/CD71+) 세포에서 테스트되었을 때 (도 32B, 9C) 또는 CD71mab-사포린 + 5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 500 nM 클로로퀸이 SK-BR-3(HER2++/CD71+) 세포에서 테스트되었을 때(도 32D), 동일한 결과가 관찰되었다. 이는 엔도솜의 산성화가 차단될 때, 2T2C 시스템내에서 접합된 SO1861의 세포내 활성이 억제될 수 있음을 나타낸다.
2 표적 2-성분 시스템(2T2C)은 또한 mAb1-SO1861 및 mAb2-안티센스 BNA 올리고 뉴클레오티드의 조합 처리이다(도 38). 따라서, 2T2C 시스템은 또한 암 특이적 표적 유전자인 열 충격 단백질 27(HSP27)의 mRNA에 대해 안티센스 BNA 올리고뉴클레오티드와 조합하여 테스트되었다. 세포질내로 방출시, 안티센스 BNA는 HSP27을 인코딩하는 mRNA를 인식하고 결합하여 파괴를 위해 mRNA를 표적화함으로써 암세포내에서 HSP27 발현을 고갈시킨다. HSP27BNA는 DAR4.4(트라스트주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4)와 함께 트라스트주맙에 접합되었고, 도 38에 도시된 바와 같이, A431(EGFR++/HER2+/-) 세포 및 A2058(EGFR-/HER2+/-) 세포에서의 HSP27 유전자 침묵 활성의 향상에 대해 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9와 함께 테스트되었다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9를 100nM 트라스트주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4의 고정 농도에 적정하였고 표적화된 HSP27BNA-매개 유전자 침묵 활성을 결정하였다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 + 100 nM 트라스투주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4는, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 단독과 비교하여 A431 세포(EGFR++/HER2+/-)에서 강력한 유전자 침묵 활성을 나타낸다(A431: IC50= 1 nM; 도 33A). A2058 세포(EGFR-/HER2+/-)에서, 본 발명에 따른 조합은 HSP27 유전자 침묵을 나타내지 않았다(A2058: IC50 > 100nM; 도 33B). 이는 세툭시맙 접합된 SO1861이 트라스투주맙 접합된 BNA 올리고 뉴클레오티드의 엔도솜 탈출을 (비효과적인 농도에서) 효율적으로 향상시켜, EGFR++/HER2+/- 발현 세포에서 표적 유전자 침묵을 유도한다는 것을 나타낸다.
다음으로, 트라스트주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4를 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9의 고정 농도에 적정하고 도 38에 도시된 바와 같이 A431(EGFR++/HER2+/-) 세포 및 A2058(EGFR-/HER2+/-) 세포에서 표적화된 HSP27BNA-매개 유전자 침묵 활성이 결정되었다. 트라스트주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 + 77 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9는 A431 세포(EGFR++/HER2+/-)에서 강력한 유전자 침묵 활성을 나타내며(A431: IC50= 1nM; 도 33C), 반면 트라스투주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 단독 또는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9 단독 또는 트라스투주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 + 77 nM 세툭시맙은 임의의 유의미한 유전자 침묵 활성을 나타내지 않았다(IC50>100nM). A2058(EGFR-/HER2+/-) 세포는 본 발명에 따른 조합에서 임의의 유전자 침묵 활성을 타내지 않았다(A2058: IC50> 100nM; 도 33D). 이 모두는 상대적으로 낮은 농도의 트라스투주맙-HSP27BNA가 HER2++/EGFR+/- 발현 세포에서 낮은 농도의 세툭시맙-(-L-SO1861) 농도와 조합된 경우에만 세포 사멸에 효과적일 수 있고 유도할 수 있음을 나타낸다.
2 표적 2-성분 시스템(2T2C)은 또한 mAb1-(덴드론(-SO1861)n)n 및 mAb2-단백질 독소의 조합 처리일 수 있다. 덴드론(-L-SO1861)4는 DAR3,9로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 항-EGFR 항체인 세툭시맙에 접합되었으며(세툭시맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)3,9), 도 39에 도시된 바와 같이 MDA-MB-468(EGFR++/CD71+) 발현 세포에서 항-CD71 항체 단백질 독소 접합체(CD71mab-사포린)와 조합하여 향상된 세포 사멸 활성에 대해 테스트되었다. 세툭시맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)3,9 + 10 pM CD71mab-사포린은 MDA-MB-468(EGFR++/CD71+) 발현 세포에서 독소-매개 세포 사멸을 효율적으로 유도하며(IC50= 0.4 nM, 도 34A), 반면에 이는 세툭시맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)3,9) 또는 세툭시맙 + 10 pM CD71mab-사포린 또는 세툭시맙에 의해 유도될 수 없었다(도 34A). 이는 세툭시맙 접합된 덴드론(-L-SO1861)4가 CD71mab-단백질 독소의 엔도솜 탈출을 (비-효과적인 농도에서) 효율적으로 향상시켜 EGFR++/CD71+ 발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 나타낸다. 유사한 실험이 HeLa 세포(HER2+/-/CD71+) 세포에서 수행되었으며 이는 세툭시맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)3,9) + 10pM CD71mab-사포린의 활성을 나타내지 않았으며 (IC50> 100nM, 도 34B), 이는 충분한 EGFR 수용체 발현이 없는 경우, 단백질 독소의 세포질 전달 및 엔도솜 탈출을 유도하기에 효과적인 세포내 SO1861 농도(역치)에 도달하지 않음을 나타낸다.
다음으로, 덴드론(-L-SO1861)4를 DAR4로 시스테인 접합(Cys)을 통해 항-HER2 항체인 트라스트주맙에 접합하여, 트라스트주맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4를 형성하고, SK-BR-3 세포(HER2++/CD71+) 발현 세포에서 항-CD71 항체 단백질 독소 접합체(CD71mab-사포린)와 조합하여 향상된 세포 사멸 활성에 대해 테스트되었다. 트라스투주맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4 + 10 pM CD71mab-사포린은 SK-BR3 세포에서 독소-매개 세포 사멸을 효율적으로 유도하지만(IC50= 3 nM, 도 34C), 이는 트라스투주맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4 또는 트라스투주맙(등가(equivalent)) + 10 pM CD71mab-사포린 또는 트라스투주맙에 의해 유도되지 않았다(도 34C). 이는 본 발명에 따른 트라스투주맙 접합된 덴드론(-L-SO1861)4이 CD71mab-단백질 독소의 엔도솜 탈출을 (비-효과적인 농도에서) 효율적으로 향상시켜 HER2++/CD71+ 발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 나타낸다. 유사한 실험이 JIMT-1 세포(HER2+/-/CD71+)에서 수행되었으며 이는 트라스투주맙-Cys-(덴드론(-L-SO1861)4)4 + 10pM CD71mab-사포린의 활성을 나타내지 않았으며(IC50> 100nM 도 34C), 이는 충분한 HER2 수용체 발현이 없는 경우, 단백질 독소의 세포질 전달 및 엔도솜 탈출을 유도하기에 효과적인 세포내 SO1861 농도(역치)에 도달하지 않음을 나타낸다.
임상적으로 승인된 ADC인 트라스투주맙-엠탄신(T-DM1)은 항-Her2 항체인 트라스투주맙과 소분자 독소 엠탄신(DAR3-4)의 접합체이다. T-DM1은 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4와 조합하여 본 발명에 따라 2T2C 시스템내에서 테스트되었다. T-DM1 + 77 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9는 T-DM1 단독 또는 T-DM1 + 77 nM 세툭시맙과 비교하여 향상된 세포 사멸 활성을 나타내지 않았으나 (IC50= 80.000 pM, 도 35), 반면, 본 발명에 따른 트라스투주맙-사포린 + 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7은 트라스투주맙-사포린 + 75 nM 세툭시맙 또는 트라스투주맙-사포린 단독에 비하여 향상된 세포 사멸 활성을 나타내었다 (IC50=3 pM, 도 35). 이 모두는 2T2C 시스템이 이미 수동적으로 세포(엔도솜) 막을 통과할 수 있는, 항체 접합된 소분자의 전달을 향상시키지 않음을 나타낸다.
결과
2 표적 2-성분 시스템(1T2C)은 또한 mAb1-QSmix(퀼라자 스포나리아로부터의 사포닌 혼합물) 및 mAb2-단백질 독소의 조합 치료일 수 있다.
QSmix-EMCH를 DAR 4.1로 시스테인 잔기(Cys)를 통해 세툭시맙(인간 EGFR을 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 접합하였다(세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1). (세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1)을 고정된 농도의 10 pM 트라스투주맙-사포린 또는 CD71mab-사포린 상에서 적정하고, A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+) 및 CaSKi(EGFR+/HER2+/-/CD71+) 상에서 표적화된 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저 농도의 세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1 + 10 pM 트라스투주맙-사포린(A431: IC50= 100 nM; 도 36A CaSKi: IC50= 10 nM 도 36B)에서뿐만 아니라 세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1 + 10 pM CD71mab-사포린(A431: IC50= 3 nM, 도 36A; CaSKi: IC50= 0.8 nM, 도 36B)에서 강한 세포 사멸을 나타내었으나, 반면에 세툭시맙, 세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1 또는 세툭시맙 + 10 pM 트라스투주맙-사포린 또는 세툭시맙 + 10 pM CD71mab-사포린은 EGFR++/HER2+/-/CD71+ 또는 EGFR+/HER2+/-/CD71+ 발혀 세포에서 어떠한 세포 사멸을 유도할 수 없는 것으로 나타났다. 이는 비교적 낮은 농도의 세툭시맙-QSmix 접합체가 (비유효 농도에서) 트라스투주맙 접합된 단백질 독소뿐만 아니라 CD71mab 접합된 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 증진시켜, EGFR++/HER2+/-/CD71+ 또는 EGFR+/HER2+/-/CD71+ 발현 세포의 효율적인 세포 사멸을 유도함을 보여준다. 동일한 실험이 A2058 세포(EGFR-/HER2+/-/CD71+) 상에서 수행된 경우, 세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1 + 10 pM 트라스투주맙-사포린 또는 세툭시맙-(Cys-L-QSmix)4,1 + 10 pM CD71mab-사포린의 활성은 관찰될 수 없었으며(도 36C), 이는 충분한 EGFR 수용체 발현의 부재하에서, 단백질 독소의 엔도솜 탈출 및 세포질 운반을 유도하기 위한 효과적인 세포내 전달된 QS 사포닌 농도(역치)에 도달하지 않음을 나타낸다.
실시예 5
세툭시맙(인간 EGFR을 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 S01861은 시스테인 잔기(Cys)를 통해 접합되고(불안정성), 디안틴(단백질 독소)은 리신 잔기(Lys)를 통해 접합되어(안정성), 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-디안틴)2이 생성되었다. 이 접합체는 A431 (EGFR++) 이종이식 마우스 종양 모델에서 도 47에 도시된 바와 같이 EGFR 종양 표적화된 세포 사멸에 대해 시험되었다. 종양이 ~150㎣의 크기에 도달한 12일째에 투여를 시작하고, 매 투여 후 종양 부피를 측정하였다. 마우스(n=3)를 12일째에 0.5 mg/kg; 15일째에 1 mg/kg 그리고 24일째에 1.5 mg/kg으로 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-디안틴)2 또는 세툭시맙-(Lys-S-디안틴)1,6으로 치료(복강내; i.p.; 투여량 증가)하였다. 26일째에, 대조군에 비해, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-디안틴)2으로 처리된 종양 함유 마우스에서 종양 부피 감소가 관찰될 수 있었다(도 40A). 이는 항체-단백질 독소(안정성) 접합체에 대한 SO1861의 불안정성 접합이 종양 표적화된 항체-단백질 독소의 표적화된 치료 효능을 증진시켜, 보다 효과적인 종양 표적 치료를 유도할 수 있음을 보여준다.
다음으로, 세툭시맙(인간 EGFR을 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 S01861은 시스테인 잔기(Cys)를 통해 접합되고(불안정성), 디안틴(단백질 독소)은 리신 잔기(Lys)를 통해 접합되어(안정성), 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-디안틴)2이 생성되었다. 이 접합체는 A431(EGFR++) 이종이식 마우스 종양 모델에서 도 47에 도시된 바와 같이 EGFR 종양 표적화된 세포 사멸에 대해 시험되었다. 종양이 ~150㎣의 크기에 도달한 12일째에 투여를 시작하고, 매 투여 후 종양 부피를 측정하였다. 마우스(n=3)를 12일째에 0.5 mg/kg; 15일째에 1 mg/kg 그리고 24일째에 1.5 mg/kg으로 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-디안틴)2 또는 세툭시맙-(Lys-L-디안틴)1,6으로 치료(복강내; i.p.; 투여량 증가)하였다. 이는 35일 후에, 대조군에 비해, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-디안틴)2으로 처리된 종양 함유 마우스에서 종양 성장 억제가 나타났다(도 40B). 마우스(n=3)를 12일째에 0.5 mg/kg; 15일째에 1 mg/kg, 18일째에 2 mg/kg, 24일째에 2.5 mg/kg으로 본 발명에 따른 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-디안틴)2으로 치료(정맥내; i.v.; 투여량 증가)한 경우에도 대조군에 비해 종양 성장 억제가 관찰될 수 있었다(데이터는 마우스 1마리에 대해 나타내었으며, 2마리는 치료 도중에 사망하였기 때문이다). 이는 항체-단백질 독소(불안정성) 접합체에 대한 SO1861의 불안정성 접합이 종양 표적화된 항체-단백질 독소의 표적화된 치료 효능을 증진시켜, 보다 효과적인 종양 표적 치료를 유도할 수 있음을 보여준다.
다음으로, 세툭시맙(인간 EGFR을 인식 및 결합하는 모노클로날 항체)에 S01861-EMCH는, DAR 3.9로, 시스테인 잔기(Cys)를 통해 접합되고(불안정성), (암세포에서 온코-표적 hsp27 mRNA의 분해를 표적 및 유도(유전자 침묵)하는) 안티센스 HSP27BNA 올리고 뉴클레오티드는, DAR 1.8로, 불안정한 (L) 링커를 통해 항체의 리신 잔기(Lys)에 접합되어, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8이 생성되었다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8는 A431 이종이식 '누드' 마우스 종양 모델에서 도 48에 도시된 바와 같이 본 발명에 따라 EGFR-매개 종양 표적화된 유전자 침묵에 대해 시험되었다. 종양이 ~150㎣의 크기에 도달한 12일째에 투여를 시작하고, HSP27 mRNA 발현을 측정하였다. 이를 위해, 1차 투여 후 72h에 종양 샘플을 수집하고, 세포 대조군 mRNA 발현 수준(레퍼런스 유전자)과 비교한 HSP27 유전자 발현 수준을 분석하였다. 30 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8로 치료한 종양 함유 마우스(n=3)는 1 투여 후에, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 또는 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)1,5 의 단일 투여에 비해 종양에서 HSP27 mRNA 발현의 40% 감소를 나타내었다(도 41). 비히클 대조군의 종양에 비해, 25% HSP27 유전자 발현의 감소가 관찰되었다. 이는 본 발명에 따른, 동일한 표적 항체에 대한 S01861 및 HSP27BNA의 접합체가 종양 함유 마우스의 고형 종양에서 치료 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 SOI861-매개 증진된 세포질 전달을 효율적으로 유도하여, 종양 표적화된 유전자 침묵을 유도함을 보여주고 가능하게 한다.
또 다른 예에서, 3작용성 링커 스캐폴드는 SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA를 생성하기 위해 한쪽 팔에 SO1861과 다른 쪽 팔에 HSP27BNA와의 접합을 위해 3개의 특이적 화학 말단기로 디자인 및 제조되었다. 다음으로, SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA는 항-EGFR 항체인 세툭시맙(세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA)3.7)의 시스테인 잔기(Cys)에 세 번째 팔과 접합되고, 도 49에 예시된 바와 같이 본 발명에 따라 EGFR-매개 종양 표적화된 유전자 침묵 활성에 대해 A431 이종이식 '누드' 마우스 종양 모델에서 시험되었다. 종양이 ~150㎣의 크기에 도달한 12일째에 투여를 시작하고, HSP27 mRNA 발현을 측정하였다. 이를 위해, 1차 투여 후 72h에 종양 샘플을 수집하고, 세포 대조군 mRNA 발현 수준(레퍼런스 유전자)과 비교한 HSP27 유전자 발현 수준을 분석하였다. 이는 30 mg/kg 세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA)3.7의 1 투여가 25 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 또는 25 mg/kg 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4 단일 치료의 단일 투여에 비해 종양에서 HSP27 유전자 발현의 40% 감소를 일으키는 것으로 나타났다(도 42). 비히클 대조군 종양에 비해, 세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA)3.7의 1 투여로 처리된 종양 함유 마우스에서 25% HSP27 유전자 발현의 감소가 관찰되었다. 이는 세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA)3.7이 종양 함유 마우스의 고형 종양에서 치료 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 SOI861-매개 증진된 세포질 전달을 효율적으로 유도하여, 생체내에서 종양 표적화된 유전자 침묵을 유도함을 보여주고 가능하게 한다.
본 발명에 따른 또 다른 예에서, SO1861(불안정) 및 단백질 독소, 디안틴(불안정 또는 안정)은 HER2 표적화 항체, 트라스투주맙에 접합되었다. 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-디안틴)1,7 또는 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-디안틴)1,7이 제조되고, 도 47에 도시된 바와 같이 SK-BR-3(HER2++) 및 MDA-MB-468 (HER2-) 세포에서 증진된 세포 사멸에 대해 시험되었다. 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-디안틴)1,7 (IC50= 0,8 nM) 및 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-디안틴)1,7 (IC50= 0,8 nM) 모두 SK-BR-3 세포(HER2++)의 세포 사멸을 효율적으로 유도한다(도 43A). 이는 트라스투주맙, 트라스투주맙-(Lys-L-디안틴)1,7, 트라스투주맙-(Lys-S-디안틴)1,7 또는 트라스투주맙-(L-SO1861)3,8 단독으로 처리된 SK-BR-3 세포에서는 관찰되지 않았다(도 43A). MDA-MB-468 세포(HER2-)에서, 본 발명에 따른 접합체 중 어느 것에 대해도 세포 사멸 활성이 관찰될 수 없었다(도 43B). 이것은 HER 표적화 항체-단백질 독소 접합체에 대한 SO1861의 접합이 표적 세포에서 단백질 독소의 SO1861-매개 증진된 세포질 전달을 효과적으로 유도하여, 표적 세포 사멸을 초래함을 보여준다.
본 발명에 따른 또 다른 예에서, SO1861(불안정) 및 단백질 독소, 디안틴(불안정 또는 안정)은 EGFR 표적 항체, 세툭시맙에 접합되었다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-디안틴)2 또는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-디안틴)2이 제조되고, 도 47에 도시된 바와 같이 A431 세포(EGFR++) 및 A2058 세포(EGFR-)에서 증진된 세포 사멸에 대해 시험되었다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-디안틴)2 (IC50= 0,3 nM) 및 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-디안틴)1,7 (IC50= 0,3 nM) 모두 세툭시맙-(Lys-L-디안틴)1,6 (IC50= 2pM), 세툭시맙-(Lys-S-디안틴)1,6 (IC5= 2pM) 단독에 비해 A431 세포(EGFR++)에서 증진된 세포 사멸을 나타내었다(도 43C). A2058 세포(EGFR-)에서, 본 발명에 따른 조합은 어떠한 세포 사멸 활성을 보니지 않았다(IC50> 200nM; 도 43D). 이는 EGFR 표적화 항체-단백질 독소 접합체에 대한 SO1861의 접합이 표적 세포에서 단백질 독소의 SO1861 매개 세포질 전달을 효율적으로 증진시켜, 표적 세포 사멸을 증진시킨다는 것을 보여준다.
본 발명에 따른 또 다른 실시예에서, SO1861(불안정) 및 HSP27BNA 올리고(불안정)는 EGFR 표적화 항체, 세툭시맙에 접합되었다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8이 제조되고, 도 48에 도시된 바와 같이 본 발명에 따라 A431 세포(EGFR++) 및 A2058(EGFR-) 세포에서 증진된 HSP27 유전자 침묵에 대해 시험되었다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8은 세툭시맙, 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)3,9 또는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8 단독에 비해 A431 세포(IC50= 3nM)에서 HSP27 유전자 침묵을 효율적으로 유도한다(도 44A). A2058 세포(EGFR-)에서는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8 로 처리된 경우에 유전자 침묵 활성이 관찰될 수 없었다(IC50> 100nM; 도 44B). 이는 본 발명에 따른 동일한 표적화 항체에 대한 SO1861 및 HSP27BNA의 접합이 표적 세포에서 치료 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 SO1861-매개 증진된 세포질 전달을 효과적으로 유도하여, 표적화된 유전자 침묵을 유도함을 나타내고 가능하게 한다.
본 발명에 따른 또 다른 예에서, SO1861(불안정) 및 HSP27BNA 올리고(불안정)는 HER2 표적화 항체, 트라스투주맙에 접합되었다. 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5은 도 48에 도시된 바와 같이 본 발명에 따라 SK-BR-3 세포(HER2++)에서 증진된 HSP27 유전자 침묵에 대해 시험되었다. 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5는 트라스투주맙-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 단독에 비해 SK-BR-3 세포(IC50= 9 nM)에서 HSP27 유전자 침묵을 효율적으로 유도한다(도 45). 이는 본 발명에 따른 HER2 표적화 항체에 대한 SO1861 및 HSP27BNA의 접합이 표적 세포에서 치료 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 SO1861-매개 증진된 세포질 전달을 효과적으로 유도하여, 표적화된 유전자 침묵을 유도함을 나타내고 가능하게 한다.
또 다른 예에서, 세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA)3,7은 도 3에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 A431(EGFR++) 및 A2058(EGFR-) 세포에서 증진된 HSP27 유전자 침묵에 대해 시험되었다. 세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA)3,7은 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4 또는 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 단독에 비해 A431 세포(IC50= 2nM)에서 HSP27 유전자 침묵을 효율적으로 유도한다(도 46A). A2058 세포(EGFR-)에서 유전자 침묵 활성은 높은(> 80nM) 농도의 세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA)3,7(IC50=100nM; 도 46B)에서만 관찰되었다. 이것은 높은 EGFR 발현 세포에서 세툭시맙-Cys-(SO1861-L-3작용성 링커-L-HSP27BNA)3,7이 표적 세포에서 치료 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 SO1861-매개 증진된 세포질 전달을 효과적으로 유도하여, 표적화된 유전자 침묵을 유도함을 나타내고 가능하게 한다.
실시예 6
도 50A-D는 트라스투주맙(도 50A), 세툭시맙(도 50B) 또는 T-DM1(도 50C), 비접합 단백질 독소, 사포린, 디안틴 및 (비-세포 결합) IgG 항체에 접합된 사포린(도 50D)이 다양한 암 세포주 SK-BR-3, JIMT-1, MDA-MB-468, A431, CaSki, HeLa, A2058에 투여된 경우, 상대적인 세포 생존력을 나타낸다.
트라스투주맙과 세툭시맙은 대부분의 세포주에 노출되었을 때 세포 생존율에 영향을 미치지 않거나 거의 영향을 미치지 않으며, 트라스투주맙이 SK-BR-3 세포에 비교적 높은 농도로 노출되었을 때 HER2 성장 인자 수용체의 기능을 차단하여 세포 성장 억제에 약간의 영향을 미치며, 그리고 세툭시맙이 MDA-MB-468 세포에 비교적 높은 용량으로 노출될 때 EGFR 성장 인자 수용체의 기능을 차단하여 세포 성장 억제에 약간의 영향을 미친다.
TDM-1, 또는 아도-트라스투주맙 엠탄신은 이전에 허셉틴(Herceptin)(화학명: 트라스투주맙) 및 탁산 화학요법으로 치료받은 HER2 양성 전이성 유방암; 허셉틴 및 탁산(taxane) 화학요법으로 신보조(neoadjuvant)(수술 전) 치료 후 잔류 질환이 발견된 경우 수술 후 초기 HER2 양성 유방암을 치료하는 미 식품의약국에 의해 승인된 표적 치료제이다. TDM-1은 허셉틴(트라스투주맙)과 화학요법 의약 엠탄신의 조합이다. 도 8C는 TDM-1이 >1000 pM 농도에서 시험된 모든 세포주에 대해 감소된 세포 생존율을 초래함을 보여준다.
유리 독소 사포린 및 디안틴 및 시험된 세포주 상의 어느 세포 표면 분자에 대한 친화도가 없는 대조군 IgG에 커플링된 독소 사포린은, 시험된 독소의 최대 100,000 pM의 광범위한 농도에 걸쳐 세포 생존에 영향을 미치지 않거나 거의 영향을 미치지 않는다(도 50D).
실시예 7
덴드론(-L-S01861) n 합성(도 52, 53, 54)
재료 및 방법
약어
DCM dichloromethane(디클로로메탄)
DIPEA N,N-diisopropylethylamine(N,N-디이소프로필에틸아민)
DMF N,N-dimethylformamide(N,N-디메틸포름아미드)
EDCI.HCl 3-((Ethylimino)methyleneamino)-N,N-dimethylpropan-1-aminium chloride(3-((에틸이미노)메틸렌아미노)-N,N-디메틸프로판-1-아미늄 클로라이드)
EMCH.TFA N-(ε-maleimidocaproic acid) hydrazide, trifluoroacetic acid salt(N-(ε-말레이미도카프로산)히드라지드, 트리플루오로아세트산염)
min minutes(분)
r.t. retention time(체류 시간)
TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드)
Temp temperature(온도)
TFA trifluoroacetic acid(트리플루오로아세트산)
THF tetrahydrofuran(테트라하이드로퓨란)
분석 방법
LC-MS 방법 1. 1
장치: Agilent 1200 Bin. 펌프: G1312A, 탈기기; 자동 샘플 주입기, ColCom, DAD: Agilent G1316A, 210, 220 및 220-320 nm, PDA: 210-320 nm, MSD: Agilent LC/MSD G6130B ESI, pos/neg 100-1000; ELSD Alltech 3300 가스 유속 1.5 ml/min, 가스 온도: 40℃; 컬럼: Waters XSelectTM CSH C18, 30×2.1mm, 3.5μm, 온도: 35℃, 유속: 1mL/min, 구배: t0 = 5% A, t1.6min = 98% A, t3min = 98% A, 사후 시간: 1.3분, 용리제 A: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산, 용리제 B: 물 중 0.1% 포름산.
LC-MS 방법 2. 2
장치: Agilent 1260 Bin. 펌프: G7112B, 멀티샘플러, Column Comp, DAD: Agilent G7115A, 210, 220 및 220-320 nm, PDA: 210-320 nm, MSD: Agilent LC/MSD G6130B ESI, 생성물의 분자량에 따른 질량 범위:
Apos/neg 100-1000
Bpos/neg 100-1400
; ELSD Alltech 3300 가스 유속 1.5 ml/min, 가스 온도: 40℃; 컬럼: Waters XSelectTM C18, 30×2.1mm, 3.5μm, 온도: 40℃, 유속: 1mL/min, 구배: t0 = 5% A, t1.6min = 98% A, t3min = 98% A, 사후 시간: 1.3분, 용리제 A: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산, 용리제 B: 물 중 0.1% 포름산.
LC-MS 방법 3. 3
장치: Waters IClass; Bin. 펌프: UPIBSM, SM: SO가 있는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, pos/neg 800-1500; ELSD: 가스압력 40psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃; 컬럼: Waters XSelectTM CSH C18, 50×2.1mm, 2.5μm 온도: 25℃, 유속: 0.6mL/min, 구배: t0 = 5% A, t2.0min = 98% A, t2.7min = 98% A, 사후 시간: 0.3분, 용리액 A: 아세토니트릴, 용리액 B: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트(pH=9.5).
LC-MS 방법 4. 4
장치: Waters IClass; Bin. 펌프: UPIBSM, SM: SO가 있는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, pos/neg 1500-2500; ELSD: 가스압력 40psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃; 컬럼: Waters XSelectTM CSH C18, 50×2.1mm, 2.5μm 온도: 25℃, 유속: 0.6mL/min, 구배: t0 = 5% A, t2.0min = 60% A, t2.7min = 98% A, 사후 시간: 0.3분, 용리액 A: 아세토니트릴, 용리액 B: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트(pH=9.5).
LC-MS 방법 5. 5
장치: Waters IClass; Bin. 펌프: UPIBSM, SM: SO가 있는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, 생성물의 분자량에 따른 질량 범위:
Apos/neg 1500-2500
Bneg 2000-3000
; ELSD: 가스 압력 40 psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃; 컬럼: Acquity C18, 50×2.1mm, 1.7μm 온도: 60℃, 유속: 0.6 mL/min, 구배: t0 = 2% A, t5.0min = 50% A, t6.0min = 98% A, 사후 시간: 1.0분, 용리액 A: 아세토니트릴, 용리액 B: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트(pH=9.5).
제조방법
제조용(Preparative) MP-LC 방법 1, 1
기기 유형: Reveleris™ prep MPLC; 컬럼: Waters XSelectTM CSH C18(145×25 mm, 10μ); 유속: 40mL/분; 컬럼 온도: 실온; 용리액 A: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트(pH= .0); 용리제 B: 물 중 99% 아세토니트릴 + 1% 10mM 암모늄 비카보네이트; 구배: t0min = 5% B, t1min = 5% B, t2min = 10% B, t17min = 50% B, t18min = 100% B, t23min = 100% B; 검출 UV: 210, 225, 285 nm.
제조용 MP-LC 방법 2, 2
기기 유형: Reveleris™ prep MPLC; 컬럼: Phenomenex LUNA C18(3)(150x25 mm, 10μ); 유속: 40mL/분; 컬럼 온도: 실온; 용리액 A: 물 중 0.1%(v/v)포름산; 용리제 B: 아세토니트릴 중 0.1%(v/v)포름산; 구배: t0min = 5% B, t1min = 5% B, t2min = 10% B, t17min = 50% B, t18min = 100% B, t23min = 100% B; 검출 UV: 210, 225, 285 nm.
제조용 MP-LC 방법 1, 3
MS 기기 유형: Agilent Technologies G6130B Quadrupole; HPLC 기기 유형: Agilent Technologies 1290 분취용 LC; 컬럼: Waters XSelectTM CSH(C18, 100×30mm, 10μ); 유속: 25ml/분; 컬럼 온도: 실온; 용리액 A: 100% 아세토니트릴; 용리제 B: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트 pH=9.0; lin. 생성물의 극성에 따른 선형(lin.) 구배:
At0 = 20% A, t2min = 20% A, t8.5min = 60% A, t10min = 100% A, t13min = 100% A
Bt0 = 5% A, t2min = 5% A, t8.5min = 40% A, t10min = 100% A, t13min = 100% A
Ct0 = 10% A, t2min = 10% A, t8.5min = 50% A, t10min = 100% A, t13min = 100% A
; 검출: DAD(220-320 nm); 검출: MSD(ESI pos/neg) 질량 범위: 100 - 800; DAD 기반 분획 수집.
제조용 MP-LC 방법 2, 4
MS 기기 유형: Agilent Technologies G6130B Quadrupole; HPLC 기기 유형: Agilent Technologies 1290 제조용 LC; 컬럼: Waters XBridge Shield(C18, 150×19mm, 5μ); 유속: 25ml/분; 컬럼 온도: 실온; 용리액 A: 100% 아세토니트릴; 용리제 B: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트 pH=9.0; 선형 구배: t0 = 5% A, t2.5min = 5% A, t11min = 40% A, t13min = 100% A, t17min = 100% A; 검출: DAD(220-320 nm); 검출: MSD(ESI pos/neg) 질량 범위: 100 - 800; DAD 기반 분획 수집.
플래시 크로마토그래피
Grace Reveleris X2® C-815 플래시; 용매 전달 시스템: 자동 프라이밍 기능이 있는 3-피스톤 펌프, 단일 실행에서 최대 4개의 용매가 있는 4개의 독립 채널, 용매가 고갈되면 자동 전환되는 라인; 최대 펌프 유속 250mL/min; 최대 압력 50bar(725psi); 검출: UV 200-400nm, 최대 4개의 UV 신호 조합 및 전체 UV 범위의 스캔, ELSD; 컬럼 크기: 기기에서 4-330g, 루어(luer) 유형, 선택적인 홀더를 가진 750g 내지 최대 3000g.
S01861-EMCH 합성(도 52)
SO1861(121mg, 0.065mmol) 및 EMCH.TFA(110mg, 0.325mmol)에 메탄올(엑스트라 건조, 3.00mL) 및 TFA(0.020mL, 0.260mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC.1로 처리하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조하여, 표제 화합물(120 mg, 90%)을 백색의 플루피(fluffy) 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 96%.
LRMS (m/z):　2069　[M-1]1-　
LC-MS　r.t.　(min):　1.084　
덴드론(-L-S01861) 4 합성(도 53)
중간체 1:
디-tert-부틸(((6-아지도헥사노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일))디카르바메이트
6-아지도헥사노익산(0.943g, 6.00mmol), EDCI.HCl(1.21g, 6.30mmol) 및 Oxyma Pure(0.938g, 6.60mmol)를 DMF(10.0mL)에 용해시키고, 그 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 그 다음, DMF(5.00mL) 중 디-tert-부틸(아잔디일비스(에탄-2,1-디일))디카바메이트(1.82g, 6.00mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 5시간 후, 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트(50mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 1N 포타슘 비설페이트 용액(50mL), 포화 소듐 비카보네이트 용액(2×50mL) 및 염수(50mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(에틸 아세테이트 - 헵탄 구배, 10:90에서 100:0으로 증가)에 의해 정제하여 표제 화합물(2.67 g, 100%)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 98%.
LRMS (m/z):　287/343/465　[M-155/M-99/M+23]1+　
LC-MS　r.t.　(min):　2.022A　
중간체 2:
N,N-비스(2-아미노에틸)- 6-아지도헥산아미드 디하이드로클로라이드
디-tert-부틸(((6-아지도헥사노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일))디카르바메이트(2.66 g, 6.00 mmol)에 이소프로판올 (5-6 N, 20.0 mL, 110 mmol) 중 HCl을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 생성된 조 생성물을 DCM(3×20mL)으로 공증발시켜 조(crude) 표제 생성물(1.49g, 79%)을 백색 고체로서 수득하였다.
LRMS (m/z):　243　[M+1]1+　
중간체 3:
테트라-tert-부틸((5S,5'S)-(((6-아지도헥사노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일))비스(아잔디일)비스(6-옥소헥산-6,1,5-트리일))테트라카르바메이트
DMF(30.0mL) 및 DIPEA(2.62mL, 15.1mmol) 중 N,N-비스(2-아미노에틸)-6-아지도헥산아미드 디하이드로클로라이드(1.19g, 3.76mmol)의 용액에 Boc-Lys(Boc)-ONp(3.69g, 7.90mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 진공하에서 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(100mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 1N 포타슘 비설페이트 용액(100mL) 및 포화 소듐 비카보네이트 용액(5×100mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 진공하에서 증발시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(DCM-메탄올/DCM(1/9, v/v) 구배 100:0에서 0:100으로 상승)로 정제하여 표제 생성물(3.07 g, 91%)을 약간 황색을 띠는 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 94%.
LRMS (m/z):　800/900/922　[M-99/M+1/M+23]1+　
LC-MS　r.t.　(min):　2.172A　
중간체 4:
4-니트로페닐 3-(아세틸티오)프로판에이트
4-니트로페닐 트리플루오로아세테이트(5.17g, 22.0mmol) 및 3-(아세틸티오)프로피온산(2.96g, 20.0mmol)을 DCM(50.0mL)에 용해시켰다. 다음으로, DIPEA(6.97mL, 40.0mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(50mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 1N 포타슘 비설페이트 용액(50mL), 포화 소듐 비카보네이트 용액(5 x 50mL) 및 염수(50mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(DCM - 메탄올/DCM(1/9, v/v) 구배 100:0에서 0:100으로 증가)로 정제하여 약간 황색을 띠는 고체로서 표제 생성물(4.90g, 91%)을 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 99%.
LRMS (m/z):　292　[M+23]1+　
LC-MS　r.t.　(min):　1.942A　
중간체 5:
(S)-2,6-디아미노-N-(2-(6-아지도-N-(2-((S)-2,6-디아미노헥산아미도)에틸)헥산아미도)에틸)헥산아미드 테트라하이드로클로라이드
테트라-tert-부틸 ((5S,5'S)-((((6-아지도헥사노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일))비스(아잔디일))비스(6-옥소헥산-6,1,5-트리일))테트라카바메이트(1.80g, 2.00mmol)를 이소프로판올(5-6N, 50.0ml, 275mmol) 중 HCl에 용해시키고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고 생성된 조 생성물을 DCM(3 x 20 mL)로 공증발시켜 조 표제 생성물을 백색 고체로서 수득하였다.
LRMS (m/z):　250　[M+2]2+, 500　[M+1]1+　
중간체 6:
(2S)-2,6-비스[3-(아세틸설파닐)프로판아미도]-N-[2-(6-아지도-N-{2-[(2S)-2,6-비스[3-(아세틸설파닐)프로판아미도]헥산아미도]에틸}헥산아미도)에틸]헥산아미드
DMF(30mL) 및 DIPEA(3.48mL, 20.0mmol) 중에 용해된 (S)-2,6-디아미노-N-(2-(6-아지도-N-(2-((S)-2,6-디아미노헥산아미도)에틸)헥산아미도)에틸)헥산아미드 테트라하이드로클로라이드(1.29g, 2.00mmol)의 용액에, 4-니트로페닐 3-(아세틸티오)프로파노에이트(2.26g, 8.40mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 주말에 걸쳐 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 DCM/메탄올(95:5, v/v, 100mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 1N 포타슘 비설페이트 용액(100mL), 1N 소듐 히드록시드 용액(3 x 100mL) 및 염수(100mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(DCM - 메탄올/DCM(1/9, v/v) 구배 100:0에서 0:100으로 증가)로 정제하여 표제 생성물(1.33g, 65%)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS에서 1개의 탈보호된 티오아세테이트기를 갖는 생성물에 해당하는 m/z 값으로 불순물(15%)이 발견되었다. 워크업 중 또는 후에 불순물이 형성되었다. LC-MS에 기초한 순도 85%.
LRMS (m/z):　510　[M+2]2+, 1019/1041　[M+1/M+23]1+　
LC-MS　r.t.　(min):　1.862B　
중간체 7:
N,N'-((9S,19S)-14-(6-아미노헥사노일)-1-메르캅토-9-(3-메르캅토프로판아미도)-3,10,18-트리옥소-4,11,14,17-테트라아자트리코산-19,23-디일)비스(3-메르캅토프로판아미드)포르메이트
스캐폴드 2(102mg, 0.100mmol)를 메탄올(1.00ml)에 용해시켰다. 다음으로, 새로 제조된 1N 소듐 히드록시드 용액(0.440ml, 0.440mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 30분 후, THF(0.500ml, 0.500mmol) 중의 1.0M 트리메틸포스핀 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 교반하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고 메탄올(2 x 10mL)로 공동 증발시켰다. 잔류물을 메탄올/물(9:1, v/v, 1.00 mL)의 혼합물에 용해시키고, 생성된 용액을 제조용 MP-LC.2에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결하고, 밤새 동결건조시켜, 무색 점착성 오일로서 표제 화합물(75.6 mg, 87%)을 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 96%.
LRMS (m/z):　513　[M+2]2+, 825　[M+1]1+　
LC-MS　r.t.　(min):　1.422A　
중간체 8:
덴드론(-L-S01861) 4 -아민
N,N'-((9S,19S)-14-(6-아미노헥사노일)-1-메르캅토-9-(3-메르캅토프로판아미도)-3,10,18-트리옥소-4,11,14,17-테트라아자트리코산-19,23-디일)비스(3-메르캅토프로판아미드)포르메이트(2.73mg, 3.13μmol)를 20mM NH4HCO3와 0.5mM TCEP/아세토니트릴(3:1, v/v, 3.00mL)의 혼합물에 용해시켰다. 다음으로, SO1861-EMCH(29.2 mg, 0.014 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 제조용 LC-MS.3B에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조시켜 표제 화합물(12.3 mg, 43%)을 백색의 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 97%.
LRMS (m/z):　1517　[M-6]6-, 1821　[M-5]5-, 2276　[M-4]4-　
LC-MS　r.t.　(min):　4.395A　
중간체 9:
덴드론(-L-S01861) 4 -아지드
덴드론(SO1861)4-아민(6.81mg, 0.748μmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(2.90mg, 7.48μmol)을 DMF(1.00 mL)에 용해하였다. 다음으로, DIPEA(1.302μL, 7.48μmol)를 첨가하고, 그 혼합물을 1분 동안 흔든 후 실온에서 방치하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 LC-MS.3C에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조하여 표제 화합물(5.86 mg, 84%)을 백색의 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 90%.
LRMS (m/z):　2344　[M-4]4-　
LC-MS　r.t.　(min):　4.785B　
중간체 10:
덴드론(-L-S01861) 4 -말레이미드1
덴드론(SO1861)4-아민(8.12 mg, 0.891 μmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(3.94mg, 8.91μmol)를 DMF(1.00mL)에 용해시켰다. 다음으로, DIPEA(1.55μL, 8.91μmol)를 첨가하고, 그 혼합물을 1분 동안 흔든 후 실온에서 방치하였다. 3시간 후, 반응 혼합물을 제조용 LC-MS.3C에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조하여, 표제 화합물(6.76 mg, 80%)을 백색 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 66%.
LRMS (m/z):　2358　[M-4]4-　
LC-MS　r.t.　(min):　2.136C　
중간체 11:
덴드론(- L-S01861) 4 -말레이미드2
스캐폴드 2(5.10mg, 5.00μmol)를 메탄올(100μL)에 용해하였다. 다음으로, 새로 준비한 1N 소듐 히드록시드 용액(22.0μL, 22.0μmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 1분 동안 흔든 후 실온에서 방치하였다. 30분 후 THF(25.0μL, 25.0μmol) 중 1.0M 트리메틸포스핀 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 1분 동안 흔들고, 실온에 방치하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 메탄올(2 x 5mL)로 공-증발시켰다. 생성된 잔류물을 20mM NH4HCO3와 0.5mM TCEP/아세토니트릴의 혼합물(3:1, v/v, 3.242mL)에 용해시켰다. 이 용액에서 SO1861-EMCH(14.4 mg, 6.94 μmol, 스캐폴드 대비 4.5 equiv.)에 직접 1000 μL를 첨가하고, 그 혼합물을 1분간 흔든 후 실온에서 방치하였다. 10분 후, 반응 혼합물을 밤새 동결건조시켰다. 생성된 잔류물에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(2-(2-(3-(2,5-디옥소-2h-피롤-1(5h)-일)프로판아미도)에톡시)에톡시)프로파노에이트(5.84 mg, 0.014 mmol) 및 DMF(1.00 mL)를 첨가하였다. 다음으로, DIPEA(2.39μL, 0.014mmol)를 첨가하고 현탁액을 1분간 흔들고 실온에서 방치하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 LC-MS.3C에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조하여 표제 화합물(10.9 mg, 85%)을 백색 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 80%.
LRMS (m/z):　2354　[M-4]4-　
LC-MS　r.t.　(min):　4.165B　
덴드론(-L-S01861) 8 합성(도 54)
중간체 1:
tert-부틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(6-아지도-N-{2-[(2S)-2,6-비스[(2S)- 2,6-비스({[(tert-부톡시)카보닐]아미노})헥산아미도]헥산아미도]에틸}헥산아미도)에틸]카바모일}-5-[(2S)-2,6-비스({[(tert-부톡시)카보닐]아미노})헥산아미도]펜틸]카바모일}- 5 -{[(tert-부톡시)카보닐]아미노}펜틸]카르바메이트
(S)-2,6-디아미노-N-(2-(6-아지도-N-(2-((S)-2,6-디아미노헥산아미도)에틸)헥산아미도)에틸)헥산아미드 테트라하이드로클로라이드(964 mg, 1.50 mmol)를 DMF(25.0mL) 및 트리에틸아민(2.08mL, 15.0mmol)에 용해시켰다. 다음으로, Boc-Lys(Boc)-ONp(3.36g, 7.18mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(DCM - 메탄올/DCM(1/9, v/v) 구배 100:0에서 0:100으로 상승)에 의해 정제하여 백색 고체로서 표제 생성물(2.71g, 100%)을 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 97%.
LRMS (m/z):　807　[M-198]2+　
LC-MS　r.t.　(min):　2.352B　
중간체 2:
(2S,2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-디아미노-10-(6-아지도헥사노일)-15-((S)-2,6-디아미노헥산아미도)-6,14,21-트리옥소-7,10,13,20-테트라아자헥사코산-1,5-디일)비스(2,6-디아미노헥산아미드)옥타하이드로클로라이드
중간체 1(2.71g, 1.50mmol)을 이소프로판올(5-6N, 25.0ml, 138mmol) 중 HCl에 용해시키고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음으로, 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 생성된 조 생성물을 DCM(3 x 20 mL)로 공증발시켜 조 표제 생성물을 백색 고체로서 수득하였다.
LRMS (m/z):　203/254　[M-200/M+4]4+,　338　[M+3]3+, 507　[M+2]2+, 1012　[M+1]1+　
중간체 3:
(2S)-2,6-비스[3-(아세틸설파닐)프로판아미도]-N-[(1S)-1-{[2-(6-아지도-N-{2-[(2S)-2,6- 비스[(2S)-2,6-비스[3-(아세틸설파닐)프로판아미도]헥사아미도]헥산아미도]에틸}헥산아미도)에틸]카바모일}-5-[(2S)-2,6-비스[3-(아세틸설파닐)프로판아미도]헥산아미도]펜틸]헥산아미드
(2S,2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-디아미노-10-(6-아지도헥사노일)-15-((S)-2,6-디아미노헥산아미도)-6,14,21-트리옥소-7,10,13,20-테트라아자헥사코산-1,5-디일)비스(2,6-디아미노헥산아미드) 옥타하이드로클로라이드(300mg, 0.230mmol)에 DMF(20.0mL), 트리에틸아민(320μl, 2.30mmol)) 및 4-니트로페닐 3-(아세틸티오)프로파노에이트(595mg, 2.21mmol)를 첨가하였다. 생성된 현탁액을 60℃에서 30분 동안 초음파 처리하고, 실온에서 밤새 교반되도록 두었다. 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 먼저 플래시 크로마토그래피(DCM-메탄올/DCM(1/9, v/v) 구배 100:0에서 0:100으로 상승)를 수행하여, 정제한 다음, 제조용 MP-LC2에 적용하여, 백색 고체로서 표제 생성물(70 mg, 15%)을 얻었다. LC-MS에 기초한 순도 100%.
LRMS (m/z):　685　[M+3]3+　
LC-MS　r.t.　(min):　1.912A　
중간체 4:
(2S)-N-[(1S)-1-{[2-(6-아미노-N-{2-[(2S)-2,6-비스[(2S)-2,6-비스(3-설파닐프로판아미도)헥산아미도]헥산아미도]에틸}헥산아미도)에틸]카바모일}-5-[(2S)-2,6-비스(3-설파닐프로판아미도)헥산아미도]펜틸]-2,6-비스(3-설파닐프로판아미도)헥산아미드 포르메이트
스캐폴드 4(10.0mg, 4.87μmol)를 메탄올(200μL)에 용해하였다. 다음으로, 새로 제조한 1N 소듐 히드록시드 용액(42.9μL, 0.043mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 30분 후 THF(24.4μL, 0.024mmol) 중 1.0M 트리메틸포스핀 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 물(1 mL)로 희석하고, 제조용 MP-LC2에 직접 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조하여, 백색의 플루피 고체로서 표제 화합물(4.02 mg, 48%)을 수득하였다.
LRMS (m/z):　564　[M+3]3+, 846　[M+2]2+　
LC-MS　r.t.　(min):　1.542C　
중간체 5:
덴드론(-L-S01861) 8 -아민
스캐폴드 5(0.52mg, 0.299μmol) 및 SO1861-EMCH(29.2mg, 0.014mmol)를 20mM NH4HCO3와 0.5mM TCEP/아세토니트릴(3:1, v/v, 1.00mL)의 혼합물에 용해시키고, 생성된 혼합물을 1분 동안 흔들고 실온에서 방치하였다. 30분 후 TCEP(0.30mg, 1.05μmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하였다. 다음으로, 그 혼합물을 직접 제조용 LC-MS.3B에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결 건조하여 백색 플루피 고체로서 표제 화합물(2.17 mg, 40%)을 얻었다. LC-MS에 기초한 순도 97%.
LRMS (m/z):　2282　[M-8]8-,　2607　[M-7]7-　
LC-MS　r.t.　(min):　4.415A　
실시예 8
SO1861-3작용성 링커-BNAoligo 합성(도 55)
재료 및 방법
3작용성 링커
3작용성 링커(DBCO, TCO, 말레이미드)는 Bio-Synthesis Inc.(Lewisville, Texas)에서 주문하였다.
HSP27BNA oligo
HSP27BNA(-티올) 올리고(서열 5'-GGCAcagccagtgGCG-3')(Zhang et al., 2011)는 Bio-synthesis Inc.(Lewisville, Texas)에서 구입하였다.
중간체 1:
SO1861-아지드
SO1861(60mg, 0.032mmol) 및 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-히드라지드(39.3mg, 0.129mmol)에 메탄올(엑스트라 건조, 1.00mL) 및 TFA(9.86μl, 0.129 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1분 동안 흔들고 실온에 두었다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC.1로 처리하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조시켜 표제 화합물(58.4 mg, 84%)을 백색 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 100%.
LRMS (m/z):　2150　[M-1]1-　
LC-MS　r.t.　(min):　1.103B　
중간체 2:
SO1861-3작용성 링커
SO1861-아지드(45mg, 0.021mmol) 및 3작용성 링커(26.5mg, 0.022mmol)를 DMF(2.50mL)에 용해시키고, 생성된 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 제조용 LC-MS.3C에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조시켜 표제 화합물(58.4 mg, 84%)을 백색 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 89%.
LRMS (m/z):　1677　[M-2]2-　
LC-MS　r.t.　(min):　2.546A　
중간체 3:
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)히드라지닐리덴)메틸)벤즈아미도)-N-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미드
1-(4-포르밀벤즈아미도)-N-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미드(28.0 mg, 0.048 mmol) 및 EMCH·TFA(24.5 mg, 0.072 mmol)에 메탄올(엑스트라 건조, 2.00 mL) 및 TFA(11.1 μL, 0.145 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 교반하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고 생성된 잔류물을 MP-LC에 의해 정제하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조시켜 밝은 보라색 플루피 고체로서 표제 화합물(33.4 mg, 88%)을 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 92%.
LRMS (m/z):　394　[M+2]2+, 789　[M+1]1+　
LC-MS　r.t.　(min):　1.287A　
중간체 4:
메틸테트라진-BNA 올리고
HSP27에 BNA 올리고 디설파이드(70.0mg, 0.012mmol)를 20mM NH4HCO3(20.0mL)에 용해시켰다. 다음으로, TCEP(14.3 mg, 0.050 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 반응 혼합물을 3000 Da(30분 동안 5000 x g)의 분자량 컷오프를 갖는 원심 필터를 사용하여 여과하였다. 다음으로, 2.5mM TCEP(20.0mL)와 함께 20mM NH4HCO3의 용액을 잔류 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 위에서 설명한 동일한 조건에서 다시 여과 하였다. 잔류 용액을 20mM NH4HCO3(30.0mL)로 희석하고, 생성된 혼합물을 아세토니트릴(10.0mL) 중 (E)-1-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)히드라진일리덴)메틸)벤즈아미도)-N-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미드(14.8mg, 18.8μmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 30분 후 반응 혼합물을 동결하고 주말 동안 동결건조하여 분홍색의 플루피 고체로서 조 표제 생성물을 얻었다. 조 생성물에 20mM NH4HCO3(20.0mL) 용액을 첨가하고, 생성된 현탁액을 0.45μm 시린지 필터로 여과하였다. 여과액은 상기와 동일한 조건으로 원심분리 필터를 이용하여 여과하였다. 다음으로, 다시 20mM NH4HCO3 용액(20.0mL)을 잔류 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 상기와 동일한 조건의 원심 필터를 사용하여 다시 여과하였다. 잔류 용액을 20mM NH4HCO3(20.0mL)로 희석하고, 생성된 혼합물을 밤새 동결건조하여 분홍색 플루피 고체로서 표제 생성물(90.0mg, 115%)을 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 91%.
LRMS (m/z):　1631　[M-4]4-, 2174　[M-3]3-　
LC-MS　r.t.　(min):　0.737B　
중간체 5:
SO1861-3작용성 링커-BNA 올리고
메틸테트라진-BNA 올리고(90.0 mg, 0.014 mmol) 및 SO1861-3작용성 링커(48.6 mg, 0.014 mmol)를 물/아세토 니트릴(4:1, v/v, 12.0 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 15분 후, 혼합물을 제조용 LC-MS.4A에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조하여 표제 화합물(82.0 mg, 60%)을 백색의 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 92%(표제 화합물에 상응하는 m/z 값 모두를 갖는 2개의 피크).
LRMS (m/z):　1641　[M-6]6-, 1970　[M-5]5-　
LC-MS　r.t.　(min):　3.24 and 3.406B　
중간체 1:
SO1861-아지드
SO1861(60mg, 0.032mmol) 및 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-히드라지드(39.3mg, 0.129mmol)에 메탄올(엑스트라 건조, 1.00mL) 및 TFA(9.86μl, 0.129 mmol)응 첨가하고, 반응 혼합물을 1분 동안 흔들고 실온에 두었다. 2시간 후, 반응 혼합물을 분취용 MP-LC.1로 처리하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조시켜 표제 화합물(58.4 mg, 84%)을 백색 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 100%.
LRMS (m/z):　2150　[M-1]1-　
LC-MS　r.t.　(min):　1.103B　
중간체 2:
SO1861-3작용성 링커
SO1861-아지드(45mg, 0.021mmol) 및 3작용성 링커(26.5mg, 0.022mmol)를 DMF(2.50mL)에 용해시키고, 생성된 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 제조용 LC-MS.3C에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조시켜 표제 화합물(58.4 mg, 84%)을 백색 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 89%.
LRMS (m/z):　1677　[M-2]2-　
LC-MS　r.t.　(min):　2.546A　
중간체 3:
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)히드라지닐리덴)메틸)벤즈아미도)-N-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미드
1-(4-포르밀벤즈아미도)-N-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미드(28.0 mg, 0.048 mmol) 및 EMCH.TFA(24.5 mg, 0.072 mmol)에 메탄올(엑스트라 건조, 2.00 mL) 및 TFA(11.1 μL, 0.145 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 교반하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고 생성된 잔류물을 MP-LC에 의해 정제하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조시켜 밝은 보라색 플루피 고체로서 표제 화합물(33.4 mg, 88%)을 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 92%.
LRMS (m/z):　394　[M+2]2+, 789　[M+1]1+　
LC-MS　r.t.　(min):　1.287A　
중간체 4:
메틸테트라진-BNA 올리고
HSP27에 BNA 올리고 디설파이드(70.0mg, 0.012mmol)를 20mM NH4HCO3(20.0mL)에 용해시켰다. 다음으로, TCEP(14.3 mg, 0.050 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 반응 혼합물을 3000 Da(30분 동안 5000 x g)의 분자량 컷오프를 갖는 원심 필터를 사용하여 여과하였다. 다음으로, 2.5mM TCEP(20.0mL)와 함께 20mM NH4HCO3의 용액을 잔류 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 위에서 설명한 동일한 조건에서 다시 여과 하였다. 잔류 용액을 20mM NH4HCO3(30.0mL)로 희석하고, 생성된 혼합물을 아세토니트릴(10.0mL) 중 (E)-1-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)히드라진일리덴)메틸)벤즈아미도)-N-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미드(14.8mg, 18.8μmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 30분 후 반응 혼합물을 동결하고 주말 동안 동결건조하여 분홍색의 플루피 고체로서 미정제 표제 생성물을 얻었다. 조 생성물에 20mM NH4HCO3(20.0mL) 용액을 첨가하고 생성된 현탁액을 0.45μm 시린지 필터로 여과하였다. 여과액은 상기와 동일한 조건으로 원심분리 필터를 이용하여 여과하였다. 다음으로, 다시 20mM NH4HCO3 용액(20.0mL)을 잔류 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 상기와 동일한 조건의 원심 필터를 사용하여 다시 여과하였다. 잔류 용액을 20mM NH4HCO3(20.0mL)로 희석하고, 생성된 혼합물을 밤새 동결건조하여 분홍색 플루피 고체로서 표제 생성물(90.0mg, 115%)을 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 91%.
LRMS (m/z):　1631　[M-4]4-, 2174　[M-3]3-　
LC-MS　r.t.　(min):　0.737B　
중간체 5:
SO1861-3작용성 링커-BNA 올리고
메틸테트라진-BNA 올리고(90.0 mg, 0.014 mmol) 및 SO1861-3작용성 링커(48.6 mg, 0.014 mmol)를 물/아세토 니트릴(4:1, v/v, 12.0 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 15분 후, 혼합물을 제조용 LC-MS.4A에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조하여 표제 화합물(82.0 mg, 60%)을 백색의 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 92%(표제 화합물에 상응하는 m/z 값 모두를 갖는 2개의 피크).
LRMS (m/z):　1641　[M-6]6-, 1970　[M-5]5-　
LC-MS　r.t.　(min):　3.24 and 3.406B　
실시예 9
S01861-BNA 올리고 접합
HSP27 BNA 올리고 디설파이드(1.10mg, 0.187μmol)를 1.0mM TCEP(500μL)가 포함된 20mM NH4HCO3에 용해시키고 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 3000 Da(30분 동안 14000 x g)의 분자량 컷오프를 갖는 원심 필터를 사용하여 여과하였다. 잔류 용액을 1.0mM TCEP(500μL)가 포함된 20mM NH4HCO3로 희석하고 생성된 혼합물을 위에서 설명한 동일한 조건에서 다시 여과하였다. 잔류 용액을 20mM NH4HCO3/아세토니트릴(3:1, v/v, 1.00mL)로 희석하고 생성된 혼합물을 SO1861-EMCH(3.54mg, 0.375μmol)에 첨가했다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 10분 후, 반응 혼합물을 제조용 LC-MS.4A에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조하여 표제 화합물(1.25 mg, 85%)을 백색 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 100%.
LRMS (m/z):　1561　[M-5]5-, 1951　[M-4]4-　
LC-MS　r.t.　(min):　2.466B　
덴드로(S01861) 4 -BNA 올리고 접합(도 56)
HSP27 BNA 올리고 디설파이드(1.1mg, 0.187μmol)를 1.0mM TCEP(500μL)가 포함된 20mM NH4HCO3에 용해하고 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치했다. 1시간 후, 반응 혼합물을 3000 Da(30분 동안 14000 x g)의 분자량 컷오프를 갖는 원심 필터를 사용하여 여과하였다. 잔류 용액을 1.0mM TCEP(500μL)가 포함된 20mM NH4HCO3로 희석하고 생성된 혼합물을 위에서 설명한 동일한 조건에서 다시 여과하였다. 잔류 용액을 20mM NH4HCO3/아세토니트릴(3:1, v/v, 1.0mL)로 희석하고 생성된 혼합물을 덴드론(SO1861)4-말레이미드1(3.54mg, 0.375μmol)에 첨가했다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고 실온에서 방치하였다. 10분 후, 반응 혼합물을 제조용 LC-MS.4A에 적용하였다. 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고 밤새 동결건조하여 표제 화합물(1.25 mg, 85%)을 백색 플루피 고체로서 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 94%
LRMS (m/z):　1896　[M-8]8-, 2167　[M-7]7-　
LC-MS　r.t.　(min):　3.776B　
덴드론(NEM) 4 합성(도 57)
벤질 비스(2-((S)-2,6-비스(3-메르캅토프로판아미도)헥산아미도)에틸)카바메이트(1.69 mg, 2.00 μmol) 및 N-에틸말레이미드(1.05 mg, 8.40 μmol)에 20의 mM NH4HCO3/아세토니트릴(3:1, v/v, 2.00 mL)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 밤새 동결건조시켰다. 생성된 잔류 물을 제조용 LC-MS3A를 사용하여 정제하여 백색 플루피 고체로서 표제 화합물(1.53 mg, 57 %)을 수득하였다. LC-MS에 기초한 순도 98%.
LRMS (m/z): 1346 [M+1]1+　
LC-MS　r.t.　(min): 1.433A　
실시예 10
A431 마우스 종양 마우스 모델 및 시험관내 및 생체내 유전자 침묵 연구
재료 및 방법
링커 올리고를 갖는 HSP27BNA(서열 5'-GGCacagccagtgGCG-3')(Zhang et al,2011)을 Bio-Synthesis Inc.(Lewisville, Texas)에서 구입하였다.
시험관내 RNA 분리 및 유전자 발현 분석
세포로부터 RNA를 분리하고 표준 프로토콜(Biorad)에 따라 분석하였다.
생체내 마우스 종양 모델
마우스 연구는 표준 프로토콜 및 절차에 따라 CrownBio(중국)에서 수행되었다. 모델: 암컷 BALB/c 누드 마우스의 피하 A431 인간 표피모양 암종 이종이식 모델. 종양 부피를 모니터링하고 유전자 침묵 분석을 위해 종양 샘플을 수집했다(아래 참조).
마우스에서 종양 샘플의 RNA 분리 및 유전자 발현 분석
제조업체의 지침에 따라 TriZol(Thermo Fisher)을 사용하여 종양에서 총 RNA를 분리했다. 분리된 RNA를 뉴클레아제가 없는 물(NFW)에 재현탁했다. RNA 샘플은 겔에서 RNA 무결성을 확인했다. cDNA를 준비하기 위해, 우선 100ng 총 RNA를 NFW에서 12.5μl의 최종 부피로 Random Hexamers(Qiagen; 최종 농도 2μM)와 혼합하고 70℃에서 5분 동안 변성시킨 후 즉시 얼음 위에서 냉각했다. 다음으로, 4μl 5xRT 버퍼(Promega), 0.4μl 25mM dNTP(Promega), 1μl 200U/μL MMLV RT-효소(Promega), 0.5μL 40U/μL RNAse 억제제(Promega) 및 1.6μL NFW으로 구성된 7.5μl의 cDNA 합성 믹스가 첨되었다. 다음 cDNA 합성 프로토콜이 사용되었다: 1) 10분 25℃ 2) 60분 37℃ 3) 5분 85℃ 4) ∞ 4℃. 단일 qPCR 반응의 경우, 다음 혼합물이 준비되었다: 1μL cDNA, 0.05μL 정방향 프라이머(250μM), 0.05μL 역방향 프라이머(250μM), 8.9μl LNFW, 10μl SYBR Green(Bio-Rad). 다음 qPCR 프로토콜이 사용되었다: 1 사이클: 5분 95℃, 40 사이클: 15초 95℃ + 30초 60℃.
HSP27 유전자 발현은 2-(Ct HSP27 -GEOMEAN(Ct ref1;Ct ref2;Ct ref3;Ct ref4))를 사용하여 계산되었으며, 여기서 ref1, ref2, ref3 및 ref4는 종양 분석을 위한 레퍼런스 유전자 IMMT, EIF2S2, GUSB 및 UBC이다. 이 종양 샘플에 대해 가장 이상적이고 안정적인 레퍼런스 유전자를 선택하기 위해 테스트한 9개의 레퍼런스 유전자 중 GeNORM 분석의 성능을 기반으로 4개의 레퍼런스 유전자가 선택되었다. 이를 위해 qPCR 결과를 Qbase+ 소프트웨어 프로그램으로 가져와 두 가지 품질 측정값을 계산했다: 정규화된 레퍼런스 유전자 발현 수준의 변동 계수(V); 및 geNorm 안정성 M-값(M)1. M<0.2 및 V<0.15인 레퍼런스 유전자는 매우 안정적인 것으로 간주된다. 이 분석을 기반으로 IMMT 및 EIF2S2가 가장 안정적인 레퍼런스 유전자로 선택되었다. 그러나, 정규화의 정확도를 더욱 향상시키기 위해 UBC 및 GUSB도 레퍼런스 유전자 그룹에 추가되었다. 각 샘플은 CFX96 Real-Time qPCR 기계(Bio-Rad)에서 기술적으로 삼중으로 분석되었다.
Figure pct00054
실시예 11
접합체 합성
모노클로날 항체, S01861, QS 사포닌
트라스투주맙(Herceptin®), 세툭시맙(Erbitux®) 및 T-DM1(kadcaya®)을 제약회사(charlite, Berlin)으로부터 구입하였다. Cd71 모노클로날 항체는 BioCell(Okt9,# BE0023)로부터 구입하였다. SO1861을 사포나리아 오피시날리스 L. 퀼라자 사포나리아(Saponaria officinalis L. Quillaja Saponaria) 사포닌 추출물(QSimix)로부터 얻은 원료 식물 추출물로부터 Analyticon Discovery GmbH에 의해 분리 및 정제하였다(Sigma Aldrich,# S4521).
재료
트라스투주맙(Tras, Herceptin®, Roche), 세툭시맙(Cet, Erbitux®, Merck KGaA), Tris(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, 98%, Sigma-Aldrich), 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB, Ellman's reagent, 99%, Sigma-Aldrich), Zeba™ Spin Desalting Columns(2mL, Thermo-Fisher), NuPAGE™ 4-12% Bis-Tris Protein Gels(Thermo-Fisher), NuPAGE™ MES SDS Running Buffer(Thermo-Fisher), Novex™ Sharp Pre-stained Protein Standard(Thermo-Fisher), PageBlue™ Protein Staining Solution(Thermo-Fischer), Pierce™ BCA Protein Assay Kit(Thermo-Fisher), N-에틸말레이미드(NEM), 98%, Sigma-Aldrich), 1,4-디티오트레이톨(DTT, 98%, Sigma-Aldrich), Sephadex G25(GE Healthcare), Sephadex G50 M(GE Healthcare), Superdex 200P(GE Healthcare), 이소프로필 알코올(IPA, 99.6%, VWR), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Tris, 99%, Sigma-Aldrich), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드(Tris.HCL, Sigma-Aldrich), L-히스티딘(99%, Sigma-Aldrich), D-(+)-트레할로스 디하이드레이트(99%, Sigma-Aldrich), 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN 20, Sigma-Aldrich), Dulbecco 포스페이트-완충 염수(DPBS, Thermo-Fisher), 구아니딘 하이드로클로라이드(99%, Sigma-Aldrich), 에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐염 디하이드레이트(EDTA-Na2, 99%, Sigma-Aldrich), 멸균 필터 0.2 μm 및 0.45 μm(Sartorius), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC, Thermo-Fisher), 디안틴-Cys(Dia-Cys, 단일 C-말단 시스테인 작용기가 있는 디안틴, Proteogenix), Vivaspin T4 및 T15 농축기(Sartorius), Superdex 200PG(GE Healthcare), 테트라(에틸렌 글리콜)석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP, Thermo-Fisher), HSP27 BNA 디설파이드 올리고뉴클레오티드(Biosynthesis), [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸우로늄-헥사플루오르포스페이트]([O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N,N-tetramethyluronium-hexafluorphosphat])(HATU, 97%, Sigma-Aldrich), 디메틸 설폭사이드(DMSO, 99%, Sigma-Aldrich), N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트염(AEM, 98%, Sigma-Aldrich), L-시스테인(98.5%, Sigma-Aldrich), 탈이온수(DI)(Ultrapure Lab Water Systems (MilliQ, Merck)로부터 새로 취함), 니켈-니트릴로트리아세트산 아가로오스(Ni-NTA agarose, Protino), 글리신(99.5%, VWR), 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산(Ellman's reagent, DTNB, 98%, Sigma-Aldrich), S-아세틸메르캅토석시닉 안하이드라이드 플루오레세인(SAMSA reagent, Invitrogen) 소듐 비카보네이트(99.7%, Sigma-Aldrich), 소듐 카보네이트(99.9%, Sigma-Aldrich), Sephadex G-25 수지가 있는 PD MiniTrap 탈염 컬럼(GE Healthcare), PD10 G25 탈염 컬럼(GE Healthcare), 0.5, 2, 5 및 10mL의 Zeba 스핀 탈염 컬럼(Thermo-Fisher), Vivaspin 원심 분리 필터 T4 10kDa MWCO, T4 100kDa MWCO 및 T15(Sartorius), Biosep s3000 aSEC 컬럼(Phenomenex), Vivacell 한외여과 장치 10 및 30kDa MWCO(Sartorius), Nalgene Rapid-Flow 필터(Thermo-Fisher),
방법
MALDI-TOF-MS
매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 플라이트 시간(MALDI-TOF) 스펙트럼은 MALDI-질량 분광계(Bruker Ultrafex III)에서 기록되었다. 일반적으로, 나노몰 내지 마이크로몰 범위의 MilliQ 물에 용해된 샘플은 아세토니트릴(MADLI-TOF-MS 시험됨, Sigma)/0.1% TFA(7:3 v/v)에 용해된 매트릭스로서 슈퍼 DHB(99%, Fluka) 또는 시나핀산(SA, 99%, Sigma-Aldrich)를 사용하여 건조-액적 방법을 통해 표적(MTP 384 표적 플래이트 연마된 강 T F, Bruker Daltons) 상에서 스포팅되었다. PepMix(Peptide Calibration Standard, Bruker Daltons) 또는 ProteoMass(Protein Calibration Standard, Sigma-Aldrich)가 보정 표준으로 사용되었다. RP 모드는 리플렉터 포지티브 모드를 나타낸다. RN 모드는 리플렉터 네거티브 모드를 나타낸다. LP 모드는 선형 포지티브 모드를 나타낸다.
투석
재생 셀룰로오스 막: MWCO = 1 및 2 kDa(Spectra/Por) 및 MWCO = 12-14 kDa(Carl Roth)를 사용하여 투석을 수행했다. 전형적으로, 투석은 1L의 용매로 24시간 동안 수행되었으며, 용매는 공정의 처음 6시간 후에 교환되었다.
동결건조
동결건조는 Alpha 1-2 LD plus(Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH)에서 수행되었다. 일반적으로 샘플을 액체 질소로 동결하고 고진공에서 동결 건조기에 넣었다.
UV-Vis
흡광도 측정은 Perkin Elmer Lambda 25 UV-Vis 또는 Thermo NanoDrop ND-2000 분광 광도계에서 200-750 nm의 스펙트럼 범위에서 수행되었다.
농도는 다음 매개변수를 사용하여 Thermo Nanodrop 2000 또는 Lambda 25 분광기를 사용하여 측정되었다:
트라스투주맙 OD280 = 1.5 (mg/ml)-1 cm-1
세툭시맙 OD280 = 1.4 (mg/ml)-1 cm-1
HSP27 올리고뉴클레오티드 OD260 = 153,000 M-1 cm-1; Rz260:280 = 1.819
Dia-Cys OD280 = 0.57 (mg/ml)-1 cm-1
PEG4-SPDP (PDT) OD343 = 8,080 M-1 cm-1
SAMSA-플루오레세인 OD495 = 64,500 M-1 cm-1; Rz280:495 = 0.232
Ellmans (TNB) OD412 = 14,150 M-1 cm-1
고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMCA)
니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 크로마토그래피를 수행하여 히스티딘-태그된 단백질 및 단백질-접합체를 정제하였다. 간단히 말해서, Ni-NTA 아가로오스(10mL)를 5mL 베드 부피에 대해 중력 흐름 컬럼으로 피펫팅했다. 수지를 20mL 탈이온수로 세척하고 5mL의 100mM NiSO4 용액으로 재충전했다. 수지를 5mL 탈이온수로 다시 5회 세척하고 DPBS로 5회 평형화시켰다. 단백질 용액을 4℃에서 30분 동안 회전하는 세척된 Ni-NTA 아가로오스와 함께 인큐베이션했다. 그 후, Ni-NTA 단백질 용액을 중력 흐름 컬럼으로 다시 피펫으로 옮겼다. 통과 흐름을 수집하고 수지를 5mL DPBS로 3회 세척했다. 그 다음, 고정된 샘플은 50mL의 125mM, pH 8에서 50mL의 250mM, pH 8로 이미다졸 농도를 증가시켜 용리되었다. 용리 분획을 PBS pH 7.4에 대해 투석하여 정제된 샘플을 얻었다.
크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 AKTA 정제기 상에서 수행하였다. 샘플을 TBS/이소프로필 알코올 용액(85:15 v/v)으로 용리시키는 Sephadex G50M 컬럼(10 x 40 cm)또는 Biosep SEC-S3000 컬럼 중 하나를 사용하여 SEC로 분석하였다. 샘플 순도는 추적 응집체 피크에 대한 항체 샘플 피크의 통합에 의해 측정되었다.
엘만 어세이(Ellman assay)
엘만 시험(또는 엘만 어세이)을 실시하여 분광광도법을 통해 샘플 중의 티올 농도를 정량적으로 측정하였다. 티올의 존재는 티올의 존재하에 엘만 시약으로부터 2-니트로-5-티오벤조에이트(TNB)의 화학량론적 방출을 통해 표시되었다. TNB는 412 nm 에서의 흡수 최대값 및 버퍼링된 시스템에서의 OD412 = 14,150 M-1 cm-1의 흡광 계수를 획득한다. 간략하게, 포스페이트 버퍼(0.1M, 1 mM EDTA, pH 7.4) 중의 엘만 시약(5,5-디티오비스(2-니트로벤조산), DTNB) 0.5mg/mL 용액 2μL를 버퍼 중에 티올을 함유하는 샘플 20μL와 혼합하였다. 그 혼합물을 5초 동안 볼텍싱하였다. 이어서, 412 nm에서의 UV-Vis 흡광도를 Thermo Nanodrop 2000 상에서 측정하여 TNB 농도 및 이에 따른 샘플의 티올 함량을 측정하였다.
디안틴 제조
디안틴은 박테리아 배양물에서 발현되었고, 그 단백질은 당업계에 공지된 통상적인 세포 배양 및 단백질 정제 단계에 따라 정제되었다.
사포린 접합체의 제조
맞춤형 트라스투주맙-사포린 세툭시맙-사포린, CD71mab-사포린 접합체는 Advanced Targeting Systems(San Diego, CA)에서 제조되고, 이로부터 구입되었다. IgG-사포린 및 사포린은 Advanced Targeting Systems 로부터 구입하였다
항체-(Cys-덴드론-(L-SO1861) n ) n 합성
트라스투주맙 및 세툭시맙은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 Ab와 수지상 사포닌 사이에 티올레-엔 Michael형 반응을 생성하는 테트라(에틸렌 글리콜) 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP) 링커를 통해 수지상 사포닌[덴드론-(L-SO1861)4-말레이미드]에 접합되었다. 절차는 세툭시맙-(S-덴드론-(L-SO1861)4)4에 대해 예시적으로 설명된다.
세툭시맙을 DPBS pH 7.5 버로로 탈염한 다음, 2.50 mg/ml로 노르말화하였다. Ab(9.19mg, 61nmol)의 분취물에 새로 제조된 PEG4-SPDP 용액(5.0mg/ml, 6.70몰 당량, 411nmol)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 간략히 볼텍싱한 다음 롤러-믹싱하면서 20℃에서 60분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 글리신(20mg/ml, 7.7μl)을 첨가하여 반응을 켄칭한 다음, TCEP(5.0mg/ml, SPDP 당 4.0몰 당량, 1.64μmol)를 첨가하여 SPDP 모이어티를 원위치에서 환원하였다. 이 혼합물을 롤러-믹싱으로 20℃에서 15분 동안 롤러 혼합하였다. 생성된 Ab-SH를 제바(zeba) 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과에 의해 정제하였다. Ab-SH는 UV-비스 분석 및 엘만 어세이로 특성화되었다(티올 대 Ab 비율 = 5.4). 벌크 Ab-SH(7.41mg, 1.93mg/ml, 49nmol)에 DMSO 중에 새로 제조된 덴드론-(L-SO1861)4-말레이디드 용액(10mg/ml, Ab 당 8.0몰 당량, 0.4 μmol, 3.16 mg, 0.32 ml)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 간략히 볼텍싱한 다음 20℃에서 밤새 배양했다. 접합 반응 외에, 탈염된 Ab-SH(0.25 mg, 1.67 nmol)의 두 분취물을 접합 전에 제거하고, 각각 양성 및 음성 대조군으로서, NEM(Ab 당 8.0 몰 당량, 13.3 nmol, 0.25 mg/ml 용액 6.7 μl)또는 TBS pH 7.5 버퍼(6.7 μl)와 20℃에서 밤새 반응시켰다. (NEM 첨가 전) 18시간 동안 인큐베이션한 후, 조 접합체 혼합물을 간단히 원심분리하고 UV-비스에 의한 분석을 위해 100㎕ 분취물을 제거하고, 양성 및 음성 대조군과 함께 엘만 어세이에 의해 특성화하여 덴드론-(L-SO1861)4 편입을 획득하였다. 벌크 Ab - 덴드론-(L-SO1861)4 혼합물에 새로 준비된 NEM 용액(2.5mg/ml, 5.0몰 당량, 0.25μmol)의 분취물을 첨가하고, 그 혼합물을 DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 × 30cm Sephadex G50 컬럼으로 정제하여 세툭시맙-(S-덴드론-(L-SO1861)4)4 접합체를 얻었다. 생성물을 0.2μm로 여과하여 투명하게 한 다음, 비바스핀 T15 농축기(3,000g, 5분 간격, 5℃)를 사용하여 약 3 mg/ml로 조심스럽게 정제하여 최종 세툭시맙-(S-덴드론(L-SO1861)4)4 접합체를 수득하였다. 수율: 4.41mg, 48%. 덴드론-(L-SO1861)4 대 Ab 비율 = 4.4.
Figure pct00055
항체-(L-S01861) n (도 51 에 예시된 바와 같음)
트라스투주맙 및 세툭시맙은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 DAR로 Michael형 티올-엔 접합 반응을 통해 사포닌 SO18161-EMCH에 접합되었다. SO1861-EMCH 분자는 구조 사이에 불안정한 (L) 히드라존 결합을 얻고, 사포닌과 Ab 사이에 불안정한 결합을 생성하는 말레이미드 작용기를 얻는다. 절차는 트라스투주맙-(L-SO1861)4에 대해 예시적으로 설명된다.
세툭시맙 용액(40mg, 8.0ml)에 Tris 농축물(127mg/ml, 1.05M), Tris.HCl 농축물(623mg/ml, 3.95M) 및 EDTA-Na2 농축물(95 mg/ml, 0.26M)을 각각 10㎕/ml씩 첨가하여 50mM TBS, 2.5mM EDTA 버퍼 pH 7.5를 얻었다.
네 부분으로 나누어진 세툭시맙(각각 9.73 mg, 4.864 mg/ml, 65 nmol)에 새로 준비한 TCEP 용액(0.5 - 2.0 mg/ml, 1.15 - 7.02 몰 당량, 75 - 455 nmol)의 분취물을 첨가하고, 그 혼합물을 간단히 볼텍싱한 다음 롤러 혼합과 함께 20℃에서 300분 동안 인큐베이션했다. (SO1861-EMCH 첨가 전) 인큐베이션 후, Ab-SH의 약 1mg(0.210ml) 분취물을 각 혼합물에서 제거하고, 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이러한 분취물은 UV-비스 분석 및 엘만 어세이로 특성화되었다(티올 대 Ab 비율 = 각각 2.0, 4.2, 5.9 및 6.8). 각각의 벌크 Ab-SH에 새로 준비된 SO1861-EMCH 용액(2 mg/ml, '티올' 당 1.3몰 당량, 0.15 - 0.61 μmol, 0.16 - 0.63 ml)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 간단히 볼텍싱한 다음 20℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 각 접합 반응 외에, 각각 양성 및 음성 대조군으로서 탈염된 Ab-SH(0.25mg, 1.67nmol)의 두 분취물을 NEM('티올' 당 1.3몰 당량, 4.3~17.4nmol, 2.2~8.7μl의 0.25mg/ml 용액) 또는 TBS pH 7.5 버퍼(2.2 - 8.7 μl)와 20℃에서 120분간 반응시켰다. (NEM 첨가 전) 배양 후, Ab - SO1861-EMCH 혼합물의 0.200ml 분취물을 제거하고 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이 분취물은 UV-비스로 특성화되었으며 양성 및 음성 대조군과 함께 엘만 어세이에 의해 특성화되어 SO1861-EMCH 편입을 얻었다. 벌크 Ab - SO1861-EMCH 혼합물에 새로 준비한 NEM 용액(2.5 mg/ml, 2.5 - 10 mole 당량, 0.15 - 0.58 μmol)의 분취물을 첨가하고 혼합물을 DPBS pH 7.5로 용리하는 제바 스핀 탈염 컬럼으로 정제하여 정제된 세툭시맙-(L-SO1861) 접합체를 수득하였다. 생물학적 평가를 위해 분배하기 전에 생성물을 2.5 mg/ml로 정규화하고 0.2μm로 여과하였다.
Figure pct00056
Figure pct00057
항체-(S-S01861) n 합성
S01861-S-Mal 합성
사포나리아 오피시날리스 L의 SO1861(15.4mg, 8.28μmol) 및 HATU(140mg, 368μmol, 44.5몰 당량)를 자기 교반기가 있는 20mL 유리 바이알에 고체로 넣고, 5mL DMSO를 첨가하여 물질을 용해시켰다. 용해된 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 30분 후, DMSO 중 새로 제조된 AEM 용액(65mg, 256μmol, 31몰 당량) 1mL를 교반 중인 SO1861-HATU 혼합물에 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 17시간 동안 교반한 후, 혼합물을 탈이온수로 희석하고 1kDa의 MWCO를 함유한 재생 셀룰로오스막 튜브(Spectra/Por 7)를 사용하여 탈이온수에 대해 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후 용액을 동결건조하여 백색 분말을 얻었다.
수율: 7.22mg(44%).
건조된 분취물은 MALDI-TOF-MS를 통한 특성화에 추가로 사용되었다.
MALDI-TOF-MS(RN 모드): m/z 1983 Da([M-H]-, SO1861-S-Mal 접합체), 2136 Da([M-H]-, 사포닌-S-Mal 접합체).
MALDI-TOF-MS(RP 모드): m/z 2007 Da([M + Na]+, SO1861-S-Mal 접합체), 2107 Da([M - Na]+, 사포닌-S-Mal 접합체).
말레이미드 작용기는 정제된 SO1861-S-Mal을 새로 준비된 L-시스테인 용액(1000몰 초과)과 혼합하고 MALDI-TOF-MS에서 예상되는 질량 이동을 관찰하여 m/z 2103 Da에서 시스테인-접합체를 생성함으로써 확인되었다.
항체 접합
트라스투주맙 및 세툭시맙은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 Michael형 티올-엔 접합 반응을 통해 사포닌 SO18161-S-Mal에 접합되었다. 사포닌은 이의 구조와 이의 말레이미드 작용기 사이에 안정적인 (S) 아미드 결합을 얻어 사포닌과 Ab 사이에 안정적인 결합을 생성한다.
PBS(포스페이트 버퍼 염수)에 녹인 Ab 5mg을 제바 스핀 탈염 컬럼을 통해 ㅌ트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 버퍼 염수(TBS) pH 7.5로 버퍼 교환하여 3mg/mL의 농도로 정규화하였다. Ab에 새로 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 용액(0.25mg/mL, 2.92몰 당량)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 간단히 볼텍싱한 다음, 20℃에서 90분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 생성된 Ab-SH를 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제하였다. 설프히드릴 함량을 확인하기 위해 엘만 어세이에 의해 분취물을 분석했다. 수득된 Ab-SH를 접합을 위한 단일 부분과 대조군을 위한 0.25mg의 2개 분취물로 분할하였다. AB-SH의 주요 부분에 새로 제조된 SO1861-S-Mal 용액의 분취물(2 mg/mL, 설프히드릴 함량에 대해 2 몰 당량)을 첨가하고, 두 번째 대조군 분취물에 버퍼 TBS pH 7.5를 첨가했다. 각 혼합물을 간단히 볼텍싱한 다음 20℃에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 그 후, 각각의 분취물을 엘만 어세이로 분석하여 대조군과 관련하여 접합체에 남아 있는 설프히드릴 함량을 확인했다. 제바 스핀 탈염 컬럼을 통해 Dulbecco의 PBS pH 7.1로 젤 여과하여 정제한 후 Ab-S-SO1861을 얻었다. 접합체를 순도 %를 확인하기 위해 SEC에 의해 추가로 분석하였다.
트라스투주맙-(S-SO1861)4 샘플의 경우 순도 99%가 측정되었다. 세툭시맙-(S-SO1861)4 샘플의 경우 순도 98.3%가 측정되었다. 트라스투주맙-(S-SO1861)4(9.1mL) 및 세툭시맙-(S-SO1861)4(8.8mL)의 체류 부피는 유사한 것으로 나타났으며 비변형 Ab(예, IgG)와 일치한다.
항체-(L-HSP27 BNA) n
DAR4로 PEG4-SPDP를 통한 트라스투주맙-(L-HSP27) 4 , 세툭시맙-(L-HSP27)4 합성 및 DAR2로 PEG4-SPDP를 통한 세툭시맙-(L-HSP27)2 합성
트라스투주맙, 세툭시맙은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 Ab와 HSP27 BNA 사이에 불안정한 (L) 이황화 결합을 형성하는 테트라(에틸렌 글리콜) 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP) 링커를 통해 HSP27 BNA 이황화물에 접합되었다. 절차는 트라스투주맙-(L-HSP27 BNA)4에 대해 예시적으로 설명된다.
HSP27 BNA 이황화 올리고(2.7mg, 470nmol, 6.10mg/ml)를 TCEP(10몰 당량, 4.7μmol, 1.34mg, 50mg/ml)와 20℃에서 롤러 혼합하면서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 올리고-SH를 TBS pH 7.5로 용리하는 PD10 G25 탈염 컬럼으로 정제하고 즉시 사용하였다. 올리고-SH를 얻었다(2.48 mg, 90%, 1.24 mg/ml, SH 대 올리고 비율 = 0.8)
트라스투주맙(1.5 mg, 10.3 nmol, 2.50 mg/ml)을 DMSO(1 mg/ml) 중 새로 제조된 PEG4-SPDP 용액(6.81 몰 당량, 70.1 nmol, 39 μg)의 분취물과 20℃에서 롤러 혼합하면서 60분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응을 글리신(TBS pH 7.5에서 새로 제조된 2 mg/ml 용액 15.1 ㎕)으로 켄칭한 다음, TBS pH 7.5로 용리하는 제바 탈염 컬럼을 통해 탈염하였다. 생성된 Tras-S-PEG4-SPDP의 분취물을 취해, UV-비스 분석으로 시험했다. SPDP 편입은 TCEP를 사용하여 피리디일-2-티온(PDT)을 유리시키고 343 nm(SPDP 대 Ab 비율: 4)에서 UV-비스 분석에 의해 측정되었다. 나머지 Tras-(S-PEG4-SPDP)4는 새로 제조된 HSP27 올리고뉴클레오티드(올리고-SH)의 분취물(8 몰 당량, 82.4 nmol, 1.24 mg/ml)과 반응하고 롤러 혼합과 함께 20℃에서 밤새 인큐베이션했다. 17시간 후, 접합체를 UV-비스 분석으로 분석하여 343 nm에서 피리디일-2-티온(PDT)의 치환에 의한 HSP27의 편입을 확인하였다. 조 접합체를 DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 x 33 cm Sephadex G50 컬럼을 사용하여 정제했다. 생성된 트라스투주맙-(L-HSP27)4를 단일 분획으로 얻었다. 수율: n.d.. 순도: 96%, HSP27 BNA 대 Ab 비율 = 4.4
Figure pct00058
항체-(L-HSP27 BNA-L-차단된(blocked)) n
트라스투주맙-(L-HSP27-L-차단된)4, 세툭시맙-(L-HSP27-L-차단된)
트라스투주맙 및 세툭시맙은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 이후 "HSP27-Mal"로 지칭되는 HSP27 유도체를 함유하는 말레이미도(Mal)에 접합되었다. Ab는 Michael형 티올-엔 접합 반응을 통해 HSP27-Mal에 접합되었다. HSP17-Mal은 이의 구조와 이의 말레이미드 작용기 사이에 불안정한 (L) 히드라존 결합을 얻어 HSP27 BNA와 Ab 사이에 불안정한 결합을 생성한다. 절차는 트라스투주맙-(L-HSP27 BNA-L-차단)n에 대해 예시적으로 설명된다.
트라스투주맙을 탈이온수(DI)로 21mg/ml로 재구성한 다음 히스티딘 버퍼 pH 6을 사용하여 5mg/ml로 희석했다. 20mg(4.0ml) 분취물에 각각의 Tris 농축물(127mg /ml, 1.05M), Tris.HCl 농축물(623mg/ml, 3.95M) 및 EDTA-Na2 농축물(95mg/ml, 0.26M)을 사용하여 50mM TBS, 2.5mM EDTA 버퍼 pH 7.5를 얻었다. 트라스투주맙(20.30mg, 4.920mg/ml, 0.14μmol)에 새로 제조된 TCEP 용액(1.00mg/ml, 2.35몰 당량, 0.32μmol)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음 롤러 혼합하면서 20℃에서 90분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후(HSP27-Mal 첨가 전), 약 2mg(0.439ml) 분취물의 Ab-SH를 각 혼합물에서 제거하고, 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이 분취물은 UV-비스 분석 및 엘만 어세이로 특성화되었다(티올 대 ab 비율 = 4.0). 벌크 Ab-SH(5.1mg, 35nmol)에 HSP27-Mal 유도체(TBS pH 7.5에서 새로 제조됨, 2mg/ml, '티올' 당 1.3몰 당량, 182nmol)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 짧게 볼텍싱시킨 다음 20℃에서 120분 동안 배양했다. 트라스투주맙 - HSP27 BNA 유도체 접합 반응 외에도 탈염된 Ab-SH(0.5mg, 3.3nmol)의 두 분취물을 각각 양성 및 음성 대조군으로서 NEM('티올' 당 1.3몰 당량, 17.3nmol, 0.25mg/ml 용액 6.7μl) 또는 TBS pH 7.5 버퍼(6.7μl)와 20℃에서 120분 동안 반응시켰다. 인큐베이션 후(NEM 첨가 전), Ab - HSP27 BNA 혼합물의 0.100ml 분취물을 제거하고 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이 분취물은 UV-비스로 특성화되었으며 양성 및 음성 대조군과 함께 HSP27 편입을 얻기 위한 엘반 어세이로 특성화되었다. 벌크 Ab - HSP27 혼합물에 새로 제조된 NEM 용액의 분취물(0.25 mg/ml, 2.5 mole 당량, 89 nmol)을 첨가하고 혼합물을 DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 × 30 cm Sephadex G50M을 사용한 겔 여과로 정제한 다음, 반복된 원심 여과 및 100KDa MWCO 농축기를 사용하여 세척하여 정제된 트라스투주맙-(L-HSP27-L-차단된)4 접합체를 얻었다. 생물학적 평가를 위해 분배하기 전에 생성물을 0.2μm까지 여과하였다.
Figure pct00059
항체 -(Cys-3작용성 링커-(L-S01861)-(L-HSP27 BNA)) n
트라스투주맙-[S-Tri-(L-SO1861)-(L-HSP27)] 4 , 트라스투주맙-[S-Tri-(차단된)-(L-HSP27)] 4 , 세툭시맙-[S-Tri-(L-SO1861)-(L-HSP27)] 4 , 세툭시맙-[S-Tri-(차단된(L-HSP27)] 4
트라스투주맙 및 세툭시맙은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 이후 "HSP27-Mal"로 지칭되는 HSP27 BNA 유도체를 함유하는 2개의 상이한 말레이미드(Mal)에 Michael형 티올-엔 반응을 통해 접합되었다. 이러한 HSP27-Mal 유도체는 즉: 1) Mal-3작용성 링커-(L-SO1861)-(L-HSP27), 2) Mal-3작용성 링커-(차단된)-(L-HSP27)이었다. 절차는 트라스투주맙-[S-3작용성 링커-(L-SO1861)-(L-HSP27 BNA)]4에 대해 예시적으로 설명된다.
트라스투주맙은 탈이온수(DI)로 21mg/ml로 재구성되고, 그 다음 히스티딘 버퍼 pH 6을 사용하여 5mg/ml로 희석되었다. 20mg(4.0ml) 분취물에 각각의 Tris 농축물(127mg /ml, 1.05M), Tris.HCl 농축물(623mg/ml, 3.95M) 및 EDTA-Na2 농축ㅁ물95mg/ml, 0.26M)을 사용하여 50mM TBS, 2.5mM EDTA 버퍼 pH 7.5를 얻었다.
트라스투주맙(20.30mg, 4.920mg/ml, 0.14μmol)에 새로 제조된 TCEP 용액(1.00mg/ml, 2.35mol 등가물, 0.32μmol)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음 롤러 혼합하면서 20℃에서 90분 동안 인큐베이션했다. 배양 후(구성물 추가 전), 약 2mg(0.439ml)의 Ab-SH 분취물을 각 혼합물에서 제거하고, 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이러한 분취물은 UV-비스 분석 및 엘만 어세이(티올 대 ab 비율 = 4.0)로 특성화되었다. 벌크 Ab-SH를 2개의 분취물(1.1 mg, 7.6 nmol 및 1.2 mg, 8.3 nmol)으로 분할하고, 각 분취물에 각 HSP27 BNA-Mal 유도체 1 - 2의 분취물(TBS pH 7.5에서 새로 제조됨, 2mg/ml, '티올' 당 1.3몰 당량, 40nmol 및 43nmol)을 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱시킨 다음 20℃에서 120분 동안 인큐베이션했다. 트라스투주맙 - HSP27 BNA 유도체 2 접합 반응 외에도 탈염된 Ab-SH(0.5mg, 3.3nmol)의 두 분취물을 각각 양성 및 음성 대조군으로서 NEM('티올' 당 1.3몰 당량, 17.3nmol, 0.25mg/ml 용액 6.7μl) 또는 TBS pH 7.5 버퍼(6.7μl)와 20℃에서 120분 동안 반응시켰다. 인큐베이션 후(NEM 첨가 전), Ab - 구조물 2 혼합물의 0.100ml 분취물을 제거하고, 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이 분취물은 UV-비스로 특성화되고 양성 및 음성 대조군과 함께 HSP27 BNA 유도체 2 편입을 얻기 위한 엘만 어세이로 특성화되었다. 각각의 벌크 Ab - 구조물 혼합물에 새로 준비된 NEM 용액(0.25 mg/ml, 2.5 mole 당량, 19 및 21 nmol)의 분취물을 첨가하고 혼합물을 DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 × 30 cm Sephadex G50M을 사용하여 겔 여과로 정제한 다음, 반복된 원심 여과 및 100KDa MWCO 농축기를 사용하여 세척하여 정제된 트라스투주맙 - 구조물 1 - 2 접합체를 얻었다. 생물학적 평가를 위해 분배하기 전에 생성물을 0.2μm까지 여과하였다.
Figure pct00060
항체-(L-S01861) n -(L-HSP27 BNA) n
DAR4로 PEG 4 -SPDP를 통한 트라스투주맙-(L-SO1861) 4 -(L-HSP27) 4 , 세툭시맙--(L-SO1861) 4 -(L-HSP27) 4 합성 DAR2로 PEG 4 -SPDP를 통한 세툭시맙--(L-SO1861) 4 -(L-HSP27) 2 (FBR703 STB17/7-8) 합성
트라스투주맙-(L-SO1861)4, 세툭시맙-(L-SO1861)4는 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 Ab와 HSP27 BNA 사이에 불안정한 (L) 이황화 결합을 형성하는 테트라(에틸렌 글리콜) 석신이미딜 3-(2 피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP) 링커를 통해 HSP27 BNA 이황화물에 접합되었다. 절차는 트라스투주맙-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4에 대해 예시적으로 설명된다.
HSP27 BNA 이황화 올리고(2.7mg, 470nmol, 6.10mg/ml)를 TCEP(10몰 당량, 4.7μmol, 1.34mg, 50mg/ml)와 20℃에서 롤러 혼합하면서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 올리고-SH를 TBS pH 7.5로 용리하는 PD10 G25 탈염 컬럼으로 정제하고 즉시 사용하였다. 올리고-SH를 얻었다(2.48 mg, 90%, 1.24 mg/ml, SH 대 올리고 비율 = 0.8).
트라스투주맙-(L-SO1861)4(1.3 mg, 8.7 nmol, 2.50 mg/ml)를 새로 제조된 DMSO(1 mg/ml) 중의 PEG4-SPDP 용액(9.26 mole 당량, 80.3 nmol, 45 μg)의 분취물과 롤러 혼합하면서 20℃에서 60분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응을 글리신(TBS pH 7.5에서 새로 제조된 2 mg/ml 용액 15.1 ㎕)으로 켄칭한 다음, TBS pH 7.5로 용리하는 제바 탈염 컬럼을 통해 탈염하였다. 생성된 Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SPDP)의 분취물을 취해 UV-비스 분석으로 시험하였다. SPDP 편입은 피리디일-2-티온(PDT)을 유리시키는 TCEP 및 343 nm에서 UV-비스 분석(SPDP 대 Ab 비율 = 4)을 사용하여 측정했다. 나머지 Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SPDP)를 새로 제조된 HSP27 올리고뉴클레오티드(올리고-SH)(8몰 당량, 54.8nmol, 0.32mg, 1.24mg/ml)의 분취물과 반응시키고 롤러 혼합하면서 20℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 17시간 후, 접합체를 UV-비스 분석으로 분석하여 343 nm에서 피리디일-2-티온(PDT)의 치환에 의한 HSP27의 편입을 확인하였다. 조 접합체를 DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 x 33 cm Sephadex G50 컬럼을 사용하여 정제했다. 생성된 트라스투주맙-(L-SO1861)4-(L-HSP27 BNA)4를 단일 분획으로 얻었다. 수율: 0.47 mg, 45%(0.49 mg/ml), HSP27 대 Ab 비율 = 3.5
Figure pct00061
항체-(L-QS Mix) n
트라스투주맙, 세툭시맙은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 Michael형 티올-엔 접합 반응을 통해 사포닌 QS Mix-EMCH에 접합되었다. 절차는 트라스투주맙-L-QS Mix에 대해 예시적으로 설명된다.
트라스투주맙("Ab", 600mg)을 탈이온수(DI)로 21mg/mL로 재구성한 다음, 새로 제조된 히스티딘 버퍼 pH 6(5mM 히스티딘 pH 6, 2% 트레할로스, 0.01% Tween 20)을 사용하여 5mg/mL로 희석하였다. 10 μL/mL 각각의 Tris 농축물(127mg/mL, 1.05M), Tris.HCL 농축물(623mg/mL, 3.95M) 및 EDTA-Na2 농축물(95mg/ml, 0.26M)을 첨가하여 50mM TBS, 2.5mM EDTA 버퍼 pH 7.5를 얻었다. 트라스투주맙(603.8 mg, 4.887 mg/mL, 4.0 μmol)에 새로 제조된 TCEP 용액(1 mg/mL, 2.35 mole 당량, 9.5 μmol, 2.72 mg)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 손으로 휘저어 혼합한 다음, 롤러 혼합하면서 20℃에서 90분 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후(QS Mix-EMCH 첨가 전), Ab-SH의 2mg(0.409mL) 분취물을 제거하고, 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이 분취물은 UV-비스 분석 및 엘만 어세이로 특성화되었다. 벌크 Ab-SH에 새로 준비된 QS Mix-EMCH 용액(2mg/mL, 5.2몰 당량, 21μmol, 21.6mL)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음 20℃에서 120분 동안 인큐베이션했다. 접합 반응 외에, 탈염된 Ab-SH(0.5 mg, 0.134 mL, 3.33 nmol)의 두 분취물을 NEM(8.00 당량, 26.6 nmol, 3.3 μg, 13.3 μL의 0.25 mg/mL 용액) 또는 TBS pH 7.5 버퍼(13.3 μL)와 20℃에서 120분간, 각각 양성 및 음성 대조군으로 반응시켰다. 배양 후(NEM 첨가 전), 약 2 mg(0.481 mL) 분취물의 QS Mix-EMCH 혼합물을 제거하고, 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이 분취물은 UV-비스로 특성화되었으며 양성 및 음성 대조군과 함께 QS Mix-EMCH 편입을 얻기 위한 엘만 어세이로 특성화되었다. 벌크 Ab - QS Mix-EMCH 혼합물에 새로 준비된 NEM 용액(2.5mg/mL, 5몰 당량, 20μmoL, 2.51mg)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 2-8℃에서 밤새 보관했다. 접합체를 DPBS pH 7.5로 용리하는 10 x 40cm Sephadex G50M 컬럼으로 정제하여 정제된 트라스투주맙-(L-QS Mix) 접합체를 얻었다. 생성물을 전체적으로 농축시킨 다음, 비바셀 100 농축기(2,000g, 4℃, 200분)를 사용하여 5mg/mL로 정규화하였다. 생성물을 0.2μm로 여과하고 생물학적 평가를 위해 분배하였다. 수율: n.d. QS 믹스 대 Ab 비율 = 4.1.
Figure pct00062
항체-(L-HSP27BNA-L-S01861) n
DAR4를 이용한 트라스투주맙-(L-HSP27BNA-L-SO1861) 4 , 세툭시맙-(L-HSP27BNA-L-SO1861) 4
트라스투주맙 및 세툭시맙은 이하 "ab"로 지칭된다. Ab는 사포닌 SO1861 및 이후 "HSP27-Mal"로 지칭되는 HSP27 유도체를 함유하는 말레이미도(Mal)와 접합되었다. Ab는 Michael형 티올-엔 접합 반응을 통해 HSP27-Mal에 접합되었다. HSP17-Mal은 이의 구조와 이의 말레이미드 작용기 사이에 불안정한 (L) 히드라존 결합을 얻어 HSP27 BNA와 Ab 사이에 불안정한 결합을 생성한다. 절차는 트라스투주맙-(L-HSP27 BNA-L-SO1861)4에 대해 예시적으로 설명된다.
트라스투주맙을 탈이온수(DI)로 21mg/ml로 재구성한 다음, 히스티딘 버퍼 pH 6을 사용하여 5mg/ml로 희석했다. 20mg(4.0ml) 분취물에 각각의 Tris 농축물(127mg /ml, 1.05M), Tris.HCl 농축물(623mg/ml, 3.95M) 및 EDTA-Na2 농축물(95mg/ml, 0.26M)을 첨가하여 50mM TBS, 2.5mM EDTA 버퍼 pH 7.5를 얻었다. 트라스투주맙(20.30mg, 4.920mg/ml, 0.14μmol)에 새로 제조된 TCEP 용액(1.00mg/ml, 2.35mol 당량, 0.32μmol)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음 롤러 혼합하면서 20℃에서 90분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후(HSP27-Mal 첨가 전), 약 2mg(0.439ml) 분취물의 Ab-SH를 각 혼합물에서 제거하고, 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이 분취물은 UV-비스 분석 및 엘만 어세이로 특성화되었다(티올 대 ab 비율 = 4.0). 벌크 Ab-SH(4.7mg, 32nmol)에 HSP27-Mal 유도체(TBS pH 7.5에서 새로 제조됨, 2mg/ml, '티올' 당 1.3몰 당량, 166nmol)의 분취물을 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음 20℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 트라스투주맙 - HSP27 BNA 유도체 접합 반응 외에도 탈염된 Ab-SH(0.5mg, 3.3nmol)의 두 분취물을 NEM('티올' 당 1.3mole 당량, 17.3nmol, 0.25mg/ml 용액 6.7μl) 또는 TBS pH 7.5 버퍼(6.7 μL)와 20℃에서 120분간, 각각 양성 및 음성 대조군으로 반응시켰다. 인큐베이션 후(NEM 첨가 전), Ab - HSP27 BNA 혼합물의 0.100ml 분취물을 제거하고 제바 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 TBS pH 7.5로 겔 여과하여 정제했다. 이 분취물은 UV-비스로 특성화되었으며 양성 및 음성 대조군과 함께 HSP27 편입을 얻기 위한 엘만 어세이로 특성화되었다. 벌크 Ab - HSP27 혼합물에 새로 준비된 NEM 용액(0.25 mg/ml, 2.5 mole 당량, 80 nmol)의 분취물을 첨가하고 혼합물을 DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 × 30 cm Sephadex G50M을 사용한 겔 여과로 정제하고, 반복된 원심 여과 및 100KDa MWCO 농축기를 사용하여 세척하여 정제된 트라스투주맙-(L-HSP27 BNA-L-SO1861)4 접합체를 얻었다. 생물학적 평가를 위해 분배하기 전에 생성물을 0.2μm까지 여과하였다.
Figure pct00063
항체-(L-S01861) n -(S-디안틴) n
DAR2를 이용한 SMCC를 통한 트라스투주맙-(L-S01861) 4 -(S-디안틴) 2 및 세툭시맙-(L-S01861) 4 -(S-디안틴) 2 합성
트라스투주맙-L-SO1861 및 세툭시맙-L-SO1861은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) 링커를 통해 디안틴-Cys에 접합되어 Ab와 디안틴 사이에 안정한 (S) 아미드 결합을 제공한다. 절차는 트라스투주맙-(L-SO1861)4-(S-디안틴)2에 대해 예시적으로 설명된다.
디안틴-Cys(7.8 mg, 261 nmol, 0.78 mg/ml)를 TCEP(5 mol 당량, 1.31 μmol, 0.37 mg, 1 mg/ml)와 20℃에서 30분 동안 롤러 혼합하면서 반응시켰다. 그 후, 단백질-SH를 TBS pH 7.5로 용리하는 제바 탈염 컬럼으로 정제하여 즉시 사용하였다. 단백질-SH를 얻었다(5.2 mg, 67%, 0.52 mg/ml, SH 대 단백질 비율 = 1 ± 0.1).
트라스투주맙-(L-SO1861)4(1.5mg, 10nmol, 2.50mg/ml)를 DMSO(0.5mg/ml) 중 새로 제조된 SMCC 용액(4.83몰 당량, 48.3nmol, 16μg)의 분취물과 롤러 혼합하면서 20℃에서 60분간 반응시켰다. 그 후, 반응을 글리신(TBS pH 7.5에서 새로 제조된 1 mg/ml 용액 18.1 ㎕)으로 켄칭한 다음, TBS pH 7.5로 용리하는 제바 탈염 컬럼을 통해 탈염하였다. 생성된 Tras-(L-SO1861)-(S-SMCC)(1.22mg, 8.1nmol, 2.03mg/ml)를 새로 환원된 디안틴-Cys(3.2몰 당량, 32.5nmol, 0.97mg, 0.52mg/ml)의 분취물과 반응시키고, 롤러 혼합하면서 20℃에서 밤새 인큐베이션했다. 17시간 후, 접합체를 비바스핀 T4 농축기를 사용하여 ≤1 ml로 농축하고, DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 x 37 cm Superdex 200PG 컬럼을 사용하여 정제했다. 생성된 Tras-(L-SO1861)4-(S-디안틴)2 접합체는 고분자량(HMW)(0.36 mg, 30%, 0.34 mg/ml, 디안틴 대 Ab 비율 = 측정되지 않음) 및 저분자량(LMW)(0.49 mg, 40%, 0.30 mg/ml, 디안틴 대 Ab 비율 = 측정되지 않음) 분획으로서 획득되었다. 수율: n.d. 순도: 79.3%.
Figure pct00064
12. 항체-(S-디안틴) n
DAR2로 SMCC를 통한 트라스투주맙-(S-디안틴) 2 , 세툭시맙-(S-디안틴) 2 합성
트라스투주맙-L-SO1861 및 세툭시맙-L-SO1861은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) 링커를 통해 디안틴-Cys에 접합되어 Ab와 디안틴 사이에 안정한 (S) 아미드 결합을 제공한다. 절차는 트라스투주맙-(S-디안틴)2에 대해 예시적으로 설명된다.
디안틴-Cys(7.8 mg, 261 nmol, 0.78 mg/ml)를 TCEP(5 mol 당량, 1.31 μmol, 0.37 mg, 1 mg/ml)와 20℃에서 30분 동안 롤러 혼합하면서 반응시켰다. 그 후, 단백질-SH를 TBS pH 7.5로 용리하는 제바 탈염 컬럼으로 정제하여 즉시 사용하였다. 단백질-SH를 얻었다(5.2 mg, 67%, 0.52 mg/ml, SH 대 단백질 비율 = 1 ± 0.1).
트라스투주맙(1.5mg, 10nmol, 2.50mg/ml)를 DMSO(0.5mg/ml) 중 새로 제조된 SMCC 용액(3.16몰 당량, 31.6nmol)의 분취물과 롤러 혼합하면서 20℃에서 60분간 반응시켰다. 그 후, 반응을 글리신(TBS pH 7.5에서 새로 제조된 1 mg/ml 용액 18.1 ㎕)으로 켄칭한 다음, TBS pH 7.5로 용리하는 제바 탈염 컬럼을 통해 탈염하였다. 생성된 Tras-(S-SMCC)(1.22mg, 8.1nmol, 2.03mg/ml)를 새로 환원된 디안틴-Cys(3.2몰 당량, 32.5nmol, 0.97mg, 0.52mg/ml)의 분취물과 반응시키고, 롤러 혼합하면서 20℃에서 밤새 인큐베이션했다. 17시간 후, 접합체를 비바스핀 T4 농축기를 사용하여 ≤1 ml로 농축하고 DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 x 37 cm Superdex 200PG 컬럼을 사용하여 정제했다. 수율: n.d. 순도: 99%
Figure pct00065
항체-(L-S01861) n -(L-디안틴) n
DAR2로 PEG 4 -SPDP를 통한 트라스투주맙-(L-S01861) 4 -(L-디안틴) 2 , 및 세툭시맙-(L-S01861) 4 -(L-디안틴)2 합성
트라스투주맙-L-S01861, 및 세툭시맙-L-S01861은 이하 "Ab"라고 지칭한다. Ab는 Ab와 디안틴 사이에 불안정한 (L) 이황화 결합을 형성하는 테트라(에틸렌 글리콜) 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP) 링커를 통해 디안틴-Cys에 접합되었다. 절차는 트라스투주맙-L-SO1861에 대해 예시적으로 설명된다.
디안틴-Cys(7.8 mg, 261 nmol, 0.78 mg/ml)를 TCEP(5 mol 당량, 1.31 μmol, 0.37 mg, 1 mg/ml)와 20℃에서 30분 동안 롤러 혼합하면서 반응시켰다. 그 후, 단백질-SH를 TBS pH 7.5로 용리하는 제바 탈염 컬럼으로 정제하여 즉시 사용하였다. 단백질-SH를 얻었다(5.2 mg, 67%, 0.52 mg/ml, SH 대 단백질 비율 = 1 ± 0.1).
트라스투주맙-(L-S01861)4(0.75 mg,5 nmol, 2.50 mg/ml)를 DMSO(1 mg/ml) 중 새로 제조된 PEG4-SPDP 용액(4.95 몰 당량, 24.75 nmol, 14 μg)의 분취물과 20℃ 에서 롤러 혼합하면서 60분 동안 반응시켰다. 이후, 반응물을 글라이신(TBS pH 7.5 에서 새로 제조된 용액 18.1μl의 1 mg/ml)으로 켄칭시킨 후, TBS pH 7.5로 용리시키는 제바 탈염 컬럼을 통해 탈염시켰다. 생성된 Tras-(L-S01861)-(S-PEG4-SPDP)의 분취물을 취하여 UV-비스 분석에 의해 시험하였다. SPDP 편입은 피리디일-2-티온(PDT)을 유리시키는 TCEP 및 343 nm에서 UV-비스 분석(SPDP 대 Ab 비 = 2.4)에 의해 측정하였다. 나머지 Tras-(L-S01861)-(S-PEG4-SPDP)를 새로 제조된 디안틴-Cys(단백질-SH)(4 몰 당량, 20 nmol, 0.6 mg, 0.52 mg/ml)의 분취물과 반응시키고, 롤러 혼합하면서 20℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 17시간 후, 콘쥬게이트의 분취물을 UV-비스 분석에 의해 분석하여 PDT의 치환에 의한 디안틴-Cys의 편입을 확인하였다. 그 후, 접합체를 비바스핀 T4 농축기를 사용하여 < 1 ml로 농축시키고, DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 x 37 cm Superdex 200PG 컬럼을 사용하여 정제했다(디안틴 대 Ab 비율 = 2). 수율: n.d. 순도: 60.5%
Figure pct00066
항체-(L-디안틴) n
트라스투주맙-(L-디안틴) 2 , 세툭시맙-(L-디안틴) 2 및 DAR2로 PEG 4 -SPDP를 통한 합성
트라스투주맙 및 세툭시맙은 이하 "Ab"라고 지칭한다. Ab는 Ab와 디안틴 사이에 불안정한 (L) 이황화 결합을 형성하는 테트라(에틸렌 글리콜) 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP) 링커를 통해 디안틴-Cys에 접합되었다. 절차는 트라스투주맙-L-SO1861에 대해 예시적으로 설명된다.
디안틴-Cys(7.8 mg, 261 nmol, 0.78 mg/ml)를 TCEP(5 mol 당량, 1.31 μmol, 0.37 mg, 1 mg/ml)와 20℃에서 30분 동안 롤러 혼합하면서 반응시켰다. 그 후, 단백질-SH를 TBS pH 7.5로 용리하는 제바 탈염 컬럼으로 정제하여 즉시 사용하였다. 단백질-SH를 얻었다(5.2 mg, 67%, 0.52 mg/ml, SH 대 단백질 비율 = 1 ± 0.1).
트라스투주맙(0.75 mg,5 nmol, 2.50 mg/ml)를 DMSO(1 mg/ml) 중 새로 제조된 PEG4-SPDP 용액(3.35 몰 당량, 16.75 nmol)의 분취물과 20℃에서 롤러 혼합하면서 60분 동안 반응시켰다. 이후, 반응물을 글라이신(TBS pH 7.5에서 새로 제조된 용액 18.1μl의 1 mg/ml)으로 켄칭시킨 후, TBS pH 7.5로 용리시키는 제바 탈염 컬럼을 통해 탈염시켰다. 생성된 Tras-(S-PEG4-SPDP)를 취하여 UV-비스 분석에 의해 시험하였다. SPDP 편입은 피리디일-2-티온(PDT)을 유리시키는 TCEP 및 343 nm에서 UV-비스 분석에 의해 측정하였다. 나머지 Tras-(S-PEG4-SPDP)를 새로 제조된 디안틴-Cys(단백질-SH)(4몰 당량, 20 nmol, 0.6 mg, 0.52 mg/ml)의 분취물과 반응시키고, 롤러 혼합하면서 20℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 17시간 후, 콘쥬게이트의 분취물을 UV-비스 분석에 의해 분석하여 PDT의 치환에 의한 디안틴-Cys의 편입을 확인하였다. 그 후, 접합체를 비바스핀 T4 농축기를 사용하여 < 1 ml로 농축시키고, DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 x 37 cm Superdex 200PG 컬럼을 사용하여 정제했다(디안틴 대 Ab 비율 = 2). 수율: n.d. 순도: 67.7%
Figure pct00067
실시예 12
재료 및 방법
현재 작업에서 본 발명자들은 Schiff(쉬프) 염기(이민)를 통한 사포닌 결합을 위한 4개의 분자 팔과 클릭 화학을 위한 하나의 팔로 구성된 모델 스캐폴드를 조사했다. 중합체 구조(도 19)는 Iris Biotech GmbH(Marktredwitz, 독일)에서 구입한 1세대의 (즉, 반복된 분기 사이클의 수) 5가 폴리에틸렌 글리콜 기반 덴드리머이다. 사포닌(이 실시예에서 SA1641)은 Merck(Darmstadt, Germany)에서 입수한 사포늄 알붐(Saponinum album)이라고 불리는 집소필라(Gypsophila) 종의 사포닌 복합 원료 추출물로부터 정제되었다. 분말 원료 추출물(2.5g)을 소듐 히드록시드(0.2g)로 물(100mL)에서 가수분해하였다. 그 용액을 40℃에서 20시간 동안 교반한 다음, pH 5.0에 도달할 때까지 글래시얼 아세트산을 보충하였다. 탄닌을 제거하기 위해 분리 깔때기에서 30mL 부탄올과 함께 용액을 흔들었다. 수상을 재포획하고 부탄올 추출을 2회 반복하였다. 부탄올 상을 무수 소듐 설페이트로 보충하고, 여과하고, 모았다. 부탄올을 증발시키고, 나머지 사포닌 분말을 20% 메탄올에 용해시켜 최종 농도 30 mg/mL로 만들었다. 짧은 초음파 처리 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 다른 사포닌을 분리했다. 튜브(컬럼 제외)를 1.5mL/min의 유속으로 따뜻한 물(40℃)로 헹군 다음, 이소프로판올(100%)이 함유된 Eurospher RP-C18-컬럼(5 μm, 250 × 8 mm)을 포함하였다. 사포닌을 컬럼에 적용하고, 메탄올 구배로 용리했다(0.01% 트리플루오로아세트산이 보충된 물에서 1.5mL/min으로 30분내 20% 메탄올 내지 70% 메탄올, 그 다음 추가 60분동안 70% 메탄올)(Sama et al., 2018). 분획의 분취물을 전자분무 이온화 질량 분석기(ESI-MS)로 SA1641 함량에 대해 분석했다. 순수한 SA1641을 함유하는 분획을 모으고 메탄올을 증발시켰다. 수용액을 드라이아이스를 사용하여 회전하는 둥근 바닥 플라스크에서 박막으로 동결시켰다. -80℃에서 16시간 동안 보관한 후 샘플을 동결건조했다. 본 발명에 정의된 스캐폴드를 생성하기 위해, 중합체 구조(0.2mM) 및 SA1641(3.2mM)을 물(약 pH 8)에 용해시키고, 동일한 부피로 혼합하고 26℃에서 24시간 동안 진탕시켰다. 그런 다음 소듐 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3; 0.1 M)를 SA1641에 대해 4배 몰 과량으로 첨가하고, 샘플을 추가로 24시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 구조를 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)/ESI-MS로 확인했다. 샘플을 RP-C4-컬럼에 적용하고, 메탄올 구배(0.01% 트리플루오로아세트산이 보충된 물에서 15분내 25% 메탄올 내지 80% 메탄올, 그 다음 추가 10분 동안 80% 메탄올)로 용리했다. 분획은 Waters Corporation의 LC-TOF(time-of-flight) 질량 분석기를 사용하여 전자분무 이온화로 정확한 질량 측정을 위해 특별히 설계된 이온 소스인 LockSpray™를 사용하여 분석했다.
결과
도 58의 삽입은 동위원소 패턴 계산기인 EnvirPat Web 2.0으로 계산하여 얻은 이론적으로 예상되는 질량 스펙트럼을 보여준다. 패턴은 분자의 전하와 동위 원소의 자연 발생을 고려하며, 이는 단일 물질에 대해 1 초과의 피크가 예상되는 이유이다. UPLC/ESI-MS로 얻은 실험 데이터(도 58)는 m/z 758-760에서 예측한 것과 동일한 강도로 거의 정확히 동일한 피크를 보여 중합체 구조로 성공적인 SA1641 커플링을 증명한다.
실시예 13
재료 및 방법
약학 활성 물질의 예로서 표적화된 독소 디안틴-표피 성장 인자(디안틴-EGF)를 사용하였다. 플라스미드 His-디안틴-EGF-pET11d(Weng et al, 2009)(100ng)를 20μL Escherichia coli Rosetta™ 2(DE3) pLysS Competent Cells(Novagen, San Diego, CA, USA)에 첨가하였다. 세포를 열 충격(얼음에서 30분, 42℃에서 90초 및 얼음에서 1분)으로 형질전환시켰다. 그 후, 300 μL 리소제니 브로쓰(LB)를 첨가하고 현탁액을 200 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 50μg/mL 암피실린이 포함된 예열된 리소제니 브로스 한천 플레이트에 100μl 박테리아 현탁액을 접종하고, 플레이트를 37℃에서 밤새 배양했다. 50μg/mL 암피실린이 포함된 리소제니 브로스(3mL)에 플레이트의 콜로니를 접종하고 박테리아를 37℃ 및 200rpm에서 8시간 동안 인큐베이션했다. 현탁액(50μL)을 50μg/mL 암피실린이 포함된 500mL의 리소제니 브로쓰에 첨가하고 37℃ 및 200rpm에서 밤새 인큐베이션했다. 이어서, 부피를 2.0 L로 스케일-업하고 파장 600 nm에서의 광학 밀도가 0.9에 도달할 때까지 동일한 조건에서 박테리아를 성장시켰다. 이후, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 최종 농도 1mM으로 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 단백질 발현은 37℃ 및 200rpm에서 3시간 동안 지속되었다. 마지막으로, 박테리아 현탁액을 5,000g 및 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, 20mL PBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4)에 재현탁하고 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다. 정제를 위해 박테리아 현탁액을 해동하고 초음파 처리하여 용해시켰다. 용해물을 원심분리하고(15,800×g, 4℃, 30분) 이미다졸을 최종 농도 20mM까지 첨가했다. 상층액을 20mM 이미다졸의 존재 하에 4℃에서 30분 동안 연속 진탕 하에 2mL의 Ni-니트릴로트리아세트산 아가로오스와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 그 물질을 20mL 컬럼에 붓고, 10mL 세정 버퍼(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸)로 3회 세척하고, 세정 버퍼 중의 증가하는 농도의 이미다졸의 10mL-부분(portion)(31, 65, 125 및 250mM)으로 디안틴-EGF를 용리하였다. 용리 분획(2mL)을 2.0L PBS에 대해 4℃에서 밤새 투석했다. 탈염된 디안틴-EGF를 Amicon® Ultra-15(10kDa)로 농축하고 단백질 농도를 정량화했다.
적절한 클릭 화학기를 디안틴-EGF에 도입하기 위해, 디안틴-EGF에 대해 언급된 8배 몰 과량의 알킨-PEG5-N-히드록시석신이미딜 에스테르를 디메틸 설폭사이드에 용해시키고, 9부피의 디안틴-EGF(0.2M NaH2PO4/Na2HPO4, pH 8에 1 mg)를 첨가하였다. 실온에서 4시간 동안 배양한 후, PD10 컬럼(GE-Healthcare, Freiburg, 독일)을 사용하여 결합되지 않은 알킨을 분리했다. 중합체 구조를 갖는 클릭 화학은 구리(I)-촉매화된 알킨-아지드 고리화 첨가에 의해 수행되었다. 알킨-디안틴-EGF(0.02mM), 덴드리머(0.05mM), CuSO4(0.1mM), 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민(0.5mM) 및 소듐아스코르베이트(5mM)을 0.1M NaH2PO4/Na2HPO4, pH 8에서, 실온에서 1시간 동안 부드러운 교반 하에 인큐베이션하였다. 그런 다음 PD10 컬럼을 사용하여 저분자량 물질을 분리했다.
본 발명의 효능을 시험하기 위해, 본 발명자들은 HER14 세포로 생존능 어세이를 수행하였다. 이들 세포는 인간 표피 성장 인자 수용체로 안정적으로 형질감염된 섬유아세포이며, 따라서 표적화된 독소 디안틴-EGF에 대한 표적 세포이다. HER14 세포(2,000개 세포/100μL/웰)를 96웰 세포 배양 플레이트의 웰에 파종하고, 37℃, 5% CO2 및 98% 습도에서 10% 소태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 다른 테스트 물질(결과 및 도 59 참조)을 25μL의 부피로 3회 첨가하고, 배지 25μL를 추가로 보충했다. 72시간 인큐베이션 후, 30 μL 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(물 중 0.5 mg/mL)를 웰당 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션했다. 그 후, 배지를 조심스럽게 제거하고, 10%(v/v) 이소프로판올, 5%(w/v) 소듐 도데실 설페이트 및 400mM HCl을 함유하는 수용액으로 교체하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 가용화된 포르마잔은 마이크로플레이트 판독기(Spectra MAX 340 PC, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에서 570nM에서 광도계로 정량화되었다. 처리되지 않은 세포는 1로 정규화되었고, 모든 샘플은 처리되지 않은 대조군으로 지칭되었다. 유의성은 언페어드 2-표본 t-검정에 의해 결정되었다.
결과
중합체 구조, 본 실시예에서 펜타머 덴드리머(펜트리머)는 SA1641이 없거나 존재하지 않을 때 표적 세포에 어떠한 세포독성 효과도 갖지 않는다(도 59, 컬럼 2 및 3). 스캐폴드가 없는 경우, 표적 독소(디안틴-EGF)는 0.1nM 농도에서 최대 독성의 절반을 나타낸다(컬럼 4). SA1641의 존재하에서 동일한 농도는 엔도솜 탈출의 인핸서로 작용하는 SA1641의 일반적인 능력을 나타내는 모든 세포의 사멸을 초래한다(컬럼 5). 중합체 구조의 존재는 SA1641의 존재 또는 부재 모두에서 디안틴-EGF의 독성에 영향을 미치지 않으며(컬럼 6 및 7), 이는 스캐폴드가 디안틴-EGF의 독성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 클릭 화학을 통해 모델 중합체 구조를 디안틴-EGF의 예시적인 약학적 활성 물질에 커플링하기 위해, 그 물질은 이전에 알킨기와 커플링되어야 했다. 이러한 변형의 결과, 디안틴-EGF는 약간의 활성을 잃었지만(각각 컬럼 8 및 9를 6 및 7과 비교), 비방향성(undirected) 알킨 변형은 본 발명의 아이디어에 영향을 미치지 않으며 향후 적용에서도 요구되지 않는다. 본 발명자들은 독소의 약학적 활성 중심을 방해할 위험이 있는 테스트 목적으로만 알킨을 비방향성 방식으로 도입해야 했다. 약학적 활성 물질의 제조업체는 합성 중 클릭 위치를 물질의 활성이 영향을 받지 않은 상태로 유지되는 자신이 선택한 위치에서 물질에 직접 도입할 수 있다. 알킨으로 변형된 약학적 활성 물질을 중합체 구조에 클릭했을 때 추가적인 활성 손실은 없었으며, 이는 중합체 구조 자체가 독성이 없음을 나타낸다(컬럼 10 및 11).
실시예 14
재료
다음 화학물질을 구입하였다: 메탄올(MeOH, LiChrosolv, Merck), N-ε-말레이미도카프론산 히드라지드(N-ε-maleimidocaproic acid hydrazide)(EMCH, 95%, TCI Chemicals), 트리플루오로아세트산(TFA, 99.8%, Carl Roth), 2-메르캅토에탄올( 98%, Sigma-Aldrich), 폴리(아미도아민)(PAMAM 덴드리머, 에틸렌디아민 코어, 제네레이션 5.0 용액, Sigma-Aldrich), 시아닌 3 카르복실산(Cy3-COOH, 95%, Lumiprobe), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트, N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로-[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드(HATU, 97%, Sigma-Aldrich), 소 혈청 알부민 분획 V(BSA, Carl Roth), 디메틸설폭사이드(DMSO, 99%, Carl Roth), 2-이미노티올란 하이드로클로라이드(98%, Sigma-Aldrich), 로다민 b(RhodB, 95%, Merck), Dulbecco의 인산완충식염수(PBS, Gibco), 염산(HCl, 37%, Merck), NHS-PEG13-DBCO(Click Chemistry Tools), Alexa Fluor™ 488 5-TFP(Thermo-Fischer), 아지도-PEG3-SS-NHS(Conju-Pro be), 소듐 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3, 95%, Sigma-Aldrich), 암모늄 퍼설페이트(APS, 98%, Sigma-Aldrich), N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TMEDA, 99%, Sigma-Aldrich) , 맞춤형 펩티드 SESDDAMFCDAMDESDSK(95%, PeptideSynthetics), 아지도-dPEG12-NHS(95%, Quanta Biodesign), PFd-G4-Azide-NH-BOC Dendron(G4-dendron, 95%, Polymer Factory), Cyanin5-DBCO( Cy5-DBCO, 95%, Lumiprobe), 클로로포름(CHCl3, 99.5%, Sigma), Amicon Ultra 0.5mL 원심분리 필터(3kDa MWCO, Sigma), mPEG-SCM(mPEG2k-NHS, 95.6%, Creative PEG Works), Amicon Ultra 15mL 원심 필터(10kDa MWCO, Sigma).
방법
MALDI-TOF-MS
MALDI-TOF 스펙트럼은 MALDI-질량 분광계(Bruker Ultrafex III)에서 기록되었다. 일반적으로 나노몰에서 마이크로몰 범위의 MilliQ 물에 용해된 샘플은 아세토니트릴(MADLI-TOF-MS 테스트됨, Sigma)/0.1% TFA(7:3 v/v)에 용해된 매트릭스로서 수퍼 DHB(99%, Fluka) 또는 시나핀산(SA, 99%, Sigma-Aldrich)을 사용하여 건조 액적 방법을 통해 표적(MTP 384 표적 플레이트 연마된 강 T F, Bruker Dalton) 상에서 스포트되었다. PepMix(Peptide Calibration Standard, Bruker Daltons) 또는 ProteMass(Protein Calibration Standard, Sigma-Aldrich)가 보정 표준으로 사용되었다. RP 모드는 리플렉터 포지티브 모드를 나타낸다. RN 모드는 리플렉터 네거티브 모드를 나타낸다. LP 모드는 선형 포지티브 모드를 나타낸다.
H-NMR
1H NMR 분석은 Bruker 400MHz NMR 분광기를 사용하여 수행하였다. 측정 24시간 전에 0.8mL의 메탄올-D4(99%, Deutero)에 2mg의 샘플이 용해된 샘플 준비를 수행하였다.
UV-비스(Vis)
UV-비스 측정은 200-750 nm의 스펙트럼 범위에서 NanoDrop ND-1000 분광 광도계에서 수행되었다.
크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 GE Healthcare의 Sephadex G 25 Superfine과 미리 포장된 PD10 컬럼(GE Healthcare, Sephadex G 25 M)에서 수행되었다. 물질은 크로마토그래피를 수행하기 전에 각각의 용리액에서 팽창에 의해 활성화되었다.
투석
재생된 셀룰로오스 막: MWCO = 1 및 2 kDa(Spectra/Por) 및 MWCO = 12-14 kDa(Carl Roth)를 사용하여 투석을 수행했다. 전형적으로, 투석은 공정의 처음 6시간 후에 교환된 용매 1L로 24시간 동안 수행되었다.
동결건조
동결 건조는 Alpha 1-2 LD plus(Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH)에서 수행되었다. 전형적으로, 샘플을 액체 질소로 동결하고 고진공에서 동결 건조기에 넣었다.
S01861-EMCH 합성
사포나리아 오피시날리스 L의 SO1861(59mg, 31.7μmol) 및 EMCH(301mg, 888μmol)를 교반기가 있는 둥근 플라스크에 넣고, 13mL 메탄올에 용해했다. TFA(400μL, cat.)를 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 RCT B 자기 교반기(IKA Labortechnik)에서 800rpm 및 실온에서 3시간 동안 교반했다. 3시간 동안 교반한 후, 혼합물을 MilliQ 물 또는 PBS로 희석하고, MWCO가 1kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(Spectra/Por 7)를 사용하여 MilliQ 물 또는 PBS로 24시간 동안 광범위하게 투석하였다. 투석 후 용액을 동결건조하여 백색 분말을 얻었다. 수율 62.4mg(95%). 건조된 분취물은 1H NMR 및 MALDI-TOF-MS를 통한 특성화에 추가로 사용되었다.
1H NMR(400MHz, 메탄올-D4)(도 60A, SO1861): δ = 0.50-5.50(m, 사포닌 트리테르페노이드 및 당 백본 양성자), 9.43(1H, s, 사포닌의 알데히드 양성자, Ha).
1H NMR(400MHz, 메탄올-D4)(도 60 B. SO1861-EMCH, PBS 워크업): δ = 0.50-5.50(m, 사포닌 트리테르페노이드 및 당 백본 양성자), 6.79(2H, s, 말레이미드 양성자, Hc ), 7.62-7.68 (1H, m, 히드라존 양성자, Hb).
MALDI-TOF-MS(RP 모드)(도 61A): m/z 2124Da([M+K]+, 사포닌-EMCH), m/z 2109Da([M+K]+, SO1861-EMCH) , m/z 2094 Da([M+Na]+, SO1861-EMCH)
MALDI-TOF-MS(RN 모드): m/z 2275 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2244 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2222 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2178 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2144 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2122 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2092 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2070 Da([MH]-, SO1861-EMCH), 2038 Da([MH]-, SO1832-EMCH), 1936 Da([MH]-, SO1730-EMCH), 1861 Da([MH]-, SO1861).
SO1861-EMCH-메르캅토에탄올
SO1861-EMCH(0.1mg, 48nmol)에 200μL 메르캅토에탄올(18mg, 230μmol)을 첨가하고 용액을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 1시간 동안 진탕했다. 1시간 동안 진탕한 후, 용액을 메탄올로 희석하고 MWCO가 1kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(Spectra/Por 7)를 사용하여 메탄올에 대해 4시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후, 분취물을 꺼내 MALDI-TOF-MS를 통해 분석했습니다.
MALDI-TOF-MS(도 61B)(RP 모드): m/z 2193 Da([M+K]+, SO1861-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2185 Da([M+K]+, SO1861-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2170 Da([M+Na]+, SO1861-EMCH-메르캅토에탄올).
BSA-S01861 합성
47μL PBS에 용해된 2-이미노티올란(231μg, 1.1μmol)을 200μL PBS에 용해된 BSA-RhodB 용액(10mg, 0.15μmol)에 첨가하고, 혼합물을 800rpm 및 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 실온에서 40분간 진탕했다. 40분 동안 진탕 후, 반응 혼합을 즉시 Sephadex G25 초미세 크기 배제 컬럼(16mL 컬럼 부피)을 통해 실행하고 100μL PBS에 용해된 SO1861-EMCH(1mg, 0.5μmol)를 수집된 BSA-SH 분획에 첨가했다. 반응 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 12시간 동안 진탕했다. 12시간 동안 진탕한 후 BSA-SO1861은 MWCO가 3kDa인 Amicon Ultra 15 필터를 통해 4,000rpm(15℃)에서 원심 여과를 사용하여 농축되었다. 접합체를 냉장고에 용액으로 보관하고 분석을 위해 분취물을 취했다. 수율: 미측정.
MALDI-TOF-MS(도 69 A)(LP 모드): m/z 74.2kDa([M+H]+, BSA-SO1861, 4 SO1861 부착), 72.2kDa([M+H]+, BSA-SO1861 3 SO1861이 부착된), 70.2 kDa([M+H]+, 2 SO1861이 부착된 BSA-SO1861), 37.0 kDa([M+H]2+, 4 SO1861이 부착된 BSA-SO1861), 35.9 kDa([M+H]2+, 3 SO1861이 부착된 BSA-SO1861), 34.7 kDa([M+H]2+, 2 SO1861이 부착된 BSA-SO1861).
Cy3-PAMAM
메탄올(30mg, 1.04μmol)에 용해된 720μL PAMAM을 250mL 둥근 플라스크에 넣고 회전 증발기(20mbar, 60℃)를 통해 메탄올을 제거했다. 나머지 PAMAM을 9mL DMSO에 용해시켰다. 0.5mL DMSO에 용해된 HATU(7.6mg, 20μmol)를 DMSO 중의 Cy3-COOH(0.6mg, 1.2μmol) 용액에 첨가하고 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 실온에서 800rpm으로 1시간 동안 진탕하였다. 1시간 진탕시킨 후, HATU-Cy3 용액을 교반 PAMAM 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 12시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 MilliQ 물로 희석하고 MWCO가 2kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(Spectra/Por 6)를 사용하여 MilliQ 물에 대해 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후, 접합체 용액의 부피는 회전 증발기(20mbar, 60℃)를 통해 감소되었고 농축된 접합체 용액은 Sephadex G25 초미세 크기 배제 컬럼(16mL 컬럼 부피)을 통해 런닝되었다. 첫 번째 분획을 수집하고 동결건조하여 점성 분홍색 PAMAM-Cy3 접합체를 얻었다. PAMAM-Cy3 접합체 형성은 박층 크로마토그래피(메탄올/물, v/v 1:1) 상의 크로마토그래피 및 Sephadex G 25 초극세 컬럼 상에서 더 빠른 밴드의 출현에 의해 확인되었다. 수율 21.3mg(63%). UV-비스 분광광도법에 의해 측정된 PAMAM 당 염료 몰비는 0.43이었다.
MALDI-TOF-MS(도 71A)(LP 모드): m/z 28.0kDa([M+H]+, Cy3-PAMAM).
Cy3-PAMAM-S01861 합성
절차는 Cy3-PAMAM-(SO1861)5에 대해 예시적으로 설명된다. 250 μL MilliQ 물에 용해된 2-이미노티올란(1 mg, 6.7 μmol)을 125 μL MilliQ 물에 용해된 PAMAM-Cy3 용액(0.5 mg, 17 nmol)에 첨가하고, 혼합물을ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800 rpm 및 실온에서 40분 동안 진탕했다. 40분 동안 진탕 후, 반응 혼합물을 즉시 Sephadex G25 초미세 크기 배제 컬럼(16mL 컬럼 부피)을 통해 실행하고 40μL MilliQ 물에 용해된 SO1861-EMCH(176μg, 85nmol)를 수집된 Cy3-PAMAM-SH 분획에 첨가하였다. 반응 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 12시간 동안 진탕했다. 12시간 동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 MilliQ 물로 희석하고 MWCO가 12 - 14 kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(ZelluTrans, Carl Roth)를 사용하여 MilliQ 물에 대해 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후, Cy3-PAMAM-SO1861 용액은 MWCO가 3kDa인 Amicon Ultra 15 필터를 통해 4000rpm(15℃)에서 원심 여과를 사용하여 농축되었다. 접합체를 냉장고에 용액으로 보관하고 분석을 위해 분취물을 취했다. 수율: 0.5mg(75%).
MALDI-TOF-MS 스펙트럼은 도 71 BD 및 도 72에 예시되어 있다. Cy3-PAMAM-(SO1861)6의 MALDI-TOF-MS(도 71B)(LP 모드): m/z 38.4 kDa([M+H]+, Cy3-PAMAM-SO1861), 17.9 kDa([M+H]2+, Cy3-PAMAM-SO1861).
Cy3-PAMAM-(SO1861)5, Cy3-PAMAM-(SO1861)13, Cy3-PAMAM-(SO1861)51 및 Cy3-PAMAM-(SO1861)27의 합성은, 출발 물질 2-이미노티올란 및 SO1861-EMCH의 공급 당량에서만 상이하고, 위에서 설명한 방법을 통해 수행되었다. 출발 물질의 각 공급 당량 및 접합체의 각 질량은 표 15에 강조 하이라이트로 표시되어 있다.
Figure pct00068
Cy3-PAMAM-NC-S01861 합성
Cy3-PAMAM(0.5mg, 18nmol), SO1861(2.3mg, 1.24μmol) 및 HATU(64.6mg, 170μmol)를 200μL DMSO에 별도로 용해했다. SO1861 및 HATU 용액을 혼합하고 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 20분 동안 진탕했다. 20분 동안 진탕한 후, Cy3-PAMAM 용액을 진탕한 SO1861-HATU 용액에 첨가하고 반응 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 12시간 동안 진탕시켰다. 12시간 동안 진탕 후, 반응 혼합물을 MilliQ 물로 희석하고 MWCO가 12-14kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(ZelluTrans, Carl Roth)를 사용하여 MilliQ 물에 대해 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후 Cy3-PAMAM-NC-SO1861 용액은 MWCO가 3kDa인 Amicon Ultra 15 필터를 통해 4,000rpm(15℃)에서 원심 여과를 사용하여 농축되었다. Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17 접합체를 냉장고에 용액으로 보관하고 분석을 위해 분취물을 취했다. 수율: 0.77 mg(69%).
MALDI-TOF-MS(도 73)(LP 모드): m/z 62.3kDa([M+H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861), 35.7kDa([M+H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861).
G4-덴드론 염료 표지 및 탈보호
PFd-G4-아지드-NH-BOC(G4-덴드론)(9.75mg, 2.11μmol)를 2mL 반응 튜브(Eppendorf)에 넣고 200μL DMSO에 용해했다. DMSO(1.72 μmol * mL-1, 170 nmol) 중 100 μL의 Cy5-DBCO 용액을 G4-덴드론 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 12시간 동안, ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800 rpm으로 진탕했다. 12시간 동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 MilliQ 물로 희석하고 MWCO가 1kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(Spectra/Por 7)를 사용하여 MilliQ 물에 대해 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후 용액을 동결건조하여 청색 분말을 얻었다. 조 생성물을 탈보호 단계를 위한 동결건조로부터 얻은 대로 사용하였다.
부분적으로 Cy5 표지된 동결건조된 G4-덴드론을 교반기가 있는 50mL 둥근 플라스크에서 12mL CHCl3에 용해시켰다. 12mL TFA를 첨가하고 반응 혼합물을 RCT B 자기 교반기(IKA Labortechnik)에서 실온 및 800rpm에서 3시간 동안 교반했다. 3시간 동안 교반한 후, 회전 증발기(Heidolph WB 2000) 상에서 감압(50℃, 30mbar)하에 용매를 제거하였다. 증발 후 배치를 MilliQ 물에 용해하고 PD10 크기 배제 컬럼을 통과시켰다. G4-덴드론 접합체 형성은 박층 크로마토그래피(메탄올/물, v/v 1:1) 상의 크로마토그래피 및 PD10 컬럼에서 더 빠른 밴드의 출현에 의해 확인되었다. 얻어진 크기 배제 크로마토그래피 분획을 동결건조하여 청색 분말을 얻었다.
수율 5.7mg(93%). UV-비스 분광광도법에 의해 결정된 G4-덴드론 몰 비율당 염료는 0.012였다.
MALDI-TOF-MS(RP 모드): m/z 3956 Da([M+Na]+, Cy5-G4-덴드론 + PF6- 반대 이온), 3820 Da([M+Na]+, Cy5-G4-덴드론 - PF6- 반대이온), 3617 Da([M+H]+, G4-덴드론 불순물), 3017([M+H]+, G4-덴드론).
G4-덴드론-S01861 합성
절차는 가장 낮은 G4-덴드론 대 SO1861-EMCH 비율에 대한 예시로 설명된다. 300 μL MilliQ 물에 용해된 2-이미노티올란(2.65 mg, 19.2 μmol)을 252 μL MilliQ 물에서 부분적으로 Cy5 표지된 G4-덴드론 용액(0.577 mg, 192 nmol)에 첨가하고 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 실온에서 800 rpm에서 40분 동안 진탕했다. 40분 동안 진탕 후 반응 혼합물을 즉시 PD10 크기 배제 컬럼을 통해 실행하고 100μL MilliQ 물에 용해된 SO1861-EMCH(1.19mg, 575nmol)를 수집된 G4-덴드론-SH 분획에 첨가했다. 반응 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 12시간 동안 진탕했다. 12시간 동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 Amicon Ultra 원심 필터(3 kDa MWCO)를 사용한 원심 여과를 통해 농축했다. 접합체를 냉장고에 용액으로 보관하고 분석을 위해 분취물을 취했다. 수율: 90 nmol(47%).
MALDI-TOF-MS 스펙트럼은 도 87에 도시된다. G4-덴드론-SO1861의 MALDI-TOF-MS(도 87C)(LP 모드): m/z 10.19 kDa([M+H]+, Cy5-G4-덴드론-[SO1861]3), 9.27kDa([M+H]+, G4-덴드론-[SO1861]3), 7.92kDa([M+H]+, Cy5-G4-덴드론-[SO1861]2), 7.14kDa([M+H]+, G4-덴드론-[SO1861]2), 5.86kDa([M+H]+, Cy5-G4-덴드론-[SO1861]1), 5.07kDa([M+H]+, G4-덴드론-[SO1861]1).
다른 G4-덴드론-(SO1861)n 접합체의 합성은 출발 물질 SO1861-EMCH의 공급 당량이 상이한 것을 제외하고 위에서 설명한 방법을 통해 수행되었다. 출발 물질의 각 공급 당량 및 접합체의 각 질량은 표 16에 하이라이트 표시되어 있다.
Figure pct00069
PAMAM 티올화
절차는 가장 높은 PAMAM 대 2-이미노티올란 비율에 대해 예시적으로 설명된다. 30 μL 메탄올에 용해된 PAMAM(333 μg, 12.8 nmol) 용액에 128 μL MilliQ 물에 용해된 2-이미노티올란(0.53 mg, 3.84 μmol)을 첨가했다. 반응 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 12시간 동안 진탕했다. 12시간 동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 15℃ 및 13500rpm에서 Amicon Ultra 원심 필터(3kDa MWCO)를 사용한 원심 여과를 통해 MilliQ 물로 4회 세척했다. 세척 후 샘플을 동결건조하여 백색 고체를 얻었다. 수율은 측정되지 않았다.
MALDI-TOF-MS 스펙트럼은 도 89에 도시된다. PAMAM-(SH)108의 MALDI-TOF-MS(도 89 E)(LP 모드): m/z 41.5 kDa([M+H]+, PAMAM-[ SH]108).
다른 PAMAM-이미노티올란 접합체의 합성은 출발 물질 2-이미노티올란의 공급 당량이 상이한 것을 제외하고 상기 기재된 방법을 통해 수행되었다. 가장 낮은 2-이미노티올란 공급 반응을 위해 Cy3-PAMAM이 사용되었다.
출발 물질의 각 공급 당량 및 접합체의 각 질량은 표 17에 하이라이트 표시되어 있다.
Figure pct00070
PAMAM PEG화(PEGylation)
절차는 가장 낮은 PAMAM 대 mPEG2k 비율에 대한 예시로 설명된다. 10 μL DMSO에 용해된 PAMAM(333 μg, 12.8 nmol) 용액에 13 μL에 용해된 mPEG2k-NHS(0.268 mg, 128 nmol)을 첨가했다. 반응 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 12시간 동안 진탕했다. 12시간 동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 MilliQ 물로 희석하고 MWCO가 2kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(Spectra/Por 6)를 사용하여 MilliQ 물에 대해 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후, 배치는 Amicon Ultra 15mL 원심 필터(10kDa MWCO)를 사용하여 원심 여과를 통해 농축되었다. 농축된 배치를 PD10 크기 배제 컬럼을 통해 실행한 후 동결건조하여 백색 플루피이 있는 분말을 얻었다. 수율은 측정되지 않았습니다.
MALDI-TOF-MS 스펙트럼은 도 90에 도시되어 있다. PAMAM-(mPEG2k)3의 MALDI-TOF-MS(도 90C)(LP 모드): m/z 33.46 kDa([M+H]+, PAMAM-[ mPEG2k]3).
다른 PAMAM-mPEG2k 접합체의 합성은 출발 물질 mPEG2k-NHS의 공급 등가물에서 상이한 것을 제외하고 상기 기술된 방법을 통해 수행되었다. 출발 물질의 각 공급 당량 및 접합체의 각 질량은 표 18에 하이라이트 표시되어 있다.
Figure pct00071
Cy3-PAMAM-S01861-DBCO 합성
절차는 Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10에 대해 예시적으로 설명된다. Cy3-PAMAM-(SO1861)27(0.41 mg, 4.71 nmol)을 동결-프라이(freeze-fried)하고 100 μL DMSO에 용해시켰다. DMSO에 용해된 DBCO-PEG13-NHS 에스테르(0.197 mg, 188 nmol)를 Cy3-PAMAM-SO1861 용액에 첨가하고, 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800 rpm 및 실온에서 진탕했다. 3시간 동안 진탕 후, 반응 혼합물을 MilliQ 물로 희석하고 MWCO가 12-14kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(ZelluTrans, Carl Roth)를 사용하여 MilliQ 물에 대해 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후 Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO 용액은 MWCO가 3kDa인 Amicon Ultra 15 필터를 통해 4,000rpm(15℃)에서 원심 여과를 사용하여 농축되었다. 접합체를 냉장고에 용액으로 보관하고 분석을 위해 분취물을 취했다. 수율: 0.1mg(22%).
MALDI-TOF-MS(도 74 D)(LP 모드): m/z 92.5 kDa([M+H]+, Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO), 53.0 kDa([M+H]2+, Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO).
Cy3-PAMAM-(SO1861)5-(DBCO)38 및 Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10의 합성은 위에서 설명한 방법을 통해 수행되었다. 출발 물질의 각 공급 당량 및 접합체의 각 질량은 표 19에 하이라이트 표시되어 있다.
Figure pct00072
Cy3-PAMAM-NC-S01861-DBCO 합성
Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17(0.3 mg, 4.8 nmol)을 동결-프라이하고 100 μL DMSO에 용해시켰다. DMSO에 용해된 DBCO-PEG13-NHS 에스테르(0.202 mg, 194 nmol)를 Cy3-PAMAM-NC-SO1861 용액에 첨가하고 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800 rpm 및 실온에서 진탕했다. 3시간 동안 진탕 후, 반응 혼합물을 MilliQ 물로 희석하고 MWCO가 12-14kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(ZelluTrans, Carl Roth)를 사용하여 MilliQ 물에 대해 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후 Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO 용액은 MWCO가 3kDa인 Amicon Ultra 15 필터를 통해 4,000rpm(15℃)에서 원심 여과를 사용하여 농축되었다. 접합체를 냉장고에 용액으로 보관하고 분석을 위해 분취물을 취했다. 수율: 0.1mg(22%). 질량 분석은 PAMAM 분자당 30개의 DBCO 모이어티의 접합을 나타낸다.
MALDI-TOF-MS(도 74B)(LP 모드): m/z 93.2kDa([M+H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO), 49.6kDa([M+H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO).
EGFD디안틴 및 디안틴 발현
플라스미드-DNA(His-디안틴-EGF-pET11d 또는 His-디안틴-pET11d)[20]를 화학적으로 컴피턴트한 대장균 NiCo21(DE3)(New England Biolabs®, Inc.)에 형질전환시키고, 200 rpm에서 5시간 동안 37℃에서 50 μg/mL 암피실린이 보충된 3 mL 리소제니 브로쓰에서 성장시켰다. 이 박테리아를 사용하여 37℃에서 밤새 배양하기 위해 50μg/mL 암피실린이 보충된 500mL 리소제니 브로쓰에 접종했다. 이어서, 배양 부피를 2 L까지 스케일업하고 광학 밀도(A600)가 0.9가 될 때까지 박테리아를 성장시켰다. 단백질 발현은 1mM의 최종 농도에서 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 첨가에 의해 유도되었다. 세포를 37℃ 및 200rpm에서 3시간 동안 추가로 성장시켰다. 원심분리(5분, 5,000g, 4℃) 후 세포 펠릿을 20mL 인산염 완충 식염수(Ca2+ 및 Mg2+가 포함된 Dulbecco의 PBS(인산염 완충 식염수), pH 7.4)에 재현탁하고 -20℃에서 보관했다. 해동 후, 초음파 장치(Branson Sonifier 250, G. Heinemann)에 의해 단백질이 방출되었다. 용액을 원심분리하고(15,800×g, 30분, 4℃) 20mM 이미다졸 농도로 조정했다. 구조물은 N-말단 His-tag를 포함하고 니켈 니트릴로트리아세트산 크로마토그래피(Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 정제되었다. 이미다졸(20-250mM)로 용리한 후 용리액을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(12%)으로 분석했다. 디안틴-EGF 또는 디안틴을 함유하는 분획을 4℃에서 2L 키틴 결합 도메인 버퍼(20mM 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄/HCl, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% Tween-20, pH 8.0)에 대해 투석했다. 키틴 컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한 추가 정제는 Ni-NTA 아가로스에 대한 결합 활성을 갖는 박테리아 단백질을 제거하는 데 사용되었다. 키틴 결합 도메인 완충액으로 용리한 후, 분획을 SDS-PAGE(12%)로 분석하였다. 디안틴-EGF 또는 디안틴을 함유하는 분획을 4℃에서 5L PBS에 대해 투석했다. 정제된 단백질은 Amicon 원심분리 필터 장치(10 kDa, Millipore, Eschborn, 독일)에 의해 농축되었다. 단백질 농도는 비신코닌산 분석법(Pierce, Rockford, USA)으로 측정하였다.
디안틴-EGF-Alexa488 합성
PBS 중 디안틴-EGF(240μg, 6.7nmol) 용액을 MWCO가 3kDa인 Amicon Ultra 15 필터에 넣고 4,000rpm 및 4℃에서 30분 동안 3회 원심분리했다. 각 사이클 후 Amicon 필터는 pH 9에서 0.1M 소듐 카보네이트 버퍼로 다시 채웠다. 세 번째 원심분리 사이클 후에 원심분리를 통해 부피를 0.5mL로 줄였다. 디안틴-EGF 소듐 카보네이트 용액을 2 mL 반응 튜브에 넣고 10 μL DMSO에 용해된 Alexa Fluor™ 488 5-TFP(50 μg, 56 nmol)를 단백질 용액에 첨가했다. 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 80분 동안 진탕했다. 진탕 후, 혼합물을 Sephadex G25 M 크기 배제 컬럼(GE Healthcare, PD10 컬럼)을 통해 실행했다. 디안틴-EGF-Alexa488 접합체를 냉장고의 pH 9에서 0.1M 소듐 카보네이트 버퍼 용액에 저장하고 분석을 위해 분취물을 취했다. 수율: 210μg(85%).
MALDI-TOF-MS(도 75 D)(LP 모드): m/z 36.8kDa([M+H]+, 디안틴-EGF-Alexa488), m/z 33.6kDa([M+H]+, 디안틴- EGF-Alexa488), 18.8kDa([M+H]2+, 디안틴-EGF-Alexa488), 16.6kDa([M+H]2+, 디안틴-EGF-Alexa488).
디안틴-Alexa488 합성
PBS 중 디안틴(184 μg, 6.2 nmol) 용액을 MWCO가 3 kDa인 Amicon Ultra 15 필터에 넣고 4,000 rpm 및 4℃에서 30분 동안 3회 원심분리했다. 각 사이클 후 Amicon 필터는 pH 9에서 0.1M 소듐 카보네이트 버퍼로 다시 채웠다. 세 번째 원심분리 사이클 후에 원심분리를 통해 부피를 0.5mL로 줄였다. 디안틴 소듐 카보네이트 용액을 2mL 반응 튜브에 넣고 3.5μL DMSO에 용해된 Alexa Fluor™ 488 5-TFP(16.7μg, 19nmol)를 단백질 용액에 첨가했다. 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800 rpm 및 실온에서 80분 동안 진탕했다. 진탕 후, 혼합물을 Sephadex G25 M 크기 배제 컬럼(GE Healthcare, PD 10 컬럼)을 통해 실행했다. 디안틴-Alexa488 접합체를 냉장고의 pH 9에서 0.1M 소듐 카보네이트 버퍼 용액에 저장하고 분석을 위해 분취물을 취했다. 수율: 미측정
MALDI-TOF-MS(도 76 D)(LP 모드): m/z 30.7 kDa([M+H]+, 디안틴-Alexa488).
디안틴-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N 3 , 및 디안틴-EGF-Alexa488-PEG 12 -N 3 합성
절차는 디안틴-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3에 대해 예시적으로 설명된다. 디안틴-EGF-Alexa488(70μg, 1.9nmol) 소듐 카보네이트 용액을 2mL 반응 튜브에 넣고 9μL DMSO에 용해된 아지도-PEG3-S-S-NHS(120μg, 272nmol)를 단백질 용액에 첨가했다. 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 12시간 동안 800rpm 및 15℃에서 진탕했다. 진탕 후, 반응 혼합물을 PBS로 희석하고 MWCO가 3kDa인 Amicon Ultra 15 필터를 사용하여 4,000rpm 및 4℃에서 원심 여과를 통해 PBS로 세척하였다.
수율: 54μg(70%).
MALDI-TOF-MS(도 75 E)(LP 모드): m/z 40.8 kDa([M+H]+, 디안틴-EGF-알렉사488-SS-PEG-N3), m/z 37.5 kDa([M+H]+, 디안틴-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3).
디안틴-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3, 및 디안틴-EGF-Alexa488-PEG12-N3의 합성은 상기 기술된 방법을 통해 수행되었지만 사용된 아지도-PEG 링커가 달랐다. 각각의 아지도-PEG 링커, 이들의 공급 당량, 및 접합체의 각각의 질량은 표 20에 하이라이트 표시되어 있다.
Figure pct00073
디안틴-Alexa488-S-S-PEG-N 3
디안틴-Alexa488(24.5μg, 0.8nmol) 소듐 카보네이트 용액을 2mL 반응 튜브에 넣고 9μL DMSO에 용해된 아지도-PEG3-S-S-NHS(34μg, 78nmol)를 단백질 용액에 첨가했다. 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 12시간 동안 800rpm 및 15℃에서 진탕했다. 진탕 후, 반응 혼합물을 PBS로 희석하고 MWCO가 3kDa인 Amicon Ultra 15 필터를 사용하여 4,000rpm 및 4℃에서 원심 여과를 통해 PBS로 세척하였다.
수율: 10.3μg(39%).
MALDI-TOF-MS(도 76 E)(LP 모드): m/z 32.9 kDa([M+H]+, 디안틴-Alexa488-S-S-PEG-N3).
Cy3-PAMAM-사포닌-독소 접합체 합성
절차는 Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO에 대해 예시적으로 설명된다. MilliQ 물 중 Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO(17 μg, 0.184 nmol) 용액을 1.5 mL PBS 중 디안틴-EGF-Alexa488-SS-PEG3-N3(3.6 μg, 0.089 nmol) 용액과 혼합했다. 반응 튜브 및 반응 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 2시간 동안 800rpm 및 15℃에서 진탕했다. 진탕 후, Molecular Imager® VersaDoc™ MP 4000 이미징 시스템(Bio-Rad)에서 SDS-PAGE 및 형광 이미징을 통한 분석을 위해 작은 분취물을 취했다(도 77).
Cy3-PAMAM-(SO1861)5-SS-디안틴-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-(SO1861)27-SS-디안틴-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-SS-디안틴-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-SS-디안틴-Alexa488 및 Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-디안틴-EGF-Alexa488의 합성은 위에서 설명한 방법을 통해 수행되었지만 사용된 PAMAM-사포닌-DBCO 배치, 사용된 아지도-독소 배치 및 이들의 공급 당량이 상이하였다. 출발 물질의 각 공급 당량은 표 21에 하이라이트 표시되어 있다.
Figure pct00074
환원성 아민화를 통한 Cy3-PAMAM-NC-S01861 합성
Cy3-PAMAM(0.19mg, 13nmol) 및 SO1861(0.73mg, 0.39μmol)을 pH 5의 200μL 0.1M 아세테이트 완충액에 별도로 용해시켰다. SO1861 및 Cy3-PAMAM 용액을 혼합하고 800rpm에서 20분 동안 진탕하고, ThermoMixer C(Eppendorf)의 실온. 20분 동안 진탕시킨 후, NaCNBH3(5 mg, 81 μmol)를 진탕 반응 용액에 첨가하고 반응 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800 rpm 및 실온에서 12시간 동안 진탕시켰다. 12시간 동안 진탕한 후, 반응 혼합물을 MilliQ 물로 희석하고 MWCO가 12-14kDa인 재생 셀룰로오스막 튜브(ZelluTrans, Carl Roth)를 사용하여 MilliQ 물에 대해 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후 Cy3-PAMAM-NC-SO1861 용액은 MWCO가 3kDa인 Amicon Ultra 15 필터를 통해 4,000rpm(15℃)에서 원심 여과를 사용하여 농축되었다. 접합체를 냉장고에 용액으로 보관하고 분석을 위해 분취물을 취했다. 수율: 미측정
MALDI-TOF-MS(도 78 B, C)(LP 모드): m/z 88.7 kDa([M+H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861), 49.2 kDa([M+H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861).
Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)30 및 Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)10의 합성은 위에서 설명한 방법을 통해 수행되었지만 환원제 NaCNBH3를 반응 배치에 첨가한 후 시간이 상이하였다. 각각의 NaCNBH3 첨가 시간 및 접합체의 각 질량은 표 22에 하이라이트 표시되어 있다.
Figure pct00075
폴리(S01861)합성
SO1861-EMCH(0.13 mg, 63 nmol)를 30 μL 탈기 MilliQ 물에 용해했다. 4 μL 탈기된 MilliQ 물에 용해된 APS(0.2 μg, 0.8 nmol)를 SO1861-EMCH 용액에 첨가하고 용액을 60℃에서 ThermoMixer C(Eppendorf)에 넣었다. 그런 다음, TMEDA(cat., 0.5μL)를 혼합물에 첨가하고 혼합물을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 60℃에서 2시간 동안 진탕했다. 2시간 후, 질량 분석을 통한 분석을 위해 소량의 분취물을 취했다.
MALDI-TOF-MS(도 80C)(LP 모드): m/z 18.2kDa([M+H]+, 폴리(SO1861)9), 16.0kDa([M+H]+, 폴리(SO1861)8), 14.2kDa([M+H]+, 폴리(SO1861)7), 12.2kDa([M+H]+, 폴리(SO1861)6), 10.2kDa([M+H]+, 폴리(SO1861)5), 8.2kDa([M+H]+, 폴리(SO1861)4), 6.2kDa([M+H]+, 폴리(SO1861)3).
SO1861-EMCH 펩티드 커플링
서열 SESDDAMFCDAMDESDSK를 갖는 맞춤형 펩티드(0.6mg, 0.3μmol) 및 SO1861-EMCH(0.8mg, 0.39μmol)를 200μL PBS에 각각 용해하였다. SO1861-EMCH 및 펩티드 용액을 혼합하고 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 12시간 동안 진탕했다. 진탕 후 분석을 위해 작은 분취물을 취하였다. 수율: 미측정
MALDI-TOF-MS(도 83B)(RN 모드): m/z 4.05kDa([M+H]-, 펩티드-SO1861), 3.92kDa([M+H]-, 펩티드-SO1730), 1.98kDa ([M+H]-, 펩티드), 1.86 kDa ([M+H]-, SO1861).
세포 생존능 분석
처리 후 제조업체의 지침(CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)에 따라 수행된 MTS-분석에 의해 세포 생존율을 측정하기 전에 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 간략히, MTS 용액은 10% FBS(PAN-Biotech GmbH)가 보충된 페놀 레드(PAN-Biotech GmbH)가 없는 DMEM에서 20x 희석되었다. 세포를 웰당 200μL PBS로 1회 세척한 후, 100μL 희석된 MTS 용액을 웰당 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 대략 20-30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, Thermo Scientific Multiskan FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific)에서 492 nm에서의 광학 밀도를 측정했다. 정량화를 위해, 처리되지 않은 웰의 백그라운드 보정된 신호를 처리된 웰의 백그라운드 보정된 신호로 나누어, 미처리/처리된 세포의 비율을 계산하기 전에, '단지 배지만 있는(medium only)' 웰의 백그라운드 신호를 다른 모든 웰에서 차감했다.
FACS 분석
HeLa 세포를 10cm 디쉬에 500,000 c/플레이트에서 10% 소 태아 혈청(PAN-Biotech GmbH) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(PAN-Biotech GmbH)이 보충된 DMEM(PAN-Biotech GmbH)에 접종하고, 90%의 컨플루언시에 도달할 때까지, 48시간 배양하였다(5% CO2, 37℃). 다음으로, 세포를 단일 세포로 트립신 처리하였다(TryplE Express, Gibco Thermo Scientific). 0.75 x 106 세포를 15mL 팔콘 튜브로 옮기고 원심분리했다(1,400rpm, 3분). 세포 펠렛을 잠긴 채로 상층액을 버렸다. 펠렛은 볼텍스 진탕기에서 팔콘 튜브를 부드럽게 두드려서 해리되었고, 세포는 4mL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 프리, 2% FBS)로 세척되었다. 세척 후 세포를 3mL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 프리, 2% FBS)에 재현탁하고, 3개의 둥근 바닥 FACS 튜브(1mL/튜브)에 균등하게 나누었다. 세포를 다시 원심분리하고, 200 μL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 프리, 2% FBS) 또는 195μL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 무함유, 2% FBS)에 5μL 항체를 함유하는 200 μL 항체 용액에 재현탁했다. APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl FC(#400122, Biolegend)를 아이소타입 대조군으로 사용하였고, APC 항-인간 EGFR(#352906, Biolegend)을 사용하여 EGFR 수용체를 염색하였다. , HER2: APC 항-인간 CD340(erbB2/ HER-2)(324408, Biolegend). CD71: APC 항-인간 CD71 #334108, Biolegend. 샘플을 튜브 롤러 믹서에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 프리, 2% FBS)로 3회 세척하고 PBS 중 2% PFA 용액을 사용하여 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 FACS 분석을 위해 250-350 μL 차가운 PBS에 재현탁했다. 샘플은 BD FACSCanto II 유세포 분석 시스템(BD Biosciences) 및 FlowJo 소프트웨어로 분석되었다.
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결과
SO1861 분자에 대한 접합 반응에 사용 가능한 화학기들 고려하여, 4개의 화학기들이 확인되었다. 도 62에 하이라이트 표시된 바와 같으, 당 잔기의 알코올과 디올, 트리테르페노이드 골격상의 알데히드기, 당 잔기 중 하나의 당 잔기상의 카르복실산(글루쿠론산), 트리테르페노이드 골격의 알켄기.
확인된 각 화학기의 장단점의 견지에서(표 24), 가역적 접합 반응에는 알데히드 및 알코올기가 가장 적합하고, 비가역적/안정적 접합 반응에는 알켄 및 카르복실산(글루쿠론산)이 가장 적합한 기이다. 그러나, SO1861의 분자 구조내 알데히드기가 알코올에 대한 가역적 접합 반응에 가장 적합하다. 왜냐하면 한편으로는, 화학 선택 반응을 허용하는 구조에 단 하나의 알데히드가 존재하기 때문이다. 다른 한편으로, 알데히드는 아민, 히드라지드 및 히드록실아민과 같은 다양한 화학기와 가역적 접합 반응을 수행하여 이민, 히드라존 및 옥심과 같은 산 절단 가능한 모이어티를 형성할 수 있기 때문이다. 이 인자는 원하는 가역적 접합 반응에 대한 화학기에 대한 선택의 자유를 가능하게 한다. 반면, 알코올은 아세탈과 케탈의 형성을 통한 가역적 접합 반응의 좋은 후보이지만 글리코시드 구조에 다량으로 존재하기 때문에 화학 선택성이 부족하다.
비가역적이고 안정적인 결합의 형성을 위해, 카르복시산은 펩티드 화학에 사용되는 일반적인 도구(예, 카르보디이미드 매개 아미드 형성을 통한 아민과의 반응)로 아미드 및 에스테르를 형성할 수 있기 때문에 가장 적합합니다.
Figure pct00077
따라서, 엔도솜 탈출 강화 사포닌(SO1861과 같은)의 개발을 위해, SO1861에 존재하는 가장 적합한 화학기를 사용하여 절단 불가능하고 절단 가능한 '접합 준비가 된(ready to conjugate)' 사포닌(도 63)을 생성할 수 있는 방법론이 확립되었다.
절단 불가능한 '접합 준비가 된' 사포닌을 생산하기 위해, SO1861의 카르복실기는 펩티드 커플링 화학에 사용되는 시약을 통해 활성화되어 활성 에스테르(예, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트, HATU)를 생성한다. 생성된 SO1861의 활성 에스테르는 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합 접합체를 형성할 수 있다(도 63A).
절단 가능한 '접합 준비가 된' 사포닌을 생산하기 위해, SO1861의 알데히드기가 EMCH(ε-말레이미도카프론산 히드라지드) 링커와 반응한다. EMCH의 히드라지드기는 SO1861의 알데히드와 산 절단 가능한 히드라존 결합을 형성한다. 동시에 EMCH 링커는 티올(설프히드릴기) 반응성인 말레이미드기를 제공하므로 티올에 접합될 수 있다(도 63B).
SO1861-EMCH의 말레이미드기는 pH 6.5-7.5 범위에서 수행될 때 티올들과 그리고 티올을 함유하는 중합체 구조와 빠르고 특정한 Michael 첨가 반응을 수행한다(도 63 B). 또한 SO1861과 EMCH 사이의 산에 민감한 히드라존 연결을 활용하여 산성 환경에서 스캐폴드로부터 사포닌 방출을 수행할 수 있다(도 64). 따라서 EMCH 링커는 pH 절단 전략과 중합체 구조에 대한 접합 전략의 필요성을 모두 충족한다.
중합체 구조에 접합하기 위한 이상적인 EMCH 스페이서 길이와 관련하여, 컴퓨터 시뮬레이션(PerkinElmer, ChemBio3D, Ver. 13.0.0.3015)은 SO1861-EMCH상의 말레이미드기가 분자 주변에 위치하므로, 티올 함유 중합체 구조에 접근할 수 있어야 함을 보여준다(도 65).
SO1861-EMCH를 합성하기 위해, SO1861상의 알데히드기를 EMCH로 전환할 수 있는 전략이 개발되었다(도 66A). SO1861-EMCH 접합체는 핵 자기 공명 분광법(재료 및 방법 섹션, 도 60B 참조) 및 도 66B 및 66C, 도 61A에 나타낸 바와 같이 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF-MS)을 통해 분리되고 성공적으로 특성화되었다.
히드라존 결합의 pH 의존적 가수분해를 테스트하기 위해, SO1861-EMCH는 pH 3의 HCl 용액에 용해되었고, MALDI-TOF-MS 스펙트럼은 두 개의 다른 시점에서 기록되었다(도 67). 도 67 A 및 67 B에서 볼 수 있듯이, SO1861-EMCH에 해당하는 m/z 2070 Da에서 피크의 명확한 감소 경향은 도 67 B에서 볼 수 있다. SO1861은 가수분해 중에 생성되기 때문에 m/z 1861 Da에서 피크의 증가가 기록되었으며, 이는 m/z 2070 Da에서 감소하는 경향을 동반하였다. 이러한 결과는 히드라존 결합이 가수분해에 반응하고 SO1861상에 부착되더라도 절단된다는 것을 보여준다.
SO1861-EMCH를 중합체 구조에 접합하기 위해, 중합체 구조의 접근 가능한 아민은 2-이미노티올란 시약의 도움으로 티올로 전환된다. 중합체 구조상에 생성된 유리 티올은 SO1861-EMCH의 말레이미드기에 티올-엔 Michael 유형을 추가하기 위한 친핵체로 작용한다(도 68). 이 개발된 방법론은 SO1861-EMCH를 사용 가능한 모든 중합체 구조에 접합하는 데 적합하며, 이는 접근 가능한 아민 그룹을 얻고, 또한 각각, 중합체 구조에 따라 접합된 SO1861 분자의 수를 제어할 수 있도록 한다.
중합체 구조에 대한 '접합 준비가 된 사포닌'의 접합에 대한 컨셉의 첫 번째 증거는 단백질의 아민인 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 획득되었다(폴리 아미노산 스캐폴드 예). 접합 후, 질량 분석은 m/z ~ 70, ~ 72 및 ~ 74 kDa에서 BSA-SO1861의 해당 피크를 얻었다(도 69A). m/z 66kDa으로 검출된 BSA 질량과 비교하여(도 69B), 얻어진 BSA-SO1861의 질량은 BSA 당 2, 3, 4개의 SO1861 분자로 구성된 BSA-SO1861 접합체들의 혼합물에 해당한다.
아민 함유 5세대(G5) 덴드리머 폴리(아미도아민)(공유 커플링된 적색 형광 염료(Cy3)이 있는 PAMAM)을 사용하여 중합체 구조에 대한 '접합 준비가 된 사포닌'의 접합에 대한 다음 컨셉 증명이 획득되었다. PAMAM-Cy3는 SO1861-EMCH 및 SO1861-HATU 모두에 대한 접합을 위한 중합체 구조로 활용되었으며, SO1861을 중합체 구조에 접합하기 위한 모델로 사용되었다(도 70).
Cy3-PAMAM의 모든 접근 가능한 아민기는 Cy3-PAMAM 아민 당 3배 과량의 2-이미노티올란을 사용한 다음 SO1861-EMCH와의 반응을 사용하여 티올로 전환되었다. SO1861-EMCH의 3가지 다른 공급 당량(5, 20 및 57)이 3개의 반응 배치에 사용되었다. 반응 후, MALDI-TOF-MS에서 기록된 Cy3-PAMAM-SO1861 접합체의 질량은 SO1861-EMCH 공급이 증가함에 따라 해당 질량의 증가를 보여준다(도 71). 세 가지 다른 공급물은 도 71 B-D에 나타낸 바와 같이 PAMAM 덴드리머 당 부착된 6, 13 및 51 SO1861 분자에 해당하는 Cy3-PAMAM-SO1861 접합체에 대해 얻어진 질량 m/z 38.4 kDa, m/z 53.9 kDa 및 m/z 133.8 kDa에 해당하였다.
다른 반응에서, SO1861-EMCH와의 반응 전에 특정 수의 PAMAM 아민만이 티올로 전환되었다. 여기에서는 2-이미노티올란(8 및 32)의 두 가지 다른 공급 당량과 SO1861-EMCH(5 및 30)의 두 가지 다른 공급 당량을 각각 사용했다. 반응 후, MALDI-TOF-MS에서 Cy3-PAMAM-SO1861 접합체의 각 스펙트럼은 도 72에 나타낸 바와 같이 m/z 37.7 kDa(SO1861-EMCH의 5 공급 당량) 및 m/z 87.0 kDa(SO1861의 30 공급 당량)에서 피크를 나타낸다. m/z 37.7 kDa 및 m/z 87.0 kDa에서 얻어진 질량은 5 및 30개의 SO1861 분자가 부착된 Cy3-PAMAM-SO1861 접합체에 해당하며, 이 방법으로 SO1861-EMCH의 거의 모든 공급물이 접합되었음을 입증한다.
pH로 절단 불가능한(non-pH-cleavable) 사포닌 접합체의 생성을 위해, SO1861의 카르복실산을 HATU로 활성화한 다음, Cy3-PAMAM의 아민과 반응시켜 Cy3-PAMAM과 SO1861 사이에 결합된 pH 안정 아미드를 형성하였다. 생성된 접합체 질량은 MALDI-TOF-MS를 통해 PAMAM 당 17.5개의 SO1861 분자가 부착된 Cy3-PAMAM-NC-SO1861(NC = 절단 불가능) 접합체에 해당하는 m/z 62.3kDa의 질량을 갖는 것으로 검출되었다(도 70B, 도 73).
다음으로, 사포닌 접합된 스캐폴드는 작용화된 스캐폴드를 얻기 위해 소위 스트레인-촉진(strain-promoted) 알킨-아지드 고리화 첨가(SPAAC, 클릭 화학)를 통해 표적화된 치료제(예, 표적화된 독소)에 대한 가능한 접합을 위한 연결 지점에 접합되었다. 이 반응을 위해, Cy3-PAMAM-SO1861(도 74C, D) 및 Cy3-PAMAM-NC-SO1861(도 74B)을 접합체 표면에 스트레인드(strained) 알킨을 생성하는 이종이작용성 NHS-PEG13-DBCO 링커에 접합시켰다(도 74A). 링커의 NHS(N 히드록시석신이미드) 모이어티는 스캐폴드와 링커 사이에 아미드 결합을 형성하는 PAMAM-사포닌 접합체의 나머지 아민과 반응하였다. 접합체에서 생성된 DBCO(디벤조시클로옥틴) 모이어티는 표적화된 치료제에 대해 상응하는 아지드와 함께 SPAAC를 수행할 수 있다.
디안틴-EGF는 모델 표적화된 독소로서 제공되었으며, 디안틴은 비표적화된 독소로서 제공되었다. 두 독소 모두 염료의 테트라플루오로페닐 에스테르(TFP) 유도체를 사용하여 Alexa Fluor™ 488로 표지되었다. 그런 다음, 염료 표지된 단백질을 이종이작용성 NHS-SS-PEG3-아지드 링커에 접합시켜 PAMAM-사포닌 접합체에 대한 SPAAC에 대한 상응하는 화학적 모이어티를 얻었다. Maldi-TOF-MS 측정은 디안틴-EGF 분자 당 1개의 Alexa Fluor™ 488 염료 및 9개의 NHS-SS-PEG3-아지드 분자가 부착되었음을 보여주었다(도 75, 도 76). 또한, Alexa Fluor™ 488 표지된 디안틴-EGF는 이황화 결합이 결여되어 비-독소-절단성 구조물을 생성하는 이종이작용성 NHS-PEG12-아지드 링커에 접합되었다.
Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO 및 Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO 접합체를 Alexa Fluor™ 488 표지된 아지도-독소와 반응시켜 스트레인-촉진 알킨-아지드 고리화 첨가를 수행했다. 반응 제제들 간의 접합은 겔 전기영동과 PAMAM 중합체에만 부착된 Cy3의 형광 신호와 겔 전기영동 후 폴리아크릴아미드 겔 상의 독소에만 부착된 Alexa Fluor™ 488의 형광 신호의 공-편재화(co-localization)을 통해 표시되었다(도 77).
PAMAM 덴드리머에 대한 대체 중합체 구조로서, 초점에 16개의 작용성 아미노 말단기 및 아지도기가 있는 G4-덴드론(PFd-G4-Azide-NH-BOC, Polymer Factory)이 SO1861에 대한 접합에 사용되었다(도 84). 덴드리머보다 덴드론을 사용하는 이점은 덴드론 구조가 나타내는 초점이다. 이 초점을 사용하면 직교 클릭 기능으로 사후 변형 없이 표적화된 독소에 직접 접합할 수 있다(도 85). 도 85에서 볼 수 있듯이, 덴드론은 PAMAM 덴드리머에 대해 기술한 것과 동일한 방법론을 거쳤다. 간단히 말해서, 부분 염료 표지 및 탈보호(도 86) 후, 덴드론의 아미노기는 티올화 시약 2-이미노티올란을 사용하여 티올로 전환된 후 SO1861-EMCH에 접합되었다. SO1861-EMCH에 대한 접합을 위해 SO1861-EMCH의 3가지 다른 공급 당량이 사용되었다. 덴드론-SO1861 접합체를 MALDI-TOF-MS를 통해 분석했다. 예상대로, 덴드론 분자당 1 및 2의 SO1861 분자의 접합체 종은 3 및 10의 낮은 SO1861-EMCH 공급 당량을 사용할 때 얻어졌다(도 87 B, C). 덴드론 분자당 22의 SO1861-EMCH 분자의 공급 당량을 사용할 때 덴드론당 최대 9의 SO1861 분자의 더 높은 덴드론-SO1861 접합체 종을 얻었다(도 87A). 추가 실험에서 사포닌 작용화된 덴드론은 작용화된 스캐폴드를 생성하기 위해 초점을 통해 표적화된 독소에 접합되고 생물학적으로 평가될 것이다.
앞선 실시예들은 측정된 양의 SO1861 분자 또는 기타 엔도솜 탈출 인핸서 분자를 중합체 구조에 접합하여 표적화된 독소와 같은 치료 물질의 세포질 전달을 강화할 수 있도록 하는 방법론이 개발되었음을 보여준다.
중합체 구조에 대한 SO1861의 다른 접합 방법론을 추가로 시험하기 위해, 환원성 아민화 경로가 사용되었다. 이를 위해 SO1861의 알데히드기 이민 결합을 형성하는 PAMAM 아민에 직접 접합되었다. 이민 결합 형성은 SO1861과 PAMAM 사이에 pH-안정적인 아민 결합을 형성하는 환원제 소듐 시아노보로하이드라이드의 첨가를 통한 환원 아민화 단계가 뒤따랐다(도 78A). EMCH 및 HATU 접근 방식과 유사하게, 이 방법론은 도 78B, C에 나타낸 바와 같이 중합체당 접합된 사포닌의 수를 제어할 수 있게 한다. 여기서 PAMAM-사포닌 접합체가 생성되어 PAMAM당 10개(도 78B) 및 30개(도 78C)의 SO1861 분자를 얻었다.
논의된 중합체 및 단백질 접근법 중 SO1861 스캐폴드 개발을 위한 또 다른 접근법은 폴리(SO1861) 접근법이다. 이 접근법의 아이디어는 SO1861을 방출하는 pH에 민감한 절단 가능한 결합과 함께 SO1861 분자로만 구성된 중합체를 생성하는 것이다. 또한 폴리(SO1861)는 독소 및 바이오중합체에 대한 접합 반응을 수행할 수 있어야 한다. 이 접근 방식의 주요 목표는 가능한 한 간단하고 비용 효율적으로 유지하는 것이다. 산 절단 가능한 SO1861의 생성을 위한 프로토콜이 이미 개발되었기 때문에(SO1861-EMCH 접근법), SO1861을 추가로 변형하거나 SO1861 분자상의 다른 접합 부위를 확인하지 않고 중합 개시제의 간단한 첨가를 통해 SO1861-EMCH를 중합하는 것이 가능하다. 과거에 여러 논문에서 말레이미드기의 이중 결합을 공격하여 말레이미드의 이중 결합을 따라 라디칼 중합을 개시하는 라디칼 개시제를 사용하여 말레이미드기응 중합하는 것에 대해 논의되었다(29-31). SO1861-EMCH는 이의 구조에서 말레이미드기를 나타내기 때문에 이 기는 라디칼 중합 반응에 대해 잠재적으로 탐구되어 산 절단 가능한 작용기를 갖는 폴리(SO1861)를 생성할 수 있다. 중합 반응이 합리적인 반응 시간을 갖는다면, 생성된 SO1861 중합체는 반응을 켄칭할 뿐만 아니라 독소 또는 바이오중합체 접합을 위한 작용기를 생성하는 라디칼 켄처로 켄칭될 수 있다. 이러한 반응 스킴은 도 79에 도시되어 있다. 여기에서 암모늄 퍼설페이트(APS) 및 테트라메틸에틸렌디아민(TMEDA)의 시스템은 라디칼 발생제로서 예시적인 방식으로 표시되고, 아미노프로판티올은 모델 라디칼 켄처로서 제공된다. 아미노프로판티올을 켄처 예시로 사용하면, 생성된 아민기는 클릭가능한 기로 특이적으로 추가로 변형되거나 폴리(SO1861)를 독소에 직접 접합하는 데 사용될 수 있습다.
자유 라디칼 중합에서 반응 조건은 중합체 특성과 반응 결과에 큰 영향을 미친다. 예를 들어, 온도, 단량체 농도 및 개시제 농도는 중합체를 형성하는 데 중요한 역할을 하며, 원하는 중합체 특성에 따라 미세 조정되어야 한다. 라디칼 중합은 일반적으로 50℃ 초과의 온도에서 수행되기 때문에, 첫 번째 반응은 60℃의 온도에서 수행된다. SO1861-EMCH 중합이 자발적으로 시작될 수 있는지 그리고 APS와 TMEDA가 중합도에 영향을 미치는지 알아보는 것은 흥미로웠다. 따라서, 동일한 SO1861-EMCH 농도를 사용하여 세 가지 반응이 수행되었지만 APS/TMEDA 조성이 상이하였다. 첫 번째 반응에서는 SO1861-EMCH만 3시간 동안 60℃까지 가열되었으며, 두 번째 반응에서는 SO1861-EMCH 및 APS가 포함되었으며, 세 번째 반응에서는 SO1861-EMCH, APS 및 TMEDA가 포함되었다. (이 실험의 경우 재료 및 방법 섹션 "폴리(SO1861) 합성"에 언급된 것과 동일한 양과 농도의 출발 물질이 사용되었다.) 배치는 도 80 A-C에 표시된 대로 MALDI-TOF-MS를 통해 분석되었다. 흥미롭게도 SO1861-EMCH는 60℃까지 가열될 때 자발적으로 2, 3, 4, 5, 및 6 SO1861 분자로 구성된 올리고머를 형성하기 시작하는 것으로 나타났다(도 80A). 동일한 온도에서 11-3 당량 APS를 추가하는 것은 이러한 경향에 영향을 미치지 않았다(도 80B). 그러나, APS/TMEDA의 개시제 시스템을 사용할 경우, 18.2kDa의 분자량을 갖는 최대 9의 SO1861 분자의 SO1861 올리고머를 검출할 수 있었다(도 80C). 또한, 올리고머에 대해 얻은 피크는 도 80A 및 80B의 피크와 비교하여 훨씬 더 크게 보였으며, 이는 이 반응에 대한 SO1861-EMCH의 더 높은 소비를 나타낸다.
반응 조건을 추가로 미세 조정하기 위해 2,2'-아조비스[2-메틸-N-(2-히드록시에틸)프로피온아미드] 및 아조비스이소부티로니트릴과 같은 아조 개시제와 같은 다른 개시제들이 시험될 뿐만 아니라, 제어된 라디칼 중합(원자-이동 라디칼-중합, 가역적 첨가-단편화 연쇄 이동 등)과 같은 다른 중합 기술들이 시험될 것이다. 더욱이, EMCH의 대체물로서 다른 히드라지드 링커가 말레이미드기보다 라디칼 중합에 더 적합한 작용기(예, 아크릴 또는 아크롤리올 잔기)를 얻는 것으로 간주될 수 있다.
SO1861 스캐폴드 개발을 위한 또 다른 접근 방식은 DNA 접근법이다. 이 접근법의 아이디어는 소위 DNA-오리가미(Kolb et al, 2004; Bird et al, 1988)의 컨셉을 활용하는 것이다. 사포닌을 접합하기 위한 중합체 또는 조립된 중합체 구조로서의 DNA-오리가미는 안정성, 확장성, 생성된 DNA-사포닌 스캐폴드의 최종 크기 및 모양의 정밀한 제어를 포함하는 여러 고유한 이점을 제공할 수 있다. 이러한 DNA 나노캐리어는 천연 DNA를 포함하여 구성되어 있기 때문에, 생체 적합성이 있고, 살아있는 세포에 독성을 나타내지 않으며, 내부 세포 구획에서 카르고(cargo)의 방출을 용이하게 할 수 있다. 이러한 구조의 다중결합성(multivalency)은 형광단 및 독소와 같은 다양한 페이로드에 대한 미세 조정 표적화 성능 및 고용량을 추가로 허용할 수 있다. 따라서, 이 접근법에서 DNA 가닥은 각각 3' 및 5' 말단에 화학적 작용기를 제공하고, 구조물의 최종 형태를 제어할 수 있도록 하는 서열의 특정 원하는 영역에서만 혼성화할 수 있는 것으로 확인된다. 예를 들어, 이미 개발된 SO1861-EMCH와 3' 및 5' DNA 가닥 중 하나에 있는 티올기 사이의 티올-엔 반응을 통해 사포닌을 커플링하기 위해 화학기를 사용해야 한다. 상보적인 DNA 가닥은 표적화된 독소에 커플링하는 데 사용할 수 있는 클릭 작용기를 제공할 수 있다. 콘셉은 도 81에 도시되어 있다.
사포닌에 결합 및 방출할 수 있고, 중합되어 큰 폴리(펩티드) 유사 구조를 형성할 수 있는 DNA 가닥 대신에 특정 펩티드 서열을 사용하여 유사한 접근 방식을 상상할 수 있다. 이 접근법에서, 길이가 SO1861-EMCH 분자의 계산된 크기에 맞는 길이를 갖고, 서열 중간에 시스테인 잔기를 제공하고, N-말단 및 C-말단 모두에 아민기를 얻는 펩티드 서열을 확인하고 구입하였다. 시스테인 잔기는 SO1861-EMCH의 말레이미드기와 시스테인 잔기의 티올기의 티올-엔 반응을 통해 SO1861-EMCH를 접합하는 데 사용할 수 있다. 2개의 아민기는 도 82에 나타낸 바와 같이 적절한 가교제를 사용하여 펩티드-SO1861 접합체를 중합하기 위해 이용될 수 있다.
접합 연구에 따르면 맞춤형 펩티드(서열: SESDDAMFCDAMDESDSK)에 대한 SO1861-EMCH의 접합이 성공적이었음을 보여주었다. MALDI-TOF-MS를 통해 서열 중간에 말레이미드 반응성 시스테인 및 SO1861-EMCH에 대한 접합을 함유하는 펩티드를 분석하였다(도 83). MALDI-TOF-MS 스펙트럼은 m/z 4053 Da에서 펩티드-SO1861 접합체에 대한 예상 피크와 SO1730의 해당 사포닌-EMCH의 펩티드-SO1861 접합체인 m/z 3821 Da에서 추가 피크를 보여준다. SO1861-EMCH가 약간 과량(1.3당량) 사용되었고, 반응 후 SO1861-EMCH 피크가 검출되지 않았기 때문에, 접합이 정량적이라고 가정할 수 있다. 펩티드-SO1861의 첫 번째 중합 반응을 시작하기 위해, 디석신이미딜 타르트레이트가 아민 반응성 가교제로 사용될 것이다.
SO1861의 엔도솜 탈출 증진 특성은 낮은 엔도솜 pH(< pH5)에서만 노출되기 때문에, 스캐폴드 또는 작용화된 스캐폴드는 엔도솜의 산성화를 방해하여 SO1861의 활성을 차단할 수 있는 화학기를 포함하지 않아야 한다.
G5 PAMAM(128개의 1차 아민 및 약 126개의 3차 아민) 및 G4-덴드론(16개의 1차 아민)의 중합체 구조를 함유하는 아민을 테스트하여 이들 분자가 SO1861의 엔도솜 탈출 증진 능력을 억제하는지 측정하였다. HeLa 세포에서 디안틴-EGF 및 다양한 SO1861 농도와 함께 PAMAM(네이티브 또는 티올화) 또는 덴드론(네이티브)의 공동 투여 실험을 수행했다. 엔도솜 산성화 억제를 위한 대조군으로 클로로퀸을 사용하였다.
HeLa 세포는 충분한 EGFR 세포 표면 수준을 보여준다(도 88A). '네이티브' PAMAM과 클로로퀸 모두 표적화된 독소의 SO1861 매개 엔도솜 탈출과 Hela 세포에서 후속 세포 사멸을 억제하는 것으로 관찰되었다(도 88 B). 500nM에서의 PAMAM은 엔도솜 산성화 억제제인 클로로퀸과 동일한 정도로 억제하지만, 667nM 덴드론은 전혀 효과가 없다. '네이티브' PAMAM의 억제 활성이 PAMAM의 아미노기의 가용성으로 인한 것인지 추가로 알아보기 위해 PAMAM의 1차 아미노기는 2-이미노티올란과의 반응을 통해 부분적으로 티올화되어(도 89), 결과적으로 128개 중 16개(도 89C), 65/128(도 89D) 및 108/128(도 89E)은 1차 아민을 차단하였다. 65개 및 108개 1차 아민의 티올화는 SO1861-매개 엔도솜 탈출의 억제를 극복하는 반면, 최대 16개 아민기의 티올화는 표적화된 독소의 SO1861-매개 엔도솜 탈출의 억제 효과를 여전히 나타내는 것으로 관찰된다(도 88C). PAMAM의 1차 아미노기는 또한 mPEG2k-NHS(도 90)와의 반응을 통해 부분적으로 PEG화되어(PEGylated), 결과적으로 128개 중 3개(도 90C), 8/128(도 90D) 및 18/128(도 90E)은 1차 아민을 차단하였다. PEG화에 의한 단 3개의 1차 아민 차단은 이미 SO1861 매개 엔도솜 탈출 억제를 역전시키기에 충분하다(도 89D). PEG화의 차폐 효과는 전환된 소수의 아민을 넘어 확장될 가능성이 높으며, 그 이유는 PEG화는 충분한 수준에 도달하면 전체 분자를 차단할 수 있는 수화층을 도입하는 것으로 알려져 있기 때문이다.
이러한 결과는 PAMAM과 같은 중합체 구조상에 특정 수의 유리 아미노기가 존재하면 엔도솜 산성화를 차단할 수 있으므로 SO1861 또는 다른 글리코시드의 엔도솜 탈출 활성을 억제할 수 있음을 보여준다. G4-덴드론에 대해 나타난 바와 같이 아미노기의 수가 적거나, 티올란 또는 PEG화와 같이 아미노기가 차폐된 경우, 억제 효과가 역전된다.
참고문헌
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SEQUENCE LISTING <110> Sapreme Technologies B.V. CHARITE- UNIVERSITATSMEDIZIN BERLIN <120> IMPROVED CELL-TARGETING BINDING MOLECULE <130> P6089255PCT <140> PCT/EP2019/084292 <141> 2019-12-09 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Antisense BNA (HSP27) oligo nucleic acid sequence <400> 1 ggcacagcca gtggcg 16 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> UBC primer forward sequence <400> 2 cagccgggat ttgggtcg 18 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> UBC primer reverse sequence <400> 3 cacgaagatc tgcattgtca agt 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> GUSB primer forward sequence <400> 4 tgcgtaggga caagaaccac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> GUSB primer reverse sequence <400> 5 gggaggggtc caaggatttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> IMMT primer forward sequence <400> 6 aacccacacc tgcactttca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> IMMT primer reverse sequence <400> 7 ttttcctgtt gtgcaaggcg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> EIF2S2 primer forward sequence <400> 8 ccacaagtcg tccgagtagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> EIF2S2 primer reverse sequence <400> 9 ggagatgttt gggctgacga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> HSP27 primer forward sequence <400> 10 gcagtccaac gagatcacca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> HSP27 primer reverse sequence <400> 11 taaggcttta cttggcggca 20 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Customized peptide <400> 12 Ser Glu Ser Asp Asp Ala Met Phe Cys Asp Ala Met Asp Glu Ser Asp 1 5 10 15 Ser Lys

Claims (48)

  1. 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프에 결합하기 위한 제1 결합 부위를 포함하는 제1 단백질성 분자로서, 제1 단백질성 분자는 적어도 하나의 링커 및/또는 올리고머성 또는 중합체 스캐폴드를 통해 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 결합되거나, 또는 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 직접 공유 결합된 적어도 하나의 사포닌과 함께 제공되는, 제1 단백질성 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 결합 부위가 항체, IgG, Vhh 도메인 또는 Vh 도메인, Fab, scFv, Fv, dAb, F(ab)2, Fcab 단편을 포함하거나 이로 구성되는 분자와 같은, 면역글로불린, 또는 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 도메인 및/또는 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 단편을 포함하거나 이로 구성되며, 그리고/또는 EGF 또는 사이토카인과 같은 세포 표면 분자에 결합하기 위한 적어도 하나의 리간드를 포함하거나 이로 구성되는, 제1 단백질성 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프는 제1 종양-세포 표면 분자의 종양-세포 특이적 제1 에피토프이고, 보다 바람직하게는 종양 세포 상에 특이적으로 존재하는 제1 종양-세포 표면 수용체의 종양-세포 특이적 제1 에피토프인, 제1 단백질성 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 사포닌은 트리테르페노이드(triterpenoid) 사포닌 및/또는 C-23 위치에 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인(12,13-dehydrooleanane)의 유형에 속하는 비스데스모시딕 트리테르펜(bisdesmosidic triterpene) 사포닌이고, 선택적으로 상기 사포닌의 C-3베타-OH 기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산(glucuronic acid) 작용기를 포함하는 것이며, 그리고/또는 집소필라(Gypsophila) 종 및/또는 사포나리아(Saponaria) 종 및/또는 아그로스템마(Agrostemma) 종 및/또는 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria)와 같은 퀼라자(Quillaja) 종으로부터 분리된 사포닌인, 제1 단백질성 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 사포닌은 표 A1 또는 스킴 I의 사포닌들, SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 퀼라자사포닌(Quillajasaponin), 사포늄 알붐(Saponinum album), QS-18, Quil-A, Gyp1, 글리코시드 A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, 또는 이들의 어느 입체 이성질체 및/또는 이들의 조합의 하나 이상과 같은, 단일 특이적 사포닌이거나, 또는 둘 이상의 상이한 사포닌들의 혼합물이며, 바람직하게 사포닌은 S01861 및/또는 GE1741 및/또는 SA1641 및/또는 QS-21 및/또는 퀼라산(quillaic acid) 아글리콘 코어, C-3베타-OH기에 Gal-(1
    Figure pct00078
    2)-[Xyl-(1
    Figure pct00079
    3)]-GlcA　카보하이드레이트 치환체 및 C-28-OH기에 Glc-(1
    Figure pct00080
    3)-Xyl-(1
    Figure pct00081
    4)-Rha-(1
    Figure pct00082
    2)-[Xyl-(1
    Figure pct00083
    3)-4-OAc-Qui-(1
    Figure pct00084
    4)]-Fuc　카보하이드레이트 치환체를 갖는 사포닌이며, 그리고/또는 3-O-베타-D-갈락토피라노실-(1
    Figure pct00085
    2)-[베타-D-자일로피라노실-(1
    Figure pct00086
    3)]-베타-D-글루쿠로피라노실 퀼라산 28-O-베타-D-글루코피라노실-(1
    Figure pct00087
    3)-베타-D-자일로피라노실-(1
    Figure pct00088
    4)-알파-L-람노피라노실-(1
    Figure pct00089
    2)-[베타-D-자일로피라노실-(1
    Figure pct00090
    3)-4OAc-베타-D-퀴노보피라노실-(1
    Figure pct00091
    4)]-베타-D-푸코피라노시드이며, 보다 바람직하게 사포닌은 SO1861 및/또는 QS-21인, 제1 단백질성 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 사포닌은 적어도 1.500달톤의 분자량을 가지며, C-23 위치에 알데히드기를 함유하는 올레아난-유형 트리테르펜을 포함하며, 그리고 선택적으로 제1 분지형 카보하이드레이트 측쇄가 선택적으로 글루쿠론산을 함유하는 C-3 위치에 제1 분지형 카보하이드레이트 측쇄와 함께, C-16 위치에 히드록실기를 포함하는 비스데스모시딕 사포닌이며, 여기서 사포닌은 제2 분지형 카보하이드레이트쇄가 바람직하게 적어도 4개의 카보하이드레이트 유닛을 포함하는 C-28 위치에 제2 분지형 카보하이드레이트 측쇄를 갖는 에스테르기를 함유하며, 선택적으로 2개의 아세틸 잔기와 같은 적어도 하나의 아세틸 잔기를 함유하며, 그리고/또는 선택적으로 데옥시 카보하이드레이트를 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 퀴노보스(quinovose)를 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 글루코오스를 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 4-메톡시신남산을 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노산을 포함하며, 그리고/또는 선택적으로 에스테르 결합을 통해 카보하이드레이트에 결합된 5-O-[5-O-Rha-(1
    Figure pct00092
    2)-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노산을 포함하거나, 또는 여기서 적어도 하나의 사포닌은 QS-21이거나, 또는 QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS-18, QS1861, 양성화된(protonated) QS1861(QS1862), Quil-A 중 어느 하나 이상인, 제1 단백질성 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 사포닌은 위치 C-23에서 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스스모시딕 트리테르펜 사포닌이고, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 사포닌내의 알데히드 작용기를 통해, 바람직하게 위치 C-23에서 상기 알데히드 작용기를 통해, 바람직하게 적어도 하나의 링커를 통해, 보다 바람직하게 적어도 하나의 절단 가능한 링커를 통해 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 커플링되며, 여기서 아미노산 잔기는 바람직하게 시스테인 및 리신으로부터 선택되는, 제1 단백질성 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 사포닌은 C-23 위치에서 알데히드 작용기를 갖는 12,13-디하이드로올레아네인의 유형에 속하는 비스데스스모시딕 트리테르펜 사포닌이고, 상기 사포닌의 C-3베타-OH기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산(glucuronic acid) 작용기를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 사포닌은 상기 사포닌의 C-3베타-OH기에서 카보하이드레이트 치환체에 글루쿠론산 작용기를 통해 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에, 바람직하게 적어도 하나의 링커를 통해, 공유 커플링되며, 여기서 아미노산 잔기는 바람직하게 시스테인 및 리신으로부터 선택되는, 제1 단백질성 분자.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 사포닌의 위치 C-23에서의 알데히드 작용기는 링커 N-ε-말레이미도카프론산 히드라지드에 공유 커플링되고, 여기서 링커는 시스테인의 설프히드릴기와 같은 제1 단백질성 분자내의 설프히드릴기에 티오-에테르 결합을 통해 공유 커플링되는, 제1 단백질성 분자.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 사포닌의 C-3베타-OH기에서 카보하이드레이트 치환체내의 글루쿠론산 작용기는 링커 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트에 공유 커플링되며, 여기서 링커는 리신의 아민기 또는 제1 단백질성 분자의 N-말단과 같은 제1 단백질성 분자내의 아민기에 아미드 결합을 통해 공유 커플링되는, 제1 단백질성 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위가 결합하는 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프는 바람직하게는 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린, 신데칸-1, 혈관 인테그린 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, PSMA, CanAg, 인테그린 알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2로부터 선택된, 보다 바람직하게는 CD71, EGFR, HER2로부터 선택된 종양-세포 특이적 수용체의 종양-세포 특이적 제1 에피토프인, 제1 단백질성 분자.
  12. 제3항 또는 제11항에 있어서,
    종양 세포-특이적 제1 에피토프, 제1 종양-세포 표면 분자 또는 제1 종양-세포 특이적 수용체는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자를 제1 에피토프 또는 제1 분자 또는 제1 수용체에 결합한 후에 종양 세포에 의해 내재화되는 제1 에피토프 또는 제1 분자 또는 제1 수용체이며, 그리고 여기서 바람직하게, 제1 단백질성 분자는, 제1 에피토프, 종양-세포 표면 분자 또는 종양-세포 특이적 수용체를 포함하는 세포 표면 분자에 결합되는 경우에, 예를 들어, 엔도사이토시스, 또는 종양-세포 표면 분자 매개된 내재화를 통해, 예를 들어 엔도사이토시스를 통해 종양-세포 수용체-매개 내재화를 받는, 제1 단백질성 분자.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 세툭시맙(cetuximab), 다라투무맙(daratumumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 이노투주맙(inotuzumab), 목세투모맙(moxetumomab), 폴라투주맙(polatuzumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), IgG 유형의 OKT-9 항-CD71 모노클로날 항체, 페르투주맙(pertuzumab), 리툭시맙(rituximab), 오파투무맙(ofatumumab), 헤르셉틴(Herceptin), 알렘투주맙(alemtuzumab), 피나투주맙(pinatuzumab), OKT-10 항-CD38 모노클로날 항체, 표 A2 또는 표 A3 또는 표 A4의 항체 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되며, 바람직하게 세툭시맙(cetuximab) 또는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 OKT-9, 또는 이의 적어도 하나의 종양-세포 수용체 결합-단편 및/또는 이의 적어도 하나의 종양-세포 수용체 결합-도메인, 바람직하게 이의 적어도 하나의 종양-세포 특이적 수용체 결합-단편 및/또는 이의 적어도 하나의 종양-세포 특이적 수용체 결합-도메인 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되는, 제1 단백질성 분자.
  14. 치료 조합물(therapeutic combination)로서,
    (a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제1 약학 조성물; 및
    (b) 제1 단백질성 분자와 상이한 제2 단백질성 분자를 포함하는 제2 약학 조성물로서, 제2 단백질성 분자는 제1 세포 표면 분자와 상이한 제2 세포 표면 분자의 제2 에피토프에 결합하는 제2 결합 부위를 포함하고, 이펙터 모이어티를 포함하고, 제2 약학 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하며, 여기서 제2 에피토프는 제1 에피토프와 상이한, 제2 약학 조성물
    을 포함하는, 치료 조합물.
  15. 제14항에 있어서,
    치료 조합물은,
    (a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자를 포함하는 제14항의 제1 약학 조성물로서, 여기서 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프는 제1 종양 세포-특이적 표면 분자 상의 종양 세포 특이적 제1 에피토프, 바람직하게는 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제1 세포-표면 수용체 상의 종양 특이적 제1 에피토프인, 제1 약학 조성물; 및
    (b) 제14항의 제2 약학 조성물로서, 여기서 제2 세포 표면 분자는 제1 종양 세포-특이적 표면 분자와 상이한 제2 종양 세포-특이적 표면 분자이고, 바람직하게는 상기 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제1 세포 표면 수용체와 상이한 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제2 세포-표면 수용체이고, 그리고 여기서 제2 에피토프는 종양-세포 특이적 제2 에피토프인, 제2 약학적 조성물
    을 포함하는, 치료 조합물.
  16. 치료 조합물로서,
    (a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 제1 단백질성 분자를 포함하고, 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위를 포함하는 제14항 또는 제15항의 제1 약학 조성물로서, 제1 약학 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 제1 약학 조성물; 및
    (b) 제3 단백질성 분자를 포함하는 제3 약학 조성물로서, 제3 단백질성 분자는 (a)의 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위 및 이펙터 모이어티를 포함하고, 제3 약학 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 제3 약학 조성물
    을 포함하며, 여기서 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위 및 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 동일하고, 그리고 여기서 제1 단백질성 분자가 결합할 수 있는, 제1 세포 표면 분자 및 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프와 제3 단백질성 분자가 결합할 수 있는, 제1 세포 표면 분자 및 제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프는 동일한, 치료 조합물.
  17. 치료 조합물로서,
    (a) 제16항의 제1 약학 조성물; 및
    (b) 제16항의 제3 약학 조성물
    을 포함하며, 여기서 제1 세포 표면 분자는 종양 세포 표면 상에서 발현되고, 바람직하게는 제1 세포 표면 분자는 종양 세포-특이적 표면 분자이며, 그리고 여기서 바람직하게 제1 에피토프는 제1 종양-세포 특이적 에피토프인, 치료 조합물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자에 있어서, 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 치료 조합물에 있어서,
    제1 세포 표면 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 부위는 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제1 세포 표면 수용체 상의 종양-세포 특이적 제1 에피토프에 대한 결합 부위인, 제1 단백질성 분자 또는 치료 조합물.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위 및/또는 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 항체, IgG, Vhh 도메인 또는 Vh 도메인, Fab, scFv, Fv, dAb, F(ab)2, Fcab 단편을 포함하거나 이로 구성되는 분자와 같은, 면역글로불린, 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 도메인 및/또는 면역글로불린의 적어도 하나의 결합 단편을 포함하거나 이로 구성되며, 그리고/또는 EGF 또는 사이토카인과 같은 세포 표면 분자에 결합하기 위한 적어도 하나의 리간드를 포함하거나 이로 구성되는, 치료 조합물.
  20. 제14항, 제15항 또는 제18항, 또는 제14항 또는 제15항 또는 제18항 중 어느 한 항에 종속하는 경우 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 에피토프에 결합하는 제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위는 종양 세포에 특이적으로 존재하는 제2 세포 표면 수용체 상의 종양-세포 특이적 제2 에피토프에 대한 제2 결합 부위이고, 여기서 제2 결합 부위는 제1 결합 부위와 상이한, 치료 조합물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자, 또는 제14항, 제15항 또는 제18항, 제19항, 또는 제14항 또는 제15항 또는 제18항 또는 제19항 중 어느 한 항에 종속되는 경우 제20항 중 어느 한 항의 치료 조합물에 있어서,
    상기 제1 및 제2 단백질성 분자는 각각 제1 및 제2 종양 세포 특이적 수용체상의 제1 및 제2 종양-세포 특이적 에피토프에 결합하기 위한 제1 및 제2 결합 부위를 각각 포함하며, 상기 수용체는 상이하며, 동일한 종양 세포에 존재하며, 여기서 제1 및 제2 결합 부위는 상이하며, 제1 및 제2 종양 세포 특이적 에피토프는 상이한, 제1 단백질성 분자 또는 치료 조합물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자, 또는 제16항, 제17항 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 종속하는 경우 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 치료 조합물에 있어서,
    상기 제1 및 제3 단백질성 분자는 제1 종양-세포 특이적 수용체 상의 제1 종양-세포 특이적 에피토프에 결합하기 위한 동일한 제1 결합 부위를 포함하는, 제1 단백질성 분자 또는 치료 조합물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    제1 수용체 및/또는 제2 수용체가 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린, 신데칸-1, 혈관 인테그린 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, PSMA, CanAg, 인테그린 알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2로부터 선택되는, 바람직하게는 CD71, EGFR 및 HER2로부터 선택되는, 제1 단백질성 분자 또는 치료 조합물.
  24. 제21항 또는 제23항의 제1 단백질성 분자 및/또는 제21항 또는 제23항의 치료 조합물에 있어서,
    제1 및 제2 종양-세포 특이적 수용체는 제1항 내지 제21항 또는 제23항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자 및/또는 제14항, 제15항 또는 제18항 내지 제21항, 또는 제14항 또는 제15항 또는 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 종속하는 경우 제23항 중 어느 한 항의 제2 단백질성 분자에 결합 후 종양 세포에 의해 내재화되며, 그리고 여기서 바람직하게 제1 단백질성 분자 및/또는 제2 단백질성 분자가 제1 및 제2 종양-세포 특이적 수용체에 각각 결합하는 것은 예를 들어, 제1 단백질성 분자 및 제1 종양-세포 특이적 수용체의 복합체 및 제2 단백질성 분자 및 제2 종양-세포 특이적 수용체의 복합체의 엔도사이토시스를 통해 종양-세포 수용체-매개된 내재화를 야기하는, 제1 단백질성 분자 및/또는 치료 조합물.
  25. 제22항 또는 제23항의 치료 조합물에 있어서, 또는 제22항 또는 제23항의 제1 약학 조성물에 있어서,
    제1 종양-세포 수용체, 바람직하게 제1 종양-세포 특이적 수용체는 제1항 내지 제20항, 제22항 또는 제23항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자에 결합 후 및/또는 제16항, 제17항 또는 제18항 내지 제20항, 또는 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 종속하는 경우 제22항 중 어느 한 항의 제3 단백질성 분자에 결합 후, 종양 세포에 의해 내재화되며, 그리고 여기서 바람직하게 제1 종양-세포 특이적 수용체와 같은 제1 종양-세포 수용체에 대한 제1 단백질성 분자 및/또는 제3 단백질성 분자의 결합에 이어서 예를 들어, 제1 단백질성 분자 및 제1 종양-세포 수용체의 복합체 및 제3 단백질성 분자 및 제1 종양-세포 수용체의 복합체의 엔도사이토시스를 통해 종양-세포 수용체-매개 내재화가 후속되는, 치료 조합물 또는 제1 약학 조성물.
  26. 제1항 내지 제15항 또는 제18항 내지 제21항 또는 제1항 내지 제15항 또는 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 종속하는 경우 제24항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자, 및/또는 제14항, 제15항, 제18항 내지 제21항 또는 제24항 중 어느 한 항의 치료 조합물에 있어서,
    제1 결합 부위 및/또는 제2 결합 부위는 모노클로날 항체 또는 이의 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 단편 및/또는 -도메인이거나 이를 포함하며, 바람직하게는 세툭시맙(cetuximab), 다라투무맙(daratumumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 이노투주맙(inotuzumab), 목세투모맙(moxetumomab), 폴라투주맙(polatuzumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), IgG 유형의 OKT-9 항-CD71 모노클로날 항체, 페르투주맙(pertuzumab), 리툭시맙(rituximab), 오파투무맙(ofatumumab), 헤르셉틴(Herceptin), 알렘투주맙(alemtuzumab), 피나투주맙(pinatuzumab), OKT-10 항-CD38 모노클로날 항체, 및 표 A4의 항체, 바람직하게 세툭시맙(cetuximab) 또는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 OKT-9, 또는 이의 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 단편 또는 -도메인 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되며, 단, 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위와 상이한, 제1 단백질성 분자 및/또는 치료 조합물.
  27. 제16항, 제17항 또는 제18항 내지 제20항, 또는 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 종속하는 경우 제22항 중 어느 한 항의 치료 조합물 또는 제16항, 제17항 또는 제18항 내지 제20항, 또는 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 종속하는 경우 제22항 중 어느 한 항의 제1 약학 조성물에 있어서,
    제1 단백질성 분자 및 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 모노클로날 항체 또는 이의 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 도메인 및/또는 -단편을 포함하며, 바람직하게는 세툭시맙, 다라투무맙, 겜투주맙, 트라스투주맙, 파니투무맙, 브렌툭시맙, 이노투주맙, 목세투모맙, 폴라투주맙, 오비누투주맙, IgG 유형의 OKT-9 항-CD71 모노클로날 항체, 페르투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 헤르셉틴, 알렘투주맙), 피나투주맙, OKT-10 항-CD38 모노클로날 항체, 표 A2 또는 표 A3 또는 표 A4의 항체, 바람직하게 세툭시맙 또는 트라스투주맙 또는 OKT-9, 또는 이의 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 단편 및/또는 -도메인 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되며, 단, 제1 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위와 동일한, 치료 조합물 또는 제1 약학 조성물.
  28. 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 단백질성 분자의 제2 결합 부위 및/또는 제3 단백질성 분자의 제1 결합 부위는 모노클로날 항체 또는 이의 적어도 하나의 세포 표면 분자 결합 단편 또는 -도메인이거나 이를 포함하며, 바람직하게는 겜투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 트라스투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine), 이노투주맙 오조가마이신(Inotuzumb ozogamicin), 목세투모맙 파수도톡스(Moxetumomab pasudotox) 및 폴라투주맙 베도틴(Polatuzumab vedotin) 및 표 A2 및 표 A3의 항체-약물 접합체 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되는, 치료 조합물.
  29. 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 단백질성 분자 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되는 이펙터 모이어티는 올리고뉴클레오티드, 핵산, 제노 핵산 중 어느 하나 이상, 바람직하게는 벡터, 유전자, 세포 자살 유도 트랜스진, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), DNA 압타머, RNA 압타머, mRNA, 미니-서클 DNA, 펩티드 핵산(PNA), 포스포아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), 잠금(locked) 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노 핵산(FANA), 2'-0-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-O,4'-아미노에틸렌 가교 핵산, 3'-플루오로 헥시톨 핵산(FHNA), 플라스미드, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스(threose) 핵산(TNA), 또는 이의 유도체 중 적어도 하나로부터 선택된, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 제노 핵산 중 어느 하나 이상, 보다 바람직하게는 예를 들어 HSP27 단백질 발현을 침묵시키기 위한 BNA와 같은 BNA를 포함하거나 이로 구성되는, 치료 조합물.
  30. 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 단백질성 분자 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되는 이펙터 모이어티는 적어도 하나의 단백질성 분자, 바람직하게는 우레아제 및 Cre-리콤비네이즈, 리보솜-불활성화 단백질, 단백질성 독소와 같은 펩티드, 단백질, 효소 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질성 분자, 보다 바람직하게 표 A5로부터 선택된 단백질 독소 및/또는 아폽틴(apoptin)과 같은 바이러스 독소; 쉬가 독소(Shiga toxin), 쉬가-유사 독소, 슈도모나스 에어루지노사 외독소(Pseudomonas aeruginosa exxtoxin, PE) 또는 PE의 외독소 A, 전장 또는 절단된 디프테리아 독소(DT), 콜레라 독소와 같은 박테리아 독소; 알파-사신(alpha-sarcin)과 같은 균류 독소; 예를 들어, 디안틴-30 또는 디안틴-32와 같은 디안틴, 예를 들어, 사포린-S3 또는 사포린-S6와 같은 사포린, 보우가닌(bouganin) 또는 보우가닌의 면역제거된 유도체 디보우가닌, 쉬가-유사 독소 A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 리신(ricin), 리신 A쇄, 모데신(modeccin), 모데신 A쇄, 아브린(abrin), 아브린 A쇄, 볼켄신(volkensin) A쇄, 비스커민(viscumin) A쇄와 같은 리보솜-불활성화 단백질 및 유형 2 리보솜-불활성화 단백질의 A쇄를 포함하는 식물 독소; 또는 프로그 RNase, 또는 인간의 그란자임 B 또는 안지오게닌, 또는 이의 어느 단편 또는 유도체와 같은 동물 또는 인간 독소로부터 선택된 단백질 독소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질성 분자를 포함하거나 이로 구성되며; 바람직하게 단백질 독소는 디안틴 및/또는 사포린인, 치료 조합물.
  31. 제14항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 단백질성 분자 및/또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함된 이펙터 모이어티는 적어도 하나의 페이로드(payload), 바람직하게는 리보솜을 표적하는 독소, 신장 인자(elongation factors)를 표적하는 독소, 튜뷸린을 표적하는 독소, DNA를 표적하는 독소 및 RNA를 표적하는 독소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된, 적어도 하나의 페이로드, 보다 바람직하게는 엠탄신, 슈도톡스, 메이탄시노이드 유도체 DM1, 메이탄시노이드 유도체 DM4, 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE, 베도틴), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF, 마포도틴), 칼리케마이신, N-아세틸-γ-칼리케마이신, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 벤조디아제핀, CC-1065 유사체, 두오카마이신, 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 에토포시드, 도세탁셀, 5-플루오로우라실(5-FU), 미톡산트론, 튜뷸리신, 인돌리노벤조디아제핀, AZ13599185, 크립토피신, 리족신, 메토트렉세이트, 안트라사이클린, 캄프토테신 유사체, SN-38, DX-8951f, 엑사테칸 메실레이트, 절단된 형태의 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소(PE38), 듀오카마이신 유도체, 아만틴, α-아만틴, 스플라이스오스타틴(spliceostatin), 테일란스타틴(thailanstatin), 오조가마이신, 테시린, Amberstatin269 및 소라브탄신, 또는 이의 유도체 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 페이로드를 포함하거나 이로 구성되는, 치료 조합물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 단백질성 분자는 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기, 바람직하게는 시스테인 및/또는 리신에 직접 공유 결합된, 및/또는 적어도 하나의 링커를 통해 공유 결합된 및/또는 적어도 하나의 절단 가능한(cleavable) 링커를 통해 및/또는 적어도 하나의 중합체 또는 올리고머 스캐폴드, 바람직하게 1-8개의 이러한 스캐폴드 또는 2-4개의 이러한 스캐폴드를 통해 공유 결합된, 하나 이상의 사포닌, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 또는 1-100개의 사포닌을 포함하거나, 또는 7, 9, 12개의 사포닌과 같이 이들 사이에 있는 임의의 수의 사포닌을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 스캐폴드는 선택적으로 덴드론에 기초하며, 여기서 1-32개의 사포닌, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32개의 사포닌, 또는 7, 9, 12개의 사포닌과 같이 이들 사이에 있는 임의의 수의 사포닌이 적어도 하나의 스캐폴드에 공유 결합된, 제1 단백질성 분자.
  33. 제7항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 링커는 절단 불가능한 링커 또는 절단 가능한 링커이고, 여기서 절단 가능한 링커는 예를 들어 산성 조건, 환원성 조건, 효소 조건 또는 광-유도 조건 하에서 절단이 이루어지며, 바람직하게 절단 가능한 링커는 사포닌에 결합된 경우 산성 조건 하에서 절단이 이루어지는 히드라존 결합 또는 히드라지드 결합을 포함하며, 그리고/또는 예를 들어 카텝신(Cathepsin) B에 의한 단백질 분해와 같이 단백질 분해에 민감한 결합을 포함하며, 그리고/또는 사포닌에 결합된 경우 이황화 결합과 같이 환원성 조건 하에서 절단에 민감한 결합인, 제1 단백질성 분자.
  34. 제7항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    절단 가능한 링커는, 절단 가능한 링커가 사포닌에 결합될 경우, 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포의 엔도솜 및/또는 리소좀에 존재하는 하는 산성 조건 하에서, 바람직하게는 pH 4.0 내지 6.5, 보다 바람직하게는 pH ≤ 5.5에서의 산성 조건 하에서 생체내에서 절단이 이루어지는, 제1 단백질성 분자.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고머 또는 중합체 스캐폴드는 중합체 또는 올리고머 구조를 포함하고, 스캐폴드를 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 커플링하기 위한 화학기를 포함하는, 제1 단백질성 분자.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 사포닌은 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 절단 가능한 링커를 통해 올리고머 또는 중합체 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조에 공유 결합되는, 제1 단백질성 분자.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고머 또는 중합체 스캐폴드를 상기 제1 단백질성 분자의 아미노산 잔기에 공유 커플링하기 위한, 올리고머 또는 중합체 스캐폴드의 화학기는 클릭 화학기(click chemistry group)이며, 바람직하게는 테트라진, 아지드, 알켄 또는 알킨, 또는 이들 기의 시클릭 유도체로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 화학 기는 아지드인, 제1 단백질성 분자.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고머 또는 중합체 스캐폴드의 중합체 또는 올리고머 구조는 선형, 분지형 및/또는 시클릭 중합체, 올리고머, 덴드리머, 덴드론, 덴드론화 중합체, 덴드론화 올리고머, DNA, 폴리펩티드, 폴리-리신, 폴리-에틸렌 글리콜, 또는 이들 중합체 또는 올리고머 구조의 어셈블리를 포함하며, 이 어셈블리는 바람직하게는 공유 가교에 의해 형성되는, 제1 단백질성 분자.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자 및 제14항, 제15항 또는 제18항 내지 제38항 중 어느 한 항의 제2 단백질성 분자를 포함하는 조성물.
  40. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자 및 제16항 내지 제38항 중 어느 한 항의 제3 단백질성 분자를 포함하는 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서,
    제2 단백질성 분자에 의해 또는 제3 단백질성 분자에 의해 포함되는 이펙터 모이어티는 제29항에 따른 이펙터 모이어티 중 어느 하나, 바람직하게는 BNA인 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자 및 임의의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산, 바람직하게는 벡터, 유전자, 세포 자살 유도 트랜스진, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), DNA 압타머, RNA 압타머, mRNA, 미니-서클 DNA, 펩티드 핵산(PNA), 포스포아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), 잠금(locked) 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노 핵산(FANA), 2'-0-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-O,4'-아미노에틸렌 가교 핵산, 3'-플루오로 헥시톨 핵산(FHNA), 플라스미드, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스(threose) 핵산(TNA), 또는 이의 유도체 중 적어도 하나로부터 선택된, 임의의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 제노 핵산, 보다 바람직하게는 예를 들어 HSP27 단백질 발현을 침묵시키기 위한 BNA와 같은 BNA를 포함하는, 조성물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 제1 단백질성 분자 및 이펙터 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체.
  44. 제43항에 있어서,
    항체는 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린, 신데칸-1, 혈관 인테그린 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 폴레이트 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, PSMA, CanAg, 인테그린-알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, ephrinA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, 바람직하게는 CD71, HER2, EGFR 중 어느 하나에 결합할 수 있으며, 그리고/또는 여기서 항체는 세툭시맙, 다라투무맙, 겜투주맙, 트라스투주맙, 파니투무맙, 브렌툭시맙, 이노투주맙, 목세투모맙, 폴라투주맙, 오비누투주맙, IgG 유형의 OKT-9 항-CD71 모노클로날 항체, 페르투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 헤르셉틴, 알렘투주맙, 피나투주맙, OKT-10 항-CD38 모노클로날 항체, 표 A2 또는 표 A3 또는 표 A4의 항체, 바람직하게 세툭시맙 또는 트라스투주맙 또는 OKT-9, 또는 이의 적어도 하나의 종양-세포 수용체 결합-단편 및/또는 이의 적어도 하나의 종양-세포 수용체 결합-도메인이거나 이를 포함하며, 그리고/또는 여기서 항체-약물 접합체는 겜투주맙 오조가마이신, 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가마이신, 목세투모맙 파수도톡스 및 폴라투주맙 베도틴 및 표 A2 및 표 A3의 항체-약물 접합체 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 여기서 리간드-약물 접합체는 EGF 또는 사이토카인과 같은 세포 표면 분자에 결합하기 위한 적어도 하나의 리간드를 포함하는, 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서,
    이펙터 모이어티가 제29항 내지 제31항에 따른 이펙터 모이어티 중 어느 하나 이상인, 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체.
  46. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 리간드-약물 접합체를 포함하며, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  47. 의약으로서 사용하기 위한, 제14항 내지 제38항 중 어느 한 항의 치료 조합물 또는 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물 또는 청구항 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체 또는 제46항의 약학 조성물.
  48. 암 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제14항 내지 제38항 중 어느 한 항의 치료 조합물 또는 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체 또는 리간드-약물 접합체 또는 제46항의 약학 조성물.
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