KR20210055722A - 신규 항체 및 뉴클레오티드 서열 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

신규 항-CTLA-4 항체 분자 및 상기 항체 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 발현 벡터, 예컨대, 바이러스가 기재된다. 신규 항체 분자는 Treg 고갈 항체 분자이고, 그것은 이필리무맙에 비해서 CTLA-4 양성 세포, 예컨대, Treg에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는다. 또한 의약, 예컨대, 암, 예컨대, 고형 종양의 치료에서의 이러한 항체 분자 또는 뉴클레오티드 서열 또는 바이러스의 용도가 기재된다.

Description

신규 항체 및 뉴클레오티드 서열 및 이의 용도

본 발명은 암 요법에서의 사용을 위한 신규 항-CTLA-4 항체 분자, 이러한 항체 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 발현 벡터(예를 들어, 종양용해성 바이러스(oncolytic virus))에 관한 것이다. 이러한 신규 항체는 이필리무맙에 비해서 개선된 Treg 고갈을 갖는다.

CD152라고도 공지된 세포독성 T 림프구-연관 항원(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen: CTLA-4 또는 CTLA4)은 T 세포 활성화를 차단하는 B7/CD28 패밀리 구성원이다. CTLA-4는 활성화된 T 세포에서 발현되고, T 세포에 저해 신호를 전달한다. 이것은 T 세포 공-자극 단백질 CD28과 상동성이며, CTLA-4와 CD28 둘 다는 CD80(B7-1이라고도 언급됨) 및 CD86 (B7-2라고도 언급됨)에 결합한다. CTLA4는 또한 조절 T 세포(Treg)에서 발견되며, 저해 기능에 기여한다. CTLA-4 단백질은 세포외 V 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 포함한다.

CTLA-4와 이의 리간드 B7.1 및 B7.2의 상호작용을 차단하는 항체는 면역 반응을 향상시킬 수 있으며, 강력한 항-종양 면역을 자극할 수 있는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Korman et al 2006, Checkpoint blockade in cancer immunotherapy, Adv Immunol. 90:297-339]).

면역조절 단클론성 항체(mAb)에 대한 유망한 임상 결과는 면역계가 암을 제어하는 열쇠를 쥐고 있다는 믿음을 되살렸다. 이러한 mAb를 면역관문 차단제(길항제) 또는 공-자극 분자의 활성화제(효능제)로 분류하는 것은, 최근 두 유형의 예가 억제 조절 T 세포(Treg)의 고갈을 통해 종양과 싸울 수 있다는 발견으로 인해 의문을 제기했다.

이필리무맙 및 다른 항-CTLA4 항체와 같은 면역조절 mAb는 소수의 환자에서도 치료하기 어려운 악성종양에서 시험했을 때 긍정적인 결과를 나타냈다(문헌[Hodi, F. S., et al. 2010, N Engl J Med 363(8): 711-723]; 문헌[Beatty, G. L., et al. 2011, Science 331(6024): 1612-1616];, 문헌[Brahmer, J. R., et al. 2012, N Engl J Med 366(26): 2455-2465]; 문헌[Topalian, S. L., et al. 2012 N Engl J Med 366(26): 2443-2454]). 이러한 유망한 결과는 면역계가 암을 통제하는 열쇠를 쥐고 있을 수 있다는 믿음을 되살리는 데 도움이 되었다. 이러한 mAb는 T 세포 또는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell: APC)에 대한 주요 분자 조절인자를 표적으로하고, 저해 신호(면역관문 차단제)의 차단 또는 공-자극 신호(효능제)의 전달을 통해 항암 면역을 강화시키기 위해서 생성되었다. 최근에, 이러한 이진 분류는 T 세포를 모두 표적으로하는 항-CTLA4 항체, 항-GITR 항체 및 항-OX40 항체의 치료 활성이 활성 FcγR의 공동 참여에 의존하는 억제성 CD4+ T 조절 세포의 결실을 포함하는 것으로 밝혀졌을 때 문제가 되었다(문헌[Bulliard, Jolicoeur et al. 2013, Marabelle, A., et al. 2013, J Clin Invest 123(6): 2447-2463]; 문헌[Simpson, T. R., et al. J Exp Med 210(9): 1695-1710]).

단클론성 CTLA-4 항체, 이필리무맙(YERVOY®; 이전에10D1, BMS-734016, MDX 101, MDX-010, MDX-CTLA-4 및 MDX-CTLA4라고 지칭됨)이 여러 국가에서 흑색종 및 다른 적응증에 대한 임상 시험을 진행 중이다(문헌[Weber 2008, Overcoming immunologic tolerance to melanoma: targeting CTLA-4 with ipilimumab (MDX-010) Oncologist, 13 (Suppl 4):16-25]). 이필리무맙은 재조합 DNA 기술에 의해 중국 햄스터 난소 세포에서 생산되는 완전 인간 항-CTLA-4 단클론성 항체(IgG1κ)이다. 그것은 CAS Registry Number 477202-00-9 및 FDA UNII 6T8C155666을 갖는다. 이필리무맙은 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄의 서열(각각 서열번호 17 및 18), VH 및/또는 VL 영역의 서열(각각 서열번호 19 및 서열번호 20) 및 CDR 서열(서열번호 21, 22 및 23에 정의된 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열번호 24, 25 및 26에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3)을 또한 설정하는 미국 특허 제9 789 182에서 추가로 정의된다.

여러 임상 시험에서 시험된 두 번째 완전 인간 단클론성 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙(이전에 티실리무맙, CP-675,206)이다(문헌[Ribas 2008, Overcoming immunologic tolerance to melanoma: targeting CTLA-4 with tremelimumab (CP-675,206) Oncologist, 13 (Suppl 4):10-5]; 문헌[Callahan et al 2010, Anti-CTLA-4 Antibody Therapy: Immune Monitoring During Clinical Development of a Novel Immunotherapy. Semin Oncol. 37(5): 473-484.]; 문헌[Blank et al 2015, Therapeutic use of anti-CTLA-4 antibodies.. International Immunology, 27(1): 3-10]).

항-CTLA-4 항체는 하기를 비롯한 몇몇 특허 출원 및 특허에 기재되어 있다.

국제 특허 제WO 93/00431호는 CTLA4 수용체 단백질, CTLA4Ig 융합 단백질 및 이러한 융합 단백질 또는 단클론성 항체를 사용한 세포 상호작용의 조절 방법에 관한 것이다.

국제 특허 제WO 97/20574호는 CTLA-4 신호전달과 연관된 T 림프구 하향조절의 차단 및 항원 자극에 대한 포유동물 T 세포의 반응을 증가시키거나 포유동물 숙주에서 종양 세포의 성장을 감소시키는 CTLA-4의 세포외 도메인에 대한 항체 이외의 CTLA-4 차단제에 관한 것이다.

국제 특허 제WO 00/37504호는 인간 항-CTLA-4 항체 및 암의 치료에서의 이러한 항체의 용도에 관한 것이다. 국제 특허 제WO 00/37504호는 추가로 이 특허 출원에서 11.2.1이라고 지칭되는, 상기에 언급된 인간 단클론성 항체 트레멜리무맙에 관한 것이다.

국제 특허 제WO 01/14424호는 또한 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 인간 항체 및 인간 질환 및 감염, 예컨대, 암의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다. 국제 특허 제WO 01/14424호는 추가로 이 특허 출원에서 10D1이라고 지칭되는, 상기에 언급되고 하기에 추가로 논의되는 인간 단클론성 항체 이필리무맙에 관한 것이다.

본 발명은 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, 이필리무맙에 비해서 CTLA-4 양성 세포에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는 항체 분자에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 분자에 관한 것이며, 이 항체 분자는 서열번호 15, 16, 17, 10, 18 및 19를 갖는 6개의 CDR 또는 서열번호 22, 23, 24, 10, 25 및 26을 갖는 6개의 CDR을 포함한다.

추가로, 본 발명은 상기 항체 분자를 암호화하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열 또는 상기 플라스미드를 포함하는, 바이러스, 예컨대, 종양용해성 바이러스에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열 또는 상기 플라스미드를 포함하는, 세포, 예컨대, CAR T-세포에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드 및/또는 세포에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스 및/또는 세포에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스 및/또는 세포의 용도에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스 및/또는 세포 중 적어도 하나, 및 선택적으로 약제학적으로-허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 상기 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스, 세포 및/또는 약제학적 조성물 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 상세한 설명, 실시예 및/또는 도면을 참고하여 본 명세서에 기재된 바와 같은, 항체 분자, 사용하기 위한 항체 분자, 단리된 뉴클레오티드 서열, 사용하기 위한 단리된 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 사용하기 위한 플라스미드, 바이러스, 사용하기 위한 바이러스, 세포, 사용하기 위한 세포, 용도, 약제학적 조성물 또는 치료 방법에 관한 것이다.

CTLA-4 양성 세포는 정상 및 병리학적 면역 환경에서 기타 면역 세포를 억제할 수 있는 T 세포의 소집단인, 조절 T 세포, Treg 세포, Treg 또는 T_reg(이전에는 억제자 T 세포, 종종 또한 억제 조절 T 세포로도 공지됨)를 포함한다. Treg는 CD4 양성 세포(CD4+ 세포)이다. Treg가 아닌 다른 CD4+ T 세포가 존재하지만; Treg는, Treg가 또한 FOXP3 양성(FOXP3+)인 반면, 비-Treg CD4+ 세포가 FOXP3 음성(FOXP3-)이라는 점에서, 비-Treg CD4+ 세포로부터 분리될 수 있다.

이필리무맙과 같이, 본 명세서에 기재된 항-CTLA-4 항체 분자는 고갈 CTLA-4 양성 세포, 예컨대, Treg에 의해서 적어도 부분적으로 작용한다. 추가로, 이필리무맙과 같이, 본 명세서에 기재된 항-CTLA-4 항체 분자는 B7.1 및 B7.2와 CTLA-4 상호작용을 차단한다. 따라서, 이들 항체는 결과적으로 효과기 T 세포 증식에 대한 CTLA-4 유도된 억제 효과를 극복하는 것을 도울 수 있다.

세포의 고갈에, 본원에서는 세포의 물리적 클리어런스(clearance)를 통한 Treg의 고갈, 결실 또는 제거가 언급된다. 특히, 본 발명자들은 종양내 Treg의 고갈을 지칭한다. Treg의 고갈은 ADCC, 즉, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 또는 항체-의존적 세포 세포독성 및/또는 ADCP, 즉, 항체 의존적 세포 식세포작용을 통해서 달성될 수 있다. 이것은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 분자가 대상체, 예컨대, 인간에게 투여될 때, 그것이 Treg의 표면 상에서 발현되는 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, 이러한 결합이 Treg의 고갈을 초래한다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, CTLA-4는 종양 미세환경에서 또는 종양 세포 상의 종양 침윤 림프구 상에서 우선적으로 발현된다.

ADCC는 Fc 수용체-보유 효과기 세포가 종양 유래 항원, 즉 본 출원의 경우 표면 상에서 CTLA-4를 발현하는 항체 코팅 표적 세포를 인식하고, 이를 사멸시킬 수 있는 면역 기전이다. ADCP는 유사한 기전이지만, 세포독성 대신 식세포작용을 통해 표적 세포가 사멸된다.

항체는 면역학 및 분자 생물학 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 항체는 2 개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 본 명세서에서, 때때로 이 완전한 항체 분자를 전체-크기(full-size) 또는 전장 항체로서 지칭한다. 항체의 중쇄는 1개의 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)를 포함하고, 항체의 분자 경쇄는 1개의 가변 도메인(VL) 및 1개의 불변 도메인(CL)을 포함한다. 가변 도메인(때때로 집합적으로 F_V 영역으로서 지칭됨)은 항체의 표적, 또는 항원에 결합한다. 각 가변 도메인은 표적 결합을 담당하는 상보적 결정 영역(CDR)으로서 지칭되는 3개의 루프를 포함한다. 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관여하지 않으나, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 항체 또는 면역글로불린은 이들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류로 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5가지의 주요 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 존재하고, 인간에서 이들 중 몇 가지는 하부부류로 추가로 나뉜다(이소타입): 예, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4; IgA1 및 IgA2. 항체의 또 다른 부분은 Fc 도메인(달리, 단편 결정화 도메인으로서 공지됨)으로, 이는 항체의 각 중쇄의 2개의 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인은 항체와 Fc 수용체 사이의 상호작용을 담당한다.

Fc 수용체는 면역계의 세포의 세포 표면 상에서 종종 발견되는 막 단백질이다(즉, Fc 수용체는 표적 세포 막에서 발견되고 - 달리는 원형질막 또는 세포질막이라고 공지됨). Fc 수용체의 역할은 Fc 도메인을 통해서 항체에 결합하고, 항체를 세포에 내재화시키는 것이다. 면역계에서, 이것은 항체-매개된 식세포작용 및 항체-의존적 세포-매개된 세포독성을 초래할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 항체 분자는 전장 또는 전체-크기 항체뿐 아니라 전장 항체의 작용적 단편 및 이러한 항체 분자의 유도체를 포함한다.

전체-크기 항체의 작용적 단편은 상응하는 전체-크기 항체와 동일한 항원 결합 특징을 갖고, 동일한 가변 도메인(즉, VH 및 VL 서열) 및/또는 상응하는 전체-크기 항체와 동일한 CDR 서열을 포함한다. 작용적 단편은 상응하는 전체-크기 항체와 동일한 항원 결합 특징을 갖는다는 것은 이것이 전체-크기 항체와 동일한 표적 상의 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다. 이러한 작용적 단편은 전체-크기 항체의 Fv 부분에 상응할 수 있다. 대안적으로, 이러한 단편은 Fc 부분을 함유하지 않는 1가 항원-결합 단편인, F(ab)로도 나타내는 Fab, 또는 디설파이드 결합에 의해 함께 연결된 2개의 항원-결합 Fab 부분을 함유하는 2가 항원-결합 단편인 F(ab')₂, 또는 F(ab')₂의 1가-변이체인 F(ab')일 수 있다. 이러한 단편은 또한 단일 쇄 가변 단편(scFv)일 수도 있다.

작용적 단편은 항상 상응하는 전체-크기 항체의 6개 모두의 CDR을 함유하는 것은 아니다. 3개 이하의 CDR 영역(일부 경우에, 심지어 단일의 CDR 또는 그의 일부)을 함유하는 분자는 CDR(들)이 유래된 항체의 항원-결합 활성을 보유할 수 있는 것으로 인지된다. 예를 들어, 문헌[Gao et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 32389-93]에서는, 전체 VL 사슬(3개의 모든 CDR)이 그의 기질에 대한 높은 친화성을 갖는 것으로 기재되어 있다.

2개의 CDR 영역을 함유하는 분자가 예를 들어 문헌[Vaughan & Sollazzo 2001, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 4: 417-430]에 기재되어 있다. 418 페이지(오른쪽 열 - 3 우리의 설계 전략)에서, 프레임 영역 내 산재된 H1 및 H2 CDR 고가변 영역만을 포함하는 미니바디(minibody)가 기재되어 있다. 미니바디는 표적에 결합할 수 있는 것으로서 기재되어 있다. 문헌[Pessi et al., 1993, Nature, 362: 367-9 및 Bianchi et al., 1994, J. Mol. Biol., 236: 649-59]는 Vaughan 및 Sollazzo가 참조하며, 이것은 H1 및 H2 미니바디 및 이의 특성을 보다 상세하게 설명한다. 문헌[Qiu et al., 2007, Nature Biotechnology, 25:921-9]에서, 2개의 연결된 CDR로 이루어진 분자가 항원을 결합할 수 있음이 입증되었다. 문헌[Quiocho 1993, Nature, 362: 293-4]은 "미니바디" 기술의 요약을 제공한다. 문헌[Ladner 2007, Nature Biotechnology, 25:875-7]은 2개의 CDR을 함유하는 분자가 항원-결합 활성을 보유할 수 있다는 점을 언급했다.

단일 CDR 영역을 함유하는 항체 분자는 예를 들어, 문헌[Laune et al., 1997, JBC, 272: 30937-44]에 기재되어 있는데, 여기서 CDR로부터 유래된 다양한 헥사펩티드가 항원-결합 활성을 보이는 것이 입증되었고, 완전한, 단일 CDR의 합성 펩티드는 강한 결합 활성을 나타내는 것이 주목된다. 문헌[Monnet et al., 1999, JBC, 274: 3789-96]에서, 다양한 12-머 펩티드 및 연관된 프레임워크 영역이 항원-결합 활성을 갖는 것을 나타내며, CDR3-유사 펩티드 단독이 항원을 결합할 수 있다고 언급되어 있다. 문헌[Heap et al., 2005, J. Gen. Virol., 86: 1791-1800]에서는, "마이크로-항체"(단일의 CDR을 함유하는 분자)가 항원을 결합할 수 있다고 보고되어 있고, 항-HIV 항체로부터의 시클릭 펩티드가 항원-결합 활성 및 기능을 갖는 것으로 나타내어져 있다. 문헌[Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13:1882-91]에서는, 단일의 CDR이 항원-결합 활성 및 이것의 라이소자임 항원에 대한 친화성을 부여할 수 있는 것으로 나타내어져 있다.

따라서, 5개, 4개, 3개 또는 그보다 적은 개수의 CDR을 가진 항체 분자는 이들이 유래된 전장-항체의 항원 결합 특성을 보유할 수 있다.

항체 분자는 또한 전장 항체의 유도체 또는 이러한 항체의 단편일 수도 있다. 유도체는 상응하는 전체-크기 항체와 동일한 항원 결합 특징을 갖는다는 것은 이것이 전체-크기 항체와 동일한 표적 상의 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다.

따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체 분자"에서, 본 발명자들은 모든 유형의 항체 분자 및 이의 기능성 단편, 예컨대, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 합성 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 다중-특이적 항체, 이중-특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 가변 단편(Fv), 단일-쇄 가변 단편(scFv 단편), 예컨대, 2가 단일-쇄 가변 단편(di-scFvs) 및 디설파이드-연결된 가변 단편, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fab' 단편, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄의 동종-이량체, 항체 경쇄의 동종-이량체, 항체 중쇄의 이종이량체, 항체 경쇄의 이종이량체, 이러한 동종 및 이종이량체의 항원 결합 기능성 단편을 포함한다.

나아가, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 용어 "항체 분자"는 IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD, 및 IgE를 포함하는, 모든 부류의 항체 분자 및 기능성 단편을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항체는 인간 IgG1이다. 당업자는 마우스 IgG2a 및 인간 IgG1이 활성적 Fc 감마 수용체와 생산 가능하게 연계되고, 예를 들어 ADCP 및 ADCC에 의해 활성적 Fc 감마 수용체 보유 면역 세포(예를 들어, 대식세포 NK 세포)의 활성화를 통해 표적 세포의 결실을 활성화시키는 능력을 공유한다는 것을 인식한다. 이와 같이, 마우스 IgG2a는 마우스에서 결실에 바람직한 아이소타입인 반면, 인간 IgG1은 인간에서 결실에 바람직한 아이소타입이다. 이에 반해서, TNFR 슈퍼패밀리 효능제 수용체, 예를 들어, 4-1BB, OX40, TNFRII, CD40의 최적의 공-자극은 저해성 FcγRII의 항체 결속에 좌우된다고 공지되어 있다. 마우스에서, 저해성 Fc 감마 수용체(FcγRIIB)에 우세하게 결합하고, 활성 Fc 감마 수용체에는 단지 약하게 결합하는 IgG1 아이소타입은 TNFR-슈퍼패밀리 표적화 mAb의 공자극 활성에 최적인 것으로 공지되어 있다. 인간에서 마우스 IgG1 아이소타입의 직접적인 등가물이 기재되지 않았지만, 항체는 활성 인간 Fc 감마 수용체에 비해 저해에 대해 유사하게 강화된 결합을 나타내도록 조작될 수 있다. 이러한 조작된 TNFR-슈퍼패밀리 표적화 항체는 또한 인간 활성 및 저해 Fc 감마 수용체를 발현하도록 조작된 트랜스제닉 마우스에서 개선된 생체내 공-자극 활성을 갖는다(문헌[Dahan et al, 2016, Therapeutic Activity of Agonistic, Human Anti-CD40 Monoclonal Antibodies Requires Selective FcγR Engagement. Cancer Cell. 29(6):820-31]).

상기 개략된 바와 같이, 항체 분자의 상이한 유형 및 형태가 본 발명에 포함되며, 면역학 분야의 당업자에게 공지될 것이다. 치료적 목적으로 사용되는 항체는 종종 항체 분자의 특성을 개질시키는 추가적인 성분으로 개질된다는 것이 널리 공지되어 있다.

그러므로, 본 발명자들은 본 발명의 항체 분자 또는 본 발명에 따라 사용된 항체 분자(예를 들어, 단클론성 항체 분자 및/또는 다클론성 항체 분자 및/또는 이중특이적 항체 분자)가 검출 가능한 모이어티(moiety) 및/또는 세포독성 모이어티를 포함한다는 것을 포함한다.

"검출 가능한 모이어티"에, 본 발명자들은 효소; 방사성 원자; 형광 모이어티; 화학발광 모이어티; 생물발광 모이어티를 포함하는 군으로부터 하나 이상을 포함한다. 검출 가능한 모이어티는 항체 분자가 시험관내 및/또는 생체내 및/또는 생체외에서 시각화될 수 있게 한다.

"세포독성 모이어티"에, 본 발명자들은 방사성 모이어티, 및/또는 효소(예를 들어, 여기서 효소는 카스파제) 및/또는 독소(예를 들어, 여기서 독소는 박테리아 독소 또는 독물임)을 포함하며; 세포독성 모이어티는 세포 용해를 유도할 수 있다.

본 발명자들은 항체 분자가 단리된 형태 및/또는 정제된 형태일 수 있고/있거나 페길화될 수 있음을 추가로 포함한다.

상기 논의된 바와 같이, 항체의 CDR은 항체 표적에 결합한다. 본원에서 기재된 각 CDR에 아미노산을 할당하는 것은 문헌[Kabat EA et al. 1991, In "Sequences of Proteins of Immunological Interest" Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242, pp xv- xvii]에 따른 정의에 따른다.

당업자가 인식하고 있는 바와 같이, 아미노산을 각 CDR에 할당하기 위한 다른 방법이 또한 존재한다. 예를 들어, International ImMunoGeneTics 정보 시스템(IMGT(R))(http://www.imgt.org/ and Lefranc and Lefranc "The Immunoglobulin FactsBook" published by Academic Press, 2001).

추가 실시형태에서, 본 발명 또는 본 발명에 따라서 사용되는 항체 분자는 본 명세서에 기재된 특이적 항체, 예컨대, 서열번호 15, 16, 17, 10, 18 및 19 또는 서열번호 22, 23, 24, 10, 25 및 26을 포함하는 항체 분자와 경쟁할 수 있는 항체 분자이다.

"경쟁할 수 있는"이란, 경쟁 항체가 본 명세서에서 정의된 바와 같은 항체 분자의 특정 표적의 결합을 적어도 부분적으로 저해하거나 그렇지 않으면 방해할 수 있다는 것을 의미한다.

예를 들어, 이러한 경쟁 항체 분자는 약 10% 이상; 예를 들어 약 20% 이상, 또는 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 100% 이상 본원에서 기재된 항체 분자의 결합을 저해할 수 있고/있거나 본원에서 기재된 항체의 특정 표적에 대한 결합을 방지 또는 감소시키는 능력을 약 10% 이상; 예를 들어 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 이상 저해할 수 있다.

경쟁적 결합은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 당업자에게 익히 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

ELISA 검정은 에피토프-개질 또는 차단 항체를 평가하는데 사용될 수 있다. 경쟁 항체를 동정하기에 적합한 추가적인 방법은 본원에서 참조로 통합되어 있는 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane (예를 들어, 페이지 567 내지 569, 574 내지 576, 583 및 590 내지 612, 1988, CSHL, NY, ISBN 0-87969-314-2 참조)]에 개시되어 있다.

항체는 정의된 표적 분자 또는 항원에 특이적으로 결합한다는 것이 널리 공지되어 있고, 즉, 이것은 항체가 우세하게 그리고 선택적으로 표적이 아닌 분자가 아니라 이의 표적과 결합한다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른, 또는 본 발명에 따라 사용된 항체의 표적 CTLA-4는 세포 표면 상에서 발현되고, 즉 이들은 항체에 대한 에피토프를 포함하는 세포 표면 항원(달리 본 문맥에서 세포 표면 에피토프로서 공지됨)이다. 세포 표면 항원 및 에피토프는 면역학 또는 세포 생물학의 당업자에 의해 용이하게 이해될 수 있는 용어이다.

"세포 표면 항원"에, 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 항체 분자가 세포막의 세포외 측면 상에 노출되는 세포 포면 또는 적어도 에피토프를 포함시킨다.

단백질 결합 평가 방법은 생화학 또는 면역학의 당업자에게 공지되어 있다. 당업자는 이 방법이 항체의 표적과의 결합 및/또는 항체의 Fc 도메인의 Fc 수용체와의 결합뿐 아니라 이들 상호작용의 상대적 강도, 또는 특이성, 또는 저해, 또는 방지 또는 감소를 평가하는데 사용될 수 있다는 점을 인지할 것이다. 단백질 결합을 평가하는데 사용될 수 있는 방법의 예는 예를 들어 면역검정, BIAcore, 웨스턴 블롯, 방사면역검정(radioimmuno검정: RIA) 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)이다(항체 특이성에 대한 논의를 위해, 문헌[Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336 (1989)]을 참조한다).

따라서, 본 명세서에서, "CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 분자" 및 "항-CTLA-4 항체 분자"는 표적 CTLA-4에 특이적으로 결합하지만 비-표적에는 결합하지 않거나, 표적보다 비-표적에 보다 약하게(더 낮은 친화성으로) 결합하는 항체 분자를 지칭한다.

일부 실시형태에서, CTLA-4(또는 항-CTLA-4 항체 분자)에 특이적으로 결합하는 항체 분자는 CTLA-4의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 지칭한다.

일부 실시형태에서, CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 분자(또는 항-CTLA-4 항체 분자)는 CD28과 교차 반응하지 않는다. 일부 실시형태에서, CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 분자(또는 항-CTLA-4 항체 분자)는 CD80 및/또는 CD86에 대한 CTLA-4의 결합을 차단함으로써, CLTA-4 신호전달을 저해한다.

또한 본 발명자들은 항체가 표적 CTLA-4에 비-표적보다 적어도 2배 더 강하게, 적어도 5배 더 강하게, 또는 적어도 10배 더 강하게, 또는 적어도 20배 더 강하게, 또는 적어도 50배 더 강하게, 또는 적어도 100배 더 강하게, 또는 적어도 200배 더 강하게, 또는 적어도 500배 더 강하게, 또는 적어도 약 1000배 더 강하게 특이적으로 결합한다는 의미를 포함한다.

추가로, 본 발명자들은 항체가 표적 CTLA-4에 적어도 약 적어도 약 10^-1 K_d, 또는 적어도 약 10^-2 K_d, 또는 적어도 약 10^-3 K_d, 또는 적어도 약 10^-4 K_d, 또는 적어도 약 10^-5 K_d, 또는 적어도 약 10^-6 K_d, 또는 적어도 약 10^-7 K_d, 또는 적어도 약 10^-8 K_d, 또는 적어도 약 10^-9 K_d, 또는 적어도 약 10^-10 K_d, 또는 적어도 약 10^-11 K_d, 또는 적어도 약 10^-12 K_d, 또는 적어도 약 10^-13 K_d, 또는 적어도 약 10^-14 K_d, 또는 적어도 약 10^-15 K_d의 K_d 로 표적에 결합하는 경우 이것이 표적에 특이적으로 결합한다는 의미를 포함시킨다.

상기에 언급된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 분자(또는 항-CTLA-4 항체 분자)는 이필리무맙에 비해서 CTLA-4 양성 세포에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는다.

항체 분자가 CTLA-4 양성 세포에 대해서 고갈 효과를 갖는다는 것은, 대상체, 예컨대, 인간에게 투여될 때, 이러한 항체가 CTLA-4 양성 세포의 표면 상에서 발현되는 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, 이러한 결합이 이러한 세포의 고갈을 초래한다는 것을 의미한다.

일부 실시형태에서, CTLA-4 양성 세포는 CD4 양성(CD4+) 세포, 즉, CD4를 발현하는 세포이다.

일부 실시형태에서, CTLA-4 양성 세포는 CD4 양성 및 FOXP3 양성 둘 다이고, 즉, CD4 및 FOXP3 둘 다를 발현한다. 이러한 세포는 Treg이다. CD8 양성 T 세포는 또한 CTLA-4를 발현하지만, Treg는 CD8 양성 T 세포보다 CTLA-4를 상당히 더 높은 수준으로 발현한다. 이것은 더 낮은 발현 CD8+ 세포에 비해 Treg가 고갈에 더 취약하게 만든다.

일부 상황에서, CTLA-4는 종양 미세환경(종양 침윤 세포, TILS)에서 면역 세포 상에서 우선적으로 발현된다.

따라서, 종양 미세환경에서, Treg는 CTLA-4의 최대 발현을 갖는 세포여서, Treg 고갈 효과를 갖는 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 분자(또는 항-CTLA-4 항체 분자)를 야기할 것이다. 이것은 하기, 예를 들어, 실시예 4 및 도 13과 관련하여 보다 상세하게 논의된다.

일부 실시형태에서, CTLA-4 양성 세포는 고형 종양에서의 Treg일 것이다. 이러한 Treg는 매우 높은 CTLA-4 발현을 가질 것이고, 따라서 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 분자는 우선적으로 이러한 Treg의 고갈을 초래한다.

상기에 언급된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 항-CTLA-4 항체 분자는 Treg 고갈 항체 분자이고, 이것은 대상체, 예컨대, 인간에게 투여될 때, 이러한 항체 분자가 Treg의 표면 상에서 발현되는 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, 이러한 결합이 Treg의 고갈을 초래한다는 것을 의미한다.

항체 분자가 본 명세서에 지칭된 바와 같은 이필리무맙에 비해서 CTLA-4 양성 세포에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는 항체 분자인지를 결정하기 위해서, 시험관내 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC) 검정 또는 PBMC-NOG/SCID 모델의 생체내 시험을 사용하는 것이 가능하다.

GFP와 함께 CD16-158V 대립유전자를 발현하도록 안정적으로 형질주입된 NK-92 세포주를 사용하여 수행되는 시험관내 ADCC 시험, 여기서 ADCC 시험은 하기 연속적인 7개의 단계를 포함한다:

1) 표적 세포로서의 CTLA-4 양성 세포, CD4 양성 세포 또는 Treg를 건강한 공여자로부터 단리한다. 이러한 단리는 CD4+ T 세포 단리 키트, 예컨대, 밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotec)로부터의 상업용 키트를 사용하여 수행될 수 있다.

2) 이어서 표적 세포를 예를 들어, 48시간 동안, CD3/CD28로, 예를 들어 CD3/CD28 Dynabeads® 및 rhIL-2, 예컨대, 50ng/ml의 rhIL-2를 사용하여 자극시킨다. 자극은 37℃에서 수행될 수 있다.

3) 이어서 표적 세포를 시험될 항체 분자와 함께, 예를 들어, 10 μg/ml로 30분 동안 4℃에서 사전 인큐베이션시키고, 이어서 NK 세포와 혼합한다.

4) 이어서 표적 세포를 HEPES 완충액, 피루브산 나트륨 및 FBS 저 IgG를 함유하는 RPMI 1640 + GlutaMAX 배지에서 적절한 시간, 예컨대, 4시간 동안 인큐베이션시킨다. RPMI 1640 + GlutaMAX 배지는 10 mM의 HEPES 완충액, 1 mM의 피루브산 나트륨 및 10%FBS 저 IgG를 함유할 수 있고, 효과기:표적 세포 비는 2:1일 수 있다.

5) 유세포 분석법에 의해서 용해를 결정한다.

6) 단계 3에서 시험된 항체 분자 대신에 이필리무맙을 사용하여 단계 1 내지 5를 반복하거나 또는 동시에 수행한다.

7) 시험된 항체 분자에 대한 용해 결과를 이필리무맙에 대한 용해 결과와 비교한다. 이필리무맙에 비해서 시험된 항체 분자에 대한 개선된 용해는, 시험된 항체 분자가 어느 표적 세포가 사용됐는지에 따라서 각각 CTLA-4 양성 세포, CD4 양성 세포 또는 Treg에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 상기 단계 7)에서의 개선된 고갈 효과는 상당히 개선된 고갈 효과이다.

이러한 검정은 하기, 실시예 4 및 도 12와 함께 보다 상세하게 설명된다.

생체내 시험은 PBMC 마우스와 NOG/SCID 마우스를 함께 사용하는 것을 기초로 하는데, 이것을 본 명세서에서 PBMC-NOG/SCID 모델이라고 부른다. PBMC 마우스 및 NOG/SCID 마우스 둘 다는 널리 공지된 모델이다. PBMC-NOG/SCID 모델에서의 생체내 시험은 하기 연속적인 9개의 단계를 포함한다:

1) 인간 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)를 단리하고, 세척하고, 멸균 PBS 중에 재현탁한다. 일부 실시형태에서, PBMC를 75x10⁶개 세포/ml로 PBS 중에 재현탁한다.

2) NOG 마우스에게 적절한 양, 예컨대, 200 μl의 단계 1)로부터의 세포 현탁액을 i.v.(정맥내)로 주사한다. 200 μl을 주사하는 경우, 이것은 15x10⁶개 세포/마우스에 상응한다.

3) 적합한 시간, 예컨대, 주사 후 제2주에, NOG 마우스로부터의 비장을 단리하고, 단일 세포 현탁액으로 만든다. 선택적으로, CTLA-4 발현을 확인하기 위해서, 단일 세포 현탁액으로부터의 소량의 샘플을 취하여 FACS에 의해서 인간 T 세포 상에서 CTLA-4의 발현을 결정한다.

4) 단계 3)으로부터의 세포 현탁액을 멸균 PBS 중에 재현탁한다. 일부 실시형태에서, 세포 현탁액을 50x10⁶개 세포/ml로 멸균 PBS 중에 재현탁한다. 선택적인 CTLA-4 발현 결정이 단계 3에 포함되는 경우, 세포 현탁액의 나머지를 단계 4에서 재현탁한다.

5) SCID 마우스에게 적절한 양, 예컨대, 200 μl의 단계 4로부터의 현탁액을 i.p.(복강내로)로 주사한다. 200 μl를 주사하는 경우, 이것은 10x10⁶개 세포/마우스에 상응한다.

6) 단계 5)에서의 주사 후, 적합한 시간, 예컨대, 1시간에, SCID 마우스를 적절한 양, 예컨대, 10 mg/kg의 시험될 항체 분자, 이필리무맙 또는 아이소타입 대조군 단클론성 항체로 처리한다.

7) 처리된 SCID 마우스의 복강내 유체를 단계 6)에서의 처리 후 적합한 시간, 예컨대, 24시간에 수집한다.

8) 인간 T 세포 하위세트를 식별하고, 하기 마커: CD45, CD4, CD8, CD25 및/또는 CD127을 사용하여 FACS에 의해서 정량한다.

9) 항체 분자로 처리된 마우스로부터의 T 세포 하위세트의 식별 및 정량으로부터의 결과를 이필리무맙으로 처리된 마우스로부터의 T 세포 하위세트의 식별 및 정량으로부터의 결과 및 아이소타입 대조군 단클론성 항체로 처리된 마우스로부터의 T 세포 하위세트의 식별 및 정량으로부터의 결과와 비교한다. 이필리무맙으로 처리된 마우스로부터의 복강내 유체 중의 CTLA-4 양성 세포의 수와 비교하여 시험될 항체 분자로 처리된 마우스로부터의 복강내 유체 중의 CTLA-4 양성 세포의 더 적은 수는 항체 분자가 이필리무맙에 비해서 CTLA-4 양성 세포에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 이필리무맙으로 처리된 마우스로부터의 복강내 유체 중의 CD4 양성 세포의 수와 비교하여 시험될 항체 분자로 처리된 마우스로부터의 복강내 유체 중의 CD4 양성 세포의 더 적은 수는 항체 분자가 이필리무맙에 비해서 CD4 양성 세포에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 이필리무맙으로 처리된 마우스로부터의 복강내 유체 중의 Treg 양성 세포의 수와 비교하여 시험될 항체 분자로 처리된 마우스로부터의 복강내 유체 중의 Treg 양성 세포의 더 적은 수는 항체 분자가 이필리무맙에 비해서 Treg 양성 세포에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

이러한 생체내 시험에서, 일부 실시형태에서 단계 7에서 Treg 고갈을 살펴보는 것이 가장 흥미롭다.

이러한 검정은 하기, 실시예 4 및 도 14와 함께 보다 상세하게 설명된다.

Treg 고갈은 또한 당업자에게 공지된 바와 같이 항체-의존적 세포 식세포작용(ADCP) 검정에서 측정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 Yervoy에 비해서 B7.1 및 B7.2 리간드와의 CTLA-4 상호작용에 대해서 유사한 차단 효과를 갖는다. 이것은 ELISA(도 10에 도시된 바와 같음)에 의해서 또는 항-CTLA-4 항체가 SEB로의 PBMC의 자극에 대한 반응으로 T 세포에 의한 IL-2 생산을 향상시키는 보다 기능성인 검정에 의해서 평가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 인간 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 인간화된 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 인간 기원의 항체 분자인데, 이는 그것이 인간 항체 분자로부터 유래되고, 이어서 변형되었다는 것을 의미한다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 인간 IgG1 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 하나 또는 몇몇의 활성 Fc 수용체에 대해서 개선된 결합을 나타내고/내거나 하나 또는 몇몇 활성 Fc 수용체에 대한 개선된 결합을 위해서 조작된 인간 IgG1 항체의 형태의 항체이고; 따라서, 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 Fc-조작된 인간 IgG1 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 뮤린 또는 인간화된 뮤린 IgG2a 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 인간 CTLA-4와 교차 반응성인 뮤린 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 단클론성 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 다클론성 항체이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 하기 표 1에 제공된 3개의 대안적인 VH-CDR1 서열 중 하나, 3개의 대안적인 VH-CDR2 서열 중 하나, 2개의 대안적인 VH-CDR3 서열 중 하나, 2개의 VL-CDR1 서열 중 하나, 2개의 VL-CDR2 서열 중 하나 및/또는 2개의 대안적인 VL-CDR3 서열 중 하나를 포함하는 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 서열번호 3, 6, 8, 10, 12 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 1 내지 6개를 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 서열번호 3, 6, 8, 10, 12 및 14를 갖는 CDR을 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 CDR, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1 및 VL-CDR3 중 1 내지 6개를 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택되고,

VH-CDR1은, 존재하는 경우, 서열번호 15, 22, 29 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VH-CDR2는, 존재하는 경우, 서열번호 16, 23, 30 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VH-CDR3은, 존재하는 경우, 서열번호 17, 24, 31 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VL-CDR1은, 존재하는 경우, 서열번호 10 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VL-CDR2는, 존재하는 경우, 서열번호 18, 25, 32 및 39로 이루어진 군으로부터 선택되고;

VL-CDR3은, 존재하는 경우, 서열번호 19, 26 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는

서열번호 15, 16, 17, 10, 18 및 19;

서열번호 22, 23, 24, 10, 25 및 26;

서열번호 29, 30, 31, 10, 32 및 26; 및

서열번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 6개의 CDR을 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 서열번호 15, 16, 17, 10, 18 및 19를 갖는 6개의 CDR을 포함하는 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 서열번호 22, 23, 24, 10, 25 및 26을 갖는 6개의 CDR을 포함하는 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 서열번호 20, 27, 33 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 서열번호 21, 28, 34 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 서열번호 20-21, 27-28, 33-34 및 41-42로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 분자이다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 서열번호 20의 서열을 갖는 VH 및 서열번호 21의 서열을 갖는 VL을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 서열번호 27의 서열을 갖는 VH 및 서열번호 28의 서열을 갖는 VL을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-CTLA-4 항체 분자는 하기 표 3에 제공된 불변 영역 중 하나 또는 둘 다를 또한 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 분자는 하기 표 4에 제공된 뉴클레오티드 서열 중 하나에 의해서 암호화된 분자이다.

일부 실시형태에서, 인간 CTLA-4(hCTLA-4) 및 시노몰거스 원숭이 CTLA-4(cmCTLA-4 또는 cyno CTLA-4) 둘 다에 결합하는 항체 분자가 이롭다. 크랩-이팅 마카크(crab-eating macaque) 또는 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)라고 지칭되는 시노몰거스 원숭이의 세포에서 발현되는 CTLA-4와의 교차 반응성이 이로울 수 있는데, 그 이유는 이것이 특히 내성에 초점을 맞춘 대리 항체를 사용하지 않고도 원숭이의 항체 분자를 시험할 수 있게 하기 때문이다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 인간 CTLA-4(hCTLA-4) 및 뮤린 CTLA-4(mCTLA-4) 둘 다에 결합하는 것이 이롭다. 이것은 대리 항체를 사용하지 않고도 효과 및 약력학에 특히 초점을 맞춘 마우스에서 항체 분자를 시험할 수 있기 때문에 이로울 수 있다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 3개의 hCTLA-4, cmCTLA-4 및 mCTLA-4 모두에 결합한다.

일부 실시형태에서, 마우스의 관련 생체내 모델에서 항체 분자의 기능적 활성을 시험하기 위해 대리 항체를 사용하는 것이 필요하다. 인간에서 항체 분자의 효과와 마우스에서 대리 항체에 대한 생체내 결과 간의 비교 가능성을 보장하기 위해서, 인간 항체 분자와 동일한 시험관내 특성을 가진 기능적으로 동등한 대리 항체를 선택하는 것이 필수적이다.

일부 실시형태에서, 항체 분자는 인간 CD28에 결합하지 않는다.

약물은 예를 들어 이것이 신체에 의해 흡수되는 속도를 변경하도록 상이한 첨가제로 개질될 수 있고; 예를 들어 신체로의 특정 투여 경로를 허용하도록 상이한 형태로 개질될 수 있다는 점이 당업자에게 공지되어 있을 것이다.

따라서, 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스 및/또는 세포가 약제학적 조성물 중에 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 희석제, 비히클 및/또는 아주반트와 조합될 수 있는 것을 포함시킨다. 이와 관련하여, 용어 약제학적 조성물은 용어 약제학적 제제, 약제학적 제형, 치료 조성물, 치료 제제, 치료 제형 및 치료 엔티티와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 일부 실시형태에서 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스 또는 세포로 이루어진다.

본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 일부 실시형태에서 상기에 기재된 항체 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 이루어지거나 이것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 세포 또는 바이러스 게놈 또는 비리옴에 통합된 본 명세서에 기재된 항체 분자의 일부 또는 완전 항체 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이어서 약제학적 조성물은 본 발명의 항체를 위한 전달 비히클로서 (또는 본 발명의 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 위한 전달 비히클로서) 세포 또는 바이러스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 실시형에서, 이러한 바이러스는 본원에 기재된 항체 분자 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 치료적 종양용해성 바이러스의 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 전장 인간 IgG 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 scFv, Fab 또는 F(ab')₂ 항체 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

첨부된 청구범위에 기재된 바와 같이, 일 실시형태에서 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 본 발명의 플라스미드를 포함하는 바이러스에 관한 것이다. 바람직하게는, 바이러스는 치료용 종양용해성 바이러스와 같은 종양용해성 바이러스이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "종양용해성"은 비-분열(예를 들어, 정상 또는 건강한) 세포에서는 복제가 없거나 최소한으로 나타내면서, 시험관내 또는 생체내에서 성장을 늦추고/늦추거나 분열하는 세포를 용해시킬 목적으로 분열 세포(예를 들어, 암 세포와 같은 증식 세포)에서 선택적으로 복제하는 바이러스의 능력을 지칭한다. "복제"(또는 "복제" 및 "복제하는" 등과 같은 복제의 임의의 형태)는 핵산 수준에서 또는 바람직하게는 감염성 바이러스 입자 수준에서 발생할 수 있는 바이러스의 복제를 의미한다. 이러한 종양용해성 바이러스는 현재 식별된 임의의 바이러스 구성원으로부터 얻을 수 있다. 이는 자연적으로 종양용해성이거나 DNA 복제, 핵산 대사, 숙주 향성, 표면 부착, 독성, 용해 및 확산에 관련된 것과 같은 분열 세포에서 종양 선택성 및/또는 우선적 복제를 증가시키도록 하나 이상의 바이러스 유전자를 변형시킴으로써 조작될 수 있는 네이티브 바이러스 일 수 있다(예를 들어, 문헌[Wong et al., 2010, Viruses 2: 78-106] 참고). 이벤트 또는 조직-특이적 조절 요소(예를 들어, 프로모터)의 제어 하에 하나 이상의 바이러스 유전자(들)를 배치하는 것도 고려할 수 있다. 예시적인 종양용해성 바이러스는 레오 바이러스, 세네카 밸리 바이러스(SVV), 소포성 구내염 바이러스(VSV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 단순 포진 바이러스(HSV), 모빌리 바이러스, 아데노 바이러스, 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 홍역 바이러스, 거품형성 바이러스, 알파 바이러스, 렌티 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신비스 바이러스, 점액종 바이러스, 랍도 바이러스, 피코르나 바이러스, 콕사키 바이러스, 파보 바이러스 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이러한 바이러스는 의학 및 바이러스학 분야의 당업자에게 공지되어 있다.

일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 헤르페스 바이러스로부터 얻어진다. 헤르페스비리대(Herpesviridae)는 모두 공통 구조를 공유하고 지질 이중층 막으로 둘러싸인 20면체 캡시드 내에 캡슐화된 100 내지 200개의 유전자를 암호화하는 비교적 큰 이중 가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 DNA 바이러스의 큰 패밀리이다. 종양용해성 헤르페스 바이러스는 다른 유형의 HSV에서 유래할 수 있지만, 특히 바람직한 것은 HSV1 및 HSV2이다. 헤르페스 바이러스는 종양에서 바이러스 복제를 제한하거나 분열되지 않는 세포에서 세포독성을 줄이기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 티미딘 키나제(문헌[Martuza et al., 1991, Science 252: 854-6]), 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR)(문헌[Mineta et al., 1994, Cancer Res. 54: 3363-66]) 또는 우라실-N-글리코실라제(문헌[Pyles et al., 1994, J. Virol. 68: 4963-72])와 같은 핵산 대사에 관련된 임의의 바이러스 유전자는 불활성화될 수 있다. 또 다른 양상은 ICP34.5 유전자와 같은 독성 인자를 암호화하는 유전자의 기능에 결함이 있는 바이러스 돌연변이체를 포함한다(문헌[Chambers et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1411-5]). 종양용해성 헤르페스 바이러스의 대표적인 예는 NV1020(예를 들어, 문헌[Geevarghese et al., 2010, Hum. Gene Ther. 21(9): 1119-28]) 및 T-VEC(문헌[Harrington et al., 2015, Expert Rev. Anticancer Ther. 15(12):1389-1403])를 포함한다.

일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 아데노 바이러스로부터 수득된다. 종양용해성 아데노 바이러스를 조작하는 방법은 당업계에서 이용 가능하다. 유리한 전략은 바이러스 프로모터를 종양-선택적 프로모터로 대체하거나 E1 아데노바이러스 유전자 산물을 변형하여 종양 세포에서 변경된 p53 또는 망막 모세포종(retinoblastoma: Rb) 단백질과의 결합 기능을 불활성화시키는 것을 포함한다. 자연적인 맥락에서, 아데노바이러스 E1B55kDa 유전자는 다른 아데노바이러스 생성물과 협력하여 p53을 불활성화(p53은 암세포에서 자주 이상조절됨)시켜 세포 사멸을 예방한다. 종양용해성 아데노바이러스의 대표적인 예는 ONYX-015(예를 들어, 문헌[Khuri et al., 2000, Nat. Med 6(8): 879-85]) 및 Oncorine이라고도 지칭되는 H101(문헌[Xia et al., 2004, Ai Zheng 23(12): 1666-70])을 포함한다.

일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 폭스바이러스이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폭스바이러스"는 폭스비리대 패밀리에 속하는 바이러스를 지칭하고, 특히 바람직하게는 코르도폭스비리대 서브패밀리에 속하는 폭스바이러스, 더욱 바람직하게는 오르토폭스 바이러스 속에 속하는 바이러스를 지칭한다. 백시니아(Vaccinia) 바이러스, 우두 바이러스, 카나리폭스 바이러스, 엑트로멜리아 바이러스, 점액종 바이러스가 본 발명의 맥락에서 특히 적절하다. 이러한 폭스바이러스의 게놈 서열은 당업계 및 전문 데이터베이스(예를 들어, 각각 Genbank 수탁 번호 NC_006998, NC_003663 또는 AF482758.2, NC_005309, NC_004105, NC_001132)에서 입수 가능하다.

구체적이고 바람직한 실시형태에서, 이러한 종양용해성 폭스바이러스는 종양용해성 백시니아 바이러스이다. 백시니아 바이러스는, 바이러스가 숙주 세포 기구와 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 수많은 바이러스 효소 및 인자를 암호화하는 200 kb의 이중 가닥 DNA 게놈을 특징으로 하는 폭스바이러스 패밀리의 구성원이다. 백시니아 바이러스 입자의 대부분은 단일 지질 외피를 가진 세포내(세포내 성숙 비리온의 경우 IMV)에 존재하며, 용해될 때까지 감염된 세포의 세포질에 남아 있다. 다른 감염성 형태는 감염된 세포를 용해시키지 않고 그것으로부터 발아하는(buding out) 이중 외피 입자(세포외 외피 비리 온의 경우 EEV)이다. 이는 임의의 백시니아 바이러스 균주에서 유래할 수 있지만 엘스트리(Elstree), 와이어스(Wyeth), 코펜하겐(Copenhagen), 리스터(Lister) 및 웨스턴 리저브(Western Reserve) 균주가 특히 바람직하다. 본 명세서에 사용된 유전자 명명법은 달리 명시되지 않는 한 코펜하겐 백시니아 균주의 명명법이다. 그러나 코펜하겐과 다른 백시니아 균주 간의 관련성은 일반적으로 문헌에서 입수 가능하다.

바람직하게는, 이러한 종양용해성 백시니아 바이러스는 하나 이상의 바이러스 유전자(들)를 변경시킴으로써 변형된다. 상기 변형(들)은 바람직하게는 합성의 부재 또는 변형되지 않은 유전자에 의해 정상 조건 하에서 생산된 단백질의 활성을 보장할 수 없는 결함이 있는 바이러스 단백질의 합성으로 이어진다. DNA 대사, 숙주 독성, IFN 경로(예를 들어, 문헌[Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11(5): 595-608]) 등에 관여하는 바이러스 유전자를 변경시키기 위한 목적의 예시적인 변형은 문헌에 개시되어 있다. 바이러스 유전자좌를 변경시키기 위한 변형은 바이러스 유전자 또는 이의 조절 요소 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드(들)(인접하든 아니든)의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포함한다. 변형(들)은 통상적인 재조합 기술을 사용하여 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 이루어질 수 있다.

보다 바람직하게는, 이러한 종양용해성 백시니아 바이러스는 티미딘 키나제 코딩 유전자(유전자좌 J2R)를 변경함으로써 변형된다. 티미딘 키나제(TK) 효소는 데옥시리보뉴클레오티드 합성에 관여한다. TK는 정상 세포에서 바이러스 복제에 필요한데, 그 이유는 이러한 세포가 일반적으로 낮은 농도의 뉴클레오티드를 가지는 반면, 높은 뉴클레오티드 농도를 포함하는 분열하는 세포에는 필요하지 않기 때문이다.

대안적으로 또는 조합하여, 이러한 종양용해성 백시니아 바이러스는 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR)를 암호화하는 적어도 하나의 유전자 또는 두 유전자 모두를 변경시킴으로써 변형된다. 자연적인 맥락에서, 이러한 효소는 리보뉴클레오티드를 DNA 생합성에서 중요한 단계를 나타내는 데옥시리보뉴클레오티드로 환원시키는 것을 촉매한다. 바이러스 효소는 포유동물 효소와 소단위 구조가 유사한데, 이것은 I4L 및 F4L 유전자좌에 의해 각각 암호화된 R1 및 R2로 지정된 2개의 이종 소단위로 구성된다. 본 발명의 맥락에서, I4L 유전자(R1 큰 소단위를 암호화함) 또는 F4L 유전자(R2 작은 소단위를 암호화함) 중 어느 하나 또는 둘 다는 불활성화될 수 있다(예를 들어, 국제 특허 제WO2009/065546호 및 문헌[Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15: 1361-71]에 기재된 바와 같음). J2R, I4L 및 F4L 유전자의 서열과 다양한 폭스바이러스의 게놈 내 위치는 공개 데이터베이스에서 입수 가능하다.

일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 상기 표 2에 제시된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 상기 표 2에 제시된 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 상기 표 2에 제시된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 상기 표 2에 제시된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 서열번호 20 및 서열번호 21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 서열번호 27 및 서열번호 28을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 서열번호 33 및 서열번호 34를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 서열번호 41 및 서열번호 42를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 상기 표 4에 제시된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 상기 표 4에 제시된 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 상기 표 4에 제시된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 상기 표 4에 제시된 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 서열번호 45 및 46을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 서열번호 47 및 48을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 서열번호 49 및 50을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 서열번호 51 및 52를 포함한다.

일부 종양용해성 바이러스는 전장 인간 항체 서열의 통합을 수용할 수 있을만큼 충분히 큰 DNA 삽입을 호스팅하는 능력을 갖는다. 약독화 백시니아 바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스는 전체 길이 IgG 항체 서열의 통합을 허용할만큼 게놈이 충분히 큰 치료용 종양용해성 바이러스의 예이다(문헌[Chan, W. M. et al 2014 Annu Rev Virol 1(1): 119-141]; 문헌[Bommareddy, P. K., et al.2018 Nat Rev Immunol 18(8): 498-513]). 전장 IgG 항체는 종양용해성 백시니아 바이러스에 성공적으로 통합되어 바이러스에 민감한 숙주 세포, 예를 들어, 암 세포의 감염시 전장 IgG 항체의 발현 및 세포외 방출(생산)을 초래한다(문헌[Kleinpeter, P., et al. 2016, Oncoimmunology 5(10): e1220467]). 아데노바이러스는 또한 세포 감염시 기능적으로 생산되고 분비되는 전장 IgG 항체를 암호화하도록 조작될 수 있다(문헌[Marino, N., et al. 2017 J Clin Invest 123(6): 2447-2463]).

바람직한 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 (J2R 유전자좌의 변경으로 인해서) TK 활성에 결함이 있거나 또는 (J2R 유전자좌 및 RR-암호화 I4L 및/또는 F4L 유전자좌 중 적어도 하나의 변경으로 인해서) TK 및 RR 활성 모두에 결함이 있고, (a) 서열번호 20 및 서열번호 21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 (b) 서열번호 27 및 서열번호 28을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 (c) 서열번호 33 및 서열번호 34를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (d) 서열번호 41 및 서열번호 42를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스)이다.

적절한 경우, 본 명세서에 기재된 종양용해성 바이러스에 삽입된 뉴클레오티드 서열(들)이 발현, 트래피킹 및 생물학적 활성을 촉진시키기 위한 추가 조절 요소를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 생산자 세포(예를 들어, 감염된 세포) 외부의 분비를 촉진하기 위해 신호 펩티드가 포함될 수 있다. 신호 펩티드는 전형적으로 Met 개시제 직후에 암호화된 폴리펩티드의 N-말단에 삽입된다. 신호 펩티드의 선택은 광범위하고 당업자가 접근 가능하다. 예를 들어, 다른 면역글로빈(예를 들어, 중쇄 IgG)으로부터 유래된 신호 펩티드는 생산자 세포 외부에서 본 명세서에 기재된 항-CTLA4 항체의 분비를 허용하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 설명을 위해, IgG-유래 펩티드 신호가 장착된 본 명세서에 기재된 4-E03 항체의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 서열번호 53 및 서열번호 54를 참조할 수 있다.

특히 바람직한 종양용해성 바이러스는 (J2R 유전자좌 및 I4L 유전자좌 모두의 변경으로 인해서) TK 및 RR 활성 모두에 결함이 있고, 서열번호 20 및 서열번호 21 또는 서열번호 53 및 서열번호 54를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백시니아 바이러스(예를 들어, 코펜하겐 균주)이다.

일부 실시형태에서, 이러한 종양용해성 바이러스는 면역조절 폴리펩티드(들)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(들)(즉, 직접 또는 간접적으로 면역 반응을 자극하는 데 관여하는 폴리펩티드)과 같은 치료적 관심의 추가 뉴클레오티드 서열(들)을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 면역조절 폴리펩티드의 대표적인 예는 어떠한 제한도 없이 과립구 대식세포 집락 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor: GM-CSF) 및 특히 인간, 비인간 영장류 또는 뮤린 GM-CSF에 대한 특정 선호도를 갖는 사이토카인 및 케모카인을 포함한다. 추가 뉴클레오티드 서열은 당업계에서 접근 가능한 서열 데이터 및 본 명세서에 제공된 정보를 사용하여 표준 분자 생물학 기술(예를 들어, PCR 증폭, cDNA 클로닝, 화학적 합성)에 의해 쉽게 수득될 수 있다. 특히 바람직한 종양용해성 바이러스는 (J2R 유전자좌 및 I4L 유전자좌 모두의 변경으로 인해서) TK 및 RR 활성 모두에 결함이 있고, 서열번호 20 및 서열번호 21 또는 서열번호 53 및 서열번호 54를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백시니아 바이러스(예를 들어, 코펜하겐 균주)이고, 인간 GM-CSF(예를 들어, 서열번호 55 또는 서열번호 56을 가짐) 또는 뮤린 GM-CSF(예를 들어, 서열번호 57 또는 서열번호 58을 가짐)가 특히 바람직하다.

또한, 이러한 종양용해성 바이러스에 삽입될 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 코돈(들)을 변형시킴으로써 특정 숙주 세포 또는 대상체에서 높은 수준의 발현을 제공하도록 최적화될 수 있다. 코돈 사용의 최적화에 더하여, 농축된 영역에 존재하는 희귀하고 최적이 아닌 코돈의 클러스터링을 방지하고/하거나 발현 수준에 부정적인 영향을 미칠 것으로 예상되는 "부정적인" 서열 요소를 억제 또는 변형시키기 위해 다양한 변형이 예상될 수 있다. 이러한 부정적인 서열 요소는 매우 높은(> 80%) 또는 매우 낮은(<30%) GC 함량을 갖는 영역; AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 스트레치; 불안정적인 직접 또는 역 반복 서열; R A 2차 구조; 및/또는 내부 TATA-박스, 카이-사이트, 리보솜 진입 부위 및/또는 스플라이싱 공여자/수용자 부위와 같은 내부 비밀 조절 요소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

일부 실시형태에서, 뉴클레오티드 서열(들)은 숙주 세포 또는 대상체에서 적절한 발현을 위해 적절한 조절 요소의 제어 하에 배치된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 복제(replication), 중복(duplication), 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 발현 세포 내부 또는 외부에서의 수송을 포함하여 주어진 숙주 세포 또는 대상체에서 암호화 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 허용, 기여 또는 조절하는 임의의 요소를 지칭한다. 당업자는 조절 요소의 선택이 뉴클레오티드 서열 자체, 그것이 삽입되는 바이러스, 숙주 세포 또는 대상체, 원하는 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 프로모터가 특히 중요하다. 본 발명의 맥락에서, 그것은 많은 유형의 숙주 세포에서 제어하거나 특정 숙주 세포에 특이적으로 또는 특정 사건 또는 외인성 인자(예를 들어, 온도, 영양 첨가제, 호르몬 등)에 대한 반응으로 또는 바이러스 주기의 단계(예를 들어, 후기 또는 조기)에 따라서 조절되는 뉴클레오티드 서열의 구성적 지시 발현일 수 있다. 바이러스 매개 발현에 적합한 프로모터는 당업계에 공지되어있다. 종양용해성 폭스바이러스에 의한 발현의 대표적인 예는 백시니아 p7.5K, pH5.R, p11K7.5, TK, p28, p11, pB2R, pA35R, K1L 및 pSE/L 프로모터(문헌[Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28]; 문헌[Orubu et al. 2012, PloS One 7: e40167]), 초기/후기 키메라 프로모터 및 합성 프로모터(문헌[Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23: 1094-7]; 문헌[Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8]; 및 문헌[Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8])를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 각각 동일한 전사 강도를 갖는 프로모터(예를 들어, p7.5K, 예컨대, 서열번호 59에 기재된 것 또는 pH5.R, 예컨대, 서열번호 60에 기재된 것)의 제어 하에, 바람직하게는 동일한 프로모터의 제어 하에 배치되어 두 사슬에 대해 유사한 수준의 발현을 얻고, 따라서 이종-사량체 단백질로서 항체의 최적 어셈블리를 얻는다(즉, 비-연관 쇄의 과량을 회피한다). 추가 뉴클레오티드 서열(예를 들어, GM-CSF를 암호화함)은 다른 프로모터(예를 들어, 서열번호 61에 기재된 것과 같은 pSE/L) 아래에 배치될 수 있다.

이러한 종양용해성 바이러스의 게놈에 뉴클레오티드 서열(들)을 삽입하는 것은(가능하면 적절한 조절 요소가 장착됨)은 적절한 제한 효소를 사용하거나 바람직하게는 상동성 재조합에 의해 통상적인 수단에 의해 행해진다. 뉴클레오티드 서열(들)은 바이러스 게놈의 임의의 위치에 독립적으로 삽입될 수 있다. 다양한 삽입 부위, 예를 들어, 비-필수 바이러스 유전자, 유전자간 영역 또는 이러한 종양용해성 바이러스 게놈의 비-암호 부분 내가 고려될 수 있다. 특히 종양용해성 바이러스가 폭스바이러스(예를 들어, 종양용해성 백시니아 바이러스)인 경우 J2R 유전자좌 및/또는 I4L 유전자좌가 적합하다. 뉴클레오티드 서열(들)을 바이러스 게놈에 삽입하면 삽입 부위의 바이러스 유전자좌가 적어도 부분적으로 결실될 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 결실 또는 부분 결실은 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 유전자좌에 의해 암호화된 바이러스 유전자 산물의 발현을 억제하여 상기 바이러스 기능에 대해 결함이 있는 바이러스를 초래할 수 있다. 특히 바람직한 종양용해성 바이러스는 J2R 유전자좌에 삽입된 중쇄를 암호화하는 카세트, I4L 유전자좌에 삽입된 경쇄를 암호화하는 카세트를 포함하는 TK 및/또는 RR에 결함이 있는 백시니아 바이러스이다. 추가 GM-CSF 암호화 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 카세트는 바이러스 게놈의 다른 위치 또는 J2R 또는 I4L 유전자좌에 삽입될 수 있으며, I4L 유전자좌에서의 삽입이 바람직하다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 종양용해성 바이러스, 특히 종양용해성 폭스바이러스를 적합한 숙주 세포(생산자 세포) 내에서 생성시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 바이러스 게놈과, 5' 및 3'에서 측접된 삽입될 (가능하게는 조절 요소를 가짐) 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 전달 플라스미드 사이의 상동성 재조합의 하나 이상의 단계(들)를 포함하며, 바이러스 서열은 각각 삽입 부위의 상류 및 하류에 존재한다. 상기 전달 플라스미드는 일상적인 기술(예를 들어, 형질주입)에 의해 생성되고, 숙주 세포로 도입될 수 있다. 바이러스 게놈은 감염에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 각각의 측접 바이러스 서열의 크기는 뉴클레오티드 서열의 각 면에서 적어도 100 bp에서 최대 1500 bp까지 다양할 수 있다(바람직하게는 200 내지 550 bp, 더 바람직하게는 250 내지 500 bp). 이러한 종양용해성 바이러스를 생성시킬 수 있는 상동성 재조합은 바람직하게는 배양된 세포주(예를 들어, HeLa, Vero) 또는 발육란에서 얻은 닭 배아 섬유 아세포(chicken embryonic fibroblast: CEF) 세포에서 수행된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA4 암호화 뉴클레오티드 서열 및 가능한 추가 뉴클레오티드 서열(예를 들어, GM-CSF)을 혼입한 종양용해성 바이러스의 식별은 선택 및/또는 검출 가능한 유전자의 사용에 의해 촉진될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 전달 플라스미드는 선택적 배지(예를 들어, 마이코페놀산, 잔틴 및 하이포잔틴의 존재 하에) 또는 검출 가능한 유전자에서 성장을 허용하는 GPT 유전자(구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제를 암호화함)에 대한 특정 선호도를 갖는 선택 마커를 추가로 포함한다. 또한, 상기 선택 또는 검출 가능한 유전자에서 이중 가닥 절단을 제공할 수 있는 엔도뉴클레아제의 사용도 고려될 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 단백질 형태이거나 발현 벡터에 의해 발현될 수 있다.

일단 생성되면, 이러한 종양용해성 바이러스는 감염성 입자의 생성 및 회수를 허용하도록 적절한 조건 하에서 형질주입되거나 감염된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 통상적인 기술을 사용하여 적절한 숙주 세포 내에서 증폭될 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 종양용해성 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 방법은 a) 생산자 세포주를 제조하는 단계, b) 제조된 생산자 세포주에 종양용해성 바이러스를 형질주입 또는 감염시키는 단계, c) 형질주입되거나 감염된 생산자 세포주를 바이러스의 생산을 허용하기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, d) 상기 생산자 세포주의 배양물로부터 생산된 바이러스를 회수하는 단계, 선택적으로 e) 상기 회수된 바이러스를 정제하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 생산자 세포는 포유동물(예를 들어, 인간 또는 비인간) 세포, 예컨대, HeLa 세포(예를 들어, ATCC-CRM-CCL-2^TM 또는 ATCC-CCL-2.2^TM), HER96, PER-C6(문헌[Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17]), 햄스터 세포주, 예컨대, BHK-21(ATCC CCL-10) 등 및 조류 세포, 예컨대, 국제 특허 제WO2005/042728호, 제WO2006/108846호, 제WO2008/129058호, 제WO2010/130756, WO2012/001075호에 기재된 것 및 수정란에서 얻은 닭 배아로부터 제조된 1차 닭 배아 섬유 아세포(CEF)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 생산자 세포는 바람직하게는 필요한 경우 혈청 및/또는 적합한 성장 인자(들)가 보충될 수 있거나 보충되지 않을 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 바람직하게는 동물 또는 인간 유래 생성물이 없는 화학적으로 정의된 배지)에서 배양된다. 적절한 배지는 생산자 세포에 따라 당업자가 쉽게 선택할 수 있다. 이러한 배지는 상업적으로 입수 가능하다. 생산자 세포는 바람직하게는 감염전 1일 내지 8일 동안 +30℃ 내지 +38℃(더 바람직하게는 대략 +37℃)에 포함된 온도에서 배양된다. 필요한 경우 총 세포 수를 늘리기 위해 1 내지 8일 동안 여러 번 계대할 수 있다.

단계 b)에서, 생산자 세포를 생산자 세포의 생산적인 감염을 허용하기 위해 적절한 감염 다중도(multiplicity of infection: MOI)를 사용하여 적절한 조건에서 종양용해성 바이러스에 의해 감염시킨다. 예시 목적을 위해, 적절한 MOI는 10^-3 내지 20의 범위이며, 특히 바람직하게는 MOI는 0.01 내지 5, 보다 바람직하게는 0.03 내지 1을 포함한다. 감염 단계는 생산자 세포의 배양에 사용되는 배지와 동일하거나 상이할 수 있는 배지에서 수행된다.

단계 c)에서, 감염된 생산자 세포는 자손 바이러스 입자가 생산될 때까지 당업자에게 널리 공지된 적절한 조건 하에서 배양된다. 감염된 생산자 세포의 배양은 또한 바람직하게는 생산자 세포의 배양 및/또는 감염 단계에 사용되는 배지/배지와 동일하거나 상이할 수 있는 배지에서 +32℃ 내지 +37℃의 온도에서 1 내지 5일 동안 수행되는 것이 바람직하다.

단계 d)에서, 단계 c)에서 생산된 바이러스 입자는 배양 상청액 및/또는 생산자 세포로부터 수집된다. 생산자 세포로부터의 회수는 생산자 세포막을 파괴하여 바이러스의 해방을 허용하는 단계를 필요로 할 수 있다. 생산자 세포막의 파괴는 동결/해동, 저장성 용해, 초음파 처리, 미세 유동화, 고전단(고속으로도 불림) 균질화 또는 고압 균질화를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업자에게 널리 공지된 다양한 기술에 의해서 유도될 수 있다.

회수된 종양용해성 바이러스는 용량으로 분배되고 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용되기 전에 적어도 부분적으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 정화, 효소 처리(예를 들어, 엔도뉴클레아제, 프로테아제 등), 크로마토그래피 및 여과 단계를 비롯한 다양한 정제 단계 및 방법이 당업계에서 이용 가능하다. 적절한 방법이 당업계에 기재되어있다(예를 들어, WO2007/147528; WO2008/138533, WO2009/100521, WO2010/130753, WO2013/022764 참고).

일 실시형태에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 종양용해성 바이러스로 감염된 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 상기에서 논의된 종양용해성 바이러스와 같은 바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 비히클 및/또는 보조제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.

약제학적 조성물은 일부 실시형태에서, 그의 키메라 항원 T 세포 수용체를 암호화하는 서열의 일부로서 본 명세서에 기재된 부분 또는 완전한 항체 서열을 보유하는 CAR-T 세포의 형태일 수 있다.

본 발명은 또한 상기에서 논의된 CAR-T 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 비히클 및/또는 보조제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 항체 약물 접합체, 융합 단백질 등과 같은 약물의 다른 치료 양식 또는 "형상" 및 이러한 치료 양식을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.

본 명세서에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스, 세포 및/또는 약제학적 조성물은 항산화제 및/또는 완충제 및/또는 정균제, 및/또는 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수용성 및/또는 비수용성 멸균 주사 용액; 및/또는 현탁화제 및/또는 증점제를 포함할 수 있는 수성 및/또는 비수성 멸균 현탁액을 포함하는 비경구 투여에 적합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 세포 및/또는 약제학적 조성물은 단위 용량 또는 다회 용량 용기, 예를 들어 밀봉 앰플 및 바이알에 존재할 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동 건조(동결건조) 조건에서 저장될 수 있다.

즉석의 주입 용액 및 현탁액은 멸균 분말 및/또는 과립 및/또는 전술한 종류의 정제로부터 제조될 수 있다.

인간 환자에 대한 비경구 투여의 경우, 항-CTLA-4 항체 분자의 1일 투여량 수준은 일반적으로 1 mg/kg 환자 체중 내지 20 mg/kg일 것이거나, 또는 일부 경우에서는 단일 투여 또는 분할 투여로 심지어 100 mg/kg까지 투여될 수 있다. 더 낮은 투여량이 특별한 상황에서, 예를 들면 장기간 투여와 병용될 때 이용될 수 있다. 어떤 경우에서도 의사는 개별 환자에게 가장 적합할 실제 투여량을 결정할 것이며, 이것은 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 가변적일 것이다. 상기 투여량은 평균 경우의 예시이다. 물론, 더 높거나 더 낮은 투여량 범위가 장점이 되는 개별 사례가 존재할 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 있다.

전형적으로, 항체 분자를 포함하는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(또는 의약)은 항-CTLA-4 항체 분자를 약 2 mg/ml 내지 150 mg/ml, 또는 약 2 mg/ml 내지 200 mg/ml의 농도로 함유할 것이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 항-CTLA-4 항체 분자를 10 mg/ml의 농도로 함유할 것이다.

전형적으로, 약제학적 조성물(또는 의약)은 바이러스 및 정량 기술에 따라서 본 명세서에 기재된 종양용해성 바이러스를 대략 10³ to 10¹² vp(바이러스 입자), iu(감염성 단위) 또는 pfu(플라크-형성 단위)로 함유할 것이다. 샘플에 존재하는 pfu의 양은 허용 세포(예를 들어, CEF 또는 Vero 세포)의 감염 후 플라크의 수를 계산하여 플라크 형성 단위(pfu) 역가를 얻고, A260 흡광도를 측정하여 vp의 양을 얻고, 예를 들어, 항-바이러스 항체를 사용하여 정량적 면역형광에 의에서 iu의 양을 얻음으로써 결정될 수 있다. 일반적인 가이드로서, 종양용해성 폭스바이러스를 포함하는 약제학적 조성물에 적합한 개별 용량은 대략 10³ 내지 대략 10¹⁰ pfu, 이롭게는 대략 10³ pfu 내지 대략 10⁹ pfu, 바람직하게는 대략 10⁴ pfu 내지 대략 10⁸ pfu; 보다 바람직하게는 대략 10⁴ pfu 내지 대략 10⁷ pfu이다.

일반적으로, 인간에서, 본 명세서에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스, 세포 및/또는 약제학적 조성물의 경구 또는 비경구 투여가 바람직한 경로이며, 이는 가장 편리하다. 수의학적 사용을 위해서, 본 명세서에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스, 세포 및/또는 약제학적 조성물은 일반적인 수의학적 실시에 따라서 적합하게 허용 가능한 제형으로서 투여되고, 수의사는 특정 동물에 가장 적절할 투여 요법 및 투여 경로를 결정할 것이다. 따라서, 본 발명은 (상기 기재되고 추가로 하기에 기재된 바와 같이) 다양한 병태를 치료하는데 유효한 양의 본 발명의 항체 분자, 뉴클레오티드 서열 플라스미드, 바이러스 및/또는 세포를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스, 세포 및/또는 약제학적 조성물은 정맥내; 종양내; 근육내; 피하를 포함하는 군으로부터 선택된 경로에 의해서 전달되도록 개작된다. 투여는 단일 주사 또는 여러 번의 반복 주사의 형태일 수 있다(예를 들어 동일하거나 상이한 투여량, 동일하거나 상이한 경로, 동일하거나 상이한 투여 부위에서). 대략 10⁴, 5x10⁴, 10⁵, 5x10⁵, 10⁶, 5x10⁶, 10⁷, 5x10⁷, 10⁸, 5x10⁸, 10⁹, 5x10⁹ 또는 10¹⁰ pfu의 종양용해성 폭스바이러스(예를 들어, 본 명세서에 기재된 TK 및 RR-결함 백시니아 바이러스)가 종양내 투여에 특히 적합하다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 결합 모이어티의 약제학적으로 허용 가능한 산 또는 염기 부가염을 포함하는 본 명세서에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스, 세포 및/또는 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 상술된 염기 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 산 부가염을 제조하는데 사용된 산은 무독성 산 부가염, 즉 약리학적으로 허용 가능한 음이온을 함유하는 염, 예컨대 그중에서도 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로아이오다이드, 니트레이트, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 아세테이트, 락테이트, 시트레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 바이타르트레이트, 숙시네이트, 말레에이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 사카레이트, 벤조에이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트 [즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3 나프토에이트)]염을 형성하는 것이다. 약제학적으로 허용가능한 염기 부가염이 또한 본 발명에 따른 작용제의 약제학적으로 허용가능한 염 형태를 생성하는데 사용될 수도 있다. 본질적으로 산성인 본 작용제의 약제학적으로 허용 가능한 염기 염을 제조하는데 시약으로서 사용될 수 있는 화학 염기는 이러한 화합물과 무독성 염기 염을 형성하는 것이다. 이러한 무독성 염기염은 이에 제한되는 것은 아니나, 특히 이러한 약리학적으로 허용 가능한 양이온, 예컨대 알칼리 금속 양이온(예를 들어, 칼륨 및 나트륨) 및 알칼리토금속 양이온(예를 들어, 칼슘 및 마그네슘)으로부터 유래된 것, 암모늄 또는 수용성 아민 부가염, 예컨대, N-메틸글루카민-(메글루민), 및 저급 알칸올암모늄 및 약제학적으로 허용가능한 유기 아민의 다른 염기염을 포함한다. 본 명세서에 기재된 항체 분자, 뉴클레오티드 서열, 플라스미드, 바이러스 및/또는 세포는 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 이용 전에 적합한 담체에 재구성될 수 있다. 임의의 적합한 동결건조 방법(예를 들어, 분무 건조, 케이크 건조) 및/또는 재구성 기술을 이용할 수 있다. 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 항체 활성 손실(예를 들어, 통상적인 면역글로불린, IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 갖는 경향이 있음)을 야기할 수 있다는 점 및 이용 수준이 보상하기 위해 상향 조절되어야 할 수 있음을 당업자는 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 동결건조된(냉동 건조된) 폴리펩티드 결합 모이어티는 재수화될 때 이것의 활성(동결건조 이전)의 약 20% 이하, 또는 약 25% 이하, 또는 약 30% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하, 또는 약 45% 이하, 또는 약 50% 이하를 손실시킨다.

일부 실시형태에서, 바이러스 조성물은 생리학적 또는 약 염기성 pH(예를 들어, 대략 pH 7 내지 대략 pH 9, 특별하게 바람직하게는 pH는 7 내지 8.5, 더욱 특별하게는 8에 가까운 pH를 포함함)에서 적절하게 완충된다. 적절한 삼투압을 보장하기 위해 바이러스 조성물에 1가 염을 포함시키는 것이 또한 유익할 수 있다. 상기 1가 염은 특히 NaCl 및 KCl로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 상기 1가 염은 바람직하게는 10 내지 500 mM(예를 들어, 50 mM) 농도의 NaCl이다. 적합한 바이러스 조성물은 사카로스 50 g/L, NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM 및 소듐 글루타메이트 10 mM, pH8을 포함한다. 조성물은 또한 저온 저장 온도에서 종양용해성 바이러스를 보호하기 위한 동결보호제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 적합한 동결보호제는 비제한적으로 수크로스(또는 사카로스), 트레할로스, 말토스, 락토스, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을, 바람직하게는 0.5 내지 20% 농도(중량 g/부피 L, w/v로 지칭)로, 그리고 고분자량 중합체, 예컨대, 덱스트란 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다

본 명세서에 기재된 항-CTLA-4 항체 분자, 뉴클레오티드 서열 및 약제학적 조성물은 대상체에서 암의 치료에서 사용될 수 있다.

본 발명자들은 대상체가 포유동물 또는 비-포유동물일 수 있다는 것을 포함시킨다. 바람직하게, 포유동물 대상체는 인간이거나 비-포유동물, 예컨대 말 또는 소, 또는 양, 또는 돼지 또는 낙타 또는 개 또는 고양이이다. 가장 바람직하게, 포유동물 대상체는 인간이다.

"나타낸다"에, 본 발명자들은 대상체가 암 증상 및/또는 암 진단 마커를 나타내고/내거나 암 증상 및/또는 암 진단 마커는 측정 및/또는 평가 및/또는 정량될 수 있음을 포함한다.

암 증상 및 암 진단 마커가 무엇인지, 암 증상의 중증도의 감소 또는 증가, 또는 암 진단 마커의 감소 또는 증가 여부를 측정 및/또는 평가 및/또는 정량하는 방법뿐 아니라 이들 암 증상 및/또는 암 진단 마커가 암에 대한 예후를 형성하는데 이용될 수 있는 방법은 의학 분야의 당업자에게 손쉽게 명백해질 것이다.

암 치료는 종종 치료 과정으로서 투여되는데, 즉 치료제가 일정 기간에 걸쳐 투여된다. 치료 과정의 시간은 다수의 인자에 따라 달라질 수 있으며, 여기에는 투여되는 치료제의 유형, 치료되는 암의 유형, 치료되는 암의 중증도 및 대상체의 연령 및 건강 상태, 그중에서도 이유가 포함될 것이다.

"치료 중"이라는 것에, 본 발명자들은 대상체가 현재 치료 과정을 제공받는 중이고/거나 치료제를 수여받는 중이고/거나 치료제 과정을 제공받는 중인 것을 포함시킨다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료되는 암은 종양이다.

일부 실시형태에서, 암은 진행성 고형 종양, 흑색종 및 피부의 기타 악성 신생물, 활액 육종, 비소세포 폐암(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 방광암, 전립선암, 중피종, 난소암, 유방암, 신장세포 암, 간세포암종, 두경부암, 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

각각의 상기 기술된 암들은 익히 공지되어 있으며, 이들 암을 치료하는데 사용된 치료제와 마찬가지로 증상 및 암 진단 마커가 잘 설명되어 있다. 따라서, 상기 언급된 암 유형을 치료하는데 사용된 치료제, 암 진단 마커 및 증상은 의학 분야의 당업자에게 공지되어 있을 것이다.

다수의 암의 진단, 예후 및 진행에 대한 임상적 정의는 병기결정(staging)으로서 공지된 특정한 분류에 좌우된다. 이들 병기결정 시스템은 암의 진단 및/또는 예후 및/또는 진행의 요약을 제공하기 위해 다수의 상이한 암 진단 마커 및 암 증상을 수집 분석하는 작용을 한다. 종양학의 당업자는 병기결정 시스템을 이용하여 암의 진단 및/또는 예후 및/또는 진행을 평가하는 방법 및 이를 위해 어떤 암 진단 마커 및 암 증상이 이용되어야 하는지 알고 있을 것이다.

"암 병기결정"에, 단계 0, 단계 I, 단계 II, 단계 III 및 단계 IV를 포함하는 Rai 병기결정, 및/또는 단계 A, 단계 B, 및 단계 C를 포함하는 Binet 병기결정, 및/또는 단계 I, 단계 II, 단계 III 및 단계 IV를 포함하는, Ann Arbour 병기결정이 포함된다.

암은 세포의 형태에 이상을 야기시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 이러한 이상은 종종 특정 암에서 재현 가능하게 발생하는데, 이는 이러한 형태 변화를 검사하는 것이 (다르게는, 조직학적 검사로서 공지됨) 암의 진단 또는 예후에 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 세포의 형태를 검사하기 위해 샘플을 시각화하고 시각화를 위한 샘플을 준비하는 기술, 예를 들어 광학 현미경 또는 공초점 현미경이 당업계에 널리 공지되어 있다.

"조직학적 검사"에, 본 발명자들은 작고, 성숙한 림프구의 존재, 및/또는 세포질의 좁은 경계를 가진 작고 성숙한 림프구의 존재, 식별가능한 핵이 부족한 치밀한 핵을 가진 작고 성숙한 림프구의 존재, 및/또는 세포질의 좁은 경계를 갖고 식별가능한 핵이 부족한 치밀한 핵을 가진 작고 성숙한 림프구의 존재, 및/또는 비정형 세포 및/또는 절단된 세포 및/또는 전림프구의 존재를 포함한다.

암이 세포의 DNA에서의 돌연변이 결과로서, 세포 사멸을 피하거나, 제어할 수 없이 증식하는 세포를 초래할 수 있다는 점은 익히 공지되어 있다. 따라서, 이들 돌연변이를 검사하는 것(또한 세포유전학적 검사로도 공지됨)은 암의 진단 및/또는 예후를 평가하는데 유용한 도구가 될 수 있다. 이것의 예는 만성 림프구 백혈병의 특징인 염색체 위치 13q14.1의 결실이다. 세포에서 돌연변이를 검사하는 기술; 예를 들어, 형광 동소 혼성화(fluorescence in situ hybridization: FISH)가 당업계에 익히 공지되어 있다.

"세포유전학적 검사"에, 세포, 특히 염색체에서의 DNA의 검사가 포함된다. 세포유전학적 검사는 불응성 암 및/또는 재발된 암의 존재와 연관될 수 있는 DNA에서의 변화를 확인하는데 사용될 수 있다. 이는 하기를 포함한다: 염색체 13의 긴 아암에서 결실 및/또는 염색체 위치 13q14.1의 결실 및/또는 염색체 12의 세염색체증(trisomy), 및/또는 염색체 12의 긴 아암에서의 결실, 및/또는 염색체 11의 긴 아암에서의 결실, 및/또는 11q의 결실 및/또는 염색체 6의 긴 아암에서의 결실 및/또는 6q의 결실, 및/또는 염색체 17의 짧은 아암에서의 결실 및/또는 17p의 결실, 및/또는 t(11:14) 전위, 및/또는 (q13:q32) 전위, 및/또는 항원 유전자 수용체 재배열, 및/또는 BCL2 재배열, 및/또는 BCL6 재배열, 및/또는 t(14:18) 전위, 및/또는 t(11:14) 전위, 및/또는 (q13:q32) 전위, 및/또는 (3:v) 전위, 및/또는 (8:14) 전위, 및/또는 (8:v) 전위, 및/또는 t(11:14) 및 (q13:q32) 전위.

암 대상체는, 종종 신체에의 암의 부담 결과인 특정한 신체적 증상을 보인다. 이들 증상은 종종 동일한 암에서 재발하고, 따라서 질병의 진단 및/또는 예후 및/또는 진행의 특징일 수 있다. 의학 전문가는 어떤 신체적 증상이 어떤 암과 연관이 있는지, 및 이들 신체적 증상을 어떻게 평가하는 것이 질병의 진단 및/또는 예후 및/또는 진행과 상관 관계에 있을 수 있는지 이해할 것이다. "신체적 증상"에, 간비대 및/또는 비장비대가 포함된다.

도면의 간단한 설명

하기 실시예에서, 다음 도면이 참조된다:

도 1: 본 발명의 항체는 CTLA-4에 특이적으로 결합한다

항체는 인간 CD28 단백질이 아닌 인간 및 시노몰거스 CTLA-4에 결합하는 것으로 ELISA에 의해서 밝혀졌다. 2-C06(도 1a), 4-E-03(도 1b), 5-B07(도 1c)에 대한 결합을 Yervoy(도 1d)와 비교하였다.

도 2: hCTLA-4-형질주입된 세포에 대한 항-CTLA-4 mAb의 용량-의존적 결합

항-CTLA-4 mAb(도 2a 내지 도 2d)는 Yervoy(도 2e)와 유사한 CTLA-4-발현 293T 세포에 대한 강한 결합을 나타낸다.

도 3: 항-CTLA-4 mAb는 시험관내-활성화된 인간 CD4+ T 세포에 결합한다

말초 인간 혈액으로부터 얻은 CD4+ T 세포를 시험관내에서 자극시켰다. 항-CTLA-4 mAb의 결합(실선, 상단 줄)을 FACS에 의해서 분석하고, Yervoy(점선, 상단 줄) 및 상업적인 FACS 항체(하단 줄)와 비교하였다.

도 4: 시험관내-활성화된 CD4+ T 세포 상에서의 결합 차단

인간 시험관내-활성화된 CD4+ T 세포를 Alexa 647-표지된 항-CTLA-4 mAb(흑색선)로 염색하였다. 항체 결합은 rhCTLA-4-Fc 단백질(회색선)에 의해서 차단되었다.

도 5: 시험관내-활성화된 시노몰거스 CD4+ T 세포에 대한 결합

말초 시노몰거스 혈액으로부터 얻은 CD4+ T 세포를 시험관내에서 CD3/CD28 비드로 자극시켰다. 항-CTLA-4 mAb의 결합(실선, 상단 줄)을 FACS에 의해서 분석하고, Yervoy(점선, 상단 줄) 및 상업적인 FACS 항체(하단 줄)와 비교하였다.

도 6: 인간 및 시노몰거스 CTLA-4 단백질에 의한 세포 결합의 차단

293T-CTLA-4 세포를 Alexa 647-표지된 항-CTLA-4 mAb(흑색선)로 염색하였다. 항체 결합은 rhCTLA-4-Fc 단백질(밝은 회색선) 및 rcmCTLA-4-Fc 단백질(어두운 회색선)에 의해서 차단되었다.

도 7: 시노몰거스 CTLA-4를 발현하는 293T 세포에 대한 결합

293T 세포에 시노몰거스 CTLA-4를 일시적으로 형질주입시키고, 상이한 농도의 항-CTLA-4 mAb에 대한 결합을 FACS에 의해서 분석하였다.

도 8: 존재하는 인간/시노몰거스 PBMC에 대한 예측된 결합 결여

4-E03 - 뿐만 아니라 2-C06, 5-B07 및 2-F09(데이터 나타내지 않음)는 FACS에 의해서 분석된 바와 같이 인간(상단 줄) 및 시노몰거스(하단 줄) PBMC에서 상이한 세포 하위세트에 어떠한 비특이적 결합도 나타내지 않는다.

도 9: 직접 효능 활성의 예측된 결여

건강한 공여자로부터의 CFSE-표지된 CD4+ T 세포를 코팅된 항-CD3과 가용성 항-CTLA-4 mAb 또는 항-CD28로 자극시켰다. % 분열하는 세포(CFSElow CD25+ 세포)를 FACS에 의해서 3일 후에 결정하였다. (a) 하나의 대표적인 실험의 FACS 플롯 (b) 6명의 공여자의 그래프 요약.

도 10: CD80/CD86 차단 활성

항-CTLA-4 mAb는 ELISA에 의해서 나타난 바와 같이 리간드 CTLA-4에 대한 CD80(도 8a) 및 CD86(도 8b)의 결합을 차단한다.

도 11: 시험관내에서 기능성 리간드 차단

PBMC를 SEB와 적정 용량의 항-CTLA-4 항체로 자극시켰다. 상청액에서 분비된 IL-2의 양을 MSD에 의해 결정하였다. 이 도면에서, 6명 중 1명의 대표 기증자를 나타낸다.

도 12: 시험관내-활성화된 CD4+ T 세포 상에서의 ADCC 검정

10 μg/ml의 항-CTLA-4 mAb로 사전 옵소닌화된 건강한 공여자로부터의 시험관내 활성화된 CD4 + T 세포를 2:1 비율로 NK 세포(NK-92 세포주)와 공배양하였다. ADCC 활성을 하기에 기재된 바와 같은 FACS에 의해 평가하였다. 도면은 4 내지 8명의 공여자의 평균 + SD를 나타낸다.

도 13: CTLA-4는 종양 상주 Treg 세포에서 가장 높게 발현된다.

새로 절제된 난소 종양 및 혈액 샘플을 수술 환자로부터 얻었다. 복수는 상이한 암 징후를 가진 환자로부터 수집하였다. 이 환자 물질에 대한 CTLA 발현을 건강한 PBMC와 비교하였다. 종양 샘플을 다지고, 소화시켰다. 말초 혈액 단핵 세포를 원심분리에 의해 분리하였다. CTLA-4 발현은 CD4+CD25+CD127- Treg 세포, CD4+ 비-Treg 세포 및 CD8+ 효과기 T 세포에서 유세포 분석법에 의해 평가하였다. 데이터는 건강한 PBMC의 경우 n = 12, 복수의 경우 n = 20, 종양의 경우 n = 9, 환자 혈액의 경우 n = 5인 개별 환자/공여자를 나타낸다.

CTLA-4 발현은 또한 생체내에서 NOG 마우스에서 활성화된 후 이들 마우스의 비장으로부터 단리된 인간 T 세포에서 분석하였다(도 14 참조).

도 14: 항-CTLA-4 mAb는 생체내에서 Treg 고갈을 매개한다 .

인간 PBMC를 i.v.로 NOG 마우스에게 주사하였다. 약 2주 후, 비장을 채취하고, 인간 Treg 세포 및 CD8+ T에서 CTLA-4의 발현을 FACS로 분석하였다. NOG 마우스에서 단리된 비장 세포를 i.p.로 SCID 마우스에게 전달하였다. 1시간 후, 마우스를 CTLA-4 hIgG1 또는 대조군 mAb로 i.p.로 처리하였다. 24시간 후에 복강내 유체를 수집하고, 인간 T 세포 하위세트(14a: Treg 및 14b: CD8+ T 세포)의 빈도를 유세포 분석법에 의해 결정하였다.

도 15: 항-CTLA-4 항체의 특징을 요약한 표

도 16: 마우스 대리 항-CTLA-4 mAb의 특징규명

도 16 a 내지 도 16b: 차단 ELISA를 m5-B07로 수행하여 리간드 차단 특징을 평가하였다. 항체는 용량 의존적 방식으로 리간드 CTLA-4에 대한 도 16a) CD80 및 도 16b) CD86의 결합을 차단한다.

도 16c 내지 도 16d: 마우스 IgG2a 형식의 5-B07은 CT26 종양 모델에서 Treg 결실을 매개하였다. Balb/c 마우스에 1x10⁶개의 CT26 세포를 피하 주사하고, 치료를 약 7x7 mm의 종양 크기에서 시작하였다. 10 mg/kg 항체를 3회 주사한 후 종양 단일 세포 현탁액을 FACS에 의해서 면역 세포 함량에 대해 분석하였다. 도 16c: 리간드 차단 대리 항체 5-B07은 T reg 고갈을 유발한다. 이것은 도 16d에 도시된 바와 같은 CD8⁺/Treg T 세포 비율의 이동을 야기한다.

도 17: COPTG19384 및 COPTG19385의 생성

본 연구에 사용된 COPTG19384 및 COPTG19385의 개략도. COPTG19385는 p7.5K에 의해 지시되는 항-CTLA-4의 중쇄로 대체된 TK 유전자좌에서 J2R 유전자의 결실 및 p7.5K에 의해 지시되는 항-CTLA-4의 경쇄로 대체된 RR 유전자좌에서 I4L 유전자의 결실을 포함한다. COPTG19384는 p7.5K에 의해 지시되는 항-CTLA-4의 중쇄로 대체된 TK 유전자좌에서 J2R 유전자의 결실 및 p7.5K에 의해 지시되는 항-CTLA-4의 경쇄 및 pSE/L에 의해서 지시되는 GM-CSF로 대체된 RR 유전자좌에서 I4L 유전자의 결실을 포함한다.

도 18: COPTG19384로 감염된 CEF 세포의 상청액에서 4-E03 단클론성 항체의 발현 분석

a) 웨스턴 블롯에 의해: CEF 세포를 삼중으로 COPTG19384로 MOI 0.05로 감염시켰다. 세포 상청액을 48시간 후에 수거하고, 비-환원 조건에서 전기영동 후 WB로, 항-Ig(왼쪽 블롯) 또는 항-경쇄(오른쪽 블롯) HRP 접합된 항체를 사용하여 분석하였다.

b) ELISA에 의해: CEF 세포를 삼중으로 COPTG19384 또는 VVTG17137로 MOI 0.05로 감염시켰다. 세포 상청액을 48시간 후 수거하고, 4-E03 단클론성 항체의 검출에 대해서 ELISA로 분석하였다.

도 19: ELISA에 의한 COPTG19384로 감염된 CEF 세포의 상청액에서 GM-CSF의 발현 분석

CEF 세포를 삼중으로 COPTG19384 1차 연구 스톡 또는 VVTG17137로 MOI 0.05로 감염시켰다. 세포 상청액을 48시간 후 수거하고, GM-CSF의 검출에 대해서 ELISA로 분석하였다.

도 20: 정상 및 종양 간세포에서 COP WT, COPTG19384(2개의 배치) 및 VVTG17137(2개의 배치)의 복제 연구

a) 정상 인간 간세포에서 복제율.

b) 악성 HepG2에서 복제율.

c) HepG2 및 간세포에서 측정된 복제율로부터 계산된 치료 지수.

도 21: 재구성된 인간 피부에서 COPTG19384 및 VVTG17137의 복제

COPTG19384 및 VVTG17137의 복제를 7일 후에 평가하고, 10에서 10⁵ pfu까지 다양한 접종물로 평가하였다. 결과는 3개의 측정치의 평균 및 SEM이다.

도 22: 3개의 인간 종양 세포주에서 COPTG19384 및 VVTG17137의 종양용해성 활성: MIA PaCa-2 (a), LoVo (b) 및 HepG2 (c)

도 23: (a) 감염된 HepG2 및 LoVo의 상청액 및 (b) 5개의 상이한 감염된 인간 종양 세포주의 상청액에서 4-E03 단클론성 항체 및 GM-CSF 둘 다의 발현 수준

a) 4-E03 및 GM-CSF 발현 수준을 접종 5일 후에, COPTG19384의 경우 10^-5 내지 10^-2의 MOI에서, 그리고 음성 대조군으로 사용된 VVTG17137의 경우 10^-2에서 평가하였다.

b) 4-E03 및 GM-CSF 발현 수준을 MOI 0.05의 COPTG19384로의 감염 48시간 후 평가하였다.

도 24: CTLA-4 단백질에 대한 4-E03의 상이한 배치의 결합

(a) 인간 및 (b) 시노몰거스 재조합 단백질에 대한 CHO(4-E03 연구 배치) 또는 HEK(4-E03 tox 배치) 세포에 의해서 재조합 방식으로 생산된 4-E03의 결합을, ELISA에 의해서, 감염된 MIA PaCa-2 종양 세포(4-E03 TG)의 상청액으로부터 정제된 4-E03의 결합과 비교하였다.

도 25: CTLA-4 발현 세포에 대한 4-E03의 상이한 배치의 결합

(a) 인간 및 (b) 시노몰거스 CTLA-4 발현 세포에 대한 CHO(4-E03 연구 배치) 또는 HEK(4-E03 tox 배치) 세포에 의해서 재조합 방식으로 생산된 4-E03의 결합을, 유세포 분석법에 의해서, 감염된 MIA PaCa-2 종양 세포(4-E03 TG)의 상청액으로부터 정제된 4-E03의 결합과 비교하였다.

도 26: LoVo 이종이식된 종양에서 바이러스 축적의 동태

바이러스 축적의 동태를, 2개의 상이한 용량(10⁴ 또는 10⁵ pfu)의 COPTG19384 또는 VVTG17137로의 단일 i.t. 주사 후에 LoVo 이종이식된 종양에서 평가하였다. 실선 또는 파선은 각각의 시간 지점에서 결정된 3개의 값의 평균을 나타낸다.

도 27: LoVo 이종이식된 종양에서 4-E03 mAb 및 GM-CSF 축적의 동태

a) LoVo 이종이식된 종양에서 4-E03 mAb 축적의 동태를, 2개의 상이한 용량(10⁴ 또는 10⁵ pfu)의 COPTG19384 또는 VVTG17137로의 단일 i.t. 주사 후에 또는 3 mg/kg의 4-E03 단클론성 항체의 단일 i.p. 주사 후에 평가하였다. 실선 또는 파선은 3개의 값의 평균을 나타낸다.

b) LoVo 이종이식 종양에서 바이러스 축적의 동태를, 2개의 상이한 용량(10⁴ 또는 10⁵ pfu)의 COPTG19384 또는 VVTG17137(10⁵ pfu)로의 단일 i.t. 주사 후에 평가하였다. 실선은 각각의 시간 지점에서 결정된 3개의 값의 평균을 나타낸다.

도 28: LoVo 이종이식된 마우스의 혈청에서 4-E03 mAb 및 GM-CSF 농도의 동태

a) 혈청에서 4-E03 mAb 농도의 동태를, LoVo 이종이식된 종양에서 2개의 상이한 용량(10⁴ 또는 10⁵ pfu)의 COPTG19384 또는 VVTG17137로의 단일 i.t. 주사 후에 또는 3 mg/kg의 4-E03 단클론성 항체의 단일 i.p. 주사 후에 평가하였다. 실선은 3개의 값의 평균을 나타낸다.

b) LoVo 이종이식 종양에서 2개의 상이한 용량(10⁴ 또는 10⁵ pfu)의 COPTG19384 또는 VVTG17137(10⁵ pfu)로의 단일 i.t. 주사 후 혈청에서 바이러스 농도의 동태. 파선은 각각의 시간 지점에서 결정된 3개의 값의 평균을 나타낸다.

도 29: CT26 종양에서 바이러스 축적의 동태

10⁷ pfu/주사의 VVTG18058, COPTG19421 또는 COPTG19407의 3회의 i.t. 주사(D0, D2 및 D4) 후 CT26 종양에서 바이러스 축적의 동태.

도 30: CT26 종양에서 m5-B07 mAb 및 mGM-CSF 축적의 동태

a) VVTG18058, COPTG19421 또는 COPTG19407(10⁷ pfu/주사)의 3회의 i.t. 주사 동안 또는 주사 후 또는 3 mg/kg의 m5-B07 단클론성 항체의 단일 i.p. 주사 후 CT26 종양에서 m5-B07 mAb 농도의 동태. 실선은 3개의 값의 평균을 나타낸다.

b) VVTG18058, COPTG19421 또는 COPTG19407(10⁷ pfu/주사)의 3회의 i.t. 주사 동안 또는 주사 후 또는 3 mg/kg의 m5-B07 단클론성 항체의 단일 i.p. 주사 후 CT26 종양에서 GM-CSF 농도의 동태. 실선은 각각의 시간 지점에서 결정된 3개의 값의 평균을 나타낸다.

도 31: CT26 모델의 혈청에서 m5-B07 mAb 농도의 동태

CT26 종양에서 VVTG18058, COPTG19421 또는 COPTG19407(10⁷ pfu/주사)의 3회의 i.t. 주사 후 또는 3 mg/kg의 m5-B07 단클론성 항체의 단일 i.p. 주사 후 혈청에서 m5-B07 mAb 농도의 동태. 실선은 각각의 시간 지점에서 결정된 3개의 값의 평균을 나타낸다.

도 32: CT26 모델에서의 항종양 활성: CT26 종양 성장 (a) 및 마우스 생존 (b)에 대한 COPTG19347 +/- 항-PD1의 효과

CT26 세포를 D-7에 BalB/c 마우스에게 SC로 주사하였다. COPTG19347(10⁷ pfu), VVTG18058(10⁷ pfu), VVTG18058 또는 완충액을 D0, D2 및 D4에 IT로 주사하였고, 가능하면, 그 다음 250 μg/마우스의 항-PD1 RMPI-14를 D7, D10, D14, D17 및 D21에 i.p.로 주사하였다.

도 33: CT26 모델에서 용량-효과 평가(COPTG19407, COPTG19421 및 VVTG18058)

도 34: CT26 종양 모델에서 VVTG18058과 m5-B07와 비교한 COPTG19407의 항-종양 활성

CT26 세포를 Balb/C 마우스에 s.c.로 주사하였다. 종양이 대략 100 mm³에 도달했을 때 마우스의 처리를 시작하였다. 마우스에게 D0, D2 및 D5에 COPTG19407(8.5x10⁶ pfu i.t.), VVTG18058(8.5x10⁶ pfu i.t.), m5-B07(10 mg/kg i.p.) 또는 VVTG18058(8.5x10⁶ pfu i.t.)와 m5-B07(10 mg/kg i.p.)를 주사하였다. 도 30a 내지 도 30d: 종양 성장 및 도 16e: 생존을 시간에 따라서 추적하였다.

도 35: 피하 A20 종양 보유 BALB/c 마우스의 개별 종양 부피 곡선.

A20 세포를 Balb/C 마우스에 s.c.로 주사하였다. 종양이 대략 80 내지 100 mm³에 도달했을 때 마우스의 처리를 시작하였다. 마우스에게 D0, D2 및 D4에 비히클(i.t), COPTG19407(4.75x10⁶ pfu i.t.), VVTG18058(4.75x10⁶ pfu i.t.), RMP1-14(항-mPD-1)(250 μg/마우스 i.p.) 또는 COPTG19407(4.75x10⁶ pfu i.t.)과 RMP1-14(250 μg/마우스 i.p.)의 조합물을 주사하였다.

a) 군 1 비히클로 처리된 동물

b) 군 2 VVTG18058로 처리된 동물

c) 군 3 COPTG19407로 처리된 동물

d) 군 4 뮤린 항-PD1로 처리된 동물

e) 군 5 COPTG19407 및 뮤린 항-PD1로 처리된 동물

도 36: 피하 A20 종양 보유 BALB/cN 마우스의 평균 종양 부피 곡선.

각각의 지점은 군당 기록된 종양 부피의 평균을 나타낸다. 모든 동물의 종양 부피를 64일에 걸쳐서 모니터링하였다. 마우스를 비히클(군 1), VVTG18058(군 2), COPTG19407(군 3), 뮤린 항-PD1 항체 RMP1-14(BioXCell)(군 4) 및 COPTG19407 및 RMP1-14(군 5)로 처리하였다. 동물을 D7에 무작위화하고, D7 내지 D31의 기간 동안 처리하였다. 마지막 마우스를 D61에 희생시켰다.

도 37: A20 모델에서의 항종양 활성: A20 종양 성장 (a) 및 마우스 생존 (b)에 대한 COPTG19407 +/- 항-PD1의 효과

A20 세포를 Balb/C 마우스에 s.c.로 주사하였다. 종양이 대략 80 내지 100 mm³에 도달했을 때 마우스의 처리를 시작하였다. 마우스를 비히클 (i.t.)(군 1), 항-PD-1(군 2), 아이소타입(군 3), VVTG18058(10⁵ pfu i.t.)(군 4), VVTG18058 (10⁵ pfu i.t.) + 아이소타입(군 5), VVTG18058(10⁵ pfu i.t.) + 항-PD-1(군 6), VVTG19407(10⁵ pfu i.t.)(군 7), VVTG19407(10⁵ pfu i.t.) + 아이소타입(군 8) 및 VVTG19407(10⁵ pfu i.t.) + 항-PD-1(군 9)로 처리하였다.

도 38: 피하 C38 종양 보유 C57BL/6 마우스의 개별 종양 부피 곡선.

C38 세포를 C57bl/6 마우스에 s.c.로 주사하였다. 종양이 대략 80 내지 100 mm³에 도달했을 때 마우스의 처리를 시작하였다. 마우스에게 D0, D2 및 D4에 비히클(i.t), COPTG19407(4.75x10⁶ pfu i.t.), VVTG18058(4.75x10⁶ pfu i.t.), RMP1-14(항-mPD-1)(250 μg/마우스 i.p.) 또는 COPTG19407(4.75x10⁶ pfu i.t.)과 RMP1-14(250 μg/마우스 i.p.)의 조합물을 주사하였다.

a) 군 1 비히클로 처리된 동물

b) 군 2 VVTG18058로 처리된 동물

c) 군 3 COPTG19407로 처리된 동물

d) 군 4 뮤린 항-PD1로 처리된 동물

e) 군 5 COPTG19407 및 뮤린 항-PD1로 처리된 동물

도 39: 피하 C38 종양 보유 C57BL/6 마우스의 평균 종양 부피 곡선.

각각의 지점은 군당 기록된 종양 부피의 평균을 나타낸다. 모든 동물의 종양 부피를 61일에 걸쳐서 모니터링하였다. 마우스를 비히클(군 1), VVTG18058(군 2), COPTG19407(군 3), 뮤린 항-PD1 항체 RMP1-14(BioXCell)(군 4) 및 COPTG19407 및 RMP1-14(군 5)로 처리하였다. 동물을 D7에 무작위화하고, D7 내지 D31의 기간 동안 처리하였다. 마지막 마우스를 D61에 희생시켰다.

도 40: 피하 EMT6 종양 보유 BALB/c 마우스의 개별 종양 부피 곡선.

EMT6 세포를 Balb/C 마우스에 s.c.로 주사하였다. 종양이 대략 80 내지 100 mm³에 도달했을 때 마우스의 처리를 시작하였다. 마우스에게 D0, D2 및 D4에 비히클(i.t), COPTG19407(4.75x10⁶ pfu i.t.), VVTG18058(4.75x10⁶ pfu i.t.), RMP1-14(항-mPD-1)(250 μg/마우스 i.p.) 또는 COPTG19407(4.75x10⁶ pfu i.t.)과 RMP1-14(250 μg/마우스 i.p.)의 조합물을 주사하였다.

a) 군 1 비히클로 처리된 동물

b) 군 2 VVTG18058로 처리된 동물

c) 군 3 COPTG19407로 처리된 동물

d) 군 4 뮤린 항-PD1로 처리된 동물

e) 군 5 COPTG19407 및 뮤린 항-PD1로 처리된 동물

도 41: 피하 EMT6 종양 보유 BALB/c 마우스의 평균 종양 부피 곡선.

각각의 지점은 군당 기록된 종양 부피의 평균을 나타낸다. 모든 동물의 종양 부피를 61일에 걸쳐서 모니터링하였다. 마우스를 비히클(군 1), VVTG18058(군 2), COPTG19407(군 3), 뮤린 항-PD1 항체 RMP1-14(BioXCell)(군 4) 및 COPTG19407 및 RMP1-14(군 5)로 처리하였다. 동물을 D7에 무작위화하고, D7 내지 D31의 기간 동안 처리하였다. 마지막 마우스를 D56에 희생시켰다. 마우스의 20% 초과의 사망 후에 곡선을 중단하였다.

실시예

본 발명의 특정 관점을 구현하는 특정한 비제한적인 실시예를 이제 기술할 것이다. 실시예에서, rh 단백질은 인간 재조합 단백질을 나타내고(예를 들어, rhIL-2는 인간 재조합 IL-2 단백질을 나타내고), rcm 단백질은 시노몰거스 재조합 단백질을 나타내고(예를 들어, rcmCTLA4는 시노몰거스 재조합 CTLA-4 단백질을 나타낸다).

상기에 언급된 서열에 더하여, 일부 추가 서열을 본 실시예에서 사용하는데, 이것은 하기 표 5에 언급되어 있다.

실시예 1 - CTLA-4 특이적 항체의 생성

scFv 항체 단편의 단리

n-CoDeR^® scFv 라이브러리(BioInvent; Soderlind E, et al Nat Biotechnol. 2000;18(8):852-6)를 사용하여 인간 CTLA-4를 인식하는 scFv 항체 단편을 단리하였다.

파지 라이브러리를 재조합 인간 단백질에 대한 3회의 연속적인 패닝에 사용하였다. 파지 인큐베이션 후, 세포를 세척하여 비결합된 파지를 제거하였다. 결합 파지를 트립신으로 용리시키고, 이.콜라이에서 증폭시켰다. 생성된 파지 스톡을 scFv 포맷으로 전환시켰다. 이.콜라이를 scFv 보유 플라스미드로 형질전환시키고, 개별 scFv 클론을 발현시켰다.

고유한 CTLA-4 결합 scFv의 식별

제3 패닝으로부터의 전환된 scFv를 인간 CTLA-4 또는 비-표적 단백질을 발현하는 형질주입된 293 FT 세포에 대한 결합에 대해서 균질 FMAT 분석(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 분석하였다.

약술하자면, 형질주입된 세포를 발현 플레이트로부터의 scFv-함유 상청액(1:7 희석됨), 마우스 항-His Tag 항체(0.4 μg/ml; R&D Systems) 및 APC-접합된 염소 항-마우스 항체(0.2 μg/ml; 카탈로그 번호 115-136-146, Jackson Immunoresearch)과 함께, 투명-바닥 플레이트에 첨가하였다. FMAT 플레이트를 실온(대략 20 내지 25℃)에서 9시간 동안 인큐베이션시킨 후, 판독하였다. 표적-특이적 박테리아 클론을 활성물질로서 분류하였고, 체리를 96-웰 플레이트에서 선택하였다.

ELISA에서 CTLA-4에 대한 IgG 결합

96-웰 플레이트(Lumitrac 600 LIA 플레이트, Greiner)를 밤새 4℃에서 1 pmol/웰의 재조합 인간 CTLA-4-Fc 단백질(R&D Systems)로, 1 pmol/웰의 재조합 시노몰거스(cm) CTLA-4-Fc 단백질(R&D Systems), 0.3 pmol/웰의 재조합 마우스 CTLA-4-Fc 단백질(R&D Systems), 1 pmol/웰의 재조합 인간 CD28-Fc 단백질(R&D Systems) 또는 0.3 pmol/웰의 재조합 마우스 CD28-Fc 단백질(R&D Systems)로 코팅하였다. 세척 후, 0 μg/ml 내지 0.06 ng/ml(66 nM 내지 0.3 pM)의 적정 용량의 항-CTLA-4 mAb를 1시간 동안 결합시켰다. 플레이트를 다시 세척하고 결합된 항체를 50 ng/ml로 희석된 항-인간-F(ab)-HRP 2차 항체(Jackson ImmunoResearch)로 검출하였다. Super Signal ELISA Pico(Thermo Scientific)를 기질로 사용하고, Tecan Ultra Microplate 판독기를 사용하여 플레이트를 분석하였다.

모든 항체는 인간 및 시노몰거스 CTLA-4 단백질에 결합하는 것으로 나타났지만 ELISA에 의해 검정된 인간 CD28 단백질에는 결합하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 5-B07은 마우스 CTLA-4에는 결합하지만 마우스 CD28에는 결합하지 않는 것으로 나타났다(도 1 참조).

유세포 분석법에서 CTLA-4-발현 293T 세포에 대한 IgG 결합

전환된 IgG 클론을 CTLA-4-발현 293T 세포(Crownbio에서 구입)에 대한 결합에 대해 분석하였다. 세포를 20분 동안 4℃에서 상이한 농도의 항-CTLA-4 mAb(도 2에 제시된 바와 같음)와 함께 인큐베이션시킨 후, 세척하고, APC-표지된 염소 항-인간 2차 항체(카탈로그 번호 109-136-088, Jackson ImmunoResearch)로 염색하였다. Fixable Viability Dye eFluor780(eBiosciences)을 사용한 분석으로부터 죽은 세포를 제외시켰다. 데이터 수집은 FACSVerse(BD Biosciences, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크사)에서 수행하였고, FlowJo 소프트웨어(Tree Star, 미국 오레곤주 애쉬랜드 소재)로 분석하였다.

항-CTLA-4 mAb는 Yervoy와 유사한 EC50 값으로 용량 의존적 방식으로 인간 CTLA-4 발현 293T 세포에 결합하는 것으로 나타났다(도 2).

인간 CTLA-4가 안정적으로 형질주입된 293T 세포, 시노몰거스 CTLA-4가 일시적으로 형질주입된 293T 세포, 미경험 인간 또는 시노몰거스 PBMC, 시험관내 활성화된 인간 또는 cyno CD4+ T 세포를 제시된 농도의 항-CTLA-4 mAb와 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이션시키고, 그 다음 세척하고, APC-표지된 항-인간 2차 항체(Jackson ImmunoResearch)로 염색하였다.

실시예 2 - 항-CTLA-4 mAb는 인간 및 시노몰거스 CTLA-4-발현(1차) 세포에 특이적으로 결합한다.

CTLA-4 특이적 mAb는 건강한 공여자로부터 단리된 미경험 PBMC가 아니라 1차 인간 및 시노몰거스 시험관내-활성화된 CD4+ T 세포에 결합한다.

PBMC를 버피 코트로부터 단리하였다. 약술하자면, 버피를 PBS에서 1:3으로 희석하고, Ficoll-Paque Plus(Amersham) 쿠션에 로딩하였다. 샘플을 20℃에서 20분 동안 800xg에서 원심분리하였다. 상부, 혈장-함유 상을 제거하고, 단핵 세포를 혈장/Ficoll 간기에서 뚜렷한 흰색 밴드로부터 단리하였다.

인간 말초 CD4⁺ T-세포를 MACS CD4 T-세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 음성 선택에 의해 정제하였다. CD4+ T 세포를 R10 배지(2 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트, 100 IU/ml 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI) 및 10% FBS(Life Technologies의 GIBCO) 중에서 CD3/CD28 dynabeads(Life Technologies)와 50 ng/ml rhIL-2(R&D Systems)를 사용하여 시험관내에서 3일 동안 활성화하여 CTLA-4 발현을 상향조절하였다. 시노몰거스 CD4 + T 세포를 비인간 CD4 마이크로비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 단리하고, 50 ng/ml PMA(Sigma-Aldrich) 및 100 ng/ml Ionomycin(Sigma-Aldrich)과 함께 3일 동안 인큐베이션시켰다.

미경험 인간 또는 시노몰거스 PBMC, 시험관내 활성화된 인간 또는 cyno CD4+ T 세포를 제시된 농도의 항-CTLA-4 mAb와 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이션시키고, 그 다음 세척하고, APC-표지된 항-인간 2차 항체(Jackson ImmunoResearch)로 염색하였다. 항-CTLA-4 mAb의 결합을 BD FACS Verse를 사용하여 FACS로 분석하였다.

항체는 시험관내 활성화된 인간(도 3) 및 시노몰거스(도 5) CD4+ T 세포에 결합하는 것으로 나타났지만 휴지기 PBMC에는 결합하지 않았다(도 8). 내인성 CTLA-4 발현 T 세포에 대한 결합은 Yervoy(도 3, 상단 줄, 점선)를 사용한 염색과 유사하며 양성 대조군으로서 BD Biosciences의 시판 항-CTLA-4 FACS 항체 (클론 BNI3; 도 3, 하단 줄)와 유사하다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 인간 시험관내-활성화된 CD4+ T 세포(흑색선)의 염색은 rhCTLA-4-Fc(회색선)에 의해 완전히 차단될 수 있는데, 이는 항체의 특이성을 입증한다. 이러한 경쟁 결합 검석에서 2 μg/ml Alexa 647-표지된 항-CTLA-4 mAb를 재조합 인간 CTLA-4-Fc 단백질(50 μg/ml)과 혼합하고, 그 다음 CTLA-4 발현 세포와 함께 인큐베이션시켰다. IgG 결합을 FACS에 의해 검출하였다.

인간 및 시노몰거스 CTLA-4를 발현하는 형질주입된 293T 세포는 시험된 항체의 시노교차반응성(cynocrossreactivity)을 확인해준다.

항체의 시노-교차 반응성을 형질주입된 CTLA-4 발현 293T 세포에서 추가로 확인하였다.

도 6에서 입증된 바와 같이, 인간 CTLA-4 발현 형질주입된 세포에 대한 CTLA-4 특이적 항체의 결합을 인간 및 시노몰거스 재조합 단백질(둘 다 R&D Systems)에 의해 저해될 수 있다. 항체는 또한 시노몰거스 CTLA-4를 발현하는 형질주입된 세포에 결합하는 것으로 나타났다(도 7, 상단 줄). 이 결합은 시노몰거스 재조합 단백질(하단 줄, 회색선)에 의해 다시 차단될 수 있다.

도 4와 관련하여 실시예 2에서 상기에 설명된 경쟁 검정과 유사하게 실험을 수행하였다.

직접 효능 활성의 예측된 결여

(예를 들어, 비특이적 결합으로 인한) 예상치 못한 직접 효능 활성을 배제하기 위해 시험관내 증식 검정을 수행하였다.

인간 말초 CD4+ T-세포를 건강한 PBMC에서 MACS CD4 T-세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 음성 선택에 의해 정제하였고, 그 후 CFSE(2 μM, Molecular Probes)로 표지하였다. 항체를 F(ab')₂ 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 또는 F(ab')₂ 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 단편 특이적과 IgG:F(ab')₂ = 1.5:1 몰비로 1시간 동안 RT에서 교차 결합시켰다. 1x10⁵개의 정제된 인간 CD4+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3(0.5 μg/ml; 클론 UCHT1, R&D Systems) 및 4 μg/ml의 가용성, 교차 결합된 항-CTLA-4 또는 교차 결합된 항-CD28(클론 CD28.2, BioLegend)으로 37℃에서 72시간 동안 자극시켰다. 세포를 세척하고, BV421-접합된 항-CD25 항체(클론 M-A251, BD Biosciences)로 염색하였다. CD25+/CFSElow 분열 세포의 백분율을 FACS에 의해 분석하였다.

도 9는 시험된 항-CTLA-4 mAb 중 어느 것도 항-CD28 자극과 대조적으로 T 세포 증식을 유도하지 않음을 입증한다.

실시예 3 - 항-CTLA-4 mAb는 CD80/CD86의 결합 리간드를 차단한다

리간드 차단 ELISA

항-CTLA-4 IgG의 리간드 차단 활성을 ELISA에 의해 평가하였다. 이를 위해, 재조합 인간 CTLA-4-Fc 단백질(R&D Systems)을 96웰 플레이트(Lumitrac 600 LIA 플레이트, Greiner)에 1 pmol/웰로 코팅하였다. 세척 후, 적정 용량의 항-CTLA-4 mAb를 1시간 동안 결합시켰다. His-태그 된 리간드를 각각 200 nM 및 100 nM(rhCD80 및 rhCD86; R&D Systems)에 첨가하고 플레이트를 15분 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 리간드를 HRP 표지된 항-His 항체(R&D Systems)로 검출하였다. Super Signal ELISA Pico(Thermo Scientific)를 기질로 사용하고, Tecan Ultra Microplate 판독기를 사용하여 플레이트를 분석하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 시험된 항-CTLA-4 항체는 Yervoy와 유사한 리간드 차단 활성을 나타낸다.

시험관내에서 기능성 리간드 차단

SEB PBMC 검정을 위해, 건강한 공여자의 총 PBMC를 96웰 플레이트(1x10⁵개 세포/웰)에 시딩하고, 적정 용량의 항-CTLA-4 IgG의 존재 하에서 1 μg/ml 스타필로코커스 장독소 B(SEB, Sigma Aldrich)로 자극하였다. IL-2 분비를 제조업체의 지침에 따라 제3일에 MSD(Mesoscale)로 측정하였다.

항체 4-E03 및 2-C06은 IL-2 생산을 향상시키는 것으로 나타났으며 그들의 효능은 Yervoy와 유사한 것으로 나타났다. 도 11에서, 6명 중 1명의 대표 기증자를 나타낸다.

실시예 4 - 항-CTLA-4 mAb는 CTLA-4 발현 세포를 시험관내 및 생체내에서 고갈시킨다.

항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)

GFP와 함께 CD16-158V 대립유전자를 발현시키기 위해 안정적으로 형질주입된 NK-92 세포주를 사용하여 ADCC 검정을 수행하였다(Conkwest에서 구입, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재; 문헌[Binyamin, L., et al., 2008, Blocking NK cell inhibitory self-recognition promotes antibody-dependent cellular cytotoxicity in a model of anti-lymphoma therapy. Journal of immunology 180, 6392-6401]). CD4+ T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 건강한 기증자의 말초 혈액에서 CD4+ 표적 T 세포를 단리하였다. 세포를 37℃에서 CD3/CD28 dynabeads(Life Technologies, Thermo Fisher) 및 50 ng/ml의 rhIL-2(R&D Systems)로 48시간 동안 자극시켰다. 표적 세포를 NK 세포와 혼합하기 전에 4℃에서 30분 동안 10 μg/ml의 mAb와 함께 사전 인큐베이션시켰다. 세포를 2:1 효과기:표적 세포 비율로 10 mM HEPES 완충액, 1 mM 피루브산 나트륨 및 10% FBS 저 IgG를 함유하는 RPMI 1640 + GlutaMAX 배지(Invitrogen)에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 유세포 분석법에 의해서 용해를 결정하였다. 약술하자면, 인큐베이션 이후에, 세포 현탁액을 10 nM SYTOX Red dead cell stain(Invitrogen) 또는 Fixable Viability Dye eFluor780(eBioscience)과 함께 BV510-접합된 항-CD4(클론 RPA-T4, BD Biosciences)으로 암실에서 4℃에서 20분 동안 염색하고, 이어서 세포를 FACSVerse(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.

4-E03은 Yervoy와 비교하여 시험관내에서 CTLA-4+ T 세포의 현저하게 개선된 결실을 나타내었다(도 12).

1차 환자 물질에 대한 CTLA-4 발현

항-CTLA-4 mAb의 고갈 활성에 대한 상기 결과의 번역 가능성을 검증하기 위해 CTLA-4 발현을 1차 환자 물질에서 조사하였다.

임상 샘플 사용에 대한 윤리적 승인은 Skane University Hospital의 윤리위원회에서 얻었다. 헬싱키 선언에 따라 사전 동의가 제공되었다. 샘플을 Lund의 Skanes University Hospital의 부인과 및 종양학과를 통해 얻었다. 복수액을 단리된 단일 세포 현탁액으로 평가하였다. 종양 물질을 작은 조각으로 자르고, DNase I(Sigma Aldrich) 및 Liberase^TM(Roche Diagnostics)와 함께 R10에서 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 남아있는 조직을 기계적으로 파손시키고, 세포 현탁액과 함께 70 μm 세포 스트레이너에 통과시켰다. 복수액 및 종양으로부터 단리된 세포를 염색하였다. 다양한 T 세포 하위세트를 식별하기 위해, 다음 항체를 사용하였다: CD4-BV510(RPA-T4), CD25-BV421(M-A251), 항-CD127-FITC(HIL-7R-M21), CTLA-4-PE(BNI3), CD8-PeCy7(RPA-T8), CD3-APC(UCHT1), CD45-PercP-Cy5.5(HI30), 마우스 IgG2a 아이소타입, κ 대조군-PE(G155-178; 모두 BD Biosciences 제품). FACSVerse를 사용하여 데이터 수집을 수행하고 FlowJo를 사용하여 데이터를 분석하였다.

도 13에 나타낸 바와 같이, CTLA-4는 종양내 Treg 세포에서 가장 많이 발현되는데, 이것은 이들을 CTLA-4 특이적 항체를 고갈시키는 데 좋은 표적으로 만든다.

PBMC-NOG/SCID 모델

CTLA-4 특이적 항체의 고갈 활성에 대한 시험관내 결과를 확인하기 위해, 생체내 PBMC-NOG/SCID 모델에서 항-CTLA-4 mAb의 고갈 능력을 분석하였다. 이 모델은 널리 확립된 hu-PBMC-NOG 모델(문헌[Sondergaard H. et al., Clin Exp Immunol. 2013 May;172(2):300-10. doi: 10.1111/cei.12051]; 문헌[Cox J H et al., PLoS One. 2013 Dec 23;8(12):e82944. doi: 10.1371/journal.pone.0082944. eCollection 2013])에 기반하였으며, 하기에 기재된 바와 같이 인-하우스에서 변형되었다.

마우스를 홈 오피스 지침에 따라 현지 시설에서 사육 및 유지시켰다. 8주령 암컷 CB 17 scid(문헌[Bosma GC et al., Nature. 1983 Feb 10;301(5900):527-30) 및 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγ^null]; 문헌[Ito M et al, 2002, NOD/SCID/γ

mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood 100(9):3175-3182]) 마우스는 Taconic(덴마크 봄홀트 소재)에서 공급되었고, 지역 동물 시설에서 유지되었다. PBMC-NOG/SCID(1차 인간 이종이식) 모델의 경우, Ficoll Paque PLUS를 사용하여 인간 PBMC를 단리하고 세척한 후 세포를 75x10⁶개 세포/ml의 멸균 PBS에 재현 탁하였다. NOG 마우스에게 15x10⁶개의 세포/마우스에 상응하는 200 μl 세포 현탁액을 i.v.로 주사하였다. 주사 2주 후, 비장을 단리하고, 단일 세포 현탁액으로 만들었다. 그 후, 소량의 샘플을 취하여 FACS에 의해 인간 T 세포에서 CTLA-4의 발현을 결정하였다. 도 13에 나타난 바와 같이, CTLA-4는 인간 환자의 상황을 반영하는 다른 T 세포에 비해 Treg 세포에서 더 많이 발현된다. 대부분의 세포를 50x10⁶개 세포/ml의 멸균 PBS에 재현탁하였다. SCID 마우스에게 10x10⁶개의 세포/마우스에 상응하는 200 μl의 현탁액을 i.p.로 주사하였다. 1시간 후, 마우스를 항-CTLA-4 hIgG1, Yervoy 또는 아이소타입 대조군 mAb 10 mg/kg으로 처리하였다. 마우스의 복강내액을 24시간 후에 수집하였다. 인간 T 세포 하위세트를 식별하고, 하기 마커 CD45, CD4, CD8, CD25, CD127(모두 BD Biosciences 제품) 마커를 사용하여 FACS에 의해 정량하였다.

시험된 모든 항체는 Yervoy와 유사하거나 더 양호한 Treg 고갈 활성을 나타냈다. CD8+ 효과기 T 세포와 같은 다른 T 세포 집단은 영향을 받지 않았다(도 14).

실시예 5 - 선택된 대리 항체 m5-B07은 4-E03과 동일한 기능성 특징을 나타낸다.

일부 실시예에서, 특히 생체내 실시예에서, mIgG2a 포맷의 항체 클론 5-B07을 사용하였다(또한 m5-B07로 표시됨). 이것은 본 명세서에 개시된 인간 항체에 대한 대리 항체인 마우스 항체이다. 이것은 뮤린 CTLA-4에 결합하여 리간드 결합을 차단하기 때문에, 이것을 대리 항체로 선택하였다(도 16a 및 도 16b). 또한, 이것은 Treg 고갈 활성도 나타낸다(도 16c 내지 도 16d).

리간드 차단 ELISA

5-B07의 리간드 차단 활성을 ELISA에 의해 평가하였다. 이를 위해, 재조합 마우스 CTLA-4-Fc 단백질(Sino Biologocal Inc.)을 96웰 플레이트(Lumitrac 600 LIA 플레이트, Greiner)에 1 pmol/웰로 코팅하였다. 세척 후, 적정 용량의 항-CTLA-4 mAb를 1시간 동안 결합시켰다. His-태그 된 리간드를 각각 200 nM 및 100 nM(rmCD80 및 rmCD86; Sino Biological Inc.)에 첨가하고 플레이트를 15분 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 리간드를 HRP 표지된 항-His 항체(R&D Systems)로 검출하였다. Super Signal ELISA Pico(Thermo Scientific)를 기질로 사용하고, Tecan Ultra Microplate 판독기를 사용하여 플레이트를 분석하였다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 항체는 리간드 CTLA-4에 대한 (a) CD80 및 (b) CD86의 결합을 차단한다.

생체내에서 Treg 고갈 활성

생체내에서 종양에서 T 세포 하위세트에 대한 CTLA-4 특이적 항체의 효과를 하기에 기재된 바와 같이 CT26 종양 모델에서 조사하였다.

마우스를 홈 오피스 지침에 따라 현지 시설에서 사육 및 유지시켰다. 6 내지 8주령의 암컷 Balb/C는 Taconic(덴마크 봄홀트 소재)에서 공급되었고, 지역 동물 시설에서 유지되었다. CT26 세포(ATCC)를 10% FCS가 보충된 글루타맥스 완충 RPMI에서 성장시켰다. 세포가 세미 컨플루언트일 때, 이것을 트립신으로 탈착하고, 멸균 PBS 중에 10x10⁶개 세포/ml로 재현탁하였다. 마우스에게 1x10⁶개의 세포/마우스에 상응하는 100 μl 세포 현탁액을 s.c.로 주사하였다. 종양이 약 7x7 mm에 도달하면, 마우스를 주 2회 i.p.로 도면에 제시된 바와 같이 표시된 항체 10 mg/kg로 처리하였다. 제3 투여 후, 종양을 절개하고 기계로 작은 조각으로 나누고, 100 μg/ml 리베라제(Roche)와 100 μg/ml Dnase(Sigma)의 혼합물을 사용하여 37℃에서 2x5분 동안 Vortex를 사용하여 소화시켰다. 이어서 세포 현탁액을 10% FBS를 함유하는 PBS로 세척(10분 동안 400g)하였다. 그 후, 세포를 MACS 완충액에 재현탁하고 CD45, CD3, CD8, CD4 및 CD25(모두 BD Biosciences 제품)를 염색하는 항체 패널로 염색하였다. 염색 전에, 세포를 100 μg/ml IVIG를 사용하여 비특이적 결합에 대해 차단시켰다. 세포를 FACS Verse(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 마우스 Treg 세포를 CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD25⁺ 세포로서 식별되었다.

도 16c에 나타낸 바와 같이, 마우스 IgG2a 포맷의 5-B07은 d) 다른 CTLA-4 특이적 n-CoDeR 항체 및 양호하게 설명된 상업적으로 입수 가능한 클론 9H10에 비해 증가된 CD8/Treg 비율과 연관된 종양에서 Treg 결실을 매개한다.

실시예 6 - 항-CTLA4 mAb(COPTG19385) 또는 항-CTLA4 mAb 및 GM-CSF(COPTG19384)를 발현하는 바이러스의 생성, 트랜스진의 발현 및 유전자 안정성의 특징규명

COPTG19384 및 COPTG19385는 단클론성 항체 항-CTLA4(4-E03)를 암호화하는 백시니아 바이러스(코펜하겐 균주)이다. COPTG19384는 인간 GM-CSF를 추가로 암호화한다. 보다 특별하게, COPTG19384 및 COPTG19385는 모두 티미딘 키나제(TK, J2R 유전자좌) 및 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR, I4L 유전자좌) 활성에 결함이 있다. 도 17에 도시된 바와 같이, p7.5K 프로모터(서열번호 59)의 제어 하에 4-E03 중쇄(HC; 서열번호 54)를 암호화하는 발현 카세트를 J2R 유전자좌에 삽입하고, 발현 p7.5K 프로모터 서열번호 59의 제어 하에 4-E03 IgG의 경쇄(LC, 서열번호 53)를 암호화하는 카세트를 I4L 유전자좌에 배치하였다. COPTG19384의 경우, pSE/L 프로모터(서열번호 61)의 제어 하에 인간 GM-CSF(서열번호 56)를 암호화하는 발현 카세트를 또한 I4L 유전자좌에 배치하였다.

동일한 프로모터(p7.5K)를 사용하여 HC 및 LC의 발현을 제어하여 두 쇄 모두에 대해 동일한 수준의 발현을 얻었고, 따라서 이종사량체 단백질로서 항체의 최적 조립을 얻었다(즉, 비-회합된 쇄 과량을 회피함) 그러나 항체의 두 쇄에 대한 동일한 프로모터는 동일한 유전자좌에 이를 삽입하는 것을 배제한다(동일한 DNA 서열은 재조합의 위험을 증가시키고, 이어서 트랜스진의 제거를 증가시킨다). 따라서, 4-E03 HC를 암호화하는 카세트를 J2R 유전자좌에 삽입하고, 4-E03 LC를 암호화하는 카세트를 I4L 유전자좌에 삽입하였다. GM-CSF 트랜스진을 암호화하지만 다른 프로모터(pSE/L) 하에 있는 카세트를 또한 항체 경쇄처럼 I4L 유전자좌에 삽입하였다.

COPTG19384의 생성

백시니아 바이러스 전달 플라스미드, pTG19339 및 pTG19341은 각각 백시니아 바이러스 게놈의 J2R 및 I4L 유전자좌에서 상동성 재조합에 의해 뉴클레오티드 서열의 삽입을 허용하도록 설계되었다. 이들은 J2R(pTG19339) 또는 I4L(pTG19341) 유전자좌를 둘러싼 측접 서열(BRG 및 BRD)이 클로닝된 플라스미드 pUC18에서 유래한다. 각각의 플라스미드는 또한 p7.5K 프로모터를 함유한다.

4-E03 항체의 HC 유전자를 포함하는 1436 bp의 "Fragment HC"라는 명명된 합성 단편을 생성시켰다. pSE/L의 제어 하에 4-E03 항체의 LC 유전자 및 hGM-CSF 유전자를 포함하는 단편 "LC 단편"을 합성 방법으로 생성하여 플라스미드 벡터에 삽입하였다. 암호 서열을 인간 코돈 사용을 위해 최적화하였고, Kozak 서열(ACC)을 ATG 시작 코돈 전에 추가하였고, 전사 종결인자(TTTTTNT)를 중지 코돈 뒤에 추가하였다. 또한, 폭스바이러스에서 발현에 유해한 TTTTTNT, GGGGG, CCCCC와 같은 일부 패턴을 배제하였다.

HC 단편은 상동성 재조합에 의해 PvuII로 제한된 pTG19339에 삽입되어, pTG19367을 발생시켰다. LC-운반 플라스미드는 SnaB1에 의해 제한되었고, 생성된 단편 "LC-GMCSF"는 PvuII로 제한되는 pTG19341에서 상동성 재조합에 의해 삽입되어 pTG19384를 발생시켰다. 이 플라스미드에서 발현 카세트는 백시니아 바이러스 게놈의 I4L 유전자좌에서 상 동성 재조합을 허용하는 재조합 아암 사이에 머리부터 꼬리까지 삽입되었다.

I4L 및 J2R 유전자좌에 연속적인 삽입을 위한 2개의 연속적인 상동성 재조합에 의해, 그리고 COPTG19156을 모 바이러스로 사용하고 2개의 전달 플라스미드 pTG19367 및 pTG19384를 사용하여 닭 배아 섬유 아세포(CEF)에서 COPTG19384를 생성시켰다. CEF는 12일령의 발아 SPF 난(Charles River)에서 단리하였다. 배아를 기계적으로 희석하고, Tryple Select 용액(Invitrogen)에 용해시키고, 5% FCS(Gibco) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 MBE(Eagle Based Medium; Gibco)에서 배양하였다.

전달 플라스미드와 모체 백시니아 바이러스 사이의 상동성 재조합은 GFP 및 mCherry 발현 카세트를 손실하고, 항체 및 GM-CSF 발현 카세트를 얻은 재조합 백시니아 바이러스의 생성을 가능하게 한다. COPTG19156은 I4L 유전자좌에 mCherry 유전자의 발현 카세트를 포함하고 J2R 유전자좌에 GFP 유전자의 발현 카세트를 포함한다. 전달 플라스미드 pTG19367과 모 COPTG19156 사이의 상동성 재조합은 GFP 발현 카세트를 손실하고, 4-E03 중쇄 발현 카세트를 얻은 재조합 백시니아 바이러스의 생성을 가능하게 하며, 선택은 적색 형광 플라크의 분리에 의해 수행하였다. 이 중간 재조합 바이러스(COPTG19367)를 mCherry 발현 카세트를 손실하고, 4-E03 경쇄 및 GM-CSF 발현 카세트를 얻은 재조합 백시니아 바이러스의 생성을 위한 전달 플라스미드로서 pTG19384와의 상동성 재조합의 제2 라운드를 위한 모체 바이러스로 사용하였다. COPTG19384(도 17)의 선택은 백색 비-형광 플라크의 단리에 의해 수행하였다.

COPTG19384의 바이러스 스톡을 2개의 F175 플라스크 내의 CEF에서 증폭시켜 적절한 바이러스 스톡을 생성시켰고, 이것을 분취하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 바이러스 스톡을 CEF 세포에서 적정하고, 감염 역가를 pfu/mL로 표현하고, 하기 수학식으로 계산하였다: 용해 면적의 수 x 희석 인자 x 4. 설명의 목적을 위해서, 생산된 바이러스 스톡을 6.8x10⁶ pfu/mL로 적정하였다. 이 스톡을 PCR로 분석하여 적절한 프라이머 쌍을 사용하여 발현 카세트 및 재조합 아암의 온전성을 확인하였다. 스톡을 또한 두 발현 카세트의 서열결정에 의해 분석하였다. 서열결정 결과의 정렬은 이론적으로 예상되는 서열과 100% 상동성을 나타내었다. 필요한 경우, 통상적인 기술을 사용하여 바이러스 제제를 정제하였다(예를 들어, 국제 특허 제WO2007/147528호에 기재됨).

COPTG19385의 생성

백시니아 바이러스 전달 플라스미드, pTG19339 및 pTG19341은 각각 백시니아 바이러스 게놈의 J2R 및 I4L 유전자좌에서 상동성 재조합에 의해 뉴클레오티드 서열의 삽입을 허용하도록 설계되었다. 이들은 J2R(pTG19339) 또는 I4L(pTG19341) 유전자좌를 둘러싼 측접 서열(BRG 및 BRD)이 클로닝된 플라스미드 pUC18에서 유래한다. 각각의 플라스미드는 또한 p7.5K 프로모터를 함유한다.

4-E03 항체의 HC 유전자를 포함하는 1436 bp의 "Fragment HC"라는 명명된 합성 단편을 생성시켰다. 암호 서열을 인간 코돈 사용을 위해 최적화하였고, Kozak 서열(ACC)을 ATG 시작 코돈 전에 추가하였고, 전사 종결인자(TTTTTNT)를 중지 코돈 뒤에 추가하였다. 또한, 폭스바이러스에서 발현에 유해한 TTTTTNT, GGGGG, CCCCC와 같은 일부 패턴을 배제하였다.

HC 단편은 상동성 재조합에 의해 PvuII로 제한된 pTG19339에 삽입되어, pTG19367을 발생시켰다.

hGM-CSF 유전자를 암호화하는 카세트를 pSE/L의 제어 하에서 플라스미드 pTG19384(상기에 기재됨)에서 제거함으로써 4-E03 경쇄 만을 암호화하는 발현 카세트를 함유하는 플라스미드를 얻었다. pTG19384를 NheI 및 XbaI(상용성 응집성 단부)로 제한시키고, 재결찰시켜 pTG19385를 생성시켰다.

J2R 및 I4L 유전자좌에 연속적인 삽입을 위한 2개의 연속적인 상동성 재조합에 의해, 그리고 COPTG19156을 모 바이러스로 사용하고 2개의 전달 플라스미드 pTG19367 및 pTG19385를 사용하여 닭 배아 섬유 아세포(CEF)에서 COPTG19385를 생성시켰다. CEF는 12일령의 발아 SPF 난(Charles River)에서 단리하였다. 배아를 기계적으로 희석하고, Tryple Select 용액(Invitrogen)에 용해시키고, 5% FCS(Gibco) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 MBE(Eagle Based Medium; Gibco)에서 배양하였다.

전달 플라스미드와 모체 백시니아 바이러스 사이의 상동성 재조합은 GFP 및 mCherry 발현 카세트를 손실하고, 항체 발현 카세트를 얻은 재조합 백시니아 바이러스의 생성을 가능하게 한다. COPTG19156은 I4L 유전자좌에 mCherry 유전자의 발현 카세트를 포함하고 J2R 유전자좌에 GFP 유전자의 발현 카세트를 포함한다. 전달 플라스미드 pTG19367과 모 COPTG19156 사이의 상동성 재조합은 GFP 발현 카세트를 손실하고, 4-E03 중쇄 발현 카세트를 얻은 재조합 백시니아 바이러스의 생성을 가능하게 하며, 선택은 적색 형광 플라크의 분리에 의해 수행하였다. 이 중간 재조합 바이러스(COPTG19367)를 mCherry 발현 카세트를 손실하고, 4-E03 경쇄 발현 카세트를 얻은 재조합 백시니아 바이러스의 생성을 위한 전달 플라스미드로서 pTG19385와의 상동성 재조합의 제2 라운드를 위한 모체 바이러스로 사용하였다. COPTG19385의 선택은 백색 비-형광 플라크의 단리에 의해 수행하였다.

COPTG19385의 바이러스 스톡을 2개의 F175 플라스크 내의 CEF에서 증폭시켜 적절한 바이러스 스톡을 생성시켰고, 이것을 분취하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 바이러스 스톡을 CEF 세포에서 적정하고, 감염 역가를 pfu/mL로 표현하고, 하기 수학식으로 계산하였다: 용해 면적의 수 x 희석 인자 x 4. 설명의 목적을 위해서, 생산된 바이러스 스톡을 1.04x10⁷ pfu/mL로 적정하였다. 이 스톡을 PCR로 분석하여 적절한 프라이머 쌍을 사용하여 발현 카세트 및 재조합 아암의 온전성을 확인하였다. 스톡을 또한 두 발현 카세트의 서열결정에 의해 분석하였다. 서열결정 결과의 정렬은 이론적으로 예상되는 서열과 100% 상동성을 나타내었다. 필요한 경우, 바이러스 제제를 통상적인 기술을 사용하여 정제하였다(예를 들어, 국제 특허 제WO2007/147528호에 기재됨).

트랜스진의 발현

4-E03 단클론성 항체의 바이러스 매개 발현을 COPTG19384로 감염된 CEF 세포의 상청액에서 웨스턴 블롯(WB)에 의해 평가하고, 재조합 방식으로 생산된 항체(40 ng의 4-E03)와 비교하였다. WB는 CTLA4에 결합하지 않는 비-기능성 분자(예를 들어, 불완전한 쇄 조립을 갖는 분자, 응집체)의 존재를 시각화할 수 있다. CEF 세포를 삼중으로 COPTG19384 바이러스 스톡으로 MOI 0.05로 감염시켰다. 세포 상청액을 48시간 후에 수거하고, 비-환원 조건에서 전기영동 후 WB로, 항-Ig(왼쪽 블롯) 또는 항-경쇄(오른쪽 블롯) HRP 접합된 항체를 사용하여 분석하였다. 도 18a에 예시된 결과는, 감염된 CEF에 의해 생산된 mAb의 비-환원 조건에서 WB 프로파일이 100 내지 150 kDa 사이의 유사한 겉보기 크기를 가진 정제된 4-E03의 프로파일에 가깝다는 것을 나타내며, 이는 올바른 쇄 접힘 및 조립을 나타낸다.

기능성 분비 4-E03 항체 및 GM-CSF의 상청액에서 정량을 ELISA로 수행하였다. ELISA는 세포 상청액에서 생산된 기능성 폴리펩티드의 양을 정량적으로 측정할 수 있게 하였다. VVTG17137을 음성 대조군으로 사용하였다. 그것은 자살 유전자 FCU1을 암호화하는 J2R 및 I4L 유전자좌에서 결실된 백시니아 바이러스(코펜하겐 균주)(국제 특허 제WO2009/065546호에 기재됨)이다.

4-E03 항체의 추정을 위해, 마이크로플레이트를 0.25 μg/mL로 CTLA4-Fc 웰당 100 μL로 4℃에서 밤새 인큐베이션시켜 코팅하였다. 인큐베이션 후 코팅 용액을 버리고, 차단 용액을 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하였다. 4-E03 보정 표준품(0.097 내지 100 ng/mL) 또는 차단 용액에 희석된 샘플(삼중)을 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 그 다음 플레이트를 세척하였다. 차단 용액에 희석된 HRP 접합 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 인큐베이션시킨 후 세척하였다. 암실에서 RT에서 30분 동안 TMB 용액과 함께 인큐베이션시킨 후, H₂SO₄ 2 M(정지 용액)을 첨가하여 효소 반응을 중단시켰다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더에서 450 nm에서 판독하였다. 보정 표준품의 항체 농도에 대한 흡광도를 플로팅하였다. 도 18b에 예시된 바와 같이, 기능성 4-E03 mAb는 COPTG19384에 감염된 세포에서 생성되어 1 μg/mL에 가까운 농도에 도달하였다.

GM-CSF의 바이러스-매개 발현을 또한 Quantikine® ELISA(R&D Systems Ref SGM00)를 사용하여 동일한 상청액에서 평가하였다. 약술하자면, 이 검정은 2개의 항-hGM-CSF 항체를 사용하는 것이다. 샘플에서 hGM-CSF를 포획하는데 사용된 제1 항체를 96웰 플레이트의 웰 표면에 코팅하였다. 제2 항체는 용액 중에서 플레이트에 접합되고, 결합되어 포획된 hGM-CSF를 감지한다. 이어서, 샘플에서 hGM-CSF의 농도를 키트에 의해서 제공된 일부 정제된 hGM-CSF로 확립된 보정 곡선으로부터 보간법으로 계산한다. 도 19에서 인지되는 바와 같이, GM-CSF의 발현 수준은 대략 6 μg/mL이다.

결론적으로, 1 μg/mL 이상의 농도가 두 이식 유전자 모두에서 검출되는데, 이것은 만족스러운 발현 수준을 나타낸다.

유전자 안정성:

유전자 안정성 시험은 10^-4의 감염 다중도(MOI)에서 무혈청 배지에서 CEF에 바이러스를 5회 계대한 후에 수행되었다. 계대 P5를 희석하고 60 mm 배양 접시에서 CEF 세포에 접종하여 접시당 20 내지 40개의 바이러스 플라크를 얻었다. 100개의 바이러스 플라크를 단리하고, 계대 배양하였다. 1회 증폭 주기 후, 단리된 바이러스 플라크를 CEF 세포에 접종하고, PCR 및 ELISA로 시험하였다. 트랜스진의 PCR 분석 및 발현은 클론의 90% 이상이 올바른 프로필을 가지고 있음을 나타내었다. 제품의 임상 개발에 대한 허용 기준은 유전자 안정성이 90% 이상이므로 COPTG19384는 유전적으로 안정적인 것으로 간주되었다.

실시예 7 - COPTG19384의 시험관내 특징규명

간세포에서의 복제 연구: 항-CTLA4 mAb 및 GM-CSF를 발현하는 바이러스의 종양-선택성

COPTG19384는 뉴클레오티드 대사에 관여하는 바이러스 효소(TK 및 RR)를 암호화하는 2개의 유전자 결실을 보유한다. 기능성인 경우, 이러한 효소는 바이러스가 휴지 상태(즉, 낮은 뉴클레오티드 풀이 이용 가능함)를 포함한 대부분의 세포의 세포질에서 복제되도록 한다. 1차 및 악성 세포에서 숙주 범위 연구를 수행하여 J2R 및 I4L 유전자좌에 다른 트랜스진을 삽입해도 숙주 범위 선택성이 변경되지 않는지의 여부를 확인하였다. COPTG19384의 복제를 정상 1차 인간 세포(Biopredic에 의해 제조된 간세포) 및 동일한 기관(간암종으로부터의 HepG2, ATCC® HB-8065™)의 종양 세포에서 평가하였다. 복제율 및 치료 지수를 계산하고, 비-선택적 백시니아 바이러스에 대한 참조로서 야생형 코펜하겐 백시니아(COP WT, 결실이 없는 바이러스) 및 재조합 이중 결실 VVTG17137 바이러스(J2R 대신에 삽입된 자살 FCU1 유전자를 가지며, J2R 및 I4L 유전자가 결실됨)와 비교하였다. 연구 배치(배치1)와 GMP 생산 배치(배치 2)의 2개의 배치를 분석하였다. 복제율은 인큐베이션 종료 시 총 감염성 입자/초기 감염 입자(접종)의 비로 결정하였다. 각각의 바이러스의 치료 지수를 비율: HepG2 세포에서의 복제율/간세포에서의 복제율로 결정하였다. 비율이 높을수록 종양 세포에 대한 바이러스의 선택성이 더 양호하다.

1차 간세포를 간세포 배양 배지용으로 1.6%의 첨가제가 보충된 기저 간세포 배지에서 성장시켰다. HepG2를 4 E+05개 세포/웰로 12웰 플레이트에 시딩하고, 5% CO₂와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 감염 전에 배양 배지를 제거하고, 간세포용 PBS 또는 HepG2용 FCS-보충 PBS 중 하나의 바이러스 70 pfu/웰을 각각의 웰에 첨가하였다. 감염된 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 30분 동안 배양한 다음 1.5 mL/웰의 배양 배지를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO₂와 함께 3일 동안 배양한 다음 -80℃에 저장하였다. 이어서, 플레이트를 해동하고, 웰을 30초 동안 진폭의 40%로 초음파처리 한 후 Vero 세포에서 적정하였다.

정상 인간 간세포에서의 복제율:

정상 인간 세포에서 COPTG19384의 용량을 모니터링하기 위해 정상 간세포를 선택하였는데, 그 이유는 이러한 1차 세포는 공여자로부터 직접 정기적으로 얻을 수 있기 때문이다. 이 세포에서, COP WT는 50,000 초과의 복제율로 잘 퍼졌다(도 20a). 즉, 각각의 초기 감염 바이러스 입자는 약 50,000개의 새로운 바이러스를 생성시켰다. 2개의 재조합 이중 결실 바이러스(즉, VVTG17137 및 COPTG19384)의 경우, 이 복제율은 바이러스 또는 바이러스 배치에 따라 5에서 15로 극적으로 감소하였다(도 20a). 이 마지막 결과는 2개의 결실로 인해 정상 세포에 대한 감쇠된 복제가 VVTG17137과 COPTG19384 사이에서 보존되었음을 나타낸다.

종양 세포 HepG2에서 복제율:

HepG2 세포는 COPTG19384가 종양성 인간 세포에서 복제하는 능력을 모니터링하기 위해 선택되었는데, 그 이유는 이러한 세포가 정상 간세포의 악성 대응물이기 때문이다. 이 세포에서, 시험된 5개의 바이러스는 시험된 초기 바이러스에 관계없이 약 100,000개의 새로운 바이러스에 도달하는 매우 유사한 복제율을 가졌다(도 20b). 따라서, VVTG17137 및 COPTG19384의 이중 결실 및 트랜스진의 벡터화는 악성 세포에서 복제하는 능력을 손상시키지 않았다.

치료 지수:

도 20c에 예시된 바와 같이, 계산된 지수는 COP WT경우 단지 2인데, 이는 종양 세포 대 정상 세포에 대한 COP WT의 불량한 선택성을 나타낸다. 반대로, VVTG17137 및 COPTG19384(및 시험된 두 바이러스 로트 모두)의 경우, 이 지수는 8.2 E+03부터 1.8 E+04까지 달라진다. 이것은, 2개의 재조합 바이러스가 종양 세포 대 정상 세포에 대해 동일한 양호한 선택성을 가지고 있음을 확인해준다.

이러한 결과는 COPTG19384 및 VVTG17137이 종양 세포 및 건강한 세포 모두에서 매우 유사한 복제 특성을 가지고 있음을 입증하였다. COP WT와 비교하여, 종양성 Hep G2에서의 복제는 유사하지만, 그것은 건강한 간세포에서는 매우 손상된다. 따라서 두 유전자(J2R 및 I4L)의 결실은 종양성 세포를 포함하는 증식 세포(즉, 높은 뉴클레오티드 풀)로 결실된 바이러스의 복제를 제한한다. 트랜스진 발현 및 복제가 밀접하게 연결되어 있기 때문에, COPTG19384는 치료 단백질을 종양으로 선택적으로 전달하기 위한 효율적인 벡터이다.

CEF 및 LoVo에 대한 복제 검정:

COPTG19384의 복제를 11일 또는 12일된 발아 특정 병원체 무함유 난(Charles Rivers)에서 단리된 CEF(생산자 세포) 및 종양 인간 세포주(LoVo; ATCC® CCL-229^TM)에서 평가하였다. CEF 및 LoVo 세포를 현탁액에서 준비하고, CEF의 경우 10^-3 및 LoVo의 경우 10^-2의 MOI로 감염시켰다(세포당 및 시점 당 3개의 웰). 여러 번의 인큐베이션 후, Vero 세포(CCL-81^TM)에서 바이러스 적정(viral titration)을 수행하였다. COPTG19384 복제를 벤치 마크로서 VVTG17137의 복제와 비교하였다. 결과는 COPTG19384 및 VVTG17137의 복제가 CEF 및 LoVo 모두에서 유사함을 나타낸다(데이터 나타내지 않음).

재구성된 인간 피부에 대한 복제 검정:

COPTG19384의 복제를 또한 재구성된 인간 피부(T-Skin™/ 인간 전체 두께 피부 모델)에서 평가하였다. (EPISKIN SA)에서 얻은 36개의 T-Skin™ 샘플을 6-웰 플레이트에서 배양하고 신선한 배양 배지에서 유지시켰다. VVTG17137 및 COPTG19384를 참여 최종 농도(즉, 10¹ 내지 10⁵ pfu/웰)를 얻기 위해 각각의 웰(삼중)에 분배하였다. 바이러스가 없는 배지에 해당하는 음성 대조군을 또한 시험하였다(모의(Mock)). 플레이트를 37℃에서 5% CO₂와 함께 7일 동안 배양하고, T-Skin™ 샘플을 수집하여 두 조각으로 절단한다. 바이러스 적정을 위해 Vero 세포를 사용하여 두 조각 중 하나에서 감염 역가를 결정하였다. 도 21은 COPTG19384가 벤치마크 VVTG17137과 동일한 정도로 재구성된 피부에서 복제됨을 나타내는데, 이는 GM-CSF 및 4-E03 mAb 모두의 벡터화가 인간 재구성된 피부에서 백시니아 바이러스의 복제 거동을 변형시키지 않았다는 사실을 뒷받침한다.

종양용해성 검정

종양용해 활성은 종양 세포에서 시험된 바이러스 샘플의 용해 활성을 나타낸다. 이것을 다른 종양 세포주: 인간 결장직장 선암 세포주 LoVo(ATCC® CCL-229™), 인간 췌장 종양 세포주 MIA PaCa-2(ATCC® CCL-1420) 및 인간 간암 세포주 HepG2(ATCC® HB-8065™)에서 5일 배양한 후 세포 생존율을 정량화하여 평가하였다. COPTG19384 종양용해 활성을 벤치마크로 VVTG17137의 종양용해 활성과 비교하였다. 감염되지 않은 세포에 상응하는 음성 대조군을 또한 플레이팅하였다(모의 감염된 세포)

세포를 준비하고, 에펜도르프 튜브(1.2x10⁶개 세포/튜브)에 분포시킨 후, MOI 10^-5 내지 10^-2로 바이러스로 감염시키고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 적절한 완전 배지를 에펜도르프 튜브에 첨가하고 이 현탁액의 분취량을 적절한 완전 배지 2 mL를 함유하는 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 (삼중으로) 첨가하였다. 플레이트를 5% CO₂와 함께 37℃에서 5일 동안 인큐베이션시키고, Vi-Cell 카운터에서 세포 생존율을 측정하였다. 결과를 모의 감염된 세포의 세포 생존율의 백분율로 표현하였다. 4-E03 mAb 및 GM-CSF의 농도 측정을 위해 세포 상청액을 또한 회수하였다. 도 22는 COPTG19384 및 VVTG17137의 종양용해 활성이 평가된 3개의 종양 세포주에서 유사함을 보여준다.

트랜스진의 발현 수준

4-E03 단클론성 및 GM-CSF 둘 다의 발현 수준을 종양용해 활성 결정(가변 MOI에서 감염 5일) 후에 회수된 HepG2 및 LoVo 세포의 배양 상청액에서 ELISA(실시예 6에 기재됨)에 의해 측정하였다.

4-E03 및 GM-CSF의 발현 수준을 또한 다음 조건에서 배양된 5개의 세포주, 각각 인간 위 암종 세포주 Hs-746 T(ATCC® HTB- 135™), 인간 난소 종양 세포주 SK-OV-3(ATCC® HTB-77™), 인간 췌장 종양 세포주 MIA PaCa-2(ATCC® CCL-1420), 인간 결장직장 선암 세포주 LoVo(ATCC® CCL-229™) 및 인간 결장직장 암종 세포주 HCT 116(ATCC® CCL-247™)의 상청액에서 ELISA(실시예 6)에 의해서 측정하였다. 각각의 세포주를 6-웰 플레이트(10⁶개 세포/웰)에서 배양하고(삼중), MOI 0.05로 감염되기 전에 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 4-E03 mAb 및 GM-CSF의 농도 결정을 위해 감염 48시간 후 세포 상청액을 또한 회수하였다. 예상된 바와 같이, MOI, 감염 후 시간 및 세포주는 감염된 세포의 상청액에서 트랜스진 발현 수준에 영향을 미치는 중요한 매개 변수이다. 도 23a는 COPTG19384에 의해 감염되었을 때 복제에 다소 관대한 (HepG2) 및 다소 내성인(LoVo) 종양 세포주가 그들의 배양 상청액에서 대략 동일한 양의 4-E03 mAb 및 GM-CSF를 생산할 수 있음을 나타낸다. 그러나 HepG2의 최대 발현은 LoVo보다 10배 낮은 MOI에서 도달된다. 더욱이, 시험된 5개의 종양 세포주에 대해, 트랜스진의 발현은 각각 4-E03 mAb 및 GM-CSF에 대해 0.1 이상 및 1 μg/mL 이상이었다(도 23b). 4-E03 mAb의 농도를 측정하는데 사용되는 ELISA 분석은 항체를 포획하기 위해 항원 CTLA4를 사용한다는 것을 주목하기 바란다. 즉, 이 분석에 의해 측정된 항체는 적어도 부분적으로 기능성이다(즉, 항원을 인식하고, 항체의 다른 기능은 Fc 부분에 의해 보유됨).

4-E03 mAb의 정제 및 글리코실화 프로파일 분석

감염된 세포로부터 다소 많은 양의 4-E03 mAb를 생산하기 위해, 약 4.7 10⁷개의Mia-PACA 세포/플라스크를 함유하는 15개의 F175 플라스크를 COPTG19384로 MOI 0.01로 감염시키고, 72시간 동안 인큐베이션시켰다. MIA Paca-2 세포 배양 상청액(ELISA에 의해 결정된 바와 같이 670 μg의 mAb 4-E03을 함유하는 약 450 mL)을 수거하고, 플링시키고, 원심분리에 의해 정화하여 대부분의 세포 파편을 제거하였다. 정화된 상청액을 0.2 μm 필터에서 여과하고, 2 mM EDTA(추정 금속 프로테아제를 저해하기 위함) 및 20 mM Tris pH7.5(pH를 증가시키기 위함)를 첨가하였다. 이어서, 여과된 상청액을 protA Hitrap 컬럼(GE Healthcare, ref 17-5079-01)에 통과시켰다. 컬럼을 옮기고, Purifier FPLC(GE Healthcare)에 연결하고, 정제 프로그램(THM/ProtA 1mL 주입 루프 frac bleu)을 적용하였다. mAb를 함유하는 용리된 분획을 mAb의 디설파이드 결합의 환원을 위해서 베타-메르캅토에탄올을 함유하거나 함유하지 않는 Laemlli 완충액(Biorad)을 첨가한 후 또는 첨가하지 않은 후 NuPage Bis-Tris 겔 4 내지 12%(Thermo NP0323)에 로딩하였다. 겔을 InstantBlue(Expedeon, ISB1L)로 염색하였다. 주요 용리 피크에 상응하는 3개의 분획을 풀링시키고, 제형 완충액에 대한 투석 후 280 nm에서 흡광도에 의해 항체 농도를 결정하였다. 정제된 mAb의 최종 농도는 0.29 mg/mL였다.

제1 특징규명은 환원 및 비-환원 조건에서 전기영동에 의한 쇄 조립의 평가하였다. 비-환원 조건에서, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄가 조립되어 자연 및 기능성 항체를 형성한다. 감염된 MIA PaCa-2로부터 정제된 4-E03 및 재조합 방식으로 생산된 4-E03은 환원 조건 및 비-환원 조건 모두에서 구별할 수 없는 전기영동 프로파일을 갖는 것으로 나타났다. 즉, 감염된 MIA PaCa-2로부터 정제된 4-E03은 예상된 경쇄 및 중쇄의 예상 비율을 가지며, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄 이종사량체로 올바르게 조립된다. 이러한 이종사량체의 존재는 질량 분석법으로 확인하였다. 정제된 mAb를 글리코실화 분석을 위해 질량 분석법에 적용하였다. 약술하자면, mAb를 힌지에서 IgG를 특이적으로 절단하는 IdeS 프로테아제로 소화시키거나 소화시키지 않았다(결과적으로 F(ab')₂ 및 Fc 부분). N-글리코실화를 수행하는 전체 항체 또는 Fc 부분의 질량을 측정하고, 각각의 질량을 Fc의 1차 서열 및 글리코실화 패턴으로부터 계산된 이론 질량과 피팅하였다. 감염된 MIA PaCa-2로부터 정제된 4-E03 mAb의 글리코실화 프로파일을 임상에서 사용되는 인간 IgG1의 벤치마크로 재조합 방식으로 생산되고 정제된 4-E03 및 MabThera 중 하나와 비교하였다. 결과는, 감염된 MIA PaCa2로부터 생산된 4-E03의 글리코실화 프로파일은 대부분 G0F(88%)를 갖는, 두 항체 참조군과 상이한 글리코실화 프로파일을 갖는 반면, 재조합 4-E03 및 MabThera는 일반적인 G0F, G1F 및 G2F 분포를 갖는 유사한 글리코실화 프로파일을 가짐을 나타낸다. 그러나, MIA PaCa-2는 낮은 수준의 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 1 전사체로 인해 정제된 4-E03 mAb에서 낮은 G1F 및 G2F 종의 원인인 것으로 의심되는데, 이는 MIA PaCa-2에서 발현되는 4-E03의 갈락토실 모이어티의 결여(따라서 G1f 및 G2F의 결여)의 원인이 될 수 있다.

CEF에서 생산된 COPTG19384를 정제하는 동안 회수된 투과액으로부터 동일한 유형의 정제 후 질량 분석을 수행하였다. 결과는 감염된 CEF로부터 4-E03의 글리코실화 프로파일이 MabThera 또는 재조합 4-E03의 것과 매우 유사하다는 것을 나타낸다. 이러한 최신 결과는 항체의 글리코실화 프로파일이 감염 자체보다 사용된 세포주에 더 많은 영향을 받는다는 것을 시사한다.

감염된 MIA PaCa-2 세포(4-E03 TG)의 상청액으로부터 정제된 4-E03은 또한 CHO(연구 배치) 또는 HEK(독성 배치) 세포에 의해 재조합 방식으로 생산된 4-E03과 동일한 결합 특성을 나타낸다(도 24 및 도 25). 이것은 재조합(도 24a) 인간 및 (도 24b) 시노몰거스 CTLA-4 단백질에 대한 결합을 시험하기기 위해 ELISA(실시예 1에 기재됨)에 의해 입증되었다. (도 25a) 인간 및 (도 25b) 시노몰거스 CTLA-4 발현 세포에 대한 결합이 시험된 FACS 분석(실시예 1 및 2 참조)은 상이한 4-E03 배치에 대해 유사한 교차 반응성 및 결합 친화성을 확인해 주었다.

GM-CSF 글리코실화 및 디설파이드 결합 패턴

글리코실화 패턴 및 일부 디설파이드 결합의 존재를 조사하기 위해, 서로 다른 인간 종양 세포주를 COPTG19384로 감염시키고 상청액을 동일한 WB 방법으로 분석하였다. MIA-Paca-2, LoVo, HepG2 및 HCT116 세포를 MOI 0.01로 감염시키고, 무혈청 배양 배지에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 배양 상청액을 수거하고, 원심분리로 정화한 다음 0.2 μm 필터로 여과하였다. 상청액을 분석 전까지 -20℃에 저장하였다. 8 μl의 Rapid PNGase F Buffer 5X를 첨가한 후 75℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 1 μL의 PNGase F를 첨가하고(당단백질에서 N-글리칸을 제거하기 위해) 혼합물을 50℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 웨스턴 블로팅에 제출하기 전에 베타-메르캅토에탄올(환원 및 비-환원 조건)을 포함하거나 포함하지 않은 5 μL Laemmli bufferx4를 첨가하여 25 μL의 샘플을 준비하였다. Amersham ECL Prime Western Blotting을 사용하여 면역 복합체를 검출하고, Molecular Imager ChemiDOC XRS(Biorad)를 사용하여 화학발광을 기록하였다.

감염된 HCT116, LoVo 및 MIA PaCa-2로부터의 GM-CSF는 동일한 글리코실화 패턴을 나타내는 반면, 감염된 HepG2에 의해 생성된 GM-CSF는 비-N-글리코실화 분자로서 이동되었다. 이러한 결과는 COPTG19384 감염된 인간 종양 세포에 의해 생산된 GM-CSF가 예상되는 번역후 변형(즉, 디설파이드 결합 및 N-글리코실화)을 가지고 있음을 나타낸다. 그러나 이러한 변형은 감염에 사용되는 종양 세포주 및 특정 대사 상태에 따라 달라질 수 있다.

실시예 8: COPTG19384의 종양내 주사 후 약동학

LoVo 이종이식된 모델에서 백시니아 바이러스의 종양내(i.t.) 주사 후 항-CTLA4 항체, GM-CSF 및 바이러스의 종양 및 혈류에서의 발현의 동태.

프로토콜

5x10⁶개의 세포 LoVo 세포를 Swiss nude 마우스(Charles River, 프랑스 소재)의 우측 옆구리에 이식하였다. 약 2주 후 종양 부피가 약 120 mm³에 도달한 경우, 마우스를 무작위화하고, 15마리 동물의 6개의 군으로 나누었다.

ㆍ 군 1부터의 마우스에게 D0에(치료 제1일) 1x10⁴ pfu/마우스의 용량으로 COPTG19384를 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 2부터의 마우스에게 D0에 1x10⁵ pfu/마우스의 용량으로 COPTG19384를 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 3으로부터의 마우스에게 D0에 1x10⁴ pfu/마우스의 용량으로 VVTG17137를 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 4로부터의 마우스에게 D0에 1x10⁵ pfu/마우스의 용량으로 VVTG17137를 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 5로부터의 마우스에게 D0에 3 mg/kg의 용량으로 4-E03를 복강내(i.p.) 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 6으로부터의 마우스에게 D0에 3 mg/kg의 용량으로 이필리무맙(Yervoy)을 i.p. 투여로 제공하였다.

3마리 동물로부터의 종양 및 혈액을 1, 3, 6, 10 및 20일에 수집하였다. 종양의 질량을 측정하고, 즉시 가공을 위해 균질화하였다. 균질화된 종양의 1/4을 바이러스 적정을 위해 수집하고, 나머지 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 혈액을 두 부분으로 나누었는데, 하나는 적정 분석을 위해 헤파린 튜브(25 IU/100 μL 혈액)에 첨가하였고, 분석 전까지 -80℃에서 냉동하였다. 다른 부분에서 정화된 혈청을 생산하여, 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 바이러스 역가를 Vero 세포에 대한 적정에 의해 종양 및 혈액 샘플에서 결정하였다.

LoVo 모델에서 바이러스 복제의 동태:

COPTG19384가 2개의 용량(1x10⁴ 또는 1x10⁵ pfu)으로 한번 주사되는 LoVo 모델에서 바이러스 복제를 모니터링하고 동일한 조건에서 주사된 VVTG17137 중 하나와 비교하였다. 도 26에 도시된 결과는, 각각의 시간 지점에 대해 측정된 바이러스 역가의 3개의 값의 중요한 분산을 나타낸다. 어쨌든, 결과는 또한 바이러스 둘 다 및 두 용량 모두에서 종양에서 복제하고, 주입 후 3일에서 최대 20일까지 종양의 역가/g을 상당히 높게 유지한다는 것을 나타낸다. 주어진 시간 지점에서, 두 용량의 바이러스 또는 사용된 두 바이러스 간에 바이러스 역가의 명백한 차이는 없다. 흥미롭게도, 13 pfu/mL만이 검출된 하나의 샘플(VVTG17137, 용량: 10일에 1x10⁷ pfu)을 제외하고, 모든 혈액 샘플은 바이러스 검출에 대해 음성이었다(데이터 나타내지 않음).

함께 이러한 결과는 하나의 i.t.의 1x10⁴ 또는 1x10⁵ pfu의 주사 후, 바이러스의 복제가 LoVo 종양에서 적어도 20일 동안 유지되었으며, 혈류에서 존재가 거의 검출 가능하지 않았다는 것을 나타낸다. LoVo 이종이식 모델은 허용되는 인간 종양 세포 및 면역계가 심각하게 손상되어 제한된 항-바이러스 활성을 갖는 Swiss nude 마우스를 사용하기 때문에 바이러스 복제에 매우 유리하다는 것을 주목해야 한다.

LoVo 모델에서 트랜스진 발현의 동태:

예상된 바와 같이, 종양에서 트랜스진 발현의 동태은 4-E03 mAb(도 27a) 및 GM-CSF(도 27b) 둘 다에 대해 6일 또는 10일에 최대 농도(Cmax)로 바이러스 복제의 동태를 따랐다. 4-E03 mAb(또는 이필리무맙)의 단일 주사의 경우, 종양 및 혈액의 Cmax가 제1 시간 지점(1일)에 관찰되었으며, 그 후 측정된 mAb의 농도는 마우스에서 인간 IgG1의 약물동태를 따랐다(도 28).

더욱이, Cmax에서 그리고 그 이후(즉, 주사 후 6 내지 10일에서 20일까지) 종양 내에서의 4-E03의 농도는 3 mg/kg의 치료 용량의 4-E03 mAb의 단일 주사 후보다 COPTG19384 처리(두 용량 모두에 대해) 후 대략 10배 더 높았다(도 27a). 대조적으로, COPTG19384 처리 후 mAb의 혈액 중의 농도는 항상 4-E03의 3 mg/kg i.p. 주사 후에 측정된 것보다 낮았다(도 28a). 이 결과는 mAb의 벡터화가 mAb의 치료적 투여에서 얻은 혈액 농도를 초과하거나 심지어 도달하지 않고도 종양 내에서 고농도에 도달할 수 있음을 나타낸다.

COPTG19384 처리 후 GM-CSF 발현의 동태는 4-E03으로 관찰된 것을 따른다(도 27b). 흥미롭게도, COPTG19384에 의해 감염된 시험관내 LoVo는 4-E03보다 약 2배 더 많은 GM-CSF를 발현하지만, 종양 내에서 측정된 GM-CSF 수준은 동일한 샘플의 경우 4-E03 수준보다 더 낮다. GM-CSF의 혈중 농도는 또한 4-E03에 비해 매우 낮았다(도 28b). 이 결과는 인간 IgG1에 비해 매우 짧은 GM-CSF의 생체내 반감기에 따른 것이다.

이러한 결과는 벡터화된 항체 및 GM-CSF가 COPTG19384의 i.t. 주사 후 최소한의 전신 노출로 종양 내에서 주로 발현된다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 벡터화가 독성학적(예를 들어, 항-CTLA4) 또는 약물동태적(예를 들어, GM-CSF) 문제가 있는 트랜스진에 특히 적합하다는 것을 확인해 준다.

CT26 동계 모델에서 백시니아 바이러스의 종양내 주사 후 항-CTLA4 항체, GM-CSF 및 바이러스의 종양 및 혈류에서의 발현의 동태.

CT26 면역적격 뮤린 모델에서 바이러스 활성을 평가하는 것은 뮤린 GM-CSF가 있거나 없는 뮤린 항-mCTLA4를 암호화하는 몇몇 대리 바이러스의 생성을 필요로 한다:

ㆍ COPTG19407은 J2R 유전자좌에서 p7.5 프로모터 하에서 뮤린 m5-B07 IgG2의 중쇄(서열번호 63)를 암호화하는 발현 카세트 및 p7.5 프로모터 하에서 m5-B07의 경쇄(서열번호 62)를 암호화하는 발현 카세트 및 I4L 유전자좌에서 pSE/L 프로모터 하에서 뮤린 GM-CSF(서열번호 58)를 함유하는 백시니아 바이러스(코펜하겐 균주)이다.

ㆍ COPTG19421은 J2R 유전자좌에서 p7.5 프로모터 하에서 m5-B07 중쇄를 암호화하는 발현 카세트 및 I4L 유전자좌에서 p7.5 프로모터 하에서 m5-B07의 경쇄를 암호화는 발현 카세트를 함유하는 백시니아 바이러스(코펜하겐 균주)이다.

ㆍ 벤치마크로서 사용된 VVTG18058은 임의의 트랜스진이 없는("빈" 바이러스), J2R 및 I4L이 결실된 백시니아 바이러스(코펜하겐 균주)이다.

이들 백시니아 바이러스를 실시예 6에 기재된 과정에 따라 J2R(TK) 및 이어서 I4L(RR) 유전자좌에서 2개의 연속적인 상동성 재조합에 의해 인간 대응물에서와 같이 생성시켰다. 뮤린 CTLA4-Fc 항원을 사용하여 뮤린 항체를 포획하고, Quantikine ELISA 키트 마우스 GM-CSF(R&D Systems)를 사용하여 mGM-CSF를 정량한 것을 제외하고는, m5-B07 항체 및 mGM-CSF를 정량하기 위한 ELISA 방법은 상기에 기재된 것(실시예 6, 4-E03 및 GM-CS에 대한 "트랜스진의 발현")과 유사하였다. 이들 바이러스의 종양용해 활성을 또한 다양한 세포주(1개의 육종: MCA205 및 2개의 결장 암종 CT26 및 MC38)에서 평가하였고, VVTG18058 중 하나와 유사한 것을 발견하였는데, 이는 mGM-CSF가 있거나 없는 뮤린 항체의 벡터화가 백시니아 바이러스의 종양용해 능력에 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다(데이터 나타내지 않음).

프로토콜: CT26 세포(2 x10⁵개 세포)를 Balb/c 마우스(Charles River, 프랑스 소재)의 우측 옆구리에 이식하였다. 약 1주 후, 종양 부피가 25 내지 50 mm³에 도달한 경우, 마우스를 무작위화하고, 20마리 동물의 3개의 군(군 1 내지 3) 및 10마리 동물의 1개의 군 4로 나누었다. 종양 및 혈액을 첫번째 3개의 군의 경우 1, 4, 8 및 10일에 수집하고, 군 4의 경우 1일에 수집한 것을 제외하고는, 종양 및 혈액을 LoVo 모델에 기재된 것과 같이 수집하고, 처리하였다.

ㆍ 군 1로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁷ pfu/마우스의 용량으로 VVTG18058를 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 2로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁷ pfu/마우스의 용량으로 COPTG19407를 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 3으로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁷ pfu/마우스의 용량으로 COPTG19421을 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 4로부터의 마우스에게 D0에 3 mg/kg의 용량으로 m5-B07을 i.p. 투여로 제공하였다.

CT26 모델에서 바이러스 복제의 동태:

2개의 대리 바이러스가 3회(1x10⁷ pfu/주사) 주사되는 CT26 모델에서 바이러스 복제를 모니터링하고 동일한 조건에서 주사된 VVTG18058 중 하나와 비교하였다. 도 29에 도시된 결과는, LoVo 모델에서와 같이, 각각의 시간 지점에 대해 측정된 바이러스 역가의 3개의 값의 중요한 분산을 나타낸다. 그러나, 3개의 바이러스에 대한 역가는 시간에 걸쳐 최대 10일까지 유지되었는데, 이는 2개의 트랜스진이 적어도 이러한 시간창에서 바이러스 제거 또는 복제에 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다. 바이러스 감염성 입자는 혈액 샘플 중 어느 것에서도 검출되지 않았다(데이터 나타내지 않음).

CT26 모델에서 트랜스진 발현의 동태

LoVo 모델과 마찬가지로, 종양 내에서의 트랜스진 발현은 바이러스 복제를 반영하였다. 즉, m5-B07 항체(도 30a) 및 mGM-CSF(도 30b)는 모니터링 10일 동안 다소 일정한 수준으로 종양에서 검출되었다.

단클론성 항체의 경우, COPTG19421 또는 COPTG19407 주사 후 도달한 Cmax는 3 mg/mL의 m5-B07 항체를 단일 i.p.로 주사한 것에서 관찰된 Cmax보다 약 10배 더 낮았다(도 30a). 혈청에서, 이러한 차이는 더욱 두드러졌는데, m5-B07의 순환 농도는 3 mg/kg의 m5-B07 주사에 비해 바이러스 처리 후 약 100배 더 낮았다(도 31).

GM-CSF의 경우, COPTG19407에 의한 치료만이, CT26 종양에서 mGM-CSF의 측정 가능한 농도를 산출하였는데, 이는 측정된 사이토카인이 엔도진(endogen) 기원이 아닌 재조합 기원을 갖는다는 것을 나타낸다. LoVo 모델에서와 같이, 종양에서 측정된 mGM-CSF 농도는 m5-B07의 농도보다 낮았다(도 30b). 더욱이, 종양에 의해 생산된 mGM-CSF는 혈청 샘플에서 검출되지 않았는데, 이는 아마도 아마도 전신 축적을 방해하는 분자의 짧은 반감기때문일 것이다.

실시예 9: 항종양 활성 연구

COPTG19347은 J2R 및 I4L 유전자가 결실되고, 뮤린 CTLA4 항원을 인식하는 전체 뮤린 항체(즉 m5-B07, 중쇄 및 경쇄)를 암호화하는 백시니아 바이러스(코펜하겐 균주)이다. COPTG19421 대 COPTG19347는 상이한 프로모터, 즉, 각각 p7.5K 및 pH5.R 하에서 m5-B07을 발현하였다. m5-B07의 정량을 MOI 10^-1로 감염된 CT26에서 약 1 μg/mL에 도달하는 감염된 세포의 상청액에서 MOI 10^-2로 감염된 MCA205 세포에서 약 4 μg/mL까지 평가하였다. CT26에 비해서 MCA205의 더 높은 발현이 COPTG19407에 의해서 감염된 세포의 배양 상청액에서 mGM-CSF에 대해서 또한 관찰되었다(데이터 나타내지 않음).

항-PD1과 조합하여 마우스 보유 CT26 모델에서 항종양 활성

프로토콜:

CT26 세포(2 x10⁵개 세포)를 Balb/c 마우스(Charles River, 프랑스 소재)의 우측 옆구리에 이식하였다. 종양의 부피가 25 내지 50 mm³에 도달하면 마우스를 10마리 동물의 5개의 군으로 무작위화하였다. 약술하자면, 마우스를 바이러스의 2일 간격의 3회 i.t 투여, 그 다음 3주 동안 주 2회 뮤린 항-PD1(RMP1-14 BioXCell)의 i.p. 처리로 처리하였다. 보다 구체적으로,

ㆍ 군 1로부터의 마우스에게 비히클을 제공하였고;

ㆍ 군 2로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁷ pfu의 COPTG19347을 i.t. 투여로 제공하였고;

ㆍ 군 3으로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁷ pfu의 COPTG19347을 i.t. 투여로 그리고 D7, D11, D14, D18 및 D22에 250 μg/마우스의 RMP1-14를 i.p. 복강내 투여로 제공하였고;

ㆍ 군 4로부터의 마우스에게 D7, D11, D14, D18 및 D22에 250 μg/마우스의 RMP1-14를 i.p. 투여로 제공하였고;

ㆍ 군 5로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁷ pfu의 VVTG18058을 i.t. 투여로 제공하였다.

종양 치수를 캘리퍼로 주 2회 측정하였고, 부피를 수학식 (

/6)(길이x폭²)을 사용하여 계산하였다. 종양 부피가 2000 mm³에 도달한 경우 동물을 안락사시켰다.

CT26 모델에서 COPTG19347의 항종양 활성:

도 32에 예시된 바와 같이, COPTG19347 처리는 종양 성장 저해(도 32a)뿐만 아니라 최종적으로 100일까지 생존하는 종양이 없는 마우스로 번역되는 종양 퇴행(도 32b)을 초래하였다. COPTG19347로의 처리는 100일에 60%의 종양이 없는 마우스를 생성시켰다. 항 PD-1 항체와의 병용 치료는 종양 성장 저해 또는 오래 살아남은 마우스의 비율을 크게 개선시키지 못했다(100일에 약 70%의 종양이 없는 마우스). 이에 비해, RPMI-14 처리는 어떠한 항-종양 효과도 제공하지 않은 반면(미처리 마우스에서와 동일한 거동)(처음 40일 이내에 모두 사망), VVTG18058은 불량한 활성을 가졌다(100일에 약 10%의 종양이 없는 마우스).

CT26 모델에서 용량-효과 평가:

3개의 대리 바이러스를 비교하고(m5-B07을 지시하고, m-GM-CSF가 있거나 없는 상이한 프로모터), COPTG19407 대 VVTG18058의 용량 증량을 수행하였다(7.5x10⁴, 7.5x10⁵ 또는 7.5x10⁶ pfu). 실험 조건은 항-PD1과의 병용 치료를 생략한 것을 제외하고는, 상기에 기재된 것과 동일하였다.

2개의의 독립적인 실험의 결과는 3개의 바이러스 시험된 COPTG19407, COPTG19421 및 COPTG19347이 7.5x10⁶ pfu의 용량에서 강력한 항-종양 활성을 가짐을 분명히 입증하였다. 이는 COPTG19407에서 암호화된 mGM-CSF 또는 COPTG19421 및 COPTG19407에서 가장 약한 프로모터의 사용이 무장 바이러스의 항-종양 활성을 손상시키지 않았음을 확인해 준다. 시험된 최고 용량(즉, 7.5x10⁶ pfu)에서, 하기 표에 요약된 바와 같이 80일에 종양이 없는 마우스의 수는 바이러스 및 실험에 따라 5/10 내지 7/10이었고, 빈 바이러스로 처리된 마우스의 경우 0/10이었다.

더욱이 "빈" 바이러스(VVTG18058) 및 COPTG19384 대리체(COPTG19407) 둘 다로 수행된 용량 증량은, 상대적으로 낮은 용량(7.5x10⁴ pfu)에서도 항체 발현 바이러스가 어느 정도 명확한 항종양 활성을 여전히 갖는다는 것을 입증하였고, 하기 표에 나타낸 바와 같이 80 내지 98일에 종양이 없는 마우스는 4/10 및 2/10였고, 동일한 낮은 용량에서 VVTG18058로의 처리의 경우 0/10이었다.

생존 데이터의 수집(2개의 독립적인 연구에서 수집된 글로벌 생존 플롯)을 도 33에 제공한다. 로그랭크 시험을 사용한 통계 분석을 수행하여 각각의 군의 생존 간에 유의한 차이가 있는지를 확인하였다.

VVTG18058과 m5-B07의 조합물과 비교한 COPTG19407의 항-종양 활성

CT26 종양-보유 마우스를 이미 기재된 바와 같이 설정하였다(실시예 5). 약술하자면, CT26 세포를 Balb/C 마우스에 s.c.로 주사하였다. 종양이 대략 100 mm³에 도달했을 때 마우스의 처리를 시작하였다. 이어서, 마우스에게 D0, D2 및 D5에 COPTG19407(8.5x10⁶ pfu i.t.), VVTG18058(8.5x10⁶ pfu i.t.), m5-B07(10 mg/kg i.p.) 또는 VVTG18058(8.5x10⁶ pfu i.t.)와 m5-B07(10 mg/kg i.p.)를 주사하였다. 이어서 종양 치수를 주 2회 측정하고, 종양이 2000 mm³에 도달한 경우 마우스를 안락사시켰다. 도 34a 내지 도 34d에 나타낸 바와 같이, 항 -CTLA-4 및 GM-CSF를 발현하는 바이러스 COPTG19407로 마우스를 처리했을 때 종양 성장이 유의하게 저해된 반면, 비무장 바이러스와 항-CTLA4 m5-B07의 조합은 단일 작용제 사용에 비해서 개선된 요법을 초래하지 않았다. m5-B07 단독, 바이러스 VVTG18058 단독 또는 m5-B07과 VVTG18058 둘 다의 조합물로 처리된 군에서, 마우스의 20% 만 70일 후에 생존하였다(도 34e). 대조적으로, 마우스의 90%는 COPTG19407의 투여 후 100일을 초과하게 생존하였는데, 이는 벡터화 전략의 효능을 입증한다.

A20 피하 뮤린 B-세포 림프종 보유 마우스에서 VVTK- RR-암호화 항-CTLA-4 및 GM-CSF의 항종양 활성

A20 세포주는 노령 BALB/cAnN 마우스(ATCC TIB-208^TM)에서 발견된 자발적 망상 세포 신생물로부터 유래된 BALB/c B 세포 림프종 세포주이다.

프로토콜 (1):

5x10⁶개의 A20 세포를 암컷 Balb/cN 마우스(Charles River, 프랑스 소재)의 우측 옆구리에 피하 주사함으로써 종양을 유도하였다. 종양의 평균 부피가 95 mm³에 도달하면 50마리의 마우스를 10마리 동물의 5개의 군으로 무작위화하였다.

ㆍ 군 1로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 비히클을 i.t. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 2로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 4.75x10⁶의 용량으로 VVTG18058를 i.t. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 3으로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 4.75x10⁶의 용량으로 COPTG19407을 i.t. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 4로부터의 마우스에게 D7, D10, D14, D17, D21 및 D24에 250 μg의 항-PD-1 항체를 i.p. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 5로부터의 마우스에게 D7, D10, D14, D17, D21 및 D24에 250 μg의 용량의 항-PD-1 항체의 i.p. 투여와 조합하여 D0, D2 및 D4에 4.75x10⁶ pfu의 용량의 COPTG19407을 i.t. 투여로 제공하였다.

항종양 활성:

모든 동물의 종양 부피를 연구 전체에서 모니터링하였다. 치료제의 항-종양 활성은 종양 배가 시간, 종양 성장 지연 및 종양 성장 저해(T/C %) 기준의 평가를 기반으로 한다.

종양 배가 시간은 5.14일(군 1) 내지 6.37일(군 2)의 범위로 군 1, 2 및 4의 경우 유사하였다. 군 3의 경우, 종양 배가 시간을 정확하게 계산할 수 없었는데, 그 이유는 종양이 기하 급수적으로 성장하지 않았기 때문이며, 이는 군 1, 2 및 4에 비해서 증가된 치료 효능을 나타낸다. 유사하게, 종양 배가 시간을 군 5에서 단지 1마리의 동물을 사용하여 계산하였다. 군 3에서 10마리 마우스 중 9마리는 D15에 퇴행되고, D25에서 D64에 연구의 마지막까지 부피가 실질적으로 성장하지 않는 종양을 가졌다. D64에, 이러한 9마리 마우스의 종양 부피는 4 mm³(종양 검출의 기술적 한계치) 내지 59.77 mm³의 범위였다. 유사하게, 군 5에서, 종양은 치료 시작 후 9마리의 마우스에서 퇴행하여, D64에 연구 종료 시에 7.24 내지 63.21 mm³ 범위의 값에 도달하였다. 각각의 치료군(도 35a 내지 도 35e에 상응하는 군 1 내지 5)의 개별 종양 부피 곡선을 나타내는 도 35에서 인지될 수 있는 바와 같이, COPTG19407을 제공받은 군 3 및 5의 동물에서는 종양이 성장하지 않았는데, 이는 항-PD1과 함께 또는 이것 없이 항체-발현 바이러스의 강력한 항-종양 활성을 확인해 준다.

종양이 평균 목표 부피 300 mm³에 도달하는 데 걸리는 시간을 추정하여 종양 성장 지연을 계산하였다. 이 매개변수는 300 mm³의 목표 부피에 도달한 종양에 대해서만 계산될 수 있었기 때문에 결과는 종양 배가 시간으로 얻은 결과와 유사하였고, 이는 군 3 및 군 5의 대부분의 동물에 해당되지 않았다. 군 1, 2 및 4는 각각 16일, 21일, 17일의 평균 종양 성장 지연을 나타내었는데 이는 서로 크게 다르지 않았다. 또한 군 3(n = 2)은 14일의 평균 종양 지연을 가졌는데, 이는 이 군에서 성장한 종양이 군 1, 2 및 4와 동일한 속도로 성장하였지만, 이들 종양은 두 동물에서 실제로 퇴행하였다는 것을 나타내었다. 이에 비해, 성장한 군 5(n=1)의 단일 종양은 43일의 다른 모든 군보다 상당히(p ≤ 0.0026) 더 긴 종양 성장 지연을 가졌다.

비히클 처리군 1의 중위 종양 부피를 다른 처리군과 비교함으로써 종양 성장 저해(T/C%)를 계산하였다. 군 2는 D22에 34%의 최적의 T/C%를 가졌는데, 이는 일시적인 한계 항-종양 활성을 나타내지만, 이 값은 D31까지 최대 71% 증가하였다. 중등도의 항-종양 활성(10 내지 30% T/C%)이 군 4에서 관찰되었다. 이에 비해, 군 3 및 군 5 둘 다는 D27에서 D31(T/C %의 마지막 계산 가능한 값)까지 현저한 항-종양 활성(T/C% 10 % 미만)을 나타냈다.

도 36은 피하 A20 종양을 보유하는 BALB/cN 마우스에 대한 평균 종양 부피 곡선을 예시하는데, 이는 종양 성장에 대한 항-PD1과 함께 또는 이것 없이 항-CTLA4 및 Gm-CSF 발현 바이러스 COPTG19407의 극적인 효과를 입증한다.

프로토콜 (2):

5x10⁶개의 A20 세포를 암컷 BALB/cN 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사함으로써 종양을 유도하였다. 종양의 평균 부피가 80 내지 100 mm³에 도달하면 90마리의 마우스를 10마리 동물의 9개의 군으로 무작위화하였다.

ㆍ 군 1로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 비히클을 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 2로부터의 마우스에게 D0, D4, D7, D10, D14 및 D17에 250 μg/마우스/주사의 용량의 항-PD-1 항체를 i.p. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 3으로부터의 마우스에게 D0, D4, D7, D10, D14 및 D17에 250 μg/마우스/주사의 용량의 아이소타입을 i.p. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 4로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁵의 용량으로 VVTG18058을 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 5로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁵ pfu의 용량의 VVTG18058을 i.t. 투여로 그리고 D0, D4, D7, D10, D14 및 D17에 250 μg/마우스/주사의 용량의 아이소타입을 i.p. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 6으로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁵ pfu의 용량의 VVTG18058을 i.t. 투여로 그리고 D0, D4, D7, D10, D14 및 D17에 250 μg/마우스/주사의 용량의 항-PD-1 항체를 i.p. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 7로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 1x10⁵의 용량으로 COPTG19407을 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 8로부터의 마우스에게 D0, D4, D7, D10, D14, D17 및 D24에 250 μg/마우스/주사의 용량으로 아이소타입을 i.p. 투여하는 것과 조합하여, D0, D2 및 D4에 1x10⁵ pfu의 용량의 COPTG19407을 i.t. 투여로 제공하였다.

ㆍ 군 9로부터의 마우스에게 D0, D4, D7, D10, D14 및 D17에 250 μg/마우스/주사의 용량으로 항-PD-1 항체를 i.p. 투여하는 것과 조합하여, D0, D2 및 D4에 1x10⁵ pfu의 용량의 COPTG19407을 i.t. 투여로 제공하였다.

항종양 활성:

COPTG19407의 용량은 최적 미만이며, 종양 부피 및 마우스 생존의 관점에서 항-PD-1 치료 중 하나와 유사한 약간의 항종양 활성을 나타내었다.

이에 반해서, COPTG19407과 항-PD-1의 조합물은 도 37a에 나타낸 바와 같이 다른 군에 비해서 작은 종양 부피를 초래하는 강한 항-종양 활성을 나타내었고(각각 항-PD-1 단독 또는 COPTG19407 단독을 제공받은 마우스의 경우 24일에 대략 630 mm³ 및 750 mm³인 것에 비해서 36일에 대략 290 mm³), 도 37b에 제공된 바와 같이 동물의 훨씬 더 양호한 생존을 나타내었다(7마리의 동물이 군 9에서 57일에 여전히 살아있는 반면 각각 군 2 또는 7에서는 단지 2마리 또는 1마리가 살아있음).

C38 피하 결장 종양 세포 보유 마우스에서 VVTK- RR-암호화 항-CTLA-4 및 GM-CSF의 항종양 활성 연구

C38은 American Type Culture Collection(ATCC CRL-2779^TM)으로부터 유래된 뮤린 결장 선암종이다.

프로토콜:

종양 단편(30 내지 50 mg)을 암컷 C57BL/6J 마우스(Janvier, 프랑스 소재)의 우측 옆구리에 피하로 이식하였다. 종양의 평균 부피가 대략 60 mm³에 도달하면 50마리의 마우스를 10마리 동물의 5개의 군으로 무작위화하였다.

ㆍ 군 1로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 비히클을 i.t. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 2로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 4.75x10⁶의 용량으로 VVTG18058을 i.t. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 3으로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 4.75x10⁶의 용량으로 COPTG19407을 i.t. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 4로부터의 마우스에게 D7, D10, D14, D17, D21 및 D24에 250 μg의 뮤린 항-PD-1 항체를 i.p. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 5로부터의 마우스에게 D7, D10, D14, D17, D21 및 D24에 250 μg의 용량의 항-PD-1 항체의 i.p. 투여와 조합하여 D0, D2 및 D4에 4.75x10⁶ pfu의 용량의 COPTG19407을 i.t. 투여로 제공하였다.

항종양 활성:

이전과 같이, 모든 동물의 종양 부피를 연구 전체에서 모니터링하였다. 종양 배가 시간은 군 1 및 2의 경우 대략 6.7일로 유사하였다. 군 4(n = 5)는 더 긴 종양 배가 시간(10.4일)을 가졌는데, 군 간에는 어떠한 유의한 차이도 존재하지 않았다. 군 3 및 군 5의 경우, 종양 배가 시간은 더 적은 동물(n = 2)을 사용하여 계산 가능하였는데, 그 이유는 이들 군의 마우스에서 대부분의 종양이 기하 급수적으로 성장하지 않았기 때문이며, 이는 군 1, 2 및 4에 비해서 증가된 치료 효능을 나타낸다. 도 38로부터 인지될 수 있는 바와 같이, 군 3에서 10마리 마우스 중 8마리는 D15에 퇴행되고, 부피가 실질적으로 성장하지 않는 종양을 가졌고, 5마리의 마우스는 D61에 연구 종료 시에 검출 가능한 종양을 갖지 않았다. 유사하게, 군 5에서, 종양은 치료 시작 후 8마리의 마우스에서 퇴행하여, D61에 연구 종료 시에 0(n = 2) 내지 47.82 mm³ 범위의 값에 도달하였다.

종양이 평균 목표 부피 300 mm³에 도달하는 데 걸리는 시간을 추정하여 종양 성장 지연을 계산하였다. 이 매개변수는 300 mm³의 목표 부피에 도달한 종양에 대해서만 계산될 수 있었기 때문에 결과는 종양 배가 시간으로 얻은 결과와 유사하였고, 이는 군 3 및 군 5의 대부분의 동물에 해당되지 않았다. 군 간에는 어떠한 유의한 차이도 존재하지 않았다. 군 1, 2 및 4(n = 5)는 각각 23 내지 27일의 평균 종양 성장 지연을 나타내었다. 또한, 군 3(n = 2) 및 군 5(n = 3)는 각각 18일 및 24일의 평균 성장 지연을 나타내었다. 이는, 이러한 2개의 군에서 성장한 종양이 군 1, 2 및 4에서의 속도와 유사한 속도로 성장하였다는 것을 나타내었다.

비히클 처리군 1의 중위 종양 부피를 다른 처리군과 비교함으로써 종양 성장 저해(T/C%)를 계산하였다. 군 2는 어떠한 종양 성장 저해도 나타내지 않았는데, 그 이유는 T/C%가 연구 기간 동안 100%를 초과하게 유지되었기 때문이다. 이에 비해, 군 3, 4 및 군 5 모두는 D31(군 3 단독)에서 D42(T/C %의 마지막 계산 가능한 값)까지 현저한 항-종양 활성(T/C% 10 % 미만)을 나타냈다.

도 39는 피하 C38 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에 대한 평균 종양 부피 곡선을 예시하는데, 이는 종양 성장에 대한 항-PD1과 함께 또는 이것 없이 항-CTLA4/GM-CSF 발현 바이러스 COPTG19407의 극적인 효과를 입증한다.

EMT6 피하 유방 종양 세포 보유 마우스에서 VVTK- RR-암호화 항-CTLA-4 및 GM-CSF의 항종양 활성 연구

EMT6은 ATTC(ATCC CRL-2755^TM)로부터 유래된 뮤린 유방 암종이다.

프로토콜:

암컷 BALB/cByJ 마우스(Charles River, 프랑스 소재)에서 1x10⁶개의 EMT6 세포의 피하 주사에 의해서 종양을 유도하였다. 종양의 평균 부피가 대략 51 mm³에 도달하면 50마리의 마우스를 개별 종양 부피에 의해서 10마리 동물의 5개의 군으로 무작위화하였다.

ㆍ 군 1로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 비히클을 i.t. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 2로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 4.75x10⁶의 용량으로 VVTG18058를 i.t. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 3으로부터의 마우스에게 D0, D2 및 D4에 4.75x10⁶의 용량으로 COPTG19407을 i.t. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 4로부터의 마우스에게 D7, D10, D14, D17, D21 및 D24에 250 μg의 항-PD-1 항체를 i.p. 투여로 제공하였고,

ㆍ 군 5로부터의 마우스에게 D7, D10, D14, D17, D21 및 D24에 250 μg의 용량의 항-PD-1 항체의 i.p. 투여와 조합하여 D0, D2 및 D4에 4.75x10⁶ pfu의 용량의 COPTG19407을 i.t. 투여로 제공하였다.

종양 배가 시간, 종양 성장 지연 및 종양 성장 저해(T/C%)의 기준을 평가함으로써 연구 전체에서 모든 동물의 종양 부피를 모니터링하였다.

항종양 활성:

종양 배가 시간은 군 1, 2 및 4의 경우 대략 5.4일로 유사하였다. 군 3의 경우, 종양 배가 시간을 계산할 수 없었는데, 그 이유는 대부분의 종양이 기하 급수적으로 성장하지 않았기 때문이며, 이는 군 1, 2 및 4에 비해서 증가된 치료 효능을 나타낸다. 유사한 효과가 군 5에서 관찰되었는데, 여기서는 1마리의 동물만을 종양 배가 시간의 계산을 위해서 사용하였다. 개별 종양 부피의 그래프(도 40)로부터 인지될 수 있는 바와 같이, 군 3에서 10마리 마우스 중 8마리는 D15에 퇴행되고, 부피가 실질적으로 성장하지 않는 종양을 가졌고, 7마리의 마우스는 D61에 연구 종료 시에 검출 가능한 종양을 갖지 않았다. 유사하게, 군 5에서, 종양은 치료 시작 후 9마리의 마우스에서 퇴행하여, D56에 연구 종료 시에 0(n = 8) 내지 13.24 mm³ 범위의 값에 도달하였다.

종양이 평균 목표 부피 200 mm³에 도달하는 데 걸리는 시간을 추정하여 종양 성장 지연을 계산하였다. 이 매개변수는 200 mm³의 목표 부피에 도달한 종양에 대해서만 계산될 수 있었기 때문에 결과는 종양 배가 시간으로 얻은 결과와 유사하였고, 이는 군 3 및 군 5의 대부분의 동물에 해당되지 않았다. 군 1, 2 및 4는 대략 19일의 평균 종양 성장 지연을 나타내었다. 또한, 군 3 및 5(두 군의 경우 n = 2)는 각각 24 및 12일의 성장 지연을 나타내었다. 이는, 이러한 2개의 군에서 성장한 종양이 군 1, 2 및 4에서의 속도와 유사한 속도로 성장하였다는 것을 나타내었다. 군 간에는 어떠한 유의한 차이도 존재하지 않았다.

비히클 처리군 1의 중위 종양 부피를 다른 처리군과 비교함으로써 종양 성장 저해(T/C%)를 계산하였다. 군 2는 D28에 일시적인 미미한 종양 성장 저해를 나타내었지만, D31에 79%까지 증가하였다. 군 4는 항-종양 활성을 나타내지 않았고, 연구 기간 동안 T/C%는 60% 초과였다. 이에 비해, 군 3 및 군 5 둘 다는 D24에서 D31(T/C %의 마지막 계산 가능한 값)까지 현저한 항-종양 활성(T/C% 10 % 미만)을 나타냈다.

도 41은 피하 EMT6 종양을 보유하는 BALB/cByJ 마우스에 대한 평균 종양 부피 곡선을 예시하는데, 이는 종양 성장에 대한 항-PD1과 함께 또는 이것 없이 항-CTLA4/GM-CSF 발현 바이러스 COPTG19407의 극적인 효과를 입증한다.

CT26 재시험감염

특이적 항종양 면역 반응이 상승되었는지를 연구하기 위해서, 10⁴, 10⁵ 또는 10⁶ pfu의 COPTG19421 또는 10⁶ pfu의 COPTG19407로의 처리 후 살아남은 CT26 종양 세포로 시험감염된 Balb/c 마우스를 CT26 종양 세포로 재시험감염시키거나 Renca 세포(신장 선암종 세포: 대조군)로 시험감염시켰다.

표 8에 제공된 결과는, COPTG19421 또는 COPTG19407이 제공된 0/8마리의 마우스가 RenCa 시험감염 후 종양이 없었지만, COPTG19421 또는 COPTG19407이 제공된 7/10마리의 마우스는 CT26 재시험감염 후 종양이 없었음을 나타낸다. 이는, COPTG19421 및 COPTG19407이 CT26 세포에 대해서 특이적 면역 기억을 상승시켰다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> BioInvent International AB Transgene SA <120> NOVEL ANTIBODIES AND NUCLEOTIDE SEQUENCES, AND USES THEREOF <130> BI86 <150> EP18192311.1 <151> 2018-09-03 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X in position 2 is S or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X in position 3 is D, S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X in position 5 is Y, S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X in position 7 is S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X in position 9 is V or I <400> 1 Phe Xaa Xaa Tyr Xaa Met Xaa Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X in position 3 is D or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X in position 3 is Y, S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X in position 3 is S or N <400> 2 Phe Ser Xaa Tyr Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X in position 3 is D or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X in position 5 is Y or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X in position 5 is S or N <400> 3 Phe Ser Xaa Tyr Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X in position 2 is G or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X in position 5 is W, G or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X in position 6 is S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X in position 7 is S or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X in position 8 is R or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X in position 9 is D, S or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X in position 10 is K, T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X in position 11 is G, Y, H or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X in position 12 is Y or F <400> 4 Ser Xaa Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X in position 2 is G or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X in position 5 is W, G or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X in position 6 is S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X in position 7 is S or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X in position 8 is R or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X in position 9 is D, S or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X in position 10 is K, T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X in position 11 is G, Y, H or D <400> 5 Ser Xaa Ile Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X in position 2 is G or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X in position 5 is W or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X in position 7 is S or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X in position 8 is R or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X in position 9 is D or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X in position 10 is K or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X in position 11 is G or Y, H or D <400> 6 Ser Xaa Ile Ser Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X in position 1 is T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X in position 2 is T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X in position 3 is D, Y or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X in position 4 is L, R, S, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X in position 5 is A, V, S or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X in position 6 is R, E, G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X in position 6 is Y, M, L or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X in position 8 is N, H, Y or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X in position 9 is Q, D or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X in position 10 is W, A, D or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X in position 11 is L, F, R or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X in position 12 is A, D, G or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X in position 13 is D, I, M or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X in position 14 is D or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X in position 15 is V or none <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X in position 1 is T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X in position 2 is T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X in position 4 is L or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X in position 5 is A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X in position 6 is R or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X in position 7 is Y or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X in position 8 is N or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X in position 9 is Q or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X in position 10 is W or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X in position 11 is L or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X in position 12 is A or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X in position 13 is D or none <400> 8 Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X in position 2 is T or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X in position 10 is A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X in position 11 is G or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X in position 13 is D or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X in position 14i s V or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X in position 15 i s H or none <400> 9 Cys Xaa Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 1 5 10 15 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X in position 1 is G, R, or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X in position 3 is D, N, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X in position 4 is N, Q or K <400> 11 Xaa Asn Xaa Xaa Arg Pro Ser 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X in position 1 is G or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X in position 3 is D or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X in position 3 is N or Q <400> 12 Xaa Asn Xaa Xaa Arg Pro Ser 1 5 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X in position 2 is A or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X in position 3 is V, A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X in position 4 is W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X in position 6 is D or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X in position 9 is N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X in position 11 is V, W or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X in position 13 is V or none <400> 13 Cys Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Ser Leu Xaa Gly Xaa Val Xaa 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X in position 3 is V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X in position 11 is V or W <400> 14 Cys Ala Xaa Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Xaa Val 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Gly Ile Ser Trp Ser Ser Arg Asp Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Thr Thr Asp Leu Ala Arg Tyr 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Asn Asp Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val 1 5 10 <210> 20 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Ser Ser Arg Asp Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Asp Leu Ala Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Asp Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ala Arg Asp Arg Val Glu Met Asn Gln Trp Leu Ala Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val 1 5 10 <210> 27 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Glu Met Asn Gln Trp Leu Ala Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Thr Tyr Ser Ser Gly Leu His Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp 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Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Phe Lys Ala Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 36 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ser Gly Ile Ser Asn Thr Gly Gly Ser Thr Asp Phe Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ala Arg Leu Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Asp Arg Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Pro Val Val 1 5 10 <210> 41 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Glu Val Gln Leu 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Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu 65 70 75 80 Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser 85 90 95 Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr 100 105 110 Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu 115 120 125 Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Val Gln Lys 130 135 140 <210> 59 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter p7.5K <400> 59 ccacccactt tttatagtaa gtttttcacc cataaataat aaatacaata attaatttct 60 cgtaaaagta gaaaatatat tctaatttat tgcacggtaa ggaagtagaa tcataaagaa 120 cagt 124 <210> 60 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter pH5.R <400> 60 tttattctat acttaaaaaa tgaaaataaa tacaaaggtt cttgagggtt gtgttaaatt 60 gaaagcgaga aataatcata aattatttca ttatcgcgat atccgttaag tttg 114 <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter pSE/L <400> 61 aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 40 <210> 62 <211> 236 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62 Met 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Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His 210 215 220 Thr Val Glu Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser 225 230 235 <210> 63 <211> 469 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Val Glu Met Asn Gln Trp Leu Ala Asp 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala 130 135 140 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser 145 150 155 160 Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr 195 200 205 Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala 210 215 220 His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly 225 230 235 240 Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val 260 265 270 Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val 290 295 300 Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met 325 330 335 Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln 370 375 380 Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr 385 390 395 400 Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr 405 410 415 Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser 435 440 445 Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser 450 455 460 Arg Thr Pro Gly Lys 465

Claims (34)

1. CTLA-4에 특이적으로 결합하고, 이필리무맙에 비해서 CTLA-4 양성 세포에 대해서 개선된 고갈 효과(depleting effect)를 갖는, 항체 분자.
2. 제1항에 있어서, 이필리무맙에 비해서 CD4 양성 세포에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는, 항체 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이필리무맙에 비해서 Treg에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는, 항체 분자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 하기 시험에서 개선된 고갈을 제공하면, CTLA-4 양성 세포, CD4 양성 세포 및/또는 Treg에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는 것으로 간주되는, 항체 분자:
   (i) GFP와 함께 CD16-158V 대립유전자를 발현하도록 안정적으로 형질주입된 NK-92 세포주를 사용하여 수행되는 시험관내 ADCC 시험이되, ADCC 시험은 하기 연속적인 단계를 포함하는, 시험:
   1) 표적 세포로서의 CTLA-4 양성 세포, CD4 양성 세포 또는 Treg를 건강한 공여자로부터 단리하는 단계;
   2) 이어서 표적 세포를 CD3/CD28 및 rhIL-2로 자극시키는 단계;
   3) 이어서 표적 세포를 항체 분자와 함께 사전 인큐베이션시키고, 이어서 NK 세포와 혼합하는 단계;
   4) 이어서 표적 세포를 1 HEPES 완충액, 피루브산 나트륨 및 FBS 저 IgG를 함유하는 RPMI 1640 + GlutaMAX 배지에서 인큐베이션시키는 단계;
   5) 유세포 분석법에 의해서 용해를 결정하는 단계;
   6) 단계 3에서 항체 분자 대신에 이필리무맙을 사용하여 단계 1 내지 5를 반복하거나 또는 동시에 수행하는 단계; 및
   7) 항체 분자에 대한 용해 결과를 이필리무맙에 대한 용해 결과와 비교하고, 이필리무맙에 비해서 항체 분자에 대한 개선된 용해는, 항체 분자가 CTLA-4 양성 세포, CD4 양성 세포 및/또는 Treg에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는다는 것을 나타내는 단계; 및/또는
   (ii) PBMC-NOG/SCID 모델에서의 생체내 시험이되, 생체내 시험은 하기 연속적인 단계를 포함하는, 시험:
   1) 인간 PBMC를 단리하고, 세척하고, 멸균 PBS 중에 재현탁하는 단계;
   2) NOG 마우스에게 단계 1)로부터의 세포 현탁액을 i.v.로 주사하는 단계;
   3) NOG 마우스로부터의 비장을 단리하고, 단일 세포 현탁액으로 만드는 단계;
   4) 단계 3)으로부터의 세포 현탁액을 멸균 PBS 중에 재현탁하는 단계;
   5) SCID 마우스에게 단계 4로부터의 현탁액을 i.p.로 주사하는 단계;
   6) 이어서 SCID 마우스를 항체 분자, 이필리무맙 또는 아이소타입 대조군 단클론성 항체 중 어느 하나로 처리하는 단계;
   7) 처리된 SCID 마우스의 복강내 유체를 수집하는 단계;
   8) 인간 T 세포 하위세트를 식별하고, 하기 마커: CD45, CD4, CD8, CD25, CD127을 사용하여 FACS에 의해서 정량하는 단계;
   9) 항체 분자로 처리된 마우스로부터의 T 세포 하위세트의 식별 및 정량으로부터의 결과를 이필리무맙으로 처리된 마우스로부터의 T 세포 하위세트의 식별 및 정량으로부터의 결과 및 아이소타입 대조군 단클론성 항체로 처리된 마우스로부터의 T 세포 하위세트의 식별 및 정량으로부터의 결과와 비교하고, 이필리무맙으로 처리된 마우스로부터의 복강내 유체 중의 CTLA-4 양성 세포, CD4 양성 세포 및/또는 Treg의 수와 비교하여 시험될 항체 분자로 처리된 마우스로부터의 복강내 유체 중의 CTLA-4 양성 세포, CD4 양성 세포 및/또는 Treg의 더 적은 수는 항체 분자가 이필리무맙에 비해서 CTLA-4 양성 세포, CD4 양성 세포 및/또는 Treg에 대해서 개선된 고갈 효과를 갖는다는 것을 나타내는 단계.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자는 서열번호 3, 6, 8, 10, 12 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 1 내지 6개를 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 분자.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자는 CDR VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1 및 VL-CDR3 중 1 내지 6개를 포함하는 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택되되,
   VH-CDR1은, 존재하는 경우, 서열번호 15, 22, 29 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VH-CDR2는, 존재하는 경우, 서열번호 16, 23, 30 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VH-CDR3은, 존재하는 경우, 서열번호 17, 24, 31 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VL-CDR1은, 존재하는 경우, 서열번호 10 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VL-CDR2는, 존재하는 경우, 서열번호 18, 25, 32 및 39로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   VL-CDR3은, 존재하는 경우, 서열번호 19, 26 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자는 서열번호 15, 16, 17, 10, 18 및 19를 갖는 6개의 CDR 또는 서열번호 22, 23, 24, 10, 25 및 26을 갖는 6개의 CDR을 포함하는, 항체 분자.
8. CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 분자로서, 항체 분자는 서열번호 15, 16, 17, 10, 18 및 19를 갖는 6개의 CDR 또는 서열번호 22, 23, 24, 10, 25 및 26을 갖는 6개의 CDR을 포함하는, 항체 분자.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자는 서열번호 20 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 및/또는 서열번호 21 및 28로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 경쇄를 포함하는, 항체 분자.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자는 중쇄 불변 영역 서열번호 43 및/또는 경쇄 불변 영역 서열번호 44를 포함하는, 항체 분자.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자는 CTLA-4에 대한 결합에 대해서 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자와 경쟁할 수 있는 항체 분자인, 항체 분자.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자는 전체-크기 항체(full-size antibody), 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab, Fv, scFv, Fab', 및 (Fab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 분자.
13. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CTLA-4(hCTLA-4) 및/또는 시노몰거스 원숭이 CTLA-4(cmCTLA-4) 및/또는 뮤린 CTLA-4(mCTLA-4)에 결합하는, 항체 분자.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD28에 결합하지 않는, 항체 분자.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자는 인간 IgG 항체, 인간화된 IgG 항체 및 인간 기원의 IgG 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 분자.
16. 제15항에 있어서, 상기 항체 분자는 인간 IgG1 항체인, 항체 분자.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자는 단클론성 항체인, 항체 분자.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자를 암호화하는 단리된 뉴클레오티드 서열.
19. 제18항에 있어서, 서열번호 45 내지 52로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진, 단리된 뉴클레오티드 서열.
20. 제18항 또는 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 플라스미드.
21. 제18항 또는 제19항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 제20항에 정의된 바와 같은 플라스미드를 포함하는, 바이러스.
22. 제21항에 있어서, 종양용해성 바이러스(oncolytic virus) 및 바람직하게는 종양용해성 폭스바이러스인, 바이러스.
23. 제22항에 있어서, 상기 폭스바이러스는 코르도폭스비리대(Chordopoxviridae) 서브패밀리, 보다 바람직하게는 오르토폭스바이러스 속(Orthopoxvirus genus) 바람직하게는 로 이루어진 군으로부터 선택 백시니아 바이러스(Vaccinia virus), 우두 바이러스(cowpox virus), 카나리폭스 바이러스(canarypox virus), 엑트로멜리아 바이러스(ectromelia virus) 및 점액종 바이러스(myxoma)에 속하는, 바이러스.
24. 제23항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스는 티미딘 키나제(thymidine kinase: TK) 활성 및/또는 리보뉴클레오티드 리덕타제(ribonucleotide reductase: RR) 활성에 결함이 있고, 서열번호 20 및 서열번호 21 또는 서열번호 53 및 서열번호 54를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백시니아 바이러스인, 바이러스.
25. 제24항에 있어서, 상기 종양용해성 백시니아 바이러스는 인간 GM-CSF(예를 들어, 서열번호 55 또는 서열번호 56을 가짐) 또는 뮤린 GM-CSF(예를 들어, 서열번호 57 또는 서열번호 58을 가짐)에 대해서 특이적 선호도를 갖는, GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는, 바이러스.
26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄를 암호화하는 카세트가 J2R 유전자좌에 삽입되고, 경쇄를 암호화하는 카세트가 I4L 유전자좌에 삽입된, 바이러스.
27. 제18항 또는 제19항에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 제20항에 정의된 바와 같은 플라스미드 또는 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 바이러스를 포함하는, 세포.
28. 의약에 사용하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자, 제18항 또는 제19항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제20항에 따른 플라스미드, 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 또는 제27항에 따른 세포.
29. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자, 제18항 또는 제19항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제20항에 따른 플라스미드, 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 또는 제27항에 따른 세포.
30. 암의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자, 제18항 또는 제19항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제20항에 따른 플라스미드, 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 또는 제27항에 따른 세포의 용도.
31. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자, 제18항 또는 제19항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제20항에 따른 플라스미드, 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 또는 제27항에 따른 세포 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 이들로 이루어진, 약제학적 조성물.
32. 암의 치료에 사용하기 위한, 제31항에 따른 약제학적 조성물.
33. 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 분자, 제18항 또는 제19항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열, 제20항에 따른 플라스미드, 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 바이러스, 제27항에 따른 세포 또는 제31항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
34. 암이 고형암인, 제24항에 따른 사용하기 위한 항체 분자, 제29항에 따른 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열, 제29항에 따른 사용하기 위한 플라스미드, 제29항에 따른 사용하기 위한 바이러스, 제29항에 따른 사용하기 위한 세포, 제30항에 따른 용도, 제32항에 따른 약제학적 조성물 또는 제33항에 따른 방법.

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