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KR20210046024A - 항-IL-1β 항체, 이의 약학적 조성물 및 용도 - Google Patents

항-IL-1β 항체, 이의 약학적 조성물 및 용도 Download PDF

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KR20210046024A
KR20210046024A KR1020217007489A KR20217007489A KR20210046024A KR 20210046024 A KR20210046024 A KR 20210046024A KR 1020217007489 A KR1020217007489 A KR 1020217007489A KR 20217007489 A KR20217007489 A KR 20217007489A KR 20210046024 A KR20210046024 A KR 20210046024A
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seq
human
chain variable
amino acid
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KR1020217007489A
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바이용 리
유 시아
종민 맥스웰 왕
펭 장
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아케소 바이오파마, 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 면역학 분야에 속하며, 항-IL-1β 항체 및 이의 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항-IL-1β 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것으로, 여기서 항체의 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 17-서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고; 항체의 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 20-서열번호 22에 제시된 LCDR1-LCDR3을 포함한다. 본원에 기재된 항체는 인간 IL-1β에 효과적으로 결합하고, IL-1β의 이의 수용체 IL-1R1에 대한 결합을 차단하고, IL-1β의 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 억제할 수 있고, 자가면역 질환, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군, 전신성 소아 특발성 관절염, 통풍성 관절염, 심혈관 질환 또는 종양을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 가능성을 갖는다.

Description

항-IL-1β 항체, 이의 약학적 조성물 및 용도
본 발명은 면역학 분야에 속하며, 항-IL-1β 항체, 이의 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항-인간 IL-1β 항체에 관한 것이고; 보다 구체적으로, 본 발명은 항-인간 IL-1β 모노클로날 항체에 관한 것이고; 더욱 구체적으로, 본 발명은 항-인간 IL-1β 인간화 모노클로날 항체에 관한 것이다.
인터류킨-1(IL-1) 패밀리는 2개의 전염증성 인자(IL-1α 및 IL-1β) 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)로 이루어지며, 여기서 IL-1α 및 IL-1β는 IL-1 수용체를 효과적으로 활성화시킬 수 있고, IL-1Ra는 IL-1 수용체의 표면에 부착하여 신호전달을 차단할 수 있다. IL-1β는 주로 단핵세포 및 대식세포에 의해 합성된다. 카스파제-1에 의해 절단되면, IL-1β 전구체 단백질이 활성화될 수 있다. IL-1 수용체 패밀리에는 IL-1R1, IL-1R2, IL-1R3(IL-1 수용체 보조 단백질 또는 IL-1RAcP로도 공지됨), IL-1R4, IL-1R5, IL-1R6, IL-1R7, IL-1R8, IL-18BP 및 2개의 희귀(orphan) 수용체(IL-1R9 및 IL-1R 10)를 포함한 다수의 리간드 서브타입이 있다.
최근, IL-1β는 IL-1R1 및 IL-1R2에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. IL-1R1(1형 IL-1 수용체 또는 IL-1R1로도 공지됨)은 막횡단 수용체이며, 이는 IL-1β 및 IL-1RAcP에 결합하여 수용체 복합체를 형성하여 관련 다운스트림 세포내 신호전달 경로를 활성화시키고 IL-1β 관련된 생물학적 효과를 매개한다. IL-1R2는 IL-1R1보다 IL-1β에 대해 더 높은 친화도를 갖지만; IL-1R2는 더 짧은 세포내 분절로 인해 IL-1β에 결합한 후 관련된 관련 세포내 신호전달 경로를 활성화할 수 없다. IL-1R1과 IL-1R2는 모두 가용성 형태로 존재할 수 있다(Boraschi et al. Immunological Reviews. 281:197-232. (2018)).
IL-1β는 선천 및 적응 면역에 관련된 이펙터 세포의 동원 및 활성화를 조절하며, 통풍성 관절염; 다양한 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 및 주기적 열 증후군, 및 자가염증 질환, 예컨대 전신성 소아 특발성 관절염의 발병기전 뿐만 아니라; 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군과 같은 질환의 발생에도 관련된다. IL-1β 경로는 최근 종양, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 간암, 폐암, 심혈관 및 뇌혈관 질환 발생에 관련되는 것으로 확인되었으며, IL-1β를 표적으로 하는 약물은 좋은 치료 및 예방 효과를 보여주었다(Cozzolino F et al. Proc Natl Acad Soci USA. 86:2369 (1989); Nakazaki H et al. Cancer. 70(3):709 (1992); Ridker PM et al.Lancet. 390(10105):1833-1842 (2017)).
류마티스 관절염(RA)은 관절 병변이 우세한 만성 및 전신성 자가면역 질환이다. IL-1β는 RA 발병에 중요한 역할을 한다. RA 환자의 활액에는 높은 수준의 IL-1β가 존재하며(van den Berg et al. Baillieres Best Pract Res Clin Rheumatol. 13:577-97(1999)), IL-1β는 관절에서 백혈구 침윤 및 기질 메탈로프로테이나제의 분비를 매개하고, 연골 분해를 유도하고, 새로운 연골 기질 합성을 억제하여 관절 파괴를 유발한다(van den Berg et al. Baillieres Best Pract Res Clin Rheumatol. 13:577-97 (1999); Johnson LL et al. Curr Opin Chem Biol. 2:466-471 (1998)). RA 환자에서, IL-1β는 파골세포의 분화 및 활성화를 자극하고 RA에 영향을 받은 관절에서 골 침식 발생에 관련된다(Gravallese EM et al. Ann Rheum Dis. 61:ii 84-86 (2002); Ghivizzani SC et al. J Immunol. 1:3604-12 (1997); Horai R et al. J Exp Med. 191:313-20 (2000); Gravallese EM et al. Arthritis Rheum. 43:250-8 (2000); Takayanagi H et al. Arthritis Rheum. 43:259-69 (2000)). 또한, IL-1β는 TNF-α 및 IL-6을 수반하는 경로를 조절하여 활막에서 백혈구 침윤 및 판누스 조직 형성 뿐만 아니라 골 손실을 촉진한다(Strand V et al. Rheumatology (Oxford). 43:iii10-iii16 (2004)). 임상 연구는 IL-1β 길항제가 RA의 물리적 징후 및 증상을 상당히 완화시키고(Mertens M et al. J Rheumatol. 36(6):1118-25 (2009)) 항-인간 IL-1β mAb 카나키누맙(Ilaris®)이 RA 환자의 질환 활성을 상당히 감소시킨다는 것을 입증하였다(Alten R et al. Arthritis Res Ther. 10:R67 (2008); Alten R et al. BMC Musculoskeletal Disorders. 12:153 (2011)).
통풍은 요산일나트륨의 침착에 의해 야기되는 결정 관련된 관절병으로, 퓨린 대사 장애 및/또는 요산 배설 감소로 인한 고요산혈증과 직접적으로 관련이 있으며, 특히 급성 특징을 나타내는 관절염 및 만성 통풍 결석 질환을 지칭하며, 주로 급성 발병 관절염, 토푸스 형성, 토푸스 만성 관절염, 우레이트 신장병 및 요산 리탕기우리아(lithangiuria), 심지어 심한 경우 관절 장애 및 신부전을 포함한다. 통풍은 종종 복부 비만, 고지혈증, 고혈압, 2형 당뇨병, 심혈관 질환 등을 동반한다. IL-1β는 통풍 염증의 발생을 유발하는 요인이다(Cumpelik A et al. Ann Rheum Dis. pii: annrheumdis-2015-207338 (2015)). 한 연구에 따라, 통풍성 관절염을 갖는 환자에서, 말초 혈액의 단일 단핵세포의 IL-1β mRNA 및 혈청 IL-1β 둘 다의 발현은 건강한 대조군의 발현보다 현저하게 높고, 급성기군의 발현은 만성기군 및 간헐기군보다 현저하게 높으며; 혈청 IL-1β의 농도는 백혈구, 호중구 과립구 및 적혈구 침강 속도와 같은 지표와 양의 상관 관계가 있으며(이는 IL-1β가 급성 및 만성 통풍성 관절염 둘 다에 관련될 수 있음을 시사함), 염증의 정도와도 관련이 있으며; 간헐기군의 혈청 IL-1β 농도는 건강한 대조군보다 현저하게 높다(이는 관절의 증상이 사라지더라도 관절 및 조직의 염증이 여전히 존재할 수 있음을 시사함)는 것이 밝혀졌다(Li Lingqin et al. Chinese Journal of General Practitioners. 14: 29-31 (2015)). 동물 실험에 따라, IL-1β는 급성 및 만성 통풍성 관절염 둘 다에서 중요한 역할을 하며, 우레이트 결정은 혈액 및 활액에서 단핵세포 및 식세포를 자극하여 IL-1β의 대량 방출을 유발한다는 것이 밝혀졌다(Di Giovine FS et al. J Immunol. 138: 3213-3218 (1987)). 마우스 모델 실험에서, IL-1β 차단제는 우레이트 결정의 복강 주사로 인한 호중구 응집을 방지할 수 있으며, 마우스에서 IL-1β 수용체가 결여된 부위에는 응집이 없다는 것이 밝혀졌다(Martinon F et al. Nature. 440:237-241 (2006)). 임상 연구에 따라, IL-1β는 급성 통풍 발작 동안 많은 수의 전염증성 시토카인의 생성을 유발한다는 것이 밝혀졌다(Amaral FA et al. Arthritis Rheum. 64: 474-484 (2012); Torres R et al. Ann Rheum Dis. 68: 1602-1608 (2009)).
통풍 치료의 효능 및 안전성을 평가하기 위한 임상 시험에서, 항-인간 IL-1β 모노클로날 항체 카나키누맙은 불응성 통풍성 관절염을 갖는 환자의 통증과 같은 임상 증상을 효과적으로 완화시키고, 트리암시놀론 아세토나이드와 비교하여 통풍의 재발을 분명히 감소시키며, 삶의 질을 개선할 수 있다는 것이 밝혀졌다(So A et al. Arthritis Rhum. 62: 3064-3076(2010)). 또 다른 임상 연구에서, 항-인간 IL-1β 모노클로날 항체 카나키누맙은 콜히친과 비교하여 통풍 발작 횟수를 상당히감소시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다(Schlesinger N et al. Ann Rheum Dis. 70: 1264-1271(2011)). mAb 카나키누맙은 현재 잦은 통풍성 관절염 발작을 앓고 있고 비스테로이드성 소염 약물, 콜히친 및 글루코코르티코이드를 견디거나 이에 반응하는 데 실패한 환자의 치료를 위해 유럽의약국에 의해 승인되었다(Lyseng-Williamson KA et al. BioDrugs. 27: 401-406 (2013)). 상기의 연구는 항-IL-1β 항체가 기존 치료에 비해 보다 효과적으로 통풍을 치료하고 증상을 완화시키며 재발을 감소시켜 통풍 발작에 대한 잠재적인 예방 및 치료 효과를 발휘할 수 있음을 시사한다.
다발성 경화증은 주로 Th1 및 Th17 서브세트의 T 세포에 의해 매개되는 만성 탈수초성 질환이다. 인터루킨 IL-1 패밀리 인자는 다발성 경화증 발생에 매우 중요하다. IL-1은 Th17 서브세트의 T 세포의 성장을 가속화하여 질환 진행을 촉진하고, 또한 탈분극 분포가 달성될 때까지 실질의 정상적인 위치로부터 내피의 양쪽으로 대뇌 혈관에서 케모카인 CXCL12의 분포를 유도하여 초기 질환 진행 동안 혈관 누출 및 T 세포의 뇌 실질로의 진입을 초래한다(Chih-Chung Lin et al. J Immunol. 198:4553-4560 (2017)). 동물 연구에 따라, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 IL-1 또는 IL-1R1 결핍 마우스에서 유도되지 않으며, IL-1β 억제제로 치료하면 야생형 마우스에서 발병을 지연시키고 중증도를 감소시키며 EAE의 기간을 단축시킬 수 있다는 것이 입증되었다(Chih-Chung Lin et al. J Immunol. 198:4553-4560 (2017)).
최근 임상 연구에 따라, 항-IL-1β 항체는 IL-1β 경로를 길항하여 소염 효과를 발휘하여 심혈관 질환의 위험을 상당히 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 죽상동맥경화증 및 혈전증은 관상동맥 심장 질환의 병적 근거이다(Dalek os GN et al. J Lab Clin Med. 129:300 (1997)). 고콜레스테롤 및 죽상동맥경화증의 토끼 모델에서, IL-1β와 IL-1β mRNA의 발현이 지질 플라크에서 증가되고 IL-1 합성을 감소시키면 죽상동맥경화증 진행을 지연시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다(Dinarell o CA et al. N Engl J Med. 328: 106 (1993)). IL-1β의 수준은 심근경색 동안 증가하고, IL-1β의 발현은 심근경색 후 리모델링 동안 혈장 및 국소 심근경색 부위 둘 다에서 증가하며, 이는 IL-1β가 심근경색 후 심근 비대, 심근 섬유증 및 기능부전의 발생 및 진행에 관련됨을 사한다(Yue P et al. Am J Physiol. 275(1Pt2): H250 (1998)). 심부전은 복합 증후군이며, 연구에 따르면 울혈성 심부전을 갖는 환자의 순환 혈액에서 IL-1 수준 증가가 발생한다(Blum A et al. Am Heart J. 135 (2 Part 1): 181 (1998); Kapadia S et al. Cardiol Clin. 16(4): 645 (1998)). IL-1β는 만성 부하 증가로 인한 울혈성 심부전의 발생 및 진행에 관련될 수 있고; 혈청 IL-1β 수준은 III-IV 등급 심부전을 갖는 환자에서 현저하게 상승되어 울혈성 심부전의 진행을 촉진한다(Yndestad A et al. Curr Cardiol Rep. 9:236-41 2007)). 염증성 죽상동맥경화성 심혈관 질환과 결합된 이전의 심근경색에 대한 항-인간 IL-1β 항체 카나키누맙의 효능, 안전성 및 내약성을 평가한 III상 CANTOS 임상 연구에서, 항-IL-1β 항체는 표준 치료와 조합하여 환자의 심장 사망, 비치명적 심근경색 및 비치명적 뇌혈관 사고 발생률을 상당히 감소시킨다는 것이 밝혀졌다(Ridker PM et al. N Engl J Med. 377:1119-1131 (2017)).
항-인간 IL-1β 항체 카나키누맙에 대한 CANTOS 임상 연구 코호트의 또 다른 분석은, 항-IL-1β 항체 카나키누맙이 폐암의 발생 및 사망 위험을 상당히 감소시킨다는 것을 밝혀내었다(Ridker PM et al. 390(10105):1833-1842 (2017))Lancet. 환자로부터의 급성 골수성 백혈병(AML) 세포의 시험관내 배양에서, IL-1의 발현이 원발성 AML 환자의 80% 초과에서 증가되며, IL-1β는 종양 세포 성장을 상당히 촉진할 수 있는 반면, 항-IL-1β 또는 IL-1α 항체는 종양 세포 성장을 억제하는 데 효과적이라는 것이 밝혀졌다(Cozzolino F et al. Proc Natl Acad Soci USA. 86: 2369 (1989)). 간세포 암종을 갖는 환자에서, 혈청 내 IL-1 수준은 건강한 대조군과 비교하여 상당히 증가된다(Nakazaki H et al. Cancer. 70(3):709 (1992)).
소아 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군(CAPS)은 단일 유전자 돌연변이로 인한 IL-1β의 과잉생성으로 인해 초래되는 희귀 질환으로, 신생아 또는 영아에서 발생할 수 있는 쇠약, 홍조, 열, 두통, 관절통 및 결막염을 초래하고, 환자의 일생 동안 매일 발생할 수 있으며, 심각한 질환을 유발할 수 있고, 난청, 골 및 관절 기형, 중추 신경계 손상으로 인한 실명, 아밀로이드증으로 인한 신부전 및 조기 사망을 포함하여 장기간 잠재적으로 치명적일 수 있다. 어린이 및 성인의 CAPS는 가족성 한랭 자가염증 증후군(FCAS), 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells syndrome: MWS), 신생아 발병 다발계 염증 질환, 만성 영아 신경 피부 및 관절 증후군, 및 가족성 한랭 두드러기를 포함한다. 항-인간 IL-1β 항체 카나키누맙은 크리오피린 관련 주기적 증후군을 갖는 환자에서 임상 증상을 상당히 개선할 수 있으므로(Yokota S et al. Clin Exp Rheumatol. 35 Suppl 108(6):19-26. (2017); Kone-Paut I et al. Arthritis Care Res. (Hoboken); 69:903-911. (2017)), 식품의약국(FDA) 및 유럽의약국(EMA)에 의해 어린이(≥4세) 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군(CAPS) 치료용으로 승인되었다.
주기적 열 증후군은 면역계의 비감염성 활성화에 의해 재발성 및 지속적인 심각한 열 및 발병성 염증을 유발하는 희귀 자가면역 질환 그룹으로, 종종 장애로 이어지며, 관절통, 종창, 근육통, 발진 및 치명적 합병증이 동반될 수 있다(Wurster VM et al. Pediatr Ann. 40(1):48-54. (2011))). 주기적 열 증후군은 TNF 수용체 관련 주기적 증후군(TRAPS), 고-IgD 증후군(HIDS)/메발로네이트 키나제 결핍(MKD), 및 가족성 지중해열(FMF)을 포함한다. 임상 연구에 따라, 항-인간 IL-1β mAb 카나키누맙이 주기적 열 증후군 치료에 효과적일 수 있다는 것이 입증되었다(De Benedetti F et al. N Engl J Med. 378(20):1908-1919 (2018)). 따라서, 항-인간 IL-1β 모노클로날 항체 카나키누맙은 FDA 등에 의해 주기적 열 증후군 치료용으로 승인되었다.
전신성 소아 특발성 관절염(sJIA)은 소아 특발성 관절염의 독특한 서브타입으로, 주로 장기간 고열증, 발진 및 빈혈과 같은 관절외 증상으로 시작된다. 일반적으로, 0-5세 어린이에게서 발견되며, 주로 만성 관절활액막염을 특징으로 하며, 주로 상이한 정도의 기관 및 조직 손상을 동반한다. 주요 증상은 열, 발진, 관절통이며, 낮은 장기간 관해율, 높은 기능장애율 및 장애율, 높은 사망률과 같은 불량한 예후를 갖는다(Woerner A et al. Expert Rev Clin Immunol. 11(5):575-88. (2015)). 일반적으로, sJIA는 자가면역 질환이 아닌 자가염증 질환으로 인정된다(Sun Juan et al. Progress in Modern Biomedicine. 8:1584-1588 (2016)). 임상 연구에 따라, 항-인간 IL-1β 모노클로날 항체 카나키누맙은 열을 동반한 활성 sJIA를 효과적으로 치료하고 스테로이드 용량을 감소시키며 sJIA의 재발을 상당히 감소시킬 수 있다는 것이 입증되었다(Orrock JE et al. Expert Rev Clin Pharmacol. 9:1015-24. (2016)). 따라서 항-IL-1β 모노클로날 항체 카나키누맙은 FDA 등에 의해 전신성 소아 특발성 관절염 치료용으로 승인되었다.
새로운 항-IL-1β 항체의 개발이 여전히 필요하다.
집중적인 연구 및 창의적인 노력으로, 본 발명자들은 포유동물 세포 발현 시스템을 사용하여 재조합 IL-1β-His를 항원으로 발현하여 마우스를 면역시켰고, 마우스 비장 세포와 골수종 세포를 융합하여 하이브리도마 세포를 수득하였다. 본 발명자들은 다수의 샘플을 스크리닝하여 하기의 하이브리도마 세포주를 획득하였다:
차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(China Center for Type Culture Collection: CCTCC)에 CCTCC 번호 C2018133의 수탁 번호로 2018년 6월 21일에 기탁된 하이브리도마 세포주 LT010.
본 발명자들은 놀랍게도 하이브리도마 세포주 LT010은 인간 IL-1β에 특이적으로 결합하는 특정 모노클로날 항체(3H6으로 명명됨)를 분비 및 생성할 수 있으며, 모노클로날 항체는 IL-1β의 IL-1R1에 대한 결합을 매우 효과적으로 차단할 수 있다는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 인간 IL-1β에 효과적으로 결합하고, IL-1β의 이의 수용체(IL-1R1)에 대한 결합을 차단하고, IL-1β의 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 억제할 수 있는, 항-인간 IL-1β 인간화 항체(각각 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1로 명명됨)를 창조적으로 제조하였다. 또한, 이들 항-인간 IL-1β 인간화 항체는 류마티스 관절염, 통풍, 다발성 경화증, 심혈관 사건 및/또는 심혈관 질환, 종양, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군, 주기적 열 증후군, 및 전신성 소아 특발성 관절염과 같은 질환을 감소, 예방 또는 치료하기 위한 약제를 제조하는 데 사용될 가능성이 있다.
본 발명은 하기에 상세히 설명된다.
본 발명의 한 측면은 항-IL-1β 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것으로서,
항체는 각각 서열번호 17-서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
항체는 각각 서열번호 20-서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게는, IL-1β는 인간 IL-1β이다.
경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원의 결합을 결정하며; 각각의 쇄의 가변 영역은 3개의 초가변 영역, 즉 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다(중쇄(H)의 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하고, 경쇄(L)의 CDR에는 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함함; 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), Volumes 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md)에 의해 정의됨).
본원에 개시된 항체 3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1은 당업자에게 널리 공지된 기술적 수단, 예컨대 VBASE2 데이터베이스에 의한 분석에 따라 동일한 HCDR1-3 및 LCDR1-3을 갖는다.
중쇄 가변 영역의 3개의 HCDR 영역의 아미노산 서열은 하기와 같고:
HCDR 1: GFSLSTSGMG(서열번호 17),
HCDR 2: IYWDDDK(서열번호 18),
HCDR 3: ARSAYYSFAY(서열번호 19);
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다:
LCDR 1: QDVDTD(서열번호 20),
LCDR 2: WAS(서열번호 21),
LCDR 3: QQYSSYPT(서열번호 22).
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 및 서열번호 14로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 및 서열번호 16으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항체는 하기로부터 선택된다:
(1) 서열번호 2에 제시된 VH 및 서열번호 4에 제시된 VL;
(2) 서열번호 6에 제시된 VH 및 서열번호 8에 제시된 VL;
(3) 서열번호 10에 제시된 VH 및 서열번호 12에 제시된 VL; 및
(4) 서열번호 14에 제시된 VH 및 서열번호 16에 제시된 VL.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역 단편, 단일쇄 항체(예컨대, scFv), 인간화 항체, 키메라 항체, 및 디아바디로부터 선택된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항체는 10-5 M 미만, 예컨대 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 또는 10-10 M 미만 또는 이보다 작은 KD로 IL-1β 단백질에 결합하고; 바람직하게는 IL-1β는 비아코어(Biacore) 분자 상호작용 기기에 의해 측정된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항체는 약 100 nM 미만, 예컨대 약 10 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 0.9 nM 미만, 약 0.8 nM 미만, 약 0.7 nM 미만, 약 0.6 nM 미만, 약 0.5 nM 미만, 약 0.4 nM 미만, 약 0.3 nM 미만, 약 0.2 nM, 약 0.1 nM 미만 또는 이보다 작은 EC50으로 IL-1β 단백질에 결합한다. 구체적으로, EC50은 간접적 ELISA 방법으로 측정된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
항체는 뮤린 이외의 종으로부터, 예컨대 인간 항체로부터 유래되는 비-CDR 영역을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체의 불변 영역은 인간화되고, 예컨대 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, 예컨대 ACCESSION: P01857 또는 Ig 감마-4 쇄 C 영역, 예컨대 ACCESSION: P01861.1이고; 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, 예컨대 ACCESSION: P01834이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항체는 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 CCTCC 번호 C201813의 수탁 번호로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT010에 의해 생성되는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 또 다른 측면은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 소분자 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것으로서, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나이고; 바람직하게는, 소분자 약물은 소분자 세포독성 약물이고; 더욱 바람직하게는, 소분자 약물은 화학요법 약물이다.
화학요법 약물은 통상적인 종양 화학요법 약물, 예컨대 알킬화제, 항대사산물, 항종양 항생제, 식물-기반 항암제, 호르몬 및 면역학적 작용제일 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 항체-약물 접합체가 제공되며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커를 통해 소분자 약물에 연결되고; 링커는 당업자에게 공지된 것, 예컨대 히드라존 결합, 이황화 결합 또는 펩티드 결합일 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 항체-약물 접합체가 제공되며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편 대 소분자 약물의 몰비는 1:1-1:4, 예컨대 1:1, 1:2, 1:3, 또는 1:4이다.
본 발명의 또 다른 측면은 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역을 포함하는 이중 특이적 항체(이기능적 항체로도 공지됨)에 관한 것으로서, 여기서
제1 단백질 기능 영역은 IL-1β를 표적으로 하고,
제2 단백질 기능 영역은 IL-1β 이외의 표적, 예컨대 IL-17A를 표적으로 하고;
여기서 제1 단백질 기능 영역은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나이고;
바람직하게는, 이중 특이적 항체는 IgG-scFv 형태이고;
바람직하게는,
(1) 제1 단백질 기능 영역은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나이고, 제2 단백질 기능 영역은 단일쇄 항체이거나;
또는
(2) 제1 단백질 기능 영역은 단일쇄 항체이고, 이의 중쇄 가변 영역은 서열번호 17-서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고, 이의 경쇄 가변 영역은 서열번호 20-서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하고, 제2 단백질 기능 영역은 항체(예컨대, 모노클로날 항체)이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체가 제공되며, 여기서 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역은 직접적으로 또는 링커 단편을 통해 연결되고;
바람직하게는, 링커 단편은 (GGGGS)m이고, 이때 m은 양의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이거나; 또는
바람직하게는, 링커 단편은 SS(GGGGS)n이고, 이때 n은 양의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체가 제공되며, 여기서 항목 (2)에서,
단일쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 및 서열번호 14로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
단일쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 및 서열번호 16으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체가 제공되며, 여기서 항목 (2)에서,
단일쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 단일쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
단일쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 단일쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
단일쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 단일쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
단일쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 단일쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체가 제공되며, 여기서 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역의 수는 각각 독립적으로 1, 2, 또는 그 초과이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체가 제공되며, 여기서 항목 (2)에서, 모노클로날 항체의 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 불변 영역으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 특이적 항체가 제공되며, 여기서 단일쇄 항체는 항체 또는 모노클로날 항체의 중쇄의 C-말단에 연결된다.
본 발명의 또 다른 측면은 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것으로서, 여기서
항체 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 17-서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고, 항체 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 20-서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하고;
바람직하게는, 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 및 서열번호 14로부터 선택되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 및 서열번호 16으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는, 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시되거나; 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시되거나; 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10에 제시되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 12에 제시되거나; 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 14에 제시되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 16에 제시되고;
더욱더 바람직하게는, 단리된 핵산 분자는 하기를 포함한다:
서열번호 1 및 서열번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열,
서열번호 5 및 서열번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열,
서열번호 9 및 서열번호 11에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는
서열번호 13 및 서열번호 15에 제시된 뉴클레오티드 서열.
단리된 핵산 분자는 단일 핵산 분자 또는 다중 핵산 분자, 예컨대 2개의 핵산 분자일 수 있다. 단일 핵산 분자의 경우, 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 동일한 핵산 분자에 의해, 예컨대 동일한 핵산 분자에 위치된 동일하거나 상이한 발현 카세트에 의해 발현될 수 있다. 다중 핵산 분자, 예컨대 2개의 핵산 분자의 경우, 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 상이한 핵산 분자에 의해 발현될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 단리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 재조합 벡터의 수는 하나 이상일 수 있다. 다중(예컨대, 2개) 핵산 분자의 경우, 다중(예컨대, 2개) 핵산 분자는 동일한 재조합 벡터에 의해 또는 상이한 재조합 벡터에 의해 발현될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 단리된 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 숙주 세포를 적합한 조건에서 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 CCTCC 번호 C2018133의 수탁 번호로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT010에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본원에 개시된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 개시된 이중 특이적 항체 중 임의의 하나를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며; 임의로, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 자가면역 질환, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 종양, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군, 전신성 소아 특발성 관절염, 또는 통풍성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본원에 개시된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 개시된 이중 특이적 항체 중 어느 하나의 용도에 관한 것이며;
바람직하게는, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 및 주기적 열 증후군으로부터 선택되고;
바람직하게는, 주기적 열 증후군은 TNF 수용체 관련 주기적 증후군(TRAPS), 고-IgD 증후군(HIDS)/메발로네이트 키나제 결핍(MKD), 및 가족성 지중해열(FMF)로부터 선택되고;
바람직하게는, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군은 가족성 한랭 자가염증 증후군, 머클-웰스 증후군, 신생아 발병 다발계 염증 질환, 만성 영아 신경 피부 및 관절 증후군, 및 가족성 한랭 두드러기로부터 선택되고;
바람직하게는, 심혈관 및 뇌혈관 질환은 심근경색, 죽상동맥경화증, 동맥 혈전증, 및 뇌혈관 사고로부터 선택되고;
바람직하게는, 종양은 폐암, 간세포 암종, 및 급성 골수성 백혈병으로부터 선택되고;
바람직하게는, 통풍성 관절염은 급성 통풍성 관절염 또는 만성 통풍성 관절염이다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기의 제조에서 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본원에 개시된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 개시된 이중 특이적 항체 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다:
인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합을 차단하기 위한 약제,
인간 IL-1β의 활성 또는 수준을 하향 조절하기 위한 약제, 또는
인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합에 의해 매개되는 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 억제하기 위한 약제.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2는 세포 표면 상의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 용도는 비치료적 및/또는 비진단적이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본원에 개시된 항체-약물 접합체 또는 본원에 개시된 이중 특이적 항체는자가면역 질환, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 종양, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군, 전신-발병 소아 특발성 관절염, 또는 통풍성 관절염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이며;
바람직하게는, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 및 주기적 열 증후군으로부터 선택되고;
바람직하게는, 주기적 열 증후군은 TNF 수용체 관련 주기적 증후군(TRAPS), 고-IgD 증후군(HIDS)/메발로네이트 키나제 결핍(MKD), 및 가족성 지중해열(FMF)로부터 선택되고;
바람직하게는, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군은 가족성 한랭 자가염증 증후군, 머클-웰스 증후군, 신생아 발병 다발계 염증 질환, 만성 영아 신경 피부 및 관절 증후군, 및 가족성 한랭 두드러기로부터 선택되고;
바람직하게는, 심혈관 및 뇌혈관 질환은 심근경색, 죽상동맥경화증, 동맥 혈전증, 및 뇌혈관 사고로부터 선택되고;
바람직하게는, 종양은 폐암, 간세포 암종, 및 급성 골수성 백혈병으로부터 선택되고;
바람직하게는, 통풍성 관절염은 급성 통풍성 관절염 또는 만성 통풍성 관절염이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편, 본원에 개시된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 개시된 이중 특이적 항체는 하기에 사용하기 위한 것이다:
인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합 차단,
인간 IL-1β의 활성 또는 수준을 하향 조절, 또는
인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합에 의해 매개되는 다운스트림 신호전달 경로의 활성화 억제.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2는 세포 표면 상의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본원에 개시된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 개시된 이중 특이적 항체 중 어느 하나의 유효량을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 생체내 또는 시험관내 방법에 관한 것으로서, 여기서 방법은 하기로부터 선택된다:
인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합을 차단하는 방법,
인간 IL-1β의 활성 또는 수준을 하향 조절하는 방법, 및
인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합에 의해 매개되는 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 억제하는 방법.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2는 세포 표면 상의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 시험관내 방법은 비치료적 및/또는 비진단적이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본원에 개시된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 개시된 이중 특이적 항체 중 어느 하나의 유효량을 하기의 치료 및/또는 예방를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 종양, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군, 전신성 소아 특발성 관절염, 또는 통풍성 관절염을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이며;
바람직하게는, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 및 주기적 열 증후군으로부터 선택되고;
바람직하게는, 주기적 열 증후군은 TNF 수용체 관련 주기적 증후군(TRAPS), 고-IgD 증후군(HIDS)/메발로네이트 키나제 결핍(MKD), 및 가족성 지중해열(FMF)로부터 선택되고;
바람직하게는, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군은 가족성 한랭 자가염증 증후군, 머클-웰스 증후군, 신생아 발병 다발계 염증 질환, 만성 영아 신경 피부 및 관절 증후군, 및 가족성 한랭 두드러기로부터 선택되고;
바람직하게는, 심혈관 및 뇌혈관 질환은 심근경색, 죽상동맥경화증, 동맥 혈전증, 및 뇌혈관 사고로부터 선택되고;
바람직하게는, 종양은 폐암, 간세포 암종, 및 급성 골수성 백혈병으로부터 선택되고;
바람직하게는, 통풍성 관절염은 급성 통풍성 관절염 또는 만성 통풍성 관절염이다.
본 발명자들은 본원에 개시된 항체, 특히 3H6H4L1이 BALB/c 마우스에서 인간 IL-1β로 형질감염된 NIH/3T3 세포에 의해 유발된 류마티스 관절염 모델의 병적 변화를 효과적으로 완화시킬 수 있다는 것을 동물 실험으로부터 발견하였으며, 항체 3H6H4L1의 투여가 병적 행동을 효과적으로 개선하고 류마티스 마우스의 영향을 받은 사지의 종창 면적을 감소시킬 수 있다는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본 발명에서 사용되는 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험실 작업은 해당 분야에서 널리 사용되는 일상적인 작업이다. 한편, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해 관련 용어에 대한 정의 및 설명이 하기에 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, IL-1β의 아미노산 서열(진뱅크(GenBank) ID: NP_000567.1)을 지칭하는 경우, 이는 IL-1β 단백질의 전체 길이 뿐만 아니라 IL-1β의 융합 단백질, 예컨대 마우스 또는 인간 IgG Fc 단백질 단편(mFc 또는 hFc) 또는 다중 His에 융합된 단편을 포함한다. 그러나, 당업자는 IL-1β의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이(치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하지만 이에 제한되지 않음)가 이의 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 자연적으로 생성되거나 인위적으로 도입될 수 있음을 이해한다. 따라서, 본 발명에서 용어 "IL-1β"는 이러한 모든 서열 뿐만 아니라 이의 자연적 또는 인위적 변이체를 포함해야 한다. 또한, IL-1β 단백질의 서열 단편이 기술되는 경우, 이는 IL-1β의 서열 단편 뿐만 아니라 이의 자연적 또는 인위적 변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, IL-1R1의 아미노산 서열(진뱅크 ID: NP_000868)을 지칭하는 경우, 이는 IL-1R1 단백질의 전체 길이 뿐만 아니라 IL-1R1의 융합 단백질, 예컨대 마우스 또는 인간 IgG Fc 단백질 단편(mFc 또는 hFc) 또는 다중 His에 융합된 단편을 포함한다. 그러나, 당업자는 IL-1R1 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이(치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하지만 이에 제한되지 않음)가 이의 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 자연적으로 생성되거나 인위적으로 도입될 수 있음을 이해한다. 따라서, 본 발명에서 용어 "IL-1R1"은 이러한 모든 서열 뿐만 아니라 이의 자연적 또는 인위적 변이체를 포함해야 한다. 또한, IL-1R1 단백질의 서열 단편이 기술되는 경우, 이는 IL-1R1의 서열 단편 뿐만 아니라 이의 자연적 또는 인위적 변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, IL-1R2의 아미노산 서열(진뱅크 ID: CAA42441.1)을 지칭하는 경우, 이는 IL-1R2 단백질의 전체 길이 뿐만 아니라 IL-1R2의 융합 단백질, 예컨대 마우스 또는 인간 IgG Fc 단백질 단편(mFc 또는 hFc) 또는 다중 His에 융합된 단편을 포함한다. 그러나, 당업자는 IL-1R2 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이(치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하지만 이에 제한되지 않음)가 이의 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 자연적으로 생성되거나 인위적으로 도입될 수 있음을 이해한다. 따라서, 본 발명에서 용어 "IL-1R2"는 이러한 모든 서열 뿐만 아니라 이의 자연적 또는 인위적 변이체를 포함해야 한다. 또한, IL-1β 단백질의 서열 단편이 기술되는 경우, 이는 IL-1R2의 서열 단편 뿐만 아니라 이의 자연적 또는 인위적 변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "EC50"은 최대 효과의 50%에 대한 농도, 즉 최대 효과의 50%를 유발할 수 있는 농도를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 일반적으로 2쌍의 폴리펩티드 쇄(각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(L) 및 하나의 "중쇄"(H)를 가짐)로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류된다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 또는 ε으로 분류된다. 또한, 항체의 이소형은 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의된다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄도 약 3개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예컨대, 이펙터 세포)의 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)에 대한 결합을 포함하여 면역글로불린의 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 초가변 영역(상보성 결정 영역 또는 CDR로도 불림)으로 더 세분화될 수 있으며, 그 사이에 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 보존 영역이 분포된다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 각각의 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 각각의 영역 또는 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, or Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883)의 정의를 따른다. 용어 "항체"는 항체를 생성하는 어떠한 특정한 방법에 의해서도 제한되지 않는다. 예컨대, 항체는, 특히 재조합 항체, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 포함한다. 항체는 상이한 이소형, 예컨대 항체 IgG(예컨대, 서브타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항원 결합 모이어티"로도 공지된 용어 "항원 결합 단편"은, 전장 항체가 결합하는 것과 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하고 및/또는 항원에 대한 특이적 결합에 대해 전장 항체와 경쟁하는, 전장 항체의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로, 문헌(Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N.Y. (1989), 모든 목적으로 전체가 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 항체의 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일쇄 항체(예컨대, scFv), 키메라 항체, 디아바디, 및 폴리펩티드에 특이적 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우에서, 항체의 항원 결합 단편은 단일쇄 항체(예컨대, scFv)이며, 여기서 VL 및 VH 도메인은 쌍을 이루어 단일 폴리펩티드 쇄를 생성할 수 있게 하는는 링커를 통해 1가 분자를 형성한다(예컨대, 문헌(Bird et al., Science 242:423 426 (1988) and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883 (1988)) 참조). 이러한 scFv 분자는 일반적인 구조: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 가질 수 있다. 적절한 선행 기술 링커는 반복되는 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 이루어진다. 예컨대, 아미노산 서열 (GGGGS)4을 갖는 링커를 사용할 수 있지만 이의 변이체도 사용할 수 있다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 링커는 문헌(Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 and Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.)에 기술되어 있다.
일부 경우에서, 항체의 항원 결합 단편은 디아바디, 즉 2가 항체이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현된다. 그러나, 사용된 링커는 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 2개의 도메인은 쌍을 이룰 수 없으며, 따라서 도메인이 다른 쇄 상의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록 강제되고 2개의 항원 결합 부위가 생성된다(예컨대, 문헌(Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), and Poljak RJ et al., Structure 2:1121-1123 (1994)) 참조).
다른 경우에서, 항체의 항원 결합 단편은 "이기능적 항체"이다. 이중 특이적 항체로도 공지된 이기능적 항체는 2개의 서로 상이한 항원을 동시에 표적으로 하는 특정 약물이며, 면역선별 정제에 의해 생성될 수 있다. 또한, 이중 특이적 항체는 유전 공학에 의해 생성될 수도 있으며, 이는 결합 부위의 최적화, 합성 형태의 고려 및 수율과 같은 측면에서 상응하는 유연성으로 인해 특정한 이점이 있다. 현재, 이중 특이적 항체는 45개 이상의 형태로 존재하는 것으로 입증되었다(Muller D, Kontermann RE. Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: Current perspectives. BioDrugs 2010; 24:89-98). 다수의 이중 특이적 항체가 IgG-ScFv 형태, 즉 모리슨(Morrison) 형태로 개발되었으며(1997 Coloma MJ, Morrison SL. Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nature Biotechnology, 1997; 15:159-163), 이는 자연적으로 존재하는 IgG 형태와 유사하고 항체 공학, 발현 및 정제의 이점으로 인해 이중 특이적 항체의 이상적인 형태 중 하나로 입증되었다(Miller BR, Demarest SJ, et al., Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies. Protein Eng Des Sel 2010; 23:549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A. Rational engineering of antibody therapeutics targeting multiple oncogene pathways. MAbs 2011; 3:299-309).
항체의 항원 결합 단편(예컨대, 상술된 항체 단편)은 당업자에게 공지된 통상적인 기술(예컨대, 재조합 DNA 기술 또는 효소적 또는 화학적 절단)을 이용하여 주어진 항체(예컨대, 본원에 제공된 모노클로날 항체 3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 또는 3H6H4L1)로부터 수득될 수 있고, 항체의 항원 결합 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 특이성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "mAb" 및 "모노클로날 항체"는, 자연적으로 발생할 수 있는 천연 돌연변이를 제외한, 고도로 상동성인 항체 그룹으로부터, 즉 동일한 항체 분자 그룹으로부터 유래된 항체 또는 항체의 단편을 지칭한다. 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대해 높은 특이성을 갖는다. 모노클로날 항체에 비해 폴리클로날 항체는 일반적으로 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 적어도 2개 이상의 상이한 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 일반적으로 쾰러(Kohler) 등(Nature, 256:495, 1975)에 의해 처음 보고된 하이브리도마 기술을 이용하여 수득될 수 있으나, 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득될 수도 있다(예컨대, U.S.P 4,816,567 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 인간 면역글로불린(수용체 항체)의 CDR 영역의 전부 또는 일부가 비인간 항체(공여자 항체)의 CDR 영역으로 대체될 때 수득되는 항체 또는 항체 단편을 지칭하며, 여기서 공여자 항체는 예상되는 특이성, 친화성 또는 반응성을 갖는 비인간(예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼) 항체일 수 있다. 또한, 수용체 항체의 프레임워크 영역(FR)의 일부 아미노산 잔기는 상응하는 비인간 항체의 아미노산 잔기로 또는 다른 항체의 아미노산 잔기로 대체되어 항체의 성능을 더욱 개선하거나 최적화할 수 있다. 인간화 항체에 대한 보다 자세한 사항은, 예컨대 문헌(Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992); and Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000))을 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 자연 상태로부터 인위적인 수단에 의해 수득되는 것을 지칭항다. 특정한 "단리된" 물질 또는 성분이 자연에 나타나는 경우, 이는 자연 환경의 변화에 기인할 수 있거나 자연 환경으로부터 단리되었거나 둘 다이다. 예컨대, 특정한 단리되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 특정한 살아있는 동물에 자연적으로 존재하고, 이러한 자연 상태로부터 단리된 고순도의 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로 불린다. 용어 "단리된"은 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 인위적 또는 합성 물질 또는 다른 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질의 발현을 가능하게 하는 경우, 벡터는 발현 벡터로 불린다. 벡터는 벡터에 의해 운반되는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래된 인공 염색체(PAC); 파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 벡터가 당업자에게 널리 공지되어 있다. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스(예컨대, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 파필로마바이러스 및 파포바바이러스(예컨대, SV40)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선별 요소 및 리포터 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 발현을 제어하는 다양한 요소를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 개시 부위를 추가로 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜리(E. coli) 또는 비. 서브틸리스(B. subtilis), 진균 세포, 예컨대 효모 세포 또는 아스페르길루스(aspergillus), 곤충 세포, 예컨대 S2 초파리 세포 또는 Sf9, 또는 동물 세포, 예컨대 섬유모세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293, 또는 인간 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 벡터를 도입하는 데 사용될 수 있는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중 특이적", "이중 특이성" 또는 "이기능적" 항원 결합 단백질 또는 항체는 각각 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이중 특이적 항체는 다중특이적 항원 결합 단백질 또는 다중특이적 항체이며, 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예컨대, 문헌(Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al. 1992, J. Immunol. 148:1547-1553)을 참조한다. 이중 특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적에 존재하는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하는"은 항체와 표적 항원 사이의 반응과 같은 2개의 분자 사이의 비-무작위 결합 반응을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원 (또는 항원에 특이적인 항체)에 특이적으로 결합하는 항체는 항체가 약 10-5 M 미만, 예컨대 약 10-6 M 미만, 약 10-7 M 미만, 약 10-8 M 미만, 약 10-9 M 미만, 또는 약 10-10 M 미만 또는 이보다 작은 친화도(KD)로 항원에 결합하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"는 항체와 항원 사이의 결합 친화도를 기술하는 데 사용되는 특정한 항체-항원 상호작용에 대한 해리 평형 상수를 지칭한다. 평형 해리 상수가 작을수록 항체-항원 결합이 더 단단하고 항체와 항원 사이의 친화성이 높다. 전형적으로, 항체(예컨대, 본원에 개시된 모노클로날 항체 3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 또는 3H6H3L3)는 약 10-5 M 미만, 예컨대 약 10-6 M 미만, 약 10-7 M 미만, 약 10-8 M 미만, 약 10-9 M 미만, 또는 약 10-10 M 미만 또는 이보다 작은 해리 평형 상수(KD)로 항원(예컨대, IL-1β 단백질)에 결합한다. KD는 당업자에게 공지된 방법, 예컨대 비아코어 분자 상호작용 기기를 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" 및 "mAb"는 동일한 의미를 가지며 상호 교환적으로 사용될 수 있으며; 용어 "폴리클로날 항체" 및 "PcAb"는 동일한 의미를 가지며 상호 교환적으로 사용될 수 있으며; 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 가지며 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 아미노산은 일반적으로 당업계에 공지된 1문자 및 3문자 약어로 표시되며, 예컨대 알라닌은 A 또는 Ala로 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하이브리도마" 및 "하이브리도마 세포주"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 용어 "하이브리도마" 및 "하이브리도마 세포주"가 지칭되는 경우, 이들은 또한 하이브리도마의 서브클론 및 자손 세포를 포함한다. 예컨대, 하이브리도마 세포주 LT010을 지칭하는 경우. 이는 또한 하이브리도마 세포주 LT010의 서브클론 및 자손 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제"는 당업계에 널리 공지된 대상체 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 적합한 담체 및/또는 부형제를 지칭하고(예컨대, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) 참조), pH 조절제, 계면활성제, 보조제 및 이온 강도 향상제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예컨대, pH 조절제는 포스페이트 버퍼를 포함하지만 이에 제한되지 않고; 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 Tween-80을 포함하지만 이에 제한되지 않고; 이온 강도 향상제는 염화나트륨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 효과를 얻거나 적어도 부분적으로 얻는 데 충분한 양을 지칭한다. 예컨대, 예방적(예컨대, RA) 유효량은 질환(예컨대, RA)의 발병을 예방, 중지 또는 지연시키기에 충분한 양을 지칭하고; 치료적 유효량은 질환을 앓고 있는 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 중지시키기에 충분한 양을 지칭한다. 이러한 유효량을 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 예컨대, 치료 용도에 효과적인 양은 치료될 질환의 중증도, 환자 자신의 면역계의 전반적인 상태, 환자의 일반적인 조건, 예컨대 연령, 체중 및 성별, 약물 투여 방식 및 동시에 투여되는 다른 치료 등에 따라 달라질 것이다.
[발명의 효과]
본원에 개시된 항-IL-1β 항체, 특히 인간화 항-IL-1β 항체는 하기의 기술적 효과 중 하나 이상을 갖는다:
(1) 인간 IL-1β에 효과적으로 결합하고 IL-1β의 수용체 IL-1R1에 대한 결합을 차단함;
(2) IL-1β의 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 억제;
(3) MRC-5 세포가 IL-6을 분비하도록 유도하는 IL-1β의 활성을 특이적으로 억제하는 능력을 가짐;
(4) NF-κB에 대한 IL-1β의 활성화를 효과적으로 차단하는 능력을 가짐;
(5) IL-1β를 억제하기 위한 약제를 제조하는 데 사용될 가능성이 가짐;; 및
(6) 류마티스 관절염, 통풍, 다발성 경화증, 심혈관 사건 및/또는 심혈관 질환, 종양, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군, 주기적 열 증후군, 전신성 소아 특발성 관절염과 같은 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 가능성을 가짐.
도 1. 인간 IL-1β-His-Bio에 대한 3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 및 3H6H3L3의 결합 활성 검정 결과.
도 2. 인간 IL-1β-His-Bio에 대한 3H6H4L1의 결합 활성 검정 결과.
도 3. 인간 IL-1β-hFc에 대한 결합에 대해 인간 IL-1R1(1-332)-His와 경쟁하는 3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 및 3H6H3L3의 활성 검정 결과.
도 4. 인간 IL-1β-hFc에 대한 결합에 대해 인간 IL-1R1(1-332)-His와 경쟁하는 3H6H4L1의 활성 검정 결과.
도 5. 인간 IL-1β에 대한 3H6H4L1의 친화도 상수 검정 결과. 참조: 곡선 1-5는 각각 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.13 nM, 및 1.56 nM의 분석물 농도를 나타낸다.
도 6. 인간 IL-1β에 대한 카나키누맙의 친화도 상수 검정 결과. 참조: 곡선 1-5는 각각 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.13 nM, 및 1.56 nM의 분석물 농도를 나타낸다.
도 7. MRC-5에 의한 IL-1β 유도된 IL-6 분비에 대한 3H6H4L1의 효과.
도 8. NF-κB 신호전달 경로의 구배 활성화에 대한 IL-1β의 효과.
도 9. IL-1β를 차단하는 3H6H4L1의 리포터 검정 다이어그램.
도 10. Lenti-IL-1β-NIH/3T3 유도된 마우스 무릎 관절염 모델에서 병적 행동에 대한 3H6H4L1의 효과.
도 11. Lenti-IL-1β-NIH/3T3 유도된 마우스 무릎 관절염 모델의 무릎 관절 면적에 대한 3H6H4L1의 효과.
도 12. Lenti-IL-1β -NIH/3T3 유도된 마우스 무릎 관절염 모델의 체중에 대한 3H6H4L1의 효과.
본 발명의 실시양태는 하기에서 실시예를 참조하여 상세히 설명될 것이다. 당업자는 하기 실시예가 본 발명을 설명하기 위해서만 사용되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해할 것이다. 기술 또는 조건에 대한 구체적인 설명이 없는 경우는 당업계의 문헌에 설명된 기술 또는 조건에 따라(예컨대, 문헌(Guide to Molecular Cloning Experiments, 저자: J. Sambrook et al., 번역자: Huang Peitang et al., third edition, Science Press) 참조) 또는 제품 매뉴얼에 따라 수행되었다. 사용된 시약 또는 기기는 제조업체가 명시되지 않은 경우 시판되는 기존 제품이다.
본 발명의 하기 실시예에서, 사용된 BALB/c 마우스는 광동 의학 실험 동물 센터(Guangdong Medical Experimental Animal Center)에서 구입되었다.
본 발명의 하기 실시예에서, 동일한 표적에 대한 시판되는 항체 카나키누맙(상표명 Ilaris®)은 노바르티스(Novartis)에서 구입되었으며 대조 항체로서 사용되었다.
제조예 1. 융합 단백질 인간 IL-1β-His, IL-1R1(1-332)-His, IL-1β-hFc, 및 인간 IL-1β-His-Bio의 제조
인간 IL-1β(진뱅크 ID: NP_000567.1) 및 IL-1R1(진뱅크 ID: NP_000868)의 단백질 서열은 NCBI 진뱅크 단백질 데이터베이스로부터 제공되었다. 인간 IL-1β 및 IL-1R1의 아미노산 서열은 각각 His 태그 및 인간 IgG Fc 정제 태그의 서열에 융합되었으며, 각각 인간 IL-1β-His, IL-1R1(1-332)-His로 약칭된다.
단백질 샘플의 품질은 SDS-PAGE로 검증되었다.
비오티닐화된 인간 IL-1β-His 단백질 샘플(간략히 인간 IL-1β-His-Bio로 지칭됨)은 EZ-Link® 술포-NHS-LC-비오티닐화 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 제조되고, 구체적인 제조 방법은 키트 매뉴얼을 참조하여 수행되었다.
제조된 융합 단백질은 하기 실시예에서 사용되었다.
실시예 1. 항-IL-1β 뮤린 항체 3H6의 제조
1. 하이브리도마 세포주 LT010의 제조
BALB/c 마우스(광동 의학 연구소 동물 센터(Guangdong Medical Laboratory Animal Center)에서 구입됨)를 항원으로서 인간 IL-1β-his에 의해 면역화시키고, 면역화된 마우스의 비장 세포를 마우스 골수종 세포에 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성하였다. ELISA에 의해 IL-1β-His-Bio를 항원으로 사용하여 하이브리도마 세포를 스크리닝하여 IL-1β-His-Bio에 특이적으로 결합하는 항체를 분비할 수 있는 하이브리도마 세포를 수득하였다. ELISA에 의해 생성된 하이브리도마 세포를 경쟁적 ELISA로 스크리닝하여 IL-1β-hFc에 대한 결합에 대해 수용체 IL-1R1(1-332)-His와 경쟁하는 항체를 분비할 수 있는 하이브리도마 세포를 수득하고, 안정한 하이브리도마 세포주를 제한 희석에 의해 수득하였다. 하이브리도마 세포 제조 방법에 대해, 현재 확립된 방법(예컨대, 문헌(Stewart, S.J., "Monoclonal Antibody Production", in Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds. G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000))을 참조한다.
본 발명자들은 상기 하이브리도마 세포주를 하이브리도마 세포주 LT010(IL-1β-3H6)으로 명명하고, 이에 의해 분비되는 모노클로날 항체를 3H6으로 명명하였다.
하이브리도마 세포주 LT010(IL-1β-3H6)은 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 CCTCC 번호 C2018133의 수탁 번호 및 중국 우한 우한 대학교 (우편 번호: 430072)의 보존 주소로 2018년 6월 21일에 기탁되었다.
2. 항-IL-1β 항체 3H6의 제조
상기 제조된 LT010 세포주는 하이브리도마 함유 무혈청 배지(1% 페니실린-스트렙토마이신 및 4% 글루타막스를 함유하는 하이브리도마 무혈청 배지, 5% CO2와 함께 37℃의 세포 인큐베이터에서 배양됨)에서 배양되었다. 7일 후, 세포 배양 상층액을 수집하고, 고속 원심분리하고, 마이크로여과막을 통해 진공 여과하고, HiTrap 단백질 A HP 컬럼을 통해 정제하여 항체 3H6을 수득하였다. 또한, 정제된 3H6 샘플을 SDS-PAGE 전기영동으로 검증하였다.
실시예 2. 항-IL-1β 항체 3H6에 대한 서열 분석
실시예 1에서 배양된 LT010 세포주로부터 배양된 세포 박테리아 총 RNA 추출 키트(Tiangen, Cat no. DP430)의 방법에 따라 mRNA를 추출하였다. cDNA를 RT-PCR 용 인비트로겐 슈퍼스크립트 III 제1-가닥 합성 시스템(Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System)의 키트 매뉴얼에 따라 합성하고, PCR로 증폭하였다. PCR 증폭된 산물을 직접적으로 TA 클로닝하고, 구체적인 작업에 대해 pEASY-T1 클로닝 키트(Transgen CT101)의 키트 매뉴얼을 참조하였다.
TA 클로닝된 산물은 직접적으로 시퀀싱되었으며, 시퀀싱 결과는 하기와 같다:
항체 3H6의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (354 bp)
Figure pct00001
항체 3H6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: (118 aa, 밑줄 친 아미노산 서열은 CDR 영역임)
Figure pct00002
항체 3H6의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (318 bp)
Figure pct00003
Figure pct00004
항체 3H6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: (106 aa, 밑줄 친 아미노산 서열은 CDR 영역임)
Figure pct00005
실시예 3. 항-IL-1β 인간화 항체 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 설계 및 제조
1. 항-IL-1β 인간화 항체 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 경쇄 및 중쇄 서열 설계
IL-1β 단백질의 3차원 결정 구조(van Oostrum J, Priestle JP, Grutter MG, Schmitz A. The structure of murine interleukin-1 beta at 2.8 A resolution. J Struct Biol. 1991, 107(2):189-95) 및 실시예 2에서 수득된 서열을 기반으로 하여, 인간화 항체 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열이 설계되었다(항체 3H6H1L1, 3H6H2L2, 및 3H6H3L3의 불변 영역의 서열은 NCBI 데이터베이스로부터의 것이고, 여기서 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, ACCESSION: P01857이고, 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, ACCESSION: P01834이고; 항체 3H6H4L1의 불변 영역의 서열은 NCBI 데이터베이스로부터의 것이고, 여기서 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-4 쇄 C 영역, ACCESSION: P01861.1이고, 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, ACCESSION: P01834임).
인간화 항체 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열은 하기와 같다:
(1) 인간화 모노클로날 항체 3H6H1L1
항체 3H6H1L1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (354 bp)
Figure pct00006
Figure pct00007
항체 3H6H1L1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: (118 aa, 여기서 밑줄 친 아미노산 서열은 CDR 영역임)
Figure pct00008
항체 3H6H1L1의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (318 bp)
Figure pct00009
항체 3H6H1L1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: (106 aa, 여기서 밑줄 친 아미노산 서열은 CDR 영역임)
Figure pct00010
(2) 인간화 모노클로날 항체 3H6H2L2
항체 3H6H2L2의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (354 bp)
Figure pct00011
Figure pct00012
항체 3H6H2L2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: (118 aa, 여기서 밑줄 친 아미노산 서열은 CDR 영역임)
Figure pct00013
항체 3H6H2L2의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (318 bp)
Figure pct00014
항체 3H6H2L2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: (106 aa, 여기서 밑줄 친 아미노산 서열은 CDR 영역임)
Figure pct00015
(3) 인간화 모노클로날 항체 3H6H3L3
항체 3H6H3L3의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (354 bp)
Figure pct00016
Figure pct00017
항체 3H6H3L3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: (118 aa, 여기서 밑줄 친 아미노산 서열은 CDR 영역임)
Figure pct00018
항체 3H6H3L3의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (318 bp)
Figure pct00019
항체 3H6H3L3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: (106 aa, 여기서 밑줄 친 아미노산 서열은 CDR 영역임)
Figure pct00020
(4) 인간화 모노클로날 항체 3H6H4L1
항체 3H6H4L1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5에 제시된다.
항체 3H6H4L1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시된다.
항체 3H6H4L1의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 7에 제시된다.
항체 3H6H4L1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시된다.
2. 인간화 항체 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 제조
3H6H1L1, 3H6H2L2, 및 3H6H3L3의 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, ACCESSION: P01857이고; 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, ACCESSION: P01834이고;
3H6H4L1의 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-4 쇄 C 영역, ACCESSION: P01861.1이고; 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, ACCESSION: P01834이다.
3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 각각의 중쇄 및 경쇄 cDNA를 pUC57simple 벡터(Genscript 제공)에 클로닝하여 각각 8개의 재조합 플라스미드, 즉 pUC57simple-3H6H1 및 pUC57simple-3H6L1; pUC57simple-3H6H2 및 pUC57simple-3H6L2; pUC57simple-3H6H3 및 pUC57simple-3H6L3; 및 pUC57simple-3H6H4 및 pUC57simple-3H6L1을 수득하였다. 또한, 이들을 각각 pcDNA3.1 벡터로 서브클로닝하였다. 중쇄를 포함하는 재조합 플라스미드 및 경쇄를 포함하는 재조합 플라스미드를 293F 세포에 공동 형질감염시킨 다음, 세포 배양물을 수집하고 정제하여 인간화 항체 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1을 수득하였다. 결과를 SDS-PAGE로 검증하였다.
실시예 4. 인간 IL-1β-His-Bio에 대한 항체 3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 결합 활성에 대한 검정(ELISA)
플레이트를 각각의 웰에서 50 μL의 2 μg/mL SA(스트렙트아비딘)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 1회 세척하고 잔류 액체를 제거한 후, 각각의 웰을 300 μL의 1% BSA 용액(PBS에 용해됨)으로 차단하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 잔류 액체를 제거하였다. 각각의 웰의 인간 IL-1β-His-Bio를 50 μL의 PBST로 0.2 μg/mL로 희석하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 3회 세척하고, 잔류 액체를 제거하였다. 항체를 초기 농도로서 표 1에서 1 μg/mL 또는 표 2에서 0.333 μg/mL로 희석하고, 1:3 구배 희석을 수행하여 블랭크 대조군에 추가하여 총 7개의 농도를 수득하였다. 웰당 100 μL의 최종 부피로 상기 농도에 대해 2개의 중복 웰을 설정하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 가볍게 두드려 잔류 액체를 제거한 후, 50 μL의 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 염소 항-인간 IgG(H + L) 2차 항체 작업 용액 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 염소 항-마우스 IgG (H + L ) 2차 항체 작업 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 여기서 50 μL의 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 염소 항-인간 IgG(H + L) 2차 항체 작업 용액을 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 3H6H4L1, 카나키누맙을 함유하는 웰에 첨가하고; 또한 50 μL의 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 염소 항-마우스 IgG(H + L) 2차 항체 작업 용액을 3H6을 함유하는 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4회 세척하고 잔류 액체를 제거한 후, 50 μL의 TMB 발색 용액을 각각의 웰에 첨가하여 실온에서 5분 동안 빛으로부터 발색시킨 다음, 50 μL의 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 플레이트를 즉시 플레이트 판독기에 넣고, 플레이트의 각각의 웰의 OD 값을 450 nm에서 판독하였다.
소프트막스 프로(SoftMax Pro) 6.2.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리하였다. 항체 농도를 가로 좌표로, 흡광도를 세로 좌표로 사용하여 4-파라미터 맞춤 곡선을 플로팅하였다. 그 결과가 도 1 및 2에 나타나 있다. 인간 IL-1β-His-Bio에 대한 3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 결합 활성 검정 결과가 각각 표 1 및 2에 나타나 있다.
Figure pct00021
Figure pct00022
결과는 하기를 나타내었다:
3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3 및 3H6H4L1은 인간 IL-1β-His-Bio에 효과적으로 결합할 수 있으며 결합 효율은 용량 의존적이고;
동일한 검정 조건 하에서, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 및 3H6H4L1의 항원 인간 IL-1β-His-Bio에 대한 결합 효율은 용량 의존적이며, 결합 활성은 동일한 표적에 대해 시판되는 약물 카나키누맙보다 우수하고; 3H6H3L3의 결합 활성은 카나키누맙의 결합 활성과 유사하다.
실시예 5. 인간 IL-1β-hFc에 대한 결합에 대해 인간 IL-1R1(1-332)-His와 경쟁하는 항체 3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 활성에 대한 검정(ELISA)
플레이트를 각각의 웰에 50 μL의 4 μg/mL 인간 IL-1β-hFc로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 1회 세척하고 잔류 액체를 제거한 후, 각각의 웰을 300 μL의 1% BSA 용액(PBS에 용해됨)으로 차단하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 3회 세척하고, 잔류 액체를 제거하였다. 항체를 초기 농도로서 2 μg/mL(최종 농도: 1 μg/mL)로 희석하고, 1:3 구배 희석을 수행하여 블랭크 대조군에 추가하여 총 7개의 농도를 수득하였다. 웰당 50 μL의 최종 부피로 상기 농도에 대해 2개의 중복 웰을 설정하고, 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 0.08 μg/mL(최종 농도: 0.04 μg/mL) 또는 0.1 μg/mL(최종 농도: 0.05 μg/mL) 인간 IL-1R1(1-332)-His를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 1:1의 부피 비율로 항체와 부드럽게 혼합하였으며, 각각의 웰의 최종 부피는 100 μL였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고 잔류 액체를 제거한 후, 50 μL의 항-His 뮤린 모노클로날 항체(HRP 표지됨) 작업 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 4회 세척하고 잔류 액체를 제거한 후, 50 μL의 TMB 발색 용액을 각각의 웰에 첨가하여 실온에서 10분 또는 5분 동안 빛으로부터 발색시키고, 이어서 50 μL의 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 플레이트를 즉시 플레이트 판독기에 넣고, 플레이트의 각각의 웰의 OD 값을 450 nm에서 판독하였다.
소프트막스 프로 6.2.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리하였으며, 항체 농도를 가로 좌표로, 흡광도를 세로 좌표로 사용하여 4-파라미터 맞춤 곡선을 플로팅하였다. 그 결과가 도 3 및 4에 나타나 있다. 인간 IL-1β-hFc에 대한 결합에 대해 인간 IL-1R1(1-332)-his와 경쟁하는 3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3, 및 3H6H4L1의 활성 검정 결과가 각각 표 3 및 4에 나타나 있다.
Figure pct00023
Figure pct00024
결과는 하기를 나타내었다:
3H6, 3H6H1L1, 3H6H2L2, 3H6H3L3 및 3H6H4L1은 항원 인간 IL-1β-hFc의 수용체 인간 IL-1R1(1-332)-his에 대한 결합을 효과적으로 차단할 수 있으며, 차단 효율은 용량 의존적이고, 경쟁적 결합 활성은 동일한 표적에 대해 시판되는 약물 카나키누맙보다 우수하다.
실시예 6. 인간 IL-1β에 대한 항체 3H6H4L1의 친화도 상수 결정
인간 IL-1β-his에 대한 항체의 친화도 상수는 비아코어 분자 상호작용 기기를 사용하여 결정되었다. 항체는 약 1000 RU의 신호 값으로 아민 커플링에 의해 PBST 버퍼에서 CM5 칩의 표면에 고정되었다. 항체는 인간 IL-1β에 1.56-25 nM(2배 구배 희석) 농도로 120초 동안 30 μL/min의 유속으로 결합되었고, 600초 동안 해리되었다. 칩은 30 μL/min의 유속으로 30초 동안 3M MgCl2를 사용하여 재생되었다. 비아코어 컨드롤 2.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고, 비아코어 T200 이밸류에이션 2.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 그 결과가 표 5, 도 5 및 도 6에 나타나 있다.
Figure pct00025
결과는 하기를 나타내었다:
인간 IL-1β에 대한 3H6H4L1의 친화도 상수는 8.79E-11M이고, 인간 IL-1β에 대한 카나키누맙의 친화도 상수는 9.79E-11M이었으며, 이는 3H6H4L1이 인간 IL-1β에 대해 더 강한 결합 능력을 가지고 있음을 시사한다.
실시예 7: 항체 3H6H4L1의 세포 생물활성에 대한 검정
1. MRC-5 세포가 IL-6을 분비하도록 유도하는 IL-1β를 차단하는 3H6H4L1의 활성에 대한 세포학 검정
인간 MRC-5 세포(중국 과학원 세포 센터(Cell Center of the Chinese Academy of Sciences)에서 구입)를 통상적으로 분해 및 계수하고, 7,500개 세포/웰을 평평한 바닥 96 웰 플레이트에 시딩하고, 세포 인큐베이터에서 배양하였다; 24시간 후(세포 성장이 80% 합류에 도달했을 때), 투여 처리를 수행하였다: 항체에 대해 4개의 농도(0.37 nM, 1.11 nM, 3.33 nM, 및 10 nM))를 설정하고 IL-1β(Sino Biological Inc.에서 구입)에 대해 3개의 농도(5 pM, 50 pM, 및 500 pM)를 설정하였으며, 50 pM IL-1β는 블랭크 대조군 및 이소형 대조군에 추가하여 항체군에서 사용되었다(항체 및 IL-1β는 37℃에서 20분 동안 미리 인큐베이션됨); 투여 후, 군들을 24시간 동안 배양하였다; 세포 상층액을 수집하고 IL-6 ELISA 키트(Dakewe Biotechnology Co., Ltd.에서 구입)를 사용하여 검정하였다. 그 검정 결과가 도 7 및 표6에 나타나 있다.
Figure pct00026
결과는 IL-1β가 용량 의존적 방식으로 IL-6를 분비하도록 MRC-5를 현저하게 촉진할 수 있음을 보여주었다; 3H6H4L1은 MRC-5세포가 IL-6을 분비하도록 유도하는 IL-1β의 활성을 특이적으로 억제할 수 있으며, 이는 IL-1β에 대한 3H6H4L1의 특이적 중화 활성을 나타낸다.
2. NF-κB 신호전달 경로를 활성화하기 위해 IL-1β를 차단하는 3H6H4L1
이 실험에서 NF-κB 신호전달 경로를 활성화하기 위해 IL-1β를 차단하는 3H6H4L1의 중화 생물활성을 루시페라제 유전자 리포터 검정으로 측정하였다.
(1) 293T-NF-κB-LUC 세포 구축
293T 세포는 판크레아틴에 의해 분해되고 계대배양되었다; 배지를 형질감염 2시간 전에 opti-DMEM 배지로 새롭게 하였다; 500 μL의 opti-DMEM 배지를 멸균 EP 튜브에 첨가한 다음, 3 μg의 플라스미드 pNF-κB-Luc2P-hygro를 첨가하였다; 500 μL의 opti-DMEM 배지를 멸균 EP 튜브에 첨가한 다음, 8 μL의 리포펙타민 2000을 첨가하였다; 희석된 플라스미드에 희석된 리포펙타민 2000을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 두었고, 세포 배양 디쉬에 균일하게 적가하였다; 형질감염 8시간 후, 배지를 새롭게 하였다; 형질감염 24시간 후, 히그로마이신을 첨가하고, 세포를 100 μg/mL의 최종 농도에서 스크리닝하고, 293T 비형질감염 플라스미드를 함유하는 웰을 대조군으로 하였다. 7-10일 후, 대조군 웰의 세포는 완전히 사멸되었고, 선별된 세포는 증폭을 위해 수거되었다. 투여를 계속하고, 농도를 100 μg/mL로 유지하였다. 안정한 293T-NF-κB-LUC 세포주를 수득하였다.
(2) NF-κB 신호전달 경로를 활성화하기 위해 IL-1β를 차단하는 3H6H4L1의 중화 생물활성 검정
93T-NF-κB-LUC 세포를 일상적으로 분해하고, 20,000개 세포/웰로 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 세포가 웰에 부착된 후, IL-1β를 1.65 ng/mL의 최종 농도로 첨가하고, 블랭크 대조군을 설정하였다. 항체 카나키누맙 및 3H6H4L1을 각각 400 ng/mL, 100 ng/mL, 25 ng/mL, 6.25 ng/mL, 및 1.56 ng/mL의 최종 농도로 각각의 항체에 대해 5개의 구배로 동시에 첨가하였다. 6시간의 공동 인큐베이션 후, 상층액을 제거하고, 50 μL의 PBS 및 50 μL의 Bright-GloTM 기질을 첨가하여 5분 동안 반응시키고, 혼합물을 기계를 사용하여 검정하였다.
그 결과가 도 8 및 9에 나타나 있다
결과는 하기를 나타내었다:
IL-1β는 명백한 용량 의존적 방식으로 NF-κB 신호전달 경로에 의존하는 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 효과적으로 활성화할 수 있고;
3H6H4L1은 IL-1β를 특이적으로 차단하여 용량 의존적 방식으로 NF-κB 신호전달 경로를 활성화할 수 있다.
결과는 3H6H4L1이 IL-1β를 효과적으로 차단하여 IL-1β 의존적 NF-κB 신호전달 경로 리포트 시스템에서 NF-κB를 활성화시킬 수 있다는 것을 나타내었으며, 이는 IL-1β에 대한 특이적 중화 활성을 나타낸다.
실시예 8. 3H6H4L1은 인간 IL-1β로 형질감염시킨 NIH/3T3 세포에 의해 유발된 류마티스 무릎 관절염 모델 마우스 치료를 완화시킨다.
46마리의 BALB/c 마우스를 체중에 따라 6개의 군, 즉 정상군, 모델군, 양성 대조군, 3H6H4L1 저용량군, 3H6H4L1 중간 용량군 및 3H6H4L1 고용량군으로 나누었다; 정상군에서의 6마리를 제외하고는, 각각의 군은 8마리를 가졌다.
세포 시딩 전, 마우스의 체중 및 투여 부피에 따라, 마우스에 양성 대조군에서는 카나키누맙을 피하 주사하고, 모델군에서는 항-HEL을 피하 주사하고, 상응하는 3H6H4L1의 투여군에서는 상응하는 농도로 3H6H4L1을 주사하고, 등용적 생리 식염수를 피하 주사하였다.
NIH/3T3(American Type Culture Collection에서 구입) 세포 및 Lenti-IL-1β-NIH/3T3 세포를 생물안전성 캐비닛에서 수집하였다. IL-1β를 안정적으로 분비하고 발현하는 Lenti-IL-1β-NIH/3T3 세포주를 Lenti-IL-1β 벡터를 NIH/3T3 세포에 형질감염시키고 스크리닝하여 수득하였다. 필요한 세포 수에 도달하면 NIH/3T3, Lenti-IL-1β-NIH/3T3 세포를 수집하였다. 생물안전성 캐비닛에서 오래된 배지를 피펫팅하고, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 적절한 양의 0.05% 트립신-EDTA(1x)로 1분 동안 분해시킨 다음, 10% FBS를 함유하는 DMEM 완전 배지를 첨가하여 분해를 중지시켰다. 세포 현탁액을 1200 rpm/min에서 4분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거한 후, 무혈청 DMEM 배지에 재현탁하여 계수하고, 세포 농도를 2,000,000개 세포/mL로 조정한 후 나중에 사용하기 위해 얼음 상에 두었다.
BALB/c 마우스를 7.5 mL/kg의 3.5% 클로랄 수화물을 복강 주사하여 마취한 후, 정상군 마우스의 무릎 관절 강에 25 μL/마우스(50,000개 세포/마우스)의 NIH/3T3 세포 현탁액을 접종하고, 다른 마우스의 무릎 관절 강에 25 μL/마우스(50,000 세포/마우스)의 Lenti-IL-1β-NIH/3T3 세포 현탁액을 접종하였다. 접종 후, 무릎 관절 상처를 봉합하고, 생리 식염수에 20배 희석된 페니실린을 도포하였다. 세포 접종 후 5일째에, 각각의 그룹의 마우스를 경추 탈구로 안락사시키고, 영향을 받은 사지의 무릎 관절을 절개하고, 영향을 받은 마우스 사지의 활막의 길이(mm) 및 너비(mm)를 버니어 캘리퍼스로 측정하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(± SEM)로 표현되었으며, 결과는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 소프트웨어로 처리된 그룹간 비교 후 일원 분산 분석으로 평가되었으며, P < 0.05에서 유의한 차이를 나타내고 P < 0.01에서 매우 유의한 차이를 나타낸다.
그 결과가 도 10, 11 및 12에 나타나 있다.
도 10은 정상군의 마우스와 비교하여 모델군의 마우스에서 병적 행동이 분명하다는 것을 보여준다(P < 0.01). 투여 후, 카나키누맙 및 3H6H4L1 고용량군 및 중간 용량군은 류마티스 관절염을 갖는 마우스의 병적 행동을 효과적으로 개선할 수 있는 반면(P < 0.01), 3H6H4L1 저용량군은 모델군과 비교하여 류마티스 관절염을 갖는 마우스의 병적 행동을 개선하는 데 효과적이지 않다(P > 0.05). 한편, 3H6H4L1은 마우스의 병적 행동 정도를 개선하는 데 특정한 용량 효과 관계를 갖는다. 양성 대조군에 비해, 3H6H4L1 중간 용량군 및 저용량군(P < 0.01)은 양성 대조군보다 덜 효과적이며, 3H6H4L1 고용량군은 양성 대조군과 동등한 효능을 갖는다(P > 0.05).
도 11은 모델군의 마우스의 영향을 받은 사지의 무릎 관절 면적이 정상군에 비해 상당히 증가한다는 것을 보여준다(P < 0.01). 투여 후, 양성 대조군(카나키누맙) 및 3H6H4L1 중간 용량군 및 고용량군은 류마티스 관절염을 갖는 마우스의 영향을 받은 사지의 종창 면적을 명백히 감소시킬 수 있는 반면(P < 0.01), 3H6H4L1 저용량군은 모델군과 비교하여 류마티스 관절염을 갖는 마우스의 영향을 받은 사지의 종창 면적을 감소시키는 데 명백한 효과가 없었다(P > 0.05). 한편, 3H6H4L1은 류마티스 관절염을 갖는 마우스의 영향을 받은 사지의 종창 면적을 감소시키는 데 특정한 용량 효과 관계를 갖는다. 3H6H4L1의 동등한 용량은 동일한 표적에 대해 시판되는 약물 카나키누맙과 동등한 효능을 갖는다(P > 0.05).
도 12는 모델군의 마우스의 체중이 정상군에 비해 상당히 감소된다는 것을 보여준다(P < 0.01). 투여 후, 동일한 표적에 대한 시판되는 약물 카나키누맙 및 3H6H4L1 고용량군은 모델군에 비해 관절염을 갖는 마우스의 체중 감소를 명백히 감소시킬 수 있다(P < 0.05). 양성 대조군과 비교하여 동등한 용량의 3H6H4L1은 동일한 표적에 대해 시판되는 약물 카나키누맙과 동등한 효능을 갖는다(P < 0.05).
상기에서 본 발명의 바람직한 실시양태를 상세히 설명하였으나, 본 발명은 실시양태에 한정되지 않는다. 당업자는 본 발명의 취지를 어기지 않으면서 다양한 등가의 변형 또는 대체를 할 수 있다. 이러한 동등한 변형 또는 대체는 본 출원의 청구범위에 의해 정의된 범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> AKESO BIOPHARMA, INC <120> ANTI-IL-1┑ ANTIBODY AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF AND USE OF SAME <130> IEC180032PCT <160> 22 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 3H6 heavy chain variable region <400> 1 caggtgaccc tgaaggagag cggaccagga atcctgcagc ctagccagac actgagcctg 60 acttgcagct tcagcggctt cagcctgagc acaagcggaa tgggcgtgtc ttggatcagg 120 cagccatcag gaaagggact cgagtggctg gctcacatct actgggacga cgacaagcgg 180 tacaacccct ccctgaagag caggctgacc atcagcaagg acaccagcag caaccaggtg 240 ttcctgaaga tcaccagcgt ggacaccgcc gatagcgcta cctactattg cgccagaagc 300 gcctactaca gcttcgccta ttggggccag ggaacactgg tgtccgtgtc agcc 354 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 3H6 heavy chain variable region <400> 2 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 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light chain variable region <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Arg Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 5 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 3H6H1L1 heavy chain variable region <400> 5 caggtgacac tgaaggagtc tggccccgcc ctgctgaagc ctacccagac actgaccctg 60 acatgtacct tctccggctt ttctctgagc acctccggca tgggcgtgtc ttggatcagg 120 cagccaagcg gcaaggccct ggagtggctg gcacacatct actgggacga tgacaagcgg 180 tataacccct ccctgaagtc tagactgaca atctctaagg ataccagctc caaccaggtg 240 ttcctgaaga tcacaaatgt ggataccgtg gacacagcca cctactattg cgcccggagc 300 gcctactatt cctttgccta ctggggccag ggcacactgg tgtctgtgag cgcc 354 <210> 6 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 3H6H1L1 heavy chain variable region <400> 6 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Leu Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ala 115 <210> 7 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 3H6H1L1 light chain variable region <400> 7 gatatccaga tgacccagtc ccacagctcc atgtccacat ctgtgggcga ccgggtgaga 60 atcacctgtc gggcctccca ggacgtggat acagacgtgg cctggtttca gcagaagccc 120 ggccaggccc ctaagctgct gatctactgg gccagcacca ggcactccgg agtgccatct 180 cgcttcagcg gctccggctc tggcacagac ttcaccctga caatcagcaa cgtgcagcca 240 gaggatttcg ccgactacta ttgccagcag tactctagct atcccacctt tggcgccggc 300 acaaagctgg agctgaag 318 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 3H6H1L1 light chain variable region <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser His Ser Ser Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Arg Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 9 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 3H6H2L2 heavy chain variable region <400> 9 caggtgacac tgaaggagtc cggccccgcc ctggtgaagc ctacccagac actgaccctg 60 acatgtacct tcagcggctt ttctctgagc acctccggca tgggcgtgtc ctggatcagg 120 cagccatctg gcaaggccct ggagtggctg gcccacatct actgggacga tgacaagcgg 180 tattctccca gcctgaagtc tagactgaca atcagcaagg ataccagctc caaccaggtg 240 ttcctgacaa tcaccaacgt ggaccccgtg gacacagcca cctactattg cgcccggagc 300 gcctactatt cctttgccta ctggggccag ggcacactgg tgtccgtgtc tgcc 354 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 3H6H2L2 heavy chain variable region <400> 10 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Thr Ile Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ala 115 <210> 11 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 3H6H2L2 light chain variable region <400> 11 gatatccaga tgacacagag ccctagctcc ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgaga 60 atcacctgta gggcctctca ggacgtggat acagacgtgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctattgg gcctctaccc tgcagagcgg agtgccatcc 180 cggttctctg gcagcggctc cggaacagac ttcaccctga caatctctag cctgcagcca 240 gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag tactcctctt atcccacctt tggcgccggc 300 acaaagctgg agctgaag 318 <210> 12 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 3H6H2L2 light chain variable region <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Arg Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 13 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 3H6H3L3 heavy chain variable region <400> 13 caggtgacac tgaaggagag cggcccagcc ctggtgaagc caacccagac actgaccctg 60 acatgtacct tctccggctt tagcctgtcc acctctggca tgggcgtgtc ttggatcagg 120 cagccacctg gcaaggccct ggagtggctg gccctgatct actgggacga tgacaagcgg 180 tatagccctt ccctgaagag cagactgaca atctccaagg atacctctaa gaaccaggtg 240 gtgctgacaa tcaccaacgt ggaccccgtg gacacagcca cctactattg cgcccggagc 300 gcctactatt cctttgccta ctggggccag ggcacactgg tgtctgtgag cgcc 354 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 3H6H3L3 heavy chain variable region <400> 14 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Ile Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ala 115 <210> 15 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 3H6H3L3 light chain variable region <400> 15 gatatccaga tgacacagag ccctagctcc ctgagcgcct ccgtgggcga cagggtgacc 60 atcacatgta gagcctctca ggacgtggat accgacctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctattgg gcctctaccc tgcagagcgg agtgccatcc 180 cggttctctg gcagcggctc cggaacagac ttcaccctga caatctctag cctgcagcca 240 gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag tactcctctt atcccacctt tggcgccggc 300 acaaagctgg agctgaag 318 <210> 16 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 3H6H3L3 light chain variable region <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 17 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 18 Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR3 <400> 19 Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR1 <400> 20 Gln Asp Val Asp Thr Asp 1 5 <210> 21 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR2 <400> 21 Trp Ala Ser 1 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 <400> 22 Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Thr 1 5

Claims (28)

  1. 항-IL-1β 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    항체는 각각 서열번호 17-서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    항체는 각각 서열번호 20-서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 및 서열번호 14로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 및 서열번호 16으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역 단편, 단일쇄 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 디아바디로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 10-5 M 미만, 예컨대 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 또는 10-10 M 미만 또는 이보다 작은 KD로 IL-1β 단백질에 결합하고; 바람직하게는 KD는 비아코어 분자 상호작용 기기로 측정되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 뮤린 이외의 종으로부터, 예컨대 인간 항체로부터 유래되는 비-CDR 영역을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 항체로부터 유래되는 불변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 항체의 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 불변 영역으로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄 불변 영역이 Ig 감마-1 쇄 C 영역 또는 Ig 감마-4 쇄 C 영역이고, 경쇄 불변 영역이 Ig 카파 쇄 C 영역인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 CCTCC 번호 C2018133의 수탁 번호로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT010에 의해 생성되는 모노클로날 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 소분자 약물을 포함하는 항체-약물 접합체로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; 바람직하게는, 소분자 약물은 소분자 세포독성 약물이며; 더욱 바람직하게는 소분자 약물은 종양 화학요법 약물인 항체-약물 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커를 통해 소분자 약물에 연결되고; 예를 들어 링커는 히드라존 결합, 이황화 결합 또는 펩티드 결합인 항체-약물 접합체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 대 소분자 약물의 몰비가 1:1-1:4인 항체-약물 접합체.
  13. 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역을 포함하는 이중 특이적 항체로서,
    제1 단백질 기능 영역은 IL-1β를 표적으로 하고,
    제2 단백질 기능 영역은 IL-1β 이외의 표적(예컨대, IL-17A)을 표적으로 하며;
    제1 단백질 기능 영역은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이고;
    바람직하게는, 이중 특이적 항체는 IgG-scFv 형태이며;
    바람직하게는, 제1 단백질 기능 영역은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체이고, 제2 단백질 기능 영역은 단일쇄 항체이거나; 또는
    바람직하게는, 제1 단백질 기능 영역은 제4항에 따른 단일쇄 항체이고, 제2 단백질 기능 영역은 항체인 이중 특이적 항체.
  14. 제13항에 있어서, 제1 및 제2 단백질 기능 영역은 직접적으로 또는 링커 단편을 통해 연결되고;
    바람직하게는, 링커 단편은 (GGGGS)m이고, 이때 m은 양의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이거나; 또는
    바람직하게는, 링커 단편은 SS(GGGGS)n이고, 이때 n은 양의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인 이중 특이적 항체.
  15. 제13항에 있어서, 제1 및 제2 단백질 기능 영역의 수가 각각 독립적으로 1, 2 또는 그 초과인 이중 특이적 항체.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 항체는 항체의 중쇄의 C-말단에 연결되는 것인 이중 특이적 항체.
  17. 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서,
    항체 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 17-서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고, 항체 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 20-서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하며;
    바람직하게는, 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 및 서열번호 14로부터 선택되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 및 서열번호 16으로부터 선택되며;
    더욱 바람직하게는, 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시되거나; 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시되거나; 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10에 제시되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 12에 제시되거나; 또는 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 14에 제시되고, 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 16에 제시되며;
    더욱더 바람직하게는, 핵산 분자는
    서열번호 1 및 서열번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열,
    서열번호 5 및 서열번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열,
    서열번호 9 및 서열번호 11에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는
    서열번호 13 및 서열번호 15에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  18. 제17항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  19. 제17항에 따른 단리된 핵산 분자 또는 제18항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  20. 제19항에 따른 숙주 세포를 적합한 조건에서 배양하는 단계, 및 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  21. 차이나 센터 포 타입 컬쳐 콜렉션(CCTCC)에 CCTCC 번호 C2018133의 수탁 번호로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT010.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적 항체; 및 임의로, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  23. 자가면역 질환, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 종양, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군, 전신성 소아 특발성 관절염, 또는 통풍성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적 항체의 용도로서,
    바람직하게는, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 및 주기적 열 증후군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 주기적 열 증후군은 TNF 수용체 관련 주기적 증후군(TRAPS), 고-IgD 증후군(HIDS)/메발로네이트 키나제 결핍(MKD), 및 가족성 지중해열(FMF)로부터 선택되며;
    바람직하게는, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군은 가족성 한랭 자가염증 증후군, 머클-웰스 증후군, 신생아 발병 다발계 염증 질환, 만성 영아 신경 피부 및 관절 증후군, 및 가족성 한랭 두드러기로부터 선택되고;
    바람직하게는, 심혈관 및 뇌혈관 질환은 심근경색, 죽상동맥경화증, 동맥 혈전증, 및 뇌졸중으로부터 선택되며;
    바람직하게는, 종양은 폐암, 간세포 암종, 및 급성 골수성 백혈병으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 통풍성 관절염은 급성 통풍성 관절염 또는 만성 통풍성 관절염인 용도.
  24. 인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합을 차단하기 위한 약제,
    인간 IL-1β의 활성 또는 수준을 하향 조절하기 위한 약제, 또는
    인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합에 의해 매개되는 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 억제하기 위한 약제
    의 제조에서의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적 항체의 용도.
  25. 자가면역 질환, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 종양, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군, 전신성 소아 특발성 관절염, 또는 통풍성 관절염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적 항체로서,
    바람직하게는, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 및 주기적 열 증후군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 주기적 열 증후군은 TNF 수용체 관련 주기적 증후군(TRAPS), 고-IgD 증후군(HIDS)/메발로네이트 키나제 결핍(MKD), 및 가족성 지중해열(FMF)로부터 선택되며;
    바람직하게는, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군은 가족성 한랭 자가염증 증후군, 머클-웰스 증후군, 신생아 발병 다발계 염증 질환, 만성 영아 신경 피부 및 관절 증후군, 및 가족성 한랭 두드러기로부터 선택되고;
    바람직하게는, 심혈관 및 뇌혈관 질환은 심근경색, 죽상동맥경화증, 동맥 혈전증, 및 뇌졸중으로부터 선택되며;
    바람직하게는, 종양은 폐암, 간세포 암종, 및 급성 골수성 백혈병으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 통풍성 관절염은 급성 통풍성 관절염 또는 만성 통풍성 관절염인, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체, 또는 상기 이중 특이적 항체.
  26. 인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합을 차단하거나,
    인간 IL-1β의 활성 또는 수준을 하향 조절하거나, 또는
    인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합에 의해 매개되는 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 억제하는 데 사용하기 위한,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적 항체.
  27. 자가면역 질환, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 종양, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군, 전신성 소아 특발성 관절염, 또는 통풍성 관절염을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적 항체의 유효량을 상기 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며;
    바람직하게는, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 및 주기적 열 증후군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 주기적 열 증후군은 TNF 수용체 관련 주기적 증후군(TRAPS), 고-IgD 증후군(HIDS)/메발로네이트 키나제 결핍(MKD), 및 가족성 지중해열(FMF)로부터 선택되며;
    바람직하게는, 어린이 및 성인의 크리오피린 관련 주기적 증후군은 가족성 한랭 자가염증 증후군, 머클-웰스 증후군, 신생아 발병 다발계 염증 질환, 만성 영아 신경 피부 및 관절 증후군, 및 가족성 한랭 두드러기로부터 선택되고;
    바람직하게는, 심혈관 및 뇌혈관 질환은 심근경색, 죽상동맥경화증, 동맥 혈전증, 및 뇌졸중으로부터 선택되며;
    바람직하게는, 종양은 폐암, 간세포 암종, 및 급성 골수성 백혈병으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 통풍성 관절염은 급성 통풍성 관절염 또는 만성 통풍성 관절염인, 상기 치료 및/또는 예방 방법.
  28. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적 항체의 유효량을 세포에 투여하는 것을 포함하는 생체내 또는 시험관내 방법으로서,
    인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합을 차단하는 방법,
    인간 IL-1β의 활성 또는 수준을 하향 조절하는 방법, 및
    인간 IL-1β의 인간 IL-1R1 및/또는 인간 IL-1R2에 대한 결합에 의해 매개되는 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 억제하는 방법
    으로부터 선택되는 상기 생체내 또는 시험관내 방법.
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