KR20200144569A - T-세포 탈진, 및 이와 관련된 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 T 세포 탈진을 유도 및 모니터링하는 방법을 제공한다. 이 방법은 인간 및 비-인간 T 세포 모두에 효과적이고, 항원-특이적 및 다클론성 T 세포 모두에 효과적이다. 본 발명은 또한 T 세포 탈진을 유도하거나 역전시킬 수 있는 약학적 제제를 스크리닝 및/또는 평가하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 T 세포 탈진을 역전시킬 수 있는 소정의 제제를 제공한다.
Description
본 출원은 2018년 4월 16일에 출원된 미국 가특허 출원번호 제62/657,932호의 우선권 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원의 진술
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 허가번호 CA009207에 따라 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 갖는다.
참조에 의한 통합
참조에 의한 통합을 허용하는 국가들에서, 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌들은 그 전체가 참조로 본원에 통합된다. 또한, 본원에 인용되거나 언급된 임의의 제품에 대한 제조업체의 지침 또는 카탈로그가 참조에 의해 통합된다. 본원에 참조에 의해 통합된 문헌들, 또는 그 안의 임의의 교시들은, 본 발명의 실행에 사용될 수 있다.
암과 만성 감염에서, T 세포는 보통 장기간 동안 항원 (예를 들어, 종양 항원 또는 바이러스 항원)에 노출된다. 항원에 대한 이러한 장기간의 만성적인 노출은 "T 세포 탈진(T cell exhaustion)" 이라고 하는 T 세포 기능저하를 초래할 수 있는데, T 세포 탈진은 종양 성장을 제어하고 만성 감염을 제어하는 면역계 능력의 감소와 관련이 있다. T 세포 탈진에 대한 리뷰는 문헌 [Wherry and Kurachi, "Molecular and Cellular Insights into T Cell Exhaustion," Nature (2015), Vol. 15, pp. 486-499] 을 참조하며, 그 내용은 본원에 참조로 통합된다. 탈진된 T 세포는일반적으로 억제성 수용체 (예를 들어, PD-1, LAG-3 및 PD-L1)의 발현 증가, 이펙터 사이토카인의 생산 감소, 증식률 감소, 및 표적세포 사멸 활성의 감소를 나타낸다. 탈진된 T 세포의 재활성화(revitalization)는 면역력 기능을 회복시킬(reinvigorate) 수 있다. 예를 들어, PD1 및 PD-L1의 억제제 (소위 "면역 체크포인트 억제제")는 T 세포 탈진을 역전시키고 종양에 대한 면역계의 반응을 회복시킬 수 있다.
T 세포 탈진을 연구하는 현재의 방법은 생체 내(in vivo)에서 탈진된 표현형을 유도하는 것을 포함한다. 생체 내에서 이러한 연구를 수행해야 할 필요성은, T 세포 탈진이 인간 면역계에서 어떻게 작용하는지 연구하고 T 세포 탈진을 (양성 또는 음성으로) 조절할 수 있는 새로운 치료제에 대한 스크리닝을 수행하는데 장벽을 제시한다. 따라서, 시험관 내(in vitro)에서 T 세포 탈진을 유도 및 연구하고, 시험관 내에서 새로운 치료 후보제를 스크리닝하거나 시험관 내에서 공지된 또는 새로운 치료제의 효과를 연구하기 위해 사용될 수 있는, 신규하고 개선된 방법이 당업계에서 요구된다. 본 발명은 이러한 필요 및 다른 필요들을 해결한다.
발명의 요지
본 발명은, 부분적으로, 아래에 요약된 일련의 새로운 방법 및 관련된 새로운 발견에 기초하며, 본원 명세서의 "도면의 간단한 설명", "도면", "발명의 내용", "실시예" 및 "청구범위" 항목에 보다 상세히 기재된다.
본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 T 세포 탈진(T cell exhaustion)을 유도하고 모니터링하는 새로운 방법을 제공하며, 이는 생체 내(in vivo)에서 T 세포 탈진을 유도하기 위해 요구되었던 종래 방법들에 비해 상당한 이점을 제공한다. 이러한 새로운 방법은 T 세포 탈진을 유도하는 고전적인 방법, 즉 만성 바이러스 감염의 생체 내 모델에 의존하는 방법 또는 종양이 있는 마우스로 T 세포를 입양전달(adoptive transfer)한 후 종양-침윤된 림프구를 분리하는 방법과는 상이하다. 본원에서 제공되는 새로운 시험관 내 방법은 인간 및 비-인간 T 세포 모두에 효과적이며, 항원-특이성 및 다클론성 T 세포 모두에 효과적이다. 또한, 본원에 제공된 방법은 시험관 내 시스템에서 T 세포가 약학적 제제에 의해 기능회복을 할 수 있는지(re-invigorated) 여부를 테스트하는 메커니즘을 제공한다. 예를 들어, 본원에 제공된 시험관 내 방법은 면역 체크포인트 억제제를 포함하나 이에 제한되지 않는 면역조절제의 전-임상 평가에 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 또한 예후 적용에 유용하다 - 환자-유래 세포의 T 세포 탈진 상태를, 및/또는 환자-유래 세포의 T 세포가 만성 자극에 반응하여 탈진에 저항하는 능력을, 시험관 내에서 평가 및 측정할 수 있도록 한다.
본원의 방법은 T 세포 수용체의 시험관 내 자극에 의해 T 세포 탈진을 유도한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명은 시험관 내에서 T 세포 탈진을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 T-세포 수용체 신호전달을 급성적으로 자극하는 조건 하에서 제1 시간 구간(time-period)동안 시험관 내에서 T 세포를 배양하는 단계, 및 그후 T-세포 수용체 신호전달을 만성적으로 자극하는 조건 하에서 제2 시간 구간 동안 시험관 내에서 T 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 이에 의해 탈진된 T 세포가 생성된다.
중요하게도, 본 방법은 다클론성 T 세포 상의 TCR에 대한 비-항원 특이적 방식의 일반화된 자극에 의해서, 또는 항원-특이적 T 세포 상의 TCR에 대한 항원-특이적 자극에 의하여, T 세포 탈진을 효과적으로 유도할 수 있다. 전자의 상황에서, 다클론성 T 세포 상의 TCR에 대한 일반화된 자극은, 예를 들어, 상기 T 세포를 (a) 항-CD3 항체 및 선택적으로, 항-CD28 항체와 함께 배양하거나, 또는 (b) 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 둘 다와 함께 배양함으로써 달성될 수 있다. 후자의 상황에서, 항원-특이적 T 세포 상의 TCR에 대한 항원-특이적 자극은, 예를 들어, 항원 제시 세포, 종양 세포, 바이러스-감염된 세포, 또는 표면의 MHC 분자 상에 특이적 항원에서 유래한 펩티드를 제시하는 임의의 세포와 함께, 상기 항원-특이적인 T 세포를 배양하는 단계에 의해 (또는, 특이적 항원이나 상기 특이적 항원에서 유래한 펩티드의 존재 하에서, 항원 제시 세포, 종양 세포, 바이러스-감염된 세포, 또는 임의의 세포와 함께, 상기 항원-특이적인 T 세포를 배양하여, 상기 항원 또는 펩티드가 상기 세포 표면의 MHC 분자 상에 전시되도록 하는 단계에 의해) 달성될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 T 세포 (즉, T 세포의 시작/투입 집단)는 항원-특이적 T 세포를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 이러한 일부 구체예에서, 항원-특이적 T 세포는 관심 항원 내의 주어진 에피토프에 대해 특이적이다. 이러한 일부 구체예에서, 항원-특이적 T 세포는 단클론성 항원-특이적 T 세포이다. 이러한 일부 구체예에서, 사용된 T 세포 (즉, T 세포의 시작/투입 집단)는 실질적으로 순수한 항원-특이적 T 세포 집단을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 이러한 일부 구체예에서, 사용된 T 세포 (즉, T 세포의 시작/투입 집단)는 관심 항원 내의 주어진 에피토프에 특이적인 실질적으로 순수한 항원-특이적 T 세포 집단을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 이러한 일부 구체예에서, 사용된 T 세포 (즉, T 세포의 시작/투입 집단)는 실질적으로 순수한 단클론성 항원-특이적 T 세포 집단을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.
이러한 항원-특이적 T 세포는 항원-특이적인 탈진된 T 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명은 시험관 내에서 항원-특이적 T 세포의 탈진을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 항원-특이적인 T 세포를, (i) T 세포가 특이적인 항원 또는 펩티드/에피토프 및 항원-제시 세포, 및 선택적으로 IL-2와 함께, 또는 (ii) T 세포가 특이적인 항원 또는 펩티드/에피토프를 MHC 분자 상에 제시하는 항원-제시 세포, 및 선택적으로 IL-2와 함께 배양하는 단계로서, 상기 배양은 제1 시간 구간(time-period)동안 시험관 내에서 수행되는, 단계, 및 그후 T 세포를, (i) T 세포가 특이적인 항원 또는 펩티드/에피토프 및 항원-제시 세포, 종양 세포, 또는 바이러스-감염된 세포, 및 선택적으로 IL-2와 함께, 또는 (ii) T 세포가 특이적인 항원 또는 펩티드/에피토프를 MHC 분자 상에 제시하는, 항원-제시 세포, 종양 세포, 또는 바이러스-감염된 세포, 및 선택적으로 IL-2과 함께 배양하는 단계로서, 상기 배양은 제2 시간 구간 동안 시험관 내에서 수행되는, 단계를 포함하고, 이에 의해 항원-특이적인 탈진된 T 세포가 생성된다.
일부 구체예에서, 사용된 T 세포 (즉, T 세포의 시작/투입 집단)는 "비-항원-특이적 T 세포"를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되며, 이는 본원에서 "다클론성 T 세포"라고도 지칭된다. 이러한 일부 구체예에서, 사용된 T 세포 (즉, T 세포의 시작/투입 집단)는 실질적으로 순수한 다클론성 T 세포 집단을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.
이러한 다클론성 T 세포는 다클론성의 탈진된 T 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서 본 발명은 시험관 내에서 다클론성 T 세포 탈진을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 다클론성 T 세포를, (i) 항-CD3 항체 및 (ii) 선택적으로 항-CD28 항체, 및 (iii) 선택적으로 IL-2 와 함꼐 배양하는 단계로서, 상기 배양은 제1 시간 구간(time-period)동안 시험관 내에서 수행되는, 단계, 및 (b) 그후 T 세포를, (i) 항-CD3 항체, (ii) 선택적으로 항-CD28 항체, 및 (iii) 선택적으로 IL-2과 함께 배양하는 단계로서, 상기 배양은 제2 시간 구간 동안 시험관 내에서 수행되는, 단계를 포함하고, 이에 의해 다클론성인 탈진된 T 세포가 생성된다.
상기 요약되고 본원의 다른 곳에 기재된 방법은, 항원-특이적 T 세포에서 시작하든 다클론성 T 세포에서 시작하든, 모두 탈진된 T 세포를 생성한다. 전형적으로, 탈진된 T 세포는 다음 특징들 중 하나 이상(또는 모두)을 나타낸다: (a) 시작 T 세포(starting T cell) 및/또는 비-탈진된 T 세포와 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1 중 하나 이상의 발현 증가, (b) 시작 T 세포 및/또는 비-탈진된 T 세포와 비교하여, 하나 이상의 이펙터 사이토카인(예를 들어, IFNγ, TNFα 및/또는 IL2)의 생산 감소, (c) 시작 T 세포 및/또는 비-탈진된 T 세포와 비교하여, 증식 감소, 및 (d) 시작 T 세포 및/또는 비-탈진된 T 세포와 비교하여, 표적세포 사멸 활성의 감소. 일부 구체예에서, 상기 요약되고 본원의 다른 곳에 기재된 방법은, 상기 방법을 사용하여 생성된 세포에서 다음 중 하나 이상을 측정하기 위해 분석을 수행하는 단계를 포함한다: (a) PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현, (b) 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산, (c) 증식률 및/또는 (d) 표적세포 사멸 활성. 이 단계는 세포의 탈진 상태를 평가하는데 유용하다. 일부 구체예에서, 이러한 분석은 "시험(test)" T 세포 및 "대조군(control)" T 세포를 이용하여 수행 될 것이다. "시험" T 세포는 전형적으로 본원에 기재된 바와 같은 탈진 유도 방법을 적용한 세포일 것이다. 일부 구체예에서, 대조군 T 세포는 시험 세포가 생성되는 기원이 된 T 세포의 시작/투입 집단일 수 있다. 일부 구체예에서, 대조군 T 세포는 T 세포 수용체 신호전달의 급성 자극만을 적용 받고, T 세포 수용체 신호전달의 만성 자극은 받지 않은 T 세포일 수 있다 (예를 들어, 본원에 기술된 방법의 첫번째 단계만 적용받고 두번째 단계는 적용받지 않음). 다른 적합한 "시험" 및 "대조군" 세포는 원하는대로 선택할 수 있다.
본원의 방법의 중요한 특징은 T 세포 수용체의 장기적인(prolonged) 시험관 내 자극에 의해 T 세포 탈진을 생성하는 것이며, 이러한 자극이 다클론성 T 세포 상의 TCR에 대한 일반화된 자극이든, 항원-특이적 T 세포에 대한 항원-특이적 자극이든 상관없다. 이 장기적인 자극은, 첫번째 조건(T 세포 수용체 신호전달을 급성적으로 자극하는 조건) 하에서 제1 시간 구간동안 T 세포를 배양하고, 이후 두번째 조건(T 세포 수용체 신호전달을 만성적으로 자극하는 조건) 하에서 제2 시간 구간동안 T 세포를 배양하는 것에 의하여 생성된다. 일부 구체예에서, 제1 시간 구간은 약 1-3일 (24-72 시간)이다. 일부 구체예에서, 제1 시간 구간은 약 1-2일 (24-48 시간)이다. 일부 구체예에서, 제1 시간 구간은 약 11/2-2일 (36-48 시간)이다. 일부 구체예에서, 제1 시간 구간은 약 2일 (48 시간)이다. 일부 구체예에서, 제2 시간 구간은 약 4-8일 (96-192 시간)이다. 일부 구체예에서, 제2 시간 구간은 약 6일 (144 시간)이다. 일부 구체예에서, 제2 시간 구간은 약 4일 (96 시간) 이상이다. 일부 구체예에서, 제2 시간 구간은 약 6일 (144 시간) 이상이다. 전형적으로, 제2 시간 구간 동안 T 세포는 재-플레이팅되거나 분할되거나 계대되거나, 또는 이들의 배양 배지가 여러 번 변경되거나 보충될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, T 세포는 재-플레이팅되거나 분할되거나 계대되거나, 또는 제2 시간 구간 동안 약 1-2일마다 이들의 배양 배지가 변경되거나 보충될 수 있다. 전형적으로, 제2 시간 구간 동안 T 세포는 재-플레이팅되거나 분할되거나 계대되거나, 또는 이들의 배양 배지를 여러 번 변경하거나 보충하여 일반화된 TCR 자극 (예를 들어, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체)의 보충 공급을 제공할 것이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 제2 시간 구간 동안 T 세포는 재-플레이팅되거나 분할되거나 계대되거나, 약 1-2일마다 이들의 배양 배지가 변경되거나 보충될 것이다.
탈진된 T 세포의 생성 방법을 제공하는 것 외에도, 본 발명은 또한 본원에 제공된 방법을 사용하여 수득된 탈진된 T 세포의 집단을 제공한다. 이러한 일부 구체예에서, 탈진된 T 세포의 집단은 탈진된 T 세포의 실질적으로 순수한 집단이다.
본 발명은 또한 T 세포 탈진에 대한 하나 이상의 시험 제제의 효과를 평가하기 위한 다양한 방법을 제공한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명은 T 세포 탈진에 대한 하나 이상의 시험 제제의 효과를 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) 시험 제제(들)의 존재 하에서 및 시험 제제(들)의 부재 하에서, 상기 기술된 또는 본원의 다른곳에 기술된 바와 같은 T 세포 수용체의 시험관내 자극에 의해 T 세포 탈진을 유도하는 방법을 수행하는 단계, 및 (b) 단계 (a)에서 생산된 T 세포에서, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산, 증식률, 및/또는 표적세포 사멸 활성 중 하나 이상을 측정하기 위한 분석을 수행하는 단계를 포함하고, 이때 시험 제제의 존재 하에서 생산된 T 세포가, 시험 제제의 부재 하에서 생산된 T 세포와 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현 증가, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산 감소, 증식률 감소, 또는 표적세포 사멸 활성의 감소를 나타내면, 시험 제제가 T 세포 탈진을 증가시키는 것이고, 시험 제제의 존재 하에서 생산된 T 세포가, 시험 제제의 부재 하에서 생산된 T 세포와 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현 감소, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산 증가, 증식률 증가, 또는 표적세포 사멸 활성의 증가를 나타내면, 시험 제제가 T 세포 탈진을 감소시키는 것이다.
유사하게, 또 다른 구체예에서, 탈진된 T 세포의 기능회복(reinvigoration)에 대한 하나 이상의 시험 제제의 효과를 평가하는 방법으로서, 상기 방법은: (a) 본원에 기재된 방법을 사용하여 생산된 탈진된 T 세포의 제1 집단을, 하나 이상의 시험 제제와 접촉시켜, T 세포의 시험 집단을 생산하는 단계, (b) 본원에 기재된 방법을 사용하여 생산된 탈진된 T 세포의 제2 집단을, 시험 제제와 접촉시키지 않거나 하나 이상의 대조군 제제와 접촉시켜, T 세포의 대조군 집단을 생산하는 단계, (c) T 세포의 시험 집단 및 T 세포의 대조군 집단에서, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산, 증식률 및/또는 표적세포 사멸 활성 중 하나 이상을 측정하기 위한 분석을 수행하는 단계를 포함하고, 이때, T 세포의 시험 집단이, T 세포의 대조군 집단과 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현 증가, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산 감소, 증식률 감소, 또는 표적세포 사멸 활성의 감소를 나타내면, 시험 제제가 T 세포 기능회복을 감소시키는 것이고, T 세포의 시험 집단이, T 세포의 대조군 집단과 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현 감소, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산 증가, 증식률 증가, 또는 표적세포 사멸 활성의 증가를 나타내면, 시험 제제가 T 세포 기능회복을 증가시키는 것이다.
다른 구체예에서, 탈진된 T 세포를 기능회복시키는(re-invigorating) 방법으로서, 탈진된 T 세포를 유효량의 N-아세틸시스테인과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 유사하게, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 T 세포 탈진을 감소 또는 역전시키는 방법으로서, 탈진된 T 세포를 유효량의 N-아세틸시스테인과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 T 세포-매개성 면역 반응 (예를 들어, 종양 또는 만성 감염에 대한)을 자극하거나 자극하거나 증가시키는 방법으로서, T 세포를 유효량의 N-아세틸시스테인과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 구체예 중 일부에서, T 세포는 살아있는 대상체에 생체 내(in vivo) 존재하고, 상기 방법은 유효량의 N-아세틸시스테인을 살아있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 일부 구체예에서, 대상체는 인간이다. 이러일 구체예 중 일부에서, 방법은 T 세포를 PD1 억제제, PDL1 억제제 또는 CTLA4 억제제와 같은 면역 체크포인트 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은, 본 특허 출원의 "도면의 간단한 설명", "도면", "발명의 내용", "실시예" 및 "청구범위" 항목 에 보다 상세히 기재된다.
도 1. A-H. 항원-특이적 마우스 T 세포 시스템에서 시험관내 탈진. 도 1A. 시험관 내 항원-특이적 T 세포 탈진 모델의 개략도. OT-I 오브알부민-특이적 CD8+ T 세포를 마우스 비장 및 림프절에서 분리하였다. 다음으로 비장 수지상 세포를 항원 제시 세포로 사용하여 2일 동안 SIINFEKL (OT-I-특이적 오브알부민 펩타이드)로 자극했다. 2일 자극 후, 세포를 추가 6일 동안 펩티드의 부재하에서 B16 흑색종 세포와 공동-배양하였다. 재-자극과 함께 또는 재-자극 없이 다색 유세포 분석을 사용하여 표현형을 분석하였다. 억제성 공동-수용체 PD-1 (도 1B), PD-L1 (도 1F), 및 LAG-3 (도 1C)의 상향 조절, 전사인자인 에오메소더민(Eomesodermin) 의 유도(도 1G 및 H), 및 이펙터 사이토카인 생산의 억제(도 1D 및 E)에 의해 알 수 있는 바와 같이, 만성 자극은 T 세포 탈진을 유도했다.
도 2 A-B. 항원-특이적 마우스 T 세포 시스템에서 시험관내 탈진. 도 2A. 시험관 내 항원-특이적 T 세포 탈진 모델의 개략도. 유세포 분석을 사용하여 표현형 분석을 수행하였다. 억제성 공동-수용체 PD-1 의 상향 조절 및 이펙터 사이토카인 TNF-α 생산의 억제에 의해 알 수 있는 바와 같이, 만성 자극은 T 세포 탈진을 유도했다 (도 2B).
도 3 A-G. 다클론성 T-세포 시스템에서 시험관내 탈진. 도 3A. 시험관 내 T 세포 탈진 모델의 개략도. 모델은 마우스 또는 인간 T 세포를 활용할 수 있다. 도 3B-E에 나타낸 데이터는 야생형 C57/BL6 마우스로부터 수득한 마우스 T-세포를 사용하여 생성된 것이다. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. 재-자극과 함께 또는 재-자극 없이 다색 유세포 분석을 사용하여 표현형을 분석하였다. 만성 자극은, 억제성 공동-수용체 PD-1 (도 3B) 및 LAG-3 (도 3C)의 발현과 사이토카인 생산의 억제 (도 3D)를 포함하여, T 세포 탈진의 표현형 및 기능적 특징을 유도했다. 건강한 공여자로부터 분리된 인간 CD3+ T 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었다 (도 3F-G). 도 3F. 건강한 기증자로부터 분리된 인간 CD3+ T 세포를 사용한 시험관 내 다클론성 T 세포 탈진 모델의 개략도. 유세포 분석을 사용하여 표현형 분석을 수행하였다. 억제성 공동-수용체 PD-1 의 상향 조절 및 이펙터 사이토카인 TNF-α 생산의 억제에 의해 알 수 있는 바와 같이, 만성 자극은 T 세포 탈진을 유도했다 (도 3G).
도 4 A-C. 시험관내 탈진된 T-세포는 종양에 침투하는 탈진된 T-세포, 만성 바이러스 감염, 및 면역요법 비-반응자 유래의 T-세포와 유사하다. 분리된 CD3+ T 세포는 이전 도면에서와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 다음으로 만성 및 급성으로 자극된 세포의 RNA-seq를, 종양에 침투하는 탈진된 마우스 T-세포 (도 4A), 만성 LCMV 감염이 있는 마우스의 탈진된 T-세포 (도 4B), 및 항-PD-1 또는 항-CTLA-4를 이용하여 체크포인트 봉쇄을 적용받았으며 반응을 하지 않은 환자의 단리된 T-세포(도 4C)의 발현 프로파일과 비교하였다. 실험 결과는 시험관 내 탈진된 T 세포가 종양 및 만성 바이러스 감염 모두에서 단리된 T-세포와 전사적으로(transcriptionally) 유사하며, 중요하게는, 체크포인트 봉쇄에 반응하지 않는 환자의 T-세포를 효과적으로 모델링한다는 것을 보여준다.
도 5. 만성적으로 자극된 T 세포는 사멸시키지 않는다. OT-I 오브알부민 특이적 CD8+ T 세포는 도 1에서와 같이 활성화되었다. 8일의 급성 또는 만성적 자극 후, T-세포를 SIINFEKL 펩티드로 펄스화된 B16 마우스 흑색종 세포와 24시간 동안 공동-배양하고 루시퍼라제 리포터를 발현시켰다. 사멸 능력은 T 세포와 함께 배양된 비-펄스화된 B16 세포 대비 잔류 발광으로 정량화하였다. 도 5의 데이터는 만성적으로 자극된 T 세포가 B16 흑색종 세포를 사멸시킬 수 없음을 보여준다.
도 6 A-B. 만성적 TCR 자극은 CD8+ T 세포 증식을 제한한다. 도 6A - 모델/방법의 개략도. 이 모델은 마우스 또는 인간 T 세포를 활용할 수 있다. 도 6B에 나타낸 데이터는 야생형 C57/BL6 마우스로부터 수득한 마우스 CD8+ T-세포를 사용하여 생성된 것이다. 단리된 CD8+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. Coulter 카운터를 사용하여 2일마다 세포를 계수했다. 도 6B의 데이터는 만성 항원 자극이 T-세포 증식을 제한하는 것을 입증한다. 건강한 공여자로부터 단리된 인간 CD8+ T 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
도 7 A-B. 만성 TCR 자극은 CD4+ T 세포 증식을 제한한다. 만성 TCR 자극은 CD8+ T 세포 증식을 제한한다. 도 7A - 모델/방법의 개략도. 이 모델은 마우스 또는 인간 T 세포를 활용할 수 있다. 도 7B에 나타낸 데이터는 야생형 C57/BL6 마우스로부터 수득한 마우스 CD4+ T-세포를 사용하여 생성된 것이다. 단리된 CD4+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. Coulter 카운터를 사용하여 2일마다 세포를 계수했다. 도 7B의 데이터는 만성 항원 자극이 T-세포 증식을 제한하는 것을 입증한다. 건강한 공여자로부터 단리된 인간 CD4+ T 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
도 8 A-D. 만성 TCR 자극은 지속적인 호기성 해당과정(aerobic glycolysis)을 유도한다. 도 8A - 모델/방법의 개략도. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. 8일째, 배지를 수확하고 YSI 생화학 분석기를 사용하여 포도당 및 젖산 농도를 분석했다. 포도당 및 젖산 소비와 배출은 세포를 함유하는 웰의 배지와 배지 단독을 비교하여 계산하였다. 실험 결과는 만성적으로 자극된 T-세포가 급성적으로 자극된 T-세포보다 더 많은 포도당을 소비하고 (도 8B) 소비된 포도당 분자 당 젖산을 더 많이 배출한다는 것을 보여준다 (도 8C-D).
도 9 A-D. 만성 TCR 자극은 지속적인 호기성 해당과정을 유도한다. 도 9A - 모델/방법의 개략도. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. 8일째, 세포를 96-웰 플레이트에 재-플레이팅하고 Seahorse 96-웰 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 산소 소비율 및 세포외 산성화율을 분석했다. 실험 결과는 만성적으로 자극된 T-세포가 급성적으로 자극된 T-세포보다 더 높은 세포외 산성화율 (도 9C-D) 및 더 낮은 산소 소비율 (도 9B, 도 9D)을 나타냄을 보여준다.
도 10 A-B. 시험관 내 탈진된 T 세포를 사용한 대사 동위원소 추적. 단리된 CD3+ T 세포는 설명한대로 급성 또는 만성적으로 자극하였다 (다클론성 모델). 배양 8일 후, T-세포는 보편적으로 C13-표지된 포도당 (위) 또는 글루타민 (아래)의 존재 하에서 6 시간 동안 배양하였다. 세포를 얼음처럼 차가운 메탄올로 고정하고, 대사산물을 추출하고, 유도체화하고, 가스크로마토그래피 - 질량 분석법 (GC-MS) 및 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법 (LC-MS)으로 분석했다. 도 10A-B의 데이터는 만성적으로 자극된 T-세포가 통상적으로 자극된 T-세포와 비교하여 트리카르복실산 회로 중간체의 표지에 현저한 차이를 보인다는 것을 나타낸다. 도 10A 및도 10B는 각각의 수평축에 표시된 바와 같은 상이한 트리카르복실산 회로 중간체들에 대한 데이터를 제공한다.
도 11 A-B. 포도당 가용성(glucose availability)이 높은 조건에서, 만성적인 T-세포 자극은 산화 스트레스를 유발한다. 도 11A - 관련 대사 경로의 개략도. 단리된 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. 8일째, 클로로메틸 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트 (CM-DCFDA)를 30분 동안 세포에 첨가한 후 유세포 분석에 의해 GFP 형광을 평가했다. CM-DCFDA는 활성 산소종 (ROS)의 존재 하에서 산화될 때에만 GFP 채널에서 형광을 발하므로 세포 내 ROS의 상대적 축적을 반영한다. 도 11B에 나타난 결과는, 만성적으로 (Ch) 자극된 CD4+ 및 CD8+ T-세포가 급성으로 자극된 (Ac) CD4+ 및 CD8+ T-세포에 비해 활성 산소종의 축적 증가 나타낸다는 것을 입증한다.
도 12 A-B. 낮은 포도당 가용성 하에서, 만성적으로 자극된 T 세포는 생존할 수 없다. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 세포를 추가 6일 동안 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나, 표시된 것처럼 20mM 포도당, 2mM 포도당, 또는 0.5 mM 포도당을 포함하는 배지에서 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다 Coulter 카운터를 사용하여 2일마다 세포를 계수했다. 도 12A-B에 제시된 데이터는, 만성적으로 자극된 T 세포 (도 12A)가 급성적으로 자극된 T 세포 (도 12A)와 비교하여, 낮은 세포외 포도당 가용성에 대한 감수성 증가 및 낮은 세포외 포도당 가용성에 대한 감수성 증가를 나타낸다는 것을 보여준다.
도 13 A-B. N-아세틸시스테인은 만성적으로 자극된 T-세포의 증식을 회복시킨다. 도 13A - 모델/방법의 개략도. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나, 10mM N-아세틸시스테인의 존재 또는 부재하에서 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. Coulter 카운터를 사용하여 2일마다 세포를 계수했다. 도 13B에 제시된 데이터는, N-아세틸시스테인이 만성 자극에 의한 증식 장애를 완전히 역전시킨다는 것을 보여준다.
도 14 A-D. N-아세틸시스테인은 내인성 T 세포 탈진을 역전시킨다. 단리된 CD3+ T 세포를, 항-PD-L1 없이 (도 14A) 또는 항-PD-L1의 존재 또는 부재 하에서 (도 14B) 및/또는 N-아세틸시스테인 (10mM)의 존재 또는 부재하에서(도 14C) 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 배양 8일 후, 세포를 사이토카인 생산(위)을 위해 재-자극하거나 특정 항원을 발현하는 종양 세포와 공동-배양했다. 만성적으로 자극된 T-세포는 감소된 사이토카인 생산을 나타내었고 (도 14A) 종양 세포를 사멸시킬 수 없었다 (도 14D). 이는 항-PD-L1 요법에 의해 최소한으로 구제되었지만(도 14B, 도 14D) N-아세틸시스테인에 의해 효과적으로 역전되었다 (도 14B, 도 14D).
도 15 A-C N-아세틸시스테인은 CAR-T 세포 탈진을 역전시킨다. CD19-특이적 CAR-T 세포를 CD19-발현 A20 림프종 세포를 보유한 마우스에 전달함으로써 탈진된 CAR-T 세포를 생성하였다. 14일 후, CAR-T 세포를 마우스 비장에서 분리하고 증식 능력, 산화 스트레스, 및 사이토카인 생산에 대해 조사했다. 비히클 처리된 탈진된 CAR-T 세포 (분홍색)는 증식 (도 15A) 또는 사이토카인 생성 (도 15C)이 불가능했으며 상승된 수준의 활성 산소종을 나타냈다 (도 15B). N-아세틸시스테인 처리 (10mM)는 산화 스트레스를 감소시키면서 (도 15B) CAR-T 세포 증식 (도 15A) 및 사이토카인 생산 (도 15C)을 향상시켰다.
도 16 A-B. N-아세틸시스테인은 T 세포 기억을 회복시킨다. 단리된 CD3+ T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 배양 8일 후, RNA를 추출하고 전사인자 Tcf7을 정의하는 기억 T 세포의 발현에 대해 분석하였다. N-아세틸시스테인은 만성 자극 동안 현저하게 소실되었던 Tcf7 발현을 회복시켰다 (도 16A). 체크포인트 억제제를 투여받은 흑색종 환자의 종양-침윤 T 세포를 추출하여 단일 세포 RNA-seq로 분석했다. 유전자 발현 분석은 산화 스트레스의 유도가 T-세포 기억의 생성과 강한 역상관을 가짐을 보여 주었고 (도 16B), 이는 N-아세틸시스테인으로 산화 스트레스를 역전시키면 기억 T-세포 분화를 회복함으로써 T-세포 면역 요법을 향상시킬 수 있다는 가설과 일치한다.
도 17 A-C. xCT 과발현은 T-세포의 항-종양 기능을 향상시킨다. 단리된 CD3+ T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 세포를 대조군 구축물 (EV) 또는 시스테인 수송체 xCT를 발현하는 구축물로 레트로바이러스 감염시켰다 (도 17A). xCT의 과발현은 만성 자극 동안 T-세포 성장 (도 17B) 및 사이토카인 생산 (도 17C) 모두의 손실을 역전시켰다.
도 18 A-C. 오프탈메이트(Ophthalmate)는 탈진된 T 세포의 산화 스트레스에 대한 바이오마커이며 N-아세틸시스테인에 의해 역전된다. 단리된 CD3+ T 세포는 N-아세틸시스테인 (10mM)의 존재 또는 부재하에서 본원에 기재된 바와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 8일 후, LC-MS에 의해 세포들에서 세포내 오프탈메이트 수준을 분석하였다. 도 18A의 개략도는 글루타티온이 고갈되고 정상적으로 글루타티온을 합성하는 효소들이 억제되는(de-repressed) 경우, 어떻게 이들 효소들에 의해 오프탈메이트가 생성되지를 보여준다. 오프탈메이트 수준은 만성적으로 자극된 T-세포에서 더 높았으며 (도 18B) N-아세틸시스테인의 투여에 의해 역전되었다 (도 18C).
도 2 A-B. 항원-특이적 마우스 T 세포 시스템에서 시험관내 탈진. 도 2A. 시험관 내 항원-특이적 T 세포 탈진 모델의 개략도. 유세포 분석을 사용하여 표현형 분석을 수행하였다. 억제성 공동-수용체 PD-1 의 상향 조절 및 이펙터 사이토카인 TNF-α 생산의 억제에 의해 알 수 있는 바와 같이, 만성 자극은 T 세포 탈진을 유도했다 (도 2B).
도 3 A-G. 다클론성 T-세포 시스템에서 시험관내 탈진. 도 3A. 시험관 내 T 세포 탈진 모델의 개략도. 모델은 마우스 또는 인간 T 세포를 활용할 수 있다. 도 3B-E에 나타낸 데이터는 야생형 C57/BL6 마우스로부터 수득한 마우스 T-세포를 사용하여 생성된 것이다. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. 재-자극과 함께 또는 재-자극 없이 다색 유세포 분석을 사용하여 표현형을 분석하였다. 만성 자극은, 억제성 공동-수용체 PD-1 (도 3B) 및 LAG-3 (도 3C)의 발현과 사이토카인 생산의 억제 (도 3D)를 포함하여, T 세포 탈진의 표현형 및 기능적 특징을 유도했다. 건강한 공여자로부터 분리된 인간 CD3+ T 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었다 (도 3F-G). 도 3F. 건강한 기증자로부터 분리된 인간 CD3+ T 세포를 사용한 시험관 내 다클론성 T 세포 탈진 모델의 개략도. 유세포 분석을 사용하여 표현형 분석을 수행하였다. 억제성 공동-수용체 PD-1 의 상향 조절 및 이펙터 사이토카인 TNF-α 생산의 억제에 의해 알 수 있는 바와 같이, 만성 자극은 T 세포 탈진을 유도했다 (도 3G).
도 4 A-C. 시험관내 탈진된 T-세포는 종양에 침투하는 탈진된 T-세포, 만성 바이러스 감염, 및 면역요법 비-반응자 유래의 T-세포와 유사하다. 분리된 CD3+ T 세포는 이전 도면에서와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 다음으로 만성 및 급성으로 자극된 세포의 RNA-seq를, 종양에 침투하는 탈진된 마우스 T-세포 (도 4A), 만성 LCMV 감염이 있는 마우스의 탈진된 T-세포 (도 4B), 및 항-PD-1 또는 항-CTLA-4를 이용하여 체크포인트 봉쇄을 적용받았으며 반응을 하지 않은 환자의 단리된 T-세포(도 4C)의 발현 프로파일과 비교하였다. 실험 결과는 시험관 내 탈진된 T 세포가 종양 및 만성 바이러스 감염 모두에서 단리된 T-세포와 전사적으로(transcriptionally) 유사하며, 중요하게는, 체크포인트 봉쇄에 반응하지 않는 환자의 T-세포를 효과적으로 모델링한다는 것을 보여준다.
도 5. 만성적으로 자극된 T 세포는 사멸시키지 않는다. OT-I 오브알부민 특이적 CD8+ T 세포는 도 1에서와 같이 활성화되었다. 8일의 급성 또는 만성적 자극 후, T-세포를 SIINFEKL 펩티드로 펄스화된 B16 마우스 흑색종 세포와 24시간 동안 공동-배양하고 루시퍼라제 리포터를 발현시켰다. 사멸 능력은 T 세포와 함께 배양된 비-펄스화된 B16 세포 대비 잔류 발광으로 정량화하였다. 도 5의 데이터는 만성적으로 자극된 T 세포가 B16 흑색종 세포를 사멸시킬 수 없음을 보여준다.
도 6 A-B. 만성적 TCR 자극은 CD8+ T 세포 증식을 제한한다. 도 6A - 모델/방법의 개략도. 이 모델은 마우스 또는 인간 T 세포를 활용할 수 있다. 도 6B에 나타낸 데이터는 야생형 C57/BL6 마우스로부터 수득한 마우스 CD8+ T-세포를 사용하여 생성된 것이다. 단리된 CD8+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. Coulter 카운터를 사용하여 2일마다 세포를 계수했다. 도 6B의 데이터는 만성 항원 자극이 T-세포 증식을 제한하는 것을 입증한다. 건강한 공여자로부터 단리된 인간 CD8+ T 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
도 7 A-B. 만성 TCR 자극은 CD4+ T 세포 증식을 제한한다. 만성 TCR 자극은 CD8+ T 세포 증식을 제한한다. 도 7A - 모델/방법의 개략도. 이 모델은 마우스 또는 인간 T 세포를 활용할 수 있다. 도 7B에 나타낸 데이터는 야생형 C57/BL6 마우스로부터 수득한 마우스 CD4+ T-세포를 사용하여 생성된 것이다. 단리된 CD4+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. Coulter 카운터를 사용하여 2일마다 세포를 계수했다. 도 7B의 데이터는 만성 항원 자극이 T-세포 증식을 제한하는 것을 입증한다. 건강한 공여자로부터 단리된 인간 CD4+ T 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
도 8 A-D. 만성 TCR 자극은 지속적인 호기성 해당과정(aerobic glycolysis)을 유도한다. 도 8A - 모델/방법의 개략도. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. 8일째, 배지를 수확하고 YSI 생화학 분석기를 사용하여 포도당 및 젖산 농도를 분석했다. 포도당 및 젖산 소비와 배출은 세포를 함유하는 웰의 배지와 배지 단독을 비교하여 계산하였다. 실험 결과는 만성적으로 자극된 T-세포가 급성적으로 자극된 T-세포보다 더 많은 포도당을 소비하고 (도 8B) 소비된 포도당 분자 당 젖산을 더 많이 배출한다는 것을 보여준다 (도 8C-D).
도 9 A-D. 만성 TCR 자극은 지속적인 호기성 해당과정을 유도한다. 도 9A - 모델/방법의 개략도. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. 8일째, 세포를 96-웰 플레이트에 재-플레이팅하고 Seahorse 96-웰 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 산소 소비율 및 세포외 산성화율을 분석했다. 실험 결과는 만성적으로 자극된 T-세포가 급성적으로 자극된 T-세포보다 더 높은 세포외 산성화율 (도 9C-D) 및 더 낮은 산소 소비율 (도 9B, 도 9D)을 나타냄을 보여준다.
도 10 A-B. 시험관 내 탈진된 T 세포를 사용한 대사 동위원소 추적. 단리된 CD3+ T 세포는 설명한대로 급성 또는 만성적으로 자극하였다 (다클론성 모델). 배양 8일 후, T-세포는 보편적으로 C13-표지된 포도당 (위) 또는 글루타민 (아래)의 존재 하에서 6 시간 동안 배양하였다. 세포를 얼음처럼 차가운 메탄올로 고정하고, 대사산물을 추출하고, 유도체화하고, 가스크로마토그래피 - 질량 분석법 (GC-MS) 및 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법 (LC-MS)으로 분석했다. 도 10A-B의 데이터는 만성적으로 자극된 T-세포가 통상적으로 자극된 T-세포와 비교하여 트리카르복실산 회로 중간체의 표지에 현저한 차이를 보인다는 것을 나타낸다. 도 10A 및도 10B는 각각의 수평축에 표시된 바와 같은 상이한 트리카르복실산 회로 중간체들에 대한 데이터를 제공한다.
도 11 A-B. 포도당 가용성(glucose availability)이 높은 조건에서, 만성적인 T-세포 자극은 산화 스트레스를 유발한다. 도 11A - 관련 대사 경로의 개략도. 단리된 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. 8일째, 클로로메틸 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트 (CM-DCFDA)를 30분 동안 세포에 첨가한 후 유세포 분석에 의해 GFP 형광을 평가했다. CM-DCFDA는 활성 산소종 (ROS)의 존재 하에서 산화될 때에만 GFP 채널에서 형광을 발하므로 세포 내 ROS의 상대적 축적을 반영한다. 도 11B에 나타난 결과는, 만성적으로 (Ch) 자극된 CD4+ 및 CD8+ T-세포가 급성으로 자극된 (Ac) CD4+ 및 CD8+ T-세포에 비해 활성 산소종의 축적 증가 나타낸다는 것을 입증한다.
도 12 A-B. 낮은 포도당 가용성 하에서, 만성적으로 자극된 T 세포는 생존할 수 없다. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 세포를 추가 6일 동안 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나, 표시된 것처럼 20mM 포도당, 2mM 포도당, 또는 0.5 mM 포도당을 포함하는 배지에서 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다 Coulter 카운터를 사용하여 2일마다 세포를 계수했다. 도 12A-B에 제시된 데이터는, 만성적으로 자극된 T 세포 (도 12A)가 급성적으로 자극된 T 세포 (도 12A)와 비교하여, 낮은 세포외 포도당 가용성에 대한 감수성 증가 및 낮은 세포외 포도당 가용성에 대한 감수성 증가를 나타낸다는 것을 보여준다.
도 13 A-B. N-아세틸시스테인은 만성적으로 자극된 T-세포의 증식을 회복시킨다. 도 13A - 모델/방법의 개략도. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나, 10mM N-아세틸시스테인의 존재 또는 부재하에서 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. Coulter 카운터를 사용하여 2일마다 세포를 계수했다. 도 13B에 제시된 데이터는, N-아세틸시스테인이 만성 자극에 의한 증식 장애를 완전히 역전시킨다는 것을 보여준다.
도 14 A-D. N-아세틸시스테인은 내인성 T 세포 탈진을 역전시킨다. 단리된 CD3+ T 세포를, 항-PD-L1 없이 (도 14A) 또는 항-PD-L1의 존재 또는 부재 하에서 (도 14B) 및/또는 N-아세틸시스테인 (10mM)의 존재 또는 부재하에서(도 14C) 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 배양 8일 후, 세포를 사이토카인 생산(위)을 위해 재-자극하거나 특정 항원을 발현하는 종양 세포와 공동-배양했다. 만성적으로 자극된 T-세포는 감소된 사이토카인 생산을 나타내었고 (도 14A) 종양 세포를 사멸시킬 수 없었다 (도 14D). 이는 항-PD-L1 요법에 의해 최소한으로 구제되었지만(도 14B, 도 14D) N-아세틸시스테인에 의해 효과적으로 역전되었다 (도 14B, 도 14D).
도 15 A-C N-아세틸시스테인은 CAR-T 세포 탈진을 역전시킨다. CD19-특이적 CAR-T 세포를 CD19-발현 A20 림프종 세포를 보유한 마우스에 전달함으로써 탈진된 CAR-T 세포를 생성하였다. 14일 후, CAR-T 세포를 마우스 비장에서 분리하고 증식 능력, 산화 스트레스, 및 사이토카인 생산에 대해 조사했다. 비히클 처리된 탈진된 CAR-T 세포 (분홍색)는 증식 (도 15A) 또는 사이토카인 생성 (도 15C)이 불가능했으며 상승된 수준의 활성 산소종을 나타냈다 (도 15B). N-아세틸시스테인 처리 (10mM)는 산화 스트레스를 감소시키면서 (도 15B) CAR-T 세포 증식 (도 15A) 및 사이토카인 생산 (도 15C)을 향상시켰다.
도 16 A-B. N-아세틸시스테인은 T 세포 기억을 회복시킨다. 단리된 CD3+ T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 배양 8일 후, RNA를 추출하고 전사인자 Tcf7을 정의하는 기억 T 세포의 발현에 대해 분석하였다. N-아세틸시스테인은 만성 자극 동안 현저하게 소실되었던 Tcf7 발현을 회복시켰다 (도 16A). 체크포인트 억제제를 투여받은 흑색종 환자의 종양-침윤 T 세포를 추출하여 단일 세포 RNA-seq로 분석했다. 유전자 발현 분석은 산화 스트레스의 유도가 T-세포 기억의 생성과 강한 역상관을 가짐을 보여 주었고 (도 16B), 이는 N-아세틸시스테인으로 산화 스트레스를 역전시키면 기억 T-세포 분화를 회복함으로써 T-세포 면역 요법을 향상시킬 수 있다는 가설과 일치한다.
도 17 A-C. xCT 과발현은 T-세포의 항-종양 기능을 향상시킨다. 단리된 CD3+ T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 세포를 대조군 구축물 (EV) 또는 시스테인 수송체 xCT를 발현하는 구축물로 레트로바이러스 감염시켰다 (도 17A). xCT의 과발현은 만성 자극 동안 T-세포 성장 (도 17B) 및 사이토카인 생산 (도 17C) 모두의 손실을 역전시켰다.
도 18 A-C. 오프탈메이트(Ophthalmate)는 탈진된 T 세포의 산화 스트레스에 대한 바이오마커이며 N-아세틸시스테인에 의해 역전된다. 단리된 CD3+ T 세포는 N-아세틸시스테인 (10mM)의 존재 또는 부재하에서 본원에 기재된 바와 같이 급성 또는 만성적으로 자극하였다. 8일 후, LC-MS에 의해 세포들에서 세포내 오프탈메이트 수준을 분석하였다. 도 18A의 개략도는 글루타티온이 고갈되고 정상적으로 글루타티온을 합성하는 효소들이 억제되는(de-repressed) 경우, 어떻게 이들 효소들에 의해 오프탈메이트가 생성되지를 보여준다. 오프탈메이트 수준은 만성적으로 자극된 T-세포에서 더 높았으며 (도 18B) N-아세틸시스테인의 투여에 의해 역전되었다 (도 18C).
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또한, "및/또는"은 각각의 2개의 특정된 성질 또는 성분의 다른 하나와 함께 또는 다른 하나 없이 특정한 기재로서 취해지는 것이다. 따라서, "A 및/또는 B"와 같은 구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A 및 B, A 또는 B, A(단독), 및 B(단독)을 포함하는 것이 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 B; A 또는 C; B 또는 C; A 및 B; A 및 C; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)를 포함하는 것이 의도된다.
단위, 접두사, 및 부호는 이의 국제단위계(Systeme International de Unites)(SI) 허용 형태로 기재된다. 본원에 제공되는 수적 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 수치와 관련하여 사용될 때 명시된 값의 + 또는 -20% 이내를 의미한다.
본원에서 사용된 약어 "APC"는 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell)를 말한다.
본원에 사용된 약어 "IL-2"또는 "IL2"는 인터루킨 2(interleukin 2)를 말한다.
본원에 사용된 약어 "IFNγ"는 인터페론 감마(interferon gamma)를 말한다.
본원에 사용된 약어 "TNFα"는 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor alpha)를 말한다.
본원에 사용된 약어 "LAG3"은 림프구-활성화 유전자 3(lymphocyte-activation gene 3)을 말한다.
본원에서 사용된 약어 "PD-1"은 프로그램된 사멸 1(Programmed Death 1)을 말하며, 이는 프로그램된 사멸 단백질 1(Programmed Death Protein 1) 또는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(Programmed Cell Death Protein 1)로도 알려져있다.
본원에 사용된 약어 "PD-L1"은 PD-1에 대한 리간드를 말한다.
본원에 사용된 약어 "EOMES"는 전사인자 에오메소더민(eomesodermin) 을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "항원-특이적"은 T 세포와 관련하여 사용시, 주어진 관심 항원에 결합하는 T 세포를 말한다. 용어 "항원-특이적"은 다음을 포함한다: (a) 모두 정확히 동일한 T 세포 수용체 (TCR)를 갖는 T 세포 - 즉 "단클론성 항원-특이적 T 세포", (b) 상이한 TCR들을 갖지만 주어진 관심 항원의 동일한 에피토프/펩티드에 결합하는 T 세포, 및 (c) 상이한 TCR들을 갖고 주어진 관심 항원 내에서 상이한 에피토프/펩티드에 결합하는 T 세포.
본원에서 사용된 용어 "다클론성"은 T 세포와 관련하여 사용시, 상이한 항원 특이성을 갖는 TCR들을 갖는 T 세포 집단, 즉 임의의 특정 항원에 특이적이지 않은 T 세포 집단을 말한다. 따라서, 용어 "다클론성" 및 "비-항원 특이적"은 T 세포와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예는 항체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 온전한 다클론성 항체, 온전한 단클론성 항체, 단일-도메인 항체, 나노바디, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 돌연변이체, 다중 특이적 항체들(예를 들어, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 생성된 2중 특이적 항체), 키메라 항체들, 인간화 항체들, 인간 항체들, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 항체가 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 각각 지칭되는 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초하여, 5개의 임의의 주요 부류의 면역글로불린 (IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 또는 이의 하위부류(이소타입)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 의 면역글로불린 분자일 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린은 서로 상이하고 널리 공지된 서브유닛 구조 및 3차원 구성을 갖는다. 항체는 네이키드이거나, 다른 분자들, 예를 들어 독소, 방사성 동위원소 또는 본원에 언급된 임의의 다른 특정 분자에 접합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 본원에 구체적으로 기재된 것과 같은, 하나 이상의 바람직한 결과(예를 들어, T 세포 탈진의 역전)를 달성하거나 달성에 기여하기에 충분한, 본원에 기재된 바와 같은 활성 제제의 양을 말한다. 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효" 양은 용량 상승 연구와 같은 당업계에 알려진 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있고, 시험관 내 또는 생체 내 사용이 바람직한 지 여부, 원하는 투여 경로 (예를 들어, 전신적 vs. 종양내), 원하는 투여 빈도 등과 같은 요인들을 고려하여 결정될 수 있다. 또한, "유효량"은 사용될 임의의 공동-투여 방법의 맥락에서 결정될 수 있다. 당업자는 (단일 제제를 사용하든 제제의 조합을 사용하든 상관없이) 이러한 용량 연구를 쉽게 수행하여 사용할 적절한 용량을 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 (예를 들어, 쥐, 마우스 및 기니피그), 소, 돼지, 양, 염소, 말 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 포유류 종으로서, 축산업에 사용되는 모든 동물종은 물론, 애완동물 및 동물원 등에서 사육되는 동물을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용된 용어 "실질적으로 순수한(substantially pure)"은 75% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과의 순도를 말한다.
용어 "억제하다", "감소하다", "차단하다" 및 "저해하다" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 특정 파라미터에서 완전한 억제를 포함하여, 특정 파라미터(예를 들어, 특정 생물학적 활성 또는 특정 마커의 발현)에서 검출가능하고 통계적으로 유의한 감소를 말한다. 예를 들어, 용어 "억제"(및 상호교환 가능한 용어들)는 특정 파라미터에서 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 의 감소를 의미할 수 있다. 예를 들어, 용어 "감소하다"가 T 세포 탈진의 마커 (예를 들어, PD-1 발현)에 대한 효과를 설명하는 데 사용되는 경우, 이 용어는 해당 마커를 통계적으로 유의하게 감소시키는 것을 나타낼 수 있다. 감소량은 적절한 대조군, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 대조군 또는 당업자에 의해 용이하게 선택된 대조군에 대해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 용어 "억제하다", "감소하다", "차단하다" 및 "저해하다" 는 결정된, 예를 들어 본원에 기술된 분석법 중 하나를 사용하여 결정된, 특정 파라미터에 있어서, 특정 파라미터의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 100%의 감소를 말한다.
용어 "자극", "증가하다", "향상하다", "유도하다" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 특정 파라미터의 전체 자극을 포함한, 특정 파라미터에서 검출가능하고 통계적으로 유의한 증가를 말한다 (예를 들어, 특정 생물학적 활성 또는 특정 마커의 발현). 예를 들어, 용어 "증가하다" (및 상호교환 가능한 용어들)는 특정 파라미터에서 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 증가, 또는 약 2배, 4배, 6배, 8배, 10배 또는 그 이상의 증가를 의미 할 수 있다 예를 들어, "증가하다"라는 용어가 T 세포 탈진의 마커 (예를 들어, 이펙터 사이토카인 생산)에 대한 효과를 설명하는데 사용되는 경우, 이 용어는 해당 마커를 통계적으로 유의하게 증가시키는 것을 나타낼 수 있다. 증가량은 적절한 대조군, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 대조군 또는 당업자에 의해 용이하게 선택된 대조군에 대해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 용어 "증가하다"(및 상호교환 가능한 용어들)는, 결정된, 예를 들어 본원에 기술된 분석법 중 하나를 사용하여 결정된, 특정 파라미터에 있어서, 특정 파라미터의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 또는 2배 이상, 4배 이상, 6배 이상, 8배 이상, 또는 10배 이상의 증가를 말한다.
다른 약어들 및 정의들은 본 명세서의 다른 곳에서 정의되거나, 당업계에서의 일반적인 의미에 따라 사용된다.
본원에 기재된 T 세포 탈진 방법을 유도하는 방법에 대한 시작점/투입으로 사용되는 T 세포는 임의의 적절한 T 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 항원-특이적이 아니다. 즉, 이들은 다클론성 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 항원-특이적 T 세포이다. 일부 구체예에서, 항원-특이적 T 세포는 주어진 관심 항원의 동일한 에피토프/펩티드에 결합한다. 일부 구체예에서, 항원-특이적 T 세포는 단클론성 항원-특이적 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 마우스 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD3+ T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 야생형 (유전적으로 조작되지 않은) T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 유전적으로 조작된 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 유전적으로 조작된 T 세포 수용체 (TCR)를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포는 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR T 세포)이다. 즉, 이들은 키메라 항원 수용체를 포함한다.
본원에 기재된 T 세포 탈진 방법을 유도하는 방법에 대한 시작점/투입으로 사용되는 T 세포는 임의의 적절한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, T 세포는 배양된 T 세포 (예를 들어, T 세포주) 일 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 동물로부터 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 마우스로부터 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 인간으로부터 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 혈액 샘플에서 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 공여자 혈액 샘플에서 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 말초혈액 단핵 세포의 샘플로부터 얻을 수 있다. 동물 (인간 포함)으로부터 T 세포를 얻는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 유사하게, 특정 특성들을 갖는 T 세포 (예를 들어, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포)를 얻는 방법도 당업계에 잘 알려져있다.
본원에 기재된 여러 방법은 "항원 제시 세포"(APC)를 포함한다. APC는 T 세포에 의해 인식되도록 그 표면의 MHC 분자에 항원 유래 펩티드를 제시할 수 있는 세포이다. 일부 구체예에서, 임의의 적합한 APC가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, APC는 이의 표면의 MHC II 분자 상에 펩티드를 제시할 수 있는 전문적 APC이다. 일부 구체예에서, 전문적 APC는 수지상 세포, 대식세포, 또는 B 세포이다. 일부 구체예에서, APC는 표면상의 MHC I 분자에 펩티드를 제시할 수있는 비-전문적 APC이다. 일부 구체예에서, 비-전문적 APC는 종양 세포 또는 바이러스-감염된 세포이다. 많은 구체예에서, 용어 APC는 전문 APC를 지칭하기 위해 사용되며, 용어가 사용되는 맥락에서 명확해질 것이다. 예를 들어, (a) APC 또는 (b) 종양 세포 또는 바이러스-감염된 세포를 사용하는 것을 언급하는 구체예에서, 언급된 APC는 전문 APC로서, 즉 비전문 APC 인 종양 세포 또는 바이러스-감염된 세포와는 구별된다.
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본 발명은하기 비-제한적인 "실시예"를 참조하여 추가로 설명되고 이해될 수 있다. 실시예에 제공된 특정 설명에 대한 수많은 변형이, 과도한 실험없이, 그리고 본 발명 및 본 개시의 범위를 벗어나지 않고 실행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백 할 것이다.
실시예
이 실시예들은 시험관 내 T 세포 탈진의 유도 및 모니터링을 위한 새로운 방법의 개발, 특성화 및 사용을 설명한다. 이러한 새로운 방법은 인간 및 비-인간 시스템 모두 (예를 들어, 인간 및 비-인간 (예를 들어, 마우스) T 세포 모두 사용) 및 항원-특이적 및 다클론성 자극 모두에서 효과적이다. 본원에 기술된 새로운 방법은, 생체 내에서 T 세포 탈진이 유도되어야 하는 이전 방법, 예를 들어, 만성 바이러스 감염에 의해 T 세포 탈진을 유도하거나 T 세포를 종양-보유 마우스로 입양전달하는 생체 내 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다. 또한, 본원에 기술된 방법은 T 세포가 약학적 제제에 의해 기능회복을 할 수 있는지(re-invigorated) 여부를 테스트하는 메커니즘을 제공한다.
실시예 1
T 세포 탈진의 시험관내 모델 개발 및 특성화.
본 실시예는 T 세포 탈진의 두 가지 시험관 내 모델 - 항원-특이적 T 세포 탈진 모델 및 다클론성 T 세포 탈진 모델의 개발 및 특성화를 설명한다.
항원-특이적 T 세포 탈진 모델
도 1A는 본 발명에 따른 항원-특이적 T 세포 탈진 모델의 개략도를 제공한다. 본 실시예에 설명된 모델 버전은 오브알부민 펩티드에 특이적인 CD8+ T 세포를 사용한다. 그러나, 이 모델은 항원 특이성이 다른 T 세포에도 사용할 수 있다. 본 실시예에서, 오브알부민 펩티드에 특이적인 CD8+ T 세포를 포함하는 비장 및 림프절은 OT-I TCR 형질 전환 마우스로부터 분리하였다 (https://www.jax.org/strain/003831). 단일 세포 현탁액을 생성하고, 적혈구를 용해시키고, 우태아혈청, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 2-머캅토에탄올 및 10 ng/mL 재조합 IL-2 을 함유하는 RPMI-1640 배지(이하, "T 세포 배지"라고 함)에서 항원제시세포로 비장 수지상 세포를 사용하여 2일 동안 세포를 1 마이크로몰 SIINFEKL (OT-I-특이적 오브알부민 펩티드)과 함께 시험관내에서 인큐베이션하였다. 자극 2일 후, 세포를 수확하고, 원심분리하고, 1 마이크로몰 SIINFEKL로 펄싱하거나 또는 펄싱하지 않은 상태로 두었던 B16-흑색종 세포를 함유하는 6-웰 플레이트 상에서 T-세포 배지에 재-플레이팅하였다. 이 과정을 총 8일 동안 2일마다 반복하였다 (2일, 4일 및 6일에 총 3회 계대); 그 결과, 세포는 48 시간마다 신선한 배지 내에 있었다. 본 분석에서 종양 세포는 만성 자극에 사용되어 T-세포가 항-종양 반응 동안 지속적인 항원과 접촉하는 설정을 보다 충실하게 모델링했다. B16 흑색종 세포는 OT-I T-세포 (C57/Bl6 마우스)와 백그라운드를 공유하는 마우스에서 유래되어 동종이계 반응(allogeneic response)을 피할 수 있기 때문에 사용하였지만, 동계(syngeneic) 종양, 예를 들어 MC38 (결장), EL4 (림프종) 세포주 및 기타 TCR 형질전환 T-세포, 예를 들어 흑색종-특이적 PMEL CD8+ TCR 형질전환 마우스 (https://www.jax.org/strain/005023)과 같은 다른 동계(syngeneic) 종양에서도 유사한 결과가 얻어졌다. TCR 형질전환 마우스는 동일한 방식으로 한 번에 수백만개의 T-세포를 자극할 수 있기 때문에 사용하였으며, 이는 본원에 설명된 많은 분석들(예를 들어, 대사 분석)에 유용하다. 그러나 1000 개의 항원-특이적 T 세포, 즉, 비-형질전환 마우스 및/또는 인간으로부터 쉽게 분리될 수 있는 다수의 T 세포에서 유사한 결과가 발견되었다. 본원에 설명된 종양 항원-특이적 모델은 CD8+ T 세포에 사용하였다. 그러나 MHC-II 발현 세포주를 사용하는 경우 CD4+ T 세포에 사용할 수 있다. 만성적인 항원 제시에 대해 D011.10 CD4 TCR 형질전환 마우스 및 RAW247 대식세포에서 유사한 결과를 관찰했다.
다클론성 T 세포 탈진 모델
도 3A 및도 3F는 일반화된 TCR 및 CD28 자극이 사용되는 다클론성 T 세포 탈진 모델의 개략도를 제공한다. 일반화된 TCR 및 CD28 자극을 사용하면 여러가지 이점이 있다. 항-종양 면역 반응의 경우와 같이, 항원-특이적 T 세포를 분리할 수 없거나, 특정 항원이 알려지지 않았거나, T 세포가 여러 항원에 반응하는 상황들에서, 본 분석을 적용할 수 있다. 또한 도 3, 6 및 7에 나타난 바와 같이, CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두와 마우스 및 인간 T 세포 모두에 쉽게 적용할 수 있다. 이 도면에서, C57/Bl6 마우스의 비장 유래 T 세포 (도 3A-E, 6 및 7) 또는 건강한 공여자 말초혈액 단핵 세포 (도 3F-G) 유래 T-세포를 Invitrogen의 Untouched T-cell Dynabeads 정제 키트를 사용한 음성 선택에 의해 분리하였다. 이들을 10ng/mL 에서 IL-2를 함유하는 T-세포 배지에서 2일 동안 3ug/mL의 플레이트-결합된 항-CD3 (2C11, EBioscience) 및 1ug/mL의 플레이트-결합된 항-CD28 (37.51, eBioscience)로 자극하였다. 2일의 자극 후, 세포를 IL-2 단독을 함유하는 T-세포 배지에서 인큐베이션하거나 항-CD3 (3ug/mL)으로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. 이 과정을 추가 6일 (총 8일) 동안 2일마다 신선한 배지로 반복하였다.
시험관내 T 세포 탈진 모델을 사용하여 생성된 T 세포의 특성분석
위에서 설명한 모델을 사용하여 생성된 T 세포의 표현형을, T 세포 탈진의 알려진 특징들을 확인하는 것으로 특성분석하였다. 예를 들어, 탈진된 T 세포는 여러가지 억제성 수용체 (예를 들어, PD-1, LAG-3 및 PD-L1)의 발현 증가, 이펙터 사이토카인 (예를 들어, IFNγ, TNFα 및 IL2)의 생산 감소, 증식률 감소, 및 표적 세포 사멸 활성 감소를 나타내는 것으로 알려져 있다(예를 들어, Wherry and Kurachi, 2015 참조). 또한, 에오메소더민(Eomesodermin, Eomes)의 높은 발현 및 T-bet의 낮은 발현을 포함한 특정 전사인자 프로파일을 가진 세포의 농축은, 말기 탈진(terminal exhaustion) 및 불량한 질병 제어와 관련이 있다 (Buggert et al., PLoS Pathogens, 17 Jul 2014, 10(7):e1004251, and Li et al., Front Immunol. 2018 Dec 18;9:2981).
T 세포 탈진과 관련된 인자들의 발현 프로파일
억제성 수용체 PD-1, LAG-3 및 PD-L1과 이펙터 사이토카인 IFNγ, TNFα 및 IL2의 발현을 유세포 분석으로 분석했다. 간략히 말하면, 본원에 기술된 바와 같이 8일 동안 급성 또는 만성적으로 자극된 세포를, 50ng/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) 및 500 ng/mL 이오노마이신을 사용하여 밤새 휴식 후 재-자극하였다. 90분 후, 브레펠딘 A(Brefeldin A)를 첨가하여 사이토카인 방출을 방지했다. 3시간 후 세포를 고정하고 세포 내 사이토카인 및 표면 마커에 대해 염색했다.
실험결과는, PD-1 (도 1B 참조), PD-L1 (도 1F 참조) 및 LAG-3 (도 1C 참조)의 상향 조절, 전사인자 EOMES의 유도 (도 1G & H 참조), 및 이펙터 사이토카인 생산의 억제에 의해 알 수 있는 것처럼, 만성적인 항원-특이적 자극이 T 세포 탈진을 유발했음을 나타낸다. 유사한 결과를 도 2에 나타내었는데, 이 도면에서 만성적인 항원-특이적 자극은 PD-1 발현의 상향 조절 및 TNF-α 생산의 억제에 의해 알 수 있는 바와 같이 T-세포 탈진을 유도하는 것으로 나타났다 (도 2B 참조).
실험결과는, PD-1 (도 3B 참조) 및 LAG-3 (도 3C 참조)의 발현 증가와 사이토카인 생산 억제 (도 3D & E 참조)에 의해 알 수 있는 바와 같이, 만성적인 다클론성 자극도 T-세포 탈진을 유도함을 보여주었다. 유사한 결과를 도 4에 나타내었는데, 이 도면에서 만성 다클론성 자극이 PD-1 발현의 상향 조절 및 TNF-α 생산의 억제에 의해 알 수 있는 바와 같이 T-세포 탈진을 유도하는 것으로 나타났다 (도 4B). 도 3에 나타난 결과는 마우스 T 세포의 다클론성 자극에 의해 생성되었지만, 건강한 공여자로부터 분리된 인간 CD3+ T 세포를 다클론성 자극 모델에 사용했을 때도 유사한 결과가 얻어졌다 (도 4).
세포 사멸 활성
궁극적으로, 만성 바이러스 감염과 암 모두의 맥락에서 T-세포 탈진의 주요 특징은, 표적세포 사멸의 부재로 정의되는, 이펙터 기능의 상실이다. 따라서 본원의 시험관내 시스템을 사용하여 생성된 탈진된 세포가 표적세포를 사멸시킬 수 없다는 것을 반드시 입증해야 했다. 이를 입증하기 위해, OT-I TCR 형질전환 T-세포를 본원에 기재된 바와 같이 자극하였다. 자극 8일 후, T-세포를, 증가하는 용량의 SIINFEKL 펩티드와 함께 펄스화된 루시퍼라제 리포터를 발현하는 B16-흑색종 세포와 공동 배양하였다. 24 시간 후 발광계를 사용하여 발광을 측정 하였다. 사멸 효능은 특정 펩티드가 없는 상태에서 T-세포와 함께 공동-배양된 B16 세포에 대한 발광으로 결정하였다. 도 5의 결과는이 시스템을 사용하여 생성된 시험관내 탈진된 T-세포가 실제로 이펙터 기능을 상실했음을 보여준다.
T 세포 증식
T-세포 탈진은 증식 능력의 상실과 밀접한 관련이 있으며 (Barber et al, Nature 2006) 탈진된 T-세포의 기능회복(re-invigoration)은 증식의 급속한 증가와 관련이 있다 (Huang et al, Nature 2017). 따라서 우리는 시험관내 탈진 모델이 T 세포 증식을 제한하는지 여부를 조사했다. 단리된 CD3+ T 세포를 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하였다. 2일 자극 후, 추가 6일 동안 세포를 IL-2 단독에서 인큐베이션하거나 2일마다 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 플레이트에 연속적으로 재-플레이팅하였다. Coulter 카운터를 사용하여 2일마다 세포를 계수했으며, 만성적 항원 자극이 T 세포 증식을 제한한다는 것을 명확하게 입증했다 (도 6B). 건강한 공여자로부터 분리된 인간 CD3+ T 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
실시예 2
대사 & 전사 특성분석
T 세포 탈진을 이해하기 위한 기존 생체 내(in vivo) 시스템의 가장 강력한 한계 중 하나는, 이 병리학의 발생과 관련된 세포 대사의 변화를 이해할 수 없다는 것이다. 이것은 여러가지 이유 때문이다; 이러한 시스템을 사용하여 분리할 수 있는 세포의 수는 질량분석법-기반 대사 분석에 제한되어 있고, 세포의 대사는 유세포분석-기반 분류 과정 동안 극적으로 변화한다. 도 8-11에서 입증한 바와 같이, 본원의 시험관내 시스템은 기존 시스템으로는 불가능했던 방식으로 T-세포 탈진의 발생 동안 T-세포의 대사 행동을 심층적으로 평가할 수 있다. 우리는 T-세포 탈진이 발생하는 동안 영양소 활용이 어떻게 급격히 변화하는지 이해할 수 있다. 이러한 연구는 T 세포 탈진의 대사 특징으로서 산화 스트레스를 확인하고 치료적 개입으로서 N-아세틸시스테인의 개발을 유도했다 (도 12-16). 따라서, 이 시스템은 기존 시스템으로는 확인할 수 없는, T-세포 탈진의 발달 과정 중 동안의 새로운 대사 변화를 발견할 수 있다.
우리는 또한 T-세포 탈진 과정을 정확하게 재현할 수 있도록, 본원의 시험관내 시스템에 대한 심층적인 전사체 프로파일링(transcriptome profiling) 을 수행하였다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 시험관내 탈진된 T-세포의 전사체 프로파일은, 탈진된 T-세포 생성에 대한 두 가지 최적-표준의 생체내 모델인, T 세포 탈진의 종양내 시그니처(intratumoral signature)와 만성 바이러스 감염의 T 세포 모두와 거의 중복된다. 또한, 체크포인트 억제제로 치료받은 환자로부터 분리된 T 세포의 단일-세포 전사체 데이터 분석은, 본원의 시험관내 시스템이 체크포인트 봉쇄에 반응하지 않은 환자의 T 세포의 전사체 프로파일과 강한 상관 관계가 있음을 보여준다. 이는 본원의 시험관내 시스템이 T-세포 탈진의 정확한 모델이며, 실제로 면역 요법에서 충족되지 않은 진정한 필요성을 나타내는, 체크포인트 억제제-불응성 T-세포 탈진에 대한 매우 정확한 모델임을 시사한다.
실시예 3
약학적 제제에 의한 탈진의 회복
본원에서 개발하고 설명한 시험관내 시스템은 T-세포 탈진의 특징으로서 산화 스트레스를 직접 확인하는 대사 평가를 허용했다. 따라서 우리는 만성적 자극 2-8일 동안 48시간마다 T-세포 배지에 N-아세틸시스테인 (10mM)을 첨가하는 것이 T-세포 성장 및 이펙터 기능에 대한 만성 자극의 효과를 역전시키기에 충분한지를 평가했다. 실제로, 우리는 N-아세틸시스테인이 T-세포 증식과 사이토카인 생산에 대한 만성 자극의 부정적인 영향을 완전히 역전시킬 수 있는 것과; 또한, 표적 세포 사멸 능력과 항-PD-1 반응성을 완전히 회복시키는 것을 발견했다. 도 12-16. 더욱이, 이 전략은 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포의 탈진을 역전시키는 데에도 효과적이었다. 이 분석을 위해, CD19를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 레트로바이러스로 감염된 T 세포를, 이전에 A20B-세포 림프종 세포를 받은 적이 있는 마우스로 입양전달하였다. 이 프로토콜은 CAR T-세포 전달 후 14일까지 "탈진된" CAR T 세포를 생성하는 것으로 알려져 있다. 우리는 이식 후 14일 후에 분리된 CAR-T 세포가, N-아세틸시스테인 (10mM)을 배양 배지에 첨가함으로써 역전시킬 수 있는 항-CD3 및 항-CD28로 재-재극한 후의 높은 수준의 산화 스트레스를 실제로 가짐을 발견했다; 이는 CAR T-세포가 증식하고 사이토카인을 생산하도록 허용했다. 추가적으로, N-아세틸시스테인 투여는 메모리 마커 Tcf7의 유도를 회복시켰는데, 그의 유도는 체크포인트 봉쇄(checkpoint blockade) 효능에 중요한 것으로 나타난 바 있다. 도 16. 이를 결정하기 위해 10mM N-아세틸시스테인의 존재 또는 부재하에 급성 또는 만성적으로 자극된 T-세포를 실시간 정량적 PCR을 통해 Tcf7 발현에 대해 평가했다. 실험결과는 Tcf7 발현이 만성적 자극에 의해 억제되고 N-아세틸시스테인의 첨가에 의해 크게 회복된다는 것을 분명히 보여준다. 이러한 관련성은, 산화 스트레스 유도와 관련된 유전자가 Tcf7의 발현과 음성적 상관관계가 있는, 체크포인트 억제제로 치료한 흑색종 환자의 단일-세포 RNA-seq 데이터 분석에 의해 확인된다(Sade-Feldman Cell 2018). 마지막으로, N-아세틸시스테인의 효과는 xCT 수송체의 레트로바이러스 과발현을 통해 시스테인 흡수를 가능하게 함으로써 크게 재현될 수 있다. 도 17. 따라서, 산화 스트레스를 역전시키기 위한 약리학적 및 유전적 접근법 모두 T 세포 탈진을 크게 역전시킬 수 있다.
Claims (59)
- 시험관 내(in vitro)에서 T 세포 탈진(T cell exhaustion)을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) T-세포 수용체 신호전달을 급성적으로 자극하는 조건 하에서 제1 시간 구간(time-period)동안 시험관 내에서 T 세포를 배양하는 단계, 및
(b) 그후 T-세포 수용체 신호전달을 만성적으로 자극하는 조건 하에서 제2 시간 구간 동안 시험관 내에서 T 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
이에 의해 탈진된 T 세포가 생성되는, 방법. - 시험관 내(in vitro)에서 항원-특이적인 T 세포 탈진(T cell exhaustion)을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 주어진 항원에 특이적인 T 세포를, (i) 항원 및 항원-제시 세포, 및 선택적으로 IL-2와 함께, 또는 (ii) 항원을 제시하는 항원-제시 세포, 및 선택적으로 IL-2와 함께 배양하는 단계로서, 상기 배양은 제1 시간 구간(time-period)동안 시험관 내에서 수행되는, 단계, 및
(b) 그후 T 세포를, (i) 항원 및 항원-제시 세포, 종양 세포, 또는 바이러스-감염된 세포, 및 선택적으로 IL-2와 함께, 또는 (ii) MHC 분자 상에 항원을 제시하는, 항원-제시 세포, 종양 세포, 또는 바이러스-감염된 세포, 및 선택적으로 IL-2와 함께 배양하는 단계로서, 상기 배양은 제2 시간 구간 동안 시험관 내에서 수행되는, 단계를 포함하고,
이에 의해 항원-특이적인 탈진된 T 세포가 생성되는, 방법. - 시험관 내(in vitro)에서 다클론성(polyclonal) T 세포 탈진(T cell exhaustion)을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) T 세포를, (i) 항-CD3 항체 및 (ii) 선택적으로 항-CD28 항체, 및 (iii) 선택적으로 IL-2 와 함께 배양하는 단계로서, 상기 배양은 제1 시간 구간(time-period)동안 시험관 내에서 수행되는, 단계, 및
(b) 그후 T 세포를, (i) 항-CD3 항체, (ii) 선택적으로 항-CD28 항체, 및 (iii) 선택적으로 IL-2과 함께 배양하는 단계로서, 상기 배양은 제2 시간 구간 동안 시험관 내에서 수행되는, 단계를 포함하고,
이에 의해 다클론성인 탈진된 T 세포가 생성되는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 탈진된 T 세포가 다음 특징들 중 하나 이상을 나타내는 방법:
(a) 시작 T 세포(starting T cell) 및/또는 비-탈진된 T 세포와 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1 중 하나 이상의 발현 증가,
(b) 시작 T 세포 및/또는 비-탈진된 T 세포와 비교하여, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산 감소,
(c) 시작 T 세포 및/또는 비-탈진된 T 세포와 비교하여, 증식 감소, 및
(d) 시작 T 세포 및/또는 비-탈진된 T 세포와 비교하여, 표적세포 사멸 활성의 감소. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시작 T 세포 및/또는 탈진된 T 세포에서 다음 특징 중 하나 이상을 측정하기 위해 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
(a) PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현,
(b) 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산,
(c) 증식률, 및
(d) 표적세포 사멸 활성. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 시간 구간이 약 1-3일 (24-72 시간) 인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 시간 구간이 약 1-2일 (24-48 시간) 인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 시간 구간이 약 11/2-2일 (36-48 시간) 인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 시간 구간이 약 2일 (48 시간) 인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간이 약 4-8일 (96-192 시간) 인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간이 약 6일 (144 시간) 인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간이 약 4일 (96 시간) 이상인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간이 약 6일 (144 시간) 이상인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간 동안, T 세포가 T-세포 수용체 신호전달이 만성적으로 자극되는 조건 하에서 배양되는 것인 방법.
- 제14 지속적인 자극인, 방법.
- 제14항에 있어서, 만성적 자극이 반복적인 자극인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간 동안, T 세포가 약 1-2일마다 재-플레이팅되거나 분할되거나 계대되는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간 동안, T 세포가 ml 당 약 1 백만 세포의 밀도로 약 1-2일마다 재-플레이팅되는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간 동안, 신선한 항원 또는 신선한 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체가 약 1-2일마다 T-세포 배양물에 첨가되는 방법.
- 제1항에 있어서, T 세포가 다클론성 T 세포이고, T 세포를 항-CD3 항체와 접촉시킴으로써 T-세포 수용체 신호전달이 자극되는 방법.
- 제1항에 있어서, T 세포가 다클론성 T 세포이고, T 세포를 (a) 항-CD3 항체 및 (b) 항-CD28 항체와 접촉시킴으로써 T 세포 수용체 신호전달이 자극되는 방법.
- 제1항에 있어서, T 세포가 항원-특이적 T 세포이고, T 세포가 이에 특이적인 항원과 접촉함으로써 T-세포 수용체 신호전달이 자극되는 방법.
- 제22항에 있어서, 항원이 항원-제시 세포, 종양 세포, 또는 바이러스-감염된 세포의 표면에 제시되는 방법.
- 제2항 또는 제23항에 있어서, 항원-제시 세포가 전문 항원-제시 세포인 방법.
- 제2항 또는 제23항에 있어서, 항원-제시 세포가 수지상 세포인 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간 동안, T 세포가 종양 세포와 함께 배양되는 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 종양 항원이고, 제2 시간 구간 동안, T 세포가 종양 항원을 발현하는 종양 세포와 함께 배양되는 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 시간 구간 동안, T 세포가 바이러스-감염된 세포와 함께 배양되는 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 바이러스 항원이고, 제2 시간 구간 동안, T 세포가 바이러스 항원을 포함하는 바이러스-감염된 세포와 함께 배양되는 방법.
- 제3항, 제19항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체가 고체 지지체에 결합되는 방법.
- 제30항에 있어서, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체가 조직 배양 플레이트 또는 다른 조직 배양 용기에 결합되는 방법.
- 제30항에 있어서, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체가 비드의 표면에 결합되는 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 CD4+ T 세포인 방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포인 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 포유류 T 세포인 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 설치류 T 세포인 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 마우스 T 세포인 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 영장류 T 세포인 방법.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 인간 T 세포인 방법.
- 제2항, 또는 제2항의 전술한 종속항들 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 TCR 형질전환 마우스로부터 수득되는 방법.
- 제1항, 제3항, 또는 제1항 또는 제3항의 전술한 종속항들 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 포유동물 혈액으로부터 수득되는 방법.
- 제1항, 제3항, 또는 제1항 또는 제3항의 전술한 종속항들 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 인간 혈액으로부터 수득되는 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 수득된 탈진된 T 세포의 집단.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 수득된 탈진된 T 세포의 실질적으로 정제된 집단.
- T 세포 탈진(T cell exhaustion)에 대한 하나 이상의 시험 제제의 효과를 평가하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 시험 제제(들)의 존재 하에서 및 시험 제제(들)의 부재 하에서 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계, 및
(b) 단계 (a)에서 생산된 T 세포에서 다음 특징들 중 하나 이상을 측정하기 위한 분석을 수행하는 단계:
i. PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현,
ii. 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산,
iii. 증식률,
iv. 표적세포 사멸 활성,
를 포함하고,
(i) 시험 제제의 존재 하에서 생산된 T 세포가, 시험 제제의 부재 하에서 생산된 T 세포와 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현 증가, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산 감소, 증식률 감소, 또는 표적세포 사멸 활성의 감소를 나타내면, 시험 제제가 T 세포 탈진을 증가시키고, (ii) 시험 제제의 존재 하에서 생산된 T 세포가, 시험 제제의 부재 하에서 생산된 T 세포와 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현 감소, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산 증가, 증식률 증가, 또는 표적세포 사멸 활성의 증가를 나타내면, 시험 제제가 T 세포 탈진을 감소시키는 것인, 방법. - 탈진된 T 세포의 기능회복(reinvigoration)에 대한 하나 이상의 시험 제제의 효과를 평가하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생산된 탈진된 T 세포의 제1 집단을, 하나 이상의 시험 제제와 접촉시켜, T 세포의 시험 집단을 생산하는 단계, 및
(b) 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생산된 탈진된 T 세포의 제2 집단을, 시험 제제와 접촉시키지 않거나 하나 이상의 대조군 제제와 접촉시켜, T 세포의 대조군 집단을 생산하는 단계,
(c) T 세포의 시험 집단 및 T 세포의 대조군 집단에서 다음 특징들 중 하나 이상을 측정하기 위한 분석을 수행하는 단계:
i. PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현,
ii. 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산,
iii. 증식률,
iv. 표적세포 사멸 활성,
를 포함하고,
(i) T 세포의 시험 집단이, T 세포의 대조군 집단과 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현 증가, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산 감소, 증식률 감소, 또는 표적세포 사멸 활성의 감소를 나타내면, 시험 제제가 T 세포 기능회복을 감소시키고, (ii) T 세포의 시험 집단이, T 세포의 대조군 집단과 비교하여, PD-1, LAG-3 및/또는 PD-L1의 발현 감소, 하나 이상의 이펙터 사이토카인의 생산 증가, 증식률 증가, 또는 표적세포 사멸 활성의 증가를 나타내면, 시험 제제가 T 세포 기능회복을 증가시키는 것인, 방법. - 환자-유래 T 세포의 T 세포 탈진 상태를 평가하는 방법으로서, 제5항의 방법 또는 제5항의 종속항들 중 어느 한 항을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
- 탈진된 T 세포를 기능회복시키는(re-invigorating) 방법으로서, 탈진된 T 세포를 유효량의 N-아세틸시스테인과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- T 세포 탈진을 감소 또는 역전시키는 방법으로서, 탈진된 T 세포를 유효량의 N-아세틸시스테인과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- T 세포-매개성 면역 반응을 자극하거나 증가시키는 방법으로서, T 세포를 유효량의 N-아세틸시스테인과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- 종양 세포에 대한 T 세포-매개성 면역 반응을 자극하거나 증가시키는 방법으로서, T 세포를 유효량의 N-아세틸시스테인과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- 만성 감염에 대한 T 세포-매개성 면역 반응을 자극하거나 증가시키는 방법으로서, T 세포를 유효량의 N-아세틸시스테인과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 살아있는 대상체에 생체 내(in vivo) 존재하고, 상기 방법이 유효량의 N-아세틸시스테인을 살아있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 인간 대상체에 존재하고, 유효량의 N-아세틸시스테인을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 면역 체크포인트 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 PD1 억제제, PDL1 억제제 또는 CTLA4 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제53항에 있어서, 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제54항에 있어서, 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제48항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 N-아세틸시스테인을 포함하는 조성물.
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