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KR20200115522A - IgE 매개된 알레르기성 질환의 치료를 위해 막-결합된 IgE를 표적화하는 펩타이드 면역원 및 이의 제형물 - Google Patents

IgE 매개된 알레르기성 질환의 치료를 위해 막-결합된 IgE를 표적화하는 펩타이드 면역원 및 이의 제형물 Download PDF

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KR20200115522A
KR20200115522A KR1020207022271A KR20207022271A KR20200115522A KR 20200115522 A KR20200115522 A KR 20200115522A KR 1020207022271 A KR1020207022271 A KR 1020207022271A KR 20207022271 A KR20207022271 A KR 20207022271A KR 20200115522 A KR20200115522 A KR 20200115522A
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ige
peptide
empd
seq
ige empd
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KR1020207022271A
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창 이 왕
펑 린
준 보 천
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유나이티드 바이오메디칼 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 IgE-매개 알레르기 질환 치료를 위한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들 및 이의 제제들에 관한 것이다. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들은 병원체 단백질들로부터 유래한 이종 보조 T 세포 (Th) 에피토프들에 선택적 스페이서를 통해 연결된, 바람직하게는 고리형인, 20개 아미노산 초과의 B 세포 에피토프 펩티드를 가진다. 이들 펩티드 면역원 구조체들 및 이의 제제들은 백신접종된 숙주들에서 IgE EMPD 펩티드에 대하여 지시되는 매우 특이적인 항체들의 생성을 자극할 수 있으며 IgE 분비가 결정된 B 림프구 상의 막-결합 IgE와 교차반응성이다. 백신접종된 숙주들에서 이러한 펩티드 면역원 구조체들 및 이의 제제들에 의해 유도된 항체들은 IgE-발현 B 세포들의 세포자멸을 유도하고 항체 의존적 세포독성 (ADCC)을 매개하여, 백신접종된 숙주에서 항원-특이적 IgE 및 총 IgE 수준을 감소시켜, IgE-매개 알레르기 병리를 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

IgE 매개된 알레르기성 질환의 치료를 위해 막-결합된 IgE를 표적화하는 펩타이드 면역원 및 이의 제형물
발명의 분야
본 발명은 IgE-매개 알레르기 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 범용 백신으로서 막-결합 IgE의 세포외 막-근위 도메인 (또는 IgE EMPD)을 표적하는 펩티드 면역원 구조체 및 이의 제제에 관한 것이다.
발명의 배경
면역글로불린 E (IgE) 매개 알레르기 질환으로도 알려진 알레르기는 통상적으로 대부분의 사람들에게 거의 또는 전혀 문제를 일으키지 않는 환경에서 무언가에 대한 면역계의 과민증에 의해 유발되는 여러 가지 상태이다. 이러한 질환에는 약물, 음식 및 곤충 알레르기, 알레르기 비염 (건초열), 아토피성 피부염, 알레르기 천식, 결막염, 습진, 두드러기 (urticaria), 두드러기 (hive) 및 아나필락시스 (웹사이트: en.wikipedia.org/wiki/Allergy)가 포함된다. 다양한 증상들은 종종 알레르기로 인한 것으로 충혈 눈, 가려운 발진, 재채기, 콧물, 호흡 곤란, 또는 붓기를 포함할 수 있다.
알레르기 질환의 유병률이 증가하고 있다. 20 세기 초, 알레르기는 드문 질환으로 여겨졌다. 그러나 그 이후로 몇 가지 요인이 알레르기 질환의 유병률을 급격히 증가시켰다. 호흡기 증상이 가장 널리 퍼져 있으며 일반 인구의 최대 30%에게 영향을 미친다. 세계 보건 기구 (WHO) 통계에 따르면 전 세계 수억 명의 사람들이 비염을 앓고 있으며 2억 3천 5백만명의 사람들이 천식을 앓고 있는 것으로 추정된다 (웹사이트: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs307/ en/index.html). 알레르기 질환의 사회적 비용은 상당하며, 이는 주로 알레르기성 코결막염의 높은 유병률 그리고 관련 생산성 손실로 인한 것이다. 스웨덴의 한 연구는 스웨덴에서만 연간 27억 유로의 비염으로 인한 생산성 손실 비용을 추정했으며, 미국의 한 연구는 비염을 미국 고용주에게 가장 비싼 질환으로 설정했다 (Larsen JN, 외, 2016).
알레르기 반응은 비정상적으로 활발한 면역 반응으로, 면역계는 신체에 무해한 항원 유형인 알레르겐으로 인해 인지된 위협과 싸운다 (웹사이트: en.wikipedia.org/wiki/Allergen). 구체적으로, 알레르겐은 IgE 반응을 통해 아토피 개체에서 제 I 형 과민 반응을 자극 할 수 있는 항원이다. 알레르겐은 먼지 진드기 배설, 꽃가루, 애완동물 비듬, 특정 음식 또는 화학적/물리적 자극제와 같은 다양한 출처에서 발견 될 수 있다. 음식 알레르기는 음식 민감성만큼 흔하지는 않지만 땅콩 (콩과 식물), 견과류, 해산물 및 조개류와 같은 일부 음식은 많은 사람들에게 심각한 알레르기의 원인이다.
알레르기는 일반적인 알레르겐에 대한 적응 면역 반응의 프라이밍에 의해 시작되는 전신 면역 질환이다. IgE는 IgE 매개 알레르기 질환의 원인이 되는 제 I 형 과민 반응을 매개하는데 중심적인 역할을 한다. IgE 매개 알레르기 질환은 알레르겐 특이적 IgE 항체와 호산구 염증의 존재를 특징으로 한다. 알레르기 반응은 2상 반응으로, 알레르겐 노출 후 수 분 내에 즉각적인 반응이 일어나고 몇 시간 후에는 후기 반응이 발생한다. 즉각적인 반응은 세포 표면상의 고-친화도 수용체에 결합된 IgE의 가교시 호염기구 및 비만 세포로부터 미리형성된 매개체 (예를 들어, 히스타민, 프로테아제, 케모카인, 헤파린)의 방출에 의해 야기된다. 후기 알레르기 반응은 호산구, 호염기구, 호중구 및 단핵 세포와 같은 염증 세포의 동원 및 인력에 의해 발생한다.
알레르겐은 알레르기가 발생하기 쉬운 개체에서 혈청 총 유리 면역글로불린 E (IgE) 및 알레르겐 특이적 IgE 수준을 상승시킨다. 알레르겐-특이적 IgE-매개 제 1 형 과민증은 IgE-매개 알레르기 질환의 발병에 핵심적이다 (도 1). IgE는 이들 효과기 세포의 표면에서 고-친화도 수용체 IgE 수용체, Fcε에 결합함으로써 비만 세포 및 호염기구에 감작한다. 비만 세포에서 Fcε에 이미 결합된 IgE에 대한 항원의 결합은 결합된 IgE의 가교 및 기저 FcεRI의 응집을 야기한다. 가교결합된 수용체는 신호 전달 캐스케이드 및 신속한 탈과립화를 개시한다. 비만 세포 및 호염기구는 저장된 히스타민을 방출하고, 이어서 브라디키닌, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 사이토카인 및 다른 염증 매개체를 합성 및 방출한다. 이들은 또한 알레르기 증상을 일으키는 염증 세포를 유인하고 활성화시켜 B 세포에 의한 IgE의 생합성을 상향 조절하여 감도 상승을 촉진시킨다. IgE-Fcε상호작용 및 탈과립화 발생은 제 1 형 알레르기 반응 및 아토피 천식의 발병에 중요하다.
다른 면역글로불린 아이소형과 마찬가지로, IgE는 분비된 혈청 면역글로불린 형태 및 막-결합 형태 (mIgE)의 2가지 형태로 발견된다. 마우스 및 인간 mIgE의 막-고정 펩티드를 인코드하는 유전자 분절에 대한 연구는 mIgE가 다음과 같은 3개의 추가 영역을 포함하는 것이 mIgE와 분비된 IgE의 차이임을 보여준다: (1) 원형질 막에 걸쳐있는 25개의 소수성, 하전되지 않은 아미노산 잔기의 중앙 보존 스트레치; (2) C-말단 세포질 꼬리; 및 (3) mIgE의 막-고정 분절의 N-말단 세포외 부분. 인간에서, B 림프구 표면상의 mIgE의 엡실론 사슬은 짧은 및 긴 아이소형 모두로서 존재한다. 짧은 아이소형은 IgE EMPD로 지칭되는 mIgE의 세포외 막 근위 도메인에 15개의 아미노산을 함유하는 반면, 긴 아이소형은 EMPD에서 총 67개의 아미노산에 대해 52개의 아미노산 잔기의 추가 분절을 함유한다. 이들 2가지 아이소형은, 156 bp만큼 분리되고 CH4 엑손의 하류에서 2천개의 뉴클레오티드 주위에 위치한 2개의 수용체 부위들과 CH4 엑손의 3' 말단에 있는 공여체 부위 사이의 대안적인 스플라이싱의 결과로서 생성된다. 긴 형태의 전사체는 IL-4 플러스 CD40으로 처리된 IgE-생성 골수종 세포 및 편도선 B 세포에서 짧은 형태보다 100배 높은 수준으로 탐지되었으며 (Peng 외 1992 및 Zhang 외 1992); 반면, 짧은 형태는 단백질 수준에서 탐지 할 수 없었다 (Peng 외, 1992). IgE EMPD는 mIgE 형태에 특이적이며 분비된 혈청 IgE에서는 발견되지 않는다 (도 2).
IgE 매개 알레르기 질환의 치료에 대한 현재 임상 지침은 환자 교육, 알레르겐 회피, 약물요법, 알레르겐 기반 면역요법 및 IgE의 치료적 표적화의 조합을 포함하지만, 이러한 치료 옵션에는 한계가 있다. 예를 들어, 알레르겐 회피는 가능할 때마다 지시되지만, 실제로 알레르겐 회피만으로는 적절한 증상 조절을 달성하기가 어렵다. 또한 알레르기 증상의 치료를 위해 안전하고 저렴한 약물을 사용할 수 있지만 많은 환자들이 이러한 약물로 증상 조절이 불충분함을 보고한다. 중요한 것은, 약물요법은 질환의 진행에 영향을 미치지 않으며 증상이 우세한 한 치료는 반복적으로 시행되어야 한다는 것이며, 이는 종종 평생을 의미한다. 고전적인 알레르겐 기반 면역요법만이 질환을 변화시킬 가능성을 가지며 최적의 치료 전략으로 간주된다.
알레르겐 기반 면역요법 (AIT)은 해당 알레르겐에 대한 후속 재노출시 증상을 억제하기 위해 점증적 증가량의 알레르겐 피하 주사를 수반한다. 자연 노출 조건하에서 점막의 면역계에 제시되는 알레르겐의 양은 비교적 적지만, 이 양은 알레르기 반응을 효율적으로 자극하고 알레르기 증상이 수분 내에 나타나게 한다. 대조적으로, 알레르겐이 면역요법으로 투여 될 때, 알레르겐의 양은 비교적 높으며, 여기서 면역요법에서 투여되는 1회 용량은 자연 노출을 통한 최대 연간 추정 섭취량의 대략 100배에 해당한다. 체내로의 상이한 진입 경로와 함께 정량적 차이는 면역계에 중대한 영향을 미치며, 이는 알레르겐에 대한 면역학적 내성을 유도함으로써 반응한다.
AIT의 원래 투여 형태는 피하 주사에 의한 것이고, 이러한 치료 요법은 전통적으로 다음 2기로 수행된다: (1) 초기 투여량 증가기 및 (2) 후속 유지기. 투여량 증가기는 개별 적정에 따르며, 이 때 증가 용량은 내약성을 천천히 구축하고 환자의 민감도를 신중하게 평가하기 위해 투여된다. 그 다음 유지기 전반에 걸쳐 최대-허용 용량, 또는 권장 최대 용량 중 먼저 도달되는 것이 제공된다.
AIT에서 다음 두 가지 메커니즘이 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다: (1) 면역 편차 및 (2) 조절 T 세포의 유도. 면역 편차 및 조절 T 세포로부터의 상대적 기여도는 밝혀지지 않았지만, 최종 결과는, 알레르겐 노출에 반응하여 알레르기 반응을 일으키는 능력의 감소, 그리고 경우에 따라서는 제거이다.
면역 편차는 알레르겐 노출에 대한 변형된 면역학적 반응을 나타내는 용어이며, 여기서 알레르겐 특이적 T 보조 1형 (Th1) 세포는 Th2 세포를 소모하여 동원되고 자극된다. Th1 세포는 인터페론 감마 (IFN-γ)를 생성하며, 이는 B 세포를 자극하여 IgE 대신 IgG를 생성하는데, IgG는 알레르기 반응을 유발할 수 없다.
조절 T 세포는 면역 반응의 조절에 활성인 다양한 T 세포 그룹이다. 말초 혈액에서 AIT 후에 알레르겐-특이적 CD4+CD25+ 조절 T 세포의 증가가 입증되었다. 이들 세포들은 인터루킨 (IL)-10 및 형질전환 성장 인자 (TGF)-β를 생성하며, 국소 Th2 세포 반응을 억제하여 IgG4 (IL10 아이소형 전환 인자) 및 IgA (TGF-β아이소형 전환 인자)를 위한 항체 클래스 전환을 재지시할 가능성을 가진다. 알레르겐-특이적 IgG4 항체는 Th2 세포에 대한 알레르겐 제시를 방해하고, 또한 비만 세포 및 호염기구의 알레르겐-유도 활성화를 차단하여 알레르기 반응을 현저하게 약화시킨다.
항원 기반 면역요법이 효과적 일 수 있지만, IgE 매개 알레르기 질환의 AIT와 관련하여 심각한 문제 및 충족되지 않은 요구가 여전히 존재한다. 첫째, AIT에 관한 모든 주사는, 즉각적이고 적절하게 치료하지 않으면 심각하거나 심지어 생명을 위협 할 수 있는 알레르기 반응을 유발할 위험이 적기 때문에 의사의 진료실에서 이루어진다. 둘째, AIT를 통한 질환 변화 양상들은 몇 가지 알레르겐 제품에 대해서만 임상적으로 입증되었다. 셋째, 특정 알레르겐의 몇 가지 구조만 설명된 바 있으며 알레르겐의 정의는 대부분 감수성이 있는 개체에서 IgE 반응을 이끌어 낼 수 있는 기능적 기준에 기초한다. 따라서, 알레르겐은 일반적으로 개별적인 환자의 면역계에 의해 정의되며, 그리하여 알레르기가 있는 대부분의 환자가 비교적 제한된 수의 주요 알레르겐에 대해 특이적인 IgE 항체를 갖더라도, 임의의 면역원성 단백질 (항원)은 알레르기 가능성을 가진다. 넷째, 모든 환자는 알레르겐 분자 및 에피토프와 관련하여 독특한 감작 패턴을 가진다. 다섯째, 모든 시판되는 알레르겐 제품은 꽃가루, 집먼지 진드기 배양물, 동물 털 및/또는 비듬 또는 곤충 독과 같은 천연 원료에서 유래된 알레르겐 원료의 수성 추출에 의해 제조되며, 이러한 천연 원료는 본질적으로 조성이 가변적이다. 따라서 AIT에 사용되는 알레르겐 제품은 일반적이지 않으며, 그 조성, IgE 결합능 및 제조업체 간의 품질 관리 정도가 다르다. 국제 표준이 적용되지 않는다. 이는 다른 제조업체의 제품이 환자들에서 다르게 작용할 수 있으며, 결과적으로 임상 결과가 알레르겐 제품 별로 직접 추정될 수 없음을 의미한다.
알레르겐 기반 면역요법: 알레르기 치료의 미래에 관한 최근의 검토내용이 본원에 참고문헌으로 포함되며 (Drug Discovery Today Volume 21, Issue 1, 2016년 1월, 26-37 페이지), 이 문헌에서 본 배경기술 부분에 기재된 내용들을 뒷받침하는 모든 문헌들을 찾을 수 있다.
AIT 이외에도, IgE 분자의 치료적 표적화가 IgE 매개 알레르기 질환의 치료에서 연구되어 왔다.
항-IgE 모노클로날 항체에 의한 혈청 가용성 IgE의 치료적 표적화는 IgE 매개 알레르기 질환의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 현재 재조합 인간화 모노클로날 항체인 오말리주맙 (XOLAIR®는 성인과 청소년의 중등도 내지 중증 지속성 알레르기성 천식 치료제로 승인되어 있다. 오말리주맙은 순환하는 결합되지 않은 유리 IgE에 결합하여 알레르기 캐스케이드를 중단시키고 이것이 면역 이펙터 세포 표면의 IgE Fcε에 결합하는 것을 방지한다. 오말리주맙을 사용한 치료는 유리 IgE 수준의 현저한 감소 및 세포성 IgE 수용체의 하향조절을 초래한다 (Chang 외, 2007). 오말리주맙을 이용한 치료는 효과적인 것으로 나타났지만, 그 한계가 존재한다. 특히, 오말리주맙은 혈청에서 유리 IgE를 중화시킬 수 있지만 IgE 생산에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 혈청 IgE의 충분한 억제를 유지하기 위해 오말리주맙을 빈번하고 만성적으로 투여해야 한다.
막 결합 IgE의 세포외 막 근위 도메인 (IgE EMPD)의 치료적 표적화 또한 IgE 매개 알레르기 질환의 치료를 위해 연구되어 왔다. 추가적인 보조자극 신호가 없는 상태에서 B 세포 수용체 (BCR)의 가교는 B 세포 사멸을 초래할 수 있다. BCR 가교를 통한 B 세포의 사멸성 고갈은 미성숙 B 세포에 관하여 자가반응성 B 세포가 B 세포 레퍼토리로부터 제거되는 메커니즘으로서 광범위하게 기술되어 왔다. 47H4 (Brightbill 외 2010), 4B12 및 26H2 (Chen 외 2010)와 같은 항-IgE EMPD 모노클로날 항체는 IgE BCR을 가교시키고 mIgE-발현 B 세포의 세포자멸사를 유발하는 것으로 나타났다 (도 2). Brightbill 등은 또한 생체내 47H4의 치료적 전달이 N. 브라질리엔시스 (brasiliensis) 감염 및 알레르기 천식 모델에서 관찰된 바와 같이 확립된 IgE 반응을 감소시킬 수 있음을 발견했다 (Chen 외 2010). IgE 계통 B 세포를 고갈시켜 혈청 IgE를 감소시키기 위해, 특히 여분의 52-아미노산-긴 형태 영역내에서 IgE-EMPD를 표적하기 위한 일부 항체 및 에피토프가 연구되고 확인되었다 (Chen 외 2010, Chang 등 2015, Chen 등 2002). 한 그룹은 BALB/c 마우스에서 특이적 IgE EMPD 항체 반응을 유도하기 위한 삽입물로서 IgE EMPD 단편을 보유하는 담체로서 B형 간염 바이러스 코어 항원 (HBcAg)의 사용을 보고한 바 있다. 클로닝된 구조체들은 면역원성을 얻기 위해 VLP의 “스파이크 (spike)”의 끝에 제시된 다양한 IgE EMPD 단편을 갖는 바이러스 유사 입자 (VPL)로 자발적으로 조립된다. 면역화된 마우스의 혈청으로부터 정제된 IgG 항체는 이펙터 세포로서 정제된 마우스 비장 NK 세포를 사용함으로써 mIgE.FcL-발현 A20 세포에서 BCR-의존성 카스파제 경로 및 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 통해 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포의 세포자멸을 유발할 수 있었다 (Lin, 외 2012). 상기 접근법은 알레르기 치료를 위한 백신 개발에 어느 정도 관심을 불러 일으켰다. 그러나, 항원 발현 시스템은 산업적 및 임상적 용도에 적용가능한 효과적인 백신 개발을 위해 최적이 아닌 항원 및 전달 시스템으로 담체 VLP를 표적하는 대부분의 항체들을 생성하는 번거로움이 있다.
상기의 관점에서, 알레르겐 독립적, IgE에 대해 매우 특이적인 면역 반응을 유발할 수 있고, 환자에게 쉽게 투여 될 수 있고, 엄격하고 우수한 제조 관행 (GMP)에 따라 제조되었으며, 100년된 AIT 관행을 대체하기 위해 전 세계적으로 적용하기에 비용 효율적인, IgE 매개 알레르기 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 면역치료적 접근법을 개발할 필요성이 충족되지 않은 채 존재한다.
참고문헌:
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발명의 요약
본 발명은 IgE 매개 알레르기 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 막-결합 IgE의 세포외 막 근위 도메인 (IgE EMPD)을 표적으로 하는 개별적인 펩티드 면역원 구조체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 펩티드 면역원 구조체, 펩티드 면역원 구조체를 제조 및 사용하는 방법, 및 펩티드 면역원 구조체에 의해 생성된 항체를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
개시된 펩티드 면역원 구조체는 약 20개 이상의 아미노산을 함유한다. 펩티드 면역원 구조체는 전장 IgE EMPD의 67개 아미노산 서열 (서열 번호: 1)로부터의 B 세포 에피토프를 함유한다. B 세포 에피토프는 임의의 이종 스페이서를 통해 병원체 단백질로부터 유래된 이종 보조 T 세포 (Th) 에피토프에 연결될 수 있다. 개시된 펩티드 면역원 구조체는 IgE EMPD에 대해 지시된 고도로 특이적인 항체의 생성을 자극하고 재조합 IgE EMPD-함유 단백질, mIgE 보유 B 세포상의 IgE EMPD 및/또는 인간 IgG1의 Fc 부분을 함유하는 재조합, 가용성 IgE EMPD 단백질 및 인간 막-결합 IgE의 IgE EMPD (“γ1-em67”로 지칭됨)에 결합할 수 있다. 개시된 펩티드 면역원 구조체는 IgE 매개 알레르기 질환을 앓고 있는 전세계 환자들을위한 알레르겐-독립적이고 비용-효과적인 범용 면역요법으로서 사용될 수 있다.
펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프 부분은 전장 IgE EMPD 서열 (서열 번호: 1)로부터의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, B 세포 에피토프는 전장 IgE EMPD 서열 (서열 번호: 1)의 넘버링에 따라 내인성 시스테인 (C18-C39)에 의해 형성된 내부적인 분자내 루프를 함유하는 서열을 가진다. 특정 구체예들에서, B 세포 에피토프는 IgE EMPD-1-39 (서열 번호: 5), IgE EMPD-7-40 (서열 번호: 6), IgE EMPD-19-38 (서열 번호: 8), 또는 IgE EMPD-1-40 (서열 번호: 9)의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 펩티드 면역원 구조체는 병원성 단백질로부터 유래된 이종 Th 에피토프 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호: 59 내지 87)을 함유 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 이종 Th 에피토프는 천연 병원체, 예컨대 디프테리아 독소 (서열 번호: 63), 플라스모듐 팔시파룸 (서열 번호: 64), 콜레라 독소 (서열 번호: 66)로부터 유래된다. 다른 구체예들에서, 이종 Th 에피토프는 단일 서열 또는 조합 서열 (서열 번호: 70, 69 및 71) 형태의, 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF 1 내지 5) 또는 B형 간염 표면 항원 (HBsAg 1 내지 3)으로부터 유래한 이상적인 인공 Th 에피토프이다.
일부 구체예들에서, 펩티드 면역원 구조체는 선택적인 이종 스페이서를 통해 이종 보조 T 세포 (Th) 에피토프에 연결된 IgE EMPD로부터의 B 세포 에피토프를 함유한다. 특정 구체예들에서, 펩티드 면역원 구조체는 선택적 이종 스페이서를 통해 병원성 단백질로부터 유래된 이종 Th 에피토프 (예를 들어, 서열 번호: 59 내지 87)에 연결된 IgE EMPD-1-40 (서열 번호 9)로부터의 약 20개 이상의 아미노산을 갖는 B 세포 항원 부위를 함유한다. 일부 구체예에서, 임의의 이종 스페이서는 2개의 아미노산 및/또는 펩티드를 함께 연결할 수 있는 분자 또는 화학 구조이다. 특정 구체예에서, 스페이서는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 또는 이들의 조합이다. 특정 구체예에서, 펩티드 면역원 구조체는 서열 번호: 88-95, 98-124 및 130의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 개시된 조성물은 둘 이상의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유한다. 특정 구체예에서, 조성물은 환자의 광범위한 유전적 배경을 커버하기 위해 IgE EMPD G1-C39 펩티드 면역원 구조체의 혼합물 (예를 들어, 서열 번호: 88-95, 98-124 및 130의 임의의 조합)을 함유한다. 펩티드 면역원 구조체의 혼합물을 함유하는 조성물은 단일 펩티드 면역원 구조체만을 함유하는 조성물과 비교하여, IgE 매개 알레르기 질환의 치료를 위해 백신접종하였을 때 보다 높은 백분율의 반응자 비율을 초래할 수 있다.
본 발명은 또한 IgE 매개 알레르기 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, 백신 제제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이러한 약학 조성물은 CpG 올리고머를 펩티드 면역원 복합체를 함유하는 조성물과 혼합함에 의한 정전기적 결합을 통해 형성된 안정화된 면역자극 복합체 형태로 본 발명의 펩티드 면역원 구조체를 함유한다. 이러한 안정화된 면역자극 복합체는 펩티드 면역원 구조체의 면역원성을 추가로 향상시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 백반 겔 (ALHYDROGEL), 알루미늄 포스페이트 (ADJUPHOS)를 포함하는 미네랄 염 또는 MONTANIDE ISA 51 또는 720을 포함하는 유중수 에멀젼과 같은 보조제를 함유한다.
본 발명은 또한 개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 대해 지시되는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 펩티드 면역원 구조체들은 대상체에 투여될 때 IgE EMPD-1-52 아미노산 서열 (서열 번호: 2), IgE EMPD 1-67 아미노산 서열 (서열 번호: 1), 및 이의 단편들 (예컨대, 서열 번호: 5 및 6)과 교차 반응성인 매우 특이적인 항체들의 생성을 자극할 수 있다. 펩티드 면역원 구조체에 의해 생성된 매우 특이적인 항체는 막-결합 IgE 함유 B 세포에서 재조합 IgE EMPD-함유 단백질, γ1-em67 및/또는 IgE EMPD와 교차 반응성이다. 개시된 항체는, 존재한다면, 면역원성 향상에 사용되는 이종 Th 에피토프에 대해 많이 지시되지 않고 IgE EMPD에 대해 높은 특이성으로 결합하는데, 이는 이러한 펩티드 항원성 향상에 사용되는 통상적인 단백질 또는 다른 생물학적 담체와는 뚜렷한 대조를 이룬다.
본 발명은 또한 개시된 펩티드 면역원 구조체 및/또는 펩티드 면역원 구조체에 대해 지시된 항체를 사용하여 IgE 매개 알레르기 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이러한 IgE 매개 알레르기 질환의 치료 및/또는 예방 방법은 개시된 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 조성물을 숙주에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법에 이용되는 조성물은 개시된 펩티드 면역원 구조체를 음으로 하전된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 CpG 올리고머와 정전기적 결합에 의한 안정한 면역자극 복합체 형태로 함유하며, 복합체는 선택적으로, IgE 매개 알레르기 질환 환자에게 투여하기위한 보조제로서 무기 염 또는 오일로 추가 보충된다. 개시된 방법은 또한 펩티드 면역원 구조체를 IgE 매개 알레르기 질환의 위험이 있거나 또는 이러한 질환을 가지는 숙주에 투여하기 위한 투여 요법, 투여 형태, 및 경로를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 IgE-매개 알레르기 질환 경로의 메커니즘을 도시한 예시이다. 나이브 성숙 B 세포는 막-결합 IgM (mIgE)을 발현함으로써 시작된다. 알레르겐을 만나면, 이들 세포는 필요한 보조자극 신호 및 사이토카인을 B 세포에 제공하는 동족 보조 T (TH) 세포의 보조를 받아 활성화된다. IL-4 및 IL-13과 같은 다수의 사이토카인에 의해 보조를 받은 활성화된 알레르겐-특이적 B 세포는 클래스 전환 재조합을 통해 mIgE를 발현하는 IgE-결정된 B 세포가 된다. 이들 IgE-결정된 B 세포는 최종적으로 IgE-분비 형질 세포로 분화된다. 대부분의 IgE-분비 형질 세포는 수명이 짧으며 염증 부위로 이동한 다음 죽는다; 그러나, 일부 수명이 긴 세포는 골수에서 해당 적소로 이동한다. 혈장 세포로부터 분비되는 알레르겐-특이적 IgE는 혈액 호염기구 및 조직 비만 세포의 표면에서 고-친화도 IgE.Fc 수용체, Fcε에 결합한다. Fcε에 결합된 IgE의 알레르겐-유도 응집은 호염기구 또는 비만 세포 탈과립화 그리고 매개체, 가령, 히스타민, 류코트리엔, PGD2, 트립타제 및 다양한 사이토카인의 방출을 자극하여 즉각적인 과민증을 유발하고 TH2 세포와 호산구와 같은 다양한 세포 유형의 동원을 촉진한다.
도 2A 및 2B는 분비된 IgE와 막 결합 IgE (mIgE) 사이의 구조적 차이점 그리고 IgE EMPD를 표적화함으로써 mIgE B 세포를 고갈시키는 이론적 근거를 보여주는 예시이다. 도 2A는 IgE가 분비 IgE 및 막-결합 IgE (mIgE)의 두 가지 형태로 발현됨을 보여준다. 분비 IgE는 Fcε를 통해 호염기구 및 비만 세포의 세포 표면에서 포획되는 반면, mIgE는 B 세포 수용체의 일부로서 IgE-결정된 B 세포에 배타적으로 존재한다. mIgE의 세포외 막 근위 도메인 (EMPD)은 CH4 도메인과 막경유 영역 사이의 67개 아미노산 펩티드 분절 (서열 번호 1)이며, mIgE B 세포에서만 발견된다. 밑줄 친 아미노산은 EMPD의 짧은 아이소형에서 발견되는 잔기를 나타낸다. IgE EMPD의 특유성은 mIgE 및 mIgE B 세포를 표적하기에 좋은 부위를 제공하였다. 도 2B는 IgE EMPD를 표적함으로써 mIgE B 세포를 고갈시키는 메커니즘을 도시하며, 이는 mIgE B 세포가 새로운 IgE-분비 형질 세포로 분화되기 전에 알레르겐-특이적 IgE 생성을 억제시킨다. 수명이 제한된 기존의 IgE 분비 혈장 세포는 결국 사멸하여 총 알레르겐-특이 적 IgE가 점차 감소한다.
도 3은 본원에 개시된 특정 구체예에 따른 백신 제제의 발견에서 상업화 (산업화)까지의 개발 과정을 보여주는 흐름도이다. 본 발명은 이 흐름도에 요약 된 바와 같이, 펩티드 면역원 설계, 펩티드 조성물 설계, 백신 제제 설계, 시험관내 기능성 항원성 연구 설계, 생체내 면역원성 및 효능 연구 설계, 및 임상 프로토콜 설계를 포함한다. 각각의 단계의 상세한 평가 및 분석은 일련의 실험으로 이어지며, 그 결과 안전하고 효과적인 백신 제제의 상업화를 가져온다.
도 4는 상이한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 88 내지 94, 96 및 97)로 면역화된 기니 피그에서 8주 기간에 걸친 항체 반응의 동역학을 나타내는 그래프이다. 10-배 연속 희석에 의해 혈청을 1:100에서 1:100000으로 희석하였다. ELISA 플레이트를 웰당 0.5 μg 펩티드의 IgE EMPD 1-39 펩티드 (서열 번호: 5)로 코팅하였다. Log10으로 표현되는 시험된 혈청의 역가는 A450의 선형 회귀 분석에 의해 계산되었으며, 컷오프 A450은 0.5로 설정되었다.
도 5는 상이한 IgE EMPD 면역원 구조체 (서열 번호: 88 내지 94, 96 및 97)에 의해 생성된, 정제된 다양한 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체의 적정 곡선을 나타내는 그래프이다. ELISA 플레이트를 재조합 IgE EMPD-(서열 번호: 1) 함유 단백질, γ1-em67 (서열 번호: 1)로 코팅하였다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 기니피그 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체를 4배 연속 희석에 의해 100 μg/mL에서 0.0238 ng/mL로 희석하였다. 각각의 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체의 EC50은 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 계산되었으며, 면역원 구조체 서열 번호: 89 및 93은 최상의 결합 효능을 보여주었다.
도 6A 내지 6C는 mIgE.FcL (왼쪽) 또는 mIgE.FcS (오른쪽)를 발현하는 Ramos 세포주 세포에 대한, IgE EMPD 면역원 구조체로 면역화된 동물로부터 풀링된 기니피그 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 항체의 결합을 나타내는 유세포 분석 히스토그램을 포함한다. 단백질 A 크로마토 그래피에 의해 기니피그 혈청으로부터 정제 된 폴리 클로 날 항 -IgE EMPD 항체들 10 μg/mL를, 20개 아미노산 잔기 보다 작은 IgE EMPD B 에피토프 펩티드 크기를 가지는 면역원 구조체 96 및 97과 비교할 때 mIgEL B 세포들에 대한 상당한 결합을 보여주는 서열 번호 88 내지 94를 가지는 면역원 구조체와 함께 사용하였다. 도 6A는 서열 번호: 88 내지 90의 IgE EMPD 면역원 구조체에 대한 폴리클로날 항체로부터의 히스토그램을 포함한다. 도 6B는 서열 번호: 91 내지 93의 IgE EMPD 면역원 구조체에 대한 폴리클로날 항체로부터의 히스토그램을 포함한다. 도 6C는 서열 번호: 94, 96 및 97의 IgE EMPD 면역원 구조체에 대한 폴리클로날 항체로부터의 히스토그램을 포함한다.
도 7은 IgE EMPD 면역원 구조체 (서열 번호: 88 내지 93)에 대해 지시되는 다양한 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체에 의해 유도된 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포의 세포자멸을 나타내는 그래프이다. 세포자멸 수준은 % 아넥신 (Annexin) V+/PI-로 표현된다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 기니피그 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체를 2배 연속 희석에 의해 1000 에서 62.5 ng/mL로 희석하였다. 인간화 항-IgE 모노클로날 항체인 XOLAIR®를 양성 대조군으로 사용하였다. 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체들의 각 세트의 EC50을 그래프로 나타내고 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 계산하였으며, 서열 번호: 88, 90 및 93을 갖는 면역원 구조체는 mIgEL B 세포의 세포자멸을 유도하는 가장 우수한 효능을 보였다.
도 8은 1/30의 이펙터/표적 비율에서 IgE EMPD 면역원 구조체들 (서열 번호: 88 내지 93)에 대해 지시되는 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체들에 의해 유도된 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들의 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 보여주는 막대 그래프이다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 기니피그 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체 10 μg/mL를 사용하였다. IL-2-자극된 마우스 비장 세포를 이펙터 세포로 사용하고, 마우스 항-IgE 모노클로날 항체인 5D5를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 9는 기니피그의 면역 혈청에 의한 IgE EMPD의 아미노산 9-50을 커버하는 중첩 10량체 펩티드를 사용하여 ELISA로 미세 특이성 분석하기 위한 에피토프 맵핑을 나타내는 개략도이다. 혈청 시료에서 항체에 의해 인식되는 우세한 에피토프는 IgE EMPD의 루프 구조를 나타내는 영역에 특이적이었다. 이 개략도는 천연 IgE EMPD에서 아미노산 C18과 C39 사이의 분자내 이황화 브릿지에 의해 형성된 내부 루프를 예시한다. 에피토프 맵핑을 위해 혈청을 1:1000으로 희석하였다. ELISA 플레이트를 10량체 펩티드 (웰당 0.5 μg 펩티드)로 코팅하였다. 서열 번호: 88, 89, 93, 96 및 97을 갖는 면역원 구조체로 사전 면역화된 기니피그로부터 수집된 면역 혈청 시료를 사용한 에피토프-맵핑 연구를 통해 반응성 부위를 확인하고 그에 따라 표시하였다.
도 10은 본 발명의 펩티드 면역원 구조체로 면역화후 파파인 유도된 일차 및 이차 면역 반응을 평가하기 위한 실험 설계를 예시하는 개략도이다. 인간 IGHE 녹인 하이브리드 마우스를 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체로 0, 3 및 5 주차에 3회 근육내 (im) 면역화시켰다. 1차 IgE 반응 모델에서, 마우스에 10주차에 파파인/TiterMax Gold를 피하 (sc) 공격접종하였고 12주차에 파파인-특이적 인간 IgE (hIgE)를 측정하였다 (도 13에 도시됨). 2차 IgE 반응 모델에서, 마우스에 16주차에 파파인/TiterMax Gold를 한번 더 피하 공격접종하였고 18주차에 파파인-특이적 인간 IgE (hIgE)를 측정하였다 (도 14에 도시됨). 면역화된 마우스의 혈청은 또한 항-IgE 항체 생산 (도 11) 및 혈청 IgE의 변화 (도 12)에 대한 연구 전반에 걸쳐 시험되었다.
도 11은 도 10에 기술된 실험 설계를 사용하여 20주 기간 동안 항-IgE 항체 생산의 동역학을 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 그래프는 지시된 용량 (면역화 당 100 μL)의 IgE EMPD 면역원 구조체 (서열 번호: 88 또는 93)로 0, 3 및 5주차에 3회 근육내 면역화되고 10및 16주차에 파파인/TiterMax로 피하 공격접종된 인간 IGHE 녹인 하이브리드 마우스 (hIGHE x Balb/c, 그룹 당 n=8)에서의 항체 반응을 보여준다. 마우스 혈청을 4배 연속 희석에 의해 1:100에서 1:(4.19x108)로 희석하였다. ELISA 플레이트를 재조합 IgE EMPD-함유 단백질, γ1-em67로 코팅하였다. 희석 계수의 Log (EC50)로 표현되는, 시험된 혈청의 역가는 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 계산되었다.
도 12는 도 10에 기술된 실험 설계를 사용하여 20주 기간 동안 혈청 IgE의 변화를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 그래프는 지시된 용량 (면역화 당 100 μL)의 IgE EMPD 면역원 구조체 (서열 번호: 88 또는 93)로 0, 3 및 5주차에 3회 근육내 면역화되고 10및 16주차에 파파인/TiterMax로 피하 공격접종된 인간 IGHE 녹인 하이브리드 마우스 (hIGHE x Balb/c, 그룹 당 n=8)에서의 IgE의 혈청 수준을 보여준다. 혈청 IgE는 인간 IgE (hIgE) 정량적 ELISA로 측정되었다. 마우스 혈청을 1:20으로 희석시켰다. U266 골수종 세포로부터 정제된 hIgE를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 4개의 파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 생성된 표준 곡선에 A450을 보간하여 IgE 농도를 계산하였다.
도 13은 도 10에 기술된 실험 설계를 사용하여 12주차에 측정된 1차 IgE 반응에서 파파인-특이적 인간 IgE (hIgE) 생성의 억제를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 인간 IGHE 녹인 하이브리드 마우스 (hIGHE x Balb/c, 그룹 당 n=8)를 지시된 용량 (면역화 당 100 μL)의 IgE EMPD 면역원 구조체 (서열 번호 88 또는 93)로 0, 3 및 5주차에 3회 근육내 면역화시켰다. 혈청 파파인-특이적 hIgE를 정량적 ELISA로 측정하였다. 마우스 혈청을 1:10으로 희석하였다. 모노클로날 키메라 파파인-특이적 hIgE를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 4개의 파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 생성된 표준 곡선에 A450을 보간하여 파파인-특이적 IgE 농도를 계산하였다.
도 14는 도 10에 기술된 실험 설계를 사용하여 18주차에 측정된 2차 IgE 반응에서 파파인-특이적 인간 IgE (hIgE) 생성의 억제를 보여준다. 구체적으로, 인간 IGHE 녹인 하이브리드 마우스 (hIGHE x Balb/c, 그룹 당 n=8)를 지시된 용량 (면역화 당 100 μL)의 IgE EMPD 면역원 구조체 (서열 번호 88 또는 93)로 0, 3 및 5주차에 3회 근육내 면역화시켰다. 혈청 파파인-특이적 hIgE를 정량적 ELISA로 측정하였다. 마우스 혈청을 1:10으로 희석하였다. 모노클로날 키메라 파파인-특이적 hIgE를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 4개의 파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 생성된 표준 곡선에 A450을 보간하여 파파인-특이적 IgE 농도를 계산하였다.
도 15는 본 발명의 펩티드 면역원 구조체로 면역화후 파파인 유도된 감작화 및 리콜 면역 반응을 평가하기 위한 실험 설계를 예시하는 개략도이다. 인간 IGHE 녹인 하이브리드 마우스를 0주차에 파파인/TiterMax Gold로 피하 (sc) 감작시킨 다음 3, 6 및 8주에 3회 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체로 근육내 면역화시켰다. 파파인-특이적 면역 리콜 반응은 12주차에 PBS 용액 중 파파인을 이용한 피내 발바닥 주사에 의해 유발되었다. 총 IgE 및 파파인-특이적 IgE/IgG의 수준은 0 내지 6 주차 실험들 간에 평가되었고 (도 16), 파파인-특이적 IgE의 수준은 12, 13 및 14 주차에 평가되었다 (도 17).
도 16은 도 15에 기재된 실험 설계를 사용하여 파파인으로 모든 인간 IGHE 녹인 하이브리드 마우스의 감작 결과를 보여주는 그래프를 포함한다. Log (EC50) 및 인간 IgE (ng/mL)에서 발현된 파파인-특이적 마우스 IgG 역가가 6주 기간에 걸쳐 탐지되었다. 또한, 방관자 (bystander) 활성화로 인해 총 IgE 수준 (ng/mL)이 증가했다.
도 17은 도 15에 기재된 실험 설계를 사용하여 12, 13, 및 14주차에 파파인-특이적 인간 IgE (hIgE) 생성의 억제를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 이 그래프는 400 μg/mL (면역화 당 100 μL)의 서열 번호: 88 또는 93으로 3, 6, 및 8주차에 3회 근육내 면역화된 감작화된 인간 IGHE 녹인 하이브리드 마우스 (hIGHE x Balb/c, 그룹 당 n=8)에서 파파인-특이적 리콜 반응을 보여준다. 혈청 파파인-특이적 hIgE를 정량적 ELISA로 측정하였다. 마우스 혈청을 1:10으로 희석하였다. 모노클로날 키메라 파파인-특이적 hIgE (ng/mL)를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 4개의 파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 생성된 표준 곡선에 A450을 보간하여 파파인-특이적 IgE 농도를 계산하였다.
도 18A 및 18B는 투약 당 30, 100, 300 및 1000 μg의 4회 용량의 IgE EMPD 면역원 구조체 (서열 번호: 88)로 면역화된 그리고 지시된 용량의 위약 대조군 제제로 0, 3 및 6 주차에 면역화된 시노몰구스 원숭이에서 프로토타입 면역치료 알레르기 백신 제제의 면역원성을 보여주는 그래프로, 항-IgE EMPD 역가에 대해 ELISA로 분석하였다. 도 18A는 Montanide ™ISA 51 및 CpG ODN을 함유하는 제형으로 면역화된 마카크 원숭이에서의 항체 반응을 보여준다. 도 18B는 ADJUPHOS 및 CpG ODN을 함유하는 제형으로 면역화된 마카크 원숭이에서의 항체 반응을 보여준다.
도 19는 300 μg/mL (면역화 당 500 μL)의 면역원 구조체 (서열 번호: 125 또는 126)로 0, 3 및 6주차에 3회 근육내 면역화된 시노몰구스 마카크 원숭이 (그룹당 수컷 2마리 및 암컷 2마리)에서 20 주 기간에 걸친 항체 반응의 동역학을 나타내는 그래프이다. 마카크 혈청을 4-배 연속 희석에 의해 1:100에서 1:(4.19x108)로 희석하였다. ELISA 플레이트를 서열 번호: 5로 코팅하였다. 희석 계수의 Log 10으로 표현되는, 시험된 혈청의 역가는 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 계산되었다. 1:100 희석의 모든 혈청 시료의 평균 A450의 2-배로 컷오프를 설정하였다.
도 20은 300 μg/mL (면역화 당 500 μL)의 IgE EMPD 면역원 구조체 (서열 번호: 125 또는 126)로 0, 3 및 6주차에 3회 근육내 면역화된 시노몰구스 마카크 원숭이 (그룹당 수컷 2마리 및 암컷 2마리)에서 20주 기간에 걸친 IgG, IgA 및 IgM 항체 반응의 동역학을 나타낸다. 마카크 혈청을 4-배 연속 희석에 의해 1:100에서 1:(4.19x108)로 희석하였다. ELISA 플레이트를 IgE EMPD 1-39 펩티드 (서열 번호: 5)로 코팅하였다. Log10으로 표현되는 역가는 각 시험된 혈청의 데이터로부터 생성된 4-파라미터 로지스틱 곡선에 대한 컷오프를 상호적용함으로써 계산되었다. 1:100 희석의 모든 혈청 시료의 평균 A450의 2-배로 컷오프를 설정하였다.
도 21은 300 μg/mL (면역화 당 500 μL)의 면역원 구조체 (서열 번호: 125 또는 126)로 0, 3 및 6주차에 3회 근육내 IgE EMPD 면역화된 시노몰구스 마카크 (그룹당 수컷 2마리 및 암컷 2마리)에서 20 주 기간에 걸친 혈청 IgE 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 혈청 IgE 수준은 마카크 원숭이 IgE 정량적 ELISA에서 측정되었다. 마카크 원숭이 혈청을 1:20으로 희석하였다. 마카크 원숭이 IgE를 사용하여 표준 곡선을 생성했다. 4개의 파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 생성된 표준 곡선에 A450을 보간하여 IgE 농도를 계산하였다. 결과는 평균 ± SD이다. 양측 가설의 대응 t 검정을 사용하여 0주차에 대한 통계적 차이를 확인하였다: *P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P< 0.001.
발명의 상세한 설명
본 발명은 막-결합 IgE의 세포외 막근위 도메인 (EMPD) (또는 IgE EMPD)을 표적하는 펩티드 면역원 구조체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 펩티드 면역원 구조체, 펩티드 면역원 구조체를 제조 및 사용하는 방법, 및 펩티드 면역원 구조체에 의해 면역화된 숙주에 의해 생성된 항체를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
개시된 펩티드 면역원 구조체는 약 20개 이상의 아미노산을 함유한다. 펩티드 면역원 구조체는 전장 IgE EMPD의 67개 아미노산 서열 (서열 번호: 1)로부터의 B 세포 에피토프를 함유한다. B 세포 에피토프는 임의의 이종 스페이서를 통해 병원체 단백질로부터 유래된 이종 보조 T 세포 (Th) 에피토프에 연결될 수 있다. 개시된 펩티드 면역원 구조체는 IgE EMPD에 대해 지시된 고도로 특이적인 항체의 생성을 자극하고 재조합 IgE EMPD-함유 단백질, γ1-em67 및/또는 mIgE 보유 B 세포상의 IgE EMPD에 결합할 수 있다. 개시된 펩티드 면역원 구조체는 IgE 매개 알레르기 질환을 앓고 있는 전세계 환자들을위한 알레르겐-독립적이고 비용-효과적인 범용 면역요법으로서 사용될 수 있다.
펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프 부분은 전장 IgE EMPD 서열 (서열 번호: 1)로부터의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, B 세포 에피토프는 전장 IgE EMPD 서열 (서열 번호: 1)의 넘버링에 따라 내인성 시스테인 (C18-C39)에 의해 형성된 IgE EMPD의 내부적인 분자내 루프를 함유하는 서열을 가진다. 특정 구체예들에서, B 세포 에피토프는 IgE EMPD-1-39 (서열 번호: 5), IgE EMPD-7-40 (서열 번호: 6), IgE EMPD-19-38 (서열 번호: 8), 또는 IgE EMPD-1-40 (서열 번호: 9)의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 펩티드 면역원 구조체는 병원성 단백질로부터 유래된 이종 Th 에피토프 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호: 59 내지 87)을 함유 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 이종 Th 에피토프는 천연 병원체, 예컨대 디프테리아 독소 (서열 번호: 63), 플라스모듐 팔시파룸 (서열 번호: 64), 콜레라 독소 (서열 번호: 66)로부터 유래된다. 다른 구체예들에서, 이종 Th 에피토프는 단일 서열 (예컨대, 서열 번호: 60, 67, 72, 및 73)또는 조합 서열 (서열 번호: 70, 69 및 71) 형태의, 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF 1 내지 5) 또는 B형 간염 표면 항원 (HBsAg 1 내지 3)으로부터 유래한 이상적인 인공 Th 에피토프이다.
일부 구체예들에서, 펩티드 면역원 구조체는 선택적인 이종 스페이서를 통해 이종 보조 T 세포 (Th) 에피토프에 연결된 IgE EMPD로부터의 B 세포 에피토프를 함유한다. 임의의 이종 스페이서는 2개의 아미노산 및/또는 펩티드를 함께 연결할 수 있는 분자 또는 화학 구조일 수 있다. 특정 구체예에서, 스페이서는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 또는 이들의 조합이다.
특정 구체예들에서, 펩티드 면역원 구조체는 선택적 이종 스페이서를 통해 병원성 단백질로부터 유래된 이종 Th 에피토프 (예를 들어, 서열 번호: 59 내지 87)에 연결된 IgE EMPD-1-40 (서열 번호 9)로부터의 약 20개 이상의 아미노산을 갖는 B 세포 항원 부위를 함유한다. 특정 구체예에서, 펩티드 면역원 구조체는 서열 번호: 88-95, 98-124 및 130의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 개시된 조성물은 둘 이상의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유한다. 특정 구체예에서, 조성물은 환자의 광범위한 유전적 배경을 커버하기 위해 상이한 Th 에피토프들에 연결된 IgE EMPD_1-39의 B 세포 에피토프 부분을 함유하는 펩티드 면역원 구조체의 혼합물 (예를 들어, 서열 번호: 98-124의 임의의 조합)을 함유한다. 펩티드 면역원 구조체의 혼합물을 함유하는 조성물은 단일 펩티드 면역원 구조체만을 함유하는 조성물과 비교하여, IgE 매개 알레르기 질환의 치료를 위해 백신접종하였을 때 보다 높은 백분율의 반응자 비율을 초래할 수 있다.
본 발명은 또한 IgE 매개 알레르기 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, 백신 제제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이러한 약학 조성물은 CpG 올리고머를 펩티드 면역원 복합체를 함유하는 조성물과 혼합함으로써 정전기적 결합을 통해 형성되는 안정화된 면역자극 복합체 형태로 본 발명의 펩티드 면역원 구조체를 함유한다. 이러한 안정화된 면역자극 복합체는 펩티드 면역원 구조체의 면역원성을 추가로 향상시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 백반 겔 (ALHYDROGEL), 알루미늄 포스페이트 (ADJUPHOS)를 포함하는 미네랄 염 또는 MONTANIDE ISA 51 또는 720을 포함하는 유중수 에멀젼과 같은 보조제를 함유한다.
본 발명은 또한 개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 대해 지시되는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 펩티드 면역원 구조체는 펩티드 면역원 구조체의 IgE EMPD B 세포 에피토프 부분과 교차 반응성인 매우 특이적인 항체의 생성을 자극 할 수 있다. 개시된 항체는, 존재한다면, 면역원성 향상에 사용되는 이종 Th 에피토프에 대해 많이 지시되지 않고 IgE EMPD에 대해 높은 특이성으로 결합하는데, 이는 이러한 펩티드 항원성 향상에 사용되는 통상적인 단백질 또는 다른 생물학적 담체를 사용하여 제조된 항체들과는 뚜렷한 대조를 이룬다. 따라서, 개시된 펩티드 면역원 구조체는 다른 펩티드 또는 단백질 면역원과 비교하여 높은 반응자 비율로 자기 항원에 대한 면역 내성을 파괴 할 수 있다.
특정 구체예들에서, 펩티드 면역원 구조체가 대상체에게 투여 될 때 항체는 IgE EMPD-1-52 아미노산 서열 (서열 번호: 2), IgE EMPD-1-67 아미노산 서열 (서열 번호: 1) 및 이의 단편 (예를 들어, 서열 번호: 5 및 6)에 대해 지시되고 이에 특이적으로 결합한다. 펩티드 면역원 구조체에 의해 생성된 매우 특이적인 항체는 가용성 IgE EMPD-함유 펩티드 및 단백질, IgE EMPD-함유 융합 펩티드 및 단백질, γ1-em67 및/또는 B 세포를 보유하는 막-결합 IgE상의 IgE EMPD와 교차반응성이다. 생성된 항체는 mIgE-발현 B 림프구상의 IgE B 세포 수용체 (BCR)에 결합하여 가교 할 수 있다. 이러한 가교는 세포자멸 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)과 같은 세포 용해 효과를 유도하여 혈청 IgE 생성을 감소시킨다.
이들의 독특한 특성 및 성질에 기초하여, 개시된 항체는 원인 알레르겐(들)에 관계없이 IgE 매개 알레르기 질환을 치료하기 위한 보편적인 면역치료 접근법을 제공 할 수 있다.
본 발명은 또한 개시된 펩티드 면역원 구조체, 조성물 및 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 개시된 방법은 원인 알레르겐 (들)에 관계없이 IgE 매개 알레르기 질환을 치료하기 위한 방법에 사용될 수있는, 펩티드 면역원 구조체 및 이러한 구조체를 함유하는 조성물의 저비용 제조 및 품질 관리를 제공한다.
본 발명은 또한 원인 알레르겐 (들)에 관계없이 개시된 펩티드 면역원 구조체 및/또는 펩티드 면역원 구조체에 대해 지시된 항체를 사용하여 IgE 매개 알레르기 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이러한 IgE 매개 알레르기 질환의 치료 및/또는 예방 방법은 개시된 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 조성물을 숙주에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법에 이용되는 조성물은 개시된 펩티드 면역원 구조체를 음으로 하전된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 CpG 올리고머와 정전기적 결합을 통해 안정한 면역자극 복합체 형태로 함유하며, 복합체는 선택적으로, IgE 매개 알레르기 질환 환자에게 투여하기위한 보조제로 추가 보충될 수 있다. 개시된 방법은 또한 펩티드 면역원 구조체를 IgE 매개 알레르기 질환의 위험이 있거나 또는 이러한 질환을 가지는 숙주에 투여하기 위한 투여 요법, 투여 형태, 및 경로를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 구획 제목은 단지 구성을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원에서 인용된 모든 참고 문헌 또는 참고 문헌의 일부는 임의의 목적을 위해 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 단수 표현은 문맥상 명백하게 달리 언급되지 않는 한, 복수 표현을 포함한다. 유사하게, 용어 “또는”은 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 “및”을 포함하는 것으로 한다. 따라서, “A 또는 B를 포함하는”이라는 문구는 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 분자 질량값은 대략적이며, 설명을 위해 제공된다. 본 출원에 기재된 것들과 유사하거나 균등한 방법들 및 재료들이 개시된 방법을 실시 또는 시험함에 사용될 수 있으나, 이하에서는 적합한 방법들 및 재료들을 기재한다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 그 전문이 참고문헌으로 포함된다. 충돌이 있는 경우, 용어 설명을 포함하는 본 명세서의 내용이 우선한다. 또한, 본원에 개시된 재료, 방법 및 실시예들은 단지 설명을 위한 것이며 제한을 하고자 하는 것이 아니다.
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체
본 발명은 이종 보조 T 세포 (Th) 에피토프에 직접적으로 또는 선택적 이종 스페이서를 통해 공유적으로 연결된 IgE EMPD로부터의 아미노산 서열을 갖는 B 세포 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 구조체를 제공한다.
본원에 사용된 문구 “IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체” 또는 “펩티드 면역원 구조체”은 (a) 전장 IgE EMPD의 67개아미노산 서열 (서열 번호: 1)로부터의 약 20개 이상의 아미노산 잔기를 가지는 B 세포 에피토프; (b) 이종 Th 에피토프; 및 (c) 선택적 이종 스페이서를 함유하는 펩티드를 지칭한다.
특정 구체예들에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 다음 식으로 나타낼 수 있다:
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 다음 식으로 나타낼 수 있다:
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD 단편)-X
또는
(IgE EMPD 단편)-(A)n-(Th)m-X
또는
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD 단편)-(A)n-(Th)m-X
이 때
Th는 이종 보조 T 에피토프이고;
A는 이종 스페이서이고;
(IgE EMPD 단편)은 IgE EMPD로부터 약 20 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프이고;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이고;
m은 1 내지 약 4이고; 그리고
n은 0 내지 약 10이다.
본 발명의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 다수의 이론적 근거에 기초하여 설계되고 선택되었다. 이들 근거 중 일부는 다음과 같은 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 사용하는 것을 포함한다:
i. 자기-분자이기 때문에 그 자체로 비-면역원성인 것;
ii. 단백질 담체 또는 효능있는 보조 T 에피토프(들)에 의해 면역원성이 될 수 있는 것;
iii. 다음과 같이 면역원성이 되어 숙주에 투여되는 경우:
a. IgE EMPD 펩티드 서열 (B 세포 에피토프)에 대해 지시되는 그리고 단백질 담체 또는 보조 T 에피토프(들)에 대해 지시되지 않는 고 역가 항체들을 유도함;
b. 면역화된 숙주에서 면역 내성을 파괴하고, mIgE.FcL-발현 CHO 세포로부터 정제된 재조합 단백질로서 또는 mIgE.FcL을 코딩하는 재조합 DNA로 형질감염된 B 세포 (예를 들어, Ramos)를 보유하는 mIgE의 막 상의 IgE EMPD (서열 번호 1)와 교차 반응성을 갖는 매우 특이적인 항체를 생성함;
c. 시험관내에서 항체-의존성 세포질 세포독성 (ADCC) 및 IgE-발현 B 림프구의 세포자멸을 유도 할 수 있는 매우 특이적인 항체를 생성함 (실시예 6); 및
d. 혈액 내 기저 수준 IgE의 생체내 감소 및 알레르겐 공격접종으로 일차 및 추가접종시 항원-특이적 IgE 수준의 현저한 감소를 초래할 수 있는 매우 특이적인 항체를 생성함 (실시예 8 내지 11).
개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 및 이의 제제는 IgE 매개 알레르기 질환을 앓고 있는 환자에서 IgE-매개 알레르기 병리를 감소시키거나 제거하기 위한 백신으로서 효과적으로 기능 할 수 있다.
개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 다양한 성분은 이하에서 보다 상세하게 기재한다.
a. IgE EMPD의 B 세포 에피토프
본 발명은 IgE EMPD 펩티드에 특이성을 갖고, IgE 분비가 결정된 인간 B 세포상에서 발현되는 막-결합 IgE에 대한 교차-반응성을 갖는 고 역가 폴리클로날 항체의 생성을 위한 신규한 펩티드 조성물에 관한 것이다. 펩티드 조성물의 부위-특이성은 합리적인 설계 노력을 통해 담체 단백질 상의 관련없는 부위에 지시되는 항체의 생성을 최소화한다.
본원에서 사용되는 용어 “IgE”는 분비된 IgE, 막-결합 IgE 및 이의 단편을 포함하는 임의의 형태의 면역글로불린 E를 지칭한다. 분비된 그리고 막-결합 형태의 IgE가 도 2A에 도시되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 “mIgE”는 구체적으로 막-결합 형태의 IgE 및 이의 단편을 지칭한다. 일부 구체예들에서, mIgE는 Ig 입실론 사슬 C 영역 형태 2- 인간 (단편); 수탁 번호 PH1215로 보고된 아미노산 서열을 갖는 인간에서의 IgE의 막 결합 형태이다. 막-결합 IgE는 도 2A (오른쪽)에 도시되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 “IgE EMPD”는 막-결합 IgE (mIgE)의 세포외 막 근위 도메인 (EMPD) 및 이의 단편을 지칭한다. IgE EMPD는 또한 Cε로도 지칭되며, CH4 도메인과 C-말단 막-고정 막경유 펩티드 사이에 위치하고 mIgE B 세포에서만 발견된다. IgE의 EMPD는 “짧은” 아이소형에 의해 사용되는 스플라이싱 수용체 부위의 156-bp 상류에서의 다른 εRNA 전사체 스플라이싱으로부터 생성된다. 인간 IgE의 전장 “긴” EMPD 아이소형은 67개 아미노산 길이이고 (서열 번호: 1), “짧은” 아이소형에는 존재하지 않는 52개 아미노산 (서열 번호: 2)을 포함한다. EMPD 부분이 개선된 막-결합 IgE가 도 2A에 도시되어 있다. 전장 IgE EMPD (서열 번호: 1) 및 이의 단편 (서열 번호: 2-58 및 127)의 아미노산 서열은 표 1에 제시되어 있다.
IgE EMPD는 IgE EMPD의 67-아미노산 및 52-아미노산 서열 (각각 서열 번호: 1 및 2)의 아미노산 넘버링에 기초하여 내인성 시스테인들 (C18-C39) 사이에 분자내 루프를 함유한다. IgE의 내부 분자내 루프가 도 9에 도시되어 있다.
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프는 IgE EMPD의 분자내 루프 구조 또는 이의 일부를 함유한다. 특정 구체예들에서, B 세포 에피토프는 약 20 내지 약 40개 아미노산의 IgE EMPD를 함유한다.
일부 구체예들에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프 부분의 아미노산 서열은 전장 IgE EMPD (서열 번호: 1)로부터 약 20 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 구체예에서, B 세포 에피토프는 전장 IgE EMPD (서열 번호: 1)의 넘버링에 따라 내인성 시스테인 (C18-C39)에 의해 형성된 IgE EMPD의 내부적인 분자내 루프로부터의 아미노산 서열을 함유한다. 특정 구체예들에서, B 세포 에피토프의 서열은 IgE EMPD의 분자내 루프 구조의 C-말단의 잔기 38에서 Arg (R), 39에서 Cys (C) 또는 40에서 His (H)로 끝난다.
일부 구체예들에서, B 세포 에피토프는 표 1에 제시된 바와 같이, IgE EMPD-1-39 (서열 번호: 5), IgE EMPD-7-40 (서열 번호: 6), IgE EMPD-19-38 (서열 번호: 8), 또는 IgE EMPD-1-40 (서열 번호: 9)의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 IgE EMPD 단편은 또한 IgE EMPD 펩티드 (서열 번호: 5, 6, 8 및 9)의 면역학적 기능적 유사체 또는 상동체 및 이의 20개 초과의 아미노산 단편을 포함한다. IgE EMPD 펩티드의 기능적 면역학적 유사체 또는 상동체 그리고 이의 20개 초과의 아미노산 단편은 원래의 펩티드와 실질적으로 동일한 면역 원성을 유지하는 변이체를 포함한다. 면역학적 기능적 유사체는 아미노산 위치에서 보존적 치환; 전체 하전의 변화; 또 다른 모이어티에 대한 공유 부착; 또는 아미노산 첨가, 삽입 또는 결실; 및/또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다.
b. 이종 보조 T 세포 에피토프 (Th 에피토프)
본 발명은 이종 보조 T 세포 (Th) 에피토프에 직접적으로 또는 선택적 이종 스페이서를 통해 공유적으로 연결된 IgE EMPD로부터의 B 세포 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 구조체를 제공한다.
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 내의 이종 Th 에피토프는 IgE EMPD 단편의 면역원성을 향상시키며, 이는 합리적인 설계를 통해 최적화된 표적 B 세포 에피토프 (즉, IgE EMPD 단편)에 대해 지시되는 특이적 고 역가 항체들의 생산을 용이하게 한다.
본원에 사용되는 용어 “이종”은 IgE EMPD의 야생형 서열의 일부가 아니거나 상동성이 아닌 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 이종 Th 에피토프는 IgE EMPD에서 자연적으로 발견되지 않는 아미노산 서열로부터 유래된 Th 에피토프이다 (즉, Th 에피토프는 IgE EMPD에 대해 자기가 아니다). Th 에피토프는 IgE EMPD와 이종이기 때문에, 이종 Th 에피토프가 IgE EMPD 단편에 공유적으로 연결될 때 IgE EMPD의 자연 아미노산 서열은 N-말단 또는 C-말단 방향으로 연장되지 않는다.
본 발명의 이종 Th 에피토프는 IgE EMPD에서 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 갖지 않는 임의의 Th 에피토프 일 수 있다. Th 에피토프는 또한 다수 종의 MHC 클래스 II 분자에 대한 무차별 (promiscuous) 결합 모티프를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, Th 에피토프는 다수의 무차별 MHC 클래스 II 결합 모티프를 포함하여 보조 T 세포의 최대 활성화를 가능하게 하고, 면역 반응을 개시 및 조절한다. Th 에피토프는 바람직하게는 그 자신에 대해서는 면역침묵이다, 즉, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들에 의해 생성된 항체들이 거의 Th 에피토프를 향해 지시되지 않게 되므로, 매우 집중된 면역 반응이 IgE EMPD 단편의 표적화된 B 세포 에피토프에 대하여 지시될 수 있게 한다.
본 발명의 Th 에피토프는 표 2에 예시된 바와 같이 외래 병원체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (서열 번호: 59-87). 또한, Th 에피토프는 이상적인 인공 Th 에피토프 및 이상적인 인공 Th 에피토프들의 조합 (예를 들어, 서열 번호: 60 및 67-73)을 포함한다. 조합 서열 (예컨대, 서열 번호: 68-71)로서 제시된 이종 Th 에피토프 펩티드들은, 특정 펩티드에 대해 상동체인 가변 잔기들에 기초하여 펩티드 프레임워크 내부의 특정 위치에서 제시되는 아미노산 잔기들의 혼합물을 함유한다. 조합 펩티드들의 어셈블리는 합성 공정 동안 특정 위치에서 하나의 특정 아미노산 대신에 지정된 보호된 아미노산의 혼합물을 첨가함으로써 한 공정에서 합성 될 수 있다. 이러한 조합 이종 Th 에피토프 펩티드 어셈블리는 다양한 유전적 배경의 동물들에 대한 광범위한 Th 에피토프 커버리지를 가능하게 할 수 있다. 이종 Th 에피토프 펩티드들의 대표적인 조합 서열들은 표 2에 제시된 서열 번호: 68-71을 포함한다. 본 발명의 에피토프 펩티드는 유전적으로 다양한 집단의 동물 및 환자에게 광범위한 반응성 및 면역원성을 제공한다.
Th 에피토프를 포함하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 단일 고체상 펩티드 합성에서 IgE EMPD 단편과 함께 나란히 동시에 생성된다. Th 에피토프는 또한 Th 에피토프의 면역학적 유사체를 포함한다. 면역학적 Th 유사체는 IgE EMPD 단편에 대한 면역 반응을 강화시키거나 자극시키기에 충분한 면역-강화 유사체, 교차 반응성 유사체 및 이들 Th 에피토프의 임의의 분절을 포함한다.
Th 에피토프 펩티드의 기능적 면역학적 유사체도 또한 효과적이며 본 발명의 일부로서 포함된다. 기능성 면역학적 Th 유사체는 Th 에피토프의 Th-자극 기능을 본질적으로 변형시키지 않는, Th 에피토프 내 1 내지 약 5개 아미노산 잔기들의 보존적 치환, 부가, 결실 및 삽입을 포함 할 수 있다. 보존적 치환, 부가 및 삽입은 IgE EMPD 단편에 대해 상기 기재된 바와 같이 천연 또는 비-천연 아미노산으로 달성 될 수 있다. 표 2는 Th 에피토프 펩티드에 대한 기능적 유사체의 또 다른 변형을 확인한다. 특히, MvF1 및 MvF2 Th의 서열 번호: 60 및 67은 아미노산 프레임에 있어서 N- 및 C-말단에서 각 2개 아미노산의 결실 (서열 번호: 60 및 67) 또는 포함 (서열 번호: 70 및 72)만큼 차이가 존재한다는 점에서 MvF4 및 MvF5의 서열 번호: 70 및 72의 기능성 유사체이다. 이들 두 일련의 유사 서열들 간의 차이는 이들 서열 내에 함유된 Th 에피토프의 기능에 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 기능성 면역학적 Th 유사체는 홍역 바이러스 융합 단백질 MvF1-4 Ths (서열 번호: 60, 67, 68, 70 및 72) 및 간염 표면 단백질 HBsAg 1-3 Ths (서열 번호: 69, 71 및 73)로부터 유래한 몇가지 형태의 Th 에피토프들을 포함한다.
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에서 Th 에피토프는 IgE EMPD 펩티드 단편의 N- 또는 C- 말단에서 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, Th 에피토프는 IgE EMPD 펩티드 단편의 N-말단에 공유적으로 연결된다. 다른 구체예들에서, Th 에피토프는 IgE EMPD 펩티드 단편의 C-말단에 공유적으로 연결된다. 특정 구체예들에서, 둘 이상의 Th 에피토프가 IgE EMPD 단편에 공유적으로 연결된다. 둘 이상의 Th 에피토프가 IgE EMPD 단편에 연결될 때, 각각의 Th 에피토프는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 둘 이상의 Th 에피토프가 IgE EMPD 단편에 연결될 때, Th 에피토프들은 임의의 순서로 배열 될 수 있다. 예를 들어, Th 에피토프는 IgE EMPD 단편의 N-말단에 연속적으로 연결되거나 IgE EMPD 단편의 C-말단에 연속적으로 연결될 수 있거나, Th 에피토프는 IgE EMPD 단편의 N-말단에 공유적으로 연결될 수 있는 반면, 별도의 Th 에피토프는 IgE EMPD 단편의 C-말단에 공유적으로 연결된다. IgE EMPD 단편과 관련하여 Th 에피토프의 배열에는 제한이 없다.
일부 구체예들에서, Th 에피토프는 IgE EMPD 단편에 직접 공유적으로 연결된다. 다른 구체예들에서, Th 에피토프는 이하에서 보다 상세하게 기재되는 이종 스페이서를 통해 IgE EMPD 단편에 공유적으로 연결된다.
c. 이종 스페이서
개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 IgE EMPD로부터의 B 세포 에피토프를 이종 보조 T 세포 (Th) 에피토프에 공유적으로 연결시키는 이종 스페이서를 선택적으로 함유한다.
상기 논의한 바와 같이, 용어 “이종”은 IgE EMPD의 자연 유형 서열의 일부가 아니거나 상동성이 아닌 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 지칭한다. 그러므로, 이종 스페이서가 IgE EMPD로부터의 B 세포 에피토프에 공유적으로 연결될 때 이러한 스페이서는 IgE EMPD 서열에 대해 이종이기 때문에 IgE EMPD의 자연 아미노산 서열은 N-말단 또는 C-말단 방향으로 연장되지 않는다.
스페이서는 2개의 아미노산 및/또는 펩티드를 함께 연결할 수 있는 임의의 분자 또는 화학 구조이다. 스페이서는 용도에 따라 길이 또는 극성이 변화할 수 있다. 스페이서 부착은 아미드-또는 카르복실-연결기에 의한 것일 수 있지만 다른 작용기도 또한 가능하다. 스페이서는 화학적 화합물, 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산을 포함 할 수 있다.
스페이서는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 구조적 특징을 제공 할 수 있다. 구조적으로, 스페이서는 IgE EMPD 단편의 B 세포 에피토프로부터 Th 에피토프의 물리적 분리를 제공한다. 스페이서에 의한 물리적 분리는 Th 에피토프를 B 세포 에피토프에 결합시킴으로써 생성되는 임의의 인공 이차 구조를 파괴 할 수 있다. 또한, 스페이서에 의한 에피토프의 물리적 분리는 Th 세포 및/또는 B 세포 반응 사이의 간섭을 제거 할 수 있다. 또한, 스페이서는 펩티드 면역원 구조체의 2차 구조를 생성 또는 변형 시키도록 설계 될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 Th 에피토프 및 B 세포 에피토프의 분리를 향상시키기 위해 가요성 힌지로서 작용하도록 설계 될 수 있다. 가요 성 힌지 스페이서는 또한 제시된 펩티드 면역원과 적절한 Th 세포 및 B 세포 사이의 보다 효율적인 상호작용을 가능하게 하여 Th 에피토프 및 B 세포 에피토프에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 가요성 힌지를 인코드하는 서열의 예는 종종 프롤린이 풍부한 면역글로불린 중쇄 힌지 영역에서 발견된다. 스페이서로서 사용될 수 있는 특히 유용한 하나의 가요성 힌지는 서열 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 번호: 128)로 제공되며, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산, 바람직하게는 아스파르트산이다.
스페이서는 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 기능적 특징을 제공 할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 전체 전하를 변화 시키도록 설계 될 수 있으며, 이는 펩티드 면역원 구조체의 용해도에 영향을 줄 수 있다. 또한, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 전체 전하를 변화시키는 것은 다른 화합물 및 시약과 결합하는 펩티드 면역원 구조체의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 아래에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 정전기적 결합을 통해 CpG 올리고머와 같은 매우 하전된 올리고뉴클레오티드와 안정한 면역자극 복합체로 형성 될 수 있다. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 전체 전하는 이들 안정한 면역자극 복합체들의 형성에 중요하다.
스페이서로서 사용될 수 있는 화학적 화합물은 (2-아미노에톡시) 아세트산 (AEA), 5-아미노발레르산 (AVA), 6-아미노카프로산 (Ahx), 8-아미노-3, 6-디옥사옥탄산 (AEEA, 미니-PEG1), 12-아미노-4,7,10-트리옥사도데칸산 (미니-PEG2), 15-아미노-4,7,10,13- 테트라옥사펜타-데칸산 (미니-PEG3), 트리옥사트리데칸-석신산 (Ttds), 12-아미노-도데칸산, Fmoc-5-아미노-3-옥사펜탄산 (O1Pen) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
천연 아미노산에는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린이 포함된다.
비-천연 아미노산은 ε리신, ß알라닌, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 티록신, γ아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린, 아미노벤조산, 6-아미노카프로산 (Aca; 6-아미노헥산산), 하이드록시 프롤린, 머캅토프로피온산 (MPA), 3-니트로-티로신, 피로글루탐산 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들에서의 스페이서는 Th 에피토프 및 IgE EMPD 펩티드의 N-또는 C-말단에서 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 스페이서는 Th 에피토프의 C-말단 및 IgE EMPD 펩티드의 N-말단에 공유적으로 연결된다. 다른 구체예들에서, 스페이서는 IgE EMPD 펩티드의 C-말단 및 Th 에피토프의 N-말단에 공유적으로 연결된다. 특정 구체예에서, 예를 들어, 펩티드 면역원 구조체에 둘 이상의 Th 에피토프가 존재하는 경우, 둘 이상의 스페이서가 사용될 수 있다. 둘 이상의 스페이서가 사용될 때, 각각의 스페이서는 서로 동일하거나 상이 할 수 있다. 또한, 둘 이상의 Th 에피토프가 펩티드 면역원 구조체에 존재하는 경우, Th 에피토프는 스페이서로 분리 될 수 있으며, 이는 Th 에피토프를 B 세포 에피토프로부터 분리하는데 사용된 스페이서와 동일하거나 상이 할 수 있다. Th 에피토프 또는 IgE EMPD 단편에 대한 스페이서의 배열에는 제한이 없다.
특정 구체예에서, 이종 스페이서는 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산이다. 다른 구체예들에서, 스페이서는 둘 이상의 천연 또는 비-천연 아미노산을 함유한다. 특정 구체예들에서, 스페이서는 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε또는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호: 129)이다.
d. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들의 특정 구체예
특정 구체예들에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 다음 식으로 나타낼 수 있다:
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD 단편)-X
또는
(IgE EMPD 단편)-(A)n-(Th)m-X
또는
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD 단편)-(A)n-(Th)m-X
이 때
Th는 이종 보조 T 에피토프이고;
A는 이종 스페이서이고;
(IgE EMPD 단편)은 IgE EMPD로부터 약 20 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프이고;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이고;
m은 1 내지 약 4이고; 그리고
n은 0 내지 약 10이다.
특정 구체예에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들에서의 이종 Th 에피토프는 표 2에 제시된 서열 번호: 59-87 중 어느 하나 및 이의 조합으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 둘 이상의 Th 에피토프를 함유한다.
특정 구체예에서, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호: 129), 및 이의 조합 중 어느 하나에서 선택된다. 특정 구체예들에서, 이종 스페이서는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호: 129)이다.
특정 구체예들에서, IgE EMPD 단편은 서열 번호: 1 또는 2의 IgE EMPD로부터의 약 20 내지 약 40개 아미노산 잔기를 갖는다. 특정 구체예에서, IgE EMPD 단편은 전장 IgE EMPD (서열 번호: 1)의 넘버링에 따라 내인성 시스테인 (C18-C39)에 의해 형성된 IgE EMPD의 내부적인 분자내 루프로부터의 아미노산 서열을 함유한다. 특정 구체예들에서, IgE EMPD 단편은 표 1에 제시된 바와 같이, IgE EMPD-1-39 (서열 번호: 5), IgE EMPD-7-40 (서열 번호: 6), IgE EMPD-19-38 (서열 번호: 8), 또는 IgE EMPD-1-40 (서열 번호: 9)의 아미노산 서열을 가진다.
특정 구체예에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 표 3에 나타낸 바와 같이 서열 번호: 88-130 중 어느 하나에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구체예에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 서열 번호: 88-95, 98-124 및 130 중 어느 하나에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
e. 변이체, 동족체, 및 기능적 유사체
IgE EMPD의 바람직한 에피토프에 대한 항체를 유도 및/또는 항체와 교차 반응하는 상기 면역원성 펩티드들의 변이체 및 유사체가 또한 사용될 수 있다. 대립 유전자, 종, 및 유도된 변이체들을 비롯한 유사체들은 전형적으로 종종 보존적 치환에 의해 1, 2, 또는 몇 개의 위치들에서 천연 펩티드와 상이하다. 유사체는 전형적으로 천연 펩티드와 80 또는 90% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 일부 유사체는 또한 1, 2, 또는 몇 개의 위치들에서 비천연 아미노산 또는 N- 또는 C-말단 아미노산들의 변형을 포함한다.
기능적 유사체인 변이체들은 아미노산 위치에서 보존적 치환; 전체 하전의 변화; 또 다른 모이어티에 대한 공유 부착; 또는 아미노산 첨가, 삽입 또는 결실; 및/또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다.
보존적 치환은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환된 경우이다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
특정 구체예에서, 기능적 유사체는 원래 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 기능적 유사체는 원래 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는다. 또한 또 다른 구체예에서, 기능적 유사체는 원래 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 기능적 유사체는 원래 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는다.
변이체는 또한 인산화 잔기에 대한 변이를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 인산화된 펩티드 내부에 상이한 잔기를 포함 할 수 있다. 변이체 면역원성 IgE EMPD 펩티드는 또한 유사-인산화 펩티드를 포함 할 수 있다. 유사-인산화 펩티드는 IgE EMPD 펩티드의 하나 이상의 인산화된 세린, 트레오닌 및 티로신 잔기를 글루탐산 및 아스파르트산과 같은 산성 아미노산 잔기로 치환함으로써 생성된다.
조성물
본 발명은 또한 개시된 IgE EMPD 면역원 구조체를 포함하는 조성물을 제공한다.
a. 펩티드 조성물
개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 조성물은 액체 또는 고체 형태 일 수 있다. 액체 조성물은 물, 완충제, 용매, 염 및/또는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 구조적 또는 기능적 특성을 변경시키지 않는 임의의 다른 허용가능한 시약을 포함 할 수 있다. 펩티드 조성물은 개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 중 하나 이상을 함유 할 수 있다.
b. 약학 조성물
본 발명은 또한 개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
약학 조성물은 약학적으로 허용되는 전달 시스템에 담체 및/또는 다른 첨가제를 함유 할 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 보조제 및/또는 다른 부형제, 가령, 희석제, 첨가제, 안정화제, 보존제, 가용화제, 완충제 등과 함께 약학적 유효량의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유 할 수 있다.
약학 조성물은 임의의 특이적 항원 효과를 갖지 않으면서 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 대한 면역 반응을 가속화, 연장 또는 향상시키는 작용을 하는 하나 이상의 보조제를 함유 할 수 있다. 약학 조성물에 사용되는 보조제는 오일, 오일 에멀젼, 알루미늄 염, 칼슘 염, 면역 자극 복합체, 박테리아 및 바이러스 유도체, 바이로좀, 탄수화물, 사이토카인, 중합체성 미세입자를 포함 할 수 있다. 특정 구체예에서, 보조제는 명반 (포타슘 알루미늄 포스페이트), 알루미늄 포스페이트 (예컨대, ADJU-PHOS®알루미늄 하이드록사이드 (예컨대, ALHYDROGEL®칼슘 포스페이트, 불완전 프로인트 보조제 (IFA), 프로인트 완전 보조제, MF59, 보조제 65, 리포반트, ISCOM, 리포신, 사포닌, 스쿠알렌, L121, Emulsigen®모노포스포릴 지질 A (MPL), Quil A, QS21, MONTANIDE®ISA 35, ISA 50V, ISA 50V2, ISA 51, ISA 206, ISA 720, 리포좀, 인지질, 펩티도글리칸, 리포폴리사카라이드 (LPS), ASO1, ASO2, ASO3, ASO4, AF03, 친유성 인지질 (지질 A), 감마 이눌린, 알가뮬린, 글루칸, 덱스트란, 글루코만노스, 갈락토만난, 레반, 자일란, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA), 및 다른 보조제 및 유화제로부터 선택 될 수 있다.
일부 구체예에서, 약학 조성물은 Montanide™ISA 51 (유중수 에멀젼의 제조를 위한 식물성 오일 및 만니드 올레에이트로 구성된 오일 보조제 조성물), Tween®80 (또한 폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트로도 알려져 있음), CpG 올리고뉴클레오티드 및/또는 이들의 임의의 조합을 함유한다. 다른 구체예에서, 약학 조성물은 보조제로서 에멀시겐 또는 에멀시겐 D를 갖는 수중유중수 (즉, w/o/w) 에멀젼이다.
약학 조성물은 또한 약학상 허용되는 첨가제 또는 부형제를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 산화 방지제, 결합제, 완충제, 증량제, 담체, 킬레이트제, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 충전제, 겔화제, pH 완충제, 보존제, 가용화제, 안정제 등을 함유 할 수 있다.
약학 조성물은 즉시 방출 또는 서방형 제형으로 제제화 될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 면역원 포획 및 미세입자와의 공투여를 통한 전신 또는 국소화된 점막 면역의 유도를 위해 제제화 될 수 있다. 이러한 전달 시스템은 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다.
약학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조 될 수 있다. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 액체 비히클은 또한 주사 전에 제조 될 수 있다. 약학적 조성물은 임의의 적합한 투여 방식, 예를 들어, i.d., i.v., i.p., i.m., 비강내, 경구, 피하 등에 의해 및 임의의 적합한 전달 장치로 투여 될 수 있다. 특정 구체예에서, 약학 조성물은 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내 투여를 위해 제형화된다. 경구 및 비강내 적용을 비롯한 다른 투여 방식에 적합한 약학 조성물이 또한 제조 될 수 있다.
약학 조성물은 또한 적합한 투여 단위 형태로 제제화 될 수 있다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 체중 kg 당 약 0.1 μg 내지 약 1 mg의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유한다. 약학적 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지, 다른 약물이 투여되는지, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부를 비롯한 많은 상이한 요인들에 따라 변화한다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 형질전환 포유동물을 포함하는 비인간 포유동물도 치료 될 수 있다. 다회 용량들로 전달 될 때, 약학 조성물을 투약 단위 형태 당 적절한 양으로 편의상 나눌 수 있다. 투여량은 치료 분야에 공지된 바와 같이 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 건강 상태에 따라 달라질 것이다.
일부 구체예에서, 약학 조성물은 둘 이상의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유한다. 약학 조성물은 구조체들의 면역효능을 상승적으로 향상시키기 위해 둘 이상의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 혼합물을 함유한다. 둘 이상의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약학 조성물은 광범위한 MHC 클래스 II 커버리지로 인해 보다 큰 유전자 집단에서보다 효과적 일 수 있으며, 그리하여 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 대한 개선된 면역 반응을 제공한다.
일부 구체예에서, 약학 조성물은 서열 번호: 88-95, 98-124 및 130 (표 3)으로부터 선택된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체, 뿐만 아니라 이의 동족체, 유사체 및/또는 조합을 함유한다.
특정 구체예에서, 다양한 유전적 배경을 갖는 백신 숙주 집단을 최대로 커버할 수 있는 백신 제제에 사용하기 위하여, 조합 형태의 MVF 및 HBsAg (서열 번호: 68 및 69)로부터 유래된 이종 Th 에피토프를 갖는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 107 및 108)을 등몰비로 혼합하였다. IgE EMPD G1-C39 및 A7-C40 면역원 구조체들 (서열 번호: 88 내지 95)에서의 상승작용적 향상이 본 발명의 펩티드 조성물에서 관찰되었으며 이러한 구조체들 (예컨대, 서열 번호: 95)에 의해 유도된 항체 반응은 면역원성 향상을 위해 사용된 이종 Th 에피토프들이 존재하는 경우 이에 대해 많이 지시되지 않고 IgE EMPD의 B 세포 에피토프 펩티드 (서열 번호: 2)에 대한 원하는 교차-반응성에 대부분 (>90%) 집중되었다 (실시예 7, 표 7). 이는 KLH와 같은 통상적인 단백질 또는 이러한 펩티드 항원성 향상에 사용되는 다른 생물학적 단백질 담체와는 대조적이다.
다른 구체예에서, 예를 들어, 현탁액 백신 제제를 형성하기 위한 보조제로서 알룸 겔 (ALHYDROGEL) 또는 알루미늄 포스페이트 (ADJUPHOS)를 포함하는 미네랄 염과 접촉되어 있는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 혼합물의 펩티드 조성물을 포함하는 약학 조성물을 백신 숙주에게 투여하기 위해 사용한다.
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약학 조성물을 사용하여 투여시 숙주에서 면역 반응을 유도하고 항체를 생성할 수 있다.
c. 면역자극 복합체
본 발명은 또한 CpG 올리고뉴클레오티드와의 면역자극 복합체 형태로 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 면역자극 복합체는 보조제 및 펩티드 면역원 안정화제로서 작용하도록 특이적으로 개작된다. 면역자극 복합체는 미립자 형태이며, 이는 IgE EMPD 펩티드 면역원을 면역계 세포에 효과적으로 제시하여 면역 반응을 일으킬 수 있다. 면역자극 복합체는 비경구 투여용 현탁액으로 제제화 될 수 있다. 면역자극 복합체는 또한 비경구 투여 후 숙주의 면역계 세포에 IgE EMPD 펩티드 면역원을 효율적으로 전달하기 위해 미네랄 염 또는 인시튜 (in-situ) 겔화 중합체와 조합된 현탁액으로서 w/o 에멀젼 형태로 제제화 될 수 있다.
안정화된 면역자극 복합체는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 정전기적 결합을 통해 음이온성 분자, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합과 복합체화함으로써 형성 될 수 있다. 안정화된 면역자극 복합체는 면역원 전달 시스템으로서 약학 조성물에 혼입 될 수 있다.
특정 구체예들에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 5.0 내지 8.0 범위의 pH에서 양으로 하전된 양이온 부분을 함유하도록 설계된다. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 또는 구조체의 혼합물의 양이온 부분에 대한 순 전하는 각 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H)에 +1 전하를, 각 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)에 -1 전하를 그리고 해당 서열 내 다른 아미노산에 대해 0 전하를 할당하여 계산된다. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 양이온성 부분 내부의 전하들을 합산하여 순 평균 전하로 표시한다. 적합한 펩티드 면역원은 +1의 순 평균 양전하를 갖는 양이온 부분을 갖는다. 바람직하게는, 펩티드 면역원은 +2 보다 큰 범위의 순 양전하를 갖는다. 일부 구체예에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 양이온 부분은 이종 스페이서이다. 특정 구체예들에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 양이온 부분은 스페이서 서열이 (α,ε-N)Lys,ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호: 129)인 경우 +4의 전하를 가진다.
본원에 기재된 “음이온 분자”는 5.0-8.0 범위의 pH에서 음으로 하전된 임의의 분자를 지칭한다. 특정 구체예에서, 음이온 분자는 올리고머 또는 중합체이다. 올리고머 또는 폴리머상의 순 음전하는 올리고머 내의 각 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 그룹에 -1 전하를 할당함으로써 계산된다. 적합한 음이온성 올리고뉴클레오티드는 8 내지 64개 뉴클레오티드 염기를 갖는 단일-가닥 DNA 분자이며, CpG 모티프 반복횟수는 1 내지 10 범위이다. 바람직하게는, CpG 면역자극 단일 가닥 DNA 분자는 18 내지 48개의 뉴클레오티드 염기를 함유하며, CpG 모티프의 반복횟수는 3 내지 8의 범위이다.
보다 바람직하게는 음이온성 올리고뉴클레오티드는 아래 식으로 나타낸다: 5' X1CGX2 3' 이 때 C 및 G는 메틸화되지 않고; 및 X1은 A (아데닌), G (구아닌) 및 T (티미딘)로 구성된 그룹에서 선택되며; X2는 C (시토신) 또는 T (티민)이다. 또는 음이온성 올리고뉴클레오티드는 아래 식으로 나타낸다: 5' (X3)2CG(X4)2 3' 이 때 C 및 G는 메틸화되지 않고; 그리고 X3는 A, T 또는 G로 구성된 그룹에서 선택되고; 그리고 X4는 C 또는 T이다.
생성된 면역자극 복합체는 전형적으로 1 내지 50 마이크론 범위의 크기를 갖는 입자의 형태이며, 상호작용 화학종의 상대 전하 화학량론 및 분자량을 비롯한 많은 인자들의 함수이다. 입자화된 면역자극 복합체는 생체내에서 특정 면역 반응의 보조 및 상향조절을 제공하는 이점을 갖는다. 또한, 안정화된 면역자극 복합체는 유중수 에멀젼, 미네랄 염 현탁액 및 중합체 겔을 포함한 다양한 공정에 의해 약학 조성물을 제조하는데 적합하다.
본 발명은 또한 IgE 매개 알레르기 질환의 치료 및 예방을 위한, 백신 제제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들 (예컨대, 서열 번호: 88-95, 98-124, 및 130)의 혼합물을 함유하는 펩티드 조성물과 CpG 올리고머를 정전기적 결합에 의해 혼합함으로써 형성된 안정화된 면역자극 복합체를 포함하여, IgE EMPD 펩티드 면역원성을 더욱 향상시키고 mIgE-발현 B 세포에 결합하는 서열 번호: 1 또는 2의 IgE EMPD 펩티드에 대한 항체를 유도하여 이들의 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 및 세포자멸을 유도한다 (실시예 6).
또 다른 구체예들에서, 약학 조성물은 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들의 혼합물 (예컨대, 서열 번호: 8-90, 94, 95, 98-124, 및 130의 임의의 조합)을, 백신 숙주들에게 투여하기 위한 현탁액 백신 제제를 형성하기 위하여 고 안전성 계수의 보조제로서 명반 겔 (ALHYDROGEL) 또는 알루미늄 포스페이트 (ADJUPHOS)를 비롯한 미네랄 염과 선택적으로 혼합된 CpG 올리고머와의 안정화된 면역자극 복합체의 형태로 함유한다.
항체
본 발명은 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 의해 유도된 항체를 제공한다.
본 발명은 자체 항원에 대한 면역 내성을 파괴 할 수있는 막-결합 IgE를 표적으로 하는 높은 역가의 항체를 유도 할 수 있고 백신접종된 숙주들에서 반응자 비율이 높은, 제조에 있어서 비용 효율적이고 그 설계에 최적인 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 및 이의 제제를 제공한다. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 의해 생성된 항체는 가용성 펩티드, 융합 단백질 또는 IgE 보유 B 세포 상에 제시되는 IgE로서 IgE-EMPD 단백질에 대해 높은 친화도를 갖는다. 생성된 항체는 mIgE-발현 B 림프구에서 IgE BCR에 결합 및 가교결합하여 세포자멸 및 ADCC와 같은 세포 용해 효과를 유도 할 수 있다. 막 결합 IgE B 림프구의 세포자멸 고갈은 혈청 IgE 생성을 감소시킨다. 따라서, 개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 및 이의 제제에 의해 생성된 세포자멸-유도 IgE EMPD 특이적 항체로 인간 mIgE B 세포를 표적하는 것은 IgE 매개 알레르기 질환에 대한 새로운 치료제 및 백신을 제공한다.
일부 구체예들에서, 항체를 유도하기 위한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들은, 병원성 단백질들, 가령, 홍역 바이러스 융합 (MVF) 단백질 (서열 번호: 73) 및 기타 (서열 번호: 59 내지 87)로부터 유래한 이종 Th 에피토프에 선택적 스페이서를 통해 연결된, IgE EMPD 펩티드 (서열 번호: 1)로부터 유래한 중심 분자내 루프 구조를 커버하는 20 내지 40개 아미노산을 함유하는 B 세포 에피토프를 가지는 IgE EMPD 펩티드 (예컨대, IgE EMPD G1-C39 (서열 번호: 5), IgE EMPD A7-H40 (서열 번호: 6), IgE EMPD H19-R38 (서열 번호: 8), 및 IgE EMPD G1-H40 (서열 번호: 9)의 IgE EMPD 펩티드)의 하이브리드를 포함한다. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들의 B 세포 에피토프 및 Th 에피토프는 함께 작용하여 (예컨대, 인간 IgG1의 Fc 부분의 Fc 부분 및 인간 막-결합 IgE의 IgE EMPD, γ1-em67을 인코드하는 재조합 DNA로 형질감염된 안정한 Flp-In CHO 세포주로부터 정제된) 재조합 IgE EMPD-함유 단백질로서 또는 막-결합 IgE 보유 세포 (예컨대, mIgE.FcL를 인코드하는 재조합 DNA로 형질감염된 Ramos 세포주)의 막에서 IgE EMPD 1-52 펩티드 (서열 번호: 2), IgE EMPD 1-67 단백질 (서열 번호: 1)과 교차 반응성인 매우 특이적인 항체들의 생성을 자극한다.
펩티드를 면역강화시키는 전형적인 방법들, 가령, 담체 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 다른 담체 단백질, 가령, 디프테리아 톡소이드 (DT) 및 파상풍 톡소이드 (TT) 단백질에 대한 화학적 커플링을 통한 방법들은 통상적으로 담체 단백질에 대해 지시된 다량의 항체를 생성시킨다. 따라서, 이러한 펩티드-담체 단백질 백신의 주요 결핍은 면역원에 의해 생성된 항체의 대부분 (>90%)이 담체 단백질 KLH, DT 또는 TT에 대해 지시되는 비-기능성 항체이고, 이는 에피토프 억제를 초래 할 수 있다는 것이다.
펩티드를 면역강화시키는 전형적인 방법과는 달리, 개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 의해 생성된 항체는 IgE EMPD 단편에 매우 특이적으로 결합하며, 이종 Th 에피토프 또는 선택적 이종 스페이서에 대해 지시되는 항체는, 존재한다 하여도, 거의 없다. 특히, 백신접종된 동물에서 유도된 폴리클로날 항체들은 도 9에 도시된 바와 같이 IgE EMPD의 루프 구조를 커버하는 중심 영역에 높은 특이성으로 결합한다.
방법
본 발명은 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들, 조성물, 및 약학 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
a. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 제작 방법
본 발명의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 통상의 숙련된 기술자에게 널리 공지되어 있는 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있다 (예컨대, Fields 외, Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 77 참고). IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 예를 들어 Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A 또는 431에서 측쇄 보호 아미노산을 사용하여 t-Boc 또는 F-moc 화학에 의해 보호된 α-NH2를 이용하는 고체상 합성에 관한 자동화 메리필드 (Merrifield) 기법을 사용하여 합성 될 수 있다. Th 에피토프에 대한 조합 라이브러리 펩티드를 포함하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 제조는 주어진 가변 위치에서의 커플링을 위한 대체 아미노산의 혼합물을 제공함으로써 달성 될 수 있다.
원하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들의 완전한 조립 후, 수지로부터 펩티드를 절단하는 표준 절차에 따라 수지를 처리할 수 있고 아미노산 측쇄상의 작용기는 차단해제 될 수 있다. 유리 펩티드는 HPLC에 의해 정제되고, 예를 들어, 아미노산 분석 또는 시퀀싱에 의해 생화학적으로 특성화 될 수 있다. 펩티드의 정제 및 특성화 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
이 화학 공정에 의해 생성되는 펩티드의 품질은 제어 및 정의 될 수 있으며, 결과적으로 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 재현성, 면역원성 및 수율이 보장 될 수 있다. 고체상 펩티드 합성을 통한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 제조에 대한 상세한 설명은 실시예 1에 제시되어 있다.
의도한 면역학적 활성을 유지 할 수 있는 구조적 가변성의 범위는, 소분자 약물에 의한 특이적 약물 활성 또는 원하는 활성 그리고 생물학적-유래 약물들과 함께 공동-생성되는 큰 분자들에서 발현되는 바람직하지 않은 독성을 유지할 수 있게 하는 구조적 가변성의 범위보다 훨씬 더 많이 수용적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 의도한 펩티드와 유사한 크로마토그래피 및 면역학적 특성을 갖는 결실 서열 부산물의 혼합물로서 합성 공정의 오류에 의해 불가피하게 생성되거나 의도적으로 설계된 펩티드 유사체는 종종 원하는 펩티드의 정제 된 제제만큼 효과적이다. 설계된 유사체 및 의도하지 않은 유사체 혼합물은 이러한 펩티드를 사용하는 최종 제품의 재현성 및 효능을 보장하기 위해 제조 공정 및 제품 평가 공정을 모두 모니터하는 엄선 QC 절차가 개발되는 한 효과적이다.
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 또한 핵산 분자, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조 될 수 있다. 이와 같이, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 인코드하는 핵산 분자 및 이의 면역학적 기능적 유사체도 본 발명의 일부로서 본 발명에 포함된다. 유사하게, 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 벡터 및 벡터를 함유하는 숙주 세포도 본 발명의 일부로서 본 발명에 포함된다.
다양한 예시적인 구체예는 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 및 이의 면역학적 기능적 유사체를 생성하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 방법은 펩티드 및/또는 유사체가 발현되는 조건하에서 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 및/또는 이의 면역학적 기능적 유사체를 인코드하는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함 할 수 있다. 보다 긴 합성 펩티드 면역원은 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 합성 될 수 있다. 이러한 기술은 널리 공지된 표준 매뉴얼에 자세한 프로토콜이 제공된다. 본 발명의 펩티드를 인코드하는 유전자를 제작하기 위해, 아미노산 서열은 역 번역되어, 바람직하게는 유전자가 발현될 유기체에 대해 최적인 코돈들을 가지는, 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 서열을 수득한다. 다음으로, 합성 유전자는 전형적으로 필요한 경우 펩티드 및 임의의 조절 요소를 인코드하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 제조된다. 합성 유전자를 적합한 클로닝 벡터에 삽입하고 숙주 세포에 형질감염시킨다. 이어서, 펩티드는 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적절한 적합한 조건하에서 발현된다. 펩티드는 정제되고 표준 방법에 의해 특성화된다.
b. 면역자극 복합체의 제조 방법
다양한 예시적인 구체예는 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 분자를 포함하는 면역자극 복합체를 생성하는 방법을 포함한다. 안정화된 면역자극 복합체 (ISC)는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 양이온 부분 및 다중음이온 CpG ODN 분자로부터 유래된다. 자체-조립 시스템은 전하의 정전기 중화에 의해 구동된다. 음이온 올리고머에 대한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 양이온 부분의 몰 전하 비율에 관한 화학양론에 의해 결합 정도가 결정된다. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 및 CpG ODN의 비-공유 정전기적 결합은 완전히 재현가능한 과정이다. 펩티드/CpG ODN 면역자극 복합체 응집체는, 면역계의 “전문적” 항원-제시 세포 (APC)로의 제시를 용이하게 하여 복합체의 면역원성을 더욱 향상시킨다. 이러한 복합체는 제조 과정 동안 품질 제어에 관해 쉽게 특성화된다. 펩티드/CpG ISC는 생체내에서 내성이 우수하다. CpG ODN 및 IgE EMPD 단편 유래 펩티드 면역원 구조체들을 포함하는 이러한 신규한 입자 시스템은 CpG ODN 사용과 관련된 일반화된 B 세포 유사분열성을 이용하지만, 균형잡힌 Th-1/Th-2 유형 반응들을 촉진하도록 설계되었다.
개시된 약학적 조성물에서 CpG ODN은 반대 전하의 정전기 중화에 의해 매개되는 공정에서 면역원에 100% 결합되어 미크론-크기의 미립자를 형성한다. 입자 형태는 CpG 보조제의 통상적인 사용으로부터 CpG의 용량을 상당히 감소시키고, 선천적 면역 반응의 가능성을 적게하며, 항원-제시 세포 (APC)를 포함하는 대안적인 면역원 처리 경로를 용이하게 한다. 결과적으로, 이러한 제제는 개념적으로 신규하고 대안적인 메커니즘에 의해 면역 반응의 자극을 촉진함으로써 잠재적인 이점을 제공한다.
c. 약학 조성물의 제조 방법
다양한 예시적인 구체예는 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약학 조성물을 포함한다. 특정 구체예에서, 약학 조성물은 유중수 에멀젼 및 미네랄 염과의 현탁액으로 사용한다.
다수의 집단이 약학 조성물을 사용하도록 하기 위해 그리고 IgE EMPD 응집의 방지가 또한 투여 목표의 일부인 경우, 안전성은 고려해야 할 또 다른 중요한 요소가 된다. 임상 시험에서 많은 제제들에 대해 인간에서 유중수 에멀젼을 사용함에도 불구하고, 명반은 그 안전성으로 인해 제제들에 사용하기 위한 주요 보조제로 남아있다. 따라서, 명반 또는 이의 미네랄 염 알루미늄 포스페이트 (ADJUPHOS)는 임상 적용을 위해 제재에서 보조제로 자주 사용된다.
다른 보조제 및 면역 자극제는 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (MPL) 또는 3-DMP, 중합체 또는 단량체 아미노산, 가령, 폴리글루탐산 또는 폴리리신을 포함한다. 이러한 보조제는 다른 특정 면역자극제, 예컨대, 뮤라밀 펩티드 (예컨대, N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미 닐-L-알라닌-2- (1'-2' 디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Al-D-이소글루-L-Ala-디팔미톡시프로필아미드 (DTP-DPP) Theramide™또는 다른 박테리아 세포벽 성분과 함께 또는 없이 사용될 수 있다. 수중유 에멀젼은 5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80, 및 0.5% Span 85 (선택적으로 다양한 양의 MTP-PE를 함유)를 함유하며 미세유동화제를 사용하여 서브미크론 입자로 제형화된 MF59 (Van Nest 외의 WO 90/14837 참고, 이는 본원에 그 전문이 참고문헌으로 포함됨); 10% 스쿠알렌, 0.4% Tween 80, 5% 플루로닉-차단 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하며, 서브미크론 에멀젼으로 미세유동화되거나 볼텍싱되어 보다 큰 입경의 에멀젼을 생성하는 SAF; 및 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80, 및 모노포스포릴 지질 A (MPL), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (CWS), 바람직하게는 MPL+CWS (Detox™)로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 박테리아 세포 벽 성분들을 함유하는 Ribi™보조제 시스템 (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, Mont.)을 포함한다. 다른 보조제들에는 완전 프로인트 보조제 (CFA), 불완전 프로인트 보조제 (IFA), 및 사이토카인, 가령, 인터루킨 (IL-1, IL-2, 및 IL-12), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한다.
보조제의 선택은 보조제를 함유하는 면역원성 제제의 안정성, 투여 경로, 투약 일정, 백신접종되는 종에 대한 보조제의 효능에 따라 달라지며, 인간에서 약학적으로 허용되는 보조제는 관련 규제 기관의 승인을 받은 것이거나 인간 투여에 승인 가능한 것이다. 예를 들어, 명반, MPL 또는 불완전 프로인트 보조제 (Chang 외, Advanced Drug Delivery Reviews 32:173-186 (1998), 그 전문이 참고로 포함됨)는 단독으로 또는 선택적으로 이의 모든 조합이 인간 투여에 적합하다.
조성물은 약학상 허용되는 비-독성 담체 또는 희석제를 포함 할 수 있으며, 이는 동물 또는 인간 투여용 약학 조성물을 제제화하기 위해 일반적으로 사용되는 비히클로 정의된다. 희석제는 상기 조합물의 생물학적 활성에 영향을 주지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리학적 인산염-완충 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 행크 용액이다. 또한, 약학 조성물 또는 제제는 다른 담체, 보조제, 또는 비독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제 등을 포함 할 수 있다.
약학 조성물은 또한 대형의, 서서히 대사되는 대분자, 가령, 단백질, 키토산과 같은 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체 (예를 들어, 라텍스 작용기화 세파로스, 아가로스, 셀룰로스 등), 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 지질 응집체 (예를 들어, 오일 액적 또는 리포좀)를 포함할 수 있다. 또한, 이들 담체는 면역자극제 (즉, 보조제)로서 기능 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 적합한 전달 비히클을 추가로 포함 할 수 있다. 적합한 전달 비히클에는 바이러스, 박테리아, 생분해 성 미세 구, 미세 입자, 나노 입자, 리포좀, 콜라겐 미니펠릿 및 코클레이트 (cochleates)가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
d. 약학 조성물의 사용 방법
본 발명은 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약학 조성물의 사용 방법을 포함한다.
특정 구체예에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약학 조성물은 약물, 음식 및 곤충 알레르기를 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 면역글로불린 E (IgE) 매개 알레르기 질환, 알레르기비염 (건초열), 아토피성 피부염, 알레르기성 천식, 결막염, 습진, 두드러기 (두드러기) 및 아나필락시스의 치료 및/또는 예방에 사용될 수있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 약리학적 유효량의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로하는 숙주에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 약리학적 유효량의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 포함하는 약학 조성물을 온혈 동물 (예를 들어, 인간, 시노몰구스 마카크, 마우스)에 투여하여, 재조합 IgE EMPD-함유 단백질로서 (예컨대, 인간 IgG1의 Fc 부분 및 인간 막-결합 IgE의 IgE EMPD, γ1-em67을 인코드하는 재조합 DNA로 형질감염된 안정한 Flp-In CHO 세포주로부터 정제된) 또는 막-결합 IgE 보유 세포 (예컨대, mIgE.FcL를 인코드하는 재조합 DNA로 형질감염된 Ramos 세포주)의 막에서, IgE EMPD 1-52 펩티드 (서열 번호: 2), IgE EMPD 1-67 단백질 (서열 번호: 1)과 교차-반응성인 매우 특이적인 항체를 유도하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약학 조성물은 IgE EMPD에 대해 지시되는 항체를 유도함으로써 IgE 매개 질환을 치료 및/또는 예방함에 사용될 수 있다. 이러한 항체는 (a) mIgE-발현 B 세포에 결합하여 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 및 세포자멸을 유도하고; (b) 혈액에서 기저 수준 IgE의 생체내 감소를 초래하고; (c) 혈액에서 항원-특이적 IgE 수준의 생체내 감소를 초래하고; 및 (d) IgE 매개 알레르기 질환을 앓고 있는 환자에서 IgE 매개 알레르기 병리를 감소 또는 제거할 수 있다.
e. 시험관내 기능 분석 및 효능 개념 연구의 생체내 증명
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들에 의해 제조된 항체들은 시험관내 기능 분석에서 사용될 수 있다. 이러한 기능 분석에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다:
(a) mIgE.FcL-발현 CHO 세포들로부터 정제된 재조합 단백질로서 IgE EMPD 1-52 펩티드 (서열 번호: 1)에 대한 시험관내 결합 (실시예 3);
(b) IgE.FcL을 인코드하는 재조합 DNA로 형질감염된 B 세포주, Ramos로부터의 막-결합 IgE 보유 세포에 대한 시험관내 결합 (실시예 3);
(c) 시험관내 항체-의존적 세포 독성 (ADCC) (실시예 6);
(d) B 림프구를 보유하는 IgE 세포자멸사의 시험관내 유도 (실시예 6);
(e) 백신접종된 숙주의 혈액에서 기저 수준 IgE의 감소를 보여줌으로써 생체내 효능 증명 (실시예 8 내지 10);
(f) 알레르겐을 공격접종하여 일차 및 추가접종시 항원-특이적 IgE 수준의 감소를 보여줌으로써 생체내 효능 증명 (실시예 8 내지 10).
본 발명에 의해, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 및 이의 제제는 IgE 매개 알레르기 질환을 앓고 있는 환자에서 IgE-매개 알레르기 병리를 감소시키거나 제거하기 위한 백신으로서 효과적으로 기능 할 수 있다.
구체예들
(1) 다음 식으로 나타내어지는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체:
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD 단편)-X
또는
(IgE EMPD 단편)-(A)n-(Th)m-X
또는
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD 단편)-(A)n-(Th)m-X
이 때
Th는 이종 보조 T 에피토프이고;
A는 이종 스페이서이고;
(IgE EMPD 단편)은 IgE EMPD의 중심 분자내 루프로부터 약 20 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프이고;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이고;
m은 1 내지 약 4이고; 그리고
n은 0 내지 약 10이다.
(2) IgE EMPD 단편이 서열 번호: 5, 6, 8 및 9로 이루어진 그룹에서 선택되는, (1)에 따른 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
(3) Th 에피토프가 서열 번호: 59-87로 이루어진 그룹에서 선택되는, (1) 또는 (2) 중 어느 하나에 따른 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
(4) 펩티드 면역원 구조체가 서열 번호: 88-95, 98-124 및 130으로 이루어진 그룹에서 선택되는, (1)에 따른 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
(5) 다음을 포함하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체:
서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 IgE EMPD 서열로부터의 약 20 내지 약 40개 아미노산 잔기를 포함하는 B 세포 에피토프;
서열 번호 59-87로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 보조 T 에피토프; 그리고
아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α,ε-N)Lys, 및 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호: 129)로 구성된 그룹에서 선택된 선택적 이종 스페이서,
여기서 B 세포 에피토프는 직접 또는 선택적 이종 스페이서를 통해 보조 T 에피토프에 공유적으로 연결된다.
(6) B 세포 에피토프가 서열 번호: 5, 6, 8, 및 9로 구성된 그룹에서 선택되는, (5)의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
(7) 보조 T 에피토프가 서열 번호: 59-87로 구성된 그룹에서 선택되는, (5)의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
(8) 선택적 이종 스페이서는 (α,ε-N)Lys 또는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호: 129)인, (5)의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
(9) 보조 T 에피토프가 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유적으로 연결된 (5)의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
(10) 보조 T 에피토프가 선택적 이종 스페이서를 통해 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유적으로 연결된 (5)의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 펩티드 면역원 구조체를 포함하는 조성물.
(12) 다음을 포함하는 약학 조성물:
a. (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 펩티드 면역원 구조체; 및
b. 약학적으로 허용되는 전달 비히클 및/또는 보조제.
(13) (12)의 약학 조성물, 이 때
a. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 서열 번호: 88-95, 98-124, 및 130으로 구성된 그룹에서 선택되고; 및
b. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되어 안정화된 면역자극 복합체를 형성함.
(14) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(15) IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 결합된 (14)에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(16) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(17) 청구항 (14) 내지 (16) 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 조성물.
사용되는 절차에 대한 자세한 설명은 다음 실시예에서 제공된다. 다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한함에 사용되어서는 안된다.
실시예 1
IgE EMPD 관련 펩티드의 합성 및 이의 제제의 제조
a. IgE EMPD 관련 펩티드의 합성
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 개발 노력에 포함되어 있었된 설계자 IgE EMPD 관련 펩티드를 합성하는 방법이 기술되어 있다. 펩티드는 혈청학적 분석, 실험실 파일럿 및 현장 연구에 유용한 소규모의 양으로, 뿐만 아니라 약학 조성물의 산업적/상업적 생산에 유용한 대규모 (킬로그램)의 양으로도 합성되었다. 효과적인 IgE 기반 알레르기 백신에 사용하기 위한 가장 최적의 펩티드 구조체의 스크리닝 및 선택을 위해 약 20 내지 70개 아미노산 길이의 서열을 갖는 IgE EMPD 관련 항원 펩티드의 대형 레퍼토리들이 설계되었다.
다양한 혈청학적 분석에서 에피토프 맵핑에 사용된, IgE EMPD 1-17 (서열 번호: 7), IgE EMPD 19-38 (서열 번호: 8), 및 다양한 10량체 펩티드 (서열 번호: 10-58)를 비롯한 대표적인 전장 IgE EMPD 1-67 (서열 번호: 1), IgE EMPD 1-52 (서열 번호: 2), 및 IgE EMPD 분절들이 표 1 (서열 번호: 1 내지 58)에 제시되어 있다.
선택된 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드들은, 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF), B 형 간염 표면 항원 단백질 (HBsAg) 인플루엔자, 클로스트리듐 테타니, 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV)를 비롯한 병원체 단백질들로부터 유래한 신중하게 설계된 보조 T 세포 (Th) 에피토프에 합성적으로 연결함으로써 표 2에 제시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들로 제조되었다 (서열 번호: 59-87). 각각의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 면역원성을 향상시키기 위해 Th 에피토프를 단일 서열 (서열 번호: 59-67 및 72-87) 또는 조합 라이브러리 (서열 번호: 68-71)에서 사용하였다.
100개가 넘는 펩티드 구조체로부터 선택된 대표적인 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 표 3에 나타낸다 (서열 번호: 88-124 및 130).
항-IgE EMPD 항체의 탐지 및/또는 측정을 위한 면역원성 연구 또는 관련된 혈청학적 시험에 사용된 모든 펩티드는 Applied BioSystems Models 430A, 431 및/또는 433의 펩티드 합성장치에 의해 F-moc 화학을 사용하여 소규모로 합성되었다. 각각의 펩타이드는 삼작용기성 아미노산의 N-말단 및 측쇄 보호 그룹에서 F-moc 보호된 고상 지지체상에서 독립적인 합성에 의해 생성되었다. 완성된 펩티드를 고체 지지체로부터 절단하고 측쇄 보호기를 90% 트리플루오로 아세트산 (TFA)에 의해 제거하였다. 정확한 아미노산 함량을 보장하기 위해 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-시간비행형-질량분석기 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-Of-Flight, MALDI-TOF) 질량 분석법에 의해 합성 펩티드 제제들을 평가하였다. 각각의 합성 펩티드를 또한 역상 HPLC (RP-HPLC)로 평가하여 제제의 합성 프로파일 및 농도를 확인하였다. 합성 공정 (커플링 효율의 단계적 모니터링 포함)의 엄격한 제어에도 불구하고, 신장 주기 동안 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 조기 종결을 비롯한 의도하지 않은 사건으로 인해 펩티드 유사체가 또한 생성되었다. 따라서, 합성된 제제는 통상적으로 표적화된 펩티드와 함께 다수의 펩티드 유사체를 포함하였다.
이러한 의도되지 않은 펩티드 유사체를 포함함에도 불구하고, 생성된 합성 펩티드 제제는 면역진단 (항체 포획 항원으로서) 및 약학적 조성물 (펩티드 면역원으로서)을 비롯한 면역학 분야에 사용하기에 적합하다. 전형적으로, 부산물 혼합물로서 합성 공정을 통해 의도적으로 설계되거나 생성된 이러한 펩티드 유사체는, 제조 공정 및 이들 펩티드를 사용한 최종 생성물의 재현성 및 효능을 보장하기 위한 생성물 평가 공정 모두를 모니터하는 엄선 QC 절차가 개발되는 한, 종종 원하는 펩티드의 정제된 제제만큼 효과적이다. 수백 내지 킬로그램 양의 대규모 펩티드 합성은 15mmol 내지 50mmol 규모로 맞춤형 자동화 펩티드 합성장치 UBI2003 등에서 수행되었다.
임상 시험을 위한 최종 약학적 조성물에 사용되는 활성 성분의 경우, IgE EMPD 관련 펩티드 구조체를 얕은 용리 농도구배하에서 분취용 RP-HPLC로 정제하고 순도 및 동일성에 관해 MALDI-TOF 질량 분석법, 아미노산 분석 및 RP-HPLC로 특성화하였다.
b. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 조성물의 제조
유중수 에멀젼 및 미네랄 염과의 현탁액을 사용한 제제들이 제조되었다. 다수의 집단이 약학 조성물을 사용하도록 하기 위해 그리고 IgE EMPD 응집의 방지가 또한 투여 목표의 일부인 경우, 안전성은 고려해야 할 또 다른 중요한 요소가 된다. 임상 시험에서 많은 약학 조성물들에 대해 인간에서 유중수 에멀젼을 사용함에도 불구하고, 명반은 그 안전성으로 인해 약학 조성물에 사용하기 위한 주요 보조제로 남아있다. 따라서, 명반 또는 이의 미네랄 염 ADJUPHOS (알루미늄 포스페이트)는 임상 적용을 위해 제재에서 보조제로 자주 사용된다.
간략하게, 아래에 기술된 각각의 연구 그룹에서 특정된 제형은 일반적으로 모든 유형의 설계자 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하였다. 먼저 100개 이상의 설계자 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 기니피그에서 면역원의 B 세포 에피토프 펩티드를 대표하는 상응하는 IgE EMPD 펩티드와의 상대적인 면역원성에 관해 그리고 다양한 상동성 펩티드들 간의 혈청학적 교차-반응성을 평가하기 위해 기니 피그에서 ELISA 분석으로 평가하였으며, 플레이트들은 서열 번호: 1-126에서 선택된 상이한 펩티드로 코팅되었다.
The IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들은 명시된 다양한 양의 펩티드 구조체들에서 (i) 인간 사용에 승인된 오일로서 Seppic Montanide™ISA 51을 사용한 유중수 에멀젼으로 제조되거나, 또는 (ii) 미네랄 염 ADJUPHOS (알루미늄 포스페이트) 또는 ALHYDROGEL (명반)과 혼합되었다. 조성물은 전형적으로 약 20 내지 800 μg/mL의 물에 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 용해시키고 Montanide™ISA 51과 함께 유중수 에멀젼으로 (1:1 부피) 또는 미네랄 염 또는 ALHYDROGEL (명반) (1:1 부피)과 함께 배합되었다. 조성물을 실온에서 약 30분 동안 유지하고 면역화 전에 약 10 내지 15초 동안 볼텍스하여 혼합하였다. 일부 동물들은 2 내지 3 용량의 특정 조성물로 면역화되었는데, 이들 용량은 0 (일차접종) 및 초기 면역화 후 3주차 (wpi) (추가접종)에, 선택적으로 2차 추가접종으로 5 또는 6 wpi에, 근육내 경로로 투여되었다. 이어서, 이들 면역화된 동물을 선택된 B 세포 에피토프 펩티드(들)로 시험하여 제제에 존재하는 다양한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 면역원성 및 관련 표적 펩티드 또는 단백질과의 교차 반응성을 평가하였다. 이어서 기니 피그의 초기 스크리닝에서 강력한 면역원성을 갖는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 예방 접종 프로토콜에 지시된 바와 같이 특정 기간에 걸친 투약 요법에 관하여 영장류에서 유증수 에멀젼, 미네랄 염 및 명반-기반 제제 모두에서 추가로 시험하였다.
IgE 매개 질환이 있는 환자들에서 신약 연구 분야 및 임상 시험 제출을 위한 준비에 있어서 GLP 유도 전임상 연구에 면역원성, 지속 기간, 독성 및 효능 연구에 관한 최종 제제에 포함되기 전에 가장 유망한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들만 추가로 광범위하게 평가되었다.
실시예 2
혈청학적 분석 및 시약
합성 펩티드 구조체 및 이의 제제의 기능적 면역원성을 평가하기 위한 혈청학적 분석 및 시약이 아래 상세히 기재되어 있다.
a. 항체 특이성 분석을위한 IgE EMPD 1-52, IgE EMPD 1-39, IgE EMPD 1-17, IgE EMPD 19-38, IgE EMPD 7-40 펩티드-기반 ELISA 시험
다음 실시예들에 기재된 면역 혈청 시료를 평가하기 위한 ELISA 분석법을 개발하고 아래에 기재하였다. 96-웰 플레이트의 웰들을 pH 9.5 (달리 언급되지 않는 한)의 10mM NaHCO3 완충제 중에서의 2μg/mL (달리 언급되지 않는 한)에서 100μL의 표적 펩티드 IgE EMPD 1-52, IgE EMPD 1-39, IgE EMPD 1-17, IgE EMPD 19-38, IgE EMPD 7-40 펩티드 등 (예를 들어, 서열 번호: 2 및 5 내지 8)으로 37 ℃에서 1 시간 동안 개별적으로 코팅 하였다.
펩티드-코팅된 웰을 37 ℃에서 1 시간 동안 PBS 중 3 중량%의 젤라틴 250 μL와 함께 배양하여 비특이적 단백질 결합 부위를 차단한 다음 0.05 부피%의 TWEEN®20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고 건조시켰다. 분석하고자 하는 혈청을 20 부피% 정상 염소 혈청, 1 중량% 젤라틴 및 0.05 부피% TWEEN®20을 함유하는 PBS로 1:20 (달리 언급되지 않는 한)으로 희석하였다. 희석된 표본들 (예를 들어, 혈청, 혈장) 백 마이크로리터 (100 μL)를 각 웰들에 첨가하고 37 ℃에서 60분 동안 반응시켰다. 이어서, 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 PBS 중의 0.05 부피% TWEEN®20으로 웰들을 6회 세척하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-접합시킨 종들 (예컨대, 마우스, 기니 피그 또는 인간) 특이적 염소 항-IgG, IgA 또는 IgM을, 양성 웰에서 형성된 항체/펩티드 항원 복합체와 결합하는 표지된 추적자로서 사용하였다. 사전-적정된 최적 희석액에서 및 PBS 중 0.05 부피% TWEEN®20이 있는 1% 부피의 정상 염소 혈청에서, 퍼옥시다제-표지된 염소 항-IgG 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 37 °C에서 추가 30분 동안 배양하였다. 웰들을 PBS 중 0.05 부피% TWEEN®20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 시트르산 나트륨 완충제 중에서의 0.04 중량%의 3', 3', 5', 5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 및 0.12 부피% 과산화수소를 함유하는 100 μL의 기질 혼합물과 추가 15분 동안 반응시켰다. 이 기질 혼합물을 사용하여 착색된 생성물을 형성함으로써 퍼옥시다제 표지를 탐지하였다. 100 μL의 1.0M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시키고 450 nm에서의 흡광도 (A450)를 측정하였다. 다양한 IgE EMPD 펩티드 백신 제제를 제공받은 백신접종된 동물의 항체 역가를 결정하기 위해, 1:100 내지 1:10,000의 10-배 연속 혈청 희석액 또는 1:100 내지 1:4.19x108의 4-배 연속 혈청 희석액을 시험하고, Log10으로 표현되는 시험된 혈청의 역가를 A450의 선형 회귀 분석으로 계산하였으며, 컷오프 A450은 0.5로 설정되었다.
b. Th 펩티드 기반 ELISA 시험에 의한 Th 펩티드에 대한 항체 반응성 평가
96-웰 ELISA 플레이트들의 웰을 유사한 ELISA 방법으로 그리고 상기 실시된 바와 같이, pH 9.5 (달리 명시되지 않는 한)의 10mM NaHCO3 완충액에서의 2 μg/mL (달리 명시되지 않는 한)의 100 μL Th 펩티드로 37 ℃에서 1 시간 동안 개별적으로 코팅하였다. 다양한 IgE EMPD 펩티드 백신 제제를 제공받은 백신접종된 동물의 항체 역가를 결정하기 위해, 1:100 내지 1:10,000의 10-배 연속 혈청 희석액을 시험하고, Log10으로 표현되는 시험된 혈청의 역가를 A450의 선형 회귀 분석으로 계산하였으며, 컷오프 A450은 0.5로 설정되었다.
c. B 세포 에피토프 클러스터 10량체 펩티드-기반 ELISA 시험에 의한 IgE EMPD 및 IgE CH4 (막에 대한 인간 IgE CH4)에 대한 미세 특이성 분석 평가 및 에피토프 맵핑
면역화된 숙주에서 항-IgE EMPD 항체의 미세 특이성 분석을 에피토프 맵핑으로 결정하였다. 요약하면, 상기 기재한 항체 ELISA 방법의 단계들에 따라 96-웰 플레이트들의 웰들을 웰 당 0.1mL 당 0.5 μg의 개별적인 IgE EMPD 10량체 펩티드 (서열 번호: 10 내지 58)로 코팅한 다음 then 100 μL 혈청 시료들 (PBS에서 1:100 희석액)을 10량체 플레이트 웰들에서 2회 배양하였다. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프 및 면역화된 숙주의 면역 혈청으로부터의 항-IgE EMPD 항체의 미세 특이성 분석을 스페이서 또는 Th 서열없는 상응하는 IgE EMPD 1-52 펩티드 (서열 번호: 1)로, 또는 추가 반응성 및 특이성 확인을 위해 비 관련 대조군 펩티드로 시험하였다.
d. 면역원성 평가
동물 또는 인간 대상체 또는 동물로부터의 사전면역 및 면역 혈청 시료들을 실험 백신접종 프로토콜에 따라 수집하고 혈청 보체 인자를 불활성화시키기 위해 56℃에서 30분 동안 가열하였다. 백신 제제들의 투여 후, 프로토콜에 따라 혈액 시료를 수득하고, 특정 표적 부위 (들)에 대한 이들의 면역원성을 평가하였다. 연속 희석된 혈청들을 시험하고 양성 역가를 역 희석의 Log10으로 표현하였다. 특정 백신 제제의 면역원성은, 표적 항원 내에서 원하는 B 세포 에피토프 서열에 대해 지시되는 높은 역가의 항체를 유도하는 반면, 사용되는 보조 T 세포 에피토프 서열에 대해 낮은 내지 무시할 수있는 항체 반응성을 유지하여 원하는 B 세포 반응 향상을 제공하는 능력에 의해 평가되었다.
e. 마우스 혈청에서 인간 IgE 수준의 평가를위한 면역분석
huIGHE 녹인 마우스에서의 인간 IgE 수준을 포획 항체로서 항-인간 IgE, HP6061 (Abcam) 및 탐지 항체로서 비오틴-표지된 항-인간 IgE, HP6029 (Abcam)를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 간단히 말하면, HP6061은 코팅 완충제 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에서 100 ng/웰로 96-웰 플레이트에 고정되었으며 4℃에서 밤새 배양되었다. 코팅된 웰들을 실온에서 1시간 동안 200 μL/웰의 분석 희석액 (PBS 중에서 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 0.02% ProClin 300)으로 차단시켰다. 플레이트들을 200 μL/웰의 세척 완충액 (0.05% Tween-20이 있는 PBS)로 3회 세척하였다. 정제된 U266 IgE를 사용하여 5% 마우스 혈청의 분석 희석액에서 표준 곡선 (2배 연속 희석으로 0 내지 800 ng/mL 범위)을 생성하였다. 희석된 혈청 (1:20) 및 표준 50 μL를 코팅된 웰에 첨가하였다. 배양을 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 모든 웰들을 흡인하고 200 μL/웰의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 포획된 인간 IgE를 실온에서 1시간 동안 100 μL의 탐지 항체 용액 (분석 희석액 중 50 ng/ml의 비오틴 표지 HP6029)과 함께 배양하였다. 이어서, 결합된 비오틴-HP6029를 스트렙타비딘 폴리-HRP (1:10,000 희석, Thermo Pierce)를 사용하여 1시간 동안 (100 μL/웰) 탐지하였다. 모든 웰들을 흡인하고 200 μL/웰의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 마지막으로, 웰들은 100 μL/웰의 NeA-Blue TMB 기질 (Clinical Scientific Products)에 의해 전개되었고 100 μL/웰의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 4개 파라미터 로지스틱 곡선-적합을 생성하는 SoftMax Pro 소프트웨어 (Molecular Devices)를 사용하여 표준 곡선을 생성하고 시험된 시료들 모두에서 IgE의 농도를 계산하는데 사용되었다. Prism 소프트웨어를 사용하는 스튜던트 t 검정을 사용하여 데이터를 비교하였다.
f. 마우스 혈청에서 파파인 특이적 IgE 수준의 평가를 위한 면역분석
huIGHE 녹인 마우스에서 발달된 파파인-특이적 IgE는 코팅 물질로서 파파인을 사용하고 탐지 항체로서 비오틴-표지된 항-인간 IgE, HP6029 (Abcam)를 사용하여 직접 ELISA에 의해 측정되었다. 간단히 말하면, 파파인은 코팅 완충제 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에서 500 ng/웰로 96-웰 플레이트에 고정되었으며 4℃에서 밤새 배양되었다. 코팅된 웰들을 실온에서 1시간 동안 200 μL/웰의 분석 희석액 (PBS 중에서 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 0.02% ProClin 300)으로 차단시켰다. 플레이트들을 200 μL/웰의 세척 완충액 (0.05% Tween-20이 있는 PBS)로 3회 세척하였다. 모노클로날 인간 키메라 파파인-특이적 IgE (AllerMAbs Co., Ltd.)를 사용하여 10% 마우스 혈청의 분석 희석제에서 표준 곡선 (2배 연속 희석에 의해 0 내지 30 ng/mL 범위)을 생성하였다. 희석된 혈청 (1:10) 및 표준 50 μL를 코팅된 웰에 첨가하였다. 배양을 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 모든 웰들을 흡인하고 200 μL/웰의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 포획된 인간 IgE를 실온에서 1시간 동안 100 μL의 탐지 항체 용액 (분석 희석액 중 50 ng/ml의 비오틴 표지 HP6029)과 함께 배양하였다. 이어서, 결합된 비오틴-HP6029를 스트렙타비딘 폴리-HRP (1:10,000 희석, Thermo Pierce)를 사용하여 1시간 동안 (100 μL/웰) 탐지하였다. 모든 웰들을 흡인하고 200 μL/웰의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 마지막으로, 웰들은 100 μL/웰의 NeA-Blue TMB 기질 (Clinical Science Products)에 의해 전개되었고 100 μL/웰의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 4개 파라미터 로지스틱 곡선-적합을 생성하는 SoftMax Pro 소프트웨어 (Molecular Devices)를 사용하여 표준 곡선을 생성하고 시험된 시료들 모두에서 파파인-특이적 IgE의 농도를 계산하는데 사용되었다. Prism 소프트웨어를 사용하는 스튜던트 t 검정을 사용하여 데이터를 비교하였다.
g. 마카크 원숭이 혈청에서 IgE 수준의 평가를 위한 면역분석
포획 항체로 인간 IgE, MB10-5C4 (Miltenyi Biotec) 및 탐지 항체로 비오틴-표지된 폴리클로날 항-마카크 IgE (Alpha Diagnostic International Inc.)를 사용하여 시노몰구스 마카크 원숭이에서 마카크 IgE 수준을 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 간단히 말하면, MB10-5C4는 코팅 완충제 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에서 100 ng/웰로 96-웰 플레이트에 고정되었으며 4℃에서 밤새 배양되었다. 코팅된 웰들을 실온에서 1시간 동안 200 μL/웰의 분석 희석액 (PBS 중에서 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 0.02% ProClin 300)으로 차단시켰다. 플레이트들을 200 μL/웰의 세척 완충액 (0.05% Tween-20이 있는 PBS)로 3회 세척하였다. 정제된 마카크 IgE를 사용하여 10% 마카크 혈청이 있는 분석 희석액에서 표준 곡선 (2-배 연속 희석에 의해 0 내지 10,000 ng/mL 범위)을 생성하였다. 희석된 혈청 (1:10) 및 표준 100 μL를 코팅된 웰에 첨가하였다. 배양을 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 모든 웰들을 흡인하고 200 μL/웰의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 포획된 인간 IgE를 실온에서 1시간 동안 100 μL의 탐지 항체 용액 (분석 희석액 중 50 ng/ml의 비오틴 표지 HP6029)과 함께 배양하였다. 이어서, 결합된 비오틴-HP6029를 스트렙타비딘 폴리-HRP (1:10,000 희석, Thermo Pierce)를 사용하여 1시간 동안 (100 μL/웰) 탐지하였다. 모든 웰들을 흡인하고 200 μL/웰의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 마지막으로, 웰들은 100 μL/웰의 NeA-Blue TMB 기질 (Clinical Science Products)에 의해 전개되었고 100 μL/웰의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 4개 파라미터 로지스틱 곡선-적합을 생성하는 SoftMax Pro 소프트웨어 (Molecular Devices)를 사용하여 표준 곡선을 생성하고 시험된 시료들 모두에서 IgE의 농도를 계산하는데 사용되었다. Prism 소프트웨어를 사용하는 스튜던트 t 검정을 사용하여 데이터를 비교하였다.
실시예 3
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들 및 이의 제제들에 의해 동물에서 유도되는 항체들의 기능성 평가
면역화된 숙주로부터의 면역 혈청 또는 정제된 항-IgE EMPD 항체들은 mIgE.FcL (EMPD를 포함하는 CM에 CH2) 또는 mIgE.FcS (EMPD 없는 CM에 대한 CH2)를 인코드하는 재조합 DNA로 형질감염된 Ramos 세포주들 및 재조합 가용성 IgE EMPD 단백질에 결합하는 이들의 능력에 대해 시험하였다.
a. 세포
Ramos 세포주는 미국 표준 균주 (ATCC, Manassas, VA)로부터 구입하여 10% 열-불 활성화 FBS (Invitrogen), 4mM L-글루타민, 25mM HEPES 및 1mM 피루브산 나트륨 (Invitrogen; 완전 RPMI 배지)을 보충한 RPMI 1640 매지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 성장시켰다. Ramos 세포들을 mIgE.FcL. 또는 mIgE.FcS를 인코드하는 재조합 DNA로 형질감염시켰다. mIgE.FcL을 발현하는 Ramos 세포를 EMPD를 비롯하여 CH2로부터 세포질 펩티드에 이르는 mIgE ε사슬의 긴 아이소형의 분절을 인코드하는 DNA 분절들로 형질감염시켰다. mIgE.FcS을 발현하는 Ramos 세포를 EMPD를 제외하고 CH2로부터 세포질 펩티드에 이르는 mIgE ε사슬의 짧은 또는 통상적인 아이소형의 분절을 인코드하는 DNA 분절들로 형질감염시켰다. mIgE.FcL 또는 mIgE.FcS를 발현하는 Ramos 세포의 안정한 형질감염체를 400 mg/ml 제오신 (Invitrogen)이 보충된 완전한 RMPI 1640 배지에서 유지시켰다.
b. ELISA 시험을 위한 가용성 재조합 IgE EMPD 단백질의 제조
가용성 재조합 IgE EMPD 단백질을 발현하는 Flp-In CHO 세포를 인간 IgG1의 Fc 부분 및 인간 막-결합 IgE의 IgE EMPD, γ1-em67을 인코드하는 DNA 분절로 형질감염시켰다. 안정한 Flp-In CHO 형질감염체는 10% 열-불활성화 FBS (Invitrogen), 4mM L-글루타민, 25mM HEPES 및 1mM 피루브산 나트륨 (Invitrogen; 완전 IMDM 배지)가 보충된 IMDM 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 유지되었다. γ1-em67 단백질은 제조업체의 지시에 따라 단백질 A 세파로스 (GE Healthcare)를 사용하여 배양 배지로부터 정제되었다.
c. 면역 혈청으로부터 폴리클로날 항체들의 정제
다양한 면역 혈청으로부터의 폴리클로날 IgG는 제조업체의 지시에 따라 단백질 A 세파로스 (GE Healthcare)를 사용하여 배양 배지로부터 정제되었다.
d. B 세포 상에서 가용성 IgE EMPD 단백질 또는 mIgE.Fc L 에 대한 폴리클로날 항체의 결합
각각의 면역화된 동물로부터의 정제된 폴리클로날 항체를 (a) ELISA에 의해 재조합 γ1-em67 단백질 (상기 기재)에, 또는 (b) 형광 유세포 분석에 의해 mIgE.FcL을 발현하는 Ramos 세포에 결합하는 이들의 상대적 활성에 대해 조사하였다. 96-웰 마이크로플레이트는 Nalge NUNC International사의 것으로서, 광학 판독용은 평평한 바닥 (카탈로그 번호. 442404)이고 세포 배양용은 V형 바닥 (카탈로그 번호 249570)이었다. VersaMax 마이크로 플레이트 판독기 (Molecular Devices)에서 광학 밀도를 판독하였다. 형광 염색기는 BD FACSCanto II 세포측정기 (DB Biosciences)에 의해 탐지되었으며; 생성된 데이터는 관련 FACSDiva 소프트웨어에 의해 수집되었다. ELISA & FACS로부터 얻은 결합 데이터를 정량 분석을 위해 Prism 6 소프트웨어에 입력하였다. 보다 구체적으로, V-바닥 마이크로플레이트에, 웰 당 0.1 mL 중 2 x 105개 세포의 분취액을 첨가하고, 원심분리하고, 액체를 폐기하였다. 세포들을 다양한 농도의 100 μL 항체 시료 분취량과 함께 얼음에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포를 1회 세척하고, 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 100 μL의 염소 F(ab)2 항-종 특이적 IgG Fc-FITC (250 ng/mL)와 함께 얼음에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 1회 세척하고 원심분리 후 액체를 폐기하였다. 각각의 웰에, 200 mL의 결합 완충액 분취액을 첨가하고 유세포 분석을 위해 마이크로희석 튜브로 옮겼다. 시료 당 10,000개 세포의 유입에 기초하여 결합 강도 (형광 강도의 기하학적 평균, GeoMFI)를 FACS에서 판독하였다.
e. 세포자멸 분석
mIgE.FcL (5 x 105 세포/mL)를 안정하게 발현하는 Ramos 세포들을 37 °C에서 1시간 동안 완전 RPMI 1640 배지에서 정제된 면역 또는 대조 항체와 함께 배양하였다. 이어서 세포를 10 μg/mL의 최종 농도에서 기니 피그 IgG의 Fc에 특이적인 이차 항체, 염소 F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)로 처리하고 37˚에서 추가 24시간 동안 배양하였다. 세포들의 세포자멸 정도를 다음과 같은 방식으로 분석하였다. 아넥신 V에 의한 분석의 경우, 세포를 실온의 암실에서 15분 동안 염색 용액에 재현탁시킴으로써 포스파티딜세린 (PS) 노출을 측정하였다. 염색 용액은 1/200으로 희석시킨 FITC-표지된 아넥신 V (Biovision, Mountain View, CA), 10 mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 140 mM NaCl, 및 5 mM CaCl2를 보유한 완충액 중의 2.5 μg/ml 프로피디움 아이오다이드 (PI)를 함유하였다. 염색된 세포들을 FACSCanto II 유세포 측정기 (BD Biosciences, San Jose, CA)에서 분석하였다. 아넥신 V-양성 및 PI-음성으로 정의되는 세포자멸 세포들의 백분율을 점그래프 분석으로 수득하였다.
f. 항체-의존적 세포독성 분석 (ADCC)
RBC 용해 완충액 (Thermo Fisher Scientific Inc.)을 사용하여 적혈구의 저장성 쇼크를 반복함으로써 Balb/c 마우스의 비장 (암컷, 6-8 주령)으로부터 비장 림프구를 분리하였다. 적혈구를 제거한 후, 비장 림프구를 50 μM 2-ME 및 100 U/mL 재조합 인간 IL-2 (PeproTech, Inc)가 보충된 완전 RPMI 배지에서 3 x 106개 세포/mL에서 3일 동안 배양하였다. mIgE.FcL (표적 세포)을 발현하는 Ramos 세포는 37℃에서 10분 동안 PBS/0.1 % BSA에서 CFSE (Invitrogen)로 표지되었다. 냉온 완전 RPMI 1640 배지로 3회 세척 후, 세포들을 105 세포/mL로 조정하였다. 200 μl의 완전한 RPMI 배지에서 표지된 세포 20,000개의 분취액을 37 °C에서 30분 동안 10 μg/mL의 상응하는 면역 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 IgG 항체로 코팅한 다음, IL-2 활성화된 비장 림프구 (이펙터 세포)와 30의 E/T 비율로 조합하였다. 24시간 배양 후, 총 세포들을 얼음에서 15분 동안 2.5 μg/mL 에서 7 아미노 액티노마이신 D (7-AAD, Invitrogen)로 염색한 다음, Becton Dickinson FACS Canto II 유세포 분석기 (BD Biosciences)에서 분석하였다. 살아있는 표적 세포는 점-그래프 분석에서 CFSE-양성 및 7-AAD-음성으로 정의되었다. 주어진 E/T 비율에서 용해된 표적 세포의 백분율은 다음과 같았다: 100 x [(항체-독립적 대조군에서 살아있는 표적 세포의 백분율-시료에서 살아있는 표적 세포의 백분율) / 항체-독립적 대조군에서의 살아있는 표적 세포의 백분율].
실시예 4
안전성, 면역원성, 독성 및 효능 연구에 사용되는 동물
a. 기니 피그:
면역원성 연구는 성숙한 나이브 성체 수컷 및 암컷 Duncan-Hartley 기니 피그 (300-350 g/BW)에서 수행되었다. 실험은 그룹 당 적어도 3 마리의 기니 피그를 사용했다. Duncan-Hartley 기니 피그 (8-12주령, Covance Research Laboratories, Denver, PA, USA)와 관련된 프로토콜은 계약된 동물 시설과 후원자로서 United Biomedical, Inc. (UBI)에서 승인된 IACUC 적용하에 수행되었다.
b. 시노몰구스 마카크:
성체 수컷 및 암컷 원숭이 (Macaca fascicularis, 약 4년령; Joinn Laboratories, Suzhou, 중국)의 면역원성 및 반복 투약 독성 연구는 계약된 동물 시설과 후원자로 UBI에서 승인된 IACUC 적용하에 수행되었다.
c. hIGHE 녹인 마우스:
C57BL/B6 유전자 배경에서 상동성 유전자 표적화에 의해 IGHG1 유전자가 인간 IGHE 유전자로 대체된 마우스 균주는 인간 분비 및 막-결합 IgE를 발현한다 (Lu, 외, 2015). hIGHE 마우스는 뮤린 IGHG1 전사 요소의 조절 제어하에 인간 IgE를 발현하고 인간 조절 요소의 대안적인 RNA 스플라이싱을 통해 인간 막-결합 IgE를 발현한다. 혈청 IgE는 순환계에서 8 내지 10주령 만큼 조기에 탐지되었다. 혼합 hIGHE x Balb/c 그라운드 (10~12주령)의 어린 새끼들을 일차/기억 면역 반응의 예방 모델 및 감작화/리콜 면역 반응의 치료 모델에 사용하였다. 두 연구는 계약된 동물 시설 (대만 국립 보건 연구소)과 후원자인 UBI에서 승인된 IACUC 적용하에 수행되었다.
16주 기간에 걸친 근육내 백신접종의 효과는 혈청 인간 IgE의 ELISA 분석에 의한 항체 반응에서 그리고 항원 공격접종시 혈청 총 IgE 및 항원-특이적 IgE의 수준 감소 증거에서 관찰되었다.
면역화 전에, 본 실시예에서 상기 기재된 방법에 따라 개별 동물로부터의 혈청 시료를 혈청 인간 IgE의 존재에 대해 시험하였다. 각각의 동물을 종 및 프로토콜에 따라 백신 제제 용량 당 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체로 면역화시켰다.
실시예 5
최종 제품 선택을 위해 기니 피그, 유전자삽입 녹인 마우스 및 시노몰구스 마카크 원숭이에서 IgE EMPD 펩티드 구조체들의 면역원성을 평가하기 위한 백신 제제
각 실험에 사용되는 약학 조성물 및 백신 제제는 아래에 보다 상세하게 기재되어 있다. 요약하면, 각 연구 그룹들에서 특정된 제제들은 일반적으로 상이한 유형의 스페이서들 (예컨대, 펩티드 구조체의 용해성을 향상시키기 위한 εK 또는 KKK)에 의해 연결된 IgE EMPD 펩티드 분절 및 설계자 펩티드 구조체들의 N-말단에 연결된 IgE EMPD 펩티드 분절(들)을 가지는 홍역 바이러스 융합 단백질 및 B형 간염 표면 항원으로부터 유래된 2 세트의 인공 보조 T 에피토프를 비롯한 무차별 보조 T 세포 에피토프의 변이체를 가지는 모든 유형들의 설계자 IgE EMPD 펩티드 구조체들을 함유하였다. 100개가 넘는 설계자 IgE EMPD 펩타이드 구조체를 먼저 기니 피그에서 IgE EMPD 1-52와의 상대적 면역원성에 대해 그리고 추가로 IgE 보유 B 세포 (Ramos 세포주)에서 막 IgE와의 교차 반응성에 대해 평가 하였다. IgE EMPD 펩티드 구조체들은 명시된 다양한 양의 펩티드 구조체들에서 인간 백신 사용에 승인된 오일로서 Seppic Montanide™ISA 51을 사용한 유중수 에멀젼으로 제조되거나, 또는 미네랄 염 ADJUPHOS 또는 ALHYDROGEL (명반)과 혼합되었다. 백신들은 통상적으로 약 20 내지 800 mg/mL의 물에 IgE EMPD 펩티드 구조체를 용해시키고 Montanide™ISA 51과 함께 유중수 에멀젼으로 (1:1 부피) 또는 미네랄 염 ADJUPHOS 또는 ALHYDROGEL (명반) (1:1 부피)과 함께 배합되었다. 백신 제제들을 실온에서 약 30분 동안 유지하고 면역화 전에 약 10 내지 15초 동안 볼텍스하여 혼합하였다.
동물들은 2 내지 3 용량의 특정 백신 제제로 면역화되었는데, 이들 용량은 0 (일차접종) 및 초기 면역화 후 3주차 (wpi) (추가접종)에, 선택적으로 2차 추가접종으로 5 또는 6 wpi에, 근육내 경로로 투여되었다. 이어서, 백신 제제에 존재하는 다양한 합성 IgE EMPD 펩티드 면역원의 면역원성 및 IgE EMPD 1-52와 이들의 교차 반응성을 평가하기 위해 이들 면역화된 동물을 시험하였다. 이어서 기니 피그의 초기 스크리닝에서 강력한 면역원성을 갖는 IgE EMPD 펩티드 면역원들을 예방 접종 프로토콜에 지시된 바와 같이 특정 기간에 걸친 투약 요법에 관하여 마카크 원숭이에서 유증수 에멀젼, 미네랄 염 및 명반-기반 제제 모두에서 추가로 시험하였다.
IgE 매개 알레르기 질환이 있는 환자들에서 신약 연구 분야 및 임상 시험 제출을 위한 준비에 있어서 GLP 유도 전임상 연구에 면역원성, 지속 기간, 독성 및 효능 연구에 관한 최종 제제에 포함되기 전에, 가장 유망한 IgE EMPD 펩티드 면역원 후보물만이, ADCC를 매개하는 면역 혈청들의 능력, mIgE 보유 B 세포들의 세포자멸, 그리고, 유전자삽입 녹인 마우스 및 마카크 원숭이에서 자기 IgE EMPD 항원과 동일한 종들에서 내성을 파괴시키는 능력에 관해 광범위하게 추가 평가되었다.
실시예 6
IgE 매개 알레르기 질환의 치료를 위해 IgE EMPD 1-39 펩티드 면역원 구조체들를 혼입시킨 다-성분 백신 제제들의 설계 이론적 근거, 스크리닝, 검증, 기능적 성질의 평가, 및 최적화
도 2A 및 2B는 IgE EMPD를 표적화함에 의한 mIgE B 세포의 고갈에 대한 이론적 근거를 예시한다. IgE는 분비 IgE 및 막-결합 IgE (mIgE)의 두 가지 형태 (각각 왼쪽 및 오른쪽, 도 2A)로 발현된다. 분비 IgE는 FcRI를 통해 호염기구 및 비만 세포의 세포 표면에서 포획되는 반면, mIgE는 B 세포 수용체 (BCR)의 일부로서 IgE-결정된 B 세포에 배타적으로 존재한다. mIgE의 세포외 막 근위 도메인 (EMPD)은 CH4 도메인과 막경유 영역 사이의 67개 아미노산 펩티드 분절 (서열 번호 1)이며, mIgE B 세포에서만 발견된다. IgE EMPD의 특유성은 mIgE 보유 B 세포를 표적하기에 좋은 부위를 제공하였다. IgE EMPD를 표적함에 의한 mIgE B 세포의 고갈은 새로운 IgE-분비 형질 세포로 분화되기 전에 알레르겐-특이적 IgE 생산을 억제 할 수있게 한다 (도 2B). 수명이 제한된 기존의 IgE 분비 혈장 세포는 점차 사멸하여, 총 알레르겐-특이적 IgE가 점차 감소하게 될 것이다.
도 3은 본원에 개시된 특정 구체예에 따른 백신 제제의 발견에서 상업화 (산업화)까지의 개발 과정을 보여주는 흐름도이다. 본 발명은 이 도면에 요약된 바와 같이, 펩티드 면역원 설계, 펩티드 조성물 설계, 백신 제제 설계, 시험관내 기능적 항원성 설계, 생체내 면역원성 및 효능 연구 설계, 및 임상 프로토콜 설계를 포함한다. 각각의 단계의 상세한 평가는 놀랍게도 일련의 실험으로 이어지며, 그 결과 안전하고 효과적인 백신 제제의 상업화를 가져온다.
상기 단계들에 대한 일반적인 요약은 다음과 같다:
a. 설계 과정
각각의 펩티드 면역원 구조체 또는 면역 치료제 제품은 그 특이적 질환 메커니즘 및 개입에 필요한 표적 단백질 (들)에 기초하여 자체적 설계 초점 및 접근법을 필요로 한다. 설계들이 모델링되는 표적은 질환 경로에 관여하는 세포 단백질 또는 병원체로부터의 몇몇 단백질이 관여 할 수있는 감염원을 포함 할 수 있다. 연구에서 상업화까지의 과정은 매우 길며 상업화까지 일반적으로 십수년이 필요하다.
대상 분자가 선택되면 광범위한 혈청학적 검증 과정이 필요하다. 개입 대상인 분자 내부에서 B 세포 및 T 세포 에피토프 및 기능적 부위 (들)의 검증은 면역원 구조체 설계에 중요하다. 표적 B 세포 에피토프가 인식되면, 다양한 보조 T 지지체 (담체 단백질 또는 적합한 보조 T 펩티드)를 포함하는 작은 동물에서 연속적인 파일럿 면역원성 연구를 수행하여 설계자 펩티드의 약학 조성물에 의해 유도된 항체의 기능적 성질을 평가한다. 이어서 유도된 항체의 면역원성 및 기능적 성질을 추가 검증하기 위해 표적 종의 동물에서 이러한 혈청학적 적용이 수행된다. 모든 연구는 평가를 위해 면역화된 숙주로부터 수집된 혈청을 갖는 다수의 병렬 그룹에서 수행된다. 또한 인간 약학 조성물의 경우 표적 종 또는 비인간 영장류에서의 초기 면역 원성 연구가 면역원성 및 설계 방향을 추가 검증하기 위해 수행된다. 이어서 표적 펩티드들을 다양한 혼합물로 제조하고, 각각의 제제 설계를 제조하기 위해 조합하여 사용될 경우 펩티드 구조체들 간의 각각의 상호작용에 관련된 기능적 성질에 있어서의 미묘한 차이를 평가한다. 추가 평가 후, 제제들의 각 물리적 매개변수에 따라 최종 펩티드 구조체, 펩티드 조성물 및 이의 제제가 확립되고, 이는 최종 생성물 개발 과정으로 이어진다.
b. IgE 매개 알레르기 질환 환자를 치료할 수 있는 약학 조성물을 위한 IgE EMPD 유래 펩티드 면역원 구조체의 설계 및 검증
약학 조성물에 포함시키기위한 가장 강력한 펩티드 구조체를 생성하기 위해, IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드 (서열 번호: 5-8) (표 1) 및 추가 설계된 다양한 병원체로부터 유래한 무차별 보조 T 에피토프 또는 인공 보조 T 에피토프 (서열 번호: 59-87) (표 2)의 대형 레퍼토리를 기니 피그에서 면역원성 연구를 위한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들로 제조하였다.
i) 면역원 디자인을위한 표적 영역으로서 IgE EMPD G1-H40의 선택.
IgE는 분비 IgE 및 막-결합 IgE (mIgE)의 두 가지 형태로 발현된다. 분비 IgE는 FcRI를 통해 호염기구 및 비만 세포의 세포 표면에서 포획되는 반면, mIgE는 B 세포 수용체 (BCR)의 일부로서 IgE-결정된 B 세포에 배타적으로 존재한다. mIgE의 전장 세포외 막 근위 도메인 (EMPD)은 CH4 도메인과 막경유 영역 사이의 67개 아미노산 펩티드 분절 (서열 번호 1)이며, mIgE B 세포에서만 발견된다. 수명이 제한된 기존의 IgE 분비 혈장 세포는 점차 사멸하여, 총 알레르겐-특이적 IgE가 점차 감소하게 될 것이다. 표 4에 제시된 바와 같이, 기니 피그에서의 면역원성에 관해 시험된 많은 펩티드 면역원 구조체들 중에서, 플레이트 코팅을 위해 IgE EMPD 1-39 (서열 번호: 5) 펩티드를 사용하고, IgE EMPD 1-52 (서열 번호: 2)로부터 유래한 대표적인 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드 그리고 기니 피그에서의 면역원성 시험을 위한 대표적인 Th 에피토프 펩티드 UBITh®(서열 번호: 72)를 포함시켜서 일련의 IgE EMPD 유래된 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 88-93)로부터 데이터를 만들었다. 3가지 배향을 가지는 6개 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들에서 높은 면역원성이 발견되었는데, 이 구조체들에서 UBITh®Th 에피토프 펩티드는 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드의 C-말단 (서열 번호: 88 및 91) 또는 N-말단에서 (서열 번호: 89, 90, 및 92) 또는 C- 및 N 말단 모두에서 (서열 번호: 93) 스페이서 링커 εK로 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드에 연결되어 있었다. 또한 구조체 설계 (예를 들어, 서열 번호: 94-97)에서 높은 면역원성을 가능하게 하기 위하여 더 긴 링커 εK-KKK (서열 번호: 129)를 함유하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 사용하였다.
IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드 (서열 번호: 7 및 8)의 보다 짧은 단편들은 또한 면역원성을 위해 보조 T 에피토프 펩티드, 가령, UBITh®로 강화되었다 (각각, 서열 번호: 96 및 97). 그러나, 이들 구조체들은 표 5에 나타낸 바와 같이 IgE EMPD에 대한 약한 결합 능력을 갖는 항체를 유도하였다 (예를 들어, 서열 번호: 5, 6, 7, 및 8을 갖는 더 긴 단편의 경우). 서열 번호: 96 및 97의 구조체들은 또한 선형 에피토프 맵핑 연구에 의해 나타난 바와 같이 매우 제한된 결합 프로파일을 갖는 항체를 유도하였으며, 이 때, 각각 서열 번호: 25 (아미노산 8-17) 및 서열 번호: 39 (아미노산 22-31)의 10량체 펩티드만이 반응성인 것으로 밝혀졌다. 또한, 서열 번호: 96 및 97의 구조체들의 유도 항체는 mIgE-B 세포 세포자멸 유도를 위한 전제조건인 최소의 mIgE-B 세포 결합 효과 (도 6C에 도시됨)를 가짐이 밝혀졌다.
ii) 병원체로부터 유래된 이종 보조 T 에피토프들의 순위결정 및 선택된 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드의 면역원성을 향상시키기 위한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들 설계에 있어서 이들의 혼입.
표 2는 B 세포 에피토프 면역원성을 향상시키기 위해 마우스, 랫트, 기니 피그, 개코 원숭이, 마카크 원숭이 등 다수종에서 상대 효능에 대해 시험한 총 29개의 이종 Th 에피토프 (서열 번호: 59-87)를 열거한다.
기니 피그에서의 면역원성 연구를 위해 개개의 무차별 보조 T 에피토프들 (서열 번호: 88, 98-124, 및 130)과 ε스페이서를 통해 연결된 IgE EMPD 1-39 B 세포 에피토프 펩티드 (서열 번호: 5)를 함유하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들에 관한 대표적인 연구를 수행하고, 표 6에 나타난 바와 같이 각각의 이종 보조 T 에피토프들의 상대 효능을 순위결정하였다. 일부 Th 에피토프의 높은 B-에피토프 향상 능력으로 인해, 기니 피그의 단회 면역화 후 초기 면역화 후 3주차 (3wpi)에 얻은 결과를 사용하여 29개의 상이한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들의 순위를 결정하였다. 모든 선택된 Th 에피토프가 IgE EMPD B-에피토프 펩티드의 면역원성을 향상시키는 능력을 가지지만, 가장 강력한 구조체는 서열 번호: 88의 구조체인 것으로 밝혀졌으며, 가장 약한 것은 서열 번호: 101의 구조체였다.
영장류를 비롯한 상이한 종들에서 각각의 그리고 모든 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들에 대한 면역원성을 신중하게 교정하는 것은 최종 백신 제제의 개발에서 궁극적인 Th 펩티드 선택 및 성공을 보장 할 것이다.
iii) 상응하는 전장 및 IgE EMPD G1-C39 펩티드로 인한 항체 반응성에 대한 IgE EMPD G1-C39 펩티드 면역원 구조체들의 면역원성 평가.
도 4는 상이한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 88 내지 94, 96 및 97)로 면역화된 기니 피그에서 8주 기간에 걸친 항체 반응의 동역학을 나타낸다. 10-배 연속 희석에 의해 혈청을 1:100에서 1:10,000,000으로 희석하였다. ELISA 플레이트를 웰당 0.5 μg 펩티드의 IgE EMPD 1-39 펩티드 (서열 번호: 5)로 코팅하였다. Log10으로 표현되는 시험된 혈청의 역가는 A450nm의 선형 회귀 분석에 의해 계산되었으며, 컷오프 A450은 0.5로 설정되었다.
도 5는 상이한 IgE EMPD 면역원 구조체 (서열 번호: 88 내지 94, 96 및 97)에 의해 생성된, 정제된 다양한 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체의 적정 곡선을 나타낸다. ELISA 플레이트를 재조합 IgE EMPD-함유 단백질, γ1-em67로 코팅하였으며, 이는 서열 번호: 1의 서열을 포함한다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 기니피그 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체를 4배 연속 희석에 의해 100 mg/mL에서 0.0238 ng/mL로 희석하였다. 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체들 각 제제의 EC50을 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 계산하였다.
도 4 및 5 모두에 나타난 바와 같이, 많은 다른 설계들로부터 선택된 서열 번호: 88 내지 94의 펩티드 면역원 구조체는 대부분 4보다 큰 Log10 역가를 가지는 높은 면역원성을 나타냈다. 도 5에 나타난 바와 같이, 각 그룹으로부터의 정제된 항체를 사용한 보다 정확한 EC50 측정치는 더 긴 IgE EMPD 1-39 및 IgE EMPD 7-40의 B 세포 에피토프 펩티드를 함유하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 88-94)에서 0.02111 내지 0.08892 μg/mL이며, 이는 더 짧은 IgE EMPD, 가령, IgE EMPD 1-17 또는 IgE EMPD 19-38의 B 세포 에피토프 펩티드들 (<20 잔기 길이)을 함유하는 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 96 및 97)에 비해 상당히 더 높은 면역원성을 보여준다.
B 세포와 Th 에피토프 사이에 더 긴 스페이서를 함유하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 또한 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드 설계의 경우와 같이 면역원성을 상당히 감소시켰다 (서열 번호: 94 vs 89, 각 EC50s 0.08892 vs 0.02368). 20개 잔기 길이보다 긴 B 세포 에피토프 펩티드 중에서, IgE EMPD 1-39가 설계에서 가장 최적인 것으로 밝혀졌으며, 따라서 하기 실시예에서 다양한 시험관내 기능 분석 및 생체내 효능 평가로 추가 평가하기 위한 대표적인 펩티드 면역원 설계에서 B 세포 에피토프 펩티드로서 가장 자주 사용될 것이다.
iv) IgE 분비로의 B 세포 분화가 결정된 IgE 보유 B 세포들에 대한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들의 항체 결합에 대한 평가
도 6A 내지 6C는 IgE EMPD 면역원 구조체들 (서열 번호: 88 내지 97)로 면역화된 각 동물들의 그룹에 있어서, 풀링된 기니 피그 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 항체들에 의한, mIgE.FcL 또는 mIgE.FcS (사이토플루로그래프 염색법에 관하여 실시예 2 참고)를 발현하는 Ramos 세포주들로부터 유래한 B 세포들에 대한 결합을 나타낸다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 기니피그 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체 10 mg/mL를 사용하였다.
표적 서열의 EMPD 단편이 없는 mIgE.FCs Ramos 세포주의 세포들과의 낮은 기저 결합은 이러한 세포 결합 분석의 높은 특이성을 나타내는 모든 그룹으로부터 정제된 항체들에서 발견되었다. 도 6A 내지 6C에 나타난 바와 같이, 서열 번호: 88 내지 94, 96, 및 97의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들로 면역화된 동물들로부터 생성된 항체들은 mIgE.FCL Ramos 세포주 세포들에 대하여 상이한 결합 친화도를 가졌다. 특히, 긴 B 세포 에피토프 펩티드 IgE EMPD 1-39를 함유하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 88-94)로부터 생성된 항체는 20개 미만 잔기의 B 세포 에피토프 펩티드들을 함유하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 96-97)로부터 생성된 항체들에 비해 mIgE.FCL Ramos 세포주 세포들의 더 높은 mIgE 결합을 나타내었다. 또한, 더 짧은 스페이서 (ε를 갖는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체로부터 생성된 항체는 더 긴 스페이서 (ε-KKK; 서열 번호: 129)를 갖는 구조체에 비해 mIgE.FCL Ramos 세포주 세포의 mIgE 결합이 더 높았는데, 이는 도 6A에서 서열 번호: 89의 결과와 도 6C에서 서열 번호: 94의 결과를 비교하면 알 수 있다.
그룹 폴리클로날 항체 EC50 값과 IgE 보유 세포의 양성 결합의 백분율 (%) 사이에 음의 상관관계가 발견되었다. IgE 보유 B 세포 결합의 백분율은 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 면역원성의 기능적 효능과 항체 교차반응성 모두의 평가에 중요한 기능적 매개변수이다.
v) 높은 역가를 가지는 항체를 생성하여, IgE 분비로의 B 세포 분화가 결정된 IgE 보유 B 세포들의 세포자멸을 유도하는 능력에 대한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들의 면역원성 평가
도 7은 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포의 세포 표면에서 용량 의존적 방식으로 IgE EMPD 면역원 구조체들 (서열 번호: 88 내지 93)에 의해 생성된 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체의 다양한 제제에 의해 세포자멸이 유도되었음을 보여준다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 기니피그 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체를 2배 연속 희석에 의해 1000 μg/mL에서 62.5 ng/mL로 희석하였다. 인간화 항-IgE 모노클로날 항체인 Xolair®를 양성 대조군으로 사용하였다. 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체들 각 세트의 EC50을 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합된 비선형 회귀에 의해 계산하였다.
도 7에 도시 된 바와 같이, Xolair®(IgE 분자의 Fc 수용체 결합 CH3 도메인을 표적으로 하는 항-IgE 모노클로날 항체)는 최고 효능을 나타내는 최저 EC50 값 (121.4 ng/mL)을 가지며, 혈청에서 이의 존재는 혈청 IgE에 의한 중화로 인해 이러한 모든 세포자멸 유도 효능을 중화시킴을 나타낸다. 시험되었던 선택된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 88-93) 중에서, 277.5 내지 536 ng/mL의 EC50 값이 관찰되었으며, 이는 독특한 EMPD 표적 서열에 대한 이들의 결합으로 인한 혈청 IgE 간섭없이 높은 세포자멸 유도 효능을 나타내는 것이다. 이들 IgE 보유 B 세포들은 IgE 분비로의 B 세포 분화가 결정된 세포들이다.
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들 (예컨대 서열 번호: 88-93)로 숙주를 면역화함에 의한 이들 세포들의 세포자멸 유도는 IgE 합성의 억제를 촉발할 것이며, 이는 알레르기 질환의 주요 원인인 IgE의 혈청 감소를 가져올 것이다.
vi) 높은 역가를 가지는 항체를 생성하여, IgE 분비로의 B 세포 분화가 결정된 IgE 보유 B 세포들의 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 촉발하는 능력에 대한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들의 면역원성 평가
도 8은 상이한 IgE EMPD 면역원 구조체들 (서열 번호: 88 내지 93)에 의해 생성된 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체의 다양한 제제가 30의 이펙터/표적 비율에서 mIgE.FcL-발현 Ramon 세포들에 대한 ADCC를 유도 할 수 있음을 보여준다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 기니피그 혈청으로부터 정제된 폴리클로날 항-IgE EMPD 항체 10 mg/mL를 사용하였다. IL-2-자극된 마우스 비장 세포들이 이펙터 세포로 사용되었다. 마우ㅅ 항-IgE 모노클로날 항체인 5D5 분비를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 8에서 보는 바와 같이, 20개 초과의 아미노산 잔기들을 가지는 긴 B 세포 에피토프 펩티드를 보유한 모든 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 88-93)은 이러한 펩티드 면역원 구조체들로 숙주를 면역화할 때 IgE 분비로의 B 세포 분화가 결정된 IgE 보유 B 세포들의 ADCC를 유도하며, 이는 IgE 혈청 수준의 감소 및 억제를 나타낸다.
vii) 상이한 무차별 보조 T 에피토프들을 가지는 IgE EMPD 유래된 펩티드 면역원 구조체들을 사용함에 의한 MHC 커버리지의 확대.
다양한 유전적 배경을 가진 환자를 치료하기 위한 약학 조성물을 설계할 때, 다양한 유전적 배경을 가진 최대 모집단을 설계에 포함시키는 것이 중요하다. MVF 또는 HBsAg에서 유래된 무차별 보조 T 에피토프는 이러한 면역원성 향상을 제공하는 가장 강력한 것들 중 하나이므로, 이들 두 보조 T 에피토프들을 함유하는 펩티드 구조체들의 조합을 설계하여 면역원성 효과를 상승작용적이게 할 수 있다. 동일한 B 세포 에피토프를 갖는 2개의 펩티드 면역원 구조체들의 혼합물은 각각의 개별 펩티드 구조체에 의해 유도된 것과 비교할 때 상당한 면역 반응을 유도하는 것으로 예상 될 것이다.
viii) 다양한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들에 의해 유도된 면역 혈청 (9 wpi)에 의한 미세 특이성 분석을 위한 에피토프 맵핑
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 IgE-EMPD 백신의 설계는 기능적 및 구조적 표적으로서 IgE-EMPD의 중앙 영역의 C18-C39의 특별한 루프 구조에 초점을 두었다. 이러한 구조-기반 설계는 고유한 세포외 루프 구조를 면역원성 표적으로서 유지하는 것을 목표로 한다.
4개의 대표적인 1-17 (서열 번호: 7), 19-38 (서열 번호: 8), 1-39 (서열 번호: 5) 및 7-40 (서열 번호: 6)의 IgE-EMPD 펩티드 단편들을 사용하여 B 세포 에피토프 펩티드들의 N- 또는 C-말단에서 UBITh®(서열 번호: 72) 또는 UBITh®(서열 번호: 73)과 연결되는 B 세포 에피토프 펩티드들을 설계하여 프로토타입 펩티드 면역원을 형성하였다. B 세포와 Th 에피토프들 사이에 εK 링커 또는 εK-KKK (서열 번호: 129) 스페이서를 사용하여 표 3에 제시된 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 88 내지 97)을 형성하였다. 아미노산 (aa) 1-39 및 7-40을 보유한 모든 펩티드 단편들은 고리화반응에 의한 C18-C39 한정된 루프 구조를 가지도록 설계되었다.
플레이트 코팅에 개개의 IgE-EMPD B 세포 에피토프 펩티드s of 1-17 (서열 번호: 7), 19-38 (서열 번호: 8), 1-39 (서열 번호: 5) 및 7-40 (서열 번호: 6)을 사용한 ELISA 시험은 이들의 상응하는 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 96, 97, 88, 89, 93)로 면역화된 기니 피그로부터 얻은 과다면역 혈청의 항체 반응성에 대해 평가하였다. 결과는 서열 번호: 88, 89, 및 93의 구조체들은 4개의 IGE EMPD B 세포 에피토프 펩티드 모두에 대해 높은 역가 항체들을 유도한 반면, IgE-EMPD 1-17 (서열 번호: 96) 및 IgE-EMPD 19-38 (서열 번호: 97) 펩티드 면역원 구조체들에 의해 유도된 기니 피그 항혈청은 상응하는 B 세포 에피토프 펩티드들 (예컨대 서열 번호: 7 또는 8)과만 항체 반응성을 가졌고 상응하지 않는 이웃 에피토프로부터의 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드 (서열 번호: 8 또는 7)에 대해서는 교차-반응성을 가지지 않았음을 보여주었는데, 이는 높은 특이성의 면역원성, 즉, 상기 설계된 면역원 구조체들은 IgE-EMPD 상응 B 세포 에피토프 도메인들과 반응하는 특이적 항체들을 유발할 수 있음을 나타내는 것이다 (표 5).
항체 결합 부위(들)을 표적 영역 내부의 특정 잔기들에 위치화시키는 미세 에피토프 맵핑 연구에서 (표 5), IgE CH4 C 말단으로부터의 첫번째 8개 아미노산 그리고 IgE-EMPD의 1 내지 50 아미노산 서열 영역을 커버하는 50가지 중첩 10량체 펩티드들 (서열 번호: 10 내지 58)을 합성하였다. 이들 10량체 펩티드들을 개별적으로 96-웰 마이크로역가 플레이트 웰들 위에 고체상 면역흡착제로서 코팅하였다. 풀링된 기니 피그 항혈청들을 2.0 μg/mL의 10량체 펩티드로 코팅된 플레이트 웰들에 표본 희석 완충액에 1:100 희석하여 첨가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 완충액으로 플레이트 웰을 세척 한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 rProtein A/G를 첨가하고 30분 동안 배양하였다. PBS로 다시 세척 한 후, 시료들을 두번 분석 할 때 ELISA 플레이트 판독기에 의해 450nm에서 흡광도를 측정하기 위해 웰에 기질을 첨가하였다. IgE-EMPD 펩티드 면역원 유도된 면역 혈청의 상응하는 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드 코팅된 웰들에 대한 결합은 최대 항체 결합 신호를 나타낸다.
미세 에피토프 맵핑은 IgE-EMPD 19-38 유래 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 97, 비-고리화 선형 B 세포 에피토프, H19-R38)로부터 풀링된 기니 피그 혈청은 IgE-EMPD의 중앙 영역에 위치한 IgE EMPD 22-31 펩티드 (서열 번호: 39)를 인식한다. 이는 또한 IgE EMPD 펩티드 19-38 (서열 번호: 8), 1-39 (서열 번호: 5) 및 7-40 (서열 번호: 6)와 반응하지만, 1-17 (서열 번호: 7)와는 반응하지 않는다.
IgE EMPD 1-17 (서열 번호: 96, 비-고리화 선형 B 세포 에피토프, G1-L17)에 의해 유도된 항혈청은 IgE-EMPD의 N 말단 영역의 IgE EMPD 8-17 (서열 번호: 25), 뿐만 아니라 IgE EMPD 1-17(서열 번호: 7), 1-39 (서열 번호: 5) 및 7-40 (서열 번호: 6)을 인식하지만, 19-38 (서열 번호: 8) 펩티드는 인식하지 않는다. IgE EMPD1- 17 (서열 번호: 96) 및 IgE EMPD 19-38 (서열 번호: 97) 면역원 구조체들에 의해 유도된 항혈청들은 교차-반응성이 없었다.
흥미롭게도, UBITh®에피토프가 N-말단 (서열 번호: 89) 또는 C-말단 (서열 번호: 88)에서 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드에 연결되어 있는 2개의 대응물 IgE-EMPD 1-39 면역원 구조체들은 뚜렷하게 상이한 에피토프 결합 패턴을 인식하는 면역 혈청을 생성하였다. 면역원 구조체 (서열 번호: 89, UBTh1은 해당 펩티드의 N-말단에 위치함)에 의해 유도된 면역 혈청은단 하나의 10량체 펩티드 (서열 번호: 47)와 IgE-EMPD의 C-말단 영역 근방인, aa 30-39에서 강하게 반응하였다. 이는 IgE EMPD 9-18과 N-말단 영역 (서열 번호: 27)에서 약하게 반응하였다.
그러나, 다른 IgE-EMPD 1-39 면역원 구조체 (서열 번호: 88, UBTh1은 C 말단에 위치함)의 경우, 유도된 항혈청은 IgE EMPD 9-19 (서열 번호: 27 및 28); IgE EMPD 19-31 (서열 번호: 37, 38, 39 및 40) 및 IgE EMPD 30-43 (서열 번호: 48, 49, 50, 51 및 52)으로 나타내어지는 3가지 불연속 선형 에피토프들과 강하게 반응하였다. 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 88)는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 89) 보다 훨씬 더 강력한 면역원성을 나타내었으며 훨씬 더 넓은 표면과 반응하였다. 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 88)과 관련된 이러한 훨씬 더 강력한 면역원성의 발견은 또한 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 89)보다 IgE-발현 림프구상에서 훨씬 더 강한 ADCC 및 세포자멸 활성을 보여주었다.
IgE-EMPD 7-40 면역원 구조체 (서열 번호: 93, IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드의 N- 및 C-말단 모두에 위치하는 2개의 UBTh1을 가짐)의 경우, 이로부터 유도된 항혈청은 서열 번호: 35-41의 펩티드들에 의해 커버되는 IgE EMPD 18-33; IgE EMPD 29-43 (서열 번호s: 45-51)의 영역 내 펩티드들과 강력하게 반응하였다는 점에서 IgE-EMPD 1-39에 의해 인식되는 것들과 유사한 2가지 주요 항원 영역들을 인식하였다. IgE-EMPD 7-40 면역원 구조체 (서열 번호: 93)는 IgE-EMPD 1-39 면역원 구조체 (서열 번호: 88, UBTh1은 IgE EMPD B 세포 에피토프 펩티드의 C-말단에 위치)와 유사한 항원 결정 영역들을 공유한다. IgE-EMPD 1-39 (서열 번호: 88)는 몇 가지 기능 분석에서 나타난 바와 같이 설계된 모든 펩티드 면역원 구조체들 중에서 가장 우수한 효능을 나타내었는데, 이 면역원 구조체가 IgE-EMPD의 세포외 막 단백질 상의 3개 이상의 B 세포 에피토프 펩티드들에 의해 커버되는 넓은 표면을 인식하는 높은 결합 폴리클로날 항체들을 유도하였다는 점에서, 이의 미세 에피토프 맵핑에 나타난 결과와 상관관계가 있다. IgE EMPD 30-43 (서열 번호: 47-51) 에피토프 영역은 매우 중요한 B 세포 에피토프 영역을 나타내는데, 이 영역은 항체 매개 세포자멸 및 ADCC에 취약한 IgE 보유 B 세포 기저 막에 근접한 루프형 구조의 C-말단 영역에 위치한다. 또한, 고리화 루프형 구조는 이의 비-고리형 대응물 보다 우수한 질의 면역원 구조체를 제공한다 (표 5 서열 번호: 88 vs 서열 번호: 88 비-고리화).
요약하면, 모두 UBITh®에피토프 펩티드에 연결된 IgE EMPD 내부의 루프형 구조로 나타내어지는 B 세포 에피토프 펩티드를 가지는, 설계된 합성 IgE-EMPD 펩티드 면역원 구조체들 (IgE EMPD 1-39, 서열 번호: 88) 및 (IgE EMPD 7-40, 서열 번호: 93)은, 중앙 루프 구조의 C-말단 영역에서의 위치로 인해 세포 막에 매우 근접한 IgE-EMPD 단백질 상의 새로운 에피토프 영역 (aa 29-43)에서 표적된 폴리클로날 항체들을 생성하는 강력한 면역 반응을 유도하였으며, 이는 ADCC를 유도할 수 있을 만큼 많은 막 IgE의 가교결합 그리고 IgE-발현 B 림프구들의 고갈로 인한 세포자멸을 가능하게 한다 (표 5).
실시예 7
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프에 대해 독점적으로 지시되는 것으로 나타난 집중된 항체 반응
표적된 B 세포 에피토프 펩티드의 각각의 담체 단백질에 대한 화학적 접합에 의하여 이러한 B 세포 에피토프 펩티드에 대해 지시되는 면역 반응을 강화시키기 위해 사용되는 모든 담체 단백질들 (예컨대, 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH) 또는 다른 담체 단백질들, 가령, 디프테리아 톡소이드 (DT) 및 파상풍 톡소이드 (TT) 단백질들)은 상기 강화되는 담체 단백질에 대해 지시되는 항체들 중 90% 이상 그리고 면역화된 숙주들에서 표적되는 B 세포 에피토프에 대해 지시된 항체들 중 10% 미만을 유도할 것임이 널리 공지되어 있다.
그러므로 본 발명의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들에 의해 유도되는 항체들의 특이성을 평가하는 것이 관심 대상이다. B 세포 에피토프 (서열 번호: 5)가 스페이서 서열 εK-KKK (서열 번호: 129)를 통해 이종 T 세포 에피토프 UBITh®(서열 번호: 72)에 연결된 대표적인 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 94)을 면역원성 평가를 위해 제조하였다. UBITh®(B 에피토프 면역강화에 사용되는 보조 T 펩티드)을 플레이트 위에 코팅하고 면역화된 기니 피그로부터 얻은 혈청을 사용하여 면역강화에 사용된 UBITh®펩티드와의 교차 반응성에 대해 시험하였다. 표 7은, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 94)로부터 생성된 항체들은 IgE EMPD (서열 번호: 5)의 상응하는 표적화된 B 에피토프에 대해 높은 면역원성을 가졌던 반면; 모두는 아지니만 대부분의 면역 혈청들은 UBITh®펩티드 (서열 번호: 72)에 대해 비-반응성인 것으로 나타났음을 보여준다.
요약하면, 신중하게 선택된 보조 T 에피토프에 연결된 표적 B 세포 에피토프를 혼입시킨 면역원 설계는 IgE EMPD B 세포 에피토프에 대해서만 표적되고 면역 반응을 강화시키기 위해 사용된 Th 에피토프에 대해서는 표적되지 않는 항체들을 유도하는 집중적이고 명확한 면역 반응을 생성한다. 약학 조성물 설계에 있어서, 면역원이 생성하는 면역 반응이 더 특이적일 수록, 조성물에 보다 높은 안전성이 제공된다. 그러므로 본 발명의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 그 표적에 대해 매우 특이적이며 또한 매우 강력하다.
실시예 8
예방적 및 치료적 모델 모두에서 유전자 변형된 녹인 마우스의 혈청 IgE 수준에 대한 면역치료 알레르기 백신의 효과
서열 번호: 88 및 서열 번호: 93의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들을 선택하여 HuIGHE x Balb/c 녹인 마우스의 F1 자손들인 인간 IgE 발현 유전자 조작 마우스를 사용한 개념 연구 증명에서 일차 및 이차/기억 반응에서의 IgE 생성을 평가하였다.
먼저, 알레르겐 (예컨대, 파파인) 공격접종하여 감작화하기 이전에 IgE EMPD 펩티드 면역원 일차-추가 면역화를 수행하였다. 8마리 동물들 (n=8)을 각 6개 치료 그룹 및 1개 위약 그룹, 총 7개 그룹에 할당하였다. 2개의 펩티드 면역원들 각각에 대해, 0, 3, 및 5주차에 i.m. 경로에 따른 상이한 용량, 9 (저), 18 (중), 및 40 (고) μg/투약의 3개 소그룹을 설계하였다. 펩티드 면역원들을 면역 반응을 향상시키기 위하여 ISA 51VG 및 CpG 보조제들과 함께 제제화하였다. 위약 그룹의 마우스들에게 오직 제제 용액의 비히클만을 0, 3, 및 5주차에 근육내 주사하였다. 10 및 16주차에, 위약 그룹을 비롯한 모든 동물 그룹들을 50 μg 파파인과 TiterMax Gold 보조제로 피하 경로로 감작화시켰다 (도 10).
상기 2가지 펩티드 면역원들에 의한 항체 반응 (γ1-εm67 융합 단백질에 대한 IgG 역가)을 실시예 2에 기재된 바와 같이 ELISA 분석하여 결정하였다. 모든 마우스들은 0, 3, 5주차에서 상이한 용량으로 면역화된 6개 치료 그룹들에서 강력한 항체 반응을 발달시켰다. ELISA 데이터는 높은 항체 역가를 가지는 모든 치료 그룹들로부터의 혈청 시료들은 3주차에서 재조합 γ1-εm67 융합 단백질에 특이적으로 결합하기 시작하며, 20주차까지 높은 역가를 유지하였음을 보여준다 (도 11). 대조적으로, 위약 그룹의 마우스들은 재조합 γ1-εm67 융합 단백질에 대해 특이적인 항체를 생성하지 않았다. 이러한 결과들은, 모든 치료 그룹들이 IgE-발현 B 림프구들을 표적하여 IgE 생성을 억제시킬 수 있는 능력을 가지는 항-IgE-EMPD 항체들을 생성하였음을 나타낸다. 도 11은 20 주의 전체 연구 기간에 걸쳐 높은 항체 역가가 유지되었음을 도시한다. 이러한 결과들은 또한 높은 역가의 항-IgE EMPD 항체들을 생성하는 특이적 면역 반응을 유도함에 있어서 상기 펩티드 면역원들 (서열 번호: 88 및 서열 번호: 93)이 이들 2가지 백신 면역원들 각각의 낮은 용량 그룹 (9 μg/투약)에서 조차도 매우 면역원성임을 나타낸다.
면역화된 마우스로부터의 1차 및 기억 반응에서 IgE 생성에 대한 면역화 효과를, 실시예 2에 기재된 분석 절차에 따라 혈청 기저 IgE 수준 및 알레르겐-특이적 IgE 수준을 측정함으로써 조사하였다. 백신접종 전후의 혈청 기저 IgE 수준을 도 12에 도시하며, 이는 모든 치료 그룹에서 마우스 혈청 기저 IgE 수준이 위약 그룹의 해당 시점의 수준과 비교하여 점진적으로 감소했음을 입증한다. 감작화 전 10 주차에, 6개 치료 그룹 모두에서 기저 IgE 수준이 최저 수준으로 감소한 반면, 위약 그룹의 기저 혈청 IgE 수준은 상당히 변화한 것은 아니었다. 이러한 결과는, 10주차에, 모든 치료 그룹들에서, 기저 IgE 생성은 위약 그룹에 비해 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 88 또는 93)을 함유하는 백신 제제를 제공받은 동물들에서 유의하게 억제되었음을 나타낸다. 도 12는 또한 모든 치료 그룹들에서 기저 혈청 IgE 수준은 10 및 16주차에 2회 알레르겐 감작화 이후에도 20주 연구 기간 전체에 걸쳐 억제되었음을 보여준다.
파파인으로 12주차 일차접종 그리고 18주차에 이차 감작화하여 유도된 알레르겐-특이적 IgE 생성은 각각 도 13 및 14에 도시되어 있다. 이러한 결과는, 두 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 88 및 93) 모두가 위약 그룹과 비교하여 일차 및 이차 알레르겐-감작화 모두 이후 파파인-특이적 IgE 수준들을 유의하게 억제할 수 있었음을 나타낸다. 이들 두 펩티드 면역원들에서 3개 용량 수준들 간에 실질적인 차이는 관찰되지 않았다. 도 13에서 보는 바와 같이, 본 연구에서 12주차의 일차 반응에서 알레르겐-특이적 IgE의 생성시, 펩티드 면역원 (서열 번호: 88)은 (서열 번호: 93) 보다 약간 더 우수하게 기능하였다. 두 가지 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들 모두 일차 및 기억 반응들 모두에서 위약 그룹과 비교하여 알레르겐-특이적 IgE 생성의 유의한 억제를 보여주었다 (도 13 및 14).
IgE-발현 B 세포를 표적하는 IgE-EMPD 펩티드 면역원 구조체들 (서열 번호: 88 및 서열 번호: 93)이 IgE 생성을 억제하여 IgE-매개 알레르기 질환을 치료하는 잠재적인 치료 효과를 추가 조사하기 위해, HuIGHE 녹인 마우스에서의 감작화/리콜 반응에 대한 이들 두 펩티드 면역원 구조체들의 효과를 평가하기 위한 또 다른 프로토콜을 설계하였다. 6마리 동물들을 각 2개 치료 그룹들 (N=6)에 그리고 4마리 동물들을 위약 그룹 (N=4)에, 총 3개 그룹에 할당하였다. 모든 그룹의 마우스들은 각각 펩티드 백신접종 전후에, 50 μg 파파인/TiterMax Gold 보조제로 0주차에 피하 경로로 그리고 12주차에 발바닥 경로로 2회 감작화되었다. 3, 6 및 8주차에 상기 두 펩티드 면역원 구조체들 중 하나를 함유하는 40 μg/0.1 mL 제제의 일차접종-추가접종 면역화 요법을 두 치료 그룹 모두에서 평가하였으며 위약 그룹은 보조제 비히클만을 투여받았다 (도 15 참고).
결과는 위약 그룹을 비롯하여 파파인으로 감작화된 모든 그룹들이 2주차 이후 모든 3개 그룹에서 파파인-특이적 IgG의 높은 역가를 유도하였으며, 6주차 (마지막 관찰 시기)까지 높은 역가를 유지하였음을 보여주었다. 총 혈청 IgE 및 파파인-특이적 IgE 수준들 모두 2주차에 최고 수준에 도달하였으며, 이후 3주차에서 점진적으로 감소하기 시작하였고 6주차에 기저선으로 돌아왔다 (도 16).
IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들의 백신접종은 γ1-εm67 융합 단백질을 특이적으로 인식하는 높은 역가의 항체들을 유도하였다. 3, 6 및 8주차에 펩티드 면역원들의 3회 주사 후, (항-γ1-εm67 또는 항-IgE-EMPD에 대해) 유도된 항체 IgG 역가는 꾸준히 상승하였으며 10주차에 최고 수준에 도달하였다 (데이터 도시되지 않음). 12주차에, 2차 파파인 감작화시, 2개 치료 그룹 중 어느 것도 파파인-특이적 IgE 수준의 상승을 보이지 않았으나; 파파인-특이적 IgE 수준은 12 및 13주차에 위약 그룹에서 유의하게 증가하였고, 이후 14주차에 보다 낮은 수준으로 떨어졌다 (데이터 도시되지 않음).
이 연구 결과는 위약 그룹과 비교할 때 서열 번호: 88 및 93의 IgE EMPD 펩티드 면역원들이 특이적 체액 면역 반응을 유도하여 생체내에서 기억 B 세포들의 리콜 증식 반응을 방지할 수 있으며, 이는 12주차에서 파파인 리콜에 의해 유발되는 파파인-특이적 IgE 생성을 완전히 차단하였음을 나타낸다 (도 17). 종합하면, 본 연구는 개시된 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체들이 1차 감작화로부터 알레르겐-특이적 혈청 IgE의 생성을 억제할 뿐만 아니라 2차 알레르겐 공격접종으로부터 리콜된 알레르겐-특이적 혈청 IgE를 꾸준히 억제하는 항체 반응들을 유도하였음을 나타낸다. 본 연구 결과는 개시된 본 발명이 IgE 매개 알레르기 질환, 가령, 천식의 치료를 위한 잠재적으로 효능있는 치료 백신을 제공함을 증명한다. 알레르겐-특이적 IgE를 약화시키는 치료 효능을 면밀한 조사했을 때, 두 펩티드 면역원들 (서열 번호: 88 및 서열 번호: 93) 모두는 알레르겐-특이적 IgE 생성을 억제함에 있어 유사한 효능을 나타내었다.
실시예 9
시노몰구스 마카크 원숭이에서 프로토타입 면역치료 알레르기 백신 제제들의 면역원성 평가를 통한 투약 및 제제 연구
a. 전체 목표:
본 연구의 목표는 선택된 서열 번호: 88의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 20주 기간에 걸친 근육내 면역화의 면역원성에 대한 효과를 평가하는 것이었다. 인간 연구들을 수행하기에 앞서 프로토타입 IgE-EMPD 펩티드 백신 제제의 면역원성 및 투약 요법을 평가하기 위한 동물 모델로서 시노몰구스 마카크 원숭이를 선택하였다. 대표적인 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 88)을 통상적으로 사용되는 2가지 제제들로 제제화하였다. 첫 번째 제제에서, 서열 번호: 88의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 Montanide™ISA51와 혼합된 유중수 에멀전을 형성하기 이전에 CpG와의 안정화된 면역자극 복합체로 제조하였다 (파트 A 연구). 두 번째 제제에서, 서열 번호: 88의 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체를 ADJUPHOS와의 현탁액 제제를 형성하기 이전에 CpG와의 안정화된 면역자극 복합체로 제조하였다 (파트 B). 본 포괄적 면역원성 연구의 각 제제들에서 투약 당 30μg, 100μg, 300μg 내지 1000μg의 4가지 용량을 평가하였다.
b. 프로토콜 요약
2.5-4.0 kg의 성체 시노몰구스 마카크 원숭이를 선택하여 면역원성 및 혈청 마카크 IgE 수준에 대한 IgE EMPD 펩티드 면역원들의 효과를 평가하였다. 총 20마리의 마카크 원숭이들을 10개 그룹으로 나누었다: 위약 대조 동물 (n = 2)에게는 보조제 만을 (Montanide™ISA 51과 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드) 또는 (ADJUPHOS와 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드) 주사하였다. 실험 동물들에게 IgE EMPD 펩티드 면역원 (서열 번호: 88)을 그룹 당 30, 100, 300, 및 1,000 mg 용량으로 주사하였다 (동물 당 총 500 mL 백신 부피; 그룹 당 n = 2, 수컷 1마리 및 암컷 1마리). 0, 3 및 6주차에 총 3회의 근육내 면역화가 투여되었다. 모든 마카크 원숭이들을 0, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 및 24주차에 면역원성 및 혈청 IgE 수준에 관해 모니터하였다.
c. 항-IgE EMPD 항체 역가들의 결정
모든 동물들은 0, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 및 24주차에 채혈되었다. 각 혈액에 대해 혈청을 분리하여, γ1-cyno em67 ELISA를 사용하여 항-IgE EMPD 항체 역가를 결정하였다. 위약-처리된 동물들에서는 항-IgE EMPD 항체 역가가 거의 내지 전혀 탐지되지 않았다 (도 18A 및 18B). 그러나, 3회 면역화된 모든 동물들은 IgE EMPD B 에피토프들에 대해 탐지가능한 IgG 항체 역가를 가졌으며 피크 역가들은 8 내지 12주차에 수득되었다. 이러한 특이적 반응성들은 24주의 연구 전반에 걸쳐 용량 의존 방식으로 유지되었다 (도 18A 및 18B). 모든 동물들은 γ1-cyno εm67 재조합 단백질에 대해 높은 항-혈청 역가를 가짐이 밝혀졌으며 투약 당 0.5 mL 중 300 μg이 두 제제들 모두에서 가장 최적인데, 왜냐하면 1,000 μg 용량 제제는 각 제제들에서 ISA51V 또는 ADJUPHOS 보조제에 대해 과량의 펩티드 면역원을 생성하게 되기 때문이다. 이러한 결과는 ISA51/CpG ODN을 함유하는 제제들이 ADJUPHOS/CpG ODN을 보유한 제제들에 비해 보다 높은 면역원성을 가져왔음을 보여준다. IgE EMPD B 세포 에피토프에 대한 항체 반응은 각 펩티드 면역원 추가접종으로 향상되었으며 이후 항 IgE EMPD 역가는 시간 경과에 따라 점진적으로 감소되었다. 유의하게 높은 항-혈청 역가가 24주 연구 기간 전반에 걸쳐 유지되었다 (도 18A 및 18B).
실시예 10
시노몰구스 마카크 원숭이에서 대용 면역치료 알레르기 백신을 이용한 효능 증명
a. 전체 목표:
본 연구의 목표는 인간 IgE 생성을 매우 유사하게 모사하는 동물 모델인 시노몰구스 마카크 원숭이에서 20주 기간에 걸쳐 자기 mIgE로부터 유래된 서열의 IgE EMPD 펩티드 면역원들을 이용한 근육내 면역화의 면역원성 및 혈청 IgE 수준에 대한 효과를 평가하는 것이었다. mIgE의 IgE EMPD는 비-인간 영장류 (예를 들어, 신 및 구 세계 원숭이 및 유인원)에서 진화상 보존되며, 이러한 IgE EMPD 대응 서열은 다른 종들 (예컨대, 설치류, 토끼 및 개과)에서는 발견되지 않았다. 시노몰구스 마카크 IgE EMPD의 아미노산 서열 (서열 번호: 127)은 인간 IgE EMPD의 아미노산 서열 (서열 번호: 2)과 높은 서열 동일성 (90%)을 가진다.
b. 프로토콜 요약
2.5-4.0 kg의 성체 시노몰구스 마카크 원숭이를 선택하여 면역원성 및 혈청 마카크 IgE 수준에 대한 IgE EMPD 펩티드 면역원들의 효과를 평가하였다. 총 12마리의 마카크 원숭이들을 3개 그룹으로 나누었다: 위약 대조 동물들 (n = 4, 2마리 수컷 및 2마리 암컷)에게 보조제만 (Montanide™ISA 51 plus CpG 올리고데옥시뉴클레오티드) 주사하였으며; 실험 동물들에게는 IgE EMPD 펩티드 면역원들 (서열 번호: 125 또는 126)을 300 mg의 용량으로 주사하였다 (동물 당 총 500 mL 백신 부피; 그룹 당 n = 4, 2마리 수컷 및 2마리 암컷). 0, 3 및 6주차에 총 3회의 근육내 면역화가 투여되었다. 모든 마카크 원숭이들을 0, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20주차에 면역원성 및 혈청 IgE 수준에 관해 모니터하였다.
c. 항-IgE EMPD 항체 역가들의 결정
모든 동물들은 0, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20주차에 채혈되었다. 각 혈액에 대해 혈청을 분리하여, γ1-cyno em67 ELISA를 사용하여 항-IgE EMPD 항체 역가를 결정하였다. 위약-처리된 동물들에서는 항-IgE EMPD 항체 역가가 전혀 탐지되지 않았다 (도 19). 그러나, 서열 번호: 125 또는 서열 번호: 126으로 3회 면역화된 모든 동물들은 IgE EMPD B 에피토프들에 대해 탐지가능한 IgG 항체 역가를 가졌으며 피크 역가들은 8 내지 12주차에 수득되었다 (도 19). 이러한 특이적 반응성들은 20주의 연구 전반에 걸쳐 유지되었다. 또한, 면역화된 동물들 모두 20-주 기간 전반에 걸쳐 특이적 IgM 및 IgA 항체 역가를 발달시켰다 (도 20).
d. 혈청 IgE 수준의 측정
모든 동물들은 0, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20주차에 채혈되었다. 정량적 마카크 IgE ELISA를 사용하여 혈청 IgE를 측정하기 위해 각 혈액에 대해 혈청을 분리하였다. 위약 그룹의 기저 IgE 수준은 생애기 동안 변화하였다. 모니터 기간 동안 서열 번호: 125를 투여받은 그룹에서 관찰된 IgE 감소는 통계적으로 유의하였던 반면 서열 번호: 126을 투여받은 그룹 또한 IgE가 감소하는 경향을 보여주었다 (도 19).
e. 결과
성체 시노몰구스 마카크 원숭이들의 혈청 시료들에서 혈청 IgE 농도 및 자기-mIgE에 대한 면역원성에 대한 대용 모델에서의 IgE EMPD 펩티드 면역원들의 효과를 평가하였다. 본 개념 증명 연구에서, 각 그룹의 4마리 동물들에게 CpG ODN 및 Montanide™ISA 51의 혼합물을 위약 대조로 투여하고 8마리 성체 시노몰구스 마카크 원숭이 (그룹 당 n=4)들을 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)와의 독자적인 면역자극 복합체들 (ISC)로 그리고 Montanide™ISA 51 보조제와 함께 제제화되어 복합체화된 서열 번호: 125 또는 126의 300 μg의 마카크 IgE EMPD 펩티드 면역원들로 0, 3 및 6주차에 면역화하였다. 서열 번호: 125 및 126은, 각각 서열 번호: 93 및 88의 인간 IgE EMPD 면역원들의 대응물이다. CpG ODN/Montanide™ISA 51과의 두 가지 마카크-유래 면역원 제제들은 모든 동물들에서 강력한 항-IgE EMPD IgG a항체 반응을 생성하였다 (도 19). 또한, 모든 동물들은 IgE EMPD에 대해 IgM 및 IgA 항체들을 발달시켰다 (도 20). 또한 기저 마카크 혈청 IgE에서 감소하는 경향이 관찰되었다 (도 21). 유해 주사 부위 반응은 전혀 없었다. 이 연구는 향상된 UBITh®T 세포 에피토프를 가지는, 자기 유래 서열의 합성 IgE EMPD 펩티드 면역원들 (서열 번호: 125 및 126)이 심오한 항-IgE EMPD 항체 반응들을 유도하여 IgE 생성을 억제하고 기저 마카크 혈청 IgE 수준 감소 경향을 초래할 수 있음을 증명하였다.
f. 결론
시노몰구스 마카크 원숭이들에게 IgE EMPD 펩티드 면역원들 (서열 번호: 125 및 126) 또는 위약 대조를 20주 기간에 걸쳐 근육내 경로로 3회 주사하였다. 동물들은 전반적으로 우수한 내약성을 보였으며 면역 관용을 깨뜨렸다. 모든 면역화된 마카크 원숭이들은 IgE EMPD 구조체들의 상응하는 B 세포 에피토프에 대하여 강력하고 지속적인 IgG (최대 105) 및 IgA (최대 104) 항체 역가를 발달시킴과 함께 일시적 특이적 IgM 항체들을 발달시켰다. 감소된 기저 IgE 수준이 각각의 모든 반응자들에서 관찰되었다. 이러한 결과들은 항체들이 막-결합 IgE-발현 B 세포들을 표적하여, 후속적으로 IgE 생성을 억제하는 항-IgE-EMPD 항체의 작용 방식을 뒷받침한다.
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SEQUENCE LISTING <110> United Biomedical, Inc. Wang, Chang Yi Lin, Feng Chen, Jun Bo <120> PEPTIDE IMMUNOGENS AND FORMULATIONS THEREOF TARGETING MEMBRANE-BOUND IGE FOR TREATMENT OF IGE MEDIATED <130> 2038-WO <140> TBD <141> 2017-12-31 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 67 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(67) <223> IgE-EMPD 1-67 <400> 1 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Ser Val Pro His Pro Arg Cys His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp 35 40 45 Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val Cys Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu 50 55 60 Ala Pro Trp 65 <210> 2 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(52) <223> IgE-EMPD 1-52 <400> 2 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Ser Val Pro His Pro Arg Cys His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp 35 40 45 Pro Gly Pro Pro 50 <210> 3 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(76) <223> IgE-EMPD -10-66 <400> 3 Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln 20 25 30 Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg 35 40 45 Cys His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu 50 55 60 Asp Val Cys Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu Ala Pro Trp 65 70 75 <210> 4 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(62) <223> IgE-EMPD -10-52 <400> 4 Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln 20 25 30 Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg 35 40 45 Cys His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro 50 55 60 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(39) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 5 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Ser Val Pro His Pro Arg Cys 35 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> IgE-EMPD 7-40 <400> 6 Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln 1 5 10 15 Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg 20 25 30 Cys His <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> IgE-EMPD 1-17 <400> 7 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> IgE-EMPD 19-38 <400> 8 His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val 1 5 10 15 Pro His Pro Arg 20 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD -9-1 <400> 9 Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD -8-2 <400> 10 Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD -7-3 <400> 11 Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD -6-4 <400> 12 Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgEEMPD -5-5 <400> 13 Val Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD -4-6 <400> 14 Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD -3-7 <400> 15 Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD -2-8 <400> 16 Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD -1-9 <400> 17 Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 1-10 <400> 18 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 2-11 <400> 19 Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 3-12 <400> 20 Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 4-13 <400> 21 Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 5-14 <400> 22 Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 6-15 <400> 23 Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 7-16 <400> 24 Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 8-17 <400> 25 Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 9-18 <400> 26 Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgEEMPD 10-19 <400> 27 Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 11-20 <400> 28 Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 12-21 <400> 29 Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 13-22 <400> 30 Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 14-23 <400> 31 Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 15-24 <400> 32 Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 16-25 <400> 33 Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgEEMPD 17-26 <400> 34 Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 18-27 <400> 35 Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 19-28 <400> 36 His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 20-29 <400> 37 Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 21-30 <400> 38 Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 22-31 <400> 39 Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 23-32 <400> 40 Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 24-33 <400> 41 Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 25-34 <400> 42 Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 26-35 <400> 43 Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 27-36 <400> 44 Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgEEMPD 28-37 <400> 45 Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 29-38 <400> 46 Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 30-39 <400> 47 Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 31-40 <400> 48 Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys His 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 32-41 <400> 49 Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys His Cys 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 33-42 <400> 50 Ser Val Pro His Pro Arg Cys His Cys Gly 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 34-43 <400> 51 Val Pro His Pro Arg Cys His Cys Gly Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 35-44 <400> 52 Pro His Pro Arg Cys His Cys Gly Ala Gly 1 5 10 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 36-45 <400> 53 His Pro Arg Cys His Cys Gly Ala Gly Arg 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 37-46 <400> 54 Pro Arg Cys His Cys Gly Ala Gly Arg Ala 1 5 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 38-47 <400> 55 Arg Cys His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 39-48 <400> 56 Cys His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgEEMPD 40-49 <400> 57 His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> IgE-EMPD 41-50 <400> 58 Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro Gly 1 5 10 <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 1 Th <400> 59 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF1 Th <400> 60 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 61 <211> 24 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Bordetella pertussis Th <400> 61 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 20 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 2 Th <400> 62 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr <210> 63 <211> 23 <212> PRT <213> diphtheria bacilli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Diphtheria Th <400> 63 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys 20 <210> 64 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Plasmodium falciparum Th <400> 64 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Schistosoma mansoni <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Schistosoma mansoni Th <400> 65 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His <210> 66 <211> 25 <212> PRT <213> Cholera Toxin <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <400> 66 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser 20 25 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF 2 Th <400> 67 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile 1 5 10 15 <210> 68 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF 3 Th <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> G or T <400> 68 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe 20 <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> D or R <400> 69 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 70 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <400> 70 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I <400> 71 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Asp <210> 72 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 5 Th <400> 72 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 73 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 3 Th <400> 73 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza Matrix protein 1 _1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza Matrix protein 1_1 Th <400> 74 Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg 1 5 10 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Influenza Matrix protein 1_2 Th <400> 75 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val 1 5 10 15 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Influenza Non-structural protein 1 Th <400> 76 Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser 1 5 <210> 77 <211> 19 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> EBV BHRF1 Th <400> 77 Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Clostridium tetani TT1 Th <400> 78 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> EBV EBNA-1 Th <400> 79 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr His Ile 20 <210> 80 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Clostridium tetani TT2 Th <400> 80 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 81 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT3 Th <400> 81 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT4 Th <400> 82 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys 1 5 10 15 <210> 83 <211> 18 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> EBV CP Th <400> 83 Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> HCMV IE1 Th <400> 84 Asp Lys Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His 1 5 10 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> EBV GP340 Th <400> 85 Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> EBV BPLF1 Th <400> 86 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln 1 5 10 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> EBV EBNA-2 Th <400> 87 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu 1 5 10 <210> 88 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(39) <223> IgE-EMPD 1-39 <220> <221> SITE <222> (40)..(40) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (41)..(59) <223> UBITh(R)1 <400> 88 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Ser Val Pro His Pro Arg Cys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly 35 40 45 Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 <210> 89 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> UBITh(R)1 <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(59) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 89 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala 20 25 30 Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg 35 40 45 Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 <210> 90 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> UBITh(R)1 <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(59) <223> IgE-EMPD 1-39 <220> <221> SITE <222> (60)..(60) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (61)..(79) <223> UBITh(R)1 <400> 90 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala 20 25 30 Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg 35 40 45 Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys Lys Ile Ser Ile Thr 50 55 60 Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 65 70 75 <210> 91 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> IgE-EMPD 7-40 <220> <221> SITE <222> (35)..(35) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (36)..(54) <223> UBITh(R)1 <400> 91 Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln 1 5 10 15 Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg 20 25 30 Cys His Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg 35 40 45 Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 <210> 92 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> UBITh(R)1 <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(54) <223> IgE-EMPD 7-40 <400> 92 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys 20 25 30 His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val 35 40 45 Pro His Pro Arg Cys His 50 <210> 93 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> UBITh(R)1 <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(54) <223> IgE-EMPD 7-40 <220> <221> SITE <222> (55)..(55) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (56)..(74) <223> UBITh(R)1 <400> 93 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys 20 25 30 His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val 35 40 45 Pro His Pro Arg Cys His Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val 50 55 60 Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 65 70 <210> 94 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> UBITh(R)1 <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(62) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 94 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser 20 25 30 Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly 35 40 45 Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 60 <210> 95 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> UBITh(R)2 <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(61) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 95 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp Lys Lys Lys Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln 20 25 30 Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu 35 40 45 Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 60 <210> 96 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> UBITh(R)1 <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(40) <223> IgE-EMPD 1-17 <400> 96 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser 20 25 30 Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu 35 40 <210> 97 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> UBITh(R)1 <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(43) <223> IgE-EMPD 19-38 <400> 97 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg 35 40 <210> 98 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 1 Th <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(57) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 98 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp 20 25 30 Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala 35 40 45 Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 <210> 99 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF1 Th <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(55) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 99 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 20 25 30 Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 35 40 45 Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 <210> 100 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Bordetella pertussis Th <220> <221> SITE <222> (25)..(25) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(64) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 100 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala 20 25 30 Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln 35 40 45 Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 60 <210> 101 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 2 Th <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(57) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 101 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp 20 25 30 Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala 35 40 45 Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 <210> 102 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Diphtheria Th <220> <221> SITE <222> (24)..(24) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (25)..(63) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 102 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln 20 25 30 Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln 35 40 45 Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 60 <210> 103 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Plasmodium falciparum Th <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(61) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 103 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln 20 25 30 Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu 35 40 45 Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 60 <210> 104 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Schistosoma mansoni Th <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(57) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 104 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp 20 25 30 Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala 35 40 45 Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 <210> 105 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <220> <221> SITE <222> (26)..(26) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (27)..(65) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 105 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser 20 25 30 Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln 35 40 45 Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg 50 55 60 Cys 65 <210> 106 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF 2 Th <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(55) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 106 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 20 25 30 Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 35 40 45 Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 <210> 107 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF 3 Th <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (23)..(23) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(62) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 107 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser 20 25 30 Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly 35 40 45 Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 60 <210> 108 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> D or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(58) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 108 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro 20 25 30 Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala 35 40 45 Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 <210> 109 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(59) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 109 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala 20 25 30 Pro Asp Arg 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<211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Influenza NSP1 Th <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (11)..(49) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 113 Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln 20 25 30 Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg 35 40 45 Cys <210> 114 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> EBV BHRF1 Th <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(59) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 114 Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gly Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala 20 25 30 Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg 35 40 45 Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 <210> 115 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens 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sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Clostridium tetani TT2 Th <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(61) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 117 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln 20 25 30 Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu 35 40 45 Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 60 <210> 118 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT3 Th <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(56) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 118 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg 20 25 30 Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly 35 40 45 Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55 <210> 119 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sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> EBV BPLF1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (14)..(14) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(53) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 123 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln Lys Gly Leu 1 5 10 15 Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys 20 25 30 His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val 35 40 45 Pro His Pro Arg Cys 50 <210> 124 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> EBV EBNA-2 Th <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (13)..(51) <223> IgE-EMPD 1-39 <400> 124 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu Lys Gly Leu Ala Gly 1 5 10 15 Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser 20 25 30 Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His 35 40 45 Pro Arg Cys 50 <210> 125 <211> 74 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> UBITh(R)1 <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(54) <223> IgE-EMPD 7-40 (Macaca fascicularis) <220> <221> SITE <222> (55)..(55) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (56)..(74) <223> UBITh(R)1 <400> 125 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys 20 25 30 His Ser Glu Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Arg Gly Ser Val 35 40 45 Pro Asp His Arg Cys His Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val 50 55 60 Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 65 70 <210> 126 <211> 59 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(39) <223> IgE-EMPD 1-39 (Macaca fascicularis) <220> <221> SITE <222> (40)..(40) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (41)..(59) <223> UBITh(R)1 <400> 126 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Cys His Ser Glu Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Arg Gly 20 25 30 Ser Val Pro Asp His Arg Cys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly 35 40 45 Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 <210> 127 <211> 52 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(52) <223> IgE-EMPD 1-52 (Macaca fascicularis) <400> 127 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Cys His Ser Glu Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Arg Gly 20 25 30 Ser Val Pro Asp His Arg Cys His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp 35 40 45 Pro Gly Leu Pro 50 <210> 128 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> Spacer 1 <400> 128 Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro 1 5 <210> 129 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> Spacer 2 <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> epsilon K <400> 129 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 130 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> SITE <222> (1)..(19) <223> UBITh(R)2 <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (21)..(58) <223> IgEEMPD 1-39 <400> 130 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro 20 25 30 Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala 35 40 45 Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys 50 55

Claims (17)

  1. 다음 식으로 나타내어지는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체:
    (Th)m-(A)n-(IgE EMPD 단편)-X
    또는
    (IgE EMPD 단편)-(A)n-(Th)m-X
    또는
    (Th)m-(A)n-(IgE EMPD 단편)-(A)n-(Th)m-X
    이 때
    Th는 이종 보조 T 에피토프이고;
    A는 이종 스페이서이고;
    (IgE EMPD 단편)은 IgE EMPD의 중심 분자내 루프로부터 약 20 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프이고;
    X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이고;
    m은 1 내지 약 4이고; 그리고
    n은 0 내지 약 10이다.
  2. 청구항 1에 있어서, IgE EMPD 단편이 서열 번호: 5, 6, 8 및 9로 이루어진 그룹에서 선택되는, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
  3. 청구항 1 또는 2 중 어느 하나에 있어서, Th 에피토프가 서열 번호: 59-87로 이루어진 그룹에서 선택되는, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
  4. 청구항 1에 있어서, 펩티드 면역원 구조체가 서열 번호: 88-95, 98-124 및 130으로 이루어진 그룹에서 선택되는, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
  5. 다음을 포함하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체:
    서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 IgE EMPD 서열로부터의 약 20 내지 약 40개 아미노산 잔기를 포함하는 B 세포 에피토프;
    서열 번호 59-87로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 보조 T 에피토프; 그리고
    아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α,ε-N)Lys, 및 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호: 129)로 구성된 그룹에서 선택된 선택적 이종 스페이서,
    여기서 B 세포 에피토프는 직접 또는 선택적 이종 스페이서를 통해 보조 T 에피토프에 공유적으로 연결됨.
  6. 청구항 5에 있어서, B 세포 에피토프는 서열 번호: 5, 6, 8, 및 9로 구성된 그룹에서 선택되는, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
  7. 청구항 5에 있어서, 보조 T 에피토프는 서열 번호: 59-87로 구성된 그룹에서 선택되는, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
  8. 청구항 5에 있어서, 선택적 이종 스페이서는 (α, ε-N)Lys 또는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호: 129)인, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
  9. 청구항 5에 있어서, 보조 T 에피토프는 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유적으로 연결되는, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
  10. 청구항 5에 있어서, 보조 T 에피토프는 선택적 이종 스페이서를 통해 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유적으로 연결되는, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 펩티드 면역원 구조체를 포함하는 조성물.
  12. 다음을 포함하는 약학 조성물:
    a. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 펩티드 면역원 구조체; 및
    b. 약학적으로 허용되는 전달 비히클 및/또는 보조제.
  13. 청구항 12에 있어서,
    a. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 서열 번호: 88-95, 98-124, 및 130으로 구성된 그룹에서 선택되고; 및
    b. IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되어 안정화된 면역자극 복합체를 형성하는, 약학 조성물.
  14. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  15. 청구항 14에 있어서, IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체에 결합되는, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  16. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 IgE EMPD 펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  17. 청구항 14 내지 16 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 조성물.
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