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KR20200087702A - 종양 조직을 분자 프로파일링하기 위한 srm/mrm 검정 - Google Patents

종양 조직을 분자 프로파일링하기 위한 srm/mrm 검정 Download PDF

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KR20200087702A
KR20200087702A KR1020200002539A KR20200002539A KR20200087702A KR 20200087702 A KR20200087702 A KR 20200087702A KR 1020200002539 A KR1020200002539 A KR 1020200002539A KR 20200002539 A KR20200002539 A KR 20200002539A KR 20200087702 A KR20200087702 A KR 20200087702A
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KR
South Korea
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protein
proteins
tissue
tumor
amount
Prior art date
Application number
KR1020200002539A
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English (en)
Inventor
토드 에이. 헴브로우
파비올라 체키
케리 미나 스콧
사릿 슈왈츠
Original Assignee
난토믹스, 엘엘씨
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Filing date
Publication date
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Abstract

대상체로부터 수득된 포르말린 고정된 조양 조직의 생물학적 샘플 내에서 단백질 발현 프로파일을 개발하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 SRM/MRM 검정은 대상체의 종양 조직에서 직접적으로 세포 분열, 세포 분화, 세포 성장 억제, 세포 물질대사, 세포 신호전달, 및 종양 면역 반응/조절을 포함하는 세포 과정에 관여하는 단백질을 검출 및 정량화하는데 사용될 수 있다. SRM/MRM 검정은 발현의 세포 기원에 상관 없이, 대상체를 위한 최적의 암 요법 치료를 알려주는 전체 조직 미세환경의 종양 조직 프로파일을 제공해줄 수 있다.

Description

종양 조직을 분자 프로파일링하기 위한 SRM/MRM 검정{SRM/MRM ASSAYS FOR MOLECULAR PROFILING TUMOR TISSUE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허원은 2019년 1월 11일자로 출원된, 미국 가특허원 제62/791,486호의 이익을 청구하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
분야
개별화된 종양 프로파일을 위해 대상체, 예를 들면, 암 환자로부터 수득한 종양 조직의 질량 분석법-기반한 정량적 단백질 유전 정보 분석(mass spectrometry-based quantitative proteomic analysis)을 위한 방법이 제공된다. 대상체의 종양 조직에서 수행된 이러한 단백질 검정은 1) 면역-기반 암 치료요법에 대한 양성 또는 음성 반응과 관련될 수 있고(여기서 검정은 면역-기반한 암 치료요법에 대한 양성 또는 음성 반응을 효과적으로 예측할 수 있다), 2) 분자-표적화된 암 치료요법에 대한 양성 또는 음성 반응과 관련될 수 있으며(여기서 당해 검정은 분자적으로 표적화된 암 치료요법에 대한 양성 또는 음성 반응을 예측할 수 있다), 3)　환자 자신의 종양 세포를 공격하는 환자 자신의 면역 시스템을 개시하고/하거나, 억제하고/하거나, 촉진하고/하거나 그렇지 않으면 조절할 수 있는 단백질의 수준을 검출하고 이의 수준을 정량화한다. 이러한 방법에 의해 제공된 대상체의 종양 조직 단백질 유전 정보 프로파일은 종양 세포를 특이적으로 공격하여 사멸시키거나 대상체의 종양 면역 반응을 조절하여 종양 세포를 사멸시키도록 설계된 암 치료제를 사용하는 개선된 암 치료 방법의 일부로서 사용된다.
종양 세포 내에서 비정상적으로 발현되고 종양 세포 성장 및 생존을 추구하는 단백질(암 생물마커)의 소 분자(small molecule) 및 생물학적 억제제는 다양한 암에 대한 치료제로서 사용된다. 비정상적으로 발현되어 종양 세포 성장 및 생존을 추구하는 암 생물마커 단백질의 예는 Met, IGF-1R, 및 Her2를 포함한다. 암 치료제는 이러한 단백질과 직접 상호작용하기 위해 개발되었다. 따라서, 환자 종양 조직 내에서 이러한 단백질의 발현을 직접 검출하고 이러한 단백질을 정량화하는 것은 치료제, 또는 제제의 조합물을 선택하고 투여하기 위한 치료 요법 중 일부로 사용될 수 있으며, 이는 이러한 단백질의 기능을 억제하여, 종양 세포 성장을 예방하고 전체적인 환자 생존을 촉진할 것이다. 종양 조직 내에서, 및 특히 이러한 조직 내에 존재하는 종양 세포내에서 단백질의 정밀한 검출 및 정량화는 조직 미세해부(microdissection)에 의해 환자 종양 조직으로부터 추출된 종양 세포 내에서 발현된 단백질로부터 유래된 특이적인 프로테아제-분해된 펩타이드의 질량 분석법-SRM/MRM 분석을 통해 효과적으로 수행될 수 있다. 단일 SRM/MRM 검정에서 이러한 단백질의 그룹을 한번에 정량화하는 것은 종양 세포-표적화된 암 치료제를 통지하기 위한 단백질 발현 랜드스케이프(protein expression landscape)의 "프로파일" 또는 "특징(signature)"를 제공한다. 표적화된 치료제를 사용한 치료 요법의 일부로서 사용되는 정량적 검정의 예는 IGF-1R 단백질(참고: 미국 특허 제8,728,753호) 및 cMet 단백질(참고: 미국 특허 제9,372,195호)을 포함한다.
암 과정을 작동시킴으로써 종양 세포 성장을 예방하는 단백질의 기능을 구체적으로 억제하도록 설계된 암 치료제의 추가의 예는 트라스투주맙이다. 다른 것들 중에서도 상표명 Herceptin® 하에 시판된 트라스트주맙은 유방암, 그러나 또한 종양 조직내의 종양 세포에서 Her2 수용체 단백질을 발현하는 다른 암을 치료하는데 주로 사용된 모노클로날 항체이다. 트라스투주맙은 Her2 수용체 단백질의 세포외 분절(extracellular segment)의 도메인 IV에 결합한다. 트라스투주맙으로 치료된 종양 세포는 세포 주기의 G1 상 동안 저지됨으로써 증식이 감소된다. 트라스투주맙은 HER-2 유전자 발현을 HER-2 유전자 발현을 변경시키지 않지만, AKT의 활성화를 하향조절하는 것으로 시사되어 왔다. 또한, 트라스투주맙은 항-혈관형성 인자의 유도 및 전-혈관형성 인자의 억제 둘 다에 의해 혈관형성을 억제한다. 암에서 관찰된 하향조절된 성장에 대한 기여는 세포외 도메인의 방출을 야기하는 Her2 단백질의 단백질분해 절단에 기인할 수 있는 것으로 고려된다. 트라스투주맙은 또한 유방암 세포내에서 Her2 엑토도메인 절단을 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 또한 종양 세포 성장을 억제하는데 도움을 준다.
암 환자 종양 면역 반응을 특징으로 하는 단백질이 약제 산업에 의해 연구 중에 있다. 이러한 단백질은 일반적으로, 및 비정상적으로, 많은 상이한 세포형, 예를 들면, 종양 세포, 고형 조직내 양성 세포, 및 다양한 계통의 혈액-기원한 림프구에서 발현된다. 이러한 단백질은 환자 자체의 종양 세포에 대한 그/그녀 자체의 면역 반응을 개시하거나, 향상시키거나, 조절하거나, 억제하는 기능을 한다. 이러한 단백질 각각이 명백한 기능을 가지지만, 면역계에 대한 이들의 효과는 단백질을 발현하는 세포에 의존할 수 있다. 정상적인 설정에서, 면역계는 림프구-의존성 종양 세포 사멸을 통해 매개된 자가 대 비 자가-인식의 복잡한 분자 신호전달 과정을 통해 종양 세포를 근절하도록 기능한다. 그러나, 이러한 복잡한 과정은 면역 감시를 피하려고 하는 종양 세포에 의해 방해받을 수 있다. 이러한 단백질과 상호작용하여 면역계를 조작함으로써 종양 세포를 공격하여 사멸시키는 소 분자 및 생물학적 치료제가 개발되었다. 표적화된 면역조절 치료제의 성공적인 투여는 어느 표적 단백질이 조직내에서 발현되는지를 측정하기 위한 환자 면역계 랜드스케이프(landscape)의 단백질 발현 "프로파일" 또는 "특징"으로부터 크게 유리할 수 있다. 이후에, 이러한 면역 프로파일은 어느 치료제, 또는 제제의 조합이 최적의 환자 결과를 위해 종양 세포에 대해 환자 면역계를 무장시키고/시키거나, 조절하고/하거나, 조작하고/하거나, 뒷받침하는 최대 기회를 제공할 가능성이 있는지를 알려줄 수 있다.
환자 면역계를 조작하도록 설계된 암 치료제의 유형의 예는 면역 체크포인트 단백질로서 공지된 단백질의 수집물과 상호작용하는 면역 체크포인트 억제제로서 공지된 화합물의 수집물이다. PD-1 단백질은 T 세포가 체내에서 다른 세포를 공격하는 것을 유지하도록 돕는 "오프 스위치(off switch)"의 유형으로서 작용하는, T 세포로 불리는 림프구 상에 일반적으로 잔류하는 면역 체크포인트 단백질이다. 이는 일부 정상(및 암) 세포의 표면에 존재하는 단백질인, PD-L1에 부착하는 경우 이를 수행한다. PD-1이 PD-L1에 결합하는 경우, 이는 T 세포가 PD-L1을 발현하는 세포를 공격하지 않도록 신호한다. 일부 암 세포는 다량의 PD-L1을 가지고 있으며, 이는 암 세포를 면역계에 대해 차폐시켜 이들이 면역 감시를 피하여 T 세포로부터의 공격을 방지하도록 한다. PD-1 또는 PD-L1을 표적화하는 모노클로날 항체는 암 세포를 차폐시키지 않음으로써 암 세포에 대한 면역 반응을 증강(boosting)시킬 수 있다. 이러한 암 치료 전략은 특정한 암의 치료에서 크게 촉망되는 것으로 밝혀졌으며 PD-1 억제제의 예는 펨브롤리주맙(Keytruda®) 및 니볼루맙(Opdivo®)을 포함한다. 이러한 약물은 몇가지 유형의 암, 예컨대, 흑색종, 비-소세포 폐암, 신장 암, 두경부 암, 및 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma)을 치료하는데 도움을 주는 것으로 밝혀졌다. 이들은 또한 많은 다른 유형의 암에 대해 사용하기 위해 연구되고 있다. PD-L1 억제제의 예는, 현재 방광암을 치료하는데 사용되고, 또한 다른 유형의 암에 대해 사용하기 위해 연구 중에 있는 아테졸리주맙(Tecentriq®)이다. PD-1 또는 PD-L1을 표적화하는 많은 다른 약물이 또한 단독으로 및 다른 약물과 함께 현재 임상 시험에서 시험 중에 있다. 이러한 예는 효과적으로 표적화된 면역-계 암 치료 전략의 일부로서 사용될 수 있는 종양 세포 및 면역계 세포 둘 다의 분자 상태의 지식 정도를 입증한다.
조직학적으로 구체화된 세포 집단의 분자 프로파일링을 위한 환자 종양 조직 단면으로부터 직접 세포의 동종 집단을 입수하는 능력은 매우 유리한데, 이에 의해, 예를 들면, 다른 유형의 세포, 예를 들면, 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 및 면역 세포내에 잔류할 수 있는 종양 세포가 연구될 수 있다. 레이저 포획 미세해부(Laser Capture Microdissection: LCM) 기술(미국 특허 제6,867,038호)을 사용하여 정밀하게 정의된 세포 집단에 대해 종양 조직의 분자 분석을 구분할 수 있다. LCM 뿐만 아니라, 다른 시판되는 조직 미세해부 기술, 예컨대, DIRECTOR 기술(미국 특허 제7,381,440호)은 병리학적으로 관련된 환경에 위치할 조직 샘플로부터 유래된 세포의 분자 프로파일링을 허용함으로써 조직 샘플의 분석을 개선시켰다.
암 환자 종양 조직으로부터 직접 제조된 단백질 유전 정보 용해물(lysate)에 있어서 구체적인 단백질의 수준을 검출하고 정량화하는데 사용될 수 있는 SRM/MRM 검정이 제공된다. 이러한 단백질은 암 치료제의 선택을 통지하고 치료 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 분석되는 단백질은 종양 세포의 개시 및 성장을 제공하며, 이러한 단백질의 세포 위치는 성장 인자, 성장 인자 수용체, 세포 신호 수용체, 세포간 통신 단백질(cell to cell communication protein), 세포 구조 단백질, 전사 인자, 핵산 프로세싱 단백질, DNA 합성 단백질, DNA 복구 단백질, 세포 분열 단백질, 신호 경로 단백질, 대사 경로 단백질, 분비된 단백질, 세포막 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질, 막-결합된 단백질, 및 단백질 해독 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 단백질은 치료제의 표적, 구체적인 치료제에 대한 환자 결과의 예측인자, 및/또는 암 환자 면역계의 조절인자일 수 있다.
본원에 기술된 SRM/MRM 검정은 종양 세포의 개별화된 분자 프로파일을 환자 종양 조직 내에서 직접 개발하는데 유용하다. 일단 이러한 단백질의 발현 상태가 측정되면 이후에 구체적인 치료제를 환자에게 투여할 수 있으며 이에 의해 이러한 제제는 본원에 기술된 SRM/MRM 검정에 의해 검출되고 측정된 단백질과 상호작용하여 종양 세포를 사멸시킬 이러한 단백질의 기능을 억제하거나 향상시킬 수 있다. 또한, 암 환자 자신의 면역계가 환자 자신의 종양 세포를 사멸하도록 유도하는 치료제를 이러한 치료 요법의 일부로서 암 환자에게 투여할 수 있다. 종양-관련된 단백질 및 면역계-지시된 치료제를 특이적으로 표적화하는 치료제는 둘 다 본원에 기술된 SRM/MRM 검정에 의해 측정된 바와 같이, 암 환자 분자 프로파일에 직접 매치됨으로써 표적화된 및 면역학적 기반의 암 치료 둘 다에 대해 개별화된 전략을 제공할 수 있다.
환자 조직 내에서 직접 하나 이상의 단백질로부터 구체적인 단편 펩타이드를 검출하고/하거나 정량화하기 위한 방법이 제공된다. 하나 이상의 단백질은 CDK12, CHD4, CLDN18.2, CSNK1A1, EZR, FAK1, FAS, FTH1, INSR, JAK1, LDHA, LDHB, MICA, MICB, N-Myc, NRP1, PAK1, PARP2, PDK2, SELL, SMARCA2, STEAP1, SYK, TP53BP1, TROP2, ULBP2, ULBP3, XPF, ASS1, MELTF, RNF43, CLDN6, CLDN9, DPEP3, 및 GPC1으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 개선된 치료방법이 제공되며 여기서 생물학적 샘플(예컨대, 종양 조직 샘플)이 수득된 환자 또는 대상체에게 치료학적 유효량의 암 치료제가 투여되며, 여기서, 투여된 암 치료제 및/또는 암 치료제의 양은 하나 이상의 단백질의 임의의 하나 이상의(멀티플렉스(multiplex))의 단편 펩타이드의 검출 및/또는 양을 기반으로 하고, 여기서 암 치료제는 면역조절성 암 치료제이며 이의 기능은 환자 면역 반응을 개시하고/하거나, 향상시키고/시키거나, 조작하고/하거나, 그렇지 않으면 조절하여 환자내 암 세포를 공격하고 사멸시키는 것이다. 단편 펩타이드는 예를 들면, 서열 번호 1 내지 59의 펩타이드일 수 있다.
구체적으로, 사람 생물학적 샘플, 예컨대, 포르말린-고정된 조직의 샘플에서 하나 이상의 단백질의 하나 이상의 수준을 검출하고 이를 측정하는 방법이 제공되며, 여기서 이러한 방법은 질량 분석법에 의해 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물(protein digest) 내에서 하나 이상의 단편 펩타이드의 양을 검출하고 정량화하는 단계 및 샘플 내에서 하나 이상의 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하고, 여기서 이러한 양은 상대량 또는 절대량이다. 단백질 분해물은 예를 들면, 액체 크로마토그래피, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고 성능 액체 크로마토그래피, 및/또는 역상 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 하나 이상의 단편 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량화하기 전에 분획화시킬 수 있다. 단백질 분해물은 프로테아제 분해물, 예컨대, 트립신 분해물일 수 있다. 단백질 분해물은 유리하게는 Liquid Tissue® 프로토콜에 의해 제조할 수 있다.
질량 분석법 방법은 탄뎀 질량 분석법(tandem mass spectrometry), 이온 트랩 질량 분석법(ion trap mass spectrometry), 삼중 4극자 질량분석법(triple quadrupole mass spectrometry), 오르비트랩 질량 분석법(orbitrap mass spectrometry), 하이브리드 이온 트랩/4극자 질량 분석법(hybrid ion trap/quadrupole mass spectrometry), MALDI-TOF 질량 분석법, MALDI 질량 분석법, 및/또는 비행 시간 질량 분석법(time of flight mass spectrometry)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 단백질의 절대량을 측정하는데 사용된 질량 분석법의 방식은 예를 들면, 선택된 반응 모니터링(SRM), 다중 반응 모니터링(MRM), 지능적 선택 반응 모니터링(intelligent Selected Reaction Monitoring: iSRM), 병렬 반응 모니터링(Parallel Reaction Monitoring: PRM), 및/또는 다중 선택된 반응 모니터링(multiple Selected Reaction Monitoring: mSRM)일 수 있다. 질량 분석법의 방법은 데이타 독립적인 획득 방법(Data Independent Acquisition method)일 수 있다. 측정되는 단백질 단편 펩타이드 또는 펩타이드는 예를 들면, 서열 번호: 1 내지 59에 나타낸 펩타이드 중 하나 이상일 수 있다.
분해물을 제조하는데 사용된 조직은 파라핀 포매된 조직(paraffin embedded tissue)일 수 있으며, 종양, 예컨대, 1차 종양 또는 2차 종양으로부터 수득될 수 있다.
하나 이상의 단백질을 정량화하는 하나의 방법은 하나의 생물학적 샘플 내의 단편 펩타이드의 양을 상이하고 별개의 생물학적 샘플 내의 동일한 단편 펩타이드의 양과 비교하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 단백질을 정량화하는 추가의 방법은 생물학적 샘플 내의 단편 펩타이드의 양을 동일한 생물학적 샘플 내의 다른 및 상이한 단백질로부터의 다른 및 상이한 단편 펩타이드와 비교하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 단백질을 정량화하는 추가의 방법은 동일한 아미노산 서열을 갖는 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드에 대해 비교함으로써 생물학적 샘플 내의 단편 펩타이드의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 내부 표준 펩타이드는 동위원소적으로 표지된 펩타이드일 수 있으며, 이는 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 안정한 중 동위원소를 포함할 수 있다.
이러한 방법에서, 단백질 분해물 내의 적어도 하나의 단백질 단편 펩타이드를 검출하고 정량화하는 단계는 환자 또는 대상체내에서 상응하는 단백질의 존재 및 암과의 연관성(association)을 나타낸다. 이러한 방법은 하나 이상의 단편 펩타이드, 또는 상응하는 단백질(들)의 양을 검출하고 정량화하는 단계의 결과를, 암의 진단적 조직학/단계/등급/상태와 관련시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 단편 펩타이드를 암의 진단적 조직학/단계/등급/상태에 대해 검출하고 정량화하는 단계의 결과를 관련시키는 단계는 다른 단백질 또는 다른 단백질로부터의 단편 펩타이드의 양을 멀티플렉스 방식으로 검출하고/하거나 정량화하는 단계와 조합시켜 암의 진단적 조직학/단계/등급/상태에 대한 추가의 정보를 제공할 수 있다.
환자 종양 조직으로부터 직접 제조된 단백질 유전 정보 용해물 내의 다양한 기능 및 세포 위치를 갖는 단백질의 수집물로부터 유래된 구체적인 프로테아제-분해된 펩타이드를 정밀하게 정량화함으로써, 암 환자에 대한 분자 프로파일을 개발하는데 유용한 구체적인 질량 분석법-SRM/MRM 검정을 수행하기 위한 방법이 제공된다. 공정 및 검정은 환자 종양의 분자 랜드스케이프를 이해하고 종양 세포를 직접 사멸시키거나 환자 자신의 종양 세포에 대해 활성이고 성공적인 면역 반응을 유도하고/하거나, 개시하고/하거나, 뒷받침하고/하거나 기타의 경우에는 조작하여, 증진된 환자 생존을 이끄는 최적의 암 치료제의 선택을 안내하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 포르말린 고정된 파라핀 포매된(embedded) 종양 조직과 같은, 암 환자로부터의 생물학적 샘플로부터의 세포는 예를 들면, 조직 미세해부의 방법론을 사용하여 수집한다. 질량 분석법 분석을 위한 용해물은 예를 들면, Liquid Tissue® 시약 및 프로토콜(참고: 미국 특허 제7,473,532호)를 사용하여 수집된 세포로부터 제조한다. 용해물은 하기 보다 상세히 기술된 바와 같이 구체적인 SRM/MRM 검정을 사용하여 분석하며, 여기서 검정은 개별적으로 또는 멀티플렉스 방식으로, 및 분자 프로파일을 개발하기 위해 이러한 SRM/MRM 검정으로부터 단백질 검출/정량화 데이타를 사용하여 수행된다. 이러한 방법 및 수득되는 SRM/MRM 검정 데이타를 사용하여 단백질 기능을 억제하여 종양 세포를 사멸시키고 이들의 성장을 억제하도록 직접 기능하는 치료제를 사용하여 환자에 대해 개선된 또는 최적의 치료 요법을 결정할 수 있다. 또한, SRM/MRM 검정 데이타를 사용함으로써 본원에 기술된 SRM/MRM 검정에 의해 검출되고/되거나 정량화된 하나 이상의 단백질과 직접 상호작용시켜 암 환자 면역계를 개시하고/하거나, 조절하고/하거나, 달성하고/하거나, 향상시키고/시키거나 그렇지 않으면 조작하여 종양 세포를 사멸하도록 기능하는 치료제를 사용하여 환자에 대한 증진된 또는 최적의 치료 요법을 결정할 수 있다.
기술된 SRM/MRM 검정에 의해 환자 분자 프로파일을 결정하는 것은 다양한 환자-유래된 샘플, 예컨대, 이에 한정되지 않는 혈액, 뇨, 가래, 흉막 삼출액, 종양 주변의 염증성 유액, 정상 조직, 및/또는 종양 조직에서 수행할 수 있다. 유리하게는, 샘플은 포르말린 고정된 파라핀 포매된 환자 종양 조직이다.
포르말린-고정된, 파라핀 포매된 조직(FFPE)은 암 환자로부터의 조직, 예를 들면, 종양 조직의 가장 광범위하고 가장 유리하게 이용가능한 형태이다. 외과적으로 제거된 조직의 포름알데하이드/포르말린 고정은 단연코 세계적으로 암 조직 샘플을 보존하는 가장 일반적인 방법이며 표준 병리학 실시에서 허용되는 관례이다. 포름알데하이드의 수용액은 포르말린으로 지칭된다. "100%" 포르말린은 수중 포름알데하이드(약 40 용적% 또는 37 용적%)의 포화된 용액으로 이루어지며, 소량의 안정화제, 일반적으로 메탄올을 사용하여 산화 및 중합도를 제한한다. 조직을 보존하는 가장 일반적인 방식은 전체 조직을 연장된 시간(8시간 내지 48시간) 동안 일반적으로 10% 중성 완충된 포르말린으로 명명된, 수성 포름알데하이드 속에 침지시킨 후, 고정된 전체 조직을 긴 기간 저장동안 실온에서 파라핀 왁스 속에 포매하는 것이다. 포르말린 고정된 암 조직을 분석할 수 있는 분자 분석 방법이 암 환자 조직의 분석을 위해 가장 허용되고 매우 활용되는 방법이다.
암 환자 조직, 특히 FFPE 조직 내에서 단백질 발현을 분석하기 위해 현재 적용된 가장 광범위하게 사용된 방법론은 면역조직화학(IHC)이다. IHC 방법론은 목적한 단백질을 검출하기 위해 항체를 사용한다. IHC 시험의 결과는 병리학자 또는 조직기술학자에 의해 가장 빈번하게 해석된다. 이러한 해석은 주관적이며 구체적인 단백질을 표적화하는 치료제에 대한 민감성의 예측일 수 있는 정량적 데이타를 제공하지 않는다. 또한, IHC 검정, 예를 들면, Her2 IHC 시험을 포함하는 연구는 이러한 시험으로부터 수득된 결과가 잘못될 수 있거나 오해의 소지가 있을 수 있음을 시사하고 있다. 이는 상이한 실험실이 양성 및 음성 IHC 상태를 분류하기 위한 상이한 규칙을 사용하기 때문인 듯 하다. 시험을 작동시키는 각각의 병리학자들은 또한 상이한 기준을 사용하여 결과가 양성인지 또는 음성인지를 결정할 수 있다. 대부분의 경우에, 이는 시험 결과가 경계선에 있는 경우, 즉, 결과가 강하게 양성이 아니거나 강하게 음성이 아닌 경우 일어난다. 다른 경우에, 암 조직 단면의 하나의 부위에 존재하는 세포는 양성으로 시험될 수 있지만 암 조직 단면의 상이한 부위에서의 세포는 음성으로 시험될 수 있다. 부정확한 IHC 시험 결과는 암으로 진단된 환자가 가장 우수한 가능성이 있는 보호를 제공받지 못함을 의미할 수 있다. 종양 조직의 모두 또는 구체적인 영역/세포는 구체적인 단백질에 대해 실제로 양성이지만 시험 결과가 이를 음성으로 분류하는 경우, 주치의는 정확한 치료학적 치료를 환자에게 실시하지 않는 경향이 있다. 종양 조직이 실제로 특정 단백질의 발현에 대해 음성이지만 시험 결과가 이를 양성으로 분류하는 경우, 주치의는 환자가 임의의 이점을 제공받지 않을 뿐 아니라 제제의 2차 위험에 노출될 것임에도 구체적인 치료학적 치료를 사용할 수 있다. 따라서, 종양 조직 내에서 구체적인 면역-계 단백질의 정량적 수준을 정밀하게 검출하고 정확하게 평가함으로써 환자가 불필요한 독성 및 다른 부작용을 감소시키면서 성공적인 면역조절 치료 요법을 제공받는 최대 기회를 가질 능력에 있어서 큰 임상적 가치가 존재한다.
종양 조직 내에서 구체적인 단백질의 정량적 수준의 정밀한 검출 및 정확한 평가는 SRM/MRM 방법론에 의해 질량 분석기 속에서 효과적으로 측정될 수 있다. 이러한 방법론은 구체적인 단백질, 예컨대, 암 생물마커 및 면역-계 단백질로부터의 독특한 단편 펩타이드를 검출하고 정량화하며, 여기서 각각의 펩타이드의 SRM/MRM 특징적 크로마토그래피 피크 부위는 Liquid Tissue® 용해물 내에 존재하는 복합체 펩타이드 혼합물 속에서 측정된다(참고: 미국 특허 제7,473,532호). 포르말린-고정된 조직으로부터 복합체 생물분자 샘플을 직접 제조하는 한가지 방법은 미국 특허 제7,473,532호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 미국 7,473,532호에 기술된 방법은 Expression Pathology Inc.(미들랜드주 록빌 소재)로부터 입수가능한 Liquid Tissue® 시약 및 프로토콜을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 단백질의 정량적 수준은 이후에 SRM/MRM 방법론에 의해 측정되며 이에 의해 생물학적 샘플 내 각각의 단백질로부터의 개개의 특정한 펩타이드의 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크 부위가 개개 단편 펩타이드 각각에 대한 공지된 양의 "스파이크된(spiked)" 내부 표준물의 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크 부위와 비교된다.
일 구현예에서, "스파이크된" 내부 표준물은 동일한 정확한 단백질-유래된 단편 펩타이드의 합성 버젼이며 여기서 합성 펩타이드는 하나 이상의 중 동위원소, 예컨대, 2H, 18O, 17O, 15N, 13C, 또는 이의 조합물로 표지된 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유한다. 이러한 동위원소 표지된 내부 표준물이 합성되어 질량 분석법 분석이 천연의 단편 펩타이드 크로마토그래피 특징 피크와는 상이하고 명백하며 비교인자 피크로서 사용될 수 있는 예측가능하고 일관된 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크를 생성한다. 따라서, 내부 표준물이 공지된 양으로 생물학적 샘플로부터의 단백질 또는 펩타이드 제제내로 "스파이크"되고 질량 분석법으로 분석되는 경우, 천연 펩타이드의 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크 부위는 내부 표준 펩타이드의 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크 부위와 비교되며, 이러한 수치 비교는 생물학적 샘플로부터의 원래의 단백질 유전 정보 제제 속에 존재하는 천연의 펩타이드의 절대 몰 농도 및/또는 절대 중량을 나타낸다. 단편 펩타이드에 대한 정량적 데이타는 샘플당 분석된 단백질 유전 정보 분해물의 양에 따라 나타난다.
주어진 단백질에 대한 단편 펩타이드에 대해 SRM/MRM 검정을 개발하고 수행하기 위하여, 단순하게 펩타이드 서열을 능가하는 추가의 정보를 질량 분석기에 의해 활용할 수 있다. 이러한 추가의 정보를 사용하여 질량 분석기(예컨대, 삼중 4극 질량 분석기)를 지시하고 명령함으로써 구체적인 단편 펩타이드의 정확하고 초점을 맞춘 분석을 수행할 수 있다. 표적 펩타이드에 대한 추가의 정보는 일반적으로 각각의 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온, 및 각각의 전이 이온의 이온 유형 중 하나 이상을 포함할 수 있다. SRM/MRM 검정은 삼중 4극자 질량 분석기 또는 이온 트랩/4극자 하이브리드 장치에서 효과적으로 수행될 수 있다. 이러한 유형의 질량 분석기는 세포 내에 함유된 모든 단백질로부터의 수십만개 내지 수백만개의 개개 펩타이드를 함유하는 매우 복잡한 단백질 분해물 내에서 단일의 단리된 표적 펩타이드를 분석할 수 있다. 이러한 추가의 정보는 정확한 지시를 지닌 질량 분석기를 제공함으로써 매우 복잡한 단백질 분해물 내에서 단일의 단리된 표적 펩타이드의 분석을 허용한다. SRM/MRM 검정은 또한 다른 유형의 질량 분석기, 예컨대, MALDI, 이온 트랩, 이온 트랩/4극자 하이브리드, 또는 삼중 4극자 장치에서 개발되어 수행될 수 있다. 이온 트랩 질량 분석기는 일반적으로 데이타 독립적인 획득(Data Independent Acquisition: DIA) 검정을 위한 펩타이드의 전반적인 프로파일링을 수행하기 위한 질량 분광기의 가장 우수한 유형으로 고려된다.
생물학적 샘플 내에서 구체적인 단백질을 검출하고 정량화하기 위한 단일 SRM/MRM 검정에 대한 토대는 단백질의 보다 큰, 전체 길이 버젼으로부터 유래된 하나 이상의 단편 펩타이드의 확인 및 분석이다. 이는 질량 분석기가 매우 작은 분자, 예컨대, 단일 단편 펩타이드를 분석하는 경우 매우 효율적이고, 능숙하며, 재현가능한 장치이지만, 질량 분석기는 전체 길이의, 완전한 단백질을 효율적으로, 능숙하게, 또는 재현가능하게 검출하여 정량화할 수 없다.
개개 단백질에 대한 단일 SRM/MRM 검정을 개발하기 위한 후보물 펩타이드는 이론적으로는, 예를 들면, 완전한 전체 길이의 단백질의 트립신을 사용한 분해와 같이, 완전한 프로테아제 분해로부터 생성된 임의의 개개 펩타이드일 수 있다. 그러나, 놀랍게도, 많은 펩타이드는, 일부 단백질의 경우, 실제로, 적합한 펩타이드가 아직까지 발견되지 않았으므로 임의의 제공된 단백질의 신뢰가능한 검출 및 정량화에 적합하지 않다. 따라서, 주어진 단백질에 대해 SRM/MRM에 의해 검정하기 위한 가장 유리한 펩타이드가 어느 것인지 예측하는 것은 불가능하며, 따라서 각각의 펩타이드에 대한 구체적으로 정의된 검정 특징이 실험적으로 발견되고 측정되어야만 한다. 이는 포르말린 고정된 파라핀 포매된 조직으로부터의 단백질 용해물, 예컨대, Liquid Tissue® 용해물 내에서 분석하기 위한 가장 우수한 SRM/MRM 펩타이드를 확인하는 경우 특히 그러하다. 본원에 기술된 SRM/MRM 검정은 각각의 단백질에 대해 하나 이상의 프로테아제-분해된 펩타이드(트립신 분해된 펩타이드)를 지정하며 이에 의해 각각의 펩타이드는 포르말린 고정된 환자 조직으로부터 제조된 Liquid Tissue® 용해물 내에서 SRM/MRM 검정용으로 유리한 펩타이드인 것으로 밝혀졌다. 펩타이드는 또한 상대적인 정량화로 발현을 검출하기 위한 DIA 검정에 유용하다.
본원에 기술된 SRM/MRM 검정은 환자 종양 조직 미세환경의 분자 프로파일을 개발하는데 사용될 수 있는 단백질을 검출하고 정량화한다. 이러한 단백질은 광범위한 기능을 제공하며 세포내 매우 다양한 위치에서 발견된다. 이러한 단백질은 성장 인자, 성장 인자 수용체, 세포외 매트릭스 단백질, 핵 전사 인자, 상피 세포 분화 인자, 세포 신호전달 단백질, 면역 세포 분화 인자, 세포/세포 인식 인자, 자가 대 종양 인식 인자, 면역 세포 활성화 인자, 면역 세포 억제 인자, 및 면역 체크포인트 단백질(immune checkpoint proteins)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 단백질의 수집물 내의 이러한 개개 단백질 각각은 암 환자내 매우 다양한 세포, 예컨대, 이에 한정되지 않는, 모든 다양한 고형 조직 세포, 예컨대, 상피 종양 세포, 정상 상피 세포, 정상 섬유아세포, 종양-관련 섬유아세포, 정상 내피 세포, 종양-관련 내피 세포, 정상 간엽성 세포, 및 종양-관련 간엽성 세포에 의해 존재할 수 있고 발현된다. 이러한 단백질 각각은 매우 다양한 혈액 기원한 백혈구 세포, 예컨대, 이에 제한되지 않는 모든 다양한 림프구, 예컨대, B 세포, T 세포, 대식구, 수상돌기, 비만 세포, 천연 킬러 세포, 호산구, 호중구, 및 호염기구에 의해 발현될 수 있다. 많은 경우에서 이러한 개개 단백질 각각은 고형 조직 세포 및 혈액-기원한 조직 세포 둘 다에 의해 발현될 수 있음이 잘 알려져 있다.
이러한 단백질 각각의 세포 발현 양식은 개인의 건강 상태에 따라 매우 상이할 수 있다. 일반적이고 통상적인 건강 상태 하에서 이러한 단백질은 세포 건강 및 건강한 면역계를 유지한다. 건강한 면역계를 유지하는 것과 관련하여, 자체적인 세포 인식은 주로 주요 조직적합성 복합체(MHC)를 통해, 비-자체적인 인식과 균형을 이룬다. MHC는 척추동물에서 면역계가 외부 분자를 인식하는데 필수적인 세포 표면 단백질의 세트이며, 이는 궁극적으로 조직접합성을 결정한다. MHC 분자의 주요 기능은 병원체로부터 유래된 펩타이드 단편에 결합하여 이들을 적절한 T-세포에 의한 인식을 위해 세포 표면에 나타냄으로써 면역 반응이 병원체에 대해 장착될 수 있도록 하는 것이다. MHC 분자는 다른 백혈 세포 또는 고형 조직 체 세포와, 면역 세포인 적혈 세포의 상호작용을 매개한다. MHC는 기관 이식을 위한 공여체의 적합성 뿐만 아니라, 가교-반응 면역화를 통해 자가면역 질환에 대한 기관이식체의 민감성을 결정한다. 사람에 있어서, MHC는 또한 사람 백혈구 항원(HLA)으로 불린다. 세포 내에서, 숙주 자체의 표현형 또는 다른 생물학적 실체의 단백질 분자는 지속적으로 합성되고 분해된다. 세포 표면 상의 각각의 MHC 분자는 에피토프(epitope)로 불리는, 단백질의 분자 분획을 나타낸다. 표시된 항원은 자가이거나 비-자가일 수 있다. 항원이 자가 인식되는 경우, 이후에 유기체 면역계는 이의 자체의 세포를 면역 사멸 반응으로 표적화하는 것이 방지된다.
MHC는 병원체로부터 신체를 보호할 뿐 아니라 암 세포의 천연적인 제어에 있어서 중요한 역할을 한다. 암 세포는 많은 돌연변이된 단백질을 함유하며 MHC 분자에 의해 면역계를 변경시키도록 나타날 수 있는 비정상적으로 발현된 단백질을 함유한다. 종양 세포는 또한 정상의 단백질을 발현할 수 있지만 비정상적인 위치에서, 비정상적인 방법으로, 및/또는 비정상적인 양으로 신호를 제공함으로써 면역 반응을 일으키거나 억제할 수 있다. 정상 세포는 이의 제I 부류 MHC에서 정상적인 세포 단백질 턴오버(turnover)를 나타낼 것이며, 면역계 세포(백혈 세포)는 적혈 세포의 표면에서 정상적으로 발현된 구체적인 단백질에 의해 매개된 중추 및 말초 내성 메카니즘으로 인하여 이들에 대한 반응시 활성화되지 않을 것이다. 세포가 바이러스 감염 후 또는 암 세포에 의한 비정상적인 단백질 발현의 경우에서와 같이, 외부 단백질을 발현하는 경우, 제I 부류 MHC의 분획은 세포 표면에서 이러한 펩타이드를 나타낼 것이다. 결과적으로, MHC:펩타이드 복합체에 대해 특이적인 이러한 백혈 세포는 이러한 세포, 예컨대, 비정상 펩타이드를 표시하는 암 세포를 인식하고 사멸할 것이다. 대안적으로, 제I 부류 MHC 자체는 바이러스 감염된 세포 및 암 세포를 사멸시키는, 천연 킬러 세포(NK)로 불리는, 백혈 세포의 이러한 집단에 대한 억제 리간드로서 작용할 수 있다. 면역 회피 동안 또는 특정의 종양에서 일부 바이러스에 의해 사용된 메카니즘인, 표면 제I 부류 MHC의 정상 수준에 있어서의 감소는 NK-매개된 세포 사멸을 불활성화시킴으로써 면역-매개된 사멸을 회피하도록 도울 수 있다.
면역 감시를 피하기 위해 여전히 다른 전략을 활용하는 암 세포의 추가의 예는 PD-L1 체크포인트 단백질을 비정상적으로 발현하는 암 세포의 경우에서이다. 프로그램화된 사멸-리간드 1(PD-L1)은 특수한 상황, 예컨대, 임신, 조직 동종이식, 자가면역 질환 및 다른 질환 상태, 예컨대, 암 동안 면역계를 억제하는데 있어서 중요학 역할을 하는 막횡단 단백질(transmembrane protein)이다. 일반적으로, 면역계는 외부 항원에 대해 반응하며 여기서 PD-1을 발현하는 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 증식을 개시하는 림프절 또는 비장내에 일부 축적이 존재한다. PD-1에 대한 PD-L1의 결합은 이러한 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전송함으로써 면역계에 암 세포를 무시하라고 신호전달한다.
암 세포에 의한 PD-L1의 상향조절된 비정상적인 발현은 암세포가 숙주 면역계를 피하도록 한다. 신장 세포 암종을 지닌 환자로부터의 196개 종양 표본의 분석으로 PD-L1의 고 종양 발현이 증가된 종양 공격성 및 4.5배의 증가된 사망 위험율과 관련되었음이 밝혀졌다. PD-L1의 보다 높은 발현을 갖는 난소암 환자는 보다 낮은 발현을 지닌 환자보다 유의적으로 더 불량한 예후를 나타낸다. 또한 PD-L1 발현은 상피조직내 CD8+ T-림프구 수(count)와는 역으로 관련되며, 이는 종양 세포에서의 PD-L1이 항종양 CD8+ T 세포를 억제할 수 있음을 시사한다. PD-L1 억제제는 현재 통상의 암 치료요법에서 사용되거나 면역-기반 암 치료제로서 개발 중에 있다. 이러한 제제는 많은 환자에서 양호한 반응 속도를 나타낸다.
면역-기반 암 치료요법 전략은 환자 자신의 면역계를 개시하거나, 조절하거나, 강화시키거나 조작함으로써 환자 자신의 암 세포와 싸워 사멸하도록 설계된다. 면역치료요법의 많은 형태가 암의 치료를 위해 사용 중에 있다. 본원에 기술된 방법은 면역-기반 암 치료제를 사용한 잠재적인 치료 전략의 일부로서 사용되어 본 설명의 중심인 종양-활성화된 면역 반응의 균형을 개시하고/하거나 조절할 수 있는 환자 종양 세포내에서 단백질, 예컨대, PD-L1/PD-1 면역 체크포인트 단백질에 대한 정량적 단백질 발현 데이타를 제공한다. 면역 체크포인트 단백질에 대한 단일 SRM/MRM 검정의 예는 특허원 제PCT/US2015/010386호에서 PD-L1 단백질에 대한 이의 전문에 기술되어 있다.
본원에 기술된 SRM/MRM 검정은 많은 상이한 세포형에 의해 발현된 독특한 단백질의 발현을 검출하고 정량화함으로써 많은 상이한 기능 및 세포내 많은 상이한 위치내 잔류를 입증한다. 각각의 검정은 복잡한 조직 샘플 내에서 단일 단백질을 신뢰가능하고 정확하게 검출하고 측정하는데 사용될 수 있는 적어도 하나의 펩타이드를 기술하며, 여기서 각각의 검정은 개별적으로 또는 멀티플렉스 방식으로 다른 단백질에 대한 다른 펩타이드를 사용하여 수행할 수 있다. 단백질 및 펩타이드 목록은 표 1에 나타낸다. 검정이 제공된 단백질은 하나 이상의 일반적인 및/또는 대안적인 명칭에 의해 하기 나열된다:
CDK12 (사이클릭-의존성 키나제 12),
CHD4 (크로모도메인-헬리카제-DNA-결합 단백질 4),
CLDN18.2 (클라우딘-18),
CSNK1A1 (카세인 키나제 I 동형 알파),
EZR (에즈린),
FAK1 (PTK2 단백질 타이로신 키나제 2),
FAS (FAS 수용체, 세포자멸사 항원 1, 분화 95의 집단),
FTH1 (페리틴 중쇄),
INSR (인슐린 수용체),
JAK1 (야누스 키나제(Janus kinase) 1),
LDHA (락테이트 데하이드로게나제 A),
LDHB (락테이트 데하이드로게나제 B),
MICA (MHC 제I 부류 폴리펩타이드-관련 서열 A),
MICB (MHC 제I 부류 폴리펩타이드-관련 서열 B),
N-Myc (v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 신경아세포종 유래된 동족체),
NRP1 (뉴로필린-1),
PAK1 (p21(RAC1) 활성화된 키나제 1),
PARP2 (폴리 [ADP-리보스] 폴리머라제 2),
PDK2 (피루베이트 데하이드로게나제 키나제 동형 2),
SELL (L-셀렉틴),
SMARCA2 (크로마틴의 매트릭스 관련된, 액틴 의존성 조절인자),
STEAP1 (전립선의 6개의 막횡단 상피 항원 1),
SYK (비장 타이로신 키나제),
TP53BP1 (종양 억제인자 p53-결합 단백질 1),
TROP2 (종양-관련 칼슘 신호 변환인자(transducer) 2),
ULBP2 (UL16 결합 단백질 2),
ULBP3 (UL16 결합 단백질 3),
XPF (ERCC4, DNA 복구 엔도뉴클레아제 XPF),
ASS1 (CTLN1, 아르기니노석시네이트 신테타제 1),
MELTF (CD228, MAP97, MTF1, MTf, MFI2, 멜라토트랜스페린),
RNF43(RING 핑거 단백질 43),
CLDN6 (클라우딘 6),
CLDN9 (클라우딘 9),
DPEP3 (디펩티다제 3), 및
GPC1 (글리피칸, 글리피칸 1).
놀랍게도, 본원의 표 1에 나타낸 단백질의 절단으로부터 유래된 많은 잠재적인 펩타이드 서열은 즉시 명백해지지 않는다는 이유로 인해 질량 분석법-기반의 SRM/MRM 검정에서 사용하기에 부적합하거나 비효율적인 것으로 밝혀졌다. MRM/SRM 검정에 가장 적합한 펩타이드를 예측하는 것이 가능하지 않았으므로, 실제 Liquid Tissue® 용해물 내에서 변형된 및 변형되지 않은 펩타이드를 실험적으로 확인하고 각각의 설계된 단백질에 대해 신뢰할 수 있고 정밀한 SRM/MRM 검정을 개발하는 것이 필수적이었다. 특정한 이론에 얽메이려는 의도는 없지만, 일부 펩타이드는 잘 이온화되지 않거나 다른 단백질로부터 명백한 단편을 생산하지 않으므로, 예를 들면, 질량 분광법에 의해 검출하는 것이 어려울 수 있는 것으로 여겨지고 있다. 펩타이드는 또한 크로마토그래피 분리에서 잘 분해되는데 실패할 수 있거나 유리 또는 플라스틱 제품에 부착할 수 있다.
표 1에서 발견된 펩타이드는 포르말린 고정된 암 조직으로부터 입수된 세포로부터 제조된 복합체 Liquid Tissue® 용해물 내에서 모든 단백질의 프로테아제 분해에 의해 이들 각각의 지정된 단백질로부터 유래되었다. 달리 나타내지 않는 한, 각각의 예에서 프로테아제는 트립신이었다. Liquid Tissue® 용해물을 이후 질량 분석법으로 분석함으로써 질량 분석법에 의해 검출되고 분석되는 지정된 단백질로부터 유래된 펩타이드를 측정한다. 질량 분석법 분석을 위한 펩타이드의 구체적인 바람직한 서브세트의 확인은 단백질로부터의 펩타이드 또는 펩타이드들이 Liquid Tissue® 용해물의 질량 분석법 분석에서 이온화하는 실험 조건 하에서의 발견을 기반으로 하며, 따라서 질량 분광법의 방법론에 의해 분석될 Liquid Tissue® 용해물을 제조하는데 사용된 프로토콜 및 실험 조건으로부터 생성될 펩타이드의 능력을 입증한다.
이러한 단백질의 수집물을 검출하는데 적합한 최적의 펩타이드는 다음과 같이 발견되었다. 포르말린(포름알데하이드) 고정된 조직으로부터 직접 입수된 세포로부터의 단백질 용해물은 세포를 샘플 튜브 내로 조직 미세해부를 통해 수집한 후, 세포를 Liquid Tissue® 완충제 속에서 연장된 시간 동안 가열시킴을 포함하는, 프로토콜 및 Liquid Tissue® 시약을 사용하여 제조하였다. 일단 포르말린-유도된 가교결합이 부정적으로 영향을 미치면, 조직/세포를 이후에 분해함으로써, 예를 들면, 프로테아제 트립신과 같은, 프로테아제를 사용하여 예측가능한 방식으로 완료한다. 각각의 단백질 용해물은 프로테아제를 사용하여 완전한 폴리펩타이드를 분해함으로써 펩타이드의 수집체로 바뀐다. 각각의 Liquid Tissue® 용해물을 분석(예컨대, 이온 트랩 질량 분석법에 의해)함으로써 펩타이드의 다수의 전반적인 단백질 유전 정보 조사를 수행하였으며 여기서 데이타는 각각의 단백질 분해물 내에 존재하는 모든 세포 단백질로부터 질량 분석법에 의해 확인될 수 있는 바와 같이 많은 펩타이드의 확인으로서 나타내었다. 이온 트랩 질량 분석기 또는 단일 복합체 단백질/펩타이드 용해물로부터 가능한 한 많은 펩타이드의 확인을 위해 전반적인 프로파일링을 수행할 수 있는 질량 분석기의 다른 형태가 전형적으로 사용된다. 그러나, 이온 트랩 질량 분석기는 펩타이드의 전반적인 프로파일링을 수행하기 위한 가장 우수한 유형의 질량 분광기일 수 있다.
데이타-독립적인 획득(DIA)로 불리는, 최근의 방법론은 SRM의 재현성을 전반적인 숏건 단백질유전정보학 분석에서 확인된 거대한 수의 단백질/펩타이드와 조합함으로써 전반적인 단백질유전정보 및 표적화된 방법 둘 다의 강도를 활용한다. MS/MS 스캔은 획득 과정 전체에서 시스템적으로(전구체 정보없이 독립적으로) 수집되므로, DIA 방법은 일반적으로 분석 동안 개개 전구체 이온을 검출할 필요성을 피한다. 다수의 DIA 양식은 사용중에 있고/있거나 현재 개발 중에 있으며 다음 중 임의의 수가 본원에 기술된 방법에 적용될 수 있다.
DIA의 데이타 생성은 DDA 또는 SRM 실험과 비교하여 보다 융통성이 있고 보다 더 단순하다. DIA는 DDA를 필요로 하는 조사 스캔 또는 전체 MS 스캔으로부터의 전구체 이온 선택과 상관없이 모든 MS/MS 스캔을 수집한다. SRM/PRM이 필요한, 표적 단편 펩타이드의 예정은 DIA 실험을 위해 불필요하다. 광범위한 전구체 및 상응하는 전이를 데이타 입수 후 추출할 수 있다. 따라서, 표적화된 단백질유전정보학에서, DIA는 표적화된 데이타 추출 전략을 사용한 포괄적인 광범위한 단백질유전자정보 정량화(inclusive proteome-wide quantification)를 목표로 한다. 그러나, SRM과 비교하여, DIA-기반한 표적화된 방법은 일반적으로 보다 낮은 민감성, 특이성, 및 재현성 뿐만 아니라 단백질 정량화에 있어서 보다 작은 역학적 범위를 제공한다.
DIA의 방법은 원래 광범위한 전구체 단리 윈도우(precursor isolation window: 10 m/z)를 적용하는 LTQ-선형 이온 트랩(LIT) 질량 분광기를 사용하여 도입됨으로써 예정된 m/z 범위의 순차적인 단리 및 단편화를 수행하였다. MS 수준 정량화와 비교하여, 신호 대 노이즈 비(S/N)는 양호한 선형 역학적 범위로 크게 개선(350% 초과)됨이 밝혀졌다. DIA 정량화의 MS/MS 수준에 있어서 이온 추출의 적용능이 또한 입증되었다. 그러나, 광범위한 전구체 단리 윈도우를 지닌 이러한 저 해상도 DIA MS/MS는 펩타이드 확인에 있어서의 질량 정확도 및 신뢰도를 저하시키며, 이는 잠재적으로 거짓 양성 발견율(false positive discovery rate)의 증가를 야기하였다.
그 이후에, 다른 개질된 DIA가 도입되었다. MSE는 방식을 따라 도입되었으며 QqTOF 장치에서 효과적으로 작동할 수 있다. 보다 작은 단리 윈도우(2.5u)의 사용은 전체 표적 질량 범위를 포함하는 전체 데이타 획득이 다중 주입(5일 동안 67회 주입)을 요구하지만 단백질 확인의 개선을 이끌었다. 훨씬 더 신속한 스캐닝 이온 트랩 MS(예컨대, LTQ Orbitrap Velos MS)는 전체 데이타 획득 시간을 ~2일로 감소시켰다. 벤치 톱 정확한(bench top Exactive) MS의 도입을 사용하여 모든-이온 단편화(AIF)의 적용을 입증하였으며, 여기서 펩타이드는 전구체 선택없이 단편화를 위해 HCD 충돌 세포로 주입되었으며 단편은 C-트랩으로 다시 되돌아와서 Orbitrap 질량 분석기를 통해 분석되었다. 동시-용출되는 전구체 이온에 대한 단편 이온의 지정은 고 해상도(m/z 200에서 100 000) 및 고 질량 정확도에 의해 용이하게 되었다. 이러한 개념은 작동 주기 시간을 유의적으로 감소시키지만 특정의 보유 시간에서 AIF로부터 더 많은 방해를 도입시킨다. 다른 DIA 접근법이 후속적으로 도입되었으며 연장된 데이타-독립적인 획득(XDIA)으로 명명되었고, 이는 전자 전달 해리(electron transfer dissociation: ETD)의 능력을 지닌 상이한 유형의 Orbitrap MS에서 수행되었다. DDA-기반 ETD 분석과 비교하는 경우, DIA-기반 ETD 접근법은 확인된 스펙트럼의 수(~250%) 및 독특한 펩타이드의 수(~30%)를 유의적으로 증가시켰으며, 이는 저-과다(low-abundance) PTM 연구를 잠재적으로 용이하게 할 수 있다.
최근에, DIA에 있어서의 유의적인 개선이 신속한 스캐닝 HR/AM 장치의 개발과 함께 달성되었으며 이에 의해, DIA의 변화가, 개념적으로는 멀티플렉스화된 스펙트럼으로 이루어진 광범위한 단리 윈도우(전형적으로 25 m/z)의 이용을 지칭하기 위해 SWATH로 명명된, QqTOF MS를 사용하여 입증되었다. QqTOF MS를 사용하는 한가지 주요 특징은 가장 신속한 데이타 획득 속도이다. 다른 DIA 전략은 QqOrbi MS의 사용으로 도입되었으며, 여기서 즉 MSX로 언급되는, 신규 획득 방법이 장치 속도, 선택성, 및 민감성을 개선시키기 위해 도입되었다. DIA 데이타 획득 및 가공에 있어서의 최근의 개선은 Orbitrap MS 장치의 신규 버젼에 의해 보조되었다. Q Exactive MS에서 시행된, pSMART로 명명되는 첫번째 것은 질량 범위에 걸쳐 비대칭적 단리 윈도우를 이용한다: 400 내지 800 m/z를 포함하는 5 Da 윈도우, 800 내지 1000 m/z를 포함하는 10 Da 윈도우 및 1000 내지 1200 m/z를 포함하는 20 Da 윈도우. 새로운 하이브리드 Q-HCD-Orbitrap-LIT MS(즉, Orbitrap Fusion and Lumos)에서 시행된, 와이드 선택된-이온 모니터링 DIA (wiSIM-DIA)로 명명된 다른 DIA 방법에서는, 200 Da 단리 윈도우를 지닌 3개의 HR/AM SIM 스캔을 사용하여 400 내지 1000 m/z의 모든 전구체 이온을 포함한다. 각각의 SIM 스캔과 동시에, 12-Da 단리 윈도우를 지닌 17개의 순차적인 이온-트랩 MS/MS를 획득함으로써 연관된 200-Da SIM 질량 범위를 포함하였다. 표준의 광범위한-윈도우 MS/MS-만의 DIA 방법과는 상이하게, pSMART 및 wiSIM-DIA의 경우 MS1 데이타(즉, 보다 긴 충전 시간을 지닌 HR/AM 전구체 데이타 및 LC 용출 프로파일에 걸쳐 충분한 전구체 이온 데이타 지점)를 민감한 검출 및 정량화를 위해 사용하는 반면, 신속한 이온 트랩 MS/MS 스캔으로부터의 MS/MS 데이타는 펩타이드 확인/입증을 위해서만 사용된다.
검출가능한 펩타이드 전구체의 모든 단편 이온을 완전히 기록하지만 정교한 데이타 분석을 갖는 표준 DIA 방법과 비교하여, pSMART 및 wiSIM-DIA는 작동 주기 시간의 대부분을 고 품질 MS1 데이타를 생성하는데 사용하므로 비교적 용이한 데이타 분석으로 검출가능한 전구체에 대해 보다 작은 수의 MS/MS 스펙트럼을 제공할 수 있다. 따라서, 이들의 민감성 및 정확성은 표준 DIA 방법에 의해 제공된 것보다 더 높지만, 이들의 정량화 정확도(즉, 특이성 또는 선택성)는 MS/MS보다 MS1으로부터의 동시-용출 방해를 갖는 것에 대한 증가된 기회로 인하여 표준 DIA 방법으로부터의 것보다 다소 더 낮을 수 있다. 가장 최근에, Q Exactive MS 플랫폼에서의 종합적인 DIA 획득 및 보유-시간 표준화된(iRT) 스펙트럼 라이브러리를 지닌 표적 데이타 분석으로 이루어진, 과도한 반응 모니터링(hyper reaction monitoring: HRM)으로 명명된 신규한 DIA 방법이 입증되었다. HRM은 일관되게 확인된 펩타이드의 수 및 다수의 측정에 걸쳐 상이하고 풍부한 단백질의 신뢰가능한 정량화 둘 다에서 전반적인 숏건 단백질 유전 정보학을 능가하는 것으로 입증되었다.
DIA 분석을 위한 보다 효과적인 생물정보학 도구는 현재 개발중에 있으며 현재 기술된 방법에서 적용될 수 있다. DIA 스펙트럼은 고도로 멀티플렉싱되어 있으므로 DDA 또는 SRM/PRM과 비교하여 보다 정교한 데이타 해석 알고리즘이 요구된다. 현재, 3개의 접근법을 사용하여 DIA 스펙트럼을 판독하고 있다. 첫번째 것은 DIA 스펙트럼으로부터 가-DDA(pseudo-DDA) 스펙트럼, 예컨대, Demux, MaxQuant, XDIA 프로세서, 및 상보성 파인더(Complementary Finder)를 구축하는 것이다. 이러한 재구축된 가-DDA 스펙트럼을 이후 통상적인 조사 엔진 도구, 예컨대, MSGF+, MaxQuant, MASCOT, 또는 다른 스펙트럼 라이브러리를 통해 가공한다. 이러한 계획의 일부는 크로마토그래피적 용출 프로파일의 사용으로 시행함으로써 펩타이드의 확인을 개선시켰다. 쑈우(Tsou) 등의 최근 공보는 DIA-Umpire로 명명된, 계산적 접근법(computational approach)의 개발을 기술하고 있다. DIA-Umpire는 2차원(m/z 및 보유 시간) 특징-검출 알고리즘으로 출발하여 MS 및 MS/MS 데이타에서 모든 가능한 전구체 및 단편 이온 신호를 발견한다. 단편 이온은 LC 용출 피크 및 피크 정점에서 보유 시간의 상관관계를 갖는 전구체 이온으로 그룹화된다. 각각의 전구체-단편 그룹에 대해 생성된 가-MS/MS 스펙트럼을 이후에 전술한 도구를 포함하는 통상의 데이타베이스 조사 엔진과 함께 가공한다(참고: Tsou et al., "DIA-Umpire: comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics," Nature Methods 12:258-264 (2015)).
다른 접근법은 멀티플렉싱된 MS/MS를 펩타이드의 이론적 스펙트럼(예컨대, ProbIDtree, Ion Accounting, M-SPLIT, MixDB, 및 FT-ARM)과 매치시키는 것이다. 점수매김 알고리즘은 서열 데이타베이스 또는 스펙트럼 라이브러리로부터 펩타이드의 얼마나 많은 이론적 단편 이온이 고 질량 정확도로 멀티플렉싱된 스펙트럼에서 발견되는가에 직접 기반한다. 처음 2개의 접근법은 추가의 정량화 전에 DIA 스펙트럼으로부터 펩타이드의 확인을 크게 다루어왔다. 자유로이 이용가능한 자동화되거나 반-자동화된 도구, 예컨대, Skyline, mProphet, OpenSWATH, 및 DI-ANA와 2개의 시판되는 소프트웨어, PeakView®(공급원: AB/Sciex) 및 Spectronaut™(공급원: Biognosys)를 사용하여 표적화된 데이타 추출 전략을 사용하는 정량적으로 표적화된 DIA 데이타를 가공하였다.
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Figure pat00002
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SRM/MRM 검정을 개발하여 임의의 유형의 질량 분석기, 예컨대, MALDI, 이온 트랩, 이온 트랩/4극자 하이브리드, 또는 삼중 4극자에서 수행할 수 있지만, SRM/MRM 검정을 위한 가장 유리한 장치 플랫폼은 흔히 삼중 4극자 장치 플랫폼인 것으로 고려된다. 일단 가능한 한 많은 펩타이드가 사용된 조건 하에서 단일 용해물의 단일 MS 분석물 내에서 확인되면, 이후에 펩타이드의 이러한 목록을 수집하고 이러한 분석물 속에서 검출된 단백질을 측정하는데 사용하였다. 이러한 공정을 다수의 Liquid Tissue® 용해물에 대해 반복하고, 펩타이드의 매우 큰 목록을 단일 데이타세트로 수집 분석한다. 이러한 유형의 데이타세트는 분석된(프로테아제 분해 후) 생물학적 샘플의 유형 및 구체적으로 생물학적 샘플의 Liquid Tissue® 용해물 내에서 검출될 수 있는 펩타이드를 나타내는 것으로 고려될 수 있으므로 지정된 단백질 각각에 대한 펩타이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 지정된 단백질의 절대량 또는 상대량의 측정시 유용한 것으로 확인된 트립신 분해된 펩타이드가 표 1에 나타나 있다. 이러한 펩타이드 각각은 포르말린 고정되고, 파라핀 포매된 조직으로부터 제조된 Liquid Tissue® 용해물 내에서 질량 분석법에 의해 검출되었다. 따라서, 각각의 펩타이드를 사용하여 생물학적 샘플, 예컨대, 포르말린 고정된 환자 조직에서 직접적으로 지정된 단백질에 대한 정량적 검정을 개발할 수 있다. 펩타이드는 또한 상기 나타낸 펩타이드 중 하나 이상의 상대적인 정량화로 발현을 검출하기 위한 DIA 검정에 유용하므로 질량 분석법에 의해 생물학적 샘플로부터 수득한 주어진 단백질 제제 속에서 상응하는 단백질의 발현을 검출하는 수단을 제공한다.
각각의 지정된 단백질로부터의 구체적인 단편 펩타이드에 대한 구체적이고 독특한 특징을 이온 트랩 및 삼중 4극자 질량 분석기 둘 다에서 모든 단편 펩타이드를 분석함으로써 개발하였다. 이러한 정보는 포르말린 고정된 샘플/조직으로부터의 Liquid Tissue® 용해물에서 각각의 및 모든 후보물 SRM/MRM 펩타이드에 대해 직접 실험적으로 측정되어야 하는데; 이는, 흥미롭게도 임의의 지정된 단백질로부터 모든 단백질이 본원에 기술된 바와 같은 SRM/MRM을 사용하여 이러한 분해물 내에서 검출될 수 없기 때문이다. 검출될 수 없는 단편 펩타이드는 포르말린 고정된 샘플/조직으로부터 Liquid Tissue® 용해물 내의 펩타이드/단백질을 직접적으로 정량화하는데 사용하기 위한 SRM 분석을 개발하기 위한 후보물 펩타이드가 아니다.
구체적인 단편 펩타이드에 대한 특수한 SRM/MRM 검정을 삼중 4극자 분자 분석기에서 수행한다. 특수한 단백질 SRM/MRM 검정에 의해 분석된 실험 샘플은 예를 들면, 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 조직으로부터 제조된 Liquid Tissue® 단백질 용해물이다. 이러한 검정으로부터의 데이타는 포르말린 고정된 샘플 내에서 이러한 단편 펩타이드에 대한 독특한 SRM/MRM 특징 피크의 존재를 나타낸다.
주어진 펩타이드에 대해 특이적인 전이 이온 특징을 사용하여 특수한 단편 펩타이드를 단순히 검출하지 않지만, 포르말린 고정된 생물학적 샘플 내에서 특수한 단편 펩타이드를 정량적으로 측정한다. 이러한 데이타는 분석된 단백질 용해물의 마이크로그램당 펩타이드의 몰 양의 함수로서 이러한 단편 펩타이드의 절대량을 나타낸다. 포르말린 고정된 환자-유래된 조직의 분석을 기반으로 한 조직 내의 상응하는 단백질 수준의 평가는 각각의 특수한 환자에 대한 진단적, 예후적, 및 치료학적으로 관련된 정보를 제공할 수 있다. 일 구현예에서, 질량 분석법을 사용하여 상기 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물 내의 하나 이상의 단편 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량화하는 단계; 및 상기 샘플 내에서 변형된 또는 변형되지 않은 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내에서 표 1에 나타낸 단백질의 각각의 수준을 측정하기 위한 방법이 제공되며; 여기서 상기 수준은 상대적인 수준 또는 절대적인 수준이다. 하나 이상의 변형된 또는 변형되지 않은 단편 펩타이드를 정량화하는 단계는 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드에 대해 비교함으로써 생물학적 샘플 내에서 단편 펩타이드 각각의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 생물학적 샘플 내의 단편 펩타이드 각각은 동일한 아미노산 서열을 가진 내부 표준 펩타이드와 비교된다. 내부 표준물은 예를 들면, 하나 이상의 안정한 중 동위원소, 예컨대, 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이의 조합을 함유하는 동위원소적으로 표지된 내부 표준 펩타이드일 수 있다. 펩타이드의 하나의 분자는 단백질의 단일 분자로부터 유래되므로 펩타이드의 분자량의 측정은 펩타이드가 유래된 단백질의 몰량의 직접적인 측정을 제공한다.
지정된 단백질의 수준을 측정하기 위한 방법에서 본원에 기술된 생물학적 샘플(또는 이의 대리물로서의 단편 펩타이드)은 환자 또는 대상체내에서 암의 진단적 지시인자로서 사용될 수 있다. 지정된 단백질의 수준의 측정으로부터의 결과를 사용하여 조직 속에 발견된 단백질의 수준을 정상 및/또는 암성 또는 전암성 조직에서 발견된 이러한 단백질의 수준과 관련시킴으로써(예컨대, 비교함으로써) 암의 진단적 단계/등급/상태를 측정할 수 있다. 지정된 단백질의 수준의 측정으로부터의 결과를 또한 사용하여 어떤 것이 암 환자를 치료하기 위한 암 치료제 및 따라서 가장 최적의 암 치료 요법인지를 측정할 수 있다.
조직 단백질 발현 랜드스케이프는 매우 복잡하며 이에 의해 다수 유형의 고형 조직 세포에 의해 발현된 다수의 단백질 및 국재화된/국재화되지 않은 면역 세포는 다수의 치료제 지시를 위한 다수의 검정을 필요로 한다. 단백질 검정 문제의 이러한 수준은 본원에 기술된 SRM/MRM 검정에 의해 분석할 수 있다. 이러한 검정은 다양한 분자 기능을 갖는 많은 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 설계되며, 여기서 단백질은 가용성 단백질, 막-결합된 단백질, 핵 인자, 분화 인자, 세포간 상호작용을 조절하는 단백질, 분비된 단백질, 면역 체크포인트 단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 세포 신호전달 단백질, 면역 억제 단백질, 사이토킨, 및 림프구-활성화/억제 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
조직 미세해부는 SRM/MRM 검정을 사용하여 단백질 발현 분석을 위해 환자 종양 조직으로부터 종양 세포의 순수한 집단을 사용함으로써 환자에 대해 종양 세포 상태를 구체적으로 정의하는 분자 프로파일을 측정하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 종양 조직의 조직 미세해부는 유리하게는 DIRECTOR 기술을 활용하는 세포 및 세포 집단의 레이저 유도된 전방 전달(forward transfer)의 공정을 사용하여 수행된다. 에너지 전달 층간 코팅의 활용을 통한 조직의 레이저 유도된 전방 전달을 위해 DIRECTOR 슬라이드를 사용하는 방법은 미국 특허 제7,381,440호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 그러나, 종양 세포의 순수한 집단의 미세해부는 종양 세포를 사멸시키는 것으로 예측된 세포, 즉, 종양 침윤 림프구(TILS)의 단백질 발현 특징/프로파일을 무시하는 경향이 있을 수 있다. 이러한 제한은 종양 세포의 순수한 집단 외에, TIL의 순수한 집단을 입수하기 위한 조직 미세해부를 활용함으로써 극복할 수 있으며 이에 의해 TIL의 거대 집단을 함유하는 조직의 부위는 기술된 SRM/MRM 검정을 사용하는 단백질 발현 분석을 위해 수집되어 가공될 수 있다. 2개의 명백한 세포 집단의 수집 및 분석을 통해, 환자 면역 프로파일을 측정하여 환자에 대해 가장 최적의 치료 요법을 통지할 수 있으며 이에 의해 면역계는 최적의 면역-매개된 종양 세포 사멸에 대한 구체적인 면역-조절화제에 의해 조절될 수 있으며 종양 세포는 표적화된 치료제 및/또는 면역-매개된 종양 세포 사멸에 의해 표적화될 수 있다.
조직 미세해부는 SRM/MRM 분석을 위해 환자 조직으로부터 특정의 세포 집단의 순수한 집단을 생산하지만, 대부분의 종양 조직은 미세해부될 TIL의 명백한 집단의 적합하게 큰 부위를 나타내지 않는다. 대부분의 경우에, TIL은 이종 복합체 조직 미세환경 중에서 드물게 산재되어 있으므로 종양 세포의 비교적 순수한 집단이 효과적으로 분석될 수 있지만 TIL의 순수한 집단의 분석은 일반적으로 효과적이지 않다. 종양 조직-유래된 TIL은 면역계 조절제를 사용하여 면역 반응의 긍정적인 조작을 통지하는데 중요한 많은 단백질을 발현하므로 분석되어야 한다. 이러한 한계는 환자 조직 내에 존재하는 종양 미세환경의 전체 부위로부터 기술된 SRM/MRM 검정에 대한 분석가능한 단백질 용해물을 제조함으로써 극복될 수 있으며 이에 의해 용해물은 종양 세포, 양성 비-종양 세포, 및 면역 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 상이한 세포형 대신에 전체 복합체의 단백질 유전 정보 표시를 포함한다. 이러한 방식으로 환자 종양 환경의 전체 분자 랜드스케이프를 포획하는 매우 복잡한 환자-특이적인 분자 프로파일이 측정될 수 있다. 또한, 동일한 조직으로부터 일련의 단면의 조직 미세해부에 의해 수집된 것으로서 종양 세포의 정제된 집단의 분석을 비교하여 전체 종양 미세환경 랜드스케이프에 대해 대조시킬 수 있다. 이러한 접근법은 면역 세포 프로파일로부터 종양 세포 프로파일을 기능적으로 분리함으로써 조직 샘플 내에 존재하지 않는 국재화된 TIL 및/또는 면역 세포에 의해 발현될 가능성이 가장 큰 면역 반응 단백질, 및 이러한 단백질이 종양 면역 랜드스케이프에 미칠 수 있는 효과를 확인한다.
본원에 기술된 SRM/MRM 검정은 고형 종양 조직으로부터 제조된 용해물 내에서 특이적인 단백질의 발현을 검출하고 정량화하지만; 세포의 순수한 집단이 수집되어 분석되지 않는 한 이러한 검정은 어느 세포가 어느 단백질을 발현하는지에 대한 상세한 정보를 제공할 수 없다. 이는 비정상 단백질 발현이 예를 들면, 종양 세포가 정상 세포, 정상 림프구 세포, 및/또는 TIL에 의해 단독으로 일반적으로 발현된 면역 억제 인자를 발현하는 경우와 같이, 종양 미세환경에서 일반적이므로 중요하다. 따라서, 후보물 치료 단백질 표적의 발현이 검출되어 기술된 SRM/MRM 검정에 의해 정량화되는 경우, 후속적인 검정이 손실된 세포 국재화 정보를 제공하는데 필수적일 수 있다. 세포 발현 맥락을 달성하는 방법은 면역조직화학이다. 어느 단백질이 종양 미세환경 속에서 발현되고 어느 세포가 이러한 단백질을 발현하는지에 대한 이해는 환자 자신의 면역 반응을 조절하여 종양 세포를 찾아 사멸시키는 최적의 치료 결정을 유리하게 통지할 수 있다. 본원에 기술된 SRM/MRM 검정 및 분석 공정은 환자 종양 조직에서 면역조절 암 치료제의 단백질 표적을 직접적으로 검출하고 정량화하는 능력을 제공한다.
종양 세포 사멸을 위한 유리한 접근법은 조합 치료요법을 사용하는 것이며 이에 의해 면역조절제가 최적의 환자 반응을 위해 종양 세포 표적화제와 함께 상승적으로 사용된다. SRM/MRM 검정을 사용하여 종양단백질 표적의 환자 종양 조직내에서 정량적 발현 상태를 측정할 수 있으며 이를 위해 억제성 치료제가 개발되었다. 종양유전자의 정량적 상태를 측정하는 SRM/MRM 검정의 예는 예를 들면, Met 단백질(참고: 미국 특허 제9,372,195호) 및 IGF-1R 단백질(참고: 미국 특허 제8,728,753호)에 대해 기술되어 있다. 약물 크리조티닙 및 카보잔티닙은 Met 단백질 기능을 억제하지만 피기투무맙 및 식수투무맙(cixutumumab)은 IGF-1R 단백질 기능을 억제한다. 이러한 검정으로부터의 정보는 본원에 기술된 SRM/MRM 검정으로부터의 정보와 조합하여 종양 조직의 면역 상태를 이해할 수 있다. 이와 함께, 데이타세트 둘 다를 사용하여 표적화된 및 면역-기반의 조합 치료학적 접근법을 위한 치료 요법을 통지할 수 있다. 예로서, 환자의 종양 세포가 SRM/MRM 방법론에 의해 측정되어 PD-L1 단백질 및 Met 단백질 둘 다를 과발현시킨 다음 타당한 조합 치료는 크리조티닙(Met 억제제)와 함께 니볼루맙(PD-1 억제제) 또는 아테졸리주맙(PD-L1 억제제)를 투여함을 포함할 수 있다. 이러한 접근법의 결과는 환자 면역계가 종양 세포를 공격하여 사멸시킴을 목적으로 하는 것과 함께 종양 세포를 구체적으로 표적하여 사멸시키는 치료제를 최적으로 활용할 수 있다.
핵산 및 단백질 둘 다가 동일한 Liquid Tissue® 생물분자 제제로부터 분석될 수 있으므로 본원에 기술된 SRM/MRM 검정을 사용하여 분석된 동일한 샘플 내의 핵산으로부터 약물 치료 결정에 관한 추가의 정보를 생성하는 것이 가능하다. 특이적인 단백질은 특정 세포에 의해 발현될 본원에 기술된 SRM/MRM 검정에 의해 증가된 수준에서 발견될 수 있지만 동시에 특이적인 유전자 및/또는 핵산 및 이들이 암호화하는 단백질의 돌연변이 상태에 대한 정보(예컨대, mRNA 분자 및 이들의 발현 수준 또는 스플라이스 변이)를 수득할 수 있다. 이러한 핵산은 예를 들면, 서열분석 방법, 폴리머라제 연쇄 반응 방법, 제한 단편 다형성 분석, 결실, 삽입의 확인, 및/또는 돌연변이, 예컨대, 이에 한정되지 않는, 단일 염기쌍 다형성, 전이, 전환(transversion), 또는 이의 조합의 존재의 측정 중 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상으로 시험할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> NANTOMICS, LLC <120> SRM/MRM Assays For Molecular Profiling Tumor Tissue <130> IPA200005-US <150> US 62/791,486 <151> 2019-01-11 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Ser Gly Pro Gln Gly Pro Arg 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Tyr Gly Asn Thr Asp Gly Pro Glu Thr Gly Phe Ser Ala Ile Asp 1 5 10 15 Thr Asp Glu Arg 20 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Tyr Ala Ile Leu Asn Glu Pro Phe Lys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Phe Ser Thr Asn Asn Pro Phe Lys 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Ser Leu Pro Trp Gln Gly Leu Lys 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Leu Gln Gly Gly Val Gly Ile Pro His Ile Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ile Gln 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Trp Tyr Ala Pro Asn Arg 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Leu Lys 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys 1 5 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ser Ala Asp Thr Leu Trp Asp Ile Gln Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ala Ser Ser Phe Tyr Pro Arg 1 5 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gly Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ser Ser Phe Leu Thr Leu Arg 1 5 <210> 27 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gly Pro Pro Thr Ala Gly Ser Thr Ala Gln Ser Pro Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Ala Gly Arg 20 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Phe Val Thr Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Phe Glu Gly Asn Asn Asn Tyr Asp Thr Pro Glu Leu Arg 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ser Val Ile Glu Pro Leu Pro Val Thr Pro Thr Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Leu Ser Ala Ile Phe Arg 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ile Pro His Asp Phe Gly Leu Arg 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ala Leu Ser Thr Asp Ser Val Glu Arg 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Thr Ser Phe Thr Phe Leu Arg 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ala Glu Ile Glu Tyr Leu Glu Lys 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Thr Leu Pro Phe Ser Arg 1 5 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ile Leu Leu Asp Pro Asn Ser Glu Glu Val Ser Glu Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Val Pro Ser Asn Ser Gln Leu Glu Ile Glu Gly Asn Ser Ser Gly Arg 1 5 10 15 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Asp Thr Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys 1 5 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Phe Val His Arg 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu Glu Ser Glu Gln Ile Val Leu Ile Gly Ser Lys 1 5 10 <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Val Pro Glu Thr Val Ser Ala Ala Thr Gln Thr Ile Lys 1 5 10 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ile Leu Asp Trp Gln Pro Arg 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg 1 5 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Asp Ser Gly Leu Thr Thr Phe Phe Lys 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ile Leu Val Val Asp Phe Leu Thr Asp Arg 1 5 10 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ile Pro Ser Asp Leu Ile Thr Gly Ile Leu Val Tyr Arg 1 5 10 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Val Phe Ile Glu Asp Val Ser Arg 1 5 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys 1 5 10 15 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Tyr Tyr Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg 1 5 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gly Ala Ser Ala Val Leu Phe Asp Ile Thr Glu Asp Arg 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg 1 5 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ser Trp Ser Glu Glu Glu Leu Gln Gly Val Leu Arg 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Leu Ala Leu Glu Gln Ile Asp Leu Ile His Arg 1 5 10 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ser Phe Val Gln Gly Leu Gly Val Ala Ser Asp Val Val Arg 1 5 10 <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gly Phe Ser Leu Ser Asp Val Pro Gln Ala Glu Ile Ser Gly Glu His 1 5 10 15 Leu Arg

Claims (17)

  1. 대상체로부터 수득된 포르말린 고정된 종양 조직(formalin fixed tumor tissue)의 생물학적 샘플 내에서 단백질 발현 프로파일을 개발하는 방법으로서, 이러한 방법이
    질량 분석기를 사용하여 포르말린 고정된 종양 조직의 상기 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물(protein digest) 내에서 하나 이상의 단편 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량화하는 단계; 및 상기 생물학적 샘플 내에서 상응하는 단백질 또는 단백질들의 양을 계산하는 단계를 포함하며;
    상기 하나 이상의 단백질이 CDK12, CHD4, CLDN18.2, CSNK1A1, EZR, FAK1, FAS, FTH1, INSR, JAK1, LDHA, LDHB, MICA, MICB, N-Myc, NRP1, PAK1, PARP2, PDK2, SELL, SMARCA2, STEAP1, SYK, TP53BP1, TROP2, ULBP2, ULBP3, XPF, ASS1, MELTF, RNF43, CLDN6, CLDN9, DPEP3, 및 GPC1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단편 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량화하는 단계 전에 상기 단백질 분해물을 분획화(fractionating)하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단편화 단계가 액체 크로마토그래피, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고 성능 액체 크로마토그래피, 및 역상 고 성능 액체 크로마토그래피로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분해물이 프로테아제 분해물, 바람직하게는 트립신 분해물을 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석법이 탄뎀 질량 분석법(tandem mass spectrometry), 이온 트랩 질량 분석법(ion trap mass spectrometry), 삼중 4극자 질량분석법(triple quadrupole mass spectrometry), 하이브리드 이온 트랩/4극자 질량 분석법(hybrid ion trap/quadrupole mass spectrometry), MALDI-TOF 질량 분석법, MALDI 질량 분석법, 및/또는 비행 시간 질량 분석법(time of flight mass spectrometry)을 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 사용된 질량 분석법의 방식이 선택된 반응 모니터링(SRM), 다중 반응 모니터링(MRM), 지능적 선택 반응 모니터링(intelligent Selected Reaction Monitoring: iSRM), 병렬 반응 모니터링(Parallel Reaction Monitoring: PRM), 및/또는 다중 선택된 반응 모니터링(multiple Selected Reaction Monitoring: mSRM)인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단편 펩타이드가 서열 번호: 1 내지 59의 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 파라핀 포매된 조직(paraffin embedded tissue)인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 1차 종양 또는 2차 종양과 같은 종양으로부터 수득되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단편 펩타이드를 정량화하는 단계가 생물학적 샘플 내의 상기 하나 이상의 단편 펩타이드의 양을 상이하고 별개의 생물학적 샘플 내에서 동일한 하나 이상의 단편 펩타이드의 양과 비교하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단편 펩타이드를 정량화하는 단계가 동일한 아미노산 서열을 가진 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드에 대한 비교에 의해 생물학적 샘플 내에서 상기 하나 이상의 단편 펩타이드의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 내부 표준 펩타이드가 바람직하게는 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이의 조합으로부터 선택된 동위원소적으로 표지된 펩타이드인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분해물 내의 상기 하나 이상의 단편 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량화하는 단계가 대상체 내에서 상응하는 단백질의 존재 및 암과의 연관성(association)을 나타내는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단편 펩타이드의 양 또는 상응하는 단백질의 양을 상기 검출하고/하거나 정량화하는 단계의 결과를 대상체의 면역계의 활성화 상태와 관련시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 하나의 단편 펩타이드의 양 또는 상기 상응하는 단백질의 양을 검출하고/하거나 정량화하는 단계의 결과를 대상체의 면역계의 활성화 상태와 관련시키는 단계가 다른 단백질 또는 다른 단백질로부터의 펩타이드의 발현의 양을 검출하고/하거나 정량화하는 단계와 조합되는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 수득된 대상체에게 치료학적 유효량의 하나 이상의 암 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 여기서 하나 이상의 암 치료제 및/또는 투여된 하나 이상의 암 치료제의 양은 서열 번호 1 내지 59의 단편 펩타이드 중 임의의 하나 이상의 검출 및/또는 양을 기반으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 암 치료제가 서열 번호 1 내지 59의 단편 펩타이드 중 하나 이상에 상응하는 단백질 중 하나 이상과 상호작용하고/하거나 암 치료제가 이의 기능이 대상체의 면역 반응을 개시하고/하거나, 향상시키고/시키거나, 조작하고/하거나 그렇지 않으면 조절함으로써 상기 대상체의 종양 세포를 공격하고 사멸시키는 면역조절 암 치료제인 방법.
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