KR20200059186A

KR20200059186A - 변형된 Cκ 및 CH1 도메인

Info

Publication number: KR20200059186A
Application number: KR1020197022000A
Authority: KR
Inventors: 용치앙 왕; 레이 팡; 젱이 왕; 빙시 궈; 징우 장
Original assignee: 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2019-01-15
Publication date: 2020-05-28
Also published as: JP6996825B2; CN110573531A; EA202091053A1; AU2019203917B2; AU2020203065B2; JP2021506747A; ZA202002567B; US20190389972A1; MX2020006942A; SG11202005009RA; CA3084398A1; AU2020203065A1; IL275943A; AU2019203917A1; BR112020009414A2; EP3577141A1; IL275943B; KR102471868B1; WO2019137552A1; CN110573531B

Abstract

Cκ 및 CH1 도메인의 쌍 형성을 가능하게 하지만, 변형 없이는 야생형 CH1 및 Cκ 도메인과 비교하여 쌍 형성을 감소시키는, 변형된 Cκ 및 CH1 도메인을 가진 항체 및 항원-결합 단편이 제공된다. 이러한 변형은 Cκ 및 CH1 도메인의 두 개의 상이한 쌍 형성을 가진 이중 특이적 항체를 제조하는데 특히 유용할 수도 있다.

Description

변형된 Cκ 및 CH1 도메인

본 개시물은 Cκ 및 CH1 도메인의 쌍 형성을 가능하게 하지만 변형이 없이는 CH1 및 Cκ 도메인의 쌍 형성을 감소시키는, 변형된 Cκ 및 CH1 도메인을 가진 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다.

이중특이적 단클론성 항체 (BsMAb, BsAb)는 두 개의 상이한 유형의 항원 또는 동일한 항원의 두 개의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 인공적인 단백질이다. BsAb는 여러 가지 구조적 포맷으로 제조될 수 있고, 현재의 적용은 암 면역요법 및 약물 전달에 대하여 분석되고 있다.

다수의 BsAb 포맷이 존재한다. IgG-유사 BsAb는, 두 개의 Fab 부위가 상이한 항원에 결합한다는 것을 제외하고, 두 개의 Fab 아암(arm) 및 하나의 Fc 영역의 전통적인 단클론성 항체 (mAb) 구조를 유지한다. 가장 공통적인 유형은 삼기능적 항체라고 불리는데, 그것들이 항체에 세 개의 특유의 결합 부위를 갖고 있기 때문이다: 두 개의 Fab 영역, 및 Fc 영역. 각각의 중쇄 및 경쇄 쌍은 특유의 mAb로부터 유래된다. 두 개의 중쇄로부터 제조된 Fc 영역은 제3 결합 부위를 형성한다. 이들 BsAb는 종종 콰드로마(quadroma), 또는 하이브리드 하이브리도마(hybrid hybridoma) 방법으로 제조된다.

하지만, 콰드로마 방법은 사용 가능한 BsAb를 형성하기 위해 무작위의 기회에 의존하고, 비효율적일 수도 있다. IgG-유사 BsAb를 제조하기 위한 또 다른 방법은 "놉 인투 홀(knobs into holes)"이라고 불리며, 하나의 mAb의 중쇄에서 큰 아미노산에 대한 돌연변이, 및 다른 mAb 중쇄에서 작은 아미노산에 대한 돌연변이를 도입하는 것에 의존한다. 이것은 표적 중쇄 (및 그에 상응하는 경쇄)가 서로 더 잘 맞게 하여, BsAb 생산을 더욱 믿을만 하게 만든다.

이 놉-인투-홀 접근법은 중쇄 호모다이머화 문제를 해결하지만, 두 개의 상이한 항체의 경쇄와 중쇄 사이에서 쌍 형성 오류(mispairing)에 관한 문제를 해결할 수 없다. 제조하기 쉽고 더 양호한 임상적 안정성 및 효능을 가진 더 양호한 BsAb를 제공할 필요가 있다.

본 개시물은 Cκ 및 CH1 도메인의 쌍 형성을 가능하게 하지만 변형이 없이는 CH1 및 Cκ 도메인의 쌍 형성을 감소시키는, 변형된 Cκ 및 CH1 도메인을 가진 항체 및 항원-결합 단편을 제공한다. 이러한 변형은 Cκ 및 CH1 도메인의 두 개의 상이한 쌍을 가진 이중특이적 항체를 제조하는데 특히 유용할 수 있다.

실험예에서 입증된 바와 같이, 두 군의 아미노산이 중요한 계면 잔기로서 확인되었는데, 이러한 계면을 재확립하기 위한 적절한 변형이 이루어지지 않는 한, 변화될 때, Cκ 및 CH1 도메인의 쌍 형성을 감소시키거나 또는 심지어 방해한다.

이러한 하나의 군은 Cκ 도메인의 Val26 (Kabat 넘버링: Val133) 및 Phe11 (Kabat 넘버링: Phe118) 및 CH1 도메인의 Leu11 (Kabat 넘버링: Leu124)을 포함한다. 예를 들어, 이들 아미노산 중 하나가 Ala로 치환될 때, Cκ/CH1 쌍 형성이 방해될 수 있다. 또 다른 예의 군은 Cκ의 Gln17 (Kabat 넘버링: 124) 및 CH1의 Phe9 (Kabat 넘버링: 122)를 포함한다.

하지만, 이들 계면 잔기에서 특정 돌연변이는 쌍 형성을 복원할 수 있으며, 이는 또한 실례에서 입증되었다. 이러한 하나의 예는 Val26Trp (Cκ)와 Leu11Trp (CH1)이다. 추가의 예는 표 1 및 표 2에서 나타나있다.

한 구체예에서, L11W 치환을 포함하는 인간 CH1 단편 및 V26W 치환을 포함하는 인간 Cκ 단편을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공된다. 이러한 항체 또는 단편은 선택적으로 야생형 파트너에 대한 결합을 더 감소시키고 및/또는 치환된 단편 사이에서의 결합을 향상시키는 추가적인 치환을 포함할 수 있다.

예를 들어, 치환의 추가적인 쌍은 CH1에서의 K101E 및 Cκ에서의 D15K 또는 D15H (D15K/H)일 수 있다. 치환의 또 다른 쌍은 CH1에서의 K96D 및 Cκ에서의 E16R이다. 또 다른 예의 쌍은 CH1에서의 K96E 및 Cκ에서의 E16K이다. 따라서, 일부 구체예에서는,CH1 단편이 치환 L11W 및 K101E를 포함하고 Cκ 단편이 치환 V26W 및 D15K/H를 포함하거나; CH1 단편이 치환 L11W 및 K96D를 포함하고 Cκ 단편이 치환 V26W 및 E16R을 포함하거나; CH1 단편이 치환 L11W 및 K96E를 포함하고 Cκ 단편이 치환 V26W 및 E16K를 포함하거나; 또는 CH1 단편이 치환 L11W 및 K96E를 포함하거나 Cκ 단편이 치환 V26W 및 E16R을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공된다.

한 구체예에서, Cκ/CH1 쌍을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 제공되는데, Cκ 및 CH1 단편은 (a) Cκ에서의 26W 및 CH1에서의 11K 및 28N; (b) Cκ에서의 11W 및 26G 및 CH1에서의 11W; (c) Cκ에서의 26G 및 CH1에서의 11W; (d) Cκ에서의 17R 및 CH1에서의 9D; (e) Cκ에서의 17K 및 CH1에서의 9D; 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함한다.

일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 제2 Cκ/CH1 쌍을 더 포함한다. 제2 Cκ/CH1 쌍은 야생형일 수 있거나 또는 돌연변이 기를 가질 수 있다. 돌연변이 기는 제1 Cκ/CH1 쌍에서와 동일한 것일 수 있지만 쌍 사이에 미스매치(mismatch)가 없도록 상이한 것이 바람직하다.

본 개시물의 또 다른 구체예는 위치 V26 및/또는 F11에서 아미노산 변형을 포함하는 Cκ 도메인, 및 위치 Leu11에서 아미노산 변형을 포함하는 CH1 도메인을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공하는데, 변형된 아미노산은 Cκ 도메인이 CH1 도메인과 쌍을 형성할 때 서로 상호작용한다. 일부 구체예에서, 제8 항의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편에 있어서, Cκ 도메인은 야생형 CH1 도메인과 상호작용하지 않고 CH1 도메인은 야생형 Cκ 도메인과 상호작용하지 않는다. 일부 구체예에서, 변형된 아미노산은 표 1로부터 선택된다.

또 다른 구체예는 위치 Q17에서 아미노산 변형을 포함하는 Cκ 도메인, 및 위치 F9에서 아미노산 변형을 포함하는 CH1 도메인을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공하는데, 변형된 아미노산은 Cκ 도메인이 CH1 도메인과 쌍을 형성할 때 서로 상호작용한다. 일부 구체예에서, Cκ 도메인은 야생형 CH1 도메인과 상호작용하지 않고 CH1 도메인은 야생형 Cκ 도메인과 상호작용하지 않는다. 일부 구체예에서, 변형된 아미노산은 표 2로부터 선택된다.

또한, 일부 구체예에서는, 제1 Cκ/CH1 쌍 및 제2 Cκ/CH1 쌍을 포함하는 이중특이적 항체가 제공되는데, 제1 쌍의 Cκ 및 CH1 단편은 (a) Cκ에서의 26W 및 CH1에서의 11K 및 28N; (b) Cκ에서의 11W 및 26G 및 CH1에서의 11W; (c) Cκ에서의 26G 및 CH1에서의 11W; (d) Cκ에서의 17R 및 CH1에서의 9D; (e) Cκ에서의 17K 및 CH1에서의 9D; 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하고, 제2 쌍의 Cκ 및 CH1 단편은 야생형이거나 또는 (a)-(e)로부터 선택된 아미노산 잔기의 상이한 세트를 포함한다.

도 1은 상호작용을 나타내는 한 쌍의 Cκ 및 CH1 도메인 (1CZ8로부터 유래됨)의 결정 구조를 나타낸다 (수소 결합에 수반된 잔기는 핑크색이고; 염 다리(salt bridge)는 노란색이고; 소수성 상호작용 잔기는 파란색 또는 초록색의 막대이다).
도 2는 도메인 사이의 상호작용을 유지하는데 중요할 수도 있는 Cκ 및 CH1 도메인의 몇 개의 잔기를 나타낸다.
도 3은 상이한 상호작용 아미노산 쌍에 대하여 ala/trp 돌연변이에 대한 환원성 SDS-PAGE 겔의 사진을 제공한다.
도 4A-4D는 실시예 3에서 분석된 다양한 돌연변이 쌍에 대한 환원성 SDS-PAGE 겔의 사진을 나타낸다.
도 5A-B는 Cκ 및 CH1 도메인 사이의 결합을 나타내는 환원성 SDS-PAGE (5A) 및 비-환원성 SDS-PAGE (5B) 겔의 사진을 제공한다.
도 6A-C는 일부가 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄 및 경쇄 사이의 결합을 나타내는 겔 이미지를 제공한다.
도 7A-D는 다양한 이중특이적 항체의 구조를 예시한다.
도 8A-B는 각각의 결합 표적으로의 테스트된 이중특이적 항체의 결합 및 이것들의 기능적인 효능을 나타내기 위한 데이터를 제공한다.

정의

용어 "하나의(a)" 또는 "하나의(an)" 실체물은 상기 실체물 중 하나 이상을 나타낸다는 것을 알아야 한다; 예를 들어, "하나의 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나의" (또는 "하나의"), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 교체 가능하게 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 단수의 "폴리펩타이드", 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드"를 포함하도록 의도되고, 아미드 결합 (펩타이드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형으로 결합된 모노머 (아미노산)로 구성된 분자를 말한다. 용어 "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 말하며, 특정 길이의 생성물을 말하는 것은 아니다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내는데 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 용어 중 어느 것 대신에, 또는 이것과 교체 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 생성물을 나타내도록 의도되며, 제한 없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호 기/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 그것은 화학적 합성을 포함한, 어떠한 방식으로도 생성될 수 있다.

용어 "단리된"은 본원에서 세포, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA에 관하여 사용된 바와 같이, 각각 거대 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 말한다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 사용된 바와 같이 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질 이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩타이드를 말한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 핵산 단편 단편으로서 자연 발생하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것으로 간주된다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 다른 세포 단백질 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 폴리펩타이드를 나타내는데 사용된다. 단리된 폴리펩타이드는 정제된 및 재조합 폴리펩타이드 둘 다를 포함하는 것으로 간주된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 적용된 바와 같이 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 형태를 의도하며, 이것의 비-제한적 예는 정상적으로는 함께 발생하지 않는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 조합함으로써 생성될 수 있다.

"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 개의 펩타이드 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 말한다. 상동성은 비교의 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열 내에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내 위치가 동일한 염기 또는 아미노산을 차지할 때, 분자는 상기 위치에서 상동성이다. 서열 간의 상동성의 정도는 서열에 의해 공유되는, 일치하거나 상동성인 위치의 개수의 함수이다. "무관한" 또는 "비-상동성" 서열은 본 개시물의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다.

폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 또 다른 서열에 대하여 특정 퍼센트 (예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 가지며, 정렬될 때, 두 서열을 비교하는데 있어서 상기 퍼센트의 염기 (또는 아미노산)가 동일한 것임을 의미한다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 해당 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology에서 기술된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 기본 파라미터가 정렬에 사용된다. 한 정렬 프로그램은 BLAST이며, 기본 파라미터를 사용한다. 특히, 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP이며, 다음 기본 파라미터를 사용한다: 유전 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프(cutoff) = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 정렬 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비-다중, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 생물학적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 명시된 퍼센트의 상동성을 갖고 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 것들이다.

용어 "동등한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 또는 그것의 보체의 뉴클레오타이드 서열과 어느 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 말한다. 이중 가닥 핵산의 상동체는 그것의 보체와 어느 정도의 상동성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 포함하도록 의도된다. 한 양태에서, 핵산의 상동체는 핵산 또는 그것의 보체에 혼성체화할 수 있다. 유사하게, "동등한 폴리펩타이드"는 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 어느 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 일부 양태에서, 서열 동일성은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 일부 양태에서, 동등한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개의 추가, 결실, 치환 및 이것들의 조합을 갖는다. 일부 양태에서, 동등한 서열은 참조 서열의 활성 (예를 들어, 에피토프-결합) 또는 구조 (예를 들어, 염-다리)을 가지고 있다.

혼성체화 반응은 상이한 "엄중도"의 조건 하에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 낮은 엄중도 혼성체화 반응은 약 10 x SSC 또는 동등한 이온 강도/온도의 용액에서 약 40℃에서 수행된다. 중간 엄중도 혼성체화는 전형적으로 약 6 x SSC에서 약 50℃에서 수행되고, 높은 엄중도 혼성체화 반응은 일반적으로 약 1 x SSC에서 약 60℃에서 수행된다. 혼성체화 반응은 또한 당업자에게 널리 공지된 "생리학적 조건" 하에서 수행될 수 있다. 생리학적 조건의 비-제한적 예는 세포에서 보통 발견되는 온도, 이온 강도, pH 및 Mg²⁺의 농도이다.

폴리뉴클레오타이드는 네 개의 뉴클레오타이드 염기의 특정 서열로 구성된다: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 티민 (T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때에는 티민에 대하여 유라실 (U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 분자의 알파벳 표기이다. 이 알파벳 표기는 중앙 처리 장치를 가진 컴퓨터의 데이터베이스에 입력되어 기능 유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학적 용도로 사용될 수 있다. 용어 "다형성"은 하나 이상의 형태의 유전자 또는 그 일부의 공존을 말한다. 적어도 두 개의 상이한 형태가 존재하는 유전자의 일부, 즉, 두 개의 상이한 뉴클레오타이드 서열은 "유전자의 다형성 영역"이라고 불린다. 다형성 영역은 단일 뉴클레오타이드일 수도 있으며, 이것의 정체는 상이한 대립유전자에 있어서 상이하다.

용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 교체 가능하게 사용되고 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이것들의 유사체의 폴리머 형태를 말한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 공지되었든 공지되지 않았든 임의의 기능을 수행할 수도 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형(branched) 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리머화 이후, 예컨대 라벨링 구성요소와의 컨쥬게이션에 의해 더 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중-및 단일-가닥 분자를 말한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 개시물의 임의의 구체예는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 각각의 두 개의 상보적 단일-가닥 형태를 모두 포함한다.

용어 "암호화하다"는 폴리뉴클레오타이드에 적용되는 바와 같이, 고유한 상태에서 또는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩타이드 및/또는 이것의 단편에 대한 mRNA를 생산하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있으면, 폴리펩타이드를 "암호화한다"고 언급되는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 안티센스(antisense) 가닥은 이러한 핵산의 보체이고, 암호화 서열은 이것으로부터 추정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"는 항원을 특이적으로 인식하여 이것에 결합하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 말한다. 항체는 전체 항체 및 이것의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬일 수 있다. 따라서 용어 "항체"는 항원에 대한 결합의 생물학적 활성을 가진 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 것들의 예는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이것들의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역, 또는 이것들의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은, 본원에서 사용된 바와 같이, F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 일부이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 용어 "항체 단편"은 압타머, 거울상체, 및 디아바디를 포함한다. 용어 "항체 단편"은 또한 특정 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 유사하게 작용하는 임의의 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다.

"단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄 (V_H) 및 경쇄 (V_L)의 가변 영역의 융합 단백질을 말한다. 일부 양태에서, 영역은 10개 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩타이드로 연결된다. 링커는 플렉시블 성질(flexibility)을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라, 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수도 있고, V_H의 N-말단과 V_L의 C-말단을 연결하거나, 그 반대도 가능하다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 원래의 면역글로불린의 특이성을 가지고 있다. ScFv 분자는 해당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 5,892,019에서 기술되어 있다.

용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양하고 광범위한 분류의 폴리펩타이드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마(gamma), 뮤(mu), 알파(alpha), 델타(delta), 또는 엡실론(epsilon) (γ, μ, α, δ, ε)로 분류되고 그것들 중 일부는 하위 분류 (예를 들어, γ l-γ4)를 갖는다는 것을 알 수 있다. 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 항체의 "분류"를 결정하는 것이 이 사슬의 성질이다. 면역글로불린 하위 분류 (아이소타입), 예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgG₅, 등은 잘 특성화되어 있고 기능적 특수성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 분류 및 아이소타입 각각의 변형된 버젼은 본 개시물을 고려하여 당업자에게 쉽게 구별 가능하고, 따라서, 본 개시물의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 분류는 분명히 본 개시물의 범위 내에 있으며, 다음 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 분류에 관한 것이다. IgG에 관하여, 표준 면역글로불린 분자는 대략 23,000 달톤(Dalton)의 분자량의 두 개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량 53,000-70,000의 두 개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 네 개의 사슬은 전형적으로 이황화 결합에 의해 "Y" 구성형태로 결합되며 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속해서 중쇄를 괄호로 묶는다.

본 개시물의 항체, 이것의 항원-결합 폴리펩타이드, 변이체, 또는 유도체는 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv (scFv), 단일 사슬 항체, 이황화 결합된 Fv (sdFv), VK 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산되는 단편, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본원에서 개시된 LIGHT 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 개시물의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 분류 (예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 분류일 수도 있다.

경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lambda) (Κ,λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수도 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 서로 공유 이황화 결합에 의해 또는 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때에는 비-공유 결합에 의해 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 구성형태의 갈래형(forked) 단부의 N-말단에서 각 사슬의 바닥의 C-말단으로 이어진다.

경쇄 및 중쇄 둘 다는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나누어진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이 점에 있어서, 경쇄 (VK) 및 중쇄 (VH) 부분 둘 다의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 알 수 있다. 반대로, 경쇄 (CK) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합, 등과 같은 중요한 생물학적 성질을 부여한다. 관례상 불변 영역 도메인의 넘버링은 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 멀어질수록 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분은 불변 영역이며; CH3 및 CK 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.

상기 나타난 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 이것에 특이적으로 결합하게 한다. 즉, 항체의 VK 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 서브세트는 조합되어 3차원 항원-결합 부위를 한정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 구조는 Y의 각 아암의 단부에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 더 구체적으로, 항원-결합 부위는 각각 VH 및 VK 사슬 상의 세 개의 CDR (즉, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에 의해 한정된다. 어떤 경우에는, 예를 들어, 카멜리드(camelid) 종으로부터 유래되거나 또는 카멜리드 면역글로불린에 기초하여 조작된 특정 면역글로불린 분자, 완전한 면역글로불린 분자는 단지 중쇄로만 이루어질 수도 있으며, 경쇄가 없다. 예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 참조.

자연 발생한 항체에서, 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는 여섯 개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 3차원 구성형태를 취하기 때문에 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치하는 아미노산의 짧고 비-인접한 서열이다. "프레임워크" 영역이라고 불리는 항원-결합 도메인에서 아미노산의 나머지는 더 적은 분자 간 가변성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 대부분 β-시트(β-sheet) 입체구조를 채택하고 CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 어떤 경우에는 그것의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬 간, 비-공유 상호작용에 의해 올바른 배향으로 CDR을 위치시키는 것을 제공하는 스캐폴드(scaffold)를 형성하는 작용을 한다. 위치한 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역 반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 한정한다. 이 상보적 표면은 항체의, 그것의 동계(cognate) 에피토프로의 비-공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산은 정확하게 정의되어 있기 때문에 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대하여 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987) 참조).

해당 분야에서 사용 및/또는 수용되는 용어의 둘 이상의 정의가 존재하는 경우에, 용어의 정의는 본원에서 사용된 바와 같이 명시적으로 반대로 언급되지 않는 한 이러한 모든 의미를 포함하도록 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견된 비-인접한 항원 조합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 사용이다. 이 특정한 영역은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 및 Chothia et al., J. MoI . Biol. 196:901-917 (1987) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 기술되어 있다. Kabat 및 Chothia에 따르는 CDR 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도, 항체 또는 그 변이체의 CDR을 나타내기 위한 둘 중 하나의 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있도록 의도된다. 상기 나열된 참고문헌 각각에 의해 한정된 바와 같이 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교대상으로서 하기 표에서 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어진 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.

Kabat, 등은 또한 어떤 항체에도 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 그 자체를 넘어서는 어떠한 실험 데이터에도 의존하지 않으면서 이러한 "Kabat 넘버링" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명료하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)에 의해 제시된 넘버링 시스템을 말한다.

상기 표에 더하여, Kabat 넘버링 시스템은 다음과 같이 CDR 영역을 기술한다: CDR-H1는 대략 아미노산 31에서 시작하고 (즉, 첫 번째 시스테인 잔기 다음의 대략 9개의 잔기), 대략 5-7개의 아미노산을 포함하고, 그 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-H2는 CDR-H1이 끝난 다음 15번째 잔기에서 시작하고, 대략 16-19개의 아미노산을 시작하고, 그 다음 아르기닌 또는 리신 잔기에서 끝난다. CDR-H3은 CDR-H2이 끝난 다음 대략 33번째 아미노산 잔기에서 시작하고, 3-25개의 아미노산을 포함하고, 서열 W-G-X-G에서 끝나며, X는 임의의 아미노산이다. CDR-L1은 대략 잔기 24 (즉, 시스테인 잔기 다음)에서 시작하고, 대략 10-17개의 잔기를 포함하고, 그 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-L2는 CDR-L1이 끝난 다음 대략 16번째 잔기에서 시작하고 대략 7개의 잔기를 포함한다. CDR-L3은 CDR-L2이 끝난 다음 대략 33번째 잔기 (즉, 시스테인 잔기 다음)에서 시작하고, 대략 7-11개의 잔기를 포함하고 서열 F 또는 W-G-X-G에서 끝나며, X는 임의의 아미노산이다.

일부 다른 넘저링 시스템은 "IMGT 넘버링" 및 "IMGT 엑손 넘버링"을 포함한다. 예를 들어, 불변 도메인 CH1 및 Cκ에 대하여, 다음 표는 IMGT 엑손 넘버링 시스템과 Kabat 넘버링 시스템 간의 상관관계를 나타낸다.

CH1에 대한 IMGT 엑손 넘버링 및 Kabat 넘버링

Cκ에 대한 IMGT 엑손 넘버링 및 Kabat 넘버링

본원에서 개시된 항체는 조류 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수도 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 설치류, 당나귀, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체이다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 기원 (예를 들어, 상어 기원)이 콘드릭토이드(condricthoid)일 수도 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 불변 영역"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: CH1 도메인, 힌지 (예를 들어, 상부, 중부, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이것들의 변이체 또는 단편. 예를 들어, 본 개시물에서 사용을 위한 항원-결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 본 개시물의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 또한, 본 개시물에서 사용을 위한 항체는 CH2 도메인의 적어도 일부 (예를 들어, CH2 도메인 전부 또는 일부)가 없을 수도 있다. 상기 제시된 바와 같이, 당업자는 중쇄 불변 영역이 아미노산 서열이 자연 발생 면역글로불린 분자와 다르도록 변형될 수도 있다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 개시된 항체의 중쇄 불변 영역은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 IgG_l 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG₃ 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 불변 영역은 부분적으로는 IgG_l 분자로부터 및 부분적으로는 IgG₃ 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로는 IgG_l 분자로부터 및 부분적으로는 IgG₄ 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄 불변 영역"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 불변 영역은 불변 카파 도메인 또는 불변 람다 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.

"경쇄-중쇄 쌍"은 경쇄의 CL 도메인과 중쇄의 CH1 도메인 사이의 이황화 결합을 통해 다이머를 형성할 수 있는 경쇄 및 중쇄의 컬렉션을 말한다.

이전에 나타난 바와 같이, 다양한 면역글로불린 분류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 구성형태는 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제1 (가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대한 아미노 말단이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CH2 도메인"은, 예를 들어, 통상적인 넘버링 계획을 사용하여 항체의 약 잔기 244에서 잔기 360까지 연장되는 중쇄 분자의 일부를 포함한다 (잔기 244 내지 360, Kabat 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 참조). CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 형성하지 않는다는 점에서 독특하다. 대신에, 두 개의 N-결합된 분지형 탄수화물 사슬이 온전하고 고유한 IgG 분자의 두 개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 또한 CH3 도메인은 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단까지 연장되고 대략 108개의 잔기를 포함한다는 것이 잘 기록되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 일부를 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하고 플렉시블(flexible)하며, 따라서 두 개의 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 움직이게 한다. 힌지 영역은 세 개의 별개의 도메인, 상부, 중부, 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이황화 결합"은 두 개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 이황화 결합 또는 다리를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CK 영역은 이황화 결합에 의해 결합되고 두 개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242 (위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에 상응하는 위치에서 두 개의 이황화 결합에 의해 결합된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역 반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 얻어지거나 유래되고 불변 영역 (온전하거나, 부분적이거나 또는 본 개시물에 따라 변형될 수도 있음)은 제2 종으로부터 얻어지는 임의의 항체를 의미할 것이다. 특정 구체예에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원 (예를 들어, 마우스 또는 영장류)로부터 유래될 것이고 불변 영역은 인간이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "퍼센트 인간화"는 인간화된 도메인 및 생식계열 도메인 간의 프레임워크 아미노산 차이 (즉, 비-CDR 차이)의 수를 결정하고, 총 아미노산 수에서 상기 수를 뺀 다음 그것을 총 아미노산 수로 나누고 100을 곱하여 계산된다.

"특이적으로 결합하다" 또는 "~에 대한 특이성을 갖는다"는 일반적으로 항체가 그것의 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 결합은 항원-결합 도메인과 에피토프 사이에서 일부 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는, 그것의 항원-결합 도메인을 통해, 무작위의 무관한 에피토프에 결합하는 것보다 상기 에피토프에 더 쉽게 결합할 때 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화도를 정량화하는데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 주어진 에피토프에 대하여 항체 "B"보다 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대하여 갖는 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.

변형된 Cκ 및 CH1 도메인

두 개의 항원 또는 에피토프를 표적화하는 이중특이적 항체 (BsAb)는 두 개의 별개의 단클론성 항체 (mAb)의 특이성 및 성질을 단일 분자에 통합시킨다. 두 세트의 쌍 형성된 VH-Ch1:VL-CL 단편이 존재할 때 쌍 형성 오류가 발생할 수도 있다. 두 개의 별개의 항체로부터 유래된 VH-CH1:VL-CL 단편의 쌍 형성 오류를 방지하기 위해서, Cross-Mab, 공통 경쇄, 및 FITIg와 같은 많은 방법들이 사용되었다.

실험예의 목적은 Cκ 및/또는 CH1 도메인, 특히 인간 도메인에 돌연변이를 도입하여 쌍 형성 오류를 감소시키는 것이었다. 바람직하게는, 돌연변이 Cκ는 돌연변이 CH1에 대하여 양호한 결합을 나타낼 수 있지만, 돌연변이 Cκ는 돌연변이되지 않은 CH1 도메인에 결합하지 않거나 약하게 결합하고 돌연변이 CH1은 돌연변이되지 않은 Cκ에 약하게 결합하거나 결합하지 않는다.

먼저, 인간 Cκ 및 CH1의 중요한 계면 잔기를 분석하여 다섯 개의 핫스팟(hotspot)을 발견하였다. 이들 잔기의 중요성을 확인하기 위해서, 알라닌 또는 트립토판으로의 각각의 잔기의 돌연변이를 제조하였다. Cκ의 Gln17 (Cκ_Q17) 또는 CH1의 Phe9 (CH1_F9)에서의 돌연변이, 및 Cκ의 Val26 또는 Phe11 (Cκ_V26_F11) 또는 CH1의 Leu11 (CH1_L11)에서의 돌연변이는 경쇄 및 중쇄의 쌍 형성을 크게 감소시켰다. 이들 결과는 군 Cκ_Q17/CH1_F9 (실시예에서 쌍 1로 불림) 및 Cκ_V26_F11/CH1_L11 (실시예에서 쌍 2로 불림)이 Cκ 및 CH1의 상호작용에 중요하다는 것을 확인하였다. 그 이후, 잠재적으로 쌍 형성을 복원할 수 있는 돌연변이가 발현되고 분석되었다. 이러한 변형은 특히 Cκ 및 CH1 도메인의 두 개의 상이한 쌍을 가진 이중특이적 항체를 제조하는데 유용하다.

계면 잔기 Cκ_V26_F11/CH1_L11 (및 선택적으로 L28)에 대하여, 다음 돌연변이는 Cκ 및 CH1 도메인의 쌍 형성을 복원할 수 있는 것으로 나타나거나 또는 그런 것으로 간주된다:

26 및 선택적으로 11에서 Cκ 및 11 및 선택적으로 28에서 CH1의 돌연변이 군

번호	Cκ (26 및/또는 11에서)	CH1 (11 및/또는 28에서)
1	26W	11W
2	26W	11K_및 28N
3	11W 및 26G	11W
4	11W 및 26G	11K 및 28N
5	26F	11F
6	26W	11F
7	26F	11W
8	26L	11W
9	26M	11W
10	26E	11W
11	26W	11W 및 28R
12	11A 및 26W	11W

유사하게, 계면 잔기 Cκ_Q17/CH1_F9에 대하여, 다음 돌연변이는 Cκ 및 CH1 도메인의 쌍 형성을 복원할 수 있는 것으로 나타나거나 또는 그런 것으로 간주된다:

Cκ 17/CH1 9에서의 돌연변이 군

번호	Cκ (17에서)	CH1 (9에서)
1	17R	9D
2	17K	9D
3	17R	9E
4	17K	9E
5	17D	9R
6	17D	9K
7	17H	9I
8	17R	9H
9	17H	9H
10	17R	9P
11	17D	9H
12	17I	9H
13	17H	9M
14	17R	9Q
15	17H	9Q

실시예 7에서 나타난 바와 같이, 야생형 Cκ 및 CH1 도메인에서 하나 이상의 기존의 염 다리를 붕괴시키고 새로운 것을 재구축하는 추가적인 아미노산 치환은 원하는 쌍 형성 특이성을 더 개선할 수 있다. 야생형 Cκ/CH1 쌍은 CH1_K96과 Cκ_E16 사이, CH1_K101과 Cκ_D15 사이, 및 CH1_H51과 Cκ_D60 사이에서 염 다리를 갖는다. 이들 각각의 염 다리는 치환에 적합한 부위일 수 있다. 예를 들어, 각각의 염 다리에서, 양으로 대전된 아미노산 (예를 들어, K, R 또는 H)은 음으로 대전된 아미노산 (예를 들어, E 또는 D)으로 치환될 수 있고, 음으로 대전된 아미노산 (예를 들어, E 또는 D)은 양으로 대전된 아미노산 (예를 들어, K, R, 또는 H)으로 치환될 수 있다. 하나의 이러한 예는 CH1_K101E/Cκ_D15K 또는 Cκ_D15H이고; 또 다른 예는 CH1_K96D/Cκ_E16R이고; 또 다른 예는 CH1_96E/Cκ_E16K이고; 또 다른 예는 CH1_H51D/Cκ_D60K이다. 이들 및 다른 예는 표 3에서 예시된다. 이러한 각각의 치환된 염 다리는 새로운 CH1/Cκ 쌍 형성을 제조하기 위해, 또는 본 개시물에서 기술된 다른 치환 중 어느 것에 더하여 독립적으로 사용될 수 있다.

붕괴 및 재구축된 염 다리

번호	CH1	Cκ
1	K101E	D15H
2	K101E	D15K
3	K101E	D15R
4	K101D	D15H
5	K101D	D15K
6	K101D	D15R
7	K96D	E16R
8	K96E	E16K
9	K96D	E16K
10	K96E	E16R
11	K96D	E16H
12	K96E	E16H
13	H51D	D60K
14	H51D	D60R
15	H51D	D60H
16	H51E	D60K
17	H51E	D60R
16	H51E	D60H

한 구체예에서, 개시된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 치환 L11W 및 K101E를 가진 CH1 단편 및 치환 V26W 및 D15K/H를 가진 Cκ 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 개시된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 치환 L11W 및 K96D를 가진 CH1 단편 및 치환 V26W 및 E16R을 가진 Cκ 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 개시된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 치환 L11W 및 K96E를 가진 CH1 단편 및 치환 V26W 및 E16K를 가진 Cκ 단편을 포함한다. 이들 돌연변이 기는 서로 결합할 수 있는 돌연변이된 Cκ 및 CH1 도메인을 제조하는데 유용할 수 있으며, 이것들은 야생형 대응물 CH1 또는 Cκ 도메인에 결합할 수 없거나 또는 그것으로의 결합을 감소시킬 수 있다. 이러한 Cκ 및 CH1 도메인은 항체 또는 항원-결합 단편, 특히 이중특이적인 것들로 통합될 수 있다.

하나의 시나리오에서, 이중특이적 항체는 두 개의 경쇄-중쇄 쌍을 포함하는 정상적인 IgG 구조를 갖는다. 각각의 중쇄는 VH, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 각각의 경쇄는 VL 및 CL (예를 들어, Cκ) 도메인을 포함한다. 본 개시물의 한 구체예에 따르면, Cκ/CH1 쌍 중 하나는 본 개시물의 돌연변이 기를 포함하지만, 다른 쌍은 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, Cκ/CH1 쌍 중 하나는 본 개시물의 돌연변이 기를 포함하고 다른 쌍은 상이한 돌연변이 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 두 쌍 중 하나는 둘 이상의 돌연변이 기 (예를 들어, 표 1에서의 한 군 및 표 2에서의 또 다른 군)을 포함한다.

또 다른 시나리오에서, 이중특이적 항체는 Fc 단편의 C-말단에서 제2 Fab 단편의 VH의 N-말단에 추가로 융합되는 정상적인 IgG 구조를 갖는다. 이러한 항체는 도 7A에서 예시된다. 본 개시물의 한 구체예에 따르면, Fc 단편의 N-말단 측면에서 Cκ/CH1 쌍 또는 Fc 단편의 C-말단 측면에서 Cκ/CH1 쌍 중 하나는 본 개시물의 돌연변이 기를 포함하고 다른 쌍은 포함하지 않는다. 게다가, 돌연변이 기는 Fc 단편의 N 또는 C-말단 측면에서 Cκ/CH1 쌍 둘 다에 포함될 수 있다.

하지만, 또 다른 구체예에서는, 이중특이적 항체는 도 7B에서 예시된 구조를 갖는다. 이 구조에서, 각각의 중쇄 및 경쇄는 두 세트의 연쇄된 Cκ/CH1 쌍을 포함한다. 돌연변이 기는 원하는 쌍 형성을 선호하는 한 이 항체 내 어디에도 배치될 수 있다. CH3 도메인에서 공지된 놉-인투-홀을 갖는 또 다른 이중특이적 항체가 도 7C에서 예시된다. 본원에서, 본 개시물의 돌연변이 기는 A 및 B Cκ/CH1 쌍 중 하나 또는 둘 다에 삽입될 수 있다. 하지만 CH2 또는 CH3 도메인을 갖지 않는 다른 예가 도 7D에서 예시된다.

한 구체예에서, 본 개시물은 인간 Cκ/CH1 쌍을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하며, Cκ 도메인의 아미노산 잔기 26은 Trp이고 CH1 도메인의 아미노산 잔기 11은 Trp이다. 일부 양태에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 제2 인간 Cκ/CH1 쌍을 더 포함하며, 제2 Cκ 도메인의 아미노산 잔기 26은 Trp가 아니고 제2 CH1 도메인의 아미노산 잔기 11은 Trp가 아니다. 일부 양태에서, the 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 개시물은 위치 Val26 및/또는 Phe11에서 아미노산 변형을 포함하는 인간 Cκ 도메인, 및 위치 Leu11에서 아미노산 변형을 포함하는 인간 CH1 도메인을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공하며, 변형된 아미노산은 Cκ 도메인이 CH1 도메인과 쌍을 형성할 때 서로 상호작용한다. 일부 구체예에서, 아미노 변형은 인간 IgG Cκ 및 CH1 도메인과 비교된 바와 같다. 일부 구체예에서, 변형된 아미노산은 표 1로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 제2 Cκ/CH1 쌍을 더 포함하며, 제2 Cκ 도메인의 아미노산 잔기 26은 Val이고 제2 CH1 도메인의 아미노산 잔기 11은 Leu이다. 일부 양태에서, 제2 Cκ 도메인의 아미노산 잔기 11은 Phe이다.

또 다른 구체예에서, 본 개시물은 위치 Gln17에서 아미노산 변형을 포함하는 Cκ 도메인, 및 위치 Phe9에서 아미노산 변형을 포함하는 CH1 도메인을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공하며, 변형된 아미노산은 Cκ 도메인이 CH1 도메인과 쌍을 형성할 때 서로 상호작용한다. 일부 구체예에서, 아미노 변형은 인간 IgG Cκ 및 CH1 도메인과 비교된 바와 같다. 일부 구체예에서, 변형된 아미노산은 표 2로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 제2 Cκ/CH1 쌍을 더 포함하며, 제2 Cκ 도메인의 아미노산 잔기 17은 Gln이고 제2 CH1 도메인의 아미노산 잔기 9는 Phe이다.

일부 구체예에서, 본 개시물은 표 1의 돌연변이 기 또는 표 2의 돌연변이 기를 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 표 1의 돌연변이 기 및 표 2의 돌연변이기를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 표 3의 돌연변이 기를 더 포함한다.

항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 어떤 공지된 분류의 항체일 수도 있지만, 바람직하게는 분류 IgG이며, 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 항체 또는 이것의 단편은 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는 완전한 인간 항체일 수 있다.

이중특이적/이기능적 분자

일부 구체예에서, 이중특이적 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 종양 항원 또는 미생물에 대하여 제1 특이성을 갖는다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 면역 세포에 대하여 제2 특이성을 갖는다.

일부 구체예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 거대 세포, 호중구, 수지상세포, 포식 세포, 자연 살해 세포, 호산구, 호염기구, 및 비만 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 표적화될 수 있는 면역 세포 상의 분자는, 예를 들어, CD3, CD16, CD19, CD28, 및 CD64를 포함한다. 다른 예는 PD-1, CTLA-4, LAG-3 (CD223으로도 알려져 있음), CD28, CD122, 4-1BB (CD137로도 알려져 있음), TIM3, OX-40 또는 OX40L, CD40 또는 CD40L, LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM 또는 BTLA (CD272로도 알려져 있음), 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), 및 CD47을 포함한다. 이중 특이성의 구체적인 예는, 제한 없이, PD-L1/PD-1, PD-L1/LAG3, PD-L1/TIGIT, 및 PD-L1/CD47을 포함한다.

"종양 항원"은 종양 세포에서 생산된 항원성 물질이며, 즉, 그것은 숙주에서 면역 반응을 촉발시킨다. 종양 항원은 종양 세포를 확인하는데 유용하고 암 치료법에서 사용을 위한 잠재적인 후보물질이다. 체내에서 정상적인 단백질은 항원이 아니다. 하지만, 특정 단백질이 종양 형성 동안에 생산되거나 과발현되며, 따라서 신체에 이질적인 것으로 보인다. 이것은 면역계로부터 잘 격리된 정상 단백질, 일반적으로 극소량으로 생산되는 단백질, 일반적으로 특정 발달 스테이지에서만 생산되는 단백질, 또는 돌연변이로 인해 구조가 변형된 단백질을 포함할 수도 있다.

종양 항원의 풍부함은 해당 분야에 널리 공지되어 있어서 새로운 종양 항원은 스크리닝에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 종양 항원의 비-제한적 예는 EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, CIX, PSMA, 폴레이트-결합 단백질, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, 인테그린, aVb3, a5b1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP 및 테나신을 포함한다.

항체 뿐만 아니라 항원 결합 단편을 포함하는 이기능적 분자가 또한 제공된다. 종양 항원 표적화 분자로서, 본원에서 기술된 것들과 같이, PD-L1에 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편은 선택적으로 펩타이드 링커를 통해 면역 사이토카인 또는 리간드와 조합될 수 있다. 결합된 면역 사이토카인 또는 리간드는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, TNF-α,CD40L, OX40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, LIGHT 및 GITRL을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 이기능적 분자는 면역 체크포인트 차단 효과와 종양 부위 국소 면역 조절을 조합할 수 있다.

항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체 제조 방법

본 개시물은 또한 본 개시물의 항체, 이것의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시물의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체 또는 유도체의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화할 수도 있다. 추가적으로, 본 개시물의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체 또는 유도체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 일부를 암호화할 수도 있다.

항체를 제조하는 방법은 해당 분야에 널리 공지되고 본원에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 본 개시물의 항원-결합 폴리펩타이드의 가변 및 불변 영역 둘 다는 완전한 인간이다. 완전한 인간 항체는 해당 분야에 설명된 기술을 사용하여 및 본원에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 항원에 대한 완전한 인간 항체는 항원의 공격에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 내인성 유전자좌가 손상된 트랜스제닉 동물에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시의 기술은 미국 특허 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140 (그 전문이 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

특정 구체예에서, 제조된 항체는 처리되는 동물, 예를 들어, 인간에서 해로운 면역 반응을 유도하지 않을 것이다. 한 구체예에서, 본 개시물의 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체, 또는 유도체는 해당 분야에서 인정된 기술을 사용하여 면역원성을 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 항체는 인간화, 영장류화, 탈면역화될 수 있거나, 또는 키메라 항체가 제조될 수 있다. 이러한 유형의 항체는 모체 항체의 항원-결합 성질을 가지고 있거나 또는 실질적으로 가지고 있지만, 인간에서 덜 면역원성인 비-인간 항체, 전형적으로 쥐 또는 영장류 항체로부터 유래된다. 이것은 (a) 전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역으로 이식하여 키메라 항체를 생성하는 단계; (b) 중요한 프레임워크 잔기의 체류 여부에 관계없이 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 중 하나 이상의 적어도 일부를 인간 프레임워크 및 불변 영역으로 이식하는 단계; 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 섹션으로 그것들을 "은폐"하는 단계를 포함하는, 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv . Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec . Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec . Immun. 31:169-217 (1994), 및 미국 특허 번호 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, 및 6,190,370 (이것들 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.

탈면역화는 또한 항체의 면역원성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "탈면역화"는 T-세포 에피토프를 변형시키기 위한 항체의 변화를 포함한다 (예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO/9852976 A1 및 WO/0034317 A2 참조). 예를 들어, 시작 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 분석되고 서열 내 상보성 결정 영역 (CDR) 및 다른 핵심 잔기에 관한 에피토프의 위치를 나타내는 각 V 영역의 인간 T-세포 에피토프 "맵"이 생성된다. T-세포 에피토프의 개개의 T-세포 에피토프는 최종 항체의 활성이 변화될 위험이 적은 대안의 아미노산 치환을 확인하기 위해 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함하는 광범위한 대안의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 설계되고 이들 서열은 그 이후 광범위한 결합 폴리펩타이드에 통합된다. 전형적으로, 12 내지 24개의 변이체 항체가 생성되고 결합 및/또는 기능에 대하여 테스트된다. 그 다음에 변형된 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현 벡터에 클로닝되고 이후의 플라스미드는 전체 항체의 생산을 위해 세포주에 도입된다. 이어서 항체는 적절한 생화학적 및 생물학적 분석으로 비교되고, 최적의 변이체가 확인된다.

본 개시물의 항원-결합 폴리펩타이드의 결합 특이성은 면역침강법, 방사 면역 분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)과 같은 시험관 내(in vitro) 분석에 의해 결정될 수 있다.

대안으로, 단일 사슬 유닛의 생산에 대하여 설명된 기술 (미국 특허 번호 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 55:5879-5883 (1988); 및 Ward et al., Nature 334:544-554 (1989))은 본 개시물의 단일 사슬 유닛을 생산하도록 조정될 수 있다. 단일 사슬 유닛은 아미노산 다리를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 결합시킴으로써 형성되며, 그 결과 단일 사슬 융합 펩타이드가 생성된다. 대장균(E. coli)에서 기능적 Fv 단편의 조립 기술이 또한 사용될 수 있다 (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).

단일 사슬 Fv (scFv) 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc . Natl . Sci . USA 90:1995-1999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에서 기술된 것들을 포함한다. 인간에서 항체의 생체 내(in vivo) 사용 및 시험관 내 검출 분석을 포함한 어떤 용도의 경우에는, 키메라, 인간화된, 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥐 단클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 가진 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 해당 분야에 기술되어 있다. 예를 들어, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol . Methods 125:191-202 (1989); 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816397 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.

인간화된 항체는 비-인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자의 프레임워크 영역을 가진 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터 유래된 항체 분자이다. 때때로, 인간 프레임워크 영역에서 프레임워크 잔기는 CDR 공여체 항체의 상응하는 잔기와 치환되어 항원-결합을 변화시킬 것이며, 바람직하게는 이것을 개선할 것이다. 이들 프레임워크 치환은 해당 분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 항원-결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 비정상적인 프레임워크 잔기를 확하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예를 들어, Queen et al., 미국 특허 번호 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 항체는, 예를 들어, CDR-이식 (EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 버니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc . Natl . Sci . USA 91:969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링(shuffling) (미국 특허 번호 5,565,332 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨))을 포함하여, 해당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.

완전한 인간 항체는 특히 인간 환자의 치료적 처리에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하여, 해당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 미국 특허 번호 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741 (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.

인간 항체는 또한 기능적인 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수도 있다. 대안으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 외에도 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수도 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과는 별도로 또는 이와 동시에 비-기능적으로 될 수도 있다. 특히, JH 영역의 동형 접합성 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포가 확장되고 배반포에 미세주사되어 키메라 마우스가 생산된다. 이어서 키메라 마우스가 교배되어 인간 항체를 발현하는 동형 접합성 자손(offspring)을 생산한다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어, 원하는 표적 폴리펩타이드 전부 또는 그 일부로 정상적인 방식으로 면역화된다. 항원에 대한 단클론성 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 얻어질 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 숨겨져 있는 인간 면역글로불린 이식 유전자는 B-세포 분화 중에 재배열되고, 그 이후 클래스 전환(class switching) 및 체세포 돌연변이된다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 이러한 기술의 검토를 위해, Lonberg and Huszar Int . Rev. Immunol. 73:65-93 (1995) 참조. 인간 항체 및 인간 단클론성 항체를 생산하기 위한 이러한 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해서는, 예를 들어, PCT 공보 WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 번호 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 및 5,939,598 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조. 이에 더하여, 이에 더하여, Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) 및 GenPharm (San Jose, Calif.)과 같은 회사들이 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하는데 종사할 수 있다.

선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 또한 "유도된(guided) 선택"이라고 불리는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이 접근법에서 선택된 비-인간 단클론성 항체, 예를 들어, 마우스 항체가 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도하는데 사용된다 (Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903 (1988). 또한 미국 특허 번호 5,565,332 (그 전문이 참조로 포함됨) 참조.

또 다른 구체예에서, 원하는 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 단리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 역할을 한다. 단리되면, DNA는 발현 벡터로 배치될 수 있으며, 이것은 이어서 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 면역글로불린을 생산하지 않는 대장균 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포에 트랜스펙션된다. 더 구체적으로, 단리된 DNA (본원에서 기술된 바와 같이 합성될 수 있음)는 1995년 1월 25일에 출원된 Newman et al., 미국 특허 번호 5,658,570 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 바와 같이 제조 항체에 대한 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 근본적으로, 이것은 선택된 세포로부터 RNA의 추출, cDNA로의 전환, 및 Ig 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 이 목적에 적합한 프라이머는 또한 미국 특허 번호 5,658,570에 기술되어 있다. 하기 더 상세히 논의되는 것처럼, 원하는 항체를 발현하는 형질전환된 세포는 면역글로불린의 임상적 및 상업적 공급량을 제공하기 위해 비교적 대량으로 키워질 수도 있다.

추가적으로, 일상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여, 본 개시물의 항원-결합 폴리펩타이드의 CDR 중 하나 이상이 프레임워크 내에서, 예를 들어, 인간 프레임워크 영역으로 삽입되어 비-인간 항체를 인간화할 수도 있다. 프레임워크 영역은 자연 발생 또는 공통 프레임워크 영역일 수도 있고, 바람직하게는 인간 프레임워크 영역일 수도 있다 (인간 프레임워크 영역의 목록에 대하여, 예를 들어, Chothia et al., J. Mol . Biol. 278:457-479 (1998) 참조). 바람직하게는, 프레임워크 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오타이드는 원하는 폴리펩타이드 중 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, LIGHT를 암호화한다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환은 프레임워크 영역 내에서 만들어질 수도 있고, 바람직하게는, 아미노산 치환이 항원에 대한 항체의 결합을 개선한다. 추가적으로, 이러한 방법은 사슬 내 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산을 치환 또는 결실시켜 하나 이상의 사슬 내 이황화 결합이 없는 항체 분자를 생성하는데 사용될 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 다른 변화는 본 개시물에 의해 및 해당 분야의 기술 내에 포함된다.

이에 더하여, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자의 유전자를 스플라이싱(splicing)함으로써 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술 (Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))이 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥐 단클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 가진 것들이다.

재조합 항체를 생성하기 위한 또 다른 고도로 효율적인 수단은 Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992)에 개시되어 있다. 구체적으로, 이 기술은 원숭이 가변 도메인 및 인간 불변 서열을 함유하는 영장류화된 항체의 생성을 유도한다. 이 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 더욱이, 이 기술은 또한 일반적으로 할당된 미국 특허 번호 5,658,570, 5,693,780 및 5,756,096 (각각 참조로 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.

대안으로, 항체-생산 세포주는 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 선택되고 배양될 수 있다. 이러한 기술은 다양한 실험실 매뉴얼 및 주요 간행물에 기술되어 있다. 이 점에 있어서, 본 개시물에서 사용에 적합한 기술은 하기 기술된 바와 같이 보충판을 포함한 Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

추가적으로, 당업자에게 공지된 표준 기술은 본 개시물의 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이를 도입하는데 사용될 수 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 아미노산 치환을 초래하는 부위-관련 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 (유도체 포함)는 참조 가변 중쇄 영역, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 가변 경쇄 영역, CDR-L1, CDR-L2, 또는 CDR-L3에 관하여 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 암호화한다. 대안으로, 돌연변이는, 예컨대 포화 돌연변이 유발에 의해, 암호화 서열 전부 또는 그 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 결과로 생성된 돌연변이는 활성을 가지고 있는 돌연변이를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다.

본 개시물은 또한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 항체의 유효량, 및 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제2 항암제 (예를 들어, 면역 체크포인트 억제자)를 더 포함한다.

특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된 또는 미국 약전 또는 동물, 및 더 구체적으로는 인간에서 사용에 대하여 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열된 것을 의미한다. 또한, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로 임의의 유형의 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 제제화 보조제일 것이다.

용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 말한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함한 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수도 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한, 특히 주사 가능한 용액에 대하여, 액체 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원하는 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 항세균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 및 장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스가 또한 구상된다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 타블렛, 알약, 캡슐, 분말, 지효성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 바인더 및 담체, 예컨대 트리글리세리드와 함께 좌제로 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트, 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin (본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위한 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 모체 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 다회수 용량의 바이알에 동봉될 수 있다.

한 구체예에서, 조성물은 일상적인 과정에 따라 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 버퍼 중의 용액이다. 필요하면, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 국소마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 별도로 공급되거나 또는 활성제의 양을 표시하는 밀폐 용기, 예컨대 앰플 또는 사세(sachette) 내에서 단일 투약 형태, 예컨대 동결건조된 분말 무수 농축물로서 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 그것은 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.

본 개시물의 화합물은 중화 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 음이온과 함께 형성된 것들, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등으로부터 유래된 것들, 및 양이온과 함께 형성된 것들, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2 철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.

실시예

실시예 1: 네 개의 Fab 단편의 Cκ/CH1 계면 상호작용 분석

이 실시예는 몇몇 항체 Fab 단편을 Cκ/CH1 계면 상호작용에 관하여 분석하였다.

구조 1: Fab 1F8의 Cκ 및 CH1에 대한 계면 상호작용 분석

1F8은 인간 CD47에 특이적인 항체로부터 제조된 Fab 분자이다.

항-CD47 Fab 1F8과의 CD47의 복합 결정 구조를 2017년에 3.1A의 분해능에서 수행하였다 (경쇄는 219개의 아미노산을 가지며, Cκ는 아미노산 114-219를 포함하였고; 중쇄는 220개의 아미노산을 가지며, CH는 아미노산 119-220을 포함한다).

이 Fab 단편의 Cκ와 CH1 도메인 사이의 계면에는, CH 도메인으로부터 총 32개의 잔기 및 Cκ 도메인으로부터 35개의 잔기가 존재한다. 1F8은 CH 도메인에서 Ser14와 Gly20 사이에서 연속적인 잔기를 갖는다. 4NYL과 비교하여 CH 단편으로부터의 Lys16 주요 사슬 산소 원자 및 Cκ 단편으로부터의 잔기 Lys100 사이에서 형성된 하나 이상의 수소 결합이 존재한다 (하기 구조 4 참조). 소수성 상호작용은 하기 나타난 바와 같이 다른 구조와 유사하다.

수소 결합 (거리 컷-오프: 3.5Å)

주:

1. CH-Lys30과 Ser24 사이의 HD는 Lys30의 NZ가 회전하는 한 다른 세 가지 구조에서 형성될 수 있다.

2. CH-Lys16/CK-Lys100과 CH-Ser102/CK-Glu106 사이의 여분의 HD는 다른 3 pdb와의 서열 차이로 인해 형성된다.

1F8의 Cκ와 CH1 사이의 염 다리

소수성 계면

* 수소 결합 및 염 결합에 수반되는 소수성 접촉은 이 표에서 제외된다.

자유 에너지 편차 분석으로 1F8 CH1 내의 일부 잔기가 Cκ 잔기와 더 강력하게 상호작용한다는 것을 확인하였다 (하기 표에서 처음 10개의 잔기 참조, 볼드체).

1F8 CH1 내 계면 잔기:

결합: 수소 결합 또는 염 다리가 형성되는지에 따른 결합 유형, H: 수소 결합, S: 염 다리

ASA: 접근 가능한 표면적

BSA: 매장된 표면적

델타G: 에너지 변화, 양의 값은 더 많은 소수성 상호작용을 수반하는 한편 음의 값은 더 많은 친수성 상호작용을 나타낸다.

델타G의 Abs: 델타G의 절대치, 표는 이 키로 정렬된다. 델타G가 0.5보다 크게 변화된 잔기 (볼드체)는 단백질을 안정화하는데 더 많이 기여하는 것으로 간주될 수 있다.

Cκ 도메인에서, 일곱 개의 잔기가 상호작용에 수반될 가능성이 크다.

1F8 Cκ 내 계면 잔기:

ASA: 접근 가능한 표면적

BSA: 매장된 표면적

구조 2: 1CZ8의 Cκ 및 CH1에 대한 계면 상호작용 분석

1CZ8 (PDB ID 1CZ8)은 VEGF에 특이적인 항체로부터 제조된 Fab 분자이다. VEGF 및 Fab의 복합 결정 구조를 2000년에 2.4A의 분해능에서 수행하였다.

아미노산 잔기는 CH 도메인에서 세 개의 역평행 베타 시트 및 Cκ 도메인에서 네 개의 역평행 베타 시트를 형성하였다. 이들 베타 시트는 계면에서 페이스-투-페이스(face-to-face) 입체구조를 형성하였다. 이 Fab 단편의 Cκ 및 CH1 도메인 사이의 계면에는, CH 도메인으로부터 총 28개의 잔기 및 Cκ도메인으로부터 30개의 잔기가 존재한다. Cκ 및 CH1 도메인 사이에는 세 개의 수소 결합이 존재한다. 예를 들어, 1CZ8에서, CH 잔기 His 51 및 Pro54 및 Leu57의 주요 사슬 산소 원자는 각각 Cκ 잔기 Asn31, Ser55 및 Gln53과 함께 이들 세 개의 수소 결합을 형성한다. 이들 수소는 계면의 한 측면에 위치한다.

소수성 상호작용은 주로 CH 잔기 Phe9, Leu11, Phe53, Val68과 Cκ 잔기 Gln17, Phe11, Val26, Phe69 및 Val28 사이에서, 계면의 중심 및 다른 측면에 위치한다. CH 잔기 Lys96 및 Lys101의 C-말단과 Cκ 잔기 Asp15 및 Glu16 사이에서 두 개의 염 다리를 형성하여 계면의 다른 측면 상에서 CH 및 Cκ 복합 구조를 안정화시켰다 (도 1; 수소 결합에 수반되는 잔기는 핑크색이고; 염 다리는 노란색이고; 소수성 상호작용 잔기는 파란색 또는 초록색의 막대이다)

수소 결합 (거리 컷-오프: 3.5Å)

CH와 Cκ 사이의 염 다리

소수성 계면 (거리 컷-오프: 4Å)

Cκ 및 CH1 상호작용에 대한 상위 5개의 중요한 계면 잔기

주: 염 다리 잔기는 제외된다

자유 에너지 편차 분석으로 1cz8 CH1 내의 일부 잔기가 Cκ 잔기와 더 강력하게 상호작용한다는 것을 확인하였다 (하기 표에서 처음 9개의 잔기 참조, 볼드체).

계면 잔기: 1cz8 CH1

ASA: 접근 가능한 표면적

BSA: 매장된 표면적

Cκ 도메인에는, 다섯 개의 잔기가 상호작용에 수반될 가능성이 크다.

계면 잔기: 1cz8 Cκ

ASA: 접근 가능한 표면적

BSA: 매장된 표면적

구조 3: 1L7I의 Cκ 및 CH1에 대한 계면 상호작용 분석

1L7I은 ErbB2를 표적으로 하는 공지된 Fab 분자 (PDB ID: 1L7I)이다. 이 항-ErbB2 Fab2C4의 결정 구조를 2002년에 1.8A에서 분해하였다.

이 Fab 단편 (PDB ID 1L7i)의 Cκ와 CH1 도메인 사이의 계면에는, CH로부터 총 33개의 잔기 및 Cκ 도메인로부터 35개의 잔기가 존재한다.

1L7i의 수소 결합 (거리 컷-오프: 3.5Å)

1L7i의 CK와 CH 사이의 염 다리

주: CH의 C-말단 잔기 Cys 103 및 Cys 107 CK는 다른 구조에서 볼 수 있는 CH 잔기 Lys101과 Ck 잔기 Asp15 사이의 염 다리를 파괴하는 이황화 다리를 형성하였다.

1L7i의 소수성 계면

자유 에너지 편차 분석으로 1L7i CH1 내의 일부 잔기가 Cκ 잔기와 더 강력하게 상호작용한다는 것을 확인하였다 (하기 표에서 처음 12개의 잔기 참조, 볼드체).

계면 잔기: 1L7i CH1

ASA: 접근 가능한 표면적

BSA: 매장된 표면적

Cκ 도메인에는, 아홉 개의 잔기가 상호작용에 수반될 가능성이 크다.

계면 잔기: 1L7i Cκ

ASA: 접근 가능한 표면적

BSA: 매장된 표면적

구조 4: 4NYL의 Cκ 및 CH1에 대한 계면 상호작용 분석

연구 중인 네 번째 구조는 4NYL이며, 공지된 Fab 분자 (PDB ID: 4NYL)이고, TNFa를 표적으로 한다. 아달리무맙 FAB 단편의 결정 구조를 2014년에 2.8A에서 분해하였다 (비교적 높은 Rfree (Rfree=35.8%/R=27.5)로 분해하였으며, 이것은 구조가 상세한 분석에 적합하지 않다는 것을 의미함). 아달리무맙은 TNFa에 대한 항체이며, 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis) 및 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)에 걸린 환자, 및 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis)에 걸린 아동을 치료하는데 사용된다. 아달리무맙 Fab 단편 (PDB ID 4NYL)의 Cκ 및 CH1 도메인 사이의 계면에는, CH1로부터 총 24개의 잔기 및 CK 도메인으로부터 28개의 잔기가 존재한다.

4NYL은 1CZ8에서와 동일한 수소 결합 및 소수성 상호작용을 갖는다. C-말단 Ch 잔기의 부족으로 인해, CH 잔기 Lys96의 C-말단과 CK 잔기 Glu15 사이에서 단 하나의 염 다리가 형성되었다.

4NYL의 수소 결합 (거리 컷-오프: 3.5Å)

주: 분해능의 한계로 인해, 물 매개된 수소 결합은 발견되지 않았다.

4NYL의 CK 및 CH 사이의 염 다리

주: 4NYL에서 C-말단 잔기 100-103이 없기 때문에, CH-Lys101과 CK-Asp15 사이에는 염 다리가 없다.

4NYL의 소수성 계면

자유 에너지 편차 분석으로 4NYL CH1 내의 일부 잔기가 Cκ 잔기와 더 강력하게 상호작용한다는 것을 확인하였다 (하기 표에서 처음 9개의 잔기 참조, 볼드체).

계면 잔기: 4NYL CH1

ASA: 접근 가능한 표면적

BSA: 매장된 표면적

계면 잔기: 4NYL Cκ

ASA: 접근 가능한 표면적

BSA: 매장된 표면적

1cz8, 4nyl, 1l7i, hCD47-1_1F8의 CH1_Cκ에 대한 계면 분석

상기 네 개의 구조에 대한 계면 분석은 염 다리, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 포함한다. 모든 델타G를 계산하였고 아미노산을 델타G로 순위 매겼다. 각각의 구조에 대하여, 추가의 분석을 위해 상위 10개의 쌍을 선택하였다. 분석은 다른 상호작용에 관계없이 소수성 상호작용에 초점을 맞췄다. 그 다음에 상위 5개의 쌍을 선두 후보물질로 선택하였다.

CH1의 서열 기록

Cκ의 서열 기록

1cz8,4nyl,1l7i 및 1F8의 상위 자유 에너지 잔기의 요약 표

볼드체: 고유한 잔기

밑줄: 낮은 상동성 잔기

표시 없음: 보존된 잔기

가장 큰 안정화 효과를 가진 잔기

C _K 및 CH1 상호작용에 대한 다섯 개의 중요한 계면 잔기 (구조 및 유리 에너지에 기초함)

주: 염 다리 잔기는 제외된다

실시예 2: Cκ 및 CH1 상호작용에 대한 중요한 계면 잔기의 발견

Cκ 및 CH1의 계면 분석에 기초하여, 이 실시예는 Cκ 및 CH1 상호작용에 대한 상위 중요 계면 잔기를 요약하였다 (하기 도 2 및 표 4 참조).

Cκ/CH1 상호작용에 영향을 미치는 잔기 쌍

CH1			Cκ			쌍 번호
위치	잔기	위치		잔기
9	PHE	17		GLN	1
11	LEU	11, 26		PHE, VAL	2
24	ALA	9, 11		PHE	3
51	HIS	31		ASN	4
53	PHE	69		SER	5

주: 염 다리 잔기는 제외된다상기 표로부터, 알라닌 또는 트립토판 단일 돌연변이를 각각의 계면 잔기를 테스트하는데 사용하였다. VH 및 VL이 없는 IgG(-Fv)를 구성하였고 Ala 및 Trp 스크리닝을 위해 발현시켰다. 돌연변이 목록은 하기와 같이 나열된다.

알라닌 스크리닝

트립토판 스크리닝

도 3의 SDS-PAGE 이미지에서 나타난 바와 같이, 쌍 2 (Cκ_F11_V26 및 CH1_L11)에 대해, 두 개의 돌연변이 Cκ_F11A/CH1 및 Cκ_V26A/CH1은 Cκ 및 CH1의 상호작용을 크게 방해하였고; 두 개의 돌연변이 Cκ_V26W/CH1 및 Cκ /CH1_L11W 또한 상호작용(FIG4)을 방해하였다. 돌연변이 Cκ/CH1_L11A 및 Cκ/CH1_F9A (쌍 1) 또한 상호작용을 방해하였다. 그에 반해, 돌연변이 Cκ_F9A/CH1, Cκ/CH1_A24F 및 Cκ/CH1_A24L은 Cκ 및 CH1의 상호작용에 영향을 미치지 않았다. 이것은 쌍 3 (Cκ_F9 및 CH1_A24)이 Cκ 및 CH1의 결합에 중요하지 않다는 것을 시사한다.

실시예 3: Discovery Studio에 의한 쌍 1에 대한 돌연변이 쌍 개발

Cκ와 CH1 사이의 상호작용을 유지하는데 중요한 잔기 쌍의 확인시, 이 실시예는 새로운 상호작용을 확립하는 돌연변이 쌍을 테스트하였다. 이 개발의 근거는 다음과 같다: 돌연변이 Cκ는 돌연변이 CH1로의 양호한 결합을 나타낼 수 있지만; 돌연변이 Cκ는 야생형 CH1에 결합하지 않거나 또는 약하게 결합하고 돌연변이 CH1은 야생형 Cκ에 약하게 결합하거나 또는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.

쌍 1에 대한 돌연변이 개발

쌍 1에 대한 잔기는 Cκ_Q17 및 CH1_F9이다 (표 4). Cκ/CH1_033의, 050으로의 이들 돌연변이를 디자인하고 발명자가 분석하였다. Cκ/CH1_051-066 돌연변이 쌍을 소프트웨어 프로그램, Discovery Studio (DS)로 개발하여 이 부위에 대한 무작위 돌연변이를 디자인하였다. 그것은 하기 나열된 바와 같이 Cκ_Q17 및 CH1_F9에 대하여 여덟 개의 쌍을 생성하였다.

주: 돌연변이 에너지: 돌연변이 이후 에너지 차이; 낮은 값이 더 안정함을 의미한다; VDW: Van der Waals

두 개의 양호한 돌연변이 쌍이 하기 나열된다:

실시예 4: Discovery Studio에 의한 쌍 2에 대한 돌연변이 쌍 개발

쌍 2에 대하여, 알라닌/트립토판 단일 돌연변이를 각각의 계면 잔기에 대하여 테스트하였다. VH 및 VL이 없는 IgG(-Fv)를 구성하였고 Ala 및 Trp 스크리닝을 위해 발현시켰다. 이 실시예는 이 부위에 대한 무작위 돌연변이를 디자인하기 위해 Discovery Studio를 사용하였다.

세 개의 양호한 돌연변이 쌍은 Cκ/CH1_072, Cκ/CH1_079 및 Cκ/CH1_107이며 하기 나열되어 있다:

쌍 2에 대한 돌연변이 개발

쌍 2에 대한 중요한 잔기는 Cκ_F11_V26 및 CH1_L11_L28이다 (표 4 참조 4). 이 핫 스팟에 대한 돌연변이 개발 전략은 돌연변이 V26W 또는 L11W를 고정하는 것이다. 이 실시예는 또한 Cκ_F11_V26 및 CH1_L11_L28에 대하여 포화된 점 돌연변이의 도입을 테스트한 다음; DS를 적용하여 모든 강력한 돌연변이를 계산하였다.

전략 I: 고정된 돌연변이 V26W를 이용하여, 무작위 점 돌연변이를 CH1_L11_L28에 도입한 다음; DS 소프트웨어를 사용하여 이 부위에 대하여 몇몇 돌연변이 쌍을 생성하였다. 몇몇 바람직한 돌연변이 쌍이 하기 나열된다.

전략 2: 고정된 돌연변이 L11W를 이용하여, 무작위 점 돌연변이를 Cκ_F11_V26에 도입한 다음; DS 소프트웨어를 사용하여 이 부위에 대하여 몇몇 돌연변이 쌍을 생성하였다. 몇몇 바람직한 돌연변이 쌍이 하기 나열된다.

전략 3: Cκ_F11_V26 및 CH1_L11_L28에 대하여 포화된 점 돌연변이를 도입한 다음; DS 소프트웨어를 사용하여 모든 강력한 돌연변이를 계산하였다. 그것은 하기 나열된 23개의 바람직한 돌연변이 쌍을 생성하였다.

상기 돌연변이 쌍에 기초하여, 쌍 1에 대해서는, 모든 돌연변이 쌍을 SDS-PAGE (환원성 및 비-환원성, 도 4A-D)로 분석하였고; 쌍 2에 대해서는, 가장 낮은 자유 에너지를 가진 일부 강력한 돌연변이 쌍을 분석을 위해 선택하였다. 모든 돌연변이 쌍 중에서, 세 개의 돌연변이 쌍 Cκ/CH1_107이 더 강력하다. 결과는 공개된 돌연변이 쌍과 비슷할 수 있다. VH 및 VL이 없는 IgG(-Fv)를 구성하였고 각각의 돌연변이 쌍에 대하여 발현시켰다. 돌연변이 목록은 하기 나열된다.

도 5A-5B의 SDS-PAGE 겔 사진에서 나타난 바와 같이, 돌연변이 쌍 Cκ_V26W/CH1_L11W는 Cκ와 CH1 사이의 결합을 재확립하였다 (Cκ_L28Y_S69W/CH1_H51A_F53G를 대조군으로 사용하였다).

실시예 5: Discovery Studio에 의한 돌연변이 쌍 Cκ_V26W/CH1_L11W 개선

전략 4: 고정된 돌연변이 Cκ_V26W 및 CH1_L11W를 이용하여, Cκ_F11 및 CH1_L28에 대하여 포화된 점 돌연변이를 도입한 다음; DS를 사용하여 모든 강력한 돌연변이를 계산하였다. 그것은 하기 나열된 23개의 바람직한 돌연변이 쌍을 생성하였다.

실시예 6: 돌연변이 쌍 개발

쌍 2에 대하여, 알라닌/트립토판 단일 돌연변이를 각각의 계면 잔기에 대하여 테스트하였다. VH 및 VL이 없는 IgG(-Fv)를 구성하였고 Ala 및 Trp 스크리닝을 위해 발현시켰다. 돌연변이 목록은 하기 나열된다.

실시예 7: 염 다리의 변화

실시예 1에서 Ck 및 CH1에 대한 계면 상호작용 분석은 1F8, 1CZ8, 1L7I 및 4NYL의 CH1과 Ck 사이에서 공통 염 다리가 다음과 같다는 것을 보여주었다:

1F8 및 1CZ8에 하나 이상의 염 다리가 존재한다:

그러므로, 이 실시예는 두 개의 염 다리를 가진 1F8의 CH1 및 Ck에 초점을 맞췄고, WT 대응물에 돌연변이된 CH1 또는 Ck를 결합시키지 않고 새로운 염 다리를 가진 돌연변이된 CH 및 Ck 사이의 결합을 재구성하는 CH1 및 Ck 내의 새로운 염 다리 쌍을 디자인하기 위해 Discovery Studio를 이용하였다.

염 다리 CH1_LYS96 및 Ck_GLU16 상의 디자인. 하기 표에서 나타난 바와 같이, 두 개의 쌍은 새로운 염 다리를 가진 CH1^mut 및 Ck^mut를 안정화하는 것으로 나타났다.

CH1: LYS96>ASP 돌연변이 및 Ck: GLU16>ARG 돌연변이;

CH1: LYS96>GLU 돌연변이 및 Ck: GLU16>ARG 돌연변이;

새로운 Cκ_V26W 및 CH1_L11W와 시너지 효과를 발휘하여 WT 대응물에 돌연변이된 CH1 또는 Ck를 결합시키지 않고 돌연변이된 CH 및 Cκ 사이에서 결합을 재구성할 수 있는 새로운 염 다리를 발견하기 위해 Discovery Studio를 더 사용하였다. 하기 표에서 나타난 바와 같이, 세 개의 쌍이 Cκ_V26W 및 CH1_L11W와 시너지 효과를 발휘하여 CH1^mut 및 Ck^mut를 안정화시키는 것으로 나타났다.

CH1: LEU11>TRP; LYS96>GLU 돌연변이 및 Ck: GLU16>LYS; VAL26>TRP 돌연변이

CH1: LEU11>TRP; LYS96>GLU 돌연변이 및 Ck: GLU16>ARG; VAL26>TRP 돌연변이

CH1: LEU11>TRP; LYS101>GLU 돌연변이 및 Ck: ASP15>LYS; VAL26>TRP 돌연변이

CH1_K96/Cκ_E16에서의 돌연변이

돌연변이	돌연변이 에너지	효과	VDW	전자기	엔트로피	비-극성	이중 돌연변이
H:LEU11>TRP.H:LYS96>GLU. L:GLU16>LYS.L:VAL26>TRP	-1.06	안정화	-4.09	1.61	0.2	0	-0.34 3.39
H:LEU11>TRP.H:LYS96>GLU. L:GLU16>ARG.L:VAL26>TRP	-0.57	안정화	-1.6	1.94	-0.84	0	-0.34 2.03
H:LEU11>TRP.H:LYS96>GLU. L:GLU16>HIS.L:VAL26>TRP	-0.5	중화	-0.79	2.11	-1.32	0	-0.34 1.11

CH1_K101/ Cκ _D15에서의 돌연변이

돌연변이	돌연변이 에너지	효과	VDW	전자기	엔트로피	비-극성	이중 돌연변이
H:LEU11>TRP.H:LYS101>GLU L:ASP15>LYS.L:VAL26>TRP	-0.65	안정화	-2.28	2.18	-0.68	0	0.58 1.57
H:LEU11>TRP.H:LYS101>GLU. L:ASP15>HIS.L:VAL26>TRP	-0.06	중화	-1.66	2.08	-0.31	0	0.58 1.66
H:LEU11>TRP.H:LYS101>ASP. L:ASP15>LYS.L:VAL26>TRP	0.27	중화	1.33	1.91	-1.53	0	0.62 1.57
H:LEU11>TRP.H:LYS101>ASP. L:ASP15>ARG.L:VAL26>TRP	0.44	중화	1.46	1.96	-1.44	0	0.62 1

실시예 8: 변화된 염 다리의 테스트CH1-CH2-CH3 또는 Cκ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드를 구성하였다. 돌연변이를 하기 나열된 도메인 중 일부에 도입하였다.

단백질 발현을 위해 플라스미드를 293F 세포로 일과성으로 트랜스펙션하였다. 단백질을 단백질 A 컬럼 및 항-FLAG 친화도 겔로 정제하고, 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였다 (레인 당 5 μg). 단백질 A는 중쇄에만 결합하기 때문에, 경쇄의 밀도는 중쇄와 경쇄 사이에서의 결합 강도를 나타낸다.

제1 배치에서, 13개의 항체를 테스트하였다. 이들 항체 내에 포함되는 돌연변이는 표 7에 나열된다.

돌연변이된 테스트 항체

번호	단백질 명칭	CH1-CH2CH3	Cκ
1	Cκ/CH1_001	WT	WT
2	Cκ/CH1_200	WT	E16R
3	Cκ/CH1_201	K96D	WT
4	Cκ/CH1_202	K96E	WT
5	Cκ/CH1_203	K96D	E16R
6	Cκ/CH1_204	K96E	E16R
7	Cκ/CH1_107	L11W	V26W
8	Cκ/CH1_205	L11W; K96E	WT
9	Cκ/CH1_206	WT	E16K; V26W
10	Cκ/CH1_207	L11W; K96E	E16K; V26W
11	Cκ/CH1_208	L11W; K96D	WT
12	Cκ/CH1_209	WT	V26W; E16R
13	Cκ/CH1_210	L11W; K96D	V26W; E16R

결과는 도 6A에서 나타나있다. Cκ/CH1_001 (야생형) 및 Cκ/CH1_107에 대하여 양호한 결합을 관찰하였다 (CH1에서 L11W 및 Cκ에서 V26W). Cκ/CH1_203은 야생형 염 다리 (K96-E16)를 방해하는 양성에서 음성으로(positive-to-negative) 및 음성에서 양성으로(negative-to-positive)의 돌연변이 쌍을 포함한다. Cκ/CH1_210에서의 결합 (CH1에서 L11W와 K96D 및 Cκ에서 V26W와 E16R)은 K96D와 E16R 사이의 결합보다 훨씬 더 강력했다. 그에 반해, 각각의 돌연변이 사슬은 더 확실하게 야생형 대응물에 결합하지 못했다 (Cκ/CH1_208 및 Cκ/CH1_209 참조). Cκ/CH1_207에서의 돌연변이 사슬, L11W와 K96E를 가진 CH1, 및 E16K와 V26W를 가진 Cκ는 돌연변이 내에서 야생형 대응물보다 더 많은 결합을 나타냈다 (Cκ/CH1_205 및 Cκ/CH1_206 참조).

제2 배치에서, 일곱 개의 항체를 테스트하였다. 이들 항체 내에 포함되는 돌연변이는 표 8에서 나열된다.

돌연변이된 테스트 항체

	단백질 명칭	CH1-CH2CH3	Ck
1	Cκ/CH1_001	Wt	Wt
2	Cκ/CH1_211	Wt	E16K
3	Cκ/CH1_202	K96E	Wt
4	Cκ/CH1_212	K96E	E16K
5	Cκ/CH1_205	L11W, K96E	Wt
6	Cκ/CH1_209	Wt	E16R,V26W
7	Cκ/CH1_213	L11W, K96E	E16R,V26W

결과는 6B에 나타나 있다. Cκ/CH1_213에서의 돌연변이 사슬, L11W와 K96E를 가진 CH1, 및 E16R과 V26W를 가진 Cκ는 돌연변이 내에서 야생형 대웅물보다 더 많은 결합을 나타냈다 (Cκ/CH1_205 및 Cκ/CH1_206 참조). 제3 배치에서, 열다섯 개의 항체를 테스트하였다. 이들 항체 내에 포함되는 돌연변이는 표 9에서 나열된다.

돌연변이된 테스트 항체

번호	단백질 명칭	CH1-CH2CH3	Cκ
1	Cκ/CH1_001	WT	WT
2	Cκ/CH1_030	L11W	WT
3	Cκ/CH1_032	WT	V26W
4	Cκ/CH1_107	L11W	V26W
5	Cκ/CH1_201	K96D	WT
6	Cκ/CH1_214	WT	C16R, Q17A
7	Cκ/CH1_217	K96D	E16R, Q17A
8	Cκ/CH1_208	L11W, K96D	WT
9	Cκ/CH1_225	WT	E16R, Q17A, V26W
10	Cκ/CH1_226	L11W, K96D	E16R, Q17A, V26W
11	Cκ/CH1_221	WT	D15K, V26W
12	Cκ/CH1_222	WT	D15H, V26W
13	Cκ/CH1_220	L11W, K101E	WT
14	Cκ/CH1_223	L11W, K101E	D15K, V26W
15	Cκ/CH1_224	L11W, K101E	D15H, V26W

도 6C에서 나타난 바와 같이, Cκ/CH1_223 (K101E-D15K) 및 Cκ/CH1_224 (K101E-D15H)에서 재구축된 염 다리는 돌연변이된 중쇄와 경쇄 사이에서 강력한 상호작용을 일으키고, 그것들 각각은 개별적으로 Cκ/CH1_107 (CH1에서 L11W 및 Cκ에서 V26W)과 비교하여 더 확실하게 야생형 대응물에 결합할 수 없다. 돌연변이 사이의 강력한 결합은 또한, 도면에서 나타난 바와 같이, L11W와 V26W 사이의 소수성 상호작용을 기반으로 한다. 즉, 소수성 상호작용과 새로운 염 다리 간의 시너지 효과는 다중-특이적 항체의 디자인에 유용한 강력한 결합과 높은 특이성을 유발한다. 실시예 9: 이중-특이적 항체 구성

경쇄 미스매치에 대한 CH1/Ck 돌연변이의 효과를 더 평가하기 위해서, 발명자들은 CH3 도메인의 DE/EE 돌연변이를 사용함으로써 IgG 유사 헤테로다이머 이중-특이적 포맷을 사용하였다 (J. Biol. Chem. (2017) 292(35) 14706-14717). 발명자들은 PDL1/CD73 쌍을 사용하여 이중-특이적 항체를 구성하였다.

PDL1/CD73 쌍 디자인은 하기 표에 기술되어 있다:

도 8A에서 나타난 바와 같이, 모든 디자인된 쌍이 ELISA에 의해 결합하는 PDL1 부분에 영향을 주는 것은 아니지만, CD47의 결합 효능이 손상되었다. B5024 Cκ/CH1_207 돌연변이 (CH1:L11W/K96E; Cκ: E16K/V26W) 및 B5023 Cκ/CH1_210 돌연변이 (CH1:L11W/K96D; Cκ: E16R/V26W)는 ELISA에 의해 결합하는 CD73 부분 항원을 복원할 수 있다. 이에 더하여, PDL1 싱글링(singling) 분석 및 CD73 효소 활성 분석은 ELISA 결합과 유사한 패턴을 나타냈다 (도 8B). 이 점에 있어서, 모든 PDL1 부분은 유사한 PDL1 길항 활성을 나타냈고 단지 B5024 및 B5023만이 강력한 CD73 안타고니스트 활성을 나타냈다. 이 쌍에서, PDL1의 경쇄는 CD73 아암(arm)의 기능을 크게 손상시키는 한편, CD73 경쇄는 PDL1 아암에 대하여 거의 효과가 없다. Cκ/CH1_207 및 Cκ/CH1_210 돌연변이 둘 다는 CD73의 기능을 복원시킬 수 있고 P이 아암에 영향을 주지 않았으며, CH1/Ck 돌연변이가 경쇄 미스매치를 방지할 수 있다는 것을 시사한다.

* * *

본 개시물은 본 개시물의 개개의 양태의 단일 예시로서 의도되는 기술된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되어서는 안 되고, 기능적으로 동등한 임의의 조성물 또는 방법이 본 개시물의 범위 내에 포함된다. 본 개시물의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 본 개시물의 방법 및 조성물에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 본 개시물은 첨부된 청구범위 및 그 동등물의 범위 내에 있으면 본 개시물의 변형 및 변화를 커버하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 개개의 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타난 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

Claims

L11W 치환을 포함하는 인간 CH1 단편 및 V26W 치환을 포함하는 인간 Cκ 단편을 포함하는, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항에 있어서, CH1 단편은 치환 L11W 및 K101E를 포함하고 Cκ 단편은 치환 V26W 및 D15K/H를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항에 있어서, CH1 단편은 치환 L11W 및 K96D를 포함하고 Cκ 단편은 치환 V26W 및 E16R을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항에 있어서, CH1 단편은 치환 L11W 및 K96E를 포함하고 Cκ 단편은 치환 V26W 및 E16K를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항에 있어서, CH1 단편은 치환 L11W 및 K96E를 포함하고 Cκ 단편은 치환 V26W 및 E16R을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항에 있어서, L11W 치환을 포함하지 않는 제2 인간 CH1 단편 및 V26W 치환을 포함하지 않는 제2 인간 Cκ 단편을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제6 항에 있어서, 제2 인간 CH1 및 제2 인간 Cκ 단편은 야생형인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제8 항에 있어서, 분류 IgG인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제9 항에 있어서, 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
인간 Cκ 단편 쌍에 대한 인간 CH1 단편을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, CH1 및 Cκ 단편은
(a) CH1에서 L11K와 L28N, 및 Cκ에서 V26W;
(b) CH1에서 L11W, 및 Cκ에서 F11W와 V26G;
(c) CH1에서 F9D, 및 Cκ에서 Q17R 또는 Q17K; 및
이것들의 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함하는, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제10 항에 있어서, CH1 및 Cκ 단편은 (a) CH1에서 K101E 및 Cκ에서 D15K/H, (b) CH1에서 K96D 및 Cκ에서 E16R, (c) CH1에서 K96E 및 Cκ에서 E16K 및 (d) CH1에서 K96E 및 Cκ에서 E16R로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
위치 Leu11에서 아미노산 치환을 포함하는 인간 CH1 단편, 및 위치 V26 및/또는 F11에서 아미노산 치환을 포함하는 인간 Cκ 단편을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 치환된 아미노산은 CH1 단편이 Cκ 단편과 쌍을 형성할 때 서로 상호작용하는, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제13 항에 있어서, 인간 CH1 단편은 야생형 인간 Cκ 도메인과 상호작용하지 않고 인간 Cκ 도메인은 야생형 인간 CH1 단편과 상호작용하지 않는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제13 항에 있어서, 아미노산 치환은 표 1로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
위치 F9에서 아미노산 치환을 포함하는 인간 CH1 단편, 및 위치 Q17에서 아미노산 치환을 포함하는 인간 Cκ 단편을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 치환된 아미노산은 CH1 단편이 Cκ 단편과 쌍을 형성할 때 서로 상호작용하는, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제16 항에 있어서, CH1 단편은 야생형 인간 Cκ 단편과 상호작용하지 않고 Cκ 단편은 야생형 인간 CH1 단편과 상호작용하지 않는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제16 항에 있어서, 아미노산 치환은 표 2로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제10 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 CH1/Cκ 쌍 및 제2 CH1/Cκ 쌍을 포함하는 이중특이적 항체로서, 제1 쌍의 CH1 및 Cκ 단편은 CH1에서 아미노산 치환 L11W 및 Cκ에서 V26W를 포함하고, 제2 쌍의 CH1 및 Cκ 단편은 L11W 및 V26W 치환을 포함하지 않는, 이중특이적 항체.
제20 항에 있어서, 제1 쌍의 CH1 및 Cκ 단편은 (a) CH1에서 K101E 및 Cκ에서 D15K/H, (b) CH1에서 K96D 및 Cκ에서 E16R, 및 (c) CH1에서 K96E 및 Cκ에서 E16K로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 더 포함하고, 제2 쌍의 CH1 및 Cκ 단편은 (a)-(c)의 치환을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제1 항 내지 제21 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
제1 항 내지 제21 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 세포.