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KR20190059318A - Fzd10에 대한 모노클로널 항체 및 이의 사용 - Google Patents

Fzd10에 대한 모노클로널 항체 및 이의 사용 Download PDF

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KR20190059318A
KR20190059318A KR1020197012936A KR20197012936A KR20190059318A KR 20190059318 A KR20190059318 A KR 20190059318A KR 1020197012936 A KR1020197012936 A KR 1020197012936A KR 20197012936 A KR20197012936 A KR 20197012936A KR 20190059318 A KR20190059318 A KR 20190059318A
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fzd10
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요스케 하라다
타츠키 요코세키
유스케 나카무라
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온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, FZD10에 대한 모노클로널 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 해당 항체를 이용하여 FZD10 관련 질환을 진단하는 방법, FZD10 단백질을 검출하는 방법, FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효를 판정하는 방법, FZD10 저해제에 의한 치료 효과의 높은 대상을 스크리닝하는 방법, 및 해당 항체를 포함하는 진단 시약을 제공한다.

Description

FZD10에 대한 모노클로널 항체 및 이의 사용
본 발명은 FZD10 대한 모노클로널 항체, 해당 항체를 이용하여 FZD10 관련 질환을 진단하는 방법, FZD10 단백질을 검출하는 방법, FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효를 판정하는 방법, FZD10 저해제에 의한 치료 효과의 높은 대상을 스크리닝하는 방법, 해당 항체를 포함하는 진단 시약에 관한 것이다.
Frizzled 단백질은 Wnt 단백질 리간드에 대한 결합 부위를 가지는 G 단백질 결합 수용체의 패밀리이다. 유전자 분석으로부터, 지금까지 18 종의 Wnt 유전자 및 10 종의 Frizzled 유전자(FZD1 ~ FZD10)가 동정되어 있으며, 이들은 모두 구조적으로 고도로 유사한 것으로 밝혀졌다.
Frizzled 단백질은 7회 막관통형 단백질이며, N 말단에 세포 외 시스테인 리치 도메인이있다. 이 시스테인 리치 도메인이 Wnt 리간드의 결합 부위이다. Wnt 리간드와 Frizzled 수용체와의 결합은 반드시 일대일이 아닌, 일종의 Wnt 리간드가 여러 종의 Frizzled 수용체와, 일종의 Frizzled 수용체에 여러 종의 Wnt 리간드가 결합하는 것이 확인되고 있다.
Wnt 리간드와 Frizzled 수용체와의 결합에 의해 Wnt 시그널 전달 경로가 활성화되는 것으로 알려져 있다. Wnt 시그널 전달 경로에는 β-카테닌 경로를 활성화시키는 것과, β-카테닌을 개의치 않는 경로가 몇 가지 존재하고, Wnt 리간드와 Frizzled 수용체의 조합에 따라 다른 경로를 활성화하는 것으로 간주되고 있다.
수용체 결합에 의해 활성화된 Wnt/β-카테닌 시그널 전달 경로는, Frizzled 수용체와 직접 상호 작용하는 세포질 단백질인 Dishevelled(Dsh)에 의해 중재되어, β-카테닌의 세포질에서의 안정화 및 축적을 초래한다. Wnt 시그널이 존재하지 않을 경우, β-카테닌은 종양 억제 단백질인 대장 선종 용종증(APC) 및 옥신을 포함하는 세포질의 분해 복합체에 국재한다. 이러한 단백질은 글리코겐 합성 효소 키나아제(GSK)-3β가 β-카테닌에 결합하여 인산화하고, 이를 유비퀴틴/프로테아좀 경로를 통해 분해용으로 지정하기위한 중요한 발판으로서 기능한다(특허 문헌 1). β-카테닌 비의존 경로는 다수의 프로세스에 관계하고있는 것으로 나타나고 있으나, 세포 골격계의 제어에 관여하는 세포 내 평면 극성(PCP), 세포의 운동 및 접착에 관여하고 있는 Wnt/Ca2+ 경로, 단백질 키나제 A를 통해 근신생의 제어에 관여하는 경로 등이 존재한다. Frizzled 수용체는 2량체화할 수 있으며, 이 2량체화는 Wnt 시그널 경로의 활성화에 관여하고 있다는 보고가 있다(비특허 문헌 1).
FZD10(참조 배열: Genbank 등록 번호 NM_007197.3(SEQ ID NO : 21)) mRNA는, 경부, 소화관 및 교아종의 세포 계통을 포함하는 수 많은 암 세포 계통에서, 및 약 40%의 원발성 위암, 원발성 대장암 및 대부분의 활막 육종 조직에서 상향 조절되어 있다는 보고가 있다(특허 문헌 1 ~ 2, 비특허 문헌 2 ~ 3). FZD10 단백질의 과발현에 관련하는 질환으로서, 활막 육종, 결장직장암(대장암), 위암, 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병(AML) 등을 들 수 있다(특허 문헌 3 ~ 5). 따라서, FZD10 항암제의 적절한 표적인 것으로 간주되고, FZD10에 특이적인 siRNA에 의해 활막 육종 세포의 증식이 억제되는 것과, FZD10 대한 항체가 활막 육종 마우스 이식 모델에서 항종양 활성을 가지는 것으로 나타내고 있다(특허 문헌 3, 4). 또한, FZD10 대한 모노클로널 항체는, 치료의 진단 약으로서 도움이 될 것이 예측될 수있다. 유방암, 악성 림프종 및 결장암에 대한 트라스트주맙(Trastuzumab)의 진단약, 리툭시맙(Rituximab)의 진단 시약 및 베바시주맙(Bevacizumab)의 진단약과 같은 모노클로널 항체의 임상적 적용의 성공예 외에, 다른 분자 표적에 대한 몇 가지 모노클로널 항체가 개발 중이며, 이러한 진단 효과를 평가 중이다. 이러한 진단약은, 치료약에 있어서 효과적인 환자의 선택이라는 관점에서 보다 효과적인 치료법으로 이어지게 될 것으로 기대된다.
WO 2007/053577 WO 2004/020668 WO 2005/004912 WO 2006/013733 WO 2007/148417
Charles E Dann et al., Nature(2001) 412 : 86-90 H.Terasaki et al., Int.J.Mol.Med(2002) 9,107-112 S.Nagayama et al., Oncogene(2005) 24,6201-6212
분자 표적 치료약을 이용한 종양 치료의 진단약은, 표적 종양의 대부분에 과잉 발현이 인정되고, 또한 정상 조직에서는 발현되지 않거나, 최소한 밖에 발현되지 않는 세포 단백질을 검출하는 것이 중요하다. 그러나, 종양에 발현되는 단백질을 특이적으로 고감도로 검출하는 것은 곤란하며, 이러한 단백질에 대한 항체를 얻는 것도 곤란하다. 예를 들면, 항암제의 표적으로 간주되고 있는 FZD10 대해서는, 몇 가지 항체가 시판되고 있다. 그러나, 본 발명자들이 입수한 시판의 항체에 의해 FZD10 발현 세포의 염색을 시도하자, FZD10의 발현 수준이 낮은 세포에서도 양성 시그널(위양성)을 발생하는 것이 있었다. 이러한 면역학적 특이성이 미흡한 항체에는, 항체 반응 강도를 지표로서 FZD10의 발현 수준의 차이를 명확하게 검출할 수 없는 우려가 있다. 따라서, 본 발명의 과제는 FZD10에 특이적이고 고감도로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.
그래서 본 발명자들은, FZD10 항원을 마우스에 면역하여 얻어진 모노클로널 항체 중에서 FZD10에 특이적으로 결합하는 항체를 탐색한 결과, 특정의 항체가 재조합 인간 FZD10 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 세포나 조직에 발현하는 FZD10 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 클론을 동정하는 데 성공하였다.
구체적으로, 본 발명은 이하에 관한 것이다:
[1] SEQ ID NO : 1로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR1;
SEQ ID NO : 2로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR2; 및
SEQ ID NO : 3으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR3
를 포함하는 중쇄 가변 영역 및
SEQ ID NO : 4로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR1;
SEQ ID NO : 5로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR2; 및
SEQ ID NO : 6으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR3
를 포함하는 경쇄 가변 영역
의 어느 하나 또는 모두를 포함하는, FZD10 단백질 또는 이의 부분 펩티드에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
[2] SEQ ID NO : 7로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO : 8로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 경쇄 가변 영역의 어느 하나 또는 모두를 포함하는, [1]에 기재의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
[3] SEQ ID NO : 9로 표시되는 아미노산 배열로부터 이루어진 폴리펩티드를 특이 적으로 인식하는, [1] 또는 [2]에 기재의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
[4] FZD10에의 특이적인 결합에 대해, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 항체와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
[5] 친화성 표지, 효소 표지, 방사성 동위 원소 표지 또는 형광 표지와 결합하고 있는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
[7] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 포함하며, FZD10 관련 질환을 진단, FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효를 판정, 또는 FZD10 저해제에 의한 치료 효과의 높은 대상을 스크리닝하기 위한 시약.
[8] 이하의 단계를 포함하는, 대상에 있어서의 FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인을 진단하는 방법:
(a) 해당 대상으로부터 단리한 시료를 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계;
(b) 해당 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 단계; 및
(c) 해당 시료 중의 FZD10 단백질 수준을 대조로 비교하는 단계로서, 대조와 비교하여 FZD10 단백질 수준이 높은 경우에 해당 대상이 해당 질환을 앓고 있거나 또는 이의 발병 위험을 가지는 것을 나타내는 단계.
[9] 상기 FZD10 관련 질환이 FZD10를 발현하고 있는 암인, [7]에 기재된 시약 또는 [8]에 기재된 방법.
[10] 상기 암은 활막 육종, 폐암, 식도암, 결장직장암(대장암), 위암, 만성 골수성 백혈병(CML)과 급성 골수성 백혈병(AML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, [7]에 기대된 시약 또는 [8]에 기재된 방법.
[11] 이하의 단계를 포함하는, 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 방법:
(a) 대상으로부터 단리한 시료를 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계; 및
(b) 해당 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 단계.
[12] 이하의 단계를 포함하는, 대상에 있어서의 FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효를 판정하는 방법:
(a) 해당 대상으로부터 단리한 시료를 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계;
(b) 해당 항체 또는 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 단계;
(c) 해당 시료 중의 FZD10 단백질 수준을 약제 투여 전의 발현 수준과 비교하는 단계로서, 약제 투여 전과 비교하여 FZD10 단백질 수준이 낮은 경우에 해당 대상에 있어서의 약효가 있었던 것으로 나타내는 단계.
[13] 이하의 단계를 포함하는, FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상을 스크리닝하는 방법:
(a) 해당 대상으로부터 단리한 시료를 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계;
(b) 해당 항체 또는 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 단계;
(c) 해당 시료 중의 FZD10 단백질 수준을 대조로 비교하는 단계로서, 대조와 비교하여 FZD10 단백질 수준이 비슷하거나 그보다 높은 경우, 해당 대상에 있어서의 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 것으로 나타내는 단계.
[14] 상기 시료가 상기 대상으로부터 단리한 세포 또는 조직인, [8] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[15] 이하의 공정을 포함하는, FZD10 단백질 또는 이의 부분 펩티드에 결합할 수있는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 제조하는 방법:
(a) [6] 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 해당 세포의 배양물 또는 배양 배지로부터 상기 항체를 회수하는 단계.
본 발명은 또한 이하에 관한 것이다:
[16] 이하의 단계를 포함하는, FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인의 진단 마커를 검출하는 방법:
(a) 해당 대상으로부터 단리한 시료를 [1] ~ [5]의 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계; 및
(b) 해당 항체 또는 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 해당 마커로서 검출하는 단계.
[17] FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인의 진단에 사용하기 위해, [1] ~ [5]의 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
[18] FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인을 진단하는 시약의 제조에 있어서, [1] ~ [5]의 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편의 사용.
[19] 이하의 단계를 포함하는 FZD10 저해제의 약효 마커를 검출하는 방법:
(a) 해당 대상으로부터 단리한 시료를 [1] ~ [5]의 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계; 및
(b) 해당 항체 또는 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 해당 마커로서 검출하는 단계.
[20] FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효 판정에 있어서 사용하기 위한, [1] ~ [5]의 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
[21] FZD10 저해제 치료 후 약효를 판정하기위한 시약의 제조에있어서, [1] ~ [5]의 어느 하나에 기재된 항체 또는 항원 결합성 단편의 사용.
[22] 이하의 단계를 포함하는 FZD10 저해제 치료 응답성 마커를 검출하는 방법:
(a) 해당 대상으로부터 단리한 시료를 [1] ~ [5]의 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계; 및
(b) 해당 항체 또는 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 감지하여 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 해당 마커로서 검출하는 단계.
[23] FZD10 저해제에 의해 치료 효과가 높은 대상의 스크리닝에 사용하기 위한, [1] ~ [5]의 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
[24] FZD10 저해제에 의해 치료 효과가 높은 대상을 스크리닝하기 위한 시약의 제조에 있어서, [1] ~ [5]의 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편의 사용.
상기에 더하여, 본 발명의 다른 목적 및 특징은, 첨부된 도표 및 실시예와 함께 이하의 상세한 설명을 읽음으로써 보다 충분히 밝혀진다. 그러나, 전술한 발명의 개요 및 이하의 상세한 설명은 모두 예시적인 양태로서, 본 발명 또는 본 발명의 다른 대안적인 양태를 한정하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 특히, 본 발명을 몇 가지의 특정의 양태를 참조하여 본 명세서에서 설명하지만, 그 설명은 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 구성되어 있지 않은 것이 이해될 것이다. 첨부의 특허 청구 범위에 의해 기재된 본 발명의 정신과 범위에서 벗어나지 않고, 당업자는 다양한 변경 및 적용에 상도할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 다른 목적, 특징, 이익 및 장점은, 본 개요 및 이하에 기재하는 특정의 양태로부터 드러나게 되어 당업자에게 용이하게 명백하게 될 것이다. 그런 목적, 특징, 이익 및 장점은 첨부의 실시예, 데이터, 도표 및 그들로부터 도출되는 모든 타당한 추론과 함께 상기에서, 단독으로, 또는 본 명세서에 포함되는 참고 문헌을 고려하여, 명백해질 것이다.
도 1은, 각 암종별의 세포주를 이용한 mRNA의 발현 분석 데이터 베이스인 Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)의 FZD10 mRNA의 각 암종 세포주에서 발현을 나타내는 도이다.
도 2는, FZD10 강제 발현 세포주를 이용한 면역 조직 화학 염색에서 안티 FZD10 항체 10A8H4G4)의 특이성을 나타내는 현미경 사진이다. 항 FZD10 항체(10A8H4G4)에 의한 면역 조직 화학 염색의 결과, FZD10 강제 발현 세포주(FZD10/DLD1)로부터 제작된 파라핀 절편에서 특이적인 염색이 관찰되었으나, 음성 대조로서 Empty Vector를 도입시킨 세포주(Mock/DLD1)는, 염색되지 않았다. 한편으로 시판 항체(FZD10(L164) Ab, FZD10PolyclonalAb)는, 면역 조직 화학 염색 결과, FZD10/DLD1 및 Mock/DLD1 어느 것에서도 염색이 관찰되었다. 시판 항체와 비교하여 항 FZD10 항체(10A8H4G4)의 특이성이 밝혀졌다. 또한, 사진의 아래의 그래프는 면역 조직 화학 염색 결과로부터 강제 발현 세포 수에서 차지하는 FZD10 양성 세포의 비율(%)을 산출하여 나타낸 것이다.
도 3은, FZD10의 발현량이 다른 여러 세포주를 이용한 유동 세포 계측법(flow cytometry)과 면역 조직 화학 염색에 있어서 발현의 상관 관계를 나타낸다. A : 각 세포주의 세포막 상의 FZD10의 발현을 검출한, 10A8H4G4를 이용한 유동 세포 계측법의 결과를 나타내는 히스토그램이다. SYO-1, T.T, H727은 FZD10 발현 세포주이며, LoVo는 FZD10 비발현 세포주이었다. B : 각 세포주에서 제작된 파라핀 절편을 이용한 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 또한, 사진의 아래의 그래프는 면역 조직 화학 염색의 결과로부터 각 세포주에서 차지하는 FZD10 양성 세포의 비율(%)을 산출하여 그래프로 나타낸 것이다. SYO-1, T.T, H727 등의 FZD10 발현 세포주에서는 염색이 인정되었으나, LoVo(비발현 세포주)에서는 염색되지 않았다. 세포주를 이용한 분석을 통해 항 FZD10 항체(10A8H4G4)의 면역 조직 화학 염색법의 특이성이 밝혀졌다.
도 4는 SYO-1, COLO201 세포주 마우스 Xenograft 종양으로부터 제작된 파라핀 절편 및 폐암 임상 검체 1 ~ 6을 이용한 면역 조직 화학 염색과 RealTime-PCR의 발현의 상관 관계를 나타낸다. A : 본 발명의 항 FZD10 항체(10A8H4G4)를 이용한 면역 조직 화학 염색을 통해 SYO-1 및 검체 5에서 FZD10 양성 소견이 관찰되었다. 한편으로 저발현 검체에서는 거의 염색되지 않았다. B : A의 면역 조직 화학 염색 결과에서 종양 세포에서 차지하는 FZD10 양성 세포의 비율을 산출하여 그래프로 나타내었다. C : 동일한 증례의 RealTime-PCR에 의한 발현 해석에 의해 면역 조직 화학 염색과 상관하는 결과가 얻어졌다. 임상 검체를 이용한 분석을 통해, 본 발명의 항 FZD10 항체(10A8H4G4)의 면역 조직 화학 염색법의 높은 특이성이 밝혀졌다.
본 발명의 양태를 실시 또는 시험함에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법 및 재료와 유사의 또는 동일한 임의의 방법 및 재료를 사용할 수 있으나, 바람직한 방법, 장치 및 재료를 여기에 기재한다. 그러나, 본 발명의 재료 및 방법에 대해 설명하기 전에, 본 명세서에 기재된 특정의 크기, 형상, 치수, 재료, 방법론, 프로토콜 등은 관례적인 실험 방법 및 최적화에 따라 변경 가능 때문에 본 발명은 이에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 기재에 사용하는 전문 용어는 특정 형태 또는 방식만을 설명하는 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허 청구 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 의도하지 않은 것도, 또한 이해되어야한다.
본 발명은, FZD10 단백질 또는 이의 부분 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는, 항 FZD10 모노클로널 항체를 제공한다. 본 발명은, 본 발명의 항 FZD10 모노클로널 항체가, 면역 조직 화학 염색법의 FZD10 단백질의 검출에 대해 높은 특이성과 증거를 제공한다.
본 발명의 항 FZD10 항체(10A8H4G4)는, 적어도 가변 영역에 하기 아미노산 배열을 가진다.
10A8H4G4, 중쇄 가변 영역 아미노산 배열(시그널 배열을 제외) :
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO : 7)
10A8H4G4, 경쇄 가변 영역 아미노산 배열(시그널 배열을 제외) :
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO : 8)
본 발명의 항체는, 상기 아미노산 배열을 코딩하는 DNA를 가진 재조합 기술에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 항체는, 마우스의 면역 감작에 의해 얻어진 복수의 항체 생산 하이브리도마(hybridoma)로부터, ELISA 법에 의해, FZD10와 결합성을 가지는 항체를 스크리닝하고 선택함으로써 실시하였다. ELISA 법으로 선택된 항체에 대해 더욱 면역 염색법에 의한 선발을 실시하였다. 강제 발현 세포(양성 컨트롤 세포)에서 양성, 음성 컨트롤 세포에서 음성을 제시하는 항체를 선택하고, 선택된 항체에 대해 더욱 내인성 FZD10 발현 세포(양성 컨트롤 세포)에서 양성, 음성 컨트롤 세포에서 음성을 제시하는 항체를 선발하였다. FZD10과의 상호 작용이 그다지 강하지 않은 경우에는, 약한 결합력을 가진 항체가 백그라운드로서 따라다닌다. 따라서, 내인성 FZD10 발현량이 미리 측정된 세포주를 이용하여 면역 염색을 실시하고 스크리닝함으로써 목적하는 FZD10과 강한 결합성을 가지는 항체를 선택할 수 있었다.
본 발명의 항체는, FZD10에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 항체는 FZD10 또는 FZD10를 발현하는 세포 또는 조직을 검출하기 위한 도구로서 유용하다. 또한, 본 발명의 항체는, 해당 항체를 검출할 수 있는 표지와 결합한 표지체로서 이용할 수 있으며, 해당 표지체는, 예를 들면, 대장암 등의 FZD10을 발현하는 암세포 또는 암 조직을 검출하는데 보다 바람직하다. 본 발명의 항체에 결합하는 표지로서는, FZD10에 결합한 항체를 검출할 수 있는 표지이면 되고, 친화성 표지(예를 들면, 비오틴, 아비딘 등), 효소 표지(예를 들면, 겨자무과산화효소(Horse Radish Peroxidase), 알칼리 포스파타제 등), 형광 표지(예를 들면, FITC, 로다민 등) 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체를 암 치료 환자의 선택에 진단약으로 사용하는 경우, 본 발명의 항체는 그대로 사용할 수도 있으나, 다양한 사용 형태에 적합한 조성물로 할 수 있다.
I. 정의
본 명세서에서 사용되는 「하나의(a)」, 「하나의(an)」와 「이의(the)」라는 단어는, 다른 특기하지 않는 한 「하나의」를 의미한다.
물질(예를 들면, 펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드 등)에 관련하여 사용하는 「단리된」 및 「정제된」이라는 용어는, 해당 물질이 그렇지 않으면, 천연원 중에 포함될 수 있는 적어도 1 종의 물질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 나타낸다. 따라서, 단리 또는 정제된 항체는, 이의 항체가 유래하는 세포 또는 조직원으로부터의 다른 세포 재료, 예를 들면, 당질, 지질 및 다른 혼입 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 항체를 말한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는 단리 또는 정제되어 있다.
「폴리펩티드」 및 「단백질」이라는 용어는, 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 폴리머를 말한다. 본 용어는, 천연형 아미노산 중합체 외에, 1개 또는 복수개의 비천연형 아미노산 잔기를 포함하는 비천연형 아미노산 폴리머에도 적용된다. 비천연형 아미노산에는, 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체 등이 포함된다.
「폴리뉴클레오티드」, 「올리고뉴클레오티드」 및 「핵산」이라는 용어는, 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 뉴클레오티드의 중합체를 말한다.
특기하지 않는, 「FZD10 관련 질환」이라는 용어는 FZD10를 발현하는 암이다.
특기하지 않는, 「암」이라는 용어는, FZD10를 발현하는 암, 바람직하게는 FZD10 유전자를 과잉 발현하는 암을 말하며, 이의 예로는 활막 육종, 폐암, 식도암, 결장직장암(대장암), 위암, 만성 골수성 백혈병(CML)과 급성 골수성 백혈병(AML) 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 각 암종별 세포주를 이용한 mRNA의 발현 분석 데이터 베이스 Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE) 등에 따라, FZD10을 발현하는 암세포를 알 수 있다. 본원에서도 폐암, 식도암, 결장직장암(대장암)에 현저한 상향 제어가 확인되었다(도 1).
본 명세서에서 사용되는 「항체」라는 용어는, 지정된 단백질 또는 펩티드에 대한 특이적 반응성을 가지는 면역 글로불린 및 그 단편을 포함하는 것이 의도된다. 항체는, 다른 단백질 또는 표지와 융합된 항체 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 항체는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는, 소망의 생물학적 활성을 나타내는 한, 인텍트(intact)한 모노클로널 항체, 폴리클로널 항체, 적어도 두 개의 인텍트한 모 항체로부터 형성된다 다중 특이성 항체(예를 들면, 이중 특이성 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 「항체」로는 모든 클래스(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)를 가리킨다.
「항체 단편」은 인텍트한 항체의 일부분이며, 인텍트한 항체의 하나 이상의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 일반적으로 포함한다. 따라서, 본 발명에서 항체 단편은 인텍트한 항체의 하나 또는 복수의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 항체의 「항원 결합 부분」또는 「항원 결합성 단편」이라는 용어는, 항원(예를 들면, FZD10)에 특이적으로 결합 할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 면역학적으로 활성의 단편을 가리킨다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것이 나타나고 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 직쇄형 항체, 및 단일 가닥 항체 분자가 포함된다. 구조에 관계없이, 항체 단편은, 인텍트한 항체에 의해 인식되는 항원과 같은 항원에 결합한다. 「항체 단편」이라는 용어는, 또한 특이적 항원에 결합하는 합성 폴리펩티드 또는 유전자 조작 폴리펩티드, 예를 들면 경쇄 가변 영역으로부터 이루어진 폴리펩티드, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터 이루어진 「Fv」단편, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 가닥 폴리펩티드 분자(「scFv 단백질」), 및 초가변 영역을 모방 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위도 포함한다.
특기하지 않는 한, 본 명세서에서 사용하는 기술 용어 및 과학 용어는 모두, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 용어와 같은 의미를 가진다.
본 발명에서, FZD10 단백질과 항체의 특이적인 결합은, 예를 들면, 항체 간의 경합에 의해 평가할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 항체로서, 예를 들면, SEQ ID NO : 7의 아미노산 배열로부터 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO : 8의 아미노산 배열로부터 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 참조 항체로서, 후보 항체의 특이성을 평가할 수 있다. 대표적인 참조 항체는, 10A8H4G4이다. 참조 항체와 인간 FZD10 단백질 사이의 항원 항체 반응에 대해, 후보 항체가 경합 한 경우에, 후보 항체가 참조 항체와 동일한 특이성을 가지는 것을 확인할 수 있다. 예를 들면, 후보 항체 부존재화로 FZD10 단백질에 결합하는 항체의 양이, 후보 항체의 공존 하에서 참조 항체와 FZD10 단백질을 반응시킨 때에, 10%, 20%, 30% 또는 40%, 보다 바람직하게는 50% 또는 그 이상의 참조 항체의 결합이 저해된 경우에, 항체 간의 경합이 발생하였다고 판정할 수 있다. 항체 간의 경합의 평가에는, FZD10 단백질 뿐만 아니라 참조 항체가 결합하는 한, 이의 부분 펩티드를 이용할 수도 있다. 바람직한 부분 펩티드는, FZD10 단백질의 N 말단 세포 외 도메인 펩티드이며, 예를 들면 SEQ ID NO : 9의 아미노산 배열을 포함하는 부분 펩티드이다.
II. 항체의 생산
본 발명에는, 항 FZD10 모노클로널 항체를 사용한다. 해당 항체는 해당 기술 분야에서 주지의 방법에 의해 제공된다.
본 발명에 의해 이용되는 예시적인 항체 생산 기술에 대해 이하에 기재한다.
(i) 모노클로널 항체
모노클로널 항체는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어진다. 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는, 약간의 양으로 존재할 수 있는 가능성의 천연의 변이를 제외하고 동일하다. 이와 같이, 「모노클로널」라는 수식어는, 별도의 항체와의 혼합물이 아니라는 항체의 특징을 나타낸다.
예를 들면 모노클로널 항체는, Kohler et al., Nature, 256 : 495(1975)에 의해 최초로 기재된 하이브리도마법을 사용하여 생산할 수 있는 또는 재조합 DNA 법(US4,816,567 호)에 의해서도 생산할 수 있다.
하이브리도마법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들면 햄스터 등을 FZD10 폴리펩티드(FZD10 단백질 또는 이의 부분 폴리펩티드)에 면역하여, FZD10 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발한다. 또는, 림프구를 시험관 내(in vitro)에서 FZD10 폴리펩티드로 면역하여도 좋다. 그 후, 폴리에틸렌 글리콜 등의 적절한 융합제를 이용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성시킨다(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986)).
조제한 하이브리도마 세포를, 융합하지 않는 친골수종 세포의 증식 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직한 적절한 배양 배지 중에 파종하여, 그 배지에서 증식시킨다. 예를 들면, 친골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실기 전이 효소(Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase, HGPRT 또는 HPRT)가 결손되어 있는 경우, 하이브리도마의 배양 배지에는 전형적으로, 하이포크산틴, 아미노 프테린 및 티미딘을 포함할 수 있으며(HAT 배지), 이러한 물질에 의해 HGPRT 결손 세포의 증식을 방해한다.
바람직한 골수종 세포로는, 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의해 안정된 높은 수준의 항체 생산을 보조하고, 또한 HAT 배지 등의 배지에 감수성을 가지는 것이다. 바람직한 골수종 세포주는, 마우스 골수종주, 예를 들면 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA에서 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래하는 것, 및, American Type Culture Collection, Manassas , Virginia, USA에서 입수 가능한 SP-2 세포 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함한다. 인간 모노클로널 항체의 생산에 관련하여, 인간 골수종 세포주 및 마우스 - 인간 헤테로 골수종 세포주도 포함되어 있다(Kozbor, J. Immunol., 133 : 300 1(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 증식하고 있는 배양 배지를, 항원에 대한 모노클로널 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로널 항체의 결합 특이성은 면역 침강법에 의해, 또는 방사 면역 측정법(RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 측정(ELISA) 등의, 시험관 내 결합 측정에 의해 결정된다.
모노클로널 항체의 결합 친화성은, 예를 들면, Munson et al., Anal. Biochem., 107 : 220(1980)의 30 스캐차드 분석에 의해 판정할 수 있다.
소망의 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후에, 이의 클론을 한계 희석법에 따라 클로닝하고, 표준 방법에 의해 증식시킬 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986)). 이 목적에 적합한 배양 배지의 예로서, D-MEM 배지 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양과 같은 생체 내(in vivo) 증식시킬 수도 있다.
서브 클론에 의해 분비되는 모노클로널 항체는, 균일하게 될 때까지 정제하여도 좋다. 예를 들면, 일반적인 단백질에 대해 사용되는 단리법 및 정제법에 따라 항체의 단리 및 정제할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지 않으나, 친화성 크로마토그래피 등의 컬럼 크로마토그래피, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동 및 등전점 전기 영동의 사용을 적절하게 선택하고 조합하는 것에 의해 배지, 복수, 또는 혈청으로부터 적절한 항체를 단리 및 단리할 수 있다(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)). 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼을 친화성 컬럼으로 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 단백질 A 컬럼은 예를 들면, Hyper D, POROS 및 Sepharose FF(Pharmacia)가 포함된다.
예시적인 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피 이외에, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등이 포함된다(Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)). 크로마토그래피 단계는 HPLC 및 FPLC 등의 액상 크로마토그래피에 의해 실시할 수 있다.
모노클로널 항체를 코딩하는 DNA는, 종래의 절차를 사용하여(예를 들면, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의해) 쉽게 단리되어, 배열 결정된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원 역할을 한다. DNA를 단리하면, 발현 벡터의 중에 배치하여, 이것을 다음에, 면역 글로불린 단백질을 다른 방법으로는 생산하지 않는 대장균(E.coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 중에 트랜스펙션(transfection)을 하여 재조합 숙주 세포 내에서의 모노클로널 항체의 합성을 달성 할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA의 세균 중에서의 재조합 발현에 관한 총설에는, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5 : 256-262(1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs., 130 : 151- 188(1992)가 포함된다.
FZD10에 대해 반응성을 나타내는 특이적인 항체 또는 항체 단편을 생산하기위한 다른 방법으로는, 세균 중에서 발현되는 면역 글로불린 유전자 또는 이의 일부를 코드하는 발현 라이브러리를, FZD10 단백질 또는 이의 부분 펩티드를 이용하여 스크리닝하는 것이다. 예를 들면, 완전한 Fab 단편, VH 영역 및 Fv 영역을 파지 발현 라이브러리를 사용하여 세균 중에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, Ward et al., Nature 341 : 544-546(1989); Huse et al., Science 246 : 1275-1281(1989); 및 McCafferty et al., Nature 348 : 552-554(1990)를 참조 원한다. 예를 들면 FZD10 펩티드를 이용하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해, FZD10 대한 반응성을 가지는 면역 글로불린 단편을 동정할 수 있다. 또는, 항체 또는 이의 단편을 생산하기 위해 SCID-hu 마우스(Genpharm로부터 입수할 수 있다)를 이용해도 좋다.
보다 양태에서, 항체 또는 항체 단편은, McCafferty et al., Nature, 348 : 552-554(1990)에 기재되어 있는 기술을 이용하여 제작된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352 : 624-628(1991) 및 Marks et al., J MoL BioL, 222 : 581-597(1991)는 파지 라이브러리를 사용하여 마우스 항체 및 인간 항체의 단리에 대해 각각 기재되어 있다. 이의 후의 간행물은, 사슬 셔플링(chain shuffling)에 의한 높은 친화성(nM 범위) 인간 항체의 생산(Marks et al., BioTechnology 10 : 779-783(1992)), 및 비상으로 큰 파지 라이브러리를 구축하기위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체 내 재조합(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21 : 2265-2266(1993))에 대해 기재되어 있다. 따라서 이러한 기술은 모노클로널 항체 단리를 위한 종래의 모노클로널 항체 하이브리도마 기술을 대체하여 실행 가능한 수단이다.
본 발명은, FZD10 관련 질환의 진단, FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효의 판정 및 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상의 스크리닝에 적합한 항체를 제공한다. 본 발명은, 면역 조직 화학 염색 및 유동 세포 계측법에서 높은 특이성으로 FZD10 단백질을 검출할 수 있는 마우스 모노클로널 항체 클론(10A8H4G4)의 수립에 성공하였다. 이 항체 클론을 폐암 임상의 검체의 면역 조직 화학 염색에 사용하면, RealTime-PCR에 의해 FZD10의 발현 수준이 높은 것으로 확인된 폐암 검체에서는 양성 소견이 인정되나, FZD10의 발현 수준이 낮은 것으로 확인된 폐암 검체에서는 거의 염색되지 않는 것이 실증되었다. 또한, 시판의 항 FZD10 항체를 이용하면 FZD10 강제 발현 세포주, 비발현 세포주 어느 것으로부터 제작된 시료에서도 염색이 확인된 반면, 본 발명의 항 FZD10 항체를 이용한 경우에는 FZD10 강제 발현 세포주로부터 제작된 시료에서 특이적으로 염색되는 것으로 밝혀졌다. 이처럼 높은 항원 특이성을 가지는 본 발명의 항체는 FZD10 발현 수준이 높은 환자, 나아가서는 FZD10 저해제에 의한 치료가 유효한 가능성이 높은 환자를 선택하는 데 유리하다.
본 발명의 항 FZD10 마우스 모노클로널 항체 클론(10A8H4G4)의 중쇄 가변 영역(H 쇄 V 영역) 및 경쇄 가변 영역(L 쇄 V 영역)의 아미노산 배열은, 각각 SEQ ID NO : 7 및 8로 표시되어 있다.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 포함된 CDR(상보성 결정 영역)은, 해당 기술 분야에서 주지의 방법에 따라 결정할 수있다. 예를 들면, Kabat 등(Kabat EA et al.(1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition) 또는 Chothia 등(Chothia et al. J. Mol. Biol.(1987) 196; 901-917)에 의해 기재된 방법이, CDR의 결정에 관련하여 일반적으로 사용된다. Kabat의 정의에 의해 결정되는 본 발명의 항 FZD10 마우스 모노클로널 항체 클론(10A8H4G4)의 중쇄 가변 영역의 CDR 1,2,3은, 각각 SEQ ID NO : 1,2,3로 표시되어 있으며, 이 클론의 경쇄 가변 영역의 CDR 1,2,3은 각각 SEQ ID NO : 4,5,6으로 표시되어 있다.
따라서 본 발명은, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는, FZD10 단백질 또는 이의 부분 펩티드에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편이며, 해당 중쇄 가변 영역은,
SEQ ID NO : 1로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR1;
SEQ ID NO : 2로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR2; 및
SEQ ID NO : 3에 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR3
를 포함하고, 해당 경쇄 가변 영역은,
SEQ ID NO : 4로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR1;
SEQ ID NO : 5로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR2; 및
SEQ ID NO : 6으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR3
을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 제공한다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 항체가 결합하는 FZD10 단백질의 부분 펩티드는, 바람직하게는, FZD10 단백질의 N 말단 세포 외 도메인 펩티드이며, 예를 들면, FZD10 단백질(SEQ ID NO : 22)의 21-161 위에 해당 아미노산 배열(SEQ ID NO : 9)을 포함하고, SEQ ID NO : 22에서 선택된 아미노산 배열로 구성된다. 보다 바람직하게는 본 발명의 FZD10 단백질의 부분 펩티드는, SEQ ID NO : 9의 아미노산 배열로부터 이루어질 수 있다.
상기의 「SEQ ID NO : 1로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR1; SEQ ID NO : 2로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR2; 및 SEQ ID NO : 3으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR3」을 포함하는 중쇄 가변 영역의 하나의 예는, SEQ ID NO : 7로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 중쇄 가변 영역이다. 상기의 「SEQ ID NO : 4로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR1; SEQ ID NO : 5로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR2; 및 SEQ ID NO : 6으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR3」를 포함하는 경쇄 가변 영역의 하나의 예는, SEQ ID NO : 8로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 경쇄 가변 영역이다.
따라서, 일양태에서, 본 발명은, SEQ ID NO : 7로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO : 8로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 제공한다.
본 발명의 항체는 종래의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 종래의 유전자 재조합 기술에 따라, 항체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터에 조합, 해당 벡터를 숙주에 도입하여, 해당 숙주에서 항체를 생산함으로써, 항체를 제조할 수 있다(예를 들면, Vandamme, AM et al., Eur. J. Biochem(1990) 192, 767-75을 참조).
본 발명의 항체의 가변 영역(V 영역)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 핵산 배열은, 본 발명의 항체의 V 영역의 아미노산 배열로부터 추정할 수 있다. 본 발명의 항체 클론의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 코드하는 핵산 배열은, 각각, 예를 들면, SEQ ID NO : 10 및 11로 표시되는 핵산 배열을 사용할 수 있다. 본 발명의 항체의 V 영역을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드는 고상 기술(Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron(1992) 48, 2223-311; Matthes et al., EMBO J(1984) 3, 801-5) 및 올리고 뉴클레오티드 합성 기술(Jones et al. Nature(1986) 321, 522-5)과 같은 종래의 방법으로 배열 정보에 따라 합성할 수 있다.
항체 V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 항체 정상(C) 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 통합한다.
본 발명에서 사용되는 항체의 생산을 위해, 해당 항체(항체 유전자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 발현 제어 요소(예를 들면, 인핸서(enhancer), 프로모터(promoter))의 제어 하에 항체 유전자가 발현할 수 있도록, 발현 벡터에 통합한다. 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질 전환하여 항체를 발현시킨다.
항체 유전자의 발현에서, 항체의 H 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 L 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 별도의 발현 벡터에 통합해도 좋고, 그 후, 얻어진 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 동시 형질 전환한다. 또는 항체 H 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 L 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 하나의 발현 벡터에 함께 통합도 좋고, 그 후 얻어진 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 형질 전환한다(예를 들면, 국제 공개 공보 제 94/11523 호).
항체 유전자는 공지의 방법에 의해 발현시킬 수 있다. 포유류 세포에서 발현의 경우, 종래의 유용한 프로모터, 발현되는 항체 유전자, 및 폴리(A) 시그널(항체 유전자의 3' 말단에 대해 하류에 위치한다)을, 기능적으로 연결시킬 수있다. 예를 들면, 유용한 프로모터/인핸서 계로서, 인간 거대세포 바이러스(cytomegalovirus) 전에 초기 프로모터/인핸서 계를 사용할 수 있다.
다른 프로모터/인핸서 계, 예를 들면, 바이러스(예를 들면, 레트로 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스 및 원숭이 바이러스 40(SV40))에서 유래한 것, 및 포유류 세포에서 유래하는 것(예를 들면, 인간 신장 인자 1α( HEF1α))을 본 발명의 항체의 발현에 사용할 수도 있다.
SV40 프로모터/인핸서 계가 사용되는 경우, 유전자 발현은 Mulligan 등(Nature(1979) 277, 108-14)의 방법에 의해 용이하게 할 수 있다. HEF1α 프로모터/인핸서 계가 사용되는 경우, 유전자 발현은 Mizushima 등(Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322.)의 방법에 의해 용이하게 할 수 있다.
대장균에서 발현의 경우, 종래의 유용한 프로모터, 관심 대상의 항체를 분비시키기 위한 시그널 배열, 및 항체 유전자를, 기능적으로 연결시킬 수 있다. 프로모터로서, lacZ 프로모터 또는 araB 프로모터를 사용할 수 있다. lacZ 프로모터가 사용되는 경우, 유전자 발현은 Ward 등(Nature(1098) 341, 544-6 .; FASBE J.(1992) 6, 2422-7)의 방법으로 할 수 있는 반면, araB 프로모터가 사용되는 경우, 유전자 발현은 Better 등(Science(1988) 240, 1041-3)의 방법으로 할 수 있다.
항체의 분비를 위한 시그널 배열에 관하여, 관심 대상의 항체가 대장균의 세포 주변강으로 분비되는 것이 의도된 경우, pelB 시그널 배열(Lei, SP et al, J. Bacteriol(1987) 169, 4379-83)을 사용할 수 있다. 세포 주변강에서 분비된 항체를 단리하여, 그 후, 항체가 적절한 입체 구조를 취하도록 다시 접는다.
바이러스(예를 들면, SV40 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소 파필로마 바이러스(BPV)) 등에 유래하는 복제 기점을 사용할 수 있다. 숙주 세포 계열의 유전자 복제 수를 증가시키기 위해, 발현 벡터에는, 아미노 글리코사이드 포스포 트랜스퍼라제(APH) 유전자, 티미딘 키나제(TK) 유전자, 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실기 전이 효소(Ecogpt) 유전자 및 디하이드로 엽산 환원 효소(dhfr ) 유전자 등의 선택 마커 유전자를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 생산에 관해서는 진핵 생물과 원핵 생물의 세포 계열을 포함하는 모든 발현 계를 사용할 수 있다. 진핵 세포에는, 동물(예를 들면, 포유류, 곤충, 곰팡이 및 진균, 효모)의 수립 세포주가 포함된다. 원핵 생물 세포에는, 대장균 세포 등의 세균 세포가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 항체는, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포, BHK 세포, Vero 세포 및 HeLa 세포 등의 포유류 세포에서 발현되는 것이 바람직하다.
다음으로, 형질 전환된 숙주 세포를 시험관 내 또는 생체 내에서 배양하여, 관심 대상의 항체를 생산한다. 숙주 세포의 배양은 임의의 공지의 방법으로 할 수있다. 본 명세서에서 사용할 수 있는 배양 배지는 DMEM, MEM, RPMI-1640 또는 IMDM 배지일 수 있다. 배양 배지는, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보충제를 포함할 수 있다.
재조합 항체의 생산에 있어서, 상기 숙주 세포 외에, 트렌스제닉 동물을 숙주로서 사용할 수도 있다. 예를 들면, 항체 유전자를, 동물의 모유 중에서 원래 생산된 단백질(예를 들면, β 카제인)을 코드하는 유전자의 소정 부위에 삽입하여, 융합 유전자를 조제한다. 항체 유전자가 도입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 비인간 동물의 배아에 주사하고, 이 배아를 다음에, 자성 동물에 도입한다. 해당 배아를 체내에 가지는 해당 자성 동물은 트렌스제닉 비인간 동물을 낳는다. 관심 대상의 항체는 해당 트렌스제닉 비인간 동물 또는 그 자손으로부터 모유로 분비된다. 해당 항체를 함유하는 모유의 양을 증가시킬 목적으로, 적절한 호르몬을 해당 트렌스제닉 동물에 투여할 수 있다(Ebert, KM et al, Bio/Technology(1994) 12, 699-702).
상기와 같이 표현된 생산된 항체를, 세포 또는 숙주 동물의 몸으로부터 단리, 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 단리 및 정제는 친화성 컬럼에 대해서 실시할 수 있다. 항체의 단리 및 정제에 종래 사용되는 다른 방법을 사용할 수 있으며; 따라서, 방법은 특히 한정되지 않는다. 예를 들면, 다양한 크로마토그래피, 여과, 한외 여과, 염석 및 투석을 단독으로 또는 조합하여 사용하여, 관심 대상의 항체를 단리 및 정제할 수 있다(Antibodies A Laboratory Manual Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
(ii) 항체 단편
다양한 기술이 항체 단편의 생산을 위해 개발되고 있다. 종래에는, 인텍트한 항체의 단백질 분해 소화를 통해 이러한 단편을 얻을 수 있었다(예를 들면, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 : 1 07-117(1992) 및 Brennan et al., Science, 229 : 81(1985)을 참조하기 바란다). 그러나, 이러한 단편은 현재, 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산할 수 있다. 예를 들면, 항체 단편을 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 또는 Fab'-SH 단편을 대장균으로부터 직접 회수하여, 화학적으로 커플링하여, F(ab')2 단편을 형성 시켜도 좋다(Carter et al., Bio/Technology 10 : 163-167(1992)). 다른 접근에 따르면, F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은, 당업자에게 명백할 것이다. 다른 양태에서, 최적의 항체로는 단일 가닥 Fv 단편(scFv)이다. WO93/16185 호; US5,571,894 호; 및 US5,587,458 호를 참조하기 바란다. 또한 항체 단편은, 예를 들면 US5,641,870 호에 예를 들면 설명된 바와 같이, 「직쇄형 항체」여도 좋다. 이러한 직쇄형 항체 단편은 단일 특이성 또는 이중 특이성을 가지고 있다.
(iii) 표지화 항체
본 발명의 항체를, 임의적으로, 친화성 표지, 효소 표지, 방사성 동위 원소 표지, 형광 표지 또는 화학 발광 표지와 결합시킨다. 예를 들면, FZD10를 발현하는 암 조직에 존재하고 검출 가능한 표지의 존재에 의해, 진단되는 대상의 암 또는 종양의 유무의 판정이 가능하게 된다. 또한, 암 조직에서 표지의 국재성에 의해, 질병의 확대를 판정할 수 있다.
사용에 적합한 표지에는, 예를 들면, 플루오레세인 및 로다민 등의 형광 표지; 및 루시페라아제 등의 효소 표지를 포함한다. 사용되는 검출가능한/검출용의 표지는, 사용하는 이미징 양식에 따라 선택된다. 그러한 표지와 항체와의 결합체는 본 기술 분야에서 공지의 프로토콜 및 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명에있어서, 본 발명의 항체는 사용의 직전에 소망의 표지와 결합될 수도 있고, 표지와 결합한 항체로서 제공되어도 좋다.
항체와 표지와의 결합체는, N-석신이미딜-3-(2-피리일디트리올)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티오란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들면, 디석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들면, 글루타르 알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들면, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들면, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들면 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 등의 다양한 이관능성 단백질 커플링제를 사용하여 제조할 수 있다. 또는, 항체 및 표지를 포함하는 융합 단백질, 예를 들면 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 융합 단백질의 바람직한 예로는, ECFP, EYFP 또는 EGFP 등의 표지 단백질과 항체와의 융합 단백질을 들 수 있다.
III. FZD10 관련 질환의 진단, FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상의 스크리닝(치료 전 진단) 또는 FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효 판정(치료 후 진단)
FZD10는, FZD10 관련 질환의 진단 마커로서뿐 아니라 이러한 질환을 앓고 있는 대상의 FZD10 저해제에 대한 응답성 및 해당 저해제의 약효를 평가하기위한 마커로서 유용하다. 따라서, 본 발명의 항체는, 암 등의 FZD10 관련 질환을 진단하기 위해, 또는 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상을 스크리닝하기 위해 또는 FZD10 저해제에 의한 치료 후 약효를 판정하기 위한 마커의 검출 시약으로 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 항체에 의해 대상으로부터 단리한 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하고, FZD10 관련 질환의 진단, FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상의 스크리닝, 또는 FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효 판정을 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 대상으로부터 단리한 시료에서 본 발명의 항체를 사용하여 FZD10 단백질을 검출하는 것에 의해, 대상에서 FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인을 진단하는 방법, 및 FZD10 저해제에 의한 치료 효과 높은 대상을 스크리닝하는 방법 및 FZD10 저해제 치료 후의 약효를 판정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 이하의 단계를 포함한다:
(a) 대상으로부터 단리한 시료를 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계;
(b) 해당 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 단계 : 및
(c) 해당 시료 중의 FZD10 단백질 수준을 대조로 비교하는 단계.
전형적인 양태에 있어서, 상기 시료는, 상기 대상에서 단리한 세포 또는 조직이며, 바람직하게는, 상기 대상에서 단리한 조직이다. 따라서, 일반적으로, 본 발명의 각 방법은, 모두 대상에서 단리한 시료에 대해 시험관 내(in vitro)에서 실시된다. 바이옵시(생검) 및 채혈 등의 방법에 의해 대상에서 조직이나 세포를 단리하는 방법은 공지이다. 또는 치료를 위한 의료적인 처치(외과적인 수술 등)을 통해 대상에서 제외된 생체 시료를 이용할 수도 있다. 대상에서 단리된 세포와 조직은 항체와 접촉하기 전에 적절하게 처리할 수 있다. 예를 들면, 일반적으로 대상에서 얻어진 조직 시료는, 동결 후에 절편으로 하여, 더욱 알코올이나 포르말린 등으로 고정하여 면역 조직학적 분석을 위한 시료로 할 수 있다. 또는 포르말린 등으로 조직 시료나 배양 세포 등을 고정 후에, 파라핀 포매하여 면역 조직학적 분석을 위한 절편을 얻을 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합성 단편의, 시료와의 결합, 즉, 시료 중의 항원 단백질과의 결합은, 당업자 공지의 방법에 의해 검출할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 항체와 상기 시료와 접촉 후, 시료 중의 FZD10에 결합하지 않은 것을 세척하여 제거한 다음에 시료 중에 남은 항체를 검출함으로써, 본 발명의 항체와 시료 중의 FZD10 단백질의 결합을 검출할 수 있다. 이때, 항체가 직접 표지된 경우에는, 표지를 감지하여 FZD10 단백질에 결합한 본 발명의 항체의 존재를 검출할 수 있다. 표지가, 효소, 형광 물질, 발광 물질 또는 입자 등의 검출 가능한 것이면 이러한 징후를 즉시 검출할 수 있다. 이 외에, 본 발명의 항체를 비오틴 등의 친화성 물질(결합 물질)로 표지한 경우(친화성 표지)에는, 표지 아비딘 등의 결합 파트너로 항체의 존재를 포착할 수 있다. 또는 본 발명의 항체가 직접 표지되지 않은 경우에는 항체에 대한 결합 시약에 의해 본 발명의 항체를 검출할 수 있다. 예를 들면, 항체 결합 시약으로서, 단백질 A 나 항체에 대한 항체를 표지하여 항체의 검출에 이용할 수 있다.
FZD10 관련 질환의 진단의 경우, 상기 단계(c)에서, 대조 수준(정상 대조 수준, 바람직하게는, FZD10 관련 질환을 앓고 있지 않은 정상 대상에서 단리한 시료 중의 FZD10 단백질의 발현 수준)과 비교하여 FZD10 단백질 수준이 높을 때, 대상이 FZD10 관련 질환을 앓고 있거나 이의 발병 위험을 가지는 것이 나타난다.
또한, FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상의 스크리닝의 경우, 상기 단계(c)에서, 대조 수준(바람직하게는, FZD10 관련 질환으로 진단된 대상 조직의 FZD10 단백질의 발현 수준)에 비해 FZD10 단백질 수준이 비슷하거나 그보다 높은 경우에, 대상에서 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 것으로 나타난다.
한편, FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효 판정의 경우, 상기 단계(c)에서 대조 수준(바람직하게는, 약제 투여 전의 대상에서 단리한 시료 중의 FZD10 단백질의 발현 수준)에 비해 FZD10 단백질 수준이 낮을 때에, 대상에서 약효가 있었던 것으로 나타난다.
본 발명의 진단 방법에 의해, FZD10 관련 질환을 가지는 것으로 나타난 환자는, FZD10 저해제에 의한 치료의 대상이 될 가능성이 높다. 따라서, 본 발명의 진단 방법에 따라, FZD10 관련 질환을 가진 것으로 나타난 환자에 FZD10 저해제를 투여 할 수 있다. 또는 FZD10 저해제의 치료 효과가 높을 가능성이 나타난 환자에게도 스크리닝을 거쳐, FZD10 저해제를 투여할 수 있다. 또한, FZD10 저해제를 투여받은 환자에서, 해당 저해제의 치료 효과가 있던 것으로 나타난 경우에도 계속 같은 환자에 FZD10 저해제를 투여할 수 있다.
즉, 본 발명은 이하의 군으로부터 선택되는 어느 환자를 본 발명의 방법에 의해 특정하여, 해당 환자에게 FZD10 저해제를 투여하는 공정을 포함하는, FZD10 관련 질환의 치료 방법에 대한 것이다;
본 발명의 진단 방법에 의해, FZD10 관련 질환을 가진 것으로 나타난 환자;
FZD10 저해제의 치료 효과가 높을 가능성이 나타난 환자; 그리고
FZD10 저해제를 투여받은 환자에게, 해당 저해제의 치료 효과가 있던 것으로 나타난 환자.
본 발명에 있어서, 환자에게 투여되는 FZD10 저해제에는, 공지의 화합물을 사용할 수 있다. 본 명세서에서는, FZD10 발현 세포에 대한 세포 독성 활성을 나타내는 항체나, FZD10의 발현을 억제하는 이중 가닥 RNA 분자도 FZD10 저해제에 포함된다. 이러한 항체 또는 이중 가닥 RNA 분자로는, 예를 들면, WO2005/004912 또는 WO2007/148417에 개시되어 있는 FZD10에 대한 항체 및 WO2006/013733에 개시되어 있는 FZD10에 특이적인 siRNA를 들 수 있다.
본 발명과 관련해서, FZD10 관련 질환을 앓고 있지 않는(예를 들면, 비암성이다) 것으로 알려진 생체 시료로부터 측정된 대조 수준은 「정상 대조 수준」이라고 칭한다. 대상으로부터 단리한 시료의 FZD10 단백질 수준이 정상 대조 수준과 비교하여 높은 경우, 대상은 치료를 받아야 할 FZD10 관련 질환을 가진다, 라고 진단될 수 있다.
한편, FZD10 관련 질환을 앓고 있는(예를 들면, 암성이다) 것으로 알려진 생체 시료로부터 측정된 대조 수준은 「질환 대조 수준(예를 들면, 암성 반대로 수준)」이라고 불린다. FZD10 저해제에 의한 치료 전의 대상으로부터 단리한 시료의 FZD10 단백질 수준이 질환 대조 수준과 비슷하거나 그보다 높은 경우, 대상은 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높다고 진단될 수 있다.
또한, FZD10 저해제에 의한 치료 후의 대상으로부터 단리한 시료의 FZD10 단백질 수준이 약제 투여 전과 동일한 대상의 질환 대조 수준보다 낮은 경우, 치료에 의한 약효가 있었다, 즉, 대상은 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높다고 진단 될 수 있다.
특정의 양태에 있어서, 치료해야 할 FZD10 관련 질환(예를 들면, 암)을 가지는 기관의 비이환 영역(예를 들면, 비암성 영역)에서 얻어진 정상 세포(또는 조직)을 정상 대조로 사용하여도 좋다. 다른 양태에 있어서, 대조 수준은, 질환 상태(예를 들면, 암성 또는 비암성)를 알고 있는 대상 유래의 시료 중에서 미리 측정 된 FZD10 단백질 수준을 분석하여 얻은 결과에 따라 통계적 방법에 의해 결정할 수 있다. 또한, 대조 수준은, 이전에 시험된 시료(세포 또는 조직)에서 유래한 발현 패턴의 데이터 베이스에서 유래할 수 있다. 평가 대상의 시료가 조직 시료인 경우, 이와 같은 조직에서 유래하는 시료를 대조 시료로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 하나의 국면에 따라, 생체 시료 중의 FZD10 단백질 수준을, 복수의 참조 시료로부터 측정되는 복수의 대조 수준과 비교될 수 있다. 대상 유래의 생체 시료의 조직형과 유사한 조직 형태에서 유래하는 참조 시료로부터 측정된 대조 수준을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태가 판명되어 있는 집단의 FZD10 단백질 수준의 기준치를 이용하는 것이 바람직하다. 기준치는 해당 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D.의 범위를 기준치로 하여 사용할 수 있다.
시료 중의 FZD10 단백질 수준은, 이의 수준이 대조 수준으로부터, 예를 들면, 10%, 25% 또는 50% 높거나, 1.1 배 이상, 1.5 배 이상, 2.0 배 이상, 5.0 배 이상, 10.0 배 이상 또는 그 이상 높으면 높다고 볼 수 있다. 시료 중의 FZD10 단백질 수준은, 이의 수준이 대조 수준으로부터, 예를 들면, 10%, 25% 또는 50% 낮거나, 1.1 배 이상, 1.5 배 이상, 2.0 배 이상, 5.0 배 이상, 10.0 배 이상 또는 그 이상 낮은 경우 낮다고 볼 수 있다.
전형적인 양태에 있어서, FZD10 관련 질환은 FZD10를 발현하는 암이다. FZD10를 발현하는 암은, 예를 들면, 활막 육종, 폐암, 식도암, 결막직장암(대장암), 위암, 만성 골수성 백혈병(CML)과 급성 골수성 백혈병(AML)이나, 이에 한정되지 않는다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은, FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인의 진단 마커를 검출하는 방법으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 이용하여 시료 중의 FZD10 단백질을 해당 진단 마커로 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. FZD10은, 일종의 암 세포에서 정상 조직에 비교하여, 발현이 강화하고 있음이 분명해지고 있다. 따라서, FZD10의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있다면, 그것은 관련하는 질환의 진단 마커로서 유용하다. 본 발명과 관련해서 FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인의 진단 마커는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과의 결합에 의해 검출되는, 대상으로부터 단리한 시료 중의 FZD10 단백질이며, 그 발현 수준이 대조 수준과 비교하여 높을 때에, 해당 대상이 해당 질환을 앓고 있거나 발병 위험을 가진 것이 나타나는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 대조 수준은, 정상 대조 수준, 바람직하게는, FZD10 관련 질환을 앓고 있지 않은 정상 대상으로부터 단리한 시료 중의 FZD10 단백질의 발현 수준이다. 일반적으로 대조 수준은, 진단 마커를 검출하려고 하는 암 세포에서 유래하는 조직과 같은 조직에서 발현 수준인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인의 진단에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 제공한다. 또는, 본 발명은 FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인을 진단하는 시약의 제조에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편의 사용을 제공한다.
또한, 본 발명은, FZD10 저해제 치료 응답성 마커를 검출하는 방법으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 이용하여 시료 중의 FZD10 단백질을 해당 응답성 마커로 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. FZD10은 일종의 암 세포에서 특이적으로 발현이 증강하고 있으며, 이러한 암세포의 증식이 FZD10 저해제에 의해 억제되는 것으로 밝혀지고 있다(WO2005/004912, WO2006/013733, WO2007/148417). 즉, FZD10의 발현을 지표로 하여, FZD10 저해제에 대한 응답성을 예측할 수 있다. FZD10을 높은 수준으로 발현하는 경우, FZD10 저해제에 의한 세포 증식 억제 작용을 기대할 수 있기 때문이다. 따라서, FZD10의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있다면 FZD10 저해제 치료 응답성 마커로서 유용하다. 본 발명과 관련해서 FZD10 저해제 치료 응답성 마커는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과의 결합에 의해 검출되는 대상으로부터 단리한 시료 중의 FZD10 단백질이며, 그 발현 수준이 대조 수준과 비교하여 비슷하거나 그보다 높은 경우, 해당 대상의 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 것으로 나타나는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 대조 수준은 바람직하게는 질환 대조 수준, 즉 FZD10 관련 질환을 앓고 있는 것으로 알려진 대상의 질환 부위에서 단리한 시료의 FZD10 단백질의 발현 수준, 특히 바람직하게는 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상으로부터 치료 전에 단리한 시료의 FZD10 단백질의 발현 수준이다.
본 발명은 또한 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상의 스크리닝에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 제공한다. 또는, 본 발명은 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상을 스크리닝하기 위한 시약의 제조에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편의 사용을 제공한다.
본 발명은 또한, FZD10 저해제의 약효 마커를 검출하는 방법으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 이용하여 시료 중의 FZD10 단백질을 해당 의약 마커로서 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. FZD10은, 일종의 암 세포에서 특이적으로 발현이 증강하고 있으며, 이러한 암세포의 증식이 FZD10 저해제에 의해 억제되는 것으로 밝혀지고 있다(WO2005/004912, WO2006/013733, WO2007/148417). 따라서 이러한 암세포를 가지는 암 조직은, FZD10 저해제에 의해 축소 또는 사멸 할 수있다. 즉, FZD10의 발현 수준을 지표로 하여, 이러한 암 세포를 가지는 대상의 FZD10 저해제의 약효를 평가할 수 있다. FZD10 양성의 암세포를 가지고 있던 조직으로부터 단리한 시료의 FZD10의 발현 수준이 FZD10 저해제 치료 전에 단리한 시료와 비교하여 감소하고 있으면 FZD10 저해제에 의해 FZD10 양성의 암세포가 감소하였다고 간주할 수 있기 때문이다. 따라서, FZD10의 발현 수준을 특이 적으로 검출할 수 있다면, FZD10 저해제의 약효 마커로서 유용하다. 본 발명과 관련해서 FZD10 저해제의 약효 마커는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과의 결합에 의해 검출되는, FZD10 저해제를 투여된 대상으로부터 단리한 시료 중의 FZD10 단백질로서 발현 수준이 대조 수준과 비교하여 낮은 경우, 해당 대상에서 FZD10 저해제의 약효가 있었음을 표시하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 대조 수준은 바람직하게는 약제 투여 전에 해당 대상의 질환 부위에서 단리한 시료 중의 FZD10 단백질의 발현 수준이다.
본 발명은 또한, FZD10 저해제에 의한 치료 후 약효 판정에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 제공한다. 또는, 본 발명은 FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효를 판정하기 위한 시약의 제조에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편의 사용을 제공한다.
IV. FZD10 관련 질환의 진단, FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상의 스크리닝 또는 FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효의 판정을 위한 시약 또는 키트
본 발명은, FZD10 관련 질환의 진단, FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상의 스크리닝 또는 FZD10 저해제에 의한 치료 후 약효의 판정을 위한 시약 또는 키트를 제공한다. 구체적으로는, 이 키트는 FZD10 단백질의 검출 시약으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 포함한다. 일양태에 있어서, 본 발명의 진단 시약 또는 키트를 위한 항체를 형광 물질, 발광 물질 또는 방사성 동위 원소로 표지할 수 있다. 항체를 표지하는 방법 및 표지 항체를 검출하기 위한 방법은, 해당 기술 분야에서 주지이며 임의의 표지 및 방법을 본 발명에 사용할 수 있다.
본 키트는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 다른 마커 검출 시약과의 조합을 포함할 수 있다. 본 키트는 또한, FZD10 대한 양성 및 음성 대조 시약, 및 본 발명의 항체를 검출하기 위한 이차 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, FZD10을 고발현하고 있는 것을 알 수 있는 세포주의 배양 절편 또는 조직 시료는, 유용한 양성 대조 시약으로 도움이 될 수 있다. 또한 예를 들면, 정상 대상 또는 비암성 조직에서 얻은 조직 시료는, 유용한 대조 시약으로 도움이 될 수 있다. 본 발명의 항체를 검출하기 위한 이차 항체는 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소 또는 효소로 표지되는 것이 바람직하다. 본 발명의 키트는 또한, 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 설명을 담은 첨부 문서(예를 들면, 서면, 테이프, CD-ROM 등)를 포함하여, 상업적인 견지 또는 사용자의 입장에서 바람직한 다른 재료를 포함할 수 있다. 이러한 시약 등을, 레이블된 용기에 보존할 수 있다. 적절한 용기로는 병, 유리병 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱 등 다양한 재료로 형성할 수 있다.
본 발명을 이의 특정의 양태에 관하여 본 명세서에서 상세하게 설명하여 왔으나, 상술의 설명은 사실상, 예시적이고 설명적인 것으로서, 본 발명 및 그 바람직한 양태를 설명하기 위한 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 관례적인 실험을 통해 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 그 속에서 이루어질 수 있는지 쉽게 이해될 것이다. 따라서 본 발명은 상기의 설명에 의해 규정되는 것이 아니라 첨부된 특허 청구 범위에 및 이들의 등가물 의해 규정되는 것이 의도된다.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이하의 재료, 방법 및 실시예는, 본 발명의 어떤 형태의 제작 및 사용에 있어서 당업자을 지원하기 위해 도움이 될 수 있는 한편, 본 발명의 국면을 설명하기 위한 것에 불과하며, 따라서 본 발명 범위를 결코 한정하는 것을 의도하지 않는다. 당업자는 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서에 포함된다.
[실시예]
다음의 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[재료 및 방법]
세포 배양
ATCC에서 구입한 인간 대장암 세포주인 DLD1에 FZD10 발현 벡터를 도입시킨 FZD10 강제 발현 세포주(FZD10/DLD1)를 제작하여, 음성 대조로서 Empty Vector를 도입시킨 세포주(Mock/DLD1)를 제작하였다. 5% CO2의 가습 분위기 중 37℃에서, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토 마이신 및 0.8 mg/mL GENETICIN을 보충 한 RPMI-1640 중에서 유지하였다. 국립 암 연구 센터 희귀 암 센터에서 분여된 인간 활막 육종 세포주인 SYO-1은 5% CO2의 가습 분위기 중 37℃에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토 마이신을 보충한 DMEM 중에서 유지하였다. JCRB에서 구입한 사람 식도암 세포주인 T.T는, 5% CO2 의 가습 분위기 중 37℃에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토 마이신을 보충한 DMEM/F12(1 : 1) 중에서 유지하였다. ATCC에서 구입한 인간 폐암 세포주인 H727은 5% CO2의 가습 분위기 중 37℃에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토 마이신을 보충한 RPMI-1640 중에서 유지하였다. ATCC에서 구입한 인간 대장암 세포주인 COLO201는 5% CO2의 가습 분위기 중 37℃에서 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토 마이신, 10mM HEPES, 1mM Sodium pyruvate 및 4.5 g/L 포도당을 보충 한 RPMI-1640에서 유지하였다. ATCC에서 구입한 인간 대장암 세포주인 LoVo는 CO2의 가습 분위기 중 37℃에서 20% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토 마이신을 보충한 F12 중에서 유지하였다.
임상 검체
외과적으로 절제된 폐암의 조직 시료(포르말린 고정 파라핀 절편, 동결 조직) 및 이에 대응하는 임상 정보는, 서면으로 통보를 취한 후, 카나가와 암 센터에서 입수하였다.
면역 조직 화학 염색(IHC)
포르말린 고정 파라핀 절편화한 FZD10/DLD1, Mock/DLD1, SYO1, T.T, H727, LoVo, COLO201 및 임상 검체를, 크실렌에 3분간 3회 침지하여 탈파라핀한 후, 100% 에탄올에 1분간 2회 90%, 70% 및 50% 에탄올로 각각 1 분간 침지하여 재수 화시켰다. 항원 부활화 처리를 위해 항원 부활화액 pH 9(니치 레이 바이오 사이언스)에 침지시킨 절편을 FZD10/DLD1, Mock/DLD1는 125℃ 30초 동안 SYO1, T.T, H727, LoVo, COLO201 및 임상 검체 95℃ 40분간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후, 20 분간 실온 방치하여, 흐르는 물에서 5 분간 수세하였다. 3.0% 과산화수소로 10 분간 침지하여 내인성 퍼옥시다아제의 블로킹을 수행하여, Wash Buffer(TBS-T(Takara Bio))에서 5분간 3회 세척하였다. 또한, 비특이적인 반응을 차단하는 목적으로 절편 상에 Protein Block 액(Dako)을 적당량 적하하여, 10 분간 정치하였다. 습윤 상자에서 1차 항체(FZD10Ab(10A8H4G4), FZD10(L164) pAb, FZD10 PolyclonalAb)를 각각 적당량 적하하여, 60분간 정치한 후, Wash Buffer에서, 5분간 3회 세척하였다. 습윤 상자에서 2차 항체로서 히스토파인 심플 스테인 MAX-PO(니치 레이 바이오 사이언스)을 적당량 적하하여 30분간 정치하였다. Wash Buffer에서 5분간 3회 세척 하였다. DAB 기질 용액(니치 레이 바이오 사이언스)에 의해 발색 반응을 수행하였다. 슬라이드 절편을 헤마톡실린(Dako)에 20초간 침지하여 흐르는 물에 세척하였다. 50%, 70% 및 90% 에탄올에서 각각 1분, 100% 에탄올에 1분간 2회 침지하여 탈수를 수행하였다. 마지막으로, 절편을 자일렌에서 3분간 2회 침지하여 투철하여, Mount-Quick(DAIDO SANGYO)에 의해 봉입하였다.
실시간(RT) PCR
RNeasy Mini kit(QIAGEN)을 이용하여 암 세포주(SYO-1, COLO201)에서 총 RNA를 추출하였다. 임상 동결 조직(폐편평 상피암)에서는, TRIzol Reagent(Invitrogen)에 동결 조직편을 담근 채 갈아서 으깨어 클로로포름 추출을 실시하였다. 얻어진 추출액에 대략 동일한 양의 70% 에탄올을 가하여, RNeasy Mini kit(QIAGEN)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)의 역전사 효소를 이용하여 총 RNA보다 cDNA를 합성하였다. cDNA를 주형으로 KAPA SYBR FAST ABI Prism qPCR kit(KAPA Biosystems)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 발현 해석 목적 유전자는 FZD10, 하우스 키핑(house keeping) 유전자는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 하였다. FZD10는 FZD10-11F: 5'-GTGTGCAGCCGTAGGTTAAAG-3'(SEQ ID NO: 12) FZD10 R5: 5'-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3'(SEQ ID NO: 13)의 프라이머 세트를 이용하고, GAPDH는 GAPDH RT-PCR Fw: 5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'(SEQ ID NO: 14), GAPDH RT-PCR Re: 5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'(SEQ ID NO : 15)의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 PCR 반응을 행하였다. PCR 증폭 산물량을 경시적으로 모니터링하여 PCR 증폭 산물이 기하급수적으로 증폭하는 영역에 임계값을 설정하여 Ct 값을 산출하였다. 검량선에 Ct 값을 적용하여 미지 시료의 농도를 산출하였다. FZD10 유전자의 정량 값을 GAPDH 유전자의 정량값으로 나누어 시료 사이의 주형량의 표준화를 행하고, FZD10 유전자의 발현량을 비교하였다.
유동 세포 계측법(FCM)
SYO1, T.T, H727 및 LoVo을, 초기 융합성(early-confluent)까지 각각 권장되는 배양 배지에서 유지하였다. 세포 표면 항원의 변성을 회피하기 위해, 다음 세포를 세포 박리용 용액(Cell Dissociation Solution; SIGMA, MO)에서 분리시켜, 0.5% BSA/PBS에 현탁하였다. 셀 스트레이너에 현탁한 세포를 통해 덩어리를 보고 세포 수를 계산하였다. 세포를 96Well 분석 플레이트에 분주하였다(2 × 105 개/50 μL). 희석된 시험 항체 또는 배양상청 50 μL를 첨가하여, 4℃에서 1시간 정치하였다. 플레이트를 1500 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하여 상청을 제거한 후, 0.5% BSA/PBS 150 μL로 2회 세척하였다. Alexa Fluor488 염소 항 마우스 IgG(H+L)(Invitrogen, CA) 20 mcg/mL로 혼합하여, 어두운 곳 중 4℃에서 1시간 방치하였다. 플레이트를 1500 rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 0.5% BSA/PBS 150 μL로 2회 세척하고, 120 μL의 0.5% BSA/PBS로 세포를 현탁하였다. 시험 항체의 결합 양식 및 특이성을 FACS Calibur(Becton Dickinson, NJ)에 따라 제조업체의 사용 설명서에 따라 평가하였다.
[실시예 1] 항 FZD10 모노클로널 항체의 제작
(1) 가용형 FZD10 단백질을 면역원으로 한 항 FZD10 항체 생산 하이브리도마의 취득
FZD10는 막 단백질이기 때문에, 고정된 막 단백질에 반응하는 항체 제작에는 세포 외 영역이 면역원으로 될 수 있다. FZD10의 N 말단 이외의 세포 외 영역은 매우 짧고, 항원으로 하는 것은 곤란하다고 생각했기 때문에, N 말단의 세포 외 영역(1-161 아미노산)을 면역원으로 선택하여, 시그널 펩티드 제외 가용형 FZD10 단백질(21-161 아미노산 영역)(SEQ ID NO: 9)를 면역원으로 모노클로널 항체를 제작 하였다. Freund Adjuvant에 항원 펩티드 50 μg을 가한 후, 에멀젼화하여 Balb/c 마우스(일본 에스엘시 주식회사)의 피하에 주사하는 것으로 초기 면역을 실시하였다. 2번째 이후의 면역은 동일하게 조제한 25μg 항원 펩티드 량 상당을 피하에 주사하여 실시하였다. 최종 면역 3일 후에 마우스에서 비장 세포를 무균적으로 조제하여 통상적인 방법에 따라 폴리에틸렌 글리콜법에 의해 마우스 미에로마 세포 SP2/0와의 세포 융합을 실시하였다.
(2) 항 FZD10 항체 생산 하이브리도마의 선발
항 FZD10 항체 선발은, 먼저 가용성 FZD10 단백질을 가졌던 ELISA 법에 의해 FZD10와 결합성을 가지는 항체를 스크리닝하였다. ELISA 법으로 선택된 항체에 대해 더욱 면역 염색법에 의한 선발을 실시하였다. 면역 염색법에 의한 선발은, 전장 FZD10 단백질(SEQ ID NO : 22)을 발현하는 FZD10 강제 발현 세포주 FZD10/DLD1을 이용한 면역 조직 화학 염색에 의해 수행하였다. 즉, 전장 FZD10 단백질을 강제 발현시킨 FZD10 강제 발현 세포주 FZD10/DLD1을 포르말린 고정 파라핀 절편화한 후, 면역 염색을 실시하고, 강한 반응이 인정된 하이브리도마를 선발하였다.
시험한 하이브리도마 중, FZD10 특이적 항체를 높은 수준으로 생산하는 것을 확인한 하이브리도마 클론 10A8H4G4에 대한 면역 조직 화학 염색 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2의 사진 및 그래프에 나타난 바와 같이, 10A8H4G4을 이용하여 염색하는 경우, FZD10 강제 발현 세포주 FZD10/DLD1에서 제작된 파라핀 절편에서는 염색이 인정된다, 즉, FZD10 양성 세포의 비율이 높은 것으로 나타났다. 한편, 음성 대조로서 Empty Vector를 도입시킨 세포주(Mock/DLD1)에서 제작된 파라핀 절편에서는 거의 염색이 인정되지 않고, FZD10 양성 세포의 비율이 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과에서 하이브리도마 클론 10A8H4G4은, 면역 조직 화학 염색에서, FZD10를 특이적으로 검출하는 항체를 생산하는 하이브리도마로서 유용하다는 것을 나타내었다.
한편, 시판 항체(FZD10(L164) Ab, FZD10PolyclonalAb)를 이용하여 염색하는 경우, FZD10/DLD1와 Mock/DLD1 중에서도 염색이 관찰되었다(높은 비율의 세포에 시그널이 감지되었다). 따라서, 이러한 시판의 항체에 의한 검출 결과에는 위양성 시그널이 포함되어 있을 가능성이 의심되었다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 항 FZD10 항체(10A8H4G4)는 면역 조직 화학 염색법에 있어서, 시판의 항 FZD10 항체에 비해 높은 특이성으로 FZD10을 검출할 수 있는 유리한 특성을 가지고 있음이 밝혀졌다.
이 하이브리도마 클론 10A8H4G4을, 더욱 실험용 항체를 생산하기 위하여 선택하였다. 하이브리도마 클론 10A8H4G4를 대량 배양하여, 2 ~ 3주 후에 배양액을 채취하였다. 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, NJ)을 이용하여 배양액으로부터 항체를 정제하였다. 본 명세서에 있어서, 본 발명의 항체는, 클론 10A8H4G4 이라고도 칭한다.
[실시예 2] 항 FZD10 모노클로널 항체의 특이성의 평가
다음으로, FZD10의 발현량이 다른 다양한 세포주를 이용하여, 10A8H4G4의 특이성을 평가하였다. 즉, 10A8H4G4을 이용한 면역 조직 화학 염색 및 유동 세포 계측법의 결과를 비교하여, FZD10 단백질의 발현량에 따라 염색이 인정될지 검토하였다. 여기에서 각 암종별 세포주를 이용한 mRNA의 발현 분석 데이터베이스 Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)에서 폐암, 식도암, 결장직장암(대장암)에 현저한 상향 제어가 표시되어 있다(도 1). 그래서, 이러한 암종에서 유래하는 세포주를 이하의 분석에 사용하였다.
먼저, 10A8H4G4를 이용한 유동 세포 계측법에 의해, 다양한 인간 암 조직 유래 세포주의 세포막 상에서의 내인성의 FZD10 단백질의 발현을 확인하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 내인성의 FZD10 단백질의 발현이 알려진 인간 활막 육종 유래 SYO-1의 외, 인간 식도암 세포주 T.T 및 인간 폐암 세포주 H727에서도, 10A8H4G4를 이용한 유동 세포 계측법에 의해 양성 시그널이 검출되었다. 한편, FZD10 비발현 세포주인 것으로 알려져 있는 인간 대장암 세포주 LoVo에서는, 10A8H4G4를 이용한 유동 세포 계측법에 의해 양성 시그널이 검출되지 않았다.
이어서, 이들의 세포주에서 제작된 파라핀 절편에 대해, 10A8H4G4를 이용하여 면역 조직 화학 염색을 실시하였다. 도 3B에 표시된 바와 같이, 10A8H4G4을 이용하여 염색한 결과, FZD10를 발현하고 있는 것이 확인된 세포주 SYO-1, T.T, H727에서 제작된 파라핀 절편에서 염색이 인정된다. 이러한 파라핀 절편에는, 유동 세포 계측법의 결과와 상관하여 높은 비율의 세포에 양성의 시그널이 검출되었다. 한편, FZD10 비세포주인 LoVo에서 제작된 파라핀 절편은 거의 염색되지 않고, 양성의 시그널이 거의 검출되지 않았다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 항 FZD10 항체(10A8H4G4)는 유동 세포 계측법에서도 면역 조직 화학 염색법에서도 높은 특이성으로 시료 중의 FZD10 단백질을 검출할 수 있는 유용한 도구임을 보여주었다.
[실시예 3] 종양 이식 모델 및 임상 검체에서 FZD10 단백질의 검출
본 발명의 항 FZD10 항체(10A8H4G4)의 면역 조직 화학 염색의 특이성을, 암 세포주의 마우스 Xenograft 종양으로부터 제작된 파라핀 절편 및 폐암 임상 검체를 이용하여 평가하였다. SYO-1, COLO201 세포주의 마우스 Xenograft 종양으로부터 제작된 파라핀 절편 및 폐암 임상 검체 1 ~ 6의 종양 영역 및 비종양 영역에서 FZD10 단백질 및 RNA의 발현을 각각 면역 조직 화학 염색 및 RealTime-PCR로 검출한 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4에 나타난 바와 같이, FZD10의 RNA의 높은 발현이 확인된 세포주 SYO-1의 마우스 Xenograft 종양으로부터 제작된 파라핀 절편에서는, 10A8H4G4 의해 염색 된 세포, 즉 FZD10 양성 세포가 검출되었지만, FZD10의 RNA의 발현량이 적었던 세포주 COLO201의 마우스 Xenograft 종양으로부터 제작된 파라핀 절편에서는 10A8H4G4 의해 염색된 세포, 즉 FZD10 양성 세포도 적었다. 이 결과는, 본 발명의 항 FZD10 항체(10A8H4G4)는, 면역 조직 화학 염색법에서 시료 중의 FZD10 단백질의 발현량과 상관한 검출 결과를 얻기 위해 유용한 도구임을 보여주고 있다.
또한, 종양 영역 특이적인 FZD10의 RNA의 발현이 확인된 폐암 임상 검체 5에서는 10A8H4G4 의해 염색된 세포, 즉 FZD10 양성 세포가 검출되었으나, 종양 영역 특이적인 FZD10의 RNA의 발현이 확인되지 않은 다른 폐암 임상 검체는 거의 염색되지 않고, FZD10 양성 세포가 거의 검출되지 않았다. 이 결과는, 10A8H4G4는 임상 검체에서도 특이적으로 FZD10 단백질을 검출할 수 있는 것을 보여주고 있다.
[실시예 4] 항 FZD10 모노클로널 항체의 가변 영역의 아미노산 배열 분석
본 발명의 항 FZD10 항체(10A8H4G4)의 가변 영역의 아미노산 배열을 분석하였다.
RNeasy mini kit(QIAGEN)을 이용하여, 총 RNA를 하이브리도마 10A8H4G4에서 추출하였다. Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen)을 이용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성용의 프라이머는 이하와 같다.
중쇄 3'프라이머 mIGCUniRv:
5'-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3'(SEQ ID NO: 16)
경쇄 3'프라이머 mIGKRv2:
5'-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3'(SEQ ID NO: 17)
5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen)를 이용하여 cDNA 말단에 dC의 폴리머를 부가하고, Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)을 이용하여 모노클로널 항체의 가변 영역을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 증폭하였다. 증폭용의 프라이머는 이하와 같다. 프라이머 배열 중의 염기 「I」는, 이노신을 나타낸다.
중쇄 5'및 경쇄 5'프라이머의 5'RACE Abridged Anchor Primer:
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3'(SEQ ID NO: 18)
중쇄 3'프라이머 mIGCUniRv2:
5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3'(SEQ ID NO: 19) 및
경쇄 3'프라이머 mIGKNesRv2:
5'-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3'(SEQ ID NO: 20).
PCR 산물을 pGEM-T Easy Vector(Promega)에 클로닝하였다. 삽입 절편 영역을 배열 결정하여, 10A8H4G4의 가변 영역(시그널 배열을 제외)의 핵산 배열을 결정하였다.
마우스 모노클로널 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 배열 및 핵산 배열은 이하와 같이 결정되었다.
10A8H4G4, 중쇄 가변 영역 아미노산 배열(시그널 배열을 제외) :
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 7)(SEQ ID NO : 10으로 표시된 핵산 배열에 의해 코딩된다)
10A8H4G4, 중쇄 가변 영역 핵산 배열 :
5'-
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTCTGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGCAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAAGAGCCTACTATGGTAATTACTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA-3'(SEQ ID NO: 10)
10A8H4G4, 경쇄 가변 영역 아미노산 배열(시그널 배열을 제외):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO: 8)(SEQ ID NO: 11로 표시된 핵산 배열에 의해 코딩된다)
10A8H4G4, 경쇄 가변 영역 핵산 배열:
5'-
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGAT-3'(SEQ ID NO: 11)
Kabat의 정의에 의해 결정되는 본 발명의 항체(10A8H4G4) CDR의 배열은 다음과 같다.
중쇄 CDR1(CDR-H1) : TSGLGVS(SEQ ID NO : 1);
중쇄 CDR2(CDR-H2) : HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQ ID NO : 2);
중쇄 CDR3(CDR-H3) : RAYYGNYYALDY(SEQ ID NO : 3);
경쇄 CDR1(CDR-L1) : KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO : 4);
경쇄 CDR2(CDR-L2) : WASTRKS(SEQ ID NO : 5); 및
경쇄 CDR3(CDR-L3) : QNDYSYPVT(SEQ ID NO : 6)
본 발명은, 임상 검체 등의 대상으로부터 단리한 시료의 FZD10 단백질을 높은 특이성으로 검출할 수 있는 항 FZD10 항체를 제작하는데 성공하였다. 본 발명의 항 FZD10 항체를 이용하여 민감하고 낮은 백그라운드에서 시료 중의 FZD10 단백질을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 FZD10를 발현하는 암 등의 FZD10 관련 질환의 진단에 유용하다. 또한, 본 발명의 항체는 시료 중의 FZD10의 발현량에 따른 FZD10의 검출이 가능한 것으로부터, FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상의 스크리닝(치료 전 진단)과 대상의 FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효의 판정(치료 후 진단)에서도 유용하다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> ANTI-FZD10 MONOCLONAL ANTIBODY AND USE THEREOF <130> ONC-A1605P <150> JP 2016-197881 <151> 2016-10-06 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 1 Thr Ser Gly Leu Gly Val Ser 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 2 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 3 Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 5 Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR <400> 6 Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Val Thr 1 5 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain variable region <400> 7 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Leu Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain variable region <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Ala Asp 115 <210> 9 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FZD10 fragment for immunogen <400> 9 Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly Lys Cys Gln Pro 1 5 10 15 Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn Met Thr Arg Met 20 25 30 Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala Ala Ile Gln Leu 35 40 45 His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His Gly His Leu Arg 50 55 60 Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr Glu Gln Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln Ala Arg Leu Lys 85 90 95 Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys Trp Pro Asp Ser Leu 100 105 110 Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn Tyr Leu Cys Met 115 120 125 Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr Arg Gly 130 135 140 <210> 10 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain variable region nucleic acid sequence <400> 10 caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggtc tgggtgtgag ctggattcgt 120 cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180 tataacccat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccag caaccaggta 240 ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaaga 300 gcctactatg gtaattacta tgctttggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 11 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain variable region nucleic acid sequence <400> 11 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 aaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccggtcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gggctgat 348 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized forward primer sequence for FZD10 <400> 12 gtgtgcagcc gtaggttaaa g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized reverse primer sequence for FZD10 <400> 13 gactgggcag ggatctcata 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized forward primer sequence for GAPDH <400> 14 acaacagcct caagatcatc ag 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized reverse primer sequence for GAPDH <400> 15 ggtccaccac tgacacgttg 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 3' primer sequence for VH <400> 16 ctgggaaggt gtgcacac 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 3' primer sequence for VL <400> 17 gttgttcaag aagcacacga c 21 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 5' primer sequence for VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is inosine <400> 18 ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 3' primer sequence for VH <400> 19 tggacaggga tccagagttc c 21 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized 3' primer sequence for VL <400> 20 cagatgttaa ctgctcactg gatgg 25 <210> 21 <211> 3288 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (485)..(2230) <300> <308> Genbank acc no. NM_0 <309> 2015-12-31 <313> 1-3288 <400> 21 cgagtcttct catcccggga cgcaaacctc gaaacagctg ccggctggtc ccggccgagg 60 ccggcgcagg gagggaggag ccgcccgggc tgtgggggcg ccgcgagctg ggccggcctc 120 ggtgtgcccg cgccgccagc ccgctccaga cgcgccacct gggcgctcca agaagaggcc 180 gaagtttgcc gcggccgtga gttggagctc gcgccgggcc gctgcgccgg gagctccggg 240 ggcttccctc gcttcccggt attgtttgca aactttgctg ctctccgccg cggcccccaa 300 ctcggcggac gccgggcgcg gagagccgag ccgggggcgc tgtgcgcagc gctcgggcca 360 ggccgggcgg gcatgggcgg gggcccgagc aggggtggag agccggggcc agcagcagcc 420 cgtgcccggg agcggcggcg ctgaggggcg cggagctccc cgcgaggaca cgtccaacgc 480 cagc atg cag cgc ccg ggc ccc cgc ctg tgg ctg gtc ctg cag gtg 526 Met Gln Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val Leu Gln Val 1 5 10 atg ggc tcg tgc gcc gcc atc agc tcc atg gac atg gag cgc ccg ggc 574 Met Gly Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly 15 20 25 30 gac ggc aaa tgc cag ccc atc gag atc ccg atg tgc aag gac atc ggc 622 Asp Gly Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly 35 40 45 tac aac atg act cgt atg ccc aac ctg atg ggc cac gag aac cag cgc 670 Tyr Asn Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg 50 55 60 gag gca gcc atc cag ttg cac gag ttc gcg ccg ctg gtg gag tac ggc 718 Glu Ala Ala Ile Gln Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly 65 70 75 tgc cac ggc cac ctc cgc ttc ttc ctg tgc tcg ctg tac gcg ccg atg 766 Cys His Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met 80 85 90 tgc acc gag cag gtc tct acc ccc atc ccc gcc tgc cgg gtc atg tgc 814 Cys Thr Glu Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys 95 100 105 110 gag cag gcc cgg ctc aag tgc tcc ccg att atg gag cag ttc aac ttc 862 Glu Gln Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe 115 120 125 aag tgg ccc gac tcc ctg gac tgc cgg aaa ctc ccc aac aag aac gac 910 Lys Trp Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp 130 135 140 ccc aac tac ctg tgc atg gag gcg ccc aac aac ggc tcg gac gag ccc 958 Pro Asn Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro 145 150 155 acc cgg ggc tcg ggc ctg ttc ccg ccg ctg ttc cgg ccg cag cgg ccc 1006 Thr Arg Gly Ser Gly Leu Phe Pro Pro Leu Phe Arg Pro Gln Arg Pro 160 165 170 cac agc gcg cag gag cac ccg ctg aag gac ggg ggc ccc ggg cgc ggc 1054 His Ser Ala Gln Glu His Pro Leu Lys Asp Gly Gly Pro Gly Arg Gly 175 180 185 190 ggc tgc gac aac ccg ggc aag ttc cac cac gtg gag aag agc gcg tcg 1102 Gly Cys Asp Asn Pro Gly Lys Phe His His Val Glu Lys Ser Ala Ser 195 200 205 tgc gcg ccg ctc tgc acg ccc ggc gtg gac gtg tac tgg agc cgc gag 1150 Cys Ala Pro Leu Cys Thr Pro Gly Val Asp Val Tyr Trp Ser Arg Glu 210 215 220 gac aag cgc ttc gca gtg gtc tgg ctg gcc atc tgg gcg gtg ctg tgc 1198 Asp Lys Arg Phe Ala Val Val Trp Leu Ala Ile Trp Ala Val Leu Cys 225 230 235 ttc ttc tcc agc gcc ttc acc gtg ctc acc ttc ctc atc gac ccg gcc 1246 Phe Phe Ser Ser Ala Phe Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Asp Pro Ala 240 245 250 cgc ttc cgc tac ccc gag cgc ccc atc atc ttc ctc tcc atg tgc tac 1294 Arg Phe Arg Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile Phe Leu Ser Met Cys Tyr 255 260 265 270 tgc gtc tac tcc gtg ggc tac ctc atc cgc ctc ttc gcc ggc gcc gag 1342 Cys Val Tyr Ser Val Gly Tyr Leu Ile Arg Leu Phe Ala Gly Ala Glu 275 280 285 agc atc gcc tgc gac cgg gac agc ggc cag ctc tat gtc atc cag gag 1390 Ser Ile Ala Cys Asp Arg Asp Ser Gly Gln Leu Tyr Val Ile Gln Glu 290 295 300 gga ctg gag agc acc ggc tgc acg ctg gtc ttc ctg gtc ctc tac tac 1438 Gly Leu Glu Ser Thr Gly Cys Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Tyr Tyr 305 310 315 ttc ggc atg gcc agc tcg ctg tgg tgg gtg gtc ctc acg ctc acc tgg 1486 Phe Gly Met Ala Ser Ser Leu Trp Trp Val Val Leu Thr Leu Thr Trp 320 325 330 ttc ctg gcc gcc ggc aag aag tgg ggc cac gag gcc atc gaa gcc aac 1534 Phe Leu Ala Ala Gly Lys Lys Trp Gly His Glu Ala Ile Glu Ala Asn 335 340 345 350 agc agc tac ttc cac ctg gca gcc tgg gcc atc ccg gcg gtg aag acc 1582 Ser Ser Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala Ile Pro Ala Val Lys Thr 355 360 365 atc ctg atc ctg gtc atg cgc agg gtg gcg ggg gac gag ctc acc ggg 1630 Ile Leu Ile Leu Val Met Arg Arg Val Ala Gly Asp Glu Leu Thr Gly 370 375 380 gtc tgc tac gtg ggc agc atg gac gtc aac gcg ctc acc ggc ttc gtg 1678 Val Cys Tyr Val Gly Ser Met Asp Val Asn Ala Leu Thr Gly Phe Val 385 390 395 ctc att ccc ctg gcc tgc tac ctg gtc atc ggc acg tcc ttc atc ctc 1726 Leu Ile Pro Leu Ala Cys Tyr Leu Val Ile Gly Thr Ser Phe Ile Leu 400 405 410 tcg ggc ttc gtg gcc ctg ttc cac atc cgg agg gtg atg aag acg ggc 1774 Ser Gly Phe Val Ala Leu Phe His Ile Arg Arg Val Met Lys Thr Gly 415 420 425 430 ggc gag aac acg gac aag ctg gag aag ctc atg gtg cgt atc ggg ctc 1822 Gly Glu Asn Thr Asp Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Arg Ile Gly Leu 435 440 445 ttc tct gtg ctg tac acc gtg ccg gcc acc tgt gtg atc gcc tgc tac 1870 Phe Ser Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala Thr Cys Val Ile Ala Cys Tyr 450 455 460 ttt tac gaa cgc ctc aac atg gat tac tgg aag atc ctg gcg gcg cag 1918 Phe Tyr Glu Arg Leu Asn Met Asp Tyr Trp Lys Ile Leu Ala Ala Gln 465 470 475 cac aag tgc aaa atg aac aac cag act aaa acg ctg gac tgc ctg atg 1966 His Lys Cys Lys Met Asn Asn Gln Thr Lys Thr Leu Asp Cys Leu Met 480 485 490 gcc gcc tcc atc ccc gcc gtg gag atc ttc atg gtg aag atc ttt atg 2014 Ala Ala Ser Ile Pro Ala Val Glu Ile Phe Met Val Lys Ile Phe Met 495 500 505 510 ctg ctg gtg gtg ggg atc acc agc ggg atg tgg att tgg acc tcc aag 2062 Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Ser Gly Met Trp Ile Trp Thr Ser Lys 515 520 525 act ctg cag tcc tgg cag cag gtg tgc agc cgt agg tta aag aag aag 2110 Thr Leu Gln Ser Trp Gln Gln Val Cys Ser Arg Arg Leu Lys Lys Lys 530 535 540 agc cgg aga aaa ccg gcc agc gtg atc acc agc ggt ggg att tac aaa 2158 Ser Arg Arg Lys Pro Ala Ser Val Ile Thr Ser Gly Gly Ile Tyr Lys 545 550 555 aaa gcc cag cat ccc cag aaa act cac cac ggg aaa tat gag atc cct 2206 Lys Ala Gln His Pro Gln Lys Thr His His Gly Lys Tyr Glu Ile Pro 560 565 570 gcc cag tcg ccc acc tgc gtg tga acagggctgg agggaagggc acaggggcgc 2260 Ala Gln Ser Pro Thr Cys Val *** 575 580 ccggagctaa gatgtggtgc ttttcttggt tgtgtttttc tttcttcttc ttcttttttt 2320 ttttttataa aagcaaaaga gaaatacata aaaaagtgtt taccctgaaa ttcaggatgc 2380 tgtgatacac tgaaaggaaa aatgtactta aagggttttg ttttgttttg gttttccagc 2440 gaagggaagc tcctccagtg aagtagcctc ttgtgtaact aatttgtggt aaagtagttg 2500 attcagccct cagaagaaaa cttttgttta gagccctccc taaatataca tctgtgtatt 2560 tgagttggct ttgctaccca tttacaaata agaggacaga taactgcttt gcaaattcaa 2620 gagcctcccc tgggttaaca aatgagccat ccccagggcc cacccccagg aaggccacag 2680 tgctgggcgg catccctgca gaggaaagac aggacccggg gcccgcctca caccccagtg 2740 gatttggagt tgcttaaaat agactccggc cttcaccaat agtctctctg caagacagaa 2800 acctccatca aacctcacat ttgtgaactc aaacgatgtg caatacattt ttttctcttt 2860 ccttgaaaat aaaaagagaa acaagtattt tgctatatat aaagacaaca aaagaaatct 2920 cctaacaaaa gaactaagag gcccagccct cagaaaccct tcagtgctac attttgtggc 2980 tttttaatgg aaaccaagcc aatgttatag acgtttggac tgatttgtgg aaaggagggg 3040 ggaagaggga gaaggatcat tcaaaagtta cccaaagggc ttattgactc tttctattgt 3100 taaacaaatg atttccacaa acagatcagg aagcactagg ttggcagaga cactttgtct 3160 agtgtattct cttcacagtg ccaggaaaga gtggtttctg cgtgtgtata tttgtaatat 3220 atgatatttt tcatgctcca ctattttatt aaaaataaaa tatgttcttt agtttgctgc 3280 taaaaaaa 3288 <210> 22 <211> 581 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Gln Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val Leu Gln Val Met Gly 1 5 10 15 Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly 20 25 30 Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn 35 40 45 Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala 50 55 60 Ala Ile Gln Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His 65 70 75 80 Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr 85 90 95 Glu Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln 100 105 110 Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys Trp 115 120 125 Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn 130 135 140 Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr Arg 145 150 155 160 Gly Ser Gly Leu Phe Pro Pro Leu Phe Arg Pro Gln Arg Pro His Ser 165 170 175 Ala Gln Glu His Pro Leu Lys Asp Gly Gly Pro Gly Arg Gly Gly Cys 180 185 190 Asp Asn Pro Gly Lys Phe His His Val Glu Lys Ser Ala Ser Cys Ala 195 200 205 Pro Leu Cys Thr Pro Gly Val Asp Val Tyr Trp Ser Arg Glu Asp Lys 210 215 220 Arg Phe Ala Val Val Trp Leu Ala Ile Trp Ala Val Leu Cys Phe Phe 225 230 235 240 Ser Ser Ala Phe Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Asp Pro Ala Arg Phe 245 250 255 Arg Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile Phe Leu Ser Met Cys Tyr Cys Val 260 265 270 Tyr Ser Val Gly Tyr Leu Ile Arg Leu Phe Ala Gly Ala Glu Ser Ile 275 280 285 Ala Cys Asp Arg Asp Ser Gly Gln Leu Tyr Val Ile Gln Glu Gly Leu 290 295 300 Glu Ser Thr Gly Cys Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Tyr Tyr Phe Gly 305 310 315 320 Met Ala Ser Ser Leu Trp Trp Val Val Leu Thr Leu Thr Trp Phe Leu 325 330 335 Ala Ala Gly Lys Lys Trp Gly His Glu Ala Ile Glu Ala Asn Ser Ser 340 345 350 Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala Ile Pro Ala Val Lys Thr Ile Leu 355 360 365 Ile Leu Val Met Arg Arg Val Ala Gly Asp Glu Leu Thr Gly Val Cys 370 375 380 Tyr Val Gly Ser Met Asp Val Asn Ala Leu Thr Gly Phe Val Leu Ile 385 390 395 400 Pro Leu Ala Cys Tyr Leu Val Ile Gly Thr Ser Phe Ile Leu Ser Gly 405 410 415 Phe Val Ala Leu Phe His Ile Arg Arg Val Met Lys Thr Gly Gly Glu 420 425 430 Asn Thr Asp Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Arg Ile Gly Leu Phe Ser 435 440 445 Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala Thr Cys Val Ile Ala Cys Tyr Phe Tyr 450 455 460 Glu Arg Leu Asn Met Asp Tyr Trp Lys Ile Leu Ala Ala Gln His Lys 465 470 475 480 Cys Lys Met Asn Asn Gln Thr Lys Thr Leu Asp Cys Leu Met Ala Ala 485 490 495 Ser Ile Pro Ala Val Glu Ile Phe Met Val Lys Ile Phe Met Leu Leu 500 505 510 Val Val Gly Ile Thr Ser Gly Met Trp Ile Trp Thr Ser Lys Thr Leu 515 520 525 Gln Ser Trp Gln Gln Val Cys Ser Arg Arg Leu Lys Lys Lys Ser Arg 530 535 540 Arg Lys Pro Ala Ser Val Ile Thr Ser Gly Gly Ile Tyr Lys Lys Ala 545 550 555 560 Gln His Pro Gln Lys Thr His His Gly Lys Tyr Glu Ile Pro Ala Gln 565 570 575 Ser Pro Thr Cys Val 580

Claims (15)

  1. SEQ ID NO : 1로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR1;
    SEQ ID NO : 2로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR2; 및
    SEQ ID NO : 3으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR3
    를 포함하는 중쇄 가변 영역 및
    SEQ ID NO : 4로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR1;
    SEQ ID NO : 5로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR2; 및
    SEQ ID NO : 6으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 CDR3
    를 포함하는 경쇄 가변 영역
    의 어느 하나 또는 모두를 포함하는, FZD10 단백질 또는 이의 부분 펩티드에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    SEQ ID NO : 7로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO : 8로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 경쇄 가변 영역의 어느 하나 또는 모두를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    SEQ ID NO : 9로 표시되는 아미노산 배열로부터 이루어진 폴리펩티드를 특이 적으로 인식하는, 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    FZD10에의 특이적인 결합에 대해, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 항체와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    친화성 표지, 효소 표지, 방사성 동위 원소 표지 또는 형광 표지와 결합하고 있는, 항체 또는 이의 항원 결합성 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 포함하며, FZD10 관련 질환을 진단, FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효를 판정, 또는 FZD10 저해제에 의한 치료 효과의 높은 대상을 스크리닝하기 위한 시약.
  8. 이하의 단계를 포함하는, 대상에 있어서의 FZD10 관련 질환 또는 해당 질환의 발병 소인을 진단하는 방법:
    (a) 해당 대상에서 단리한 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계;
    (b) 해당 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 단계; 및
    (c) 해당 시료 중의 FZD10 단백질 수준을 대조로 비교하는 단계로서, 대조와 비교하여 FZD10 단백질 수준이 높은 경우에 해당 대상이 해당 질환을 앓고 있거나 또는 이의 발병 위험을 가지는 것을 나타내는 단계.
  9. 상기 FZD10 관련 질환이 FZD10를 발현하고 있는 암인, 제7항에 기재된 시약 또는 제8항에 기재된 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 암은 활막 육종, 폐암, 식도암, 결장직장암(대장암), 위암, 만성 골수성 백혈병(CML)과 급성 골수성 백혈병(AML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시약 또는 방법.
  11. 이하의 단계를 포함하는, 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 방법:
    (a) 대상으로부터 단리한 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 해당 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 단계.
  12. 이하의 단계를 포함하는, 대상에 있어서의 FZD10 저해제에 의한 치료 후의 약효를 판정하는 방법:
    (a) 해당 대상으로부터 단리한 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계;
    (b) 해당 항체 또는 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 단계;
    (c) 해당 시료 중의 FZD10 단백질 수준을 약제 투여 전의 발현 수준과 비교하는 단계로서, 약제 투여 전과 비교하여 FZD10 단백질 수준이 낮은 경우에 해당 대상에 있어서의 약효가 있었던 것으로 나타내는 단계.
  13. 이하의 단계를 포함하는, FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 대상을 스크리닝하는 방법:
    (a) 해당 대상으로부터 단리한 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 접촉시키는 단계;
    (b) 해당 항체 또는 이의 항원 결합성 단편과 해당 시료와의 결합을 검출하는 것에 의해, 해당 시료 중의 FZD10 단백질을 검출하는 단계;
    (c) 해당 시료 중의 FZD10 단백질 수준을 대조로 비교하는 단계로서, 대조와 비교하여 FZD10 단백질 수준이 비슷하거나 그보다 높은 경우, 해당 대상에 있어서의 FZD10 저해제에 의한 치료 효과가 높은 것으로 나타내는 단계.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료가 상기 대상으로부터 단리한 세포 또는 조직인 방법.
  15. 이하의 공정을 포함하는, FZD10 단백질 또는 이의 부분 펩티드에 결합할 수있는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편을 제조하는 방법:
    (a) 제6항에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 해당 세포의 배양물 또는 배양 배지로부터 상기 항체를 회수하는 단계.
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