KR20190045829A - Method for improving transdermal delivery of exosome and its application - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 엑소좀의 경피 투과 증진 방법 및 이의 응용에 관한 것이다.The present invention relates to a transcutaneous permeation enhancing method of exosome and its application.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 엑소좀의 경피 투과 증진 방법을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법 또는 피부질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. In addition, the present invention relates to a cosmetic method or a method for treating a skin disease by controlling the condition of mammalian skin except for therapeutic use by using the transcutaneous permeation enhancing method of exosome as described above.
피부는 표피, 진피, 피하지방의 3층 구조로 되어 있는데, 피부의 가장 바깥에 위치한 표피의 각질층은 피부의 수분 증발을 억제하고, 피부장벽 역할을 한다. 그러나 각질층의 피부 장벽은 기능성 화장품이나 의약 외품을 피부에 도포시 유효성분의 침투를 방해하여 기능성 화장품이나 의약 외품의 효능을 떨어뜨리는 문제가 있다.The skin has a three-layer structure of epidermis, dermis, and subcutaneous fat. The stratum corneum of the epidermis, which is located at the outermost part of the skin, suppresses moisture evaporation of the skin and acts as a skin barrier. However, the skin barrier of the stratum corneum has a problem of impairing the penetration of the active ingredient when the functional cosmetic or the medicinal product is applied to the skin, thereby deteriorating the efficacy of the functional cosmetic or the medicinal product.
피부 표면에 도포되는 유효성분이 피부 장벽을 용이하게 통과하게 하고 피부 내부 깊숙이 전달하기 위한 도구가 경피전달시스템(Transdermal Delivery System)이다. 대표적으로 알려진 경피전달시스템으로는 리포좀이 있다. 리포좀은 세포막 또는 각질층의 세포 간 지질과 구조적으로 유사한 지질 이중층으로 구성되어 있어 세포막과 융합하여 리포좀 내부의 유효성분을 효과적으로 피부 내부로 전달할 수 있다. 그러나 인공적으로 합성된 리포좀은 안정성 문제 및 피부 침투의 한계가 있다.A transdermal delivery system is an effective ingredient applied to the surface of the skin to easily pass through the skin barrier and deliver it deeply into the skin. Typically known transdermal delivery systems include liposomes. Liposomes are composed of lipid bilayers that are structurally similar to cell membranes or intercellular lipids of the stratum corneum, so they can be fused with cell membranes, effectively transferring the active ingredients inside the liposomes into the skin. Artificially synthesized liposomes, however, have limited stability and limited skin penetration.
피부 흡수율을 높이고 피부 침투 시 피부 각질층을 잘 투과할 수 있도록 탄력적으로 변형이 쉬운 소포체를 만들고자 하는 시도가 이루어졌는데, 그 예가 에토좀이다. 에토좀은 피부 투과 증진제로 알려진 에탄올에 인지질을 용해시켜 만든다. 에토좀의 에탄올은 피부 각질층의 세포간 지질막을 약화시켜 유효성분의 피부 흡수율을 높여주며, 소포체 자체의 막을 유연하게 만든다. 이러한 특징으로 에토좀은 유효성분의 피부 내부 전달에 있어 효과적이고 더 깊숙한 곳까지 유효성분을 전달할 수 있다. 그러나 에토좀 역시 나노입자의 경화로 인한 경시적인 입자의 합일, 층분리 현상 등의 문제점이 있다.An attempt has been made to create an elastomer that is flexible and easy to deform so as to increase the skin absorption rate and to penetrate the horny layer of the skin when the skin penetrates, for example an etosome. Ethosomes are made by dissolving phospholipids in ethanol known as skin permeation enhancers. Ethanol ethanol weakens the intercellular lipid membranes of the skin's horny layer, increasing the skin's absorption rate of the active ingredient and making the membrane of the endoplasmic reticulum itself flexible. This feature allows the etosome to deliver effective ingredients to the deeper and deeper part of the active ingredient in the skin. However, ethosomes also have problems such as agglomeration of particles due to curing of nanoparticles and layer separation phenomenon.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. Recently, there have been reported studies on the secretion of various bioactive factors that regulate cell behavior, and in particular, exosome (exosome), which has intercellular signal transduction, , And the research on the composition and function thereof is actively under way.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.Cells release various membrane-type vesicles in the extracellular environment, and these release vesicles are commonly referred to as extracellular vesicles (EVs). The extracellular endoplasmic reticulum is sometimes referred to as cell membrane-derived endoplasmic reticulum, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes and, in some cases, differentiated from exosomes.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579). Exosome is an endoplasmic reticulum of several tens to several hundreds of nanometers in size, composed of double lipid membranes identical to the cell membrane structure, and contains proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosomal cargo inside. Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differentially regulated by the environment of the secretory cells. Exosome is an intercellular signaling mediator that is secreted by the cell, and various cell signals transmitted through it regulate cell behavior including activation, growth, migration, differentiation, de-differentiation, apoptosis, and necrosis of target cells It is known. Exosomes contain specific genetic material and bioactivity factors depending on the nature and condition of the derived cells. The proliferating stem cell-derived exosomes regulate cell behavior such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflect the characteristics of stem cells involved in tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다. 특히, 엑소좀의 피부 침투 능력 향상과 관련한 응용기술의 개발은 미진한 상황이다. However, in spite of various studies such as the possibility of treatment of specific diseases using exosome, there have been many studies to develop a new formulation capable of stably maintaining and storing exosome, various medical treatments Or beauty technology has not received much attention. Particularly, development of application technology related to improvement of skin penetration ability of exosome is insufficient.
본 발명자들은 엑소좀의 새로운 응용분야 및 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 엑소좀의 경피 투과 증진 방법 및 이의 응용 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors have intensively studied the new application field of exosomes and medical or cosmetic techniques, and developed a transepithelial permeation enhancing method and its application technology of exosome to complete the present invention.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.It should be understood, however, that the foregoing description of the background art is merely for the purpose of promoting an understanding of the background of the present invention, and not as an admission that it can be used as the " prior art "
본 발명의 목적은 엑소좀의 경피 투과 증진 방법 및 이의 응용을 제공하는데 있다. It is an object of the present invention to provide a method for enhancing transdermal permeation of exosomes and their application.
본 발명의 다른 목적은 상기 엑소좀의 경피 투과 증진 방법을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법 또는 피부질환을 치료하는 방법을 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a cosmetic method or a method for treating a skin disease by controlling the state of mammalian skin except for therapeutic use by using the transcutaneous permeation enhancing method of the exosome.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 엑소좀의 경피 투과 증진 방법, 미용방법 및/또는 치료방법에 적합한 엑소좀의 경피 전달용 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 이러한 엑소좀의 경피 전달용 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 도포하거나 침적하기 위한 엑소좀 조성물을 제공하는데 있다. It is still another object of the present invention to provide a mask pack, mask sheet or patch for transdermal transdermal delivery of exosomes suitable for transcutaneous permeation enhancement, cosmetic and / or therapeutic methods of the exosome, To provide an exosome composition for applying or depositing a mask sheet or patch.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.However, the above-described problems of the present invention are illustrative and not intended to limit the scope of the present invention. Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포유동물의 피부에 국소적으로 도포하는 단계와, 상기 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 단계를 포함하는 엑소좀의 경피 투과 증진 방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a method for treating a skin cancer, comprising the steps of topically applying a composition comprising an exosome as an active ingredient to the skin of a mammal, Contacting or adhering to the skin of the mammal. ≪ Desc /
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.As used herein, the term " exosomes " refers to an endoplasmic reticulum of several tens to several hundred nanometers (preferably about 30 to 200 nm) in size, consisting of double lipid membranes identical in structure to the cell membrane The particle size of the exosome can be varied according to the cell type, the separation method and the measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, DOI 10.1007 / s00216-015-8535-3). Exosomes contain proteins called exosomal cargo (cargo), nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.). Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differentially regulated by the environment of the secretory cells. Exosome is an intercellular signaling mediator that is secreted by the cell, and various cell signals transmitted through it regulate cell behavior including activation, growth, migration, differentiation, de-differentiation, apoptosis, and necrosis of target cells It is known.
본 명세서에서 용어, "생물학적 용액"은 생물기원의 액체 용액으로서 엑소좀이 분산, 현탁, 침전, 부유 또는 혼합되어 있는 용액을 의미하고, 예를 들어 세포 배양액, 세포 배양 상청액, 줄기세포 배양액, 줄기세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 제대혈, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 태반 추출액 및 골수 흡입물 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물 기원의 용액을 배제하는 것이 아님은 물론이다. "생물학적 용액"은 엑소좀을 방출 및/또는 분비시키는 조건 하에서 배양 또는 인큐베이션될 수 있고, 냉동 및 해동될 수도 있다.As used herein, the term " biological solution " means a liquid solution of biogenic origin, in which the exosome is dispersed, suspended, precipitated, suspended or mixed, and includes, for example, a cell culture solution, a cell culture supernatant, Cell culture supernatant, whole blood, serum, cord blood, plasma, multiple fluid, brain and cerebrospinal fluid, placenta extract, and bone marrow aspirate. However, the present invention is not limited thereto, and it is needless to say that it does not exclude various biological origin solutions such as various animals, plants, bacteria, fungi, algae and the like. A " biological solution " may be cultured or incubated under conditions that release and / or secrete exosomes, and may be frozen and thawed.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등의 세포, 바람직하게는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. As used herein, the term " exosome " is intended to mean an exosome that is secreted from cells of various animals, plants, bacteria, fungi, algae and the like, preferably stem cells, (E. G., Exosome-like vesicles) having a nano-sized bezacl structure and a composition similar to exosome.
그러나 본 발명에서 사용되는 엑소좀은 피부에 적용가능하고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.However, it is needless to say that the exosome used in the present invention can be applied to skin and various exosomes which are used in the art or can be used in the future can be used as long as they do not cause adverse effects on the human body. Therefore, it should be understood that the exosome isolated according to the separation method of the following embodiments should be understood as an example of exosome that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
본 명세서에서 용어, "피부 상태의 개선"이란 피부의 외관 및/또는 느낌에 있어 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화로서, 피부 조직 재생을 포함하며, 예를 들어 노화와 관련된 피부 상태를 개선하거나 피부 노화를 예방하거나, 또는 피부 상태가 병적 상태인 것을 완화, 개선 내지는 정상 상태로 회복시켜 주는 것을 포함한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, "피부 상태의 개선"은 피부처짐, 피부 주름, 피부 탄력감소, 잔주름, 주름살, 거칠고 깊은 주름, 균열, 융기(bumps) 및 모공 확대 등의 완화, 개선 또는 제거; 피부의 두꺼워짐 감소(예를 들어, 피부의 표피층, 진피층, 피하층, 손발톱 및 모간의 각질층 제거); 기능성 피부 엘라스틴의 손실, 손상 및/또는 불활성화로 인한 피부 또는 모발 탄력성 손실의 방지; 셀룰라이트의 감소; 창백함, 기미, 주근깨, 잡티, 피부, 모발 또는 손발톱에 대한 변색, 예를 들어 흑자, 눈밑 다크서클, 홍반, 점, 까페오레반점, 베커반점, 오타모반, 색소성 모반, 표피모반, 멜라닌 색소반점, 색소침착, 모세혈관 확장증 또는 거미상 혈관에 의해 야기된 변색 등의 완화, 개선 또는 제거; 피부 건조 및 푸석푸석함(brittleness)의 개선, 완화 또는 방지를 포함할 수 있다.As used herein, the term " improvement of skin condition " is a positive change visually and / or tactually perceptible to the appearance and / or feel of the skin, including skin tissue regeneration, Improving the skin condition, preventing aging of the skin, or restoring the skin condition to a mild condition, an improvement condition or a normal condition. As an example that does not limit the present invention, the term " improvement of skin condition " refers to alleviation, improvement or elimination of skin defects, skin wrinkles, reduced skin elasticity, wrinkles, wrinkles, rough and deep wrinkles, cracks, bumps, ; Skin thickening (e.g., removal of the epidermis, dermis, subcutaneous layer, nail and stratum corneum of the skin); Prevention of skin or hair elasticity loss due to loss, damage and / or inactivation of functional skin elastin; Reduction of cellulite; Discoloration of pale skin, spots, freckles, dullness, skin, hair or nails, such as blackness, dark circles under eyes, erythema, dots, café aureus, becker spots, osteoblast, pigmentary nevus, epidermal nevus, melanin pigment spot Alleviating, improving or eliminating pigmentation, capillary vasodilation or discoloration caused by spider blood vessels; Alleviating or preventing skin dryness and brittleness.
본 명세서에서 용어, "피부 미용"은 피부처짐, 움푹 들어간 뺨, 패인 눈, 피부 주름, 피부 탄력감소, 잔주름, 모공 확대 등의 피부노화를 감소, 완화 또는 개선시키는 것 또는 이러한 피부노화에 의해 나빠진 피부 상태를 정상상태로 회복시키는 것; 피부 박피, 피부 재생, 미백, 주근깨, 다크써클, 기미, 문신, 여드름, 엘라스틴층 자국, 튼살, 흉터, 확대된 모공, 창백함, 잡티, 흑자, 눈밑 다크서클, 홍반, 점, 까페오레반점, 베커반점, 오타모반, 색소성 모반, 표피모반, 멜라닌 색소반점, 색소침착 등의 다양한 피부 결점들의 제거 내지는 보정; 탈모 예방, 발모 촉진, 두피 관리, 셀룰라이트 감소, 얼굴 축소, 윤곽교정, 연부조직의 결함 보정, 조직확대, 볼륨업(volume-up), 피부팽만, 피부 보습 및 진정(soothing), 홍조 및 혈관확장증의 감소 내지 개선 등을 의미한다. 그러나, 본 발명에 있어서 "피부 미용"은 전술한 것에 제한되지 않고 다양한 피부결점들을 제거 내지는 보정하는 것을 포함하는 것임은 물론이다.As used herein, the term " skin aesthetic " is intended to reduce, alleviate, or ameliorate skin aging such as skin sagging, dented cheeks, depressed eyes, wrinkles, reduced skin elasticity, Restoring the skin condition to a normal state; Skin, skin regeneration, skin whitening, freckles, dark circles, spots, tattoos, acne, elastin layer marks, stretch marks, scarring, enlarged pores, pale, spots, black circles, dark circles, erythema, Removal or correction of various skin defects such as spots, osteoblasts, pigmented nevi, epidermal nevus, melanin pigment spots, and pigmentation; Hair loss enhancement, scalp management, cellulite reduction, facial reduction, contour correction, soft tissue defect correction, tissue enlargement, volume-up, skin swelling, skin moisturizing and soothing, redness and blood vessels Reduction or improvement of diabetes mellitus. However, in the present invention, the term " skin beauty " is not limited to the above, and includes, for example, removing or correcting various skin imperfections.
본 명세서에서 용어, "피부질환 치료"는 안면 홍조, 기미, 주근깨, 잡티, 흑자, 눈밑 다크서클, 홍반, 점, 까페오레반점, 베커반점, 오타모반, 색소성 모반, 표피모반, 멜라닌 색소반점, 색소침착 등의 색소성 피부 병변을 제거, 완화 또는 개선시키는 것 또는 이러한 색소성 피부 병변에 의해 나빠진 피부 상태를 정상상태로 회복시키는 것; 화염상 모반, 모세혈관 확장증, 주사, 혈관종, 포도색모반 등과 같은 혈관성 피부 병변을 제거, 완화 또는 개선시키는 것 또는 이러한 혈관성 피부 병변에 의해 나빠진 피부 상태를 정상상태로 회복시키는 것; 접촉피부염, 자극 접촉피부염, 알레르기 접촉피부염, 광독성 및 광알레르기 접촉피부염, 접촉 두드러기 증후군, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 자가감작 피부염, 자가면역 프로게스테론 피부염, 울체 피부염, 여드름 또는 습진과 같은 다양한 피부염을 완화, 개선 또는 정상상태로 회복시켜 주는 것; 발작성 가려움증, 동계 가려움증, 항문 가려움증, 외음 가려움증, 음낭 가려움증, 수인성 가려움증, 두피 가려움증, 코 가려움증, 목 가려움증, 만성단순태선, 가려움발진, 발모벽, 신경성 긁은 상처, 피부를 침범하는 행동장애 및 기생충증망상 등의 정신피부질환과 같은 다양한 가려움증을 완화, 개선 또는 정상상태로 회복시켜 주는 것; 피부경화증을 포함하는 다양한 섬유성 피부 질환을 완화, 개선 또는 정상상태로 회복시켜 주는 것 등을 포함한다. 그러나, 본 발명에 있어서 "피부질환 치료"는 전술한 것에 제한되지 않고 다양한 피부질환들의 병적상태를 완화, 개선 내지는 정상상태로 회복시켜 주는 것을 포함하는 것임은 물론이다.As used herein, the term " treatment of skin diseases " refers to the treatment of facial flushing, spots, freckles, dullness, dark circles, dark circles, erythema, dots, café au lait, becker dots, Or ameliorating or alleviating pigmented skin lesions such as pigmentation, or restoring skin conditions that are deteriorated by such pigmented skin lesions to a normal state; Relieving, alleviating or ameliorating vascular skin lesions such as flame nevus, capillary vasodilatation, injection, hemangiomas, vesicular blebs, etc., or to restore normalized skin conditions deteriorated by such vascular skin lesions; Such as contact dermatitis, irritant contact dermatitis, allergic contact dermatitis, phototoxic and photoallergic contact dermatitis, contact urticaria, atopic dermatitis, seborrheic dermatitis, self-sensitizing dermatitis, autoimmune progesterone dermatitis, dermatitis dermatitis, acne or eczema , Improving or restoring normal state; Itching rash, itching rash, hairy wall, nervous scraping wound, behavioral disorders involving the skin, and parasitic warts, itching, itchy itchiness, itching in the winter, itching in the face, itching in the scrotum, itching in the scrotum, watery itching, scalp itching, nasal itching, Alleviating, ameliorating, or restoring a variety of itching, such as mental dermatological conditions, such as diarrhea; Alleviating, ameliorating or restoring a variety of fibrotic skin diseases, including skin sclerosis, to a normal state, and the like. However, in the present invention, " treatment for skin diseases " is not limited to the above-mentioned, and it is of course that the pathological condition of various skin diseases is alleviated, ameliorated or restored to a normal state.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 경피 투과 증진 방법은 (a) 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 준비하는 단계와, (b) 상기 조성물을 포유동물의 피부에 국소적으로 도포하는 단계와, (c) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 단계를 포함한다.The method for enhancing transdermal permeability of an exosome according to an embodiment of the present invention comprises the steps of: (a) preparing a composition comprising an exosome as an active ingredient; (b) locally applying the composition to the skin of a mammal; (c) contacting or adhering the mask pack, mask sheet or patch with the composition applied or immersed to the skin of the mammal.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 경피 투과 증진 방법은, (d) 상기 (c) 단계 이후에 상기 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. (D) removing the mask pack, mask sheet or patch from the skin of the mammal after the step (c), and then applying the composition to the skin of the mammal The method comprising the steps of:
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 경피 투과 증진 방법은 상기 (a) 단계에 있어서 상기 엑소좀을 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 경피 투과 증진 방법은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종을 상기 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다.The method for enhancing transdermal permeability of exosome according to one embodiment of the present invention is characterized in that in step (a), the exosome is hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or hyaluronic acid gel The method comprising the steps of: Alternatively, the method for enhancing transdermal permeability of an exosome according to one embodiment of the present invention may be a method of enhancing transdermal permeation of at least one of hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (e.g., sodium hyaluronate) or hyaluronic acid gel, The method comprising the step of applying the coating composition to at least one surface of the sheet or patch.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 경피 투과 증진 방법에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.In the transcutaneous permeation enhancement method of exosome according to one embodiment of the present invention, the kind of the hydrogel is not limited, but it may be a hydrogel obtained by dispersing a gelated polymer in a polyhydric alcohol. Wherein the gel polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cacao gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum And the polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol and glycerin.
본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득될 수 있다: (a) 생물학적 용액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 생물학적 용액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 생물학적 용액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계.As one illustrative example of the invention, the exosome can be obtained by performing the following steps: (a) adding trehalose to the biological solution, (b) adding the trehalose (C) separating the exosomes from the filtered biological solution using TFF (Tangential Flow Filtration), and (d) removing the buffer used for desalting and buffer exchange (diafiltration). , Adding trehalose to the solution, and performing desalting and buffer exchange (diafiltration) on the separated exosome using TFF (Tangential Flow Filtration) using the buffer solution to which the trehalose is added .
한편, 상기 (d) 단계에서 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하면, 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 효과적으로 수득할 수 있다(도 6 참조). 본 발명에서는 TFF에 의한 엑소좀 분리 전의 사전 여과 과정((b) 단계)과 엑소좀 분리 후 TFF에 의한 탈염 및 버퍼교환 과정((d) 단계)에서 트레할로우스를 사용하는 것에 의해 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있다. 한편, 본 발명에 있어서 트레할로오스는 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀을 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다.On the other hand, when trehalose is added to the buffer solution used for desalting and diafiltration in step (d), exosomes having a uniform particle size distribution and high purity can be effectively obtained (see FIG. 6 ). In the present invention, trehalose is used in the pre-filtration step (step (b) before separation of exosome by TFF) and desalting by TFF and buffer exchange step ((d) It is possible to obtain an exosome having a uniform size distribution with a high yield. On the other hand, trehalose in the present invention imparts a function of efficiently separating exosomes from impurities such as cellular debris, waste products, proteins and macromolecules.
상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행할 수 있다. 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행할 수 있다. 또한, TFF를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 ㎛ TFF 필터를 사용할 수 있다. 상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다. The desalting and buffer exchange can be performed continuously or intermittently. Desalting and buffer exchange can be carried out using a buffer solution having a volume of at least 4 times, preferably 6 times to 10 times, more preferably 12 times the starting volume. For TFF, a molecular weight cutoff (MWCO) of 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da or 750,000 Da TFF filter or 0.05 占 퐉 TFF filter can be used. The step (c) may further include a step of concentrating the solution to a volume of 1/100 to 1/25 using TFF (Tangential Flow Filtration).
본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 상기 생물학적 용액은 줄기세포 배양액일 수 있다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.As one example that does not limit the present invention, the biological solution may be a stem cell culture solution. The type of the stem cell is not limited, but may be a mesenchymal stem cell, for example, a fat, a bone marrow, an umbilical cord or a cord blood-derived stem cell, more preferably a fat-derived stem cell. The type of the adipose-derived stem cell is not limited as long as it does not cause a risk of infection by a pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but it may be preferably a human adipose-derived stem cell.
그러나 본 발명에서 사용되는 엑소좀은 전술한 바와 같은 분리방법에 따라 수득된 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.However, the exosome used in the present invention is not limited to the exosome obtained according to the separation method described above, and it is needless to say that various exosomes which are used in the art or can be used in the future can be used. It is to be understood that the exosome isolated according to the above separation method should be understood as an example of exosome that can be used in the composition of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 경피 전달용 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 도포하거나 침적하기 위한 조성물은, 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물과, 상기 엑소좀이 담지되는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종을 포함한다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명들에서 예시된 것일 수 있다.The composition for applying or immersing the mask pack, mask sheet or patch for transdermal transdermal delivery of exosome according to one embodiment of the present invention comprises a composition containing exosome as an active ingredient and a composition containing the exosome-carrying hydrogel, hyaluronic acid , Hyaluronic acid salt (e.g., sodium hyaluronate), or hyaluronic acid gel. The type of the hydrogel is not limited, but it may preferably be a hydrogel obtained by dispersing a gelated polymer in a polyhydric alcohol. The gelled polymer and the polyhydric alcohol may be exemplified in the above description.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 경피 전달용 마스크팩, 마스크시트 또는 패취는 상기 엑소좀의 경피 전달용 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 도포하거나 침적하기 위한 조성물이 침적되거나 적어도 일면(一面)에 도포되어 있다. The mask pack, mask sheet or patch for transdermal delivery of exosomes according to one embodiment of the present invention is characterized in that a composition for applying or immersing the mask pack, mask sheet or patch for transdermal delivery of the exosome is immersed or at least on one surface Respectively.
본 발명의 다른 구체예는 상기 엑소좀의 경피 투과 증진 방법을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부 재생, 주름 제거 또는 개선, 미백, 흉터 제거, 피부 텍스쳐(skin texture) 개선, 홍조 감소, 피부의 상태를 촉촉하게 하거나 매끈하게 하는 것, 또는 피부를 긁거나 문질러서 나빠진 피부 상태의 개선일 수 있다.Another embodiment of the present invention provides a cosmetic method for regulating the condition of mammalian skin except therapeutic use by using the transcutaneous permeation enhancement method of the exosome. In the cosmetic method of the present invention, conditioning of the skin means improvement of the condition of the skin and / or prevention of the condition of the skin, and improvement of the condition of the skin means visual and / Or a tactile perceptible positive change. For example, skin condition improvement may include skin regeneration, wrinkle removal or improvement, whitening, scar removal, skin texture improvement, redness reduction, moistening or smoothing of the condition of the skin, Rubbing can be an improvement of the deteriorated skin condition.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 엑소좀의 경피 투과 증진 방법을 이용하여, 피부질환을 치료하는 방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a method for treating a skin disease using the transcutaneous permeation enhancement method of the exosome.
본 발명의 엑소좀의 경피 투과 증진 방법은 기능성 화장품이나 의약 외품으로서의 기능을 가질 수 있는 엑소좀의 피부 적용을 간편하게 하고 엑소좀이 피부 장벽을 효율적으로 통과하게 하는 효과가 있다. 즉, 본 발명은 엑소좀의 국소적 피부 도포와, 엑소좀을 포함하는 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 피부 접촉 또는 부착의 조합에 의해 엑소좀의 피부 적용을 간편하게 하고 엑소좀이 피부 장벽을 효율적으로 통과하게 하는 효과가 있다.The method of enhancing transdermal permeability of exosome of the present invention has the effect of facilitating skin application of exosomes which can function as functional cosmetics or medicines, and allowing exosomes to efficiently pass skin barrier. That is, the present invention simplifies skin application of exosomes by combination of local skin application of exosomes and skin contact or attachment of a mask pack, mask sheet or patch comprising exosome, To pass through.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.On the other hand, the scope of the present invention is not limited by the above-mentioned effects.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀을 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액, 예를 들어 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 생물학적 용액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "생물학적 용액, 예를 들어 줄기세포 배양액(CM) 단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 4A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 4D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 4E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "도 6A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6B"는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "도 6D"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "도 6E"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 8은 PKH67로 염색된 엑소좀을 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 9는 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 10은 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지와, 이로부터 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a flow chart illustrating a process for separating and purifying exosomes in a method for producing exosomes from a biological solution according to one embodiment of the present invention.
2 is a graph showing a result of measuring a relative amount of protein contained in a solution for each step of preparing a biological solution, for example, a stem cell culture solution, according to an embodiment of the present invention . The ratio of the total amount of protein in each step was expressed by the relative ratio of total protein amount to the total biological solution. The experimental results show the results obtained in two different batches, respectively.
FIG. 3 shows the results of measuring the productivity and purity of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention. The productivity of exosomes was calculated as "the number of particles of exosome obtained per mL of biological solution, eg, a stem cell culture (CM)," and the purity of exosome was calculated as "the number of exosomes per microgram of protein contained in the final fraction Quot; number of particles " The experimental results show the results obtained in five different batches.
FIG. 4 shows the results of physical property analysis of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention. 4A shows particle size distribution and number of particles by TRPS (tunable resistive pulse sensing) analysis. &Quot; Figure 4B " shows particle size distribution and number of particles by NTA (nanoparticle tracking analysis) analysis. 4C " shows particle images by transmission electron microscopy (TEM) according to magnification. 4D " shows the Western blot results of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention. &Quot; Figure 4E " shows flow cytometric analysis results for CD63 and CD81 in marker assays for exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
Figure 5 shows the results of NTA analysis on particle size distribution showing that a uniform and high-purity exosome is obtained with trehalose addition. As the amount of trehalose added increases, a particle size distribution having a single peak can be obtained.
FIG. 6 shows the results of NTA analysis showing the particle size distribution according to whether trehalose was added during the preparation of exosome according to one embodiment of the present invention. 6A shows a case where trehalose is added throughout the production process, " Fig. 6B " shows a case where trehalose is added after the cell culture solution is stored in a frozen state, and " The results are shown without adding os. 6D shows the results of comparing relative productivity and relative concentration of exosomes isolated by the methods of FIGS. 6A to 6C. 6E shows the mean size of exosomes isolated by the methods of FIGS. 6A to 6C.
FIG. 7 shows the result of confirming the absence of cytotoxicity after treatment of exosome according to one embodiment of the present invention with HS68 cells of human skin fibroblasts.
FIG. 8 shows fluorescence intensity measurement results of exosomes stained with PKH67.
Fig. 9 is an image of a fluorescence microscope confirming the degree of transfer of fluorescent stained exosomes into pig skin tissue.
FIG. 10 is a graph showing a comparison of fluorescence intensities obtained by measuring the fluorescence intensity of each image from a confocal fluorescence microscope image in which the degree of fluorescence-stained exosomes was confirmed in the mouse skin tissue.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail in the following Examples. It should be noted, however, that the following examples are illustrative only and do not limit or limit the scope of the present invention. It will be understood by those of ordinary skill in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. The references cited in the present invention are incorporated herein by reference.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification, when an element is referred to as " comprising ", it means that it can include other elements as well, without excluding other elements unless specifically stated otherwise.
실시예Example
실시예 1: 세포의 배양Example 1: Culture of cells
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.HS68 cells, a human dermal fibroblast, were purchased from ATCC and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific) The cells were subcultured in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) medium containing 5% CO 2 at 37 ° C.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.According to the cell culturing method known in the art, adipose-derived stem cells were cultured at 5% CO 2 and 37 ° C. Then, the cells were washed with a phosphate-buffered saline (purchased from ThermoFisher Scientific), replaced with serum-free, non-phenol red medium, cultured for 1 to 10 days, and the supernatant .
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.Trehalose was added to the culture medium in an amount of 2% by weight in order to obtain an exosome having a uniform particle size distribution and high purity in the process of separating exosome. After the addition of trehalose, the culture was filtered with a 0.22 μm filter to remove impurities such as cellular debris, waste products and large particles. The filtered cultures were immediately separated to isolate exosomes. In addition, the filtered culture was stored in a refrigerator (image below 10 ° C) and used for exosome isolation. In addition, the filtered culture was frozen in an ultra-low temperature freezer at -60 ° C or lower, and thawed, followed by exosome isolation. Then, the exosomes were separated from the culture medium by using Tangential Flow Filtration (TFF).
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제Example 2: Isolation and purification of exosome by TFF method
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.In Example 1, a TFF (Tangential Flow Filtration) method was used for separating, concentrating, desalting and diafiltration exosomes from a culture filtrated with a 0.22 μm filter. For the TFF method, a cartridge filter (also called a hollow fiber filter (purchased from GE Healthcare) or a cassette filter (purchased from Pall or Sartorius or Merck Millipore) was used. The TFF filter can be selected by a variety of molecular weight cutoffs (MWCO). Exosomes were selectively isolated and concentrated by selected MWCOs, and particles, proteins, lipids, nucleic acids, low molecular weight compounds, etc. smaller than MWCO were removed.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.To separate and concentrate the exosomes, TFF filters of MWCO 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, or 500,000 Da were used. The culture medium was concentrated to a volume of about 1/100 to 1/25 using the TFF method, and substances smaller than MWCO were removed to separate the exosomes.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. 트레할로오스 처리에 따라 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.Separated and concentrated exosomal solutions were further desalted and buffered (diafiltration) using the TFF method. At this time, the desalination and buffer exchange are performed by continuous diafiltration or discontinuous diafiltration, and at least 4 times, preferably 6 times to 10 times or more, more preferably, Was performed using a buffer solution having a volume of 12 times or more. To the buffer solution, 2% by weight of trehalose dissolved in PBS was added to obtain an exosome having a uniform particle size distribution and high purity. 6 shows the results of confirming the effect of obtaining an exosome with high purity and homogeneous particle size distribution at a high yield by trehalose treatment.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석Example 3: Characterization of isolated exosomes
분리된 엑소좀, 배양액, 및 TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.The amount of protein in the fractions of the isolated exosome, culture medium, and TFF separation process was measured using BCA colorimetry (purchased from ThermoFisher Scientific) or FluoroProfile fluorescence (purchased from Sigma). The extent to which the exosome was isolated and concentrated by the TFF method of the present invention and the removal of proteins, lipids, nucleic acids, and low-molecular compounds was monitored by a protein determination method, and the results are shown in FIG. As a result, it was found that the protein present in the culture solution was very effectively removed by the TFF method of one embodiment of the present invention.
본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀을 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다.FIG. 3 shows the results of comparing the productivity and purity in five independent batches when isolating exosomes by the TFF method of one embodiment of the present invention. As a result of analyzing the results obtained from the five independent batches, it was confirmed that the exosome can be separated very stably by the TFF method of one embodiment of the present invention.
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4A 내지 도 4C에 도시하였다.Separated exosomes were measured for particle size and concentration by nanoparticle tracking analysis (NTA; purchased from Malvern) or tunable resistive pulse sensing (TRPS; purchased from Izon Science). The uniformity and size of isolated exosomes were analyzed by transmission electron microscopy (TEM). The results of the TRPS, NTA and TEM analyzes of the separated exosomes according to one embodiment of the present invention are shown in Figs. 4A to 4C.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리한 후, 트레할로오스의 첨가 여부에 따른 엑소좀의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 트레할로오스 농도를 0 중량%, 1 중량% 및 2 중량%로 증가시켰고(도 5의 위에서부터 아래), 3회 반복하여 실험하였다. 트레할로오스가 존재하지 않은 경우 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 트레할로오스의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.FIG. 5 shows the result of NTA analysis of the size distribution of exosomes according to whether or not trehalose was added after the exosome was separated by the TFF method. The concentration of trehalose was increased to 0% by weight, 1% by weight and 2% by weight (from top to bottom in FIG. 5) and repeated three times. In the absence of trehalose, particles having a size of 300 nm or more were identified, while particles having a size of 300 nm or more were reduced by increasing the amount of trehalose, and the size distribution of the exosome was uniformized .
TFF 방법으로 엑소좀을 분리하는 과정에 트레할로오스의 첨가에 따른 효과를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 엑소좀의 제조과정 전과정에 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀을 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용하되, 탈염과 버퍼교환 과정에서만 트레할로오스를 첨가하여 TFF 과정을 진행한 경우나, 트레할로오스를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀을 얻었다(도 6B 및 도 6C).The effect of adding trehalose was further investigated in the process of isolating exosome by the TFF method. 6, when 2 wt% trehalose dissolved in PBS was added to the whole process of exosome production, exosomes having a uniform size distribution were obtained (Fig. 6A). On the other hand, in the case of using the culture solution free of trehalose, which was stored in freeze, only TFF process was performed by addition of trehalose only in desalting and buffer exchange process, or TFF process was performed without adding trehalose On the other hand, uneven exosomes containing large particles were obtained (Figs. 6B and 6C).
분리된 엑소좀의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀을 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀의 평균 크기도 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).As a result of comparing the relative productivity and concentration of isolated exosomes, it was found that when trehalose was added to the whole process of exosomes, exosome was obtained with high productivity and the concentration of exosome obtained was 5 times higher (Fig. 6D). As shown in the results of NTA analysis, the average size of the separated exosomes was uniformly observed at 200 nm when trehalose was added to the entire process of exosome (Fig. 6E).
도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.FIG. 4D shows the presence of CD9, CD63, CD81 and TSG101 markers as a result of performing Western blotting on isolated exosomes according to the method of one embodiment of the present invention. Anti-CD9 (purchased from Abcam), anti-CD63 (purchased from System Biosciences), anti-CD81 (purchased from System Biosciences), and anti-TSG101 (purchased from Abcam) were used as the antibodies for each marker.
도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.FIG. 4E shows the presence of CD63 and CD81 markers as a result of analysis using a flow cytometer on exosomes isolated according to the method of one embodiment of the present invention. Human CD63 isolation / detection kit (purchased from ThermoFisher Scientific) was used according to the manufacturer's method to isolate the positive exosomes for CD63 and PE-mouse anti-human CD63 (PE-Mouse anti markers were stained using the PE-mouse CD63 (purchased from BD) and PE-mouse anti-human CD81 (purchased from BD), and analyzed using a flow cytometer (ACEA Biosciences) Respectively.
한편, 본 발명에서 사용되는 엑소좀은 전술한 바와 같은 실시예들의 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 실시예들에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.Meanwhile, the exosome used in the present invention is not limited to the exosome of the above-mentioned embodiments, and it is needless to say that various exosomes which are used in the art or can be used in the future can be used. It should be understood that the exosome isolated according to the above embodiments is an example of exosome that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정Example 4: Measurement of cytotoxicity by treatment with exosome
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다. In order to evaluate the toxicity of exosomes obtained according to the isolation method of one embodiment of the present invention in human skin fibroblast HS68 cells, exosomes were treated by concentration to the cells and the proliferation rate of the cells was confirmed. HS68 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS, and the cells were mixed with 80 ~ 90% confluency and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 24 hours. After 24 hours, the culture solution was removed, and the cell survival rate was evaluated by culturing the exosome prepared in Example 2 for each concentration and culturing for 24 to 72 hours. Cell viability was measured using WST-1 reagent (purchased from Takara), MTT reagent (purchased from Sigma), CellTiter-Glo reagent (purchased from Promega), or Aramar Blue reagent alamarBlue reagent (purchased from ThermoFisher Scientific) and a microplate reader (purchased from Molecular Devices).
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 7).The comparison group was based on the number of cells cultured in the normal cell culture medium not treated with exosome, and it was confirmed that no cytosoxicity by exosome was observed within the tested concentration range (FIG. 7).
실시예 5: 형광염색된 엑소좀의 제조Example 5: Preparation of fluorescent dyed exosomes
형광염색된 엑소좀을 제조하기 위하여 PKH67 염료(Sigma에서 구입)를 사용하였다. 1 mM의 PKH67을 Diluent C (Sigma에서 구입)에 희석하여 10 μM의 PKH67 용액을 제조한 후, 적정 농도의 엑소좀 용액과 혼합하여 상온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PKH67로 염색된 엑소좀(이하, "PKH-엑소좀"으로 약칭)으로부터 잔여 PKH67 염료를 제거하기 위하여 MW3000 스핀 컬럼(ThermoFisher Scientific에서 구입)을 사용하였다. 형광측정기(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 확인한 결과, 엑소좀과 반응하지 않은 PKH67을 제거한 후 PKH-엑소좀에서 충분한 강도의 형광이 검출됨을 확인하였다(도 8).PKH67 dye (purchased from Sigma) was used to prepare fluorescently stained exosomes. 1 mM PKH67 was diluted in Diluent C (purchased from Sigma) to prepare a 10 μM PKH67 solution, mixed with an appropriate concentration of exosome solution, and allowed to react at room temperature for 10 minutes in the absence of light. After the reaction, an MW3000 spin column (purchased from ThermoFisher Scientific) was used to remove the remaining PKH67 dye from the exosomes stained with PKH67 (hereinafter abbreviated as "PKH-exosomes"). After confirming the use of a fluorescence analyzer (purchased from Molecular Devices), it was confirmed that sufficient intensity of fluorescence was detected in the PKH-exosome after removing PKH67 not reacted with exosomes (FIG. 8).
실시예 6: PKH-엑소좀의 돼지 피부투과 평가Example 6: Evaluation of pig skin permeation of PKH-exosomes
PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 돼지 피부 바깥면에 도포하였다. 도포된 PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 덮어 준 후 적정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 PKH-엑소좀이 피하 조직에 전달되도록 하였다. 반응이 종료된 후, 돼지 피부조직을 3.7% 포름알데히드 용액에 담궈 하룻밤 동안 반응시키고, 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 세척된 돼지 피부조직을 30% 수크로오스 용액에 담가 처리한 후, OCT 화합물을 처리하였다. 다시 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척한 후, 마이크로톰을 이용하여 종단면으로 절편을 제작하여 슬라이드글라스 위에 조직 절편을 위치시켰다. 한편 조직 절편의 제작은 포름알데히드 용액으로 조직을 고정하기 전에 진행할 수도 있다. 조직 절편에서 PKH-엑소좀으로부터 검출되는 형광은 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 돼지 피부조직의 표피를 투과하여 피하 조직으로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하였다(도 9). 따라서 본 발명의 엑소좀의 경피 투과 증진 방법은 돼지 피부에 대한 엑소좀의 경피 투과를 도와 주는 것을 알 수 있다. PKH-exosomes were dispersed in phosphate buffer (PBS) at a proper concentration, for example, 1 × 10 5 to 1 × 10 9 particles / mL, and then applied to the outer surface of the pig skin. To prevent drying of the applied PKH-exosomes, the nonwoven fabric was covered and allowed to react for an appropriate period of time, for example, 30 minutes to 1 hour to allow the PKH-exosomes to be delivered to the subcutaneous tissues. After the reaction was completed, the pig skin tissue was immersed in a 3.7% formaldehyde solution, reacted overnight, and washed three times for 5 minutes each with phosphate buffered saline. The washed pig skin tissue was immersed in a 30% sucrose solution and treated with OCT compound. After washing three times for 5 minutes with phosphate buffer solution, sections were prepared on a longitudinal section using a microtome, and tissue sections were placed on a slide glass. On the other hand, the preparation of the tissue section may be carried out before the tissue is fixed with formaldehyde solution. Fluorescence detected from PKH-exosomes in tissue sections was observed using fluorescence microscopy. As a result, PKH-exosomes transmitted through the epidermis of pig skin tissue and transferred to subcutaneous tissue were identified (Fig. 9). Therefore, it can be seen that the transcutaneous permeation enhancing method of the present invention helps transdermal permeation of exosome to pig skin.
실시예 7: PKH-엑소좀의 생쥐 피부투과 평가Example 7: Evaluation of rat skin permeation of PKH-exosomes
헤어리스 마우스의 피부조직을 적출하여 프란츠 확산셀(Franz Diffusion Cell)의 챔버 위쪽에 위치시켰다. 이때, 확산셀의 내부는 인산완충용액으로 채워주었다. PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 생쥐의 피부조직 바깥쪽에 도포하였다. 이때, PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 생쥐 피부조직 바깥쪽에 미리 위치시키고, 부직포와 피부조직 사이에 PKH-엑소좀을 주입하였다. 그 후 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 즉시 공초점형광현미경(Leica, SP8X)을 이용하여 피부조직 내부로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하거나, 1시간 내지 6시간 동안 피부조직과 PKH-엑소좀 용액을 추가로 반응시킨 후, 공초점형광현미경으로 PKH-엑소좀을 확인하였다(도 10). 그 결과, 생쥐 피부조직 내부로 깊숙이 전달된 PKH-엑소좀을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 엑소좀의 경피 투과 증진 방법은 생쥐 피부에 대한 엑소좀의 경피 투과를 도와 주는 것을 알 수 있다. The skin tissue of the hairless mouse was harvested and placed on top of the chamber of the Franz Diffusion Cell. At this time, the inside of the diffusion cell was filled with a phosphate buffer solution. PKH-exosomes were dispersed in phosphate buffer (PBS) at a proper concentration, for example, 1 × 10 5 to 1 × 10 9 particles / mL, and then applied to the outside of the skin tissue of the mice. At this time, in order to prevent drying of PKH-exosomes, the nonwoven fabric was pre-positioned outside the mouse skin tissue, and PKH-exosomes were injected between the nonwoven fabric and skin tissue. Then, the reaction was carried out for 30 minutes to 1 hour. After completion of the reaction, the PKH-exosomes transferred into the skin tissue were confirmed immediately using a confocal fluorescence microscope (Leica, SP8X) or the skin tissue and the PKH-exosomal solution were further reacted for 1 hour to 6 hours , And PKH-exosomes were confirmed by confocal fluorescence microscopy (Fig. 10). As a result, we could confirm PKH-exosomes deeply transferred into mouse skin tissue. Therefore, it can be seen that the transcutaneous permeation enhancement of exosome of the present invention helps transcutaneous permeation of exosome to mouse skin.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.Although the present invention has been described with reference to the above embodiments, the present invention is not limited thereto. It will be understood by those skilled in the art that modifications and variations may be made without departing from the spirit and scope of the invention, and that such modifications and variations are also contemplated by the present invention.
Claims (12)
(b) 상기 조성물을 포유동물의 피부에 국소적으로 도포하는 단계와,
(c) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 경피 투과 증진 방법.(a) preparing a composition comprising an exosome as an active ingredient, and
(b) topically applying the composition to the skin of a mammal, and
(c) contacting or adhering the mask pack, mask sheet or patch with the composition applied or immersed to the skin of the mammal.
(d) 상기 (c) 단계 이후에 상기 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 엑소좀의 경피 투과 증진 방법.The method according to claim 1,
(d) removing the mask pack, mask sheet or patch from the skin of the mammal after step (c), and applying the composition to the skin of the mammal. Way.
상기 (a) 단계에 있어서 상기 엑소좀을 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지시키는 단계를 더 포함하는, 엑소좀의 경피 투과 증진 방법.The method according to claim 1,
The method of enhancing transdermal permeability of exosomes according to claim 1, further comprising, in step (a), supporting the exosomes on at least one of hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt or hyaluronic acid gel.
하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종을 상기 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포하는 단계를 더 포함하는, 엑소좀의 경피 투과 증진 방법.The method according to claim 1,
A method for enhancing transdermal permeability of exosomes, which comprises applying at least one of hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt or hyaluronic acid gel to at least one surface of said mask pack, mask sheet or patch.
상기 하이드로겔은 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 경피 투과 증진 방법.The method according to claim 3 or 4,
Wherein the hydrogel is a hydrogel obtained by dispersing a gelled polymer in a polyhydric alcohol.
상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 경피 투과 증진 방법.6. The method of claim 5,
Wherein the gel polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cacao gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum Wherein the polyol is at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol and glycerin. / RTI >
상기 엑소좀이 담지되는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종을 포함하는, 엑소좀의 경피 전달용 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 도포하거나 침적하기 위한 조성물.A composition comprising an exosome as an active ingredient,
A composition for applying or dipping a mask pack, mask sheet or patch for transdermal delivery of exosomes comprising at least one of hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt or hyaluronic acid gel carrying the exosome.
상기 하이드로겔은 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔인 것을 특징으로 하는, 조성물.8. The method of claim 7,
Wherein the hydrogel is a hydrogel obtained by dispersing a gelled polymer in a polyhydric alcohol.
상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는, 조성물.9. The method of claim 8,
Wherein the gel polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cacao gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum Wherein the polyhydric alcohol is at least one member selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol and glycerin.
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |