KR20190027761A - Novel Virus Like Particle with Dual-Antigenicity, Vaccine Composition for Preventing Diseases from Canine Parvovirus and Canine distemper Virus Infection Comprising the Same, and Method for Manufacturing Thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 이중 항원성을 갖는 신규한 바이러스 유사입자, 이를 포함하는 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스 감염에 의한 질환 예방용 백신 조성물, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel virus-like particle having dual antigen, a canine parvovirus comprising the same, a vaccine composition for preventing disease caused by dog dysenteria virus infection, and a method for producing the same.
개 파보바이러스(Canine Parvovirus, CPV)는 개에서 발생하는 전염성 바이러스 질병이다. 고양이 범백혈구 감소증 바이러스가 개 파보바이러스로 변이된 것으로 여겨진다. 개 파보바이러스는 외막이 없는 ssDNA 바이러스이며 직경은 20~25nm의 크기를 가진다. 파보바이러스과(Parvoviridae)의 프로토파보바이러스(protoparvovirus)에 속한다. 파보바이러스는 분변이나 타액등으로 개에서 개로 매우 높은 전염성을 보인다. 일반적으로 환절기에 많은 발병을 하며 주된 원인은 감염된 개와 같은 공간에서 생활하면서 분변이나 타액을 통한 직접적인 접촉에 의해 감염되며, 감염된 개의 분변과 타액이 묻어있는 애견용품이나 주인의 손을 통한 간접적인 접촉에 의해 감염된다. 예방접종을 진행한 개의 경우 파보바이러스에 대한 감염을 막을 수 있으나, 감염된 개는 치료가 없는 경우 높은 치사율을 보인다. Canine Parvovirus (CPV) is a contagious viral disease in dogs. It is believed that the cat leukopenia virus has been mutated into the dog parvovirus. Dog parvovirus is an outer membrane-free ssDNA virus with a diameter of 20-25 nm. It belongs to the protoparvovirus of Parvoviridae . Parvovirus is highly infectious from dog to dog due to feces or saliva. Generally, there are a lot of cases in the transition period, and the main cause is infected by direct contact through the feces or saliva while living in the same space as the infected dog, and the indirect contact through the dog's articles with the feces and saliva . In the case of vaccinated dogs, infection with parvovirus can be prevented, but infected dogs show high mortality without treatment.
한편, 파보바이러스는 심근형과 장염형으로 나뉜다. 심근형은 주로 3~8주령까지의 강아지에서 나타난다고 보고되었으며, 감염 후 원기가 없어지고 급성심부전증을 나타내기도 하며, 높은 치사율을 나타낸다. 장염형 파보바이러스는 8주령 이후 개에서 나타나는데, 피가 섞여 있으며 심한 냄새를 나는 설사와 구토를 하며 원기와 식욕을 잃고 심한 탈수증세를 나타내다가 높은 확률로 사망하게 된다. 임신한 암컷이 파보바이러스에 감염된 경우 바이러스가 태반을 통과하여 태아에게 영향을 미치게 된다.Parvovirus is divided into myocardial and enteritis types. The myocardial infarction has been reported to occur mainly in puppies up to 3 to 8 weeks of age. Enteroviruses Parvovirus enteritis occurs after 8 weeks of age. It is mixed with blood, it causes diarrhea and vomiting that smells badly, loses pleasure and appetite, shows severe dehydration, and dies with high probability. If the pregnant female is infected with parvovirus, the virus will pass through the placenta and affect the fetus.
이러한 개 파보바이러스를 치료하기 위해서는 빠른 진단과 개의 나이가 중요하다. 초기치료를 통해서 생존률을 높일 수 있는데 치료는 광범위 항생제 투여, 항구토제 및 크리스탈로이드(Crystalloid) 수액 또는 콜로이드(Colloid) 수액을 정맥투여하는 것이다. 수액을 지속적으로 공급하면서 점차 상태가 좋아지면 소화가 잘되는 음식을 소량 급여한다. 2차 감염에 저항할 수 있는 생태와 백혈구 수치에 따라서 경구용 항생제를 투약한다. 빠른 확진을 통해서 2~3일 만에 회복하기도 하나, 2주까지 치료가 진행되기도 한다. 그러나, 치료가 잘되더라도 생존을 보장할 수 없다.Early diagnosis and age of dogs are important to treat these canine parvoviruses. Initial treatment can increase survival rate. Treatment is intravenous administration of broad-spectrum antibiotics, corticosteroids, and Crystalloid or colloid sap. Feed a small amount of digestible food if the condition is getting better as the fluid is continuously supplied. Oral antibiotics should be given according to the ecological and leukocyte counts that can resist secondary infections. It can be recovered within 2 ~ 3 days by rapid confirmation, but it is treated for up to 2 weeks. However, survival can not be guaranteed even with good treatment.
개 디스템퍼 바이러스(Canine distemper Virus, CDV)는 개 홍역이나 경척증으로 널리 알려져 있다. 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 모빌리바이러스(mobilivirus)에 속한다. 외막이 있는 ssRNA 바이러스이다. 개 디스템퍼 바이러스는 호흡을 통하여 감염될 정도로 감염성이 매우 높은 바이러스 질병이다. 뿐만 아니라, 감염된 개의 배설물이나 타액에 의해서 감염이 이루어진다. 개 디스템퍼 바이러스는 전신감염을 유발한다. 감염한 뒤 3~6일 사이에 발열을 하며 일반적인 증상이 나타나는 경우는 2주에서 3주사이에 나타난다. 감염된 개에서 나타나는 증상으로는 림프조직파괴로 면역력과 2차감염을 나타내며, 간질성 폐렴, 뇌염과 코와 발바닥에 과각화를 나타낸다. 감염된 개의 면역상태에 따라서 치사율이 결정되며 강아지의 경우에는 폐렴과 뇌염 등의 합병증에 의해 높은 치사율을 나타낸다. 개의 경우에는 뇌염의 합병증으로 인해 전정기관 이상이 생기며, 염증성 중추신경계 질환을 유발한다. 흔히는 콧물, 구토, 탈수, 설사, 기침, 식욕감퇴, 체중감소가 나타난다. Canine distemper virus (CDV) is widely known as canine measles virus or canker disease. It belongs to the Paramyxoviridae family (mobilivirus). It is an ssRNA virus with an outer membrane. Dog Distemper virus is a highly infectious viral disease that is infectious through respiration. In addition, infection is caused by infected dog feces or saliva. Dog distemper virus causes systemic infection. Infections develop between 3 and 6 days after infection, and symptoms usually appear in 2 to 3 injections. Symptoms that appear in infected dogs include immunity and secondary infections due to lymphoid tissue destruction, and are characterized by interstitial pneumonia, encephalitis, and exaggerated nose and soles. The mortality rate is determined according to the immune status of infected dogs. In case of dogs, it shows high mortality rate due to complications such as pneumonia and encephalitis. In dogs, complications of encephalitis result in vestibular system abnormalities, leading to inflammatory central nervous system diseases. They often have runny nose, vomiting, dehydration, diarrhea, coughing, loss of appetite, and weight loss.
이러한 개 디스템퍼바이러스의 경우 특별한 치료법은 없으며 현재는 디스템퍼 바이러스가 리바비린(ribavirin)에 감수성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 아직 연구중인 방법이며, 예방만이 가장 신뢰도가 높다.There is no specific treatment for such dog distemper virus and it is now known that distemper virus is susceptible to ribavirin. However, it is still under study, and prevention is the most reliable.
현재 국내에서 사용되는 CPV 및 CDV의 예방을 위한 백신으로는 약독화 백신을 이용한다. 약독화 백신은 생백신으로 야생형이나 질병을 일으키는 바이러스나 세균에서 돌연변이 과정을 거친 후 독성을 없애거나 약하게 만든 것이다. 이러한 과정은 많은 계대를 요구하며 상당히 낮은 성공률을 보인다. 또한, 바이러스나 세균 자체가 생체 내에서 증식하고 살아있는 백신이기 때문에 신체 내에서 변이반응이 일어날 가능성이 있으며, 면역억제반응이 일어나 합병증을 유발할 수 있다. Currently, vaccines for the prevention of CPV and CDV used in Korea are attenuated vaccines. An attenuated vaccine is a live vaccine that has been mutagenized in viral or germ-causing wild-type or disease-causing viruses, thereby eliminating or reducing toxicity. This process requires a large number of passages and has a fairly low success rate. In addition, since viruses and bacteria themselves multiply in vivo and are live vaccines, mutation reactions may occur in the body, and immunosuppression reaction may occur and cause complications.
따라서, 이러한 문제를 극복하기 위한 대안으로서 감염능이 있는 바이러스를 배제하고 유전자를 재조합하여 이중 항원성을 갖도록 제작한 바이러스 유사 입자가 가장 바람직한 대안으로 여겨지고 있다. Therefore, as an alternative to overcome this problem, virus-like particles which are produced so as to have double antigenicity by excluding the infectious virus and recombining the genes are considered as the most preferable alternatives.
이러한 상황하에서, 본 발명자들은 상술한 개 파보바이러스와 개 디스템퍼 바이러스의 예방 백신에 대한 종래 문제점을 해결하고, 개 파보바이러스와 개 디스템퍼 바이러스에 대하여 보다 향상된 면역반응을 유도할 수 있는 신규한 예방 방법을 개발하고자 예의연구하였다. 그 결과, 본 발명자들은 개 파보바이러스의 구조 유전자 중 높은 중화 항체 형성이 가능한 VP2 유전자와 개 디스템퍼 바이러스의 중화항체 형성부위인 F 단백질의 p35 서열을 융합하여 두 가지 질환에 대한 중화항체 형성 부위를 가지는 이중항원성 바이러스 유사 입자를 제작하였고, 이에 의한 탁월한 백신 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. Under these circumstances, the present inventors have solved the above-mentioned problems of the conventional vaccine against canine parvovirus and dog distemper virus, and found a novel preventive method capable of inducing a more improved immune response against canine parvovirus and dog distemper virus We have studied the case for development. As a result, the present inventors have found that the VP2 gene capable of forming a highly neutralizing antibody in the structural gene of canine parvovirus and the p35 sequence of F protein, which is a neutralizing antibody forming site of dog distemper virus, are fused to form a neutralizing antibody- Double antigenic virus-like particles were prepared, and the excellent vaccine effect was confirmed, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 일 목적은 서열번호 1로 표시되는 개 파보바이러스(Canine Parvovirus)의 VP2 단백질을 코딩하는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 개 디스템퍼바이러스(Canine distemper Virus)의 F 단백질 p35 부위를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 데 있다.Therefore, one object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising the nucleotide sequence encoding the VP2 protein of Canine Parvovirus represented by SEQ ID NO: 1 and the p35 region of the F protein of Canine distemper virus represented by SEQ ID NO: 2 Encoding a recombinant expression vector comprising the nucleotide sequence.
또한, 본 발명의 다른 목적은 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a transformant transformed by a recombinant expression vector.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 형질전환체에 의하여 생산되는 바이러스 유사입자(Virus-Like Particle, VLP)를 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a virus-like particle (VLP) produced by a transformant.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스 감염에 의한 질환 예방용 백신 조성물을 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a vaccine composition for preventing diseases caused by infection with canine parvovirus and dog distemper virus, which comprises virus-like particles as an active ingredient.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스 감염에 의한 질환 예방용 바이러스 유사입자의 제조방법을 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing virus-like particles for preventing diseases caused by canine parvovirus and dog distemper virus infection.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 개 파보바이러스(Canine Parvovirus, CPV)의 VP2 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 서열번호 2로 표시되는 개 디스템퍼바이러스(Canine distemper Virus, CDV)의 F 단백질의 p35 부위를 코딩하는 염기서열;을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a nucleotide sequence encoding a VP2 protein of Canine Parvovirus (CPV) represented by SEQ ID NO: 1; And a nucleotide sequence encoding the p35 region of the F protein of Canine distemper virus (CDV) represented by SEQ ID NO: 2.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 특정 세포 내에서 발현할 수 있는 외인성 작동성 유전자를 포함하는 모든 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 벡터는 인간, 조류 또는 곤충 세포 배양 시스템 내에서 발현되는 2 개 이상의 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있으며, "재조합 발현 벡터" 또는 "재조합 벡터"와 혼용된다.The term " vector " as used herein refers to all nucleotide sequences that comprise an exogenous operable gene that can be expressed in a particular cell. For example, the vector may comprise a nucleic acid encoding two or more proteins expressed in a human, alveolar or insect cell culture system and is mixed with a " recombinant expression vector " or " recombinant vector ".
본 발명의 가장 큰 특징은 개 파보바이러스(Canine Parvovirus, CPV)의 VP2 단백질을 코딩하는 염기서열과 개 디스템퍼바이러스(Canine distemper Virus, CDV)의 F 단백질의 p35 부위를 코딩하는 염기서열의 조합을 이용하는 것이다.The most remarkable feature of the present invention is that the combination of the nucleotide sequence encoding the VP2 protein of Canine Parvovirus (CPV) and the nucleotide sequence encoding the p35 region of the F protein of Canine distemper virus (CDV) will be.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 목적의 단백질인 CPV의 VP2 단백질과 CDV의 F 단백질의 p35 부위가 융합된 재조합 단백질의 발현 수준 또는 효율을 증가시킬 수 있는 한, 임의의 서열들, 바람직하게는 프로모터 및/또는 발현 촉진을 위한 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.Preferably, the recombinant expression vector of the present invention may be any sequence as long as it can increase the expression level or efficiency of the recombinant protein fused with the VP2 protein of the CPV of interest and the p35 region of the CDV F protein May further comprise a promoter and / or a sequence for promoting expression.
본 발명의 목적 산물인 CPV의 VP2 단백질과 CDV의 F 단백질의 p35 부위가 융합된 재조합 단백질의 발현 수준 또는 효율의 증가를 언급하면서 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 발현 벡터"는 "재조합 전이 벡터"와 동일하며, 본 발명에서 혼용된다. As used herein, the term " recombinant expression vector " refers to an expression level or efficiency of a recombinant protein in which the VP2 protein of the CPV of the present invention is fused with the p35 region of the F protein of CDV, And are mixed in the present invention.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적으로 배큘로바이러스의 다각체 단백질(polyhedrin) 코딩 유전자의 프로모터, 상동지역 5(homologous region 5: hr5) 서열, Burst 서열 및 vp39 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.Preferably, the recombinant expression vector of the present invention further comprises a promoter of a polyhedrin coding gene of baculovirus, a homologous region 5 (hr5) sequence, a Burst sequence, and a vp39 promoter Or more.
즉, 본 발명의 재조합 전이 벡터는 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터; 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 서열번호 9로 표시되는 Burst 서열;을 포함할 수 있다.That is, the recombinant transfer vector of the present invention is a promoter of a polymorphic protein coding gene of baculovirus; And a Burst sequence of SEQ ID NO: 9 operably linked to the promoter.
본 발명에 있어서 "프로모터"는, 전사를 이끌기에 충분한 최소한의 서열을 의미한다.In the present invention, the term " promoter " means a minimum sequence sufficient to lead to transcription.
본 발명에 있어서 "배큘로 바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터"는 서열번호 10으로 표시된 것일 수 있다. 상기 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터는 외래 목적 단백질의 앞부분에 위치하여, 목적 단백질의 발현 효율을 증가시킬 수 있는 프로모터로, 상기 다각체 단백질의 전사 및 기능적 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 바람직하게는 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica NPV; AcNPV) 다각체 단백질의 구조 유전자 상류 약 100 bp 서열 부위, 보다 바람직하게는 상류(upstream) -1 bp 내지 -52 bp 부위를 포함할 수 있다. In the present invention, " the promoter of the polymorphic protein coding gene of baculovirus " may be represented by SEQ ID NO: 10. The promoter of the polymorphic protein coding gene is a promoter capable of increasing the expression efficiency of a target protein located at the front of the foreign target protein, and is a DNA sequence essential for transcription and functional expression of the polymorphic protein. Preferably about 100 bp sequence region upstream of the structural gene of Autographa californica NPV (AcNPV) polynucleotide protein, more preferably upstream-1 bp to -52 bp region can do.
본 발명에 있어서, "배큘로 바이러스"는 사람이나 척추 동물에는 병원성이 없으며, 곤충에 대해서만 병원성을 나타내는 곤충 병원성 바이러스를 모두 포함한다. 바람직하게는 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus: NPV) 및 과립병 바이러스(Granulovirus: GV)를 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직한 일 예로 핵다각체병 바이러스를 의미할 수 있다. In the present invention, " baculovirus " is not pathogenic to humans or vertebrates, and includes all of the insect pathogenic viruses which are only pathogenic to insects. Preferably Nucleopolyhedrovirus (NPV) and granulovirus (GV). In the present invention, it may mean a nuclear polyhedrosis virus.
본 발명에 있어서, 용어 "배큘로바이러스의 다각체 단백질"은 감염 말기에 곤충 세포의 핵으로부터 대량 합성되어지는 배큘로 바이러스 다각체의 구조단백질로서 예를 들어, 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica Nucleopolyhedrovirus, AcNPV)의 다각체 단백질, 파밤나방(Spodoptera exigua) 핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질(Elisabeth et al., 1992, J. Gen. Viral., 13, 2813-2821), 누에(Bombix mori) 핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질(Iatrou et al., 1985, J. Virol., 54, 436-445) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 상기 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(AcNPV)의 다각체 단백질을 의미할 수 있다.In the present invention, the term " polymorphic protein of baculovirus " is a structural protein of a baculovirus polynucleotide that is mass-synthesized from the nucleus of an insect cell at the end of infection, such as, for example, an autograpakoliponic nuclear polyhedrosis virus Polymorphic proteins of Autographa californica Nucleopolyhedrovirus (AcNPV), polymorphic proteins of Spodoptera exigua nuclear polyhedrosis virus (Elisabeth et al., 1992, J. Gen. Viral., 13, 2813-2821) (Iatrou et al., 1985, J. Virol., 54, 436-445) of the Bombix mori nuclear polyhedrosis virus, and preferably the autograpakolinican nuclear polyhedrosis virus ≪ / RTI > AcNPV).
본 발명에 있어서, 상기 Burst 서열은 폴리헤드린(Polyhedrin) 프로모터내 존재하는 일부분으로써 번역 개시 부위와 TAAG 사이에 위치한 서열이며, 배큘로바이러스 감염말기에 Vlf-1이 Burst 서열에 특이적으로 결합하여 전사를 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Manohar 등 2010). 본 발명의 Burst 서열은 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다. In the present invention, the Burst sequence is a part located in the polyhedrin promoter and located between the translation initiation site and the TAAG, and at the end of the baculovirus infection, Vlf-1 specifically binds to the Burst sequence, (Manohar et al. 2010). The Burst sequence of the present invention may be the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or a mutant thereof.
본 발명의 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 서열번호 9로 표시되는 Burst 서열을 포함하는 재조합 전이 벡터는 외래 목적 단백질의 발현을 가장 효율적으로 증가시킬 수 있는 가장 단순한 형태의 재조합 전이 벡터로 해당 재조합 전이 벡터를 토대로 추가적인 프로모터 또는 촉진 서열을 조합하여 사용할 수 있다. The recombinant transfer vector comprising the promoter of the polymorphic protein coding gene of the baculovirus of the present invention and the Burst sequence of SEQ ID NO: 9 operably linked to the promoter is capable of most efficiently increasing the expression of the foreign target protein The simplest form of the recombination transfer vector can be used in combination with additional promoters or promoters based on the recombination transfer vector.
따라서, 본 발명은 서열번호 7로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열 및 서열번호 8로 표시되는 vp39 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터를 제공한다. Therefore, the present invention provides a recombinant transfer vector comprising the sequence of SEQ ID NO: 7 and the vp39 promoter represented by SEQ ID NO: 8, in addition to the one or more sequences selected from the group consisting of the hr5 (homologous region 5) do.
상기 hr (homologous region) 서열은 배큘로바이러스의 게놈에 존재하는 반복된 염기서열 영역을 의미하고, hr1, hr2L, hr2R, hr3, hr4L, hr4R, hr5가 존재한다. 이들 hr 서열의 대부분이 바이러스 DNA복제와 증식에서 중요한 역할을 수행하며 바이러스 또는 비바이러스 유전자의 전사 촉진자로 기능을 가지는 것으로 확인되었다 (Rodems와 Friesen, 1993). 본 발명에서는 hr5 서열을 이용하였으며, 이는 서열번호 7로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다. The hr (homologous region) sequence refers to a repeated nucleotide sequence region present in the genome of baculovirus, and hr1, hr2L, hr2R, hr3, hr4L, hr4R and hr5 exist. Most of these hr sequences play an important role in viral DNA replication and proliferation and have been shown to function as transcriptional promoters for viral or nonviral genes (Rodems and Friesen, 1993). In the present invention, the hr5 sequence is used, which may be the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 or a mutant thereof.
또한 상기 vp39 프로모터는 vp39 유전자의 발현을 조절하는 프로모터이며, vp39 유전자는 late 유전자로써 바이러스 입자의 구조 단백질 중 하나이다. 상기 vp39 프로모터는 서열번호 8로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다. The vp39 promoter is a promoter that regulates the expression of the vp39 gene, and the vp39 gene is a late gene, which is one of the structural proteins of the viral particle. The vp39 promoter may be the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 or a mutant thereof.
본 발명에 있어서, 서열번호 10으로 표시되는 상기 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터, 서열번호 9로 표시되는 Burst 서열, 서열번호 7로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열 및 서열번호 8로 표시되는 vp39 프로모터는 외래 목적 단백질의 발현 증대를 달성할 수 있는 한, 그 순서 및 개수, 방향성을 당 분야의 통상의 기술자의 상식에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있다. In the present invention, the promoter of the polymorphic protein coding gene of baculovirus represented by SEQ ID NO: 10, the Burst sequence of SEQ ID NO: 9, the
본 발명의 구현예에서는 서열번호 7로 표시되는 hr5 서열, 서열번호 10으로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 및 서열번호 9로 표시되는 Burst 서열이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터; 서열번호 7로 표시되는 hr5 서열, 서열번호 8로 표시되는 vp39 프로모터, 서열번호 10으로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 및 서열번호 9로 표시되는 Burst 서열이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터; 또는 서열번호 8로 표시되는 vp39 프로모터, 서열번호 10으로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 및 서열번호 9로 표시되는 Burst 서열이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터;를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이 외 추가적인 프로모터 또는 발현 촉진을 위한 서열을 포함할 수 있다. In the embodiment of the present invention, the hr5 sequence shown in SEQ ID NO: 7, the promoter of the polyhedrin protein coding gene of baculovirus shown in SEQ ID NO: 10, and the Burst sequence shown in SEQ ID NO: 9 are sequentially connected. Recombinant transfer vectors; The hr5 sequence shown in SEQ ID NO: 7, the vp39 promoter shown in SEQ ID NO: 8, the promoter of the polyhedrin protein coding gene of baculovirus shown in SEQ ID NO: 10, and the Burst sequence shown in SEQ ID NO: , A recombinant transfer vector; Or a vp39 promoter represented by SEQ ID NO: 8, a promoter of a polymorphic protein coding gene of baculovirus represented by SEQ ID NO: 10, and a Burst sequence represented by SEQ ID NO: 9 are sequentially linked. But are not limited to, additional promoters or sequences for promoting expression.
또한, 본 발명은 서열번호 8로 표시되는 vp39 프로모터; 및 서열번호 10으로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터;를 포함하는 재조합 전이 벡터를 이용할 수 있다. The present invention also relates to a vp39 promoter represented by SEQ ID NO: 8; And a promoter of a polymorphic protein coding gene of baculovirus represented by SEQ ID NO: 10 can be used.
이는 다각체 단백질 코딩 유전자 프로모터에 의한 외래 목적 단백질의 발현을 더욱 촉진하기 위하여 서열번호 8로 표시되는 vp39 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다. Which is characterized by comprising the vp39 promoter represented by SEQ. ID. NO: 8 for further promoting the expression of the foreign target protein by the polyprotein coding gene promoter.
상기 서열번호 8로 표시되는 vp39 프로모터와 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터는 상호 교환적인 순서로 연결될 수 있으며, 바람직하게는 vp39 프로모터와 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 순으로 순차적으로 연결될 수 있다. The vp39 promoter of SEQ ID NO: 8 and the promoter of the polyhedrin protein coding gene of baculovirus may be linked in an interchangeable sequence, preferably in the order of the vp39 promoter and the promoter of the polymorphic protein coding gene of baculovirus Can be connected in sequence.
또한 본 발명의 재조합 전이 벡터는 서열번호 7로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.In addition, the recombination transfer vector of the present invention may further comprise an hr5 (homologous region 5) sequence represented by SEQ ID NO: 7.
서열번호 7로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열, 서열번호 8로 표시되는 vp39 프로모터 및 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터는 외래 목적 단백질의 발현 증대를 달성할 수 있는 한, 그 순서 및 개수, 방향성을 당 분야의 통상의 기술자의 상식에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 hr5 (homologous region 5) 서열, vp39 프로모터 및 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터가 순차적으로 연결될 수 있다.The promoter of the hr5 (homologous region 5) sequence shown in SEQ ID NO: 7, the vp39 promoter shown in SEQ ID NO: 8, and the polymorphic protein coding gene of baculovirus can be used as long as they can attain an increase in expression of a foreign target protein And the number and direction of the polynucleotide of the present invention can be suitably adjusted according to the common sense of the art in the field. Preferably, the promoter of the hr5 (homologous region 5) sequence, the vp39 promoter and the polyhedrin protein coding gene of baculovirus Can be connected.
따라서, 본 발명에 있어서, 본 발명의 재조합 전이 벡터는 바람직하게는, 외래 단백질 발현 증가를 위한 재조합 전이벡터 중 서열번호 8로 표시되는 vp39 프로모터; 서열번호 10으로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터; 서열번호 9로 표시되는 Burst 서열이 순차적으로 연결된 재조합 전이 벡터이다.Therefore, in the present invention, the recombinant transfer vector of the present invention is preferably a vp39 promoter represented by SEQ ID NO: 8 among recombination transfer vectors for increasing expression of foreign proteins; A promoter of a polymorphic protein coding gene of baculovirus represented by SEQ ID NO: 10; The Burst sequence shown in SEQ ID NO: 9 is a recombinant transfer vector in which the sequences are sequentially connected.
상기 재조합 전이 벡터는 도 5에 기재된 개열 지도를 갖는 것일 수 있으며, 본 발명의 외래 목적 단백질의 발현 증대를 달성할 수 있는 벡터의 구성이라면 이에 제한되지 않는다.The recombination transfer vector may have a cleavage map as shown in FIG. 5, but is not limited thereto, so far as the vector is capable of achieving an increase in the expression of the foreign target protein of the present invention.
본 발명에 있어서, 염기서열의 변이체란 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 기존의 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 이와 같은 변이체는 기존의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.In the present invention, a variant of a base sequence is a functional equivalent of a nucleic acid molecule, for example, a nucleotide sequence that has been modified by deletion, substitution or insertion of a part of a base sequence, It is a concept that includes variants that can perform the same function. Such a variant may comprise a nucleotide sequence having a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% with the conventional nucleotide sequence . &Quot;% of sequence homology to polynucleotides " is ascertained by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I. E., A gap) relative to the < / RTI >
본 발명에 있어서 상기 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. In the present invention, the above-mentioned " recombinant vector " means an expression vector of a desired polypeptide capable of expressing the desired polypeptide at a high efficiency in an appropriate host cell when the coding gene of the desired polypeptide to be expressed is operatively linked , And the recombinant vector can be expressed in host cells.
본 발명에 있어서 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.In the present invention, " operably linked " refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a desired protein to perform a general function. For example, a nucleic acid sequence encoding a promoter and a protein or RNA may be operably linked to affect the expression of the coding sequence. The operative linkage with the recombinant vector can be produced using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage are made using enzymes generally known in the art.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 전이 벡터가 도입된 곤충 세포를 제공한다. The present invention also provides an insect cell into which a recombinant transfer vector according to the present invention is introduced.
본 발명의 곤충 세포는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)의 BT1-Tn-5B1-4 또는 Hi5 (High Five ?) 세포, 리만트리아 디스파(Lymantria dispar)의 LD652Y 세포, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 Sf9 세포, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 Sf21 세포, 드로소필라(Drosophila)의 Kc1 세포, 드로소필라(Drosophila)의 SL2 세포, Bm5 (Bombyx mori 5)세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 곤충 세포일 수 있으며, 바람직하게는 Sf9, Sf21, Hi5 및 Bm5 로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 곤충 세포 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. The insect cells of the present invention include BT1-Tn-5B1-4 or Hi5 (High Five?) Cells of Trichoplusia ni, LD652Y cells of Lymantria dispar, Spodoptera frugiperda Sf9 cells of Spodoptera frugiperda, Sf21 cells of Spodoptera frugiperda, Kc1 cells of Drosophila, SL2 cells of Drosophila, Bm5 ( Bombyx mori 5 ) cells And mosquito cells. Preferably, the insect cells may be one insect cell selected from the group consisting of Sf9, Sf21, Hi5, and Bm5. However, the insect cells include, but are not limited to, no.
본 발명에 있어 곤충 세포는 이를 포함하는 곤충을 모두 포함하는 의미로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. In the present invention, insect cells can be used interchangeably to include all insects including the insect cells.
본 발명에 있어서, "도입" 이란 외부로부터 주어진 DNA를 세포 내에 이식하는 것을 의미하며, 즉 생물의 어떤 계통의 세포(바이러스 세포 제외)에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 진핵 세포에 주입하였을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상이다. 즉, "도입"이란 특정 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. In the present invention, " introduction " means transplanting a DNA given from outside into a cell, that is, transferring DNA, which is a kind of nucleic acid extracted from a cell of some lineage of an organism (except for a virus cell) When injected, DNA enters the cell and changes its genetic trait. That is, " introduction " means that a specific gene can be introduced into a host cell and expressed in the host cell.
본 발명의 재조합 벡터를 세포주에 도입하는 방법은 본 발명의 재조합 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법, 전기천공법, 재분포법 등의 공지 방법으로 수행될 수 있다. The method of introducing the recombinant vector of the present invention into a cell line can be carried out by a known method such as calcium phosphate coprecipitation, DEAE-text treatment, electroporation, redistribution, etc. Lt; / RTI >
또한 본 발명의 곤충 세포는 백미드(bacmid)가 동시에 도입된 곤충세포 일 수 있다. The insect cell of the present invention may be an insect cell into which a bacmid is simultaneously introduced.
용어 "백미드"란, 배큘로바이러스와 플라스미드의 합성어로 baculovirus shuttle vector 를 의미한다. 본 발명에 있어서 백미드는 AcNPV 계열의 bacmid 인 ApGOZA, AcGOZA, BmNPV (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus) 계열로 BpGOZA (int J.indust Entomol Vol. 2. No. 2001, pp155~160 참조), BmGOZA (Biotechnology Letters 23: 1809-1817, 2001 참조) 게놈을 모두 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 AcNPV (Autographa califomica nucleopolyhedrovirus)의 백미드를 사용할 수 있다.The term " backmade " means a baculovirus shuttle vector, which is a combination of baculovirus and plasmid. BmGOZA (Biotechnology Letters 23: 2002), BpGOZA (int.industry entomol Vol. 2. No. 2001, pp 155-160), ApGOZA, AcGOZA and BmNPV (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus) 1809-1817, 2001). All genomes can be used without restriction, and preferably the back mid of AcNPV (Autographa califomica nucleopolyhedrovirus) can be used.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a transformant transformed with said recombinant expression vector.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환, 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다.As used herein, the term " transformation " refers to a change in the genetic properties of an organism by exogenously given DNA, that is, DNA, which is a kind of nucleic acid extracted from cells of a certain lineage of an organism, It is a phenomenon that DNA enters into the cell and the genetic characteristic changes, and it is called transformation, transformation or conversion.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환체"는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환식물 또는 형질전환동물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 변이가 유발되어 생성된 유전자 재조합체를 포함한다. As used herein, the term " transformant " means a transgenic plant or a transgenic animal produced by transformation, and refers to a gene recombinant produced by inducing a modification or mutation of a specific gene using a gene recombination technique .
본 발명에서, 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 CPV의 VP2 단백질 코딩 유전자 및 CDV의 F 단백질의 p35 부위 코딩 유전자를 동시에 삽입하여 형질전환체가 CPV의 VP2 단백질과 CDV의 F 단백질의 p35 부위가 동시에 발현될 뿐만 아니라, 목적 산물인 상기 단백질이 고농도로 생산됨을 확인하였다. In the present invention, the recombinant vector of the present invention is used to simultaneously insert the VP2 protein coding gene of CPV and the p35 region coding gene of F protein of CDV, so that the VP2 protein of CPV and the p35 region of F protein of CDV simultaneously express And that the protein as a target product was produced at a high concentration.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체에 의하여 생산되는 재조합 단백질을 제공하며, 본 발명에서 상기 재조합 단백질은 바이러스 유사입자(Virus-Like Particle, VLP)를 의미한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a recombinant protein produced by the transformant. In the present invention, the recombinant protein refers to a virus-like particle (VLP).
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이러스 유사 입자(Virus-Like Particle, VLP)"는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 소단위체를 지칭한다. 예를 들어, 바이러스 유사 입자는 DNA 또는 RNA 게놈이 완전히 결여될 수도 있다. 추가로, 바이러스성 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자는 자발적 자가 어셈블리를 진행할 수 있다.As used herein, the term " Virus-Like Particle (VLP) " refers to a noninfectious viral subunit with or without a viral protein. For example, virus-like particles may completely lack DNA or RNA genomes. In addition, virus-like particles comprising a viral capsid protein can undergo spontaneous self-assembly.
본 발명은 (a) 개 파보바이러스(Canine Parvovirus, CPV) VP2(viral protein 2) 단백질 및 (b) 개 디스템퍼바이러스(Canine distemper Virus, CDV) F 단백질의 에피톱으로서 p35 부위 융합된 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스 동시 항원성 복합 항원 단백질을 제공한다.The present invention relates to a canine parvovirus (CPV) VP2 (viral protein 2) protein and (b) an canine distemper virus (CDV) Lt; / RTI > antigenic complex antigen protein.
본 발명의 명세서상의 용어 "융합"은 N-말단 또는 C-말단의 아미노산과 펩타이드 결합을 통해 결합되어 있는 것을 의미한다.The term " fused " in the specification of the present invention means that it is bonded to an amino acid at the N-terminal or C-terminal through a peptide bond.
본 발명의 명세서상의 용어 "동시 항원성 복합 항원 단백질" 또는 "이중 항원성 복합 항원 단백질"은 둘 이상의 바이러스 또는 세균으로부터의 항원이 융합되어 각 항원의 특징을 동시에 나타내는 복합 항원 단백질을 의미한다. 상기 복합 항원 단백질은 각 바이러스로부터의 항원 또는 그의 에피톱을 포함할 수 있다.The term " co-antigenic complex antigen protein " or " dual antigenic complex antigen protein " in the specification of the present invention means a complex antigen protein in which two or more viruses or antigens from bacteria are fused to simultaneously exhibit the characteristics of each antigen. The complex antigen protein may comprise an antigen from each virus or an epitope thereof.
상기 F 단백질의 p35 부위를 코딩하는 서열은 CPV VP2 단백질의 N-말단 또는 C-말단 또는 양쪽 말단을 코딩하는 부위에 위치한다.The sequence encoding the p35 region of the F protein is located at the N-terminal or C-terminal or at both ends of the CPV VP2 protein.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 F 단백질의 에피톱은 상기 VP2 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합되어 있는 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 F 단백질의 에피톱은 상기 VP2 단백질의 N-말단에 융합되어 있는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the epitope of the F protein may be fused to the N-terminal or C-terminal of the VP2 protein. Preferably, the epitope of said F protein is fused to the N-terminus of said VP2 protein.
본 발명에서 이들 두 단백질이 발현 과정에서 서로 조립되어 바이러스 유사입자 형태를 형성하며, 본 발명의 바이러스 유사입자는 개파보바이러스 및 개디스템퍼바이러스에 대하여 이중항원성을 나타내므로, 상기 생산된 발현 단백질인 바이러스 유사입자를 함유한 백신을 대상에 접종하면 높은 수준의 이중 항체가 생성되므로, 탁월한 예방 효과를 나타낼 수 있어, CPV와 CDV 모두에 백신으로 이용될 수 있다.In the present invention, these two proteins are assembled together to form a virus-like particle shape during the expression process. Since the virus-like particles of the present invention exhibit double antigenicity against canine parvovirus and dog distemper virus, Inoculating a vaccine containing virus-like particles into a subject produces a high level of double antibody, which can be used as a vaccine for both CPV and CDV because of its excellent preventive effect.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스 감염에 의한 질환 예방용 백신 조성물을 제공한다.According to still another aspect of the present invention, there is provided a vaccine composition for preventing disease caused by canine parvovirus infection and canine distemper virus infection, comprising the virus-like particle as an active ingredient.
본 발명의 백신 조성물은 백신 효과를 가지는 단백질 항원을 투여함으로써 이후의 병원균 감염을 예방하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 상기 단백질 항원은 상술한 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스 모두에 이중항원성을 나타내는 바이러스 유사입자를 의미한다.The vaccine composition of the present invention is characterized by preventing a subsequent pathogenic infection by administering a protein antigen having a vaccine effect. In the present invention, the protein antigen means virus-like particles exhibiting dual antigenicity in both of the dog parvovirus and dog distemper virus described above.
상기 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 보조제(adjuvant), 면역 자극제(immune stimulator) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.The vaccine composition may comprise any one selected from the group consisting of a pharmaceutically acceptable carrier, an adjuvant, an immune stimulator, and combinations thereof.
이에 적합한 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.Suitable carriers are well known in the art and include, but are not limited to, proteins, sugars, and the like. Such carriers may be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Examples of non-aqueous carrier include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable organic ester such as ethyl oleate. Aqueous carriers include water, alcohol / aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media. Parenteral carriers include sodium chloride solution, Ringer ' s dextrose, dextrose and sodium chloride, lactic acid treatment linger or fixed oils. The intravenous carrier includes electrolyte supplements, liquids and nutritional supplements, such as those based on Ringer ' s dextrose. Preservatives and other additives such as antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents, inert gases and the like may be additionally present. Preferred preservatives include formalin, thimerosal, neomycin, polyamicin B and amphotericin B.
또한, 상기 백신 조성물은 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 보조제는 프로인트 완전애주번트, 프로인트 불완전애주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 보조제는 Fort Dodge Animal Health의 METASTIM 애주번트이다. In addition, the vaccine composition may further comprise an adjuvant. Such adjuvants include any absorption-promoting agent which refers to a compound or mixture that promotes an immune response and / or promotes the rate of absorption after inoculation. Acceptable adjuvants include, but are not limited to, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, saponin, mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyvalent anions, peptides, oils or hydrocarbon emulsions, , Dinitrophenol, and the like, but are not limited thereto. A preferred adjuvant is the METASTIM adjuvant of Fort Dodge Animal Health.
본 발명의 목적을 위한 백신 조성물의 투여량은 체중 1kg 당 0.01 ㎖ 내지 1 ㎖, 바람직하게는 체중 1kg당 0.2 ㎖ 내지 0.4 ㎖이다.The dosage of the vaccine composition for the purposes of the present invention is from 0.01 ml to 1 ml per kg of body weight, preferably from 0.2 ml to 0.4 ml per kg of body weight.
본 발명의 백신 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌 내로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The vaccine composition of the present invention may be administered through at least one route selected from the group consisting of muscle, subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, oral, dermal, ocular, and brain.
본 발명의 백신 조성물의 유효성분인 바이러스 유사입자는 천연에서 추출하여 수득하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 다음과 같은 방법에 의해 수득할 수 있다. 항원 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 상기 형질전환체를 배양한 뒤, 형질전환체로부터 항원 단백질을 획득하는 과정으로 이루어진다. 상세한 과정은 하기에서 설명된다.Virus-like particles, which are effective components of the vaccine composition of the present invention, can be obtained by extraction from nature or by using recombinant techniques. When the recombinant DNA technology is used, it can be obtained by the following method. Inserting a nucleic acid sequence encoding an antigen protein into an appropriate expression vector, transforming the vector with a host cell, culturing the transformant, and obtaining an antigen protein from the transformant. The detailed procedure is described below.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스 감염에 의한 질환 예방용 바이러스 유사입자의 제조방법을 제공한다:According to yet another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing virus-like particles for preventing diseases caused by canine parvovirus and candysperm virus infection, comprising the steps of:
(a) 서열번호 1로 표시되는 개 파보바이러스(Canine Parvovirus)의 VP2 단백질을 코딩하는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 개 디스템퍼바이러스(Canine distemper Virus)의 F 단백질 p35 부위를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;(a) a nucleotide sequence encoding the VP2 protein of Canine Parvovirus represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence encoding the F protein p35 region of Canine distemper virus of SEQ ID NO: 2 Preparing a recombinant expression vector containing the recombinant expression vector;
(b) 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환체를 제조하는 단계; (b) preparing a transformant using the recombinant expression vector;
(c) 상기 형질전환체를 숙주세포에 형질감염(transfection)시키는 단계;(c) transfecting the transformant into a host cell;
(d) 상기 형질감염된 숙주세포를 배양하고, 그 배양물을 수득하는 단계; 및(d) culturing the transfected host cell and obtaining a culture thereof; And
(e) 상기 배양물로부터 바이러스 유사입자를 수득하는 단계.(e) obtaining virus-like particles from the culture.
본 방법은 상기 배양물로부터 바이러스 유사입자를 수득하는 단계에서, 바이러스 유사입자가 포함된 상기 배양물의 상층액을 일련의 과정을 거치지 않고 바이러스 유사입자가 포함된 원액 자체로서 백신항원으로 이용하고, 숙주세포는 일련의 과정을 거쳐서 백신항원으로 제조할 수 있다. 예컨대, 숙주세포에서 발현된 바이러스 유사입자를 별도의 정제과정을 거치지 않거나 또는 정제하여 배양된 숙주세포를 파쇄하여 제조한 세포 용해물을 그대로 사용할 수 있다.The present method is characterized in that, in the step of obtaining virus-like particles from the culture, the supernatant of the culture containing the virus-like particles is used as a vaccine antigen as the undiluted antigen itself not containing a series of steps, Cells can be produced as a vaccine antigen through a series of processes. For example, the viral-like particles expressed in the host cell may be used as they are, without any separate purification process, or may be prepared by lysing the host cells cultured and purified.
또한, 본 발명의 방법에 따르면 본 발명의 바이러스 유사입자를 보다 용이하게 대량으로 생산할 수 있어 경제적인 면에서 매우 유리한 장점이 있다. In addition, according to the method of the present invention, the virus-like particles of the present invention can be produced more easily in a large amount, which is advantageous in terms of economy.
종래의 경우 인공 감염된 개의 장기를 이용하여 백신 항원 조성물을 제조하므로, 특수 동물 실험시설과 동물 사육 및 위생관리 조건을 갖춘 특수 실험시설에서만 제조가 가능하다. 반면, 본 발명의 방법으로 바이러스 유사입자를 항원으로서 생산하는 경우, 상술한 종래 방식과 달리 세포만을 이용하여 단기간에 단백질 항원을 대량 생산할 수 있는 우수한 효과가 있다.Since the vaccine antigen composition is prepared using artificially infected dog organs in the past, it can be manufactured only in a special laboratory equipped with special animal testing facilities and animal breeding and hygiene management conditions. On the other hand, when the virus-like particle is produced as an antigen by the method of the present invention, unlike the conventional method described above, there is an excellent effect that a protein antigen can be mass-produced in a short time using only cells.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된 고정된 숙주 세포, 숙주 세포 추출물, 또는 상기 숙주세포로부터 생산되거나 또는 화학 합성에 의해 생산된 부분적으로 또는 완전히 정제된 바이러스 유자입자로 이루어질 수 있다.In addition, the vaccine composition of the present invention may be a fixed host cell prepared according to the method of the present invention, a host cell extract, or a partially or fully purified viral particle produced from the host cell or produced by chemical synthesis .
본 방법은 상술한 형질전환체를 이용하여 바이러스 유사입자를 제조하므로, 상술한 형질전환체와 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since this method uses the transformants described above to produce virus-like particles, the duplicate contents of the above-mentioned transformants are omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification due to the overlapping description of the contents.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 바이러스 유사입자(Virus-Like Particle, VLP)를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스 감염에 의한 질환 예방 방법을 제공한다.According to still another aspect of the present invention, the present invention provides a method for preventing and treating canine parvovirus infection, comprising administering a vaccine composition containing the virus-like particle (VLP) as an active ingredient to a mammal other than a human, Provides a method for preventing diseases caused by distemper virus infection.
바람직하게는 상기 포유동물은 개, 고양이, 소, 돼지, 염소, 양, 말, 토끼 및 쥐로 이루어진 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 개이다.Preferably said mammal is selected from the group consisting of dogs, cats, cows, pigs, goats, sheep, horses, rabbits and rats, most preferably dogs.
상기 조성물의 투여는 경구, 비강, 복막, 정맥, 피하, 근육 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 투여될 수 있다.Administration of the composition may be administered by any method selected from the group consisting of oral, nasal, peritoneal, intravenous, subcutaneous, muscular, and combinations thereof.
본 발명의 방법은 상술한 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하므로, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the method of the present invention uses a composition comprising the above-mentioned virus-like particle as an active ingredient, the contents overlapping with the above-described composition of the present invention are not limited to the above description It is omitted.
본 발명은 개 파보바이러스의 주요 항원인 VP2 단백질과 개디스템퍼 바이러스의 주요 항원인 F-단백질의 p35 부위를 융합시켜 생성한 바이러스 유사입자 및 이의 제조 방법을 제공하며, 본 발명의 방법에 따라 제조된 융합 단백질은 두 가지 바이러스의 동시 항원성을 가지는 바이러스 유사 입자이므로 이를 다양한 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료에 효과적으로 이용할 수 있다.The present invention provides a virus-like particle produced by fusing the VP2 protein, which is the main antigen of canine parvovirus, with the p35 region of F-protein, which is a major antigen of the dog distemper virus, and a method for producing the same. Since the fusion protein is a virus-like particle having the simultaneous antigenicity of two viruses, it can be effectively used for prevention and treatment of infectious diseases caused by various viruses.
도 1은 CPV-CDV에 대한 이중항원 바이러스 유사입자 제작을 위한 재조합 배큘로바이러스 제작 과정 모식도를 보여준다.
도 2는 재조합 배큘로바이러스의 제작 여부 및 순수성을 보여준다.
도 3은 Bm5 세포주에서의 CPV-N-VP2, CPV-N-VP2-C, CPV-VP2-C 단백질 발현 여부 검정 결과를 보여준다.
도 4는 투과전자현미경을 이용하여 제작된 VLP의 관찰 결과를 보여준다.
도 5는 CPV-CDV에 대한 이중항원 바이러스 유사입자의 고발현을 위하여 발현 효율이 향상되도록 제작한 재조합 전이 벡터의 모식도를 보여준다.
도 6은 발현 효율이 향상된 재조합 전이 벡터를 이용하여 제작된 재조합 바이러스의 이중 항원성 확인 결과를 보여준다.
도 7은 투과전자현미경을 이용하여 제작된 VLP의 관찰 결과를 보여준다.
도 8은 누에 세포주에서의 본 발명의 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스에 대한 이중-항원성을 갖는 재조합 단백질의 발현 결과를 보여준다.1 shows a schematic diagram of recombinant baculovirus production for production of double antigen virus-like particles against CPV-CDV.
Figure 2 shows the production and purity of the recombinant baculovirus.
FIG. 3 shows the results of CPV-N-VP2, CPV-N-VP2-C and CPV-VP2-C protein expression test in Bm5 cell line.
4 shows the observation result of the VLP produced using the transmission electron microscope.
FIG. 5 shows a schematic diagram of a recombinant transfer vector prepared so as to enhance the expression efficiency for high expression of double antigen virus-like particles against CPV-CDV.
FIG. 6 shows the result of double antigenicity determination of a recombinant virus prepared using a recombination transfer vector with improved expression efficiency.
FIG. 7 shows the observation results of VLPs fabricated using a transmission electron microscope.
FIG. 8 shows the results of expression of a recombinant protein having double-antigenicity against canine parvovirus and candysperm virus of the present invention in silkworm cell line.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention as defined by the appended claims. It will be obvious to you.
실시예 1. 재조합 전이벡터 및 재조합 바이러스 제작Example 1 Preparation of Recombinant Transition Vector and Recombinant Virus
본 발명자들은 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스에 대한 이중 항원성을 갖는 바이러스 유사 입자를 획득하기 위하여, CPV의 주요 항원으로 작용하는 VP2 단백질 유전자(서열번호 1)를 기반으로 CDV의 주요항원 부위로 보고된 F protein의 p35 서열(서열번호 2)을 VP2 유전자를 중심으로 N-말단, C-말단, N-과 C- 양 말단에 각각 융합발현할 수 있는 배큘로바이러스 전이벡터를 제작하였다(도 1). 구체적으로는 누에핵다각체병바이러스(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus: BmNPV)를 기반으로 하는 발현벡터인 pBmKSK3에 CPV VP2 유전자 N-말단, N-C말단, C-말단에 CDV의 p35 서열을 융합한 목적유전자를 각각 클로닝하여 pBmKSK3-N-VP2, pBmKSK3-N-VP2-C, pBmKSK3-VP2-C를 각각 제작하였다. In order to obtain virus-like particles having dual antigenicity against canine parvovirus and dog distemper virus, the inventors of the present invention reported on the major antigen site of CDV based on the VP2 protein gene (SEQ ID NO: 1) acting as a major antigen of CPV A baculovirus transfer vector capable of fusing and expressing the p35 sequence (SEQ ID NO: 2) of the F protein with the VP2 gene at the N-terminus, C-terminus, and N- and C- ends was prepared ). Specifically, the target gene fused with pBmKSK3, which is an expression vector based on Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), is fused with the N-terminal of CPV VP2 gene, the NC terminus, and the p35 sequence of CDV at the C- PBmKSK3-N-VP2, pBmKSK3-N-VP2-C and pBmKSK3-VP2-C, respectively.
제작된 각 벡터는 바이러스 증식능이 결여된 Bacmid인 BpGOZA DNA와 누에 세포주인 Bm5 세포에 동시전이(cotransfection)시켜 벡터와 바이러스 DNA간의 상동재조합 과정을 목적 유전자를 지닌 재조합 바이러스 rBP-CPV-NVP2, rBP-CPV-N-VP2-C, rBP-CPV-VP2-C를 각각 제작하였다(도 1). 제작된 재조합 바이러스에서 목적 유전자의 존재와 바이러스의 순수성은 PCR 검출을 통해 확인하였다. PCR 검정은 다각체단백질 유전자의 프로모터(polyhedrin promoter) 부위(서열번호 3)와 목적 유전자에 대한 특이 프라이머(서열번호 4)로 증폭을 실시하여 목적 유전자의 존재를 확인하였다(도 2A). Each vector was cotransfected into BpGOZA DNA, which is a Bacmid lacking viral replication ability, and Bm5 cells, a silkworm cell line, and the recombinant viruses rBP-CPV-NVP2 and rBP- CPV-N-VP2-C and rBP-CPV-VP2-C, respectively (Fig. 1). The presence of the target gene and the purity of the virus in the prepared recombinant virus were confirmed by PCR detection. PCR was performed by amplifying the polyhedrin promoter region (SEQ ID NO: 3) of the polymorphic protein gene and the specific primer (SEQ ID NO: 4) for the target gene to confirm the presence of the desired gene (FIG. 2A).
또한, 재조합 바이러스의 순수성은 BpGOZA에만 존재하는 mini-F 특이적인 프라이머(서열번호 5) 및 mini-R 특이적인 프라이머(서열번호 6)로 PCR 증폭하여 재조합 바이러스에 그 서열이 존재하지 않음으로 판별하였다(도 2B).In addition, the purity of the recombinant virus was determined by PCR amplification with a mini-F specific primer (SEQ ID NO: 5) and mini-R specific primer (SEQ ID NO: 6) existing only in BpGOZA and no sequence in the recombinant virus (Fig. 2B).
실시예 2. 이중 항원성 및 VLP 형성 확인Example 2. Identification of Dual Antigenicity and VLP Formation
본 발명자들은 재조합 바이러스에 의한 목적 단백질의 발현 확인을 위하여 Bm5 세포에 각 재조합 바이러스를 5MOI(multiplicity of infection)로 접종하고 접종 후 3일에 바이러스에 감염된 세포를 수거하였다. 수거한 세포를 단백질 시료용액으로 용해시키고 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동 결과, CPV의 VP2 단백질에 해당하는 64kDa(위 화살표)과 p35가 융합된 약 66kDa 크기의 융합 단백질(아래 화살표) 위치에 단백질 밴드가 존재하였으며, VP2 및 p35 항체를 각각 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 목적 단백질임을 확인하였다(도 3).In order to confirm the expression of the target protein by the recombinant virus, the present inventors inoculated each recombinant virus into Bm5 cells with 5 MOI (multiplicity of infection) and harvested the virus-infected cells on the 3rd day after inoculation. The collected cells were dissolved in a protein sample solution and subjected to electrophoresis using 10% SDS-PAGE. As a result of the electrophoresis, there was a protein band at a position of about 66 kDa fusion protein (below arrow) in which 64 kDa (upper arrow) corresponding to VP2 protein of CPV and p35 were fused and Western blot analysis using VP2 and p35 antibodies (Fig. 3).
CPV-VP2와 p35서열의 융합 발현에 의한 VLP 형성 여부를 확인하기 위하여 각 재조합바이러스 감염 후 72시간된 Bm5 세포를 수거하고 용해시킨 후, 상층액을 초원심분리를 통해 농축한 다음 투과전자현미경 관찰을 실시하였다. 투과전자현미경 관찰 결과, 3가지 재조합 바이러스 모두에서 VLP 형성이 확인되었다(도 4; 화살표로 표시).In order to confirm the formation of VLPs by the fusion of CPV-VP2 and p35 sequences, 72-hour-old Bm5 cells were harvested and dissolved after each recombinant virus infection. The supernatant was concentrated by ultracentrifugation, Respectively. Transmission electron microscopy confirmed the formation of VLPs in all three recombinant viruses (FIG. 4; indicated by arrows).
이상의 결과로 CPV-VP2와 CDV p35 서열이 융합 발현된 재조합 단백질은 CPV-VP2 및 CDV-p35에 대해서 모두 항원성을 가지며 바이러스 유사 입자 형태로 발현됨을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the recombinant protein in which the CPV-VP2 and CDV p35 sequences were fused was expressed as a viral-like particle having both antigenicity for CPV-VP2 and CDV-p35.
실시예 3. 발현 효율이 향상된 재조합 전이 벡터를 이용한 재조합 바이러스 제작 Example 3 Production of Recombinant Virus Using Recombinant Transformation Vector with Improved Expression Efficiency
본 발명자들은 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스에 대한 이중 항원성을 갖는 바이러스 유사 입자의 발현 수준을 향상시키기 위하여, 발현 효율이 향상된 재조합 전이 벡터를 추가적으로 제작하였으며, 상기 재조합 전이 벡터를 이용하여, CPV의 주요 항원으로 작용하는 VP2 단백질 유전자(서열번호 1) 및 CDV의 주요항원 부위로 보고된 F 단백질의 p35 서열(서열번호 2)을 발현하는 바이러스 유사 입자(VLP)를 제작하였다. In order to improve the expression level of virus-like particles having dual antigenicity against canine parvovirus and dog distemper virus, the present inventors further produced a recombinant transfer vector with improved expression efficiency, and using the recombinant transfer vector, Virus-like particles (VLP) expressing the VP2 protein gene (SEQ ID NO: 1) acting as a major antigen and the p35 sequence (SEQ ID NO: 2) of F protein reported as a major antigen site of CDV were prepared.
먼저, 발현 효율이 향상되도록 디자인한 재조합 벡터의 개열 지도는 도 5에 나타냈으며, 이의 제작 방법은 다음과 같다: First, the cleavage map of the recombinant vector designed to improve the expression efficiency is shown in FIG. 5, and the production method thereof is as follows:
도 1에 나타낸 pBmKSK3-N-VP2로부터 CPV의 VP2 단백질 유전자(서열번호 1)의 N-말단에 CDV의 주요 항원 부위인 F 단백질의 p35 서열(서열번호 2)이 붙어있는 유전자를 특이적 프라미머를 이용하여 PCR로 증폭하였으며, pMD20-T-Vector (Takara, Japan)로의 클로닝을 진행하였다. The gene having the p35 sequence (SEQ ID NO: 2) of the F protein, which is the major antigenic site of CDV, is attached to the N-terminus of the VP2 protein gene (SEQ ID NO: 1) of CPV from pBmKSK3-N- , And cloned into pMD20-T-Vector (Takara, Japan).
도 5에 나타낸 재조합 전이 벡터(pFBpol6-EGFP)를 제작하기 위하여 pMD20-T-Vector (Takara, Japan)에 클로닝 되어있는 vp39 프로모터 서열 (서열번호 8); 다각체 단백질 유전자 (polyhedrin gene) 프로모터 서열 (서열번호 10); Burst 서열 (서열번호 9) 4 반복의 순서 조합을 제한효소를 처리한 뒤 pFastBac HT A vector (Invitrogen, USA)에 동일한 제한효소 조합을 처리 후 라이게이션(ligation) 반응하여 클로닝을 진행하였다. 이렇게 제작된 상기 각각의 플라스미드는 제한효소 처리와 염기서열 분석을 통해 최종 확인하였으며, 각각 pMD20-T-CPV-N-VP2와 pFBpol6-EGFP라 명명하였다.The vp39 promoter sequence (SEQ ID NO: 8) cloned in pMD20-T-Vector (Takara, Japan) to construct the recombination transfer vector (pFBpol6-EGFP) shown in Fig. 5; A polyhedrin gene promoter sequence (SEQ ID NO: 10); (SEQ ID NO: 9). The restriction enzyme was treated with the restriction enzyme, and the same restriction enzyme combination was treated with pFastBac HTA vector (Invitrogen, USA), followed by ligation reaction. Each of the plasmids thus constructed was finally identified by restriction enzyme treatment and sequencing, and was named pMD20-T-CPV-N-VP2 and pFBpol6-EGFP, respectively.
상기 제작된 pMD20-T-CPV-N-VP2에 제한효소를 처리하여 개 파보바이러스와 개 디스템퍼 바이러스의 항원 부위를 가지는 유전자 서열(CPV-N-VP2)을 절단하였고, pFBpol6-EGFP에 클로닝 가능한 제한효소의 조합을 처리하여 절단한 뒤 이에 CPV-N-VP2를 클로닝하였다. 제작된 재조합 전이 벡터는 도 5에 나타내었으며, pFBpol6-CPV-N-VP2로 나타내었다.The prepared pMD20-T-CPV-N-VP2 was treated with restriction enzymes to cleave the gene sequence (CPV-N-VP2) having an antigenic region of canine parvovirus and dog distemper virus, and the cloning restriction in pFBpol6-EGFP And then CPV-N-VP2 was cloned. The prepared recombinant transfer vector is shown in Fig. 5 and is represented by pFBpol6-CPV-N-VP2.
다음으로, 본 발명자들은 상기 제조된 재조합 벡터가 도입된 재조합 바이러스를 제작하기 위하여, 상술한 재조합 전이벡터 DNA를 BmBacmid가 존재하는 E.coli에 형질전환하여 DNA간에 전위에 의해 재조합 백미드를 제작하였다. 제작된 재조합 바이러스를 선발하여 DNA를 추출하여 재조합 백미드 3 ㎍을 그레이스 배지(Grace's Insect Medium, unsupplemented, Invitrogen, USA)에 혼합하고, 형질감염(transfection) 제제인 Cellfectin® II Reagent (Invitrogen, USA) 8 ㎕를 100 ㎕의 그레이스 배지(Grace's Insect Medium, unsupplemented, Invitrogen, USA)에 첨가하여 각각의 혼합액(mixture)은 재혼합하여 27℃에서 30분간 반응시켰으며, 반응이 종료된 혼합액은 1.0 X 106 cells/㎖로 분주된 Bm5 세포에 접종(transfection)하였다. 접종 3일 후부터 위상차 현미경을 이용하여 재조합 바이러스의 생성을 확인하였고, rBp-FBpol6-CPV-N-VP2로 나타내었다. Next, in order to produce a recombinant vector into which the recombinant vector was introduced, the present inventors transformed the recombinant transfer vector DNA described above into E. coli containing BmBacmid to prepare a recombinant backmade by translocation between DNAs . 3 μg of the recombinant Bacmid was mixed with Grace's Insect Medium (unsupplemented, Invitrogen, USA) and the transfection agent, Cellfectin® II Reagent (Invitrogen, USA) (Grace's Insect Medium, unsupplemented, Invitrogen, USA). The mixture was re-married and reacted at 27 ° C for 30 minutes. The reaction mixture was terminated by 1.0 × 10 6 cells / ml. < / RTI > From 3 days after the inoculation, the production of recombinant virus was confirmed using a phase contrast microscope and expressed as rBp-FBpol6-CPV-N-VP2.
실시예 4. 발현 효율이 향상된 재조합 전이 벡터를 이용하여 제작된 재조합 바이러스의 이중 항원성 확인Example 4. Double antigenicity determination of recombinant viruses prepared using recombinant transfer vectors with improved expression efficiency
본 발명자들은 상술한 실시예 3에서 제조된 재조합 바이러스에 의한 목적 단백질의 발현 확인을 위하여 Bm5 세포에 야생주 바이러스 (BmNPV); 일반적인 재조합 전이 벡터로 제작된 개 파보바이러스의 항원 단백질인 VP2만을 발현할 수 있는 재조합 바이러스 (rBp-CPV-VP2); 도 1에 나타낸 rBp-CPV-N-VP2; 발현 효율이 향상된 재조합 전이 벡터를 이용하여 제작된 재조합 바이러스(rBp-FBpol6-CPV-N-VP2)를 각각 5MOI(multiplicity of infection)로 접종하고 접종 후 3일에 바이러스에 감염된 세포를 수거하였다. 수거한 세포를 단백질 시료용액으로 용해시키고 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 실시하였다(도 6a). To confirm the expression of a target protein by the recombinant virus prepared in Example 3, the present inventors used Bm5 cells as wild-type virus (BmNPV); A recombinant virus (rBp-CPV-VP2) capable of expressing only VP2, an antigen protein of canine parvovirus prepared with a general recombination transfer vector; RBp-CPV-N-VP2 shown in Fig. 1; The recombinant virus (rBp-FBpol6-CPV-N-VP2) prepared by using the recombinant transfer vector with improved expression efficiency was inoculated with 5 MOI (multiplicity of infection) and the virus-infected cells were harvested 3 days after inoculation. The collected cells were dissolved in a protein sample solution and subjected to electrophoresis using 10% SDS-PAGE (FIG. 6A).
그 결과, 도 6a 내지 도 6c에 나타낸 바와 같이, CPV의 VP2 단백질에 해당하는 64kDa과 p35가 융합된 약 66kDa 크기의 융합 단백질 위치에 단백질 밴드가 존재하였으며, VP2 항체(도 6b) 및 p35 항체(도 6c)를 각각 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 목적 단백질임을 확인하였다.As a result, as shown in Figs. 6A to 6C, there was a protein band at the position of the fusion protein of about 66 kDa in which 64 kDa and p35 were fused, corresponding to VP2 protein of CPV, and the VP2 antibody (Fig. 6B) and the p35 antibody Fig. 6C), respectively.
따라서, 상술한 실시예 3에서 제조된 재조합 벡터에 의해서 CPV-VP2와 CDV p35 서열이 융합 발현된 재조합 단백질은 CPV-VP2 및 CDV-p35에 대해 모두 항원성, 즉, 이중항원성을 나타내는 것을 확인하였다. Therefore, it was confirmed that the recombinant protein in which the CPV-VP2 and CDV p35 sequences were fused and expressed by the recombinant vector prepared in Example 3 exhibited antigenicity, that is, double antigenicity, against CPV-VP2 and CDV-p35 Respectively.
또한, 발현량이 저조하던 CPV-N-VP2의 경우, 상술한 실시예 3에서 제조된 재조합 전이 벡터에 의해서 CPV-VP2 정도로 증가되는 것을 확인할 수 있었다.In addition, CPV-N-VP2, which had a low expression level, was increased to about CPV-VP2 by the recombinant transfer vector prepared in Example 3 described above.
또한, 본 발명자들은 상술한 실시예 3에서 제조된 재조합 전이 벡터를 통한 CPV-VP2와 p35서열의 융합 발현에 의한 VLP 형성 여부를 확인하였다. 이를 위해, 각 재조합바이러스 감염 후 72 시간된 Bm5 세포를 수거하고 용해시킨 후, 상층액을 초원심분리를 통해 농축한 다음 투과전자현미경 관찰을 실시하였다. In addition, the present inventors confirmed the formation of VLP by fusion expression of CPV-VP2 and p35 sequences through the recombinant transfer vector prepared in Example 3 described above. For this, Bm5 cells were harvested and dissolved 72 hours after each recombinant virus infection, and the supernatant was concentrated by ultracentrifugation and then observed by transmission electron microscope.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, VLP 형성이 확인되었다(화살표로 표시).As a result, as shown in Fig. 7, VLP formation was confirmed (indicated by an arrow).
이상의 결과로 CPV-VP2와 CDV p35 서열이 융합 발현된 재조합 단백질은 CPV-VP2 및 CDV-p35에 대해서 모두 항원성을 가지며 바이러스 유사 입자 형태로 발현됨을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the recombinant protein in which the CPV-VP2 and CDV p35 sequences were fused was expressed as a viral-like particle having both antigenicity for CPV-VP2 and CDV-p35.
실시예 5. 누에 세포주에서의 본 발명의 개 파보바이러스 및 개 디스템퍼바이러스에 대한 이중-항원성을 갖는 재조합 단백질의 발현Example 5 Expression of Recombinant Proteins Having Double-Antigenicity to Dog Parvovirus and Dog Distemper Virus of the Present Invention in Silkworm Cell Lines
본 발명자들은 상술한 실시예 3에서 제조된 재조합 바이러스에 의한 목적 단백질의 발현 확인을 위하여 누에 충체에 야생주 바이러스 (BmNPB); 일반적인 재조합 전이 벡터로 제작된 개 파보바이러스의 항원 단백질인 VP2를 발현할 수 있는 재조합 바이러스 (rBp-CPV-VP2); 도 1에 나타낸 rBp-CPV-N-VP2; rBp-CPV-N-VP2-C; rBp-CPV-VP2-C를 각각 5MOI(multiplicity of infection)로 접종하고 접종 후 3일에 바이러스에 감염된 누에 충체를 수거하였다. 누에 충체에서 지방체와 혈림프를 분리한 뒤 단백질 시료용액으로 용해시키고 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 실시하였다.In order to confirm the expression of the target protein by the recombinant virus prepared in Example 3, the present inventors used wild-type virus (BmNPB); A recombinant virus (rBp-CPV-VP2) capable of expressing VP2, an antigen protein of canine parvovirus prepared with a general recombination transfer vector; RBp-CPV-N-VP2 shown in Fig. 1; rBp-CPV-N-VP2-C; rBp-CPV-VP2-C were each inoculated with 5 MOI (multiplicity of infection), and virus-infected silkworms were collected on the 3rd day after inoculation. The lipids and the hemolymph were separated from the silkworms, dissolved in protein sample solution, and subjected to electrophoresis using 10% SDS-PAGE.
그 결과, 도 8a 내지 8f에 나타낸 바와 같이, 지방체를 이용한 그룹(도 7a 내지 도 7c) 및 혈림프를 이용한 그룹(도 7d 내지 도 7f)에서 CPV의 VP2 단백질에 해당하는 64kDa과 p35가 융합된 약 66kDa 크기의 융합 단백질 위치에 단백질 밴드가 존재하였으며, VP2 항체(도 7b 및 7e) 및 p35 항체(도 7c 및 도 7f)를 각각 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 목적 단백질임을 확인하였다.As a result, as shown in Figs. 8A to 8F, 64 kDa and p35 corresponding to the VP2 protein of CPV in the fat body group (Figs. 7A to 7C) and the hemolymph group (Figs. 7D to 7F) The protein band was located at the fusion protein of about 66 kDa in size and confirmed to be the target protein by Western blot analysis using the VP2 antibody (FIGS. 7B and 7E) and the p35 antibody (FIGS. 7C and 7F), respectively.
따라서, 상술한 실시예 3에서 제조된 재조합 벡터에 의해서 CPV-VP2와 CDV p35 서열이 융합 발현된 재조합 단백질은 누에 충체에서도 CPV-VP2 및 CDV-p35에 대해 모두 항원성, 즉, 이중항원성을 나타내는 단백질을 발현하는 것을 확인하였다.Therefore, the recombinant protein in which the CPV-VP2 and CDV p35 sequences are fused by the recombinant vector prepared in the above-mentioned Example 3 has both antigenicity, i.e., dual antigenicity, against CPV-VP2 and CDV-p35 in the silkworm Lt; / RTI > protein.
따라서, 본 발명의 이중 항원성 VLP 백신용 항원은 두 가지 질병에 대한 중화항체를 형성할 수 있으며, 살아있는 개 파보바이러스나 개 디스템퍼 바이러스를 직접 다루지 않아도 되기에 안전한 생산 및 시간과 비용을 절감할 수 있다. 또한, 본 발명에서 제작된 CPV-CDV VLP의 기술적 방법을 이용하여 또 다른 바이러스 질병에 관련된 구조 단백질과 중화항체 형성 부위의 융합을 통해 또 다른 바이러스 질병을 예방할 수 있는 다양한 VLP 백신용 항원 제작이 가능하다.Thus, the dual antigenic VLP vaccine antigens of the present invention can form neutralizing antibodies against two diseases and do not have to deal directly with live dog parvovirus or dog distemper virus, thus saving production time and cost have. In addition, by using the technical method of CPV-CDV VLP prepared in the present invention, it is possible to produce various VLP vaccine antigens that can prevent another viral disease through fusion of structural proteins and neutralizing antibody forming sites related to another viral disease Do.
<110> Optipharm.CO.,LTD Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Virus Like Particle with Dual-Antigenicity, Vaccine Composition for Preventing Diseases from Canine Parvovirus and Canine distemper Virus Infection Comprising the Same, and Method for Manufacturing Thereof <130> OPI1-49P-1 <150> KR 10-2017-0114606 <151> 2017-09-07 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1755 <212> DNA <213> Canine Parvovirus <400> 1 atgtctgacg gagcagtaca accggacggt ggtcaacctg cagtacgcaa cgaaagagcc 60 acgggctccg ggaacggaag cggaggcgga ggtggtggcg gttctggggg tgtgggcatt 120 agcacgggca cgttcaataa tcagacggag tttaaattct tggaaaacgg atgggtggag 180 atcacagcga actcaagcag attggtgcat ttaaatatgc ccgaatccga aaactatagg 240 cgagtggttg tcaacaatct ggacaagact gccgttaacg gaaacatggc tctggacgac 300 acccacgccc agatcgtaac accttggtca ctcgttgatg ccaacgcgtg gggagtgtgg 360 ttcaacccag gcgattggca actaattgtc aacactatga gtgagttgca cttggtcagt 420 ttcgagcagg agatctttaa cgtcgtcctc aagactgttt 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aaattttttg tgtttggaat tagtcttttt cacgcttgat 120 attatgttat tgcaagcgct ctgaataggt atacgagtgc gaaagccgtt ttcgtcgtac 180 aaatcgaaat attgttgtgc cagcgaataa ttaggaacaa tataagaatt taaaatttta 240 tacaacaaat cttggctaaa atttattgaa taagagattt ctttctcaat cataaaattg 300 ccgtggtcca tatttataac ggcaacaat 329 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Burst sequence <400> 9 ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat 40 <210> 10 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyhedrin gene promotor sequence <400> 10 caaataaata agtattttac tgttttcgta acagttttgt aataaaaaaa cctataaat 59 <110> Optipharm.CO., LTD Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Virus Like Particle with Dual-Antigenicity, Vaccine Composition for Preventing Diseases from Canine Parvovirus and Canine distemper Virus Infection Comprising the Same, and Method for Manufacturing Thereof <130> OPI1-49P-1 <150> KR 10-2017-0114606 <151> 2017-09-07 <160> 10 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 1755 <212> DNA <213> Canine Parvovirus <400> 1 atgtctgacg gagcagtaca accggacggt ggtcaacctg cagtacgcaa cgaaagagcc 60 acgggctccg ggaacggaag cggaggcgga ggtggtggcg gttctggggg tgtgggcatt 120 agcacgggca cgttcaataa tcagacggag tttaaattct tggaaaacgg atgggtggag 180 atcacagcga actcaagcag attggtgcat ttaaatatgc ccgaatccga aaactatagg 240 cgagtggttg tcaacaatct ggacaagact gccgttaacg gaaacatggc tctggacgac 300 acccacgccc agatcgtaac accttggtca ctcgttgatg ccaacgcgtg gggagtgtgg 360 ttcaacccag gcgattggca actaattgtc aacactatga gtgagttgca cttggtcagt 420 ttcgagcagg agatctttaa cgtcgtcctc aagactgttt cagaatcggc tactcaacca 480 cccactaagg tgtacaataa tgatcttacc gcatcgttga tggtcgccct tgattcaaat 540 aatactatgc ctttcacacc cgctgctatg agatccgaga cattgggctt ctacccgtgg 600 aaaccaacca tacctacccc atggagatat tacttccagt gggataggac actcatccct 660 tctcatactg gcactagtgg aacgccgaca aacatttacc acggtacaga ccctgatgac 720 gtcagtttt acacaatcga aaattctgtg ccagtacacc tcctgcgtac cggtgacgaa 780 tttgctaccg 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cttggaatcc aatccaacag atgagtatca atgtagacaa tcagttcaac 1680 tacgtcccct ccaacatcgg aggcatgaaa atcgtatacg aaaagagcca actcgcaccc 1740 cgcaaattgt actaa 1755 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Canine distemper Virus <400> 2 atgaccgccg ctcaaattac cgccggtatt gctctgcacc agtctaatct gaattaa 57 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyhedrin promoter Primer <400> 3 cagttttgta ataaaaaaac ctataaat 28 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF1629 primer <400> 4 gcccgatgtt aaatatgtcc 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mini-F primer F <400> 5 atgttcagaa tgaaactcat ggaa 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mini-F primer R <400> 6 ttatctaatc tcccagcgtg gtt 23 <210> 7 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> homologous region 5 <400> 7 cgcgtaaaac acaatcaagt atgagtcata agctgatgtc atgttttgca cacggctcat 60 aaccgaactg gctttacgag tagaattcta cttgtaacgc acgatcagtg gatgatgtca 120 tttgtttttc aaatcgagat gatgtcatgt tttgcacacg gctcataaac tcgctttacg 180 agtagaattc tacgtgtaac gcacgatcga ttgatgagtc atttgttttg caatatgata 240 tcatacaata tgactcattt gtttttcaaa accgaacttg atttacgggt agaattctac 300 ttgtaaagca caatcaaaaa gatgatgtca tttgtttttc aaaactgaac tcgctttacg 360 agtagaattc tacgtgtaaa acacaatcaa gaaatgatgt catttgttat aaaaataaaa 420 gctgatgtca tgttttgcac acggctcata accgaactcg ctttacgggt agaattctac 480 gcg 483 <210> 8 <211> 329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vp39 promoter sequence <400> 8 gtcttgtaag gcagtttgat ttctttgctc tctctccaca ccagcggcac caacgcgttg 60 gtatctttag gccaataaac aaattttttg tgtttggaat tagtcttttt cacgcttgat 120 attatgttat tgcaagcgct ctgaataggt atacgagtgc gaaagccgtt ttcgtcgtac 180 aaatcgaaat attgttgtgc cagcgaataa ttaggaacaa tataagaatt taaaatttta 240 tacaacaaat cttggctaaa atttattgaa taagagattt ctttctcaat cataaaattg 300 ccgtggtcca tatttataac ggcaacaat 329 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Burst sequence <400> 9 ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat 40 <210> 10 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyhedrin gene promotor sequence <400> 10 caaataaata agtattttac tgttttcgta acagttttgt aataaaaaaa cctataaat 59
Claims (10)
A nucleotide sequence encoding the VP2 protein of Canine Parvovirus (CPV) represented by SEQ ID NO: 1; And a nucleotide sequence encoding the p35 region of the F protein of Canine distemper virus (CDV) represented by SEQ ID NO: 2.
상기 재조합 발현 벡터는 배큘로바이러스의 다각체 단백질(polyhedrin) 코딩 유전자의 프로모터, 상동지역 5(homologous region 5: hr5) 서열, Burst 서열 및 vp39 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
The method according to claim 1,
The recombinant expression vector may further comprise at least one sequence selected from the group consisting of a promoter of a polyhedrin coding gene of baculovirus, a homologous region 5 (hr5) sequence, a Burst sequence and a vp39 promoter Wherein the recombinant expression vector is characterized by:
A transformant transformed with the recombinant expression vector of claim 1 or 2.
A virus-like particle (VLP) produced by the transformant of claim 3.
5. The virus-like particle according to claim 4, wherein the virus-like particle exhibits dual antigenicity against canine parvovirus and dog distemper virus.
A vaccine composition for preventing diseases caused by infection with canine parvovirus and dog distemper virus comprising the virus-like particle of claim 4 as an active ingredient.
7. The vaccine composition of claim 6, wherein the vaccine composition comprises any one selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants, immune stimulators, and combinations thereof.
(a) 서열번호 1로 표시되는 개 파보바이러스(Canine Parvovirus)의 VP2 단백질을 코딩하는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 개 디스템퍼바이러스(Canine distemper Virus)의 F 단백질 p35 부위를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환체를 제조하는 단계;
(c) 상기 형질전환체를 숙주세포에 형질감염(transfection)시키는 단계;
(d) 상기 형질감염된 숙주세포를 배양하고, 그 배양물을 수득하는 단계; 및
(e) 상기 배양물로부터 바이러스 유사입자를 수득하는 단계.
A method for the preparation of virus-like particles for the prevention of diseases caused by canine parvovirus and dog distemper virus infection comprising the steps of:
(a) a nucleotide sequence encoding the VP2 protein of Canine Parvovirus represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence encoding the F protein p35 region of Canine distemper virus of SEQ ID NO: 2 Preparing a recombinant expression vector containing the recombinant expression vector;
(b) preparing a transformant using the recombinant expression vector;
(c) transfecting the transformant into a host cell;
(d) culturing the transfected host cell and obtaining a culture thereof; And
(e) obtaining virus-like particles from the culture.
A method for preventing diseases caused by canine parvovirus and candyspemper virus infection, comprising administering the vaccine composition of claim 6 to a mammal other than a human.
상기 포유동물은 개, 고양이, 소, 돼지, 염소, 양, 말, 토끼 및 쥐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.10. The method of claim 9,
Wherein the mammal is selected from the group consisting of dogs, cats, cows, pigs, goats, sheep, horses, rabbits and rats.
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|---|---|---|---|---|
| CN115960262A (en) * | 2022-10-19 | 2023-04-14 | 四川农业大学 | Canine parvovirus-like particles displaying CDV antigenic epitope and its construction method and application |
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|---|
| GenBank AFK94137.1 (2012.06.09.)* * |
| Vaccine. Vol.28(1), pp.132-139. (2010)* * |
| 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템 매뉴얼, PHARMINGEN (1999.05.)* * |
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| CN115960262A (en) * | 2022-10-19 | 2023-04-14 | 四川农业大学 | Canine parvovirus-like particles displaying CDV antigenic epitope and its construction method and application |
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