KR20190017493A

KR20190017493A - p53-비돌연변이 암에 대한 암 마커 유전자 및 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20190017493A
Application number: KR1020170102422A
Authority: KR
Inventors: 김일철; 김동민; 최승현; 이동주
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2019-02-20
Also published as: KR102018899B1

Abstract

본 발명은 p53-비돌연변이 암에 대한 암 마커 유전자 및 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다. 현재까지 대부분의 암에서 암 억제 유전자인 p53에서 돌연변이가 발견되는 것과 구별하여, 본 발명자에 의하여 최초로 명확히 규명된 p53-독립적으로 MDM2의 과발현을 조절하는 상위 조절 유전자들을 기반으로 하는 본 발명의 스크리닝 방법은 p53-비돌연변이 암 특이적 항암제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있다. 뿐만아니라 본 발명에서 규명한 유전자(표 1 참조)들은 p53비돌연변이 암의 상태에서 유의적으로 상향발현되므로, 기존에 암진단이 p53-돌연변이 존재에 의존적이었던것과는 달리 p53-비돌연변이 암 발생에 대한 진단이 가능하다.

Description

p53-비돌연변이 암에 대한 암 마커 유전자 및 치료제 스크리닝 방법{Method for screening cancer markers and therapeutics for p53-nonmutational cancer}

본 발명은 p53-비돌연변이 암에 대한 암 마커 유전자 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준 측정을 통한 p53-비돌연변이 암 진단 방법과, (a) p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene)를 발현하는 세포를 시험제제와 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 유전자 발현정도와 비교하여 상기 시험제제가 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)에 대한 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.

p53 단백질은 인간에서 TP53 유전자에 의해 인코딩되는 종양 억제 단백질로 잘 알려진 것으로 세포 내 DNA를 손상시키는 신호에 반응하여 다양한 하위 유전자의 발현을 조절함으로써 세포 주기를 조절하고, 세포사멸을 유도함으로써 세포가 악성형질로 전환되지 않도록 보호한다. 상기 p53을 발현하는 유전자는 1979년 최초로 발견되었으나, 당시에는 변이된 p53 유전자를 연구하였으므로 발암 유전자로 알려졌다. 이후, 1989년 p53 유전자는 실제로는 암 억제 유전자임이 규명되었다. 원발성 종양의 약 50%에서, 특히 대장암에서는 약 85%에서 p53 유전자의 돌연변이가 관찰되는 등 p53 유전자는 세포의 암화와 매우 밀접한 연관을 지니고 있는 것으로 확인되었다. 특히 종양의 발암과정과 관련하여서는 종양의 진행을 억제하며, 세포주기 및 종양세포의 세포사멸에도 관여하는 것으로 밝혀져 암의 발생 및 진행과 관련된 매우 중요한 유전자이다.

TP53 돌연변이는 10%(예를 들어, 조혈성 악성 종양에서) 내지 거의 100%(예를 들어, 높은 심각성을 보이는 난소 암종에서)로 거의 모든 유형의 암에서 발생하는 것으로 보고되었다(Noa Rivlin et al., Mutations in the p53 Tumor Suppressor Gene, Genes Cancer. 2011 Apr; 2(4): 466474.). 그럼에도 불구하고, 실질적으로 p53 돌연변이율이 낮은, 즉 p53 돌연변이를 포함하지 않은 상당수의 암 종류들이 보고되고 있다. 흥미롭게도 백혈병은 상당수 p53 돌연변이를 포함하지 않는 암 종류를 대표한다(M. Wada et al., Analysis of p53 mutations in a large series of lymphoid hematologic malignancies of childhood, Blood 82 (1993) 3163e3169.). 돌연변이 발생률이 낮은 암에서 p53은 종종 다른 기전으로 인해 비활성화된다. 자궁경부암의 경우 HPV E6에의하여 p53의 분해가 일어나는 것으로 알려져있으며, 육종(sarcoma)에서 과발현된 HDM2에의하여 p53의 분해가 일어나는 것으로 알려져 있다(Magali Olivier et al., TP53 Mutations in Human Cancers: Origins, Consequences, and Clinical Use, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Jan; 2(1): a001008.).

이처럼 기존에 p53 돌연변이에 의한 종양의 발생이 지배적 연구론이었던 것과는 달리 근래에 p53-비돌연변이 암에 대하여 다수 보고가 되고 있기 때문에, 치료방법 및 치료제 개발 등에 있어서 새로운 방식의 접근이 필요하다.

전술한 바와 같이 백혈병은 상당수 p53 돌연변이를 포함하지 않는 암 종류를 대표하며, 이러한 백혈병에서 직접적인 p53 돌연변이는 거의 없지만, 상류(upstream) 또는 하류(downstream) 조절자의 변경으로 인해 p53 경로(pathway)에 결함이 있는 것으로 제시되어왔다. 백혈병은 p53의 중요한 음성 조절자인 MDM2가 종종 과발현되는 현상을 나타낸다. p53은 스트레스를 받지 않은 세포에서는 매우 불안정한 단백질로서 존재하며 이때 반감기는 5-30 분이고, MDM2가 매개하는 지속적인 분해로 인해 정상세포, 즉 스트레스를 받지 않은 세포(normal unstressed cell)에서는 매우 낮은 수준으로 존재한다. MDM2 유전자는 과발현 될 때 세포의 종양 형성 가능성을 증가시키고, 추정 전사 인자(putative transcription factor)를 암호화한다.

주로 MDM2는 핵 및 세포질 26S 프로테아좀(proteasome)에서 유비퀴틴-의존성 경로를 통해 p53의 분해를 촉진하는 E3 리가아제(E3 ligase)이다. MDM2 자체는 p53-유도성 유전자의 산물이다(Y. Barak et al., mdm2 expression is induced by wild type p53 activity, EMBO J. 12 (1993) 461e468.). 따라서 두 분자는 스트레스가 없을 때 세포에서 낮은 p53 수준을 유지하는 것을 목적으로 하는 자기조절적 음성 피드백 루프(autoregulatory negative feedback loop)를 통해 연관되어있다. 이처럼 두 분자가 서로의 발현과 생체 내 존재에 대하여 조절자로서 작용하고 있는 것으로 알려져 있기도 하지만, MDM2는 또한 세포주기 조절, 분화, 세포 운명 결정, DNA 복구, 기본 전사(basal transcription) 및 기타 과정에서 p53과 무관한 기능을 가지고 있다. 예를 들어, 발달 중 MDM2의 발현은 조직 특이적이며 다른 장기(organ)의 p53과 무관하다. 높은 MDM2 발현 수준은 기능적 p53(functional p53)이 거의 없거나 전혀 없는 인간 종양 세포주에서 관찰된다. 더욱이, MDM2는 야생형 p53이 없는 경우에 변형된 표현형에 기여하는 것으로 보인다(G. Ganguli, B. Wasylyk, p53-independent functions of MDM2, Mol. Cancer Res. 1 (2003) 1027e1035.).

상기와 같은 사실이 당업계에 보고되어 왔지만, 실질적으로 p53 비돌연변이 암들에 있어서 p53과 무관하게(독립적으로) MDM2를 발현을 조절하는 구체적 메커니즘 관련 인자들에 대해서는 명확히 알려진 바 없었다.

이에 본 발명자들은 암세포에서 p53-독립적으로 MDM2의 과발현을 조절하는 상위 조절 유전자들을 규명하고 이들 중 종양의 생존에 유리한 표현형을 부과하는 유전자들의 특이적 효과를 확인하여, p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)에 대한 치료제 스크리닝을 위한 하기의 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 (a) p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene)를 발현하는 세포를 시험제제와 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 유전자 발현정도와 비교하여 상기 시험제제가 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)에 대한 치료제 스크리닝 방법과 상기 방법에 의해 스크리닝된 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 저해제 또는 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 p53-비돌연변이 암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 p53-비돌연변이 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, p53-비돌연변이 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 정성 또는 정량분석하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene)를 발현하는 세포를 시험제제와 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 유전자 발현정도와 비교하여 상기 시험제제가 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)에 대한 치료제 스크리닝 방법과 상기 방법에 의해 스크리닝된 화합물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 저해제 또는 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 p53-비돌연변이 암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 p53-비돌연변이 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 p53-비돌연변이 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 정성 또는 정량분석하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale ＆ Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.

본 명세서에서 용어 "단백질"은 "폴리펩티드(polypeptide)" 또는 “펩티드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 "핵산", "DNA 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클 레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 발명자들은 p53 비돌연변이 암에서 종종 과발현 상태를 보이는 MDM2에 대하여, p53 null 세포를 이용하여 본 명세서의 [표 1]에 기재된 바와 같은 유전자들이 p53-독립적으로 MDM2를 상향 조절한다는 것을 규명하였으며, 이들 유전자들의 종양세포 생존성 관련 표현형에 대한 영향을 확인하였다.

따라서 본 발명은

(a) p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene)를 발현하는 세포를 시험제제와 배양하는 단계; 및

(b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 유전자 발현정도와 비교하여 상기 시험제제가 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)에 대한 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기‘p53-독립적(p53-independent) MDM2 조절’은 기존에 MDM2가 p53-의존적(p53 dependant) 경로에 의하여 발현된다고 알려진 것과 대비하여, MDM2가 p53유전자와는 상당히 먼 관련성을 가지는 다른 경로(pathway)에 의하여 또는 p53 유전자와 무관한 다른 경로에 의하여 그 발현이 조절되는 것을 의미한다.

상기‘조절’은 상향 조절(up-regulation) 및 하향 조절(down-regulation)을 모두 포함하는 의미로서, 바람직하게 본 발명에서 상향 조절을 의미하는 것일 수 있다. 상기‘조절’은 목적하는 유전자의 프로모터 수준, RNA 전사 수준 또는 단백질 번역 수준에서의 조절을 모두 포함하는 의미한다.

따라서 상기‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자’는 바람직하게 p53-독립적 MDM2 상향조절 유전자를 의미하는 것으로, MDM2 유전자의 발현 프로모터 수준, MDM2 mRNA 수준 또는 MDM2 단백질 수준에서의 상향 조절을 모두 포함하는 의미이며, 이러한 구체적 유전자에 대해서는 본 명세서 [표 1]에 기재한 바와 같다. 본 발명에서는 [표 1]에 기재된 유전자 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 사용하는 것을 특징으로하며, 상기 유전자 군에서 두 개 이상을 선택하여 상기 유전자의 동시적 발현 억제효과를 탐색할 수도 있다.

바람직하게 상기‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자’는 MDM2 mRNA 수준 또는 MDM2 단백질 수준에서의 상향 조절을 수행하는 유전자를 의미하는 것 일 수 있으며, 구체적으로 CBX5, FMOD, GNA15, GPD2, GZMK, IL8RB, KNG1, LOC51035, MAGEA12, MLH1, MNDA, MYOZ2, NTRK2, PRCC, RARS, SERPINA3, SFRS10, SFRS2 및 SLC12A1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.

상기‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자’는 더욱 바람직하게‘p53-독립적 MDM2 단백질 과발현 유도 유전자’를 의미하는 것일 수 있으며, 구체적으로 EIF5A, ELAVL1, GNA15, KNG1, NTRK2, PRCC, SERPINA3, SFRS2, LOC51035 및 MAGEA12로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.

상기 p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)은 암 억제 유전자인 p53에 돌연변이 없이 p53 경로의 기능저하, 결함 또는 비활성화를 보이는 암의 종류들을 의미하는 것으로, 본 발명에서 p53 돌연변이율이 통상 50% 이하인 것으로 보고되고 있는 하기의 암 종류들을 의미한다(괄호안의 수치는 p53 돌연변이율); 백혈병(Leukemia, 5%), 림프종(Lymphoma, 19.1%) 혈액종양(hematopoietic malignancy, 10~12.7%), 자궁경부암(cervical cancer, 5.8%), 육종(sarcoma, 5%), 고환암(testicular cancer, 5%), 악성 흑색종(malignant melanoma, 5%), 내분비 종양(endocrine tumor, 14.6%), 골암(bone cancer, 14.6%), 전립선암(prostate cancer, 17.5%), 자궁암(uterus cancer, 20.5%), 유방암(breast cancer, 25%), 방광암(bladder cancer, 26.4%), 뇌 종양(brain cancer, 27%), 간암(liver cancer, 31.9%), 위암(stomach cancer, 32%), 췌장암(pancreas cancer, 32.6%), 피부암(skin cancer, 35%), 폐암(lung cancer, 38.6%), 후두암(larynx cancer, 40.4%), head and neck cancer(두경부암, 40.6%), 식도암(esophageal cancer, 43.1%), 대장암(colorectal cancer, 43.2%) 또는 난소암(ovarian cancer, 47.8%). 구체적 암 종류에 따른 p53 돌연변이율에 대해서는 하기의 문헌을 참고로 할 수 있다;‘Magali Olivier et al., TP53 Mutations in Human Cancers: Origins, Consequences, and Clinical Use, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Jan; 2(1): a001008.’,‘Arnold J. Levine, Mutations in the p53 Tumor Suppressor Gene/Important Milestones at the Various Steps of Tumorigenesis Genes Cancer. 2011 Apr; 2(4): 466474.’

본 발명의 상기‘p53-비돌연변이 암’은 바람직하게 암 억제 유전자인 p53에 돌연변이가 일어나지 않은 암으로서 MDM2가 상향조절된 상태를 보이는 암 종류를 의미하는 것으로, 본 발명에서 가장 바람직하게 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)을 의미하는 것일 수 있다.

본 발명에서 ‘제제(agent)’ 또는 ‘시험제제(test agent)’라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 저 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 방법을 통해 선별되는 물질은, 예를 들어 메치오닌 아미노산 유사체, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 천연추출물 및 화학물질 등일 수 있다.

본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 시험제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO 93/06121,WO94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다. 상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약5-20개, 보다 바람직하게는 약7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스화(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 "핵산”일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스화” 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 위에서 기재한 대로 소분자 시험 제제의 조합 라이브러리가 본 발명의 스크리닝 방법에 용이하게 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).

본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 이에 의해 발현되는 mRNA, 단백질이나 이의 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 상기 유전자, mRNA 또는 단백질에 결합할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. 목적 단백질의 의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E.(Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp.221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisengerg ＆ D.Crothers(Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). 목적 단백질의 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다: Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986).

본 발명에서 상기‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자를 발현하는 세포를 시험제제와 배양하는’것은 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 자체, 이의 발현물(mRNA 또는 단백질 발현) 또는 상기 유전자 발현에 영향을 주는 인자와 시험제제의 접촉을 유도하는 과정을 의미하는 것이다. 상기 시험제제의 접촉 방법은 예를 들어, 시험관 내(in vitro)에서 시험제제가 세포막 외부에 처리되어 세포 내로 도입되는 것에 의한 것일 수도 있고, 또는 공지의 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술에 의해 시험제제가 세포 내에서 발현됨에 따른 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미하는 것으로, 프로모터에 의해 유발된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사와 번역을 모두 포함하며, 번역 후의 단백질의 존재 상태, 번역후 단백질의 실질적 기능의 존재 상태를 모두 포함하는 의미이다.

상기 (a) 단계에서‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자를 발현하는 세포’는 전술한 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현이 일어나는 세포라면 이에 한정되지 않으나, 자연적으로 전술한 p53-독립적 MDM2 조절 유전자를 보유하고 있는 세포 또는 분자 클로닝 등의 분자적 기술을 통하여 전술한 p53-독립적 MDM2 조절 유전자를 보유하도록 작제된 형질전환 세포 등을 포함한다. 상기 세포의 종류는 특별히 제한되지 않으나 바람직하게 진핵세포일 수 있다. 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J.,Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: ColdSpring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

바람직하게‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자를 발현하는 세포’는 정상 세포에서 상기 유전자(전술한 p53-독립적 MDM2 조절 유전자)가 발현되는 수준 이상으로 유전자의 과발현이 일어나는 것이 바람직할 수 있다. 즉, p53-독립적 MDM2 조절 유전자를 정상 수준 이상으로 과발현 하는 세포일 수 있다.

상기 (b) 단계에서‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인’하는 것은, 상기 시험제제가 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 mRNA 전사를 억제하는지, mRNA 전사 후 단백질 번역을 억제하는지, 번역된 단백질에 구조변경 또는 분해를 일으키는지, 번역된 단백질에 시험제제가 결합하여 실질적 기능의 부재상태가 되는지 등을 확인하는 것을 의미한다.

상기 (b) 단계에서 시험제제의 처리를 통하여 실질적으로 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현이 없는 상태, 또는 과발현된 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 질병이 없는 정상개체의 수준으로 발현되는 상태, 또는 과발현된 MDM2가 정상개체의 수준으로 발현되는 상태이면 시험제제가 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는 것으로 판단할 수 있으며, 이를 MDM2 발현억제제(더욱 바람직하게는 MDM2 과발현 억제제)로서 p53-비돌연변이 암에 대한 치료제로서 판단 할 수 있다.

구체적으로 상기 시험제제의 처리에 의하여 전술한 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현이 양성대조군 대비(시험제제 없이 배양된 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현세포) 억제되는 경우에 이를 MDM2 발현억제제(더욱 바람직하게는 MDM2 과발현 억제제)로서 p53-비돌연변이 암에 대한 치료제로서 판단 할 수 있다.

본 발명의 p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)에 대한 치료제 스크리닝 방법은, p53-독립적 MDM2 조절 유전자 발현 정도를 측정하여 수행될 수 있으며, 이때 상기‘유전자 발현정도 측정’은 목적 유전자(p53-독립적 MDM2 조절 유전자)의 발현수준 측정을 의미하는 것으로 mRNA 발현수준 측정 및 단백질발현 수준 측정(단백질 양 변화 측정)을 모두 포함하는 의미이다.

상기 'mRNA 발현수준 측정'이란 대상 세포에서 목적 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. mRNA 발현 수준의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 발현수준은 RTPCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular 및 Cellular Methods in Biology 및 Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), DNA 칩, 리포터 시스템을 이용한 발현 정량 키트 등을 이용하여 본 발명의 각 유전자 프로모터의 세기를 모니터링하거나, MDM2 발현을 모니터링하는 것으로 실시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시험물질을 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 목적 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 목적 유전자의 발현량 변화를 측정한다.

상기‘단백질 발현수준 측정’이란 대상세포에서 목적 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 예를 들어 상기 목적 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 단백질발현 수준 측정은 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질의 양의 변화는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석등을 사용할 수 있고, 이외에도 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 웨스턴 블랏, 단백질 칩(protein chip) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 스크리닝 방법은 추가적으로 하기의 단계를 포함할 수 있다;

(c) 상기 (b) 단계에서 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는 것으로 확인된 시험제제를 p53-비돌연변이 암을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계.

상기 (c) 단계에서 동물은 인간이 아닌 동물(non-human animal)인 것이 바람직할 수 있다. 또한 상기 '치료 효과'란 p53-비돌연변이 암 및 이에 의한 증상을 완화 또는 개선하는 효과, p53-비돌연변이 암의 진행을 억제하는 효과의 일부 또는 전부를 포함하는 의미이다.

또한 본 발명은 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 저해제 또는 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자’및‘p53-비돌연변이 암’의 의미 및 구체적 종류에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 저해제’는 이에 제한되지 않으나, p53-독립적 MDM2 조절 유전자에 특이적인 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 타겟 유전자만 억제하는 능력을 의미한다.

상기‘안티센스 RNA'란 표적 유전자의 제1전사체 또는 mRNA 전체 또는 일부에 상보성이고, 제1전사체 또는 mRNA의 프로세싱, 수송 및(또는) 번역을 방해함으로써 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 말한다. 안티센스 RNA는 5' 비코딩 서열, 3' 비코딩 서열, 인트론 또는 코딩 서열에서 특정 유전자 전사체의 일부와 상보성일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 안티센스 RNA는 유전자 발현을 차단하는 안티센스 RNA의 효능성을 증가시키는, 리보자임 서열 영역을 포함할 수 있다.‘리보자임’이란 촉매 RNA를 말하고, 서열 특이적 엔도리보뉴클레아제를 포함한다. 상기‘표적 유전자’는 본 발명의 목적상 p53-독립적 MDM2 조절 유전자이고, 이들의 구체적 종류는 전술한 바와 같다.

상기‘RNA 전사체’란 DNA 서열의 RNA 폴리머라제에 의해 촉매된 전사에 기인한 생성물을 말한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완전한 상보성 카피인 경우, 제1 전사체로서 또는 제1 전사체의 전사 후 프로세싱으로부터 유래된 RNA 서열일 수 있다. "전령 RNA(mRNA)"란 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 말한다.

상기 “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 의미하고, 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법 또는 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA,바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA 를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에서 "miRNA(마이크로 RNA)"는 유전자 발현의 전사후 조절자로서 작용하는, 내인성 유전자에서 유래된 짧은 비코딩 RNA를 의미한다. miRNA는 표적 유전자의 mRNA와 염기쌍을 이룸으로써 유전자 발현의 전사 후 조절자로서 작용한다. 본 발명의 miRNA는 전술한 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는 활성이 있는 한 그 염기 서열 및 길이는 특별히 제한되지 않는다.

상기 본 발명의 p53-독립적 MDM2 조절 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA는 공지의 방법을 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어 상기 본 발명의 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA는 벡터에 포함되어 개체에 제공될 수 있다. 즉, 프로모터; 및 이와 작동 가능하게 연결된 상기 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터의 형태로 세포 또는 개체에 제공될 수 있다.

상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 제조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다.

또한 상기 저해제는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자에 의해 발현된 단백질에 특이적인 항체일 수 있다. 상기 항체에서“특이적” 또는 “특이적인”이란 세포내에서 항체가 오직 하나의 항원에만 결합할 수 있는 특이성을 의미하며, 또한 항원 결합 도메인이 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해특이적인 경우에도 사용된다. 본 발명에서 상기 항원은 본 발명의 목적상 p53-독립적 MDM2 조절 유전자에 의해 발현된 단백질이다.

상기‘항체’란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자에 의해 발현된 단백질을 특이적으로 인지하는 항체를 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다.

본 발명의 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 구체적 서열은 본 명세서의 표 1에 기재된 바와 같이 이미 해당분야에 규명되어있으므로, 이를 이용하여 번역되는 단백질과 이에 대한 특이적 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,567호) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

상기 항체는 기존의 항암제로 알려진 물질과 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 상기 커플링 될 수 있는 치료제는 항암제로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 예를 들어, 파클리탁셀(Paclitaxel) 등 일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 저해제 또는 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 저해제들을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명에서 규명한 유전자(표 1 참조)들은 p53비돌연변이 암의 상태에서 유의적으로 상향발현되므로, 기존에 암진단이 p53-돌연변이 존재에 의존적이었던것과는 달리 p53-비돌연변이 암 발생에 대한 진단이 가능하다.

따라서 본 발명은 p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 p53-비돌연변이 암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 p53-비돌연변이 암 진단용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 모두 포함하는 개념이다. 바람직하게 본 발명에서의 진단은 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하여 p53-비돌연변이 암의 존재 또는 발병 여부를 확인하는 것일 수 있다.

상기‘p53-독립적 MDM2 조절 유전자’에 대해서는 전술한바와 같으며(표 1 참조), 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 대해서는 당업계에 공지된 단백질 및 유전자 데이터 베이스(예를 들어, Genbank 또는 Uniprot)의 정보를 원용하여 당업자에게 자명하게 이해된다.

상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는, 당업계에 단백질의 발현수준 측정에 사용가능한 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다.

본 발명에서 용어 '항체(antibody)'는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질 이외의 다른 단백질에는 반응하지 않고, p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체이다. 상기 항체는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질을 동물에 주입하여 생성되는 항체를 수득하는 등의 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 항체는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 전장 서열 단백질을 통해 제작되는 것일 수도 있고, 또는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질의 항원성 부위를 포함하는 폴리펩타이드 단편을 이용하여 제조할 수도 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성(반응)을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.

본 발명에서 용어‘앱타머’는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에따라, 확인하고자 하는 표적 단백질(본 발명에서는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질)에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 수준을 측정한다는 의미는 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자로부터 파생되는 전사물들의 발현 수준을 측정하는 것을 포하함하는 의미이고, 일례로 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.

따라서 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 유전자로부터 발현된 mRNA를 검출하는 제제를 의미하는 것일 수 있다. 따라서 p53-독립적 MDM2 조절 유전자를 검출하는 제제는, 상기 유전자로부터 발현된 mRNA에 특이적으로 부착 또는 혼성화(hybridization)하는 리간드라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 프라이머(쌍) 또는 프로브 일 수 있다.

상기 “프라이머”는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA 또는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.

'프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA의 발현양을 측정함으로써 감염성 염증 질환의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.

본 발명의 진단용 키트에는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질을 마커로 인식하는 항체, 앱타머 또는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 양태로서 상기 키트는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법을 수행하기 위해 필요한 공지의 필수요소 및 부수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일례로, 상기 키트는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 목적 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 상기 키트는 추가적으로 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 잉여의 발색 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 항체와 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.

또한 상기 키트는 당업계에 프라이머(프라이머쌍) 또는 프로브를 구성품으로 제공하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응), RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, 서던 블랏팅 또는 DNA 마이크로어레이 칩용 키트 등을 포함한다.

일례로, 상기 진단 키트는 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 중합효소반응 키트는 마커 유전자(mRNA)에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자(mRNA)의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), DNA 폴리머라아제(예를 들어 Taq-폴리머라아제) 및 역전사효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 p53-비돌연변이 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 정성 또는 정량 분석하는 방법을 제공한다.

구체적으로 상기 방법은 (a) 피검체의 시료로부터 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계;및

(b) 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 정상인과 비교하고, 정상인에 비해 발현 수준이 증가한 피검체를 p53-비돌연변이 암에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어‘분석’은 바람직하게‘측정’을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있다.

이하, 상기 방법을 각 단계에 따라 설명한다.

상기 (a) 단계는 피검체(잠재 환자)로부터 제공된 시료에서 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계이다.

상기 시료는 암(특히, p53-비돌연변이 암)의 발병 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직(특히 암발생이 의심되는 부위의 세포나 조직), 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다.

상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

상기 단백질 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역염색법(면역조직화학염색 및 면역형광염색 등 포함), 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩방법 중 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.

상기 유전자 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 유전자 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 PCR , RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.

상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 측정한 피검체 시료의 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 정상인과 비교하고, 정상인에 비해 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준이 증가한 피검체를 p53-비돌연변이 암에 걸린 것으로 판정하는 단계이다.

상술한 (a) 단계의 방법으로 측정한 피검체 시료의 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을, 동일한 방법으로 측정한 정상인 시료의 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준과 비교한다. 이때 상기 시료는 피검체와 정상인 간에 동일한 종류 또는 동일한 방법에 의해 수득된 시료인 것이 바람직하다. p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준이 건강한 정상인에 비하여 증가한 피검체를 p53-비돌연변이 암에 걸린 것(또는 p53-비돌연변이 암 발생 고위험군)으로 판정할 수 있다.

현재까지 대부분의 암에서 암 억제 유전자인 p53에서 돌연변이가 발견되는 것과 구별하여, 본 발명자에 의하여 최초로 명확히 규명된 p53-독립적으로 MDM2의 과발현을 조절하는 상위 조절 유전자들(표 1 참조)을 기반으로 하는 본 발명의 스크리닝 방법은 p53-비돌연변이 암 특이적 항암제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있다. 뿐만아니라 본 발명에서 규명한 유전자(표 1 참조)들은 p53비돌연변이 암의 상태에서 유의적으로 상향발현되므로, 기존에 암진단이 p53-돌연변이 존재에 의존적이었던것과는 달리 p53-비돌연변이 암 발생에 대한 진단이 가능하다.

도 1은 급성 골수성 백혈병(AML) 환자에서, real-time PCR을 이용하여 MDM2 및 p53 mRNA 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸다(보라색 막대: MDM2 mRNA level, 흰색 막대: TP53 mRNA level, Data are presented as mean ± SD (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001.).
도 2는 두 개의 서로 다른 MDM2 프로모터(P1 및 P2 프로모터)를 기반으로하는 MDM2 리포터의 제작과정을 나타낸다. 상단 패널(panel)은 염색체상의 각 프로모터를 나타내며, 하단 패널은 각각의 리포터 시스템에 클로닝 된 영역을 나타낸다. 각 영역의 숫자는 프로모터 영역에서의 숫자와 일치한다.
도 3은 실시예 <2-2>에서, HCT116 p53+/+ 및 HCT116 p53-/- 세포에 대하여 수행된 리버스 트렌스펙션의 조건 조합(특히 스크리닝 라이브러리와 함께 트랜스펙션된 프로모터 리포터의 종류 조합)을 나타낸다.
도 4는 368 개의 KUGI 클론에 대하여 이중 루시퍼라제 시스템을 이용해 MDM2 P1 및 P2 프로모터, p21 프로모터 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 색상은 Mock 클론에 대비하여 MDM2 프로모터 리포터 활성 비율을 나타낸다.
도 5는 표 1의 클론에 대하여, HCT116 p53-/- 세포에서 MDM2 프로모터 활성을 log2 scale로 나타낸 것이다(흰색 막대: P2 프로모터 활성, 검정색 막대: P1 프로모터 활성).
도 6은 표 1의 클론에 대하여, HCT116 p53+/+ 세포에서 MDM2 프로모터 활성을 log2 scale로 나타낸 것이다(흰색 막대: P2 프로모터 활성, 검정색 막대: P1 프로모터 활성).
도 7은 HCT116 p53-/- 세포에서, 각 클론에 의한 MDM2 mRNA 수준을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 HCT116 p53-/- 및 HCT116 p53+/+ 세포에서, 각 클론에 의한 MDM2 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 MDM2 P2 promoter에서 AP-1 binding motif를 실질적으로 제거하기위한 점돌연변이 위치(밑줄친 부분)를 보여주는 모식도이다.
도 10A는 각 클론을 HCT116 p53+/+ 세포에 트랙스펙션시킨 후, UV crosslinker를 조사(radiation)한 후, cell proliferating counting system을 이용해 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸다(White bar, no treatment; black bar, 5 mJ/cm² UV radiation 30초).
도 10B는 각 클론을 LLC-PK 세포에 트랙스펙션시킨 후, UV crosslinker를 조사(radiation)한 후, 현미경 하에서 세포수를 카운트하는 방법으로 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실험방법]

1.세포배양

야생형 p53 HCT116 대장암 세포(HCT116+/+) 및 동질유전자성(isogenic) p53 녹아웃 대응물(HCT116-/-)을, 10% (v/v) fetal bovine serum (Hyclone, Logan, UT, USA), 100 IU/ml penicillin 및 100 g/ml streptomycin(GIBCO-BRL)이 보충된 DMEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA) 배지에서 배양하였다.

2. 리포터 플라스미드의 제작

MDM2 프로모터의 P1 또는 P2 영역을 인간 유방 게놈 DNA 라이브러리를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하였고, pcDNA-luc에 삽입하였다(도 2 참조). 상기 P1 및 P2 프로모터는 각각 MDM2P1F1 (5’-CTGACTCGAGGTTGGTCTTGAACTCCTG-3’) 및 MDM2P1R1 (5’-GACTGAATTCCCTCAAGACTCCCCAGT-3’) 프라이머 세트와 MDM2P2F1 (5’-CTGACTCGAGTCTTGAGGGACCCCCGA-3’) 및 MDM2P2R1 (5’-GACTGAATTCGCCACTGAACACAGCTG-3’)프라이머 세트를 이용하여 증폭되었다. 증폭물을 pcDNA-Luc의 XhoI/EcoRI site에 삽입하였다. AP-1 binding site에 점 돌연변이가 있는 P2 promoter를 제작하기 위하여, the QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (#200518; Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 이용해 PCR (denaturation : 94℃ 1분, annealing : 58℃ 30초, extention : 72℃ 30초, 30 cycles)을 수행하였다.

3. MDM2 조절자(regulator) 라이브러리 및 스크리닝

MDM2 발현 조절자들의 스크리닝을 위해서 사용된 cDNA 클론(clone)들은 Korean UniGene (KUGI) Library(http://kugi.kribb.re.kr/KUGI/doc/KUG-Methods.html) 로부터 수득되었다. 368개의 유전자가 어레이된(arrayed) cDNA library의 대규모 리버스 트랜스팩션(Highthroughput reverse-transfection)이 수행되었다. 간략히, 각 well에 0.5㎍씩 서로 다른 cDNA가 포함된 96-well plate(Corning Inc., Corning, NY, USA)에서, 각 well을 젤라틴으로 스포팅(spotting) 하였다. 트랜스팩션을 위해 각 well에, 1㎕ MilyMax 시약(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)과, 0.2 ㎍ Renilla luciferase DNA 및 P1wt- 또는 P2-luciferase reporter DNA가 포함된 50㎕ serum-free media를 첨가하였다. 15분 후, 3000 HCT116(+/+) 또는 HCT116(-/-) 세포가 포함된 20% FBS-media 50㎕을 각 웰에 분주하였다. 5% CO₂, 37℃에서 48시간 배양 후, Dual-Luciferase® Reporter Assay System (E1910; Promega)으로부터의 luciferase assay reagent 40㎕를 각 웰에 첨가하고, Acquest Plate Reader (LJL Biosystems, Sunnyvale, CA, USA)로 즉시 발광을 분석하였다.

4. RNA 추출 및 역전사-PCR(reverse transcription-PCR)

세포로부터 전체 RNA를 Trizol(Invitrogen)로 추출하였으며, AMV reverse transcriptase(Promega)를 이용하여 42℃에서 1시간동안 제조사의 매뉴얼에따라 반응시켜, 5㎍의 전체 RNA로부터 first-strand cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA는 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 증폭을 위한GDH1(5’-TGAGAACGGGAAGCTTGTCA-3’) 및 GDH2 (5’-GGAAGGCCATGCCAGTGA-3’)프라이머 세트와, human MDM2의 증폭을 위한 HDM2F1 (5’- CGTGCCAAGCTTCTCTGTGAAA-3’) 및 HDM2R1 (5’- CTCATCATCTTCATCTGAGAGT-3’) 프라이머 세트를 이용하여 증폭되었다. 상기 프라이머들은 PCR과정 동안 58℃에서 결합(annealing)되었다. 최종 PCR 산물은 1.2%(w/v) 아가로오스 겔 전기영동에 의하여 분석되었다.

5. 웨스턴 블롯팅 및 항체

트렌스펙션된 세포를 회수하고, lysis buffer(1%(v/v) Triton X-100, 20mM HEPES(pH 7.9), 300mM NaCl, 100mM KCl, 10mM EDTA, 10㎍/ml aprotinin, 100㎍/ml leupeptin, 및 10μM PMSF)에서 용해하였다. 정량 후, 20㎍/ml의 총 단백질 용해물을 acrylamide gel에 전기영동하고, 이를 Trans-Blot® membrane(162-0145; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 트랜스퍼하였다. 상기 멤브레인은 항체들로 면역블롯(immunoblot)되었으며, Enhanced chemiluminescence detection system(Thermo Scientific. Rockford, Il, USA)으로 디벨롭되었다. 상기 사용된 항체는 mouse anti-human MDM2 monoclonal antibody(K0165-3; Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japan), mouse anti-p53 monoclonal antibody(sc-126; Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA), 및 mouse anti-b-actin monoclonal antibody(sc-8432; Santa Cruz Biotechnology)이다.

6. 세포 생존율(Cell viability) 분석

세포 증식은 Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories) 및 96-well microplate를 이용하여 분석되었다. 10㎕의 CCK-8 solution을 첨가한 후, 각 웰에 존재하는 트렌스펙션된 세포를 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 기준파장(reference wavelength)은 600nm로 하였다.

< 실시예 1>

p53 돌연변이율이 낮은 암에서, MDM2 발현 양상 확인

‘Magali Olivier et al., TP53 Mutations in Human Cancers: Origins, Consequences, and Clinical Use, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Jan; 2(1)’등의 문헌에 따르면, primary leukemia, sarcoma, testicular cancer, malignant melanoma 및 cervical cancer 등의 암에서는 p53 돌연변이가 약5%로 나타나는 것으로 알려졌다. 이렇게 p53 돌연변이율이 낮은 암에서, p53은 종종 다른 메커니즘에 의하여 비활성화(inactivation)되어 있는 것으로 알려졌다. 또한 백혈병(leukemia) 세포를 포함하여 인간 암세포 주에서, p53의 기능이 거의 없이 MDM2가 과발현 된다. 이에 급성 골수성 백혈병(AML) 환자에서 MDM2 및 p53 발현 수준을 확인하였다. AML 환자 17명에 대하여 MDM2 및 p53의 mRNA level을 모니터하기 위하여 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 17명의 ALM 환자 중 8명의 환자(1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14; 47%)에서 MDM2 mRNA가 av_NR(Normal sample)과 비교하여 높은 발현 수준을 보임이 확인되었다(도 1 참조). 상기 8명의 환자 중 5명의 환자(1, 2, 7, 9, 12; 62.5%)에서, p53 mRNA 발현과 관계없이 높은 MDM2 mRNA 수준이 확인되었다(도 1 참조). 백혈병에서는 소수의 p53 돌연변이가 발견되며, MDM2는 세포주기 조절, 분화, 세포 운명 결정, DNA 복구, 기본 전사(basal transcription) 및 기타 과정에서 p53과 무관한(독립적인) 기능을 가지고 있다. 이에, 백혈병에서 MDM2 상부 조절자(upstream regulator)의 변경에 의하여 p53과 무관한 MDM2 발현(p53-independent MDM2 expression)이 일어난다고 가정하였다.

< 실시예 2>

p53에 독립적인 방식으로 MDM2 발현을 조절하는 인간 유전자의 대규모 스크리닝

<2-1> 60개의 대형 인간 데이터세트를 기반으로한 mRNA 동시 발현( mRNA co-expression)의 대규모 분석

MDM2와 다른 유전자들의 신뢰성 있는 동시발현 패턴을 TMM database (http://microarray.cpmc.columbia.edu/tmm)를 기반으로 분석하였다. 데이터세트(dataset)들은 Stanford Microarray Database 및 the Gene Expression Omnibus에서 공개적으로 사용가능하다. 발현 수준(Expression level)은 두 배의 로그비율(two-fold logarithm ratio)로 포맷될 수 있다. 신뢰성 있는 동시발현 패턴을 위하여 적어도 10개 샘플을 포함하고 있는 데이터세트(dataset)들을 이용하였다. 표준 피어슨 상관계수를 이용하여, 각각의 유전자 발현 프로파일은 다른 유전자 발현 프로파일과 쌍으로 비교되었다. 만일 MDM2 발현 프로파일이 어떤 유전자‘A’의 발현 프로파일과 유사하다면,‘동시 발현(co-expression)’ 링크(link)를 생성하였다. 귀무가설(null hypothesis)에 의하여 추정된 동시발현 연관성은 n-2 자유도를 갖는 t-분포를 이용하아 평가되었다(여기서 n은 표본의 수). P-value는 데이터의 부분 집합(subset)에 대한 순열 기반 테스트에 의해 얻어졌다. MDM2 유전자와 유전자 ‘A’사이에 상관관계가 없다는 가설로 부터의 큰 편차(deviation)는 유의미한 관련이 있다. 동시 발현을 확인하기 위하여, MDM2와 유전자‘A’사이에 나타나는 유사한 동시발현 패턴을 다른 데이터세트들에서도 찾았다. 그러나, 데이터세트들이 서로 다른 마이크로어레이 플랫폼들, 조직들, 또는 종에서 기원된 것일 수 있기 때문에 상기 발현 프로파일이 데이터세트 간에 꼭 유사할 필요는 없다. MDM2에는 엄격도 2(stringency of 2) 이상의, 즉 2개 이상의 데이터 세트들에서 검색되는 1089개의 링크가 있었다. 총 746 및 343개의 유전자가 각각 MDM2 mRNA 수준과 양성적으로 또는 음성적으로 연관되어있었다. 상기 1089 MDM2-coexpressed gene들 중, 총560개의 클론이 human KUGI cDNA library (http://kugi.kribb.re.kr/) 상에서 매칭(matching)되었다. 그중에서, 전장 서열을 가지는 368개의 클론(368 full-length clone)들을, CMV 프로모터 또는 SV40 프로모터에 의해 조절되는 포유류 발현 벡터(pCMV-SPORT6, pCNS 또는 pME8S-FL3)에 삽입하였다. 상기 클론들은 리포터 벡터와 함께 리버스 트랜스펙션(reverse transfection)되었고 스크리닝 테스트에 사용되었다.

<2-2> p53-독립적 MDM2 발현을 활성화시키는 인간 유전자의 대규모 스크리닝

MDM2는, RAR/RXR 및 E2F binding site를 가지는 P1 프로모터와 AP-1, p53, 및 c-myc binding site를 가지는 P2 프로모터를 가지고 있다. MDM2 P2 프로모터의 활성이 MDM2 P1 프로모터에 비하여 훨씬 강하다고 알려져 있기 때문에, 일반적으로 각각 분리된 P1 및 P2 프로모터 리포터가 클로닝되어 프로모터 활성을 연구하는데 사용되었다. 그러므로, p53에 의존적인 방식까지도 포함하는 프로모터 활성을 평가하기 위하여, 스크리닝에 사용될 두 프로모터 리포터를 분리하여(도 2 참조) pGL3-Basic plasmid에 삽입하였다. 96-well plate 상에서, 스크리닝 라이브러리 플라스미드 및 상기 프로모터가 클로닝된 루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 p53-wild type HCT116(HCT116 p53+/+) 세포 및 p53-결손 HCT116(HCT116 p53-/-)세포에 리버스 트랜스펙션하였다. 도 3에서 상기 리버스 트렌스펙션의 조건 조합을 도식적으로 나타낸다. MDM2 P1 및 P2 프로모터 활성과 p21 프로모터 활성은 dual luciferase kit (Promega) 및 luminometer를 이용하여 측정되었다. p53은 MDM2 E3 ligase의 기질(substrate)임에도 불구하고, MDM2 또한 p53-매개 전사(p53-mediated transcription)의 대상이다. 따라서 MDM2 P1 및 P2 promoter 활성 둘 다 HCT116 p53-/-세포에서 결합된다. luciferase assay로부터 측정된 배수 변화 값(Fold-change value)을 log2 value로 변환하여, MDM2 P1 및 P2 promoter에 대한 스크리닝 라이브러리 클론의 영향을 분석하였다. 피어슨 상관계수와 평균 연관에 의한 자율적 계층 클러스터링은, p53 의존적 클론으로부터 p53 독립적으로 MDM2 프로모터를 활성화하는 클론들을 구별하기 위하여 사용되었다. 이때 p53 활성은 p21 promoter 활성에 의해 모니터되었다(도 4 참조). HCT116 p53+/+ 세포에서 MDM2 P2 및 p21 promoter를 가진 샘플 클러스터들은 p53 활성이 상기 프로모터들의 활성을 지배한다는 사실을 밝혀내었다(도 4 참조). 계층적 연관(Hierarchical linkage)은 HCT116 p53-/- 세포에서 MDM2 P1 및 P2 프로모터 활성이 HCT116 p53+/+ 세포에서의 p21프로모터 활성과 매우 다르다는 사실을 보여준다. 이로써, 상승된 MDM2 P1 및 P2 promoter 활성을 가지고 감소된 p21 프로모터 활성을 보이는 클론들이 p53-독립적 MDM2 전사 활성인자(p53-independent MDM2 transcription activator)후보로서 밝혀졌으며, 본 발명자들은 하기 [표 1]에 기재된 바와 같은 71개의 클론을 p53독립적 MDM2 전사 활성인자로서 선별해내었다.

<2-3> p53-독립적 MDM2 조절자들에 의한, 향상된 MDM2 전사

HCT116 p53-/- 세포 및 HCT116 p53+/+ 세포에서 MDM2 프로모터 활성이 상기 71개의 클론으로 측정되었다(도 5 및 도 6 참조). 도 5에서 보는 바와 같이, HCT116 p53-/- 세포에서 25개의 클론이 향상된 MDM2 P1 프로모터 활성을 보였다. HCT116 p53-/- 세포에서 CBX5, GNA15, SERPINA3, NTRK2, KNG1, ELAVL1, SFRS2, SFRS10, GZMK, IL8RB, RARS, FMOD, MLH1, PRCC, YWHAB, MYOZ2, GPD2, MNDA, EIF5A, 또는 SLC12A1의 과발현이 MDM2 mRNA를 증가시켰다(도 7 참조). 상기 클론들은 HCT116 p53+/+ 세포에서 TP53 mRNA 발현을 저해하지 않았다(데이터 미도시). 상기 유전자들의 증가된 발현이 MDM2의 전사를 활성화시킨다는 사실은 p53 독립적 종양발생과정(p53-independent oncogenic process)을 제시한다. 클론들 중, SFRS2, LOC51035, ELAVL1, NTRK2, GNA15, 또는 SERPINA3은 HCT116 p53-/- 세포에서 MDM2 단백질 발현을 향상시켰다(도 8 참조). 한편, SFRS2, LOC51035, EVAVL1, MAGEA12, GNA15, SERPINA3, NTRK2, EIF5A, PRCC, 또는 KNG1 발현은 HCT116 p53+/+ 세포에서 p53 단백질 수준에는 유의한 변화 없이 MDM2 전사 수준을 증가시켰다. 이러한 데이터로부터, 상기 클론들은 p53 활성과 관계없이 MDM2 발현을 향상시키는 것으로 결론지었다(도 7 및 도 8 참조). 상기 실시예 <2-2>의 과정으로 인해 p53-의존적인 MDM2 발현의 가능성을 배재하였기 때문에, 전술한 결과는 상기 클론들이 p53에 독립적인 방식으로 MDM2 발현을 매개한다는 것을 나타낸다.

<2-4> MAPK -의존성 및 - 비의존성 신호에 의한 MDM2 전사 조절

AP1 전사 인자를 통하여 MDM2의 전사를 활성화시키는 클론을 규명하기 위하여, AP1 binding motif에 돌연변이가 있는 MDM2 P2 promoter reporter를 구축하였다. 도 9에서 도시한 것과 같이, MDM2 P2 promoter에 점돌연변이를 발생시켜 실질적으로 AP-1 binding site가 제거된 것과 같은 상태로 만들었다. 71개의 클론을 대상으로 상기 돌연변이 P2 프로모터에 대한 영향을 확인하였다. 각 프로모터의 상대적 강도를 구별하기 위하여, wild type P2 promoter 활성을 mutant P2 promoter 활성과 나눈 후 배수변화(fold change)를 log2 value로 변환하였다(표 1 참조). 하기 [표 1]은 AP-1 binding site가 제거된 p2 프로모터와 wild type P2 프로모터의 활성의 비율을 모니터링함으로서 AP-1 독립적 MDM2 발현 조절을 보여준다. mutant P2 promoter가 +1 fold 초과로 활성화된 대부분의 경우, 도 5와 비교했을 때 p53은 주요한 조절 인자일 것이다. p53-negaitve cell에서 MDM2 P2 promoter 활성을 증가시킨 클론들 중, NTRK2, GNA15 또는 SFRS2의 3개의 클론은 AP-1 binding site 없이 P2 promoter의 활성화를 보였다. 상기 클론들은 p53과 AP-1에 비의존적인 방식의 MDM2 전사 활성 메커니즘을 가진다. -1 fold 미만으로 돌연변이 프로모터의 활성이 감소된 클론들은 AP-1 조절 활성을 가지며, 이는 AP-1이 MDM2 전사의 자극 인자임을 나타낸다. 이러한 결과는 상기 71개의 클론 중, EIF5A, ELAVL1 또는 YWHAB는 p53-negative cell에서 P2 promoter 활성을 향상시킬 수 있고, p53에는 독립적이고 AP-1에는 의존적인 방식으로 MDM2 전사를 조절 할 수 있다는 것을 제시한다. -1 에서 +1 fold의 프로모터 활성을 보이는 클론들은 AP-1 기능과 관련되지 않는다. 상기 결과들로 미루어볼 때, p53-독립적으로 MDM2를 상향조절하는 클론들 중에서도 하기 [표 1]의 No.56 내지 No.62, No.64의 일부 유전자들만 MAPK signaling과 관련이 있음을 확인하였다.

NO.	Gene symbol	NCBI Genbank accession number	Gene title	Mutant P2 promoter (Log ₂ Fold)
1	LIMK2	BC013051	LIM domain kinase 2	2.5795574
2	ARHGDIA	BC016031	Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha	2.3041281
3	XRCC4	BC016314	X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4	2.0948869
4	GNA15	BC013585	guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 15 (Gq class)	1.8437359
5	PEPD	BC028295	peptidase D	1.8156391
6	SLC12A8	BC020506	solute carrier family 12 (potassium/chloride transporters), member 8	1.7809956
7	KRT16	BC039169	keratin 16 (focal non-epidermolytic palmoplantar keratoderma)	1.6973294
8	SH3GL1	BC001270	SH3-domain GRB2-like 1	1.6957875
9	NRG1	NM_013958	neuregulin 1	1.5941074
10	CCL13	BC008621	chemokine (C-C motif) ligand 13	1.5831476
11	LTBR	BC026262	leucine zipper and CTNNBIP1 domain containing	1.5108681
12	SRP14	BC035495	signal recognition particle 14kDa (homologous Alu RNA binding protein)	1.5026752
13	NTRK2	BC031835	neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2	1.4409936
14	PTPN9	BC010863	protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 9	1.3593083
15	MATR3	AAH15031	Matrin-3	1.2316177
16	IFI44L	NP_006811	interferon induced protein 44 like	1.2077829
17	NTRK3	BC013693	neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3	1.2009373
18	PMM1	BC010855	phosphomannomutase 1	1.1852772
19	PITX1	BC003685	paired-like homeodomain transcription factor 1	1.1363
20	TCF2	BC017714	transcription factor 2, hepatic; LF-B3; variant hepatic nuclear factor	1.1245194
21	VBP1	NM_003372	von Hippel-Lindau binding protein 1	1.0541948
22	PRMT2	NP_001229793	protein arginine methyltransferase 2	0.9730853
23	CHES1	BC010460	checkpoint suppressor 1	0.9606215
24	PTGS1	BC029840	phosphatase and tensin homolog (mutated in multiple advanced cancers 1)	0.9318186
25	PRCC	BC010450	papillary renal cell carcinoma (translocation-associated)	0.9097436
26	SFRS2	BC001303	splicing factor, arginine/serine-rich 2	0.8979251
27	FNTA	NM_001018676	farnesyltransferase, CAAX box, alpha	0.8873807
28	GCDH	NM_013976	glutaryl-Coenzyme A dehydrogenase	0.8466588
29	MCCC2	BC014897	methylcrotonoyl-Coenzyme A carboxylase 2 (beta)	0.7945142
30	CDC27	S78234	cell division cycle 27	0.7506156
31	HLA-DPB1	BC013184	major histocompatibility complex, class II, DP beta 1	0.7302533
32	SHC1	NM_003029	SHC (Src homology 2 domain containing) transforming protein 1	0.7019317
33	HINT1	BC001287	histidine triad nucleotide binding protein 1	0.6890165
34	EZH2	BC010858	enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila)	0.4952767
35	MYOZ2	AF249873	myozenin 2	0.4482624
36	USP48	BC013567	ubiquitin specific peptidase 48	0.4412951
37	TMSB10	BC016025	thymosin, beta 10	0.4123228
38	LRRC48	BC040276	leucine rich repeat containing 48	0.3597844
39	SLC22A6	BC033682	solute carrier family 22 (organic anion transporter), member 6	0.2823883
40	GMPS	NM_003875	guanine monphosphate synthetase	0.1605923
41	JTV1	BC013630	JTV1 gene	0.0460815
42	CYP2C8	BC020596	cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 8	0.020361
43	SERPINA6	NM_001756	serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 6	-0.079384
44	NRD1	BC008775	nardilysin (N-arginine dibasic convertase)	-0.1021581
45	KNG1	NM_000893	kininogen 1	-0.2347799
46	MDM4	BC067299	Mdm4, transformed 3T3 cell double minute 4, p53 binding protein (mouse)	-0.252151
47	TUBG1	NM_001070	tubulin, gamma 1	-0.3261284
48	CASP3	BC016926	caspase 3, apoptosis-related cysteine peptidase	-0.3873012
49	ABCG1	BC029158	ATP-binding cassette, sub-family G (WHITE), member 1	-0.4181947
50	HISPPD1	BC024591	Histidine acid phosphatase domain containing 1	-0.4686259
51	PCNA	NM_182649	proliferating cell nuclear antigen	-0.4724855
52	IL3RA	BC035407	interleukin 3 receptor, alpha (low affinity)	-0.5082548
53	BDH1	BC011964	3-hydroxybutyrate dehydrogenase, type 1	-0.6009692
54	LOC51035	BC000902	UBX domain-containing protein 1	-0.7089884
55	TPM3	BC015403	tropomyosin 3	-0.8851024
56	EIF5A	BC080196	eukaryotic translation initiation factor 5A	-1.0062502
57	ZNF212	BC022785	zinc finger protein 212	-1.0281441
58	SLC1A4	BC026216	solute carrier family 1 (glutamate/neutral amino acid transporter), member 4	-1.0551598
59	SLC12A9	BC000154	solute carrier family 12 (potassium/chloride transporters), member 9	-1.0687621
60	ZFP36L1	BC018340	zinc finger protein 36, C3H type-like 1	-1.2227328
61	ITIH4	NM_002218	inter-alpha (globulin) inhibitor H4 (plasma Kallikrein-sensitive glycoprotein)	-1.2281534
62	ELAVL1	BC003376	ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, Drosophila)-like 1 (Hu antigen R)	-1.3487199
63	CALB2	BC015484	calbindin 2, 29kDa (calretinin)	-2.0840134
64	YWHAB	NM_003404	tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, beta polypeptide	-2.159689
65	MAGEA12	BC003408	melanoma antigen family A, 12	-2.4032261
66	MRCL3	BC032748	myosin regulatory light chain MRCL3	-2.7416348
67	SFRS10	NP_001230808	Transformer-2 protein homolog beta	-3.3800243
68	CYP19A1	BC035714	cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1	-4.7011835
69	RGL2	BC032681	ral guanine nucleotide dissociation stimulator-like 2	-5.144463
70	SERPINA3	NP_001076	serpin family A member 3	-5.6767538
71	BCL2	BC027258	B-cell CLL/lymphoma 2	-5.9073463

상기 표 1의 유전자에 대한 추가적인 정보는 당업계에 공지된 단백질 및 유전자 데이터 베이스 (예를 들어, Genbank 또는 Uniprot)의 정보를 원용한다.

< 실시예 3>

MDM2 조절 유전자에 의한 세포 생존율 조절

전술한 실시예에서 선택된 클론들에 의해 증가된 MDM2 발현이 세포 생존율(cell viability)에 미치는 영향을 평가하기 위해서, HCT116 p53+/+ 세포 및 LLC-PK 세포를 상기 클로들로 트렌스펙션 시키고 UV crosslinker를 조사(radiation)한 후, cell proliferating counting system을 이용해 세포 생존율을 측정하였다. LOC51035, MAGEA12, SFRS2, ELAVL1, PRCC, SERPINA3, GNA15, 또는 NTRK2로 트렌스펙션된 세포들은 세포 성장이 향상된 것을 보여주었다(도 10A 참조). 그러나, EIF5A 또는 KNG1은 세포의 성장에 영향을 주지 않았다(도 10A 참조). 이러한 경향성은 p53-deficient cell에서도 유사하였다(데이터 미도시). 30초 동안 UV 조사(UV radiation) 후, SFRS2, PRCC, 또는 NTRK2이 트렌스펙션된 세포들은 더 나은 세포 생존성을 보였다(도 10A 참조). 흥미롭게도 NTRK2를 발현하도록 한 세포는 UV 조사에의한 영향을 받지 않았으며, 이는 NTRK2가 DNA damage signaling에의하여 세포사를 방지하는 역할을 함을 시사한다. 이와 유사한 현상이 LLC-PK cell에서 관찰되었다(도 10B 참조). SFRS2, PRCC, 또는 NTRK2로 트렌스펙션된 세포들은 UV 조사 후 향상된 세포 생존성을 보였다(도 10B 참조). 즉, 상기 SFRS2, PRCC 또는 NTRK2로 트렌스펙션된 세포들은 UV 조사에의한 p53-의존성 세포자멸(apoptosis)에 내성을 보이는 것으로서, 이러한 사실들은 상기 유전자를 활성화시키는 것이 종양 발생 중 p53을 억제하고 DNA damage signaling에 의하여 세포사를 막는 것을 의미한다. 다시말해서 종양세포가 p53에 의한 아포토시스(apoptosis)에 저항성을 가지게 됨을 시사한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 p53-비돌연변이 암에 대한 암 마커 유전자 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준 측정을 통한 p53-비돌연변이 암 진단 방법과, (a) p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene)를 발현하는 세포를 시험제제와 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 유전자 발현정도와 비교하여 상기 시험제제가 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)에 대한 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.

현재까지 대부분의 암에서 암 억제 유전자인 p53에서 돌연변이가 발견되는 것과 구별하여, 본 발명자에 의하여 최초로 명확히 규명된 p53-독립적으로 MDM2의 과발현을 조절하는 상위 조절 유전자들(표 1 참조)을 기반으로 하는 본 발명의 스크리닝 방법은 p53-비돌연변이 암 특이적 항암제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있다. 또한 상기 방법에 의하여 스크리닝된 화합물로서 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 저해제 또는 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 저해제 물질들은 p53-비돌연변이 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 이용하능하며, 뿐만아니라 본 발명에서 규명한 유전자(표 1 참조)들은 p53비돌연변이 암의 상태에서 유의적으로 상향발현되므로, 기존에 암진단이 p53-돌연변이 존재에 의존적이었던것과는 달리 p53-비돌연변이 암 발생에 대한 진단이 가능하므로, 제약 및 체외진단 산업등의 분야에서 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

(a) p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene)를 발현하는 세포를 시험제제와 배양하는 단계; 및
(b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 유전자 발현정도와 비교하여 상기 시험제제가 p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계
를 포함하는, p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)에 대한 치료제 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, p53-독립적 MDM2 조절 유전자는 SLC12A9, LOC51035, SFRS10, MAGEA12, SFRS2, PITX1, HINT1, SH3GL1, ELAV1, CCL13, PRCC, NTRK3, CHES1, GNA15, PTPN9, USP48, PMM1, EZH2, IFI44L, TMSB10, MCCC2, ARHGDIA, MATR3, JTV1, SERPINA3, SLC12A8, CALB2, BDH1, ZFP36L1, LIMK2, HLA-DPB1, TPM3, TCF2, CASP3, ZNF212, HISPPD1, SLC1A4, BCL2, KRT16, PEPD, NTRK2, ABCG1, LRRC48, PTGS1, IL3RA, SLC22A6, MRCL3, RGL2, CYP19A1, SHC1, VBP1, FNTA, LTBR, TUBG1, PCNA, MDM4, XRCC4, SRP14, YWHAB, CDC27, EIF5A, NRG1, MYOZ2, ITIH4, CYP2C8, GCDH, SERPINA6, KNG1, NRD1, PRMT2 및 GMPS로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, p53-독립적 MDM2 조절 유전자는 CBX5, FMOD, GNA15, GPD2, GZMK, IL8RB, KNG1, LOC51035, MAGEA12, MLH1, MNDA, MYOZ2, NTRK2, PRCC, RARS, SERPINA3, SFRS10, SFRS2 및 SLC12A1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, p53-독립적 MDM2 조절 유전자는 GNA15, KNG1, NTRK2, PRCC, SERPINA3, SFRS2, LOC51035 및 MAGEA12로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 p53-비돌연변이 암은 p53 유전자에 돌연변이가 일어나지 않았으며, 백혈병(Leukemia), 림프종(Lymphoma) 혈액종양(hematopoietic malignancy), 자궁경부암(cervical cancer), 육종(sarcoma), 고환암(testicular cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 내분비 종양(endocrine tumor), 골암(bone cancer), 전립선암(prostate cancer), 자궁암(uterus cancer), 유방암(breast cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌 종양(brain cancer), 간암(liver cancer), 위암(stomach cancer), 췌장암(pancreas cancer), 피부암(skin cancer), 폐암(lung cancer), 후두암(larynx cancer), head and neck cancer(두경부암), 식도암(esophageal cancer), 대장암(colorectal cancer) 및 난소암(ovarian cancer)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 p53-비돌연변이 암은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)임을 특징으로 하는 방법.
제1항의 p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)에 대한 치료제 스크리닝 방법을 통해 스크리닝된 화합물.
p53-독립적 MDM2 조절 유전자의 발현 저해제 또는 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 p53-비돌연변이 암(p53-non mutational cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 저해제는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 상기 저해제는 p53-독립적 MDM2 조절 유전자에 의해 발현된 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자는 CBX5, FMOD, GNA15, GPD2, GZMK, IL8RB, KNG1, LOC51035, MAGEA12, MLH1, MNDA, MYOZ2, NTRK2, PRCC, RARS, SERPINA3, SFRS10, SFRS2 및 SLC12A1로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 상기 p53-비돌연변이 암은 p53 유전자에 돌연변이가 일어나지 않았으며, 백혈병(Leukemia), 림프종(Lymphoma) 혈액종양(hematopoietic malignancy), 자궁경부암(cervical cancer), 육종(sarcoma), 고환암(testicular cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 내분비 종양(endocrine tumor), 골암(bone cancer), 전립선암(prostate cancer), 자궁암(uterus cancer), 유방암(breast cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌 종양(brain cancer), 간암(liver cancer), 위암(stomach cancer), 췌장암(pancreas cancer), 피부암(skin cancer), 폐암(lung cancer), 후두암(larynx cancer), head and neck cancer(두경부암), 식도암(esophageal cancer), 대장암(colorectal cancer) 및 난소암(ovarian cancer)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 p53-비돌연변이 암은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)임을 특징으로 하는 조성물.
p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 p53-비돌연변이 암 진단용 조성물.
제14항에 있어서, 상기 제제는
(a) p53-독립적 MDM2 조절 유전자 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는
(b) p53-독립적 MDM2 조절 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
제14항에 있어서, p53-독립적 MDM2 조절 유전자는 SLC12A9, LOC51035, SFRS10, MAGEA12, SFRS2, PITX1, HINT1, SH3GL1, ELAV1, CCL13, PRCC, NTRK3, CHES1, GNA15, PTPN9, USP48, PMM1, EZH2, IFI44L, TMSB10, MCCC2, ARHGDIA, MATR3, JTV1, SERPINA3, SLC12A8, CALB2, BDH1, ZFP36L1, LIMK2, HLA-DPB1, TPM3, TCF2, CASP3, ZNF212, HISPPD1, SLC1A4, BCL2, KRT16, PEPD, NTRK2, ABCG1, LRRC48, PTGS1, IL3RA, SLC22A6, MRCL3, RGL2, CYP19A1, SHC1, VBP1, FNTA, LTBR, TUBG1, PCNA, MDM4, XRCC4, SRP14, YWHAB, CDC27, EIF5A, NRG1, MYOZ2, ITIH4, CYP2C8, GCDH, SERPINA6, KNG1, NRD1, PRMT2 및 GMPS로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 조성물.
제14항에 있어서, 상기 p53-비돌연변이 암은 p53 유전자에 돌연변이가 일어나지 않았으며, 백혈병(Leukemia), 림프종(Lymphoma) 혈액종양(hematopoietic malignancy), 자궁경부암(cervical cancer), 육종(sarcoma), 고환암(testicular cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 내분비 종양(endocrine tumor), 골암(bone cancer), 전립선암(prostate cancer), 자궁암(uterus cancer), 유방암(breast cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌 종양(brain cancer), 간암(liver cancer), 위암(stomach cancer), 췌장암(pancreas cancer), 피부암(skin cancer), 폐암(lung cancer), 후두암(larynx cancer), head and neck cancer(두경부암), 식도암(esophageal cancer), 대장암(colorectal cancer) 및 난소암(ovarian cancer)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제14항의 조성물을 포함하는 p53-비돌연변이 암 진단용 키트.
p53-비돌연변이 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 p53-독립적 MDM2 조절 유전자(p53-independent MDM2 modulating gene) 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 정성 또는 정량분석하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 방법은
(a) 피검체의 시료로부터 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계;및
(b) 상기 p53-독립적 MDM2 조절 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 정상인과 비교하고, 정상인에 비해 발현 수준이 증가한 피검체를 p53-비돌연변이 암에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 유전자 발현 수준 측정은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트면역전기영동, 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의한 것을 특징으로 하는 방법.