KR20190009961A

KR20190009961A - Bcl2 유전자 및 bi-1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산

Info

Publication number: KR20190009961A
Application number: KR1020170091980A
Authority: KR
Inventors: 최진우
Original assignee: (주)큐리진
Priority date: 2017-07-20
Filing date: 2017-07-20
Publication date: 2019-01-30
Also published as: KR101993377B1

Abstract

본 발명은 BCL2 유전자 및 BI-1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 분자와, 이를 포함하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, siRNA의 표적 특이성으로 인한 치료 효과가 높지 않은 단점을 극복하기 위하여, 암과 관련된 BCL2 유전자 및 BI-1 유전자의 발현을 동시에 억제하도록 설계된 본원발명의 이중 가닥 siRNA는 암세포의 사멸을 촉진하고, 항암제와의 병용 처리에서 암세포 사멸을 시너지적으로 향상시키는 효과가 있으므로, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

BCL2 유전자 및 BI-1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산{Nucleic acids for simultaneous inhibition of BCL2 gene and BI-1 gene}

본 발명은 BCL2 유전자 및 BI-1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 분자와, 이를 포함하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 전세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로, 혁신적인 암 치료제의 개발은 이에 대한 치료시 발생되는 의료비를 절감할 수 있음과 동시에 고부가가치를 창출할 수 있다. 또한, 2008년의 통계에 따르면, 기존항암제 내성을 극복 할 수 있는 분자 치료제는 주요 7개국(US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK)에서 $17.5 billion을 차지했고, 2018년의 경우 약 $45 billion 정도의 market size를 차지하여, 2008년 대비 9.5%의 성장률을 보일 것이라 예측되고 있다. 암의 치료는 수술, 방사선치료, 화학요법, 생물학적 치료로 구분되는데, 이 중에 화학요법은 화학물질로서 암 세포의 증식을 억제하거나 죽이는 치료법으로 항암제에 의하여 나타나는 독성은 상당부분 정상세포에서도 나타나기 때문에 일정 정도의 독성을 나타내며, 항암제가 효과를 나타내다가도 일정 기간의 사용 후에는 효과가 상실되는 내성이 발생하기 때문에 암세포에 선택적으로 작용하고 내성이 생기지 않는 항암제의 개발이 절실하다 (암 정복의 현주소 Biowave 2004. 6(19)). 최근 암에 대한 분자유전정보의 확보를 통해 암의 분자적 특성을 표적으로 한 새로운 항암제의 개발이 진행되고 있으며, 암세포만이 가지고 있는 특징적인 분자적 표적(molecular target)을 겨냥하는 항암제들은 약제 내성이 생기지 않는다는 보고도 있다.

유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 간섭 RNA(RNA interference, 이하 ‘RNAi’라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764773). RNAi는 21-25개의 뉴클레오타이드 크기의 이중나선 구조를 가진 작은 간섭 리보핵산 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 ‘siRNA’라고 한다)이 상보적인 서열을 가지는 전사체(mRNA transcript)에 특이적으로 결합하여 해당 전사체를 분해함으로써 특정 단백질의 발현을 억제하는 현상이다. 세포 내에서는 RNA 이중가닥이 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의해 프로세싱되어 21 내지 23개의 이중가닥(base pair,bp)의 siRNA로 변환되며, siRNA 는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514). 베르트랑(Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 포함하는 것으로 밝혀졌다 (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 296: 1000-1004). siRNA를 포함하는 RNAi 기술 기반 치료제 시장은 향후 세계 시장규모가 2020년경에 총 12조원 이상을 형성하는 것으로 분석되었으며, 해당 기술을 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대되어 기존의 항체, 화합물 기반 의약품으로 치료하기 어려운 질병을 치료할 수 있는 차세대 유전자 치료기술로 평가되고 있다. 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질(small molecule drug)이 특정한 단백질 표적에 최적화되기까지 오랜 동안의 개발 기간 및 개발 비용이 소요되는 것에 비하여, 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있고, 개발 기간이 단축되면서, 의약화가 불가능한 표적 물질을 포함한 모든 단백질 표적에 대하여 최적화된 리드 화합물을 개발할 수 있다는 장점을 가진다 (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670). 이에, 최근 이 리보핵산 매개 간섭현상이 기존의 화학 합성 의약 개발에서 발생되는 문제의 해결책을 제시하면서 전사체 수준에서 특정 단백질의 발현을 선택적으로 억제하여 각종 질병 치료제, 특히 종양 치료제 개발에 이용하려는 연구가 진행되고 있다. 또한, siRNA 치료제는 기존 항암제와 달리 표적이 명확하여 부작용이 예측 가능하다는 장점이 있으나, 이러한 표적 특이성은 다양한 유전자의 문제에 의해 발생하는 질병인 종양의 경우, 오히려 이러한 표적 특이성은 치료 효과가 높지 않은 원인이 되기도 한다.

인간에서 BCL2 유전자에 의해 암호화되는 Bcl-2 (B-cell lymphoma 2)는 세포 사멸을 유발 (pro-apoptotic) 또는 억제 (anti-apoptotic)함으로써 세포 사멸(apoptosis)을 조절하는 단백질로 알려져 있다 ("Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome translocation. Science. 226 (4678): 1097?9.). Bcl-2는 중요한 항-세포 사멸 단백질로 여겨지지만, 원발암-유전자로 여겨지지는 않는다. Bcl-2 유전자의 손상은 흑색종, 유방암, 전립선암, 만성 림프구성 백혈병 및 폐암를 포함하는 다양한 암의 원인으로 밝혀졌으며, 정신분열증 및 자가면역의 원인일 가능성이 밝혀졌다. 또한, 이는 암 치료에 대한 저항성을 유발하는 원인인 것으로도 알려졌다. Bcl2이 항암제의 좋은 타겟이므로, 이에 대한 다양한 억제제(inhibitor)들이 개발되고 있으나, 다양한 부작용과 내성이 발생하는 문제점이 있어왔다.

한편, BI-1(BAX inhibitor 1)은 Bax에 의한 세포사멸을 억제하고, 여러 자극에 의한 세포사멸로부터도 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. 또한, 동물, 식물을 비롯해서 미생물에도 유사 단백질이 존재하는 것으로 밝혀지고 있으며, 각각의 작용과 그 기작이 비슷하다고 알려져 있다.

현재, Bcl-2는 항암제 개발의 타겟이 되고 있지만, 본 발명자들은 Bcl-2 의 기능을 억제하더라도, BI-1의 과발현은 항암제의 치료효과를 저해하는 것을 확인하여, 이들을 동시에 억제하기 위한 siRNA를 구성하기에 이르렀다.

본 발명에서는 siRNA의 표적 특이성으로 인한 치료 효과가 높지 않은 단점을 극복하기 위하여, 암과 관련된 BCL2 유전자 및 BI-1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 siRNA 및 shRNA를 제작하였으며, 이의 항암 활성 및 항암제와의 시너지적 항암 활성을 확인함으로써 이를 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 BCL2 유전자 및 BI-1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터를 도입한 바이러스를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는, 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본원발명의 이중 가닥 siRNA의 센스 가닥은 BCL2 유전자의 발현을 억제하고 안티센스 가닥은 BI-1 유전자의 발현을 억제하므로, 두 유전자를 동시에 억제할 수 있으며, 이를 통해 암세포의 사멸을 촉진하고, 각각의 siRNA를 함께 처리한 것보다 항암 활성이 현저하며, 항암제와의 병용 처리에서 암세포 사멸을 시너지적으로 향상시키는 효과가 있고, siRNA는 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어나므로, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 이중 표적 siRNA를 포함하는 shRNA들을 세포 내에서 발현하기 위한 벡터의 맵을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 이중 표적 siRNA에 의한 BCL2 유전자 (좌) 및 BI-1 유전자 (우)의 발현 억제 효과를 확인한 도이다.
도 3은 이중 표적 siRNA과 항암제의 병용 처리에 의한 암세포 사멸 효과를 BCL2 유전자에 대한 siRNA 및 BI-1 유전자에 대한 siRNA를 함께 처리한 군과 비교한 도이다:
control: 대조군 siRNA 트랜스펙션 후 시스플라틴을 처리한 군;
Bcl2: Bcl2 siRNA를 트랜스펙션 후 시스플라틴을 처리한 군;
BI-1: BI-1 siRNA를 트랜스펙션 후 시스플라틴을 처리한 군; 및
dual: 본 발명의 이중 표적 siRNA를 트랜스펙션 후 시스플라틴을 처리한 군.
도 4는 항암제와 Bcl2 siRNA 및 BI-1 siRNA의 병용 처리에 의한 암세포 사멸을 확인한 도이다:
siBlc2&BI1: Bcl2 siRNA 및 BI-1 siRNA 혼합 트랜스펙션; 및
no treat: 항암제를 처리하지 않은 처리군.
도 5는 본 발명의 이중 표적 siRNA와 항암제의 병용처리에 의한 암세포 사멸을 확인한 도이다;
siBB: 본 발명의 이중 표적 siRNA; 및
no treat: 항암제를 처리하지 않은 처리군.
도 6은 항암제로 사용되고 있는 Bcl2 억제제인 ABT-737과 본 발명의 이중 표적 siRNA의 암세포 사멸 효과와, 이들의 병용 처리에 의한 시너지 효과를 확인한 도이다:
ABT: ABT-737; 및
siRNA: 본 발명의 이중 표적 siRNA

이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

일 측면에서, 본 발명은 BCL2 유전자 및 BI-1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 분자에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 핵산 분자는 RNA 간섭에 의해 BCL2(B-cell lymphoma 2) 유전자 발현을 억제할 수 있고, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 핵산 분자는 RNA 간섭에 의해 BI-1(BAX inhibitor 1) 유전자의 발현을 억제할 수 있어, 본원발명의 핵산 분자는 BCL2 유전자와 BI-1 유전자의 발현을 동시에 억제할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 siRNA가 부분적으로 상보적 결합을 이루고 있는 이중 가닥(double strand) siRNA일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 siRNA (BCL2 유전자에 대한 안티센스 가닥) 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 siRNA (BI-1 유전자에 대한 안티센스 가닥)가 21mer 중 15mer가 상보적으로 결합되어 이중 가닥의 siRNA를 이루도록 제작하였고, 이중 가닥의 siRNA가 각각 BCL2 유전자 및 BI-1 유전자를 표적화하여 두 유전자의 발현을 동시에 억제함을 확인함으로써 이중 표적 siRNA 세트임을 확인하였다.

일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 shRNA(short hairpin RNA)일 수 있으며, 상기 shRNA는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 shRNA는 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열이 부분적으로 상보적 결합하고 루프 영역에 의해 회문적으로 연결되어 헤어핀 구조를 형성할 수 있으며, 본원발명의 일 실시예에서는 헤어핀 구조의 루프 부분 염기서열에 따라 TTCAAGAGAG loop shRNA (서열번호 5) 또는 TTGGATCCAA loop shRNA (서열번호 6)로 기재하였다.

본 발명에서 BCL2 및 BI-1를 표적으로 하는 siRNA는 인간(Homo sapiens)의 BCL2 유전자 또는 BI-1 유전자의 일부와 상보적인 서열을 가지고, BCL2 유전자 또는 BI-1 유전자의 mRNA를 분해하거나, 번역을 억제할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “발현 억제"란 표적 유전자의 (mRNA로의) 발현 또는 (단백질로의) 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “siRNA(small interfering RNA)”란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 일반적으로 siRNA는 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되나, 본 발명의 이중 가닥 siRNA는 센스 RNA 가닥이 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 siRNA (BCL2 유전자에 대한 안티센스 가닥)이고, 안티센스 RNA 가닥이 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 siRNA (BI-1 유전자에 대한 안티센스 가닥)이므로, 이중 가닥의 siRNA가 각각 동시에 BCL2 유전자 및 BI-1 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

일 측면에서, 본 발명은 본원발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 siRNA을 포함할 수 있으며, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 shRNA 또는 서열번호 6의 염기서열의 염기서열을 포함하는 shRNA를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합벡터는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있으며, 일 실시예에서는 pE3.1 벡터를 이용하였다.

본 발명에서 BCL2 및 BI-1에 대한 siRNA를 전달하기에 유용한 비바이러스 벡터로는 통상적으로 유전자 요법에 사용되는 모든 벡터를 포함하며, 예를 들어 진핵세포에서 발현 가능한 다양한 플라스미드 및 리포좀 등이 있다.

본 발명에서 BCL2 및 BI-1를 표적으로 하는 이중 가닥 siRNA가 전달된 세포에서 적절히 전사되게 하기 위해서는 이를 포함하는 shRNA, 특히, 서열번호 5의 염기서열 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 shRNA를 적어도 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 상기 프로모터는 진핵세포에서 기능할 수 있는 프로모터라면 어떤 것이든지 무방하나, 서열번호 7로 기재한 U7 프로모터가 보다 바람직하다. BCL2 및 BI-1를 표적으로 하는 이중 가닥 siRNA 또는 shRNA의 효율적인 전사를 위하여 필요에 따라 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 인핸서, 업스트림 활성화 서열, 신호펩타이드 서열 및 전사 종결인자를 비롯한 조절서열을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명에서 BCL2 및 BI-1에 대한 siRNA 또는 shRNA를 전달하기에 유용한 바이러스 또는 바이러스 벡터로는 바쿨로비리디애(baculoviridiae), 파르보비리디애(parvoviridiae), 피코르노비리디애(picornoviridiae), 헤레페스비리디애(herepesviridiae), 폭스비리디애(poxviridiae), 아데노비리디애(adenoviridiae) 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은 본원발명의 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는, 항암용 약학적 조성물에 대한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 항암용 약학적 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 항암제는 ABT-737, 택솔(Taxol), 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 에토포사이드(Etoposide), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, ABT-737, 택솔(Taxol), 시스플라틴(Cisplatin) 또는 에토포사이드(Etoposide)인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 전립선암 또는 자궁경부암인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본원발명의 핵산을 포함하는 조성물의 투여로 암세포의 사멸 또는 암의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

본 발명의 약학 조성물은 암 및 이의 합병증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 항암보조제로도 사용될 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 이중 표적 siRNA 제작

BCL2(B-cell lymphoma 2) 및 BI-1(BAX inhibitor 1)을 동시에 억제할 수 있는 21mer 의 이중 표적 siRNA (double strand)를 하기 표 1의 서열로 제작하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea).

siRNA	서열 (5'→3')	서열번호
sense (Antisense Bcl-2)	AAG AAG AGG AGA AAA AAA UGA	1
antisense (Antisense BI-1)	UCA UUU CUU CUC UUU CUU CUU	2

상기 서열번호 1 및 2로 이루어진 21mer의 siRNA는 21mer 중 15mer가 서로 상보적이며, 서열번호 1의 siRNA (Antisense Bcl-2)가 Bcl-2의 mRNA에 상보적으로 결합하고, 서열번호 2의 siRNA (Antisense BI-1)가 BI-1의 mRNA에 상보적으로 결합하여 Bcl-2 및 BI-1 유전자의 발현을 동시에 감소시킨다.

실시예 2. 이중 표적 shRNA 제작

상기 실시예 1에서 제작한 이중 표적 siRNA를 세포 내에서 발현할 수 있게 하기 위하여, 상기 siRNA 이중 가닥의 DNA 변환 서열 (서열번호 3 및 4)과 루프 서열을 포함하는 shRNA들 (TTCAAGAGAG 루프 shRNA 및 TTGGATCCAA 루프 shRNA)을 제작하였다 (표 2). 제작한 shRNA들을 각각 pE3.1 벡터 (도 1)의 제한효소 PstⅠ 및 EcoRⅤ 절단 위치에 U7 프로모터 (서열번호 7) 이후에 오도록 배치하여, BCL2 및 BI-1를 표적으로 하는 이중 표적 siRNA를 포함하는 두 종의 shRNA를 세포 내에서 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제작하였다.

	서열 (5'→3')	서열번호
Antisense Bcl-2	aagaagaggagaaaaaaatga	3
Antisense BI-1	tcatttcttctctttcttctt	4
TTCAAGAGAG loop shRNA	aagaagaggagaaaaaaatgaTTCAAGAGAGtcatttcttctctttcttcttTT	5
TTGGATCCAA loop shRNA	aagaagaggagaaaaaaatgaTTGGATCCAAtcatttcttctctttcttcttTT	6

실험예 1. 이중 표적 siRNA의 Bcl-2 및 BI-1 유전자 발현 억제 효과 확인

12웰 플레이트에 Hela, Hek293 및 A549세포를 각각 분주한 뒤, 세포 confluent가 50%가 될 때까지 10% FBS (Hyclone 사)가 첨가된 RPMI 배지 (Hyclone 사)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 그 후, 상기 세포가 배양된 웰에 상기 실시예 1에서 제작한 이중 표적 siRNA를 웰당 80 pmole씩 3㎕의 리포펙타민(lipofectamine)3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 트랜스펙션하여 BCL2 및 BI-1를 동시에 낙다운하였다. 트랜스펙션 48시간 후, 세포를 파쇄하여 GeneJET RNA Purification Kit (Invitrogen)로 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA를 주형으로 사용하여 RT-PCR 반응을 통해 cDNA로 역전사 한 뒤, q-PCR 반응을 통해 이중 표적 siRNA에 의한 BCL2 및 BI-1의 mRNA 발현량을 확인하였다. 구체적으로, 하기 표 3의 프라이머 세트와 표 4의 반응 혼합물을 이용하여 표 5의 PCR 조건으로 낙다운한 세포 파쇄물에서의 BCL2 및 BI-1의 mRNA를 cDNA로 변환하였다.

		서열 (5'→3')	서열번호
BCL2	forward	TTTGAGTTCGGTGGGGTCAT	8
BCL2	reverse	TGACTTCACTTGTGGCCCAG	9
BI-1	forward	GCCGGGTAAAAGATCGGGAG	10
BI-1	reverse	AAGATCATTGCCGTGCCCAT	11
GAPDH	forward	CTAGGCGCTCACTGTTCTCTC	12
GAPDH	reverse	GTCCGAGCGCTGACCTT	13

10X reaction Buffer	2 ㎕
HQ Buffer	2 ㎕
dNTP	1.6㎕
Primer(F, R, 10 pmole/ul)	각각 1㎕
Template(500 ng)	2㎕
Taq	0.2㎕
DW	10.2㎕
Total vol.	20㎕

Pre heat 95 ℃	2 min
Denaturation 95 ℃	20 sec	30 cycles
Annealing 60 ℃	10 sec
Extension 72 ℃	30 ~ 60 sec
Final extension 72 ℃	5 min

역전사된 cDNA를 주형으로 이용하여, 하기 표 6의 조성으로 반응 혼합물을 준비하고 표 7의 조건으로 qPCR 을 수행하였다. 참고로, 사용한 프로브는 Bcl2(Thermo, Hs00608023_m1), BI-1(Thermo, Dm01835892_g1), GAPDH(Thermo, Hs02786624_g1)이며, QS3 장비를 이용하여 수행하였다. 모든 반응은 3회씩 반복수행되고 이들의 평균값이 취해졌다. 이렇게 얻은 결과들은 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 mRNA 값에 대해 정규화하였다.

Template(RT-PCR product)	6㎕
Taqman probe	3㎕
10X reaction Buffer	6㎕
HQ Buffer	6㎕
dNTP	4.8㎕
Taq	0.6㎕
DW	10.2㎕
Total vol.	60㎕

Pre denaturation 95 ℃	10 min
Denaturation 95 ℃	15 sec	40 cycles
Extension 60 ℃	1 min	40 cycles

그 결과, 이중 표적 siRNA에 의해 BCL2 및 BI-1의 발현이 모두 감소하여, 본 발명의 이중 표적 siRNA가 두 유전자의 발현을 동시에 억제하는 것을 알 수 있었다 (도 2).

실험예 2. 이중 표적 siRNA과 항암제의 병용 처리에 의한 암세포 사멸 효과 확인

인간 전립선 암세포주인 PC3 세포주를 6웰 플레이트에 각각 배양한 뒤, 본 발명의 이중 표적 siRNA (siBB, dual)와, 하기 표 8의 BCL2 또는 BI-1 각각에 대한 siRNA를 각각 트랜스펙션한 뒤 48시간 뒤에 시스플라틴을 10 ~ 20 uM로 처리하였다. 시스플라틴 처리 12시간 뒤에 5mg/mL MTT (Promega, Ltd.)를 세포에 처리하고 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고 가용화 용액(solubilization solution) 및 정지 용액(stop solution) 150㎕을 처리하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 반응 용액의 흡광도를 570nm에서 측정하고 하기 수학식을 이용하여 세포 생존율을 계산하였다.

		서열 (5'→3')	서열번호
BCL2 siRNA	sense	CAGAAGUCUGGGAAUCGAU(dTdT)	14
BCL2 siRNA	anti-sense	AUCGAUUCCCAGACUUCUG(dTdT)	15
BI-1 siRNA	sense	GGAUCGCAAUUAAGGAGCA(dTdT)	16
BI-1 siRNA	anti-sense	UGCUCCUUAAUUGCGAUCC(dTdT)	17

그 결과, 시스플라틴을 처리하지 않고, 대조군 siRNA를 처리한 대조군에 비해 본 발명의 이중 표적 siRNA를 시스플라틴과 병용 처리한 군이 암세포 사멸이 현저히 증가하였으며, 그 정도가 BCL2 및 BI-1 각각에 대한 siRNA를 처리한 군들에 비해 현저히 증가한 것을 알 수 있었다 (도 3).

실험예 3. 항암제와 이중 표적 siRNA의 병용 처리에 의한 시너지 효과 확인

3-1. BCL2 siRNA 및 BI-1 siRNA 혼합 처리

인간 자궁경부암 세포주인 Hela 세포에 BCL2 또는 BI-1 각각에 대한 siRNA를 함께 트랜스펙션한 뒤, 항암제를 종류별로 6시간 동안 처리한 뒤 암세포주의 사멸 정도를 MTT 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, 6웰 플레이트에 분주한 Hela 세포에 웰당 200 pmole의 siRNA를 리포펙타민 7.5㎕로 트랜스펙션한 뒤 48시간 동안 인큐베이션하고, 세포주를 다시 96웰-플레이트에 재분주하고 50% 컨플루언시 (2.5×10⁴)가 되도록 배양한 뒤 택솔 0.5μM, 시스플라틴 20μM 및 에토포사이드 10μM를 각각 처리하고 6시간 뒤에 실험예 2에서와 같이 MTT 분석을 수행하여 암세포의 사멸 정도를 확인하였다.

그 결과, BCL2 또는 BI-1 각각에 대한 siRNA를 함께 트랜스펙션한 경우, siRNA들만을 처리한 대조군의 경우 암세포의 사멸이 거의 일어나지 않았으나, 항암제와 병용 처리시 암세포 사멸 효과가 다소 발생하였다 (도 4).

3-2. BCL2 및 BI-1에 대한 이중 표적 siRNA 처리

상기 실험예 3-1에서와 같이, 인간 자궁경부암 세포주인 Hela 세포에 본 발명의 BCL2 및 BI-1에 대한 이중 표적 siRNA를 트랜스펙션한 뒤, 항암제를 종류별로 6시간 동안 처리한 뒤 암세포주의 사멸 정도를 MTT 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, 6웰 플레이트에 분주한 Hela 세포에 웰당 200 pmole의 siRNA를 리포펙타민 7.5㎕로 트랜스펙션한 뒤 48시간 동안 인큐베이션하고, 세포주를 다시 96웰-플레이트에 재분주하고 50% 컨플루언시 (2.5×10⁴)가 되도록 배양한 뒤 상기 실험예 3-1에서 사용한 항암제 농도의 절반인 택솔 0.25μM, 시스플라틴 10μM 및 에토포사이드 5μM로 각각 처리하고 6시간 뒤에 실험예 2에서와 같이 MTT 분석을 수행하여 암세포의 사멸 정도를 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 BCL2 및 BI-1에 대한 이중 표적 siRNA만을 처리한 대조군의 경우 암세포의 사멸이 현저히 발생하였으며, BCL2 siRNA 및 BI-1 siRNA를 함께 처리한 실험에 3-1보다 현저히 적은 농도의 항암제와의 병용 처리에도 암세포 사멸 효과가 시너지적으로 증가하는 것을 알 수 있었다 (도 5). 이를 통해, 본 발명의 이중 표적 siRNA 자체가 항암 활성을 나타내고, 항암제와의 병용 처리에 의한 시너지 효과도 이중 표적 siRNA에 특이적임을 유추할 수 있었다.

실험예 4. 이중 표적 siRNA의 Bcl2 억제제와의 효과 비교

본 발명의 BCL2 및 BI-1에 대한 이중 표적 siRNA의 암세포 사멸 억제 효과를 BCL2의 억제를 통한 암세포 치료제로 이용되고 있는 ABT-737 약물과 비교하였다. 구체적으로, 상기 실험예들에서와 같이 전립선 암 세포인 LnCap 세포주를 분주한 뒤, 본 발명의 BCL2 및 BI-1에 대한 이중 표적 siRNA를 트랜스펙션하고 ABT-737 3μM을 처리한 뒤 12시간 동안 인큐베이션한 후, MTT 분석으로 암세포주의 사멸 정도를 확인하였다.

그 결과, ABT-737 또는 본 발명의 BCL2 및 BI-1에 대한 이중 표적 siRNA 처리에 의해 LnCap 세포주의 사멸이 증가하였으며, 특히, ABT-737와 본 발명의 이중 표적 siRNA를 병용 처리한 경우 시너지적으로 암세포의 사멸이 현저하게 증가한 것을 알 수 있었다 (도 6).

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Nucleic acids for simultaneous inhibition of BCL2 gene and BI-1 gene <130> PN1611-429 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense RNA (BCL2 antisense) <400> 1 aagaagagga gaaaaaaaug a 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense RNA (BI-1 antisense) <400> 2 ucauuucuuc ucuuucuucu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense DNA (BCL2 antisense) <400> 3 aagaagagga gaaaaaaatg a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense DNA (BI-1 antisense) <400> 4 tcatttcttc tctttcttct t 21 <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTCAAGAGAG loop shRNA <400> 5 aagaagagga gaaaaaaatg attcaagaga gtcatttctt ctctttcttc tttt 54 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTGGATCCAA loop shRNA <400> 6 aagaagagga gaaaaaaatg attggatcca atcatttctt ctctttcttc tttt 54 <210> 7 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U7 promotor <400> 7 cctagagtcg acactagata acaacatagg agctgtgatt ggctgttttc agccaatcag 60 cactgactca tttgcatagc ctttacaagc ggtcacaaac tcaagaaacg agcggtttta 120 atagtctttt agaatattgt ttatcgaacc gaataaggaa ctgtgctttg tgattcacat 180 atcagtggag gggtgtggaa atggcacctt gatctcaccc tcatcgaaag tggagttgat 240 gtccttccct ggctcgctac agacgcactt ccgcaa 276 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL2 foward primer <400> 8 tttgagttcg gtggggtcat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL2 reverse primer <400> 9 tgacttcact tgtggcccag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BI-1 forward primer <400> 10 gccgggtaaa agatcgggag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BI-1 reverse primer <400> 11 aagatcattg ccgtgcccat 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 12 ctaggcgctc actgttctct c 21 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 13 gtccgagcgc tgacctt 17 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL2 siRNA sense <400> 14 cagaagucug ggaaucgaud tdt 23 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL2 siRNA antisense <400> 15 aucgauuccc agacuucugd tdt 23 <210> 16 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BI-1 siRNA sense <400> 16 ggaucgcaau uaaggagcad tdt 23 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BI-1 siRNA antisense <400> 17 ugcuccuuaa uugcgauccd tdt 23

Claims

BCL2 유전자 및 BI-1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 분자.
제 1항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 핵산 분자.
제 2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 핵산 분자는 RNA 간섭에 의해 BCL2(B-cell lymphoma 2) 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 2항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 핵산 분자는 RNA 간섭에 의해 BI-1(BAX inhibitor 1) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 siRNA(small interfeing RNA) 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 siRNA가 부분적으로 상보적 결합을 이루고 있는 이중 가닥(double strand) siRNA인 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 shRNA(short hairpin RNA)인 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 6항에 있어서, shRNA는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열이 부분적으로 상보적 결합하여 헤어핀 구조를 이루는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 1항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 9항의 재조합 발현 벡터를 도입한 바이러스.
제 1항의 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는, 항암용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서, 항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 항암용 약학적 조성물.
제 12항에 있어서, 항암제는 ABT-737, 택솔(Taxol), 시스플라틴(Cisplatin) 또는 에토포사이드(Etoposide)인 것을 특징으로 하는, 항암용 약학적 조성물.