KR20180128395A - 세제에서의 개선된 효소 안정성을 갖는 프로테아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 2에 주어진 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지며, 각 경우에 서열식별번호: 2에 따른 넘버링과 관련하여 위치 P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 또는 Q271 중 적어도 하나에서의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 프로테아제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그의 생산 및 용도에 관한 것이다. 이러한 프로테아제는 우수한 세정 성능을 갖는 것과 동시에, 매우 우수한 안정성, 특히 저장 안정성을 나타낸다.

Description

세제에서의 개선된 효소 안정성을 갖는 프로테아제

본 발명은 효소 기술 분야에 속한다. 본 발명은, 특히 세척제 및 세정제에서의 사용과 관련하여, 그에 개선된 저장 안정성을 부여하기 위해 아미노산 서열이 변경된 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus)로부터의 프로테아제, 상기 프로테아제를 코딩하는 핵산, 및 상기 프로테아제의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 프로테아제의 용도, 상기 프로테아제가 사용되는 방법, 및 상기 프로테아제를 함유하는 작용제, 특히 세척제 및 세정제에 관한 것이다.

프로테아제는 산업적으로 가장 중요한 효소 중 하나이다. 세척제 및 세정제와 관련하여, 프로테아제는 실질적으로 모든 최신의 고성능 세척제 및 세정제에 함유되는, 가장 오래전에 확립된 효소이다. 이들은 세정하려는 물품 상의 단백질-함유 얼룩의 분해를 야기한다. 이들 프로테아제 중에, 서브틸리신-유형 프로테아제 (서브틸라제, 서브틸로펩티다제, EC 3.4.21.62)가 특히 중요하며, 이러한 프로테아제는 촉매적 활성 아미노산으로 인해 세린 프로테아제이다. 상기 프로테아제는 비-특이적 엔도펩티다제로서 작용하며, 펩티드 또는 단백질 내에 있는 임의의 산 아미드 결합을 가수분해한다. 그의 최적 pH는 통상적으로 고 알칼리성 범위에 있다. 상기 패밀리의 개관은, 예를 들어, 논문 ["Subtilases: Subtilisin-like Proteases" by R. Siezen, pages 75-95 in "Subtilisin enzymes"] (R. Bott 및 C. Betzel, 뉴욕, 1996년 발행)에서 확인된다. 서브틸라제는 미생물에 의해 자연 형성된다. 이들 중에, 바실루스 종에 의해 형성되며 그로부터 분비되는 서브틸리신이 특히 서브틸라제 내의 가장 중요한 군으로서 언급되어야 한다.

세척제 및 세정제에 바람직하게 사용되는 서브틸리신-유형 프로테아제의 예는 서브틸리신 BPN' 및 칼스버그, 프로테아제 PB92, 서브틸리신 147 및 309, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 특히 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 프로테아제, 서브틸리신 DY, 효소 써미타제, 프로테이나제 K 및 프로테아제 TW3 및 TW7 (이는 서브틸라제에 속하지만, 보다 좁은 의미에서는 더 이상 서브틸리신에 속하지 않음), 및 출발 프로테아제와 비교하여 변경된 아미노산 서열을 갖는 언급된 프로테아제의 변이체이다. 프로테아제는 선행 기술로부터 알려진 방법에 의해 선택적으로 또는 무작위로 변경되며, 이에 의해 예를 들어 세척제 및 세정제에서의 사용에 대해 최적화된다. 이들 방법은 점, 결실 또는 삽입 돌연변이유발, 또는 다른 단백질 또는 단백질 일부와의 융합을 포함한다. 따라서, 적절하게 최적화된 변이체가 선행 기술로부터 알려진 대부분의 프로테아제에 대해 알려져 있다.

유럽 특허 출원 EP 2 016 175 A1에는 예를 들어 세척제 및 세정제를 위해 제공된 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제가 개시되어 있다. 일반적으로, 단지 선택된 프로테아제만이 어떤 식으로든 액체 계면활성제-함유 제제에 사용하기에 적합하다. 이러한 종류의 제제에서, 많은 프로테아제가 충분한 촉매적 성능 또는 안정성을 나타내지 않는다. 특히 통상적으로 세척제가 마지막으로 소모될 때까지 수주 또는 수개월이 걸릴 수 있는 양으로 소비자에 의해 구입되는 세척제에 사용되는 경우에 (즉, 세척제가 소비자에 의해 수주 또는 수개월 동안 저장되어야 함), 많은 프로테아제는 불안정성을 나타내어, 결국에는 세척 과정 동안 불충분한 촉매적 활성으로 이어진다. 포스포네이트-함유 액체 계면활성제 제제에서, 이러한 문제는, 예를 들어 포스포네이트의 착물-형성 특성 때문에 또는 포스포네이트와 프로테아제 사이의 불리한 상호작용 때문에 훨씬 더 심각하다.

그 결과, 선행 기술로부터의 프로테아제- 및 계면활성제-함유 액체 제제는, 저장 후에, 상기 제제가 종종 만족스러운 단백질분해 활성을 갖지 않으며, 따라서 프로테아제-민감성 얼룩에 대해 최적의 세정 성능을 나타내지 않는다는 단점을 갖는다.

본 발명에 이르러 놀랍게도, 각 경우에 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에 기반하여 위치 P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 또는 Q271 중 적어도 하나에서의 아미노산 치환을 갖는 바실루스 푸밀루스로부터의 서브틸리신-유형 프로테아제 또는 합리적으로 유사한 프로테아제 (서열 동일성의 관점에서)가 야생형 형태에 비해 (저장) 안정성과 관련하여 개선되며, 따라서 세척제 또는 세정제에 사용하기에 특히 적합한 것으로 밝혀진 바 있다.

따라서 제1 측면에서, 본 발명은 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일하며, 각 경우에 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에 기반하여 위치 P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 또는 Q271 중 적어도 하나에서의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 프로테아제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열이 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 출발 프로테아제에서, 서열식별번호: 2의 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 또는 271에 상응하는 적어도 하나의 위치에서 아미노산을 치환하여, 프로테아제가 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E 중 적어도 하나를 갖도록 하는 것을 포함하는, 프로테아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 특허 출원의 의미 내에서 "프로테아제"는 프로테아제 그 자체 및 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조된 프로테아제 둘 다를 포함한다. 따라서, 프로테아제와 관련하여 이루어진 모든 설명은 프로테아제 그 자체 및 상응하는 방법을 사용하여 제조된 프로테아제 둘 다에 대한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 이들 프로테아제를 코딩하는 핵산, 본 발명에 따른 프로테아제 또는 핵산을 함유하는 비-인간 숙주 세포, 본 발명에 따른 프로테아제를 포함하는 작용제, 특히 세척제 및 세정제, 세척 및 세정 방법, 및 지방-함유 얼룩을 제거하기 위한 세척제 또는 세정제에서의 본 발명에 따른 프로테아제의 용도에 관한 것이다.

본원에 사용된 "적어도 하나"는 하나 이상, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 그 초과를 의미한다.

본 발명은 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖는 프로테아제에서, 서열식별번호: 2에 따른 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 또는 271 중 적어도 하나에서의 아미노산 치환으로, 상응하는 위치에 아미노산 9T/S/H, 62E, 101E, 130D, 166S, 187H, 216C, 238K 또는 271E가 존재하도록 하는 것이 세척제 및 세정제에서의 이러한 변경된 프로테아제의 개선된 (저장) 안정성을 야기한다는 본 발명자의 놀라운 발견에 기반한다. 상기 언급된 아미노산 치환이 이전에는 프로테아제의 증가된 안정성과 연관된 바 없으므로, 이는 특히 놀랍다.

본 발명에 따른 프로테아제는, 특히 3일 이상, 4일 이상, 7일 이상, 10일 이상, 12일 이상 또는 14일 이상 저장될 때 세척제 또는 세정제에서 증가된 안정성을 갖는다. 성능의 관점에서 개선된 이러한 종류의 프로테아제는 광범위한 온도 범위에서 단백질분해 민감성 얼룩에 대해 개선된 세척 결과를 제공한다.

본 발명에 따른 프로테아제는 효소적 활성을 가지며, 즉 이들은 특히 세척제 또는 세정제에서 펩티드 및 단백질을 가수분해할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 프로테아제는 단백질/펩티드 기질 내의 아미드/펩티드 결합의 가수분해를 촉매하며, 따라서 펩티드 또는 단백질을 절단할 수 있는 효소이다. 게다가, 본 발명에 따른 프로테아제는 바람직하게는 성숙 프로테아제, 즉 신호 펩티드(들) 및/또는 프로펩티드(들) 없이 촉매적으로 활성인 분자이다. 달리 나타내지 않는 한, 명시된 서열은 또한 각각 성숙 (프로세싱된) 효소에 대한 것이다.

다양한 실시양태에서, 본 발명에 따른 프로테아제는 각 경우에 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에 기반하여 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 및 Q271E로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 프로테아제는 하기 아미노산 치환 변이체: (i) P9T; (ii) Q271E; (iii) P9S 및 N238K; (iv) P9H; (v) N187H; (vi) S216C; (vii) Q62E 및 N130D; (viii) Q62E, D101E, N130D, G166S 및 Q271E; 또는 (ix) P9T, N187H, S216C 및 Q271E 중 하나를 함유하며, 넘버링은 각 경우에 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에 기반한다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 프로테아제는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% 및 98.8% 동일하며, 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에서 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 또는 271 중 적어도 하나에서의 아미노산 치환 9T/S/H, 62E, 101E, 130D, 166S, 187H, 216C, 238K 또는 271E 중 하나 이상을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명과 관련하여, 프로테아제가 언급된 치환을 갖는다는 특색은 프로테아제가 상응하는 위치에서의 상응하는 아미노산 중 적어도 하나를 함유한다는 것을 의미하며, 즉 9개의 위치 모두가, 예를 들어 프로테아제의 단편화에 의해 달리 돌연변이되거나 또는 결실되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 바람직한 이러한 종류의 프로테아제의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3-11에 제시되어 있다.

핵산 또는 아미노산 서열의 동일성은 서열 비교에 의해 결정된다. 이러한 서열 비교는 선행 기술에 확립되어 있으며 통상적으로 사용되는 BLAST 알고리즘 (예를 들어 문헌 [Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410] 및 [Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pages 3389-3402] 참조)에 기반한 것으로, 원칙적으로 핵산 또는 아미노산 서열에서의 유사한 일련의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 서로에 대해 지정됨으로써 수행된다. 표에 제시된 관련 위치의 지정은 "정렬"이라 지칭된다. 선행 기술로부터 이용가능한 또 다른 알고리즘은 FASTA 알고리즘이다. 서열 비교 (정렬), 특히 다중 서열 비교는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 이루어진다. 예를 들어, Clustal 시리즈 (예를 들어 문헌 [Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500] 참조), T-Coffee (예를 들어 문헌 [Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217] 참조) 또는 이들 프로그램 또는 알고리즘에 기반한 프로그램이 종종 사용된다. 명시된 표준 파라미터와 함께 컴퓨터 프로그램 Vector NTI® Suite 10.3 (미국 캘리포니아주 칼스배드 1600 패러데이 애비뉴 소재 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation))을 사용하는 서열 비교 (정렬)가 또한 가능하며, 서열 비교를 위한 이 프로그램의 AlignX-Modul은 ClustalW에 기반한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 명시된 서열 동일성은 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정된 것이다.

이러한 종류의 비교는 비교되는 서열 사이의 유사성을 명시할 수 있게 한다. 이러한 유사성은 통상적으로 퍼센트 동일성, 즉 정렬 시 동일한 위치 또는 서로에 상응하는 위치에서의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율로 표현된다. 아미노산 서열에서, 보다 넓은 개념의 "상동성"은 보존된 아미노산 교환, 즉 유사한 화학적 활성을 갖는 아미노산을 고려하는데, 그 이유는 이들이 통상적으로 단백질 내에서 유사한 화학적 활성을 갖기 때문이다. 따라서, 비교되는 서열 사이의 유사성이 또한 퍼센트 상동성 또는 퍼센트 유사성으로 표현될 수 있다. 동일성 및/또는 상동성에 관한 정보는 폴리펩티드 또는 유전자의 전체에 또는 단지 개개의 절편에 적용될 수 있다. 따라서, 상이한 핵산 또는 아미노산 서열의 상동 절편 또는 동일한 절편은 서열의 매칭에 의해 정의된다. 이러한 종류의 절편은 종종 동일한 기능을 갖는다. 상기 절편은 작을 수 있으며 단지 소수의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 작은 절편은 종종 단백질의 전체 활성에 있어 필수적인 기능을 수행한다. 따라서, 단지 개개의, 임의로 작은 절편에 대한 서열 매칭이 편리할 수 있다. 그러나, 달리 나타내지 않는 한, 본 출원에서 동일성 또는 상동성에 관한 정보는 각 경우에 명시된 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 길이에 대한 것이다.

본 발명과 관련하여, 아미노산 위치가 서열식별번호: 2에서의 숫자로 확인된 위치에 상응한다고 언급되는 경우에, 이는 상응하는 위치가 상기 정의된 바와 같은 정렬 시 서열식별번호: 2에서의 숫자로 확인된 위치로 지정된다는 것을 의미한다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 프로테아제는 그의 세정 성능이 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 프로테아제와 비교하여 유의하게 감소되지 않는 것을 특징으로 하며, 즉 상기 프로테아제는 참조 세척 성능의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 100%, 보다 바람직하게는 적어도 110%를 갖는다. 세정 성능은 세척액의 리터당 4.5 내지 7.0 그램의 투입량으로 세척제를 함유하는 세척 시스템에서 결정될 수 있고, 프로테아제와 비교될 프로테아제는 동일한 농도 (활성 단백질 기준)로 사용되며, 면의 얼룩에 대한 세정 성능은 세척된 직물이 세정된 정도를 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 세척 과정은 40℃의 온도에서 70분 동안 수행될 수 있고, 물은 15.5 내지 16.5° (독일 경도 등급)의 물 경도를 가질 수 있다. 이러한 세척 시스템을 위해 의도된 세척제 중의 프로테아제의 농도는 정제된 활성 단백질을 기준으로 하여 0.001 내지 0.1 wt%, 바람직하게는 0.01 내지 0.06 wt%이다.

이러한 종류의 세척 시스템을 위한 액체 참조 세척제는 하기와 같이 구성될 수 있다 (모든 양은 중량 퍼센트로 주어짐): 4.4%의 알킬 벤젠 술폰산, 5.6%의 추가의 음이온성 계면활성제, 2.4%의 지방산의 C12-C18 Na 염 (비누), 4.4%의 비-이온성 계면활성제, 0.2%의 포스포네이트, 1.4%의 시트르산, 0.95%의 NaOH, 0.01%의 거품제거제, 2%의 글리세롤, 0.08%의 보존제, 1%의 에탄올, 및 나머지 백분율의 탈염수. 액체 세척제의 투입량은 바람직하게는 세척액의 리터당 4.5 내지 6.0 그램, 예를 들어 세척액의 리터당 4.7, 4.9 또는 5.9 그램이다. 세척은 바람직하게는 pH 8 내지 pH 10.5, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 9의 pH 범위 내에서 수행된다.

본 발명의 범주 내에서, 세정 성능은, 예를 들어, 상기 명시된 바와 같은 액체 세척제를 사용하여 40℃에서 결정되며, 세척 과정은 바람직하게는 600 rpm에서 60분 동안 수행된다.

세정 성능의 척도로서 백색도, 즉 얼룩의 미백화가 광학 측정 방법을 사용하여, 바람직하게는 광도계로 결정된다. 이러한 목적에 적합한 장치는 예를 들어 분광계 미놀타 CM508d이다. 측정을 위해 사용되는 장치는 통상적으로 백색 표준물, 바람직하게는 그와 함께 제공되는 백색 표준물에 대해 미리 보정된다.

동일한 방식으로 적용되는 각각의 프로테아제는 활성의 관점에서, 전체 단백질에 대한 활성 물질의 비 (비활성의 값)에 있어서 어느 정도의 차이가 있더라도, 관련 효소적 특성, 즉 예를 들어 특정한 얼룩에 대한 세정 성능이 비교되도록 보장한다. 일반적으로, 낮은 비활성은 보다 다량의 단백질을 첨가함으로써 보상될 수 있다.

그 외에는, 효소 기술 분야의 통상의 기술자라면 프로테아제 활성을 결정하는 방법에 익숙하고, 통상의 기술자는 일상적으로 상기 방법을 사용한다. 예를 들어, 이러한 종류의 방법은 문헌 [Tenside, Band 7 (1970), pages 125-132]에 개시되어 있다. 대안적으로, 프로테아제 활성은 기질 suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드 (AAPF)로부터의 발색단 파라-니트로아닐린 (pNA)의 유리에 의해 결정될 수 있다. 프로테아제는 기질을 절단하여 pNA를 유리시킨다. pNA의 유리는 410 nm에서의 흡광의 증가를 야기하며, 그의 시간 경과가 효소적 활성의 척도이다 (문헌 [Del Mar et al., 1979] 참조). 측정은 25℃의 온도, 8.6의 pH 및 410 nm의 파장에서 행해진다. 측정 시간은 5분이고, 측정 간격은 20초 내지 60초이다. 프로테아제 활성은 통상적으로 프로테아제 유닛 (PU)으로 표현된다. 적합한 프로테아제 활성은, 예를 들어, 세척액의 ml당 2.25, 5 또는 10 PU이다. 그러나, 프로테아제 활성은 0이 아니다.

본 발명에 따른 프로테아제의 단백질분해 활성을 확립하기 위한 대안적 시험은 광학 측정 방법, 바람직하게는 광도측정 방법이다. 이러한 목적에 적합한 시험은 기질 단백질 카세인의 프로테아제-의존성 절단을 포함한다. 상기 단백질은 프로테아제에 의해 복수의 보다 작은 부산물로 절단된다. 모든 이들 부산물은 절단되지 않은 카세인과 비교하여 290 nm에서의 증가된 흡수를 가지며, 이러한 증가된 흡수는 광도계를 사용하여 결정되고, 그에 따라 프로테아제의 효소적 활성에 대한 결론을 도출할 수 있다.

단백질 농도는 알려진 방법, 예를 들어 BCA 방법 (비신코닌산; 2,2'-비퀴놀릴-4,4'-디카르복실산) 또는 뷰렛 방법 (A. G. Gornall, C. S. Bardawill and M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pages 751-766)을 사용하여 결정될 수 있다. 이와 관련하여, 활성 단백질 농도는 적합한 비가역적 억제제를 사용하여 활성 중심을 적정하고, 잔여 활성을 결정함으로써 결정될 수 있다 (문헌 [M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), pages 5890-5913] 참조).

상기 언급된 아미노산 변경 이외에도, 본 발명에 따른 프로테아제는 추가의 아미노산 변경, 특히 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다. 이러한 종류의 프로테아제는, 예를 들어, 표적화된 유전자 변경에 의해, 즉 돌연변이유발 방법에 의해 발생되고, 특정한 용도에 대해 또는 특정한 특성과 관련하여 (예를 들어 그의 촉매적 활성, 안정성 등과 관련하여) 최적화된다. 게다가, 본 발명에 따른 핵산은 재조합 접근법으로 혼입될 수 있으며, 따라서 완전히 새로운 유형의 프로테아제 또는 다른 폴리펩티드를 생산하는데 사용된다.

목적은 예를 들어 본 발명에 따른 효소의 세정 성능을 개선시키기 위해, 기지의 분자에 표적화된 돌연변이, 예컨대 치환, 삽입 또는 결실을 도입하는 것이다. 이러한 목적을 위해, 특히 분자의 표면 전하 및/또는 등전점, 및 따라서 그의 기질과의 상호작용이 변경될 수 있다. 예를 들어, 효소의 알짜 전하는, 특히 세척제 및 세정제에 사용하기 위해 기질 결합에 영향을 미치도록 변화될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 프로테아제의 안정성은 하나 이상의 적절한 돌연변이에 의해 추가로 더욱 증가될 수 있고, 따라서 그의 세정 성능이 개선될 수 있다. 개별 돌연변이, 예를 들어 개별 치환의 유리한 특성은 서로를 보완할 수 있다. 따라서, 특정한 특성의 관점에서, 예를 들어 저장 동안의 그의 안정성의 관점에서 이미 최적화된 프로테아제가 또한 본 발명의 범주 내에서 발생될 수 있다.

정확히 하나의 아미노산 위치에 영향을 미치는 치환 (아미노산 교환)을 기재하기 위해, 하기 관례가 본원에서 사용된다: 자연 존재하는 아미노산의 국제적으로 통상적인 단일-문자 코드가 가장 먼저 주어지고, 그 다음에 연관된 서열 위치, 마지막으로 부가된 아미노산이 주어진다. 위치가 수많은 대안적 아미노산에 의해 대체될 수 있다면, 대안은 슬래시에 의해 서로로부터 분리된다. 예를 들어, P9T/S/H는 프롤린이 위치 9에서 트레오닌, 세린 또는 히스티딘에 의해 대체될 수 있다는 것을 의미한다. 삽입의 경우에는, 부가 아미노산이 서열 위치 다음에 나타내어진다. 결실의 경우에는, 제거된 아미노산이 기호, 예를 들어 별표 또는 대시로 대체되거나, 또는 Δ가 상응하는 위치 앞에 표시된다. 예를 들어, P9T는 위치 9에서의 프롤린의 트레오닌에 의한 치환을 기재하고, P9KT는 위치 9에서의 아미노산 리신 다음에 트레오닌의 삽입을 기재하고, P9* 또는 ΔP9는 위치 9에서의 프롤린의 결실을 기재한다. 이러한 명명법은 효소 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.

따라서, 본 발명은 추가로 출발 분자로서 작용하는 상기 기재된 바와 같은 프로테아제로부터 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 수득될 수 있으며, 프로테아제가 상기 기재된 바와 같이, 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에서 서열식별번호: 2의 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서의 본 발명에 따른 아미노산 치환 중 적어도 하나를 여전히 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제에 관한 것이다. 용어 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기의 또 다른 아미노산 잔기와의 교환 (치환)으로서, 이러한 교환이 교환된 아미노산의 위치에서의 극성 또는 전하의 변화를 야기하지 않는 것, 예를 들어 비극성 아미노산 잔기의 또 다른 비극성 아미노산 잔기와의 교환을 의미한다. 본 발명의 범주 내에서, 보존적 아미노산 치환은 예를 들어 하기를 포함한다: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.

대안적으로 또는 추가로, 프로테아제는 출발 분자로서 작용하는 본 발명에 따른 프로테아제로부터 단편화, 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있고, 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 또는 274개의 상호연결된 아미노산의 길이에 걸쳐 출발 분자의 것과 매칭되는 아미노산 서열을 가지며, 출발 분자에 함유된 아미노산 치환이 서열식별번호: 2의 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치 중 하나 이상에 여전히 존재하는 것을 특징으로 한다.

따라서, 예를 들어, 단백질분해 활성의 상실 또는 감소를 야기하지 않으면서, 효소 말단 또는 루프로부터 개별 아미노산이 결실될 수 있다. 게다가, 이러한 종류의 단편화, 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해, 예를 들어 관련 효소의 알레르기원성이 또한 감소될 수 있고, 따라서 그의 유용성이 전반적으로 개선될 수 있다. 효소는 유리하게는 돌연변이유발 후에도 그의 단백질분해 활성을 여전히 가지며, 즉 그의 단백질분해 활성이 적어도 출발 효소의 활성에 상응하며, 즉 바람직한 실시양태에서 단백질분해 활성이 출발 효소의 활성의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%이다. 다른 치환이 또한 유리한 효과를 가질 수 있다. 단일 아미노산 또는 다수의 상호연결된 아미노산의 다른 아미노산과의 교환이 가능하다.

대안적으로 또는 추가적으로, 상기 프로테아제는 출발 분자로서 본 발명에 따른 프로테아제로부터 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 수득될 수 있으며, 프로테아제가 서열식별번호: 2에 따른 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 한다.

다른 실시양태에서, 상기 프로테아제는 출발 분자로서 본 발명에 따른 프로테아제로부터 단편화, 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있고, 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 또는 274개의 상호연결된 아미노산의 길이에 걸쳐 출발 분자의 것과 매칭되는 아미노산 서열을 가지며, 프로테아제가 서열식별번호: 2에 따른 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 한다.

이러한 경우에, 다른 아미노산 위치는 본 발명에 따른 프로테아제의 아미노산 서열과 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은, 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 아미노산 서열의 정렬에 의해 정의된다. 게다가, 위치의 지정은 성숙 단백질에 의해 결정된다. 특히, 이러한 지정은 또한 본 발명에 따른 프로테아제의 아미노산 서열이 서열식별번호: 2에 따른 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제보다 더 많은 수의 아미노산 잔기를 갖는 경우에도 사용된다. 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 아미노산 서열의 언급된 위치에서 비롯된, 본 발명에 따른 프로테아제에서의 변경 위치는 정렬 시 정확히 이들 위치에 대해 지정된 위치이다.

따라서, 본 발명에 따른 프로테아제의 상동 위치로 전환될 때 바람직하게 중요하며 프로테아제에 유리한 기능적 특성을 부여하는, 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 서열 변경, 특히 치환을 위한 유리한 위치는 정렬 시 서열식별번호: 2의, 즉 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에서 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치이다. 언급된 위치에서, 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 야생형 분자에는 하기 아미노산 잔기가 존재한다: P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 및 Q271.

변경될 아미노산, 즉 특히 그의 기능적 상응물의 정확한 지정에 대한 추가의 확증은, 정렬에 기반하여 서로에 대해 지정된 2개의 위치가 서로 비교되는 2종의 프로테아제에서 동일한 방식으로 변경되고, 2종의 프로테아제에서 효소적 활성이 동일한 방식으로 변경되는지를 관찰하는 비교 시험에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 2에 따른 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 특정한 위치에서의 아미노산 교환이 효소적 파라미터의 변화, 예를 들어 K_M 값의 증가와 연관있고, 효소적 파라미터의 상응하는 변화, 따라서 예를 들어 또한 K_M 값의 증가가, 아미노산 교환이 동일한 부가 아미노산에 의해 달성된 본 발명에 따른 프로테아제 변이체에서도 관찰된다면, 이는 정확한 지정에 대한 확증으로 간주된다.

명시된 모든 요소는 또한 프로테아제를 제조하는 본 발명에 따른 방법에도 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 하기 방법 단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다:

a) 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 도입하며, 프로테아제는 서열식별번호: 2에 따른 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E 중 적어도 하나를 갖는 것인 단계;

b) 단편화, 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 아미노산 서열을 변경하여, 프로테아제가 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 또는 274개의 상호연결된 아미노산의 길이에 걸쳐 출발 분자의 것과 매칭되는 아미노산 서열을 갖도록 하며, 프로테아제는 서열식별번호: 2에 따른 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E 중 적어도 하나를 갖는 것인 단계.

모든 설명은 또한 본 발명에 따른 방법에도 적용된다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 프로테아제 또는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조된 프로테아제는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 여전히 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% 또는 98.8% 동일하다. 대안적으로, 프로테아제 또는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조된 프로테아제는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 3-11에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 여전히 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5% 또는 98% 동일하다. 프로테아제 또는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조된 프로테아제는 각 경우에 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에 기반하여 위치 P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 및 Q271 중 적어도 하나에서의 아미노산 치환을 갖는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 아미노산 치환은 각 경우에 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에 기반하여 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 및 Q271E로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 프로테아제는 하기 아미노산 치환 변이체 중 하나를 갖는다: (i) P9T; (ii) Q271E; (iii) P9S 및 N238K; (iv) P9H; (v) N187H; (vi) S216C; (vii) Q62E 및 N130D; (viii) Q62E, D101E, N130D, G166S 및 Q271E; 또는 (ix) P9T, N187H, S216C 및 Q271E.

본 발명은 또한, 특히 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환에 의해 또는 중합체와의 커플링에 의해 추가적으로 안정화된, 상기 기재된 바와 같은 프로테아제에 관한 것이다. 저장 동안 및/또는 사용 동안, 예를 들어 세척 과정 동안의 안정성의 증가는 보다 오랫동안 효소적 활성이 유지되도록 하며, 따라서 세정 성능의 개선으로 이어진다. 원칙적으로, 편리하고/거나 선행 기술에 기재되어 있는 모든 안정화 가능성이 이를 위해 고려될 수 있다. 효소 자체의 돌연변이에 의해 달성되는 안정화가 바람직한데, 그 이유는 이러한 종류의 안정화는 효소가 수득된 후에 임의의 추가의 작업 단계를 요구하지 않기 때문이다. 이러한 목적에 적합한 서열 변경의 예는 상기 언급되었다. 추가의 적합한 서열 변경은 선행 기술로부터 알려져 있다.

안정화를 위한 추가의 가능성은 예를 들어 하기를 포함한다:

- 예를 들어 칼슘 결합에 수반되는 하나 이상의 아미노산(들)의 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산과의 교환 및/또는 2개의 아미노산 아르기닌 및 글리신의 서열 중 적어도 하나에서의 서열 변경의 도입에 의한, 금속 이온의 결합, 특히 칼슘 결합 부위의 변경;

- 단백질의 표면 상에서 또는 표면에서 아미노산 서열이 변경되도록 하는 돌연변이에 의한, 변성제, 예컨대 계면활성제의 영향에 대한 보호;

- N-말단에 가까이 있는 아미노산의, 비-공유 상호작용에 의해 분자의 나머지와 접촉하게 되며, 따라서 구상 구조의 유지에 기여하는 것으로 가정되는 아미노산과의 교환.

바람직한 실시양태는 효소가 여러 상이한 방식으로 안정화되는 것이며, 그 이유는 여러 안정화 돌연변이가 누적 또는 상승작용적 효과를 갖기 때문이다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 기재된 바와 같은 프로테아제에 관한 것이다. 이러한 방식으로 변경된 프로테아제는 "유도체"라 지칭되며, 즉 프로테아제는 유도체화된다.

따라서, 본 출원의 의미 내에서, "유도체"는 그의 순수 아미노산 쇄가 화학적으로 변형되어 있는 단백질을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 종류의 유도체화는 생체내에서, 예를 들어, 단백질을 발현하는 숙주 세포에 의해 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 저분자량 화합물, 예컨대 지질 또는 올리고사카라이드와의 커플링이 특히 중요하다. 그러나, 유도체화는 또한 시험관내에서, 예를 들어 아미노산의 측쇄의 화학적 전환에 의해 또는 또 다른 화합물의 단백질과의 공유 결합에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 등전점을 변화시키기 위해 아민을 효소의 카르복실 기에 커플링시킬 수 있다. 이러한 다른 화합물은 또한 예를 들어 이관능성 화학적 화합물을 통해 본 발명에 따른 단백질에 결합되는 또 다른 단백질일 수 있다. 유도체화는 또한 거대분자 담체와의 공유 결합 또는 적합한 거대분자 케이지 구조에의 비-공유 내포를 의미하는 것으로 이해된다. 유도체화는, 예를 들어, 기질 특이성 또는 기질과의 결합 강도에 영향을 미치거나, 또는 커플링되는 물질이 억제제인 경우에는 효소적 활성의 일시적 억제를 야기할 수 있다. 이는 예를 들어 저장 기간의 관점에서 편리할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 또한 안정성 또는 효소적 활성에 영향을 미칠 수 있다. 이들은 또한 단백질의 알레르기원성 및/또는 면역원성을 감소시키며, 따라서 예를 들어 그의 피부 적합성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 거대분자 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과의 커플링은 안정성 및/또는 피부 적합성의 관점에서 단백질을 개선시킬 수 있다.

가장 넓은 의미에서, 본 발명에 따른 단백질의 유도체는 이들 단백질의 제제를 또한 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 단백질이 수득, 회수 또는 제조되는 방법에 따라, 상기 단백질은, 예를 들어 그를 생산하는 미생물의 배양물로부터의 광범위한 범위의 다른 물질과 조합될 수 있다. 단백질은 또한 예를 들어 그의 저장 안정성을 증가시키기 위해 다른 물질과 의도적으로 혼합되어 있을 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 단백질의 모든 제제를 포함한다. 이는 이러한 효소적 활성이 실제로 특정한 제제에서 발생하는지 또는 그렇지 않은지의 여부와 상관없이 해당된다. 그 이유는 단백질이 저장될 때는 임의의 활성을 갖지 않거나 또는 단지 낮은 활성을 가지고, 효소적 기능이 단백질이 사용 중일 때에만 발생하는 것이 바람직할 수 있기 때문이다. 이는, 예를 들어, 적절한 동반 물질에 의해 제어될 수 있다. 특히, 이와 관련하여, 프로테아제 및 특정한 억제제를 공동으로 제조하는 것이 가능하다.

모든 상기 기재된 프로테아제 또는 프로테아제 변이체 및/또는 유도체 중에, 그의 안정성 및/또는 활성이 서열식별번호: 3-11에 따른 프로테아제 중 적어도 하나에 상응하고/거나 그의 세정 성능이 서열식별번호: 3-11에 따른 프로테아제 중 적어도 하나에 상응하는 프로테아제, 프로테아제 변이체 및/또는 유도체가 본 발명의 범주 내에서 특히 바람직하며, 세정 성능은 상기 기재된 바와 같은 세척 시스템에서 결정된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 프로테아제를 코딩하는 핵산, 및 이러한 종류의 핵산을 함유하는 벡터, 특히 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 이러한 종류의 핵산은 코딩 서열로서 서열식별번호: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이러한 뉴클레오티드 서열은 목적하는 아미노산 치환을 제공하기 위해 상응하는 위치에서 돌연변이된다.

이들은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들은 단일 가닥으로서, 제1 단일 가닥에 상보적인 단일 가닥으로서, 또는 이중 가닥으로서 존재할 수 있다. 특히 DNA 분자의 경우에는, 2개의 상보적 가닥의 서열이 모든 3개의 가능한 리딩 프레임으로 고려되어야 한다. 또한, 상이한 코돈, 즉 염기 트리플렛이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있으므로, 특정한 아미노산 서열이 여러 상이한 핵산에 의해 코딩될 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 유전자 코드의 이러한 축중성 때문에, 상기 기재된 프로테아제 중 하나를 코딩할 수 있는 모든 핵산 서열이 본 발명의 상기 대상에 포함된다. 유전자 코드의 축중성에도 불구하고, 규정된 아미노산이 개개의 코돈에 대해 지정될 수 있으므로, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 절대적인 확신을 가지고 이들 핵산 서열을 확인할 수 있다. 따라서, 아미노산 서열로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 용이하게 확인할 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 핵산에서, 하나 이상의 코돈은 동의 코돈에 의해 대체될 수 있다. 이러한 측면은 특히 본 발명에 따른 효소의 이종 발현에 대한 것이다. 따라서, 각각의 유기체, 예를 들어 생산 균주의 숙주 세포는 특정한 코돈 용법을 갖는다. "코돈 용법"은 관련 유기체에 의한 유전자 코드의 아미노산으로의 번역을 의미하는 것으로 이해된다. 핵산 상의 코돈이 유기체에서 비교적 소수의 하전된 tRNA 분자에 의해 동반된다면, 단백질 생합성 중에 병목현상이 발생할 수 있다. 동일한 아미노산을 코딩하지만, 이는 코돈이 유기체에서 동일한 아미노산을 코딩하는 동의 코돈보다 덜 효율적으로 번역되도록 한다. 동의 코돈에 대한 tRNA 분자가 보다 다수 존재하기 때문에, 상기 코돈이 유기체에서 보다 효율적으로 번역될 수 있다.

현재 일반적으로 알려진 방법, 예컨대 화학적 합성 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 분자 생물학적 및/또는 단백질 화학적 표준 방법과 함께 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기지의 DNA 및/또는 아미노산 서열에 기반하여 상응하는 핵산 및 심지어 전체 유전자를 생산할 수 있다. 이러한 종류의 방법은, 예를 들어, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Laboratory Press]으로부터 알려져 있다.

본 발명의 의미 내에서, 벡터는 핵산으로 이루어지며, 특징적인 핵산 영역으로서 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 요소를 의미하는 것으로 이해된다. 벡터는 이러한 핵산이 종 또는 세포주에서 다세대에 걸쳐 또는 세포 분열에 걸쳐 안정한 유전 요소로서 확립되도록 한다. 벡터는, 특히 박테리아에서의 사용을 위한 특정한 플라스미드, 즉 환형 유전 요소이다. 본 발명의 범주 내에서, 본 발명에 따른 핵산은 벡터에서 클로닝된다. 이들은, 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 바이러스 또는 박테리오파지로부터 유래하는 벡터, 또는 우세하게 다양한 기원의 요소를 갖는 합성 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있다. 각 경우에 존재하는 추가의 유전 요소를 사용하여, 벡터는 수세대에 걸쳐 해당 숙주 세포에서 안정한 유닛으로서 확립될 수 있다. 이들은 염색체로부터 떨어져 있는 별개의 유닛으로서 존재할 수 있거나 또는 염색체 또는 염색체 DNA에 통합될 수 있다.

발현 벡터는 이들을 함유하는 숙주 세포, 바람직하게는 미생물, 특히 바람직하게는 박테리아에서 이들의 복제를 가능하게 하며 그 안에서 함유된 핵산의 발현을 가능하게 하는 핵산 서열을 갖는다. 발현은, 특히, 전사를 조절하는 프로모터(들)의 영향을 받는다. 원칙적으로, 발현은 발현될 핵산 앞에 원래 위치해 있는 천연 프로모터에 의해, 발현 벡터 상에 제공된 숙주 세포의 프로모터에 의해, 또는 또 다른 유기체 또는 또 다른 숙주 세포의 변형되거나 또는 완전히 상이한 프로모터에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 경우에, 본 발명에 따른 핵산의 발현을 위해 적어도 하나의 프로모터가 제공되며, 그의 발현을 위해 사용된다. 발현 벡터는 또한, 예를 들어 배양 조건을 변화시킴으로써, 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포에서 특정한 세포 밀도에 도달함으로써, 또는 특정한 물질, 특히 유전자 발현을 위한 활성인자를 첨가함으로써 조절될 수 있다. 이러한 종류의 물질의 예는 박테리아 락토스 오페론 (lac 오페론)을 위한 활성인자로서 사용되는 갈락토스 유도체 이소프로필-ß-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)이다. 발현 벡터와 달리, 클로닝 벡터에 함유된 핵산은 발현되지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터를 함유하거나 또는 본 발명에 따른 프로테아제를 함유하는 비-인간 숙주 세포, 특히 숙주 세포 주위의 배지로 프로테아제를 분비하는 비-인간 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 미생물로 형질전환되고, 따라서 이는 본 발명에 따른 숙주 세포를 구성한다. 대안적으로, 개별 구성요소, 즉 본 발명에 따른 핵산 일부 또는 핵산의 단편이 숙주 세포에 도입될 수 있어, 생성된 숙주 세포는 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터를 함유한다. 이러한 절차는 숙주 세포가 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터의 하나 이상의 구성요소를 이미 함유하고 있으며, 그에 따라 추가의 구성요소가 그 후에 첨가되는 경우에 특히 적합하다. 세포의 형질전환 방법은 선행 기술에 확립되어 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 충분히 알려져 있다. 원칙적으로, 모든 세포, 즉 원핵 또는 진핵 세포가 숙주 세포로서 적합하다. 바람직한 숙주 세포는, 예를 들어 핵산 또는 벡터 및 그의 안정한 확립물을 사용하는 형질전환을 수반하여, 유전학적으로 유리하게 처리될 수 있는 것들, 예를 들어 단세포 진균 또는 박테리아이다. 추가로, 바람직한 숙주 세포는 우수한 미생물학적 및 생명공학적 처리가능성에 의해 구별된다. 이는, 예를 들어, 배양의 용이성, 빠른 성장 속도, 발효 배지에 대한 낮은 요건, 및 외래 단백질의 우수한 생산율 및 분비율에 대한 것이다. 본 발명에 따른 바람직한 숙주 세포는 숙주 세포 주위의 배지로 (트랜스제닉) 발현된 단백질을 분비한다. 게다가, 프로테아제는, 제조 후에, 그를 생산한 세포에 의해, 예를 들어 당 분자의 부착에 의해, 포르밀화에 의해, 아미노화 등에 의해 변형될 수 있다. 이러한 종류의 번역후 변형은 프로테아제에 그의 기능의 관점에서 영향을 미칠 수 있다.

활성이 예를 들어 벡터 상에 제공되는 것 뿐만 아니라, 또한 처음부터 이들 세포에 존재할 수 있는 유전학적 조절 요소로 인해 조절될 수 있는 숙주 세포가 다른 바람직한 실시양태를 나타낸다. 이들 숙주 세포는, 예를 들어 활성인자로서 사용되는 화학적 화합물의 제어되는 첨가에 의해, 배양 조건을 변화시킴으로써, 또는 특정 세포 밀도에 도달 시 발현하도록 유도될 수 있다. 이는 본 발명에 따른 단백질의 비용-효과적인 생산을 제공한다. 이러한 종류의 화합물의 예는 상기 기재된 바와 같은 IPTG이다.

원핵 또는 박테리아 세포가 바람직한 숙주 세포이다. 박테리아는 짧은 세대 시간 및 배양 조건에 대한 낮은 요건에 의해 구별된다. 이에 의해 비용-효과적인 배양 방법 또는 제조 방법이 확립될 수 있다. 게다가, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 발효 기술에 있어서 박테리아와 관련하여 풍부한 경험을 갖는다. 임의의 주어진 경우에 실험에 의해 결정되어야 할 매우 다양한 이유, 예를 들어 영양소 공급원, 생성물 형성률, 시간 제약 등으로 인해 특정한 생산을 위해 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아가 적합할 수 있다.

그람-음성 박테리아, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 경우에, 수많은 단백질이 주변세포질 공간, 즉 세포를 둘러싼 2개의 막 사이의 구획으로 분비된다. 이는 특정한 적용을 위해 유리할 수 있다. 게다가, 그람-음성 박테리아는 또한 이들이 발현된 단백질을 주변세포질 공간 뿐만 아니라, 박테리아 주위의 배지로도 분비하도록 형성될 수 있다. 대조적으로, 그람-양성 박테리아, 예를 들어 바실루스 또는 악티노미세테스(actinomycetes) 또는 악티노미세탈레스(actinomycetales)의 다른 대표예는 외막을 갖지 않고, 따라서 분비되는 단백질이 박테리아 주위의 배지, 일반적으로 영양 배지로 직접적으로 유리되며, 그로부터 발현된 단백질이 정제될 수 있다. 이들은 배지로부터 직접적으로 단리될 수 있거나 또는 추가로 프로세싱될 수 있다. 더욱이, 그람-양성 박테리아는 산업적으로 중요한 효소를 위한 대부분의 기원 유기체와 관련있거나 또는 그와 동일하고, 이들 자체가 통상적으로 유사한 효소를 형성하므로, 이들은 유사한 코돈 용법을 가지며, 그의 단백질 합성 기구가 그에 따라 자연히 정렬된다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 배양 조건에 대한 그의 요구의 관점에서 변경될 수 있거나, 상이한 또는 추가의 선택 마커를 가질 수 있거나, 또는 상이한 또는 추가의 단백질을 발현할 수 있다. 이들 숙주 세포는 특히 복수의 단백질 또는 효소를 트랜스제닉 발현하는 숙주 세포일 수 있다.

본 발명은, 원칙적으로, 모든 미생물에 대해, 특히 모든 발효가능한 미생물에 대해, 특히 바람직하게는 바실루스 속의 미생물에 대해 사용될 수 있으며, 이러한 종류의 미생물을 사용하여 본 발명에 따른 단백질을 제조하는 것이 가능하도록 한다. 따라서 이러한 종류의 미생물은 본 발명의 의미 내에서 숙주 세포를 구성한다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아, 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 바실루스, 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아르트로박터(Arthrobacter), 스트렙토미세스(Streptomyces), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 군으로부터 선택된 박테리아, 보다 바람직하게는 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 렌투스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실루스 글로비기이(Bacillus globigii), 바실루스 기브소니이(Bacillus gibsonii), 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실루스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실루스 푸밀루스, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아르트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxidans), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor) 및 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)의 군으로부터 선택된 박테리아인 것을 특징으로 한다.

그러나, 숙주 세포는 또한 핵을 갖는 것을 특징으로 하는 진핵 세포일 수도 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 핵을 갖는 것을 특징으로 하는 숙주 세포에 관한 것이다. 원핵 세포와 달리, 진핵 세포는 형성된 단백질을 번역후 변형시킬 수 있다. 그의 예는 진균 예컨대 악티노미세테스, 또는 효모 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 클루이베로미세스(Kluyveromyces)이다. 이는, 예를 들어, 그의 합성과 관련하여, 단백질이 이러한 종류의 시스템이 허용하는 특정한 변형을 겪도록 의도되는 경우에 특히 유리할 수 있다. 특히 단백질 합성과 관련하여, 진핵 시스템에 의해 수행되는 변형은, 예를 들어, 저분자량 화합물 예컨대 막 앵커 또는 올리고사카라이드의 결합을 포함한다. 이러한 종류의 올리고사카라이드 변형은, 예를 들어, 발현되는 단백질의 알레르기원성을 감소시키기 위한 수단으로서 바람직할 수 있다. 이러한 종류의 세포에 의해 자연적으로 형성되는 효소, 예컨대 셀룰라제와의 공동-발현이 또한 유리할 수 있다. 게다가, 예를 들어 고온성 진균 발현 시스템은 온도-저항성 단백질 또는 변이체의 발현에 특히 적합할 수 있다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 통상적인 방식으로, 예를 들어 배치 또는 연속 시스템에서 배양되고 발현된다. 전자의 경우에는, 적합한 영양 배지에 숙주 세포를 접종하고, 생성물을 실험에 의해 결정될 수 있는 시간 기간 후에 배지로부터 수확한다. 연속 발효는, 비교적 긴 시간 기간에 걸쳐, 일부 세포가 사멸하기도 하지만, 또한 재생되고, 그와 동시에 형성 단백질이 배지로부터 제거될 수 있는 정상 상태의 달성에 의해 구별된다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 본 발명에 따른 프로테아제를 제조하기 위해 바람직하게 사용된다. 따라서, 본 발명은 또한 하기를 포함하는, 프로테아제를 제조하는 방법에 관한 것이다:

a) 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양, 및

b) 배양 배지로부터 또는 숙주 세포로부터의 프로테아제의 단리.

본 발명의 상기 대상은 바람직하게는 발효 방법을 포함한다. 발효 방법은 그 자체가 선행 기술로부터 알려져 있으며, 제조된 생성물, 예를 들어 본 발명에 따른 프로테아제를 정제하는 적합한 방법이 일반적으로 이어지는, 실제 대규모 생산 단계를 구성한다. 본 발명에 따른 프로테아제를 제조하는 상응하는 방법에 기반한 모든 발효 방법은 본 발명의 상기 대상의 실시양태를 구성한다.

발효가 유입 전략을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 방법이 특히 고려된다. 여기서, 연속 배양에 의해 소모되는 배지 구성요소가 공급된다. 세포 밀도 및 세포 물질 또는 건조 물질 둘 다, 및/또는 특히 관심 프로테아제의 활성의 상당한 증가가 이러한 방식으로 달성될 수 있다. 게다가, 발효는 또한 바람직하지 않은 대사 생성물이 여과되거나, 또는 완충제 또는 적절한 반대이온을 첨가함으로써 중화되는 방식으로 설계될 수 있다.

제조된 프로테아제는 발효 배지로부터 수확될 수 있다. 이러한 종류의 발효 방법은 숙주 세포로부터의 프로테아제의 단리, 즉 세포 물질 (건조 물질)로부터의 생성물 회수보다 바람직하지만; 상기 방법은 숙주 세포가 발효 배지로 프로테아제를 분비하도록 하는, 적합한 숙주 세포 또는 하나 이상의 적합한 분비 마커 또는 메카니즘 및/또는 수송 시스템의 제공을 요구한다. 대안적으로, 분비 없이, 프로테아제는, 예를 들어 황산암모늄 또는 에탄올을 이용한 침전에 의해 또는 크로마토그래피 정제에 의해 숙주 세포로부터 단리, 즉 세포 물질로부터 분리될 수 있다.

모든 상기 언급된 요소는 조합되어 본 발명에 따른 프로테아제를 제조하는 방법을 구성할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은, 본 발명에 따른 프로테아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 작용제에 관한 것이다. 작용제는 바람직하게는 세척제 또는 세정제이다.

이는 상업용 규모로 세척 기계에 사용하기 위한 또는 수동 세척 또는 세정을 위한, 농축물 및 희석되지 않은 형태로 사용될 작용제 둘 다를 포함한, 모든 고려가능한 유형의 세척제 또는 세정제를 포함한다. 이들 작용제는, 예를 들어, 직물, 카펫 또는 천연 섬유를 위한 세척제를 포함하며, 이들에 대해서는 용어 "세척제"가 사용된다. 이들은 또한, 예를 들어, 식기세척기용 식기세척 세제 또는 수동 식기세척 세제 또는 경질 표면, 예컨대 금속, 유리, 도자기, 세라믹, 타일, 석재, 코팅된 표면, 플라스틱 소재, 목재 또는 가죽을 위한 세정제, 즉 수동 및 자동 식기세척 세제 이외에도, 또한 연마 세정제, 유리 세정제, WC 림 블록 등을 포함하며, 이들에 대해서는 용어 "세정제"가 사용된다. 본 발명의 범주 내에서, 세척제 및 세정제는 또한 수동으로 또는 기계를 사용하여 직물을 세척할 때 추가의 효과를 달성하기 위해 실제 세척제에 첨가되는 보조 세척제를 포함한다. 게다가, 본 발명의 범주 내에서, 세척제 및 세정제는 또한 직물 전처리제 및 후처리제, 즉 예를 들어 지우기 힘든 오염물의 연화를 위해 세탁물이 실제 세척되기 전에 접촉하게 되는 작용제, 및 또한 실제 직물 세척 과정 후에 이어지는 단계에서 세탁물에 다른 바람직한 특성, 예를 들어 부드러운 촉감, 방추성 또는 낮은 정전하를 부여하는 작용제를 포함한다. 마지막으로 언급된 작용제는 특히 유연제를 포함한다.

분말화된 고체, 압축된 입자, 균질 용액 또는 현탁액의 형태로 존재할 수 있는, 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는, 본 발명에 따른 프로테아제 이외에도, 이러한 종류의 작용제에 통상적인 모든 알려진 성분을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 적어도 1종의 추가의 성분이 작용제에 존재한다. 본 발명에 따른 작용제는 특히 계면활성제, 빌더, 과산소 화합물 또는 표백 활성화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 수혼화성 유기 용매, 추가의 효소, 봉쇄제, 전해질, pH 조절제 및/또는 추가의 보조제 예컨대 광학 증백제, 회색화 억제제, 거품 조절제, 및 염료 및 향료 및 그의 조합을 함유할 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 프로테아제와 작용제의 1종 이상의 추가의 성분(들)의 조합이 유리한데, 그 이유는 이에 의해 얻어지는 상승작용 때문에 이러한 종류의 작용제가 본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서 개선된 세정 성능을 갖기 때문이다. 특히, 이러한 상승작용은 본 발명에 따른 프로테아제와 계면활성제 및/또는 빌더 및/또는 과산소 화합물 및/또는 표백 활성화제의 조합에 의해 달성될 수 있다. 본원에 기재된 프로테아제는 심지어 효소 안정화제, 예를 들어 붕산이 없어도 높은 효소 안정성을 가지므로, 다양한 실시양태에서 효소-함유 작용제에 이러한 안정화제를 첨가하는 것이 생략될 수 있거나 또는 상기 안정화제의 양이 감소될 수 있다.

본 발명에 따른 작용제의 유리한 성분은 국제 특허 출원 WO2009/121725에, 제5면의 끝에서 두번째 단락에서부터 제13면의 두번째 단락까지 개시되어 있다. 이러한 개시내용은 분명히 참조되며, 그의 내용은 본 특허 출원에 포함된다.

본 발명에 따른 작용제는 바람직하게는 프로테아제를 작용제의 g당 2 μg 내지 20 mg, 바람직하게는 5 μg 내지 17.5 mg, 특히 바람직하게는 20 μg 내지 15 mg, 매우 특히 바람직하게는 50 μg 내지 10 mg의 양으로 함유한다. 게다가, 작용제에 함유된 프로테아제 및/또는 작용제의 추가의 성분은 실온에서 또는 물의 부재 하에 효소에 대해 불투과성인 물질에 캡슐화될 수 있으며, 이러한 물질은 작용제의 사용 조건 하에서는 효소에 대해 투과성이 된다. 따라서, 본 발명의 이러한 실시양태는 프로테아제가 실온에서 또는 물의 부재 하에 프로테아제에 대해 불투과성인 물질에 캡슐화되는 것을 특징으로 한다. 게다가, 세척제 또는 세정제 자체는 또한 용기, 바람직하게는 기밀 용기에 포장될 수 있으며, 사용 직전에 또는 세척 과정 동안에 그로부터 개봉된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 작용제는:

(a) 고체 형태로, 특히 300 g/l 내지 1200 g/l, 특히 500 g/l 내지 900 g/l의 벌크 밀도를 갖는 유동성 분말로서 존재하거나, 또는

(b) 페이스트 또는 액체 형태로 존재하고/거나,

(c) 겔 또는 파우치 형태로 존재하고/거나,

(d) 단일-구성요소 시스템으로서 존재하거나, 또는

(e) 복수의 구성요소로 분할되는 것

을 특징으로 한다.

본 발명의 이들 실시양태는, 임의로 또한 복수의 상으로 이루어질 수 있으며 압축된 또는 비압축된 형태로 존재할 수 있는, 본 발명에 따른 작용제의 모든 고체, 분말, 액체, 겔 또는 페이스트 투입 형태를 포함한다. 작용제는, 특히 300 g/l 내지 1200 g/l, 보다 특히 500 g/l 내지 900 g/l 또는 600 g/l 내지 850 g/l의 벌크 밀도를 갖는 유동성 분말의 형태로 존재할 수 있다. 작용제의 고체 투입 형태는 또한 압출물, 과립, 정제 또는 파우치를 포함한다. 대안적으로, 작용제는 또한, 예를 들어 비-수성 액체 세척제 또는 비-수성 페이스트의 형태 또는 수성 액체 세척제 또는 물-함유 페이스트의 형태의, 액체, 겔 또는 페이스트일 수 있다. 게다가, 작용제는 단일-구성요소 시스템으로서 존재할 수 있다. 이러한 종류의 작용제는 하나의 상으로 이루어진다. 대안적으로, 작용제는 또한 복수의 상으로 이루어질 수 있다. 따라서, 이러한 종류의 작용제는 복수의 구성요소로 분할된다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 단지 프로테아제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 이들은 또한 추가의 가수분해 효소 또는 다른 효소를 작용제의 유효성의 관점에서 편리한 농도로 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 1종 이상의 추가의 효소를 또한 포함하는 작용제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 작용제에서 촉매적 활성을 발생시킬 수 있는 모든 효소, 특히 리파제, 아밀라제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 만난아제, 탄나제, 크실라나제, 크산타나제, 크실로글루카나제, β-글루코시다제, 펙티나제, 카라기나제, 퍼히드롤라제, 옥시다제, 옥시도리덕타제 또는 본 발명에 따른 프로테아제와는 상이한 다른 프로테아제, 및 그의 혼합물이 추가의 효소로서 바람직하게 사용될 수 있다. 추가의 효소는 유리하게는 각 경우에 활성 단백질을 기준으로 하여 1 x 10^-8 내지 5 wt%의 양으로 작용제에 함유된다. 각각의 추가의 효소는 활성 단백질을 기준으로 하여 바람직한 순으로 1 x 10^-7 내지 3 wt%, 0.00001 내지 1 wt%, 0.00005 내지 0.5 wt%, 0.0001 내지 0.1 wt%, 가장 특히 바람직하게는 0.0001 내지 0.05 wt%의 양으로 본 발명에 따른 작용제에 함유된다. 효소는 특히 바람직하게는 특정한 얼룩 또는 자국에 대해 상승작용적 세정 성능을 가지며, 즉 작용제 조성물에 함유된 효소가 그의 세정 성능의 관점에서 서로를 보조한다. 매우 특히 바람직하게는, 이러한 상승작용은 본 발명에 따라 함유된 프로테아제와 본 발명에 따른 작용제의 추가의 효소 사이에, 특히 언급된 프로테아제와 아밀라제 및/또는 리파제 및/또는 만난아제 및/또는 셀룰라제 및/또는 펙티나제 사이에 존재한다. 상승작용적 효과는 상이한 효소 사이에서 뿐만 아니라, 또한 1종 이상의 효소와 본 발명에 따른 작용제의 다른 성분 사이에서도 발생할 수 있다.

본 발명은 추가로 직물 또는 경질 표면을 세정하는 방법으로서, 본 발명에 따른 작용제가 적어도 하나의 방법 단계에서 사용되거나, 또는 본 발명에 따른 프로테아제가 적어도 하나의 방법 단계에서 촉매적으로 활성이 되어, 특히 프로테아제가 40 μg 내지 4 g, 바람직하게는 50 μg 내지 3 g, 특히 바람직하게는 100 μg 내지 2 g, 매우 특히 바람직하게는 200 μg 내지 1 g의 양으로 사용되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

다양한 실시양태에서, 상기 기재된 방법은 프로테아제가 0 내지 100℃, 바람직하게는 0 내지 60℃, 보다 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서, 가장 바람직하게는 대략 35℃의 온도에서 사용된다는 점에서 구별된다.

이들 실시양태는 수동 및 자동 방법 둘 다를 포함하며, 자동 방법이 바람직하다. 직물을 세정하는 방법은 일반적으로 세정 효과를 갖는 다양한 물질이 복수의 방법 단계에서 세정하려는 물품에 적용되고, 접촉 시간 후에 세척 제거되거나, 또는 세정하려는 물품이 어떤 다른 방식으로 세척제 또는 이러한 작용제의 용액 또는 희석액으로 처리된다는 점에서 구별된다. 직물 이외의 다른 모든 소재, 특히 경질 표면을 세정하는 방법의 경우도 마찬가지이다. 모든 고려가능한 세척 또는 세정 방법이 방법 단계 중 적어도 하나에서 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제, 또는 본 발명에 따른 프로테아제를 사용하여 증진될 수 있고, 따라서 본 발명의 실시양태를 구성한다. 본 발명에 따른 프로테아제 및 그를 함유하는 작용제에 대해 기재된 모든 요소, 대상 및 실시양태는 또한 본 발명의 상기 대상에도 적용될 수 있다. 따라서, 이제, 본 개시내용이 또한 본 발명에 따른 상기 방법에도 적용되는 것으로 나타내어지는 경우에는, 상응하는 점에서 본 개시내용이 분명히 참조된다.

본 발명에 따른 프로테아제는 자연적으로 이미 가수분해 활성을 가지며, 이들은 또한 달리 세정력을 갖지 않는 배지, 예컨대 단순 완충제에서 발생하므로, 이러한 종류의 방법의 개개의 및/또는 유일한 단계는, 바람직하게는 완충제 용액 또는 물 중에서, 세정 효과를 갖는 유일한 구성요소로서 본 발명에 따른 프로테아제를 얼룩과 접촉하게 하는 것일 수 있다. 이는 본 발명의 상기 대상의 추가 실시양태를 구성한다.

본 발명에 따른 프로테아제가 적어도 하나의 방법 단계에서 활성이 되는, 직물 원료를 처리하거나 또는 직물을 관리하는 방법이 또한 본 발명의 상기 대상의 대안적 실시양태를 구성한다. 이러한 방법 중에, 천연 구성요소를 갖는 직물 원료, 섬유 또는 직물을 위한 방법, 매우 특히 울 또는 실크를 함유하는 것들을 위한 방법이 바람직하다.

마지막으로, 본 발명은 추가로, 예를 들어 직물 또는 경질 표면으로부터의 단백질-함유 얼룩의 (개선된) 제거를 위한, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은, 세척제 또는 세정제에서의 본원에 기재된 프로테아제의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 프로테아제 및 그를 함유하는 작용제에 대해 기재된 모든 요소, 대상 및 실시양태는 또한 본 발명의 상기 대상에도 적용될 수 있다. 따라서, 이제, 본 개시내용이 또한 본 발명에 따른 상기 용도에도 적용되는 것으로 나타내어지는 경우에는, 상응하는 점에서 본 개시내용이 분명히 참조된다.

실시예

분자 생물학을 수반하는 모든 작업 단계는, 예를 들어, 매뉴얼 [Fritsch, Sambrook and Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989], 또는 유사한 관련 문헌에 명시된 바와 같은 표준 방법을 따랐다. 효소 및 키트는 각 경우에 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.

돌연변이의 개관

실시예 1: 세척제에서의 효소의 저장 안정성

프로테아제를 동일한 활성 수준에서 세척제 매트릭스 중에서 교반하고, 30℃에서 저장하였다. 프로테아제에 대한 표준 활성 검정 (suc-AAPF-pNA의 가수분해)을 사용하여, 프로테아제의 초기 활성 및 잔여 활성을 30℃에서 42시간 및 9일 저장한 후에 측정하였다.

혹독한 조건을 만들기 위해, 프로테아제를 한 번은 안정화제 (붕산) 없이, 그리고 비교를 위해 한 번은 붕산과 함께 세척제 매트릭스 중에 저장하였다.

하기는 이 경우에 사용된 세척제 매트릭스이다 (LSPA+):

상기 매트릭스는 1% 붕산의 안정화제를 사용한 측정을 위해 제공된다.

실시예 2: 효소

프로테아제는 진탕 플라스크에 생성된 상청액 중에 바실루스 서브틸리스에 존재하였다. 상기 프로테아제를 동일한 활성 수준으로 희석하였다. 50%의 세척제 매트릭스 +/- 붕산을 50%의 상응하게 희석된 바실루스 서브틸리스 프로테아제 상청액과 섞어 잘 혼합하였다. 밀폐된 유리를 30℃에서 인큐베이션하였다. 샘플을 채취할 때, 특정 양의 매트릭스/프로테아제 혼합물을 꺼내어, 샘플 완충제 (0.1 M 트리스/HCl, pH 8.6) 중에 RT에서 20분 동안 교반하여 용해시켰다. 이어서, AAPF 검정을 하기 기재된 바와 같이 수행하였다.

9종의 돌연변이체 (서열식별번호: 3-11)가 유리한 것으로 입증된 바 있으며; 활성은 초기 값의 %로 제시되어 있다. 이는 프로테아제를 매트릭스와 상호혼합한 직후에 측정된 것이며, 각 경우에 100%로 설정되었다:

서열식별번호: 9 내지 11에 따른 돌연변이체는 또 다른 시험에서 측정된 바 있는 재조합체이다:

모든 돌연변이체는 야생형의 것과 유사한 세척 성능을 나타내는데, 즉 그의 세척 성능이 최대 10% 불량해지며, 이는 측정 변동의 한계 내에 있다 (결과는 제시되지 않음).

실시예 3: 프로테아제 활성 검정

프로테아제의 활성을 기질 숙시닐 알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-파라-니트로아닐리드 (AAPFpNA; 바켐 L-1400)로부터의 발색단 파라-니트로아닐린의 유리에 의해 결정하였다. pNA의 유리는 410 nm에서의 흡광의 증가를 야기하며, 그의 시간 경과가 효소적 활성의 척도이다.

측정은 25℃의 온도, 8.6의 pH 및 410 nm의 파장에서 행하였다. 측정 시간은 20 내지 60초의 측정 간격으로 5분이었다.

측정 제제:

10 μL AAPF 용액 (70 mg/mL)

1000 μL 트리스/HCl (0.1 M; 0.1% 브리즈 35에 의한 pH 8.6)

10 μL 희석된 프로테아제 용액

25℃에서 5분에 걸쳐 산출된 반응속도론 (410 nm)

SEQUENCE LISTING <110> Henkel AG & Co. KGaA <120> Proteasen mit verbesserte Enzymstabilit? in Waschmittel <130> PT033537PCT <150> 102016204815.5 <151> 2016-03-23 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 825 <212> DNA <213> Bacillus pumilus <400> 1 gcacaaaccg tcccttatgg aatccctcaa atcaaagctc cagctgtaca cgctcaaggt 60 tataaaggtg ctaatgtcaa agtagctgtc cttgatactg gaatccacgc tgcacatcct 120 gacttaaatg ttgcaggcgg tgccagcttc gtcccttcag agccaaatgc cacccaagac 180 tttcaatcac atggaactca cgtagccgga accattgctg cccttgataa cacaattggt 240 gttcttgggg tcgctccaag tgcttcccta tatgctgtta aagtattaga ccgcaatggc 300 gacggacaat acagctggat cattagcggt attgaatggg ctgtagccaa taacatggat 360 gtcatcaata tgagcttagg tggaccaaac ggttcaacag cgcttaaaaa tgccgttgat 420 acagcaaata accgcggagt cgttgttgtg gcggccgcag gtaattcagg ttccactggc 480 tctacaagta cagttggcta tccagcaaaa tatgattcta caattgccgt tgccaatgta 540 aacagcagca atgtcagaaa ctcgtcttcc agcgcaggtc ctgaattaga tgtttctgca 600 cctggtactt ctattttaag tacagtacca agcagtggat acacatctta tactggaact 660 tctatggcgt ctcctcatgt agcaggagca gcagcgctta ttctttctaa aaatccgaac 720 ctatcaaatt cacaggttcg ccagcgctta gaaaacacgg caacaccgct tggtaactcc 780 ttctattacg gaaaagggtt aatcaacgct caagcggctt ctaac 825 <210> 2 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus pumilus <400> 2 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asn Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Gln Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 3 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus pumilus protease mutant <400> 3 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Thr Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asn Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Gln Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 4 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus pumilus protease mutant <400> 4 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asn Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Glu Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 5 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus pumilus protease mutant <400> 5 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asn Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Lys Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Gln Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 6 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus pumilus protease mutant <400> 6 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile His Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asn Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Gln Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 7 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus pumilus protease mutant <400> 7 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asn Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg His Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Gln Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 8 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus pumilus protease mutant <400> 8 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asn Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Cys Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Gln Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 9 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus pumilus protease mutant <400> 9 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Glu Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asp Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Gln Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 10 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus pumilus protease mutant <400> 10 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Glu Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Glu Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asp Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Ser Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Glu Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 11 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus pumilus protease mutant <400> 11 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Thr Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asn Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg His Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Cys Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Glu Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275

Claims (13)

1. 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일하며, 각 경우에 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에 기반하여 위치 P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 및 Q271 중 적어도 하나에서의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 프로테아제.
2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 치환이 각 경우에 서열식별번호: 2에 따른 넘버링에 기반하여 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로테아제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 아미노산 치환 변이체 중 하나를 갖는 프로테아제:
   (i) P9T;
   (ii) Q271E;
   (iii) P9S 및 N238K;
   (iv) P9H;
   (v) N187H;
   (vi) S216C;
   (vii) Q62E 및 N130D;
   (viii) Q62E, D101E, N130D, G166S 및 Q271E; 또는
   (ix) P9T, N187H, S216C 및 Q271E.
4. 하기 특징을 갖는 프로테아제:
   (a) 상기 프로테아제는 출발 분자로서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제로부터 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 수득될 수 있으며, 프로테아제는 서열식별번호: 2에 따른 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E 중 적어도 하나를 가짐; 및/또는
   (b) 상기 프로테아제는 출발 분자로서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제로부터 단편화, 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있고, 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 또는 274개의 상호연결된 아미노산의 길이에 걸쳐 출발 분자의 것과 매칭되는 아미노산 서열을 가지며, 프로테아제는 서열식별번호: 2에 따른 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E 중 적어도 하나를 가짐.
5. 서열이 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 출발 프로테아제에서, 서열식별번호: 2의 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산을 치환하여, 바람직하게는 프로테아제가 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E를 갖도록 하는 것을 포함하는, 프로테아제를 제조하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 하기 방법 단계 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함하는 방법:
   (a) 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 도입하며, 여기서 프로테아제는 서열식별번호: 2에 따른 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E 중 적어도 하나를 갖는 것인 단계;
   (b) 단편화, 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 아미노산 서열을 변경하여, 프로테아제가 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 또는 274개의 상호연결된 아미노산의 길이에 걸쳐 출발 분자의 것과 매칭되는 아미노산 서열을 갖도록 하며, 여기서 프로테아제는 서열식별번호: 2에 따른 위치 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 및 271에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K 또는 Q271E 중 적어도 하나를 갖는 것인 단계.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제를 코딩하거나 또는 제5항 또는 제6항의 방법을 사용하여 수득될 수 있는 프로테아제를 코딩하는 핵산.
8. 제7항에 따른 핵산을 함유하는 벡터, 특히 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
9. 제7항에 따른 핵산 또는 제8항에 따른 벡터를 함유하거나 또는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제를 함유하거나 또는 제5항 또는 제6항의 방법을 사용하여 수득될 수 있는 프로테아제를 함유하는 비-인간 숙주 세포.
10. 하기를 포함하는, 프로테아제를 제조하는 방법:
    a) 제9항에 따른 숙주 세포의 배양; 및
    b) 배양 배지로부터 또는 숙주 세포로부터의 프로테아제의 단리.
11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1종의 프로테아제 또는 제5항 또는 제6항의 방법을 사용하여 수득될 수 있는 프로테아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 작용제, 특히 세척제 또는 세정제.
12. 제11항에 따른 작용제가 적어도 하나의 방법 단계에서 사용되거나, 또는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제 또는 제5항 또는 제6항의 방법을 사용하여 수득될 수 있는 프로테아제가 적어도 하나의 방법 단계에서 사용되는 것을 특징으로 하는, 직물 또는 경질 표면을 세정하는 방법.
13. 단백질-함유 얼룩을 제거하기 위한 세척제 또는 세정제에서의, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제 또는 제5항 또는 제6항의 방법을 사용하여 수득될 수 있는 프로테아제의 용도.