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KR20180107151A - Tgf베타 2 항체 - Google Patents

Tgf베타 2 항체 Download PDF

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KR20180107151A
KR20180107151A KR1020187023260A KR20187023260A KR20180107151A KR 20180107151 A KR20180107151 A KR 20180107151A KR 1020187023260 A KR1020187023260 A KR 1020187023260A KR 20187023260 A KR20187023260 A KR 20187023260A KR 20180107151 A KR20180107151 A KR 20180107151A
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KR
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tgf
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variable region
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KR1020187023260A
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치?두 이베분조
카르슈텐 자코비
안젤리카 마이어
에벨리네 샤트
앤-울리크 트렌델렌버그
올가 블라디미로프나 미티나
Original Assignee
노파르티스 아게
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Publication date
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Abstract

본 발명은 항-형질전환 성장 인자 베타 2 (TGF-β2) 항체의 분야에 있다. 특히, 본 발명은 인간 TGF-β1 또는 TGF-β3 이소형보다 인간 TGF-β2 이소형에 우선적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 제공한다.

Description

TGF베타 2 항체
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 출원되었으며 그 전문이 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2017년 2월 13일에 생성된 상기 ASCII 카피는 PAT057206-WO-PCT_SL.TXT로 명명되고, 162,071 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 발명은 항-형질전환 성장 인자 베타 2 (TGF-β2) 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 TGF-β1 또는 TGF-β3 이소형보다 인간 TGF-β2 이소형에 우선적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 제공한다.
형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 슈퍼패밀리의 구성원은 다양한 병리학적 상태 예컨대 섬유증, 반흔형성, 암 (Growth Factors. 2011 Aug;29(4):140-52), 특정한 상태 예컨대 마르팡-연관 상태 (US8,597,646) 및 수포성 표피박리증과 연관된 시토카인이다. US 5,571,714는 악성종양 및 전이성 암을 치료함에 있어서의 항 TGF 베타 항체의 용도를 개시한다. 항-TGF베타 항체는 수많은 질환 예컨대: 폐 섬유증 (S.N. Giri et al. Thorax 48, 959-966, 1993); 신경 반흔형성 (A. Logan et al. Eur. J. Neurosci. 6, 355-363, 1994); 동맥 손상 (Y.G. Wolf, L.M. Rasmussen & E. Ruoslahti J. Clin. Invest. 93, 1172-1178, 1994); 사구체신염 (W.A Border et al. Nature 346, 371-374, 1990); 류마티스 관절염 (Wahl et al. J. Exp. Medicine 177, 225-230, 1993) 및 피부 반흔형성 (M. Shah et al. Lancet 339, 213-214 1992; M.Shah et al. J.Cell Science 107, 1137-1157, 1994; M. Shah et al. 108, 985-1002, 1995)의 치료에 사용되었다. 따라서, TGF-β 활성을 표적화하는 것은 안티센스 올리고뉴클레오티드 (Curr Pharm Biotechnol. 2011 Dec;12(12):2203-13.)), TGF-β 수용체 키나제의 소분자 억제제 (예를 들어, TGF-β 수용체 제I형 및 제II형을 표적화하는 LY2109761 (Mol Cancer Ther 2008 7; 829)), 그의 천연 리간드를 포획하는 가용성 수용체 엑토도메인, 및 모노클로날 항체 (문헌 [Growth Factors. 2011 Aug;29(4):140-52; WO9713844]에 검토됨)를 포함하는 상이한 접근법을 사용하는 활발한 연구 분야이다.
형질전환 성장 인자 베타 2 (TGF-β2)는 TGF-β 단백질 패밀리의 >30종의 구성원 중 한 구성원이다. 이는 TGF-β1/3 이소형과 밀접하게 관련된다. 모든 TGF-β 전구체 단백질은 N-말단 신호 펩티드, 대형 프로펩티드-절편 및 C-말단 폴리펩티드로 이루어진다. 후자는 이량체화하여 TGF-β2로 지칭되는 활성 성숙 TGF-β2 단백질을 형성한다. 성숙 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 사이의 상동성은 비교적 높은 반면 (71-79%), 프로펩티드-절편은 현저하게 비보존된다 (43-54% 상동성). 더욱이, TGF-β2의 다른 TGF-β 패밀리 단백질에 대한 상동성은 단지 <33%인 반면, 인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스를 포함한 다양한 종으로부터의 TGF-β2 사이에서 매우 높은 상동성이 관찰된다 (95-100%).
가장 널리 기재된 TGF-β 신호전달 경로는 TGF-β 제II형 수용체인 ALK5 및 Smad2/3을 통한 것이지만, ALK- 및 Smad-비의존성 경로를 포함한 많은 다른 경로가 확립되었다. 대부분의 상업적으로 입수가능한 TGF-β 항체는 비-인간 종으로부터 유래된 폴리클로날 항체 또는 마우스 모노클로날 항체 예컨대 웨스턴 블롯 분석에 사용하기 위한 TGF-β1-특이적 MAB240 (알앤디 시스템즈(R&D Systems)™에 의함)이다 (J Immunol Methods. 1999 May 27;225(1-2):87-93). 인간에서의 임상 연구에 사용하기 위한 항체는 도구 항체와는 상이한 요건을 충족하여야 한다. 결정적인 요건은 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체의 사용에 의한 잠재적 면역원성의 감소이다. 하기를 포함하는, 이들 요건을 충족하는 임상 개발 중인 다수의 TGF-β 이소형 항체가 존재한다:
1. TGF-β 이소형 1, 2 및 3을 중화시키는 완전-인간 모노클로날 항체 GC1008 (프레솔리무맙),
2. TGF-β1을 중화시키는 항체 LY2382770,
3. TGF-β1을 중화시키는 항체 CAT-192 (메텔리무맙), 및
4. TGF-β2에 대한 고친화도 및 TGF-β3과의 교차-반응성을 갖는 항체 CAT-152 (레르델리무맙, 또한 6B1로도 알려짐) (상기 모두가 문헌 [Growth Factors. 2011 Aug;29(4):140-52]에 검토됨).
CAT-152: CAT-152는 TGF-β2 (비아코어(Biacore)® 시스템 해리 상수 0.89nM)에 대한 친화도 및 TGF-β3 (비아코어® 시스템 해리 상수 10nM)과의 9% 교차-반응성을 갖지만 TGF-β1에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는 완전 인간 IgG4 항체이다 (J Immunol Methods. 1999 Jul 30;227(1-2):17-29; Drugs R&D 2002; 3 (2):106-108; WO9713844). CAT-152는 섬유주절제술로도 알려져 있는 녹내장 배액 수술에 대한 보조제로서 개발되었다 (Drugs R&D 2002; 3 (2):106-108). 그러나, CAT-152는 III상 시험에서의 1차 섬유주절제술 후 특정 녹내장 환자에서의 섬유증의 진행을 방지하는 데 실패하였다 (Ophthalmology. 2007 Oct; 114(10):1822-30.).
CAT-192: TGF-β1 특이적 재조합 인간 항체 CAT-192는 초기 미만성 전신 피부 경화증의 치료를 조사하는 I/II상 시험에서 효능의 증거를 보여주는 데 실패하였다 (Arthritis Rheum. 2007 Jan;56(1):323-33). 더욱이, 그 시험에서 위약을 제공받은 환자에서보다 CAT-192를 제공받은 환자에서 더 많은 유해 사건이 관찰되었다. 이러한 발견은 활성 TGF-β1의 감소된 수준이 다기관 염증, 표피 내 랑게르한스 세포의 결핍 및 종양의 발생과 연관되는 것을 보여주는, 돌연변이체 마우스 모델에서 수득된 결과에 의해 추가로 지지된다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 2;105(48)).
3종의 밀접하게 관련된 TGF-β1/2/3 이소형의 존재는 유해하거나 원치 않는 사건과 연관될 수 있는 다른 경로에 의한 임의의 간섭을 피하기 위한 인간에서의 이들 단백질의 특이적 검출 및 중화를 가능하게 하는 화합물에 대한 필요를 생성한다. 보다 구체적으로, 이는 TGF-β2를 효과적으로 중화시키고 TGF-β1 또는 TGF-β3에 비한 TGF-β2의 우선적인 결합 및 중화를 나타내는 이소형 특이적 항-TGF-β2 치료 항체에 대한 강한 의료 필요를 생성한다. 이상적으로, TGF-β2 항체의 특이성은 높은 결합 친화도와 조합되는데, 이는 높은 결합 친화도가 증가된 효력 및 보다 낮은 투여 요건과 연관되어 증진된 효능, 안전성 및 보다 낮은 비용에 기여하기 때문이다 (MAbs. 2012 May-Jun;4(3):341-8). 종종 모노클로날 항체는 질환 메카니즘에서 매우 단단한 단백질:단백질 상호작용을 파괴하기 위해 매우 낮은 (예를 들어, 피코몰) 해리 상수를 필요로 할 수 있다 (MAbs. 2012 May-Jun;4(3):341-8). 이는 매우 낮은 피코몰 해리 상수를 나타내는 이소형 특이적 TGF-β2 치료 항체에 대한 강한 의료 필요를 생성하며, 이것이 또한 본 발명에 의해 해결된다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 하기 측면에서 기재된다:
1. 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2를 중화시키고 인간 이소형 TGF-β3을 중화시키지 않는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편.
2. 측면 1에 있어서, 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2를 중화시키고 인간 이소형 TGF-β3 및 TGF-β1을 중화시키지 않는 항체 또는 그의 기능적 단편.
3. 측면 1 또는 2에 있어서, 중화가 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의해 결정되는 것인 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편.
4. 측면 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의한 결정 시에, 인간 TGF-β2를 250pM 미만의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키고, 인간 TGF-β1 및/또는 TGF-β3을 100nM 초과의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키는 항체 또는 그의 기능적 단편.
5. TGF-β1 또는 TGF-β3에 대한 해리 상수보다 적어도 70배 더 낮은 해리 상수로 인간 이소형 TGF-β1 및 TGF-β3보다 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2에 우선적으로 결합하며, 인간 TGF-β2를 중화시키는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편.
6. 측면 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 인간 TGF-β2에 1pM 이하의 KD로 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
7. 측면 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 21, 41, 61, 81, 101 또는 4, 24, 44, 64, 84, 104 또는 124-129로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 CDR1 영역; 서열식별번호: 2, 22, 42, 62, 82, 102 또는 5, 25, 45, 65, 85, 105로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 CDR2 영역; 서열식별번호: 3, 23, 43, 63, 83, 103 또는 6, 26, 46, 66, 86, 106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 CDR3 영역; 서열식별번호: 11, 31, 51, 71, 91, 111 또는 14, 34, 54, 74, 94, 114로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 CDR1 영역; 서열식별번호: 12, 32, 52, 72, 92, 112 또는 15, 35, 55, 75, 95, 115로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 CDR2 영역; 및 서열식별번호: 13, 33, 53, 73, 93, 113 또는 16, 36, 56, 76, 96, 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 CDR3 영역을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
8. 측면 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 7, 27, 47, 67, 87 또는 107 중 적어도 1개와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
9. 측면 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 17, 37, 57, 77, 97 또는 117 중 적어도 1개와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
10. 측면 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 7, 27, 47, 67, 87 또는 107 중 적어도 1개와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 폴리펩티드 서열 및 서열식별번호: 17, 37, 57, 77, 97 또는 117 중 적어도 1개와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
11. 측면 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1, 21, 41, 61, 81, 101 또는 4, 24, 44, 64, 84, 104 또는 124-129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 2, 22, 42, 62, 82, 102 또는 5, 25, 45, 65, 85, 105로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 3, 23, 43, 63, 83, 103 또는 6, 26, 46, 66, 86, 106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 11, 31, 51, 71, 91, 111 또는 14, 34, 54, 74, 94, 114로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 12, 32, 52, 72, 92, 112 또는 15, 35, 55, 75, 95, 115로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 13, 33, 53, 73, 93, 113 또는 16, 36, 56, 76, 96, 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
12. 측면 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서,
(a) 서열식별번호: 1의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 2의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 3의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 11의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 12의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 13의 경쇄 가변 영역 CDR3,
(b) 서열식별번호: 21의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 22의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 23의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 31의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 32의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 33의 경쇄 가변 영역 CDR3,
(c) 서열식별번호: 41의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 42의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 43의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 51의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 52의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 53의 경쇄 가변 영역 CDR3,
(d) 서열식별번호: 61의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 62의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 63의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 71의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 72의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 73의 경쇄 가변 영역 CDR3,
(e) 서열식별번호: 81의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 82의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 83의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 91의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 92의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 93의 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는
(f) 서열식별번호: 101의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 102의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 103의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 111의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 112의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 113의 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 기능적 단편.
13. 측면 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 9, 29, 49, 69, 89, 109로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 전장 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
14. 측면 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 19, 39, 59, 79, 99, 119로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
15. 측면 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 9, 29, 49, 69, 89, 109로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 전장 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 19, 39, 59, 79, 99, 119로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
16.
(a) 서열식별번호: 7의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17의 가변 경쇄 서열;
(b) 서열식별번호: 27의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 37의 가변 경쇄 서열;
(c) 서열식별번호: 47의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 가변 경쇄 서열;
(d) 서열식별번호: 67의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 77의 가변 경쇄 서열;
(e) 서열식별번호: 87의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 97의 가변 경쇄 서열; 또는
(f) 서열식별번호: 107의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 117의 가변 경쇄 서열
을 포함하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체.
17.
(a) 서열식별번호: 9의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 19의 경쇄 서열;
(b) 서열식별번호: 29의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 39의 경쇄 서열;
(c) 서열식별번호: 49의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 59의 경쇄 서열;
(d) 서열식별번호: 69의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 79의 경쇄 서열;
(e) 서열식별번호: 89의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 99의 경쇄 서열; 또는
(f) 서열식별번호: 109의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 119의 경쇄 서열
을 포함하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체.
18. 측면 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, IgG1 이소형의 항-TGF-β2 항체.
19. 측면 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 갖는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체.
20. 측면 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 항체 또는 기능적 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열.
21. 측면 20에 있어서, 서열식별번호: 8, 10, 18, 20, 28, 30, 38, 40, 48, 50, 58, 60, 68, 70, 78, 80, 88, 90, 98, 100, 108, 110, 118 또는 120 중 1개 이상을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열.
22. 측면 20 또는 측면 21에 따른 1개 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
23. 측면 22에 있어서, 적어도 1개의 CDR 영역을 코딩하는 서열식별번호: 8, 10, 18, 20, 28, 30, 38, 40, 48, 50, 58, 60, 68, 70, 78, 80, 88, 90, 98, 100, 108, 110, 118 또는 120 또는 그의 단편 중 1개 이상을 포함하는 벡터.
24. 측면 22 또는 측면 23에 따른 1개 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
25. 측면 1 내지 19 중 어느 하나의 항체 또는 그의 기능적 단편의 생산 방법이며, 측면 24의 숙주 세포를 배양하고 상기 항체 또는 기능적 단편을 단리하는 것을 포함하는 방법.
26. 측면 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 제약 조성물.
27. 요법에 사용하기 위한, 측면 12, 15, 16, 17 및 26 중 어느 하나의 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 제약 조성물.
28. 의약으로서 사용하기 위한, 측면 12, 15, 16, 17 및 26 중 어느 하나의 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 제약 조성물.
29. 측면 26 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
30. 측면 26 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 추가의 활성제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
31. 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 듀피트렌병의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
32. 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 로이스-디에츠-증후군의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
33. 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 마르팡-연관 상태 또는 마르팡병의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
34. 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 수포성 표피박리증의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
35. 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 섬유주절제술의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
36. 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 전신 피부 경화증의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
37. 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 근골격 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
38. 측면 37에 있어서, 상기 근골격 질환 또는 장애가 근육 위축, 예를 들어 근병증, 예컨대 근긴장증, 선천성 근병증 (네말린 근병증, 멀티/미니코어 근병증 및 근세관성 (중심핵성) 근병증 포함), 미토콘드리아 근병증, 가족성 주기성 마비, 염증성 근병증, 대사성 근병증, 예컨대 글리코겐 또는 지질 축적 질환에 의해 유발되는 것, 피부근염, 다발근염, 봉입체 근염, 골화성 근염, 횡문근융해증 및 미오글루빈뇨; 이영양증, 예컨대 뒤시엔느(Duchenne), 베커(Becker), 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss), 안인두, 견갑상완, 지대, 후쿠야마(Fukuyama), 선천성 근육 이영양증 또는 유전성 원위 근병증; 골다공증; 골절; 저신장; 왜소증; 장기간 침상 안정; 수의적 무활동; 또는 불수의 무활동에 의해 유발되는 것인 제약 조성물.
39. 듀피트렌병을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 유효 용량의 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 따른 제약 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
40. 마르팡-연관 상태 또는 마르팡병을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 유효 용량의 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 따른 제약 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
41. 수포성 표피박리증을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 유효 용량의 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 따른 제약 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
42. 섬유주절제술을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 유효 용량의 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 따른 제약 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
43. 전신 피부 경화증을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 유효 용량의 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 따른 제약 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
44. 로이스-디에츠-증후군을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 유효 용량의 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 따른 제약 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
45. 근골격 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 유효 용량의 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 따른 제약 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
46. 측면 45에 있어서, 상기 근골격 질환 또는 장애가 근육 위축, 예를 들어 근병증, 예컨대 근긴장증, 선천성 근병증 (네말린 근병증, 멀티/미니코어 근병증 및 근세관성 (중심핵성) 근병증 포함), 미토콘드리아 근병증, 가족성 주기성 마비, 염증성 근병증, 대사성 근병증, 예컨대 글리코겐 또는 지질 축적 질환에 의해 유발되는 것, 피부근염, 다발근염, 봉입체 근염, 골화성 근염, 횡문근융해증 및 미오글루빈뇨; 근육 이영양증, 예컨대 뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스, 안인두, 견갑상완, 지대, 후쿠야마, 선천성 근육 이영양증 또는 유전성 원위 근병증; 골다공증; 골절; 저신장; 왜소증; 장기간 침상 안정; 수의적 무활동; 또는 불수의 무활동에 의해 유발되는 것인 방법.
47. 듀피트렌병, 마르팡-연관 상태 또는 마르팡병, 수포성 표피박리증, 섬유주절제술, 로이스-디에츠-증후군, 전신 피부 경화증 또는 근골격 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 측면 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 항체 또는 기능적 단편, 측면 20 또는 21에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 측면 26 내지 30 중 어느 하나에 따른 제약 조성물의 용도.
48. 측면 47에 있어서, 상기 근골격 질환 또는 장애가 근육 위축, 예를 들어 근병증, 예컨대 근긴장증, 선천성 근병증 (네말린 근병증, 멀티/미니코어 근병증 및 근세관성 (중심핵성) 근병증 포함), 미토콘드리아 근병증, 가족성 주기성 마비, 염증성 근병증, 대사성 근병증, 예컨대 글리코겐 또는 지질 축적 질환에 의해 유발되는 것, 피부근염, 다발근염, 봉입체 근염, 골화성 근염, 횡문근융해증 및 미오글루빈뇨; 이영양증, 예컨대 뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스, 안인두, 견갑상완, 지대, 후쿠야마, 선천성 근육 이영양증 또는 유전성 원위 근병증; 골다공증; 골절; 저신장; 왜소증; 장기간 침상 안정; 수의적 무활동; 또는 불수의 무활동에 의해 유발되는 것인 용도.
49. 측면 17의 적어도 1종의 항체에 의해 TGF베타-2에 결합하는 것을 교차-차단하거나 또는 교차 차단된 항체 또는 그의 기능적 단편.
도 1: 용액 평형 적정 (SET) 방법 (섹터 이미저 6000(Sector Imager 6000) (MSD))을 사용하여 수득된, 인간 재조합 TGF-β2 상에 결합하는 TGF-β2-특이적 AB MOR13436의 농도-반응 곡선을 보여주고 있다. KD 친화도 결정은 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Friquet et al., J Immnunol Meth 77, 305-319. 1985). SET 방법의 감도 및 정확도를 개선시키기 위해, 전형적 ELISA에서 ECL 기반 기술로 바꾸었다 (Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184. 2005).
도 2: 용액 평형 적정 (SET) 방법 (섹터 이미저 6000 (MSD))을 사용하여 수득된, 인간 재조합 TGF-β2 및 마우스 재조합 TGF-β2 상의 TGF-β2-특이적 AB (A) MOR14799, (B) MOR14800, (C) MOR14797 및 (D) MOR14809의 농도-반응 곡선을 보여주고 있다. Kd 친화도 결정은 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Friquet et al., J Immnunol Meth 77, 305-319. 1985). SET 방법의 감도 및 정확도를 개선시키기 위해, 전형적 ELISA에서 ECL 기반 기술로 바꾸었다 (Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184. 2005).
도 3: TGF-β2-특이적 AB MOR13436의 생물학적 "중화" 활성을 보여주고 있다. 인산화된 Smad-2 및 Smad-3에 특이적인 루시페라제 리포터 검정인 HEK293T/17 CAGA-12 (HEK293T-RGA)에서의 재조합 인간 TGF-β2, 마우스 TGF-β2, 인간 TGF-β3 및 인간 TGF-β1의 효과에 대한 항체의 농도-반응 곡선이 제시된다. 재조합 TGF-β는 CAGA-12 리포터에 결합하고 루시페라제 유전자 발현을 유발하는 Smad-2 및 Smad-3 인산화를 유도한다. MOR13436은 재조합 인간 및 마우스 TGF-β2를 중화시키나, 인간 TGF-β1 및 TGF-β3을 중화시키지는 않는다. IgG 항체 MOR03207은 음성 대조군으로서의 역할을 한다. MOR03207은 인간 선천성 면역계의 일부인 효소를 인식한다.
도 4: TGF-β2-특이적 AB MOR14799, MOR14800, MOR14797 및 MOR14809의 생물학적 "중화" 활성을 보여주고 있다. 인산화된 Smad-2 및 Smad-3에 특이적인 루시페라제 리포터 검정인 HEK293T/17 CAGA-12 (HEK293T-RGA)에서의 다양한 재조합 인간 TGF-β 패밀리 단백질: 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, GDF-11, 미오스타틴, TGF-b2 및 TGF-b3의 효과에 대한 AB의 농도-반응 곡선이 제시된다. 재조합 TGF-β는 CAGA-12 리포터에 결합하고 루시페라제 유전자 발현을 유발하는 Smad-2 및 Smad-3 인산화를 유도한다. 모든 AB는 재조합 인간 TGF-β2를 중화시키나, 임의의 다른 TGF-β 단백질 패밀리 구성원을 중화시키지는 않는다. IgG 항체 MOR03207 (100 nM 및 33.3 nM에서 평가됨)은 음성 대조군으로서의 역할을 한다. MOR03207은 인간 선천성 면역계의 일부인 효소를 인식한다.
도 5: TGF-β2-특이적 AB MOR13436의 생물학적 "중화" 활성을 보여주고 있다. 재조합 인간 TGF-β2 (●), 마우스 TGF-β2 (■) 및 인간 TGF-β3 (◆)에 의한 인간 골격근 세포 (skMC) 분화의 억제를 상쇄시키는 AB의 농도-반응 곡선이 제시된다. 세포를 최대 120시간까지 분화시키고, 널리 확립된 골격근 세포 분화 마커인 크레아틴 키나제 (CK) 활성을 측정하였다. 모든 TGF-β는 CK 활성을 억제하고, Ab는 TGF-β2 반응을 상쇄시키나 TGF-β3 반응을 상쇄시키지는 않는다.
도 6: TGF-β2-특이적 AB (A) MOR14799, (B) MOR14800, (C) MOR14797 및 (D) MOR14809의 생물학적 "중화" 활성을 보여주고 있다. 재조합 인간 TGF-β2 (●), 마우스 TGF-β2 (■) 및 인간 TGF-β3 (◆)에 의한 인간 골격근 세포 (skMC) 분화의 억제를 상쇄시키는 AB의 농도-반응 곡선이 제시된다. 세포를 최대 120시간까지 분화시키고, 널리 확립된 골격근 세포 분화 마커인 크레아틴 키나제 (CK) 활성을 측정하였다. 모든 TGF-β는 CK 활성을 억제하고, Ab는 TGF-β2 반응을 상쇄시키나 TGF-β3 반응을 상쇄시키지는 않는다.
도 7: TGF-β2-특이적 AB MOR14797 또는 범-TGF-β 항체 1D11과 함께 7일 동안 배양된 듀피트렌 환자 샘플에서의 콜라겐 I 단백질에 대한 면역염색을 정량화하는 막대 그래프를 보여주고 있다. 환자 조직을 슬라이싱하고, 7일 동안 Ab의 존재 하에 배양한 다음, 콜라겐 I에 대해 면역염색하였다.
도 8: 이소형 대조군 (A/C)에 비해 TGF-β2-특이적 AB MOR14797 (B/D)과 함께 7일 동안 배양된 2개의 상이한 듀피트렌 환자 샘플에서의 콜라겐 I 단백질에 대한 면역염색을 보여주고 있다. 환자 1로부터의 결과가 A/B에, 및 환자 2로부터의 결과가 C/D에 제시된다. 환자 조직을 슬라이싱하고, 7일 동안 Ab의 존재 하에 배양한 다음, 콜라겐 I에 대해 면역염색하였다.
도 9: TGF-β2-특이적 AB MOR13436으로 치료된 일측성 요관 폐쇄 모델 (UUO)로부터의 마우스 신장에서의 콜라겐 I 단백질에 대한 mRNA 발현을 정량화하는 막대 그래프를 보여주고 있다. 모의- 또는 UUO-수술된 동물을 14일 동안 Ab로 치료하고, 신장을 꺼내고, mRNA를 단리하고, qPCR에 의해 분석하였다.
도 10: TGFβ-2에 결합하는 MOR14797의 에피토프: (A) TGFβ-2 이량체에 결합하는 2종의 MOR14797 Fab의 전체 구조. MOR14797은 표면으로서, TGFβ-2는 리본으로서 제시된다. (B) MOR14797에 대해 5 Å 거리 내에 있는 TGFβ-2 이량체의 잔기가 스틱으로서 제시된다.
도 11: TGFβ-2에 결합하는 MOR14797의 파라토프: MOR14797 VH (A) (출현 순서로, 각각 서열식별번호: 67 및 67) 및 VL (B) (출현 순서로, 각각 서열식별번호: 77 및 77)의 서열이 열거된다. CDR 루프 (카바트 및 코티아 정의 둘 다)가 박스표시된다. TGFβ-2 이량체에 대해 5 Å 거리 내에 있는 MOR14797의 잔기가 회색으로 음영표시된다.
일반적 정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
포함하는: 용어 "포함하는"은 "포함한"을 의미하며, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 X로만 이루어질 수 있거나 또는 추가의 것, 예를 들어 X + Y를 포함할 수 있다.
용어 "인간 TGF-β 이소형"은 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 슈퍼패밀리의 구성원, 즉 각각 인간 TGF-β 이소형 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3을 기재하는 데 사용된다. 용어 "인간 TGF-β 이소형 TGF-β2", "TGF-β2 이소형", "TGFβ2" 및 "TGF-β2" 및 TGF베타-2는 본 개시내용 전반에 걸쳐 동의어로 사용된다.
본원에 지칭된 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉 "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. 자연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 더 보존되어 있는 영역 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, 항원-결합 부분에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 TGF베타-2 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음).
본원에 사용된 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비 (즉 Kd/Ka)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 몰 농도 (M)로 표시된다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 비아코어®의 바이오센서 시스템 또는 용액 평형 적정 (SET)이다 (문헌 [Friguet B et al. (1985) J. Immunol Methods; 77(2): 305-319, 및 Hanel C et al. (2005) Anal Biochem; 339(1): 182-184] 참조). 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되고, 본원에 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 10의 지수를 표기하는 것에 대한 상이한 과학적 표기법이 사용된다. 과학적 E 표기법 (예를 들어, 1.1E-15)은 10의 지수를 표기하는 것에 대한 대안으로서 사용된다. 예를 들어, 0.000000001 몰은 3.0 x 10-9 몰로서 또는 3.0E-9 몰로서 표기될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포성 세포독성" 활성은 인간 B 세포 고갈 활성을 지칭한다. ADCC 활성은 관련 기술분야에 공지된 인간 B 세포 고갈 검정에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 게다가, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 형태, 또는 예를 들어 문헌 [Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86)]에 기재된 바와 같은 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이; 또는 인간화 항체).
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG 예컨대 IgG1 또는 IgG2)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "암"은 조직병리학적 유형 또는 침습 병기에 관계없이, 모든 유형의 암성 성장 또는 종양원성 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직, 또는 기관을 포함하는 것으로 의도된다. 암성 장애의 예는 고형 종양, 혈액암, 연부 조직 종양 및 전이성 병변을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 고형 종양의 예는 다양한 기관계의 악성종양, 예를 들어 육종 및 암종 (선암종 및 편평 세포 암종 포함), 예컨대 간, 폐, 유방, 림프성, 위장 (예를 들어, 결장), 비뇨생식관 (예를 들어, 신장, 요로상피 세포), 전립선 및 인두에 영향을 미치는 것들을 포함한다. 선암종은 악성종양 예컨대 대부분의 결장암, 직장암, 신세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암을 포함한다. 편평 세포 암종은, 예를 들어 폐, 식도, 피부, 두경부 영역, 구강, 항문 및 자궁경부에서의 악성종양을 포함한다. 한 실시양태에서, 암은 흑색종, 예를 들어, 진행 병기 흑색종이다. 상기 언급된 암의 전이성 병변은 또한 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다.
본원에 개시된 항체 분자를 사용하여 성장을 억제할 수 있는 예시적인 암은 전형적으로 면역요법에 반응성인 암을 포함한다. 치료를 위한 바람직한 암의 비제한적 예는 흑색종 (예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 신암 (예를 들어, 투명 세포 암종), 전립선암 (예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 유방암, 결장암 및 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐암)을 포함한다. 추가적으로, 불응성 또는 재발성 악성종양이 본원에 기재된 항체 분자를 사용하여 치료될 수 있다.
치료될 수 있는 다른 암의 예는 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위-식도, 위암, 지방육종, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 메르켈 세포암, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병 (급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 포함), 소아기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양암, 편평 세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유발된 것을 포함한 환경적으로 유발된 암 (예를 들어, 중피종), 및 상기 암의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 피부암, 예를 들어, 메르켈 세포 암종 또는 흑색종이다. 한 실시양태에서, 암은 메르켈 세포 암종이다. 다른 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암 (TNBC) 또는 HER2-음성 유방암이다. 다른 실시양태에서, 암은 신장암, 예를 들어, 신세포 암종 (예를 들어, 투명 세포 신세포 암종 (CCRCC) 또는 비-투명 세포 신세포 암종 (nccRCC))이다. 다른 실시양태에서, 암은 갑상선암, 예를 들어, 역형성 갑상선 암종 (ATC)이다. 다른 실시양태에서, 암은 신경내분비 종양 (NET), 예를 들어, 비정형 폐 카르시노이드 종양, 또는 췌장, 위장 (GI) 관 또는 폐에서의 NET이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐암, 예를 들어, 비소세포 폐암 (NSCLC) (예를 들어, 편평 NSCLC 또는 비-편평 NSCLC)이다.
본원에 사용된 용어 "프로그램화된 사멸 1" 또는 "PD-1"은, 예를 들어 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, Treg 및 B 세포 상에 발현된 CD28/CTLA-4 패밀리 구성원과 관련된다. 이는 이펙터 T 세포 신호전달 및 기능을 음성 조절한다. PD-1은 종양-침윤 T 세포 상에서 유도되고, 기능적 소진 또는 기능장애를 일으킬 수 있다 (Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704; Pardoll et al. (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64). PD-1은 그의 2개의 리간드 중 어느 하나, 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 또는 프로그램화된 사멸-리간드 2 (PD-L2)에 대한 결합 시에 공동억제 신호를 전달한다. PD-L1은 T 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 수지상 세포 (DC), B 세포, 상피 세포, 혈관 내피 세포를 포함한 다수의 세포 유형, 뿐만 아니라 많은 유형의 종양 상에서 발현된다. 뮤린 및 인간 종양 상에서의 PD-L1의 높은 발현은 다양한 암에서의 불량한 임상 결과와 연관되었다 (Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704; Pardoll et al. (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64). PD-L2는 수지상 세포, 대식세포 및 일부 종양 상에서 발현된다. PD-1 경로의 차단은 암 면역요법에 대해 전임상적으로 및 임상적으로 승인되었다. 전임상 및 임상 연구 둘 다는 항-PD-1 차단이 이펙터 T 세포의 활성을 회복시킬 수 있고 강력한 항종양 반응을 일으키는 것을 입증하였다. 예를 들어, PD-1 경로의 차단은 소진/기능장애 이펙터 T 세포 기능 (예를 들어, 증식, IFN-γ 분비 또는 세포용해 기능)을 회복시키고/거나 Treg 세포 기능을 억제할 수 있다 (Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704; Pardoll et al. (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64). PD-1 경로의 차단은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 항체, 그의 항원 결합 단편, 이뮤노어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드를 사용하여 실시될 수 있다. PD-1, 예를 들어, 인간 PD-1의 아미노산 서열은 관련 기술 분야, 예를 들어, 문헌 [Shinohara T et al. (1994) Genomics 23(3):704-6; Finger LR, et al. Gene (1997) 197(1-2):177-87]에 공지되어 있다.
본 발명의 다양한 정의 및 측면은 하기 서브섹션에 추가로 상세하게 제공/기재된다.
발명의 상세한 설명
특유의 기능과 연관된 여러 고도로 상동인 표적 중 1종의, 인간 모노클로날 항체를 사용한 특이적 중화가 주요 도전과제로 남아있다. 이 도전과제는 다른 상동 표적과의 교차-반응성이 유해하거나 원치 않는 사건과 연관될 수 있는 경우의 치료 상황에서 보다 더 명백하다. 이러한 문제는 상동 이소형 TGF-β1 및 TGF-β3의 존재로 인해 인간 모노클로날 항체를 사용하여 TGF-β2를 표적화하는 경우에 발생할 수 있다. 이들 TGF-β 이소형은 녹아웃 마우스로부터의 실험 데이터에 따라 특유의 기능과 연관된다. 또한, TGF-β1의 억제는 유해 사건의 높은 위험과 연관되는 것으로 알려져 있다. 게다가, 본 발명자들은 본원에서 TGF-β3 및 TGF-β2의 동시 억제가 동물 모델에서, 심장 판막의 심각한 장애인 판막증과 연관된다는 인식되지 않은 문제를 개시한다. 이는 TGF-β2를 특이적으로 중화시키나 TGF-β3 또는 TGF-β3 및 TGF-β1을 중화시키지는 않는 모노클로날 치료 항체를 제공하기 위한, 지금까지 미해결된 필요를 생성한다. 보다 구체적으로, 임상 세팅에서 효과적일 매우 낮은 피코몰 해리 상수를 나타내는 항-TGF-β2 항체의 중화에 대한 필요가 존재한다. 또한, 높은 결합 친화도를 갖는 항-TGF-β2 항체를 중화시키는 것은 이들이 유해 사건과 연관될 수 있는 다른 경로에 의한 간섭을 유발할 가능성이 더 작은 보다 낮은 용량으로 투여될 필요가 있으므로, 증진된 효능 및 안전성과 연관된다. 게다가, 보다 낮은 용량의 모노클로날 항-TGF-β2 항체의 투여는 또한 보다 낮은 비용과 연관된다. 이러한 문제가 본 발명에 의해 해결된다.
TGF-베타1/2/3 이소형의 중화가 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에서 결정된다. 용어 "중화 항체" 및 "길항작용 항체"는 동의어로 사용되고, Smad 의존성 리포터 유전자 검정에서의 TGF베타-1,-2 및/또는 -3 유도된 신호전달 활성을 100nM 이하의 IC50으로 억제하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명의 문맥에서 사용된 어구 "인간 TGF-β 이소형 TGF-β2를 중화시키고 인간 이소형 TGF-β3을 중화시키지 않는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편" 또는 "TGF-β2를 특이적으로 중화시키나 TGF-β3 또는 TGF-β1 (또는 TGF-β3 및 TGF-β1 둘 다)을 중화시키지는 않는다"는 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의한 결정 시에, TGF-β2를 150pM 미만의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 특이적으로 중화시키나 인간 TGF-β1 및/또는 TGF-β3을 중화시키지는 않는 (예를 들어, 인간 TGF-β1 및/또는 TGF-β3에 대해 100nM 초과의 IC50을 갖는) 인간 모노클로날 항체를 지칭한다. 결과적으로, 본 개시내용의 인간 TGF-β2 중화 항체는 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의한 결정 시에, 인간 TGF-β2를 예를 들어 107pM 미만의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키고 인간 TGF-β1 및/또는 TGF-β3을 100nM 초과의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시킨다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 TGF-β2 중화 항체는 인간 TGF-β2를 예를 들어 107pM 미만의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키고, 인간 TGF-β1 및/또는 TGF-β3을 중화시키지 않는데, 이는 상기 항체가 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에서 이들 단백질에 대한 본질적으로 검출불가능한 결합을 나타내기 때문이다.
본원에 사용된 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 내에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유된 기능에 대해 시험될 수 있다.
"교차-반응"하는 항체는 1종 초과의 항원에 결합하는 항체를 지칭하며, 여기서 상기 결합은 상기 항원(들)의 활성의 조작 (중화, 감소 또는 활성화)을 일으킬 수 있으나 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 교차 반응성은 Smad 의존성 리포터 유전자 검정을 사용하여, 및 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어® 시스템, 또는 용액 평형 적정을 사용하여 결정될 수 있는 KD를 결정함으로써 결정될 수 있다.
"인간 TGF-β 이소형 TGF-β2에 결합하고 인간 이소형 TGF-β3 또는 TGF-β1 또는 TGF-β3 및 TGF-β1과 결합 (교차 반응)하지 않는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편"은 또한 TGF-β2에 약 1pM 이하의 KD로, 및 TGF-β1 또는 TGF-β3에 약 2 x 10-9 M 또는 약 5 x 10-9 M 또는 약 10 x 10-9 M 또는 그 초과의 KD로 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, TGF-β3 및 TGF-β1 항원과 교차-반응하지 않는 이러한 항체는 실제로 표준 결합 검정에서 이들 단백질에 대한 본질적으로 검출불가능한 결합을 나타낸다.
예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 및 방사선면역검정 (RIA)을 포함한, 다양한 종의 TGF-β2에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적합한 검정이 실시예 섹션에 상세하게 기재된다. 항체의 결합 친화도는 또한 관련 기술분야에 공지된 표준 검정, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어® 시스템 분석) 또는 용액 평형 적정에 의해 평가될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명 기반 기술 예컨대 비아코어® 시스템은 결합 친화도의 계산을 가능하게 하는 결합 동역학을 결정할 수 있다. TGF-β2의 기능적 특성에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 검정은 실시예 섹션에 추가로 상세하게 기재된다.
본 발명은 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 보다 특히, 이는 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2 (서열식별번호: 122) (유니프롯(UniProt) ID: P61812 - TGFB2_HUMAN (http://www.uniprot.org/); HUGO 유전자 명명 위원회(HUGO Gene Nomenclature Committee) (HGNC)에 의해 승인된 유전자 기호=TGFB2; HGNC ID= HGNC:11768)를 중화시키고, 인간 이소형 TGF-β3 (서열식별번호: 123) (유니프롯 ID: P10600 - TGFB3_HUMAN; 유전자 기호 HGNC=TGFB3; HGNC ID= HGNC:11769)을 중화시키지 않는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2를 중화시키고 인간 이소형 TGF-β3 및 TGF-β1 (서열식별번호: 121) ((유니프롯 ID: P01137 - TGFB1_HUMAN; 유전자 기호 HGNC=TGFB1; HGNC ID= HGNC:11766)을 중화시키지 않는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 항체 또는 그의 기능적 단편에 의한 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3 중화는 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의해 결정된다. 바람직하게는, 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 그의 기능적 단편은 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의한 결정 시에, 인간 TGF-β2를 150pM 미만, 또는 107pM 미만, 또는 100pM 미만, 또는 95pM 미만, 또는 80pM 미만, 또는 30pM 미만, 또는 20pM 미만, 또는 10pM 미만의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키고, 인간 TGF-β1 또는 TGF-β3을 중화시키지 않는다 (100nM 초과의 IC50을 가짐). 본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 기능적 단편은 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의한 결정 시에, 인간 TGF-β2를 약 1pM 내지 약 150pM, 또는 약 1pM 내지 약 107pM, 또는 약 1pM 내지 약 95pM, 또는 약 1pM 내지 약 80pM의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키고, 인간 TGF-β1 또는 TGF-β3을 중화시키지 않는다 (100nM 초과의 IC50을 가짐).
본 발명은 또한 인간 이소형 TGF-β1 및/또는 TGF-β3보다 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2에 우선적으로 결합하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 특히, 제공된 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 TGF-β3에 대한 그의 해리 상수보다 적어도 약 70배, 약 1000배, 약 2000배, 약 10000배, 약 20000배, 약 200000배, 약 300000배, 약 1000000배 또는 약 6000000배 더 낮은 해리 상수로 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2에 결합하며, 여기서 항체 또는 그의 기능적 단편은 인간 TGF-β2를 중화시키나 TGF-β3을 중화시키지는 않는다.
한 실시양태에서, 인간 TGF-β2에 대한 제공된 항체의 해리 상수는 TGF-β1 또는 TGF-β3에 대한 그의 해리 상수보다 약 2000배 내지 약 1000000배 더 낮다. 또 다른 실시양태에서, 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 TGF-β3에 대한 그의 해리 상수보다 적어도 2000배 또는 적어도 1000000배 더 낮은 해리 상수로 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2에 결합하며, 여기서 항체는 인간 TGF-β2를 중화시키나 TGF-β3을 중화시키지는 않는다. 항체의 결합 친화도는 또한 본원에 개시된 표준 검정, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어® 시스템 분석) 또는 용액 평형 적정에 의해 평가될 수 있다. 인간 이소형 TGF-β1 및 TGF-β3보다 인간 TGF-β2에 우선적으로 결합하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 약 1pM 이하, 또는 약 100fM 이하, 또는 약 50fM 이하의 해리 상수 (KD)로 TGF-β2에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 개시된 항체 또는 기능적 단편은 1pM 이하 또는 약 1pM 내지 약 10fM의 해리 상수 (KD)로 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 인간 TGF-β 이소형 TGF-β3에 대한 그의 해리 상수보다 적어도 70배 더 낮은 해리 상수로 인간 TGF-β 이소형 TGF-β3보다 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2에 우선적으로 결합하며, 여기서 항체는 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2를 중화시키나 인간 TGF-β 이소형 TGF-β3을 중화시키지는 않고, 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2에 1pM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 TGF-β1 및 TGF-β3에 대한 그의 해리 상수보다 적어도 70배 더 낮은 해리 상수로 인간 TGF-β1 및 TGF-β3보다 인간 TGF-β2에 우선적으로 결합하며, 여기서 항체는 인간 TGF-β2를 중화시키나 TGF-β3 및 TGF-β1을 중화시키지는 않고, 인간 TGF-β2에 1pM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합한다.
본원에 기재된 바와 같은 항-TGF-β2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단일 쇄 항체, Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, 또는 scFv 단편, 및/또는 IgG 이소형일 수 있다.
선행 기술 항체 중 어느 것도 특이성 및 선택성의 관점에서, 본원에 개시된 항체, 특히 항체 MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 또는 MOR14787과 매칭되지 않는다. 본 발명의 항체는 실시예에 기재된 바와 같은 단리되고 구조적으로 특징화된 인간 재조합 항체를 포함한다. 본 발명의 단리된 항체의 VH 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 7, 27, 47, 67, 87 및 107에 제시된다. 본 발명의 단리된 항체의 VL 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 17, 37, 57, 77, 97 및 117에 제시된다. 본 발명의 항체의 바람직한 전장 중쇄 아미노산 서열의 예는 각각 서열식별번호: 9, 29, 49, 69, 89 및 109에 제시된다. 본 발명의 항체의 바람직한 전장 경쇄 아미노산 서열의 예는 각각 서열식별번호: 19, 39, 59, 79, 99 및 119에 제시된다. 본 발명의 다른 항체는 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되었지만 상기 기재된 서열에 도시된 전장 중쇄 아미노산 서열과 적어도 80, 90, 95, 97 또는 99 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 추가로, 가변 중쇄 뉴클레오티드 서열은 각각 서열식별번호: 8, 28, 48, 68, 88 및 108에 제시된다. 가변 경쇄 뉴클레오티드 서열은 각각 서열식별번호: 18, 38, 58, 78, 98 및 118에 제시된다. 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 각각 서열식별번호: 20, 40, 60, 80, 100 및 120에 제시된다. 전장 중쇄 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 10, 30, 50, 70, 90 및 110에 제시된다. 본 발명의 다른 항체는 돌연변이되었지만 상기 기재된 서열과 적어도 90 이상 (즉 91, 92, 93, 94, 95, 97, 99 또는 그 초과) 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산 또는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태는 상기 기재된 서열에 도시된 가변 영역에 비해, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 가변 영역에서 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 이들 항체가 동일한 표적에 결합하므로, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열)은 본 발명의 다른 항-TGF-β2 항체를 생성하기 위해 "혼합 및 매칭"될 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 TGF-β2 결합은 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH/VL 쌍형성으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍형성으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 VH/VL 쌍형성으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍형성으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 7, 27, 47, 67, 87 및 107로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 17, 37, 57, 77, 97 및 117로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 단리된 재조합 항-TGF-β2 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도에 기여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 각각의 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 존재한다. 주어진 CDR의 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("카바트" 넘버링 스킴)]에 의해 기재된 것들을 포함한 다수의 널리 공지된 스킴 중 어느 것을 사용하여 결정될 수 있다. CDR 영역을 결정하는 대안적 방법은 코티아에 의해 고안된 방법을 사용한다 (Chothia et al. 1989, Nature, 342:877-883). 코티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 기초한다. CDR을 정의하기 위한 다른 시스템이 존재하고 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, http://www.bioinf.org.uk/abs/ 참조). CDR은 항원 인식 및 결합을 설명하고, 따라서 항원 결합 영역을 함유하는 것으로 가정된다. 본 개시내용의 문맥에서, CDR은 카바트 및 코티아 넘버링 시스템을 사용하여 정의되었다. 카바트 시스템을 사용하여 정의된 CDR은 "카바트 CDR"로 지정된다. 코티아 시스템을 사용하여 정의된 CDR은 "코티아 CDR"로 지정된다. 카바트 및 코티아 시스템을 사용하여 예측된 CDR은 주로 중첩하나 반드시 동일한 것은 아니다. 따라서, 항체 결합 영역은 또한 카바트 및 코티아 시스템에 의해 예측된 CDR 아미노산 서열을 병합함으로써 정의될 수 있다 ("카바트/코티아 CDR"). 실제로 항원에 결합하는 일부 아미노산 잔기가 CDR의 범위 밖에 있고, 결과적으로, X선 결정학 및 X선 회절 데이터가 또한 추가의 항체 결합 영역/아미노산 또는 파라토프 영역을 정의하는 데 사용될 수 있음이 알려져 있다.
용어 "항체 결합 영역", "항체 조합 부위" 및 "파라토프 영역"은 본 문헌 전반에 걸쳐 동의어로 사용되고, 특정한 항원과 상호작용하는 항체의 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역의 이들 부분을 지칭한다. 파라토프는 화학적 상호작용 (예를 들어, 극성-, 비-극성-, 수소-결합/-접촉 또는 염 가교)의 확립에 의해 항원에 결합하는 항체의 가변 영역에 포함되는 아미노산의 스트레치 또는 단일 아미노산으로 이루어진다. CDR (예를 들어, 카바트/코티아 시스템에 기초하여 예측됨)은 집합적으로 항체의 카바트/코티아 파라토프를 지칭한다. 본 개시내용의 문맥에서, 파라토프는 항체/항원 결합/조합에 수반되는 항체의 이들 아미노산 잔기로 이루어지며, 여기서 항원에 대해 5 Å 거리 내에 있는 아미노산은 항체/항원 결합에 수반되는 것으로 여겨진다. 파라토프는 카바트/코티아에 따라 정의된 CDR 아미노산뿐만 아니라 항체/항원 결합/조합에 수반되는 주어진 항체의 가변 경쇄 및/또는 중쇄 영역의 프레임워크 영역에 포함되는 아미노산을 포함할 수 있다. 카바트/코티아에 기초한 파라토프 예측 이외에, 주어진 항체의 완전 파라토프가 X선 결정학/X선 회절 데이터를 사용하여 확인될 수 있다.
항체의 문맥에서 사용되는 경우의 어구 "그의 기능적 단편"은 항원-결합 영역을 포함하는 전장 항체의 단백질 단편 (단일 쇄 항체, Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편 및/또는 scFv 단편)을 지칭하며, 여기서 (i) 상기 단편은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하거나 또는 (ii) 상기 기능적 단편의 또 다른 항체 또는 항체 유사 구조에 대한 전달/융합 (서열 대체) 시, 항원 (예를 들어, TGF베타-2의 부분)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 항체의 "기능적 단편"의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 게다가, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들로 하여금 VL 및 VH 영역이 쌍형성하여 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 생성되도록 하는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "기능적 단편" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
한 측면에서, 본 개시내용의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 카바트 또는 코티아에 의해, 또는 카바트 및 코티아에 의해 정의된 하기 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다
(i) 서열식별번호: 1-3, 11-13, 21-23, 31-33, 41-43, 51-53, 61-63, 71-73, 81-83, 91-93, 101-103 또는 111-113에 열거된 카바트 CDR, 또는
(ii) 서열식별번호: 4-6, 14-16, 24-26, 34-36, 44-46, 54-56, 64-66, 74-76, 84-86, 94-96, 104-106 또는 114-116에 열거된 코티아 CDR, 또는
(iii) 서열식별번호: 124-129에 열거된 카바트/코티아 CDR.
본 개시내용의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 1, 21, 41, 61, 81, 101 또는 4, 24, 44, 64, 84, 104 또는 124-129로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 2, 22, 42, 62, 82, 102 또는 5, 25, 45, 65, 85, 105로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 3, 23, 43, 63, 83, 103 또는 6, 26, 46, 66, 86, 106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 11, 31, 51, 71, 91, 111 또는 14, 34, 54, 74, 94, 114로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 12, 32, 52, 72, 92, 112 또는 15, 35, 55, 75, 95, 115로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 13, 33, 53, 73, 93, 113 또는 16, 36, 56, 76, 96, 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
본 개시내용의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 7, 27, 47, 67, 87 또는 107 중 적어도 1개와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 17, 37, 57, 77, 97 또는 117 중 적어도 1개와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 7, 27, 47, 67, 87 또는 107 중 적어도 1개와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 서열 및 서열식별번호: 17, 37, 57, 77, 97 또는 117 중 적어도 1개와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함한다.
통상의 기술자는 2개의 DNA 또는 단백질 서열의 동일성을 평가하는 데 사용될 수 있는 방법을 인지한다. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적으로 정렬한다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭을 도입할 수 있고, 비-상동 서열은 비교 목적상 무시될 수 있음). 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램 내로 혼입된 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) (((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) 알고리즘을 사용하여 결정된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70 또는 80, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다. 특히 바람직한 파라미터 세트 (및 달리 명시되지 않는 한 사용되어야 하는 것)는 갭 페널티 12, 갭 연장 페널티 4, 및 프레임시프트 갭 페널티 5를 사용하는 블로섬 62 점수화 매트릭스이다. 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 얼라인(ALIGN) 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 이. 메이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller) ((1989) CABIOS, 4:11-17)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 (서열식별번호: 1) 분자에 대해 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 워드길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 대해 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 워드길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭드(Gapped) BLAST가 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
본 개시내용의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 1, 21, 41, 61, 81, 101 또는 4, 24, 44, 64, 84, 104 또는 124-129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 2, 22, 42, 62, 82, 102 또는 5, 25, 45, 65, 85, 105로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 3, 23, 43, 63, 83, 103 또는 6, 26, 46, 66, 86, 106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 11, 31, 51, 71, 91, 111 또는 14, 34, 54, 74, 94, 114로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 12, 32, 52, 72, 92, 112 또는 15, 35, 55, 75, 95, 115로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 13, 33, 53, 73, 93, 113 또는 16, 36, 56, 76, 96, 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
각각의 이들 항체가 TGF-β2에 결합할 수 있기 때문에, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"된다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 TGF-β2 결합은 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭된 경우, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭된 경우, 특정한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있음이 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (A) 서열식별번호: 1의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 2의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 3의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 11의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 12의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 13의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 (A)의 항체는 서열식별번호: 124의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (B) 서열식별번호: 4의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 5의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 6의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 14의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 15의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 16의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 (B)의 항체는 서열식별번호: 124의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 (C): 서열식별번호: 1, 2 및 3의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 11, 12 및 13의 CDR을 포함하는 가변 경쇄로 이루어지며, 여기서 상기 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 7의 가변 중쇄 (VH) 서열의 프레임워크 영역 및 서열식별번호: 17의 가변 경쇄 (VL) 서열의 프레임워크 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 (D): 서열식별번호: 4, 5 및 6의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 14, 15 및 16의 CDR을 포함하는 가변 경쇄로 이루어지며, 여기서 상기 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 7의 가변 중쇄 (VH) 서열의 프레임워크 영역 및 서열식별번호: 17의 가변 경쇄 (VL) 서열의 프레임워크 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 (E): 서열식별번호: 61, 62 및 63의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 71, 72 및 73의 CDR을 포함하는 가변 경쇄로 이루어지며, 여기서 상기 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 67의 중쇄 서열 (VH)의 프레임워크 영역 및 서열식별번호: 77의 경쇄 서열 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (F) 서열식별번호: 61의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 62의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 63의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 71의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 72의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 73의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (F)는 서열식별번호: 127의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (F2) 서열식별번호: 61의 중쇄 가변 도메인 CDR1; 서열식별번호: 62의 중쇄 가변 도메인 CDR2; 서열식별번호: 63의 중쇄 가변 도메인 CDR3; 서열식별번호: 71의 경쇄 가변 도메인 CDR1; 서열식별번호: 72의 경쇄 가변 도메인 CDR2; 및 서열식별번호: 73의 경쇄 가변 도메인 CDR3을 포함하며, 여기서 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (F2)는 서열식별번호: 127의 중쇄 가변 도메인 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (G): (i) 서열식별번호: 61, 62 및 63의 CDR 및 (ii) 위치 1에서의 아미노산 Q 및 위치 99에서의 아미노산 R을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (iii) 서열식별번호: 71, 72 및 73의 CDR 및 (iv) 위치 49에서의 아미노산 F를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 서열 (VH) 및 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인 서열 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 여기서 (ii) 및 (iv)에 언급된 아미노산의 위치는 각각 서열식별번호: 67 및 77의 위치 1, 99 및 49에 상응한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (H) 서열식별번호: 64의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 65의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 66의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 74의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 75의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 76의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (H)는 서열식별번호: 127의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (H1) 서열식별번호: 64의 중쇄 가변 도메인 CDR1; 서열식별번호: 65의 중쇄 가변 도메인 CDR2; 서열식별번호: 66의 중쇄 가변 도메인 CDR3; 서열식별번호: 74의 경쇄 가변 도메인 CDR1; 서열식별번호: 75의 경쇄 가변 도메인 CDR2; 및 서열식별번호: 76의 경쇄 가변 도메인 CDR3을 포함하며, 여기서 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (H1)는 서열식별번호: 127의 중쇄 가변 도메인 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (H2): (i) 서열식별번호: 64, 65 및 66의 CDR 및 (ii) 위치 1에서의 아미노산 Q 및 위치 99에서의 아미노산 R을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (iii) 서열식별번호: 74, 75 및 76의 CDR 및 (iv) 위치 49에서의 아미노산 F를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 여기서 (ii) 및 (iv)에 언급된 아미노산의 위치는 각각 서열식별번호: 67 및 77의 위치 1, 99 및 49에 상응한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (I): 하기 아미노산: (i) 위치 1에서의 Q, 위치 31에서의 T, 위치 32에서의 S, 위치 34에서의 M, 위치 55에서의 W, 위치 56에서의 N, 위치 58에서의 D, 위치 99에서의 R, 위치 101에서의 F, 위치 102 및 103에서의 Y, 위치 104에서의 S, 위치 106에서의 Y 및 위치 108에서의 D를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 하기 아미노산: (ii) 위치 32에서의 Y, 위치 49에서의 F, 위치 53에서의 S, 위치 54에서의 L, 위치 55에서의 Q, 위치 56에서의 S, 위치 91에서의 T, 위치 92에서의 N 및 위치 93에서의 T를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 여기서 (i) 및 (ii)에 언급된 아미노산의 위치는 각각 서열식별번호: 67의 위치 1, 31, 32, 34, 55, 56, 58, 99, 101, 102, 103, 104, 106 및 108 및 서열식별번호: 77의 위치 32, 49, 53, 54, 55, 56, 91, 92 및 93에 상응한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (I1): (i) TGF베타-2 이량체에 결합되는 경우 상기 항원에 대해 5 Å 거리 내에 있는 위치 1, 31, 32, 34, 55, 56, 58, 99, 101-104, 106 및 108에서의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 (ii) TGF베타-2 이량체에 결합되는 경우 항원에 대해 5 Å 거리 내에 있는 위치 32, 49, 53-56 및 91-93에서의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 (i) 및 (ii)에 언급된 아미노산의 위치는 각각 서열식별번호: 67의 위치 1, 31, 32, 34, 55, 56, 58, 99, 101-104, 106 및 108 및 서열식별번호: 77의 위치 32, 49, 53- 56, 91, 92 및 93에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (I2) 또는 그의 기능적 단편은 중쇄 가변 도메인의 위치 1, 31, 32, 34, 55, 56, 58, 99, 101-104, 106 및 108에서 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 단백질 내의 동일한 위치에 있는 것들과 동일한 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 도메인의 위치 32, 49, 53-56 및 91-93에서 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인 단백질 내의 동일한 위치에 있는 것들과 동일한 아미노산을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (I3) 또는 그의 기능적 단편은 중쇄 가변 도메인의 위치 1, 31, 32, 34, 55, 56, 58, 99, 101-104, 106 및 108에서 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 단백질 내의 동일한 위치에 있는 이들 아미노산과 유사한 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하고, 중쇄 가변 도메인의 위치 32, 49, 53-56 및 91-93에서 서열식별번호: 77의 중쇄 가변 도메인 단백질 내의 동일한 위치에 있는 이들 아미노산과 유사한 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (I4): 하기 아미노산: TGF베타-2 이량체에 결합되는 경우 항원에 대해 5 Å 거리 내에 있는 위치 1에서의 Q, 위치 31에서의 T, 위치 32에서의 S, 위치 34에서의 M, 위치 55에서의 W, 위치 56에서의 N, 위치 58에서의 D, 위치 99에서의 R, 위치 101에서의 F, 위치 102 및 103에서의 Y, 위치 104에서의 S, 위치 106에서의 Y 및 위치 108에서의 D를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 하기 아미노산: TGF베타-2 이량체에 결합되는 경우 항원에 대해 5 Å 거리 내에 있는 위치 32에서의 Y, 위치 49에서의 F, 위치 53에서의 S, 위치 54에서의 L, 위치 55에서의 Q, 위치 56에서의 S, 위치 91에서의 T, 위치 92에서의 N 및 위치 93에서의 T를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크는 각각 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (J) 서열식별번호: 21의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 22의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 23의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 31의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 32의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 33의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (J)는 서열식별번호: 125의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 (K): 서열식별번호: 21, 22 및 23의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 31, 32 및 33의 CDR을 포함하는 가변 경쇄로 이루어지며, 여기서 상기 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 29의 중쇄 서열 (VH)의 프레임워크 영역 및 서열식별번호: 39의 경쇄 서열 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (L) 서열식별번호: 21의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 22의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 23의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 31의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 32의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 33의 경쇄 가변 영역 CDR3; 및 서열식별번호: 131 및 132의 프레임워크 파라토프 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (L)는 서열식별번호: 125의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (M) 서열식별번호: 24의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 25의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 26의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 34의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 35의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 36의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (M)는 서열식별번호: 125의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (N) 서열식별번호: 24의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 25의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 26의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 34의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 35의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 36의 경쇄 가변 영역 CDR3; 및 서열식별번호: 131 및 132의 파라토프 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (N)는 서열식별번호: 125의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (O) 서열식별번호: 41의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 42의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 43의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 51의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 52의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 53의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (O)는 서열식별번호: 126의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 (P): 서열식별번호: 41, 42 및 43의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 51, 52 및 53의 CDR을 포함하는 가변 경쇄로 이루어지며, 여기서 상기 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 47의 중쇄 서열 (VH)의 프레임워크 영역 및 서열식별번호: 57의 경쇄 서열 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (Q) 서열식별번호: 44의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 45의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 46의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 54의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 55의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 56의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (Q)는 서열식별번호: 126의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (R) 서열식별번호: 81의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 82의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 83의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 91의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 92의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 93의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (R)는 서열식별번호: 128의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 (S): 서열식별번호: 81, 82 및 83의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 91, 92 및 93의 CDR을 포함하는 가변 경쇄로 이루어지며, 여기서 상기 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 87의 중쇄 서열 (VH)의 프레임워크 영역 및 서열식별번호: 97의 경쇄 서열 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (T) 서열식별번호: 84의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 85의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 86의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 94의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 95의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 96의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (T)는 서열식별번호: 128의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (U) 서열식별번호: 101의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 102의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 103의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 111의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 112의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 113의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (U)는 서열식별번호: 129의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 (V): 서열식별번호: 101, 102 및 103의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 111, 112 및 113의 CDR을 포함하는 가변 경쇄로 이루어지며, 여기서 상기 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 107의 중쇄 서열 (VH)의 프레임워크 영역 및 서열식별번호: 117의 경쇄 서열 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (W) 서열식별번호: 104의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 105의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 106의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 114의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 115의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 116의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 (W)는 서열식별번호: 129의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 기재된 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 (A) 내지 (W) 또는 그의 기능적 단편은 TGF-β1 또는 TGF-β3에 대한 그의 해리 상수보다 적어도 2,000배 더 낮은 해리 상수로 인간 TGF-β1 및 TGF-β3보다 우선적으로 인간 TGF-β2에 결합하며, 여기서 항체는 인간 TGF-β2를 중화시키나 TGF-β3을 중화시키지는 않고, 인간 TGF-β2에 1pM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 서열식별번호: 9, 29, 49, 69, 89 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 전장 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 서열식별번호: 19, 39, 59, 79, 99 및 119로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체는 서열식별번호: 9, 29, 49, 69, 89 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 전장 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 19, 39, 59, 79, 99 및 119로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은
(a) 서열식별번호: 7의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17의 가변 경쇄 서열; (b) 서열식별번호: 27의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 37의 가변 경쇄 서열; (c) 서열식별번호: 47의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 가변 경쇄 서열; (d) 서열식별번호: 67의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 77의 가변 경쇄 서열; (e) 서열식별번호: 87의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 97의 가변 경쇄 서열; 또는 (f) 서열식별번호: 107의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 117의 가변 경쇄 서열
을 포함하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편을 추가로 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 TGF-β1 또는 TGF-β3에 대한 그의 해리 상수보다 적어도 2,000배 더 낮은 해리 상수로 인간 TGF-β1 및 TGF-β3보다 인간 TGF-β2에 우선적으로 결합하며, 여기서 항체는 인간 TGF-β2를 중화시키나 TGF-β3을 중화시키지는 않고, 인간 TGF-β2에 1pM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합하며, 여기서 항체 또는 그의 기능적 단편은 (a) 서열식별번호: 7의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17의 가변 경쇄 서열; (b) 서열식별번호: 27의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 37의 가변 경쇄 서열; (c) 서열식별번호: 47의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 가변 경쇄 서열; (d) 서열식별번호: 67의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 77의 가변 경쇄 서열; (e) 서열식별번호: 87의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 97의 가변 경쇄 서열; 또는 (f) 서열식별번호: 107의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 117의 가변 경쇄 서열을 포함한다.
본 발명은
(a) 서열식별번호: 9의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 19의 경쇄 서열;
(b) 서열식별번호: 29의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 39의 경쇄 서열;
(c) 서열식별번호: 49의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 59의 경쇄 서열;
(d) 서열식별번호: 69의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 79의 경쇄 서열;
(e) 서열식별번호: 89의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 99의 경쇄 서열; 또는
(f) 서열식별번호: 109의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 119의 경쇄 서열
을 포함하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체를 추가로 제공한다.
MOR14799: 본원에서 MOR14799로 지칭되는 본 개시내용의 모노클로날 항체는 서열식별번호: 9의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 19의 경쇄 서열을 포함한다. MOR14799는 서열식별번호: 7의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17의 가변 경쇄 서열을 포함한다. MOR14799는 서열식별번호: 1의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 2의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 3의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 11의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 12의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 13의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, MOR14799는 서열식별번호: 124의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. MOR14799의 중쇄 및 중쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 10 및 8의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. MOR14799의 경쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 20 및 18의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 항체 MOR14799의 (i) hTGF베타-2에 대한 KD 값은 1.08E-15 M이고, (ii) TGF베타-1에 대한 검출가능한 결합이 없고, (iii) hTGF베타-3에 대한 KD 값은 1.99E-11 M이다 (표 4 참조). 이로부터, MOR14799의 TGFβ2에 대한 KD 값은 TGF베타 3에 대한 것보다 18000배 초과 더 낮음을 따른다. 심지어 MOR14799의 KD 값 측정의 보다 더 보존적인 해석을 적용하는 경우에도, 이러한 검정의 검출 한계에 밀접한 극도로 낮은 KD 값으로부터 생성되는 가능한 측정 부정확도를 고려하기 위해, 100fM 이하의 KD 값을 일치시킴으로써, MOR14799의 TGFβ2에 대한 KD 값은 TGF베타 3에 대한 것보다 여전히 200배 더 낮을 것이다. 이들 데이터는 문헌 [Thompson et al. (J Immunol Methods. 1999 Jul 30;227(1-2):17-29)]에 의해 공개된 데이터에 기초하여, 선행 기술 항체 CAT-152의 (i) hTGF베타-2에 대한 KD 값이 0.89nM이고, (ii) hTGF베타-3에 대한 KD 값이 10nM이기 때문에, 선행 기술 항체에 비한 MOR14799의 놀라운 우월성을 설명한다. 이로부터, CAT-152의 TGFβ2에 대한 KD 값은 TGF베타 3에 대한 것보다 단지 11배 더 낮음을 따른다. 본원에 제공된 실험 데이터에 기초하여, CAT-152의 TGFβ2에 대한 KD 값은 7.3E-11M이고, hTGF베타-3에 대한 KD 값은 1.18E-09M이며, 이는 TGF베타 3에 대한 것보다 단지 16배 더 낮은 CAT-152의 TGFβ2에 대한 KD 값을 생성한다.
본원에 제공된 실험 데이터에 기초하여, 1D11의 TGFβ2에 대한 KD 값은 1.17 E-10M이고, hTGF베타-3에 대한 KD 값은 2.0 E-11M이며, 이는 TGF베타 3에 대한 것보다 단지 17배 더 낮은 1D11의 TGFβ2에 대한 KD 값을 생성한다.
MOR14800: 본원에서 MOR14800으로 지칭되는 본 개시내용의 모노클로날 항체는 서열식별번호: 29의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 39의 경쇄 서열을 포함한다. MOR14800은 서열식별번호: 27의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 37의 가변 경쇄 서열을 포함한다. MOR14800은 서열식별번호: 21의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 22의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 23의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 31의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 32의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 33의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, MOR14800은 서열식별번호: 125의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. MOR14800의 중쇄 및 중쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 30 및 28의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. MOR14800의 경쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 40 및 38의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 항체 MOR14800의 (i) hTGF베타-2에 대한 KD 값은 4.34E-16 M (보존적 추정 100fM)이고, (ii) TGF베타-1에 대한 검출가능한 결합이 없고, (iii) TGF베타-3에 대한 검출가능한 결합이 없다 (표 4). 따라서, 항체 MOR14800은 TGF베타 1 또는 TGF베타 3과 어떠한 방식으로든 반응하지 않는다. 이들 데이터는 선행 기술 항체에 비한 MOR14800의 놀라운 우월성을 설명한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 모노클로날 항체 MOR14800은 서열식별번호: 21의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 22의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 23의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 31의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 32의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 33의 경쇄 가변 영역 CDR3; 및 서열식별번호: 131 및 132의 프레임워크 파라토프 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 항체 MOR14800은 서열식별번호: 125의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다.
MOR14809: 본원에서 MOR14809로 지칭되는 본 개시내용의 모노클로날 항체는 서열식별번호: 49의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 59의 경쇄 서열을 포함한다. MOR14809는 서열식별번호: 47의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 가변 경쇄 서열을 포함한다. MOR14809는 서열식별번호: 41의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 42의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 43의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 51의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 52의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 53의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 MOR14809는 서열식별번호: 126의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. MOR14809의 중쇄 및 중쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 50 및 48의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. MOR14809의 경쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 60 및 58의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 항체 MOR14809의 (i) hTGF베타-2에 대한 KD 값은 5.24E-14M (보존적 추정 100fM)이고; (ii) TGF베타-1에 대한 검출가능한 결합이 없고, (iii) TGF베타-3에 대한 검출가능한 결합이 없다 (표 4 참조). 따라서, 항체 MOR14809는 TGF베타- 1 또는 TGF베타-3과 어떠한 방식으로든 반응하지 않는다. 이들 데이터는 선행 기술 항체에 비한 MOR14809의 놀라운 우월성을 설명한다.
MOR14797: 본원에서 MOR14797로 지칭되는 본 개시내용의 모노클로날 항체는 서열식별번호: 69의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 79의 경쇄 서열을 포함한다. MOR14797은 서열식별번호: 67의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 77의 가변 경쇄 서열을 포함한다. MOR14797은 서열식별번호: 61의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 62의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 63의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 71의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 72의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 73의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 MOR14797은 서열식별번호: 127의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. MOR14797의 중쇄 및 중쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 70 및 68의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. MOR14797의 경쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 80 및 78의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 항체 MOR14797의 (i) hTGF베타-2에 대한 KD 값은 4.46E-15 M이고, (ii) TGF베타-1에 대한 검출가능한 결합이 없고, (iii) hTGF베타-3에 대한 KD 값은 2.74E-08 M이다 (표 4). 이로부터, MOR14797의 TGF베타-2에 대한 KD 값은 TGF베타-3에 대한 것보다 6백만 배 더 낮음을 따른다. 심지어 MOR14799의 KD 값 측정의 보다 더 보존적 해석을 적용하는 경우에도, 이러한 검정의 검출 한계에 밀접한 극도로 낮은 KD 값으로부터 생성되는 가능한 측정 부정확도를 고려하기 위해, 100fM 이하의 KD 값을 일치시킴으로써, MOR14797의 TGFβ2에 대한 KD 값은 TGF베타-3에 대한 것보다 여전히 270000배 더 낮을 것이다. 이들 데이터는 선행 기술 항체에 비한 MOR14797의 놀라운 우월성을 설명한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (i) 서열식별번호: 61, 62 및 63의 CDR 및 (ii) 위치 1에서의 아미노산 Q 및 위치 99에서의 아미노산 R을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (iii) 서열식별번호: 71, 72 및 73의 CDR 및 (iv) 위치 49에서의 아미노산 F를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 서열 (VH) 및 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인 서열 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 98% 서열 동일성을 가지며, 여기서 (ii) 및 (iv)에 언급된 아미노산의 위치는 각각 서열식별번호: 67 및 77의 위치 1, 99 및 49에 상응한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은 (i) 서열식별번호: 64, 65 및 66의 CDR 및 (ii) 위치 1에서의 아미노산 Q 및 위치 99에서의 아미노산 R을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (iii) 서열식별번호: 74, 75 및 76의 CDR 및 (iv) 위치 49에서의 아미노산 F를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 각각 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 프레임워크 영역과 적어도 98% 서열 동일성을 가지며, 여기서 (ii) 및 (iv)에 언급된 아미노산의 위치는 각각 서열식별번호: 67 및 77의 위치 1, 99 및 49에 상응한다.
MOR14805: 본원에서 MOR14805로 지칭되는 본 개시내용의 모노클로날 항체는 서열식별번호: 89의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 99의 경쇄 서열을 포함한다. MOR14805는 서열식별번호: 87의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 97의 가변 경쇄 서열을 포함한다. MOR14805는 서열식별번호: 81의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 82의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 83의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 91의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 92의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 93의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 MOR14805는 서열식별번호: 128의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. MOR14805의 중쇄 및 중쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 90 및 88의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. MOR14805의 경쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 100 및 98의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 항체 MOR14805의 (i) hTGF베타-2에 대한 KD 값은 9.70E-13M이고, (ii) TGF베타-1에 대한 검출가능한 결합이 없고, (iii) hTGF베타-3에 대한 KD 값은 7.05E-11M이다 (표 4 참조). 이로부터, MOR14805의 TGF베타-2에 대한 KD 값은 TGF베타-3에 대한 것보다 73배 더 낮음을 따른다. 이들 데이터는 선행 기술 항체에 비한 MOR14805의 놀라운 우월성을 설명한다.
MOR14787: 본원에서 MOR14787로 지칭되는 본 개시내용의 모노클로날 항체는 서열식별번호: 109의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 119의 경쇄 서열을 포함한다. MOR14787은 서열식별번호: 107의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 117의 가변 경쇄 서열을 포함한다. MOR14787은 서열식별번호: 101의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 102의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 103의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 111의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 112의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 113의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 MOR14787은 서열식별번호: 129의 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. MOR14787의 중쇄 및 중쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 110 및 108의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. MOR14787의 경쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열식별번호: 120 및 118의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 항체 MOR14787의 (i) hTGF베타-2에 대한 KD 값은 7.38E-16 M이고, (ii) TGF베타-1에 대한 검출가능한 결합이 없고, (iii) TGF베타-3에 대한 검출가능한 결합이 없다 (표 4 참조). 따라서, 항체 MOR14787은 TGF베타-1 또는 TGF베타-3과 어떠한 방식으로든 반응하지 않는다. 이들 데이터는 선행 기술 항체에 비한 MOR14787의 놀라운 우월성을 설명한다.
높은 결합 친화도/선택성을 갖는 항-TGF-β2 항체의 중화는 유해 사건과 연관될 수 있는 다른 경로에 의한 간섭을 유발할 가능성이 더 작다. 본 발명의 항체는 TGF베타 이소형 1 및 3에 결합하고/거나 이를 중화시키지 않는다. 게다가, 본 발명의 항체는 동일한 또는 관련된 대사 경로에서 활성인 다른 단백질에 결합하지 않는다. 특히, 본 발명의 항체는 인간 단백질 GDF-11, GDF-8, 액티빈 A, 액티빈 B 및 액티빈 A/B ("역-표적")에 결합하지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 또는 MOR14787에 관한 것이며, 여기서 상기 항체는 최대 100nM IgG 항체까지 역-표적 GDF-11, GDF-8, 액티빈 A, 액티빈 B 및 액티빈 A/B를 중화시키지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 이들 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체에 기초한 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 항체는 본 발명의 항-TGF베타-2 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 1-3, 11-13, 21-23, 31-33, 41-43, 51-53, 61-63, 71-73, 81-83, 91-93, 101-103, 111-113 및 124-129 또는 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 b) 서열식별번호: 4-6, 14-16, 24-26, 34-36, 44-46, 54-56, 64-66, 74-76, 84-86, 94-96, 104-106, 114-116 및 124-129 또는 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 재조합 항-TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 바람직하게는 이러한 항체는 하기 기능적 특성 중 적어도 1가지를 나타낸다: (i) Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의한 결정 시에 인간 TGF-β2를 150pM 미만, 또는 107pM 미만, 또는 100pM 미만, 또는 80pM 미만, 또는 30pM 미만, 또는 20pM 미만, 또는 10pM 미만의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키고 인간 TGF-β1 또는 TGF-β3을 100nM 초과의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키는 것, 또는 (ii) Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의한 결정 시에 인간 TGF-β2를 약 1pM 내지 약 150pM, 또는 약 1pM 내지 약 107pM, 또는 약 1pM 내지 약 80pM의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키고 인간 TGF-β1 또는 TGF-β3을 100nM 초과의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키는 것. 이러한 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
다른 실시양태에서, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 가지며, 여기서 이들 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기초한 명시된 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 항-TGF베타-2 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 서열식별번호: 9, 29, 49, 69, 89 및 109의 전장 중쇄 서열 및 서열식별번호: 19, 39, 59, 79, 99 또는 119의 전장 경쇄 서열로 이루어진 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 단리된 모노클로날 항-TGF베타-2 항체를 제공하며, 여기서 보존적 변형은 상기 서열 내에 도입되었다. 다양한 실시양태에서, 항체는 상기 열거된 기능적 특성 중 하나 또는 둘 다를 나타낼 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편은, 특히 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 이소형의 인간 중쇄 불변 영역으로부터 선택되는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 이소형일 수 있다. 본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG 예컨대 IgG1 또는 IgG2)를 지칭한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 기능적 단편은 Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 가질 수 있다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1 이소형이고, Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 변경된 이펙터 기능은 감소된 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성이다. 한 실시양태에서, 상기 변경된 이펙터 기능은 침묵화된 ADCC 및 CDC 활성이다. 항체는 또한 침묵 IgG1LALA 포맷으로 전환될 수 있으며, 여기서 위치 234 및 235에서의 류신은 알라닌으로 돌연변이되어 FcRγ 결합을 제거하고 이펙터 기능을 약화시켰다. 항체 불변 영역을 변경하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 변경된 기능, 예를 들어, 이펙터 리간드, 예컨대 세포 상의 FcR 또는 보체의 C1 성분에 대한 변경된 친화도를 갖는 항체는 항체의 불변 부분 내의 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 대체함으로써 생산될 수 있다 (예를 들어, EP388151; US5,624,821 참조). 뮤린 또는 다른 종 이뮤노글로불린에 적용될 경우에 이들 기능을 감소시키거나 제거하는 유사한 유형의 변경이 기재될 수 있다.
본 발명의 항-TGF-β2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특이적 항-TGF-β2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 서열식별번호: 67의 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 77의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 따라서, 본 발명은 항체 MOR14797에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 결정화 및 구조 결정 후 목적하는 본 발명의 항체의 결합 영역은 보다 더 명백하게 규정되었다. 따라서, 본 발명은 인간 TGFβ-2 단백질의 쇄 A의 아미노산 LEU 304, ASN 316, PRO 351, TYR 352, LEU 353, TRP 354, SER 355, SER 356, GLN 359, ARG 362, VAL 363, LEU 366, THR 369 및 ILE 370, 및 인간 TGFβ-2 단백질의 쇄 B의 LYS 327, GLY 331, TRP 332, LYS 333, TRP 334, TYR 392, ILE 394, LYS 399, GLU 401 및 LEU 403을 포함하는 인간 TGFβ-2 단백질의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열식별번호: 27의 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 따라서, 본 발명은 항체 MOR14800에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 따라서, 본 발명은 인간 TGFβ-2 단백질의 쇄 A의 아미노산 GLY 29, TRP 30, LYS 31, TRP 32, TYR 90, TYR 91, ILE 92, GLU 99, LEU 101 및 MET 104, 및 인간 TGFβ-2 단백질의 쇄 B의 ALA1, LEU 2, ASP 3, ALA 5, TYR 6, ASN 10, ASN 14, PRO 49, TYR 50, LEU 51, TRP 52, SER 53, SER 54, ASP 55, GLN 57, ARG 60, VAL 61, LEU 64, GLN 81, LYS 110을 포함하는 인간 TGFβ-2 단백질의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
조작되고 변형된 항체
본 발명의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본원에 제시된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상을 갖는 항체를 사용하여 추가로 제조할 수 있으며, 여기서 변형된 항체는 출발 항체로부터의 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경하기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 항체 결합 영역/파라토프 또는 CDR 그라프팅이다. 파라토프 서열은 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정한 자연 발생 항체로부터의 CDR/파라토프 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정한 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 (a) 서열식별번호: 1-3, 11-13, 21-23, 31-33, 41-43, 51-53, 61-63, 71-73, 81-83, 91-93, 101-103, 111-113 및 124-129 또는 b) 서열식별번호: 4-6, 14-16, 24-26, 34-36, 44-46, 54-56, 64-66, 74-76, 84-86, 94-96, 104-106, 114-116 및 124-129에 열거된 서열의 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역 서열의 혼합을 포함하는 단리된 모노클로날 항-TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 개시된 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체와 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공중 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능), 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al., [상기 문헌]; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열에 비해 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, US5,530,101; US5,585,089; US5,693,762 및 US6,180,370 참조). 또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 관심 항체의 1가지 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이며, 이는 "친화도 성숙"으로 알려져 있다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 기능적 관심 특성이 본원에 기재되고 실시예에 제공된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
대안적 프레임워크 또는 스캐폴드로의 항원-결합 도메인 그라프팅
생성된 폴리펩티드가 TGF베타-2에 특이적으로 결합하는 적어도 1개의 결합 영역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5개의 주요 이디오타입 또는 그의 단편 (예컨대 본원의 다른 곳에 개시된 것들)을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여 단일 중쇄 항체 예컨대 낙타류에서 확인되는 것들이 특히 관심대상이다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 계속해서 발견되고 개발된다.
낙타류 항체
신세계 구성원 예컨대 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 포함한 낙타 및 단봉낙타 패밀리 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로마데리우스(Camelus dromaderius))의 구성원으로부터 수득된 항체 단백질이 인간 대상체에 대한 크기, 구조적 복잡성 및 항원성에 관해 특징화되었다. 자연에서 발견되는 바와 같은 이 포유동물 패밀리로부터의 특정 IgG 항체는 경쇄가 결여되고, 따라서 다른 동물로부터의 항체의 경우 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 구분된다 (WO94/04678 참조). VHH로 확인되는 소형 단일 가변 도메인인 낙타류 항체의 영역은 표적에 대한 높은 친화도를 갖는 소형 단백질을 생성하도록 유전자 조작함으로써 수득할 수 있으며, 이는 "낙타류 나노바디"로 알려져 있는 저분자량 항체-유래 단백질을 생성한다 (US 5,759,808; 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520] 참조). 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는, 예를 들어, 벨기에 겐트 소재의 아블링스(Ablynx)로부터 상업적으로 입수가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체와 같이, 낙타류 항체의 아미노산 서열을 재조합적으로 변경하여 인간 서열과 보다 밀접하게 유사한 서열을 수득할 수 있으며, 즉 나노바디를 "인간화"할 수 있다. 따라서 인간에 대한 낙타류 항체의 자연적으로 낮은 항원성은 추가로 감소될 수 있다. 낙타류 나노바디는 인간 IgG 분자의 것의 대략 1/10인 분자량을 갖고, 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 소형 크기의 하나의 결과는 보다 큰 항체 단백질에게 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력이며, 즉 낙타류 나노바디는 전형적인 면역학적 기술을 사용하여 달리 잠재하는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서 소형 크기의 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 표적 단백질의 홈 또는 좁은 간극 내의 특정한 부위에 대한 결합의 결과로서 억제할 수 있고, 따라서 전형적 항체의 것보다 전형적 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력을 제공할 수 있다는 것이다. 저분자량 및 조밀한 크기는 추가로, 극도로 열안정성이고, 극도의 pH 및 단백질분해적 소화에 대해 안정하고, 불량하게 항원성인 낙타류 나노바디를 생성한다. 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 용이하게 이동하고, 심지어 혈액-뇌 장벽을 가로지르고 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 추가로, 혈액 뇌 장벽을 가로질러 약물 수송을 용이하게 할 수 있다 (US2004/0161738 참조). 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특색은 큰 치료 잠재력을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서 완전히 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되고, 기능적이다. 따라서, 본 발명의 특색은 예를 들어 WO94/04678에 기재된 바와 같이, 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열로 그라프팅함으로써 수득되는 낙타류 항체이다.
비-항체 스캐폴드
알려져 있는 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 애드넥틴(Adnectin) (피브로넥틴) (컴파운드 테라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월섬), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd) (매사추세츠주 캠브리지) 및 아블링스 엔브이 (벨기에 츠뷔나아르드), 리포칼린 (안티칼린(Anticalin)) (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징), 소형 모듈 면역-제약 (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.) (캘리포니아주 마운틴 뷰)), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린 (감마-결정질 또는 유비퀴틴) (실 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레), 단백질 에피토프 모방체 (폴리포르 리미티드(Polyphor Ltd), 스위스 알슈빌)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
(i) 피브로넥틴 스캐폴드
피브로넥틴 스캐폴드는 바람직하게는 피브로넥틴 제III형 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 제III형의 제10 모듈 (10 Fn3 도메인))에 기초한다. 피브로넥틴 제III형 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 그 자체가 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 추가로 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR과 유사)를 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에 적어도 3개의 이러한 루프가 존재하며, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향과 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418). 이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는 이뮤노글로불린이 아니지만, 전체 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄의 가변 영역인 최소 기능적 항체 단편의 것과 밀접하게 관련된다. 이러한 구조 때문에, 비-이뮤노글로불린 항체는 성질 및 친화도가 항체의 것과 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙의 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는 분자의 루프 영역이 표준 클로닝 기술을 사용하여 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체는, 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형을 가한 것을 포함한다. 전형적으로 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이"된 항체는 또한 본 발명에 포괄되는 것으로 의도된다. 또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T-세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로 지칭되고, US2003/0153043에 추가로 상세하게 기재되어 있다. 프레임워크 또는 CDR 영역 내에 가해진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는, 전형적으로 항체의 1가지 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 게다가, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있거나), 또는 그의 글리코실화를 변경하여 항체의 1가지 이상의 기능적 특성이 다시 변경되도록 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 US5,677,425에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하기 돌연변이 중 1개 이상이 도입될 수 있다: US6,277,375에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, US5,869,046 및 US6,121,022에 기재된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 항체가 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경하기 위해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 1개 이상의 아미노산은 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 US5,624,821 및 US5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다. 특히, 잔기 234 및 235가 돌연변이될 수 있다. 특히, 이들 돌연변이는 알라닌으로 이루어질 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 234 및 235 중 하나 또는 둘 다에서 Fc 영역 내에 돌연변이를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 234 및 235 중 하나 또는 둘 다는 알라닌으로 치환될 수 있다. 아미노산 234 및 235 둘 다의 알라닌으로의 치환은 ADCC 활성을 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이러한 접근법은 WO00/42072에 추가로 기재되어 있다. 더욱이, 인간 IgG1 상의 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되었다 (문헌 [Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조). 또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 일으키는 1개 이상의 아미노산 치환이 이루어짐으로써 그 부위에서의 글리코실화가 제거될 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현함으로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 저푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어, 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자의 발현이 결핍된 포유동물 세포주에서의 재조합 발현에 의해 생산된다. WO03/035835는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하며, 또한 그 숙주 세포 내에서 발현된 항체의 저푸코실화를 일으킨다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). WO99/54342는 당단백질을 변형시키는 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 이와 같이 조작된 세포주 내에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (또한, 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 대안적으로, 본 발명의 항체는 포유동물-유사 글리코실화 패턴으로 조작되고 글리코실화 패턴으로서 푸코스가 결여된 항체를 생산할 수 있는 효모 또는 사상 진균에서 생산될 수 있다 (예를 들어, EP1297172B1 참조).
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 알려져 있는 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 서열식별번호: 20, 40, 60, 80, 100 또는 120에 제시된다. 전장 중쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 서열식별번호: 10, 30, 50, 70, 90 또는 110에 제시된다. 핵산은 전세포, 세포 용해물에 존재할 수 있거나, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것들을 포함한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우에 "단리된" 또는 "실질적으로 순수해진"다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터 예컨대 파지 디스플레이 벡터, 또는 재조합 플라스미드 벡터 내에 존재할 수 있다. 본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득할 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용함)의 경우, 항체를 코딩하는 핵산을 라이브러리의 구성원인 다양한 파지 클론으로부터 회수할 수 있다. 또한 본 발명의 범주 내에 1개 이상의 결실, 부가 또는 치환을 포함하는 변이체 핵산 서열이 포함된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8, 10, 18, 20, 28, 30, 38, 40, 48, 50, 58, 60, 68, 70, 78, 80, 88, 90, 98, 100, 108, 110, 118 또는 120 중 1개 이상을 포함한다. 유전자 코드의 축중성으로 인해, 아미노산은 1개 초과의 코돈에 의해 코딩될 수 있다. 따라서, 번역되는 아미노산 서열은 동일하게 유지되도록 하면서 뉴클레오티드 서열을 수정하는 것이 가능하다.
VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자가 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환될 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 DNA 분자에, 또는 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 단편에 작동가능하게 연결된다. 이 문맥에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편이 기능적 방식으로, 예를 들어, 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록, 또는 단백질이 바람직한 프로모터의 제어 하에 발현되도록 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. [상기 문헌]] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 이소형 중에서 선택된다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, [Kabat, E. A., et al. [상기 문헌]] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시켜, VH 및 VL 서열이 인접 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 하며, VL 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554] 참조).
본 발명의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein (1975 Nature 256: 495)]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하는 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고, 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단세포 현탁액을, 50% PEG를 함유하는 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)의 수의 1/6에 융합시킬 수 있다. 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트 내에 대략 2 x 145로 플레이팅한 후, 20% 태아 클론 혈청, 18% "653" 조건화 배지, 5% 오리겐 (이겐(IGEN)), 4mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨, 5mM HEPES, 0:055mM 2-메르캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신, 50mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마(Sigma); HAT는 융합 24시간 후에 첨가됨)를 함유하는 선택 배지에서 2주 인큐베이션한다. 대략 2주 후에, HAT를 HT로 대체한 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개별 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 광범위한 하이브리도마 성장이 발생하면, 통상적으로 10-14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우 모노클로날 항체를 한계 희석에 의해 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관내 배양하여 조직 배양 배지 중에 특징화를 위한 소량의 항체를 생성할 수 있다. 인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia))를 사용한 친화성 크로마토그래피 전에 상청액을 여과하고, 농축시킬 수 있다. 순도를 보장하기 위해 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 체크할 수 있다. 완충제 용액을 PBS로 교환할 수 있고, 1.43 흡광 계수를 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고, -80℃에서 저장할 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 항체는 또한 예를 들어 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]). 예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현하기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA가 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 제공하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 개별 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 보다 전형적으로, 유전자 둘 다는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 목적하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입하여 VH 절편이 벡터 내의 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내의 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 인 프레임으로 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 항체 쇄 유전자를 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다. 항체 쇄 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 설계가 인자 예컨대 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등에 따라 달라질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포에서의 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 추가로, 조절 요소는, SRa 프로모터 시스템이 SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 제1형의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는 것처럼, 상이한 공급원으로부터의 서열로 구성된다 (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472). 항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선택 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위함)를 포함한다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 적어도 1개의 CDR 영역을 코딩하는 서열식별번호: 8, 10, 18, 20, 28, 30, 38, 40, 48, 50, 58, 60, 68, 70, 78, 80, 88, 90, 98, 100, 108, 110, 118 또는 120 또는 그의 단편 중 1개 이상을 포함하는 상기 기재된 바와 같은 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 데 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하다. 항체를 진핵 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 논의되는데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 가능성이 원핵 세포보다 더 크기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 높은 수율의 활성 항체의 생산에 효과적이지 않은 것으로 보고되어 있다 (Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13). 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DH FR 선택 마커와 함께 사용되는 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO K1PD 세포이다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 WO87/04462, WO89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포는 예를 들어 US6,946,292B2에 기재된 바와 같은 FUT8 유전자 발현이 결핍된 포유동물 세포주를 포함한다. 따라서 한 측면에서, 본 발명은 상기 기재되거나 본원에 개시된 벡터 중 1개 이상을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
항체 유전자 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우에, 항체는 숙주 세포에서의 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하고 항체 또는 그의 기능적 단편을 단리하는 것을 포함하는, 본 발명의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편의 생산 방법을 제공한다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 개시내용의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 적어도 1종의 근육 질량/세기 증가제, 예를 들어 IGF-1 또는 IGF-1의 변이체, 항-미오스타틴 항체, 항-액티빈 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 이를 활성화시키지는 않는 미오스타틴 디코이 단백질, ActRIIB 디코이 수용체, β2 효능제, 그렐린(Ghrelin) 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴과 조합될 수 있다. 본 발명의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편을 사용한 치료는 코르티코스테로이드, 면역 억제제, 항-시토카인 작용제, 항암 약물; 성장 인자 예컨대 에리트로포이에틴, G-CSF, GM-CSF 또는 다른 것들; 당뇨병의 치료에 사용되는 약물 (인슐린 및 경구 혈당강하제 포함), 항-결핵 약물 및 항생제와 조합될 수 있다. 조합은 소분자 및 생체분자 작용제 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 단독 활성제로서 또는 ActRIIB 항체, ActRIIA 항체 또는 ActRIIA 및 ActRIIB 범 특이적 항체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약물은 WO2010125003에 개시된 바와 같은 ActRIIB 항체와 조합되어 사용될 수 있다. 용어 "제약상 허용되는"은 미국 연방 정부 또는 주 정부 당국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 보다 특히 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거된 것임을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 포함한 물 및 오일일 수 있다. 적합한 제약 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 원하는 경우에, 또한 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지연-방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체 예컨대 트리글리세리드와 함께 좌제로서 제제화될 수 있다. 경구 제제는 표준 담체 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 인간으로의 정맥내 투여에 적합화된 제약 조성물과 같은 상용 절차에 따라 제제화된다. 필요한 경우에, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 국부 마취제 예컨대 리도카인을 포함할 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우에, 이는 멸균 제약 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 투여 전에 성분이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하여야 한다 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함). 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한, 아주반트 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 상기 문헌의 멸균 절차, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시키는 것 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 제약 형태의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 본 발명의 제약 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다. 치료 조성물은 전형적으로, 제조 및 저장 조건 하에 멸균이고 안정하여야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 작용제 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 내에 혼입시킨 후, 멸균 마이크로여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 작용제를 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성제 플러스 임의의 추가의 목적하는 작용제의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조 (동결건조)이다. 따라서, 본 발명은 본 개시내용의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하며, 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 제조할 수 있는 활성제의 양은 치료되는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 제조할 수 있는 활성제의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 제약상 허용되는 담체와 조합되어 100％ 중에서 약 0.0001％ 내지 약 15％의 활성제, 약 0.01％ 내지 약 10％, 또는 약 0.1％ 내지 약 5％의 활성제 범위일 것이다. 투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 용량이 치료 상황의 위급성에 의해 지시된 바와 같이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 상세사항은, 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 개체에서의 감수성의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 내재된 제한에 의해 좌우되고 이에 직접적으로 의존한다. 본 개시내용의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편, 또는 상기 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 조성물의 치료 유효량은 숙주 체중의 약 0.001 내지 150 mg/kg, 또는 0.01 내지 30 mg/kg, 및 보다 통상적으로 0.1 내지 10 mg/kg 범위이다. 통상의 기술자는 적합한 유효 용량을 확인하는 방법을 알고 있으며, 이는 투여 경로 (예를 들어, 정맥내로 또는 피하로)에 따라 달라질 것이다. 예시적인 치료 요법은 1일에 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회 또는 1개월에 1회 투여를 수반한다. 이러한 투여는 정맥내로 또는 피하로 수행될 수 있다. 본 개시내용의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편에 대한 투여 요법은 정맥내 투여에 의한 0.01 mg/kg 체중 또는 0.1 mg/kg 체중 또는 0.5 mg/kg 체중 또는 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중을 포함한다. 대안적으로, 조성물은 지속 방출 제제일 수 있으며, 이 경우에 보다 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그의 여생 동안 계속해서 치료를 제공받는다. 치료 용도에서, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 나타낼 때까지, 비교적 짧은 간격으로의 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법이 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물 중 활성제의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 양의 활성제를 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 기타 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 대안적으로, 항체는 약 1년에 1회 또는 오직 1회 투여될 수 있다. 이러한 투여는 정맥내로 또는 피하로 수행될 수 있다. 본 발명의 항-TGF베타-2 항체에 대한 투여 요법은 정맥내 투여에 의해 0.1 mg/kg 체중 또는 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함할 수 있으며, 항체는 하기 예시된 투여 스케줄 중 하나를 사용하여 제공된다: 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; 3주마다; 3 mg/kg 체중 1회에 이어서 1 mg/kg 체중 3주마다. 본 발명의 조성물 중에 포함되는 본 개시내용의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편의 치료 유효 용량의 투여는 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통, 즉, 듀피트렌병 환자에서 미세 운동 능력을 영구적으로 파괴하는, 손바닥과 손가락 사이의 강한 섬유성 조직의 감소로 인한 손상 또는 장애의 방지를 일으킬 수 있다. 환자는 폴리펩티드 활성 성분의 유효량, 즉, 해당 질환 또는 장애를 검출, 치료, 호전 또는 예방하기에 충분한 양을 제공받을 것이다. 치료 효과는 또한 신체 증상의 감소를 포함할 수 있다. 임의의 특정한 대상체에 대한 치료 단백질의 최적의 유효량 및 농도는 환자의 연령, 크기, 건강 및/또는 성별, 상태의 성질 및 정도, 특정한 치료 단백질의 활성, 신체에 의한 그의 클리어런스 속도, 및 또한 치료 단백질과 조합되어 투여되는 임의의 가능한 추가 치료제(들)를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 주어진 상황에 전달되는 유효량은 상용 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의의 판단 내에 있다. 투여량은 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄에 의할 수 있다.
본 발명의 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 1가지 이상을 이용하여 1개 이상의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 치료 단백질에 대한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 포함 조성물은 정맥내로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 피하로 투여된다. 대안적으로, 본 발명의 조성물 중에 포함되는 본 개시내용의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 비-비경구 경로에 의해, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 즉시 방출에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께, 예컨대 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 많은 제조 방법이 특허되었거나 또는 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 관련 기술분야에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 제시된 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 하기를 포함한다: 제어된 속도로 의약을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 제시한 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하는 치료 장치를 제시한 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하는 의약 주입 펌프를 제시한 미국 특허 번호 4,447,233; 연속적 약물 전달을 위한 가변 유동식 이식가능한 주입 장치를 제시한 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 제시한 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 제시한 미국 특허 번호 4,475,196. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 마이크로칩스(MicroCHIPS)™ (매사추세츠주 베드포드)에 의해 제조된 것들을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 조성물은 생체내 적절한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 가로지르는 것을 보장하기 위해 (원하는 경우에); 이들은 예를 들어 리포솜으로 제제화될 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특정한 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되어 표적화된 약물 전달을 증진시키는 1개 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016 참조); 만노시드 (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 (P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함하며; 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273]을 참조한다.
환자 군
제안된 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 환자는 집중 치료 또는 장기간 입원 (1주 초과)을 필요로 하는 급성 또는 중대 질병으로부터 회복 중인 환자; 근육감소증을 갖는 노쇠한 고령 환자; 심각한 외상, 예컨대 자동차 사고, 중증 화상, 전투 부상, 및 다른 외상성 손상으로부터 회복 중인 청년 성인; 상기 열거된 바와 같은, 악액질을 유발하는 것으로 알려져 있는 만성 질환을 갖는 환자; 및 상기 열거된 바와 같은 근육 질환을 갖는 환자를 포함한다. 근육 손실은 중증이거나 장기 지속되는 대부분의 질병의 공통적인 합병증이므로, 근육 소모의 반전은 근육 손실의 근본적인 원인과 무관하게 근육 손실을 경험하는 환자의 회복을 촉진하고 기능을 복구할 것으로 예상된다. 게다가, 환자는 병리학적 상태 예컨대 듀피트렌병 (손바닥과 손가락 사이에 강한 섬유성 조직을 형성하여 미세 운동 능력을 영구적으로 파괴하는 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질의 과도한 생산을 특징으로 하는 손의 양성 섬유증식성 질환) 섬유증, 반흔형성, 암, 특정한 상태 예컨대 마르팡-연관 상태, 수포성 표피박리증, 특히 이영양성 수포성 표피박리증 또는 접합부 수포성 표피박리증을 갖는다.
섬유주절제술 및 전신 피부 경화증은 제안된 치료로부터 이익을 얻을 수 있다. 추가적으로, 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 푸크스 이영양증을 갖는 환자가 제안된 치료로부터 이익을 얻을 수 있다. 게다가, 과다증식성 장애 예컨대 레더호스병, 페이로니병, 지관절 배결절증, 오십견, 손목 터널 증후군 손등 상의 섬유종증, 결절성 근막염, 공격성 섬유종증, 진동 백색 손가락 손가락 운동증 (손-팔 진동 증후군 (HAVS)으로도 알려짐), 발바닥섬유종증 및 개러드 배결절증을 갖는 환자가 제안된 치료로부터 이익을 얻을 수 있다. 섬유증은 전형적으로 염증 또는 손상의 결과로서, 신체 내의 많은 조직에서 발생할 수 있고, 예는 폐, 간, 심장, 무릎, 어깨, 다른 관절을 포함한다. 따라서, 변성 및 섬유화 질환 예컨대 경피증, 비대성 반흔형성 및 켈로이드, 특발성 폐 섬유증, 심장 섬유증 (또한 섬유화 심근염), 심방 섬유증, 심내막심근 섬유증, 간 섬유증 (예를 들어, NASH), 폐 섬유증, 신장 섬유증 (예를 들어, 알포트 증후군), 낭성 섬유증, 전신 경화증, 원발성 골수섬유증, 관절섬유증, 아테롬성동맥경화증 및 종격 섬유증을 갖는 환자가 제안된 치료로부터 이익을 얻을 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체는 치료 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 대상체에게 투여될 수 있고, 질환의 치료, 예방에 및 질환 증상의 개시를 지연시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 요법에 사용하기 위한 또는 의약으로서의 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 또는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 병리학적 장애의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 또는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 병리학적 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 또는 제약 조성물의 용도를 추가로 제공한다. 본 발명은 병리학적 장애를 앓고 있는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물, 예를 들어 영장류, 바람직하게는 고등 영장류, 예를 들어 인간 (예를 들어, 본원에 기재된 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자)일 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 비정상적 TGF베타-2 기능을 특징으로 하는 장애 또는 상태를 갖는 인간 대상체, 예를 들어, 인간 환자이다. 본 발명은 치료 유효량의 본 개시내용의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편을 투여하는 것을 포함하는, 병리학적 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 치료 유효량의 항체 MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 또는 MOR14787을 투여하는 것을 포함하는, 병리학적 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 본 개시내용의 TGF베타-2 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 따라서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 항체 MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 또는 MOR14787을 제공한다. 본원에 사용된 "병리학적 장애"는 근골격 질환 또는 장애, 근육 위축, 근육 이영양증, 듀피트렌병, 근육감소증, 외상성 손상, 악액질을 유발하는 것으로 알려져 있는 만성 질환 (예를 들어, 암), 병리학적 상태 예컨대 섬유증, 마르팡-연관 상태, 수포성 표피박리증, 특히 이영양성 수포성 표피박리증 또는 접합부 수포성 표피박리증, 섬유주절제술, 로이스-디에츠-증후군, 전신 피부 경화증, 과다증식성 장애 예컨대 레더호스병, 페이로니병, 지관절 배결절증, 오십견, 손목 터널 증후군 손목 상의 섬유종증, 결절성 근막염, 공격성 섬유종증, 진동 백색 손가락 손가락 운동증, 발바닥섬유종증 및 개러드 배결절증 및 변성 및 섬유화 질환 예컨대 경피증, 비대성 반흔형성 및 켈로이드, 특발성 폐 섬유증, 심장 섬유증 (또한 섬유화 심근염), 간 섬유증 (예를 들어, NASH), 폐 섬유증, 신장 섬유증 (예를 들어, 알포트), 낭성 섬유증, 전신 경화증, 원발성 골수섬유증, 아테롬성동맥경화증, 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 푸크스 이영양증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수포성 표피박리증은 임의의 형태의 수포성 표피박리증을 지칭하나, 특히 이영양성 수포성 표피박리증 및 접합부 수포성 표피박리증을 지칭한다.
글루코코르티코이드 예컨대 코르티솔, 덱사메타손, 베타메타손, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 또는 프레드니솔론을 사용한 치료의 결과를 포함하여, 근육 위축의 많은 원인이 존재한다. 근육 위축은 또한 신경 외상으로 인한 탈신경의 결과, 또는 변성, 대사성 또는 염증성 신경병증 (예를 들어, 길랑-바르(Guillian-Barre) 증후군, 말초 신경병증, 또는 환경 독소 또는 약물에 대한 노출)의 결과일 수 있다. 또한, 근육 위축은 근병증, 예컨대 근긴장증; 선천성 근병증 (네말린 근병증, 멀티/미니코어 근병증 및 근세관성 (중심핵성) 근병증 포함); 미토콘드리아 근병증; 가족성 주기성 마비; 염증성 근병증; 대사성 근병증, 예컨대 글리코겐 또는 지질 축적 질환에 의해 유발되는 것; 피부근염; 다발근염; 봉입체 근염; 골화성 근염; 횡문근융해증 및 미오글루빈뇨의 결과일 수 있다. 근병증은 근육 이영양증 증후군, 예컨대 뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스, 안인두, 견갑상완, 지대, 후쿠야마, 선천성 근육 이영양증 또는 유전성 원위 근병증에 의해 유발될 수 있다. 또한, 근육 위축은 성인 운동 뉴런 질환 예컨대 근위축성 측삭 경화증; 영아 척수성 근육 위축, 소아 척수성 근육 위축, 다초점 전도 차단을 동반하는 자가면역 운동 신경병증, 졸중 또는 척수 손상으로 인한 마비, 외상으로 인한 골격 고정화, 장기간 침상 안정, 수의적 무활동, 불수의 무활동, 대사성 스트레스 또는 영양 부족, 암, AIDS, 단식, 갑상선 또는 부신 또는 뇌하수체 장애, 당뇨병, 양성 선천성 저긴장증, 중심핵병, 간 질환 (예, 예컨대 섬유증, 간경변증), 패혈증, 신부전, 울혈성 심부전, 노화, 우주 여행 또는 무중력 환경에서 보낸 시간의 결과일 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 상기 열거된 병리학적 장애의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물은 듀피트렌병의 치료에 사용되거나, 또는 근육 이영양증의 치료에 사용되거나, 또는 근육감소증의 치료에 사용되거나, 또는 섬유화 상태의 치료에 사용되거나, 또는 마르팡-연관 상태의 치료에 사용되거나, 또는 수포성 표피박리증, 특히 이영양성 수포성 표피박리증 또는 접합부 수포성 표피박리증, 로이스-디에츠-증후군의 치료에 사용되거나, 또는 섬유주절제술의 치료에 사용되거나, 또는 전신 피부 경화증의 치료에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 듀피트렌병의 치료 또는 근육 이영양증의 치료 또는 근육감소증의 치료 또는 섬유화 상태의 치료 또는 마르팡-연관 상태의 치료 또는 수포성 표피박리증, 특히 이영양성 수포성 표피박리증 또는 접합부 수포성 표피박리증의 치료 또는 섬유주절제술의 치료 또는 전신 피부 경화증의 치료 또는 로이스-디에츠-증후군의 치료에 사용하기 위한 항체 MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 또는 MOR14787을 제공한다. 특정한 실시양태에서, MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 및 MOR14787로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 포함하는 본 발명의 제약 조성물은 듀피트렌병의 치료 또는 로이스-디에츠-증후군의 치료에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 특정한 실시양태에서, MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 및 MOR14787로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 포함하는 본 발명의 제약 조성물은 근육 이영양증의 치료에 사용될 수 있다. 추가의 상태는 악액질, 류마티스 관절염과 연관된 악액질, 및 암과 연관된 악액질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같은 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편을 투여하는 것을 포함하는, 근육 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 개시내용은 MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 및 MOR14787로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 근육 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 근육 질량을 증가시키기 위해 개시된 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 조성물을 사용하는 치료의 필요는 상기 언급된 상태 중 1종으로부터, 특히 근골격 질환 또는 장애, 예컨대 근육 위축의 결과로서 발생할 수 있으며, 여기서 근육 장애는 비만-연관 근육감소증, 근육감소증 및 당뇨병-연관 근육 위축으로 이루어진 군으로부터 선택되는 근육 위축이다.
게다가, 본 발명은 듀피트렌병, 마르팡-연관 상태 또는 마르팡병, 수포성 표피박리증, 섬유주절제술, 로이스-디에츠-증후군, 전신 피부 경화증 또는 근골격 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편, 특히 MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 및 MOR14787로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 용도에 관한 것이다.
TGF-β는 예를 들어 골 형태발생 단백질 (BMP), 성장 및 분화 인자, 액티빈 및 인히빈을 포함한 구조적으로 관련된 시토카인의 거대 패밀리에 속한다.
정상 상태 하에, TGF-β는 항상성을 유지하고, 예를 들어 항증식 및 아폽토시스 반응의 유도를 통해 상피, 내피, 뉴런 및 조혈 세포 계통의 성장을 제한한다. 정규 및 비-정규 신호전달 경로는 TGF-β에 대한 세포성 반응에 수반된다. TGF-β/Smad 정규 경로의 활성화는 TGF-β의 항증식 효과를 매개할 수 있다. 비-정규 TGF-β 경로는 추가의 세포내 경로, 예를 들어, 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK), 포스파티딜이노시톨 3 키나제/단백질 키나제 B, Rho-유사 GTPase (Tian et al. Cell Signal. 2011; 23(6):951-62; Blobe et al. N Engl J Med. 2000; 342(18):1350-8)를 활성화시켜, 상피 중간엽 이행 (EMT) 및/또는 세포 운동성을 조정할 수 있다.
TGF-β 신호전달 경로의 변경은 인간 질환, 예를 들어, 암, 심혈관 질환, 섬유증, 생식 장애 및 상처 치유와 연관된다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 암에서의 TGF-β의 역할이 질환 환경 (예를 들어, 종양 병기 및 유전자 변경) 및/또는 세포 상황에 의존성인 것으로 여겨진다. 예를 들어, 암 후기에서, TGF-β는 예를 들어 종양 성장을 촉진하거나 (예를 들어, EMT를 유도하거나), 항종양 면역 반응을 차단하거나, 종양-연관 섬유증을 증가시키거나, 또는 혈관신생을 증진시킴으로써, 암-관련 과정을 조정할 수 있다 (Wakefield and Hill Nat Rev Cancer. 2013; 13(5):328-41).
전임상 증거는 TGF-β가 면역 조절에서 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다 (Wojtowicz-Praga Invest New Drugs. 2003; 21(1):21-32; Yang et al. Trends Immunol. 2010; 31(6):220-7). TGF-β는 여러 메카니즘, 예를 들어, T-헬퍼의 Th2 면역 표현형으로의 균형 이동; 항종양 Th1 유형 반응 및 M1-유형 대식세포의 억제; 세포독성 CD8+ T 림프구 (CTL), NK 림프구 및 수지상 세포 기능의 억제, CD4+CD25+ T-조절 세포의 생성; 또는 면역억제 시토카인 (예를 들어, IL10 또는 VEGF), 염증유발 시토카인 (예를 들어, IL6, TNFα 또는 IL1)의 분비 및 유전자독성 활성을 갖는 반응성 산소 종 (ROS)의 생성에 의해 매개되는 종양형성 활성을 갖는 M2-유형 대식세포의 촉진을 통해 숙주-면역 반응을 하향-조절할 수 있다 (Yang et al. Trends Immunol. 2010; 31(6):220-7; Truty and Urrutia Pancreatology. 2007; 7(5-6):423-35; Achyut et al. Gastroenterology. 2011; 141(4):1167-78).
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, PD-1 면역요법에 대한 내성이, 예를 들어 TGF-β 신호전달 및 TGF-β-의존성 과정, 예를 들어, 상처 치유 또는 혈관신생에 연관된 유전자를 포함하는 전사 서명의 존재와 연관되는 것으로 여겨진다 (Hugo et al. Cell. 2016; 165(1):35-44). TGF-β 차단은 PD-1/PD-L1 축을 억제하는 요법의 치료 범위를 확장한다. TGF-β 억제제는, 예를 들어 종양 미세환경, 예를 들어, 혈관 생성, 섬유증, 또는 이펙터 T 세포의 동원에 영향을 미치는 인자를 조정함으로써, PD-1 면역요법의 임상 이익에 영향을 미칠 수 있다 (Yang et al. Trends Immunol. 2010; 31(6):220-7; Wakefield and Hill Nat Rev Cancer. 2013; 13(5):328-41; Truty and Urrutia Pancreatology. 2007; 7(5-6):423-35).
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 항종양 면역 사이클의 다수의 요소가 PD-1 및 TGF-β 수용체 둘 다를 발현하고, PD-1 및 TGF-β 수용체는 비-중복 세포 신호를 전파할 가능성이 있는 것으로 또한 여겨진다. 예를 들어, 자발생 전립선암의 마우스 모델에서, T 세포에서의 TGFBRII의 어느 한 우성-음성 형태의 사용 또는 TGF-β 생산의 종료는 종양 성장을 지연시킨다 (Donkor et al. Immunity. 2011; 35(1):123-34; Diener et al. Lab Invest. 2009; 89(2):142-51). 마우스 전립선 (TRAMP) 마우스의 트랜스제닉 선암종의 연구는 입양 전달된 T 세포에서의 TGF-β 신호전달을 차단하는 것이 그의 지속성 및 항종양 활성을 증가시키는 것을 보여주었다 (Chou et al. J Immunol. 2012; 189(8):3936-46). 전달된 T 세포의 항종양 활성은 부분적으로 종양-침윤 림프구에서의 PD-1 상향조절로 인해 시간 경과에 따라 감소될 수 있으며, 이는 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 및 TGF-β 억제의 조합을 지지한다. PD-1 또는 TGF-β에 대한 중화 항체의 사용은 또한 그의 높은 PD-1 발현 수준 및 그의 TGF-β 자극에 대한 반응성을 고려할 때, 조절 T-세포 (Treg)에 영향을 미칠 수 있으며 (Riella et al. Am J Transplant. 2012; 12(10):2575-87), 이는 예를 들어 Treg 분화 및 기능의 조정을 증진시킴으로써 암을 치료하기 위한 PD-1 및 TGF-β 억제의 조합을 지지한다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 암이 종양 성장 및 전이성 진행을 용이하게 하기 위해 면역 감시를 회피하는 데 TGF-β를 사용할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 특정 진행성 암에서, 높은 수준의 TGF-β는 종양 공격성 및 불량한 예후와 연관되고, TGF-β 경로는 암 세포 운동성, 침습, EMT 또는 줄기 세포 표현형 중 하나 이상을 촉진할 수 있다. 암 세포 및 백혈구 집단에 의해 (예를 들어, 다양한 세포-발현된 또는 분비된 분자, 예를 들어, IL-10 또는 TGF-β를 통해) 매개되는 면역 조절은 특정 환자에서 단독요법으로서 체크포인트 억제제에 대한 반응을 제한할 수 있다. 특정 실시양태에서, 체크포인트 억제제 (예를 들어, PD-1의 억제제)와 TGF-β의 조합된 억제는 체크포인트 억제제 (예를 들어, 항-PD-1) 단독요법에 반응하지 않거나 또는 불량하게 반응하는 암, 예를 들어, 췌장암 또는 결장직장암 (예를 들어, 미소위성체 안정한 결장직장암 (MSS-CRC))을 치료하는 데 사용된다. 다른 실시양태에서, 체크포인트 억제제 (예를 들어, PD-1의 억제제)와 TGF-β의 조합된 억제는 높은 수준의 이펙터 T 세포 침윤을 나타내는 암, 예를 들어, 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐암), 유방암 (예를 들어, 삼중 음성 유방암), 간암 (예를 들어, 간세포성 암종), 전립선암, 또는 신암 (예를 들어, 투명 세포 신세포 암종)을 치료하는 데 사용된다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 PD-1의 억제제 (예를 들어, 항-PD-1 항체)와 TGF-β-2 항체의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 조합은 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편 및 PD-1의 억제제 (예를 들어, 항-PD-1 항체)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 0.1 mg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.3 mg/kg 내지 12 mg/kg 또는 1 mg/kg 내지 6 mg, 예를 들어, 약 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 12 mg/kg 또는 15 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내로 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 50 mg 내지 500 mg의 용량으로 (예를 들어, 100 mg 내지 400 mg, 예를 들어, 약 100 mg, 200 mg, 300 mg 또는 400 mg의 용량으로), 예를 들어 3주마다 1회 또는 4주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 100 mg 내지 300 mg의 용량으로 (예를 들어, 약 100 mg, 200 mg 또는 300 mg의 용량으로), 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 약 0.1 mg/kg 또는 0.3 mg/kg의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 약 100 mg의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 약 0.3 mg/kg의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 약 100 mg 또는 300 mg의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 약 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 12 mg/kg 또는 15 mg/kg의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 약 300 mg의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 0.1 mg 내지 0.2 mg (예를 들어, 약 0.1 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 50 mg 내지 200 mg (예를 들어, 약 100 mg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 0.2 mg 내지 0.5 mg (예를 들어, 약 0.3 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 50 mg 내지 200 mg (예를 들어, 약 100 mg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 0.2 mg 내지 0.5 mg (예를 들어, 약 0.3 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 200 mg 내지 400 mg (예를 들어, 약 300 mg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 0.5 mg 내지 2 mg (예를 들어, 약 1 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 200 mg 내지 400 mg (예를 들어, 약 300 mg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 2 mg 내지 5 mg (예를 들어, 약 3 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 200 mg 내지 400 mg (예를 들어, 약 300 mg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 5 mg 내지 10 mg (예를 들어, 약 6 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 200 mg 내지 400 mg (예를 들어, 약 300 mg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 10 mg 내지 15 mg (예를 들어, 약 12 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 200 mg 내지 400 mg (예를 들어, 약 300 mg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 10 mg 내지 20 mg (예를 들어, 약 15 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여되고, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체는 200 mg 내지 400 mg (예를 들어, 약 300 mg)의 용량으로, 예를 들어 3주마다 1회, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 PD-1의 억제제 (예를 들어, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체)가 투여되기 전에 투여된다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 PD-1의 억제제 (예를 들어, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체)가 투여된 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편 및 PD-1의 억제제 (예를 들어, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체)는 두 투여 사이에 적어도 30분 (예를 들어, 적어도 1, 1.5 또는 2시간) 휴지기를 갖고 개별적으로 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 췌장암, 결장직장암 (예를 들어, 미소위성체 안정한 결장직장암 (MSS-CRC)), 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐암), 유방암 (예를 들어, 삼중 음성 유방암), 간암 (예를 들어, 간세포성 암종), 전립선암, 또는 신암 (예를 들어, 투명 세포 신세포 암종)을 치료하기 위해 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체와 조합되어 투여되는 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 항체 MOR14799, MOR14800, MOR14809, MOR14797, MOR14805 또는 MOR14787이다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체와 조합되어 투여되는 TGF-β-2 항체 또는 그의 기능적 단편은 항체 MOR14797이다.
또 다른 실시양태에서, 암은, 예를 들어 본원에 기재된 암, 예컨대 폐암 (편평), 폐암 (선암종), 두경부암, 자궁경부암 (편평), 위암, 갑상선암, 피부암, 흑색종, 비인두암 (예를 들어, 분화 또는 미분화 전이성 또는 국부 재발성 비인두 암종), 신장암, 신경내분비 종양 (NET), 난소암, 난관암, 결장직장암 또는 유방암일 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 피부암, 예를 들어, 메르켈 세포 암종 또는 흑색종이다. 한 실시양태에서, 암은 메르켈 세포 암종이다. 다른 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암 (TNBC) 또는 HER2-음성 유방암이다. 다른 실시양태에서, 암은 신장암, 예를 들어, 신세포 암종 (예를 들어, 투명 세포 신세포 암종 (CCRCC) 또는 비-투명 세포 신세포 암종 (nccRCC))이다. 다른 실시양태에서, 암은 갑상선암, 예를 들어, 역형성 갑상선 암종 (ATC)이다. 다른 실시양태에서, 암은 신경내분비 종양 (NET), 예를 들어, 비정형 폐 카르시노이드 종양, 또는 췌장, 위장 (GI) 관 또는 폐에서의 NET이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐암, 예를 들어, 비소세포 폐암 (NSCLC) (예를 들어, 편평 NSCLC 또는 비-편평 NSCLC)이다. 특정 실시양태에서, 암은 난소암이다. 특정 실시양태에서, 암은 난관암이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암 (CRC) (예를 들어, 미소위성체 불안정성-높은 결장직장암 (MSI-높은 CRC) 또는 미소위성체 안정한 결장직장암 (MSS CRC))이다.
또 다른 측면에서, 대상체를 치료하는, 예를 들어 대상체에서 과다증식성 상태 또는 장애 (예를 들어, 암), 예를 들어, 고형 종양, 혈액암, 연부 조직 종양 또는 전이성 병변을 감소 또는 호전시키는 방법이 제공된다. 방법은 대상체에게 본원에 개시된 TGF-β-2 항체/PD-1 억제제 조합물 중 1종 이상을 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 하기 측면에서 기재된다:
50. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게
(a) 서열식별번호: 7의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17의 가변 경쇄 서열;
(b) 서열식별번호: 27의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 37의 가변 경쇄 서열;
(c) 서열식별번호: 47의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 가변 경쇄 서열;
(d) 서열식별번호: 67의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 77의 가변 경쇄 서열;
(e) 서열식별번호: 87의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 97의 가변 경쇄 서열; 또는
(f) 서열식별번호: 107의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 117의 가변 경쇄 서열
을 포함하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체
및 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체 분자를 암을 치료하는 데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체 분자는 서열식별번호: 153의 VHCDR1 아미노산 서열, 서열식별번호: 154의 VHCDR2 아미노산 서열 및 서열식별번호: 155의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열식별번호: 163의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열식별번호: 164의 VLCDR2 아미노산 서열 및 서열식별번호: 165의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인, 암을 치료하는 방법.
51. 측면 50에 있어서, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체가 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 방법.
52. 측면 50 또는 51에 있어서, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체가 서열식별번호: 161의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 방법.
53. 측면 50에 있어서, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체가 서열식별번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 149의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 방법.
54. 측면 50 또는 53에 있어서, 인간 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 단백질에 결합할 수 있는 항체가 서열식별번호: 161의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 151의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 방법.
예시적인 PD-1 억제제
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 항-PD-1 항체 분자이다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 그 전문이 참조로 포함된, "Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof"라는 표제 하에 2015년 7월 30일에 공개된 US 2015/0210769에 기재된 바와 같은 항-PD-1 항체 분자이다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열 표에 제시되거나, 또는 서열 표에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터의 (예를 들어, 서열 표에 개시된 BAP049-클론-E 또는 BAP049-클론-B의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로부터의) 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역 (CDR) (또는 집합적으로 모든 CDR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 정의에 따른다 (예를 들어, 서열 표에 제시된 바와 같음). 일부 실시양태에서, CDR은 코티아 정의에 따른다 (예를 들어, 서열 표에 제시된 바와 같음). 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 및 코티아 둘 다의 조합된 CDR 정의에 따른다 (예를 들어, 서열 표에 제시된 바와 같음). 한 실시양태에서, VH CDR1의 카바트 및 코티아 CDR의 조합은 아미노산 서열 GYTFTTYWMH (서열식별번호: 203)를 포함한다. 한 실시양태에서, CDR 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR)은 서열 표에 제시되거나, 또는 서열 표에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열에 비해, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 변화, 예를 들어, 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환) 또는 결실을 갖는다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 153의 VHCDR1 아미노산 서열; 서열식별번호: 154의 VHCDR2 아미노산 서열; 및 서열식별번호: 155의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열식별번호: 163의 VLCDR1 아미노산 서열, 서열식별번호: 164의 VLCDR2 아미노산 서열 및 서열식별번호: 165의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 각각이 서열 표에 개시된다.
한 실시양태에서, 항체 분자는 서열식별번호: 173의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VHCDR1; 서열식별번호: 174의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VHCDR2; 및 서열식별번호: 175의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VHCDR3을 포함하는 VH; 및 서열식별번호: 179의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VLCDR1; 서열식별번호: 180의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VLCDR2; 및 서열식별번호: 181의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VLCDR3을 포함하는 VL을 포함하며, 각각이 서열 표에 개시된다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 139의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 139와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 169의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 169와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 149의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 149와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 149의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자는 서열식별번호: 140의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 140과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 서열식별번호: 170 또는 150의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 170 또는 150과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 서열식별번호: 140의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VH 및 서열식별번호: 170 또는 150의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 141의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 141과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 171의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 171과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 151의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 151과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 141의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열식별번호: 141의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 151의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 분자는 서열식별번호: 162의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 162와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 서열식별번호: 172 또는 152의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 172 또는 152와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 서열식별번호: 142의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 서열식별번호: 172 또는 152의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함한다.
일반적으로, 구체적으로 나타내지 않는 한, 항-PD-1 항체 분자는 예를 들어 본원에 첨부된 서열 표에 기재된 카바트 CDR 및/또는 코티아 CDR 중 1개 이상의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 모든 정의 하에, 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 프레임워크 (FR)를 포함한다.
다른 예시적인 PD-1 억제제
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 또는 옵디보(OPDIVO)®로도 알려져 있는 니볼루맙 (브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb))이다. 니볼루맙 (클론 5C4) 및 다른 항-PD-1 항체는 그 전문이 참조로 포함된 US 8,008,449 및 WO 2006/121168에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열 표에 개시된 니볼루맙의 CDR 서열 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR 서열), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 람브롤리주맙, MK-3475, MK03475, SCH-900475 또는 키트루다(KEYTRUDA)®로도 알려져 있는 펨브롤리주맙 (머크 앤 캄파니(Merck & Co))이다. 펨브롤리주맙 및 다른 항-PD-1 항체는 그 전문이 참조로 포함된 문헌 [Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44], US 8,354,509, 및 WO 2009/114335에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열 표에 개시된 펨브롤리주맙의 CDR 서열 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR 서열), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 CT-011로도 알려져 있는 피딜리주맙 (큐어테크(CureTech))이다. 피딜리주맙 및 다른 항-PD-1 항체는 그 전문이 참조로 포함된 문헌 [Rosenblatt, J. et al. (2011) J Immunotherapy 34(5): 409-18], US 7,695,715, US 7,332,582 및 US 8,686,119에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 서열 표에 개시된 피딜리주맙의 CDR 서열 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR 서열), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 AMP-514로도 알려져 있는 MEDI0680 (메드이뮨(Medimmune))이다. MEDI0680 및 다른 항-PD-1 항체는 그 전문이 참조로 포함된 US 9,205,148 및 WO 2012/145493에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 MEDI0680의 CDR 서열 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR 서열), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 REGN2810 (레게네론(Regeneron))이다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 REGN2810의 CDR 서열 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR 서열), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 PF-06801591 (화이자(Pfizer))이다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 PF-06801591의 CDR 서열 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR 서열), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 BGB-A317 또는 BGB-108 (베이진(Beigene))이다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 BGB-A317 또는 BGB-108의 CDR 서열 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR 서열), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 INCSHR01210 또는 SHR-1210으로도 알려져 있는 INCSHR1210 (인사이트(Incyte))이다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 INCSHR1210의 CDR 서열 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR 서열), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 ANB011로도 알려져 있는 TSR-042 (테사로(Tesaro))이다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 TSR-042의 CDR 서열 중 1개 이상 (또는 집합적으로 모든 CDR 서열), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
추가로 알려져 있는 항-PD-1 항체는 예를 들어 그 전문이 참조로 포함된 WO 2015/112800, WO 2016/092419, WO 2015/085847, WO 2014/179664, WO 2014/194302, WO 2014/209804, WO 2015/200119, US 8,735,553, US 7,488,802, US 8,927,697, US 8,993,731 및 US 9,102,727에 기재된 것들을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 본원에 기재된 항-PD-1 항체 중 1종과 동일한 PD-1 상의 에피토프와의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그에 결합하는 항체이다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 예를 들어 그 전문이 참조로 포함된 US 8,907,053에 기재된 바와 같은 PD-1 신호전달 경로를 억제하는 펩티드이다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 이뮤노어드헤신 (예를 들어, 불변 영역 (예를 들어, 이뮤노글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 이뮤노어드헤신)이다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 AMP-224 (예를 들어 그 전문이 참조로 포함된 WO 2010/027827 및 WO 2011/066342에 개시된 B7-DCIg (암플리뮨(Amplimmune)))이다.
상기에 따라 본 발명은 추가 측면을 제공한다:
본 발명의 항체를 또 다른 활성제와 함께 투여하는 경우, 공-투여되는 조합 화합물의 투여량은 당연히 사용되는 공동-약물의 유형, 사용되는 특정한 약물, 치료되는 상태 등에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 인간 항체를 포함하는 조성물 및 사용에 대한 지침서로 이루어진 키트가 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 키트는 적어도 1종의 추가의 시약, 또는 1종 이상의 추가의 본 발명의 항체를 추가로 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 내용물의 의도되는 용도를 지시하는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나, 또는 달리 키트에 동반되는 임의의 문서 또는 기록된 자료를 포함한다. 키트는 환자가 항-TGF베타-2 항체 치료에 반응할 군에 속하는지를 진단하기 위한 도구를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 키트는 동결건조된 형태의 본 발명의 항체, 희석제 및 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 본 발명이 충분히 기재되었으나, 하기 실시예 및 청구범위에 의해 추가로 설명되며, 이는 예시적인 것이고 추가로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
서열/서열 표
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본 발명의 수행 방식
HuCAL 플라티눔(HuCAL PLATINUM)® 패닝
파지미드 라이브러리는 HuCAL® 개념 (Knappik et al., J Mol Biol 296, 57-86. 2000)에 기초하고, Fab를 파지 표면 상에 디스플레이하기 위한 시스디스플레이(CysDisplay)® 기술을 사용한다 (WO 01/05950).
TGF-β2에 대한 비드-기반 패닝
비드-기반 패닝 전에, 항원을 카르복시 비드 (디나비즈(Dynabeads)® M-270 카르복실산, 인비트로젠(Invitrogen))에 고정시켜야 했다. 파지 풀당, 1x107개의 항원 코팅된 비드를 PBS/0.1% 트윈(Tween)20/5% 분유로 차단하였다. 동시에, 각각의 패닝에 대해 HuCAL 플라티눔® 파지-항체를 동등 부피의 PBS/0.05% 트윈20/5% 분유/5% BSA로 차단하였다. 비드-결합 파지의 제거를 위해, 각각 0.5-1.0x107개의 BSA 코팅된 비드를 사용하여 차단된 파지 입자의 사전-흡착을 2회 수행하였다. 이어서, 차단된 항원 코팅된 비드를 사전-흡착 및 차단된 파지 입자에 첨가하고, 회전기 상에서 RT (실온)에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 항원 코팅된 비드에 결합된 파지 입자를 자기 분리기로 수집하였다. 비특이적으로 결합된 파지를 PBS/0.05% 트윈20 및 PBS를 사용하여 여러 세척 단계에 의해 세척하고, 특이적으로 결합된 파지를 DDT를 사용하여 항원 코팅된 비드로부터 용리시켰다. 이어서, DTT 용리액을 이. 콜라이 TG1로 옮기고, 파지 감염을 위해 37℃에서 수조에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 박테리아 펠릿을 2xYT 배지 중에 재현탁시키고, LB/Cam 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, o/n 인큐베이션하였다. 콜로니를 플레이트로부터 긁어내고, 파지 구출, 선택된 클론의 폴리클로날 증폭, 및 파지 생산에 사용하였다. 정제된 파지를 사용하여 다음 패닝 라운드를 시작하였다. 보다 엄격한 세척 조건이 적용된 것을 제외하고 제1 라운드의 프로토콜에 따라 비드-기반 패닝의 제2 및 제3 라운드를 수행하였다.
TGF-β2에 대한 용액 패닝
용액 패닝을 위한 전제조건은 항원의 비오티닐화, 및 비오티닐화된 항원의 보유 활성의 확인이었다. 용액 패닝 동안, Fab 디스플레이 파지 및 비오티닐화된 항원을, 파지에 의한 항원의 접근성을 용이하게 하는 용액 중에서 인큐베이션하였다.
스트렙타비딘-커플링된 자기 비드를 사용한 용액 패닝 프로토콜
파지 풀당, 4 mg 스트렙타비딘 비드 (디나비즈® M-280 스트렙타비딘, 인비트로젠)를 1x 케미블로커(Chemiblocker)로 차단하였다. 동시에, 각각의 패닝에 대해, HuCAL 플라티눔® 파지-항체를 케미블로커/ 0.1% 트윈20으로 차단하였다. 후속적으로, 스트렙타비딘- 또는 비드-결합 파지의 제거를 위해, 각각 스트렙타비딘 비드를 사용하여 차단된 파지 입자의 사전-흡착을 2회 수행하였다. 이어서, 100nM 비오티닐화된 항원 TGF-β2를 사전-흡착 및 차단된 파지 입자에 첨가하고, 회전기 상에서 RT에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 2mg 차단된 스트렙타비딘 비드를 사용하여 파지-항원 복합체를 포획하고, 스트렙타비딘 비드에 결합된 파지 입자를 자기 분리기로 수집하였다. 비특이적으로 결합된 파지를 PBS/0.05% 트윈20 및 PBS를 사용하여 여러 세척 단계에 의해 세척하였다. 특이적으로 결합된 파지를 DDT를 사용하여 스트렙타비딘 비드로부터 용리시켰다. 이어서, DTT 용리액을 이. 콜라이 TG1로 옮기고, TG1 및 DTT 용리액의 믹스를 파지 감염을 위해 인큐베이션하였다. 박테리아 펠릿을 2xYT 배지 중에 재현탁시키고, LB/Cam 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, o/n 인큐베이션하였다. 콜로니를 플레이트로부터 긁어내고, 파지 구출, 선택된 클론의 폴리클로날 증폭, 및 파지 생산에 사용하였다. 정제된 파지를 사용하여 다음 패닝 라운드를 시작하였다. 감소된 양의 항원 및 보다 엄격한 세정 조건을 제외하고 제1 라운드의 프로토콜에 따라 용액 패닝의 제2 및 제3 라운드를 수행하였다.
RapMAT® 패닝
증가된 친화도를 갖는 특이적 항체를 수득하기 위해, RapMAT® 패닝을 수행하였다 (Prassler et al., Immunotherapy 1, 571-583. 2009). 이 목적을 위해, 상기 기재된 바와 같은 항원 TGF-β2를 사용하여 비드-기반 또는 용액 패닝의 2회 라운드를 수행하였다.
a) LCDR3 RapMAT®의 경우: 패닝의 제2 라운드 후에, 파지 유래 pMORPH30® 벡터 DNA의 Fab-코딩 단편을 효소적으로 소화시키고, LCDR3을 다양화하기 위해 TRIM™ LCDR3 성숙 카세트를 효소적 라이게이션 (Virnekas et al., 1994)에 의해 삽입하였다.
b) HCDR2 RapMAT®의 경우: 패닝의 제2 라운드 후에, 파지 유래 pMORPH®30 벡터 DNA의 Fab-코딩 단편을 효소적으로 소화시키고, HCDR2를 다양화하기 위해 TRIM™ HCDR2 성숙 카세트 (Virnekas et al., Nucleic Acids Res 22, 5600-5607. 1994)를 효소적 라이게이션에 의해 삽입하였다.
라이게이션 혼합물을 이. 콜라이 TOP10F´ 세포에 전기천공시켜 > 5x106개의 비의존성 콜로니를 생성하였다. 생성된 라이브러리를 증폭시키고, 각각 용액 패닝의 제3 및 제4 라운드에 대해 5nM 및 0.5nM의 항원 농도를 사용하여 증가된 엄격도를 갖는 패닝의 라운드에 2회 더 적용하였다.
선택된 Fab 단편의 서브클로닝 및 스크리닝 규모 발현
가용성 Fab의 신속 발현을 용이하게 하기 위해, 선택된 HuCAL 플라티눔® 파지의 Fab 코딩 삽입물을 pMORPH®30 디스플레이 벡터로부터 pMORPH®x11 발현 벡터 pMORPH®x11_Fab_FH 내로 서브클로닝하였다. 이. 콜라이 TG1-F- 단일 클론의 형질전환 후에, HuCAL®-Fab 단편을 함유하는 주변세포질 추출물의 발현 및 제조를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Rauchenberger et al., J Biol Chem 278, 38194-38205. 2003).
마스터플레이트의 생성
클로람페니콜 내성 단일 클론을 2xYT-CG (34 μg/ml 클로람페니콜 (Cam); 0.1% 글루코스) 배지로 사전-충전된 멸균 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 내로 골라넣고, 37℃에서 o/n 성장시켰다. 다음날 아침, 글리세롤을 함유하는 멸균 2xYT 배지를 마스터플레이트의 각 웰 내에 첨가하고; 플레이트를 알루미늄 호일로 밀봉하고, -80℃에서 저장하였다. 하기 2개의 챕터는 각각 384- 및 96-웰 포맷에서의 Fab-발현 이. 콜라이로부터의 용해물의 제조를 기재한다. 이들 발현 플레이트는 이후 스크리닝 접근법에 사용된다.
ELISA 및 FMAT 스크리닝을 위한 Fab 함유 박테리아 용해물의 제조
각각의 o/n 배양물 5 μl를 웰당 40 μl 2xYT-CG 배지 (34 μg/ml 클로람페니콜 (Cam); 0.1% 글루코스)로 사전-충전된 멸균 384-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 배양물이 약간 혼탁할 때까지 37℃에서 인큐베이션하고, Cam 및 IPTG를 함유하는 2xYT 배지를 웰당 첨가하였다. 밤새 인큐베이션 후에, BEL 완충제 (2.5mg/ml 리소자임, 4mM EDTA, 10U/μl 벤조나제)를 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다.
pSMAD3 슈어파이어(SureFire)® 검정을 위한 Fab 함유 박테리아 용해물의 제조
각각의 o/n 배양물 5 μl를 웰당 100 μl 2xYT-CG 배지 (34 μg/ml Cam; 0.1% 글루코스)로 사전-충전된 멸균 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 배양물이 약간 혼탁할 때까지 22℃에서 인큐베이션하고, CAM 및 IPTG를 함유하는 2xYT 배지를 웰당 첨가하였다. 다음날 아침, 박테리아를 원심분리에 의해 스핀 다운시키고, 상청액을 버리고, BEL 완충제 (2.5 mg/ml 리소자임, 컴플리트(Complete) (w/o EDTA; 로슈(Roche)), 20 U/ml 벤조나제)를 각 웰 내에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션하고, BEL-용해물 (BEL 완충제를 사용함으로써 생성된 용해물)을 원심분리하여 박테리아 세포 파편을 스핀 다운시켰다. Fab 함유 상청액을 스크리닝 목적 (예를 들어, pSMAD3 슈어파이어® 검정)으로 사용하였다.
Fab-함유 미가공 박테리아 용해물의 스크리닝
ELISA 스크리닝
ELISA 스크리닝을 사용하여, 패닝 산출물로부터 표적 항원 인간 TGF-β2 단백질에 대한 결합에 대해 단일 Fab 클론을 확인한다. Fab는 상기 기재된 Fab 함유 조 이. 콜라이 용해물을 사용하여 시험한다.
직접적으로 코팅된 항원에 대한 ELISA 스크리닝
이러한 접근법은 SET 전에 일부 RapMAT® 패닝의 스크리닝에 사용하였다. 맥시소르프(Maxisorp)™ 384-웰 플레이트를 PBS 중에서 각각 5 μg/ml 또는 1 μg/ml의 농도에서 마우스 TGF-β2로 코팅하였다. PBS 중 5% 탈지 분유를 사용한 플레이트의 차단 후, Fab-함유 이. 콜라이 용해물을 첨가하였다. 아토포스(Attophos) 형광 기질 (로슈, #11681982001)을 사용하여 알칼리성 포스파타제에 접합된 F(ab)2 특이적 염소 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research), #109-055-097) (1:5000 희석됨)에 의해 Fab의 결합을 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
비오티닐화된 항원의 ELISA 스크리닝 (Fab 포획 ELISA)
항-TGF-β2 Fab 항체의 인간 TGF-β2 및 마우스 TGF-β2에 대한 특이성 및 래트 TGF-β3, 인간 TGF-β1에 대한 교차반응성을 ELISA 세팅에서 평가하였다.
이를 위해, 달리 언급되지 않는 한, 맥시소르프™ 384-웰 플레이트를 PBS 중에서 1:1000 희석된 Fd 단편 특이적 양 항-인간 IgG (더 바인딩 사이트(The binding site), #PC075)로 코팅하였다. PBS 중 5% 탈지 분유로 차단한 후에, Fab-함유 이. 콜라이 용해물을 첨가하였다. 후속적으로, 포획된 HuCAL® Fab 단편이 비오티닐화된 항원에 결합되도록 하였다. 비오티닐화된 항원의 하기 농도를 스크리닝에 사용하였다:
- 표준 패닝의 Fab 포획 ELISA 기반 스크리닝을 위한 1 μg/ml 비오티닐화된 인간 TGF-β2 / 비오티닐화된 트랜스페린 (관련없는 비오티닐화된 단백질에 대한 역 스크리닝을 위함);
- SET 전에 일부 RapMAT® 패닝의 Fab 포획 ELISA 기반 스크리닝을 위한 0.01 μg/ml 비오티닐화된 인간 TGF-β2;
비오티닐화된 항원에 결합된 항-TGF-β2 Fab 항체를 알칼리성 포스파타제 (포스파타제 (인비트로젠 (자이메드(Zymed)), #43-4322))에 접합된 스트렙타비딘과의 인큐베이션 후 아토포스 형광 기질 (로슈, #11681982001)의 첨가에 의해 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
FMAT 스크리닝
FMAT (형광측정 마이크로부피 검정 기술) 스크리닝을 사용하여, 비드 상에 고정화된 표적 항원 (항원 또는 BSA가 상기 기재된 바와 같은 카르복시 비드 상에 고정화됨)에 결합하기 위한 패닝 산출물로부터 단일 Fab 클론을 확인한다. Fab를 Fab 함유 조 이. 콜라이 용해물 (상기 기재된 바와 같이 제조됨)을 사용하여 시험한다.
Fab-함유 용해물 및 비드를 PBS/0.1% 트윈20/3% BSA에서 차단하였다. 차단된 용해물, 차단된 비드 및 Cy™5-접합된 아피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노리서치, # 109-176-097)를 FMAT 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 암실에서 실온에서 ~3시간 동안 인큐베이션하였다. FMAT 판독을 제조업체의 지침서에 따라 8200 세포 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 사용하여 수행하였다.
SET 스크리닝
친화도 등급화를 원칙적으로 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 문헌 [Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184 2005]에 의해 기재된 원칙에 기초한 용액 평형 적정에 의한 성숙 결합제의 등급화를 위해, 일정한 양의 희석된 BEL 추출물 (BEL 완충제: 2.5mg/ml 리소자임, 4mM EDTA, 10U/μl 벤조나제를 사용함으로써 생성된 용해물)을 상이한 농도의 항원으로 밤새 평형화하였다.
이어서, 혼합물을 이전에 항원으로 코팅한 MSD 플레이트로 옮기고, 인큐베이션 및 세척한 후, 적합한 MSD-술포-태그 표지된 검출 항체를 첨가하였다.
후속적으로, 미결합 Fab의 농도를 섹터 이미저 6000 (메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 ECL 검출을 통해 정량화하였다. 결과를 XL피트 (IDBS) 소프트웨어를 사용하고 상응하는 피트 모델 (하기 참조)을 적용하여 처리하여 친화도를 추정하고, 이에 따라 성숙에 의해 가장 개선된 클론을 확인하였다.
HuCAL® Fab 단편의 발현 및 정제
이. 콜라이에서의 His-태그부착된 HuCAL® Fab 단편의 미세-발현 및 -정제
50ml 팔콘에서 0.1% 글루코스, 34μg/ml 클로람페니콜 및 0.1mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토-피라노시드)로 보충된 25ml의 2xYT 배지를 사용하여 이. 콜라이 TG1 F- 세포에서 pMORPH®x11_Fab_FH에 의해 코딩되는 Fab 단편의 발현을 수행하였다. 배양물을 30℃에서 18시간 동안 진탕시켰다. 세포를 수거하고, 리소자임 및 버그 부스터(Bug Buster) 단백질 추출 시약 (노바젠(Novagen), 독일)의 조합을 사용하여 파괴하였다. His6-태그부착된 Fab 단편 (서열식별번호: 204로서 개시된 "His6")을 아이맥(IMAC) (퀴아젠(Qiagen), 독일)을 통해 단리하였다. D-튜브96™-투석기 (MWCO 6-8 kDa, 노바젠, 독일)를 사용하여 1x 둘베코 PBS(Dulbecco´s PBS) (pH 7.2)로의 완충제 교환을 수행하였다. 단백질 농도를 UV-분광광도측정법에 의해 결정하였다. 대표적으로 선택된 샘플의 순도를 변성, 환원 15% SDS-PAGE에서 분석하였다.
이. 콜라이에서의 His-태그부착된 HuCAL® Fab 단편의 발현 및 정제
진탕 플라스크 배양물에서 0.1% 글루코스 및 34 μg/ml 클로람페니콜로 보충된 500 ml의 2xYT 배지를 사용하여 이. 콜라이 TG1 F- 세포에서 pMORPH®x11_Fab_FH에 의해 코딩되는 Fab 단편의 발현을 수행하였다. 배양물을 30℃에서 OD600이 0.5의 값에 도달할 때까지 진탕시켰다. Fab 발현을 0.75mM의 최종 농도의 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)의 첨가 및 30℃에서 20시간 동안의 추가 배양에 의해 유도하였다. 세포를 수거하고, 리소자임을 사용하여 파괴하였다. His6-태그부착된 Fab 단편 (서열식별번호: 204로서 개시된 "His6")을 아이맥 (바이오-라드(Bio-Rad), 독일)을 통해 단리하고, 이미다졸을 사용하여 용리시켰다. PD10 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 독일)을 사용하여 1x 둘베코 PBS (pH 7.2)로의 완충제 교환을 수행하였다. 샘플을 멸균 여과하였다 (0.2μm). 단백질 농도를 UV-분광광도측정법에 의해 결정하였다. 샘플의 순도를 변성, 환원 15% SDS-PAGE에서 분석하였다. Fab 제제의 균질성을 보정 표준을 갖는 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의해 본래 상태에서 결정하였다.
기능적 생물-검정
리포터 유전자 검정 (RGA)
HEK293T/17 세포주의 배양
HEK293T/17 세포를 10% FBS (소 태아 혈청), 2mM L-글루타민, 페니실린 (50 IE/ml) 및 스트렙토마이신 (50μg/ml)을 함유하는 DMEM (둘베코 변형 이글 배지)에서 유지하였다. 세포를 37℃ 및 5％ CO2의 인큐베이터 내에서 성장시키고, 3-4일마다 계대배양하였다. 아쿠타제(Accutase)™를 사용하여 세포를 탈착시킨 다음, 신선한 배지를 함유하는 새로운 플라스크로 옮겼다. CAGA-12 luc로 안정적으로 형질감염된 HEK293T/17 세포를 모 HEK293T/17 세포에 대해 상기 기재된 바와 같이 배양하되, 세포 성장 배지를 FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신에 더하여 4 mM L-글루타민 및 3μg/ml 블라스티시딘으로 보충하였다.
TGF-β-단백질 유도된 루시페라제 리포터 유전자 검정
다른 TGF-β1, TGF-β3, 미오스타틴, 액티빈 및 GDF-11에 대한 TGF-β2-유도된 신호전달 및 특이성을 억제하는 항-TGF-β2 항체의 능력을 결정하기 위해, 안정한 리포터 세포주 HEK293T/17 CAGA-12 luc를 사용하는 리포터 유전자 검정을 수행하였다. CAGA-12 루시페라제 리포터 구축물은 인산화된 Smad-2 및 Smad-3에 특이적인 최소 프로모터 및 다중 CAGA 박스의 하류에 루시페라제 유전자를 보유한다. 정제된 재조합 TGF-β2 (뿐만 아니라 TGF-β3, TGF-β1, 미오스타틴, GDF-11 및 액티빈)의 첨가는 Smad-2 및 Smad-3 인산화를 유도하고, 그에 따라 CAGA-12 리포터에 결합하고 루시페라제 유전자 발현으로 이어진다. HEK293T/17 CAGA-12 luc 세포의 90% 전면생장률에서, 세포를 아큐타제를 사용하여 탈착시키고, 2.5x105개 세포/ml의 농도로 검정 배지 (2% FBS 및 2mM L 글루타민으로 보충된 DMEM) 중에 희석하였다. 후속적으로, 웰당 100μl 세포를 백색 편평-바닥 96-웰 플레이트 (BD 팔콘, # 353296) 내로 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 목적하는 농도의 TGF-β2 항체 (Fab 또는 IgG) 및 TGF-β 단백질을 PBS 중에서 혼합하였다. 혼합물 중 항원의 최종 농도는 본 검정에서의 그의 각각의 ~EC80 농도에 상응하고, 하기와 같다: TGF-β1/2/3 단백질 - 12pM (활성 이량체), 액티빈 A, GDF-8, GDF-11 - 1nM (활성 이량체) 및 액티빈 B, 액티빈 AB - 100pM (활성 이량체). 항원 및 항체를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 검정 배지를 세포로부터 제거하고, 혼합물을 시딩된 세포에 첨가하였다. 밤새 인큐베이션한 후에, 검정 배지를 제거하고, 70 μl의 PBS (CaCl2 및 MgCl2 함유)를 각 웰에 첨가하였다. 실온에 적응시킨 후에, 50 μl의 새로 제조된 브라이트라이트 플러스(BriteLite Plus) 시약 (퍼킨엘머(PerkinElmer), # 6016761)을 각 웰에 첨가하였다. 5분 인큐베이션 시간 후에, 발광을 발광측정기 (제니오스프로(GeniosPro), 테칸(Tecan))에서 판독하였다. 반수 최대 억제 농도 (IC50 값)는 각각의 항체의 완전한 적정 후에 프리즘(Prism) 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))를 사용하여 계산하였다.
수용체/리간드 상호작용 Elisa
억제 Fab가 인간 TGF-βRIII/Fc의 TGF-β2 결합 부위를 차단하는 것을 통해 작용하는지를 평가하기 위해, TGF-β 수용체-TGF-β 상호작용 ELISA를 수행하였다.
TGF-β2 - TGF-βRIII 상호작용 검정
이를 위해, 맥시소르프™ 384-웰 플레이트를 밤새 4℃에서 2 μg/ml (~22nM) TGF-βRIII (알앤디 시스템즈, #LF1309051)으로 코팅하였다. 1.25μg/ml (~100nM) 비오티닐화된 인간 TGF-β2를 30분 동안 상이한 Fab / IgG 농도로 인큐베이션한 다음, 케미블로커로 차단된 코팅된 웰에 첨가하였다. 결합된 비오티닐화된 인간 TGF-β2를 알칼리성 포스파타제 (인비트로젠 (자이메드), #43-4322)에 접합된 스트렙타비딘과 함께 인큐베이션한 후 아토포스 형광 기질 (로슈, #11681982001)의 첨가에 의해 검출하였다. 535nm에서의 형광 방출을 430nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
pSMAD3 슈어파이어® 검정
이 기능적 스크리닝을 위해, 특수하게 제조된 Fab-함유 박테리아 용해물 (BEL 완충제)을 포스포-SMAD3 (Ser423/425)에 대한 알파스크린(AlphaScreen)® 슈어파이어® 키트 (퍼킨엘머# TGRSM3S10K) 및 알파스크린® IgG(단백질A) 검출 키트 (# 6760617C)를 사용하여 HEK293T 세포에서의 TGF-β-유도된 Smad3 인산화를 결정하는 데 사용하였다. BEL 용해물 (BEL 완충제를 사용함으로써 생성된 용해물)의 TGF-β2/3 중화 능력을 결정하기 위해, 리포터 세포주 HEK293T (CAGA-12 루시페라제)로부터의 웰당 8.000개의 세포를 검정 배지 (2% FBS 및 2mM L-글루타민으로 보충된 DMEM) 중의 콜라겐 코팅된 프록시플레이트™ 내로 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음날, 각각 0.3ng/ml TGF-β2 또는 3으로 보충된 75μl의 무혈청 검정 배지 및 25μl의 BEL 용해물을 함유하는 마스터 플레이트를 제조하였다. 종이 수건 상에서 플레이트를 털고 태빙(tabbing)함으로써 검정 배지를 세포로부터 제거하였다. 이어서, 마스터 플레이트로부터 15 μl를 HEK293T 세포로 옮기고, 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 자극하였다. 배지를 제거하고, 4μl 1x 용해 완충제를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 -80℃에서 분석할 때까지 저장하였다. 분석을 위해 5μl "수용자 비드 믹스"를 2시간 동안 첨가한 후, 2μl "공여자 비드 믹스"를 첨가하고, 추가의 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 알파스크린 플레이트 판독기 상에서 알파스크린 세팅을 사용하여 판독하였다.
골격근 세포 분화 검정 (크레아틴 키나제 (CK) 검정)
인간 골격근 세포 (HsKMC; 론자)를 20% FCS (PAA)로 보충된 골격근 기초 배지 (skBM; 론자)로 이루어진 성장 배지 (GM)를 사용하여 96-웰 플레이트 (7500개 세포/웰)에서 배양하였다. skBM으로 이루어진 무혈청 분화 배지 (DM)로 교환함으로써 시딩한 후 24 내지 48시간에 분화를 개시하였다. 분화의 개시 시에 0.3ng/ml TGF-β2 및 7개의 상이한 농도 (최대 3μg/ml)의 각각의 IgG1을 첨가함으로써 HuSKMC 분화에 대한 효과를 평가하고, 세포를 최대 120시간 동안 근관으로 분화시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 리포터 용해 완충제 (프로메가(Promega))로 용해시키고, -80℃에서 측정할 때까지 저장하였다. CK 활성을 CK (IFCC) 시약 (써모 일렉트론(Thermo Electron))을 사용하여 측정하였다. CK 시약을 제조업체의 지침서에 따라 제조하였다. 실온 (RT)으로 조정되게 하기 위해, 검정 플레이트를 측정 전 적어도 90분에 -80℃ 동결기에서 꺼냈다. 각 웰에 75μl CK 시약을 첨가한 후에 (플레이트 설계 참조), 검정 플레이트를 즉시 ELISA 판독기로 옮기고, 흡광도를 340 nm에서 20분 동안 1분 판독 간격으로 판독하였다. CK 활성을 계산하기 위해, 표준 곡선 (0.02-40 μg/ml)을 토끼 근육으로부터의 CK (#10127566001; 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))를 사용하여 리포터 용해 완충제 중에서 새로 제조하였다.
단백질 함량을 비신코닌산 (BCA) 시약 (#BCA-1; 시그마)을 사용하여 결정하였다. BCA 시약을 제조업체의 지침서에 따라 제조하였다. 각 웰에 200 μl BCA 시약을 첨가한 후에, 검정 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 흡광도를 562 nm에서 판독하였다. 단백질 함량을 계산하기 위해, 단백질 표준 곡선 (리포터 용해 완충제 중 0.25-1 mg/ml)을 제조하였다. CK 활성을 하기와 같이 계산하였다 (또한 문헌 [Florini et al. 1989] 참조). 기록된 각각의 21개 시점에서의 흡광도 값의 평균을 내고, 플롯팅하였다. 이들 플롯의 선형 부분으로부터, 최대 기울기를 선형 회귀 (시그마플롯(SigmaPlot) 소프트웨어를 사용함)에 의해 결정하고, CK 표준 곡선의 도움을 받아 CK 활성 (m단위)으로 전환시켰다. 이어서, 값을 상응하는 단백질 함량으로 정규화하고, CK 활성을 m단위/mg 단백질 또는 대조군의 백분율로 표시하였다.
가능한 경우, EC50 값 (반수-최대 효과를 유발하는 농도) 및 Emax (최대 효과)를 생성하는 S자형 곡선 피팅 (XL피트 소프트웨어를 사용함)에 의해 농도-반응 데이터를 평가하였다.
친화도 결정
표면 플라즈몬 공명 (비아코어)을 사용한 친화도 결정
직접적 항원 고정을 위해, 표준 EDC-NHS 아민 커플링 화학을 사용하였다. CM5 칩 (비아코어, 스웨덴)을 10mM 아세테이트 완충제, pH 4.5 중에서 적절한 공명 단위 (RU)의 인간- 또는 마우스-TGF베타-2/Fc (항원의 활성에 따름)로 코팅하였다. 참고 유동 세포에 대해, 각각의 양의 HSA를 사용하였다. 5μl 10mM 글리신/HCl 완충제 pH 1.5를 사용하여 재생을 수행하였다. 대안적으로, 항원을 직접적으로 고정시키지 않고, 항-인간-Fc 항체로 변형시킨 CM5 칩 상에 포획하였다 (Fc 포획 키트, 지이 헬스케어 / 비아코어). 참고 유동 세포에 대해서는, 포획 항체를 고정시켰지만 어떠한 항원도 포획되지 않았다. 5μL 3M MgCl2의 2회 주사를 사용하여 재생을 달성하였다. 동역학 측정은 Fab 샘플의 연속 희석 열을 사용하여 둘베코 PBS 중에서 20μl/분의 유량으로 수행하였다. Fab 농도는 15.6 내지 500nM 범위였다. 각각의 농도에 대한 주사 시간은 1분이었다. 해리 시간은 적어도 2분 (또는 그 초과, 결정된 친화도에 따름)으로 설정하였다. 구동 완충제의 블랭크 주사를 이중 참조로 사용하였다. BIA 평가 소프트웨어 3.2 (비아코어, 스웨덴)를 사용하여 모든 센소그램을 광범위하게 피팅하였다.
용액 평형 적정 (SET) 방법 (섹터 이미저 6000 (MSD))을 사용한 선택된 항-인간 TGF-β2 Fab 및 IgG의 친화도 결정
KD 결정을 위해, 항체 단백질의 단량체 분획을 사용하였다 (적어도 90% 단량체 함량, 분석용 SEC에 의해 분석됨; 각각, Fab에 대해서는 슈퍼덱스75(Superdex75) (아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)), 또는 IgG에 대해서는 도소(Tosoh) G3000SWXL (도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))). 용액에서의 친화도 결정을 기본적으로 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Friquet et al., J Immnunol Meth 77, 305-319. 1985). SET 방법의 감도 및 정확도를 개선시키기 위해, 고전적 ELISA에서 ECL 기반 기술로 바꾸었다 (Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184. 2005). 1 mg/ml 염소-항-인간 (Fab)2 단편 특이적 항체 (디아노바(Dianova))를 MSD-술포-TAG™ NHS-에스테르 (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 미국 메릴랜드주 게이더스버그)로 제조업체의 지침서에 따라 표지하였다. 실험을 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트, 및 검정 완충제로서 0.5% BSA 및 0.02% 트윈-20을 함유하는 PBS pH 7.4에서 수행하였다. 비표지된 항원을 예상 KD보다 적어도 10배 더 높은 농도에서 출발하여 2n 시리즈로 희석하였다. 항원이 없는 웰을 사용하여 Bmax 값을 결정하고; 검정 완충제만을 함유하는 웰을 사용하여 배경을 결정하였다. 적절한 양의 결합제의 첨가 후 (예상 KD와 유사하거나 그 미만의 항체 농도, 60 μl 최종 부피), 혼합물을 RT에서 밤새 인큐베이션하였다. MSD 플레이트를 항원으로 코팅하였다 (웰당 30 μl). 0.02% 트윈-20을 함유하는 PBS로 플레이트를 세척한 후, 평형화된 샘플을 이들 플레이트로 옮기고 (웰당 30 μl), 20분 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 웰당 30 μl의 MSD-술포-태그 표지된 검출 항체 (항-인간 (Fab)2, 전형적으로 1:2000 최종 희석)를 MSD 플레이트에 첨가하고, 에펜도르프(Eppendorf) 진탕기 (700 rpm) 상에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. MSD 플레이트를 세척하고 계면활성제를 함유하는 30 μl/웰 MSD 판독 완충제 T를 첨가한 후, 섹터 이미저 6000 (메소 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 전기화학발광 신호를 검출하였다.
데이터를 맞춤화된 피팅 모델을 적용한 XL피트 (IDBS) 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. Fab 분자의 KD 결정을 위해, 하기 피트 모델을 사용하였다 ((Abraham et al., J Mol Recognit. 9, 456-461.1996)에 따라 변형된 (Haenel et al., Anal Biochem 339, 182-184.2005)에 따름):
Figure pct00015
[Fab]t: 적용된 총 Fab 농도
x: 적용된 총 가용성 항원 농도 (결합 부위)
Bmax: 항원이 없는 Fab의 최대 신호
KD: 친화도
Fab의 친화도 결정
항-TGF-β2 Fab의 KD 결정을 기본적으로 하기와 같이 수행하였다: 모든 희석물에 대해, 인간 TGF-β2를 4 mM HCl을 사용하여 100 μg/mL로 사전희석하였다. 코팅을 위해, 항원을 PBS 중에서 0.05 μg/ml로 추가로 희석하고 (TGF-β2), 4℃에서 표준 MSD 플레이트 상에서 o/n 코팅하였다. 후속적으로, MSD 플레이트를 RT에서 1시간 동안 PBS 중 3% BSA로 차단하였다.
TGF-β1/3 및 역-표적에 대한 결합
TGF-β1, TGF-β3 및 역-표적 (미오스타틴, GDF-11, 액티빈 A, 액티빈 B 및 액티빈 AB)에 대한 결합의 SET 기반 분석을 위해, 각각 특이적 항원, 인간 TGF-β1 또는 TGF-β3을 기재된 바와 같이 코팅하였다. 시험될 단백질을 적정에 사용하고, 2n 시리즈로 희석하였다. 출발 농도는 각각 TGF-β1에 대해 2 μM, TGF-β3에 대해 0.05 μg/ml, 또는 모든 역 표적에 대해 100 nM이었다.
에피토프 비닝
맥시소르프™ 384-웰 플레이트를 PBS 중에 희석된 2.5 μg/ml의 TGF-β2 특이적 Fab를 사용하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 비오티닐화된 TGF-β2 단백질을 0.1 μg/ml (~8 nM)의 일정한 TGF-β2 농도를 갖는 용액 중의 Fab 및 TGF-β2 단백질에 비해 12.5 몰 과잉의 Fab (5 μg/ml (100 nM))에서 출발한 Fab의 적정액과 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, Fab - TGF-β2 복합체를 BSA로 차단된 Fab 코팅된 웰에 30분 동안 첨가하였다. 알칼리성 포스파타제 (인비트로젠 (자이메드), #43-4322)에 접합된 스트렙타비딘과의 인큐베이션 후 아토포스 형광 기질 (로슈, #11681982001)의 첨가에 의해, 결합된 비오티닐화된 TGF-β2를 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
IgG로의 전환
전장 IgG를 발현시키기 위해, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 단편을 Fab 발현 벡터로부터 인간 IgG1f_LALA에 대한 pMorph®4_hIg1f_LALA_카파 또는 pMorph®4_hIg1f_LALA_람다 벡터 내로 서브클로닝하였다.
HuCAL® 이뮤노글로불린의 생산
pMORPH®4 벡터 시스템을 사용한 인간 IgG의 일시적 탐색적 발현 및 정제. 진핵 HKB11 세포를 IgG의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 pMORPH®4 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 세포 배양 상청액을 형질감염후 제3일 또는 제7일에 수거하고, 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어(MabSelect SURE), 지이 헬스케어)에 적용하였다. 달리 언급되지 않는 한, 1x 둘베코 PBS (pH 7.2, 인비트로젠)로의 완충제 교환을 수행하고, 샘플을 멸균 여과하였다 (0.2 μm 세공 크기). IgG의 순도를 랩칩 시스템(Labchip System) (캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences), 미국 또는 미국 애질런트)을 사용하거나 또는 SDS-PAGE 상에서 변성, 환원 및 비-환원 조건 하에 분석하였다. 단백질 농도를 UV-분광광도측정법에 의해 결정하고, HP-SEC를 수행하여 IgG 제제를 본래 상태에서 분석하였다.
패닝, 항체 확인 및 특징화
항원 TGF-β2 단백질의 생물학적 활성을 중화시키는 치료 항체는 항체 변이체 단백질의 공급원으로서 상업적으로 입수가능한 파지 디스플레이 라이브러리인 모르포시스(MorphoSys) HuCAL 플라티눔® 라이브러리를 사용하여 높은 결합 친화도를 갖는 클론의 선택에 의해 생성하였다. HuCAL 플라티눔® 파지미드 라이브러리는 HuCAL® 개념에 기초하고 (Knappik et al., J Mol Biol 296, 57-86, 2000), Fab를 파지 표면 상에 디스플레이하기 위해 시스디스플레이(CysDisplay)® 기술을 사용한다 (WO 01/05950).
5가지 패닝 전략을 수행하였으며, 3가지는 비드-기반이고 2가지는 용액 패닝이었다. 표준 패닝의 제2 라운드의 산출물을 사용하여 RapMAT® 패닝을 수행하였다. 고도로 다양한 HuCAL® 항체를 선택할 확률을 증가시키기 위해, 라이브러리 풀을 주로 분리하여 유지하였다. 고친화도 항체를 생성할 확률을 증가시키기 위해, 표준 패닝의 제2 라운드 산출물을 사용하여 RapMAT®를 수행하였다. H-CDR2 및 L-CDR3을 개별적으로 다양화하였다. 표준 패닝 산출물을 인간 TGF-β2에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝 방법은 패닝 전략에 기초하여 선택하였다: 비드 패닝은 FMAT 접근법을 사용하여 스크리닝하고, 용액 패닝은 Fab 포획 ELISA 접근법을 사용하여 스크리닝하였다. TGF-β1에 대한 역 스크리닝은 FMAT를 사용하여 수행하였다. pSmad3 슈어파이어® 기반 스크리닝은 rh TGF-β2에 대한 패닝에 대해 수행하였다. RapMAT® 패닝 산출물을 주로 가장 많은 아핀 히트에 대해 SET 접근법을 사용하여 스크리닝하였다. pSmad3 슈어파이어® 기반 스크리닝은 표준 vs. RapMAT® 패닝의 일부로서의 rh TGF-β2에 대한 패닝에 대해 수행하였다. 이러한 방법을 사용하여, hTGF-β2의 억제를 분석하였다. hTGF-β2 및 TGF-β3 음성 클론을 선택하기 위한 엄격한 ELISA 스크리닝을 적용하였다. 추가적으로, SET 스크리닝은 높은 아핀 (TGF-β1에 대한 KD < 25 nM) TGF-β1 결합제를 배제시키기 위한 TGF-β1에 대한 역 스크리닝을 포함하였다. 표준 패닝의 1차 스크리닝에서 확인된 1차 히트 중에서, pSmad3 슈어파이어® 기반 스크리닝에서 확인된 27종의 모노클로날 TGF-β2 억제 항체를 통합하였다. 후속적으로, 27종의 고유한 통합된 클론 중 10종을 탐색적 규모로 발현 및 정제하였다. 이어서, 이들 정제된 Fab 단백질을 RGA에서 분석하였다. RapMAT® 패닝의 1차 스크리닝에서 확인된 1차 히트를 Fab-FH 포맷으로 미세-발현 및 -정제하고, 후속적으로 RGA에서 hTGF-β2, mTGF-β2, TGF-β3 및 TGF-β1의 억제에 대해 분석하였다. 이어서, pSmad3 슈어파이어® 스크리닝 접근법에서 확인된 mTGF-β2 억제 히트와 조합하여, 38종의 고유한 통합된 항체를 탐색적 규모로 Fab-FH 포맷으로 발현시키고, 또한 RGA에서 분석하였다. ELISA 및 서열분석에서 상이한 TGF-β 이소형에 대한 결합의 분석을 포함하는 통합 단계를 위해 가장 강력한 2차 히트를 선택하였다. 총 190종의 고유한 Fab가 모든 패닝 및 스크리닝 전략으로부터 통합될 수 있다. 190종의 고유한 통합된 항체의 서열 분석은 하기를 제시한다:
- 90 HCDR3 패밀리;
- 89 카파 및 101 람다 항체.
190종의 통합된 Fab를 이. 콜라이에서 발현시키고, 정제하였다. 190종의 발현된 Fab 중 169종은 품질 관리를 통과하였고, 인간 TGF-β2, 마우스 TGF-β2, 인간 TGF-β3 및 인간 TGF-β1의 억제에 대해 RGA에서 특징화되었다. 이 특징화의 결과에 기초하여, Rap클론®을 통한 hIgG1f_LALA 포맷으로의 전환을 위해 가장 유망한 116종의 항체를 선택하였다.
선택-발생가능성 평가 (s-DAS)를 포함한 IgG 특징화
116종의 IgG를 진핵 HKB11 세포에서 발현시키고, 정제하였다. 116종의 발현된 IgG 중 90종은 품질 관리를 통과하였고, 인간 TGF-β2, 마우스 TGF-β2, 인간 TGF-β3 및 인간 TGF-β1의 억제에 대해 RGA에서 특징화되었다. 항체의 높은 비율이 응집 성향으로 인한 높거나 적당한 발생가능성 위험을 갖는 것으로 밝혀졌다. 확장된 s-DAS 분석 내에서, 소수성 분석을 또한 수행하였다. 결과는 매우 소수성인 항체의 높은 비율을 보여주었다. 높은 소수성은 항체의 응집 경향과 상호관련되는 것으로 밝혀졌다: 높은 / 적당한 소수성을 갖는 항체의 높은 비율은 언급된 항체 중에서 낮은 발생가능성 위험을 갖는 것으로 언급된 항체에 비해 높거나 적당한 발생가능성 위험을 갖는 것으로 밝혀졌다.
후보의 특징화 (배선화 및 PTM 제거 전)
s-DAS를 통과한 56종의 항체는 RGA에서 친화도 및 효력을 나타내었다. RGA 및 CK 검정 및 확장된 s-DAS 데이터 (s-DAS + 소수성 평가)에서의 활성에 기초하여, 6종의 항 TGF-β2 항체를 생체내 특징화 및 PTM 제거/배선화를 위해 선택하였다. 이들 6종의 선택된 항체 (MOR12773, MOR13436, MOR13438, MOR12413, MOR13416, MOR13426)는 하기 요약된 다양한 검정에서 특징화되었다.
친화도 결정
항체 항원 상호작용의 KD 값은 상기 기재된 원리 및 조건에 따라 SET를 사용하여 결정하였다. TGF-β2 특이적 Ab MOR13436) 및 선택된 TGF-β2 항체에 대한 KD 값이 표 1에 요약된다. 이 프로젝트를 위한 KD 성공 기준을 인간 TGF-β2에 대해 200pM 미만이도록 설정하였다. 모든 선택된 TGF-β2 특이적 항체 후보가 이 기준을 충족시켰다. TGF-β2 특이적 항체는 바람직하게는 5배 완화된 기준으로 마우스 TGF-β2에 결합하여야 한다. 6종의 선택된 TGF-β2 특이적 항체 중 4종이 기준을 충족시켰다.
표 1 SET 측정에 의한 KD 결정 (배선화/PTM 제거 전)
Figure pct00016
n.a. 최대 2 μM까지 친화도 없음
역 표적에 대한 교차-반응성
TGF-β1 및 5종의 역 표적 (미오스타틴, GDF-11, 액티빈 A, 액티빈 B 및 액티빈 AB)에 대한 최종 항체의 결합 (PTM 제거 및 배선화 전)을 상기 기재된 원리 및 조건에 따라 SET를 사용하여 분석하였다. 모든 선택된 TGF-β2-특이적 Ab가 성공 기준을 충족시켰다.
RGA에서의 활성
최종 항체의 활성 (PTM 제거 및 배선화 전)을 상기 기재된 조건을 사용하여 RGA에서 hTGF-β2, mTGF-β2, TGF-β3 및 TGF-β1의 억제에 대해 분석하였다. MOR13436에 대한 RGA 활성 데이터의 예가 도 3에 제공된다. 이 프로젝트를 위한 RGA 성공 기준에서의 IC50을 인간 TGF-β2에 대해 200 pM 미만이도록 설정하였다. 모든 선택된 TGF-β2 특이적 항체 후보가 이 기준을 충족시켰다.
CK 검정에서의 활성
최종 항체의 활성 (PTM 제거 및 배선화 전)을 상기 기재된 조건을 사용하여 CK 검정에서 분석하였다. CK 검정 데이터는 CK 검정에서 일반적으로 더 낮은 효력을 갖는 RGA 데이터와 크게 상호관련되었다. 이 프로젝트를 위한 CK 검정 성공 기준에서의 IC50을 각각 인간 TGF-β2 및 TGF-β3 항체에 대해 1000 pM 미만이도록 설정하였다. MOR13436의 농도-반응 곡선에 대한 예가 도 5에 제시된다.
수용체-리간드 상호작용 검정
TGF-β2 - TGF-βRIII 결합을 억제하는 최종 항체의 능력 (PTM 제거 및 배선화 전)을 상기 기재된 조건을 사용하여 수용체-리간드 상호작용 검정에서 분석하였다.
최종 후보의 배선화/조작
표 2: TGF-β2 특이적 항체의 서열을 필요한 PTM 제거 및 배선화에 대해 분석하였다.
Figure pct00017
PTM 제거 및 배선화 후에 총 23종의 유도체를 pM4_hIgG1f_LALA_카파 또는 pM4_hIgG1f_LALA_람다에서 생성하였다. 표는 PTM 제거 및 배선화 후의 항체 유도체의 개관을 제공한다.
표 3: PTM 제거 / 배선화 후의 항체 유도체
Figure pct00018
RGA에서의 활성
최종 항체의 활성 (PTM 제거 및 배선화 후)을 상기 기재된 조건을 사용하여 RGA에서 hTGF-β2, mTGF-β2, TGF-β3 및 TGF-β1의 억제에 대해 분석하였다. 데이터는 표 4에 요약된다.
CK 검정에서의 활성
최종 항체의 활성 (PTM 제거 및 배선화 후)을 상기 기재된 조건을 사용하여 CK 검정에서 분석하였다. CK 검정 데이터는 표 4에 요약된다.
표 4: TGF-b2-특이적 Ab의 결합 및 생물학적 활성
Figure pct00019
CK: 골격근 세포 분화 검정 (크레아틴 키나제); n.e. 최대 100 nM까지 효과 없음
역 표적에 대한 교차-반응성 (RGA)
TGF-β3 및 5종의 역 표적 (미오스타틴, GDF-11, 액티빈 A, 액티빈 B 및 액티빈 AB)에 대한 최종 항체의 교차-반응성 (PTM 제거 및 배선화 후)을 상기 기재된 조건을 사용하여 RGA에서 분석하였으며, 표 4에 제시된다.
요약하면, TGF-β3 및 5종의 역 표적의 농도 의존성 억제를 시험된 항체 중 어느 것에 대해서도 검출할 수 없었다. 최종 항체를 또한 TGF-β1의 억제에 대해 시험하였다. 항체 중 어느 것도 최대 100 nM IgG까지 TGF-β1의 농도 의존성 억제를 나타내지 않았다.
통계적 분석
결과는 평균 +/-SEM으로 표시된다. 일원 분산 분석에 따른 던넷(Dunnett) 다중 비교 시험을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 처리 (항-TGF-β2 항체 MOR14797, MOR14799, MOR14800, MOR14805, MOR14809 및 MOR14787이 대조군 항체와의 차이에 대해 시험됨) 및 차이는 확률 값이 < 0.05인 경우에 유의한 것으로 여겨졌다: *: P < 0.05, **: P < 0.01, NS: IgG 대조군에 대해 유의하지 않음. 통계적 분석은 그래프패드 프리즘 버전 5.0 (그래프패드 소프트웨어, 인크.)에 의해 수행하였다. 체중은 제0일의 체중을 감하여 계산하였고, 근육 중량은 제0일의 체중 (최초 체중)에 의해 정규화하였다.
듀피트렌병을 앓고 있는 환자로부터의 조직 내의 항-TGF-β2 항체의 생체외 시험
면역조직화학 및 mRNA에 의해 섬유증 마커를 측정하여 그의 항섬유화 활성을 결정하기 위해 듀피트렌 구축 질환의 최근 기재된 3-D 생체외 배양 시스템 (Karkampouna et al. 2014, Molecular Therapy - Nucleic Acids, (2014) 3, e142)에서 TGF-β2-특이적 Ab MOR14797을 시험하고 범-TGF-β Ab 1D11과 비교하였다. 결과는 도 7 및 8에 제시된다. 생체외 모델은 문헌 [Karkampouna et al. 2014]에 기재된 바와 같이 이루어졌다. 환자 조직을 슬라이싱하고, 니트로셀룰로스 막 상에서 3 μg/ml의 항체의 존재 하에 7일 동안 배양하였다. 제7일에 조직 슬라이스를 mRNA 단리를 위해 수집하거나, 또는 면역조직화학 분석에 사용되는 경우 동결포매를 위해 고정 및 처리하였다.
면역조직화학을 위해, 5 μm 절편을 절단하고, 콜라겐1 및 α-평활근 액틴에 대한 항체로 염색하였다. 핵을 핵 염료 DAPI를 사용하여 평가하였다. 표지된 시편의 공초점 현미경을 사용하여 절편당 3개의 이미지를 수득하고, 영상화 분석에 의해 정량화하였다. RNA 분석을 위해, 총 RNA를 단리하고, 정량적 PCR (qPCR)을 수행하였다. 결과는 하우스-키핑 유전자의 발현에 대해 정규화된 mRNA 발현으로서 제시된다. 3명의 상이한 환자로부터의 배양물에서, MOR14797 3 μg/ml는 면역조직화학에 의한 측정 시에 섬유증 마커 콜라겐 1 및 α-평활근 액틴 (SMA; 도 7 참조)을 효과적으로 감소시켰고; MOR14797은 범-TGF-β AB 1D11보다 더 효과적이었다. 2명의 추가의 환자로부터의 배양물에서, 섬유증 마커 콜라겐 1 및 α-평활근 액틴의 용량-의존성 (0.03 - 3 μg/ml) 감소가 나타났다. TGF-β2-특이적 Ab MOR14797의 콜라겐 1 면역염색 억제의 예는 도 8에 제시된다. MOR14797은 또한 mRNA 수준에서 다양한 섬유증 마커의 발현을 감소시켰다.
일측성 요관 폐쇄 (UUO) 마우스 신장 섬유증 모델에서의 생체내 시험
mRNA에 의해 섬유증 마커를 측정하여 그의 항섬유화 활성을 결정하기 위한 마우스 신장 섬유증 모델, 일측성 요관 폐쇄 (UUO)에서의 TGF-β2-특이적 Ab MOR13436. 결과는 도 9에 제시된다. 생체외 모델이 문헌 [Kitamoto et al. 2009 (J Pharmacol Sci, 111, 285-292)]에 기재된 바와 같이 이루어졌다. 간략하게, UUO를 좌측 요관의 완전한 라이게이션에 의해 수행하고, 14일 동안 5 mg/kg의 TGF-β2-특이적 AB MOR14346으로 치료하였다. 신장을 mRNA 단리를 위해 수집하였다. RNA 분석을 위해 총 RNA를 단리하고, 정량적 PCR (qPCR)을 수행하였다. 결과는 하우스-키핑 유전자의 발현에 대해 정규화된 mRNA 발현으로서 제시된다.
인간 TGFβ-2 / MOR14797 Fab 복합체의 X선 결정 구조
MOR14797의 Fab 단편 (서열식별번호: 69 (부분적 서열) 및 79, 표 5)에 결합된 인간 TGFβ-2 (잔기 303 - 414, 서열식별번호: 122)의 결정 구조를 결정하였다. 하기 상술된 바와 같이, 복합체의 개별 성분을 개별 발현 시스템을 사용하여 생산하고, 조합하여 정제된 복합체를 생성하였다. 이어서, X선 결정학을 사용하여 MOR14797 Fab에 결합된 TGFβ-2에 대한 회절 데이터를 생성하였으며, 이는 항원-결합 부위를 규명한다.
표 5: 결정 구조 결정에 사용되는 단백질
Figure pct00020
단백질 생산
IgG의 파파인 절단으로부터의 Fab 생산: MOR14797 Fab는 고정화된 파파인 (써모 사이언티픽 피어스(Thermo Scientific Pierce))을 사용한 전장 MOR14797 IgG의 절단에 의해 생산하였다. 20 mM 인산나트륨 (pH 7.0), 10 mM EDTA 중 20 mg/ml의 MOR14797 IgG를 고정화된 파파인과 80:1의 중량비로 혼합하고, 혼합물을 회전 플랫폼 상에서 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, Fab 및 Fc 단편을 중력 유동 칼럼을 사용하여 고정화된 파파인으로부터 분리하였다. 이어서, 수집된 유동 통과액을 하이트랩 맙셀렉트 슈어(HiTrap MabSelect SURE) 칼럼 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스) 상에 로딩하여 임의의 Fc 단편을 제거하였다. 이어서, Fab-함유 유동 통과액을 농축시키고, 20 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl로 평형화된 하이로드(HiLoad) 16/600 슈퍼덱스 200 칼럼 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스) 상에 로딩하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE에 의한 분석에 적용한 다음, 조합된 분획을 사용하여 TGFβ-2와의 복합체를 형성하였다.
TGFβ-2 - MOR14797 Fab 복합체의 시험관내 재구성: 1 mg/ml의 농도의 Fab를 1:10 (v/v)의 1 M 시트르산삼나트륨 (pH 3.5)을 첨가함으로써 산성화시켰다. 이어서, 정제된 TGFβ-2를 MOR14797 Fab와 1:1.5의 몰비 (OD A280에 의해 측정된 농도)로 혼합하였다. 복합체를 1:5 (v/v)의 1 M 트리스-HCl (pH 8.5)로 중화시킨 다음, 농축시킨 후 20 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl로 평형화된 하이로드 16/600 슈퍼덱스 200 칼럼 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스) 상에 로딩하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE에 의한 분석에 적용하고, 선택된 분획을 결정화 시험을 위해 조합하였다.
결정화 및 구조 결정
TGFβ-2 - MOR14797 복합체를 20 mg/ml로 농축시킨 후, 분배 결정화 스크리닝 전에 20,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 결정을 20℃에서 시팅 드롭 증기 확산 셋업을 사용하여 성장시켰다. 0.1 μl의 TGFβ-2 - MOR14797 복합체를 0.1 M HEPES (pH 7.5) 및 70% (v/v) MPD를 함유하는 0.1 μl의 저장 용액과 혼합하고, 드롭을 45 μl의 저장 용액에 대해 평형화하였다. 결정을 액체 질소에서 직접적으로 급속-냉각시키고, 빔라인 17-ID에서의 회절 데이터의 수집을 위해 어드밴스드 포톤 소스(Advanced Photon Source) (아르곤 국립 연구소(Argonne National Laboratory), 미국)에 전송하였다. 오토프록(autoPROC) (버전 1.1.6, 글로벌 페이징 리미티드(Global Phasing Ltd.))을 사용하여 셀 치수 a = 77.2 Å, b = 122.1 Å, c = 130.1 Å, α= 90°, β= 90°, 및 γ= 90°를 갖는 공간군 P212121에서의 2.4 Å의 해상도로 데이터세트를 처리하였다. 페이저(Phaser) (버전 2.5.5, McCoy et al., J. Appl. Cryst. 40, 658-674, 2007)를 사용하여 분자 대체에 의해 복합체의 구조를 해석하였으며, 최종 모델을 COOT (버전 0.8.7, Emsley et al., Acta Cryst. D66, 486-501, 2010)에서 구축하고, 페닉스(Phenix) (버전 1.11.1, Afonine et al., Acta Cryst. D66, 213-221, 2010)를 사용하여 정밀화하였다. R작업 및 R유리 값은 각각 17.5% 및 23.0%이다. 결합 길이 및 각도에 대한 RMSD 값은 0.008 Å 및 1.054°였다.
에피토프는 MOR14797 Fab의 임의의 원자의 5 Å 내에 있는 원자를 함유하는 TGFβ-2의 잔기로 정의되고, PyMOL (버전 1.8, 슈뢰딩거, LLC.(Schrodinger, LLC.))을 사용하여 확인되고, 표 6에 열거된다. 비대칭 단위 (결정 내 가장 작은 고유한 단위)에 TGFβ-2/MOR14797 Fab 복합체의 2 카피가 존재하고, 카피 둘 다에 공통인 이들 항체-접촉 잔기만이 에피토프 잔기로서 열거된다.
TGFβ-2에 결합하는 MOR14797의 에피토프 및 파라토프
TGFβ-2 - MOR14797 Fab 복합체의 결정 구조를 사용하여 TGFβ-2에 결합하는 MOR14797의 에피토프 및 파라토프를 확인하였다. MOR14797 Fab와 상호작용하는 TGFβ-2 상의 표면은 표 6에 상술된 바와 같은 여러 비인접 서열에 의해 형성된다. 이들 잔기는 MOR14797 Fab에 의해 인식되는 3차원 입체형태적 에피토프를 형성한다 (도 1). TGFβ-2와 상호작용하는 MOR14797 상의 표면은 표 6에 상술된 바와 같은 여러 비인접 서열에 의해 형성된다. 이들 잔기는 TGFβ-2에 결합하는 MOR14797의 3차원 파라토프를 형성한다 (도 11).
표 6: 인간 TGFβ-2와 MOR14797 Fab 사이의 상호작용. TGFβ-2 잔기는 유니프롯 엔트리 P61812 (서열식별번호: 122)에 기초하여 넘버링되고, TGFβ-2 이량체의 2개의 쇄는 A 및 B로 표지된다. Fab 잔기는 그의 선형 아미노산 서열 (서열식별번호: 69 (부분 서열) 및 79)에 기초하여 넘버링되고, 상응하는 쇄가 표지된다 (중쇄에 대해 "H", 경쇄에 대해 "L"). 제시된 TGFβ-2 잔기는 잠재적 물 매개 상호작용을 설명하기 위해, MOR14797 Fab에서 원자의 5 Å 내에 적어도 1개의 원자를 갖는다.
Figure pct00021
Figure pct00022
TGFβ-2에 결합하는 MOR14800의 에피토프
표 7: 인간 TGFβ-2와 MOR14800 Fab 사이의 상호작용. TGFβ-2 잔기는 유니프롯 엔트리 P61812 (서열식별번호: 122)에 기초하여 넘버링되고, TGFβ-2 이량체의 2개의 쇄는 A 및 B로 표지된다. 제시된 TGFβ-2 잔기는 잠재적 물 매개 상호작용을 설명하기 위해, MOR14797 Fab에서 원자의 5 Å 내에 적어도 1개의 원자를 갖는다.
Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> TGFBETA 2 ANTIBODIES <130> PAT057206-WO-PCT <140> <141> <150> 62/296,282 <151> 2016-02-17 <160> 204 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Arg Tyr Tyr Val Ala 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Trp Ile Asp Pro Gly Gln Ser Asn Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Met Leu Ala Trp Gly Trp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 199 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 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Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 200 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 200 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 201 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 201 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asp Ser Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Gly Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Val Gly Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 202 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 202 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Cys Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 203 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 203 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 204 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 204 His His His His His His 1 5

Claims (28)

  1. 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2를 중화시키고 인간 이소형 TGF-β3을 중화시키지 않는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편.
  2. 제1항에 있어서, 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2를 중화시키고 인간 이소형 TGF-β3 및 TGF-β1을 중화시키지 않는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중화가 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의해 결정되는 것인 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의한 결정 시에, 인간 TGF-β2를 250pM 미만의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키고, 인간 TGF-β1 또는 TGF-β3을 100nM 초과의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 중화시키는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  5. TGF-β1 또는 TGF-β3에 대한 해리 상수보다 적어도 70배 더 낮은 해리 상수로 인간 이소형 TGF-β1 및 TGF-β3보다 인간 TGF-β 이소형 TGF-β2에 우선적으로 결합하며, 인간 TGF-β2를 중화시키는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 그의 기능적 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TGF-β2에 1pM 이하의 KD로 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 7, 27, 47, 67, 87 또는 107 중 적어도 1개와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 서열 및 서열식별번호: 17, 37, 57, 77, 97 또는 117 중 적어도 1개와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1, 21, 41, 61, 81, 101 또는 4, 24, 44, 64, 84, 104 또는 124-129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 2, 22, 42, 62, 82, 102 또는 5, 25, 45, 65, 85, 105로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 3, 23, 43, 63, 83, 103 또는 6, 26, 46, 66, 86, 106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 11, 31, 51, 71, 91, 111 또는 14, 34, 54, 74, 94, 114로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 12, 32, 52, 72, 92, 112 또는 15, 35, 55, 75, 95, 115로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 13, 33, 53, 73, 93, 113 또는 16, 36, 56, 76, 96, 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열식별번호: 1의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 2의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 3의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 11의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 12의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 13의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (b) 서열식별번호: 21의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 22의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 23의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 31의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 32의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 33의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (c) 서열식별번호: 41의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 42의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 43의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 51의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 52의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 53의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (d) 서열식별번호: 61의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 62의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 63의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 71의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 72의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 73의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (e) 서열식별번호: 81의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 82의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 83의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 91의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 92의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 93의 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는
    (f) 서열식별번호: 101의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 102의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 103의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 111의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 112의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 113의 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체 또는 기능적 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 9, 29, 49, 69, 89, 109로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 전장 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 19, 39, 59, 79, 99, 119로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단편.
  11. (a) 서열식별번호: 7의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17의 가변 경쇄 서열;
    (b) 서열식별번호: 27의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 37의 가변 경쇄 서열;
    (c) 서열식별번호: 47의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 가변 경쇄 서열;
    (d) 서열식별번호: 67의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 77의 가변 경쇄 서열;
    (e) 서열식별번호: 87의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 97의 가변 경쇄 서열; 또는
    (f) 서열식별번호: 107의 가변 중쇄 서열 및 서열식별번호: 117의 가변 경쇄 서열
    을 포함하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체.
  12. (a) 서열식별번호: 9의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 19의 경쇄 서열;
    (b) 서열식별번호: 29의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 39의 경쇄 서열;
    (c) 서열식별번호: 49의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 59의 경쇄 서열;
    (d) 서열식별번호: 69의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 79의 경쇄 서열;
    (e) 서열식별번호: 89의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 99의 경쇄 서열; 또는
    (f) 서열식별번호: 109의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 119의 경쇄 서열
    을 포함하는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 이소형의 항-TGF-β2 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 갖는 인간 모노클로날 항-TGF-β2 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 기능적 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  16. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 8, 10, 18, 20, 28, 30, 38, 40, 48, 50, 58, 60, 68, 70, 78, 80, 88, 90, 98, 100, 108, 110, 118 또는 120 중 1개 이상을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  17. 제15항 또는 제16항에 따른 1개 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 적어도 1개의 CDR 영역을 코딩하는 서열식별번호: 8, 10, 18, 20, 28, 30, 38, 40, 48, 50, 58, 60, 68, 70, 78, 80, 88, 90, 98, 100, 108, 110, 118 또는 120 또는 그의 단편 중 1개 이상을 포함하는 벡터.
  19. 제17항 또는 제18항에 따른 1개 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 기능적 단편의 생산 방법이며, 제24항의 숙주 세포를 배양하고 상기 항체 또는 기능적 단편을 단리하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 제약 조성물.
  22. 요법에서 또는 의약으로서 사용하기 위한, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 제약 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 추가의 활성제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 듀피트렌병, 마르팡-연관 상태 또는 마르팡병, 수포성 표피박리증, 섬유주절제술, 로이스-디에츠-증후군, 전신 피부 경화증 및 근골격 질환 또는 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 병리학적 상태의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  26. 듀피트렌병, 마르팡-연관 상태 또는 마르팡병, 수포성 표피박리증, 섬유주절제술, 로이스-디에츠-증후군, 전신 피부 경화증 및 근골격 질환 또는 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 병리학적 상태를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 유효 용량의 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  27. 듀피트렌병, 마르팡-연관 상태 또는 마르팡병, 수포성 표피박리증, 섬유주절제술, 로이스-디에츠-증후군, 전신 피부 경화증 또는 근골격 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 기능적 단편, 제15항 또는 제16항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물의 용도.
  28. 제12항의 적어도 1종의 항체에 의해 TGF베타-2에 결합하는 것을 교차-차단하거나 또는 교차 차단된 항체 또는 그의 기능적 단편.
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