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KR20180086260A - 높은 활성 및 감소한 오프 타겟을 위한 sirna 구조 - Google Patents

높은 활성 및 감소한 오프 타겟을 위한 sirna 구조 Download PDF

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KR20180086260A
KR20180086260A KR1020187019177A KR20187019177A KR20180086260A KR 20180086260 A KR20180086260 A KR 20180086260A KR 1020187019177 A KR1020187019177 A KR 1020187019177A KR 20187019177 A KR20187019177 A KR 20187019177A KR 20180086260 A KR20180086260 A KR 20180086260A
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겐지로우 미노미
옌스 하르보르트
시마 시나
제인 정
나렌드라 바이쉬
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닛토덴코 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 RNA 간섭을 사용하여 표적 유전자의 발현을 조정하기 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 RNAi 구조 및 분자는 높은 수준의 RNAi 활성 및 감소된 오프 타겟 작용으로, 유전자 발현을 조정하거나 침묵화시키는데 사용될 수 있다. 유리한 구조는 시드 부위에 위치한 하나 이상의 2'-데옥시뉴클레오티드를 갖는 임의의 유전자에 대해 표적화된 siRNA 를 포함한다. RNA 간섭 분자는 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법에서 사용될 수 있다.

Description

높은 활성 및 감소한 오프 타겟을 위한 SIRNA 구조
본 발명은 핵산 기반 분자로 구성되는 생물의약품 및 치료제 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 유전자의 발현을 조정하기 위해 RNA 간섭 (RNAi) 을 이용하는 화합물의 구조, 및 이의 용도에 관한 것이다.
서열목록
본 출원은 크기가 170,872 바이트이며 그 전문이 본원에 참고로 포함되는, ND6122770WO_SL.txt 로 명명된, 2016 년 1 월 2 일에 생성된 ASCII 파일로서 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다.
RNA 간섭 (RNAi) 은 짧은 간섭 RNA (siRNA) 에 의해 매개되는 동물에서의 서열-특이적 후-전사 유전자 침묵 (gene silencing) 에 사용되고있다. 예를 들어, [Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Fire et al., Nature, 1998, Vol. 391, pp. 806811; Sharp, Genes & Development, 1999, Vol. 13, pp. 139-141] 을 참조한다.
세포에서의 RNAi 반응은, 메커니즘이 아직 완전히 이해되지 않았으나, 이중 가닥 RNA (dsRNA) 에 의해 촉발될 수 있다. 일반적으로, siRNA 는 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드 길이일 수 있으며 약 19 뉴클레오티드 길이의 염기쌍 듀플렉스 부위를 포함한다.
RNAi 는 RNA 유도된 침묵 복합체 (RISC) 로서 공지된 엔도뉴클레아제 복합체를 포함한다. siRNA 는, RISC 복합체에 진입하며 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 RNA 표적의 절단을 매개하는 안티센스 또는 가이드 가닥을 갖는다. siRNA 의 다른 가닥은 패신저 가닥이다. 표적 RNA 의 절단은, siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 부위의 중간에서 발생한다. 예를 들어, [Elbashir et al., Genes & Development, 2001, Vol. 15, pp. 188-200] 을 참조한다.
약물 제제로서 사용하기 위한 siRNA 화합물의 특성을 개선시키기 위해, siRNA 화합물의 구조는 안정성이 개선되고 오프 타겟 (off target) 효과가 감소되도록 다양한 방식으로 변형되어왔다. siRNA 의 오프 타겟 활성은, 다양한 메커니즘을 통해 발생할 수 있는, 표적화 RNA 외에 세포적 핵산의 조정을 포함한다.
siRNA 화합물의 변형은 임의의 뉴클레오티드의 염기, 당 및/또는 백본의 구조적 변화를 포함한다. siRNA 뉴클레오티드를 변형하기 위한 한 방법은 siRNA 에서 특정 리보뉴클레오티드를 데옥시뉴클레오티드로 대체하는 것이다. 특히, 데옥시뉴클레오티드는 종종 siRNA 구조의 오버행 (overhang) 또는 말단 뉴클레오티드에서 이용된다.
그러나, siRNA 구조에서 데옥시뉴클레오티드를 이용하는 것의 결점은, 데옥시뉴클레오티드가 siRNA 의 시드 부위에서 사용될 수 없다는 것이다. 이는 유전자 침묵 활성이 감소됨에 따라 siRNA 의 이러한 변형이 바람직하지 않기 때문이다.
활성 손실 없이 오프 타겟 작용을 감소시키는 유전자의 발현을 조정하기 위한 RNAi 구조에 대해 긴급한 필요성이 존재한다.
특히, 종양유전자 및 암-관련 유전자의 RNAi 억제를 기반으로 하는 치료제는 고도로 강력하고 안정적인 siRNA 서열 및 구조를 필요로 할 것이다.
유전자 발현을 조정하기 위해 고도로 활성인 구조를 갖는 siRNA 화합물이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 RNA 간섭을 사용하여 표적 유전자 발현을 조정하기 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시물의 siRNA 화합물 및 구조는 유전자 발현을 조정하기 위해 고도로 활성일 수 있다.
본 발명의 RNAi 구조는 놀랍게도 높은 수준의 활성 및 감소한 오프 타겟 작용을 갖는 유전자의 발현을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 활성 손실 없이 오프 타겟 작용을 감소시키는 RNA 간섭에 의한 유전자 침묵을 위한 분자를 제공한다.
추가 구현예에서, 본 발명은 예기치 않게 높은 유전자 침묵 활성을 갖는, 오프 타겟 작용을 감소시키는 RNA 간섭에 의한 유전자 침묵을 위한 분자를 제공한다.
본 발명의 RNAi 분자는, 유전자의 RNAi 억제를 기반으로 하는 치료제에 사용될 수 있는 고도로 강력하고 안정한 siRNA 구조를 제공할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 구조, 분자 및 조성물은 질환의 예방 또는 치료, 또는 하나 이상의 유전자와 관련된 병상 또는 장애의 증상의 완화를 위한 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예는 하기를 포함한다:
하기와 같은 핵산 분자:
a) 분자는 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 가짐;
b) 분자의 각각의 가닥은 15 내지 30 뉴클레오티드 길이임;
c) 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위는 mRNA 의 서열에 상보적임;
d) 센스 가닥의 적어도 일부분은 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적이고, 분자는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 부위를 갖고, 여기서 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 3 내지 8 에서의 듀플렉스 부위에서의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 데옥시뉴클레오티드임. mRNA 는 인간 mRNA 일 수 있음.
일부 구현예에서, 핵산 분자 안티센스 가닥은 복수의 위치에서 데옥시뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 복수의 위치는 하기의 것 중 하나이다:
안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 4, 6 및 8;
안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 3, 5 및 7;
안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 1, 3, 5 및 7;
안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 3-8; 및
안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 5-8.
핵산 분자는 mRNA 의 발현을 조정하기 위해 활성인 RNAi 분자일 수 있다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는 단백질 코딩 유전자, 원종양유전자, 종양유전자, 종양 억제인자 유전자 및 세포 신호전달 유전자에서 선택되는 유전자의 발현을 억제하기 위해 활성일 수 있다.
추가의 구현예에서, mRNA 는 SRY, 베타-글로빈, RAS, 세포질 GST, 미토콘드리아 GST, MAPEG GST, GST-π, p16, p21, p53, 혈청 알부민, 유형 VII 콜라겐, 보체 C3, 아포리포단백질 B, 페닐알라닌 히드록실라아제, 인자 VIII, 헌팅틴, RB1 망막모세포종 단백질, CFTR, 티틴, 유트로핀 및 디스트로핀을 포함하는 단백질의 인간 계열의 임의의 구성원 또는 하위-구성원을 발현하는 인간 mRNA 일 수 있다.
핵산 분자는 100 pM 미만, 또는 50 pM 미만, 또는 10 pM 미만의 mRNA 의 녹다운에 대한 IC50 을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 분자의 단일 투여 후 mRNA 를 생체내 (in vivo) 적어도 25% 억제할 수 있다.
일부 구현예에서, 분자의 각각의 가닥은 18 내지 22 뉴클레오티드 길이이다. 듀플렉스 부위는 19 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥은 단일 가닥으로서 연결될 수 있고, 루프에 의해 하나의 말단에서 연결된 듀플렉스 부위를 형성할 수 있다.
핵산 분자는 평활 말단 (blunt end) 을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 3' 오버행을 가질 수 있다.
본 발명의 구현예는 변형되거나 화학적으로 변형되는 듀플렉스 부위에서의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 변형된 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-알킬 치환된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 잠금 (locked) 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 발명은 또한 핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물을 고려한다. 담체는 지질 분자 또는 리포좀일 수 있다.
본 발명의 구현예는 추가로, 핵산 분자를 함유하는 세포 또는 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한, 대상체에게 핵산 분자를 함유하는 조성물을 투여함으로써 유전자 침묵에 의해 이를 필요로 하는 대상체에서의 질환을 예방, 치료 또는 완화시키기 위한 방법을 고려한다. 질환은 악성 종양, 암, 육종, 또는 암종일 수 있다.
본 발명의 구현예는 이를 필요로 하는 대상체에서의 질환 또는 병상을 예방, 완화 또는 치료하기 위한 핵산 분자의 조성물의 용도를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 의료 요법에서 사용될 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 조성물은 인간 또는 동물 신체의 치료에서 사용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서의 질환 또는 병상의 예방, 완화 또는 치료용 약제를 제조 또는 생산하기 위한 것일 수 있다.
도 1: 도 1 은 GST-π 에 대해 표적화된 본 발명의 siRNA 에 의한 생체내 동소위 (orthotopic) 폐암 종양의 큰 감소를 나타낸다. GST-π siRNA 를, A549 동소위 폐암 종양을 나타내는 무흉선 누드 마우스에 2 mg/kg 의 용량에서 리포좀 제형으로 투여하였다. 최종 원발성 종양 중량을 처리군 및 비히클 대조군에 대한 부검시 측정하였다. GST-π siRNA 는 이러한 6-주 연구에서 폐암 종양의 억제를 위한 상당한 효능을 나타내었다. 도 1 에서 나타낸 바와 같이, 43 일 후, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제를 나타내었는데, 최종 원발성 종양 평균 중량이 대조군과 비교하여 2.8 배로 상당히 감소하였다.
도 2: 도 2 는 GST-π siRNA 에 대한 생체내 종양 억제 효능을 나타낸다. A549 세포를 사용하는 암 이종이식 모델을 0.75 mg/kg 에서 상대적으로 저용량의 siRNA 와 함께 이용하였다. GST-π siRNA 는 수일 내에 유리한 종양 억제를 나타내었다. 36 일 후, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제를 나타내었는데, 대조군과 비교하여 최종 종양 평균 부피가 약 2 배로 상당히 감소하였다.
도 3: 도 3 은 도 2 의 종말점에서 GST-π siRNA 에 대한 생체내 종양 억제 효능을 나타낸다. GST-π siRNA 는 2 배 초과로 평균 종양 중량 감소와 함께, 유리한 종양 억제를 나타내었다.
도 4: 도 4 는 본 발명의 GST-π siRNA 가 시험관내 (in vitro) 세포자멸사에 의한 암 세포사를 크게 증가시켰다는 것을 보여준다. GST-π siRNA 는, 세포 생존력의 손실과 관련되는 세포자멸사의 바이오마커인 PUMA 의 상향조절을 초래하였다. 도 4 에서, PUMA 의 발현은 GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후 2-6 일로부터 크게 증가하였다.
도 5: 도 5 는 본 발명의 GST-π siRNA 가 생체내 A549 이종이식 종양에 대한 녹다운 효능을 제공하였다는 것을 보여준다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운은 GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 를 갖는 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스 (Charles River) 에서 관찰되었다. 도 5 에서 나타낸 바와 같이, 4 mg/kg 의 용량에서, GST-π mRNA 에 있어서 약 40% 의 상당한 감소가 주사 24 시간 후 검출되었다.
도 6: 도 6 은 본 발명의 GST-π siRNA 가 생체내 췌장암 이종이식 종양을 억제하였다는 것을 보여준다. GST-π siRNA 는, 6 내지 8 주령 무흉선 누드 암컷 마우스에서 췌장암 이종이식 종양에 리포좀 제형으로 투여되는 경우, 생체내 유전자 침묵 효력을 제공하였다. 도 6 에서 나타낸 바와 같이, 0.375 mg/kg 내지 3 mg/kg 범위의, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 용량으로, 용량 반응을 수득하였다. GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유리한 종양 억제를 나타내었는데, 종양 부피가 종말점에서 약 2 배로 감소하였다.
도 7: 도 7 은 본 발명의 GST-π siRNA 가 증가된 혈청 안정성을 나타내었다는 것을 보여준다. 도 7 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 센스 가닥에 대한 혈청에서의 반감기 (t½) (도 7, 상부) 및 안티센스 가닥에 대한 혈청에서의 반감기 (t½) (도 7, 하부) 둘 모두는 약 100 분이었다.
도 8: 도 8 은 본 발명의 GST-π siRNA 가 혈장에서의 제형 중 향상된 안정성을 나타내었다는 것을 보여준다. 도 8 은 PBS 중 50% 인간 혈청에서의 GST-π siRNA 의 리포좀 제형의 인큐베이션, 및 다양한 시점에서의 잔여 siRNA 의 검출을 나타낸다. 도 8 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 제형의 혈장에서의 반감기 (t½) 는 100 시간보다 상당히 더 길었다.
도 9: 도 9 는 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 9 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 가이드 가닥 녹다운은 효과를 나타내지 않는 스크램블드 서열을 갖는 대조군과 비교하여 대략 지수적이다.
도 10: 도 10 은 도 9 의 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 10 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 에 대한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운은 크게 감소하였는데, 본질적으로 효과가 없었다.
도 11: 도 11 은 몇몇 고도 활성 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 11 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 가이드 가닥 녹다운 활성은 대략 지수적이었다.
도 12: 도 12 는 도 11 의 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 12 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 에 대한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운 활성은 약 500 pM 미만으로 상당히 감소하였다.
도 13: 도 13 은 고도 활성 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 13 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 가이드 가닥 녹다운 활성은 대략 지수적이었다.
도 14: 도 14 는 도 13 의 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 14 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 에 대한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운 활성은 상당히 감소하였다.
도 15: 도 15 는 p21 siRNA 에 대한 생체내 종양 억제 효능을 나타낸다. A549 세포를 사용하는 암 이종이식 모델을 0.75 mg/kg 에서 상대적으로 저용량의 siRNA 와 함께 이용하였다. p21 siRNA 는 수일 내에 유리한 종양 억제를 나타내었다. 30 일 후, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제를 나타내었고, 최종 종양 평균 부피가 대조군과 비교하여 2 배 초과로 상당히 감소하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 유전자 발현을 조정하기 위한 핵산 기반 치료제를 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 RNA 간섭에서 활성인 분자 뿐만 아니라 유전자의 발현을 침묵시킬 수 있는 구조 및 조성물을 제공한다.
본 개시물의 구조 및 조성물은 다양한 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 치료적 RNAi 분자의 전달 및 흡수를 위한 조성물 뿐만 아니라 이의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 RNA-기반 조성물은 암과 같은 악성 종양의 예방 또는 치료를 위한 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 RNA 간섭에서 활성인 핵산 분자를 포함한다. 치료적 핵산 분자는 유전자 침묵을 위해 다양한 유전자에 대해 표적화될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 소 간섭 RNA (siRNA) 로서 활성일 수 있고, 유전자 발현을 조절하거나 침묵시킬 수 있는 다양한 분자를 제공한다.
본 발명의 구현예는 또한 본 발명의 siRNA 를 질환 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 비히클, 제형 또는 지질 나노입자 제형을 제공한다. 본 발명은 추가로, 치료제로서 siRNA 를 포유동물에게 투여하는 방법을 고려한다.
본 발명의 치료적 분자 및 조성물은 화합물 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 질환을 예방 또는 치료하는 것으로 의도된 RNA 간섭에 사용될 수 있다.
본 발명은 다양한 RNAi 분자를 제공하며, 여기서 각각의 분자는 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 가지고; 분자의 각각의 가닥은 15 내지 30 뉴클레오티드 길이이고; 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위는 mRNA 의 서열에 적어도 부분적으로 상보적이고; 센스 가닥의 적어도 일부분은 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적이며, 분자는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 부위를 갖는다.
본 발명의 RNAi 분자는 분자의 듀플렉스 부위에 위치하는, 인간 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 인간 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위를 가질 수 있다.
본 발명의 구현예는 또한, 질환 또는 병상의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 완화시키기 위한, 또는 질환 또는 병상의 발전 위험성을 감소시키기 위한, 또는 이를 필요로 하는 포유동물에서의 질환 또는 병상의 개시를 지연시키기 위한 방법을 제공할 수 있다.
보편적인 게놈 침묵을 위한 RNAi 구조
본 발명의 구현예는 유전자의 발현을 침묵시키기 위한 높은 활성을 나타내는 임의의 유전자에 대해 표적화된 RNAi 분자를 제공할 수 있다.
본 개시물의 RNAi 분자는, 감소된 오프 타겟 효과를 제공하면서, 유전자의 발현을 침묵시키기 위한 놀랍게도 높은 활성을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 하나 이상의 2'-데옥시뉴클레오티드를 함유한다. 이들 구현예에서, 하나 이상의 2'-데옥시뉴클레오티드는 siRNA 의 시드 부위에 위치할 수 있다.
하나 이상의 2'-데옥시뉴클레오티드는 모노-데옥시뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 데옥시뉴클레오티드는 모노-2'-데옥시뉴클레오티드를 지칭한다.
2'-데옥시뉴클레오티드는 2' 위치에서 할로겐으로 치환될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 siRNA 의 안티센스 또는 가이드 가닥에서 하나 이상의 2'-데옥시뉴클레오티드를 함유한다. 보다 특히, 하나 이상의 데옥시뉴클레오티드는 siRNA 의 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1 내지 8 에 위치할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 데옥시뉴클레오티드는 siRNA 의 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 내지 8 에 위치할 수 있다. 추가의 구현예에서, 하나 이상의 데옥시뉴클레오티드는 siRNA 의 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 3 내지 8 에 위치할 수 있다.
본 발명은 복수의 위치에서 데옥시뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥을 가질 수 있는 siRNA 구조를 고려한다.
일부 구현예에서, siRNA 구조는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 4, 6 및 8 에서 데옥시뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
추가 구현예에서, siRNA 구조는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3, 5 및 7 에서 데옥시뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
추가의 구현예에서, siRNA 구조는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 1, 3, 5 및 7 에서 데옥시뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, siRNA 구조는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3 내지 8 에서 데옥시뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 구조는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 5 내지 8 에서 데옥시뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
임의의 이들 구조는 다른 위치에서 하나 이상의 변형된 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드와 조합될 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는 약 200 pM 미만의 유리한 IC50 으로 유전자의 mRNA 의 발현을 억제할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 약 100 pM 미만, 또는 약 50 pM 미만, 또는 약 30 pM 미만, 또는 약 20 pM 미만, 또는 약 10 pM 미만, 또는 약 5 pM 미만, 또는 약 1 pM 미만의 유리한 IC50 으로 유전자의 mRNA 의 발현을 억제할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 단일 투여시, 유전자의 mRNA 수준의 발현을 생체내 적어도 25% 억제할 수 있다.
본 발명의 siRNA 는 임의의 유전자에 대해 표적화될 수 있다.
본 발명의 siRNA 가 그에 대해 표적화될 수 있는 유전자의 예는 HUGO 유전자 명명법 위원회의 유전자 계열 지수 (Gene Families Index) 에 열거된 유전자를 포함한다.
본 발명의 siRNA 가 그에 대해 표적화될 수 있는 유전자의 예는 핵 유전자, 미토콘드리아 유전자, 단백질 코딩 유전자, 원종양유전자, 종양유전자, 종양 억제인자 유전자 및 세포 신호전달 유전자를 포함한다.
본 발명의 siRNA 가 그에 대해 표적화될 수 있는 유전자의 예는 SRY, 베타-글로빈, RAS, 세포질 GST, 미토콘드리아 GST, MAPEG GST, GST-π, p16, p21, p53, 혈청 알부민, 유형 VII 콜라겐, 보체 C3, 아포리포단백질 B, 페닐알라닌 히드록실라아제, 인자 VIII, 헌팅틴, RB1 망막모세포종 단백질, CFTR, 티틴, 유트로핀 및 디스트로핀을 포함하는 단백질의 인간 계열의 임의의 구성원 또는 하위-구성원을 발현하는 유전자를 포함한다.
변형된, 및 화학적으로 변형된 siRNA
본 발명의 구현예는 유전자 침묵에 대한 증가된 활성 및 효력과 같은 치료 용도를 위한 향상된 특성이 제공되도록 변형된 또는 화학적으로 변형된 siRNA 분자를 포함한다. 본 발명은 유전자 조절 및 유전자 침묵에 대한 siRNA 분자의 활성 및 효력의 손실 없이, 증가된 혈청 안정성 뿐만 아니라 감소된 오프 타겟 효과를 가질 수 있는 변형된 또는 화학적으로 변형된 siRNA 분자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 siRNA 의 안정성 및 효능을 향상시키는, 변형 또는 화학적 변형을 다양한 조합으로 갖는 siRNA 를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 '변형된 및 화학적으로 변형된' 은, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체, 변경된 뉴클레오티드, 비-표준 뉴클레오티드, 비-자연 발생 뉴클레오티드 및 이들의 조합을 갖는 siRNA 를 포함하는, siRNA 의 자연 발생 뉴클레오티드의 구조 또는 핵산 구조에서 이루어진 변화를 지칭한다.
일부 구현예에서, siRNA 에서 변형된 또는 화학적으로 변형된 구조의 수는 siRNA 분자의 모든 구조적 성분 및/또는 모든 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 뉴클레오티드의 당 기의 변형, 뉴클레오티드의 핵염기의 변형, 핵산 백본 또는 연결의 변형, siRNA 가닥의 말단에서의 뉴클레오티드(들) 의 구조의 변형 및 이들의 조합을 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 당의 2' 탄소에서의 치환기의 변형을 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 가닥의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에서 변형을 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 가닥 간의 상보성 미스매치 (mismatch) 를 생성시키는 변형을 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 5'-프로필아민 말단, 5'-인산화된 말단, 3'-퓨로마이신 말단, 또는 3'-바이오틴 말단 기를 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 2'-플루오로 치환된 리보뉴클레오티드, 2'-OMe 치환된 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'-아미노 치환된 리보뉴클레오티드, 2'-티오 치환된 리보뉴클레오티드를 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 하나 이상의 5-할로우리딘, 5-할로시티딘, 5-메틸시티딘, 리보티미딘, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 4-티오우리딘 또는 5-아미노알릴우리딘을 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 하나 이상의 포스포로티오에이트기를 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 하나 이상의 2'-플루오로 치환된 리보뉴클레오티드, 2'-플루오로우리딘, 2'-플루오로시티딘, 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'-데옥시아데노신 또는 2'-데옥시구아노신을 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결을 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 하나 이상의 알킬렌 디올 연결, 옥시-알킬티오 연결 또는 옥시카르보닐옥시 연결을 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 하나 이상의 데옥시비염기성 (deoxyabasic) 기, 이노신, N3-메틸-우리딘, N6,N6-디메틸-아데노신, 슈도우리딘, 퓨린 리보뉴클레오시드 및 리바비린을 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 하나 이상의 3' 또는 5' 역전된 말단기를 갖는 siRNA 를 포함한다.
변형된 및 화학적으로 변형된 siRNA 의 예는 하나 이상의 5-(2-아미노)프로필우리딘, 5-브로모우리딘, 아데노신, 8-브로모 구아노신, 7-데아자-아데노신 또는 N6-메틸 아데노신을 갖는 siRNA 를 포함한다.
GST-π 및 RNAi 분자
다양한 인간 암 조직은 돌연변이된 KRAS 유전자의 외관과 상관관계가 있는 것으로 발견되었다. 일부 경우에, 조직은 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 Pi (GST-π) 발현의 상승된 수준을 나타낸다 (Miyanishi et al., Gastroenterology, 2001, Vol. 121:865-874, Abstract). 예를 들어, 상승된 혈청 GST-π 수준이 다양한 위장 악성종양을 갖는 환자에서 관찰되었다 (Niitsu et al., Cancer, 1989, Vol.63, No. 2, pp. 317-323, Abstract).
GST-π 는 감소된 글루타티온과 소수성 및 친전자성 화합물의 컨쥬게이션을 촉매화시킴으로써 해독에 있어서 역할하는 효소의 GST 계열의 일원이다. GST-π 발현은 siRNA 로 시험관내 감소될 수 있다 (Niitsu et al., US 2014/0315975 A1). 그러나, 현존하는 siRNA 제제의 많은 결점, 예컨대 불충분한 활성, 오프 타겟 효과, 혈청 안정성 결여, 및 생체내 효력 또는 효능 결여가 존재한다.
예시 표적 인간 글루타티온 S-전달효소 pi (인간 GST-π) mRNA 의 핵산 서열은 GenBank 등록 번호 NM_000852.3 (hGSTP1) 으로 개시되어있으며, 986 뉴클레오티드 길이이다.
당업자는 보고된 서열이 경시적으로 변화할 수 있으며 그에 따라 본원에서 핵산 분자에 필요한 임의의 변화를 혼입시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 구현예는 소 핵산 분자를 사용하는 GST-π 발현의 유전자 침묵을 위한 조성물 및 방법을 제공할 수 있다. 핵산 분자의 예는 RNA 간섭에서 활성인 분자 (RNAi 분자), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자 뿐만 아니라 DNA-유도 RNA (ddRNA), 피위 (Piwi)-상호작용 RNA (piRNA) 및 반복 관련 siRNA (rasiRNA) 를 포함한다. 이러한 분자는 GST-π 유전자 발현에 대항하여 RNA 간섭을 매개할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한 대상체에서 다양한 종류의 악성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 방법은 GST-π 를 인코딩하는 유전자의 발현을 하향 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 독립적으로 또는 조합으로, GST-π 단백질 및/또는 GST-π 단백질을 인코딩하는 유전자, GST-π 와 관련된 질환, 병상 또는 장애, 예컨대 악성 종양의 유지 및/또는 발전에 관련된 GST-π 를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조정 또는 조절할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 GST-π 의 예시적인 서열을 참조로 하여 기재된다. 당업자는 본 발명의 다양한 양태 및 구현예가 임의의 관련된 GST-π 유전자, 서열, 또는 변이체, 예컨대 동족체 유전자 및 전사 변이체, 및 임의의 GST-π 유전자와 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 을 비롯한 다형성에 관한 것이라는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 GST-π 유전자, 예를 들어 인간 GST-π 의 발현을 하향조절하는 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siRNA) 분자를 제공할 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는, 예를 들어 상보적 서열을 사용하여, 또는 비-표준적 염기쌍, 예를 들어 미스매치 및/또는 우블 (wobble) 염기쌍 (추가의 표적 서열을 제공할 수 있음) 을 혼입함으로써 GST-π 및 임의의 상동성 서열에 대해 표적화될 수 있다.
미스매치가 확인되는 경우, 비-표준적 염기쌍, 예를 들어 미스매치 및/또는 우블 염기가 사용되어, 하나 초과의 유전자 서열을 표적화하는 핵산 분자를 생성할 수 있다.
예를 들어, 비-표준적 염기쌍 예컨대 UU 및 CC 염기쌍을 사용하여, 서열 상동성을 공유하는 상이한 GST-π 표적에 대해 서열을 표적화할 수 있는 핵산 분자를 생성할 수 있다. 따라서, RNAi 분자는 상동성 유전자와, 하나 초과의 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있는 단일 RNAi 분자 사이에 보존되는 뉴클레오티드 서열에 대해 표적화될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 GST-π mRNA 에 대하여 활성인 RNAi 분자를 포함하며, 이때 RNAi 분자는 GST-π 서열을 인코딩하는 임의의 mRNA 에 상보적인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시물의 RNAi 분자는 GST-π RNA 에 대하여 활성을 가질 수 있으며, 이때 RNAi 분자는 변이체 GST-π 인코딩 서열을 갖는 RNA 에 상보적인 서열, 예를 들어, 악성 종양에 관련되는 당업계에 공지된 돌연변이체 GST-π 유전자를 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는, GST-π 유전자의 뉴클레오티드 서열과 상호작용할 수 있으며 GST-π 유전자 발현의 침묵을 매개할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
GST-π 의 발현을 억제하기 위한 핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가질 수 있으며, 여기서 상기 가닥은 듀플렉스 부위를 형성한다. 핵산 분자는 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 변형을 비롯하여 변형되는 또는 화학적으로 변형되는 듀플렉스 부위에서의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 가질 수 있다. siRNA 의 오버행에서의 임의의 뉴클레오티드는 또한 변형 또는 화학적으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 바람직한 변형된 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시뉴클레오티드이다. 추가의 구현예에서, 변형된 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-알킬 치환된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 바람직한 구조는 복수의 위치에서 데옥시뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥을 가질 수 있는데, 복수의 위치는 하기의 것 중 하나이다: 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 4, 6 및 8; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 1, 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3-8; 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 5-8. 임의의 이들 구조는 듀플렉스 부위에서 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드와 조합될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 약 200 pM 미만의 유리한 IC50 으로 GST-π mRNA 의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 핵산 분자는 단일 투여시, GST-π mRNA 수준의 발현을 생체내 적어도 25% 억제할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체와 조합으로 본원에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 siRNA 를 함유할 수 있는 약학 조성물이 본 발명에서 고려된다. 당업계에 공지된 것들을 포함하는 임의의 적합한 담체 뿐만 아니라 지질 분자, 나노입자, 또는 리포좀이 사용될 수 있으며, 이들 중 임의의 것이 siRNA 분자를 캡슐화할 수 있다.
본 발명은 GST-π 발현과 관련된 질환을 치료하기 위한 방법을 개시하며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 siRNA 의 하나 이상을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 치료할 질환은 그 중에서도, 악성 종양, 암, 돌연변이된 KRAS 를 발현하는 세포에 의해 초래된 암, 육종 및 암종을 포함할 수 있다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 1 에 나타낸다.
표 1: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
표 1 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘을 지칭한다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 2 에 나타낸다.
표 2: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00004
표 2 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 나타낸다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 나타낸다 (예를 들어, U). 소문자는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 3 에 나타낸다.
표 3: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00005
표 3 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자는 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 를 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 4 에 나타낸다.
표 4: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00006
표 4 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 5 에 나타낸다.
표 5: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00007
표 5 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 6 에 나타낸다.
표 6: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00008
표 6 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기와 같은 다양한 핵산 분자를 제공한다: a) 분자가 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 가짐; b) 분자의 각각의 가닥이 15 내지 30 뉴클레오티드 길이임; c) 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위가 GST-π 를 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적임; d) 센스 가닥의 적어도 일부분이 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적이고, 분자가 15 내지 30 뉴클레오티드 길이인 듀플렉스 부위를 가짐.
일부 구현예에서, 핵산 분자는, 분자의 듀플렉스 부위에 위치하며 GST-π 를 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위를 가질 수 있다.
추가의 구현예에서, 핵산 분자는 GST-π 를 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 핵산 분자의 각각의 가닥은 18 내지 22 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 핵산 분자의 듀플렉스 부위는 19 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
대안적인 형태에서, 핵산 분자는 단일 가닥으로서 연결되며 루프에 의해 하나의 말단에서 연결된 듀플렉스 부위를 형성하는 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
본 개시물의 핵산 분자의 일부 구현예는 평활 말단을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 3' 오버행을 가질 수 있다.
본 발명은 유전자 침묵을 위해 활성인 RNAi 분자인 다양한 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 dsRNA, siRNA, 마이크로-RNA, 또는 shRNA (유전자 침묵을 위해 활성임) 뿐만 아니라 DNA-유도된 RNA (ddRNA), 피위-상호작용 RNA (piRNA) 또는 반복 관련 siRNA (rasiRNA) 일 수 있다. 핵산 분자는 GST-π 의 활성을 억제하기 위해 활성일 수 있다.
본 발명의 구현예는 100 pM 미만의 GST-π 의 녹다운에 대한 IC50 을 갖는 핵산 분자를 추가로 제공한다.
추가의 본 발명의 구현예는 50 pM 미만의 GST-π 의 녹다운에 대한 IC50 을 갖는 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 발명의 핵산 분자의 하나 이상을 함유하는 조성물을 고려한다. 특정 구현예에서, 담체는 지질 분자 또는 리포좀일 수 있다.
본 발명의 화합물 및 조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 화합물 또는 조성물을 투여함으로써 GST-π 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법에서 유용하다.
본 발명의 방법은 악성 종양의 예방 또는 치료를 위해 본 발명의 화합물을 이용할 수 있다. 악성 종양은 다양한 질환, 예를 들어 GST-π 발현과 관련된 암, 돌연변이된 KRAS 를 발현하는 세포에 의해 초래된 암, 육종, 섬유육종, 악성 섬유질 조직구종, 지방육종, 횡문근육종, 평활근육종, 맥관육종, 카포시 육종, 림프관육종, 활막 육종, 연골육종, 골육종, 암종, 뇌종양, 두경부 암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장 암, 맹장암, 결장직장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담도암, 항문 암, 신장암, 요도 암, 비뇨기 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 난소암, 피부암, 백혈병, 악성 림프종, 상피성 악성 종양, 및 비-상피성 악성 종양으로 나타날 수 있다.
P21 및 RNAi 분자
p21 은 CDKN1A 유전자에 의해 인코딩되고 CIP/KIP 계열에 속하는 세포 주기-조절 단백질이다. 이 단백질은, 복합체에 대한 결합을 통해 사이클린-CDK 복합체의 효과를 억제함으로써 G1 단계 및 G2/M 단계에서 세포 주기 진행을 억제하는 기능을 갖는다. 구체적으로, p21 유전자는 종양 억제인자 유전자 중 하나인 p53 에 의해 활성화를 거친다. DNA 손상 등으로 인한 p53 의 활성화 시, p53 이 p21 을 활성화시켜 세포 주기가 G1 단계 및 G2/M 단계에서 저지된다는 것이 보고되어있다.
p21 은 전립선, 자궁경부, 유방 및 편평상피 세포 암종을 포함하는 다양한 인간 암에서 과발현되고, 많은 경우, p21 상향조절은 종양 등급, 침입성 및 공격성과 긍정적으로 상관관계가 있다. 예를 들어, [Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 8, pp. 4291-96] 을 참조한다. 또한, p21 의 상향조절은 뇌, 전립선, 난소, 유방 및 식도 세포 암을 포함하는 많은 형태의 암에서 종양형성능 및 불량한 예후와 관련되는 것으로 보고되어있다. 예를 들어, [Winters et al., Breast Cancer Research, 2003, Vol. 5, No. 6, pp. R242-R249] 를 참조한다. 또한, 질환은 죽상경화증, 알츠하이머병, 아밀로이드증 및 관절염을 포함하는 연령 관련 질환일 수 있다. 예를 들어, [Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 8, pp. 4291-96] 을 참조한다.
p21 은 인간을 포함하는 다양한 동물에서 존재한다. 인간 CDKN1A (p21) 에 대한 서열 정보는 하기에서 발견된다: NM_000389.4, NM_078467.2, NM_001291549.1, NM_001220778.1, NM_001220777.1 (NP_001207707.1, NP_001278478.1, NP_001207706.1, NP_510867.1, NP_000380.1).
표적 인간 p21 mRNA 는 GenBank 등록 번호 NM_000389.4 (CDKN1A) 에서 개시되며, 2175 염기쌍 길이이다.
당업자는 보고된 서열이 경시적으로 변화할 수 있으며 그에 따라 본원의 핵산 분자에 필요한 임의의 변화를 혼입할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 구현예는 소 핵산 분자를 사용하는 p21 발현의 유전자 침묵을 위한 조성물 및 방법을 제공할 수 있다. 핵산 분자의 예는 RNA 간섭에서 활성인 분자 (RNAi 분자), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로-RNA (miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자 뿐만 아니라 DNA-유도된 RNA (ddRNA), 피위-상호작용 RNA (piRNA) 및 반복 관련 siRNA (rasiRNA) 를 포함한다. 이러한 분자는 p21 유전자 발현에 대하여 RNA 간섭을 매개할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한 대상체에서의 다양한 종류의 악성 종양의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 방법은 p21 을 인코딩하는 유전자의 발현을 하향 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은, 독립적으로 또는 조합으로, p21 단백질 및/또는 p21 단백질을 인코딩하는 유전자, p21 과 관련된 질환, 병상 또는 장애, 예컨대 악성 종양의 유지 및/또는 발전과 관련된 p21 을 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조정하거나 조절할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 p21 의 예시적인 서열을 참조로 하여 기재된다. 당업자는 본 발명의 다양한 양태 및 구현예가 임의의 관련된 p21 유전자, 서열, 또는 변이체, 예컨대 동족체 유전자 및 전사 변이체, 및 임의의 p21 유전자와 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 을 비롯한 다형성에 관한 것이라는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 p21 유전자, 예를 들어 인간 CDKN1A 의 발현을 하향조절하는 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siRNA) 분자를 제공할 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는, 예를 들어 상보적 서열을 사용하여, 또는 비-표준적 염기쌍, 예를 들어 미스매치 및/또는 우블 염기쌍 (추가의 표적 서열을 제공할 수 있음) 을 혼입함으로써 p21 및 임의의 상동성 서열에 대해 표적화될 수 있다.
미스매치가 확인되는 경우, 비-표준적 염기쌍, 예를 들어 미스매치 및/또는 우블 염기가 사용되어, 하나 초과의 유전자 서열을 표적화하는 핵산 분자를 생성할 수 있다.
예를 들어, 비-표준적 염기쌍 예컨대 UU 및 CC 염기쌍을 사용하여, 서열 상동성을 공유하는 상이한 p21 표적에 대해 서열을 표적화할 수 있는 핵산 분자를 생성할 수 있다. 따라서, RNAi 분자는 상동성 유전자와, 하나 초과의 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있는 단일 RNAi 분자 사이에 보존되는 뉴클레오티드 서열에 대해 표적화될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 p21 mRNA 에 대하여 활성인 RNAi 분자를 포함하여, 이때 RNAi 분자는 p21 서열을 인코딩하는 임의의 mRNA 에 상보적인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시물의 RNAi 분자는 p21 RNA 에 대하여 활성을 가질 수 있으며, 이때 RNAi 분자는 변이체 p21 인코딩 서열을 갖는 RNA 에 상보적인 서열, 예를 들어, 악성 종양에 관련되는 당업계에 공지된 돌연변이체 p21 유전자를 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는, p21 유전자의 뉴클레오티드 서열과 상호작용할 수 있으며 p21 유전자 발현의 침묵을 매개할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
p21 의 발현을 억제하기 위한 핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가질 수 있으며, 여기서 상기 가닥은 듀플렉스 부위를 형성한다. 핵산 분자는 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 변형을 비롯하여 변형되는 또는 화학적으로 변형되는 듀플렉스 부위에서의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 가질 수 있다. siRNA 의 오버행에서의 임의의 뉴클레오티드는 또한 변형 또는 화학적으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 바람직한 변형된 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시뉴클레오티드이다. 추가의 구현예에서, 변형된 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-알킬 치환된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 바람직한 구조는 복수의 위치에서 데옥시뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥을 가질 수 있는데, 복수의 위치는 하기의 것 중 하나이다: 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 4, 6 및 8; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 1, 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3-8; 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 5-8. 임의의 이들 구조는 듀플렉스 부위에서 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드와 조합될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 약 200 pM 미만의 유리한 IC50 으로 p21 mRNA 의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 핵산 분자는 단일 투여시, p21 mRNA 수준의 발현을 생체내 적어도 25% 억제할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체와 조합으로 본원에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 siRNA 를 함유할 수 있는 약학 조성물이 본 발명에서 고려된다. 당업계에 공지된 것들을 포함하는 임의의 적합한 담체 뿐만 아니라 지질 분자, 나노입자, 또는 리포좀이 사용될 수 있으며, 이들 중 임의의 것이 siRNA 분자를 캡슐화할 수 있다.
본 발명은 p21 발현과 관련될 수 있는 질환을 치료하기 위한 방법을 개시하며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 siRNA 의 하나 이상을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 치료할 질환은 그 중에서도, 악성 종양, 암, 돌연변이된 KRAS 를 발현하는 세포에 의해 초래된 암, 육종 및 암종을 포함할 수 있다.
p21 mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 7 에 나타낸다.
표 7: p21 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
표 7 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 티미딘을 나타낸다. mU 는 2'-메톡시-U 이다.
p21 mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 8 에 나타낸다.
표 8: p21 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00011
표 8 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C, 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
본 발명의 구현예는 상기 예에 따라 변형 또는 화학적으로 변형되는 표 1-8 의 siRNA 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기와 같은 다양한 핵산 분자를 제공한다: a) 분자가 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 가짐; b) 분자의 각각의 가닥이 15 내지 30 뉴클레오티드 길이임; c) 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위가 p21 을 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적임; 및 d) 센스 가닥의 적어도 일부분이 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적이고, 분자가 15 내지 30 뉴클레오티드 길이인 듀플렉스 부위를 가짐.
일부 구현예에서, 핵산 분자는, 분자의 듀플렉스 부위에 위치하며 p21 을 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위를 가질 수 있다.
추가의 구현예에서, 핵산 분자는 p21 을 인코딩하는 mRNA 의 서열에 상보적인 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위를 가질 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 18 내지 22 뉴클레오티드 길이인 분자의 각각의 가닥을 가질 수 있다. 핵산 분자는 19 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 부위를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는 단일 가닥으로서 연결되며 루프에 의해 하나의 말단에서 연결된 듀플렉스 부위를 형성하는 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 평활 말단을 가질 수 있으며 하나 이상의 3' 오버행을 가질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 유전자 침묵을 위해 활성인 RNAi 분자, 예를 들어 유전자 침묵을 위해 활성인 dsRNA, siRNA, 마이크로-RNA 또는 shRNA (유전자 침묵을 위해 활성임) 뿐만 아니라 DNA-유도된 RNA (ddRNA), 피위-상호작용 RNA (piRNA), 및 반복 관련 siRNA (rasiRNA) 일 수 있다.
본 발명은 p21 의 발현을 억제하기 위해 활성인 다양한 핵산 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 100 pM 미만의 p21 의 녹다운에 대한 IC50 을 가질 수 있다.
추가의 구현예에서, 핵산 분자는 50 pM 미만의 p21 의 녹다운에 대한 IC50 을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 조성물을 고려한다. 담체는 지질 분자 또는 리포좀일 수 있다.
본 발명의 화합물 및 조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 화합물 또는 조성물을 투여함으로써 p21 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법에서 유용하다.
추가 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 조성물을 투여함으로써, p21 발현과 관련된 질환을 치료하기 위한 방법을 포함한다. 질환은 그 중에서도, p21 발현과 관련된 암과 같은 질환으로 나타날 수 있는 악성 종양일 수 있다.
본 발명의 방법은 악성 종양의 예방 또는 치료를 위해 본 발명의 화합물을 이용할 수 있다. 악성 종양은 다양한 질환, 예를 들어 p21 발현과 관련된 암, 돌연변이된 KRAS 를 발현하는 세포에 의해 초래된 암, 육종, 섬유육종, 악성 섬유질 조직구종, 지방육종, 횡문근육종, 평활근육종, 맥관육종, 카포시 육종, 림프관육종, 활막 육종, 연골육종, 골육종, 암종, 뇌종양, 두경부 암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장 암, 맹장암, 결장직장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담도암, 신장암, 요도 암, 비뇨기 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 난소암, 피부암, 백혈병, 악성 림프종, 상피성 악성 종양 및 비-상피성 악성 종양으로 나타날 수 있다.
본 발명의 구현예는 유전자 및/또는 단백질의 발현을 하향 조절하거나 억제하는데 사용될 수 있는 RNAi 분자를 제공할 수 있다.
본 개시물의 RNAi 분자는 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하기 위해 개별적으로, 또는 다른 siRNA 와 조합으로 사용될 수 있다.
본 개시물의 RNAi 분자는 질환을 예방 또는 치료하거나 병상 또는 장애의 증상을 완화시키기 위해 개별적으로, 또는 조합으로, 또는 다른 공지된 약물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는 서열-특이적 방식으로 유전자의 발현을 조정 또는 억제하는데 사용될 수 있다.
본 개시물의 RNAi 분자는 일련의 인접 뉴클레오티드가 인간 mRNA 에 적어도 부분적으로 상보적인 가이드 가닥을 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예는 이를 필요로 하는 대상체에서의 질환 또는 병상의 증상을 예방, 치료 또는 완화시키기 위한 방법을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에서의 악성 종양의 증상을 예방, 치료 또는 완화시키기 위한 방법은 대상체 또는 유기체에서의 유전자 발현을 조정하기 위해 본 발명의 RNAi 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포 또는 유기체를 본 발명의 RNAi 분자와 접촉시킴으로써 세포 또는 유기체에서의 유전자 발현을 하향 조절하기 위한 방법을 고려한다.
Hsp47 에 대해 표적화된 RNAi 분자
일부 구현예에서, 본 발명은 열충격 단백질 47 (Hsp47), 세포내 이동 및 성숙을 위한 콜라겐-특이적 분자 샤페론의 발현을 조정하기 위한 다양한 RNAi 분자 및 조성물을 제공할 수 있다.
Hsp47 에 대한 siRNA 의 일부 예가 그 전문이 본원에 모든 목적을 위해 참조로 포함되는 US 8,710,209 에 제공된다.
Hsp47 또는 이의 상동성 유전자 서열은 예를 들어, GenBank 등록 번호 AB010273 (인간), X60676 (마우스), 또는 M69246 (랫트, gp46) 로서 개시되어있다.
Hsp47 을 억제하기 위한 제제는 섬유증을 억제하는 것으로 개시되어있다. 예를 들어, 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 US 8,173,170 B2 를 참조한다. 그러나, 악성 종양 발전, 진행 및 성장에 있어서 Hsp47 을 억제하는 효과에 관련하여 제한된 정보가 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자의 각각의 가닥은 15 내지 60 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 40 뉴클레오티드 길이, 또는 19 내지 25 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 Hsp47 에 대해 표적화된 RNAi 분자인 악성 종양을 치료하기 위한 RNAi 분자를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
Hsp47 mRNA 에 대해 표적화된 본 개시물의 RNAi 분자의 예를 표 9 에 나타낸다.
표 9: Hsp47 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00012
Figure pct00013
표 9 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 d 는 "데옥시" 를 나타낸다.
표 9 에서, Hsp47 에 대해 표적화된 임의의 RNAi 분자의 안티센스 가닥은 복수의 위치에서 데옥시뉴클레오티드를 가질 수 있는데, 복수의 위치는 하기의 것 중 하나이다: 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 4, 6 및 8; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 1, 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3-8; 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 5-8.
Hsp47 mRNA 에 대해 표적화된 본 개시물의 RNAi 분자의 추가 예를 표 10 에 나타낸다.
표 10: Hsp47 에 대한 RNAi 분자 서열 및 대조군
Figure pct00014
표 10 에 대한 기호 설명: 지정: rX 는 리보뉴클레오티드를 나타내고, mX 는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드를 나타내고, 25rX 는 2'-5' 연결을 갖는 리보뉴클레오티드를 나타내고, C3 은 1,3-프로판디올 스페이서를 나타내고, idAB 는 역전된 1,2-디데옥시-D-리보오스를 나타내고, P 는 3'-말단 상의 포스페이트기를 나타낸다.
표 10 에서, Hsp47 에 대해 표적화된 임의의 RNAi 분자의 안티센스 가닥은 대안적으로 복수의 위치에서 데옥시뉴클레오티드를 가질 수 있는데, 복수의 위치는 하기의 것 중 하나이다: 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 4, 6 및 8; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 1, 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3-8; 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 5-8.
MCL1 에 대해 표적화된 RNAi 분자
일부 구현예에서, 본 발명은 유전자 호모사피엔스 골수 세포 백혈병 1 (MCL1), 전사 변이체 2, mRNA 의 발현을 조정하기 위한 다양한 RNAi 분자 및 조성물을 제공할 수 있다.
MCL1 은 예를 들어, 등록 번호 NM_182763.2 (인간) 에서 개시되어있다.
MCL1 mRNA 에 대해 표적화되는 본 개시물의 RNAi 분자의 예를 표 11 에 나타낸다.
표 11: MCL1 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00015
표 11 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 d 는 "데옥시" 를 나타낸다.
표 11 에서, MCL1 에 대해 표적화된 임의의 RNAi 분자의 안티센스 가닥은 대안적으로 복수의 위치에서 데옥시뉴클레오티드를 가질 수 있는데, 복수의 위치는 하기의 것 중 하나이다: 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 4, 6 및 8; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3, 5 및 7+; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 1, 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3-8; 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 5-8.
ARAF 에 대해 표적화된 RNAi 분자
일부 구현예에서, 본 발명은 유전자 호모사피엔스 A-Raf 원종양유전자, 세린/트레오닌 키나아제 (ARAF), 전사 변이체 1, mRNA 의 발현을 조정하기 위한 다양한 RNAi 분자 및 조성물을 제공할 수 있다.
ARAF 는 예를 들어, 등록 번호 NM_001654.4 (인간) 에서 개시되어있다.
ARAF mRNA 에 대해 표적화된 본 개시물의 RNAi 분자의 예를 표 12 에 나타낸다.
표 12: ARAF 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00016
표 12 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 d 는 "데옥시" 를 나타낸다.
표 12 에서, ARAF 에 대해 표적화된 임의의 RNAi 분자의 안티센스 가닥은 대안적으로 복수의 위치에서 데옥시뉴클레오티드를 가질 수 있는데, 복수의 위치는 하기의 것 중 하나이다: 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 4, 6 및 8, 의; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 1, 3, 5 및 7; 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 3-8; 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 각각의 위치 5-8.
RNA 간섭
일반적으로, siRNA 는 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드 길이일 수 있으며 약 19 뉴클레오티드 길이의 염기쌍 듀플렉스 부위를 포함한다.
RNAi 는 RNA 유도 침묵화 복합체 (RISC) 로서 공지된 엔도뉴클레아제 복합체를 포함한다. siRNA 는, RISC 복합체에 진입하며 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 RNA 표적의 절단을 매개하는 안티센스 또는 가이드 가닥을 갖는다. siRNA 의 다른 가닥은 패신저 가닥이다. 표적 RNA 의 절단은, siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 부위의 중간에서 발생한다. 예를 들어, [Elbashir et al., Genes & Development, 2001, Vol. 15, pp. 188-200] 을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "센스 가닥" 은 siRNA 분자의 상응하는 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 부분적으로 또는 완전히 상보적인 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. siRNA 분자의 센스 가닥은 표적 핵산 서열과 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안티센스 가닥" 은 표적 핵산 서열의 적어도 일부분에 부분적으로 또는 완전히 상보적인 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. siRNA 분자의 안티센스 가닥은 siRNA 분자의 상응하는 센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다.
RNAi 분자는 서열-특이적 방식으로 RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현을 조절하거나 녹다운시킬 수 있다. 예를 들어, Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Elbashir et al., Nature, 2001, Vol. 411, pp. 494-498; Kreutzer et al., WO2000/044895; Zernicka-Goetz et al., WO2001/36646; Fire et al., WO1999/032619; Plaetinck et al., WO2000/01846; Mello et al., WO2001/029058 을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 발현에 관한 용어 "억제하다", "하향조절하다" 또는 "감소시키다" 는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 수준, 또는 인코딩된 단백질 중 하나 이상의 활성이 본 발명의 RNAi 분자 또는 siRNA 의 부재시 관찰된 것 이하로 감소되는 것을 의미한다. 예를 들어, 발현 수준, mRNA 의 수준, 또는 인코딩된 단백질 활성의 수준은 본 발명의 RNAi 분자 또는 siRNA 의 부재시 관찰된 것으로부터 적어도 1%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 90%, 또는 그 이상 감소될 수 있다.
RNAi 분자는 또한 바이러스 유전자 발현을 녹다운시키는데 사용될 수 있으며, 따라서 바이러스 복제에 영향을 준다.
RNAi 분자는 별개의 폴리뉴클레오티드 가닥: 센스 가닥 또는 패신저 가닥, 및 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥으로부터 만들어질 수 있다. 가이드 및 패신저 가닥은 적어도 부분적으로 상보적이다. 가이드 가닥 및 패신저 가닥은 약 15 내지 약 49 염기쌍을 갖는 듀플렉스 부위를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 의 듀플렉스 부위는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49 염기쌍을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 분자는 RISC 복합체에서 활성일 수 있으며, 듀플렉스 부위의 길이가 RISC 에 대해 활성이다.
추가의 구현예에서, RNAi 분자는 RISC 복합체에서 활성일 수 있는 RNAi 분자로 전환될 다이서 (Dicer) 기질로서 활성일 수 있다.
일부 양태에서, RNAi 분자는 긴 분자의 대향 말단에서 상보적 가이드 및 패신저 서열 부분을 가질 수 있어, 분자가 상보적 서열 부분을 갖는 듀플렉스 부위를 형성할 수 있고, 가닥이 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커에 의해 듀플렉스 부위의 하나의 말단에서 연결된다. 예를 들어 헤어핀 배열, 또는 스탬 및 및 루프 배열이 있다. 가닥과의 링커 상호작용은 공유결합 또는 비-공유 상호작용일 수 있다.
본 개시물의 RNAi 분자는 핵산의 안티센스 부위에 핵산의 센스 부위를 연결시키는 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드, 또는 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 링커를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 링커는 ≥2 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 길이의 링커일 수 있다. 뉴클레오티드 링커는 핵산 압타머일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "압타머" 또는 "핵산 압타머" 는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 지칭하며, 여기서 핵산 분자는 그의 자연적 환경에서 표적 분자에 의해 인지되는 서열을 포함하는 서열을 갖는다. 대안적으로, 압타머는 표적 분자에 결합하는 핵산 분자일 수 있으며, 여기서 표적 분자는 핵산에 자연적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 압타머는 단백질의 리간드-결합 도메인에 대한 결합에 사용될 수 있어, 이로써 자연 발생 리간드와 단백질의 상호작용을 방지한다. 예를 들어, Gold et al., Annu Rev Biochem, 1995, Vol. 64, pp. 763-797; Brody et al., J. Biotechnol., 2000, Vol. 74, pp. 5-13; Hermann et al., Science, 2000, Vol. 287, pp. 820-825 를 참조한다.
비-뉴클레오티드 링커의 예는 무염기성 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리히드로카본, 또는 다른 중합체 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 예컨대 2 내지 100 개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 것들을 포함한다. 일부 예가 Seela et al., Nucleic Acids Research, 1987, Vol. 15, pp. 3113-3129; Cload et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, pp. 6324-6326; Jaeschke et al., Tetrahedron Lett., 1993, Vol. 34, pp. 301; Arnold et al., WO1989/002439; Usman et al., WO1995/006731; Dudycz et al., WO1995/011910, 및 Ferentz et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, pp. 4000-4002 에 기재되어있다.
RNAi 분자는 듀플렉스 부위로부터 하나 이상의 오버행을 가질 수 있다. 비-염기쌍 형성된, 단일 가닥 부위인 오버행은, 1 내지 8 뉴클레오티드 길이일 수 있거나, 더 길 수 있다. 오버행은 3'-말단 오버행일 수 있고, 여기서 가닥의 3'-말단은 1 내지 8 뉴클레오티드의 단일 가닥 부위를 갖는다. 오버행은 5'-말단 오버행일 수 있고, 여기서 가닥의 5'-말단은 1 내지 8 뉴클레오티드의 단일 가닥 부위를 갖는다.
RNAi 분자의 오버행은 동일한 길이를 가질 수 있거나, 상이한 길이일 수 있다.
RNAi 분자는 하나 이상의 평활 말단을 가질 수 있으며 (여기서 듀플렉스 부위 말단은 오버행을 갖지 않음), 가닥은 듀플렉스 부위의 말단과 염기쌍 형성된다.
본 개시물의 RNAi 분자는 하나 이상의 평활 말단을 가질 수 있거나, 하나 이상의 오버행을 가질 수 있거나, 평활 말단 및 오버행 말단의 조합을 가질 수 있다.
RNAi 분자의 가닥의 5'-말단은 평활 말단에 있을 수 있거나, 오버행에 있을 수 있다. RNAi 분자의 가닥의 3'-말단은 평활 말단에 있을 수 있거나, 또는 오버행에 있을 수 있다.
RNAi 분자의 가닥의 5'-말단은 평활 말단에 있을 수 있는 한편, 3'-말단은 오버행에 있다. RNAi 분자의 가닥의 3'-말단은 평활 말단에 있을 수 있는 한편, 5'-말단은 오버행에 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자의 양 말단은 평활 말단이다.
추가의 구현예에서, RNAi 분자의 양 말단은 오버행을 갖는다.
5'- 및 3'-말단에서의 오버행은 상이한 길이의 것일 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 분자는 평활 말단을 가질 수 있으며, 이때 안티센스 가닥의 5'-말단 및 센스 가닥의 3'-말단은 임의의 오버행 뉴클레오티드를 갖지 않는다.
추가 구현예에서, RNAi 분자는 평활 말단을 가질 수 있으며, 이때 안티센스 가닥의 3'-말단 및 센스 가닥의 5'-말단은 임의의 오버행 뉴클레오티드를 갖지 않는다.
RNAi 분자는 듀플렉스 부위에서의 염기쌍 형성에서 미스매치를 가질 수 있다.
RNAi 분자의 오버행에서의 임의의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드일 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드는 5'-말단에 있을 수 있고, 여기서 RNAi 분자의 다른 가닥의 3'-말단은 오버행을 가지지 않을 수 있거나, 데옥시리보뉴클레오티드 오버행을 가지지 않을 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드는 3'-말단에 있을 수 있고, 여기서 RNAi 분자의 다른 가닥의 5'-말단은 오버행을 가지지 않을 수 있거나, 데옥시리보뉴클레오티드 오버행을 가지지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자의 오버행 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 전부는 2'-데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.
다이서 기질 RNAi 분자
일부 양태에서, RNAi 분자는 RISC 활성 RNAi 분자가 생성되도록 처리될 수 있는 다이서 기질로서 적합한 길이의 것일 수 있다. 예를 들어, Rossi et al., US2005/0244858 을 참조한다.
다이서 기질인 이중 가닥 RNA (dsRNA) 는 활성 RNAi 분자가 생성되도록 다이서에 의해 처리되기에 충분한 길이의 것일 수 있으며, 하기의 특성 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: (i) 다이서 기질 dsRNA 는 예를 들어 안티센스 가닥에 3' 오버행을 갖는 비대칭의 것일 수 있고, (ii) 다이서 기질 dsRNA 는 다이서 결합의 배향 및 활성 RNAi 분자로의 dsRNA 처리를 유도하기 위해 센스 가닥에 변형된 3' 말단을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 에서 최장 가닥은 24-30 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 는 대칭 또는 비대칭일 수 있다.
일부 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 22-28 뉴클레오티드의 센스 가닥 및 24-30 뉴클레오티드의 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 안티센스 가닥의 3' 말단에 오버행을 가질 수 있다.
추가 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 25 뉴클레오티드 길이 센스 가닥, 및 27 뉴클레오티드 길이 안티센스 가닥을 2 염기 3'-오버행과 함께 가질 수 있다. 오버행은 1, 2 또는 3 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 센스 가닥은 또한 5' 포스페이트를 가질 수 있다.
비대칭 다이서 기질 dsRNA 는 2 개의 리보뉴클레오티드 대신에 센스 가닥의 3'-말단에서 2 개의 데옥시리보뉴클레오티드를 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 센스 가닥은 약 22 내지 약 30, 또는 약 22 내지 약 28; 또는 약 24 내지 약 30; 또는 약 25 내지 약 30; 또는 약 26 내지 약 30; 또는 약 26 내지 29; 또는 약 27 내지 약 28 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 센스 가닥은 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 은 적어도 약 25 뉴클레오티드 길이, 및 약 30 뉴클레오티드 길이 이하인 센스 및 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 26 내지 29 뉴클레오티드 길이인 센스 및 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 27 뉴클레오티드 길이인 센스 및 안티센스 가닥을 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 센스 및 안티센스 가닥은 평활 말단화되는 것에서와 동일한 길이이거나, 오버행을 갖는 것에서와 상이한 길이일 수 있고, 또는 평활 말단 및 오버행을 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 는 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 부위를 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 안티센스 가닥은 생물학적 조건 하, 예컨대 진핵 세포의 세포질 내에서, 센스 가닥의 서열의 적어도 일부분에 어닐링되는 임의의 서열을 가질 수 있다.
센스 및 안티센스 가닥을 갖는 다이서 기질은 제 3 구조, 예컨대 링커기 또는 링커 올리고뉴클레오티드에 의해 연결될 수 있다. 링커는 예를 들어 2 개 가닥의 dsRNA 를 연결하여, 헤어핀이 어닐링시 형성된다.
다이서 기질의 센스 및 안티센스 가닥은 일반적으로 상보적이지만, 염기쌍 형성에서 미스매치를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 다이서 기질 dsRNA 는 비대칭일 수 있어, 센스 가닥이 22-28 뉴클레오티드를 갖고 안티센스 가닥이 24-30 뉴클레오티드를 갖는다.
다이서 기질 dsRNA 의 가닥 중 하나의 부위, 특히 안티센스 가닥은, 적어도 19 뉴클레오티드의 서열 길이를 가질 수 있고, 여기서 이들 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 3' 말단에 인접한 21-뉴클레오티드 부위에 있으며 표적 유전자로부터 생성된 RNA 의 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적이다.
다이서 기질 dsRNA 의 안티센스 가닥은 22-28 뉴클레오티드 길이가 제공되도록 5'-말단에 1 내지 9 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 안티센스 가닥이 21 뉴클레오티드 길이를 갖는 경우, 1-7 리보뉴클레오티드, 또는 2-5 리보뉴클레오티드, 또는 4 리보뉴클레오티드가 3'-말단에 첨가될 수 있다. 첨가된 리보뉴클레오티드는 임의의 서열을 가질 수 있다.
다이서 기질 dsRNA 의 센스 가닥은 24-30 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 센스 가닥은 생물학적 조건 하에 안티센스 가닥에 어닐링되도록 안티센스 가닥과 실질적으로 상보적일 수 있다.
RNAi 분자를 사용하기 위한 방법
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 분자의 직접 적용에 의해, 또는 담체 또는 희석제와 조합된 분자로, 세포 또는 조직에 전달될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는, 담체 또는 희석제를 사용하는 분자의 직접 적용에 의해, 또는 세포 내로의 진입을 보조, 촉진 또는 도모하도록 작용하는 임의의 다른 전달 비히클, 예를 들어 바이러스 서열, 바이러스 물질, 또는 지질 또는 리포좀 제형에 의해 세포, 조직, 장기 또는 대상에 전달 또는 투여될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 양이온성 지질과 복합체화되고, 리포좀 내에 패키징되거나, 다르게는 표적 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 핵산 또는 핵산 복합체는 직접 진피 적용, 경피 적용 또는 주사를 통해 생체외 (ex vivo), 또는 생체내 (in vivo) 관련 조직에 국소적으로 투여될 수 있다.
전달 시스템은 예를 들어 수성 및 비수성 겔, 크림, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 리포좀, 연고, 수용액 및 비-수용액, 로션, 에어로졸, 탄화수소 염기 및 분말을 포함할 수 있고, 및 부형제 예컨대 가용화제 및 투과 증강제를 함유할 수 있다.
본 개시물의 조성물 및 방법은 핵산 분자의 발현을 허용하는 방식으로 본 발명의 적어도 하나의 RNAi 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다. 재조합 벡터는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 핵산 분자의 일시적 발현을 제공하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 벡터는 듀플렉스의 RNAi 분자의 양 가닥을 인코딩하는 서열, 또는 자기-상보적이며 따라서 RNAi 분자를 형성하는 단일 핵산 분자를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 둘 이상의 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
핵산 분자는 진핵 프로모터로부터 세포 내에서 발현될 수 있다. 당업자는 적절한 DNA/RNA 벡터로부터 진핵 세포에서 임의의 핵산이 발현될 수 있다는 것을 인지한다.
일부 양태에서, 바이러스 구성물은 발현 구성물에 의해 인코딩된 dsRNA 구성물의 전사를 위해, 발현 구성물을 세포에 도입시키는데 사용될 수 있다.
지질 제형은 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사, 또는 경구로 또는 흡입에 의해 또는 당업계에 공지되어있는 다른 방법에 의해 동물에 투여될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 투여하기 위한 약학적으로 허용가능한 제형이 공지되어있으며 사용될 수 있다.
질환을 치료하기 위한 방법
질환의 예는 암, 육종, 섬유육종, 악성 섬유질 조직구종, 지방육종, 횡문근육종, 평활근육종, 맥관육종, 카포시 육종, 림프관육종, 활막 육종, 연골육종, 골육종 및 암종을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법은, 예를 들어 뇌종양, 두경부 암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담도암, 신장암, 요도암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 난소암, 피부암, 백혈병, 악성 림프종, 상피성 악성 종양 및 비-상피성 악성 종양을 포함하는, 임의의 장기 또는 조직에서의 악성 종양 및 암을 예방 또는 치료하기 위해 본 발명의 화합물을 이용할 수 있다.
시험관내 녹다운을 위한 예시적 프로토콜
트랜스펙션 1 일 전에, 세포를 10% FBS 를 함유하는 100 ㎕ 의 DMEM (HyClone 카탈로그 번호 SH30243.01) 으로 웰 당 2 x 103 세포로 96-웰 플레이트에서 플레이팅하고, 공기 중 5% CO2 의 가습된 분위기를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 트랜스펙션 전에, 배지를, 2% FBS 를 함유하는 90 ㎕ 의 Opti-MEM I 환원 혈청 배지 (Life Technologies 카탈로그 번호 31985-070) 로 바꾸었다. 그런 다음, 0.2 ㎕ 의 리포펙타민 RNAiMax (Life Technologies 카탈로그 번호 13778-100) 를 4.8 ㎕ 의 Opti-MEM I 과 실온에서 5 분 동안 혼합하였다. 다음으로, 1 ㎕ 의 siRNA 를 4 ㎕ 의 Opti-MEM I 과 혼합하고 LF2000 용액과 조합하고, 볼텍싱 없이 부드럽게 혼합하였다. 실온에서 5 분 후, 혼합물을 실온에서 추가 10 분 동안 인큐베이션하여, RNA-RNAiMax 복합체가 형성되게 하였다. 또한, 10 ㎕ 의 RNA-RNAiMax 복합체를 웰에 첨가하고, 플레이트를 손으로 부드럽게 진탕하였다. 세포를 2 시간 동안 공기 중 5% CO2 의 가습된 분위기를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 배지를, 2% FBS 를 함유하는 신선한 Opti-MEM I 환원 혈청 배지로 바꾸었다. 트랜스펙션 24 시간 후, 세포를 빙랭 PBS 로 1 회 세척하였다. 세포를 50 ㎕ 의 Cell-to-Ct 용해 완충제 (Life Technologies 카탈로그 번호 4391851 C) 로 실온에서 5-30 분 동안 용해하였다. 5 ㎕ 의 중지 용액을 첨가하고, 이를 실온에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. mRNA 수준을, TAQMAN 으로 RT-qPCR 에 의해 즉시 측정하였다. 샘플을 -80℃ 에서 동결시키고 나중에 분석하였다.
혈청 안정성을 위한 예시적 프로토콜
0.2 mg/ml siRNA 를, 10% 인간 혈청과 함께 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 특정 시점 (0, 5, 15 및 30 분) 에, 200 ㎕ 의 샘플을 분취하고 200 ㎕ 추출 용매 (클로로포름:페놀:이소아밀 알코올 = 24:25:1) 로 추출하였다. 샘플을 볼텍싱하고 13,000 rpm 에서 10 분 동안 RT 에서 원심분리한 다음, 상부층 용액을 이동시키고 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 여과물을 300 ㎕ HPLC 주사 바이알에 이동시켰다. LCMS 에 대해, 이동상은 MPA: 100 mM HFIP + 7 mM TEA (H2O 중) 이고, MPB: 50% 메탄올 + 50% 아세토니트릴이었다. 컬럼: Waters Acquity OST 2.1 x 50 mm, 1.7 ㎛.
실시예
실시예 1: GST-π 에 대해 표적화된 본 발명의 siRNA 는 시험관내 유전자 침묵을 위해 활성이라는 것이 발견되었다. 유전자 녹다운을 위한 GST-π siRNA 의 용량-의존적 활성은 약 250 피코몰 (pM) 미만, 및 1 pM 만큼 낮은 IC50 을 나타내는 것으로 발견되었다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, siRNA 녹다운 효능을 측정하였다. GST-π mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운이, 표 13 에서 나타낸 바와 같이, 표 1 의 siRNA 로 관찰되었다.
표 13: A549 세포주에서 GST-π mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운
Figure pct00017
표 13 에서 나타낸 바와 같이, 표 1 의 GST-π siRNA 의 활성은 17-235 pM 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 적합한 것이다.
실시예 2: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치한 데옥시뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 GST-π siRNA 의 구조는 예기치 않으며 유리하게 증가한 시험관내 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, 구조 BU2' 기반의 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 131 및 157) 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이, 표 14 에서 나타낸 바와 같이 구조 BU2' 기반의 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 14: 구조 BU2' 기반의 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00018
표 14 에서 나타낸 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 BU2' 기반의 GST-π siRNA 의 활성은 놀랍고 예기치 않게, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 최대 6 배로 증가하였다.
이들 데이터는, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 3, 5 및 7, 또는 위치 4, 6 및 8 에 위치한 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 가지는 GST-π siRNA 가, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 놀랍게도 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 나타낸다.
안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 14 에서 나타낸 활성은 5 내지 8 pM 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 예외적으로 적합한 것이다.
실시예 3: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치한 데옥시뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 GST-π siRNA 의 구조는 예기치 않으며 유리하게 증가한 시험관내 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, 구조 A9' 기반의 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 183 및 195) 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이, 표 15 에서 나타낸 바와 같이 구조 A9' 기반의 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 15: 구조 A9' 기반의 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00019
표 15 에서 나타낸 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 내지 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 A9' 기반의 GST-π siRNA 의 활성은 놀랍게도, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 최대 24 배로 증가하였다.
이들 데이터는, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 4, 6 및 8, 또는 위치 1, 3, 5 및 7, 또는 위치 3-8, 또는 위치 5-8, 또는 위치 3, 5 및 7 에 위치한 3 내지 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 가지는 GST-π siRNA 가, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 예기치 않게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 나타낸다.
안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 내지 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 15 에서 나타낸 활성은 1 내지 15 pM 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 예외적으로 적합한 것이다.
실시예 4: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치한 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 의 구조는 예기치 않으며 유리하게 증가한 시험관내 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, 구조 B13' 기반의 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 207 및 222) 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이, 표 16 에서 나타낸 바와 같이 구조 B13' 기반의 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 16: 구조 B13' 기반의 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00020
표 16 에서 나타낸 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B13' 기반의 GST-π siRNA 의 활성은 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여 예기치 않게 증가하였다.
이들 데이터는, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 4, 6 및 8 에 위치한 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 가지는 GST-π siRNA 가, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 예기치 않게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 나타낸다.
안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 16 에서 나타낸 활성은 11 pM 에서의 피코몰 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 예외적으로 적합한 것이다.
실시예 5: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치한 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 의 구조는 예기치 않고 유리하게 증가한 시험관내 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, 구조 B4' 기반의 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 261 및 273) 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이, 표 17 에서 나타낸 바와 같이 구조 B4' 기반의 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 17: 구조 B4' 기반의 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00021
표 17 에서 나타낸 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B4' 기반의 GST-π siRNA 의 활성은 예기치 않게, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 2 배 초과로 증가하였다.
이들 데이터는, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 3-8 에 위치한 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 가지는 GST-π siRNA 가, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 놀랍게도 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 나타낸다.
안티센스 가닥의 시드 부위에서 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 17 에서 나타낸 활성은 113 pM 에서의 피코몰 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 예외적으로 적합한 것이다.
실시예 6: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치한 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 의 구조는 예기치 않고 유리하게 증가한 시험관내 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, 구조 B2' 기반의 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 237 및 249) 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이, 표 18 에서 나타낸 바와 같이 구조 B2' 기반의 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 18: 구조 B2' 기반의 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00022
표 18 에서 나타낸 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 내지 4 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B2' 기반의 GST-π siRNA 의 활성은 놀랍게도, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 최대 4 배로 증가하였다.
이들 데이터는, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 5-8, 또는 위치 1, 3, 5 및 7, 또는 위치 3, 5 및 7 에 위치한 3 내지 4 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 가지는 GST-π siRNA 가, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 예기치 않게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 나타낸다.
안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 내지 4 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 18 에서 나타낸 활성은 30-100 pM 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 예외적으로 적합한 것이다.
실시예 7: 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드를 포함하는 GST-π siRNA 의 구조는 예기치 않게 증가한 시험관내 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, 구조 BU2' 기반의 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 131 및 157) 에 대한 녹다운 활성을 측정하였다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이, 표 19 에서 나타낸 바와 같이 구조 BU2' 기반의 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 19: 구조 BU2' 기반의 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00023
표 19 에서 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 BU2' 기반의 GST-π siRNA 의 활성은 놀랍게도, 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 최대 10 배로 증가하였다.
이들 데이터는 하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 가지는 GST-π siRNA 가 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 예기치 않게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 나타낸다.
하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 19 에서 나타낸 활성은 3 내지 13 pM 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 예외적으로 적합한 것이다.
실시예 8: 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드를 포함하는 GST-π siRNA 의 구조는 예기치 않게 증가한 시험관내 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, 구조 B13' 기반의 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 207 및 222) 에 대한 녹다운 활성을 측정하였다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이, 표 20 에서 나타낸 바와 같이 구조 B13' 기반의 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 20: 구조 B13' 기반의 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00024
표 20 에서 나타낸 바와 같이, 비-오버행 위치에 위치한 3 개의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B13' 기반의 GST-π siRNA 의 활성은 놀랍게도, 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 약 3 배로 증가하였다.
이들 데이터는 하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 가지는 GST-π siRNA 가 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교하여, 예기치 않게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 나타낸다.
하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 20 에서 나타낸 활성은 6 pM 에서의 피코몰 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 예외적으로 적합한 것이다.
실시예 9: 동소위 A549 폐암 마우스 모델. 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내 동소위 폐암 종양의 큰 감소를 나타낼 수 있다. 이 실시예에서, 리포좀 제형으로 무흉선 누드 마우스에서의 동소위 폐암 종양에 투여한 경우, GST-π siRNA 는 생체내 유전자 녹다운 효력을 제공하였다.
일반적으로, 동소위 종양 모델은 약물 효능 및 효력에 대한 직접적인 임상 관련성 뿐만 아니라 개선된 예측 능력을 나타낼 수 있다. 동소위 종양 모델에서, 종양 세포는 세포가 유래한 동일한 종류의 장기에 직접 이식된다.
인간 폐암 A549 에 대한 siRNA 제형의 항종양 효능을, 처리군 및 비히클 대조군에 대한 검시에서 측정한 최종 원발성 종양 중량을 비교하여 평가하였다.
도 1 은 구조 BU2 기반의 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 61 및 126) 에 대한 생체내 동소위 폐암 종양 억제를 나타낸다. 동소위 A549 폐암 마우스 모델을 2 mg/kg 의, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 에서의 상대적 저용량으로 이용하였다.
GST-π siRNA 는 이 6 주 연구에서 유의하고 예기치 않게 유리한 폐 종양 억제 효능을 나타내었다. 도 1 에서 나타낸 바와 같이, 43 일 후, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제 효능을 나타내었는데, 최종 종양 평균 중량은 대조군과 비교하여 2.8 배로 상당히 감소하였다.
이 연구를 위해, 5-6 주령의 수컷 NCr nu/nu 마우스를 사용하였다. 실험적 동물을 실험 기간 동안 HEPA 여과된 환경에서 유지시켰다. siRNA 제형을 사용 전 4℃ 에서 저장하고, 마우스에 주사하기 10 분 전에 실온으로 가온하였다.
이 A549 인간 폐암 동소위 모델에 대해서, 외과적 동소위 이식 (SOI) 일에, A549 종양 이종이식편을 가지는 동물의 피하 위치로부터 스톡 (stock) 종양을 수확하고, RPMI-1640 배지에 두었다. 괴저성 조직을 제거하고 생존가능 조직을 1.5-2 mm3 조각으로 절단하였다. 동물을 이소플루란 흡입으로 마취시키고 수술 부위를 요오드 및 알코올로 멸균하였다. 한 쌍의 수술용 가위를 사용하여 마우스의 좌측 흉벽에서 대략 1.5 cm 길이로 횡행 절개하였다. 제 3 늑골과 제 4 늑골 사이에 늑골간 절개를 수행하고 좌측 폐를 노출시켰다. 8-0 수술용 봉합사 (나일론) 로, 하나의 A549 종양 단편을 폐 표면에 이식하였다. 흉벽을 6-0 수술용 봉합사 (실크) 로 폐쇄하였다. 25 G X 1 ½ 바늘과 3 cc 주사기를 사용하여 폐를 흉곽내 천자에 의해 재팽창시켜, 흉강 내 잔여 공기를 빼냈다. 흉벽을 6-0 외과용 실크 봉합사로 폐쇄하였다. 상기 기재된 수술의 모든 절차를 HEPA 여과 층류 후드 하에서 7 x 배율 현미경으로 수행하였다.
종양 이식 3 일 후, 모델 종양-함유 마우스를 군 당 10 마리 마우스의 군으로 무작위하게 나누었다. 관심 군에 대해, 10 마리 마우스의 처리를 종양 이식 3 일 후에 개시하였다.
관심 군에 대해서, 제형은 (이온화가능 지질:콜레스테롤:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K:DSPE-PEG-2K), 리포좀 조성물이었다. 리포좀은 GST-π siRNA 를 캡슐화하였다.
연구 종말점에 대해서, 실험용 마우스를 처리 개시 42 일 후 희생시켰다. 원발성 종양을 절제하고 후속적 분석을 위해 전자 저울에서 칭량하였다.
화합물 독성의 추정을 위해, 처리군 및 대조군에서의 마우스의 평균 체중을 전체 실험 기간 동안 정상 범위 내에서 유지시켰다. 독성의 다른 증상은 마우스에서 관찰되지 않았다.
실시예 10: 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내 암 이종이식 종양의 큰 감소를 나타내었다. 리포좀 제형으로 암 이종이식 종양에 투여한 경우, GST-π siRNA 는 생체내 유전자 녹다운 효력을 제공하였다.
도 2 는 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 156 및 182) 에 대한 종양 억제 효능을 나타낸다. 암 이종이식 모델을, 0.75 mg/kg 의, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 에서의 상대적 저용량으로 이용하였다.
GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의하고 예기치 않게 유리한 종양 억제 효능을 나타내었다. 36 일 후, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제 효능을 나타내었는데, 종양 부피는 대조군과 비교하여 2 배로 감소하였다.
도 3 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 는 종말점일에 유의하고 예기치 않게 유리한 종양 억제 효능을 입증하였다. 특히, 종양 중량은 2 배 초과로 감소하였다.
GST-π siRNA 를, 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포좀 제형의 2 회 주사 (제 1 일 및 제 15 일) 로 투여하였다.
암 이종이식 모델에 대해서, A549 세포주를 ATCC 로부터 입수하였다. 세포를 10% 우태 혈청 및 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 배양 배지에서 유지시켰다. 세포를 접종 전 48 시간 분열시켜, 세포가 수확시 대수 증식 성장에 있게 하였다. 세포를 트립신-EDTA 로 가볍게 트립신화하고, 조직 배양물로부터 수확하였다. 생존 세포의 수를 트립판 블루의 존재 하에 혈구계에서 계수 및 측정하였다 (생존 세포만이 계수됨). 세포를 무혈청 배지에서 5 x 107/ml 의 농도로 재현탁하였다. 그런 다음, 주사를 위해, 세포 현탁액을 얼음 해동된 BD 매트리겔과 1:1 비로 잘 혼합하였다.
마우스는 군 당 7-8 마리 마우스의, 면역 저하된, 6-8 주령 Charles River 실험실 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스였다.
종양 모델 준비를 위해, 25 G 바늘 및 주사기를 사용하여, 마우스 당 하나의 접종물로, 각각의 마우스를 2.5 x 106 의 A549 세포의 0.1 ml 접종물로 우측 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스는 접종을 위해 마취되지는 않았다.
종양 부피 측정 및 무작위화를 위해, 종양 크기를 0.1 mm 에 가깝게 측정하였다. 종양 부피를 하기 식을 사용하여 계산하였다: 종양 부피 = 길이 x 폭2/2. 확립된 종양이 대략 120 - 175 mm3 에 도달하고나면, 평균 종양 부피는 약 150 mm3 이었고, 마우스를 다양한 비히클 대조군 및 처리군에 배정하여, 처리군에서의 평균 종양 부피가 비히클 대조군에서의 평균 종양 부피의 10% 내에 있도록, 이상적으로, 종양 부피의 CV% 가 25% 미만이도록 하였다. 동일한 날에, 시험 물품 및 대조 비히클을 투약 레지멘에 따라 투여하였다. 종양 부피를, 연구 종결일을 포함하여, 제 1 주에 대해서는 3 회, 나머지 주에 대해서는 2 회 모니터링하였다.
투여량 투여에 대해서는, 투약일에, 시험 물품을 -80℃ 냉동고에서 꺼내고 얼음 상에서 해동하였다. 주사기에 적용하기 전, 제형을 함유하는 병을 수회 손으로 리버팅하였다. 모든 시험 물품을 0.75 mg/kg 에서, IV 로, q2w X 2, 10 ml/kg 에서 투약하였다.
체중에 대해서는, 마우스를 0.1 g 에 가깝게 칭량하였다. 체중을 첫 번째 용량에 대한 투약 후 7 일 내에 모니터링하고 매일 기록하였다. 체중을 연구 종결일을 포함하여, 나머지 주에 대해서는 몇주 동안 2 회 모니터링하고 기록하였다.
종양 수집을 위해, 제 1 투약 후 28 일에, 종양 부피를 측정하고, 종양을 중량 측정을 위해 해부하고, PD 바이오마커 연구를 위해 저장하였다. 종양 중량을 기록하였다.
실시예 11: 본 발명의 GST-π siRNA 는 시험관내 암 세포의 세포자멸사에 의한 증가한 암 세포사를 입증하였다. GST-π siRNA 는 GST-π 녹다운을 제공하였는데, 이는 세포자멸사에 대한 바이오마커이며 세포 생존력의 손실과 관련되는 PUMA 의 상향조절을 초래하였다.
GST-π siRNA SEQ ID NO: 156 및 182 (시드 부위에서의 데옥시뉴클레오티드, 2'-F 치환된 데옥시뉴클레오티드, 및 2'-OMe 치환된 리보뉴클레오티드의 조합을 포함함) 는, 암 세포의 예기치 않게 증가한 세포자멸사를 제공하였다.
GST-π siRNA SEQ ID NO: 156 및 182 에 대한 PUMA 의 발현 수준을 도 4 에서 나타낸 바와 같이 측정하였다. 도 4 에서, PUMA 의 발현은 GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후 2-4 일로부터 크게 증가하였다.
이들 데이터는, 시드 부위에서의 데옥시뉴클레오티드, 2'-F 치환된 데옥시뉴클레오티드, 및 2'-OMe 치환된 리보뉴클레오티드의 조합을 포함하는 GST-π siRNA 의 구조가 암 세포의 예기치 않게 증가한 세포자멸사를 제공하였다는 것을 나타낸다.
PUMA 바이오마커에 대한 프로토콜은 하기와 같다. 트랜스펙션 1 일 전에, 세포를 10% FBS 를 함유하는 100 ㎕ 의 DMEM (HyClone 카탈로그 번호 SH30243.01) 으로 2 x 103 세포/웰에서 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 공기 중 5% CO2 의 가습된 분위기를 포함하는 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 다음 날, 트랜스펙션 전에 배지를 2% FBS 를 함유하는 90 ㎕ 의 Opti-MEM I 환원 혈청 배지 (Life Technologies 카탈로그 번호 31985-070) 로 대체하였다. 그런 다음, 0.2 ㎕ 의 리포펙타민 RNAiMAX (Life Technologies 카탈로그 번호 13778-100) 를 실온에서 5 분 동안 4.8 ㎕ 의 Opti-MEM I 과 혼합하였다. 1 ㎕ 의 GST-π siRNA (저장액 농도 1 μM) 를 4 ㎕ 의 Opti-MEM I 과 혼합하고 RNAiMAX 용액과 조합한 다음, 부드럽게 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여, RNA-RNAiMAX 복합체가 형성되게 하였다. 10 ㎕ 의 RNA-RNAiMAX 복합체를 siRNA 10 nM 의 최종 농도로 웰 당 첨가하였다. 세포를 2 시간 동안 인큐베이션하고, 2% FBS 를 함유하는 신선한 Opti-MEM I 환원 혈청 배지로 바꾸었다. 트랜스펙션 후 1, 2, 3, 4, 및 6 일에 대해, 세포를 빙랭 PBS 로 1 회 세척한 다음, 50 ㎕ 의 Cell-to-Ct 용해 완충제 (Life Technologies 카탈로그 번호 4391851 C) 로 실온에서 5-30 분 동안 용해하였다. 5 ㎕ 의 중지 용액을 첨가하고, 실온에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. PUMA (BBC3, 카탈로그 번호 Hs00248075, Life Technologies) mRNA 수준을 TAQMAN 으로 qPCR 에 의해 측정하였다.
실시예 12: 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내 암 이종이식 종양의 큰 감소를 나타낼 수 있다. 리포좀 제형으로 암 이종이식 종양에 투여한 경우, GST-π siRNA 는 생체내 유전자 녹다운 효력을 제공할 수 있다.
도 5 는 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 61 및 126) 에 대한 종양 억제 효능을 나타낸다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운을, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 로 생체내 관찰하였다. 암 이종이식 모델을, 0.75 mg/kg 의, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 에서의 상대적 저용량으로 이용하였다.
GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의하고 예기치 않게 유리한 종양 억제 효능을 나타내었다. 도 5 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 로의 처리는 지질 제형으로의 주사 4 일 후 GST-π mRNA 발현의 상당한 감소를 초래하였다. 더 높은 용량 4 mg/kg 에서, 약 40% 의 상당한 감소가 주사 24 시간 후 검출되었다.
GST-π siRNA 를, 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 10 mL/kg 의 리포좀 제형의 단일 주사로 투여하였다.
암 이종이식 모델에 대해서, A549 세포주를 ATCC 로부터 입수하였다. 세포를 10% 우태 혈청 및 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 에서 유지시켰다. 세포를 접종 전 48 시간 분열시켜, 세포가 수확시 대수 증식 성장에 있게 하였다. 세포를 트립신-EDTA 로 가볍게 트립신화하고, 조직 배양물로부터 수확하였다. 생존 세포의 수를 트립판 블루의 존재 하에 혈구계에서 계수 및 측정하였다 (생존 세포만이 계수됨). 세포를 무혈청 RPMI 배지에서 4 x 107/ml 의 농도로 재현탁하였다. 그런 다음, 주사를 위해, 세포 현탁액을 얼음 해동된 BD 매트리겔과 1:1 비로 잘 혼합하였다.
마우스는 군 당 3 마리 마우스의, 면역 저하된, 6-8 주령 Charles River 실험실 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스였다.
종양 모델 준비를 위해, 25 G 바늘 및 주사기를 사용하여, 마우스 당 하나의 접종물로, 각각의 마우스를 2 x 106 의 A549 세포의 0.1 ml 접종물로 우측 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스는 접종을 위해 마취되지는 않았다.
종양 부피 측정 및 무작위화를 위해, 종양 크기를 0.1 mm 에 가깝게 측정하였다. 종양 부피를 하기 식을 사용하여 계산하였다: 종양 부피 = 길이 x 폭2/2. 종양 부피를 주 2 회 모니터링하였다. 확립된 종양이 대략 350 - 600 mm3 에 도달하고나면, 마우스를 다양한 시점으로 군에 배정하였다. 동일한 날에, 시험 물품을 투약 레지멘에 따라 투여하였다.
투여량 투여에 대해서는, 확립된 종양이 대략 350 - 600 mm3 에 도달한 날에, 시험 물품을 4℃ 냉장고에서 꺼냈다. 주사기에 적용하기 전, 제형을 함유하는 병을 수회 손으로 리버팅하여 균질한 용액을 만들었다.
체중에 대해서는, 마우스를 0.1 g 에 가깝게 칭량하였다. 체중을 연구 종결일을 포함하여, 나머지 주에 대해서는 몇주 동안 2 회 모니터링하고 기록하였다.
종양 수집을 위해, 동물을 과투여 CO2 에 의해 희생시키고 종양을 투약 후 0, 24, 48, 72, 96 (선택적) 및 168 시간에 해부하였다. 종양을 먼저 습식 칭량한 다음, KD, 분포 및 바이오마커 분석용으로 3 부분으로 분리하였다. 샘플을 액체 질소에서 급속 동결시키고, 처리될 준비가 될 때까지 -80℃ 에서 저장하였다.
실시예 13: 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내 췌장암 이종이식 종양을 억제하였다. 리포좀 제형으로 췌장암 이종이식 종양에 투여한 경우, GST-π siRNA 는 생체내 유전자 녹다운 효력을 제공하였다.
이 이종이식 모델에서, 각각의 마우스를 2.5 x 106 의 PANC-1 세포의 0.1 ml 접종물로 우측 옆구리에 피하 접종하였다. 6 내지 8 주령 무흉선 누드 암컷 마우스 (Charles River) 를 사용하였다. 종양 크기를 0.1 mm 에 가깝게 측정하였다. 확립된 종양이 대략 150 - 250 mm3 (평균 종양 부피 약 200 mm3) 에 도달하고 나면, 마우스를 다양한 비히클 대조군 및 처리군에 배정하여, 처리군에서의 평균 종양 부피가 비히클 대조군에서의 평균 종양 부피의 10% 내에 있도록 하였다. 동일한 날에, 시험 물품 및 대조 비히클을 투약 레지멘에 따라 투여하였다. 종양 부피를 연구 종결일을 포함하여, 제 1 주에 대해서는 3 회, 나머지 주에 대해서는 2 회 모니터링하였다.
도 6 은 GST-π siRNA (SEQ ID NO: 61 및 126) 에 대한 종양 억제 효능을 나타낸다. 도 6 에서 나타낸 바와 같이, 0.375 mg/kg 내지 3 mg/kg 범위의, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 의 용량으로 용량 반응을 수득하였다. GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의하고 예기치 않게 유리한 종양 억제 효능을 나타내었다. 따라서, GST-π siRNA 는 종말점에서 유의하고 예기치 않게 유리한 종양 억제 효능을 입증하였다.
GST-π siRNA 를, 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포좀 제형으로 투여하였다.
실시예 14: 본 발명의 GST-π siRNA 는 증가한 혈청 안정성을 나타내었다.
도 7 은 인간 혈청에서의 인큐베이션 및 HPLS/LCMS 에 의한 다양한 시점에서 잔여 siRNA 의 검출을 나타낸다. 도 7 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA (SEQ ID NO: 61 및 126) 의 센스 가닥 (도 7, 상부) 및 안티센스 가닥 (도 7, 하부) 둘 모두에 대한 혈청에서의 반감기 (t½) 는 약 100 분이었다.
실시예 15: 본 발명의 GST-π siRNA 는 혈장에서의 제형 중 향상된 안정성 을 나타내었다.
도 8 은 혈장에서의 인큐베이션 및 다양한 시점에서의 잔여 siRNA 의 검출을 나타낸다. 도 8 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA (SEQ ID NO: 61 및 126) 의 제형의 혈장에서의 반감기 (t½) 는 100 시간보다 상당히 더 길었다.
GST-π siRNA 를, 조성 (이온화 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포좀 제형으로 준비하였다. 리포좀 나노입자에 대한 z-평균 크기는 40.0 nm 였고, siRNA 는 91% 캡슐화되었다.
제형을 PBS 중 50% 인간 혈청에서 40 분, 1.5 시간, 3 시간, 24 시간 및 96 시간 동안 인큐베이션하였다. GST-π siRNA 의 양을 ELISA-기반 검정에 의해 측정하였다.
실시예 16: 본 발명의 GST-π siRNA 는 패신저 가닥에 의한 감소한 오프 타겟 효과를 나타내었다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO: 156 및 182) 에 대해서, 도 9 는 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운이, 효과를 나타내지 않는 스크램블드 서열을 갖는 대조군과 비교하여 대략 지수적이었음을 보여준다. 이 siRNA 의 IC50 은 5 pM 에서 측정되었다. 도 10 은 동일한 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 10 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 에 대한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운은 100 배 초과로 크게 감소하였다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO: 187 및 199), (SEQ ID NO: 189 및 201), 및 (SEQ ID NO: 190 및 202) 에 대해서, 도 11 은 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운이 대략 지수적이었음을 보여준다. 이들 siRNA 의 IC50 은 각각 6, 7 및 5 pM 에서 측정되었다. 도 12 에서 나타낸 바와 같이, 이들 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운은 적어도 10 배로 상당히 감소하였다. 이들 GST-π siRNA 모두는 듀플렉스 부위의 시드 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 가졌으며, 듀플렉스 부위에서 다른 변형은 갖지 않았다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO: 217 및 232) 에 대해서, 도 13 은 이러한 고도 활성 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운이 대략 지수적이었음을 보여준다. 이 siRNA 의 IC50 은 11 pM 에서 측정되었다. 도 14 에서 나타낸 바와 같이, 이 GST-π siRNA 의 패신저 가닥의 시험관내 녹다운은 100 배 초과로 상당히 감소하였다. 이 GST-π siRNA 는 듀플렉스 부위의 시드 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 가졌으며, 듀플렉스 부위에서 다른 변형은 갖지 않았다.
오프-타겟 효과를, 레닐라 루시퍼라아제 (Renilla luciferase) 유전자를 인코딩하는 발현 리포터 플라스미드 psiCHECK-2 를 사용하여 측정하였다 (이중-루시퍼라아제 리포터 검정 시스템, Promega, 카탈로그 번호: E1960). siRNA 농도는 통상 50 pM 이었다. 프로토콜: 제 1 일, HeLa 세포를 5 내지 7.5 x 103/100ul/웰에서 시딩하였다. 제 2 일, 세포 밀집도 약 80% 로 동시-트랜스펙션하였다. 제 3 일, 루시퍼라아제 활성 측정을 위해 세포를 수확하였다. 루시퍼라아제 활성을, 제조사 프로토콜에 따라 Promega 루시퍼라아제 검정 시스템 (E4550) 을 사용하여 측정하였다.
psiCHECK-2 벡터는, 레닐라 루시퍼라아제의 리포터 유전자에 융합된 표적 유전자의 발현에 있어서의 변화를 모니터링할 수 있게 하였다. siRNA 구성물을 다중 클로닝 부위에 클로닝하고, 벡터를 HeLa 세포에 siRNA 와 동시 트랜스펙션하였다. 특이적 siRNA 가 표적 mRNA 에 결합하고 RNAi 과정을 개시하는 경우, 융합된 레닐라 루시퍼라아제: 구성물 mRNA 는 절단되고 이후 분해되어, 레닐라 루시퍼라아제 신호를 감소시킬 것이다.
예를 들어, BU2' 구조를 갖는 siRNA 에 대한 플라스미드 삽입물은 하기와 같다:
PsiCHECK-2 (F) 플라스미드 삽입물:
Figure pct00025
PsiCHECK-2 (R) 플라스미드 삽입물:
Figure pct00026
실시예 17: 본 발명의 GST-π siRNA 는, 시드-의존적 비의도된 오프-타겟 유전자 침묵인, 유리하게 감소한 miRNA-유사 오프 타겟 효과를 나타내었다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO: 156 및 182), (SEQ ID NO: 187 및 199), (SEQ ID NO: 189 및 201), (SEQ ID NO: 190 및 202) 및 (SEQ ID NO: 217 및 232) 에 대해서, miRNA 를 모방하는 오프 타겟 활성은 본질적으로 무시할 만한 것으로 발견되었다. 이들 GST-π siRNA 에 대한 시드-의존적 비의도된 오프-타겟 유전자 침묵은 가이드 가닥의 온-타겟 활성보다 적어도 10 배 내지 100 배 더 적었다.
miRNA-관련 오프 타겟 효과를 시험하기 위해, 전체 시드-함유 부위, 안티센스 가닥의 5' 말단의 위치 1-8 에 상보적이나 남아있는 비-시드 부위, 위치 9-21 에는 상보적이지 않은 시드-매칭된 표적 서열의 1 내지 4 반복물을 루시퍼라아제 mRNA 의 3'UTR 에 상응하는 부위에 도입하여, 시드-의존적 비의도된 오프-타겟 효과의 효율을 측정하였다. 시드 부위에서 완전한 매칭을 갖고 비-시드 부위에서 미스매치 (벌지) 를 갖는 miRNA 를 모방하는데 플라스미드 삽입물을 사용하였다.
예를 들어, BU2' 구조를 갖는 siRNA 에 대한 플라스미드 삽입물은 하기와 같다:
PsiCHECK-2 (Fmi1) 플라스미드 삽입물:
Figure pct00027
PsiCHECK-2 (Fmi2) 플라스미드 삽입물:
Figure pct00028
PsiCHECK-2 (Fmi3) 플라스미드 삽입물:
Figure pct00029
PsiCHECK-2 (Fmi4) 플라스미드 삽입물:
Figure pct00030
본원에 기재된 구현예는 제한하는 것이 아니며, 당업자는 개선된 RNAi 활성을 갖는 핵산 분자를 확인하기 위하여 과도한 실험 없이 본원에 기재된 변형의 특이적 조합을 시험할 수 있다는 것을 용이하게 인지할 수 있다.
실시예 18: p21 에 대해 표적화된 본 발명의 siRNA 는 시험관내 유전자 침묵을 위해 활성이라는 것이 발견되었다. 유전자 녹다운을 위한 p21 siRNA 의 용량-의존적 활성은 약 3 피코몰 (pM) 미만, 및 1 pM 만큼 낮은 IC50 을 나타내는 것으로 발견되었다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, siRNA 녹다운 효능을 측정하였다. p21 mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운이, 표 21 에서 나타낸 바와 같이, 표 7 의 siRNA 로 관찰되었다.
표 21: A549 세포주에서 p21 mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운
Figure pct00031
표 21 에서 나타낸 바와 같이, 표 7 의 p21 siRNA 의 활성은 0.3-10 pM 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 적합한 것이다.
실시예 19: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치한 데옥시뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 p21 siRNA 의 구조는 예기치 않고 유리하게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여, 구조 1735' 기반의 p21 siRNA (SEQ ID NO: 341 및 355) 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. p21 mRNA 의 용량 의존적 녹다운이, 표 22 에서 나타낸 바와 같이, 구조 1735' 기반의 p21 siRNA 로 관찰되었다.
표 22: 구조 1735' 기반의 p21 siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 p21 mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00032
표 22 에서 나타낸 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 1735' 기반의 p21 siRNA 의 활성은 놀랍고도 예기치 않게, 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 p21 siRNA 와 비교하여, 최대 300 배로 증가하였다.
이들 데이터는, 안티센스 가닥의 시드 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 가지는 p21 siRNA 가 듀플렉스 부위에서 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 p21 siRNA 와 비교하여, 놀랍게도 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 나타낸다.
안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 p21 siRNA 에 대한 표 22 에서 나타낸 활성은 0.001 내지 0.1 pM 범위에 있었는데, 이것은 생체내 사용될 약물 제제로서를 비롯하여 많은 용도에 예외적으로 적합한 것이다.
실시예 20: 본 발명의 p21 siRNA 는 생체내 암 이종이식 종양의 큰 감소를 나타낼 수 있다. p21 siRNA 는 리포좀 제형으로 암 이종이식 종양에 투여한 경우 생체내 유전자 녹다운 효력을 제공할 수 있다.
도 15 는 p21 siRNA (SEQ ID NO: 341 및 355, 여기서 N = U 임) 에 대한 종양 억제 효능을 나타낸다. 암 이종이식 모델을 0.75 mg/kg 의, p21 에 대해 표적화된 siRNA 에서의 상대적 저용량으로 이용하였다.
p21 siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의하고 예기치 않게 유리한 종양 억제 효능을 나타내었다. 30 일 후, p21 siRNA 는 현저하게 유리한 종양 억제 효능을 나타내었는데, 대조군과 비교하여 종양 부피가 2 배 초과로 감소하였다.
p21 siRNA 를 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 10 mL/kg 의 리포좀 제형의 4 회 주사 (제 1, 8, 15 및 22 일) 로 0.75 mg/kg 의 투약량으로 투여하였다.
암 이종이식 모델에 대해서, A549 세포주를 ATCC 로부터 입수하였다. 세포를 10% 우태 혈청 및 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 배양 배지에서 유지시켰다. 세포를 접종 전 48 시간 분열시켜, 세포가 수확시 대수 증식 성장에 있게 하였다. 세포를 트립신-EDTA 로 가볍게 트립신화하고, 조직 배양물로부터 수확하였다. 생존 세포의 수를 트립판 블루의 존재 하에 혈구계에서 계수 및 측정하였다 (생존 세포만이 계수됨). 세포를 무혈청 배지에서 5 x 107/ml 의 농도로 재현탁하였다. 그런 다음, 주사를 위해, 세포 현탁액을 얼음 해동된 BD 매트리겔과 1:1 비로 잘 혼합하였다.
마우스는 군 당 7-8 마리 마우스의, 면역 저하된, 6-8 주령 Charles River 실험실 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스였다.
종양 모델 준비를 위해, 25 G 바늘 및 주사기를 사용하여, 마우스 당 하나의 접종물로, 각각의 마우스를 2.5 x 106 의 A549 세포의 0.1 ml 접종물로 우측 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스는 접종을 위해 마취되지는 않았다.
종양 부피 측정 및 무작위화를 위해, 종양 크기를 0.1 mm 에 가깝게 측정하였다. 종양 부피를 하기 식을 사용하여 계산하였다: 종양 부피 = 길이 x 폭2/2. 확립된 종양이 대략 120 - 175 mm3 에 도달하고나면, 평균 종양 부피는 약 150 mm3 이었고, 마우스를 다양한 비히클 대조군 및 처리군에 배정하여, 처리군에서의 평균 종양 부피가 비히클 대조군에서의 평균 종양 부피의 10% 내에 있도록, 이상적으로, 종양 부피의 CV% 가 25% 미만이도록 하였다. 동일한 날에, 시험 물품 및 대조 비히클을 투약 레지멘에 따라 투여하였다. 종양 부피를, 연구 종결일을 포함하여, 제 1 주에 대해서는 3 회, 나머지 주에 대해서는 2 회 모니터링하였다.
투여량 투여에 대해서는, 투약일에, 시험 물품을 -80℃ 냉동고에서 꺼내고 얼음 상에서 해동하였다. 주사기에 적용하기 전, 제형을 함유하는 병을 수회 손으로 리버팅하였다. 모든 시험 물품을 0.75 mg/kg 에서, IV 로 투약하였다.
체중에 대해서는, 마우스를 0.1 g 에 가깝게 칭량하였다. 체중을 첫 번째 용량에 대한 투약 후 7 일 내에 모니터링하고 매일 기록하였다. 체중을 연구 종결일을 포함하여, 나머지 주에 대해서는 몇주 동안 2 회 모니터링하고 기록하였다.
종양 수집을 위해, 제 1 투약 후 28 일에, 종양 부피를 측정하고, 종양을 중량 측정을 위해 해부하고, PD 바이오마커 연구를 위해 저장하였다. 종양 중량을 기록하였다.
본원에 기재된 구현예는 제한하는 것이 아니며, 당업자는 개선된 RNAi 활성을 갖는 핵산 분자를 확인하기 위하여 과도한 실험 없이 본원에 기재된 변형의 특이적 조합을 시험할 수 있다는 것을 용이하게 인지할 수 있다.
실시예 21: MCL1 에 대해 표적화된 본 발명의 siRNA 를 제조하였으며 시험관내 유전자 침묵을 위해 활성이라는 것이 발견되었다. 유전자 녹다운을 위한 MCL1 siRNA 의 용량-의존적 활성은 약 100 피코몰 (pM) 미만의 IC50 을 나타내는 것으로 발견되었다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 siRNA 녹다운 효능을 측정하였다. MCL1 mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운이, 표 11 의 siRNA 로 관찰되었다.
실시예 22: ARAF 에 대해 표적화된 본 발명의 siRNA 를 제조하였으며 시험관내 유전자 침묵을 위해 활성이라는 것이 발견되었다. 유전자 녹다운을 위한 ARAF siRNA 의 용량-의존적 활성은 약 100 피코몰 (pM) 미만의 IC50 을 나타내는 것으로 발견되었다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 siRNA 녹다운 효능을 측정하였다. ARAF mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운이, 표 12 의 siRNA 로 관찰되었다.
본원에 구체적으로 언급된 모든 공개물, 특허 및 문헌은 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
본 발명에서는, 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 물질 및 시약이, 이들이 가변적일 수 있으므로, 여기에 제한되지 않는다는 것이 이해된다. 본원에 사용된 용어가 특정 구현예만을 기술하고자 하는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 또한 이해될 것이다. 당업자에게, 상세한 설명의 범주 및 취지에 벗어남이 없이 다양한 치환 및 변형이 본원에 개시된 상세한 설명에 이루어질 수 있으며, 이들 구현예가 본 상세한 설명 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 있다는 것이 용이하게 명백할 것이다.
문맥에서 다르게 명백히 기재하지 않는 한, 본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태에는 복수의 대상이 포함된다는 것에 주의해야 한다. 또한, 용어 "한", "하나 이상" 및 "적어도 하나" 는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "포함하다", "포함하는", "함유하는", "비롯하는" 및 "갖는" 은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 확장적이고 비제한적으로 판독되어야 한다는 것이 또한 주목될 것이다.
본원에서 값의 범위의 인용은, 본원에서 다르게 나타내지 않는 한, 단지 범위 내에 포함되는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 속기법으로서 역할하는 것으로 의도되며, 각각의 별개의 값은 이것이 본원에 개별적으로 인용되는 것처럼 명세서에 포함된다. 마쿠쉬 (Markush) 군에 대해서는, 당업자는 이러한 설명이 개별 구성원 뿐만 아니라 마쿠쉬 군의 일원의 하위군을 포함한다는 것을 인지할 것이다.
추가 상술 없이, 당업자가, 상기 설명을 기반으로 하여, 본 발명을 그의 최대 범위로 이용할 수 있다고 여겨진다. 따라서 이어지는 특이적 구현예는 단지 설명적인 것으로 해석되며, 어떤 식으로도 개시물의 나머지를 제한하지 않는다.
본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 결합될 수 있다. 본원에서 개시된 각각의 특징은 동일, 동등, 또는 유사 목적을 제공하는 대안적 특징에 의해 대체될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> NITTO DENKO CORPORATION <120> SIRNA STRUCTURES FOR HIGH ACTIVITY AND REDUCED OFF TARGET <130> ND6122770WO <140> <141> <150> 62/266,675 <151> 2015-12-13 <160> 456 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ucccagaacc agggaggcat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2 cuuuugagac ccugcuguct t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 3 cugucccaga accagggagt t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 16 gagcuggaag gaggaggugt t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 17 ugcuguccca gaaccagggt t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 18 cccagaacca gggaggcaat t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ccagaaccag ggaggcaagt t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 20 uuugagaccc ugcuguccct t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 21 gacccugcug ucccagaact t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 22 gaucagggcc agagcuggat t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 23 agccuuuuga gacccugcut t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 24 gccuuuugag acccugcugt t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ccuuuugaga cccugcugut t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 26 cgccuuuuga gacccugcat t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ccuacaccgu ggucuauuut t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ugugggagac cagaucucct t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gcgggaggca gaguuugcct t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 30 ccuuucucca ggaccaauat t 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 31 acccugcugu cccagaacct t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ggucuauuuc ccaguucgat t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 33 cccuggugga cauggugaat t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 34 acaucucccu caucuacact t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 35 gcaaggauga cuaugugaat t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 36 ccuucgcuga cuacaaccut t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 37 cuggcagauc agggccagat t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gacggagacc ucacccugut t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 39 cgggcaagga ugacuaugut t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 40 cuuuugagac ccugcuguat t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 41 gagcuggaag gaggagguat t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 42 acccugcugu cccagaacat t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 43 ugcuguccca gaaccaggat t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 44 agccuuuuga gacccugcat t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 49 ggaugacuau gugaaggcat t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 50 gaugacuaug ugaaggcact t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 51 cucccucauc uacaccaact t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 52 gaagccuuuu gagacccugt t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 53 ucucccucau cuacaccaat t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 54 ccucaucuac accaacuaut t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 55 cccucaucua caccaacuat t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 56 caacugaagc cuuuugagat t 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 57 aacugaagcc uuuugagact t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 58 cugaagccuu uugagaccct t 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 59 ucccucaucu acaccaacut t 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 60 gcucccucau cuacaccaat t 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 61 gaagccuuuu gagacccuat t 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 62 acugaagccu uuugagacat t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 63 cucccucauc uacaccaaat t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 64 ccucaucuac accaacuaat t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 65 accaauaaaa uuucuaagat t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 66 ugccucccug guucugggac a 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 67 gacagcaggg ucucaaaagg c 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 68 cucccugguu cugggacagc a 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 69 ccucccuggu ucugggacag c 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 70 gcagggucuc aaaaggcuuc a 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 71 ugggacagca gggucucaaa a 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 72 ggacagcagg gucucaaaag g 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 73 ucugggacag cagggucuca a 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 74 accaccuccu ccuuccagct c 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 75 caccaccucc uccuuccagc t 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 76 cuuccagcuc uggcccugat c 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 77 cugggacagc agggucucaa a 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 78 uccuuccagc ucuggcccug a 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 79 ccaccuccuc cuuccagcuc t 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 80 uucugggaca gcagggucuc a 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 81 caccuccucc uuccagcuct g 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 82 cccugguucu gggacagcag g 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 83 uugccucccu gguucuggga c 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 84 cuugccuccc ugguucuggg a 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 85 gggacagcag ggucucaaaa g 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 86 guucugggac agcaggguct c 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 87 uccagcucug gcccugauct g 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 88 agcagggucu caaaaggcut c 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 89 cagcaggguc ucaaaaggct t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 90 acagcagggu cucaaaaggc t 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 91 ugcagggucu caaaaggcgt c 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 92 aaauagacca cgguguaggg c 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 93 ggagaucugg ucucccacaa t 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 94 ggcaaacucu gccucccgct c 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 95 uauugguccu ggagaaagga a 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 96 gguucuggga cagcaggguc t 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 97 ucgaacuggg aaauagacca c 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 98 uucaccaugu ccaccagggc t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 99 guguagauga gggagaugua t 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 100 uucacauagu cauccuugcc c 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 101 agguuguagu cagcgaagga g 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 102 ucuggcccug aucugccagc a 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 103 acagggugag gucuccgucc t 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 104 acauagucau ccuugcccgc c 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 105 uacagcaggg ucucaaaagg c 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 106 uaccuccucc uuccagcuct g 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 107 uguucuggga cagcaggguc t 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 108 uccugguucu gggacagcag g 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 109 ugcagggucu caaaaggcut c 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 110 ucagcagggu cucaaaaggc t 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 111 agggucucaa aaggcuucag t 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 112 ggucucaaaa ggcuucagut g 21 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 113 gccuucacau agucauccut g 21 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 126 uagggucuca aaaggcuuca g 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 127 ugucucaaaa ggcuucagut g 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 128 uuugguguag augagggaga t 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 129 uuaguuggug uagaugaggg a 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 130 ucuuagaaau uuuauugguc c 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> a, c, t, g, u, unknown or other <400> 131 gaagccuuuu gagacccuan n 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 132 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 133 gaagccuuuu gagacccuau u 21 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3-C3 spacer <400> 412 aggaaguuga ucuuggagu 19 <210> 413 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 5'-Inverted 1,2-dideoxy-D-Ribose <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3 spacer <400> 413 uccugagaca cauggguga 19 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 5'-Inverted 1,2-dideoxy-D-Ribose <220> <221> modified_base <222> (2)..(3) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(8) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(15) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3-spacer <400> 417 cuuacgcuga guacuucgu 19 <210> 418 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3-C3-spacer <400> 418 acgaaguacu cagcguaag 19 <210> 419 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 419 gccuuccaag gauggguuug u 21 <210> 420 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 420 ggaguucuuc cauguagagg a 21 <210> 421 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 421 ccauguagag gaccuagaag g 21 <210> 422 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 422 gccuuccaag gauggguuug u 21 <210> 423 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 423 gccuuccaag gauggguuug u 21 <210> 424 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 424 gccuuccaag gauggguuug u 21 <210> 425 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 425 gccuuccaag gauggguuug u 21 <210> 426 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 426 gccuuccaag gauggguuug u 21 <210> 427 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 427 aaacccaucc uuggaaggcc g 21 <210> 428 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 428 cucuacaugg aagaacucca c 21 <210> 429 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 429 uucuaggucc ucuacaugga a 21 <210> 430 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-nucleotide <400> 430 aaacccaucc uuggaaggcc g 21 <210> 431 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 431 aaacccaucc uuggaaggcc g 21 <210> 432 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 432 aaacccaucc uuggaaggcc g 21 <210> 433 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-nucleotide <400> 433 aaacccaucc uuggaaggcc g 21 <210> 434 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-nucleotide <400> 434 aaacccaucc uuggaaggcc g 21 <210> 435 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 435 gcucauuguc gagguccuug a 21 <210> 436 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 436 gccaaaccug uggcuacaag u 21 <210> 437 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 437 ggaagacgcg acaugucaac a 21 <210> 438 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 438 gcucauuguc gagguccuug a 21 <210> 439 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 439 gcucauuguc gagguccuug a 21 <210> 440 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 440 gcucauuguc gagguccuug a 21 <210> 441 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 441 gcucauuguc gagguccuug a 21 <210> 442 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 442 gcucauuguc gagguccuug a 21 <210> 443 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 443 aaggaccucg acaaugagcu c 21 <210> 444 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 444 uuguagccac agguuuggca a 21 <210> 445 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 445 uugacauguc gcgucuuccu g 21 <210> 446 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-nucleotide <400> 446 aaggaccucg acaaugagcu c 21 <210> 447 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 447 aaggaccucg acaaugagcu c 21 <210> 448 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 448 aaggaccucg acaaugagcu c 21 <210> 449 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-nucleotide <400> 449 aaggaccucg acaaugagcu c 21 <210> 450 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-nucleotide <400> 450 aaggaccucg acaaugagcu c 21 <210> 451 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 451 ctcgaggggc aactgaagcc ttttgagacc ctgctgtccc aggcggccgc 50 <210> 452 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 452 ctcgagctgg gacagcaggg tctcaaaagg cttcagttgc ccgcggccgc 50 <210> 453 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 453 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctgtccc aggcggccgc 50 <210> 454 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 454 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctctacg caaaacagac cctgctgtcc 60 caggcggccg c 71 <210> 455 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 455 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctctacg caaaacagac cctgctctac 60 gcaaaacaga ccctgctgtc ccaggcggcc gc 92 <210> 456 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 456 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctctacg caaaacagac cctgctctac 60 gcaaaacaga ccctgctcta cgcaaaacag accctgctgt cccaggcggc cgc 113

Claims (32)

  1. 하기와 같은 핵산 분자:
    a) 분자는 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥을 가짐;
    b) 분자의 각각의 가닥은 15 내지 30 뉴클레오티드 길이임;
    c) 안티센스 가닥의 15 내지 30 뉴클레오티드의 인접 부위는 mRNA 의 서열에 상보적임;
    d) 센스 가닥의 적어도 일부분은 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적이고, 분자는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 부위를 갖고, 여기서 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 3 내지 8 에서의 듀플렉스 부위에서의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 데옥시뉴클레오티드임.
  2. 제 1 항에 있어서, 안티센스 가닥이 복수의 위치에서 데옥시뉴클레오티드를 갖는 핵산 분자로서, 복수의 위치가 하기의 것 중 하나인 핵산 분자:
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 4, 6 및 8;
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 3, 5 및 7;
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 1, 3, 5 및 7;
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 3-8; 및
    안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의, 각각의 위치 5-8.
  3. 제 1 항에 있어서, mRNA 의 발현을 조정하기 위해 활성인 RNAi 분자인 핵산 분자.
  4. 제 1 항에 있어서, 단백질 코딩 유전자, 원종양유전자, 종양유전자, 종양 억제인자 유전자 및 세포 신호전달 유전자에서 선택되는 유전자의 발현을 억제하기 위해 활성인 핵산 분자.
  5. 제 1 항에 있어서, mRNA 가 인간 mRNA 인 핵산 분자.
  6. 제 1 항에 있어서, mRNA 가 SRY, 베타-글로빈, RAS, 세포질 GST, 미토콘드리아 GST, MAPEG GST, GST-π, p16, p21, p53, 혈청 알부민, 유형 VII 콜라겐, 보체 C3, 아포리포단백질 B, 페닐알라닌 히드록실라아제, 인자 VIII, 헌팅틴, RB1 망막모세포종 단백질, CFTR, 티틴, 유트로핀 및 디스트로핀을 포함하는 단백질의 인간 계열의 임의의 구성원 또는 하위-구성원을 발현하는 인간 mRNA 인 핵산 분자.
  7. 제 1 항에 있어서, 100 pM 미만의, mRNA 의 녹다운에 대한 IC50 을 갖는 핵산 분자.
  8. 제 1 항에 있어서, 50 pM 미만의, mRNA 의 녹다운에 대한 IC50 을 갖는 핵산 분자.
  9. 제 1 항에 있어서, 10 pM 미만의, mRNA 의 녹다운에 대한 IC50 을 갖는 핵산 분자.
  10. 제 1 항에 있어서, 핵산 분자의 단일 투여가 mRNA 를 생체내 (in vivo) 적어도 25% 억제하는 핵산 분자.
  11. 제 1 항에 있어서, 핵산 분자의 각각의 가닥이 18 내지 22 뉴클레오티드 길이인 핵산 분자.
  12. 제 1 항에 있어서, 듀플렉스 부위가 19 뉴클레오티드 길이인 핵산 분자.
  13. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 센스 가닥 및 폴리뉴클레오티드 안티센스 가닥이 단일 가닥으로서 연결되고, 루프에 의해 하나의 말단에서 연결된 듀플렉스 부위를 형성하는 핵산 분자.
  14. 제 1 항에 있어서, 평활 말단 (blunt end) 을 가지는 핵산 분자.
  15. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 3' 오버행 (overhang) 을 가지는 핵산 분자.
  16. 제 1 항에 있어서, 듀플렉스 부위에서의 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형되거나 화학적으로 변형되는 핵산 분자.
  17. 제 16 항에 있어서, 변형되거나 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-알킬 치환된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 잠금 (locked) 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합인 핵산 분자.
  18. 제 1 항에 있어서, 안티센스 가닥의 염기 서열이 SEQ ID NO: 157 이고 센스 가닥의 염기 서열이 SEQ ID NO: 131 인 핵산 분자.
  19. 제 1 항에 있어서, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 182 이고 센스 가닥이 SEQ ID NO: 156 인 핵산 분자.
  20. 제 1 항에 있어서, 안티센스 가닥의 염기 서열이 SEQ ID NO: 195 이고 센스 가닥의 염기 서열이 SEQ ID NO: 183 인 핵산 분자.
  21. 제 1 항에 있어서, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 205 이고 센스 가닥이 SEQ ID NO: 193 인 핵산 분자.
  22. 제 1 항에 있어서, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 357 이고 센스 가닥이 SEQ ID NO: 343 인 핵산 분자.
  23. 제 1 항에 있어서, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 356 이고 센스 가닥이 SEQ ID NO: 342 인 핵산 분자.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 담체가 지질 분자 또는 리포좀을 포함하는 약학 조성물.
  26. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 세포.
  27. 유전자 침묵에 의해 그를 필요로 하는 대상체에서의 질환을 예방, 치료 또는 완화시키기 위한 방법으로서, 제 24 항에 따른 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 질환이 악성 종양, 암, 육종 또는 암종인 방법.
  29. 그를 필요로 하는 대상체에서의 질환 또는 병상을 예방, 완화 또는 치료하기 위한, 제 24 항에 따른 약학 조성물의 용도.
  30. 제 24 항에 있어서, 의료 요법에서 사용하기 위한 약학 조성물.
  31. 제 24 항에 있어서, 인간 또는 동물 신체의 치료에서 사용하기 위한 약학 조성물.
  32. 그를 필요로 하는 대상체에서의 질환 또는 병상의 예방, 완화 또는 치료용 약제를 제조 또는 생산하기 위한, 제 24 항에 따른 약학 조성물의 용도.
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