Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR20180073675A - Asct2에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

Asct2에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20180073675A
KR20180073675A KR1020187015380A KR20187015380A KR20180073675A KR 20180073675 A KR20180073675 A KR 20180073675A KR 1020187015380 A KR1020187015380 A KR 1020187015380A KR 20187015380 A KR20187015380 A KR 20187015380A KR 20180073675 A KR20180073675 A KR 20180073675A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
asct2
antigen
seq
binding fragment
Prior art date
Application number
KR1020187015380A
Other languages
English (en)
Inventor
나벤두 포어
마틴 제이 써드 보록
파사 쵸두리
에밀 에프 미켈로티
데이빗 에이 타이스
로버트 이 홀링스워스
치엔 잉 창
Original Assignee
메디뮨 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메디뮨 엘엘씨 filed Critical 메디뮨 엘엘씨
Publication of KR20180073675A publication Critical patent/KR20180073675A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6831—Fungal toxins, e.g. alpha sarcine, mitogillin, zinniol or restrictocin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 개시는 ASCT2 결합 분자, 예컨대, 항-ASCT2 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 양태에서, 이러한 ASCT2 결합 분자들은 세포독성제에 접합된다. 예컨대, ASCT2 항체 약물 접합체(ADC). 일부 양태에서, 이러한 항-ASCT2 항체 및 이의 단편들은 하이브리도마 유래 뮤린 단일클론성 항체 및 이의 인간화 버전일 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 ASCT2 결합 분자들은 ASCT2를 발현하는 세포에 특이적으로 결합하고, 어떤 경우에는 세포 내로 내재화된다. 또한, 본 개시는 ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애, 예컨대, 일부 유형의 암을 진단 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 ASCT2 ADC를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

ASCT2에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
용질 운반체(solute carrier, SLC) 패밀리는 수십 개의 서브 패밀리로 체계화된, 막 수송 단백질을 암호화하는 300종 이상의 유전자를 포함한다. SLC1A 서브 패밀리는 수송 시스템 ASC를 포함하는데, 이것은 척추동물 세포에서 나트륨 의존성 중성 아미노산 수송을 매개한다. 알라닌, 세린 및 시스테인이 이러한 ASC 시스템의 선호 기질이다. 이러한 ASC 시스템의 두 가지 하위 유형인 ASC 운반체 1(ASC1, SLC1A4로도 알려져 있음)과 ASC 운반체 2(ASCT2, SLC1A5로도 알려져 있음)가 확인된 바 있다.
ASCT2는 여덟 개의 막 관통 도메인이 있는, 541개 아미노산의 다중패스 막 단백질이다. ASCT2의 분자량은 다양한 글리코실화 프로파일에 따라 55 내지 75 KD까지 다양하다. L-알라닌, L-세린 및 L-시스테인 수송 외에도, ASCT2는 L-트레오닌과 L-글루타민도 수송한다. 나아가, ASCT2는 D형 유인원 레트로바이러스와 C형 바이러스에 의해 공유되는 세포 표면 수용체로서 작용한다.
ASCT2의 과발현은 결장직장암, 두경부 편평상피세포암종(HNSCC), 전립선암, 폐암, 췌장암 및 혈액암, 예컨대, 골수종 및 림프종을 비롯한 다양한 암에서 보고되었다. 면역조직화학적 분석(IHC)에 의해 평가된 ASCT2의 과발현은 결장직장암, 전립선암, 폐암 및 췌장암을 비롯한 다양한 암에서 불량한 예후를 보인다(K Kaira, et al. (2015) Histopathology; Shimizu, et al. (2014) BJC; D Witte, et al. (2002) Anticancer Research; R Li, et al. (2003) Anticancer Research). ASCT2가 포유동물의 라파마이신 표적(mammalian target of rapamycin: mTOR) 신호전달 경로의 하나의 동인이며, 따라서 종양 성장의 한 추진 요인임이 보고된 바 있다(Nicklin P. et al. (2009) Cell).
항체 약물 접합체(ADC)는 항체의 특이성을 세포독성 소분자 또는 독소의 효능과 결합시켜 약물 관련 독성을 감소시키면서도 더욱 효과적으로 암을 치료하는 전도유망한 새로운 치료적 접근법을 나타낸다. ADC는 세포독소를 포함할 수 있는데, 이러한 세포독소는 링커를 함유하도록 화학적으로 개질된 소분자일 수 있다. 그런 다음, 이러한 링커는 세포독소를 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접합시키는 데 사용된다. ADC가 표적 양성 세포의 항원 표면에 결합하고, 내재화되어 리소좀으로 트래피킹되어, 리소좀에서 (예를 들어, 리소좀에서 발견되는 카텝신 B에 의해) 절단 가능한 링커의 단백질 가수분해 후, 또는 세포독소를 항체에 부착시키는 데 절단 불가능한 링커가 사용되는 경우 단백질 가수분해에 의한 항체 분해를 통해 세포독소가 방출될 때, 세포독성이 유도된다. 그런 다음, 세포독소는 리소좀 안에서 밖으로 나와 시토졸로 이동하며, 시토졸에서 세포독소의 작용 기전에 따라 그 표적과 결합할 수 있다. 일반적으로 이들 세포독소는 세포주기 정지를 유도하며, 이는 나중에 세포자멸사로 이어진다. 영상화제를 함유하는 상응하는 접합체는 생체 내 또는 시험관 내에서 암세포를 검출하는 전도유망한 새로운 방법을 나타내기도 한다.
본 개시는 ASCT2에 특이적으로 결합하는 분자 및 이러한 분자를 사용하는 방법, 예컨대, ASCT2의 검출방법, 세포로의 이종 기원의 작용제의 전달방법, 또는 ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애, 예컨대, 암의 치료방법을 제공한다. 본 개시는 세포독성 약물, 예컨대, 튜불라이신(tubulysin) 유도체 또는 피롤로벤조디아제핀에 접합된 항-ASCT2 항체(항-ASCT2-ADC)를 제공한다. 본 발명의 항체는 ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애, 예컨대, 암의 치료에 유용하다. 예를 들어, 본 발명자들은 항-ASCT2 ADC가 인간 결장직장암 및 두경부암의 이종발생성 마우스 모델에서 종양 퇴화를 유발함을 밝혀냈다.
본 발명의 주요 양태들 일부를 아래에 개괄하였다. 추가적인 양태는 본 개시의 '발명의 상세한 설명', '실시예', '도면' 및 '청구범위' 섹션에 기술하였다. 본 개시의 각 섹션의 기술 내용은 다른 섹션들과 함께 이해되도록 한 것이다. 나아가, 본 개시의 각 섹션에 기술된 다양한 구현예는 여러 가지 다양한 방식으로 조합될 수 있고, 그러한 조합 전부는 본 발명의 범위 내에 해당하도록 의도된 것이다.
본 개시는 ASCT2 결합 분자, 예컨대, 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대, ASCT2와 결합할 수 있는 단일클론성 항체를 제공한다. 일부 양태에서, 이러한 결합 분자는 작용제, 예컨대, 세포독소에 접합된다.
일부 예에서, ASCT2의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편은 17c10 또는 1e8의 중쇄 가변 부위(VH) 및 경쇄 가변 부위(VL)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 ASCT2 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일부 예에서, 17c10의 VH는 서열 번호 1 또는 서열 번호 5를 포함하고, 17c10의 VL은 서열 번호 2 또는 서열 번호 6을 포함한다.
일부 예에서, 1e8의 VH는 서열 번호 3 또는 서열 번호 7을 포함하고, 1e8의 VL은 서열 번호 4 또는 서열 번호 8을 포함한다.
일부 예에서, ASCT2에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 VL을 포함하는데, 이때, 이러한 VL은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택된 기준 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 예에서, ASCT2에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 VH를 포함하는데, 이때, 이러한 VH는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 7로 이루어지는 군으로부터 선택된 기준 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 예에서, ASCT2에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편은 항미생물제, 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 지질, 생물학적 반응 조절제, 약제, 림포카인, 이종 항체 또는 이의 단편, 검출 가능한 표지, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 임의의 상기 작용제 중 둘 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 작용제에 접합된다.
일부 예에서, ASCT2에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독소에 접합된다. 특정 구현예에서, 이러한 세포독소는 AZ1508, SG3249 및 SG3315로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 이러한 결합 분자 또는 이의 단편은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 예에서, ASCT2에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하는데, 이때, 이러한 VH와 VL은 각각 서열 번호 1과 서열 번호 2; 서열 번호 3과 서열 번호 4; 서열 번호 5와 서열 번호 6; 및 서열 번호 7과 서열 번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택된 기준 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서, 이러한 VH는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 VL은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서, 이러한 VH는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 VL은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 불변 부위 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 예에서, 이러한 중쇄 불변 부위 또는 이의 단편은 IgG 불변 부위이다. 일부 예에서, 이러한 IgG 불변 부위는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서, 이러한 IgG 불변 부위는 인간 IgG1 불변 도메인이다.
일부 예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 카파 불변 부위 및 인간 람다 불변 부위로 이루어지는 군으로부터 선택된 경쇄 불변 부위를 포함한다.
일부 예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일클론성 항체, 다클론성 항체, 재조합 항체, 다중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 예에서, 이러한 항원-결합 단편은 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv 및 sc(Fv)2이다.
일부 예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 ASCT2 및 시노몰구스 (시노) 원숭이 ASCT2에 결합할 수 있다.
일부 예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 ASCT1에 특이적으로 결합하지 않는다.
일부 예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항미생물제, 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 지질, 생물학적 반응조절제, 약제, 림포카인, 이종 항체 또는 이의 단편, 검출 가능한 표지, PEG 및 임의의 상기 작용제 중 둘 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 작용제에 접합된다.
일부 예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독소에 접합된다. 특정 구현예에서, 이러한 세포독소는 AZ1508, SG3249 및 SG3315로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 본 발명은 본 설명에 기술된 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 조합물을 제공한다. 일부 예에서, 본 발명은 본 설명에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 조합물을 제공한다.
일부 예에서, 본 발명은 본 설명에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 예에서, VH를 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 VL을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 벡터에 있다. 일부 예에서, VH를 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 VL을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 상이한 벡터에 있다.
일부 예에서, 본 발명은 (i) 본 설명에 기술된 결합 분자 또는 이의 단편 및 (ii) 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 예에서, 본 발명은 (i) 본 설명에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 (ii) 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 예에서, 본 발명은 (i) 본 설명에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 및 (ii) 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 예에서, 본 발명은 (i) 본 설명에 기술된 벡터 및 (ii) 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 이러한 담체는 약학적으로 허용 가능한 담체이다.
일부 예에서, 본 발명은 본 설명에 기술된 폴리뉴클레오티드, 본 설명에 기술된 벡터, 또는 본 설명에 기술된 조성물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 예에서, 본 발명은 (a) 본 설명에 기술된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 본 설명에 기술된 결합 분자 또는 단편을 분리하는 단계를 포함하는, 결합 분자 또는 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 본 발명은 (a) 본 설명에 기술된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 본 설명에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 예에서, 본 발명은 본 설명에 기술된 결합 분자 또는 이의 단편, 또는 본 설명에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 진단 시약 또는 키트를 제공한다.
일부 예에서, ASCT2 발현 세포에 작용제를 전달하는 방법은 이러한 세포를, 본 설명에 기술된 작용제에 접합된 결합 분자 또는 단편, 또는 본 설명에 기술된 작용제에 접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 이때, 이러한 작용제는 세포에 의해 내재화된다. 일부 예에서, 이러한 작용제는 항미생물제, 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 지질, 생물학적 반응 조절제, 약제, 림포카인, 이종 항체 또는 이의 단편, 검출 가능한 표지, PEG 및 상기 작용제 중 둘 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 예에서, 이러한 작용제는 세포독소일 수 있다.
일부 예에서, ASCT2 발현 세포에서 사망을 유도하는 방법은 이러한 세포를, 본 설명에 기술된 세포독소에 접합된 결합 분자 또는 단편, 또는 본 설명에 기술된 세포독소에 접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 이때, 이러한 세포독소는 세포에 의해 내재화된다. 바람직한 일 구현예에서, 이러한 세포독소는 AZ1508, SG3249 및 SG3315로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 대상체에서 ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애, 예컨대, 암을 치료하는 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에 유효량의, 본 설명에 기술된 결합 분자 또는 단편, 또는 본 설명에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 본 설명에 기술된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 예에서, ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애, 예컨대, 암을 치료하는 방법은 고형 종양으로부터 혈액 종양에 걸친 광범위한 암을 포함한다. 치료방법의 이러한 광범위한 효과는 일반적이라기보다는 오히려 예상 밖이다. 고형 종양과 혈액 종양에 걸쳐 증명된 광범위한 효과 이외에도, 본 설명에 기술된 발명은 암 줄기세포(cancer stem cell, CSC)의 존재를 결정하는 방법 및 CSC를 수반하는 치료방법에 사용될 수도 있는데, 이는 본 설명에 기술된 발명의 용도의 폭과 예상치 못한 효과를 추가적으로 뒷받침한다.
일부 예에서, 이러한 암은 결장직장암, HNSCC, 전립선암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 자궁내막암 및 혈액암(급성 골수성 백혈병(AML), 다발성 골수종(MM), 광범위 큰 B세포 림프종(DLBCL))으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또한, 방법은 CSC를 표적화하는 단계를 포함하는 치료를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 대상체는 인간 대상체이다.
일부 예에서, 샘플의 ASCT2 발현 수준을 검출하는 방법은 (a) 상기 샘플을 본 설명에 기술된 결합 분자 또는 단편, 또는 본 설명에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 본 설명에 기술된 조성물과 접촉시키는 단계, 및 (b) 이러한 결합 분자 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의, 상기 샘플 중의 ASCT2에의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 이러한 샘플은 세포 배양물이다. 일부 예에서, 이러한 샘플은 단리된 조직이다. 일부 예에서, 이러한 샘플은 대상체, 바람직하게는 인간 대상체로부터 유래된 것이다.
도 1a는 건강한 샘플의 골수와 비교하여 AML 및 MM 샘플의 골수 흡인물에서의 높은 ASCT2 발현을 증명하는 유세포 분석 정량화를 보여준다.
도 1b는 백혈병 줄기세포 모집단(LSC)을 정의하는 보고된 마커인 CD34+/CD38+ 모집단에서의 높은 ASCT2 발현을 보여준다. 추가적으로 ASCT2의 발현을 CD34+CD38-, CD34+CD38+ 및 CD34-CD38+ 모집단과 같은 모든 다른 하위 유형에서 평가하였다.
도 1c는 MM 샘플의 형질 세포(PC; CD138+/CD19-)와 줄기세포(SC; CD138-/CD19+)에서의 ASCT2 발현을 보여준다.
도 1d는 췌장 CSC에 대한 보고된 마커인 EpCAM+/CD24+/CD44+ 세포 모집단에서 평가한 ASCT2 발현을 보여준다. 유세포 분석은 췌장 종양에서 CSC의 높은 ASCT2 발현을 시사한다.
도 1e는 생체 내 ASCT2-PBD ADC(항체 17c10이 SG3249에 접합된 것임) 치료 후 췌장 종양의 CSC(EpCAM+/CD24+/CD44+) 모집단 제거를 보여준다.
도 2는 인간 ASCT2를 발현하는 플라스미드로 형질감염시킨 293F 세포에 대한 정제된 인간 항-ASCT2 IgG 1e8, 3f7, 5a2, 9b3, 10c3, 16b8, 17c10 및 17a10의 결합 활성의 변화 배수를 도시한 그래프를 보여준다.
도 3a는 음성 대조군으로 처리(미처리); 1차 항-ASCT2 항체 1e8과 17c10 처리; 사포린에 접합된 항-ASCT2 항체 처리; 또는 사포린에 연결된 대조 항체 처리(hIgG-사포린)가 이루어진, ASCT2를 발현하는 293F 세포의 미처리 대조군 세포의 생존능에 대한 상대적인 생존능을 나타내는 막대 그래프를 보여준다.
도 3b는 Sw48 세포에서 튜불라이신 AZ1508에 고전적으로 접합시킨 항-ASCT2 1E8, 항-ASCT2 17C10 및 이소형 대조군 R347의 세포독성을 나타내는 그래프를 보여준다.
도 4는 유세포 분석법으로 평가한, WiDr 세포 또는 ASCT2 발현의 shRNA 넉다운 WiDr 세포에 대한, 항-ASCT2 항체 17c10 및 1e8의 결합을 도시한 막대 그래프를 보여준다.
도 5a는 항-ASCT2 항체 17c10와 이소형 대조군의 내재화 동역학을 보여준다.
도 5b는 세포독성 살해로 측정한, ASCT2-ADC(AZ1508에 접합된 항체 17c10)의 내재화 동역학을 보여준다. 세포에 각 기간 동안 ASCT2-ADC(17c10-AZ1508)를 펄스시켰다. 그 후, ADC를 함유하는 배지를 신선한 배지로 교체하고, 4일 동안 추가로 배양하였다. 세포 생존능을 CTG 키트를 이용하여 측정하였다. 용량 반응 곡선을 미처리 대조군의 백분율로서 나타냈다.
도 6a 내지 도 6h는 ASCT2 발현 세포주에 대한 항-ASCT2 항체 17c10과 1e8, 이소형 대조군 R347의 결합으로부터 나온 유세포 분석 곡선을 보여준다. 도 6a, 인간 암 세포주 Cal27; 도 6b, 인간 암 세포주 FaDu; 도 6c 인간 암 세포주 SSC15; 도 6d 인간 암 세포주 WiDr; 도 6e 인간 ASCT2를 안정적으로 발현하는 CHOK1 세포; 도 6f 시노 ASCT2를 안정적으로 발현하는 CHOK1 세포; 도 6g 시노 암 세포주 CynoMK1; 및 도 6h 모의 형질감염시킨 CHOK1 세포.
도 7a는 항-ASCT2 항체 17c10의 SKMEL-2 세포에 대한 결합은 ASCT1 shRNA에 의해 바뀌지 않지만, 이러한 결합은 ASCT2 특이적 shRNA 넉다운 후에 크게 감소되었음을 보여준다.
도 7b는 항-ASCT2 항체 ADC(AZ1508에 접합된 항체 17c10)의 세포독성 살해가 ASCT1 shRNA 넉다운 후에 영향받지 않았으나, ASCT2 shRNA 침묵화 후에는 세포독성 살해의 상당한 감소가 관찰되었음을 보여준다. 모든 shRNA 넉다운 군으로부터의 데이터는 미처리 대조군에 대해 정규화하였다.
도 8a와 도 8b는 인간 또는 시노 ASCT2 단백질 또는 관련 없는 수용체를 발현하는 안정적인 CHO-K1 세포주에 대한 튜불라이신 1508에 접합된 항-ASCT2 항체 17c10(도 8a)과 1e8(도 8b)의 세포독성 효과를 보여준다.
도 9a 내지 도 9d는 인간 ASCT2를 발현하는 안정적인 CHO-K1 세포주(도 9a); 시아노 ASCT2를 발현하는 안정적인 CHO-K1 세포주(도 9b); ASCT2를 발현하는 결장직장암 세포 WiDr(도 9c); 및 모의 형질감염시킨 대조군 세포(도 9d)에 대한 17c10 모 항체, 17c10 생식세포화된 항체 및 R347 이소형 대조 항체의 결합을 나타내는 유세포 분석 곡선을 보여준다.
도 10a 내지 도 10f는 췌장암 세포(도 10a), 결장암 세포(도 10b), 폐암 세포(도 10c), HNSCC 암세포(도 10d), 전립선암 세포(도 10e) 및 ASCT2 비 발현 세포주(도 10f)에 대한 튜불라이신 AZ1508에 접합된 항-ASCT2 항체 17c10 및 튜불라이신 AZ1508에 접합된 R347 이소형 대조 항체 처리 암 세포주의 미처리 대조군 세포의 생존능에 대해 정규화한 상대적인 생존능(%)을 보여준다.
도 11a는 SG3249에 접합된 항-ASCT2 항체 17c10으로 처리한 세포의 SG3249에 접합된 대조 항체로 처리한 세포의 생존능에 대해 정규화한 상대적인 생존능을 보여준다.
도 11b는 SG3315에 접합된 항-ASCT2 항체 17c10으로 처리한 세포의 SG3315에 접합된 대조 항체로 처리한 세포의 생존능에 대해 정규화한 상대적인 생존능을 보여준다.
도 12a, 도 12b 및 도 12c는 튜불라이신 또는 PBD에 접합된 항-ASCT2 항체 17c10로 처리한 후의 WiDr 결장직장암 또는 원발성 췌장암 이종이식 모델에서의 종양 부피의 시간 경과를 보여준다. 도 12a, 17c10 항체는 튜불라이신 1508에 접합된다; 도 12b, 항-ASCT2 항체 17c10은 SG 3315에 접합된다; 도 12c, 항-ASCT2 항체 17c10은 SG 3249에 접합된다.
도 13a는 파종성 TF1 알파 AML 마우스 모델에서 ASCT2-PBD ADC(항체 17c10이 SG3249에 접합됨)의 항 종양 효능을 보여준다. 이러한 ADC와 이소형 대조군을 Q1Wx4 스케줄로 투여하였다. 이환율과 사망률을 매일 모니터링하였다. ADC의 모든 용량 수준(0.05, 0.1, 0.25 및 0.5 mg/kg)이 미처리 대조군과 비교하여 생존을 상당히 개선하였다. 데이터를 각 군 내의 개별적인 동물들의 운명을 보여주는 카플란-마이어 생존 곡선으로 나타냈다.
도 13b는 파종성 MM.1S MM 마우스 모델에서 ASCT2-PBD ADC(항체 17c10이 SG3249에 접합됨)의 항 종양 효능을 보여준다. 도 13a에 기술된 바와 같이 마우스를 ADC 또는 이소형 대조군으로 처리하였다. 이환율과 사망률을 매일 모니터링하였다. ADC의 두 용량 수준(0.1 및 0.4 mg/kg)이 미처리 대조군(55.5일)과 비교하여 생존을 상당히 개선하였다(각각 117일과 123.5일). 데이터를 각 군 내의 개별적인 동물들의 운명을 보여주는 카플란-마이어 생존 곡선으로 나타냈다.
본 발명은 ASCT2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, 이러한 항체, 또는 항원-결합 단편은 작용제, 바람직하게는 세포독소에 접합된다. 이러한 항체 및 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 이러한 항체를 발현하는 숙주 세포가 포함된다. 이러한 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물 및 이러한 항-ASCT2 항체 및 항원-결합 단편을 제조하는 방법 또한 제공된다. 진단 용도에 있어서, 또는 ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애, 예컨대, 암을 치료하는 방법에 있어서와 같이, 신규한 항-ASCT2 항체를 사용하는 방법이 추가적으로 제공된다.
본 발명이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 먼저 특정 용어를 정의한다. 추가적인 정의를 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재하였다.
I. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 용어 "a" (또는 "an")뿐만 아니라, 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 설명에서 서로 바꾸어 사용될 수 있다.
나아가, "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2종의 명시된 특징 또는 성분 각각의 구체적인 개시내용으로 받아들여진다. 따라서, "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 A 및 B, A 또는 B, A(단독) 및 B(단독)를 포함하도록 의도한 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 B; A 또는 C; B 또는 C; A 및 B; A 및 C; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)를 포함하도록 의도한 것이다.
표현 "포함하는"과 함께 구현예를 기술한 모든 경우에, "로 이루어지는(consisting of)" 및/또는 "로 필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)"의 용어로 기술된 다른 유사한 구현예가 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 설명에 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 관련된 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, The Dictionary of Cell and Molecular Biology (5th ed. J.M. Lackie ed., 2013), the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (2d ed. R. Cammack et al. eds., 2008) 및 The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, P-S. Juo, (2d ed. 2002)는 본 설명에 사용된 일부 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공할 수 있다.
단위, 접두어 및 기호는 시스템 인터내셔날 드 유니테(Systeme International de Unites; SI)가 용인한 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 한정하는 숫자들을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 표기된다. 본 설명에 제공된 표제는 본 발명의 다양한 양태 또는 구현예의 제한이 아니며, 이는 전체로서 본 명세서를 참조함으로써 이루어질 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 본 명세서를 전체적으로 참조하여 더욱 완전하게 정의된다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명체계 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)가 권고한 통상적으로 공지된 3문자 기호 또는 1문자 기호에 의해 본 설명에 지칭된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 통상적으로 용인된 단일 문자 코드로 지칭된다.
용어 "ASCT2"는 시스템 ASC 아미노산 운반체 2 단백질 및/또는 이의 활성 단편을 지칭한다. ASCT2는 글루타민, 알라닌, 및 세린, 시스테인, 및 트레오닌을 포함하는 작은 중성 아미노산의 운반을 Na+ 의존적인 방식으로 매개하는 막 관통 단백질이다. ASCT2의 RNA, DNA 및 아미노산 서열은 당업자에게 공지되어 있으며, 여러 데이터베이스, 예를 들어, 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. NCBI에서 발견된 이들 서열의 예로 유전자은행 등록번호(GenBank Accession Number) NM_005628 및 NP_005619를 갖는 인간 ASCT2 서열; 유전자은행 등록번호 NM_001284054 및 NP-001270983을 갖는 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) ASCT2 서열이 있다.
용어 "억제하다", "차단하다", 및 "저해하다"는 본 설명에서 서로 바꿔 사용되며, 활성의 완전 차단을 포함하는, 생물학적 활성의 임의의 통계적으로 유의한 감소를 지칭한다. 예를 들어, "억제"는 생물학적 활성 또는 과정에서의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 감소를 지칭할 수 있다.
용어 "항체" 또는 "면역 글로불린"은 본 설명에서 상호교환적으로 사용된다. 전형적인 항체는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 무거운(H) 사슬 및 두 개의 가벼운(L) 사슬을 포함한다. 각각의 중쇄는 (본 설명에서 VH 로 축약된) 중쇄 가변 부위와 중쇄 불변 부위로 이루어진다. 이러한 중쇄 불변 부위는 세 개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 (본 설명에서 VL로 축약된) 경쇄 가변 부위와 경쇄 불변 부위로 이루어진다. 이러한 경쇄 불변 부위는 하나의 도메인 Cl로 이루어진다. VH 및 VL 부위는 기본틀 부위(FW)로 지칭되는 보다 보존된 부위들이 사이에 개재되어 있는 상보성 결정 부위(CDR)라 지칭되는 고변이성 부위로 추가적으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FW로 구성되고, 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 다음의 순서로 배열된다: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. 중쇄 및 경쇄의 가변 부위는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 이러한 항체들의 불변 부위는, 면역계의 다양한 세포들(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직들 또는 인자들에 대한 면역 글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 본 개시의 예시적 항체에는 하이브리도마 제조 뮤린 단일클론성 항체 17c10과 1e8, 인간화 항체, 친화도 최적화 항체, 생식세포화된 항체, 및/또는 이들 항체의 다른 버전, 및 혈청 반감기 최적화 항-ASCT2 YTE 항체(예컨대, K44VHa-N56Q, K44VHa6-N56Q, 또는 K2Ha-N56Q)가 포함된다.
용어 "생식세포화(germlining)"는 항체 내 특정 위치의 아미노산들이 생식세포의 아미노산들로 다시 돌연변이됨을 의미한다.
용어 "항체"는 면역 글로불린 분자의 가변 부위 내의 적어도 1개의 항원 인식 자리를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 전술한 것들의 조합을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 면역 글로불린 분자를 지칭할 수 있다. 본 설명에 사용된 용어 "항체"는 온전한 다클론성 항체, 온전한 단일클론성 항체, 항체 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv(scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예컨대 적어도 2개의 온전한 항체들로부터 생성된 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항원 인식 자리를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역 글로불린 분자를 포괄한다. 항체는 그의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초하여 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 면역 글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위부류(이소형)(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 상이한 부류의 면역 글로불린은 상이하고 널리 공지되어 있는 서브유닛 구조와 3차원 배위를 갖는다. 항체는 접합되지 않은 네이키드(naked)이거나 또는 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성 동위원소 등에 접합될 수 있다.
용어 "ASCT2 항체", "ASCT2와 결합하는 항체" 또는 "항-ASCT2"는 이러한 항체가 ASCT2를 표적으로 하는 데 있어서 치료제로서 또는 진단제로서 유용하도록 충분한 친화도로 ASCT2와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 관련 없는, 비- ASCT2 단백질에 대한 항-ASCT2 항체의 결합 정도는 예컨대, 방사성 면역 분석법(RIA), (분석물로서 재조합 ASCT2와 리간드로서 항체를 이용하거나 그 역을 이용하는) 비아코어(BIACORE®), KINEXA®, 또는 당해 분야에 공지된 기타 결합 분석법으로 측정한 바에 따르면, ASCT2에 대한 이러한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, ASCT2와 결합하는 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤10 pM, ≤1 pM, 또는 ≤0.1 pM의 해리 상수(KD)를 갖는다.
용어 "항원 결합 단편"은 온전한 항체의 일부분을 지칭하며, 온전한 항체의 상보성 결정 가변 부위를 지칭한다. 전체 길이 항체의 단편은 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 항체 단편들의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체(예를 들어, ScFv), 그리고 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
"단일클론성 항체"(mAb)는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종 항체 집단을 지칭한다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정기들에 대항하여 유도되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론성 항체와 대조된다. 용어 "단일클론성 항체"는 온전한 단일클론성 항체와 전체 길이의 단일클론성 항체뿐만 아니라 항체 단편들(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄(scFv) 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 및 항원 인식 자리를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역 글로불린 분자를 포괄한다. 나아가, "단일클론성 항체"는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 형질전환 동물을 포함하나 이에 한정되지 않는, 임의의 여러 방식으로 제조된 이러한 항체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 최소의 비 인간(예컨대, 뮤린) 서열을 함유하도록 유전자 조작된 비 인간(예컨대, 뮤린) 면역 글로불린으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는, CDR(상보적 결정 부위)로부터의 잔기들이 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비 인간 종(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기들로 대체된 인간 면역 글로불린이다(Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). 일부 경우에, 인간 면역 글로불린의 Fv 기본틀 부위(FW) 잔기는 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비 인간 종으로부터의 항체 내 상응하는 잔기로 대체된다.
인간화 항체는 Fv 기본틀 부위에서 및/또는 대체된 비 인간 잔기 내에서 추가적인 잔기들의 치환에 의해 더 변형되어 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개선하고 최적할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비 인간 면역 글로불린에 상응하는 CDR 부위들을 전부, 또는 실질적으로 전부 함유하는, 적어도 하나의, 그리고 전형적으로는 2개 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이나, FR 부위들의 전부, 또는 실질적으로 전부는 인간 면역 글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 적어도 면역 글로불린 불변 부위 또는 도메인(Fc)의 일부분, 전형적으로는 인간 면역 글로불린의 일부분을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하는데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 번호 5,225,539 또는 5,639,641에 기술되어 있다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 대상체에 독성이 없는, 활성 성분 이외의 약학적 제형 내의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 설명에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리적으로 적합한, 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수/재흡수 지연제 등을 포함한다.
항체의 "가변 부위"는 항체 경쇄의 가변 부위 또는 항체 중쇄의 가변 부위를, 단독으로 또는 조합하여, 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 부위는 각각이 과가변 부위로도 알려진 3개의 상보적 결정 부위(CDR)에 의해 연결된 4개의 기본틀 부위(FW)로 이루어진다. 각각의 쇄에서의 CDR들은 FW 부위에 의해 서로 매우 가까이 유지되고, 다른 쇄의 CDR들과 함께 항체의 항원 결합 자리의 형성에 기여한다. CDR을 결정하는 기법은 적어도 두 가지가 있다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기초한 접근법(즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). 또한, 이들 두 접근법의 조합이 당해 분야에서 CDR을 결정하는 데 사용되기도 한다.
"카밧 넘버링 시스템"은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기(대략적으로 경쇄의 잔기 1 내지 107 및 중쇄의 잔기 1 내지 113)를 지칭할 때 사용된다(예컨대, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
카밧에서와 같은 아미노산 위치 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에서 항체들의 편집물의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대하여 사용된 넘버링 체계를 지칭한다. 이러한 넘버링 체계를 사용하여, 실질적인 선형 아미노산 서열은 가변성 도메인의 FW 또는 CDR의 단축 또는 가변성 도메인의 FW 또는 CDR로의 삽입에 상응하는, 더 적은 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변성 도메인은 단일 아미노산 삽입부(카밧에 따른 잔기 52a)를 H2의 잔기 52 뒤에 포함하고, 삽입된 잔기(예를 들어, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 중쇄 FW 잔기 82 뒤에 포함할 수 있다.
잔기의 카밧 넘버링은 주어진 항체에 대해 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열로 정렬시킴으로써 결정될 수 있다. 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 대신 지칭한다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 카밧 넘버링 관례를 이용하여 넘버링했을 때 코티아 CDRH1의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 다르다(이는 카밧 넘버링 체계가 H35A와 H35B에 삽입물을 위치시키기 때문이다; 만일 35A와 35B가 존재하지 않는다면, 이러한 루프는 32에서 끝난다; 35A만 존재한다면, 이러한 루프는 33에서 끝난다; 35A와 35B 모두가 존재할 경우, 이러한 루프는 34에서 끝난다). AbM 과가변 부위는 카밧 CDR들과 코티아 구조적 루프 사이의 절충물을 나타내며, 옥스포드 몰레큘러(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. 아래 표 1은 각 시스템에서 항체의 가변 부위를 포함하는 아미노산의 위치를 나열한 것이다.
각 시스템의 아미노산 위치
부위 카밧 AbM 코티아
LCDR1 L24~L34 L24~L34 L24~L34
LCDR2 L50~L56 L50~L56 L50~L56
LCDR3 L89~L97 L89~L97 L89~L97
HCDR11 H31~H35B H26~H35B H26~H32..34
HCDR12 H31~H35 H26~H35 H26~H32
HCDR2 H50~H65 H50~H58 H52~H56
HCDR3 H95~H102 H95~H102 H95~H102
1카밧 넘버링
2코티아 넘버링
IMGT(임뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics))도 CDR들을 포함하는 면역 글로불린 가변 부위에 대한 넘버링 시스템을 제공한다. 예를 들면, Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003)) 참조. IMGT 넘버링 시스템은 5,000개를 초과하는 서열들의 정렬선, 구조적 데이터 및 과가변 루프의 특징 규명을 기초로 하고, 모든 종들에 대한 가변 부위 및 CDR 부위의 용이한 비교를 가능하게 한다. IMGT 넘버링 체계에 따르면, VH-CDR1은 위치 26 내지 35에 존재하고, VH-CDR2는 위치 51 내지 57에 존재하고, VH-CDR3은 위치 93 내지 102에 존재하고, VL-CDR1은 위치 27 내지 32에 존재하고, VL-CDR2는 위치 50 내지 52에 존재하고, VL-CDR3은 위치 89 내지 97에 존재한다.
명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 기술된 VH CDR 서열들은 전통적인 카밧 넘버링 위치에 해당한다. 즉, 카밧 VH-CDR1은 위치 31 내지 35에 존재하고, VH-CDR2는 위치 50 내지 65에 존재하고, VH-CDR3은 위치 95 내지 102에 존재한다. VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3도 전통적인 카밧 넘버링 위치, 즉, 각각 위치 24 내지 34, 50 내지 56 및 89 내지 97에 해당한다.
용어 "인간 항체"는 인간에서 생성된 항체, 또는 당해 분야에서 공지된 임의의 기법을 이용함으로써 제조된, 인간에서 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 가진 항체를 의미한다. 인간 항체의 이 정의는 온전한 또는 전체 길이 항체, 이의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체, 예를 들면, 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 면역 글로불린 분자의 아미노산 서열이 2 이상의 종들로부터 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 부위는 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 가진, 포유동물의 한 종(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼 등)으로부터 유래된 항체의 가변 부위에 상응하는 반면, 불변 부위는 그 종에서 면역 반응을 유발하는 것을 피하기 위해 또 다른 종(통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동하다.
용어 "YTE" 또는 "YTE 돌연변이체"는 인간 FcRN에 대한 결합의 증가를 초래하고 이러한 돌연변이를 갖는 항체의 혈청 반감기를 개선하는 IgG1 Fc의 돌연변이를 지칭한다. YTE 돌연변이체는 IgG1의 중쇄 내로 도입된, 세 가지 돌연변이의 조합 M252Y/S254T/T256E(EU 넘버링 Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.). 본 설명에 참조로 포함된 미국 특허번호 7,658,921 참조. 이러한 YTE 돌연변이체는 동일한 항체의 야생형 버전과 비교하여 항체의 혈청 반감기를 대략 4배 증가시키는 것으로 밝혀졌다(Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514~24 (2006); Robbie et al., (2013) Antimicrob. Agents Chemother. 57, 6147~6153). 또한, 전체가 참조로 포함된 미국 특허번호 7,083,784 참조.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 자리와 그의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비 공유적 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본 설명에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 표시할 수 있다. 친화도는 본 설명에 기술된 방법들을 포함하는, 당해 분야에 공지된 통상의 방법들에 의해 측정할 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 느리게 항원에 결합하고 용이하게 해리되는 경향을 나타내는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 보다 더 빠르게 항원에 결합하고 더 오랫동안 결합된 상태로 남아있는 경향을 나타낸다. 다양한 결합 친화도 측정 방법들이 당해 분야에 공지되어 있고, 이 방법들 중 임의의 방법을 본 발명의 목적을 위해 이용할 수 있다.
달리 언급되어 있지 않은 한, 결합 분자의 "효능"은 통상적으로 ng/ml로 나타낸 IC50 값으로서 표현된다. IC50은 항체 분자의 중간 억제 농도이다. 기능성 분석에서, IC50은 최대치의 50%까지 생물학적 반응을 감소시키는 농도이다. 리간드 결합 연구에서, IC50은 최대 특이적 결합 수준의 50%까지 수용체 결합을 감소시키는 농도이다. IC50은 당해 분야에 공지된 다수의 수단에 의해 계산할 수 있다.
기준 항체와 비교하여 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드에 대한 효능의 배수 개선은 적어도 약 2배, 적어도 약 4배, 적어도 약 6배, 적어도 약 8배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배 또는 적어도 약 180배 이상일 수 있다.
항체의 결합 효능은 달리 언급되지 않는 한 일반적으로 EC50 값(nM 또는 pM)으로 표현된다. EC50은 소정의 노출 시간 후 기준선과 최대값 사이의 중간 반응을 유도하는 약물의 농도이다. EC50은 당해 분야에 공지된 임의의 수의 수단에 의해 산출될 수 있다.
"치료적 항체"는 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위해 대상체에 투여될 수 있는 것이다. "대상체"는 진단, 예후 또는 치료가 바람직한 임의의 개체, 특히 포유동물이다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 경작용 동물, 스포츠 동물 및 동물원 동물, 예컨대, 인간, 비 인간 영장류, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소 등을 포함한다.
"치료"는 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하고/치유하거나, 늦추고/늦추거나, 이러한 상태 또는 장애의 증상을 경감시키고/경감시키거나, 이러한 상태 또는 장애의 진행을 중단시키는 치료적 조치를 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 이는 이미 이러한 장애가 있는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 환자가 예컨대, 이러한 질병 또는 장애와 관련된 증상의 전체적, 부분적, 또는 일시적 경감 또는 제거를 보이는 경우, 본 설명에 제공된 방법에 따라, 질병 또는 장애, 예를 들어, 암에 대해 성공적으로 "치료"된다.
"예방"은 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발생을 예방하고/예방하거나 이를 늦추는 예방적 또는 방지적 조치를 지칭한다. 따라서, 예방이 필요한 이는 이러한 장애를 앓기 쉽거나 이러한 장애에 취약한 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자가 일시적으로 또는 영구적으로 본 발명의 방법을 경험한 적이 없는 환자보다 예컨대, 질병 또는 장애와 관련하여 더 적거나 덜 심각한 증상, 또는 이러한 질병 또는 장애와 관련하여 더 늦은 증상의 발생을 발달시키는 경우, 본 설명에 제공된 방법에 따라, 질병 또는 장애가 성공적으로 예방된다.
용어 "약학적 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고, 조성물이 투여될 대상체에 허용 불가능하게 독성을 나타내는 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균 조성물일 수 있고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대, 생리 식염수를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 조성물은 완충액(예컨대, 아세트산염, 인산염, 또는 시트르산염 완충액), 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트), 안정화제(예컨대, 인간 알부민), 보존제(예컨대, 벤질 알코올) 및 생물학적 이용가능성을 증진시키는 흡수 촉진제 및/또는 기타 통상적인 가용화제 또는 분산제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 설명에 개시된 항체의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여, 경험적으로 및 통상적인 방식으로 결정할 수 있다.
"표지"는 "표지된" 결합 분자 또는 항체를 생성하도록 결합 분자 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합되는 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 이러한 표지는 그 자체로 검출될 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소적 표지의 경우, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 개질에 촉매 작용을 미칠 수 있다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본 설명에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 개질된 아미노산을 포함할 수 있고, 비 아미노산은 이를 단절할 수 있다. 이러한 용어들은 천연적으로 또는 조작, 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 기타 조작 또는 개질, 예컨대, 표지 성분과의 접합에 의해 개질된 아미노산 중합체도 포괄한다. 예를 들어, (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함하는)아미노산의 하나 이상의 유사체뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 개질도 함유하는 폴리펩타이드도 이러한 정의 내에 포함된다. 특정 구현예에서, 이러한 폴리펩타이드는 단일 쇄 또는 연결된 쇄로서 존재할 수 있다.
본 설명에 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 하나 이상의 "핵산", "핵산 분자" 또는 "핵산 서열"을 포함할 수 있고, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA와 RNA를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 개질된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 개질된 뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 포함하는, 본 설명에서 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드들에 적용된다.
용어 "벡터"는 관심 있는 하나 이상의 유전자 또는 서열을 전달할 수 있고, 일부 구현예에서는 이를 숙주 세포에서 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 어느 것도 연결되지 않은(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵세포들, 예컨대, 생산자 세포가 있으나 이에 한정되지 않는다.
"단리된" 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태로 존재하는 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 이들이 자연에서 발견된 형태로는 더 이상 존재하지 않을 정도까지 정제된 단리된 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드의 맥락에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 서열 동일성의 일부분으로 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고, 최대한의 대응을 위해 비교 및 (필요한 경우 갭을 도입하여) 정렬 시, 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위 서열 또는 소정 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하거나 육안 검사에 의해 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 수득하는 데 이용할 수 있는 다양한 알고리즘과 소프트웨어는 당해 분야에 공지되어 있다.
이러한 서열 정렬 알고리즘의 비 제한적인 예 한 가지는 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264~2268 (1990)에 기술되고, Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873~5877(1993)에 의해 수정되어, NBLAST 및 XBLAST 프로그램(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389~3402 (1991))에 도입된 알고리즘이다. 특정 구현예에서, 갭 블라스트(Gapped BLAST)가 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389~3402 (1997)에 의해 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2(Altschul et al., Methods in Enzymol. 266:460~480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2(제넨테크(Genentech), 미국 캘리포니아 주 사우스샌프란시스코) 또는 Megalign(DNASTAR)은 서열을 정렬하는 데 사용할 수 있는 추가적인 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 프로그램이다. 특정 구현예에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 (예컨대, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 90의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 이용하여) 결정한다. 일부 대안적인 구현예에서, Needleman and Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444~453(1970))의 알고리즘을 도입한 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램이 (예컨대, BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5의 길이 가중치를 이용하여) 두 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성을 결정하는 데 이용될 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Myers and Miller (CABIOS 4:11~17(1989))의 알고리즘을 이용하여 결정된다. 예를 들어, ALIGN 프로그램(버전 2.0)을 이용하여, 그리고 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티와 함께 PAM120을 이용하여, 퍼센트 동일성을 결정할 수 있다. 당업자는 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬을 위해 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 이용된다.
특정 구현예에서, 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 백분율 동일성 "X"는 100 x (Y/Z)로서 계산되고, 이때 Y는 (시각적 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬될 때) 제1 서열과 제2 서열의 정렬선에서 동일한 매치로서 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, Z는 제2 서열에서의 잔기의 총 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 더 긴 경우, 제2 서열에 대한 제1 서열의 퍼센트 동일성은 제1 서열에 대한 제2 서열의 퍼센트 동일성보다 더 높을 것이다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 비슷한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들면, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는, 비슷한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리들이 당해 분야에 정의되어 있다. 예를 들어, 티로신 대신 페닐알라닌으로의 치환은 보존적 치환이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 항체, 및 항원 결합 단편의 아미노산 서열들의 보존적 치환은 아미노산 서열을 함유하는 결합 분자, 항체, 또는 항원 결합 단편의 항원(들), 즉, 결합 분자, 항체, 또는 항원 결합 단편이 결합하는 ASCT2에 대한 결합을 저해하지 않는다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, Brummell et al., Biochem. 32: 1180~1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879~884 (1999); Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412~417 (1997) 참조.
II. 항-ASCT2 항체 및 항원-결합 단편
본 발명은 ASCT2와 특이적으로 결합하는 항-ASCT2 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 ASCT2에 대한 전체 길이 아미노산(aa) 및 뉴클레오티드(nt) 서열은 당해 분야에 공지되어 있고, 적어도 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)의 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. NCBI 데이터베이스는 온라인에서 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 설명에 제공된 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항-ASCT2 항체는 세포독소에 접합되어 있으므로, 그것들은 항-ASCT2 ADC라 지칭된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-ASCT2 항체는 세포 표면 위의 ASCT2와 결합하여, 세포 내로 내재화된다. 일부 구현예에서, 항-ASCT2 항체는 약 100 ng/ml 내지 약 1 μg/ml, 약 100 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 100 ng/ml 내지 약 250 ng/ml, 약 250 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 350 ng/ml 내지 약 450 ng/ml, 약 500 ng/ml 내지 약 1 μg/ml, 약 500 ng/ml 내지 약 750 ng/ml, 약 750 ng/ml 내지 약 850 ng/ml, 또는 약 900 ng/ml 내지 약 1 μg/ml의 10분에서의 IC50으로 ASCT2 발현 세포 내로 내재화된다. 일부 구현예에서, 항-ASCT2 항체는 약 100 ng/ml 내지 약 1 μg/ml, 약 100 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 100 ng/ml 내지 약 250 ng/ml, 약 250 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 250 ng/ml 내지 약 350 ng/ml, 약 350 ng/ml 내지 약 450 ng/ml, 약 500 ng/ml 내지 약 1 μg/ml, 약 500 ng/ml 내지 약 750 ng/ml, 약 750 ng/ml 내지 약 850 ng/ml, 또는 약 900 ng/ml 내지 약 1 μg/ml의 30분에서의 IC50으로 ASCT2 발현 세포 내로 내재화된다. 일부 구현예에서, 항-ASCT2 항체는 약 50 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml, 약 100 ng/ml 내지 약 200 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 300 ng/ml, 약 300 ng/ml 내지 약 400 ng/ml, 또는 약 400 ng/ml 내지 약 500 ng/ml의 120분에서의 IC50으로 ASCT2 발현 세포 내로 내재화된다. 일부 구현예에서, 항-ASCT2 항체는 약 5 ng/ml 내지 약 250 ng/ml, 약 10 ng/ml 내지 약 25 ng/ml, 약 25 ng/ml 내지 약 50 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml, 약 100 ng/ml 내지 약 150 ng/ml, 약 150 ng/ml 내지 약 200 ng/ml, 또는 약 200 ng/ml 내지 약 250 ng/ml의 8시간에서의 IC50으로 ASCT2 발현 세포 내로 내재화된다. 일부 예에서, 세포독소에 접합된 항-ASCT2 항체는 항-ASCT2 ADC이다.
일부 양태에서, 본 개시는 세 개의 중쇄 상보성 결정 부위(HCDR) 및 세 개의 경쇄 상보성 결정 부위(LCDR)를 포함하는 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 양태에서, HCDR1은 서열 번호 10 및 서열 번호 16으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; HCDR2는 서열 번호 22, 서열 번호 11 및 서열 번호 17로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; HCDR3은 서열 번호 23, 서열 번호 12 및 서열 번호 18로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; LCDR1은 서열 번호 13 및 서열 번호 19로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; LCDR2는 서열 번호 14, 서열 번호 20 및 서열 번호 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; LCDR3은 서열 번호 15, 서열 번호 21 및 서열 번호 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 본 설명에 제공된 바와 같이, VH는 서열 번호 1 또는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고; VH는 서열 번호 2 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-ASCT2 항체는 서열 번호 5의 아미노산 서열의 VH 및 서열 번호 6의 아미노산 서열의 VL을 포함한다. 선택적으로, 항-ASCT2 항체는 서열 번호 3 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열의 VH 및 서열 번호 4 또는 서열 번호 8의 아미노산 서열의 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-ASCT2 항체는 서열 번호 7의 아미노산 서열의 VH 및 서열 번호 8의 아미노산 서열의 VL을 포함한다.
나아가, 본 개시는 VH 및 VL을 포함하는 ASCT2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 여기서 VH와 VL은 각각 기준 아미노산 서열인 서열 번호 1 및 서열 번호 2; 서열 번호 3 및 서열 번호 4; 서열 번호 5 및 서열 번호 6; 또는 서열 번호 7 및 서열 번호 8 각각과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유한다.
일 양태에서, 본 개시는 VH 아미노산 서열인 서열 번호 5 및 VL 아미노산 서열인 서열 번호 6을 포함하는 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시는 VH 아미노산 서열인 서열 번호 7 및 VL 아미노산 서열인 서열 번호 8을 포함하는 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 설명에 기술된 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예컨대, 뮤린 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일클론성 항체, 다클론성 항체, 재조합 항체, 다중특이적 항체, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 항-ASCT2 항체 항원-결합 단편은 Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, dsFv 단편, scFv 단편, 또는 sc(Fv)2 단편일 수 있다.
일 양태에서, 본 개시는 종을 가로질러 ASCT2 분자에 결합할 수 있는 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예컨대, 이러한 항체 또는 단편은 마우스 ASCT2, 랫트 ASCT2, 토끼, ASCT2, 인간 ASCT2 및/또는 시노몰구스 원숭이 ASCT2와 결합할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체 또는 단편은 인간 ASCT2 및 시노몰구스 원숭이 ASCT2와 결합할 수 있다. 추가적인 예에서, 이러한 항체 또는 단편은 마우스 ASCT2와 결합할 수도 있다.
본 설명에 제공된 일부 구현예에서, 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASCT2, 예컨대, 인간 ASCT2 및 시노몰구스 원숭이 ASCT2에 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 ASCT1에 특이적으로 결합하지 않는다.
본 설명에 기술된 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VH 및 VL 이외에도, 중쇄 불변 부위 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 중쇄 불변 부위는 인간 중쇄 불변 부위, 예컨대, 인간 IgG 불변 부위, 예컨대, 인간 IgG1 불변 부위이다. 일부 구현예에서, 특히 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 작용제, 예컨대, 세포독성제에 접합되는 경우, 시스테인 잔기는 IgG1의 CH2 부위의 아미노산 S239와 V240 사이에 삽입된다. 이 시스테인은 "239 삽입" 또는 "239i"라 지칭된다.
일부 양태에서, 중쇄 불변 부위 또는 이의 단편, 예컨대, 인간 IgG 불변 부위 또는 이의 단편은 야생형 IgG 불변 도메인에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있는데, 이때, 이러한 개질된 IgG는 야생형 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 반감기와 비교하여 증가된 반감기를 갖는다. 예를 들어, IgG 불변 도메인은 251~257, 285~290, 308~314, 385~389 및 428~436 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있는데, 이때, 이러한 아미노산 위치 넘버링은 카밧에 기재된 EU 인덱스에 따른 것이다. 일부 양태에서, 이러한 IgG 불변 도메인은 카밧 위치 252의 아미노산의 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 또는 트레오닌(T)으로의 치환, 카밧 위치 254의 아미노산의 트레오닌(T)으로의 치환, 카밧 위치 256의 아미노산의 세린(S), 아르기닌(R), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 아스파르트산(D), 또는 트레오닌(T)으로의 치환, 카밧 위치 257의 아미노산의 류신(L)으로의 치환, 카밧 위치 309의 아미노산의 프롤린(P)으로의 치환, 카밧 위치 311의 아미노산의 세린(S)으로의 치환, 카밧 위치 428의 아미노산의 트레오닌(T), 류신(L), 페닐알라닌(F), 또는 세린(S)으로의 치환, 카밧 위치 433의 아미노산의 아르기닌(R), 세린(S), 이소류신(I), 프롤린(P), 또는 글루타민(Q)으로의 치환, 또는 카밧 위치 434의 아미노산의 트립토판(W), 메티오닌(M), 세린(S), 히스티딘(H), 페닐알라닌(F), 또는 티로신으로의 치환 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 더욱 구체적으로, 이러한 IgG 불변 도메인은 카밧 위치 252의 아미노산의 티로신(Y)으로의 치환, 카밧 위치 254의 아미노산의 트레오닌(T)으로의 치환 및 카밧 위치 256의 아미노산의 글루탐산(E)으로의 치환을 포함하는, 야생형 인간 IgG 불변 도메인에 대한 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 본 개시는 이러한 중쇄가 인간 IgG1 YTE 돌연변이체인 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 설명에 제공된, 예컨대, 위에 기술된, 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VH 및 VL 이외에도, 선택적으로 중쇄 불변 부위 또는 이의 단편, 경쇄 불변 부위 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 경쇄 불변 부위는 카파 람다 경쇄 불변 부위, 예컨대, 인간 카파 불변 부위 또는 인간 람다 불변 부위이다.
위에서 지적한 바와 같이, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 본 설명에 기재된 서열에 대해 예컨대, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사할 수 있고/있거나, 본 설명에 기재된 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 치환, 예컨대, 보존적 치환을 포함할 수 있다. VH 부위 또는 VL 부위에 대해 특정 퍼센트 유사성을 나타내거나, 하나 이상의 치환, 예컨대, 보존적 치환을 갖는 VH 및 VL 부위를 갖는 ASCT2 항체는 본 설명에 기술된 VH 및/또는 VL 부위를 암호화하는 핵산 분자들의 돌연변이 유발(예컨대, 부위 특이적 또는 PCR 매개성 돌연변이 유발)에 이어, 암호화된 변경된 항체의 ASCT2에 대한 결합 시험 및 선태적으로 본 설명에 기술된 기능적 분석법을 이용한 보유된 기능 시험에 의해 수득될 수 있다.
항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 당해 분야에 잘 알려져 있는 임의의 적절한 방법, 예컨대, 유동 세포분석법, 효소결합 면역흡착 측정법(ELISA) 또는 방사성면역분석법(RIA), 또는 동역학(예컨대, KINEXA® 또는 BIACORE™ 분석)을 이용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 직접적인 결합 분석법뿐만 아니라, 경쟁적 결합 분석법 포맷이 용이하게 활용될 수 있다(예를 들어, Berzofsky et al., Antibody-Antigen Interactions, In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); 및 본 설명에 기술된 방법 참조). 측정된 특정 항체-항원 상호작용의 친화도는 상이한 조건(예컨대, 염 농도, pH, 온도) 하에서 측정되었다면 다를 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 항원 결합 파라미터(예컨대, KD 또는 Kd, Kon, Koff)의 측정은 당해 분야에 공지된 바와 같이, 표준화된 항체 및 항원 용액, 그리고 표준화된 완충액을 이용하여 이루어진다.
일부 구현예에서, 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유세포 분석법으로 측정한 바에 따르면, 약 500 nM 미만, 약 350 nM 미만, 약 250 nM 미만, 약 150 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 60 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 40 nM 미만, 약 30 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 500 pM 미만, 약 350 pM 미만, 약 250 pM 미만, 약 150 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 75 pM 미만, 약 60 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 40 pM 미만, 약 30 pM 미만, 약 20 pM 미만, 약 15 pM 미만, 약 10 pM 미만, 또는 약 5 pM 미만의 IC50으로 ASCT2 발현 세포에 결합할 수 있다.
III. 항-ASCT2 항체 및 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 결합 분자
특정 구현예에서, 본 개시는 본 설명에 기술된 항-ASCT2 항체가 결합하는 동일한 에피토프에 결합하는 항-ASCT2 항체를 제공한다. 용어 "에피토프"는 본 발명의 항체에 결합할 수 있는 표적 단백질 결정기를 지칭한다. 에피토프는 보통 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어지며, 보통은 특이적인 3차원 구조적 특성뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 나타낸다. 입체형태적 에피토프와 비 입체형태적 에피토프는 전자에 대한 결합은 변성 용매의 존재 하에 사라지지만 후자에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 이러한 항체들은 일반적인 ASCT2 결합 또는 활성 분석법에서 본 설명에 기술된 것들과 같은 항체들과 교차 경쟁하는 (예컨대, 통계적으로 유의미한 방식으로, 결합을 경쟁적으로 억제하는) 능력을 기초로 하여 확인할 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 또 다른 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대, 뮤린 단일클론성 항체 17c10 또는 1e8, 또는 본 설명에 개시된 인간화 변이체와 ASCT2에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항-ASCT2 항체 및 이의 항원 결합 단편, 예컨대, 단일클론성 항체를 제공한다. 예컨대, 17c10 또는 1e8의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 이러한 시험 항체가 ASCT2에 대한 그 항체와 경쟁할 수 있음을 증명한다. 이러한 항체는 비 제한적인 이론에 따라 그것이 경쟁하는 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 ASCT2 상의 동일하거나 관련된 (예컨대, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 가까운) 에피토프와 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 예컨대, 이러한 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 뮤린 단일클론성 항체 17c10 또는 1e8와 ASCT2 상의 동일한 에피토프와 결합한다.
IV. 항-ASCT2 항체 및 항원 결합 단편의 제조
단일클론성 항-ASCT2 항체들은 Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)에 기재된 것들과 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 하이브리도마 방법을 이용하여 마우스, 햄스터 또는 기타 적절한 숙주 동물을 위에 기술된 바와 같이 면역화시켜 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생성을 유발한다. 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수도 있다. 면역화 후, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 단리하고 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한 후, 이 하이브리도마 세포를 비 융합된 림프구 및 골수종 세포로부터 선별할 수 있다. 그 다음, 면역침전, 면역블롯팅 또는 시험관 내 결합 분석법, 예를 들면, 방사성면역분석법(RIA) 또는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 결정된 바에 따라, 선택된 항원에 대해 특이적으로 유도된 단일클론성 항체를 생성하는 하이브리도마를, 표준 방법(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)을 이용하여 시험관 내 배양물에서 증식시킬 수 있거나 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 증식시킬 수 있다. 그 후, 공지된 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 이러한 단일클론성 항체를 정제할 수 있다.
대안적으로 항-ASCT2 단일클론성 항체는 미국 특허 번호 4,816,567에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조될 수도 있다. 단일클론성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 이러한 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 성숙한 B 세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리되고, 그의 서열은 통상적인 절차를 이용하여 결정된다. 그 다음, 이러한 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 이러한 단리된 폴리뉴클레오티드는, 숙주 세포, 예컨대, 대장균 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 면역 글로불린 단백질을 달리 생성하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염될 때 이러한 숙주 세포를 통해 단일클론성 항체가 생성되는, 적합한 발현 벡터 내로 클로닝된다. 또한, 원하는 종의 재조합 항-ASCT2 단일클론성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기술된 바와 같이 원하는 종의 CDR들을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 이러한 폴리뉴클레오티드(들)은 재조합 DNA 기술을 이용하여 다수의 상이한 방식으로 더 개질되어 대안적인 항체들을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들면, 마우스 단일클론성 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인들은 (1) 키메라 항체를 생성하기 위해 예를 들면, 인간 항체의 이들 부위들 대신에 치환될 수 있거나, (2) 융합 항체를 생성하기 위해 비 면역 글로불린 폴리펩타이드 대신에 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 불변 부위들은 단일클론성 항체의 원하는 항체 단편을 생성하기 위해 절두되거나 제거된다. 가변 부위의 위치 특이적 또는 고밀도 돌연변이 유발이 단일클론성 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화하는 데 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 이러한 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기법들을 이용하여 직접적으로 제조될 수 있다. 표적 항원에 대해 유도된 항체를 생성하는, 시험관 내에서 면역화되었거나 면역화된 개체로부터 단리된 불멸화된 인간 B 림프구가 생성될 수 있다. 예컨대, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol. 147 (1):86-95 (1991); 미국 특허 5,750,373 참조.
또한, 이러한 항-ASCT2 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, Vaughan et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996); Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)에 기술된 바와 같이, 파지 라이브러리로부터 선별될 수 있고, 여기서 그러한 파지 라이브러리가 인간 항체를 발현한다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 이용을 위한 기법 또한 미국 특허 번호 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; 및 7,264,963; 그리고 Rothe et al., J. Molec. Biol. 376:1182-1200 (2008)(이들 각각은 전체가 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
친화도 성숙 전략 및 체인 셔플링 전략이 당해 분야에 공지되어 있으며, 고친화도 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하기 위하여 이용될 수 있다. 그 전체가 참조로 도입된 Marks et al., BioTechnology 10:779-783 (1992) 참조.
일부 구현예에서, 항-ASCT2 단일클론성 항체는 인간화 항체일 수 있다. 비 인간 또는 인간 항체를 조작하거나, 인간화하거나 재표면화하는(resurfacing) 방법도 이용될 수 있고, 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 인간화, 재표면화 또는 유사하게 조작된 항체는 비 인간, 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 비 인간 영장류 또는 기타 포유동물(그러나 이에 한정되지 않음)인 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비 인간 아미노산 잔기는 전형적으로, 공지된 인간 서열의 "이입(import)" 가변, 불변 또는 기타 도메인으로부터 취한 "이입" 잔기라 종종 지칭되는 잔기들로 교체된다. 이러한 이입된 서열들은 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화성, 결합 속도, 해리 속도, 결합력, 특이성, 반감기 또는 임의의 기타 적합한 특성을 감소시키거나, 향상시키거나 변경시키기 위하여 이용될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기들은 ASCT2 결합에 영향을 미치는 데에 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 관여한다. 따라서, 비 인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 유지되는 반면, 가변 및 불변 부위의 비 인간 서열은 인간 또는 기타 아미노산으로 교체될 수 있다.
또한, 항체는 ASCT2 항원에 대한 높은 친화도 및 기타 유리한 생물학적 성질을 보유하도록 선택적으로 인간화, 재표면화, 조작 또는 인간 항체 조작될 수 있다. 이 목표를 달성하기 위해, 인간화(또는 인간) 또는 조작된 항-ASCT2 항체 및 재표면화 항체는 모 서열, 조작된 서열 및 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 인간화 및 조작된 생성물들을 분석하는 과정에 의해 선택적으로 제조될 수 있다. 3차원적 면역 글로불린 모델이 흔히 이용될 수 있고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역 글로불린 서열의 가능한 3차원적 입체형상적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역 글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역 글로불린이 그의 항원, 예컨대, ASCT2에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FW 잔기가 원하는 항체 특성, 예컨대, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 공통 서열 및 이입 서열들로부터 선택되어 조합될 수 있다.
본 발명의 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 인간화, 재표면화 또는 조작은 임의의 공지된 방법, 예컨대, Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993); 미국 특허 번호 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567, 7,557,189; 7,538,195; 및 7,342,110; 국제 출원 번호 PCT/US98/16280; PCT/US96/18978; PCT/US91/09630; PCT/US91/05939; PCT/US94/01234; PCT/GB89/01334; PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; 국제 특허 출원 공개 번호 WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; 및 유럽 특허 공개 번호 EP 229246(이들 각각은 전체적으로 본 설명에 참조로 포함된다)(이들에 인용된 참고문헌을 포함)에 기술된 방법들(그러나 이에 한정되지 않음)을 이용하여 이루어질 수 있다.
항-ASCT2 인간화 항체 및 이의 항원 결합 단편은 내인성 면역 글로불린 생성 부재 하에서 면역조치 시 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 인간 면역 글로불린좌를 함유하는 형질전환 마우스에서도 제조될 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기술되어 있다.
특정 구현예에서 항-ASCT2 항체 단편이 제공된다. 항체 단편 생성을 위한 다양한 기법들이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 예를 들어, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 24:107-117 (1993) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)에 기술된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질 용해성 분해를 통해 유래된다. 특정 구현예에서, 항-ASCT2 항체 단편은 재조합적으로 생성된다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 대장균 또는 기타 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 대장균 또는 기타 숙주 세포로부터 분비될 수 있으므로, 다량의 이들 단편의 생성을 가능하게 한다. 이러한 항-ASCT2 항체 단편은 위에서 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수도 있다. 이러한 항-ASCT2 항체 단편은 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같이 선형 항체일 수도 있다. 항체 단편의 기타 제조 기법은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 따르면, ASCT2에 특이적인 단일 쇄 항체의 생산 기법이 채택될 수 있다.(예컨대, 미국 특허 번호 4,946,778 참조). 또한, ASCT2에 대한 원하는 특이성을 가진 단일클론성 Fab 단편, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체의 신속하고 효과적인 확인을 가능하게 하기 위해 Fab 발현 라이브러리를 구축하는 방법이 채택될 수 있다. 예를 들어, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) 참조. 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성된 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 이황화 가교의 환원에 의해 생성된 Fab 단편; 항체 분자의 파파인 및 환원제 처리에 의해 생성된 Fab 단편; 또는 Fv 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는 항체 단편들이 당해 분야에 알려진 기법에 의해 생성될 수 있다.
특정 양태에서, 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 그것의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여 개질될 수 있다. 이것은 예를 들면, 항체 또는 항체 단편의 적절한 부위의 돌연변이로 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 또는 항체 단편 내로 도입하거나, (예를 들면, DNA 또는 펩타이드 합성으로) 어느 한 말단 또는 중간에서 항체 또는 항체 단편에 융합되는 펩타이드 태그 내로 에피토프를 도입함으로써, 또는 YTE 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 혈청 반감기를 증가시키는 기타 방법, 예를 들면, 이종 분자, 예컨대, PEG와의 접합이 당해 분야에 공지되어 있다.
본 설명에 제공된, 개질된 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이러한 항체 또는 폴리펩타이드의 ASCT2와의 결합을 제공하는 임의의 유형의 가변 부위를 포함할 수 있다. 이 점에 있어서, 이러한 가변 부위는 체액 반응을 시작하고 원하는 항원에 대한 면역 글로불린을 생성하도록 유도될 수 있는 임의의 유형의 포유동물을 포함하거나 이러한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 따라서, 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 이러한 가변 부위는 예를 들어, 인간, 뮤린, 비 인간 영장류(예컨대, 시노몰구스 원숭이, 마카크 등) 또는 이리 기원의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 개질된 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 가변 부위와 불변 부위 모두는 인간이다. 다른 양태들에서, (보통 비 인간 공급원으로부터 유래된) 적합한 항체의 이러한 가변 부위는 조작되거나 특이적으로 맞추어져 결합 특성을 개선하거나 이러한 분자의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 유용한 가변 부위는 인간화되거나 그렇지 않으면 이입된 아미노산 서열의 포함을 통해 변경될 수 있다.
특정 구현예에서, 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인들은 하나 이상의 CDR들의 적어도 부분적인 교체 및/또는 부분적인 기본틀 부위 교체 및 서열 바꿈에 의해 변경된다. 이러한 CDR들이 기본틀 부위가 유래되는 항체와 동일한 부류의 항체 또는 심지어 이러한 항체의 하위 부류로부터 유래될 수 있지만, 이러한 CDR들은 상이한 부류로부터, 그리고 특정 구현예에서는 상이한 종의 항체로부터 유래될 것임이 예상된다. 모든 CDR을 공여자 가변 부위로부터의 완전 CDR로 대체하여 하나의 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또 다른 가변 도메인으로 옮기는 것은 필수적이지 않다. 오히려, 항원 결합 자리의 활성을 유지하기 위해 필요한 이들 잔기를 옮기는 것만 필수적이다. 미국 특허 번호 5,585,089, 5,693,761 및 5,693,762에 기재된 설명을 고려하면, 통상적인 실험을 수행하여 면역원성이 감소된 기능성 항체를 수득하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 해당할 것이다.
가변 부위에 대한 변경에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 개질된 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 불변 부위 도메인들 중 하나 이상의 적어도 일부분이 결실되었거나 그렇지 않으면 변경되어 원했던 생화학적 특성, 예컨대, 천연의 또는 변경되지 않은 불변 부위를 포함하는 대략 동일한 면역원성의 항체에 비해 증가된 종양 편재화 또는 감소된 혈청 반감기를 제공하는 항체(예컨대, 전체 길이 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 포함할 것임을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 개질된 항체의 이러한 불변 부위는 인간 불변 부위를 포함할 것이다. 이러한 본 발명과 양립할 수 있는 이러한 불변 부위에 대한 개질은 하나 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 즉, 본 설명에 개시된 이러한 개질된 항체는 3종의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인(CL)에 대한 변경 또는 개질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실된 개질된 불변 부위가 고려된다. 일부 구현예에서, 이러한 개질된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구축물 또는 변이체 (ΔCH2 구축물)를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 생략된 불변 부위 도메인은 부재한 불변 부위에 의해 통상 제공되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서(예를 들어, 10개의 잔기)에 의해 대체될 수 있다.
이들의 입체배치 외에도, 이러한 불변 부위가 몇몇 이펙터 기능을 매개한다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체는, 세포의 Fc 수용체(FcR)와 결합하는 항체 Fc 부위의 Fc 수용체 자리를 이용하여, Fc 부위를 통해 세포와 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(에타 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)를 비롯한 다양한 부류의 항체에 대해 특이적인 Fc 수용체가 다수 존재한다. 세포 표면의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용리(항체 의존적 세포 매개성 세포독성, 또는 ADCC라 함), 염증 매개자의 방출, 태반 통과 및 면역 글로불린 생산 제어를 포함한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발한다.
특정 구현예에서, 이러한 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 결국 투여된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생물학적 프로파일에 영향을 미치는, 변경된 이펙터 기능을 제공한다. 예를 들어, (점 돌연변이 또는 기타 방법을 통한) 불변 부위 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 개질된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있다. 다른 경우, 본 발명과 일치하는 불변 부위 개질은 보체 결합을 완화시켜, 혈청 반감기 및 접합된 세포독소의 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 이러한 불변 부위의 또 다른 개질을 이용하여, 항원 특이성 또는 항체 가요성 증가로 인한 편재성 증진을 가능하게 하는 이황화 결합 또는 올리고당 모이어티를 제거할 수 있다. 유사하게, 본 발명에 따른 이러한 불변 부위에 대한 개질은 당업자의 범위 내에서 널리 공지된 생화학 또는 분자 공학 기법을 이용하여 용이하게 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, ASCT2-결합 분자, 즉, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 이펙터 기능을 나타내지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC) 활성 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성을 나타내지 않는다. 특정 구현예에서, 이러한 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 수용체 및/또는 보체 인자와 결합하지 않는다. 특정 구현예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 어떠한 이펙터 기능도 나타내지 않는다.
특정 구현예에서, 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 조작하여 CH3 도메인을 각각의 개질된 항체 또는 이의 단편의 힌지 부위에 직접 융합시킬 수 있다. 다른 구축물에서, 힌지 부위와 개질된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩타이드 스페이서가 삽입될 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고, 남은 CH3 도메인(개질되거나 개질되지 않음)이 5 내지 20개의 아미노산 스페이서를 이용하여 힌지 부위에 연결된 적합한 구축물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서를 첨가하여, 예를 들어, 불변 도메인의 조절 요소를 자유롭고 접근가능하게 유지하거나, 또는 힌지 부위를 가요적이게 유지할 수 있다. 아미노산 스페이서는 일부 경우에 면역원성인 것으로 판명되어, 이러한 구축물에 대해 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 이러한 구축물에 첨가되는 임의의 스페이서는 상대적으로 비 면역원성이거나, 또는 심지어 개질된 항체의 원하는 생화학적 품질을 유지하도록 전부 생략될 수 있다.
전체 불변 부위 도메인의 결실 이외에도, 본 설명에 제공된 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 불변 부위의 소수의 또는 심지어 단일 아미노산의 부분적 결실 또는 치환에 의해 개질될 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역의 단일 아미노산의 돌연변이는 실질적으로 Fc 결합을 감소시켜 종양 편재화를 증가시키기에 충분할 수 있다. 마찬가지로, 이펙터 기능(예컨대, 보체 C1Q 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 부위 도메인을 완전히 또는 부분적으로 결실시킬 수 있다. 불변 부위의 이러한 부분 결실은 대상 불변 부위 도메인과 관련된 기타 바람직한 기능을 온전하게 둔 해 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 선택된 특징(예컨대, 혈청 반감기)을 개선할 수 있다. 게다가, 개시된 항-ASCT2 항체 및 이의 항원 결합 단편의 불변 부위를, 그에 따른 구축물의 프로파일을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 개질시킬 수 있다. 이러한 점에서, 개질된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 입체배치 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지하면서, 보존된 결합 자리(예를 들어, Fc 결합)에 의해 제공되는 활성을 파괴하는 것이 가능하다. 특정 구현예들은 이러한 불변 부위에 하나 이상의 아미노산을 첨가하여 바람직한 특성을 증진시킬 수 있다. 예컨대 이펙터 기능을 감소 또는 증진시키거나, 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공할 수 있다. 이러한 구현예에서, 선택된 불변 부위 도메인으로부터 유래된 특정 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 본 설명에 기재된 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항-ASCT2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편과 실질적으로 상동성인 변이체 및 등가물을 또한 포함한다. 이들은, 예를 들어 보존적 치환 돌연변이, 즉, 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산을 동일한 공통 부류 내의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예를 들어 하나의 산성 아미노산을 또 다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또 다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산을 또 다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환이 의미하는 것은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 보통은 이러한 단백질의 일부분이 아닌 추가적인 화학적 모이어티를 함유하도록 더 개질될 수 있다. 이러한 유도체화된 모이어티는 이러한 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 또는 흡수를 향상시킬 수 있다. 또한, 이러한 모이어티는 이러한 단백질 등의 임의의 바람직한 부작용을 감소시키거나 제거할 수 있다. 이러한 모이어티에 대한 개요는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd ed., Ed. Lloyd V. Allen, Jr. (2012)에서 볼 수 있다.
V. 항-ASCT2 항체 접합체
본 개시는 이종 기원의 작용제에 접합된, 위에 기술된 항-ASCT2 항체 또는 이의 단편을 추가적으로 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, "접합됨"은 공유 결합 또는 이온 결합을 통해 연결됨을 의미한다. 일부 양태에서, 이러한 작용제는 항미생물제, 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 지질, 생물학적 반응 조절제, 약제, 림포카인, 이종 항체 또는 이의 단편, 검출 가능한 표지, PEG, 또는 임의의 상기 작용제 중 둘 이상의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 ASCT2 결합 분자는 ASCT2-ADC이다.
따라서, 본 개시는 본 설명에 개시된 항-ASCT2 항체를 포함하며, 적어도 하나의 세포독성제를 더 포함하는 ADC 또한 제공한다. 일부 양태에서, 이러한 ADC는 적어도 하나의 선택적인 스페이서를 더 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 적어도 하나의 스페이서는 펩타이드 스페이서이다. 일부 양태에서, 이러한 적어도 하나의 스페이서는 비 펩타이드 스페이서이다.
세포독성제 또는 세포독소는 세포의 기능을 억제하거나 방해하고/하거나, 세포의 파괴(세포 사멸)을 야기하고/하거나, 항-신생물/항-증식 효과를 발휘하는 당해 분야에 공지된 임의의 분자일 수 있다. 여러 부류의 세포독성제들이 ADC 분자에서 잠재적인 유용성을 갖고 있다고 알려져 있다. 그것들은 아마니틴, 아우리스타틴, 다우노마이신, 독소루비신, 듀오카르마이신, 돌라스타틴, 에네디인, 렉시트롭신, 탁산, 퓨로마이신, 메이탄시노이드, 빈카 알칼로이드, 튜불라이신 및 피롤로벤조디아제핀(PBD)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 세포독성제의 예는 AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, 아우리스타틴 E, 파클리탁셀, 도세탁셀, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 돌라스타틴-10, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 칼리케아미신, 메이탄신, DM-1, 빈블라스틴, 메토트렉세이트 및 네트롭신, 및 이의 유도체 및 유사체이다. ADC에 사용하기에 적합한 세포독소와 관련된 추가적인 개시는 예를 들어, 전체가 본 설명에 참조로 포함된, 국제 특허출원 공개번호 WO 2015/155345 및 WO 2015/157592에서 찾아볼 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 세포독성제는 튜불라이신 또는 튜불라이신 유도체이다. 튜불라이신 A는 다음의 화학 구조를 갖는다:
Figure pct00001
.
튜불라이신은 믹소박테리아 종으로부터 단리된 한 부류의 천연 생성물의 구성원이다(Sasse et al., J. Antibiot. 53:879~885 (2000)). 세포골격 상호작용제로서, 튜불라이신은 세포주기 정지 및 세포자멸사를 초래하는 유사분열 독소이다(Steinmetz et al., Chem. Int. Ed. 43:4888~4892 (2004); Khalil et al., Chem. Biochem. 7:678~683 (2006); Kaur et al., Biochem. J. 396: 235~242 (2006)). 본 설명에 사용된 용어 "튜불라이신"은 자연적으로 발생하는 튜불라이신 및 튜불라이신의 유사체 및 유도체를 집합적으로 및 개별적으로 지칭한다. 튜불라이신의 실례가 되는 예는 예를 들어, 본 설명에 참조로 포함된, WO2004005326A2, WO2012019123A1, WO2009134279A1, WO2009055562A1, WO2004005327A1,US7776841, US7754885, US20100240701, US7816377, US20110021568 및 US20110263650에 개시되어 있다. 이러한 유도체는 예를 들어, 하나 이상의 보호 또는 보호기, 하나 이상의 연결 모이어티를 포함하는 튜불라이신 전구약물 또는 튜불라이신을 포함하는 것으로 이해된다.
일부 양태에서, 이러한 튜불라이신은 본 설명에서 "AZ1508"로도 지칭되며 본 설명에 참조로 포함된 WO 2015157594에 더욱 상세하게 기술되었고 다음의 구조를 갖는 튜불라이신 1508이다:
Figure pct00002
.
또 다른 구현예에서, 이러한 세포독성제는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 또는 PBD 유도체일 수 있다. PBD는 핵으로 자리를 옮겨, 그곳에서 DNA를 교차 결합시켜, 유사분열 중에 복제를 방지하고, 단일 가닥 절단을 유도하여 DNA를 손상시키고, 이어서 세포자멸사를 초래한다. 일부 PBD는 DNA의 특정 서열을 인식하고 이에 결합할 수 있는 능력이 있다. 바람직한 서열은 PuGPu이다. PBD는 일반적인 구조를 갖는다:
Figure pct00003
.
PBD들은 방향족 A 고리 및 피롤로 C 고리에서 치환기의 수, 유형 및 위치가 상이하며, C 고리의 포화도가 상이하다. B 고리에는 DNA의 알킬화를 담당하는 친전자성 중심인 N10-C11 위치에 이민(N=C), 카르비놀아민(NH-CH(OH)) 또는 카르비놀아민 메틸 에테르(NH-CH(OMe))가 존재한다. 공지된 천연 생성물 모두는 C 고리로부터 A 고리를 향해 볼 때 이를 오른쪽으로 비틀어지게 하는 키랄 C11a 위치에서 (S) 입체배치를 갖는다. 이는 이들에 B형 DNA의 작은 홈(minor groove)과의 등나선성(isohelicity)을 위한 적절한 3차원 형상을 제공하여 결합 부위에서 제대로 맞도록 한다(Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3~11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230~237 (1986)). 작은 홈에서 부가물을 형성하는 능력 덕분에 이들은 DNA 프로세싱을 방해할 수 있게 되어 항종양제로서 사용이 가능하다.
최초의 PBD 항종양 항생제인 안트라마이신은 1965년에 발견되었다(Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc. 87:5793-5795 (1965); Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc. 87:5791-5793 (1965)). 그 이후로, 다수의 자연 발생적 PBD가 보고되었고, 다양한 유사체에 대해 10개 이상의 합성 경로가 개발되었다 (Thurston et al., Chem. Rev. 1994:433~465 (1994); Antonow, D. and Thurston, D.E., Chem. Rev. 111:2815~2864 (2011)). 패밀리 구성원에는 아베이마이신(Hochlowski et al., J. Antibiotics 40:145~148 (1987)), 치카마이신(Konishi et al., J. Antibiotics 37:200~206 (1984)), DC-81(일본 특허 58~180 487; Thurston et al., Chem. Brit.26:767~772 (1990); Bose et al., Tetrahedron 48:751~758 (1992)), 마제트라마이신(Kuminotoet al., J. Antibiotics 33:665~667 (1980)), 네오트라마이신 A 및 B(Takeuchi et al., J. Antibiotics 29:93~96 (1976)), 포로트라마이신(Tsunakawa et al., J. Antibiotics 41:1366~1373 (1988)), 프로트라카르신(Shimizuet al., J. Antibiotics 29:2492~2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem. 52:91~97 (1987)), 시바노마이신(DC-102) (Hara et al., J. Antibiotics41:702~704 (1988); Itohet al., J. Antibiotics 41:1281~1284 (1988)), 시비로마이신(Leberet al., J. Am. Chem. Soc. 110:2992~2993 (1988)) 및 토마마이신(Arimaet al., J. Antibiotics 25:437~444 (1972))이 포함된다. PBD와 이를 포함하는 ADC 또한 전체가 본 설명에 참조로 포함된 국제 특허출원 국제 특허출원 공개 번호 WO 2015/155345 및 WO 2015/157592에 기술되어 있다.
일부 양태에서, PBD는 본 설명에서 "SG3249"로도 지칭되며 본 설명에 참조로 포함된 WO 2014/057074에 더욱 상세하게 기술되었고 다음의 구조를 갖는 PBD 3249이다:
Figure pct00004
.
일부 양태에서, PBD는 본 설명에서 "SG3315"로도 지칭되며 본 설명에 참조로 포함된 WO 2015/052322에 더욱 상세하게 기술되었고 다음의 구조를 갖는 PBD 3315이다:
Figure pct00005
.
본 설명에 개시된 항-ASCT2 항체 및 이의 항원 단편은 부위 특이적 또는 비 부위 특이적 접합 방법을 이용하여 이종 작용제에 접합될 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 ADC는 하나, 둘, 셋, 넷 이상의 치료적 모이어티를 포함한다. 일부 양태에서, 모든 치료적 모이어티는 동일하다.
전통적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 접합 전략은 라이신 또는 시스테인을 통한 항체 또는 단편에 페이로드를 임의로 접합시키는 것에 의존한다. 따라서, 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 항체 또는 단편의 부분적인 환원에 이어, 부착된 링커 모이어티가 있거나 없는, 원하는 작용제와의 반응에 의해, 작용제에 임의로 접합된다. 항체 또는 단편은 DTT 또는 유사한 환원제를 이용하여 환원시킬 수 있다. 그런 다음, 부착된 링커 모이어티가 있거나 없는 이러한 작용제는 DMSO의 존재 하에 환원된 항체 또는 단편에 몰 초과량으로 첨가될 수 있다. 접합 후, 과량의 유리 시스테인이 반응하지 않은 작용제를 퀀치하기 위해 첨가될 수 있다. 그런 다음, 반응 혼합물을 정제하고, PBS로 완충액 교환할 수 있다.
또 다른 양태에서, 특정 위치의 반응성 아미노산 잔기들을 이용하는 항체에 대한 치료적 모이어티의 부위 특이적인 접합은 균일한 화학량론으로 균질한 ADC 제제를 산출한다. 이러한 부위 특이적인 접합은 시스테인, 잔기 또는 비 자연적 아미노산을 통할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 세포독성제 또는 영상화 작용제는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합된다. 일부 양태에서, 각각의 치료적 모이어티는 Fc 부위의 특정 카밧 위치의 아미노산의 측쇄에 화학적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 이러한 세포독성제 또는 영상화 작용제는 위치 239, 248, 254, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 440, 441, 442, 443 및 446 중 적어도 하나의 시스테인 치환을 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합되는데, 이때, 이러한 넘버링은 카밧의 EU 인덱스에 해당한다. 일부 양태에서, 이러한 특정 카밧 위치는 239, 442, 또는 둘 다이다. 일부 양태에서, 이러한 특정 위치는 카밧 위치 442, 카밧 위치 239와 240 사이의 아미노산 삽입, 또는 둘 다이다. 일부 양태에서, 이러한 작용제는 티올-말레이미드 연결을 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합된다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 측쇄는 설프하이드릴 측쇄이다.
일 구현예에서, ASCT2 결합 분자, 예컨대, ASCT2-ADC, 항-ASCT2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 ASCT2 발현 세포에 세포독성 페이로드를 전달하고, 증식을 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 약 100% 저해하거나 억제한다. 세포 증식은 세포 분열의 속도, 및/또는 세포 분열을 거치는 세포 집단 내의 세포의 비율, 및/또는 말기 분화 또는 세포 사망(예컨대, 티미딘 도입)으로 인한 세포 집단으로부터의 세포 소실 속도를 측정하는 당해 분야에서 인정된 기법을 이용하여 분석할 수 있다.
VI. ASCT2 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이의 발현
본 개시는 ASCT2 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항-ASCT2 항체를 암호화하거나 그러한 항체의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 이러한 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태로 존재할 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하고, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우 코딩 가닥 또는 비 코딩(안티센스) 가닥일 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 cDNA일 수 있거나, cDNA로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합적으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 숙주 세포로부터의 폴리펩타이드의 발현 및 분비에 도움을 주는 폴리뉴클레오티드(예컨대, 이러한 세포로부터의 폴리펩타이드의 수송을 조절하기 위한 분비 서열로서 작용하는 리더 서열)에 대해 동일한 판독 프레임으로 융합된 성숙 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 리더 서열을 가진 이러한 폴리펩타이드는 전구단백질이고, 이러한 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 형성하기 위해 숙주 세포에 의해 절단되는 리더 서열을 가질 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질 플러스 추가적인 5' 아미노산 잔기인 ASCT2 결합 전구단백질을 암호화할 수도 있다.
본 개시는 항체 VH를 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서, 이때, 이러한 VH는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 7로 이루어지는 군으로부터 선택된 기준 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 제공한다.
게다가, 본 개시는 항체 VL을 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 이때, 이러한 VL은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택된 기준 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 항체 VH를 암호화하는 핵산 및 항체 VL을 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 이때, 이러한 VH는 기준 아미노산 서열인 서열 번호 1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL은 기준 아미노산 서열인 서열 번호 2와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 항체 VH를 암호화하는 핵산 및 항체 VL을 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 이때, 이러한 VH는 기준 아미노산 서열인 서열 번호 3과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL은 기준 아미노산 서열인 서열 번호 4와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 항체 VH를 암호화하는 핵산 및 항체 VL을 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 이때, 이러한 VH는 기준 아미노산 서열인 서열 번호 5와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL은 기준 아미노산 서열인 서열 번호 6과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 항체 VH를 암호화하는 핵산 및 항체 VL을 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 이때, 이러한 VH는 기준 아미노산 서열인 서열 번호 7과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL은 기준 아미노산 서열인 서열 번호 8과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 양태에서, 위에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VH 또는 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASCT2, 예컨대, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 ASCT2에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 사례에서, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 17c10 또는 1e8의 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시는 결합 분자, 예컨대, ASCT2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 조합물을 제공한다.
위에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 추가적으로 제공된다. 적절한 벡터는 본 설명에 기술되어 있으며, 당업자에 공지되어 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 위에 기술된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 담체, 희석제, 부형제, 또는 기타 첨가제를 더 포함하는 조성물, 예컨대, 약학적 조성물을 제공한다.
위에 기술된 폴리뉴클레오티드 조성물에서, VH를 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 VL을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 단일 벡터 내에 존재할 수 있거나 별도의 벡터 상에 있을 수 있다. 따라서, 본 개시는 위에 기술된 폴리뉴클레오티드 조성물을 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공한다.
본 개시는 위에 제공된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 조성물, 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공하는데, 여기서 숙주 세포는 일부 예에서 ASCT2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현할 수 있다. 이러한 숙주 세포는 본 설명에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법에 이용될 수 있는데, 여기서 이러한 방법은 (a) 이러한 숙주 세포를 배양하는 단계 및 (b) 이러한 숙주 세포로부터 발현된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 암호화된 폴리펩타이드의 정제를 가능하게 하는, 마커 서열에 동일한 판독 프레임으로 융합된, 성숙 ASCT2 결합 폴리펩타이드, 예컨대, 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 암호화 서열을 포함한다. 예를 들면, 이러한 마커 서열은 세균 숙주의 경우 이러한 마커에 융합된 성숙 폴리펩타이드의 정제를 제공하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 포유동물 숙주(예를 들면, COS-7 세포)가 사용될 때 이러한 마커 서열은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다.
또한, 폴리뉴클레오티드 변이체가 제공된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 암호화 부위, 비 암호화 부위 또는 둘 다에서 변경을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 치환, 추가, 또는 결실을 생성하나 암호화된 폴리펩타이드의 성질 또는 활성을 바꾸지 않는 변경을 함유한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 유전 코드의 축퇴성으로 인한 침묵 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유들로, 예컨대, 특정 숙주를 위한 코돈 발현을 최적화하기 위해 (인간 mRNA 내의 코돈을 대장균과 같은 세균 숙주에 의해 선호되는 코돈으로 바꾸기 위해) 생성될 수 있다. 본 설명에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포도 제공된다.
일부 구현예에서, ASCT2-결합 분자를 암호화하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용한 화학적 합성에 의해 구축될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 및 관심 있는 재조합 폴리펩타이드가 생성될 숙주 세포에서 유리한 코돈의 선택을 기초로 설계될 수 있다. 표준 방법을 적용하여 관심 있는 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성할 수 있다. 예를 들면, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된(backtranslated) 유전자를 구축할 수 있다. 나아가, 특정 단리된 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들면, 원하는 폴리펩타이드의 일부를 암호화하는 여러 작은 올리고뉴클레오티드들을 합성한 후 라이게이션시킬 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 함유한다.
(합성, 위치 특이적 돌연변이 유발 또는 또 다른 방법에 의해) 일단 조립되면, 관심 있는 특정 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고 원하는 숙주에서의 단백질의 발현에 적절한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적절한 조립은 예를 들어, 적합한 숙주에서 생물학적 활성 폴리펩타이드의 뉴클레오티드 서열 결정, 제한 매핑 및/또는 발현에 의해 확인될 수 있다. 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 얻기 위해, 이러한 유전자는 선택된 발현 숙주에서 작용하는 전사 및 번역 발현 조절 서열과 결합되거나 이에 작동가능하게 연결될 수 있다.
특정 구현예에서, 재조합 발현 벡터를 사용하여 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 DNA를 증폭하고 발현시킨다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 항-ASCT2 항체 또는 및 이의 항원 결합 단편의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 합성 또는 cDNA 유래의 DNA 단편을 가진, 복제 가능한 DNA 구축물이다. 전사 유닛은 일반적으로 본 설명에 상세히 기술된 바와 같이 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 수행하는 유전적 요소 또는 요소들, 예를 들면, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조적 또는 암호화 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 조립체를 포함한다. 이러한 조절 요소는 전사를 조절하기 위한 작동유전자 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로 복제기점에 의해 부여된, 숙주에서 복제하는 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하기 위한 선별 유전자가 추가로 도입될 수 있다. DNA 부위들은 서로 기능적으로 관련되어 있을 때 작동 가능하게 연결된다. 예를 들면, 신호 펩타이드(분비 리더)에 대한 DNA가 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되어 있거나; 프로모터가 서열의 전사를 조절하는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결되어 있거나; 리보좀 결합 자리가 번역을 허용하도록 위치되는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 효모 발현 시스템에서 사용되기 위한 구조적 요소는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포 외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 이 단백질은 N 말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 발현된 재조합 단백질로부터 선택적으로 나중에 절단되어 최종 생성물을 제공할 수 있다.
발현 조절 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 의존할 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합들이 사용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는 예를 들면, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 세균 숙주에 유용한 발현 벡터는 pCR1, pBR322, pMB9, 및 이들의 유도체를 포함하는 공지된 세균 플라스미드, 예컨대, 대장균으로부터의 플라스미드, 보다 더 넓은 숙주 범위 플라스미드, 예컨대, M13 및 사상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
ASCT2-결합 분자의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 조절 하에 있는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵세포를 포함한다. 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들면, 대장균 또는 바실러스를 포함한다. 고등 진핵세포는 본 설명에 기술된 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 세포 무함유 번역 시스템도 사용될 수 있다. 항체 생산을 포함한 단백질 생산 방법에 관한 추가적인 정보는 예컨대, 미국 특허 공개 번호 2008/0187954, 미국 특허 번호 6,413,746 및 6,660,501, 및 국제 특허 공개 번호 WO 04009823(이들 각각은 전체가 참고로 본 설명에 포함됨)에서 볼 수 있다.
다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템들도 재조합 ASCT2-결합 분자를 발현하는 데에 유리하게 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질은, 이러한 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고 적절하게 개질되고 완전한 기능성을 갖기 때문에, 발현이 이루어질 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 HEK-293 및 HEK-293T, Gluzman, Cell 23:175 (1981)이 기술한 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주, 및 예를 들면, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소(CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 포함하는 기타 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 비전사 요소, 예컨대, 복제기점, 발현될 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 기타 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대, 필요한 리보좀 결합 자리, 폴리아데닐화 자리, 스플라이스 공여자 및 수용자 자리, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 제조하기 위한 바큘로바이러스 시스템은 Luckow and Summers, BioTechnology 6:47 (1988)에 의해 검토되었다.
형질전환된 숙주에 의해 생성된 ASCT2-결합 분자는 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 이러한 표준 방법은 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화도 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 임의의 기타 표준 단백질 정제 기법을 포함한다. 친화도 태그, 예컨대, 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 단백질에 부착시켜 적절한 친화도 컬럼을 통과시켜 용이한 정제를 가능하게 할 수 있다. 단백질용해, 핵 자기 공명 또는 x선 결정학과 같은 기법을 이용하여 단리된 단백질을 물리적으로 특징규명할 수도 있다.
예를 들면, 재조합 단백질을 배양 배지 내로 분비하는 시스템으로부터의 상층액을, 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면, 아미콘(AMICON) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여 먼저 농축할 수 있다. 농축 단계 후, 농축액을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들면, 펜던트 디에틸아미노에틸(DEAE) 기를 가진 매트릭스 또는 기질이 사용될 수 있다. 이러한 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에서 통상적으로 사용되는 기타 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계가 사용될 수 있다. 적합한 양이온 교환제는 설포프로필 또는 카복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스들을 포함한다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들면, 펜던트 메틸 또는 기타 지방족 기를 가진 실리카 겔을 사용한 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 사용하여 ASCT2-결합 분자를 더 정제할 수 있다. 다양한 조합들에서, 전술한 정제 단계들의 일부 또는 전부를 이용하여 균질한 재조합 단백질을 제공할 수도 있다.
세포 배양물에서 생성된 재조합 ASCT2-결합 분자는 예를 들면, 세포 펠렛으로부터의 초기 추출에 이은 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 최종 정제 단계를 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용할 수 있다. 재조합 단백질의 발현에서 사용된 미생물 세포는 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 파괴할 수 있다.
당해 분야에 공지된, 항체 및 기타 단백질을 정제하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 공개 번호 2008/0312425, 2008/0177048 및 2009/0187005(이들 각각은 전체가 본 설명에 참고로 도입됨)에 기술된 방법들도 포함한다.
VII. 약학적 조성물 및 투여 방법
본 설명에 제공된 ASCT2 결합 분자를 제조하고 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 결정된다. ASCT2 결합 분자의 투여 경로는 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본 설명에 사용된 용어 비경구는 예를 들면, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 이러한 모든 투여 형태는 명백히 본 발명의 범위 내인 것으로 생각되지만, 또 다른 투여 형태의 예는 주사용 용액, 특히 정맥 내 또는 동맥 내 주사 또는 점적을 위한 용액이다. 대개, 적절한 약학적 조성물은 완충액(예컨대, 아세트산염, 인산염 또는 시트르산염 완충액), 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예컨대, 사람 알부민) 등을 포함할 수 있다. 본 설명의 교시와 양립할 수 있는 기타 방법에서, 본 설명에 제공된 ASCT2 결합 분자는 부정적인 세포 집단 자리에 직접적으로 전달되어, 병든 조직의 치료제에 대한 노출을 증가시킬 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 투여는 예컨대, 흡입 또는 비강 내 투여에 의해 직접적으로 기도로 한다.
본 설명에서 논의된 바와 같이, 본 설명에 제공된 ASCT2 결합 분자는 직장결장암, HNSCC, 전립선암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 자궁내막암, 혈액암(AML, MM, DLBCL) 및 CSC를 포함하는 암과 같은, ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애의 생체 내 치료를 위해 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이 점과 관련하여, 개시된 결합 분자는 투여를 용이하게 하고 활성 작용제의 안정성을 증진시키기 위해 제형화될 수 있음이 인정될 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 생리 식염수, 무독성 완충액, 보존제 등과 같은 약학적으로 허용 가능한, 무독성의, 멸균 담체를 포함할 수 있다. 본 출원의 목적을 위해, 약학적으로 유효한 양의 ASCT2 결합 분자는 표적에 대한 유효한 결합을 달성하고 이익을 달성하기에 충분한, 예컨대, 질병 또는 병태의 증상을 개선하거나 물질 또는 세포를 검출하기에 충분한 양을 의미한다. 본 설명에 개시된 치료적 방법에 사용하기에 적합한 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd ed., Ed. Lloyd V. Allen, Jr. (2012)에 기술되어 있다.
본 설명에 제공된 일부 약학적 조성물은 예컨대, 캡슐, 정제, 수성 현탁액, 또는 용액을 포함하는 허용 가능한 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 또한 일부 약학적 조성물은 코 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 벤질 알코올 또는 기타 적합한 보존제, 생체이용률을 증진시키는 흡수 촉진제, 및/또는 기타 통상적인 가용화제 또는 분산제를 이용하여, 식염수 중 용액으로 제조될 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위하여 담체 물질과 조합될 수 있는 ASCT2 결합 분자의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 이러한 조성물은 단일 용량, 다중 용량으로, 또는 주입제로 확립된 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 또한, 투여 계획은 최적의 원하는 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다.
본 개시의 범위에 맞추어, ASCT2 결합 분자는 치료적 효과를 생성하기에 충분한 양으로 앞서 언급된 치료 방법에 따라 인간 또는 기타 동물에 투여될 수 있다. 본 설명에 제공된 ASCT2 결합 분자는 공지된 기법에 따라 본 발명의 ASCT2 결합 분자를 통상적인 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 조합하여 제조된 통상적인 투여 형태로 이러한 인간 또는 기타 동물에 투여될 수 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 형태 또는 특징은 그것이 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 잘 알려져 있는 변수에 의해 좌우될 수 있다. 1종 이상의 본 발명의 ASCT2 결합 분자, 예컨대, ASCT2-ADC, 항-ASCT2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 칵테일 또한 이용될 수 있다.
"치료적으로 유효한 용량 또는 양" 또는 "유효량"은 투여 시, 치료될 질병 또는 병태를 앓는 환자의 치료와 관련하여 긍정적인 치료적 반응을 가져오는 ASCT2 결합 분자의 양을 의미한다.
일부 암과 같은, ASCT2가 과발현되는 질병 또는 장애의 치료를 위한, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 용량은 투여 수단, 표적 자리, 환자의 생리 상태, 환자가 인간인지 동물인지, 및 기타 투여된 약물을 포함하는 여러 상이한 인자들에 따라 달라진다. 보통, 환자는 인간이지만, 형질전환 포유동물을 포함하는 비 인간 동물 또한 치료될 수 있다. 치료 정량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 당업자에 공지된 통상적인 방법을 이용하여 적정될 수 있다.
투여되는 적어도 하나의 ASCT2 결합 분자의 양은 본 개시를 고려할 때 과도한 실험 없이 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 투여 방식 및 적어도 하나의 ASCT2 결합 분자의 각각의 양에 영향을 주는 인자들로는 질병의 중증도, 질병 이력, 치료를 받고 있는 개인의 연령, 신장, 체중, 건강 및 신체 상태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 마찬가지로, 투여되는 ASCT2 결합 분자의 양은 투여 방식 및 대상체가 단일 용량 또는 다중 용량의 이러한 작용제를 경험할 것인지에 종속될 것이다.
또한, 본 개시는 ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 병태, 예컨대, 결장직장암, HNSCC, 전립선암, 폐암, 췌장암, 또는 혈액암의 치료용의 ASCT2 결합 분자, 예컨대, ASCT2-ADC, 항-ASCT2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공한다.
또한, 본 개시는 ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 병태, 예컨대, 결장직장암, HNSCC, 전립선암, 폐암, 췌장암, 또는 혈액암 치료를 위한 의약 제조에 있어서, ASCT2 결합 분자, 예컨대, ASCT2-ADC, 항-ASCT2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공한다.
VIII. 진단
본 개시는 일부 암과 같은 ASCT2 과발현을 특징으로 하는 질병의 진단 중에 유용한 진단 방법으로서, 개체로부터의 세포 또는 조직에서 ASCT2의 발현 수준을 측정하고, 측정된 발현 수준을 정상 세포 또는 조직에서의 표준 ASCT2 발현과 비교하는 단계를 포함하며, 이때, 표준과 비교한 발현 수준의 증가는 본 설명에 제공된 ASCT2 결합 분자에 의해 치료 가능한 장애를 나타내는 것인 진단 방법을 추가로 제공한다.
본 설명에 제공된 ASCT2 결합 분자는 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법을 이용하여 생물학적 샘플에서 ASCT2 단백질 수준을 분석하는 데 이용될 수 있다. Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087~3096 (1987); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976~985 (1985) 참조. ASCT2 단백질 발현을 검출하는 데 유용한 기타 항체 기반의 방법에는 면역분석법, 예컨대, ELISA, 면역침전, 또는 웨스턴 블롯팅이 포함된다.
"ASCT2 폴리펩타이드의 발현 수준을 분석하는"은 직접적으로(예를 들면, 절대적 단백질 수준을 측정하거나 추정함으로써) 또는 상대적으로(예를 들면, 제2 생물학적 샘플 중의 질병 관련 폴리펩타이드 수준과 비교함으로써) 제1 생물학적 샘플 중의 ASCT2 폴리펩타이드 수준을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하거나 추정하는 것을 의미한다. 제1 생물학적 샘플 중의 ASCT2 폴리펩타이드 발현 수준은 측정될 수 있거나 추정될 수 있고 표준 ASCT2 폴리펩타이드 수준과 비교될 수 있는데, 이때 이러한 표준은 장애를 갖지 않은 개체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플로부터 수득되거나, 장애를 갖지 않은 개체들의 집단으로부터 수준들의 평균을 산출함으로써 결정된다. 당해 분야에서 인식될 바와 같이, 일단 "표준" ASCT2 폴리펩타이드 수준이 공지되어 있으면, 그것은 비교를 위한 표준으로서 반복적으로 이용될 수 있다.
"생물학적 샘플"은 ASCT2를 잠재적으로 발현하는 개체, 세포주, 조직 배양물 또는 다른 세포 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 의미한다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 수득하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
IX. ASCT2 결합 분자를 포함하는 키트
본 개시는 본 설명에 기술된 ASCT2 결합 분자를 포함하며 본 설명에 기술된 방법을 수행하는 데 이용할 수 있는 키트를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 적어도 하나의 정제된 항-ASCT2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 적어도 하나의 정제된 ASCT2-ADC를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 키트는 모든 대조군들, 분석을 수행하기 위한 설명서 및 결과의 분석 및 제시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어를 비롯한, 검출 분석을 수행하는 데에 필요하고/하거나 충분한 모든 구성요소들을 함유한다. 당업자라면 개시된 ASCT2 결합 분자가 당해 분야에 잘 공지되어 있는 확립된 키트 포맷들 중 하나 내로 용이하게 도입될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
X. 면역분석법
본 설명에 제공된 ASCT2 결합 분자는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 면역특이적 결합 분석에 이용될 수 있다. 이용할 수 있는 면역분석법은 웨스턴 블롯, RIA, ELISA, ELISPOT, "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 분석법, 침전소 반응법, 겔 확산 침전소 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석법, 면역방사측정 분석법, 형광 면역분석법 및 단백질 A 면역분석법과 같은 기법들을 이용하는 경쟁적 분석 시스템 및 비 경쟁적 분석 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 분석법들은 통상적이며, 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 전체가 본 설명에 참조로 포함되는 Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 참조.
본 설명에 제공된 ASCT2 결합 분자는 예를 들어, ASCT2 또는 이의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편의 제자리(in situ) 검출을 위해, 면역형광, 면역전자 현미경관찰 또는 비 면역학적 분석법에서와 같이, 조직학적으로 이용될 수 있다. 제자리 검출은 환자로부터 조직학적 표본을 떼어내어, 표지된 ASCT2 결합 분자를 이러한 표본에 적용함으로써, 예컨대, 표지된 ASCT2 결합 분자를 생물학적 샘플 위에 올려놓아 적용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 절차의 이용을 통해 ASCT2, 또는 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편의 존재뿐만 아니라 검사된 조직에서의 그의 분포도 결정할 수 있다. 당업자라면 본 발명을 이용하여 이러한 제자리 검출을 달성하기 위해 매우 다양한 조직학적 방법들 중 임의의 조직학적 방법(예컨대, 염색 절차)을 변경시킬 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
주어진 로트의 ASCT2-결합 분자의 결합 활성은 잘 공지된 방법에 따라 결정할 수 있다. 당업자라면 통상적인 실험을 이용하여 각각의 결정을 위한 작동적 및 최적의 분석 조건을 결정할 수 있을 것이다.
단리된 ASCT2-결합 분자의 결합 특성의 결정에 적합한 방법 및 시약은 당해 분야에 공지되어 있고/있거나 상업적으로 입수 가능하다. 이러한 동력학적 분석을 위해 설계된 장치 및 소프트웨어는 상업적으로 입수가능하다(예를 들면, BIAcore®, BIAevaluation® 소프트웨어, GE Healthcare; KINEXA® 소프트웨어, Sapidyne Instruments).
달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명의 실시는 당해 분야의 기술 내에 해당하는 세포생물학, 세포 배양, 분자생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기법들을 이용할 것이다. 이러한 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription and Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); 및 Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.) 참조.
항체 조작의 일반적인 원리는 Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)에 기재되어 있다. 단백질 조작의 일반적인 원리는 Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)에 기재되어 있다. 항체 및 항체-햅텐 결합의 일반적인 원리는 Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); 및 Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)에 기재되어 있다. 추가적으로, 당해 분야에서 공지되어 있고 구체적으로 기재되어 있지 않은 면역학의 표준 방법은 일반적으로 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) 및 Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)에 기재된 바에 따른다.
면역학의 일반적인 원리를 기재한 표준 참고문헌 자료로는 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)를 포함한다.
본 개시에 언급된 참고문헌 전부는 그 전체가 참조로 본 설명에 포함된다. 또한, 본 설명에 인용되거나 언급된 임의의 제품을 위한 임의의 제조사의 설명서나 카탈로그는 참조로 포함된다. 본문에 참조로 포함된 문서, 또는 그 안의 임의의 교시는 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 본문에 참조로 포함된 문서는 선행기술로 인정되지 않는다.
XI. 구현예
구현예 1. 중성 아미노산 운반체 2(ASCT2)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 이때, 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄 가변 부위(VH)의 세 개의 중쇄 상보성 결정 부위(HCDR) 및 경쇄 가변 부위(VL)의 세 개의 경쇄 상보성 결정 부위(LCDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 ASCT2 에피토프에 특이적으로 결합하고; HCDR1의 아미노산 서열은 서열 번호 10에 기재되어 있고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열 번호 22에 기재되어 있으며, HCDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 23에 기재되어 있고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열 번호 13에 기재되어 있고, LCDR2의 아미노산 서열은 서열 번호 24에 기재되어 있으며, LCDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 25에 기재되어 있는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 서열 번호 10 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 11 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 12 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 13 또는 서열 번호 19의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 14 또는 서열 번호 20의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 15 또는 서열 번호 21의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, VH는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 7로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 8로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, VH는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 5. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, VH는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, IgG 불변 부위는 239번 위치의 세린(S)과 240번 위치의 V 사이에 시스테인(C) 삽입을 포함하는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 7. 구현예 6에 있어서, 이러한 항체는 서열 번호 9의 아미노산 서열의 중쇄를 포함하는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 이러한 항체가 세포 표면 상의 ASCT2에 결합 시, 항체가 세포 내로 내재화되는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 인간 카파 불변 부위 및 인간 람다 불변 부위로 이루어지는 군으로부터 선택된 경쇄 불변 부위를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 10. 구현예 9에 있어서, 이러한 항체는 서열 번호 26의 인간 카파 불변 부위를 포함하는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 항미생물제, 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 지질, 생물학적 반응 조절제, 약제, 림포카인, 이종 항체, 이종 항체의 단편, 검출 가능한 표지, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 방사성 동위원소, 및 임의의 상기 세포독소 중 둘 이상의 조합물로 구성되는 군으로부터 선택된 세포독소에 추가로 접합된 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 12. 구현예 11에 있어서, 세포독소에 접합되는 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 13. 구현예 12에 있어서, 이러한 세포독소는 튜불라이신 유도체 및 피롤로벤조다이제핀으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 14. 구현예 13에 있어서, 이러한 튜불라이신 유도체는 튜불라이신 AZ1508인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 15. 구현예 13에 있어서, 이러한 피롤로벤조디아제핀은 SG3315 및 SG3249로부터 선택되는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 16. 구현예 15에 있어서, 이러한 피롤로벤조디아제핀은 SG3315인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 16A. 구현예 15에 있어서, 이러한 피롤로벤조디아제핀은 SG3249인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 17. 구현예 1 내지 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 이러한 항체는 인간 ASCT2 및 시노몰구스 원숭이 ASCT2에 결합하는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 이러한 항체는 인간 ASCT1에 특이적으로 결합하지 않는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 19. 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예의 항체 또는 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
구현예 20. 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 조합물.
구현예 21. 구현예 20에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 조합물을 포함하는 벡터.
구현예 22. 청구항 20에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 조합물 또는 구현예 21에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
구현예 23. 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로, 이때, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 10의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 22의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 23의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 13의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 23의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하고, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편이 세포독소에 접합되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
구현예 23A. 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로, 이때, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 10의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 22의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 23의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 13의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하고, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편이 세포독소에 접합되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
구현예 24. 구현예 23에 있어서, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
구현예 24A. 구현예 23에 있어서, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
구현예 25. 구현예 23 또는 구현예 24에 있어서, 이러한 세포독소는 항미생물제, 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 지질, 생물학적 반응 조절제, 약제, 림포카인, 이종 항체, 이종 항체의 단편, 검출 가능한 표지, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 방사성 동위원소, 및 임의의 상기 세포독소 중 둘 이상의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
구현예 26. 구현예 23 또는 구현예 24에 있어서, 이러한 세포독소는 튜불라이신 유도체 및 피롤로벤조디아제핀으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
구현예 27. 구현예 26에 있어서, 이러한 튜불라이신 유도체는 튜불라이신 AZ1508인 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
구현예 28. 구현예 26에 있어서, 이러한 피롤로벤조디아제핀은 SG3315 및 SG3249로부터 선택되는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, 이러한 피롤로벤조디아제핀은 SG3315인 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
구현예 29A. 구현예 28에 있어서, 이러한 피롤로벤조디아제핀은 SG3249인 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
구현예 30. 구현예 23 내지 29에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
구현예 31. 구현예 22의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 항체 또는 항원-결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조방법.
구현예 32. 구현예 1 내지 18 또는 23 내지 29 중 어느 한 구현예에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 진단 시약.
구현예 33. 구현예 1 내지 18 또는 23 내지 29 중 어느 한 구현예에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 구현예 19 또는 30에 따른 조성물을 포함하는 키트.
구현예 34. ASCT2 발현 세포에 작용제를 전달하는 방법으로, 이러한 방법은 이러한 세포를 구현예 23 내지 29 중 어느 한 구현예에 따른 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 이때, 이러한 작용제는 이러한 세포에 의해 내재화되는 것인, ASCT2 발현 세포에 작용제를 전달하는 방법.
구현예 35. ASCT2 발현 세포의 사망을 유도하는 방법으로, 이러한 방법은 이러한 세포를 구현예 23 내지 29 중 어느 한 구현예에 따른 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 이때, 이러한 세포독소에 접합된 이러한 항체가 ASCT2 발현 세포의 사망을 유도하는 것인, ASCT2 발현 세포의 사망을 유도하는 방법.
구현예 36. 치료를 필요로 하는 대상체에 유효량의, 구현예 1 내지 18 또는 23 내지 29 중 어느 한 구현예에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 구현예 19 또는 구현예 30에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 ASCT2의 과발현을 특징으로 하는 암을 치료하는 방법.
구현예 37. 구현예 36에 있어서, 이러한 암은 결장직장암, 두경부 편평상피세포암종(HNSCC), 전립선암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 자궁내막암 및 혈액암(AML, MM, DLBCL)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
구현예 37A. 구현예 36에 있어서, 이러한 암은 CSC를 포함하는 것인 방법.
구현예 38. 구현예 37에 있어서, 이러한 혈액암은 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 단구성 백혈병(AMoL), 호지킨 림프종, 비 호지킨 림프종, 및 다발성 골수종으로부터 선택되는 것인, 방법.
구현예 39. 샘플 내 ASCT2 발현 수준을 검출하는 방법으로, 이러한 방법은 샘플을 구현예 1 내지 18 또는 23 내지 29 중 어느 한 구현예에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 구현예 19 또는 구현예 30에 따른 조성물과 접촉시키는 단계, 및 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 샘풀 내 ASCT2에 대한 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 40. 구현예 39에 있어서, 이러한 샘플은 세포 배양물인 방법.
구현예 41. 구현예 39에 있어서, 이러한 샘플은 분리된 조직인 방법.
구현예 42. 구현예 39에 있어서, 이러한 샘플은 인간으로부터 유래된 것인 방법.
구현예 43. 서열 번호 10의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 12의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 13의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 튜불라이신 AZ1508을 포함하는 ASCT2 항체-약물 접합체(ASCT2-ADC).
구현예 44. 서열 번호 10의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 12의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 13의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 PBD SG3249를 포함하는 ASCT2-ADC.
구현예 45. 서열 번호 10의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 12의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 13의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 튜불라이신 및 PBD SG3315를 포함하는 ASCT2-ADC.
구현예 46. 서열 번호 16의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 17의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 18의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 19의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 튜불라이신 AZ1508을 포함하는 ASCT2-ADC.
구현예 47. 서열 번호 16의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 17의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 18의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 19의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 PBD SG3249를 포함하는 ASCT2-ADC.
구현예 48. 서열 번호 16의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 17의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 18의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 19의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 PBD SG3315를 포함하는 ASCT2-ADC.
실시예
다음의 실시예들은 제한이 아니라 예시로써 제공된다.
본 개시의 구현예는 본 개시의 특정 항체들의 제조 및 본 개시의 항체를 이용하는 방법을 상세히 기술하는 다음의 비 제한적인 실시예를 참고함으로써 더 정의할 수 있다. 재료 및 방법 둘 다에 대한 많은 변경들이 본 개시의 범위를 벗어나지 않으면서 실시될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1. 인간의 정상 조직 및 암 조직에서의 ASCT2 발현
IHC로 분석한 정상 조직과 종양 조직에서의 ASCT2 단백질 발현
ASCT2의 단백질 발현을 평가하기 위해, 정상 인간으로부터의 절편과 인간의 종양 포름알데히드 고정 조직으로부터의 절편에서 IHC를 수행하였다. 시트르산 완충액(pH=6.0)으로 항원 회수 처리 후, 제조사의 프로토콜에 따라 조직을 항-ASCT2 토끼 다중클론성 항체(EMD 밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠 주 빌레리카; Cat# ABN73)로 시험하였다. 양성 대조군으로 HT29 세포주와 음성 대조군으로 1차 인간 간세포를 이용하여 프로토콜 최적화를 수행했다.
정상적인 조직에서는 간, 심장, 페포세포, 사구체 및 뇌에서 ASCT2에 대한 착색이 관찰되지 않았다.
인간 종양에서 ASCT2 발현
다양한 암 조직에 걸쳐 ASCT2 발현을 IHC로 평가하였다. 결장암종, 폐 편평상피세포암종, 두경부암 및 전립선암 조직을 포함한 고형 종양과 AML, MM, 및 DLBCL과 같은 혈액암에서 강한 막성 ASCT2 발현이 관찰되었다. 또한, 난소 자궁내막암 조직과 흑색종 조직에서 높은 ASCT2 발현이 관찰되었다. 아래 표 2는 인간 암 조직에서의 ASCT2 발현에 대한 요약을 제공한다.
인간 종양에서의 ASCT2 발현
　 전체 음성* 낮음 중간 높음 양성 코어 양성률(%)
폐 NSCLC SCC 5 0 1 1 3 5 100
폐 NSCLC 선암종 5 3 0 2 0 2 40
미분화된 폐 NSCLC 2 1 0 0 1 1 50
유방 침습성 관상 10 8 1 1 0 2 20
유방 침습성 소엽성 2 2 0 0 0 0 0
난소 장액성 및 장액성-유두 선종 8 5 1 1 1 3 38
난소 자궁내막 4 1 0 0 3 3 75
결장 11 0 1 3 7 11 100
흑색종(전이) 11 4 2 2 3 7 64
전립선 12 0 0 1 11 12 100
두경부 10 0 1 2 7 10 100
MM 15 0 0 0 15 15 100
AML 16 0 4 0 12 16 100
DLBCL 128 6 20 32 70 122 95.3
AML 및 MM으로부터의 암 줄기세포에서 ASCT2 발현이 관찰되었다. 암 줄기세포의 ASCT2는 형광단 알렉사(Alexa) 647과 접합된 ASCT2 항체 17c10을 이용하여 유세포 분석법으로 평가하였다. 도 1a에 기술된 바와 같이 AML 및 MM 환자에서의 ASCT2 발현은 정상 골수에서보다 상당히 높았다. CD38+, CD38-, CD34+; CD34-; CD38+ 및 CD34+; CD38- 및 CD34-와 같은 상이한 하위 모집단을 분류하는 유세포 분석법을 이용하여, 세포들을 분리하고, 각 하위 모집단에 대해 클론원성 분석법을 수행하여 그것들의 줄기세포 성질에 대해 추가로 특성을 분석하였다. 본 발명자들은 CD38+, CD34+ 세포들만 콜로니를 형성하였음을 발견하였는데, 이들은 문헌[Lapidot T et al., Nature 1994; 367(6464):645~8; Bonnet D et al. Nat Med 1997; 3(7):730~7]에 기술된 결과를 추가로 확증한다. 위에 기술된 모든 하위 모집단에서 ASCT2 발현을 평가하였다. 도 1b는 백혈병 줄기세포 모집단, 즉, AML 환자 샘플의 CD38+, CD34+ 모집단에서의 높은 ASCT2 발현을 묘사한 것이다. 마찬가지로, ASCT2 발현은 도 1c에 묘사된 바와 같이 AML의 벌크 또는 비 백혈병 줄기 세포 모집단에서도 높다. 나아가, ASCT2 발현을 MM 종양의 CD138+, CD19-(형질세포) 및 CD138-, CD19+ (줄기세포) 세포에서도 평가하였다. 도 1c의 히스토그램은 MM의 줄기세포와 비교한 형질세포에서의 높은 ASCT2 발현을 시사한다. 이러한 데이터는 ASCT2 발현이 정상 공여자로부터의 골수와 비교하여 AML 및 MM 환자 샘플로부터의 골수에서 관찰되었음을 뒷받침한다. 게다가, ASCT2는 AML 환자 샘플의 백혈병 줄기세포(LSC)(CD34+/CD38+)에서 고도로 과발현된다. 나아가, MM 형질세포라고도 정의된 CD138+, CD19- 세포는 줄기세포 모집단(CD138-, CD19+)과 비교하여 더 높은 ASCT2 발현을 보여준다.
ASCT2 발현은 췌장 종양으로부터의 암 줄기세포에서도 관찰되었다. 췌장 고형 종양 단편을 콜라겐 III으로 소화시키고, 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 해리된 세포들을 세포 표면 단백질 EpCAM, CD44, CD24에 대한 항체 및 위에서 기술한 ASCT2 항체로 염색하였다. 췌장암 줄기세포에 대한 세포 표면 단백질 특징은 잘 분석된 바 있다. EpCAM+ CD44+ CD24+ 세포는 췌장 종양에서 암 줄기세포로 정의된다(Li, C et al. Cancer Res.　2007;67:1030~1037). CSC 모집단(EpCAM+, CD44+, CD24+)에서의 ASCT2 발현의 예를 도 1d에 묘사하였다. 이 동일한 전략을 이용하여, ASCT2-PBD ADC 또는 이소형 대조 ADC로의 단일 용량 처리 후 췌장 종양의 암 줄기세포 모집단에서 ASCT2 발현을 평가하였다. 도 1e는 ASCT2-PBD ADC가 암 줄기세포 모집단을 제거함을 증명한다. 본 설명의 데이터는 고형 종양에서뿐만 아니라 혈액암 및 암 줄기세포에서의 ASCT2 표적화는 효과가 있음을 증명한다.
실시예 2. 항-ASCT2 항체의 생성
면역화 및 하이브리도마 생성
인간 ASCT2 유전자를 보유하는 플라스미드의 DNA 면역화(Chowdhury et al., J. Immunol. Methods 249:147, 2001)에 의해 ASCT2에 대한 항체를 생성하였다. 인간 ASCT2에 대한 유전자를 발현 플라스미드 pcDNA3.1(인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아 주 칼즈배드) 내로 클로닝하였다. 8주령의 VelocImmune II 마우스(리제네론(Regeneron), 미국 뉴욕 주 태리타운)에 격주로 PBS 중의 1 mg/mL의 ASCT2 발현 플라스미드 100 μg을 꼬리 맨 아랫 부분에 피내로 주사하였다. 최초 주사 후 28일째부터 2주 간격으로 시험 혈액을 수집하고, 유세포 분석으로 ASCT2 특이적 항체를 분석했다. 시험 혈액의 단계별 희석액을 ASCT2 또는 관련 없는 세포 표면 단백질을 발현하는 293F 세포와 배양하였다. 56일과 70일에 최대 특이적 역가의 마우스를 희생시켰다. 림프절과 비장으로부터 림프구를 단리하고, 폴리에틸렌 글리콜(로쉐 다이아그노틱스(Roche Diagnostics), 미국 인디애나 주 인디애나폴리스) 융합 방법에 따라 골수종 세포주 P3x/63Ag8.653과 1:1 비율로 융합시켰다. 융합된 세포를 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)을 함유하는 하이브리도마 성장 배지에서 선택하였다.
유세포 분석법 스크리닝 분석법
하이브리도마 상등액을 ASCT2를 발현하는 HEK 293F 세포에 대한 결합에 대해 평가하였다. 유세포 분석법을 통해 ASCT2 발현 HEK 293F 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 상등액을 ASCT2 발현 암 세포주 패널로의 유세포 분석법 염색으로 ASCT2 특이적 결합에 대해 추가로 확인하였다. 마지막으로, 확인된 상등액을 추가적인 결합 평가를 위해 인간 IgG1로 전환시켰다.
인간 항-ASCT2 IgG mAb 및 Fab의 클로닝 및 발현
하이브리도마를 한계 희석법에 의해 서브클로닝하였다. 모 하이브리도마를 위해 위에 설명한 바와 같이 유세포 분석법에 의해 ASCT2 특이적인 항체에 대해 단백질 A-친화도 정제된 IgG 서브클론의 상등액을 스크리닝하였다. 서브클로닝된 하이브리도마의 mRNA를 다이나비즈(Dynabeads) mRNA 다이렉트 키트(Direct Kit, 인비트로젠)를 이용하여 분리하였다. 슈퍼스크립트(SuperScript) III 역전사효소(인비트로젠) 및 무작위 헥사머 프라이머를 이용하여 cDNA의 제1 가닥을 합성하였다. 노바젠(Novagen®) 디제너레이트(degenerate) Ig-프라이머 세트(EMD 밀리포어, 카탈로그 #69830)를 이용한 PCR로 인간 Ig VL 및 VH 유전자를 증폭시켰다. PCR 증폭된 VL 및 VH 생성물을 플라스미드 pCR2.1-TOPO(인비트로젠) 내로 클로닝하고 시퀀싱했다. 각각의 하이브리도마로부터의 VH 및 VL 유전자를 인간 IgG카파 pOE 벡터 안으로의 클로닝을 위해 제한 효소를 첨가하여 PCR로 다시 증폭시켰는데, 여기서 VL은 인간 c-카파와 융합된 BssHII/BsiWI 자리에서 클로닝되었고, VH는 인간 IgG-1 중쇄 불변 부위(또는 Fab 생성을 위한 CH1 부위)와 융합된 BsrGI/SalI 자리에서 클로닝되었다. 그에 따른 pOE 플라스미드를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
항-ASCT2 항체를 Hek293F(인비트로젠) 또는 CHO-G22 세포에서 일시적으로 발현시켰다. Hek293F 세포에서의 발현을 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 293펙틴(fectinTM)(인비트로젠; Cat.#12347-019)을 이용하여 형질감염을 수행하였다. 세포를 프리스타일(FreeStyleTM) 293 발현 배지(인비트로젠; Cat. #12338-018)에 배양하고, 형질 전환 후 3일과 6일째에 배양 부피를 두 배로 늘렸다. 형질감염된 Hek293F 세포를 총 11일 동안 배양하였다. CHO-G22 세포에서의 발현을 위해, 제조사의 프로토콜을 이용하여 25 kDa 선형 폴리에틸렌이민(폴리사이언스(Polysciences), 미국 펜실베이니아 주 워링톤)을 이용하여 세포를 형질감염시켰다. 세포를 CD CHO 배지(인비트로젠)에서 배양하고, 사내 영양분 공급원을 격일로 공급하였다. 형질감염된 CHO-G22 세포를 총 12일 동안 배양하였다.
전체 길이의 인간 IgG를 단백질 A 크로마토그래피로 단리한 후, 결합을 유세포 분석법을 통해 다시 평가하였다. 도 2는 단리된 인간 IgG인 1e8, 3f7, 5a2, 9b3, 10c3, 16b8, 17c10, 및 17a10의 인간 ASCT2를 발현하는 세포에 대한 결합의 변화 배수를 모의 형질감염된 세포와 비교하여 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이다. 도면에서 보는 바와 같이, 전체 길이의 인간 IgG 중 몇몇은 ASCT2 결합 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3. 항체-약물 접합체(ADC)로서의 ASCT2 결합 항체
ASCT2 결합 항체의 ADC 매개성 세포독성의 평가
모 항체의 내재화를 확인하기 위해, 그리고 모 항체가 세포독성 페이로드를 전달할 수 있는지를 예측하기 위해, 제조사의 설명서에 따라 Hum-ZAP 항체 내재화 분석법(어드밴스드 타게팅 시스템즈, 미국 캘리포니아 주 샌디에고)으로 모 항체를 시험했다. 간략히 설명하자면, ASCT2 양성 WiDr 세포를 조직 배양물이 처리된 96-웰 플레이트의 웰당 1,000개 세포의 밀도로 배양 배지에 플레이팅하고, 37℃/5% CO2에서 밤새 부착되도록 하였다. 시험 품목을 제조하기 위해, 각각의 모 항체를 리보솜 불활성화 단백질인 사포린과 접합된 2차 항체(염소 항-인간 IgG)와 실온에서 30분 동안 배양하여 2차 접합체를 형성하였다. 그런 다음, 이 2차 접합체의 단계별 희석액을 제조하여, 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다.
72시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양한 후, 셀타이터-글로(CellTiter-Glo®) 발광 생존능 분석법(프로메가(Promega), 미국 위스콘신 주 매디슨)을 이용하여 상대적인 세포독성을 결정하였다. 간략히 설명하자면, 셀타이터-글로 시약을 각 웰에 첨가하여, 가볍게 진탕하며 실온에서 10분 동안 배양하였다. 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 엔비젼(EnVision®) 광도계를 이용하여 각 샘플의 흡광도를 560 nM에서 판독하였다. 모 항체 1E8 또는 17C10, 사포린에 화학적으로 연결된 항-ASCT2 항체(hIgG-사포린), 또는 사포린에 화학적으로 연결된 이소형 대조군으로 처리된 세포들의 상대적인 증식률(%)을 미처리 대조군 세포의 상대적인 생존능과 비교하였다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 상대적인 세포 증식률은 사포린 접합된 항체로 처리된 세포보다 사포린에 화학적으로 연결되지 않은 항-ASCT2 항체들로 처리된 세포에서 더 낮았다.
튜불라이신 페이로드와 고전적으로 접합시킨 항-ASCT2 항체들의 ADC 매개성 세포독성 평가
튜불라이신 페이로드에 접합된 항-ASCT2 항체에 의한 ADC 매개성 살해를 확인하기 위해, 리드 항체 1E8 및 17C10을 튜불라이신 독소 부류와 직접적으로 접합시키고, 접합된 항체를 이용한 세포독성 살해를 ASCT2 양성 결장암 세포에서 시험하였다. 간략히 설명하자면, SW48 세포를 조직 배양물이 처리된 96-웰 플레이트의 웰당 1,000개 세포의 밀도로 배양 배지에 플레이팅하고, 37℃/5% CO2에서 밤새 부착되도록 하였다. 시험 품목을 제조하기 위해, 튜불라이신 페이로드와 접합된 각각의 항체(ASCT2 리드 1E8 및 17C10, 이소형 대조군)를 순차적으로 희석하여 각 웰에 첨가하였다. 72시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양한 후, 위에 기술된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 생존능 분석법을 이용하여 상대적인 세포독성을 결정하였다.
다음 식에 의해 퍼센트 세포 생존능을 계산하였다: (처리된 샘플의 평균 발광/대조군 샘플의 평균 발광)x100. 그래프패드 프리즘 소프트웨어로의 로지스틱 비선형 회귀 분석을 이용하여 IC50 값을 결정하였다. 도 3b는 튜불라이신 AZ1508에 고전적으로 접합시킨 항-ASCT2 1E8, 항-ASCT2 17C10, 및 이소형 대조군 R347의 세포독성을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 이러한 도면은 항-ASCT2 항체 둘 다 비슷한 세포독성을 나타냄을 보여준다. 계산된 IC50 값을 아래 표 3에 나타내었다.
튜불라이신에 고전적으로 접합시킨 ASCT2 리드 항체에 의한 ADC 매개성 세포독성 살해
항체 클론 17c10 1e8 R347
IC50 (ng/ml) 45.98 34.83 NA
부위 특이적 접합을 위한 시스테인 돌연변이의 클로닝
표준적인 중첩 PCR 방법을 이용하여 항-ASCT2 항체 1E8 및 17C10의 CH2 부위의 아미노산 S239와 V240 사이에 시스테인 잔기를 도입하였다. "239 삽입" 또는 "239i"라 지칭되는 이 시스테인은 항-ASCT2 ADC 항체의 제조에서 세포독성 약물을 위한 접합 자리로서 작용할 것이다. Maia 삽입을 함유하는 중쇄 백본의 아미노산 서열을 서열 번호 9로 나타냈다. 도입된 시스테인을 함유하는 항체들을 반드시 아래에 기술된 바와 같이 튜불라이신 페이로드(튜불라이신 AZ1508) 또는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 페이로드(SG3249 또는 SG3315)에 접합시켰다.
말레이미드 함유 약물의 접합
ADC 페이로드(AZ1508, SG3249, SG3315)에 대해 평가되는 모든 화합물은 링커 및 항체의 티올 잔기에 용이하게 접합되는 말레이미드 기를 함유하여, 티올-말레이미드 연결을 형성한다. 말레이미드 기를 함유하는 세포독소(예컨대, 튜불라이신 1508)가 본 발명의 항-ASCT2 항체(예컨대, 17c10, 1e8) 내로 조작된 특이적인 시스테인 잔기에 접합될 수 있다. 대안적으로, 또는 선택적으로, 고전적인 접합 방법을 이용하여 세포독성제를 기술된 항체에 부착시킬 수 있다. 항체의 본래의 라이신 및 시스테인에 대한 세포독소의 접합 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. (조작된 시스테인 잔기에서의) 부위 특이적인 접합 및 (본래의 시스테인 잔기에서의) 고전적인 접합을 위한 대표적인 방법이 아래에 제공된다.
대표적인 부위 특이적 항체-약물 접합 공정은 (a) 유도체화 가능한 아미노산(예컨대, 시스테인)의 크기 사슬의 캡 제거 단계, (b) 산화 단계, (c) 페이로드(예컨대, 튜불라이신 1508과 같은 세포독성제) 접합 단계, 및 (d) 접합 시약 및 반응하지 않은 페이로드 제거에 의한 폴리싱(polishing) 단계를 포함한다. 예를 들어, 항체를 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 1X PBS에서 제형화하여 조작된 시스테인에 대한 접합을 수행할 수 있다. 항체당 40 당량의 트리스(2-카복시에틸)포스핀 염산염을 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하여 유리 티올을 생성하는 데 약한 환원법이 이용된다. 1 mM EDTA를 함유하는 1X PBS에서의 세 차례의 연속적인 투석을 이용하여 트리스(2-카복시에틸)포스핀 염산염을 제거하였다. 대안적으로, 탈염 컬럼을 이용하여 트리스(2-카복시에틸)포스핀 염산염을 제거할 수 있다. 약 20당량의 데하이드로아비에트산(dhAA) 첨가 및 실온에서 약 4시간 동안의 배양에 의해 항체 사슬 내 이황화결합이 다시 형성되도록 하였다.
접합을 위한 준비에서, 디메틸설폭사이드를 항-ASCT2 항체에 10 퍼센트 v/v까지 첨가하였다. (각각 2T 및 4T 약물 부하를 위해) 디메틸설폭사이드 중 튜불라이신 1508 페이로드 8당량 또는 12당량을 첨가하고, 이러한 혼합물을 실온에서 약 1시간 동안 배양하였다. 대안적으로, 약 16시간 동안 4℃에서 배양을 수행할 수 있다. 페이로드당 N-아세틸 시스테인(NAC) 약 4몰 당량(즉, 32 또는 48)을 첨가하여 반응을 퀀치시켰다. 제조사의 권고에 따라 수산화인회석 세라믹을 이용하여 접합된 항체로부터 유리 페이로드를 제거하였다. 원하는 경우, 최종 생성물을 완충액 교환처리할 수 있다. 순도 및 중쇄에 대한 접합을 확인하기 위해, 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 접합된 항체를 분석할 수 있다. 일부 예에서, 비환원 및 환원 SDS-PAGE가 순도 및 중쇄에 대한 접합을 확인하는 데 이용될 수 있다.
항체의 부분적인 환원에 이어 원하는 링커-약물과의 반응에 의해 본래의 시스테인 잔기에 무작위로 접합된 약물이 있는 ADC를 제조한다. pH 8.0의 DTT 약 3몰 당량을 첨가하고 약 37℃에서 약 2시간 동안 배양하여 5 mg/mL 농도의 항체를 부분적으로 환원시킨다. 그런 다음, 이러한 환원 반응물을 얼음에서 냉각시키고, 과량의 DTT를 예를 들어 정용여과를 통해 제거한다. 그런 다음, 링커-약물을 약 1:10의 링커-약물/티올 몰 비율로 첨가한다. 이러한 접합 반응을 약 10% v/v의 DMSO의 존재 하에 수행한다. 접합 후, 과량의 유리 시스테인(링커-약물에 대해 약 2배의 몰 비율)을 첨가하여 반응하지 않은 링커-약물을 퀀치시켜 시스테인-링커-약물 부가물을 생성한다. 반응 혼합물을 (예컨대, 소수성 상호작용 크로마토그래피로) 정제하고, PBS로 완충액 교환하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피와 환원된 역상 크로마토그래피와 같은 표준적인 방법을 이용하여 약물 부하 분포를 결정하였다.
실시예 4. ASCT2 결합 mAb 및 ADC의 특성 분석
결장직장암 세포에서 ASCT2 항체의 ASCT2 특이적 결합
일부 하이브리도마 클론의 결합이 ASCT2 항원에 대해 특이적인지를 결정하기 위해, ASCT2 발현의 shRNA 넉다운 후 결합을 평가하였다. 간략히 설명하면, WiDr 세포를 ASCT2 shRNA 또는 비 표적 shRNA(NTshRNA)를 발현하는 렌티바이러스로 형질변환시켰다. 두 가지 항-ASCT2 하이브리도마 클론 17c10 및 1e8의 결합을 감염 후 72시간에 평가하였다. 도 4에서 보이는 바와 같이, ASCT2 발현의 넉다운은 각각의 클론의 결합을 현저하게 제거하였고, ASCT2 mAb 17c10 및 1e8의 항원 특이적 결합을 추가로 확인시켜주었다.
항-ASCT2 접합되지 않은 항체의 내재화 동역학
표적 항원과의 결합 시 항체의 내재화는 원하는 ADC 효과를 달성하기 위한 필요조건이다. 따라서, ASCT2 항체의 내재화 특성을 조사하였다. WiDr 세포를 다양한 기간 동안 알렉사 488에 접합된 항-ASCT2 항체 17c10(17c10-알렉사 488)과 함께 배양하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 얼음 위에서 45분 동안 항-알렉사 488 항체와 함께 또는 항-알렉사 488 항체 없이 배양하여 세포 표면 신호를 퀀치시켰다. 전체 신호 및 (내재화된 항체를 나타내는) 퀀치된 신호의 형광 강도를 유세포 분석법으로 측정했다. 도 5a에서 보이는 바와 같이, 항-ASCT2 항체 17c10은 내재화를 나타내지 않은 이소형 대조 항체와 비교하여 시간 경과에 따라 증가된 내재화를 보여주었다.
세포독성 살해로 측정한 ASCT2-ADC(17c10AZ1508)의 내재화 동역학
세포를 다양한 시간 동안 튜불라이신 AZ1508에 접합된 항-ASCT2 항체(17C10-AZ1508)로 펄스시켰다. 그 후, ADC 함유 배지를 신선한 배지로 교체하고, 세포를 4일 동안 더 배양하였다. CTG 키트를 이용하여 세포 생존능을 측정하였다. 용량-반응 곡선을 미처리 대조군 세포의 백분율로 나타냈고, 대표적인 그래프를 도 5b로 도시하였다. 위에 기술된 바와 같이 IC50 값을 계산하였고, 결과를 아래 표 4에 요약하였다.
ASCT2-ADC(17c10AZ1508)의 내재화 동역학
IC 50 (ng/ml)
시간 17c10 1e8
10분 410.9 963.6
30분 295.5 819.6
120분 100 317
8시간 29.04 110.9
친화도 결정(ASCT2 발현 세포주에 대한 17c10 & 1e8의 결합)
ASCT2를 발현하는 인간, 시노몰구스 원숭이 및 CHO 유래 세포주를 이용하여 ASCT2 특이적 항체의 결합 친화도 및 교차 반응성을 평가하였다. 형광단 표지된 항체를 적정하여 겉보기 친화도를 측정하였다. 대표적인 결과를 아래 표 6에 요약하였고, 도 6에 도시하였다.
도 6은 ASCT2 발현 세포주에 대한 항-ASCT2 항체 17c10과 1e8, 그리고 이소형 대조군 R347의 결합으로부터 얻어진 유세포 분석 곡선을 보여준다. 인간 암 세포주 Cal27에 대한 결과는 도 6a에 나타냈다. 인간 암 세포주 FaDu에 대한 결과는 도 6b에 도시하였다. 인간 암 세포주 SSC15에 대한 결과는 도 6c에 도시하였다. 인간 암 세포주 WiDr에 대한 결과는 도 6d에 도시하였다. 인간 ASCT2를 안정적으로 발현하는 CHOK1 세포에 대한 결과는 도 6e에 도시하였다. 시노 ASCT2를 안정적으로 발현하는 CHOK1 세포에 대한 결과는 도 6f에 도시하였다. 시노 암 세포주 CynoMK1에 대한 결과는 도 6g에 도시하였다. 모의 형질감염시킨 CHOK1 세포에 대한 결과는 도 6h에 도시하였다. ASCT2 발현 세포주에 대한 17c10 및 1e8 결합에 대한 EC50 값을 아래 표 5로 나타냈다.
ASCT2 발현 세포주에 대한 17c10 및 1e8 결합에 대한 EC50 값
세포주 17c10 EC 50 (nM) 1E8 EC 50 (nM)
Fadu 3.8 6.8
SSC15 3.6 8.8
WiDr 7.0 5.8
Cal27 2.8 13
Cyno MK1 6.7 14.8
HuASCT2-CHOK1 8.6 8.1
CynoASCT2-CHOK1 9.6 28.4
ASCT2 항원에 대한 17c10 항체의 특이성
항-ASCT2 항체 17c10은 SLC1A 패밀리의 다른 구성원인 ASCT1(SLC1A4)에 대해 친화도를 나타내지 않는다. 도 7a에 도시된 그래프에서 보이는 바와 같이 shRNA에 의한 ASCT1 발현의 침묵화는 SKMEL-2 세포에서 17c10의 ASCT2 특이적 결합을 제거하지 않는다. 웨스턴 블롯 분석으로 shRNA의 넉다운 효율성을 추가로 확인하였다. 뿐만 아니라, 도 7b에 도시된 그래프에서 보이는 바와 같이 ASCT1 발현이 각각의 shRNA에 의해 침묵화된 세포의 세포독성 프로파일에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 결과를 표 6에 요약하였다.
17c10-ADC의 ASCT2 특이적 결합 및 세포독성 살해
NTshRNA ASCT1-shRNA1 ASCT1- shRNA2 ASCT2-shRNA
IC50 (ng/ml) 14.34 7.59 4.96 205.4
시노 ASCT2에 대한 ASCT2-ADC 항체의 교차 반응성 & 세포독성
튜불라이신 AZ1508에 접합된 항-ASCT2 결합 클론 17c10 및 1e8을 대상으로 CHOK1 세포에서 안정적으로 발현된 시노 ASCT2, CHOK1 세포에서 안정적으로 발현된 인간 ASCT2, 및 CHOK1 세포에서 발현된 대조군 분자에 대한 결합에 대해 평가하였다. 튜불라이신 1508 페이로드에 접합되었을 때 ASCT2 항체 17c10(도 8a) 및 ASCT2 항체 1e8(도 8b)은 인간 및 시노 ASCT2를 발현하는 CHOK1 세포에서 강력한 세포독성 활성을 보여주지만, 형질감염되지 않은 CHOK1 또는 CHOK1-ABCB5에서는 그렇지 않았다. 이러한 결과를 아래 표 7에 요약하였다.
17c10-ADC의 ASCT2 특이적 결합 및 세포독성 살해
결합 세포독성
EC50 (nM) IC50 (ng/ml)
17C10 1e8 17C10 1e8
HuASCT2 8.6 8.1 5.531 20.69
CynoASCT2 9.6 28.4 8.59 140.3
17c10의 생식세포화
17c10에 대한 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 VBASE 데이터베이스의 공지된 인간 생식세포 서열에 대해 정렬시키고, 가장 가까운 생식세포를 서열 유사성으로 확인하였다. VH 도메인의 경우, 이것은 IgVh4-34*01이었다. VL 도메인의 경우, 그것은 IgKv1-5*03이었다. 17c10의 경우, 이러한 생식세포화 공정은 VH 도메인의 1개 프레임워크 잔기 및 VL 도메인의 5개 잔기를 복귀시키는 것을 수반했다. VH 도메인에서, 이러한 복귀 돌연변이는 카밧 위치 82a에 있었는데, 여기서 트레오닌(T)이 세린(S)으로 복귀되었다. VL 도메인에서, 돌연변이는 카밧 위치 13, 21, 39, 70, 및 76에 있었는데, 카밧 위치 13에서는 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 복귀되었고, 카밧 위치 21에서는 류신(L)이 이소류신(I)으로 복귀되었으며, 카밧 위치 39에서는 아스파라긴(N)이 라이신(K)로 복귀되었고, 카밧 위치 70에서는 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로 복귀되었고, 카밧 위치 76에서는 트레오닌(T)이 세린(S)으로 복귀되었다. 이러한 돌연변이가 있는 VH 및 VL 도메인을 합성하고 기존의 VH 및 VL을 제한효소 절단 및 연결을 이용하여 교체함으로써 이러한 변경이 이루어졌다. 생식세포화된 17c10 및 본래 (비 생식세포화된) 17c10 둘 다를 IgG로서 발현시키고, 여러 ASCT2 발현 세포주에 대한 친화도를 유세포 분석법으로 평가하였다. 도 9a 내지 도 9d에 나타난 바와 같이, WiDr 세포에 대한, 또는 HuASCT2 또는 CyASCT2를 발현하는 CHO 세포에 대한, 생식세포화된 17c10 또는 모 17c10의 결합에는 전혀 차이가 없었다.
실시예 5. 다양한 암에서 ASCT2-ADC에 의한 세포독성 살해
위에 기술된 바와 같이 부위 특이적인 접합 자리를 통해 17c10 항체를 PBD(SG3315) 또는 튜불라이신(AZ1508) 페이로드와 접합시켰다. 약물-항체 비율(DAR)은 각 자산에 대해 약 2.0으로 추정되었다. 췌장암, 결장암, 폐암, 두경부 편평상피세포암종(HNSCC), 전립선암 및 ASCT2 음성 폐암으로부터와 같이 다양한 표시의 암세포를 이용하여 세포독성 분석을 수행하였다. 도 10a 내지 도 10f에 도시된 바와 같이, AZ1508에 접합된 17c10 ADC 항체는 튜불라이신에 결합된 대조 항체보다 더 높은 세포독성 활성을 나타냈다. 또한, SG3249 또는 SG3315에 접합된 항-ASCT2 항체 17c10는 튜불라이신 AZ1508에 결합된, 또는 PBD SG3249에 결합된, 또는 SG3315에 결합된 대조 항체보다 더 높은 세포독성 활성을 나타냈다. SG3249에 접합된 17c10을 이용하는 세포독성 분석으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 도 11a에 나타냈고, SG3315에 접합된 17c10을 이용하는 세포독성 분석으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 도 11b에 나타냈다. IC50 값을 아래 표 8에 요약하였다.
ASCT2-ADC에 의한 암세포 증식 억제
　 　 IC 50 (ng/ml)
표시 세포주 17c10-239i-AZ1508 17c10-239i-SG3315 17c10-239i-SG3249
결장 SW48 3.5 0.2 0.1
결장 HT29 2.5 2 1.8
결장 WiDR 1.9 0.25 0.4
결장 DLD1 17.1 11.5 10.3
결장 HCT116 25.42 6.54 5.625
HNSCC OE21 4.94 11.26 -
HNSCC FADU 82.7 17.5 15.88
폐-SSC H2170 4.1 3.7 3.5
폐-SCLC H69 >1000 200 189.4
폐-SC H2081 - - -
전립선 22RV1 34.44 4.299 ─
전립선 DU145 408.4 568.7 ─
전립선 PC-3 13.43 21.94 ─
췌장암 BXPC3 7.85 3.28 2.98
AML HL60 47.41 ─ 9.796
AML KG1 37.72 ─ 64.25
AML MOLM-13 69.21 ─ 0.1001
AML Mv4-11 75 ─ 0.0515
AML Nomo-1 45 ─ 9.9
AML TF-1A 5.57 ─ 0.17
버킷 Raji 76.66 ─ 7.89
MM H929 14.9 ─ 0.6966
MM OPM-2 0.8 ─ 1.503
실시예 6. ASCT2-ADC는 생체 내에서 종양 성장을 억제한다
모든 생체 내 절차는 AAALAC 인증 기관의 기관 지침에 따라 수행되었으며, 메디뮨 기관 동물 관리 및 이용 위원회(MedImmune, LLC Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. ASCT2-ADC 항체의 종양 세포 살해 능력을 시험하기 위해, WiDr(100 μl/ 106개 세포/마우스) 또는 원발성 췌장 종양(PDX)을 암컷 3~5주령의 누드 마우스(찰스 리버 래보래토리즈(Charles River Laboratories), 미국 매사추세츠 주 월밍턴)의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 몇 주간 길러 종양을 발달시켰다. 종양이 약 150~200 mm3에 이르면, 마우스를 무작위 배정하고 치료군(10마리/군)에 할당했다. 그 후, 상이한 용량의 항-ASCT2 ADC(17c10-Az1508 또는 17c10-SG3315 또는 17c10-SG3249) 또는 이소형 대조 약물-접합 항체를 마우스에 정맥 내 주사하였다. 처리된 이종이식 마우스의 체중 및 종양 부피를 각각의 기간 동안 모니터링하였다. 다음 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다: (최단 직경)2 x (최장 직경) x 0.5. 결과를 도 12a, 도 12b 및 도 12c에 나타냈다.
추가적으로, 다양한 수준의 ASCT2를 발현하는 상이한 하위 모집단을 나타내는 혈액학적 악성 종양 모델 패널에서 17c10-SG3249의 생체 내 효능을 평가하였다. 파종성 종양 이종이식 모델에서 매주 0.4 mg/kg (또는 0.5 mg/kg) 및 0.1 mg/kg의 용량으로 총 4회 용량의 ADC를 투여했다. 도 13a 및 도 13b에 도시된 바와 같이 카플란-마이어 곡선은 미처리 또는 이소형 ADC 대조군과 비교하여 17c10-SG3249 코호트의 경우 생존 이득의 상당한 증가를 보여준다. 여러 AML 이종이식 종양 모델에서 17c10-SG3249 투여는 SOC, 미처리 alc 이소형 대조군 ADC와 같은 다른 코호트와 비교하여 생존 이득의 실질적인 증가를 보여주었다. TF1a AML 모델에서, 17c10-SG3249는 이소형 대조군 ADC(66일)과 비교하여 우수한 활성(중간 생존 >205일)을 보여주었다. 마찬가지로, 17c10-SG3249는 몇몇 MM1.S 다발성 골수종(MM) 모델에서 강력한 종양 성장 억제 및 생존 이득을 보여주었다(중간 생존 123.5일 대 미처리 대조군의 경우 55.5일). 몇몇 혈액학적 악성 종양에서 17c10-SG3249에 대한 결과를 아래 표 9에 요약하였다.
혈액학적 중간 생존
모델 중간 생존기간(일)
미처리 이소형 ADC ASCT2-17C10-239i-SG3249
0.5mg/kg 0.4mg/kg 0.25mg/kg 0.1mg/kg 0.05mg/kg
TF1a 66 83 >205** >205* >205** >205**
MM.1S 55.5 63 123.5*** 117***
RAJI 16 17* 49.5*** 22*** 19**
697 20.5 22 68*** 46*** 36***
미처리로부터의 통계적 유의도(로그-랭크(만텔-콕스) 검정) - *** = P<0.0001, ** = P<0.001, * = P<0.01
실시예 7. ADC를 형성하기 위한 항-ASCT2 항체에 대한 화학적 모이어티의 접합
항-ASCT2 mAb의 정제방법을 개발했다. 간략히 설명하자면, 세포 배양물 상등액으로부터 단백질을 포획하고 공정 관련 및 생성물 관련 불순물을 제거하기 위해 수확한 세포 배양액을 맙셀렉트 슈어(MAbSelect Sure) 수지(GE 헬스케어)를 이용하여 수행된 단백질 A 포획 단계를 거치도록 하였다. 모든 공정 단계는 300 cm/hr의 선형 유속으로 수행되었다. 수지를 50 mM 트리스, pH 7.4로 평형화하고, 조정 배지를 30 g/L 수지의 로딩 챌린지(load challenge)까지 컬럼에 로딩하였다. 이러한 컬럼을 50 mM 트리스, pH 7.4로 재평형화한 다음, 불순물을 감소시키고 조정된 배지에 존재하는 과량의 경쇄를 줄이고자 최적화된 2회의 세척 단계에 노출시켰다. 1차 세척 단계는 50 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, pH 7로 구성되었고, 2차 세척 단계는 50 mM 아세트산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 5.0을 함유했다. 그런 다음, 컬럼을 50　mM 트리스, pH 7.4로 재평형화하고, 생성물을 25 mM 아세트산나트륨, pH 3.6으로 용리시켰다. 상승하는 쪽의 용리 피크 상의 0.5 OD로부터 하강 지점 상의 0.5 OD까지의 생성물을 수집하였다. 각 정제 사이클 후, 컬럼을 100 mM 아세트산으로 스트립핑한 다음, 50mM 트리스, pH 7.4로 재평형화하고, 0.1 N 수산화나트륨으로 위생 처리하고, 2% (v/v) 벤질 알코올, 100 mM 아세트산나트륨, pH 5.0에 보관하였다. 이 단계의 전형적인 수득률은 70~75%이다.
바이러스 불활성화를 위해 낮은 pH 처리를 수행하였다. 간략히 설명하자면, 1 M 아세트산을 첨가하여 맙셀렉트 슈어 생성물을 3.5의 목표 pH까지 조정하였다. 60분의 보류 시간 후, 1M 트리스를 첨가하여 용액을 7.4의 목표 pH까지 중화시켰다. 이후, 생성물을 여과하였다.
중간 정제 단계로서, 캡토 어드히어(Capto Adhere) 수지(GE 헬스케어)fmf 이용하여 혼합 모드 크로마토그래피를 수행했다. 이 컬럼을 유동통과(flowthrough) 모드로 조작하였다. 50mM 트리스, pH 7.4로 컬럼을 평형화하고, 중화된 단백질 용액을 컬럼에 로딩하였다. 불순물을 수지에 결합하지만, 생성물은 유동통과 풀에서 회수된다. 전형적인 단계 수득률은 80~84%였다.
양이온 교환 수지 HS 50(포로스(POROS))를 이용하여 폴리싱 단계를 수행하였다. 이 단계는 결합-용리 모드로 수행되며, 공정 관련 불순물을 더 줄이는 기능을 한다. 컬럼을 50 mM 트리스, pH 7.4로 평형화하고, 혼합 모드 크로마토그래피 단계로부터의 생성물을 컬럼에 로딩하였다. 그 후, 컬럼을 50　mM 트리스, pH 7.4로 세척한 다음, 50 mM 트리스, 150 mM 염화나트륨, pH 7.4로 세척하고, 50 mM 트리스, 400 mM 염화나트륨, pH 7.4로 용리시켰다. 상승하는 쪽의 용리 피크의 0.5 OD로부터 하강하는 쪽의 0.5 OD까지의 생성물을 수집하였다. 각 정제 사이클 후, 컬럼을 50 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, pH 7.4를 이용하여 스트립핑하고, 1 N 수산화나트륨으로 위생 처리하고, 0.1 N NaOH에 보관하였다. 이 단계의 전형적인 수득률은 95~98%였다.
30 kDa 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 펠리콘(Pellicon) 3 울트라셀(Ultracel) 멤브레인을 이용하여 정제된 mAb 중간물질을 농축하고, 정용여과에 의해 제형 완충액(20 mM 히스티딘, 240 mM 수크로스 pH 6.0)로 옮겼다. 최종 단백질 농도는 약 20 mg/ml이었다. 필요한 경우, 단백질은 접합 시까지 -80℃에 냉동 보관하였다. 아래 표 10은 단일클론성 항체 정제 과정 중 생성물 품질을 요약한 것이다.
항-ASCT2 항체 하류 공정에 걸친 공정 순도
공정 단계 HP SEC에 의한 단량체 순도 HCP (ng/mg) DNA (ng/mg)
MAb 셀렉트 슈어 98.0 % 2698 0.14
캡토 어드히어 99.0% 45 0.0004
HS50 99.2 % 27 0.002
튜불라이신 AZ1508과 항-ASCT2 항체의 접합
말레이미드 화학을 통해 두 개의 조작된 유리 시스테인 잔기에 튜불라이신(AZ1508)을 위치 지향적으로 접합시켜 항체-약물 접합체를 제조하였다.
정제된 mAb 중간물질을 해동시키고, 1 M 트리스 염기를 첨가하여 pH를 pH 7.0으로 조정하였다. 이러한 단백질 용액을 20　mM 히스티딘 완충액, pH 7.0으로 최종 농도가 7.5 mg/ml가 되도록 희석하고, EDTA를 1 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이러한 단백질을 적절한 반응 용기로 옮기고, 온도를 37℃로 조정하였다. 새롭게 제조된 50 mM 모액으로부터 환원제 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)을 TCEP:mAb = 30:1의 몰 비율로 첨가하였다. 이러한 용액을 37℃에서 3시간 동안 가볍게 교반하면서 배양하였다. 이 배양 시간 후, 20 mM 히스티딘/1 mM EDTA 완충액, pH 7.0에 대한 투석 또는 정용여과에 의해 환원제를 제거하였다. 회수된 생성물을 0.22 μm 필터로 여과하였다. 산화를 위해, 이러한 단백질 용액을 데하이드로아스코르브산(DHA)과 10:1(DHA:mAb)의 몰 비율로 배양하였다. (50 rpm 혼합 속도로) 가볍게 교반하면서 4시간 동안 22~25℃에서 배양을 수행하였다. 이 시간 후, DMSO 중의 10 mM 모액으로부터 튜불라이신 페이로드(AZ1508)를 8:1 페이로드:mAb의 몰 비율로 첨가하였다. 추가적인 DMSO를 점적 첨가하여 10% (v/v)의 최종 농도에 도달하게 하였다. 이러한 혼합물을 가볍게 교반하면서 22~25℃에서 1시간 동안 교반하여 항체-약물 접합체가 형성되도록 하였다. 그런 다음, 100 mM 모액으로부터 N-아세틸시스테인(NAC)을 5:1의 NAC:튜불라이신 몰 비율로 첨가하여 반응을 퀀치시켰다.
단백질 단편, 응집체 및 과량의 유리 튜불라이신 페이로드를 제거하기 위해, 수산화인회석 세라믹(CHT) I형(바이오래드(Biorad))을 이용하여 접합 후 정제를 수행하였다. 컬럼을 180 cm/hr의 선형 유속의 결합-용리 모드로 조작하였다. 퀀치된 항체-약물-접합체 혼합물에 300 mM 모액으로부터 인산나트륨을 10 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. CHT 컬럼을 300 mM 인산나트륨, pH 6.5로 미리 평형화하고, 10 mM 인산나트륨, pH 6.5로 평형화하였다. 항체-약물 접합체 혼합물을 20 g/L의 로딩 챌린지까지 로딩하고, 컬럼을 10 mM 인산나트륨, pH 6.5로 재평형화하였다. 10배의 컬럼 부피에 걸쳐 10 mM 인산나트륨, pH 6.5 중 1 M 염화나트륨까지 선형 기울기로 용리를 수행하였다. 용리 피크를 분획화하고, 분획을 HP SEC로 분석하였다. 단량체 순도 >95%인 접합된 단백질을 함유하는 분획을 모았다. 각 정제 사이클 후, 컬럼을 300 mM 인산나트륨, pH 6.5로 스트리핑하고, 1 N 수산화나트륨으로 위생 처리하고, 0.1 N 수산화나트륨에 보관하였다.
모은 항체 약물 접합체(ADC)를 30 kDa MWCO의 재생 셀룰로스 또는 PES 멤브레인을 이용하여 접선 유동 여과에 의해 최종 제형 완충액으로 농축 교환하였다. 10% 모액으로부터 부형제 PS80을 첨가하였다. 최종 ADC 농도는 20mM 히스티딘, 240 mM 수크로스, 0.02 % PS80, pH 6.0 중에서 5 mg/ml이었다. 이러한 조건 하에서, 생성된 ADC는 <12%의 접합되지 않은 중쇄, 75 내지 82%의 단일 접합된 중쇄, 및 1.8~1.9의 약물 대 항체 비율을 보여주었다.
피롤로벤조디아제핀(PBD) SG3249와 항-ASCT2 항체의 접합
말레이미드 화학을 통해 두 개의 조작된 유리 시스테인 잔기에 PBD(SG3249)를 위치 지향적으로 접합시켜 항체-약물 접합체를 제조하였다. 정확한 조건은 상이하지만, 공정 순서는 위에 요약된 튜불라이신 접합에 대해 논의된 것과 동일하다.
정제된 mAb 중간물질을 해동시키고, 1 M 트리스 염기를 첨가하여 pH를 pH 7.0으로 조정하였다. PBD 접합체의 환원, 산화 및 접합 단계는 20mM 히스티딘, 1 mm EDTA, pH 7.0 중에 20 mg/ml의 단백질 농도로 수행하였다. 이러한 단백질을 적절한 반응 용기로 옮기고, 온도를 37℃로 조정하였다. 새롭게 제조된 50 mM 모액으로부터 환원제 디티오트레이톨(DTT)을 DTT:mAb = 30:1의 몰 비율로 첨가하였다. 이러한 용액을 37℃에서 1시간 동안 가볍게 교반하면서 배양하였다. 이 배양 시간 후, 20 mM 히스티딘/1 mM EDTA 완충액, pH 7.0에 대한 투석 또는 정용여과에 의해 환원제를 제거하였다. 회수된 생성물을 0.22 μm 필터로 여과하였다. 산화를 위해, 이러한 단백질 용액을 데하이드로아스코르브산(DHA)과 10:1(DHA:mAb)의 몰 비율로 배양하였다. (50 rpm 혼합 속도로) 가볍게 교반하면서 1시간 동안 22~25℃에서 배양을 수행하였다. 이 시간 후, DMSO 중의 10 mM 모액으로부터 PBD 페이로드(SG3249)를 8.5:1 페이로드:mAb의 몰 비율로 첨가하였다. 추가적인 DMSO는 이 반응물에 첨가하지 않았지만, DHA 및 페이로드 첨가로 인해 유효한 DMSO 농도는 약 11.4%였다. 이러한 혼합물을 가볍게 교반하면서 22~25℃에서 1시간 동안 교반하여 항체-약물 접합체가 형성되도록 하였다. 그런 다음, 100 mM 모액으로부터 N-아세틸시스테인(NAC)을 4:1의 NAC:PBD 몰 비율로 첨가하여 반응을 퀀치시켰다.
단백질 단편, 응집체 및 과량의 유리 PBD 페이로드를 제거하기 위해, 수산화인회석 세라믹(CHT) I형(바이오래드)을 이용하여 접합 후 정제를 수행하였다. 컬럼을 180 cm/hr의 선형 유속의 결합-용리 모드로 조작하였다. 1 M 트리스 염기를 첨가하여 퀀치된 항체-약물 반응 혼합물의 pH를 pH 7.0으로 조정하였다. CHT 컬럼을 300 mM 인산나트륨, pH 6.5로 미리 평형화하고, 10 mM 인산나트륨, pH 6.5로 평형화하였다. 항체-약물 접합체 혼합물을 20 g/L의 로딩 챌린지까지 로딩하고, 컬럼을 10 mM 인산나트륨, pH 6.5로 재평형화하였다. 그런 다음, 결합된 단백질을 10 mM 인산나트륨, 25 mM 카프릴산나트륨, pH 6.5로 세척하여 과량의 유리 약물을 제거하고, 10 mM 인산나트륨, pH 6.5로 재평형화하였다. 10배의 컬럼 부피에 걸쳐 10 mM 인산나트륨, pH 6.5 중에서 0.3 M부터 1 M 염화나트륨까지의 선형 기울기로 용리를 수행하였다. 용리 피크를 분획화하고, 모든 분획을 HP SEC로 분석하였다. 단량체 순도 >95%인 접합된 단백질을 함유하는 분획을 모았다. 각 정제 사이클 후, 컬럼을 2 M 염화나트륨으로 스트리핑하고, 1 N 수산화나트륨으로 위생 처리하고, 0.1 N 수산화나트륨에 보관하였다.
ADC를 30 kDa MWCO의 재생 셀룰로스 또는 PES 멤브레인을 이용하여 접선 유동 여과에 의해 최종 제형 완충액으로 농축 교환하였다. 10% 모액으로부터 부형제 PS80을 첨가하였다. 최종 ADC 농도는 20mM 히스티딘, 240 mM 수크로스, 0.02 % PS80, pH 6.0 중에서 5 mg/ml이었다.
아미노산 서열:
본래 17c10 VH; 서열 번호 1
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGGANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGQGKNWHYDYFDYWGQGTLVTVSSA
본래 17c10 VL; 서열 번호 2
DIQMTQSPSTLSTSVGDRVTLTCRASQSIRSWLAWYQQNPGKAPKLLIYKASILKIGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYYSYSRTFGQGTKVEIK
본래 1e8 VH; 서열 번호 3
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIPQPPGKGVEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISSDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGQGKNWNYDYFDYWGQGTLVTVSSA
본래 1e8 VL; 서열 번호 4
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTLTCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSFSRTFGQGTKVEIK
생식세포화된 17c10 VH; 서열 번호 5
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGGANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGQGKNWHYDYFDYWGQGTLVTVSSA
생식세포화된 17c10 VL; 서열 번호 6
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASILKIGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYSRTFGQGTKVEIK
생식세포화된 1e8 VH; 서열 번호 7
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGQGKNWNYDYFDYWGQGTLVTVSSA
생식세포화된 1e8 VL; 서열 번호 8
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLKSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSFSRTFGQGTKVEIK
Maia 중쇄 백본(시스테인 삽입은 박스 및 굵은 활자체로 나타냄): 서열 번호 9
Figure pct00006
17c10 생식세포화된 HCDR1 (카밧 넘버링) 서열 번호 10
GYYWS
17c10 생식세포화된 HCDR2 (카밧 넘버링); 서열 번호 11
EIHHSGGANYNPSLKS
17c10 생식세포화된 HCDR3 (카밧 넘버링); 서열 번호 12
GQGKNWHYDYFDY
17c10 생식세포화된 LCDR1 (카밧 넘버링); 서열 번호 13
RASQSIRSWLA
17c10 생식세포화된 LCDR2 (카밧 넘버링); 서열 번호 14
KASILKI
17c10 생식세포화된 LCDR3 (카밧 넘버링); 서열 번호 15
QQYYSYSRT
1e8 생식세포화된 HCDR1 (카밧 넘버링); 서열 번호 16
GYYWS
1e8 생식세포화된 HCDR2 (카밧 넘버링); 서열 번호 17
EIHHSGSTNYNPSLKS
1e8 생식세포화된 HCDR3 (카밧 넘버링); 서열 번호18
GQGKNWNYDYFDY
1e8 생식세포화된 LCDR1 (카밧 넘버링); 서열 번호 19
RASQSIRSWLA
1e8 생식세포화된 LCDR2 (카밧 넘버링); 서열 번호 20
KASSLKS
1e8 생식세포화된 LCDR3 (카밧 넘버링); 서열 번호 21
QQYYSFSRT
공통 HCDR2; 서열 번호 22
EIHHSGX1X2NYNPSLKS; 여기서 X1은 S 또는 G이고, X2는 A 또는 T임.
공통 HCDR3; 서열 번호 23
GQGKNWX1YDYFDY; 여기서 X1은 H 또는 N임.
공통 LCDR2; 서열 번호 24
KASX1LKX2; 여기서 X1은 I 또는 S이고, X2는 I 또는 S임.
공통 LCDR3; 서열 번호 25
QQYYSX1SRT; 여기서 X1은 Y 또는 F임.
인간 카파 경쇄; 서열 번호 26
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
특정 구현예에 대한 전술한 설명은 다른 이들이 과도한 실험없이 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않고 다양한 적용을 위해 당해 기술 내의 지식을 적용하여 그러한 구체적인 구현예를 용이하게 변경 및/또는 채택할 수 있도록 본 발명의 일반적인 성질을 완전히 드러낼 것이다. 따라서, 그러한 채택 및 변경은 본 설명에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 구현예의 균등물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된 것이다. 본 설명의 어구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이지 제한의 목적이 아니며, 본 명세서의 어구 또는 용어는 이러한 교시 및 지침의 견지에서 당업자에 의해 해석된다고 이해해야 한다. 본 발명을 다음의 청구항에 의해 추가적으로 기술한다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE, LLC <120> BINDING MOLECULES SPECIFIC FOR ASCT2 AND USES THEREOF <130> ASCT2-100-WO-PCT <140> PCT/US2016/061219 <141> 2016-11-10 <150> 62/253,774 <151> 2015-11-11 <150> 62/253,371 <151> 2015-11-10 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His His Ser Gly Gly Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gln Gly Lys Asn Trp His Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ile Leu Lys Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Pro Gln Pro Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gln Gly Lys Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Ser Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His His Ser Gly Gly Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gln Gly Lys Asn Trp His Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ile Leu Lys Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gln Gly Lys Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Ser Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 10 Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 11 Glu Ile His His Ser Gly Gly Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 12 Gly Gln Gly Lys Asn Trp His Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 13 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 14 Lys Ala Ser Ile Leu Lys Ile 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 15 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg Thr 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 16 Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 17 Glu Ile His His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 18 Gly Gln Gly Lys Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 19 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 20 Lys Ala Ser Ser Leu Lys Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 21 Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Ser Arg Thr 1 5 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Gly" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> /replace="Thr" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 22 Glu Ile His His Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Asn" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 23 Gly Gln Gly Lys Asn Trp His Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="Ser" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace="Ser" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 24 Lys Ala Ser Ile Leu Lys Ile 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace="Phe" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 25 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg Thr 1 5 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 27 His His His His His His 1 5

Claims (20)

  1. 중성 아미노산 운반체 2(ASCT2)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 이때, 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄 가변 부위(VH)의 세 개의 중쇄 상보성 결정 부위(HCDR) 및 경쇄 가변 부위(VL)의 세 개의 경쇄 상보성 결정 부위(LCDR)를 포함하고, 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 10 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열 번호 11 또는 서열 번호 17의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열 번호 12 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열의 HCDR3, 서열 번호 13 또는 서열 번호 19의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열 번호 14 또는 서열 번호 20의 아미노산 서열의 LCDR2, 및 서열 번호 15 또는 서열 번호 21의 아미노산 서열의 LCDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, VH는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 7로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 8로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, VH는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, VH는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편은 239번 위치의 세린(S)과 240번 위치의 발린(V) 사이에 시스테인(C) 삽입을 포함하는 IgG 불변 부위를 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 이러한 항체는 서열 번호 9의 아미노산 서열의 중쇄를 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 상의 ASCT2에 이러한 항체 결합 시, 항체가 세포 내로 내재화되는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 카파 불변 부위 및 인간 람다 불변 부위로 이루어지는 군으로부터 선택된 경쇄 불변 부위를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  9. 제9항에 있어서, 이러한 항체는 서열 번호 26의 인간 카파 불변 부위를 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항미생물제, 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 지질, 생물학적 반응 조절제, 약제, 림포카인, 이종 항체, 이종 항체의 단편, 검출 가능한 표지, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 방사성 동위원소, 및 임의의 상기 세포독소 중 둘 이상의 조합물로 구성되는 군으로부터 선택된 세포독소에 추가로 접합된 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 세포독소에 접합되는 항체 또는 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 이러한 세포독소는 튜불라이신 유도체 및 피롤로벤조다이제핀으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 이러한 튜불라이신 유도체는 튜불라이신 AZ1508인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  14. 제12항에 있어서, 이러한 피롤로벤조디아제핀은 SG3315 및 SG3249로부터 선택되는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 이러한 항체는 인간 ASCT2 및 시노몰구스 원숭이 ASCT2에 결합하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항에 있어서, 이러한 항체는 인간 ASCT1에 특이적으로 결합하지 않는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 조합물.
  19. 제18항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편의 제조방법.
  20. 치료를 필요로 하는 대상체에 유효량의, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 제17항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 ASCT2의 과발현을 특징으로 하는 암의 치료방법.
KR1020187015380A 2015-11-10 2016-11-10 Asct2에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 KR20180073675A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562253371P 2015-11-10 2015-11-10
US62/253,371 2015-11-10
US201562253774P 2015-11-11 2015-11-11
US62/253,774 2015-11-11
PCT/US2016/061219 WO2017083451A1 (en) 2015-11-10 2016-11-10 Binding molecules specific for asct2 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180073675A true KR20180073675A (ko) 2018-07-02

Family

ID=57421946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187015380A KR20180073675A (ko) 2015-11-10 2016-11-10 Asct2에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도

Country Status (30)

Country Link
US (2) US10829554B2 (ko)
EP (2) EP3719039B1 (ko)
JP (1) JP6898925B2 (ko)
KR (1) KR20180073675A (ko)
CN (1) CN108290949B (ko)
AU (1) AU2016352967A1 (ko)
BR (1) BR112018008983A2 (ko)
CA (1) CA3003468C (ko)
CL (1) CL2018001238A1 (ko)
CO (1) CO2018004930A2 (ko)
CY (1) CY1123525T1 (ko)
DK (1) DK3374398T3 (ko)
ES (2) ES2959663T3 (ko)
HK (1) HK1258317A1 (ko)
HR (1) HRP20200882T1 (ko)
HU (1) HUE050312T2 (ko)
IL (1) IL259036B (ko)
LT (1) LT3374398T (ko)
MX (1) MX2018005541A (ko)
MY (1) MY192146A (ko)
PL (1) PL3374398T3 (ko)
PT (1) PT3374398T (ko)
RS (1) RS60389B1 (ko)
RU (1) RU2710194C9 (ko)
SG (2) SG11201803068YA (ko)
SI (1) SI3374398T1 (ko)
SM (1) SMT202000285T1 (ko)
TW (1) TWI726936B (ko)
WO (1) WO2017083451A1 (ko)
ZA (1) ZA201803841B (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201832778A (zh) * 2016-11-10 2018-09-16 美商麥迪紐有限責任公司 對ａｓｃｔ２具有特異性的結合分子及其用途
US20220047715A1 (en) * 2018-09-11 2022-02-17 The Johns Hopkins University Force-dependent drug release system to enhance selective killing and minimize adverse effects in cancer treatment
KR20210106467A (ko) 2018-12-21 2021-08-30 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 튜불리신 및 단백질-튜불리신 접합체
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
EP4382120A1 (en) * 2022-12-05 2024-06-12 Institut Regional du Cancer de Montpellier Anti-slc1a4 monoclonal antibodies and uses thereof
WO2024243340A1 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Tandem fusogens and related lipid particles
EP4471061A1 (en) * 2023-06-01 2024-12-04 Emergence Therapeutics AG Anti-asct2-antibodies and adcs derived therefrom
CN118406145B (zh) * 2024-05-29 2024-11-15 北京励和同创生物科技有限公司 一种抗磷酸化ASC_Tyr 144抗体及其应用

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58180487A (ja) 1982-04-16 1983-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗生物質ｄｃ−８１およびその製造法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE3588239T3 (de) 1985-03-30 2007-03-08 Kauffman, Stuart A., Santa Fe Verfahren zum Erhalten von DNS, RNS, Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen durch DMS-Rekombinant-Verfahren
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5763192A (en) 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2057923A1 (en) 1989-05-16 1990-11-17 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
CA2507749C (en) 1991-12-13 2010-08-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6706484B1 (en) 1995-08-18 2004-03-16 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
ATE482275T1 (de) 1999-07-02 2010-10-15 Morphosys Ag Erzeugung spezifischer bindungspartner die an von genomischen dns-fragmenten oder ests kodierten (poly)peptiden binden
CA2431600C (en) 2000-12-12 2012-04-17 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
AU2003266233A1 (en) 2002-07-09 2004-01-23 Morphochem Aktiengesellschaft Fur Kombinatorische Chemie Novel tubulysin analogues
WO2004005326A2 (de) 2002-07-09 2004-01-15 Morphochem Aktiengellschaft Fu Tubulysinkonjugate
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
US7557189B2 (en) 2002-11-07 2009-07-07 Immunogen Inc. Anti-CD33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
DE10254439A1 (de) 2002-11-21 2004-06-03 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Tubulysine, Herstellungsverfahren und Tubulysin-Mittel
WO2005075514A2 (en) 2004-03-10 2005-08-18 Lonza Ltd. Method for producing antibodies
WO2006024497A1 (en) 2004-08-30 2006-03-09 Lonza Biologics Plc. Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies
US20090123388A1 (en) * 2005-01-14 2009-05-14 Medical College Of Georgia Research Institute Prodrugs of Short-Chain Fatty Acids and Treatment Methods
EP2389950A1 (en) * 2006-03-23 2011-11-30 Novartis AG Anti-tumor cell antigen antibody therapeutics
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
FR2912314B1 (fr) 2007-02-09 2012-08-03 Geneuro Sa Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w.
US8476451B2 (en) 2007-07-20 2013-07-02 The Regents Of The University Of California Tubulysin D analogues
US20110263650A1 (en) 2007-07-20 2011-10-27 Helmholtz-Zentrum Für Infektions-Forschung Gmbh Tubulysin D Analogues
AU2008316835B2 (en) 2007-10-25 2015-07-16 Endocyte, Inc. Tubulysins and processes for preparing
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
US8168586B1 (en) 2007-11-21 2012-05-01 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
EP2287174B8 (en) 2008-01-18 2016-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of antibody fragments by apatite chromatography
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
US8268592B2 (en) * 2008-07-17 2012-09-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Anti-system ASC amino acid transporter 2 (ASCT2) antibody
EP2352526A1 (en) 2008-09-19 2011-08-10 Protox Therapeutics Inc. Treating cancer stem cells using targeted cargo proteins
WO2010054010A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Fabrus Llc Anti-dll4 antibodies and uses thereof
JP5812869B2 (ja) * 2010-01-15 2015-11-17 協和発酵キリン株式会社 抗システムａｓｃアミノ酸トランスポーター２（ａｓｃｔ２）抗体
SG187728A1 (en) 2010-08-06 2013-03-28 Endocyte Inc Processes for preparing tubulysins
CN104603618A (zh) 2012-05-25 2015-05-06 新加坡国立大学 识别胎儿成红血细胞的方法
CN104837502B (zh) 2012-10-12 2018-08-10 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AR100006A1 (es) 2014-04-11 2016-08-31 Medimmune Llc Derivados de tubulisina
RU2711485C2 (ru) * 2014-04-11 2020-01-17 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Конъюгированные соединения, содержащие сконструированные с цистеином антитела
WO2015155345A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune Limited Antibodies and antibody-drug conjugates
RU2016144176A (ru) 2014-04-11 2018-05-14 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Биспецифические антитела к her2
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor
TW201832778A (zh) 2016-11-10 2018-09-16 美商麥迪紐有限責任公司 對ａｓｃｔ２具有特異性的結合分子及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
HUE050312T2 (hu) 2020-11-30
MY192146A (en) 2022-08-01
CY1123525T1 (el) 2022-03-24
RU2710194C2 (ru) 2019-12-24
US10829554B2 (en) 2020-11-10
NZ743023A (en) 2021-08-27
MX2018005541A (es) 2018-08-01
JP6898925B2 (ja) 2021-07-07
CL2018001238A1 (es) 2018-10-12
JP2018535674A (ja) 2018-12-06
HK1258317A1 (zh) 2019-11-08
PL3374398T3 (pl) 2020-08-24
CN108290949B (zh) 2021-12-14
CA3003468A1 (en) 2017-05-18
RU2018120695A3 (ko) 2019-12-16
CA3003468C (en) 2024-06-18
IL259036B (en) 2020-04-30
SMT202000285T1 (it) 2020-07-08
EP3374398B1 (en) 2020-03-18
SI3374398T1 (sl) 2020-07-31
US20180273617A1 (en) 2018-09-27
RU2018120695A (ru) 2019-12-16
TWI726936B (zh) 2021-05-11
DK3374398T3 (da) 2020-06-08
EP3719039A1 (en) 2020-10-07
HRP20200882T1 (hr) 2020-09-04
WO2017083451A8 (en) 2018-02-01
EP3374398A1 (en) 2018-09-19
ES2959663T3 (es) 2024-02-27
ES2796560T3 (es) 2020-11-27
TW201726738A (zh) 2017-08-01
CO2018004930A2 (es) 2018-11-30
RS60389B1 (sr) 2020-07-31
WO2017083451A1 (en) 2017-05-18
IL259036A (en) 2018-06-28
SG11201803068YA (en) 2018-05-30
AU2016352967A1 (en) 2018-06-21
US11608375B2 (en) 2023-03-21
RU2710194C9 (ru) 2020-09-14
LT3374398T (lt) 2020-09-10
SG10202103712VA (en) 2021-05-28
PT3374398T (pt) 2020-06-16
BR112018008983A2 (pt) 2018-10-30
US20210024629A1 (en) 2021-01-28
ZA201803841B (en) 2019-04-24
CN108290949A (zh) 2018-07-17
EP3719039B1 (en) 2023-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20190083654A (ko) Asct2에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
US11608375B2 (en) Binding molecules specific for ASCT2 and uses thereof
US9125896B2 (en) EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof
EP3315512A1 (en) Method for selectively manufacturing antibody-drug conjugate
TW202330036A (zh) 抗體-藥物結合物之製造方法
EP3095797A1 (en) Anti dll3 antibodies and methods of use thereof
CA3231632A1 (en) Antibody-drug conjugate for use in methods of treating chemotherapy-resistant cancer
TW202400644A (zh) 針對ＦＲα之結合分子
NZ743023B2 (en) Binding molecules specific for asct2 and uses thereof
AU2015252047A1 (en) Novel EGFR-Binding Molecules and Immunoconjugates Thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20180530

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20201216

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20230216

Patent event code: PE09021S01D

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20230809

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20230216

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I