KR20180070117A

KR20180070117A - 인산을 이용하여 생합성된 메발론산으로부터 메발로노락톤을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20180070117A
Application number: KR1020160172410A
Authority: KR
Inventors: 이평천; 김진원; 윤희찬
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2018-06-26
Also published as: KR101915272B1

Abstract

본 발명은 인산을 이용하여 생합성된 메발론산으로부터 메발로노락톤을 제조하는 방법을 개시한다. 본 발명은 불순물이 거의 생성되지 않는 고순도의 메발로노락톤을 얻을 수 있는 효과를 가진다.

Description

인산을 이용하여 생합성된 메발론산으로부터 메발로노락톤을 제조하는 방법{Method for preparing mevalonolactone from biosynthesized mevalonic aicd using phosphoric acid}

본 발명은 인산을 이용하여 생합성된 메발론산으로부터 메발로노락톤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

메발론산은 생물에서 코엔자임 큐텐(coenzyme Q10), 스쿠알렌(squalene), 콜레스테롤(cholesterol), 이소프레노이드(isoprenoid) 등의 생합성에 이용되는 중간대사체로 알코올 작용기와 카르복실 작용기를 양쪽 끝에 가지고 있는 구조이며, 물에 잘 녹고 극성 용매에도 잘 녹는다. 메발론산은 3위 탄소가 비대칭탄소원자이며 R 형만이 생물학적으로 생산되고 이용된다.

메발론산의 생합성 과정을 보면, 도 1에서 확인되듯이 2 분자의 아세틸 코엔자임 A(acetyl-CoA)를 전구체로 하여 아세토아세틸 코엔자임 A(acetoacetyl-CoA)와 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A(HMGCoA; hydroxymethylglutaryl CoA)의 생성을 거쳐 이루어진다.

2 분자의 아세틸 코엔자임 A로부터 아세토아세틸 코엔자임 A의 생성에는 아세토아세틸 코엔자임 A 합성효소(acetoacetyl-CoA synthase, acetyl-CoA acetyltransferase or acetoacetyl-CoA thiolase, 이하 "AtoB"), 아세토아세틸 코엔자임 A로부터 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A의 생성에는 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 합성효소(HMG-CoA synthase, 이하 "HMGS"), 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A로부터 메발론산의 생성에는 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 환원효소(HMG-CoA reductase, 이하 "HMGR")가 각각 관여하며, AtoB를 암호화하는 유전자는 phaA, mvaE, atoB 등으로 알려져 있고, HMGS를 암호화하는 유전자는 HMGS, mvaS 등으로 알려져 있으며, HMGR를 암호화하는 유전자는 HMGR, mvaA, mvaE 등으로 알려져 있다(Journal of Biotechnology 140:218.226, 2009; NATURE BIOTECHNOLOGY 21:796-802, 2003; Metabolic Engineering 11:13-19, 2009; Clinical Biochemistry 40:575-584, 2007; Arch Biochem Biophys. 505(2):131-143, 2011)

메발론산과 메발로노락톤은 현재 산업적 응용범위가 넓어지고 있는 추세이며, 화장품 첨가물이나, 생분해성 폴리머 생산, 키랄 화합물생산에 사용되고 있다. 특히 화장품 원료로 사용 시 피부 세포에 흡수되어 항노화, 항산화, 보습, 피부 장벽 재생, 주름 개선 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 실제 메발론산은 피부에 처리하면 손상에 대한 피부 내성을 증대시키고 세균이나 외부 자극으로부터 피부를 보호해 주고 피부의 수분 유지를 도와주는 막인 피부 장벽이 손상으로부터 복원되는 것을 촉진하는 것으로 보고되었다.

메발로론산은 R형의 메발론산만이 생물학적으로 생산되고, 또한 이용되고 있으며, 화학적으로 합성된 라세믹 혼합물 형태(R형 50%와 S형 50%의 혼합물)의 메발론산은 거기서 R형을 분리하는 것이 용이하지 아니하여 경제적이지 못하다.

메발론산을 메발로노락톤으로 전환시키는 방법으로 기존에 황산을 이용하여 왔으나(발명의 명칭이 "Processes for conversion of biologically derived mevalonic acid"인 국제공개 WO 2016085987 A1와, 발명의 명칭이 "메발론산 또는 메발로노락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물, 및 이를 이용한 메발론산 또는 메발로노락톤의 제조방법"인 한국 공개특허 제10-2015-0134512호 등 참조), 황산을 이용할 경우 과량의 부산물인 언하이드로메발로노락톤(Anhydromevalonolactone)이 생성되어 전환 수율이 낮은 문제점을 갖고 있다(M Xiong 2014 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America vol 111 no. 23 pp8357-8362).

본 발명은 생합성된 메발론산을 메발로노락톤으로 전환할 때 인산을 이용할 경우 불순물이 생성되지 않아 순도도 높고 전환 수율이 높음을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명의 목적은 인산을 이용하여 생합성된 메발론산으로부터 메발로노락톤을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 기타의 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 메발론산 생합성 관련 유전자로 형질전환된 숙주 미생물을 배양하여 메발론산을 생합성하고 활성탄으로 배지 성분을 제거하여 생합성된 메발론산을 준비한 후, 인산(phosphoric acid)을 처리하여 메발로노락톤의 전환을 유도할 경우, 불순물이 거의 생성되지 않음으로써 순도가 높고 전환 수율이 높은 메발로노락톤이 얻어짐을 확인하였다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, (a) 생합성된 메발론산을 준비하는 단계, (b) 그 생합성된 메발론산에 인산을 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하여 구성된다.

본 명세서에서, 메발론산(mevalonic acid)은 메발로네이트(mevalonate) 상호 등가적으로 사용된다.

또 본 명세서에서, "생합성된 메발론산"은 화학적으로 합성되지 않고 생물학적으로 합성된 메발론산을 의미한다. 이는 R 형의 메발론산만으로 구성되게 된다.

또 본 명세서에서, "인산"은 당업계에서 인산으로 인식되고 있는 모든 인산, 즉 오산화인이 수화하여 생기는 일련의 산을 의미한다. 구체적으로 메타인산, 피로인산, 오쏘인산, 삼인산, 사인산, 폴리인산 등을 포함하는 의미이다. 바람직하게는 오쏘인산(orthophosphoric acid, 정인산, H₃PO₄)을 의미한다.

본 발명의 방법에서, 상기 (a) 생합성된 메발론산을 준비하는 단계는 통상 메발론산의 생합성 관련 유전자를 발현벡터를 이용하여 적정 숙주 미생물에 형질전환시키고 그 숙주 미생물을 배양함으로써 이루어질 것이다. 구체적으로 상기 (a) 단계는 (a-1) 아세토아세틸 코엔자임 A 합성효소인 AtoB, 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 합성효소인 HMGS 및 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 환원효소인 HMGR를 발현시킬 수 있는 발현벡터로 형질전환된 숙주 미생물을 제조하는 단계, (a-2) 이 숙주 미생물 배양을 위한 배지를 조제하는 단계, (a-3) 그 배지에 상기 숙주 미생물을 접종하여 배양하는 단계, 및 (a-4) 배양액으로부터 배지 성분을 제거하고 메발론산을 분리하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 여기서 AtoB, HMGS 및 HMGR를 발현시킬 수 있는 발현벡터의 제조는 AtoB, HMGS 및 HMGR를 암호화하는 유전자를 포함하여 구성되는데, 해당 유전자들은 전술한 바와 같이 당업계에 많은 양의 문헌을 통하여 널리 주지되어 있다. 또한 프로모터나 터미네이터 등의 조절서열이나 선별마커 등을 포함하는 발현벡터 구성이나 재조합 DNA 기술, 형질전환 방법, 배지의 구성, 형질전환 후 배양 방법 등에 대해서도 당업계에 상당한 양의 문헌이 축적되어 있다. 구체적으로 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)), 문헌(F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley amp; Sons, Inc. (1994)), 문헌(Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques), 문헌(Kaufman RJ. Methods Enzymol 185, 537-56 (1990)), 문헌(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 문헌(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)), 문헌(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 문헌(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 문헌(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 문헌(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), 문헌(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 문헌(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 문헌(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Har bor Laboratory (1982)) 문헌(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, 12073-12080 (1980)), 문헌(Luchansky et al Mol. Microbiol. 2, 637-646 (1988)) 등을 참조할 수 있다. 이들 문헌을 포함하여 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 모두 본 명세서의 일부로 간주된다.

본 발명의 방법에서, 상기 (a-4) 단계를 수행하기 위해서, 즉 배양액으로부터 배지 성분을 제거하고 메발론산을 분리하기 위해서 아래의 실시예가 보여주는 바와 같이 20~60 mesh의 활성탄을 5%(w/v) 이상 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 20~60 mesh의 활성탄을 이용한 배지 성분의 제거는 20~60 mesh의 활성탄을 배양액에 5%(w/v) 이상 첨가하여 진탕(또는 교반) 반응시킨 후 원심분리하고 상등액을 취함으로써 수행될 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 인산은 메발론산에 대해 인산의 양이 메발론산의 메발로노락톤으로의 전환에 장애 요소가 되지 않도록 하기 위해 1 당량 이상으로 첨가되어 반응하는 것이 바람직하다. 또한 인산과 메발론산의 반응은 아래의 실시예에서 확인할 수 있듯이 pH 2 내지 pH 3.5 범위에서 이루어지는 것이 바람직하다. 그것은 이러한 pH 범위에서 메발로노락톤으로의 전환 수율이 특히 우수하기 때문이다.

또 본 발명의 방법에서, 반응 시간은 실온 또는 25±5℃ 범위에서 이루어질 수 있고, 반응 시간은 메발론산이 메발로노락톤으로 충분히 전환될 수 있도록 하기 위해서 아래의 실시예에서 확인되듯이 24시간 이상인 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 인산을 이용하여 생합성된 메발론산으로부터 메발로노락톤을 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명은 불순물이 거의 생성되지 않는 고순도의 메발로노락톤을 얻을 수 있는 효과를 가진다.

도 1은 메발론산의 생합성 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 메발론산 생합성에 사용한 pSTVM_mvaS_atoB의 모식도이다.
도 3은 활성탄의 입경 크기에 따른 배지 성분의 제거 효율을 나타낸 결과이다.
도 4는 배양액과 활성탄의 혼합 비율에 따른 배지 성분 제거 효율을 나타낸 결과이다.
도 5는 메발론산의 표준용액의 HPLC 분석 결과와 배양액의 HPLC 분석 결과이다.
도 6 내지 도 11은 배양액과 인산의 반응 전(도 6), 반응 3시간(도 7), 6시간(도 8), 9시간(도 9), 24시간(도 10) 후 그리고 에틸아세테이트 추출 후(도 11)의 NMR 결과를 순서대로 나타낸 것이다.
도 12는 도 6 내지 도 11의 NMR 결과를 종합하여 순서대로 나타낸 것이다.
도 13은 표준시약과 배양액 메발로노락토으로의 전환 후의 시료의 키이랄 분석 결과이다.
도 14는 배양액과 인산 반응물의 pH별 메발로노락톤의 생성 수율을 나타낸 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 인산을 이용한 메발론산 의 메발로노락톤으로의 전환

< 실시예 1> 메발론산 생성을 위한 형질전환 숙주 미생물의 제조

메발론산 생합성과 관련된 mvaE, mvaS, atoB의 유전자가 포함되고 각각 암피실린과 글로람페니콜에 내성 유전자가 포함된 2개의 플라스미드(pUCM_mvaE 및 pSTVM_mvaS_atoB)로 형질전환된 대장균 MG1655 균주를 실험에 사용하였다. mvaE, mvaS 유전자는 각각 발명의 명칭이 "메발론산 또는 메발로노락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물, 및 이를 이용한 메발론산 또는 메발로노락톤의 제조방법"인 한국 등록특허 제10-1625898호에서 각각 서열번호 7 및 8의 프라이머 서열로 증폭된 유전자(mvaE)와 위 한국 등록특허 제10-1625898호의 서열번호 5 및 6의 프라이머 서열로 증폭된 유전자(mvaS)이고, atoB 유전자는 KEGG EC:2.3.1.9의 유전자(대장균 MG1655 균주가 가지고 있는 유전자임, http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?eco:b2224+eco:b2844)이며, pUCM_mvaE의 모식도는 위 한국 등록특허 제10-1625898호의 도 3에서 확인할 수 있고, pSTVM_mvaS_atoB의 모식도는 도 2에 개시되어 있다.

< 실시예 2> 형질전환 숙주 미생물을 통한 메발론산 의 생성

상기 형질전환된 대장균의 단일 클로니를 100ug/ml의 암피실린과 50ug/ml의 클로람페니콜이 함유된 LB 배지(트립톤(Tryprone) 10g/L, 효모추출물(Yeast extract) 5g/L, 염화나트륨(sodium chloride) 5g/L) 4ml를 함유한 cap tube에 접종하여 30℃에서 12h 동안 배양하였다. cap tube에 배양한 후 100ug/ml의 암피실린과 50ug/ml의 클로람페니콜이 함유된 SB 배지(트립톤 35g/L, 효모추출물 20g/L, 염화나트륨 5g/L, 글리세롤 20g/L) 100ml를 함유한 500ml 용량의 플라스크에 접종한 후 30℃에서 4h 동안 진탕 배양하였다. 이 후 수득된 배앵액 100ml을 100ug/ml의 암피실린과 50ug/ml의 클로람페니콜이 함유된 SB 배지(트립톤 35g/L, 효모추출물 20g/L, 염화나트륨 5g/L, 순수 글리세롤 20g/L) 900ml에 접종한 후 2L 발효기를 이용하여 30℃에서, 900rpm, 50% DO값을 유지시켜 60시간 동안 배양하였으며, 30% 암모니아수를 이용해 pH 6.8로 유지하였다. 탄소원인 순수 글리세롤은 배지에서의 농도가 20g/L의 농도가 되도록 pH Stat 방법(BS Kim et al 2004 bioprocess and biosystems engineering vol26 issue 3 pp147-150)으로 공급하여 유가배양하였다.

< 실시예 3> 활성탄을 이용한 배지 불순물 제거

상기 진탕 배양하여 얻은 배양액으로부터 메발론산을 분리하기 위해 상기 배양액으로부터 배지 성분을 활성탄을 이용하여 제거하였다.

먼저 활성탄의 입경 크기에 따른 배지 성분의 제거 효율을 확인하고자, 빈 칼럼에 크기별(4~8, 20~60 및 100 mesh) 활성탄을 충진시키고, 그 충진된 칼럼에 상기 배양액(배양원액을 원심분리하여 균체를 분리하여 얻은 상등액임) 1ml을 넣고 감압펌프(Gast(USA), Gast compressure and vaccum pump)를 이용하여 배양액이 활성탄을 통과하도록 하였다. 그 결과를 사진으로 촬영하여 도 3에 타나내었다. 도 3을 참조하여 보면 20~60 mesh의 활성탄을 사용한 경우(도 3의 B) 배양 성분이 제거됨을 확인하였으며, 100 mesh의 활성탄을 사용한 경우(도 3의 C)에는 배지 성분이 제거되나 그 활성탄 입자가 작아서 필터에 걸리지 않아 배양액과 함께 통과되는 것을 확인하였다.

위 결과를 기초로 20~60 mesh의 활성탄을 사용하여 배양액과 활성탄의 비율에 따른 배지 성분 제거 실험을 진행하였다. 구체적으로 1L의 배양액에 20~60mesh크기의 활성탄을 0%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%(w/v)으로 첨가하고, 37℃ 진탕배양기에서 활성탄과 배양액이 반응시킨 후 원심분리하고 상등액을 취하여 배지 성분 제거되는 정도를 확인하였다. 결과를 사진으로 촬용하여 도 4에 나타내었다. 도 4를 참조하여 보면, 20~60 mesh의 활성탄을 5%(w/v) 이상 사용할 경우 배지 성분이 제거됨을 확인하였다.

< 실시예 4> 배지 성분이 제거된 배양액의 메발론산 정량분석

상기 <실시예 3>에서 20~60 mesh의 활성탄을 5%(w/v) 이상 사용하여 얻은, 배지 성분이 제거된 배양액 중의 메발론산을 HPLC를 통해 정량하기 위하여, 먼저 메발론산 표준용액을 사용하여 검량 곡선을 작성하였다.

분석을 시료 준비는 Xiong M. 등의 방법(Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol 111, no.23 pp8357~8362)에 따랐으며, 분석에 사용한 메발론산은 시그마 알드리치(sigma aldrich)사 제품을 구입하여 사용하였다. 메발론산 표준용액은 메발론산을 물에 녹여 20g/L 되도록 제조한 후 0.312에서 10g/L의 농도로 6종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, HPLC를 통하여 검량 곡선을 작성하였다. 상기 배지 성분이 제거된 배양액 중의 메발론산을 정량하기 위해서, 그 배양액을 0.45㎕의 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다.

HPLC 분석 조건은 아래 표와 같다.

메발론산의 표준용액의 HPLC 분석 결과와 배지 성분이 제거된 배양액의 HPLC 분석 결과를 도 5에 나타내었다(도 5의 A는 표준용액 분석 결과이고 도 5의 B는 배양액 분석 결과이다). 도 5의 결과를 기초로 상기 배양액 중에 메발론산이 64.7g/L로 존재함을 확인하였다.

< 실시예 5> 배지 성분이 제거된 배양액에 인산 처리를 통한 메발로노락톤으로의 전환과 ¹ H NMR를 통한 메발론산 와 메발로노락톤의 측정(정성분석)

메발론산와 메발로노락톤의 정성분석은 Min-Seob Seo 방법(JACS, 137:14190-14195, 2015)을 이용하여 ¹H NMR(Nucler magnetic resonance, 400 Hz)로 분석하였다.

구체적으로 상기 <실시예 4>에서 메발론산 함량이 측정된, 배지 성분이 제거된 배양액 10ml에, 인산(H₃PO₄, 85% 용액, 삼전화학, 한국 경기도)을 1 당량으로 첨가한 후 실온에서 24시간 동안 반응시켜 메발로노락톤으로의 전환을 유도하였다. 반응 전, 반응 3시간, 6시간, 9시간, 24시간 후 반응물(반응 전은 인산 첨가 전의 배양액임)을 샘플링하여 동결건조기에서 물을 완전히 제거한 후 D₂O에 녹여서 NMR를 수행하였다. 또 24시간 반응 후 반응물을 취하여 50℃에서 진공펌프를 이용하여 물을 완전히 제거하고, 에틸아세테이트(Ethtyl acetate)를 1ml을 첨가하여 진탕한 후 원심분리하여 에틸아세테이트 층을 얻었고, 이를 두 번 수행하여 메발로노락톤을 추출하였다. 이 에틸아세테이트 추출액에 황산나트륨을 처리하여 잔여 수분을 제거하고 0.45㎕ 필터로 여과한 후 NMR을 분석하였다.

반응 전, 반응 3시간, 6시간, 9시간, 24시간 후 그리고 에틸아세테이트 추출 후의 NMR 결과를 순서대로 도 6 내지 도 11에 나타내었으며, 도 6 내지 도 11의 NMR 결과를 종합하여 도 12에 나타내었다.

반응 전과 시간별 반응 후의(인산을 첨가한 후의) NMR 결과를 보면 메발론산에 해당하는 peak들이 줄어들고 다른 peak들이 생기는 것으로부터 락톤 형태의 물질이 점점 생성되는 것을 확인할 수 있으며, 에틸아세테이트 추출 전까지의 NMR 결과들에서 메발론산와 메발로노락톤에 해당하는 peak들 이외의 peak들이 발견되지 않고, 또 에틸아세테이트 추출 후의 NMR 결과에는 거의 메발로노락톤에 해당하는 peak들만이 발견되는 것으로 보아 에틸아세테이트 추출물의 메발로노락토의 순도는 적어도 95% 이상인 것으로 판단된다.

< 실시예 6> 키이랄 ( 광학순도 ) 분석(정성분석)

표준시약(메발로노락톤, sigma aldrich)과 상기 메발론산에서 메발로노락톤으로 전환된 시료(에틸아세테이트 추출 시료)의 키이랄 분석을 Min-Seob Seo 방법(JACS, 137:14190-14195, 2015)의 방법에 따라 수행하여 결과를 도 13에 나타내었다. 표준시약은 R,S form의 메발로노락톤이 나타나는 것을 확인하였고, 인산으로 전환된 시료는 R form의 메발로노락톤만이 나타는 것을 확인하였으며, 광학 순도는 99.9% 이상인 것을 확인하였다.

< 실시예 7> 반응물의 pH별 메발로노락톤의 생성 수율

상기 <실시예 5>와 동일하게, 상기 배지 성분이 제거된 배양액을 물로 희석하여 메발론산 농도 30g/L가 되도록 조정한 후에, 여기에 인산(H₃PO₄, 85% 용액, 삼전화학, 한국 경기도)을 첨가하여 pH를 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0으로 조절한 후 25℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후 상기 반응물에 에틸아세테이트(Ethtyl acetate)를 20ml을 첨가하여 진탕한 후 원심분리하여 에틸아세테이트 층을 얻었고, 이를 두 번 수행하여 메발로노락톤을 추출하였다. 회수한 에틸아세테이트 층에 이 에틸아세테이트 추출액에 황산나트륨을 처리하여 잔여 수분을 제거하고 Vacuum distillation을 통해 남아 있는 에틸아세테이트를 완전히 제거하고 순수한 메발로노락톤을 수집한 후 EZ-2(SP SCIENTIFIC of SP Industries, Inc.)를 이용하여 샘플을 완전히 Dry 시킨 뒤 20ml의 DDW에 샘플을 녹여 메발론산으로의 전환을 유도한 뒤, 상기 <실시예 4>와 동일한 방법으로 HPLC를 통하여 메발론산(메발론산)을 측정함으로써 메발로노락톤으로의 전환 수율을 측정하였다(메발론산에서 메발로노락톤으로 전환을 시킨 후 이를 다시 메발론산으로 전환하여 HPLC분석을 통하여 전환된 메발론산을 측정함으로써 pH에 따른 전환 수율을 측정한 것임).

결과를 도 14에 나타내었다. pH 2일 때 메발론산은 14.8g pH 2.5에서는 15.3g/L, pH 3일 때 메발론산은 14.4g/L, pH 3.5에서는 13.6g/L, pH 4에서는 10g/L의 메발론산이 생성되는 것을 알 수 있으며, 이는 pH 2 내지 pH 3.5일 때가 메발로노락톤으로의 전환 수율이 우수함을 보여주는 것이라 할 수 있다.

Claims

(a) 생합성된 메발론산을 준비하는 단계, 및 (b) 그 생합성된 메발론산에 인산을 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는
메발론산으로부터 메발로노락톤을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 인산은 오쏘인산인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계는,
(a-1) 아세토아세틸 코엔자임 A 합성효소인 AtoB, 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 합성효소인 HMGS 및 하이드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 환원효소인 HMGR를 발현시킬 수 있는 발현벡터로 형질전환된 숙주 미생물을 제조하는 단계,
(a-2) 이 숙주 미생물 배양을 위한 배지를 조제하는 단계,
(a-3) 그 배지에 상기 숙주 미생물을 접종하여 배양하는 단계, 및
(a-4) 배양액으로부터 배지 성분을 제거하고 메발론산을 분리하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 (a-4) 단계는 배양액에 20~60 mesh의 활성탄을 5%(w/v) 이상 첨가하고 혼합한 후 원심분리하여 상등액을 취함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계는 메발론산에 인산을 1 당량 이상으로 첨가하여 반응시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계는 pH 2 내지 pH 3.5 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계는 25±5℃에서 24시간 이상 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.