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KR20180069109A - 플로우 셀로의 시약 전달을 위한 유체 시스템 - Google Patents

플로우 셀로의 시약 전달을 위한 유체 시스템 Download PDF

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KR20180069109A
KR20180069109A KR1020187016706A KR20187016706A KR20180069109A KR 20180069109 A KR20180069109 A KR 20180069109A KR 1020187016706 A KR1020187016706 A KR 1020187016706A KR 20187016706 A KR20187016706 A KR 20187016706A KR 20180069109 A KR20180069109 A KR 20180069109A
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KR
South Korea
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reservoir
flow cell
cache
manifold
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KR1020187016706A
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미쉘 스톤
드류 베르카데
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일루미나, 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 시약 카트리지 및 플로우 셀의 유입구 사이의 유체 소통을 위해 구성된 복수의 채널을 포함하는 시약 매니폴드; 매니폴드에서 포트로부터 하향 연장되는 복수의 시약 시퍼로서, 각각의 시약 시퍼가 시약 카트리지의 시약 저장소에 배치되도록 구성되어 액체 시약이 시약 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있게 하는 복수의 시약 시퍼; 저장소 및 플로우 셀의 유입구 사이의 유체 소통을 매개하도록 구성된 적어도 하나의 밸브를 포함하는 유체 시스템에 관한 것이다. 시약 매니폴드는 또한 시약 재사용을 위한 캐시 저장소를 포함할 수 있다.

Description

플로우 셀로의 시약 전달을 위한 유체 시스템{FLUIDIC SYSTEM FOR REAGENT DELIVERY TO A FLOW CELL}
본 출원은 본원에 참조로서 포함되는 현재 계류중인 2013년 8월 8일 출원된 미국 가특허출원 61/863,795호의 이익을 주장한다.
본 발명의 구체예는 일반적으로, 예를 들어, 핵산 서열화 절차에서 샘플의 유체 조작 및 광학 검출을 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
본 발명자들의 유전체는 선호도, 적성, 질환에 대한 감수성 및 치료 약물에 대한 반응성과 같은 다수의 고유한 소인을 예측하기 위한 청사진을 제공한다. 개별적인 인간 유전체는 30억개 초과의 뉴클레오티드의 서열을 함유한다. 단지 그러한 뉴클레오티드의 분획에서의 차이는 많은 독특한 특징을 부여한다. 연구 단체는 청사진을 구성하는 특징들을 풀어내고 각 청사진에서의 정보가 어떻게 인간 건강과 관련되는 지에 대한 더욱 완전한 이해를 얻음에 있어서 인상적인 발전을 하고 있다. 그러나, 그러한 이해는 결코 완전하지 않고 이는 연구소로부터, 우리가 의사와 함께 앉아 건강한 생활 습관 또는 치료의 적절한 과정을 위한 적합한 선택을 결정할 수 있도록 언젠가 우리 각자가 우리 자신의 개인 유전체의 복사체를 가지는 것이 소망인 임상으로의 정보의 이동을 방해한다.
현재의 장애물은 처리량 및 규모의 문제이다. 임의의 주어진 개체에 대한 청사진을 풀어내는 기본 구성요소는 이들의 유전체에서 30억개 뉴클레오티드의 정확한 서열을 결정하는 것이다. 이를 수행하는 기법들이 이용가능하지만, 그러한 기법들은 전형적으로 수행하는데 있어 많은 날과 수천 달러의 수천 배를 소비한다. 더욱이, 어떤 개체의 유전체 서열의 임상 관련성은 이들의 유전체 서열 (즉, 이들의 유전자형)의 고유의 특징을 공지된 특징 (즉, 표현형)과 관련된 참조 유전체와 비교하는 문제이다. 규모 및 처리량의 문제는 통계적으로 유효해지기 위해 참조 유전체가 전형적으로 수천 명의 개체를 이용한 조사 연구에서 발생한 유전자형 대 표현형의 상관관계에 기반하여 생성된다고 고려할 때 뚜렷해진다. 따라서, 임상적으로 적절한 임의의 유전자형 대 표현형 상관관계를 확인하기 위해 실제로 수 십억개의 뉴클레오티드가 수 천명의 개체에 대해 서열화될 수 있다. 질환의 수, 약물 반응, 및 다른 임상적으로 적절한 특징이 추가로 더해지면, 매우 저렴하고 신속한 서열화 기법에 대한 필요성이 더욱 더 분명해진다.
필요한 것은 연구 과학자들에 의해 수행되는 큰 유전적 상관관계 연구를 추진하고 삶의 변화를 결정하는 개별 환자의 치료를 위한 임상 환경에 접근가능한 서열화를 만드는 서열화 비용에서의 감소이다. 본원에 개시된 본 발명의 구체예는 이러한 요구를 충족시키고 다른 이점도 제공한다.
간단 개요
본 발명은 시약 카트리지 및 플로우 셀의 유입구 사이의 유체 소통을 위해 구성된 복수의 채널을 포함하는 시약 매니폴드; 매니폴드에서 포트로부터 하향 연장되는 복수의 시약 시퍼(sipper)로서, 각각의 시약 시퍼가 시약 카트리지의 시약 저장소 내에 배치되도록 구성되어 액체 시약이 시약 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있는 복수의 시약 시퍼; 저장소 및 플로우 셀의 유입구 사이의 유체 소통을 매개하도록 구성된 적어도 하나의 밸브를 포함하는 유체 시스템을 제공한다.
본 발명은 액체 시약이 시약 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있도록 z 차원에 따라 유체 시스템의 복수의 시약 시퍼를 동시에 채용할 수 있게 구성된 복수의 시약 저장소로서, 시약 저장소가 x 및 y 차원에서 상부, 중간 및 하부 열로 배열되고, 카트리지의 상부 및 하부 열에 따른 시약 저장소가 하나 이상의 중간 열의 시약 저장소보다 z 차원을 따라 더 깊은, 복수의 시약 저장소; 및 유체 시스템의 상응하는 정렬 핀과 맞물리도록 구성된 적어도 2개의 인터페이스 슬롯을 포함하는 시약 카트리지를 추가로 제공한다.
또한, 적어도 10개, 15개, 또는 적어도 20개 포트를 포함하는 다층 확산 결합된 시약 매니폴드로서, 각각의 포트가 시퍼를 통해 분리된 시약 저장소로부터 시약을 끌어 당기도록 구성되고, 포트는 매니폴드에서 유체 채널을 통해 플로우 셀의 하나 이상의 채널과 유체 소통하는, 다층 확산 결합된 시약 매니폴드가 제공된다.
본 발명은 a) 액체 시약을 시약 저장소로부터, 시약 저장소 및 플로우 셀의 적어도 하나의 채널과 유체 소통하는 캐시 저장소(cache reservoir)로 끌어 당기는 단계; b) 시약을 캐시 저장소로부터 플로우 셀의 적어도 하나의 채널로 수송하는 단계; c) 플로우 셀로부터의 액체 시약이 플로우 셀과의 접촉 후에 다시 시약 저장소로 유도되지 않도록 플로우 셀 채널 상의 시약의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 캐시 저장소로 수송하는 단계; 및 d) 단계 b) 및 c)를 반복하여 플로우 셀 상의 액체 시약의 재사용을 달성하는 단계를 포함하는, 시약 재사용 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 (a)(i) 광학적으로 투명한 표면을 포함하는 플로우 셀, (ii) 핵산 샘플, (iii) 서열화 반응을 위한 복수의 시약, 및 (iv) 시약을 플로우 셀로 전달하기 위한 유체 시스템을 포함하는 유체 시스템을 제공하는 단계; (b)(i) 복수의 미세형광계로서, 각각의 미세형광계가 x 및 y 차원의 상평면에서 광시야(wide-field) 이미지 검출을 위해 구성된 대물렌즈를 포함하는 복수의 미세형광계, 및 ii) 샘플 스테이지를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; 및 (c) 카트리지에서 핵산 서열화 절차의 유체 작업 및 검출 장치에서 핵산 서열화 절차의 검출 작업을 수행하는 단계로서, (i) 시약이 유체 시스템에 의해 플로우 셀로 전달되고, (ii) 핵산 특징부의 광시야 이미지가 복수의 미세형광계에 의해 검출되고, 그리고 (iii) 적어도 일부 시약이 플로우 셀로부터 캐시 저장소로 제거되는 단계를 포함하는, 서열화 방법을 추가로 제공한다.
하나 이상의 구체예의 자세한 내용은 첨부된 도면 및 하기 설명에 개시된다. 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1a는 시약 카트리지와 상호작용하는 시약 시퍼를 지닌 유체 시스템을 도시한다.
도 1b는 매니폴드 어셈블리의 등각 뷰를 도시하며 매니폴드 내 유체 채널의 레이아웃의 예를 나타낸다.
도 2는 시약 시퍼, 밸브 및 정렬 파인트를 갖는 매니폴드 어셈블리의 정면 투시도를 도시한다. 이는 또한 상이한 길이의 시퍼를 도시한다.
도 3은 매니폴드 내 유체 채널의 가능한 한 레이아웃을 나타내는 매니폴드 어셈블리의 상면도를 도시한다.
도 4는 캐시 라인의 단면도를 포함하는, 매니폴드 내 채널의 단면도, 및 비-캐시 유체 채널을 도시한다.
도 5는 시약 포트를 2개의 밸브와 연결하기 위한 다양한 정션을 도시한다.
도 6은 다양한 깊이의 웰을 지닌 시약 카트리지의 단면도를 도시한다.
도 7a는 한 구체예에 따른 매니폴드 어셈블리에서 캐시 라인의 단순화된 상면도를 도시한다.
도 7b는 캐시 라인으로부터 플로우 셀로, 이어서 플로우 셀로부터 캐시 라인의 부분적인 재충전의 시약의 상호적인 흐름을 활용하는 방법에서 시약 재사용의 다양한 단계를 도시한다.
도 8은 시약 웰 및 정렬 핀에 대한 인터페이스 슬롯을 갖는 시약 트레이 인터페이스의 상면도를 도시한다.
도 9는 유체 시스템에 대한 유체공학 맵을 도시한다.
도 10은 순응 시퍼(compliant sipper) 및 피어싱 시퍼(piercing sipper)를 포함하는 시약 시퍼(reagent sipper)의 상세도를 도시한다.
본 발명은 플로우 셀과 같은 챔버에 시약을 제공하기 위한 유체 시스템 및 방법을 제공한다. 특히 유용한 응용은 고정된 생물학적 샘플의 검출이다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 시스템은 핵산 서열화 응용에 이용될 수 있다. 광학적 및 비광학적으로 검출가능한 샘플 및/또는 시약을 활용한 다양한 핵산 서열화 기법이 이용될 수 있다. 이러한 기법은 본 발명의 방법 및 장치에 특히 매우 적합하므로 본 발명의 특정 구체예에 대한 여러가지 장점을 강조한다. 이러한 장점들 중 일부가 예시를 위해 하기에 개시되며, 비록 핵산 서열화 응용이 예시되었으나, 상기 장점은 다른 적용에까지 확대될 수 있다.
본원에 개시된 유체 시스템은 그 내용이 전체로서 참조로서 포함되는 2013년 2월 13일 출원된 명칭 "INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING"의 미국특허 출원 일련 번호 13/766,413호에 개시된 임의의 검출 장치 구성 및 서열화 방법에 특히 유용하다.
특정 구체예에서, 검출되어야 하는 샘플은 본원에 제공된 유체 시스템을 이용하여 검출 챔버에 제공될 수 있다. 핵산 서열화 적용의 더욱 구체적인 예를 들자면, 유체 시스템은 서열화 시약을 보유하기 위한 저장소, 샘플 제조 시약을 보유하기 위한 저장소, 서열화 동안 생성된 폐기물을 보유하기 위한 저장소, 및/또는 플로우 셀을 통해 유체를 이동시킬 수 있는 펌프, 밸브 및 다른 구성요소 중 하나 이상과 유체 소통하도록 배치될 수 있는 매니폴드 어셈블리를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 유체 시스템은 하나 이상의 시약의 재사용을 허용하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 유체 시스템은 시약을 플로우 셀에 전달한 다음, 시약을 플로우 셀로부터 제거한 후에, 시약을 플로우 셀에 재도입하도록 구성될 수 있다. 시약을 재사용하는 이점은 폐기물 부피를 감소시키고 값비싼 시약 및/또는 고농도 (또는 높은 양으로)로 전달되는 시약을 이용하는 공정의 비용을 감소시키는 것이다. 시약 재사용은 시약의 고갈이 단지 또는 주로 플로우셀 표면에서 발생하므로, 대부분의 시약은 사용되지 않은 채 이동하고 재사용될 수 있다는 이해를 활용한다.
도 1a는 본원에 개시된 여러 구체예에 의해 제공된 유체 시스템의 장점을 활용한 시약 시퍼 (103 및 104) 및 밸브 (102)를 갖는 예시적인 유체 시스템 (100)을 도시한다. 유체 시스템 (100)은, 예를 들어, 시약 시퍼, 밸브, 채널, 저장소 등을 포함하는 다양한 고정된 구성요소를 포함하는 매니폴드 어셈블리 (101)를 포함한다. 액체 시약이 시약 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있도록 차원 z를 따라 시약 시퍼의 세트 (103 및 104)를 동시에 채용하도록 구성된 시약 저장소 (401 및 402)를 갖는 시약 카트리지 (400)가 존재한다.
액체 시약을 시약 저장소로부터 플로우 셀로 제공하는데 이용될 수 있는 예시적인 매니폴드 어셈블리 (101)가 도 1b에 도시된다. 매니폴드는 매니폴드의 포트로부터 차원 z로 하향 연장되는 시약 시퍼 (103 및 104)를 포함한다. 시약 시퍼 (103 및 104)는 시약 카트리지에서 하나 이상의 시약 저장소 (도시되지 않음) 내로 배치될 수 있다. 매니폴드는 또한 시약 시퍼 (103)를 밸브 (102) 및 밸브 (109)로 유체적으로 연결시키는 채널 (107)을 포함한다. 시약 시퍼 (103 및 104), 채널 (107) 및 밸브 (102)는 시약 저장소 및 플로우 셀 (도시되지 않음) 사이의 유체 소통을 매개한다. 밸브 (102 및 109)는 개별적으로 또는 함께, 시퍼 (103 또는 104)를 선택하여, (107)과 같은 채널을 통해, 시약 저장소 및 플로우 셀 (도시되지 않음) 사이의 유체 소통을 매개할 수 있다.
도 1a 및 1b에 도시된 장치들은 예시적인 것이다. 도 1a 및 1b의 실시예에 대안적으로 또는 추가로 이용될 수 있는 본 발명의 방법 및 장치의 추가의 예시적인 구체예가 하기에 더 자세하게 개시된다.
도 2는 시약 시퍼 및 밸브를 갖는 다른 예시적인 매니폴드 어셈블리를 도시한다. 매니폴드는 시약 시퍼에 평행한 축에서 매니폴드로부터 아래로 돌출한 정렬 핀 (105)을 갖는다. 정렬 핀 (105)은 시약 시퍼에 비해 z 차원을 따라 더 길지만, 대안적인 구체예에서, 이들은 동일하거나 더 짧은 길이를 지닐 수도 있다. 정렬 핀 (105)은 시약 카트리지 (도시되지 않음) 상에서 하나 이상의 상응하는 인터페이스 슬롯과 맞물리도록 구성된다. 시약 시퍼 (103 및 104)는 매니폴드 몸통에 수용된 포트 (106)를 통해 매니폴드에 커플링된다. 시약 시퍼 (104)는 시약 시퍼 (103 또는 104)의 깊이에 해당하는 다양한 깊이의 시약 저장소로부터 액체를 끌어 당기기 위해, 시약 시퍼 (103)에 비해 더 길다. 대안적인 구체예에서, 시퍼 (103 및 104)는 동일한 길이를 가질 수 있거나, 지배적인 길이로 전환될 수 있다.
또한 별도의 x-y 평면에 존재하는 채널 (107A 및 107B)이 도 2에 도시된다. 별도의 채널 (107A 및 107B)은 단일 채널에서 비롯된 후에 T-정션 (109)에서 두 갈래로 나뉘어 별도의 평면에 존재하는 다수의 채널을 발생시킬 수 있다. 매니폴드는, 오로지 동일한 평면 A 상에, 또는 평면 A 및 B의 조합에 존재하는 특정 밸브 (102)에 연결된 채널을 지님에 의해 액체 시약을 하나의 시퍼로부터 하나 이상의 밸브로 유도하는 한편, 임의의 다른 밸브에 연결된 채널은 공동-평면 또는 평면-간 개시의 이러한 특징을 공유할 수 있다.
도 3은 매니폴드 내 유체 채널의 한 가능한 레이아웃을 나타내는 매니폴드 어셈블리 (101)의 상면도를 도시한다. 유체 채널 (107A 및 107B)은 단일 포트 (106)에서 비롯되며 포트 (106)를 밸브 (102A 또는 102B)에 연결시킨다. 특정 채널은 플로우 셀로부터의 액체 시약이 플로우 셀과의 접촉 후에 다시 시약 저장소 (도시되지 않음)로 유도되지 않도록 다량의 액체 시약이 플로우 셀 (도시되지 않음)로부터 캐시 저장소 (108)로 흐를 수 있게 하는 충분한 부피를 지닌 캐시 저장소 (108)를 포함한다. 또한 하나 이상의 정렬 핀 (105)의 예시적인 위치가 도 3에 도시된다. 도 3에 도시된 매니폴드 어셈블리는 또한 공유 완충제용 유입구 포트 (111)를 포함한다. 각각의 밸브 (102A 및 102B)는 각각의 시약 포트 (106)에 해당하는 유입구 포트, 및 유체적으로 플로우 셀에 연결된 일반적인 출력 포트 (112 및 110) 및 유체적으로 폐기물 용기에 연결된 폐기물 포트 (113 및 109)를 지니도록 구성된다.
상기 예시적인 구체예에 의해 입증된 대로, 시약을 시약 카트리지로부터 플로우 셀로 전달하기 위한 유체 시스템은 시약 카트리지 및 플로우 셀의 유입구 사이의 유체 소통을 위해 구성된 복수의 채널을 포함하는 시약 매니폴드를 포함할 수 있다. 유체 시스템에서 매니폴드의 이용은 단독 튜브의 사용에 비해 여러 이점을 제공한다. 예를 들어, 고정된 채널을 지닌 매니폴드는 튜브 부착의 오배치와 같은 어셈블리 동안의 오류 가능성, 뿐만 아니라 연결의 과다- 또는 과소-체결을 감소시킨다. 또한, 매니폴드는 유지보수의 용이성을 제공하여, 예를 들어, 오히려 시간이 많이 걸리는 시험 및 개별 라인의 교체보다 전체 유닛의 빠른 교체를 가능하게 한다.
매니폴드의 채널들 중 하나 이상은 고체 물질을 통한 유체 트랙을 포함할 수 있다. 상기 트랙은 트랙을 통해 요망되는 수준의 유체 전달이 가능하도록 하는 임의의 직경을 지닐 수 있다. 상기 트랙은 직경에 있어서, 예를 들어, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.3 mm 0.4 mm, 0.5 mm, 0.6 mm, 0.7 mm, 0.8 mm, 0.9 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm 미만 또는 10 mm 미만의 내부 직경을 지닐 수 있다. 트랙 형태는, 예를 들어 직선 또는 곡선일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 트랙은 곡선 부분과 직선 부분의 조합을 지닐 수 있다. 트랙의 단면은, 예를 들어, 사각형, 원형, "D"-형상, 또는 트랙을 통한 요망되는 수준의 유체 전달을 가능하게 하는 임의의 다른 형상일 수 있다. 도 4는 매니폴드 몸통을 통한 유체 트랙을 예시하고 한 트랙 (302)의 단면도를 도시한다. 도 4에 도시된 예시적인 채널 (302)은 추가로 0.65 mm x 0.325 mm 직사각형과 합쳐진 0.65 mm 직경의 반원으로 형성된 "D" 형상 단면을 지닌다.
시퍼 및 밸브 사이의 채널은 매니폴드 몸통 내에 완전히 수용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 채널은 매니폴드의 외부에 있는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가요성 튜브와 같은 튜브는 유체 트랙의 일부를 매니폴드 상의 트랙의 다른 부분에 연결시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 가요성 튜브는 플로우 셀을, 예를 들어, 펌프, 밸브, 센서 및 게이지(guages)를 포함하는 시스템의 고정된 유체 구성요소에 연결시킬 수 있다. 예로서, 가요성 튜브는 플로우 셀 또는 본 시스템의 채널을 주사기 펌프 또는 연동 펌프와 같은 펌프에 연결하도록 제공될 수 있다.
매니폴드 몸통은, 예를 들어, 그 안의 하나 이상의 채널을 지지할 수 있는 임의의 적합한 고체 물질로 제조될 수 있다. 따라서, 매니폴드 몸통은 수지, 예컨대 폴리카르보네이트, 폴리비닐 클로라이드, DELRIN® (폴리옥시메틸렌); HALAR®; PCTFE (폴리클로로트리플루오로에틸렌); PEEK™ (폴리에테르에테르케톤); PK (폴리케톤); PERLAST®; 폴리에틸렌; PPS (폴리페닐렌 설파이드); 폴리프로필렌; 폴리설폰; FEP; PFA; 고순도 PFA; RADEL® R; 316 스테인레스 스틸; TEFZEL® ETFE (에틸렌 테트라플루오로에틸렌); TPX® (폴리메틸펜텐); 티타늄; UHMWPE (초고 분자량 폴리에틸렌); ULTEM® (폴리에테르이미드); VESPEL® 또는 본원에 제시된 구체예에서 매니폴드의 채널을 통해 수송되는 용매 및 유체와 상용가능한 임의의 다른 적합한 고체 물질일 수 있다. 매니폴드 몸통은 단일 피스(piece)의 물질로부터 형성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 매니폴드 몸통은 함께 결합된 다수의 층으로부터 형성될 수 있다. 결합 방법은, 예를 들어, 접착제, 개스킷, 및 확산 결합의 이용을 포함한다. 채널은 임의의 적합한 방법에 의해 고체 물질로 형성될 수 있다. 예를 들어, 채널은 고체 물질로 드릴, 에칭 또는 밀링될 수 있다. 채널은 다수의 층을 함께 결합하기 전에 고체 물질로 형성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 채널은 층들을 함께 결합시킨 후에 형성될 수 있다.
도 5는 시약 포트 (301)를 2개의 밸브와 연결시키기 위한 다양한 정션 (300)을 도시한다. 도 5에 도시된 각각의 예에서, 포트 (301)는 각 채널이 상이한 밸브를 공급하는 2개의 채널 (302A 및 302B)로 나뉘는 채널 (302)에 유체적으로 연결된다. 첫 번째 구성에서, 정션은 포트 (301)로부터의 유체 흐름을 매니폴드의 분리된 층 상의 채널 (302A 및 302B)로 분할한다. 도 5에 도시된 두 번째 및 세 번째 구성에서, 정션 (300)은 층 내에 둥근 사각형 (303) 분할 또는 매니폴드의 층 내에 완전히 둥근 분할 (304)을 포함한다.
본원에 제공된 매니폴드 어셈블리는 시약 카트리지로부터 플로우 셀로의 액체 시약의 전달을 위해 구성된다. 따라서, 매니폴드는 시약 시퍼에 커플링된 임의의 수의 포트를 지닐 수 있다. 보다 구체적으로, 포트의 수는 시약 카트리지의 시약 저장소의 수 및 구성과 일치할 수 있다. 일부 구체예에서, 매니폴드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 적어도 30개의 포트를 포함하고, 각각의 포트는 시약 시퍼를 적어도 하나의 밸브와 유체 소통하는 채널에 커플링하도록 구성된다.
본원에 제시된 유체 시스템은 또한 매니폴드에서 포트로부터 z 차원을 따라 하향 연장되는 시퍼 튜브의 어레이를 포함할 수 있고, 각각의 시약 시퍼는 액체 시약이 시약 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있도록 시약 카트리지의 시약 저장소 내에 삽입되도록 구성된다. 시약 시퍼는, 예를 들어, 근위 단부 및 원위 단부를 지닌 관상 몸통을 포함할 수 있다. 원위 단부는 시약 카트리지의 시약 저장소 위의 시일로서 이용되는 필름 또는 포일 층을 관통하도록 구성된 뾰족한 끝으로 점점 가늘어질 수 있다. 다양한 예시적인 시퍼 끝이 도 10에 도시되어 있다. 시약 시퍼에는, 예를 들어, 원위에서 근위 단부로 관상 몸통을 통해 진행되는 단일 루멘이 제공될 수 있다. 루멘은 시퍼의 한 단부 상의 시약 카트리지 및 시퍼의 다른 단부 상의 시약 매니폴드 사이에 유체 소통을 제공하도록 구성될 수 있다. 예시적인 도 2에 도시된 대로, 시약 시퍼 (103 및 104)는 매니폴드 몸통에 수용된 포트 (106)를 통해 매니폴드에 커플링된다.
일부 구체예에서, 도 2에 예시된 대로, 시약 시퍼의 서브세트는 다른 시약 시퍼보다 짧은 길이를 갖는다. 예를 들어, 서브세트의 길이는 다른 시약 시퍼보다 적어도 1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 적어도 2.0 mm 더 짧을 수 있다. 매니폴드 및 시약 시퍼는 시약 시퍼가 상응하는 웰 또는 시약 카트리지의 저장소 내에 삽입되도록 시약 카트리지를 z 차원을 따라 두 방향으로 이동시키도록 구성된 엘리베이터 메커니즘을 갖는 디바이스에서 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 시약 웰은 보호성 포일로 덮일 수 있다. 따라서, 다양한 길이의 시퍼를 제공하는 이점은 시약 카트리지가 피어싱 시퍼와 접촉하게 될 때 포일-관통력을 수용하기 위해 엘리베이터 메커니즘에 의해 요구되는 힘의 감소이다. 시퍼 길이에서의 차이는 유리하게는 시약 카트리지의 시약 웰의 깊이와 상응할 수 있어서, 각각의 시퍼는 시퍼 및 카트리지가 충분히 맞물린 위치에 있을 때 이의 상응하는 시약 웰에서 요망되는 깊이에 도달한다.
시퍼는 루멘을 통한 유체 전달을 허용하고 본원에 제시된 구체예에서 매니폴드의 채널을 통해 수송되는 용매 및 유체와 상용가능한 임의의 적합한 물질로 형성될 수 있다. 시퍼는 단일 튜브로부터 형성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 시퍼는 함께 요망되는 길이 및 직경의 시퍼를 형성하는 다수의 세그먼트로 제조될 수 있다.
일부 구체예에서, 시약 시퍼 중 적어도 하나는 팁이 시약 카트리지의 시약 웰의 바닥에 충돌할 때 구부러지도록 구성된 순응 팁을 포함한다. 순응 팁은 구부러지거나 변형됨에 의해, 시퍼의 루멘이 시약 웰의 바닥에 더욱 충분히 접근하거나 심지어 접촉하도록 함으로써, 시약 웰의 배출 부피를 감소시키거나 심지어 제거한다. 순응 팁은 적은 부피로 이용되는 샘플 또는 시약의 흡수에, 또는 시약 저장소의 액체의 대부분 또는 모든 흡수가 바람직한 상황에 특히 유리할 수 있다. 순응 팁을 갖는 시퍼의 몸통은 전적으로 팁과 동일한 가요성 물질로 제조될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시퍼의 몸통은 팁과 별개의 물질로 제조될 수 있다. 순응 팁은 시약 저장소의 바닥과 접촉하도록 강제될 때 순응 팁이 변형되거나 항복할 수 있도록 하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 일부 적합한 물질은 폴리우레탄과 같은 열가소성 중합체를 포함하는, 중합성 및/또는 합성 포움, 고무, 실리콘 및/또는 엘라스토머를 포함한다.
본원에 제시된 유체 시스템은 또한, 예를 들어, 저장소 및 플로우 셀의 유입구 사이의 유체 소통을 제어하기 위해 선택적으로 작동할 수 있는 펌프 및 밸브를 포함할 수 있다. 도 2 및 3에 도시된 매니폴드 어셈블리에 의해 예시된 대로, 매니폴드 상의 채널 배출구는 각각의 시약 채널이 밸브 상의 유입구 포트와 유체 소통하도록 하나 이상의 밸브 상의 상응하는 유입구 포트와 연결되도록 구성될 수 있다. 따라서, 매니폴드의 시약 채널을 통해, 유입구 포트 중 하나 이상 또는 각각은 시약 시퍼와 유체 소통할 수 있다. 하나 이상의 밸브는 각각 플로우 셀의 하나 이상의 레인의 유입구에 유체적으로 연결되는 일반적인 출력 포트 (110, 112)를 갖도록 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 밸브는 각각 하나 이상의 폐기물 용기에 유체적으로 연결되는 폐기물 포트 (109, 113)를 갖도록 구성될 수 있다.
유체 시스템이 적어도 제 1 밸브 및 제 2 밸브를 포함하는 구체예에서, 각각의 밸브는 분리된 시약을 각각 플로우 셀의 제 1 채널 및 제 2 채널을 가로질러 동시에 전달하도록 구성될 수 있다. 따라서, 한 밸브가 하나의 시약을 제 1 플로우 셀 채널에 전달하는 동안, 제 2 밸브는 상이한 시약을 제 2 플로우 셀 채널에 동시에 전달할 수 있다. 도 9의 예시적인 구체예에 도시된 대로, 밸브 A (VA)는 시약을 레인 1 및 레인 3에 전달하는 매니폴드인 플로우 셀의 유입구 (V1)에 유체적으로 연결된다. 유사하게, 밸브 B (VB)는 플로우 셀의 맞은편 단부에 위치하여, 시약을 레인 2 및 레인 4에 전달하는 유입구 (V2)에 유체적으로 연결된다. 유입구 (V1 및 V2)는 플로우 셀의 맞은편 단부에 위치하며 레인 2 및 4에 비해 레인 1 및 3에 대한 반대 방향으로 시약 흐름의 방향이 발생한다.
본원에 기재된 유체 시스템은 핵산 서열화 동안 플로우 셀 채널의 유체적 조작에 유리하게 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 유체 시스템은 검출 장치에 의한 플로우 셀에서의 핵산 특징부의 검출을 위한 구성으로 검출 장치에 작동적으로 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 검출 장치는 복수의 미세형광계를 포함할 수 있고, 각각의 미세형광계는 x 및 y 차원의 상평면에서 광시야 이미지 검출을 위해 구성된 대물렌즈를 포함한다. 본원에 개시된 유체 시스템은 그 내용이 전체로서 참조로서 포함되는 2013년 2월 13일 출원된 명칭 "INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING"의 미국특허 출원 일련 번호 13/766,413호에 개시된 임의의 검출 장치 구성을 갖는 것이 특히 유용하다.
예로서, 특정 핵산 서열화 구체예에서, 복수의 채널을 함유하는 플로우 셀은 엇갈린 양상으로 유체적으로 조작되고 광학적으로 검출될 수 있다. 보다 구체적으로, 유체적 조작은 플로우 셀의 채널의 제 1 서브세트에 대해 수행될 수 있는 한편, 광학적 검출은 채널의 제 2 서브세트에 대해 발생한다. 예를 들어, 한 구성에서 적어도 4개의 선형 채널이 플로우 셀에 서로 평행하게 배치될 수 있다 (예컨대, 채널 1 내지 4는 순차적인 열로서 배열될 수 있다). 유체적 조작은 다른 모든 채널에 대해 수행될 수 있는 한편 (예컨대, 채널 1 및 3) 검출은 다른 채널에 대해 발생한다 (예컨대, 채널 2 및 4). 이러한 특정 구성은 대물렌즈가 플로우 셀의 다른 모든 채널을 가리키도록 이격된 구성에 위치한 검출기를 갖는 판독 헤드를 이용함에 의해 수용될 수 있다. 이러한 경우에, 밸브는 검출되는 채널이 검출 상태로 유지되는 동안 서열화 사이클을 위한 시약의 흐름을 교대 채널로 유도하도록 동작할 수 있다. 이러한 예에서, 교대 채널의 제 1 세트는 제 1 서열화 사이클의 유체적 단계를 겪을 수 있고 교대 채널의 제 2 세트는 제 2 서열화 사이클의 검출 단계를 겪는다. 일단 제 1 사이클의 유체적 단계가 완료되고 제 2 사이클의 검출 단계가 완료되면, 판독 헤드는 교대 채널의 제 1 세트에 대한 단계를 밟을 수 있고 (예컨대, x 차원을 따라) 밸브는 채널의 제 2 세트에 서열화 시약을 전달하도록 동작할 수 있다. 그 후, 제 1 사이클의 검출 단계가 완료될 수 있고 (채널의 제 1 세트에서) 제 3 사이클에 대한 유체적 단계가 발생할 수 있다 (채널의 제 2 세트에서). 요망되는 수의 사이클이 수행되거나 서열화 절차가 완료될 때까지 상기 단계들은 이러한 방식으로 여러 번 반복될 수 있다.
상기 개시된 엇갈린 유체 및 검출 단계의 이점은 더욱 신속한 전반적인 서열화 진행을 제공하는 것이다. 상기 예에서, 유체적 조작에 필요한 시간이 검출에 필요한 시간과 대략 동일한 경우 엇갈린 구성으로부터 더욱 신속한 서열화 진행이 발생할 것이다 (모든 채널을 동시에 유체적 조작한 다음 모든 채널을 동시에 검출하는 것에 비해). 물론, 검출 단계를 위한 타이밍이 유체적 단계를 위한 타이밍과 동일하지 않은 구체예에서, 엇갈린 구성은 채널의 서브세트의 병행 스캐닝을 수용하는 동안 다른 서브세트의 채널이 유체적 단계를 겪도록 다른 모든 채널로부터 더욱 적절한 패턴으로 변화될 수 있다.
반대 방향의 유체 흐름을 갖는 추가 이점은 개별적인 미세형광계 성능의 비교 수단을 제공하는 것이다. 예를 들어, 플로우 셀 레인 당 다수의 미세형광계가 이용되는 경우, 감소된 미세형광계 성능이 검출기에 의해 발생하였는지 또는 레인의 한 단부에서 다른 단부로의 감소된 화학 효율로부터 발생하였는지를 구별하기 어려울 수 있다. 반대 방향의 액체 흐름을 지님에 의해, 레인을 가로지르는 미세형광계 성능이 비교될 수 있고, 감소된 성능이 미세형광계 때문인지 아닌지를 효과적으로 구별할 수 있다.
예시적인 유체 시스템에 대한 유체 맵이 도 9에 도시된다. 플로우 셀 (2020)은 4개의 레인을 지니는데, 각각은 유입구 밸브 (VA 및 VB)에 의해 개별적으로 동작하는 2개의 개별적인 유체 라인 (FV 및 RV) 중 하나에 유체적으로 연결된다. 유입구 밸브 (VA) 및 유입구 밸브 (VB)는 시약 매니폴드 (2030) 내 다양한 포트에 유체적으로 연결된 시약 카트리지 또는 트레이 (2035)의 증폭 시약 저장소, SBS 시약 저장소 및 샘플 저장소로부터의 유체의 흐름을 제어한다.
도 9의 시스템을 통한 유체의 흐름은 두 별개의 주사기 펌프 (2041 및 2042)에 의해 구동된다. 주사기 펌프는 유체 시스템을 통해 유체를 끌어 당기도록 정위되고 각각의 펌프는 밸브 (2051 및 2052)에 의해 개별적으로 동작할 수 있다. 따라서, 플로우 셀의 각각의 채널을 통한 흐름은 전용 압력 공급원에 의해 개별적으로 제어될 수 있다. 밸브 (2051 및 2052)는 또한 폐기물 저장소 (2060)로의 유체의 흐름을 제어하도록 구성된다.
도 9는 유체가 하향 주사기 펌프의 작동에 의해 끌어 당겨지는 유체 시스템을 예시한다. 유용한 유체 시스템은 유체를 구동시키기 위해 주사기 펌프 대신, 예를 들어 정압 또는 부압, 연동 펌프, 다이아프램 펌프, 피스톤 펌프, 기어 펌프 또는 나선식 펌프(Archimedes screw)를 포함하는 다른 유형의 장치를 이용할 수 있음이 이해될 것이다. 더욱이, 상기 및 다른 장치는 플로우 셀에 대해 하향 위치로부터 유체를 끌어 당기거나 상향 위치로부터 유체를 밀어 내도록 구성될 수 있다.
도 9는 또한 플로우 셀의 4개 채널에 대한 2개 주사기 펌프의 용도를 예시한다. 따라서, 유체 시스템은 사용 중인 채널의 수보다 적은 수의 펌프를 포함한다. 본 발명의 유체 카트리지에 유용한 유체 시스템은 임의의 수의 펌프, 예를 들어, 사용 중인 채널의 수와 같거나 적은 수의 펌프 (또는 다른 압력 공급원)를 지닐 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 여러 채널이 공유된 펌프에 유체적으로 연결될 수 있고 밸브는 개별적인 채널을 통한 유체 흐름을 작동시키기 위해 이용될 수 있다.
도 9에 예시된 유체 시스템은 또한 밸브 (VA) 및 플로우 셀 유입구 (V1) 사이의 유체 경로 (RV)를 따라 정위된, 기포를 검출하기 위한 센서 (BUB-4)를 포함한다. 추가의 기포 센서 (BUB-3)가 밸브 (VB) 및 플로우 셀 유입구 (V2) 사이의 유체 경로 (FV)를 따라 정위된다. 본 발명의 유체 시스템에 유용한 유체 라인은 임의의 수의 기포 센서, 압력 게이지 등을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 센서 및/또는 게이지는 유체 시스템의 유체 경로의 임의의 부분을 따라 임의의 위치에 정위될 수 있다. 예를 들어, 센서 및 게이지는 밸브 중 하나 및 플로우 셀 사이의 유체 라인을 따라 정위될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 센서 또는 게이지는 시약 저장소 및 밸브 중 하나의 사이, 밸브 및 펌프 사이, 또는 펌프 및 배출구 또는 폐기물 저장소와 같은 저장소 사이의 유체 라인을 따라 정위될 수 있다.
예시적인 시약 카트리지의 단면이 도 6에 도시된다. 도 6에 도시된 시약 카트리지 (400)는 웰 (402)의 깊이에 비해 z 차원을 따라 다양한 깊이의 웰 (401)을 포함한다. 보다 구체적으로, 도 6에 예시된 시약 카트리지는 시퍼와 카트리지가 충분히 맞물린 위치에 있을 때 각각의 시퍼가 그 상응하는 시약 웰의 요망되는 깊이에 도달하도록 하는 상응하는 시약 시퍼 (도시되지 않음)의 길이를 수용하도록 설계된 웰을 갖는다. 도 6에 예시된 시약 카트리지에서, 웰은 y 차원을 따른 행 또는 열로 배열되며, 행 또는 열 외부의 웰 (401)은 행 또는 열 내부의 웰 (402)보다 z 차원을 따라 더 아래로 연장된다. 웰의 일부 또는 전부는 다양한 깊이를 지닐 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 웰의 일부 또는 전부는 동일한 깊이를 지닐 수 있다. 시퍼 및 카트리지가 충분히 맞물린 위치에 있을 때, 임의의 시퍼 끝의 관통 깊이 (즉, 웰의 바닥 표면으로부터 시퍼 끝의 단부까지의 거리)는 시약 카트리지의 임의의 다른 주어진 웰에서 임의의 다른 시퍼 끝의 관통 깊이와 동일할 수 있다. 임의의 시퍼 끝의 관통 깊이는 시약 카트리지의 임의의 다른 주어진 웰의 관통 깊이와 동일한 필요는 없다. 적어도 일부 시약 웰이 상이한 웰 깊이를 지닐 때, 웰 깊이는 다른 시약 시퍼보다, 예를 들어, 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 적어도 2.0 mm 더 짧을 수 있다. 유사하게, 시퍼 및 카트리지가 충분히 맞물린 위치에 있을 때, 임의의 시퍼 끝의 관통 깊이는 시약 카트리지의 임의의 다른 시퍼 끝의 관통 깊이보다 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 적어도 2.0 mm만큼 상이할 수 있다.
시약 웰 및 정렬 핀에 대한 인터페이스 슬롯을 갖는 예시적인 시약 트레이 인터페이스의 상면도가 도 8에 도시된다. 도 8의 예시적인 시약 카트리지 (400)에 도시된 대로, 카트리지는 복수의 시약 저장소 (401A, 401B, 402A 및 402B)를 포함한다. 도 8의 시약 저장소는 x 및 y 차원에서 열로 배열된다. 또한 도 8에 도시된 대로, 카트리지는 매니폴드 어셈블리 (도시되지 않음)의 상응하는 정렬 핀과 맞물리도록 구성된 인터페이스 슬롯 (403 및 404)을 포함한다. 카트리지는 또한 카트리지가 피어싱 시퍼와 접촉하게 될 때 피어싱 시퍼에 의해 관통될 수 있는, 임의의 수의 시약 웰 또는 저장소를 덮는 보호 포일을 포함할 수 있다.
본원에 제시된 시약 카트리지는 임의의 수의 시약 저장소 또는 웰을 포함할 수 있다. 시약 저장소 또는 웰은 카트리지에서 시약의 수송 및 저장을 촉진하기 위해 x 및 y 차원에 따른 임의의 포맷으로 배열될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시약 저장소 또는 웰은 매니폴드에서 포트로부터 z 차원을 따라 하향 연장되는 시퍼 튜브의 어레이와 상호작용하기에 적합한 x 및 y 차원에 따른 임의의 포맷으로 배열될 수 있다. 보다 구체적으로, 시약 저장소 또는 웰은 액체 시약이 시약 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있도록 시약 시퍼의 매트릭스를 동시에 채용하기에 적합한 임의의 포맷으로 배열될 수 있다.
모든 시약 웰이 매니폴드 어셈블리의 모든 시퍼 튜브와 동시에 상호작용해야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 시약 카트리지는 다른 저장소 또는 웰이 시퍼 튜브의 어레이에 의해 채용되는 동안 비-상호작용 상태로 유지되도록 구성된 하나 이상의 시약 저장소 또는 웰의 서브세트를 포함할 수 있다. 일례로서, 본원에 제시된 카트리지는 복수의 시약 저장소에 상응하는 구성으로 배열된 복수의 세척 저장소를 포함할 수 있으며, 세척 저장소는 시약 시퍼가 시약 저장소와 맞물리지 않을 때 시약 시퍼를 동시에 채용하도록 구성되어, 세척 완충제가 세척 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨지도록 할 수 있다. 시약 웰 (401A)의 열을 도시하는 예시적인 구체예가 도 8에 제시된다. 카트리지는 또한 서로에 대해 x 차원으로 동일한 배향을 유지하지만, 웰 (401A)로부터 y 차원으로 오프셋인 상응하는 웰 (401B)의 열을 포함한다. 오프셋 웰 (401B)은, 예를 들어, 한 카트리지를 이용한 후에 그리고 다른 카트리지를 이용하기 전에 시퍼 튜브 및 유체 라인을 세정하기 위해 제공된 세척 완충제를 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 비어 있거나, 완충제, 샘플 또는 다른 시약을 보유하는 다른 저장소가 카트리지 상에 존재할 수 있다. 추가의 저장소는 시퍼 튜브와 상호작용할 수 있으나, 반드시 상호작용할 필요는 없다. 예를 들어, 저장소는 카트리지 사용 과정을 통해 폐기 또는 유출 시약 또는 완충제로 충전되도록 구성될 수 있다. 그러한 저장소는, 예를 들어 시퍼 튜브와 접속하지 않는 포트를 통해 접근할 수 있다.
카트리지 저장소와 상응하는 시퍼 튜브의 올바른 정렬을 촉진하기 위해, 정렬 슬롯이 카트리지에 정위될 수 있다. 예를 들어, 시퍼 튜브의 어레이가 한 세트의 저장소로부터 제거되어 시약 또는 세척 저장소의 다른 세트로 전위되는 특정 구체예에서, 정렬 슬롯은 시약 시퍼의 어레이와 하나 또는 둘 모두의 세트의 저장소의 올바른 정렬을 확보하기 위해 카트리지에 정위될 수 있다. 도 8에 도시된 대로, 예시적인 카트리지는 x 차원으로 동일한 배향을 유지하지만, 상응하는 정렬 슬롯 (403)에 대해 y 차원으로 오프셋인 정렬 슬롯 (404)을 포함한다. 본원에 제시된 구체예의 카트리지는 유체 어셈블리의 특징을 갖는 적합한 정렬을 제공하는 임의의 수의 정렬 슬롯을 지닐 수 있다. 예를 들어, 카트리지는 유체 시스템의 시약 시퍼가 시약 및/또는 세척 저장소와 정렬하여 정위되도록 유체 시스템의 상응하는 정렬 핀과 맞물리도록 구성된 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 정렬 슬롯을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 유체 시스템은 하나 이상의 시약의 재사용을 허용하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 유체 시스템은 시약을 플로우 셀에 전달한 다음, 시약을 플로우 셀로부터 제거한 후에 시약을 플로우 셀에 재도입하도록 구성될 수 있다. 한 구성이 도 7a에 예시되며, 이는 매니폴드 어셈블리에서 캐시 라인의 상면도를 도시한다. 도 7a의 상부의 개략도에 도시된 대로, 시약 캐시는 최대 사용된 시약으로부터 최소 사용된 (새로운) 시약까지 농도 구배를 유지하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 캐시 저장소는 캐시 저장소 내 유체의 혼합을 감소시키도록 구성되어, 플로우 셀에 근위인 단부로부터 플로우 셀에 원위인 단부까지 저장소의 길이를 따라 액체 시약의 구배를 유지할 수 있다. 시약이 캐시 저장소로부터 플로우 셀로 다시 전달됨에 따라, 구배는 플로우 셀을 가로질러 흐른 시약이 최대 사용된 시약으로부터 최소 사용된 (새로운) 시약까지의 구배를 형성하도록 유지된다.
도 7a의 하부에 예시된 다이아그램과 같이, 매니폴드 유체공학은 시약 저장소가 밸브 유입구 (1804)를 통해 플로우 셀 (도시되지 않음)의 입력 포트와 유체 소통하도록 구성될 수 있다. 밸브 (1804)는 플로우 셀 (도시되지 않음)과, 각각의 CLM 저장소, SRE 저장소, IMF 저장소, 및 LAM1 및 LPM1 저장소 사이의 유체 흐름을 제어한다. 채널 (1802)은 CLM 저장소를 포트 (1801)를 통해 밸브 유입구 (1804)와 유체적으로 연결한다. 채널 (1802)의 일부는 플로우 셀 (도시되지 않음)의 하나 이상의 레인의 부피와 같은 부피의 시약을 보유하도록 구성된 시약 캐시 (1803)를 포함한다. 채널 (1802)의 다른 부분에 비해 증가된 부피의 시약 캐시 (1803)는 사용된 시약이 재사용을 위해 저장되도록 하면서, 시약 저장소에서 사용되지 않은 시약의 원액을 유지함으로써 시약 저장소의 사용되지 않은 시약 원액이 사용된 시약으로 오염되는 것을 막는다.
도 7a에 도시된 구성은 예시적인 것이다. 재사용을 달성하기 위한 다른 구성 역시 가능하다. 예를 들어, 캐시 저장소 중 하나 이상은 캐시 저장소와 유체 소통하는 플로우 셀 채널의 부피의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1500%, 2000%, 2500%, 3000% 이상의 부피를 지닐 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 캐시 저장소는 플로우 셀로부터의 액체 시약이 플로우 셀과 접촉 후에 시약 저장소로 다시 유도되지 않도록, 하나 이상의 플로우 셀 채널의 다량의 액체 시약이 캐시 저장소로 흐르게 하는 충분한 부피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 액체 시약의 양은 하나 이상의 플로우 셀 채널에서의 액체 시약의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1500%, 2000%, 2500%, 3000% 이상을 포함할 수 있다.
본원에 제시된 캐시 저장소는 캐시 저장소 내 유체의 혼합을 감소시키도록 구성될 수 있다. 그러한 일부 구체예에서, 이렇게 감소된 혼합은 플로우 셀에 근위인 단부로부터 플로우 셀에 원위인 단부까지 저장소의 길이를 따라 액체 시약의 구배를 유지할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 제시된 캐시 저장소는 캐시 저장소 내 유체의 혼합을 촉진하도록 구성된 하나 이상의 혼합 부재를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 능동 또는 수동 혼합 부재가 상기 구체예에 이용될 수 있다. 예를 들어, 혼합 부재는 유체가 캐시 저장소를 가로질러 수송됨에 따라 혼합을 촉진하도록 구성된 배플 부재, 곡선 구조 또는 임의의 다른 수동 또는 능동 구조적 또는 유체적 특징부를 포함할 수 있었다. 대안적으로 또는 추가로, 임의의 적합한 펌프, 로터, 블레이드, 유입구 등이 캐시 저장소 내 능동 혼합에 이용될 수 있다.
본원에 제시된 캐시 저장소는 캐시 저장소의 목적에 적합한 임의의 형상, 부피 및 길이를 지닐 수 있다. 특수한 구체예에서, 임의의 형상, 부피 및/또는 길이의 캐시 저장소가 본원에 제시된 유체 시스템에 이용되어 플로우 셀로부터의 액체 시약이 플로우 셀과 접촉 후에 시약 저장소로 다시 유도되지 않도록 하나 이상의 플로우 셀 채널의 다량의 액체 시약이 캐시 저장소로 흐르게 할 수 있다. 예를 들어, 캐시 저장소는 S자 채널을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 캐시 저장소는 원통형 또는 비원통형의 채널을 포함할 수 있다. 추가로, 본원에 제시된 유체 시스템의 임의의 수의 유체 채널은 하나 이상의 개별적인 캐시 저장소를 포함할 수 있다.
본원에 제시된 캐시 저장소는 캐시 저장소로부터 플로우 셀로 그리고 다시 플로우 셀로부터 캐시 저장소로 액체 시약을 이동시키도록 구성된 펌프와 유체 소통할 수 있고, 플로우 셀로의 시약의 유입 및 플로우 셀로부터의 시약의 배출은 플로우 셀의 동일한 포트를 통해 발생한다. 대안적으로 또는 추가로, 플로우 셀로의 시약의 유입 및 플로우 셀로부터의 시약의 배출은 플로우 셀의 별개의 포트를 통해 발생할 수 있고 여전히 시약 재사용을 달성한다. 예를 들어, 본원에 제시된 유체 시스템은 그 내용의 전문이 참조로서 포함되는 2013년 2월 13일 출원된 명칭 "INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING"의 미국 특허 출원 일련 번호 13/766,413호에 개시된 장치 구성과 관련하여 기재된 임의의 재사용 저장소 및 구성을 이용할 수 있다.
도 7b의 개략도는 캐시 라인으로부터 플로우 셀로, 이어서 플로우 셀로부터 캐시 라인의 부분적인 재충전의 시약의 상호적인 흐름을 활용하는 본원에 제시된 재사용 방법의 예시적인 도면을 개시한다. 도 7b의 상부 패널에 도시된 상태에서, 100μL의 시약 (1906)을 함유하는 캐시 저장소 (1903)는 스플리터 (1904) 및 밸브 (1911)를 통해 플로우 셀 레인 (1905)과 유체 소통한다. 밸브 (1904)는 시약 (1906)이 플로우 셀 레인 (1905)으로 흐를 수 있도록 작동한다. 동시에, 새로운 시약 (1907)이 시약 저장소로부터 끌어 당겨져 캐시 저장소 (1903)의 남은 공간을 채운다. 플로우 셀 상의 시약의 이용 후에, 밸브 (1911)는 사용된 시약 (1906)의 일부 (75μL)를 다시 캐시 저장소 (1903)로 유도한다. 사용된 시약 (1906)의 또 다른 부분 (25μL)은 밸브 (1911)에 의해 폐기물 용기로 전환된다. 사이클 1의 끝에, 캐시 저장소 (1903)는 캐시 저장소의 길이를 가로질러 25μL의 새로운 시약 (1907) 및 75μL의 사용된 시약 (1906)의 구배를 갖는다. 캐시 저장소에서 플로우 셀로 그리고 다시 캐시 저장소로의 시약의 상호적인 흐름의 사이클이 반복되고, 사용된 시약 (1906)의 일부 (25μL)는 각 사이클에서 밸브 (1911)에 의해 폐기물 용기로 전환되고 사용된 시약 (1906)의 나머지는 다시 캐시 저장소 (1903)로 흐른다. 그러한 4번의 반복된 사이클의 끝에, 캐시 저장소 (1903)는 25μL의 새로운 시약 (1910), 한 번 사용된 25μL의 시약 (1909), 두 번 사용된 25μL의 시약 (1908), 및 세 번 사용된 25μL의 시약 (1907)을 포함한다.
도 7a 및 도 7b에 도시된 구성은 예시적인 것이다. 특정 공정에 사용된 시약 중 하나 이상의 재사용을 달성하는 다른 구성 역시 가능하다. 일부 시약 재사용 구성에서, 시약 재사용을 위한 유체적 구성은 특정 공정에 사용된 시약의 서브세트에 대해서만 이용됨이 이해될 것이다. 예를 들어, 시약의 제 1 서브세트는 재사용되기에 충분히 강건한 반면, 제 2 서브세트는 단일 사용 후에 오염, 분해 또는 다른 원치 않는 효과를 갖는 경향이 있을 수 있다. 따라서, 유체 시스템은 시약의 제 1 서브세트의 재사용을 위해 구성될 수 있는 반면, 시약의 제 2 세트에 대한 유체공학은 단일 사용을 위해 구성될 것이다.
특정 시약은 특정 공정에 적합한 요망되는 임의의 횟수만큼 재사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 예시되거나, 본원에 인용된 참고문헌에 기재되거나, 본원에 개시된 공정에 사용하도록 달리 공지된 시약 중 하나 이상은 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50회 이상 재사용될 수 있다. 실제로 임의의 다양한 요망되는 시약은 적어도 여러 번 재사용될 수 있다. 특정 시약의 임의의 부분은 재사용을 위해 다시 캐시 저장소로 전환될 수 있다. 예를 들어, 본원에 예시되거나, 본원에 인용된 참고문헌에 기재되거나, 본원에 개시된 공정에 사용하도록 달리 공지된 시약 중 하나 이상은 후속 재사용을 위해 캐시 저장소로 다시 유도되는 하나 이상의 플로우 셀 레인 상에서 시약 부피의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 지닐 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 플로우 셀 레인 상의 시약 부피의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 폐기물 용기로 전환되거나 플로우 셀 상의 후속 사용으로부터 달리 제거될 수 있다.
시약 재사용을 위한 유체 구성 및 방법은, 비록 핵산 서열화 공정을 위해 예시되었으나, 다른 공정, 특히 시약 전달의 반복된 사이클을 포함하는 공정에 이용될 수 있다. 예시적인 공정은 중합체, 예컨대 폴리펩티드, 다당류 또는 합성 중합체의 서열화를 포함하고 또한 그러한 중합체의 합성을 포함한다.
상기 예시적인 구체예에서 입증된 대로, 시약 재사용 방법은 a) 액체 시약을 시약 저장소로부터 캐시 저장소로 끌어 당기는 단계로서, 캐시 저장소가 시약 저장소 및 플로우 셀의 적어도 하나의 채널과 유체 소통하는 단계; b) 시약을 캐시 저장소로부터 플로우 셀의 적어도 하나의 채널로 수송하는 단계; c) 플로우 셀 채널 상의 시약의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 캐시 저장소로 수송하여, 플로우 셀로부터의 액체 시약이 플로우 셀과 접촉 후에 시약 저장소로 다시 유도되지 않도록 하는 단계; d) 단계 b) 및 c)를 반복하여 플로우 셀 상에서 액체 시약의 재사용을 달성하는 단계를 포함할 수 있다. 캐시 저장소 중 하나 이상은 캐시 저장소로부터 플로우 셀로 그리고 플로우 셀로부터 다시 캐시 저장소로 액체 시약을 이동시키도록 구성된 펌프와 유체 소통할 수 있어서, 플로우 셀로의 시약의 유입 및 플로우 셀로부터의 시약의 배출이 플로우 셀의 동일한 포트를 통해 발생하도록 한다. 대안적으로 또는 추가로, 플로우 셀로의 시약의 유입 및 플로우 셀로부터의 시약의 배출은 플로우 셀의 별개의 포트를 통해 발생할 수 있고 여전히 시약 재사용을 달성한다. 일부 구체예에서, 단계 c)에서 캐시 저장소로 수송되지 않은 플로우 셀로부터의 시약은 전환될 수 있다. 예로서, 캐시 저장소로 수송되지 않은 플로우 셀로부터의 시약은 폐기물 저장소로 수송될 수 있다. 단계 b) 및 c) 중 어느 하나 또는 둘 모두에서의 시약의 수송은 캐시 저장소 및 플로우 셀과 유체적으로 연결된 밸브를 통해 수행될 수 있다. 단계 b) 및 c) 중 어느 하나 또는 둘 모두에서의 시약의 수송은, 예를 들어 단일 방향으로의 유체 흐름으로 수행될 수 있거나, 왕복 흐름으로 수행될 수 있다.
본 발명의 유체 시스템 및 방법의 구체예는 핵산 서열화 기법을 위한 특정 용도를 제공한다. 예를 들어, 서열화에 의합 합성(sequencing-by-synthesis)(SBS) 프로토콜이 특히 이용가능하다. SBS에서, 주형에서의 뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위해 핵산 주형을 따른 핵산 프라이머의 연장이 모니터된다. 기본 화학 공정은 중합화 (예컨대, 폴리머라제 효소에 의해 촉매화됨) 또는 라이게이션 (예컨대, 리가제 효소에 의해 촉매화됨)일 수 있다. 특히 폴리머라제-기반 SBS 구체예에서, 형광 표지된 뉴클레오티드가 주형 의존적인 형식으로 프라이머에 첨가되어 (이에 의해 프라이머를 연장함), 프라이머에 첨가된 뉴클레오티드의 순서 및 유형의 검출을 이용하여 주형의 서열을 결정할 수 있게 한다. 복수의 상이한 주형은 상이한 주형에 대해 발생한 사건이 구별될 수 있는 조건 하에 표면 상에서 SBS 기법으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 주형은 상이한 주형이 공간적으로 서로 구별될 수 있도록 어레이의 표면에 존재할 수 있다. 전형적으로 주형은 각각이 동일한 주형의 다수의 복사체를 갖는 특징부에 발생한다 (때로 "클러스터" 또는 "콜로니"라 불림). 그러나, 단일 주형 분자가 다른 것으로부터 확인될 수 있는 한 분자가 되도록, 각각의 특징부가 존재하는 단일 주형 분자를 갖는 어레이 상에서 SBS를 수행하는 것이 또한 가능하다 (때로 "단일 분자 어레이"라 불림).
플로우 셀은 핵산의 어레이를 수용하기 위한 편리한 기질을 제공한다. 기법은 전형적으로 사이클에서 시약의 반복적인 전달을 포함하기 때문에 플로우 셀은 서열화 기법에 편리하다. 예를 들어, 제 1 SBS 사이클을 개시하기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드, DNA 폴리머라제 등이 핵산 주형의 어레이를 수용한 플로우 셀 내로/통해 흐를 수 있다. 프라이머 연장이 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 야기하는 이러한 특징은, 예를 들어 본원에 개시된 방법 또는 장치를 이용하여 검출될 수 있다. 임의로, 뉴클레오티드는, 일단 뉴클레오티드가 프라이머에 첨가된 다음, 추가의 프라이머 연장을 종료시키는 가역적 종료 속성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 유사체가 프라이머에 첨가되어, 탈차단제가 모이어티를 제거하기 위해 전달될 때까지 후속 연장이 발생할 수 없도록 할 수 있다. 따라서, 가역적 종결을 이용하는 구체예의 경우 탈차단 시약이 플로우 셀에 전달될 수 있다 (검출이 발생하기 전 또는 후). 다양한 전달 단계들 사이에 세척이 수행될 수 있다. 그 후 사이클이 n개 뉴클레오티드에 의해 프라이머를 연장하기 위해 n회 반복되어, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 예시적인 서열화 기법이, 예를 들어, 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, 및 US 2008/0108082, 각각은 본원에 참조로서 포함된다]에 기재되어 있다.
SBS 사이클의 뉴클레오티드 전달 단계를 위해, 단일 타입의 뉴클레오티드가 한 번에 전달될 수 있거나, 다수의 상이한 뉴클레오티드 타입 (예컨대, A, C, T 및 G 함께)이 전달될 수 있다. 단일 타입의 뉴클레오티드만이 동시에 존재하는 뉴클레오티드 전달 구성의 경우, 상이한 뉴클레오티드는 별개의 표지를 가질 필요가 없는데, 그 이유는 이들이 개별화 전달에 고유한 시간적 분리에 기반하여 구별될 수 있기 때문이다. 따라서, 서열화 방법 또는 장치는 단일 색상 검출을 이용할 수 있다. 예를 들어, 미세형광계 또는 판독 헤드는 단일 파장 또는 단일 범위의 파장에서만 여기를 제공할 필요가 있다. 따라서, 미세형광계 또는 판독 헤드는 단지 단일 여기 공급원을 필요로 하고 여기의 멀티밴드 여과를 반드시 필요로 하지는 않는다. 전달이 한 번에 플로우 셀에 존재하는 다수의 상이한 뉴클레오티드를 발생시키는 뉴클레오티드 전달 구성의 경우, 상이한 뉴클레오티드 타입을 혼입한 특징부는 혼합물 중의 개개의 뉴클레오티드 타입에 부착된 상이한 형광 표지에 기반하여 구별될 수 있다. 예를 들어, 4개의 상이한 뉴클레오티드가 이용될 수 있고, 각각은 4개의 상이한 형광단 중 하나를 지닌다. 한 구체예에서 4개의 상이한 형광단은 4개의 상이한 스펙트럼 영역에서 여기를 이용하여 구별될 수 있다. 예를 들어, 미세형광계 또는 판독 헤드는 4개의 상이한 여기 방사선원을 포함할 수 있다. 대안적으로, 판독 헤드는 4개보다 적은 상이한 여기 방사선원을 포함할 수 있지만 단일 공급원으로부터의 여기 방사선의 광학 여과를 활용하여 플로우 셀에서 상이한 범위의 여기 방사선을 생성할 수 있다.
일부 구체예에서, 4개의 상이한 뉴클레오티드는 4개 보다 적은 수의 상이한 색상을 이용하여 샘플 (예컨대, 핵산 특징부의 어레이)에서 검출될 수 있다. 첫 번째 예로서, 한 쌍의 뉴클레오티드 타입이 동일한 파장에서 검출될 수 있으나, 그 쌍의 다른 구성원에 비해 한 구성원에 대한 세기에서의 차이에 기반하여, 또는 그 쌍의 다른 구성원에 대해 검출된 신호에 비해 명백한 신호가 나타나거나 사라지게 하는 그 쌍의 한 구성원에 대한 변화에 기반하여 (예컨대, 화학적 변형, 광화학적 변형 또는 물리적 변형을 통해) 구별될 수 있다. 두 번째 예로서, 4개의 상이한 뉴클레오티드 타입 중 3개는 특정 조건 하에 검출될 수 있는 반면, 4번째 뉴클레오티드 타입은 그러한 조건 하에 검출가능한 표지가 결여되어 있다. 두 번째 예의 SBS 구체예에서, 핵산으로의 처음 3개 뉴클레오티드 타입의 혼입은 이들의 개개 신호의 존재에 기반하여 확인될 수 있고, 핵산으로의 네 번째 뉴클레오티드 타입의 혼입은 임의의 신호의 부재에 기반하여 확인될 수 있다. 세 번째 예로서, 한 뉴클레오티드 타입은 2개의 상이한 이미지 또는 2개의 상이한 채널에서 검출될 수 있는 반면 (예컨대, 동일한 염기이지만 상이한 표지를 갖는 2개 종의 믹스가 이용될 수 있거나, 2개의 표지를 갖는 단일 종이 이용될 수 있거나 양 채널 모두에서 검출되는 표지를 갖는 단일 종이 이용될 수 있다), 다른 뉴클레오티드 타입은 단지 하나의 이미지 또는 채널에서 검출된다. 이러한 세 번째 예에서, 두 이미지 또는 두 채널의 비교는 상이한 뉴클레오티드 타입을 구별하는 역할을 한다.
상기 단락의 세 예시적인 구성은 상호 배타적이지 않으며 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 예시적인 구체예는 형광 표지를 갖는 가역적으로 차단된 뉴클레오티드 (rbNTP)를 이용하는 SBS 방법이다. 이러한 포맷에서, 4개의 상이한 뉴클레오티드 타입은 서열화되는 핵산 특징부의 어레이에 전달될 수 있고 가역적 차단기로 인해 1회 및 단지 1회의 혼입 사건이 각각의 특징부에서 발생할 것이다. 이러한 예에서 어레이에 전달되는 뉴클레오티드는 제 1 채널에서 검출되는 제 1 뉴클레오티드 타입 (예컨대, 제 1 여기 파장에 의해 여기될 때 제 1 채널에서 검출되는 표지를 갖는 rbATP), 제 2 채널에서 검출되는 제 2 뉴클레오티드 타입 (예컨대, 제 2 여기 파장에 의해 여기될 때 제 2 채널에서 검출되는 표지를 갖는 rbCTP), 제 1 및 제 2 채널 둘 모두에서 검출되는 제 3 뉴클레오티드 타입 (예컨대, 제 1 및/또는 제 2 여기 파장에 의해 여기될 때 양 채널 모두에서 검출되는 적어도 하나의 표지를 갖는 rbTTP) 및 어느 한 채널에서 검출되는 표지가 결여된 제 4 뉴클레오티드 타입 (예컨대, 외부 표지를 갖지 않는 rbGTP)을 포함할 수 있다.
일단 4개의 뉴클레오티드 타입이 상기 예의 어레이와 접촉하면, 예를 들어, 어레이의 두 이미지를 캡쳐하기 위한 검출 절차가 수행될 수 있다. 이미지는 분리된 채널에서 수득될 수 있고 동시에 또는 순차적으로 수득될 수 있다. 제 1 채널의 제 1 여기 파장 및 방출을 이용하여 수득된 첫 번째 이미지는 제 1 및/또는 제 3 뉴클레오티드 타입 (예컨대, A 및/또는 T)을 혼입한 특징부를 도시할 것이다. 제 2 채널의 제 2 여기 파장 및 방출을 이용하여 수득된 두 번째 이미지는 제 2 및/또는 제 3 뉴클레오티드 타입 (예컨대, C 및/또는 T)을 혼입한 특징부를 나타낼 것이다. 각각의 특징부에 혼입된 뉴클레오티드 타입의 명확한 식별은 하기에 도달하는 2개의 이미지를 비교함에 의해 결정될 수 있다: 제 1 뉴클레오티드 타입 (예컨대, A)을 혼입한 제 1 채널에서만 표시되는 특징부, 제 2 뉴클레오티드 타입 (예컨대, C)을 혼입한 제 2 채널에서만 표시되는 특징부, 제 3 뉴클레오티드 타입 (예컨대, T)을 혼입한 양 채널에서 표시되는 특징부 및 제 4 뉴클레오티드 타입 (예컨대, G)을 혼입한 어느 채널에서도 표시되지 않는 특징부. 이러한 예에서 G를 혼입한 특징부의 위치는 다른 사이클 (다른 3개의 뉴클레오티드 타입 중 적어도 하나가 혼입됨)로부터 확인될 수 있음을 주목하라. 4개보다 적은 수의 색상의 검출을 이용하여 4개의 상이한 뉴클레오티드를 구별하는 예시적인 장치 및 방법이 예를 들어 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 일련 번호 61/538,294호에 개시되어 있다.
일부 구체예에서, 핵산은 표면에 부착되어 서열화 전에 또는 서열화 동안에 증폭될 수 있다. 예를 들어, 증폭은 표면 위에 핵산 클러스터를 형성하기 위해 브릿지 증폭을 이용하여 수행될 수 있다. 유용한 브릿지 증폭 방법은, 예를 들어, US 5,641,658; US 2002/0055100; US 7,115,400; US 2004/0096853; US 2004/0002090; US 2007/0128624; 또는 US 2008/0009420 (각각은 본원에 참조로서 포함된다)에 개시된다. 표면 위에서 핵산을 증폭하기에 유용한 또 다른 방법은 예를 들어, 문헌[Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) 및 US 2007/0099208 A1, 각각은 본원에 참조로서 포함됨]에 기재된 회전환 증폭 (RCA)이다. 예를 들어, 문헌[Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), WO 05/010145, US 2005/0130173 또는 US 2005/0064460, 각각은 본원에 참조로서 포함됨]에 기재된 비드 상 에멀젼 PCR도 이용될 수 있다.
상기 개시된 대로, 서열화 구체예는 반복 공정의 예이다. 본 발명의 방법은 반복 공정에 매우 적합하다. 일부 구체예가 하기 및 본원의 다른 곳에 기재된다.
따라서, (a)(i) 광학적으로 투명한 표면을 포함하는 플로우 셀, (ii) 핵산 샘플, (iii) 서열화 반응을 위한 복수의 시약, 및 (iv) 시약을 플로우 셀로 전달하기 위한 유체 시스템을 포함하는 유체 시스템을 제공하는 단계; (b)(i) 복수의 미세형광계로서, 각각의 미세형광계가 x 및 y 차원의 상평면에서 광시야 이미지 검출을 위해 구성된 대물렌즈를 포함하는 복수의 미세형광계, 및 (ii) 샘플 스테이지를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; 및 (c) 카트리지에서 핵산 서열화 절차의 유체 작업 및 검출 장치에서 핵산 서열화 절차의 검출 작업을 수행하는 단계로서, (i) 시약이 유체 시스템에 의해 플로우 셀로 전달되고, (ii) 핵산 특징부의 광시야 이미지가 복수의 미세형광계에 의해 검출되고, 그리고 (iii) 적어도 일부 시약이 플로우 셀로부터 캐시 저장소로 제거되는 단계를 포함하는, 서열화 방법이 본원에 제공된다.
본 출원을 통틀어 다양한 공보, 특허 및/또는 특허 출원이 참조되었다. 이러한 간행물의 기재는 이에 의해 그 전문이 본 출원에 참조로서 포함된다.
포함하는이라는 용어는 본원에서 제한이 없음(open-ended)을 의미하며, 인용된 요소를 포함할 뿐 아니라 다른 추가의 요소도 그 위에 포함한다.
많은 구체예가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구체예가 하기 청구항의 범위 내에 있다.

Claims (80)

  1. 시약 카트리지 및 플로우 셀의 유입구 사이의 유체 소통을 위해 구성된 복수의 채널을 포함하는 시약 매니폴드;
    매니폴드에서 포트로부터 하향 연장되는 복수의 시약 시퍼로서, 각각의 시약 시퍼가 시약 카트리지의 시약 저장소에 배치되도록 구성되어 액체 시약이 시약 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있게 하는 복수의 시약 시퍼;
    저장소 및 플로우 셀의 유입구 사이의 유체 소통을 매개하도록 구성된 적어도 하나의 밸브를 포함하는, 시약 카트리지로부터 플로우 셀로 시약을 전달하기 위한 유체 시스템.
  2. 제 1항에 있어서, 매니폴드의 채널 중 하나 이상이 캐시 저장소를 포함하는 유체 시스템.
  3. 제 2항에 있어서, 캐시 저장소 중 하나 이상이 캐시 저장소와 유체 소통하는 플로우 셀 채널의 부피의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%인 부피를 갖는 유체 시스템.
  4. 제 3항에 있어서, 캐시 저장소가, 플로우 셀로부터의 액체 시약이 플로우 셀과의 접촉 후에 다시 시약 저장소로 유도되지 않도록, 다량의 액체 시약이 하나 이상의 플로우 셀 채널에서 캐시 저장소로 흐를 수 있게 하는 충분한 부피를 포함하는 유체 시스템.
  5. 제 4항에 있어서, 액체 시약의 양이 하나 이상의 플로우 셀 채널에서의 액체 시약의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 포함하는 유체 시스템.
  6. 제 2항에 있어서, 캐시 저장소 중 하나 이상이 캐시 저장소로부터 플로우 셀로 그리고 플로우 셀로부터 다시 캐시 저장소로 액체 시약을 이동시키도록 구성된 펌프와 유체 소통하고, 플로우 셀로의 시약의 유입 및 플로우 셀로부터의 시약의 배출이 플로우 셀의 동일한 포트를 통해 발생하는 유체 시스템.
  7. 제 6항에 있어서, 적어도 하나의 밸브가 액체 시약을 플로우 셀로부터 다시 캐시 저장소 또는 폐기물 저장소로 구별하여 유도하도록 구성되는 유체 시스템.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 캐시 저장소가 캐시 저장소 내 유체의 혼합을 감소시키도록 구성되어, 저장소의 길이를 따라 플로우 셀에 근위인 단부로부터 플로우 셀에 원위인 단부까지 액체 시약의 구배를 유지하는 유체 시스템.
  9. 제 2항에 있어서, 상기 캐시 저장소가 캐시 저장소 내 유체의 혼합을 촉진하도록 구성된 복수의 혼합 부재를 포함하는 유체 시스템.
  10. 제 9항에 있어서, 혼합 부재가 캐시 저장소 또는 캐시 저장소의 내부 표면에 고정된 특징부를 포함하는 유체 시스템.
  11. 제 9항에 있어서, 혼합 부재가 배플 부재를 포함하는 유체 시스템.
  12. 제 2항에 있어서, 상기 캐시 저장소가 S자 채널(serpentine channel)을 포함하는 유체 시스템.
  13. 제 2항에 있어서, 상기 캐시 저장소가 비-원통형의 채널을 포함하는 유체 시스템.
  14. 제 1항에 있어서, 매니폴드가 제 1 시약 저장소로부터 제 1 채널을 통해 제 1 밸브로 시약을 전달하고 제 1 시약 저장소로부터 제 2 채널을 통해 제 2 밸브로 시약을 전달하도록 구성되는 유체 시스템.
  15. 제 14항에 있어서, 매니폴드가 복수의 층을 포함하고, 제 1 및 제 2 채널 각각이 복수의 층의 분리된 층에 존재하는 유체 시스템.
  16. 제 15항에 있어서, 2개의 분리된 채널이 만나서 포트에 T-정션을 형성하는 유체 시스템.
  17. 제 1항에 있어서, 복수의 시약 시퍼 각각이 근위 및 원위 단부를 지닌 관상 몸통을 포함하고, 원위 단부가 시약 카트리지의 시약 저장소를 덮는 포일 층을 관통하도록 구성된 뾰족한 끝으로 점점 가늘어지는 유체 시스템.
  18. 제 17항에 있어서, 복수의 시약 시퍼에 원위에서 근위 단부로 관상 몸통을 통해 진행되는 단일 루멘이 제공되고, 루멘이 시약 카트리지 및 시약 매니폴드 사이에서 유체 소통하도록 구성되는 유체 시스템.
  19. 제 17항에 있어서, 시약 시퍼의 서브세트가 복수의 시약 시퍼에서의 다른 시약 시퍼보다 짧은 길이를 갖는 유체 시스템.
  20. 제 19항에 있어서, 서브세트의 길이가 다른 시약 시퍼보다 적어도 1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2.0 mm 더 짧은 유체 시스템.
  21. 제 1항에 있어서, 시약 시퍼 중 적어도 하나가 팁이 시약 카트리지의 시약 웰의 바닥에 충돌할 때 구부러지도록 구성된 순응 팁(compliant tip)을 포함하는 유체 시스템.
  22. 제 1항에 있어서, 시스템이 검출 장치에 의한 플로우 셀에서의 핵산 특징부의 검출을 위한 구성에서 검출 장치에 작동적으로 결합되는 유체 시스템.
  23. 제 22항에 있어서, 검출 장치가 복수의 미세형광계를 포함하고, 각각의 미세형광계가 x 및 y 차원의 상평면에서 광시야 이미지 검출을 위해 구성된 대물렌즈를 포함하는 유체 시스템.
  24. 제 1항에 있어서, 매니폴드가 10개 내지 20개 포트를 포함하고, 각각의 포트가 적어도 하나의 밸브와 유체 소통하는 채널에 시약 시퍼를 커플링하도록 구성된 유체 시스템.
  25. 제 1항에 있어서, 시약 시퍼에 평행한 축에서 매니폴드로부터 하향 연장되는 하나 이상의 정렬 핀을 추가로 포함하고, 정렬 핀이 시약 시퍼보다 길고 시약 카트리지 상의 상응하는 인터페이스 슬롯(interface slot)과 맞물리도록 구성되는 유체 시스템.
  26. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 밸브가 복수의 유입구 포트 및 하나 이상의 배출구 포트를 갖고, 각각의 유입구 포트가 시약 시퍼와 유체 소통하고 각각의 배출구 포트가 플로우 셀의 유입구 또는 폐기물 용기와 유체 소통하는 유체 시스템.
  27. 제 1항에 있어서, 시스템이 플로우 셀의 제 1 채널 및 제 2 채널을 가로질러 분리된 시약을 동시에 전달하도록 구성된 제 1 밸브 및 제 2 밸브를 포함하는 유체 시스템.
  28. 제 27항에 있어서, 제 1 및 제 2 채널을 가로지르는 시약 흐름이 반대 방향으로 발생하는 유체 시스템.
  29. 제 1항에 있어서, 기포를 검출하기 위한 센서를 추가로 포함하고, 센서가 시약 저장소 및 플로우 셀 사이의 유체 경로를 따라 정위되는 유체 시스템.
  30. 제 29항에 있어서, 센서가 밸브 중 하나 및 플로우 셀 사이의 유체 라인을 따라 정위되는 유체 시스템.
  31. 제 29항에 있어서, 센서가 시약 저장소와 밸브 중 하나 사이의 유체 라인을 따라 정위되는 유체 시스템.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항의 유체 시스템과 유체 소통으로 상호작용하도록 구성된 시약 카트리지.
  33. 액체 시약이 시약 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있도록 유체 시스템의 복수의 시약 시퍼를 z 차원을 따라 동시에 채용하도록 구성된 복수의 시약 저장소로서, 시약 저장소가 x 및 y 차원에서 상부, 중간 및 하부 열로 배열되고, 카트리지의 상부 및 하부 열에 따른 시약 저장소가 하나 이상의 중간 열의 시약 저장소보다 z 차원을 따라 더 깊은, 복수의 시약 저장소; 및
    유체 시스템의 상응하는 정렬 핀과 맞물리도록 구성된 적어도 2개의 인터페이스 슬롯을 포함하는 시약 카트리지.
  34. 제 32항 또는 제 33항에 있어서, 상기 카트리지가 복수의 시약 저장소에 상응하는 구성으로 배열된 복수의 세척 저장소를 추가로 포함하고, 이에 의해 시약 시퍼가 시약 저장소와 맞물리지 않을 때 세척 저장소가 시약 시퍼를 동시에 채용하도록 구성되어 세척 완충제가 세척 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있는 시약 카트리지.
  35. 제 34항에 있어서, 유체 시스템의 시약 시퍼가 세척 저장소와 정렬하여 정위되도록 유체 시스템의 상응하는 정렬 핀과 맞물리도록 구성된 적어도 2개의 추가의 인터페이스 슬롯을 추가로 포함하는 시약 카트리지.
  36. 제 32항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 시약 저장소 중 적어도 하나를 덮는 포일 층을 포함하는 시약 카트리지.
  37. 적어도 10개, 15개, 또는 20개 포트를 포함하는 다층 확산 결합된 시약 매니폴드로서, 각각의 포트가 시퍼를 통해 분리된 시약 저장소로부터 시약을 끌어 당기도록 구성되고, 포트가 매니폴드에서 유체 채널을 통해 플로우 셀의 하나 이상의 채널과 유체 소통하는, 다층 확산 결합된 시약 매니폴드.
  38. 제 37항에 있어서, 제 1 밸브 및 제 2 밸브를 포함하고, 제 1 밸브에 연결된 채널이 제 1 층에 존재하고, 제 2 밸브에 연결된 채널이 제 2 층에 존재하는 시약 매니폴드.
  39. 제 37항에 있어서, 매니폴드의 채널 중 하나 이상이 캐시 저장소를 포함하는 시약 매니폴드.
  40. 제 39항에 있어서, 캐시 저장소 중 하나 이상이 캐시 저장소와 유체 소통하는 플로우 셀 채널의 부피의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%인 부피를 갖는 시약 매니폴드.
  41. 제 39항에 있어서, 캐시 저장소가, 플로우 셀로부터의 액체 시약이 플로우 셀과의 접촉 후에 다시 시약 저장소로 유도되지 않도록, 다량의 액체 시약이 하나 이상의 플로우 셀 채널에서 캐시 저장소로 흐를 수 있게 하는 충분한 부피를 포함하는 시약 매니폴드.
  42. 제 39항에 있어서, 액체 시약의 양이 하나 이상의 플로우 셀 채널에서의 액체 시약의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 포함하는 시약 매니폴드.
  43. 제 39항에 있어서, 캐시 저장소 중 하나 이상이 캐시 저장소로부터 플로우 셀로 그리고 플로우 셀로부터 다시 캐시 저장소로 액체 시약을 이동시키도록 구성된 펌프와 유체 소통하고, 플로우 셀로의 시약의 유입 및 플로우 셀로부터의 시약의 배출이 플로우 셀의 동일한 포트를 통해 발생하는 시약 매니폴드.
  44. 제 39항에 있어서, 적어도 하나의 밸브가 액체 시약을 플로우 셀로부터 다시 캐시 저장소 또는 폐기물 저장소로 구별하여 유도하도록 구성되는 시약 매니폴드.
  45. 제 39항에 있어서, 상기 캐시 저장소가 캐시 저장소 내 유체의 혼합을 감소시키도록 구성되어, 저장소의 길이를 따라 플로우 셀에 근위인 단부로부터 플로우 셀에 원위인 단부까지 액체 시약의 구배를 유지하는 시약 매니폴드.
  46. 제 39항에 있어서, 상기 캐시 저장소가 캐시 저장소 내 유체의 혼합을 촉진하도록 구성된 복수의 혼합 부재를 포함하는 시약 매니폴드.
  47. 제 46항에 있어서, 혼합 부재가 배플 부재를 포함하는 시약 매니폴드.
  48. 제 39항에 있어서, 상기 캐시 저장소가 S자 채널을 포함하는 시약 매니폴드.
  49. 제 39항에 있어서, 상기 캐시 저장소가 비-원통형의 채널을 포함하는 시약 매니폴드.
  50. 제 37항에 있어서, 매니폴드가 제 1 시약 저장소로부터 제 1 채널을 통해 제 1 밸브로 시약을 전달하고 제 1 시약 저장소로부터 제 2 채널을 통해 제 2 밸브로 시약을 전달하도록 구성되는 시약 매니폴드.
  51. 제 37항에 있어서, 포트로부터 하향 연장되는 복수의 시약 시퍼를 포함하고, 액체 시약이 시약 저장소로부터 시퍼로 끌어 당겨질 수 있도록 각각의 시약 시퍼가 시약 카트리지의 시약 저장소 내에 정위되도록 구성되는 시약 매니폴드.
  52. 제 37항에 있어서, 복수의 시약 시퍼 각각이 근위 및 원위 단부를 지닌 관상 몸통을 포함하고, 원위 단부가 시약 카트리지의 시약 저장소를 덮는 포일 층을 관통하도록 구성된 뾰족한 끝으로 점점 가늘어지는 시약 매니폴드.
  53. 제 52항에 있어서, 복수의 시약 시퍼에 원위에서 근위 단부로 관상 몸통을 통해 진행되는 단일 루멘이 제공되고, 루멘이 시약 카트리지 및 시약 매니폴드 사이에서 유체 소통하도록 구성되는 시약 매니폴드.
  54. 제 52항에 있어서, 시약 시퍼의 서브세트가 복수의 시약 시퍼에서의 다른 시약 시퍼보다 짧은 길이를 갖는 시약 매니폴드.
  55. 제 54항에 있어서, 서브세트의 길이가 다른 시약 시퍼보다 적어도 1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2.0 mm 더 짧은 시약 매니폴드.
  56. 제 37항에 있어서, 시약 시퍼 중 적어도 하나가 팁이 시약 카트리지의 시약 웰의 바닥에 충돌할 때 구부러지도록 구성된 순응 팁을 포함하는 시약 매니폴드.
  57. a) 액체 시약을 시약 저장소로부터, 시약 저장소 및 플로우 셀의 적어도 하나의 채널과 유체 소통하는 캐시 저장소로 끌어 당기는 단계;
    b) 시약을 캐시 저장소로부터 플로우 셀의 적어도 하나의 채널로 수송하는 단계;
    c) 플로우 셀로부터의 액체 시약이 플로우 셀과의 접촉 후에 다시 시약 저장소로 유도되지 않도록 플로우 셀 채널 상의 시약의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 캐시 저장소로 수송하는 단계; 및
    d) 단계 b) 및 c)를 반복하여 플로우 셀 상의 액체 시약의 재사용을 달성하는 단계를 포함하는, 시약 재사용 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 캐시 저장소 중 하나 이상이 캐시 저장소로부터 플로우 셀로 그리고 플로우 셀로부터 다시 캐시 저장소로 액체 시약을 이동시키도록 구성된 펌프와 유체 소통하고, 플로우 셀로의 시약의 유입 및 플로우 셀로부터의 시약의 배출이 플로우 셀의 동일한 포트를 통해 발생하는 방법.
  59. 제 58항에 있어서, 단계 c)의 캐시 저장소로 수송되지 않은 플로우 셀로부터의 시약이 폐기물 저장소로 수송되는 방법.
  60. 제 57항에 있어서, 단계 b) 및 c) 중 어느 하나 또는 둘 모두에서의 수송이 캐시 저장소와 플로우 셀을 유체적으로 연결하는 밸브를 통해 수행되는 방법.
  61. 제 57항에 있어서, 단계 b) 및 c) 중 어느 하나 또는 둘 모두에서의 수송이 단일 방향으로의 유체 흐름으로 수행되는 방법.
  62. 제 57항에 있어서, 단계 b) 및 c) 중 어느 하나 또는 둘 모두에서의 수송이 왕복 흐름으로 수행되는 방법.
  63. 제 57항에 있어서, 액체 시약이 핵산 서열화를 수행하기 위한 시약을 포함하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 시약이 폴리머라제를 포함하는 방법.
  65. 제 63항에 있어서, 시약이 뉴클레오티드 또는 상이한 뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 방법.
  66. 제 57항에 있어서, 하나 이상의 상이한 시약이 단계 d)를 수행하기 전에 플로우 셀 상으로 흐르는 방법.
  67. 제 57항에 있어서, 단계 c)에서 다시 캐시 저장소로 흐른 시약이 캐시 저장소에서 유사한 시약과 혼합되어, 단계 b) 및 c)의 복수의 반복으로부터의 유사한 시약을 포함하는 혼합된 시약을 형성하는 방법.
  68. 제 57항에 있어서, 다시 캐시 저장소로 흐른 시약과 새로운 시약의 혼합이 캐시 저장소에서 최소화되는 방법.
  69. 제 57항에 있어서, 상기 방법이 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항의 유체 시스템 또는 제 37항 내지 제 56항 중 어느 한 항의 매니폴드 상에서 수행되는 방법.
  70. 검출 장치; 및
    제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항의 유체 시스템을 포함하는 서열화 시스템.
  71. (a) (i) 광학적으로 투명한 표면을 포함하는 플로우 셀,
    (ii) 핵산 샘플,
    (iii) 서열화 반응을 위한 복수의 시약, 및
    (iv) 시약을 플로우 셀로 전달하기 위한 유체 시스템을 포함하는 유체 시스템을 제공하는 단계;
    (b) (i) 복수의 미세형광계로서, 각각의 미세형광계가 x 및 y 차원의 상평면에서 광시야 이미지 검출을 위해 구성된 대물렌즈를 포함하는 복수의 미세형광계; 및
    (ii) 샘플 스테이지를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; 및
    (c) 카트리지에서 핵산 서열화 절차의 유체 작업 및 검출 장치에서 핵산 서열화 절차의 검출 작업을 수행하는 단계로서,
    (i) 시약이 유체 시스템에 의해 플로우 셀로 전달되고
    (ii) 핵산 특징부의 광시야 이미지가 복수의 미세형광계에 의해 검출되고, 그리고
    (iii) 적어도 일부 시약이 플로우 셀로부터 캐시 저장소로 제거되는 단계를 포함하는, 핵산을 서열화하는 방법.
  72. 제 71항에 있어서, 유체 시스템이 폐기물 저장소를 추가로 포함하고, 핵산 서열화 절차의 유체 작업이 시약의 적어도 일부를 플로우 셀로부터 페기물 저장로소 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  73. 제 71항에 있어서, 캐시 저장소가 캐시 저장소로부터 플로우 셀로 그리고 플로우 셀로부터 다시 캐시 저장소로 액체 시약을 이동시키도록 구성된 펌프와 유체 소통하고, 플로우 셀로의 시약의 유입 및 플로우 셀로부터의 시약의 배출이 플로우 셀의 동일한 포트를 통해 발생하는 방법.
  74. 제 71항에 있어서, 단계 (c)(iii)에서 캐시 저장소로 수송되지 않은 플로우 셀로부터의 시약이 폐기물 저장소로 수송되는 방법.
  75. 제 71항에 있어서, 단계 (c)(i) 또는 단계 (c)(iii)에서의 시약 전달이 캐시 저장소와 플로우 셀을 유체적으로 연결하는 밸브를 통해 수행되는 방법.
  76. 제 71항에 있어서, 단계 (c)(i) 또는 단계 (c)(iii)에서의 시약 전달이 단일 방향으로의 유체 흐름으로 수행되는 방법.
  77. 제 71항에 있어서, 단계 (c)(i) 또는 단계 (c)(iii)에서의 시약 전달이 왕복 흐름으로 수행되는 방법.
  78. 제 71항에 있어서, 액체 시약이 핵산 서열화를 수행하기 위한 시약인 방법.
  79. 제 78항에 있어서, 시약이 폴리머라제인 방법.
  80. 제 78항에 있어서, 시약이 뉴클레오티드 또는 상이한 뉴클레오티드의 혼합물인 방법.
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