KR20180068997A - 인 비트로 간 구조체의 제조방법 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
인공 간 구조체를 제조하는데 유용한 세포 조성물이 본 명세서에 제공된다. 세포 조성물은 조합된, (a) 간 세포, (b) 쿠퍼 세포, (c) 간 성상 세포, (d) 시누소이드 내피 세포, 및 (e) 담관 세포를 포함할 수 있다.
Description
관련출원
본 출원은 2015년 10월 15일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/241,966호의 이익을 주장하며, 그의 개시가 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다.
정부지원
본 발명은 SSC 퍼시픽(Space and Naval Warfare Systems Center Pacific) 산하 국방 위협 감소 기구(Defense Threat Reduction Agency)(DTRA)가 제공한 계약번호 N66001-13-C-2027에 따른 정부 지원에 의해서 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.
많은 세포 배양 시스템은 전통적으로 2차원적인(2D) 방법에 의존해 왔다. 그러나 종래의 2D 시스템은 생체 내(in vivo)에서 발견되는 세포간 및 세포보다 큰 구조(intercellular and supracellular structures)는 재현하지 못한다. 생체 내 기관의 생리와 기능을 모델링(modeling)하기 위해 다양한 3D 배양 시스템이 개발되었다. 탈세포화된 기관과 같은 생물학적으로 유도된 기질(matrices), 합성 폴리머 같은 인공 기질 및 세포외 단백질과 폴리머의 하이브리드, 하이드로겔 및 무기 기질(inorganic substrates)이 3D 지지체(scaffold) 구조를 생성하고 생체 내 기관 구조(in vivo organ architecture)를 재현(recapitulate)하는데 사용되어 왔다. 과학자들은 위빙(weaving), 전기방사(electrospinning), 바이오프린팅(bioprinting), 미세기계가공(micromachining) 및 몰딩(molding)과 같은 제조 방법에서 이러한 바이오, 합성 및 하이브리드 재료를 통합(incorporate)했다. 이러한 방법은 유용한 구조적 복잡성을 생성할 수는 있지만, 낮은 재현성, 높은 가변성, 낮은 확장성 및 제조의 어려움이 있다. 예를 들면, 전반적으로 Godoy et al., Arch Toxicol, 87, 1315-1530 (2013); Khetani et al., J Lab Autom. pii: 2211068214566939 (23 Jan 2015); Bale et al., Exp. Biol. Med. 239(9), 1180-1191 (2014)을 참조한다.
Cavnar et al., J Lab Autom 19 (2), 208-214 (2014)이 3D 구조체를 형성하는 방법의 개발과 장치의 구성을 기술하나, 3D 구조체의 생물학적 구성 요소에서 기술 수준을 발전시키지는 않는다. Gunnes et al., Toxicol. Sci. 133(1), 67-78 (2013)는 간 세포(hepatocytes)와 비-실질 세포(non-parenchymal cells)의 혼합물을 사용하여 간 오가노이드(organoid)를 제조하는데 어려움이 있으며, 이는 세포주의 이용를 통해 회피됨을 기술하였다. Kim and Rajagopalan, PLoSOne 5(11), e15456 (2010)는 간 세포와 내피 세포가 조합된 3D 간 배양물(3D hepatic culture)을 기술한다. Messner et al., Arch Toxicol 87, 209-213 (2013)는 3D 간 스페로이드(liver spheroid)를 조립하기 위한 현적배양(hanging drop) 방법의 이용을 기술하지만, 간 세포, 쿠퍼 세포 및 내피(비개시 타입) 세포의 비개시(undisclosed) 혼합물을 사용했다.
발명의 요약
일부 구체예에 따르면, 인공 간 구조체(artificial liver constructs)의 제조에 유용한 세포 조성물은 조합된, (a) 간 세포(hepatocyte cells), (b) 쿠퍼 세포(Kuppfer cells), (c) 간 성상 세포(hepatic stellate cells), (d) 시누소이드 내피 세포(sinusoidal endothelial cells) 및 (e) 담관 세포(cholangiocyte cells)를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, (a) 상기 간 세포는 개수 기준으로 70 내지 90 %의 양으로 포함될 수 있고, (b) 상기 쿠퍼 세포는 개수 기준으로 5 내지 20 %의 양으로 포함될 수 있으며, (c) 상기 간 성상 세포는 개수 기준으로 2 내지 10 %의 양으로 포함될 수 있고, (d) 상기 시누소이드 내피 세포는 개수 기준으로 2 내지 10 %의 양으로 포함될 수 있으며, 및 (e) 상기 담관 세포는 개수 기준으로 1 내지 4 %의 양으로 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 포유동물 세포일 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 배양 조성물은 수성 배양 배지 중에 전술된 세포 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 배양 배지는 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 인공 간 구조체는 전술된 세포 조성물 또는 전술된 배양 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 인공 간 구조체는 100 내지 300 미크론(micron)의 직경을 가질 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 전술된 인공 간 구조체를 제조하는 방법은 전술된 배양 조성물을 사용한, 현적배양 방법(hanging drop culture method), 중력-강제 자가-조립 방법(gravity-enforced self-assembly method) 또는 미세 가공된 몰드(microfabricated mold)를 사용하는 방법을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 조성물은 (a) 하이드로겔 및 (b) 상기 하이드로겔 중 전술된 복수 개의 인공 간 구조체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 장치는 (a) 내부에 하나 이상의 챔버를 포함하는 기판(substrate) 및 (b) 상기 챔버 중 전술된 하나 이상의 인공 간 구조체 또는 상기 챔버 중 전술된 조성물을 포함할 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 장치를 제조하는 방법은 (a) 기판을 제공하는 단계, 및 (b) 하나 이상의 전술된 구조체 또는 전술된 조성물을 상기 기판 상에 침착(depositing)시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 침착시키는 단계는 바이오프린팅(bioprinting), 피펫팅(pipetting), 미세주입(microinjection) 또는 미세유체 침착(microfluidic deposition)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 약리학적 및/또는 독성학적 활성에 대해 화합물을 스크리닝하는 방법은 (a) 전술된 장치를 제공하는 단계, (b) 상기 인공 간 구조체에 화합물을 투여하는 단계, 및 그 후 (c) 상기 인공 간 구조체의 하나 이상의 세포로부터 상기 화합물에 대한 약리학적 및/또는 독성학적 반응을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 예시적 구체예의 상세한 설명
본 발명이 이하, 본 발명의 구체예를 보여주는 첨부된 도면을 참조하여 보다 완전하게 설명된다. 그러나, 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본명세서에 기재된 구체예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이들 구체예는 본 개시를 철처하고 완전하게 하고, 본 발명의 범위를 당업자에게 충분히 전달할 수 있도록 제공된다. 본 명세서에 인용된 모든 미국 특허 문헌의 개시는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용된, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에 달리 명시되지 않는 한, 복수 형태도 포함한다. 본 명세서에서 사용될때, 용어 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 명시된 특징, 단계, 조작, 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹 또는 조합의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 단계, 조작, 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹 또는 조합의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "및/또는(and/or)"은 연관되어 열거된 항목의 모든 가능한 조합 또는 하나 이상, 및 대안적으로("또는") 해석될때 조합의 부재를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 통상적으로 사용되는 사전에서 정의된 용어들과 같은, 용어는 명세서 및 청구항의 문맥에서의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명시적으로 정의되지 않는 한, 이상화되거나(idealized) 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안되는 것으로 이해될 것이다. 잘 알려져 있는 기능 또는 구조(construction)는 간결성 및/또는 명료성을 위해서 상세하게 서술되지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "세포(cell)"는 일반적으로 개, 고양이, 소, 염소, 말, 양, 마우스, 토끼, 랫트 등의 포유동물 세포이다. 일부 바람직한 구체예에서, 세포는 인간 세포이다. 적합한 세포는 공지되어 있고, 상업적으로 이용 가능하고 및/또는 공지된 기법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,737,270호를 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 "배지(media)" 또는 "배양 배지(culture media)"는 본 발명을 수행하는데 사용되는 세포의 성장, 생존 또는 저장을 위해 제공되는 수성 용액을 의미한다. 배지 또는 배양 배지는 천연유래(natural)이거나 인공적일 수 있다. 배지 또는 배양 배지는 기본 배지를 포함할 수 있으며, 배지에서 배양되는 세포의 세포 생존력, 성장, 증식 및/또는 분화와 같은, 원하는 세포 활성을 촉진하기 위해 영양소(예를 들면, 염, 아미노산, 비타민, 미량 원소, 항산화제)로 보충될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "기본 배지(base media)"는 세포내 및/또는 세포외 삼투압 균형을 유지시키고 정상적인 세포 대사에 필수적인 특정 벌크 무기 이온(bulk inorganic ions) 및 물을 세포에 제공하는, 기타 성분 및 염의 수용액 또는 기초 염 영양소(basal salt nutrient)를 의미한다. 일부 구체예에서, 기본 배지는 생리학적 pH 범위 내에서 배지를 유지시키는 완충 시스템 및/또는 에너지원으로서 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 기본 배지의 예는 PBS(phosphate buffered saline), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640, MCDB 131, 클릭 배지(Click's medium), 맥코이(Macoy's) 5A 배지, 배지 199(Medium 199), 윌리엄 배지 E(William's Medium E), 그레이스(Grace's) 배지와 같은 곤충 배지(insect media), Ham's F-10(Ham's Nutrient mixture F-10), Ham's F-12, αMEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 이스코브 변형 둘벡코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 출원공보 US20150175956을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 "세포외 기질 단백질(Extracellular Matrix Proteins)"(또는 "ECM")은 공지되어 있으며, 그 개시가 전체로서 본 명세서에 참조에 의해 포함된, Y Zhang 등의 미국 특허 출원공보 US 20130288375에 개시된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한 예를 들면, Skardal et al., Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function, Biomaterials 33(18): 4565-75 (2012)를 참조한다.
하이드로겔(가교 가능한 하이드로겔을 포함하나 이에 한정되지 않는다)과 같이 일반적으로 "바이오잉크(bioink)"에 의한 세포의 "바이오프린팅 (bioprinting)"은 공지된 기술이며, 다양한 공지된 방법 및 장치에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 출원공보 US20080194010; PCT 출원공보 WO2016/064648A1를 참조한다.
세포를 배양하는 "현적배양(hanging drop)" 방법 및 이에 유용한 장치는 공지되어 있고, 공지된 기법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제7,112,241호; 미국 특허 출원공보 제20030235519A1호; 제20130040855A1호; 제20140179561호; 및 제20130084634A1호; 및 PCT 출원공보 WO2012117083A3를 참조한다.
세포 조성물. 인공 간 구조체(또는 "오가노이드(organoid)")의 제조에 유용한 세포 조성물은 조합된, (a) 간 세포, (b) 쿠퍼 세포, (c) 간 성상 세포, (d) 시누소이드 내피 세포 및 (e) 담관 세포를 포함할 수 있다. 일반적으로:
(a) 간 세포는 개수 기준으로(by number) 70 내지 90 %(가장 바람직하게는 78 %)의 양으로 포함되고,
(b) 쿠퍼 세포는 개수 기준으로 5 내지 20 %(가장 바람직하게는 10 %)의 양으로 포함되며,
(c) 간 성상 세포는 개수 기준으로 2 내지 10 %(가장 바람직하게는 5 %)의 양으로 포함되고,
(d) 시누소이드 내피 세포는 개수 기준으로 2 내지 10 %(가장 바람직하게는 5 %)의 양으로 포함되며; 및
(e) 담관 세포는 개수 기준으로 1 내지 4 %(가장 바람직하게는 2 %)의 양으로 포함된다.
배양 조성물. 세포 조성물은 기관-형성(organ-forming) 배양 배지(예를 들면, 수성 기관-형성 배양 배지)에서 배합되어 배양 조성물을 제공할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 배양 배지는 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 단백질(예를 들면, 라미닌(laminin), I형 콜라겐, IV형 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin), 엘라스틴(elastin) 또는 이들의 조합)을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 ECM 단백질은 하나 이상의 I형 콜라겐을 포함할 수 있다. 바람직하게는, ECM 단백질(들)은 적합한 양, 전형적으로는 10 ng/ml 내지 1 mg/ml(바람직하게는 1 내지 10㎍/ml)로 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 기관-형성 배양 배지는 10 내지 30 중량%(가장 바람직하게는 20 중량%)의 혈청(예를 들면, 열에 의해 불활성화된 소태아혈청)을 포함할 수 있다.
인공 간 구조체. 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포 조성물을 포함하거나 그로부터 제조될 수 있는 인공 간 구조체는 현적배양(hanging drop culture)과 같은 적합한 기법에 의해 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 인공 간 구조체는 100 또는 200 내지 250 또는 300 미크론(micron)의 직경을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 인공 간 구조체 내의 모든 세포의 총 수는 100 또는 1,000개 내지 2,000 또는 10,000개(바람직하게는, 오가노이드당 약 1,500개 또는 1,000개의 세포)일 수 있다. 일부 구체예에서, 인공 간 구조체는 (i) 간 세포 미세융모(hepatocyte microvilli), 모세 담관 유사 구조(bile canaliculus like structures) 및/또는 리소좀(lysosome)중 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 모두의 존재; 및/또는 (ⅱ) 배양에서 유지되는 10, 20 또는 30일 이상의 시간 동안 요소(urea), 알부민(albumin) 및/또는 알파 1-항 트립신(alpha 1-antitrypsin)중 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 모두의 발현에 의해 특징지어질 수 있다
인공 간 구조체를 제조하는 방법. 일부 구체예에서, 인공 간 구조체는 스페로이드 배양(spheroid culture) 방법(즉, 무지지체 응집 배양 방법(scaffold-free aggregate culture methods))을 이용하여 제조될 수 있다. 스페로이드 배양 방법은 세포가 스스로를 별개의 층으로 구조화할 수 있는 공동 배양(co-culture)에 유용할 수 있다. 구체적으로, 현적배양 방법을 이용하여 인공 간 구조체를 나타내는 자가-조립 세포 응집 구조(self-assembled cellular aggregate structures)를 제조할 수 있다. 현적배양 방법은 배양 기판(예를 들면, 현적 플레이트(hanging drop plate))에 배양 조성물을 포함하는 액적(droplet)을 침착시키는 단계 및 배양 조성물에서 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 현적배양 방법은 선택적으로 세포 배양 전에 배양 기판을 뒤집는 것을 포함할 수 있다. 현적배양 방법은 세포가 기판의 표면에 매달려있는 액적의 바닥에 응집체(aggregate)를 형성하게 한다. Foty, Ramsey, A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids, Journal of Visualized Experiments: JoVE, no. 51. doi:10.3791/2720 (2011)를 참조한다. 현적배양 방법은 액적(drop)에 접종된 세포의 수에 기초하여 균일한 크기의 조직을 생성할 수 있다. Mehta et al., Opportunities and Challenges for Use of Tumor Spheroids as Models to Test Drug Delivery and Efficacy, Journal of Controlled Release 164 (2): 192-204 (2012)를 참조한다. 인스페로(InSphero)(Schlieren, Switzerland) 및 3D 바이오매트릭스(3D Biomatrix)(Ann Arbor, Michigan, USA)의 상용 현적 플레이트를 사용하여 인공 간 구조체를 생성할 수 있다. 그러나 중력-강제 자가-조립 방법(gravity-enforced self-assembly methods)(예를 들면 Kelm et al., Trends Biotechnol. 2004, 22 : 195-202 (1997) 참조) 또는 미세 제작된 몰드(microfabricated molds) (예를 들면 Yeon et al., PLos One 2013, 8 (9), e73345 참조)를 사용하는 방법과 같이, 상호 작용하는 기판의 부재하에 인접한 세포-세포 접촉(close cell-cell contact)을 용이하게 하는 방법이 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 인공 간 구조체를 형성하기 위해 기능성 첨가제(functional additives)가 배양 조성물에 첨가될 수 있다. 라미닌, 콜라겐 I 또는 IV, 피브로넥틴 또는 엘라스틴과 같은 세포외 기질(ECM)로부터 유래된 소량의 단백질이 배양 조성물에 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 간 세포외 기질(ECM)로부터 유래된 단백질이 배양 조성물에 첨가될 수 있다. 세포-결합 단백질의 바람직한 조성 및 농도는 1 내지 10㎍/mL의 콜라겐(예를 들면, I형 콜라겐)이다. 또한, 일부 구체예에서, 배양 조성물은 > 10 %, 바람직하게는 20 %의 높은 분량(fraction)의 혈청(예를 들면 열에 의해 불활성화된 소태아혈청)을 갖는다.
하이드로겔(hydrogel) 조성물. 전술된 인공 간 구조체 또는 오가노이드는 그 자체로 사용될 수 있거나, 추가 사용을 위해, 하이드로겔, 예를 들면 가교성 하이드로겔(cross-linkable hydrogel)과 조합될 수 있다. 적합한 하이드로겔은 공지되어 있고, Skardal et al., A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs, Acta Biomater. 25: 24-34 (2015)에서 기술된 것들을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
하이드로겔은 천연-유래 하이드로겔(naturally-derived hydrogel)과 합성 하이드로겔의 두 가지 주요 카테고리로 나뉜다. 천연-유래 하이드로겔과 합성 하이드로겔은 혼합되어 하이브리드 하이드로겔(hybrid hydrogel)을 형성할 수 있다. 천연-유래 하이드로겔은 콜라겐과 알지네이트(alginate) 및 세포주에서 수집된 천연 세포외 기질 단백질로 제조된, 매트리젤®(Matrigel®)을 포함할 수 있다. 천연-유래 하이드로겔은 탈세포화된 조직 추출물을 사용할 수 있다. 세포외 기질은 특정 조직으로부터 수집될 수 있고, 해당 조직 유형의 세포를 지지하는데 사용되는 하이드로겔 물질과 조합될 수 있다. Skardal et al., Tissue Specific Synthetic ECM Hydrogels for 3-D in vitro Maintenance of Hepatocyte Function, Biomaterials 33 (18): 4565-75 (2012)를 참조한다. 키토산 하이드로겔(chitosan hydrogel)은 여러 다른 세포 유형을 지지(supportive)하고, 분해 가능한 천연-유래 하이드로겔의 예이다. 예를 들면, Moura et al., In Situ Forming Chitosan Hydrogels Prepared via Ionic/Covalent Co-Cross-Linking, Biomacromolecules 12 (9): 3275-84 (2011)를 참조한다. 히알루론산 하이드로겔(Hyaluronic acid hydrogels)도 사용될 수 있다. 예를 들면 Skardal et al., A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs, Acta Biomater. 25: 24-34 (2015)를 참조한다.
합성 하이드로겔은 다양한 물질(예, 폴리-(에틸렌 글리콜))로부터 및 다수의 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 천연-유래 하이드로 겔과는 대조적으로, 합성 하이드로겔은 균일하게 생성될 수 있으며 쉽게 재현 가능하고, 특징화(characterized)될 수 있다. 그러나, 합성 하이드로겔은 천연 세포외 기질에서 발견되는 활성 부위와 같은, 세포의 기능적 신호가 부족할 수 있어서 세포를 지원하는 능력(potential)이 제한될 수 있다. 예를 들면, Mahoney et al., Three-Dimensional Growth and Function of Neural Tissue in Degradable Polyethylene Glycol Hydrogels, Biomaterials 27 (10): 2265-74 (2006)를 참조한다. 하이브리드 하이드로겔은 절충(compromise)을 제공할 수 있으며 특정 미세 환경을 재구성하는 능력에 대한 보다 많은 제어를 가능하게 할 수 있다. 확정된 합성 하이드로겔(defined synthetic hydrogels)과 세포외 기질 분자(예를 들어, 세포외 기질 단백질)와 같은 천연 성분을 조합함으로써, 보다 쉽게 재생 가능하고 기능적인 하이드로겔이 생성될 수 있다. 예를 들면, Salinas et al., Chondrogenic Differentiation Potential of Human Mesenchymal Stem Cells Photoencapsulated within Poly(Ethylene Glycol)-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine Thiol-Methacrylate Mixed-Mode Networks, Tissue Engineering 13 (5): 1025-34 (2007)를 참조한다.
인공 간 구조체의 바이오프린팅. 일부 구체예에서 전술된 인공 간 구조체는 바이오프린팅 기법을 이용하여 하이드로겔(예를 들면, 생체 적합성 하이드로겔)과 조합될 수 있다. 일부 구체예에서, 하이드로겔은 압출가능한(extrudable) 하이드로겔 조성물(또는 "바이오잉크")일 수 있다. 하이드로겔 조성물은 가교성 프리폴리머(cross-linkable prepolymer) 및 후-침착 가교기(post-deposition crosslinking group)를 포함할 수 있다. 가교성 프리폴리머는 아크릴레이트계 가교제(예를 들면, 폴리에틸렌 (글리콜) 디아크릴레이트(polyethylene (glycol) diacrylate)(PEGDA)를 포함할 수 있고, 후-침착 가교기는 알카인계 가교제(alkyne-based crosslinkers)(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 알카인(polyethylene glycol (PEG) alkyne), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8-암 알카인(polyethylene glycol (PEG) 8-arm alkyne))을 포함할 수 있다. 하이드로겔 조성물은 또한 티올화 히알루론산(HA)(thiolated hyaluronic acid), 티올화 젤라틴(thiolated gelatin) 및 비변형(unmodified) HA, 젤라틴 및/또는 세포외 기질(ECM) 물질(예를 들면, 간 ECM 물질)을 포함할 수 있다.
하이드로겔 조성물이 준비되고, 티올-아크릴레이트 결합(thiol-acrylate binding)을 통해 자발적으로 가교되어 연질의 압출가능한 물질을 생성할 수 있다. 바이오프린팅은 압출가능한 하이드로겔 조성물을 침착시킴으로써 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 하이드로겔 조성물은 침착 전에, 실온 및 대기압에서 0.05, 0.1 또는 0.5 내지 1, 5 또는 10 킬로파스칼(kPa), 또는 그 이상의 강도(stiffness)를 가질 수 있다. 바이오프린팅된 구조는 하이드로겔 조성물의 강도를 증가시키기에 충분한 양만큼 가교성 프리폴리머와 후-침착 가교기를 가교시킴으로써 목표강도(target stiffness)를 갖게할 수 있다. 일부 구체예에서, 가교 단계는 실온 및 대기압에서 하이드로겔 조성물의 강도를 1 또는 5에서 10, 20 또는 50 킬로파스칼(kPa), 또는 이상까지 증가시킬 수 있다. 가교 단계는, 예를 들면, 하이드로겔 조성물을 가열하고, 빛(예를 들어, 주변 광, UV 광)으로 하이드로겔 조성물을 조사하고 및/또는 하이드로겔 조성물의 pH를 변화시킴으로써 수행될 수 있다.
장치. 본 발명의 인공 간 구조체 또는 오가노이드의 인 비트로 화합물 스크리닝에 유용한 장치는 전형적으로 (a) 내부에 형성된 하나 이상의 챔버(챔버는 바람직하게는 그 내부에 형성된 유입 및 유출 개구부(inlet and outlet opening)를 포함함)를 갖는 기판 또는 장치 본체(예를 들어, 미세유체 장치(microfluidic device))를 제공하는 단계; 및 (b) 전술된 하나 이상의 구조체(그 자체 또는 하이드로겔과 조합된 조성물)를 챔버에 침착시키는 단계에 의해 생성된다. 침착 단계는 바이오프린팅, 피펫팅, 미세주입, 미세유체 침착 등과 같은, 적합한 기법에 의해 수행될 수 있다. 장치는 펌프, 배양 배지 저장소(들)(culture media reservoir(s)), 검출기 등을 포함하는 보다 큰 장치(apparatus)로의 삽입 또는 "플러그인(plug in)"을 위한 카트리지 형태로 제공될 수 있다.
장치 본체 또는 미세유체 장치 자체는 적합한 재료 또는 재료들의 조합으로 형성될 수 있다. 예는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)(PDMS), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate)(PMMA), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 관능화된(functionalized) PEG(예를 들면, PEG 디아크릴레이트, PEG 디아크릴아미드, PEG 디메타크릴레이트 등 또는 다중-암(multi-arm) 형태의 전술된 PEG 중 하나)를 포함한, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 가교를 지원하는 화학기로 관능화된 유도체를 포함한, 가교 또는 경화될 수 있는 단백질 또는 천연 폴리머(예를 들면, 히알루론산, 젤라틴, 콘드로이틴 설페이트, 알긴산 염 등) 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 장치 본체는 몰딩(molding), 주조(casting), 부가 제조(additive manufacturing)(3D 프린팅), 리소그래피(lithography) 등, 그 조합을 포함한 적절한 프로세스에 의해서 형성될 수 있다.
장치 보관(Storing) 및 운반(shipping). 일단 제조되면, 카트리지 형태의 전술된 장치는 즉시 사용되거나 저장 및/또는 운반을 위해 준비될 수 있다.
제품을 보관하고 운반하기 위해, 물과 혼합된 젤라틴과 같이, 실온(예를 들면, 25 ℃)에서 유동가능한 액체이지만, 냉장 온도(예를 들면, 4 ℃)에서 겔화 또는 고화되는 임시 보호성 지지 매질(transient protective support media)이 장치에 첨가되어 챔버(들) 및 바람직하게는, 관련된 도관(associated conduits)을 실질적으로 또는 완전하게 충전시킬 수 있다. 유입구 및 유출구 포트는 적절한 캡핑 요소(capping element)(예를 들면, 플러그) 또는 캡핑 물질(capping material)(예를 들면, 왁스)로 캡핑될 수 있다. 그 다음, 장치는 냉각 요소(예를 들면, 얼음, 드라이 아이스, 열전기 냉각기 등)와 함께 포장될 수 있으며, 모두가 (바람직하게는 절연된) 패키지 내에 배치될 수 있다.
일부 구체예에서, 제품을 보관하고 운반하기 위해, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 블록 코폴리머와 같이 냉각된 온도(예를 들면, 4 ℃)에서 유동가능한 액체이지만, 실온(예를 들면, 20 ℃) 또는 체온(예를 들면, 37 ℃)과 같은 따뜻한 온도에서 겔화 또는 고화되는 임시 보호성 지지 매질이 챔버(들) 및 바람직하게는 관련된 도관을 실질적으로 또는 완전하게 충전시키기 위해 장치에 첨가될 수 있다.
수령 시에, 최종 사용자는 간단하게 관련된 패키지 및 냉각 요소에서 장치를 꺼낼 수 있고,(임시 보호성 지지 매질의 선택에 따라서) 온도를 상승시키거나 하강시킬 수 있으며, 포트들을 언캡핑(uncap)할 수 있고, 주사기(syringe)로 (예를 들면, 성장 배지로 플러싱(flushing)함에 의해) 임시 보호성 지지 매질을 제거할 수 있다.
장치 사용 방법. 전술된 장치는 약리학적 및/또는 독성학적 활성에 대해 화합물(또는 화합물들)의 인 비트로 스크리닝(고속 대량 스크리닝(high through-put screening) 포함)에 사용될 수 있다.
이러한 스크리닝은: (a) 전술된 장치를 제공하는 단계; (b) 인공 간 구조체에 화합물을 투여하는 단계(예를 들면, 구조체를 포함하는 챔버를 통해 유동하는 성장 배지에 첨가함으로써); 및 그 후 (c) 구조체의 하나 이상의 세포로부터 화합물에 대한 약리학적 및/또는 독성학적 반응을 검출하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 반응의 검출은 감지되는 특정 반응 또는 일련의 반응(set of response)에 따라, 현미경 검사, 조직학, 면역 분석법 등, 및 이들의 조합을 포함한 적합한 기법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 반응 또는 반응들은 세포사(노화(senescence) 및 세포사멸(apoptosis) 포함), 세포 증식(예를 들면, 양성 및 전이성 세포 증식), 화합물의 흡수, 분포, 대사 또는 배출(ADME) 또는 생리학적 반응(예를 들면, 하나 이상의 세포에 의한 화합물 생산의 상향 조절 또는 하향 조절), 또는 약리학적 및/또는 독성학적 활성과 관련된 기타 생물학적 반응일 수 있다.
본 발명은 하기의 비-한정적인 실시예에서 보다 상세히 설명된다.
도 1은 본 발명의 구체예의 2 주령 간 구조체에 대한 기본적인 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 구체예의 새로 형성된 간 구조체의 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 3은 CellTiter-Glo ATP 분석에 의해 입증된, 본 발명의 구체예의 간 구조체의 장기간 생존력을 보여준다.
도 4는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 의한 간 바이오마커 요소의 장기간 생성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 의한 간 바이오마커 알부민의 장기간 생성을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 구체예의 간 구조체에 의한 간 바이오마커 알파 1-항트립신의 장기간 생성을 나타낸다.
도 7은 2D 배양물 대비, 본 발명의 구체예의 3D 간 구조체에 의한 디아제팜(diazepam)에서 테마제팜(temazepam)으로의 장기간 대사를 나타낸다.
도 8은 2D 배양물 대비, 본 발명의 구체예의 3D 간 구조체에 의한 디아제팜에서 노르디아제팜(nordiazepam)으로의 장기간 대사를 나타낸다.
도 9는 리포폴리사카라이드(LPS)에 대한 본 발명의 구체예의 간 구조체의 장기간 염증 반응을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 구체예의 간 구조체의 장기간 안정성 및 생존력을 도시하고, 도 10c는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 대한 LIVE/DEAD 염색 결과를 도시하며, 도 10d-10j는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 대한 조직학적 및 면역조직화학적 염색 결과를 나타낸다.
도 11a-11e는 2D 배양물 대비, 본 발명의 구체예의 3D 간 구조체의 장기간 간 기능 및 대사의 기준선(baseline)을 나타낸다.
도 12는 디아제팜의 간 구조체 대사를 도시한다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 구체예의 새로 형성된 간 구조체의 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 3은 CellTiter-Glo ATP 분석에 의해 입증된, 본 발명의 구체예의 간 구조체의 장기간 생존력을 보여준다.
도 4는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 의한 간 바이오마커 요소의 장기간 생성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 의한 간 바이오마커 알부민의 장기간 생성을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 구체예의 간 구조체에 의한 간 바이오마커 알파 1-항트립신의 장기간 생성을 나타낸다.
도 7은 2D 배양물 대비, 본 발명의 구체예의 3D 간 구조체에 의한 디아제팜(diazepam)에서 테마제팜(temazepam)으로의 장기간 대사를 나타낸다.
도 8은 2D 배양물 대비, 본 발명의 구체예의 3D 간 구조체에 의한 디아제팜에서 노르디아제팜(nordiazepam)으로의 장기간 대사를 나타낸다.
도 9는 리포폴리사카라이드(LPS)에 대한 본 발명의 구체예의 간 구조체의 장기간 염증 반응을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 구체예의 간 구조체의 장기간 안정성 및 생존력을 도시하고, 도 10c는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 대한 LIVE/DEAD 염색 결과를 도시하며, 도 10d-10j는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 대한 조직학적 및 면역조직화학적 염색 결과를 나타낸다.
도 11a-11e는 2D 배양물 대비, 본 발명의 구체예의 3D 간 구조체의 장기간 간 기능 및 대사의 기준선(baseline)을 나타낸다.
도 12는 디아제팜의 간 구조체 대사를 도시한다.
A. 재료.
세포의 출처. 간 세포/담관 세포는 Triangle Research Labs (6 Davis Drive, Research Triangle Park, North Carolina USA 27709)로부터 제품 번호 HUCP16로 입수했다. 쿠퍼 세포는 Life Technologies/ThermoFisher Scientific (81 Wyman Street, Waltham, Massachusets USA 02451)에서 제품 번호 HUKCCS로 입수했다. 간 성상 세포는 ScienCell(6076 Corte Del Cedro, Carlsbad, California USA 92011)에서 제품 번호 HHSteC/3830으로 입수했다. 시누소이드 내피 세포는 ScienCell으로부터 제품 번호 HHSEC/5000으로 입수했다.
기관 형성 배지(Organ Formation Media). 20% 열 불활성화 소태아 혈청(heat inactivated fetal bovine serum) 및 10㎍/ml의 랫트 꼬리 I형 콜라겐(rat tail collagen type I)을 함유하는, 완전 간 세포 배양 배지(Complete Hepatocyte culture medium)(Lonza). 배지는 다음과 같이 제조된다: Lonza Hepatocyte Basal Culture Medium (product CC3197) 500ml에 제조자에 의해 특정된 양의 single-quot supplements(product # CC4182) 아스코르빈산(Ascorbic acid), 소혈청알부민(지방산 불포함), 인간 표피 성장 인자(human epidermal growth factor), 트랜스페린(transferrin), 인슐린(insulin) 및 젠타마이신(gentamycin)을 첨가한다. 하이드로코르티손(Hydrocortisone) 보충물은 염증 반응을 향상시키기 위해 생략한다. 이 배지에 20 % 열 불활성화 소태아혈청 (Atlanta Biologicals product # S11550H)과 10㎍/ml의 무균 랫트 꼬리 I 형 콜라겐 (Life technologies product # A1048301)을 첨가한다.
3D 구조체 유지 배지(3D Construct Maintenance Media). 이 배지는 앞서 제조된 완전 간 세포 배양 배지로 구성되지만, 소태아혈청이나 랫트 꼬리 콜라겐이 제외된다.
B. 방법.
간 세포, 쿠퍼 세포, 간 성상 세포, 담관 세포 및 시누소이드 내피 세포의 혼합물로부터 간 기관 구조체를 생성한다. 간 세포의 혼합물은 이전에 사용되었지만, 이 혼합물의 조성은 더 긴 지속기간(duration of performance)과 더 높은 성능을 제공한다. 세포의 수와 기관 구조의 크기(dimension)도 생체 내(in vivo) 구조와 기능을 더 잘 나타낸다. 구체적으로, 사용되는 세포의 총 수의 범위는 100-10,000개이며, 바람직하게는 약 1,000개 또는 1,500개이다. 개수(number) 기준으로 세포 혼합물의 바람직한 조성물은 간 세포, 쿠퍼 세포, 간 성상 세포, 시누소이드 내피 세포 및 담관 세포가 각각 78 %: 10 %: 5 %: 5 %: 2 %이다.
현적배양(Hanging drop) 방법은 미세 간 구조(micro liver structure)를 나타내는 자가-조립된(self-assembled) 세포 응집 구조를 생성하기 위해 사용되었다. 본 개시의 중요한 부분은 간 세포 응집체의 형성을 가능하게 하는 기술적 방법이다. 다수의 세포주 및 종양 세포와는 달리, 본 명세서에 개시된 세포 혼합물이 단지 배양 배지에서 혼합되고 현적(hanging drops)으로 분배되는 경우, 응집체 구조를 즉시 형성하지 않는다. 본 개시는 이 세포의 혼합물이 3D 구조를 형성하기 위한 조건 및 기능성 첨가제를 포함한다. 라미닌, 콜라겐 I 또는 IV, 피브로넥틴 또는 엘라스틴과 같은 세포외 기질(ECM)에서 유래된 소량의 단백질을 세포 혼합물에 첨가한다. 세포-결합 단백질의 바람직한 조성 및 농도는 1 내지 10㎍/mL의 콜라겐(예를 들면, I형 콜라겐)이다. 또한, 세포 혼합물은 높은 분량(fraction)의 혈청, 바람직하게는 불활성화된 소태아혈청 >10%, 바람직하게는 20%를 포함한다.
약 3일간의 배양 후, 세포의 혼합물은 직경이 약 200-250 미크론인 3D 구조 체로 변형된다. 일단 형성되면, 3D 간 구조체를 혈청이 존재 또는 부재된 통상적인 간 세포 유지 배지에서 지속시킬 수 있다. 3D 간 구조체는 생존력 및 기능, CYP 활성, 염증 반응 및 간 특이적 바이오마커 생산과 같은 주요한(highly relevant) 생리 기능이 오래 지속된다. 알부민, 요소 및 α-1 항 트립신의 생산은 3D 구조체의 안정적인 장기 배양을 보여준다(아래 참조). 대표적인 시토크롬 450 이소형(cytochrome 450 isozymes) 3A4 및 2C19의 활성은 4주 보다 길게 지속된 활성을 나타낸다. 또한, 간 기관 구조체는 아래와 같이, 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 염증 자극에 반응할 수 있다.
일단 형성되면, 구조체는 생체 적합성 하이드로겔에 통합(incorporate)되고, 그 내부에 3D 간 구조체가 현탁(suspend)된다. 하이드로겔의 조성은 간 구조체의 3D 구조를 유지하기 위해 개발되었다. 통상적인 ECM-유래 또는 합성 하이드로겔은 간 구조체의 구조를 유지하고 생물학적 활성을 지지할 수 없다. Skardal et al., Acta Biomater. 25, 24-34, (2015)에서 기술된, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA) 및 폴리에틸렌-알카인의 2개의 성분은 40-100 Pa 사이의 영률(Young's modulus)을 갖는 하이드로겔을 생성시키는데 사용되었다. 3D 간 구조체는 하이드로겔에서 현탁될 수 있기 때문에 바이오프린팅이 가능하다. 바이오프린팅은 분석 장치와 기구 내에서 기관 구조체의 공간 배열에 대한 제어를 제공한다.
C. 결과.
2주령 간 구조체에 대한 기본적인 면역조직화학 염색(immunohistochemistry staining) 결과가 도 1에 제시된다. 새롭게 형성된 간 구조체의 전자현미경 이미지가 도 2a 및 도 2b에 제시된다. 도 3에서 CellTiter-Glo ATP 분석법을 통해 간 구조체의 장기간 생존력이 입증되었다.
도 4는 인공 간 구조체에 의한 간 바이오마커인 요소의 장기간 생산을 나타낸다. 도 5는 인공 간 구조체에 의한 간 바이오마커 알부민의 장기간 생산을 나타낸다. 도 6은 인공 간 구조체에 의한 간 바이오마커 알파-1-항트립신의 장기간 생산을 나타낸다.
도 7은 2D 배양물 대비, 3D 간 구조체에 의한 디아제팜에서 테마제팜으로의 장기간 대사를 나타낸다. 도 8은 2D 배양물 대비, 3D 간 구조체에 의한 디아제팜에서 노르디아제팜으로의 장기간 대사를 나타낸다.
도 9는 리포폴리사카라이드(LPS)에 대한 간 구조체의 장기간 염증 반응을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 구체예의 간 구조체의 장기간 안정성 및 생존율을 도시하고, 도 10c는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 대한 LIVE/DEAD 염색 결과를 나타내며, 도 10d-10j는 본 발명의 구체예의 간 구조체에 대한 조직학적 및 면역조직화학적 염색 결과를 나타낸다. 도 10a. 평균 오가노이드 직경은 28일 동안 일관되게 유지된다. 도 10b. 간 오가노이드는 ATPase의 발광 판독에 의해 결정된 바와 같이, 28일 동안 대사 활성을 유지한다. 도 10c. LIVE/DEAD 염색(14 일차에 도시됨)은 오가노이드에서 높은 세포 생존력을 보여준다. 녹색-칼세인(calcein) AM 염색-살아있는 세포; 적색-에티디움 호모다이머(ethidium homodimer)-1 염색-죽은 세포; 직경 261㎛. 도 10d 내지 도 10j. 조직학적 및 면역조직화학적 염색은 오가노이드 구조 및 구성(organization)을 나타낸다. 도 10d. H & E 염색은 전체 오가노이드 형태를 보여준다. 일차 인간 간 세포(primary human hepatocytes)는 알부민 발현으로 확인되고(도 10e), 세포막 주위의 E-카데린(E-cadherin) 발현을 통해 상피 구성을 나타내고(도 10f), 또한 코넥신 32(connexin 32)(도 10g) 및 시토크롬 P450 환원효소(cytochrome P450 reductase)를 발현한다(도 10h). 간 성상 세포 및 쿠퍼 세포는 각각 GFAP(도 10i) 및 CD68(도 10j)에 의해 확인된다. 보라색-헤마톡실린(hematoxylin)-염색된 핵; 분홍색-세포질; 갈색은 표시된 얼룩(stain); 스케일 바-100㎛.
도 11a 내지 11e는 2D 배양물 대비, 본 발명의 구체예의 3D 간 구조체의 장기간 간 기능 및 대사의 기준선(base line)을 나타낸다. ELISA 및 비색 분석법(colorimetric assays)으로 분석한, 정규화된(nomalized) 요소(도 11a) 및 알부민(도 11b)의 배지로의 분비는 2-D 간 세포 샌드위치 배양 대비 3-D 오가노이드 포맷(format)에서 현저하게 증가된 기능적 생산(functional output)을 보여준다. 주로 CYP2C19 및 CYP3A4에 의한 디아제팜의 대사산물인 테마제팜(도 11c), 노르디아제팜(도 11d) 및 옥사제팜(도 11e)의 정량. 통계적 유의성: * 각 시점에서 3-D와 2-D 비교간의 p < 0.05.
도 12는 시토크롬 p450 이소형에 의한 디아제팜의 테마제팜, 노르디아제팜 및 옥사제팜으로의 간 구조체 대사를 나타낸다.
전술은 본 발명의 설명이며, 그를 한정하는 것으로 받아들여서는 안 된다. 본 발명은 하기 청구항에 의해 정의되며, 청구항의 균등물은 그에 포함된다.
Claims (24)
- 조합된, (a) 간 세포(hepatocyte cell), (b) 쿠퍼 세포(Kuppfer cell), (c) 간 성상 세포(hepatic stellate cell), (d) 시누소이드 내피 세포(sinusoidal endothelial cell) 및 (e) 담관 세포(cholangiocyte cell)를 포함하는, 인공 간 구조체(artificial liver construct)의 제조에 유용한 세포 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
(a) 상기 간 세포는 개수 기준으로 70 내지 90 %의 양으로 포함되며,
(b) 상기 쿠퍼 세포는 개수 기준으로 5 내지 20 %의 양으로 포함되고,
(c) 상기 간 성상 세포는 개수 기준으로 2 내지 10 %의 양으로 포함되며,
(d) 상기 시누소이드 내피 세포는 개수 기준으로 2 내지 10 %의 양으로 포함되고, 및
(e) 상기 담관 세포는 개수 기준으로 1 내지 4 %의 양으로 포함되는 것인 세포 조성물.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 것인 세포 조성물.
- 수성 배양 배지에 청구항 1 내지 청구항 3의 세포 조성물을 포함하는 배양 조성물로서, 상기 배양 배지는 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 단백질을 추가로 포함하는 것인 배양 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 단백질은 I 형 콜라겐을 포함하는 것인 배양 조성물.
- 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서, 상기 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 단백질은 10 ng/ml 내지 1 ㎎/ml의 양으로 포함되는 것인 배양 조성물.
- 청구항 4 내지 청구항 6에 있어서, 상기 배양 배지는 10 내지 30 중량%의 혈청을 추가로 포함하는 것인 배양 조성물.
- 청구항 1 내지 청구항 3의 세포 조성물, 또는 청구항 4 내지 청구항 7의 배양 조성물을 포함하는 인공 간 구조체.
- 청구항 8에 있어서, 상기 인공 간 구조체는 100 내지 300 미크론(micron)의 직경을 갖는 것인 인공 간 구조체.
- 청구항 8 또는 청구항 9에 있어서, 상기 인공 간 구조체 중 모든 세포의 총 개수가 100 내지 10,000개인 것인 인공 간 구조체.
- 청구항 8 내지 청구항 10에 있어서, 상기 인공 간 구조체는
(i) 간 세포 미세융모(hepatocyte microvilli), 모세 담관 유사 구조(bile canaliculus like structures) 및/또는 리소좀(lysosome) 중 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 모두의 존재; 및/또는
(ⅱ) 배양에서 유지되는 10일 이상의 시간 동안 요소(urea), 알부민(albumin) 및/또는 알파 1-항 트립신(alpha 1-antitrypsin) 중 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 모두의 발현을 특징으로 하는 것인 인공 간 구조체.
- 청구항 8 내지 청구항 11에 있어서, 상기 인공 간 구조체는 응집체 형태(aggregate form)인 것인 인공 간 구조체.
- 청구항 8 내지 12의 인공 간 구조체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 4 내지 청구항 7의 배양 조성물을 사용한, 현적배양 방법(hanging drop culture method), 중력-강제 자가-조립법(gravity-enforced self-assembly method) 또는 미세 가공된 몰드(microfabricated mold)를 사용하는 방법을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 현적배양 방법을 수행하는 단계는
청구항 4 내지 청구항 7의 배양 조성물을 포함하는 액적(droplet)을 배양 기판(culturing substrate) 상에 침착시키는 단계; 및 그 후
상기 배양 조성물에서 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- (a) 하이드로겔; 및
(b) 상기 하이드로겔 중 복수 개의 청구항 8 내지 청구항 12의 인공 간 구조체를 포함하는, 조성물.
- (a) 내부에 하나 이상의 챔버를 포함하는 기판; 및
(b) 상기 챔버 중 청구항 8 내지 청구항 12의 하나 이상의 인공 간 구조체 또는 상기 챔버 중 청구항 15의 조성물을 포함하는, 장치.
- 청구항 16에 있어서, 상기 장치는 상기 챔버 중 겔화된 형태의 임시 보호성 지지 매질(transient protective support media)과 함께 용기 내에, 및 선택적으로 상기 용기 중 냉각 요소와 함께 포장되는 것인 장치.
- 장치를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) 기판을 제공하는 단계; 및
(b) 하나 이상의 청구항 8 내지 청구항 12의 구조체 또는 청구항 15의 조성물을 상기 기판 상에 침착시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 침착시키는 단계는 바이오프린팅(bioprinting), 피펫팅(pipetting), 미세주입(microinjection) 또는 미세유체 침착(microfluidic deposition)에 의해 수행되는 것인 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 침착시키는 단계는 상기 기판에 청구항 15의 조성물을 바이오프린팅하는 것에 의해 수행되고,
상기 하이드로겔은 상기 침착 단계 전에 자발적으로 가교되도록 구성된 가교성 프리폴리머(cross-linkable prepolymer) 및 상기 침착 단계 후에 상기 가교성 프리폴리머와 가교되도록 구성된 후-침착 가교기(post-deposition crosslinking group)를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 20에 있어서, 상기 하이드로겔에 빛을 조사함으로써 상기 후-침착 가교기를 상기 가교성 프리폴리머와 가교시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 20 또는 청구항 21에 있어서, 상기 가교성 프리폴리머는 폴리에틸렌 (글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA)를 포함하고,
상기 후-침착 가교기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 알카인을 포함하는 것인 방법.
- 약리학적 및/또는 독성학적 활성에 대해 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 제 16 항의 장치를 제공하는 단계;
(b) 상기 인공 간 구조체에 화합물을 투여하는 단계; 및 그 후
(c) 상기 인공 간 구조체의 하나 이상의 세포로부터 상기 화합물에 대한 약리학적 및/또는 독성학적 반응을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 23에 있어서, 상기 반응은 세포사(cell death), 세포 성장(cell growth), 상기 화합물의 흡수, 분포, 대사 또는 배설(absorption, distribution, metabolism, or excretion), 또는 생리적 반응을 포함하는 것인 방법.
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