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KR20180050339A - 글리칸 어레이 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20180050339A
KR20180050339A KR1020187008928A KR20187008928A KR20180050339A KR 20180050339 A KR20180050339 A KR 20180050339A KR 1020187008928 A KR1020187008928 A KR 1020187008928A KR 20187008928 A KR20187008928 A KR 20187008928A KR 20180050339 A KR20180050339 A KR 20180050339A
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cancer
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ssea
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lipid
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KR1020187008928A
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페이웬 유
웨이-치엔 탕
수-이 린
쳉-치 왕
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오비아이 파머 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 링커 및 링커로 어레이를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 어레이 상의 다양한 유형의 분자에 결합하는 작용제를 확인하고 그 작용제에 결합하는 어레이 상의 분자의 구조적 요소를 정의하는 방법에 관한 것이다. 본원에 제공된 어레이 및 방법은 에피토프 확인, 약물 발견을 위해 및 분석 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명은 암의 검출, 진단, 재발 모니터링 및 예방에 유용한, 유용한 글리칸 및 에피토프 결정기를 제공한다.

Description

글리칸 어레이 및 사용 방법
본 발명은 링커 및 링커로 어레이를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 어레이 상의 다양한 유형의 분자에 결합하는 작용제를 확인하고 그 작용제에 결합하는 어레이 상의 분자의 구조적 요소를 정의하는 방법에 관한 것이다. 본원에 제공된 어레이 및 방법은 에피토프 확인, 약물 발견을 위해 및 분석 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명은 암의 검출, 진단, 재발 모니터링 및 예방에 유용한, 유용한 글리칸 및 에피토프 결정기를 제공한다.
글리칸은 세포와 그의 환경 사이에서 전형적으로 제일 및 잠재적으로 가장 중요한 계면이다. 모든 살아있는 시스템의 생체 구성성분으로서, 글리칸은 인식, 부착, 운동성 및 신호전달 과정에 수반된다: (1) 살아있는 유기체 내 모든 세포, 및 바이러스는 다양한 유형의 글리칸으로 코팅되고; (2) 글리코실화는 모든 살아있는 유기체에서 발생하는 번역후 또는 번역-동시 변형이며; (3) 변경된 글리코실화는 인간 병리상태의 발달에 있어서 초기 지점 및 가능하게는 임계점의 지표이다. (Jun Hirabayashi, Oligosaccharide microarrays for glycomics, 2003, Trends in Biotechnology. 21(4): 141-143; Sen-Itiroh Hakomori, Tumor-associated carbohydrate antigens defining tumor malignancy: Basis for development of and-cancer vaccines, 2001, Advances in Experimental Medicine and Biology. 491:369-402.) 이들 세포-확인 글리코실화 분자는 당단백질 및 당지질을 포함하고, '렉틴'으로 불리는 다양한 글리칸-인식 단백질에 의해 특이적으로 인식된다. 그러나, 이들 상호작용의 막대한 복잡성, 및 잘-정의된 글리칸 라이브러리 및 분석 방법의 결여는 당쇄체학의 발달에 있어서 주요 장애물이었다.
뉴클레오티드 및 단백질 마이크로어레이의 개발은 게놈, 유전자 발현 및 프로테옴 연구에 대변혁을 일으켰다. 이들 어레이의 혁신의 속도가 폭발적이었지만, 글리칸 마이크로어레이의 개발은 비교적 느렸다. 이에 대한 한 이유는 화학적으로 및 구조적으로 다양한 글리칸의 집단을 확실하게 고정화시키는 것이 어려웠다는 것이다. 더욱이, 글리칸은 핵산 및 단백질에 상용적으로 적용되는 다수의 현재 이용가능한 분자 기술에 의한 분석 (예컨대 급속 서열분석 및 시험관내 합성)을 용이하게 따르지 않는다.
글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4 (탄수화물 글리칸의 글로보 시리즈), 및 시알릴 루이스 A (SLea), 루이스 A (Ley), 시알릴 루이스 X (SLex) 및 루이스 X (Lex)는 암 세포의 표면 상에서 발현되는 항원이고, 유방, 췌장, 위, 결장직장, 폐, 구강, 난소 및 전립선을 포함한 폭넓은 범위의 상이한 암 유형에 특이적이다.
글로보 H는 구조 (Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)를 갖는 헥사사카라이드이며, 이는 다양한 유형의 암, 특히 유방암, 전립선암 및 폐암 상에서 고도로 발현되는 항원 탄수화물 패밀리의 구성원이다 (Kannagi R, et al. J Biol Chem 258:8934-8942, 1983; Zhang SL, et al. Int J Cancer 73:42-49, 1997; Hakomori S, et al. Chem Biol 4:97-104, 1997; Dube DH, et al. Nat Rev Drug Discov 4:477-488, 2005). 글로보 H는 당지질로서 및 가능하게는 당단백질로서 암 세포 표면 상에서 발현된다 (Menard S, et al. Cancer Res 43:1295-1300, 1983; Livingston PO Cancer Biol 6:357-366, 1995). 유방암 환자의 혈청은 글로보 H 에피토프에 대한 높은 수준의 항체를 함유한다 (Menard S, et al. Cancer Res 43:1295-1300, 1983).
스테이지-특이적 배아 항원-3으로 또한 공지되어 있는 SSEA-3, Gb5로 또한 공지되어 있으며 구조 (2Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1)를 갖는 글로보펜타오스; 및 스테이지-특이적 배아 항원-4로 또한 공지되어 있으며 구조 (Neu5Acα2→ 3Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1)를 갖는 SSEA-4는 글로보 H의 유사체이다. 시알릴 루이스 X (SLex)는 구조 α-NeuNAc-(2→3)-β-D-Gal-(1→4)(α-L-Fuc-[1→3])-D-GlcNAc를 갖는 테트라사카라이드, 3'-SLex이다. 시알릴 루이스 A (SLea)는 구조 α-NeuNAc-(2→3)-β-D-Gal-(1→3)-(α-L-Fuc-[1→4])-D-GlcNAc를 갖는 테트라사카라이드, 3'-SLea이다. Lex로 또한 공지되어 있는 Lex는 구조 Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-를 갖는다. Ley로 또한 공지되어 있는 Ley는 구조 Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-를 갖는다.
본 개시내용은 한 측면에서 글리칸, 예를 들어 글로보시리즈 글리칸 (글로보시리즈 글리코스핑고지질 항원) 및/또는 종양 연관 탄수화물 항원 (TACA)의 효율적 검출 및 결합을 용이하게 할 수 있는 링커 조성물 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 도 1을 참조한다. 추가로, 용어 "글로보시리즈 글리칸 경로"는 도 2에 기재된 글리코스핑고지질의 생합성 경로를 지칭한다.
TACA는 다음 2종의 부류로 나누어질 수 있다: 당단백질 항원 및 당지질 항원. 당단백질 항원은, 예를 들어 다음을 포함 또는 제외할 수 있다: (1) 뮤신은, 예를 들어 다음을 포함 또는 제외할 수 있다: α-2,6-N-아세틸갈락토사미닐 (Tn), 톰센-프린드라이히 (TF) 및 시알릴-Tn (sTn) 및 (2) 폴리시알산 (PSA). 당지질 항원은, 예를 들어 다음을 포함 또는 제외할 수 있다: (1) 글로보 시리즈 항원은, 예를 들어 다음을 포함 또는 제외할 수 있다: 글로보 H, SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, Gb3 및 Gb4; (2) 혈액형 결정기는, 예를 들어 다음을 포함 또는 제외할 수 있다: 루이스x (Lex), 루이스y (Ley), 루이스a (Lea), 시알릴 루이스x (sLex) 및 시알릴 루이스a (SLea) 및 (3) 강글리오시드는, 예를 들어 다음을 포함 또는 제외할 수 있다: GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1 및 Neu5GcGM3.
한 측면에서, 본 발명은 다양한 적용에 사용될 수 있는 링커를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 링커는 다음을 포함 또는 제외할 수 있는 기재에 분자를 부착하는데 사용될 수 있다: 표면, 고체 표면, 입자, 어레이 또는 비드. 링커는, 일부 측면에서, 탄수화물과 상호작용하는 제1 모이어티 및 표면과 상호작용하는 제2 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 링커, 및 링커-글로보시리즈 글리칸 또는 다른 TACA를 포함한 링커-TACA, 링커-글로보 시리즈 당단백질 접합체를 포함 또는 제외할 수 있는 링커 및 글리칸의 접합체, 및 이들의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 예시적인 글로보시리즈 글리칸은 SSEA-3, SSEA-4 및 글로보 H를 포함 또는 제외할 수 있다. 예시적인 글로보시리즈 당단백질은 펩티드 또는 단백질에 부착된 SSEA-3, SSEA-4 및 글로보 H를 포함 또는 제외할 수 있다. 추가의 TACA 글리칸은, 예를 들어 Ley, SLea 및 SLex를 포함 또는 제외할 수 있다. TACA는 또한 예시적인 글리칸 중 어느 것의 n-펜틸아민-관능화 변이체, 예를 들어 SSEA-3, SSEA-4, Gb3, Gb4, 글로보 H, Ley, SLea 및 SLex의 n-펜틸아민-관능화 변이체를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 링커에 의한 것을 포함한 기재에 접합된 글리칸을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 기재 상에 고정화된 탄수화물의 어레이에 관한 것이며, 어레이는 복수종의 G-A-Z 탄수화물을 포함하고, 각각의 G-A-Z 모이어티는 기재 상의 개별 위치에 놓여 있고, 여기서 G는 1종 이상의 TACA이고; A는 알킬, 에스테르 또는 아미드를 포함하는 모이어티이고; Z는 1종 또는 복수종의 지질 쇄 및 1종 또는 복수종의 지질 쇄에 연결된 스페이서 기로부터 선택된다.
본 발명은 또한 링커를 갖는 글리칸 어레이 (또는 마이크로어레이), 및 이러한 글리칸 어레이 또는 마이크로어레이를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 어레이 상의 탄수화물과 샘플로부터의 분자 사이의 결합 복합체를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 다양한 유형의 글리칸이 다른 분자와 하는 상호작용을 확인 및 분석하기 위해 이러한 어레이를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 글리칸 어레이 및 스크리닝 방법은 탄수화물 결합 파트너, 예를 들어 글리칸 결합 단백질, 수용체, 항체, 항체 단편 또는 나노입자, 핵산, 압타머, 렉틴, 또는 글리칸이 결합할 다른 분자 또는 물질을 확인하는데 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 글리칸 라이브러리 및 글리칸 어레이는 글리칸-결합 파트너 특징화, 수용체 리간드 특징화, 결합 복합체의 검출 및 그의 결합 강도, 세포 막 상 및 세포하 성분 내 탄수화물의 확인, 항체 에피토프 확인, 효소 특징화 및 라이브러리 스크리닝, 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝에 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 글리칸이 링커 분자, 예컨대 본원에 개시된 바와 같은 링커 분자에 의해 어레이에 부착되어 있는 글리칸의 어레이를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 (a) 탄수화물 결합 모이어티를 포함하는 샘플을 기재 상에 고정화된 1종 이상의 종양 연관 탄수화물의 어레이와 접촉시키며, 어레이는 고체 기재의 표면 상의 개별 위치에 고정화된 복수종의 탄수화물을 포함하는 것이고; (b) 1종 이상의 고정화된 탄수화물과 탄수화물에 특이적으로 결합하는 것으로 추측되는 적어도 1종의 탄수화물 결합 모이어티와의 복합체를 형성시키고; (c) 복합체를 검출하는 것에 관한 것이다. 검출은 분자에 커플링된 검출가능한 표지 또는 리포터 또는 제1 결합 분자에 특이적인 2차 결합 분자를 검출하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 (임의로 코팅된) 고체 기재의 표면 상에서 생성된 리포터 신호의 강도가 관능화 기재 상에서보다 더 높은 감도로 검출가능하다. 탄수화물 결합 모이어티는 다음을 포함 또는 제외할 수 있다: 샘플 중 분자, 항체, 유출된 항원, 분비된 단백질, 세포, 세포하 단편 또는 다른 세포 성분. 일부 측면에서, 본 발명은 기재 상에 고정화된 탄수화물의 어레이에 관한 것이며, 어레이는 고체 기재의 표면 상의 개별 위치에 고정화된 복수종의 탄수화물을 포함하고, 여기서 (a) 1종 이상의 종양 연관 탄수화물 항원 (TACA)을 포함하는 고정화된 탄수화물은 검출 방법 및/또는 시약에 의해 검정될 수 있고; (b) 고정화된 탄수화물과 탄수화물에 특이적으로 결합하는 것으로 추측되는 제1 결합 분자 사이의 결합 반응의 분석이 수행될 수 있고; 여기서 방법은 분자에 커플링된 검출가능한 표지 또는 리포터 또는 제1 결합 분자에 특이적인 2차 결합 분자를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 (코팅된) 고체 기재의 표면 상에서 생성된 리포터 신호의 강도가 관능화 기재 상에서보다 더 높은 감도로 검출가능한 것이 제공된다. 기재는, 일부 측면에서, 표면, 고체 표면, 비-투명 고체, 가시 또는 비-가시 광선의 선택된 파장에 대해 투명한 고체, 입자, 어레이, 마이크로버블, 또는 비드일 수 있다. 일부 측면에서 기재는 코팅될 수 있다. 특정 측면에서, 어레이는 고정화된 탄수화물과 임상 샘플 사이의 결합 반응을 검출하거나 또는 그 사이의 복합체를 검출함으로써 검정될 수 있고; 여기서 방법은 임상 샘플에 특이적인 항체에 커플링된 영상화 태그를 검출하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 제1 항체는 리포터 분자에 직접적으로 태그부착될 수 있다.
한 측면에서, TACA는 글로보 H를 포함한다.
한 측면에서, TACA는 SSEA-3을 포함한다.
한 측면에서, TACA는 SSEA-4를 포함한다.
한 측면에서, TACA는 SLex를 포함한다.
한 측면에서, TACA는 SLea를 포함한다.
한 측면에서, TACA는 Ley를 포함한다.
한 측면에서, 제1 고체 기재는 니트로셀룰로스이다.
한 측면에서, 탄수화물은 글리칸이다.
한 측면에서, 탄수화물은 반 데르 발스 상호작용에 의해 기재에 부착된다.
한 측면에서, 탄수화물은 링커 분자로 변형된다.
한 측면에서, 어레이는 화학식: G-A-Z-X (화학식 1)를 갖는 링커를 포함하며, 여기서 G는 글리칸이고; A는 에스테르 또는 아민을 포함하는 모이어티이고; X는 표면, 고체 표면, 투명한 고체, 비-투명 고체, 가시 또는 비-가시 광선의 선택된 파장에 대해 투명한 고체, 입자, 어레이, 마이크로버블, 또는 비드, 코팅된 기재, 코팅된 표면, 중합체 표면, 니트로셀룰로스-코팅된 표면, 또는 비드 표면을 포함 또는 제외할 수 있는 기재; 기재에 부착된 스페이서 기 또는 기재에 링커를 부착하기 위한 기를 갖는 스페이서 기이고; 및 Z는 지질 쇄 또는 지질 쇄를 갖는 스페이서 기이다.
한 측면에서, 본 개시내용의 신규 G-A-Z-X 어레이는 1종 이상의 고정화된 탄수화물과 샘플로부터의 1종 이상의 탄수화물 결합 모이어티 사이의 1종 이상의 복합체를 검출하는데 사용되며, 복합체에 1종 이상의 검출가능하게 표지된 복합체-결합제를 결합시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 탄수화물 결합 모이어티가 항체인 경우에, 검출가능하게 표지된 단백질 A 또는 검출가능하게 표지된 항-인간 항체가 1종 이상의 복합체와 접촉될 수 있다. 일부 측면에서, 검출가능한 표지는 효소, 형광 표지, 화학발광 표지, 나노입자 표지, 또는 합성, 비-천연 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서 표지는, 예를 들어 표면-플라즈몬 공명 (SPR), 이동성 변화 검정 또는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 검출가능할 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용의 신규 G-A-Z-X 어레이를 사용하는 방법은 1종 이상의 고정화된 탄수화물과 샘플로부터의 1종 이상의 탄수화물 결합 모이어티 사이의 1종 이상의 복합체를 검출하기 위해 사용되며, ELISA 검정을 포함한다. 일부 측면에서 ELISA 검정은 2차 검출가능하게 표지된 복합체 결합제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 탄수화물 결합 모이어티가 항체인 경우에, 효소 연결된 단백질 A 또는 효소 연결된 항-인간 항체가 복합체의 ELISA 검출을 위해 1종 이상의 복합체와 접촉될 수 있다.
일부 측면에서, 탄수화물은 폴리사카라이드, 또는 올리고사카라이드, 또는 글리콜-접합체의 탄수화물 부분, 또는 SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, 글로보 H, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex 중 1종 이상을 포함한다.
일부 측면에서, 고정화된 탄수화물 사이의 복합체를 검출하는 것은 효소 반응을 포함한다.
한 측면에서, 효소 반응은 어레이 표면 상의 고정화된 탄수화물 상에서 수행되며, 여기서 효소는 고정화된 폴리사카라이드, 또는 올리고사카라이드, 또는 당접합체의 탄수화물 부분, 또는 SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, 글로보 H, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex를 검출할 수 있다.
한 측면에서, 탄수화물 결합 모이어티는 단백질이다. 일부 측면에서, 어레이 상에 고정화된 탄수화물에 결합하는 단백질은 검출가능한 표지로 표지된다.
한 측면에서, 단백질 표지는 화학발광 리포터 분자를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 질환 진단, 재발 모니터링 및 약물 발견에 사용하기 위한 기재 상에 고정화된 탄수화물의 개시된 신규 어레이에 관한 것이다. 일부 측면에서, 어레이는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조된다: (a) 기재를 제공하고; (b) 기재를 니트로셀룰로스로 코팅하고; (c) 기재의 표면 상의 개별 위치에 복수종의 G-A-Z 모이어티를 고정화시키는 것. 일부 측면에서, 본 발명은 고정화된 G-A-Z 모이어티를 TACA에 대한 표지된 항체와 접촉시키고, 항체와 글리칸 사이의 복합체를 형성시키고, 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 어레이를 특징화하는 방법에 관한 것이다. 표지된 항체는 효소를 포함하는 표지, 형광 표지, 화학발광 표지 또는 나노입자 표지를 포함할 수 있다. 항체 표지는 효소-연결된 표지일 수 있다. 항체는 고정화된 폴리사카라이드, 또는 올리고사카라이드, 또는 당접합체의 탄수화물 부분, 또는 SSEA-3, SSEA-4, 또는 글로보 H를 특이적으로 인식할 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 질환 진단, 재발 모니터링 및 약물 발견에 사용하기 위한 기재 상에 고정화된 탄수화물의 신규 어레이에 관한 것이다. 일부 측면에서, 어레이는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조된다: (a) 기재를 제공하고; (b) 기재를 니트로셀룰로스로 코팅하고; (c) 기재 상의 개별 위치에 복수종의 탄수화물을 고정화시키는 것. 일부 측면에서, 고정화된 탄수화물은, 예를 들어 ELISA 방사성동위원소 표지, 화학발광물질, 형광 표지, 나노입자, 표면-플라즈몬 공명 (SPR), 이동성 변화 검정 또는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 특징화될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 기재가 어레이에 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 질환 진단, 재발 모니터링 및 약물 발견에 사용하기 위한 비드에 관한 것이며, 비드는 다음을 포함한다: (a) 각각의 비드 상 또는 내에 고유한 식별자; 및 (b) 링커 모이어티를 통해 비드의 표면에 부착된 글리칸. 링커 모이어티는 본원에 개시된 임의의 링커일 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 (a) 각각의 비드 상 또는 내에 고유한 식별자를 포함하는 비드를 제공하고; (b) 글리칸-링커를 비드와 접촉시키고; (c) 글리칸-링커와 비드 사이의 접합체를 형성시키는 것을 포함하는, 글리칸-링커-비드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 접합체는 에스테르 또는 아미드 결합의 형성을 통해 형성된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 질환 진단, 재발 모니터링 및 약물 발견에 사용하기 위한 복수종의 비드에 관한 것이며, 여기서 각각의 비드는 각각의 비드 상 또는 내에 고유한 식별자를 갖고, 여기서 비드-n은 복수종의 G1-A-Z 모이어티를 포함하고, 여기서 G1은 1종의 TACA이고, 비드-n은 복수종의 Gn-A-Z를 포함하고, 여기서 Gn은 G1 TACA와 실질적으로 동일한 제2 TACA이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 화학식: G-A-Z-X (화학식 1)의 화합물에 관한 것이며, 여기서 G는 글리칸이고; A는 에스테르 또는 아미드를 포함하는 모이어티이고; X는 기재, 예를 들어 표면, 고체 표면, 투명한 고체, 비-투명 고체, 가시 또는 비-가시 광선의 선택된 파장에 대해 투명한 고체, 입자, 어레이, 마이크로버블, 또는 비드, 코팅된 기재, 코팅된 표면, 중합체 표면, 니트로셀룰로스-코팅된 표면, 또는 비드 표면; 기재에 부착된 스페이서 기 또는 기재에 링커를 부착하기 위한 기를 갖는 스페이서 기이고; Z는 1종 또는 복수종의 지질 쇄, 지질 쇄를 갖는 1종 또는 복수종의 스페이서 기이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식을 갖는 화합물을 특색으로 한다:
Figure pct00001
한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식을 갖는 화합물을 특색으로 한다:
Figure pct00002
한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식을 갖는 예시적인 G-A-Z 화합물을 특색으로 한다:
Figure pct00003
여기서 Q는
Figure pct00004
또는 수소일 수 있고, C2는 키랄 또는 비-키랄일 수 있고, C3은 제시된 바와 같은 키랄성을 갖고, [지질 쇄]는 임의의 C4-C16 선형 또는 분지형 알킬 또는 알콕시 쇄일 수 있고, m은 1 내지 10의 범위의 정수 값을 가질 수 있고; 여기서 TACA는 하기 중 1종으로부터 선택된다: 글로보 H, SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체. 상기에 나타낸 바와 같이, 이 화학식은 예시적인 G-A-Z이다.
한 측면에서, 예시적인 G-A-Z 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00005
여기서 C2는 키랄 또는 비-키랄일 수 있고, C3은 제시된 바와 같은 키랄성을 갖고, [지질 쇄 1]은 임의의 C4-C16 선형 또는 분지형 알킬 또는 알콕시 쇄일 수 있고, [지질 쇄 2]는 수소 또는 적어도 1개의 히드록시 모이어티를 포함하는 임의의 불포화 C4-C16 알킬 쇄일 수 있고, m은 1 내지 10의 범위의 정수 값을 가질 수 있고; 여기서 TACA는 하기 중 1종으로부터 선택된다: 글로보 H, SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체.
한 측면에서, m은 5일 수 있고, [지질 쇄 1]은 하기 화학식일 수 있다:
Figure pct00006
여기서 n은 7을 포함한, 1 내지 10의 정수이고, 파상선은 [지질 쇄 1]에 연결된 카르보닐 탄소에 대한 결합을 나타낸다.
한 측면에서, 하기 화학식에 따른 화합물이 제공된다:
Figure pct00007
여기서 C2는 키랄 또는 비-키랄일 수 있고, C3은 제시된 바와 같은 키랄성을 갖고, m은 1을 포함한, 1 내지 10의 범위의 정수 값을 가질 수 있고; 여기서 TACA는 하기 중 1종으로부터 선택된다: 글로보 H, SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체.
한 측면에서, 하기 화학식에 따른 화합물이 제공된다:
Figure pct00008
여기서 본원에서 또한 "지질"로 지칭되는 [지질 쇄]는 임의의 C4-C16 선형 또는 분지형 알킬 또는 알콕시 쇄일 수 있고, m은 1 내지 10의 범위의 정수 값을 가질 수 있고; 여기서 TACA는 하기 중 1종으로부터 선택된다: 글로보 H, SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체.
한 측면에서, 하기 화학식에 따른 화합물이 제공된다:
Figure pct00009
여기서 키랄 탄소 원자 C1은 라세미 또는 키랄이고;
여기서 R1 및 R2는 알킬, 아릴, 할로, 헤테로아릴, 할로알킬, 벤질, 페닐일 수 있고, R1 및 R2가 시클릭 결합을 형성할 수 있도록 상호연결될 수 있고;
여기서 n은 n = 7을 포함한, 4 내지 9의 범위의 정수이고;
여기서 TACA는 글로보 H, SSEA-3, Gb3, Gb4, SSEA-4, Ley, SLea, 및 SLex, 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체 중 1종으로부터 선택된다.
한 측면에서 하기 화학식 중 어느 하나에 따른 화합물이 제공된다:
Figure pct00010
여기서 키랄 탄소 원자 C1은 라세미 또는 키랄이고;
여기서 n은 n = 7을 포함한, 4 내지 9의 범위의 정수이고;
여기서 TACA는 글로보 H, SSEA-3 (또는 Gb5), Gb3, Gb4, SSEA-4, Ley, SLea, 또는 SLex, 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체 중 1종으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본원의 화합물을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 지질 쇄-1 또는 지질 쇄-2는 펜틸아민-관능화 글로보 H와 반응하여 아미드 결합을 형성한다.
한 측면에서, 하기 화학식에 따른 화합물이 제공된다:
Figure pct00011
여기서 m은 1 내지 10의 범위의 정수 값을 가질 수 있고;
여기서 V는 산소 또는 탄소일 수 있고;
여기서 q는 1 내지 3의 범위의 정수 값을 가질 수 있고;
여기서 TACA는 하기 중 1종으로부터 선택된다: 글로보 H, SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex, 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체.
한 측면에서, 본원에 개시된 링커의 사용을 포함하는, 어레이에서 감도를 개선시키는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (a) 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 항체를 함유하는 샘플을 제공하고; (b) 샘플을 1종 이상의 TACA를 포함하는 어레이와 접촉시키고; (c) 1종 이상의 TACA에 결합된 샘플 중 항체의 복합체를 형성시키고; (d) 1종 이상의 TACA에 결합된 항체의 양을 검출하고; (e) 상기 1종 이상의 TACA와 결합된 항체의 정상 수준과 비교하여 상기 1종 이상의 TACA와 결합된 상기 항체의 양에 기초하여 대상체의 질환 상태를 결정하는 것을 포함하는, 암 진단 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 정상 수준은, 예를 들어 정상 환자 또는 정상 환자 집단으로부터의 샘플 중 TACA 결합된 항체의 수준의 측정에 기초한 참조 값 또는 범위일 수 있다. 일부 측면에서, 검출된 TACA 결합 항체는 순환 항체이다. 한 측면에서 검출은 적어도 1종의 TACA에 대한 적어도 1종의 항체의 결정을 포함한다. 일부 측면에서, 어레이 상의 TACA는 Tn, TF, sTn, 폴리시알산, 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Gb3, Gb4, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1 또는 Neu5GcGM3 중 1종 이상으로부터 선택될 수 있다.
한 측면에서 샘플은 체액 (혈청, 타액, 림프절 유체, 소변, 질 스왑 또는 협측 스왑)이다.
한 측면에서 본 개시내용은 TACA 결합 파트너를 위한 글리칸 결합 파트너의 라이브러리의 스크리닝에 관한 것이다. 일부 측면에서 분자 또는 라이브러리는, 예를 들어 항체, 나노바디, 항체 단편, 압타머, 렉틴, 펩티드 또는 조합 라이브러리 분자를 포함할 수 있다. 한 측면에서 상기 TACA 결합 파트너를 확인하기 위한 상기 라이브러리의 스크리닝은 본원에 개시된 바와 같은 TACA 글리칸 어레이의 사용을 포함한다.
일부 측면에서, TACA 결합 파트너는 다양한 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 본 개시내용은 (a) 대상체로부터의 샘플을 제공하고; (b) 샘플을 1종 이상의 TACA 결합 파트너와 접촉시키고; (c) TACA와 결합 파트너 사이의 결합의 특이성을 측정하고, (d) 발현된 종양 연관 탄수화물 항원 (TACA)의 수준을 검출하는 것을 포함하는, 질환 상태의 결정을 필요로 하는 대상체의 질환 상태를 결정하는 방법에 관한 것이다.
TACA 결합 파트너는, 예를 들어 치료를 필요로 하는 환자, 예를 들어 TACA 발현 암, 종양, 신생물 또는 증식증을 갖는 환자를 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다.
한 측면에서, 검출은 TACA의 검출을 포함한다. 한 측면에서 상기 TACA의 검출은 TACA 글리칸 어레이의 사용을 포함한다.
일부 측면에서, 방법은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 및/또는 전립선암 중 1종 이상으로부터 선택된 샘플을 검정하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 방법은 유방암, 난소암, 폐암, 췌장암, 위암 (위장암), 결장직장암, 전립선암, 간암, 자궁경부암, 식도암, 뇌암, 구강암 및/또는 신장암 중 1종 이상으로부터 선택된 샘플의 검정을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 암, 신생물, 유방암, 난소암, 폐암, 췌장암, 위암 (위장암), 결장직장암, 전립선암, 간암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 뇌암, 구강암 및/또는 신장암의 증식증 중 1종 이상을 검출하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 질환 상태 중 1종 이상은 B 세포 림프종, 흑색종, 신경모세포종, 육종, 비소세포 폐 암종 (NSCLC)을 특징으로 한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체의 치료에서 항신생물제의 치료 효능을 결정하기 위해 본 개시내용의 신규 어레이를 사용하는 방법에 관한 것이며, (a) 대상체로부터의 샘플을 제공하고; (b) 샘플을 TACA 어레이와 접촉시키고; (c) TACA 또는 항체 중 1종 이상의 결합을 검정하고; (d) 검정된 글리칸 검출 값에 기초하여 신생물에 대한 치료에서 항신생물제의 치료 효과를 결정하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 동안 항신생물제의 치료 효능을 결정하기 위해 본 개시내용의 신규 어레이를 사용하는 방법은 다음을 포함한다: (a) 치료 전 대상체로부터의 샘플을 제공하고; (b) 샘플을 TACA 어레이와 접촉시키고; (c) 치료 전 TACA 결합 모이어티의 역가를 검정하고; (d) 항신생물제의 투여 후 대상체로부터의 1개 또는 복수의 샘플을 제공하고; (e) 1개 또는 복수의 샘플을 TACA 어레이와 접촉시키고; (f) 1개 또는 복수의 샘플에서 TACA 역가를 검정하고; (g) TACA 역가에서의 변화에 기초하여 신생물에 대한 치료에서 항신생물제의 치료 효과를 결정하는 것. 일부 측면에서 TACA 결합 모이어티는 항체일 수 있다.
한 측면에서, 항신생물제는 백신을 포함한다. 백신은 탄수화물 항원 또는 담체 단백질에 접합된 탄수화물 면역원성 단편을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 탄수화물 항원 또는 탄수화물 면역원성 단편은 글로보 H, 스테이지-특이적 배아 항원 3 (SSEA-3), 스테이지-특이적 배아 항원 4 (SSEA-4), Tn, TF, sTn, 폴리시알산, 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Gb3, Gb4, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1 또는 Neu5GcGM3을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 담체 단백질은 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌), DT-CRM 197 (디프테리아 독소 교차-반응 물질 197), 디프테리아 톡소이드 또는 파상풍 톡소이드를 포함한다. 한 측면에서, 백신은 제약 조성물로서 제공된다. 한 측면에서, 제약 조성물은 글로보 H-KLH 및 추가의 아주반트를 포함한다. 한 측면에서, 추가의 아주반트는 사포닌, 프로인트 아주반트 또는 α-갈락토실-세라미드 (α-GalCer) 아주반트로부터 선택된다. 한 측면에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 OBI-822/OBI-821을 포함한다. 한 측면에서, 항신생물제는 1종 이상의 탄수화물 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함한다.
한 측면에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 암, 암종, 신생물 또는 증식증 중 1종 이상을 갖는 것으로 의심된다. 한 측면에서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 및 전립선암.
본 발명의 어레이 상에 사용된 글리칸은 2종 이상의 당 단위를 포함할 수 있다. 본 발명의 글리칸은 직쇄 및 분지형 올리고사카라이드 뿐만 아니라 자연 발생 및 합성 글리칸을 포함할 수 있다. 알로스, 알트로스, 아라비노스, 글루코스, 갈락토스, 굴로스, 푸코스, 프룩토스, 이도스, 릭소스, 만노스, 리보스, 탈로스, 크실로스, 뉴라민산 또는 다른 당 단위를 포함한 임의의 유형의 당 단위가 본 발명의 글리칸에 존재할 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 당 단위는 다양한 치환기를 가질 수 있다. 예를 들어, 당 단위에 전형적으로 존재하는 치환기 대신에 또는 그에 추가로 존재할 수 있는 치환기는 아미노, 이온성 카르복시 및 그의 염을 포함한 카르복시 (예를 들어, 나트륨 카르복실레이트), 티올, 아지드, N-아세틸, N-아세틸뉴라민산, 옥시 (=O), 시알산, 이온성 술페이트 및 그의 염을 포함한 술페이트 (-SO4-), 이온성 포스페이트 및 그의 염을 포함한 포스페이트 (-PO4-), 저급 알콕시, 저급 알카노일옥시, 저급 아실, 및/또는 저급 알카노일아미노알킬을 포함한다. 지방산, 지질, 아미노산, 펩티드 및 단백질이 또한 본 발명의 글리칸에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 글리칸은 다음을 포함 또는 제외할 수 있다: 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, SLex 또는 그의 임의의 조합. 일부 측면에서, 글리칸은 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, SLex의 n-펜틸아민-관능화 변이체 또는 관능화 글리칸 변이체 및/또는 비-관능화 글리칸의 임의의 조합을 포함 또는 제외한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 고체 기재 및 고체 지지체 상의 다수의 한정된 글리칸 위치를 포함하는 마이크로어레이를 제공하며, 각각의 글리칸 위치는 그에 부착된 한 유형의 글리칸 분자의 다중 카피를 포함하는 고체 지지체의 영역을 한정하고, 여기서 글리칸은 본원에 기재된 바와 같은 링커에 의해 마이크로어레이에 부착된다. 이들 마이크로어레이는, 예를 들어 약 1 내지 약 100,000개의 상이한 글리칸 위치, 또는 약 1 내지 약 10,000개의 상이한 글리칸 위치, 또는 약 2 내지 약 100개의 상이한 글리칸 위치, 또는 약 2 내지 약 5개의 상이한 글리칸 위치를 가질 수 있다. 일부 측면에서, 어레이에 부착된 글리칸은 글리칸 프로브로 지칭된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 시험 분자 또는 시험 물질이 본 발명의 어레이 또는 마이크로어레이 상에 존재하는 글리칸에 결합할 수 있는지 여부를 확인하는 방법을 제공한다. 방법은 어레이를 시험 분자 또는 시험 물질과 접촉시키고, 시험 분자 또는 시험 물질이 글리칸 라이브러리 내 또는 어레이 상의 글리칸에 결합하는지 여부를 관찰하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 라이브러리 내 시험 분자 또는 시험 물질에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 시험 분자 또는 시험 물질이 어느 글리칸에 결합할 수 있는지를 확인하는 방법을 제공하며, 여기서 글리칸은 본 발명의 어레이 상에 존재한다. 방법은 어레이를 시험 분자 또는 시험 물질과 접촉시키고, 시험 분자 또는 시험 물질이 어레이 중 어느 글리칸에 결합할 수 있는지 관찰하는 것을 포함한다.
각각의 글리칸 위치에서의 글리칸의 밀도는 유도체화된 글리칸 위치에 적용되는 글리칸 용액의 농도를 달리함으로써 조정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 링커 분자를 통해 어레이에 부착된 분자의 라이브러리를 포함할 수 있는 분자의 어레이에 관한 것이며, 여기서 절단가능한 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00012
여기서 G는 글리칸이고; A는 에스테르 또는 아미드를 포함하는 모이어티이고; X는 기재, 예를 들어 표면, 고체 표면, 투명한 고체, 비-투명 고체, 가시 또는 비-가시 광선의 선택된 파장에 대해 투명한 고체, 입자, 어레이, 마이크로버블, 또는 비드, 코팅된 기재, 코팅된 표면, 중합체 표면, 니트로셀룰로스-코팅된 표면, 또는 비드 표면; 기재에 부착된 스페이서 기 또는 기재에 링커를 부착하기 위한 기를 갖는 스페이서 기이고; Z는 1종 또는 복수종의 링커 (여기서 상기 링커는 지질 쇄를 포함할 수 있음), 지질 쇄를 갖는 1종 또는 복수종의 스페이서 기이다.
일부 측면에서, 어레이는 기재 및 고체 지지체 상의 다수의 한정된 글리칸 프로브 위치를 포함하고, 각각의 글리칸 프로브 위치는 그에 부착된 한 유형의 유사한 글리칸 분자의 다중 카피를 갖는 고체 지지체의 영역을 한정한다.
A와 X 사이의 상호작용은, 일부 측면에서, 공유 결합, 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 이온 결합 또는 소수성 상호작용일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 어레이를 시험 샘플과 접촉시키고, (b) 시험 샘플 중 분자가 어레이에 부착된 분자에 결합하는지 여부를 관찰하는 것을 포함할 수 있는, 시험 샘플 중 분자가 분자의 어레이에 결합할 수 있는지 여부를 시험하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 분자의 어레이를 시험 샘플과 접촉시키고, 어레이를 세척하고, 어레이에 부착된 분자의 분자 구조의 구조적 또는 기능적 분석을 허용하기 위해 절단가능한 링커를 절단하는 것을 포함할 수 있는, 어느 분자 구조가 시험 샘플 중 생체분자에 결합하는지 결정하는 방법이다. 예를 들어, 생체분자는 항체, 수용체 또는 단백질 복합체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 시험 샘플을 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, 및 SLex를 포함하는 글리칸에 공유 부착된 링커와 접촉시키고; (b) 시험 샘플 중 항체가 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, 및 SLex와 연관된 분자/결정기에 결합하는지 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있는, 시험 샘플에서 유방암을 포함한 암을 검출하는 방법이다.
여기서 키랄 탄소 원자, 예를 들어 C1은 라세미 또는 키랄이고; n은 n = 7을 포함한 5 내지 9의 범위의 정수이고; TACA는 글로보 H, SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex 중 1종으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식을 갖는 화합물을 특색으로 한다:
Figure pct00013
Figure pct00014
도 1. 글리칸-연결된 당펩티드의 형성에 대한 반응식.
도 2. 글리코스핑고지질의 생합성 경로.
도 3a 및 도 3b. 지질 쇄 유사체의 합성에 대한 반응식 (지질 쇄 1 내지 지질 쇄 6은 각각 또한 지질-1 내지 지질-6으로 지칭될 수 있음). 이 반응은 지질-NH2 합성의 3 단계 (도 3a) 및 지질 쇄 유사체 형성 (도 3b)을 포함한다.
도 4a, 도 4b, 도 4c, 도 4d, 도 4e 및 도 4f. 글로보 H-NH2 및 지질 쇄 생성물의 커플링 반응. 도 4a는 글로보 H-지질 1 (화학식 2)의 합성을 제시하였다. 도 4b는 글로보 H-지질 2 (화학식 3)의 합성을 제시하였다. 도 4c는 글로보 H-지질 3 (화학식 16)의 합성을 제시하였다. 도 4d는 글로보 H-지질 4 (화학식 17)의 합성을 제시하였다. 도 4e는 글로보 H-지질 6 (화학식 18)의 합성을 제시하였다. 도 4f는 글로보 H-지질 1 (라세미) (화학식 19)의 합성을 제시하였다.
도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 도 5e, 도 5f. 글로보 H-지질 쇄 생성물의 질량 스펙트럼. 도 5a는 글로보 H-지질 1의 질량 스펙트럼을 제시하였다. 도 5b는 글로보 H-지질 2의 질량 스펙트럼을 제시하였다. 도 5c는 글로보 H-지질 3의 질량 스펙트럼을 제시하였다. 도 5d는 글로보 H-지질 4의 질량 스펙트럼을 제시하였다. 도 5e는 글로보 H-지질 6의 질량 스펙트럼을 제시하였다. 도 5f는 글로보 H-지질 1 (라세미)의 질량 스펙트럼을 제시하였다.
도 6a 및 도 6b. SSEA-3-NH2 및 지질 쇄 생성물의 커플링 반응. 도 6a는 SSEA-3-지질 1 (화학식 20)의 합성 과정을 제시하였다. 도 6b는 SSEA-3-지질 1의 질량 스펙트럼을 제시하였다.
도 7a 및 도 7b. SSEA-4-NH2 및 지질 쇄 생성물의 커플링 반응. 도 7a는 SSEA-4-지질 1 (화학식 21)의 합성 과정을 제시하였다. 도 7b는 SSEA-4-지질 1의 질량 스펙트럼을 제시하였다.
도 8a 및 도 8b. 글로보 H-세라미드와 글로보 H-지질 사이의 ELISA 분석의 비교. 도 8a는 글로보 H-세라미드 및 글로보 H-지질의 ELISA 결합 패턴을 제시하였다. 도 8b는 췌장암의 검출에서 글로보 H-세라미드, 글로보 H-지질 1 및 글로보 H-지질 2 결합 효율의 비교를 제시하였다.
도 9. 예시적인 마이크로유체 카트리지의 예시적인 성분 층.
도 10a, 도 10b, 도 10c, 도 10d, 도 10e. 글리칸-세라미드 및 글리칸-지질의 인간 IgM/IgG 글리칸 점수의 비교. 도 10a는 글로보 H-세라미드 IgM의 결합 패턴을 예시하였다. 도 10b는 글로보 H-지질 1 IgM의 결합 패턴을 예시하였다. 도 10c는 SSEA-3-세라미드 IgM의 결합 패턴을 예시하였다. 도 10d는 글로보 H-지질 1 IgG의 결합 패턴을 예시하였다. 도 10e는 SSEA-4-지질 1 IgG의 결합 패턴을 예시하였다.
도 11a, 도 11b, 도 11c 및 도 11d. 췌장암 임상 샘플을 사용하는 글리칸-지질의 인간 IgM 수준의 비교. 도 11a는 글로보 H-지질 1의 결합 패턴을 예시하였다. 도 11b는 SSEA-4-지질 1의 결합 패턴을 예시하였다. 도 11c는 글로보 H-지질 1의 카테고리화된 췌장암 스테이지를 예시하였다. 도 11d는 SSEA-4-지질 1의 카테고리화된 췌장암 스테이지를 예시하였다.
도 12a, 도 12b, 도 12c, 도 12d, 도 12e 및 도 12f. 폐암 임상 샘플을 사용하는 글리칸-지질의 인간 IgM 수준의 비교. 도 12a는 글로보 H-지질 1의 결합 패턴을 예시하였다. 도 12b는 SSEA-3-지질 1의 결합 패턴을 예시하였다. 도 12c는 SSEA-4-지질 1의 결합 패턴을 예시하였다. 도 12d는 글로보 H-지질 1의 카테고리화된 폐암 스테이지를 예시하였다. 도 12e는 SSEA-3-지질 1의 카테고리화된 폐암 스테이지를 예시하였다. 도 12f는 SSEA-4-지질 1의 카테고리화된 폐암 스테이지를 예시하였다.
본 개시내용은 단백질, 수용체, 항체, 지질, 핵산, 탄수화물 및 다른 분자 및 물질 중 어느 유형이 주어진 글리칸 구조에 결합할 수 있는지를 확인하기 위해 사용될 수 있는 글리칸의 라이브러리 및 어레이를 제공한다.
본 발명의 라이브러리, 분자, 어레이 및 방법은 여러 이점을 갖는다. 본 발명의 어레이의 하나의 특정한 이점은 어레이 상의 글리칸이 링커에 의해 기재, 예컨대 중합체 기재에 부착된다는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 링커는 중합체 표면과의 결합 상호작용의 유형에 대해 안정한 장쇄 알킬 쇄에 연결되는 펩티드 결합을 가질 수 있다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 부착된 글리칸을 갖는 링커가 추가로 분석되거나 다른 목적을 위해 이용될 수 있도록 선택하는 경우에 링커는 반 데르 발스 상호작용의 파괴 (예를 들어, 계면활성제 사용)를 통해 탈착될 수 있다.
본 발명의 어레이 및 방법은 또한 고도로 정확한 결과를 제공한다. 본 발명의 라이브러리 및 어레이는 많은 수의 다양한 글리칸을 제공한다. 비제한적 예로서, 본 발명의 라이브러리 및 어레이는 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 10종 또는 적어도 100종의 글리칸을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 라이브러리 및 어레이는 어레이당 약 1 내지 약 100,000종, 또는 약 1 내지 약 10,000종, 또는 약 1 내지 약 1,000종, 또는 약 1 내지 약 100종, 또는 약 2 내지 약 100종, 또는 약 2 내지 약 10종, 또는 약 1 내지 약 10종의 상이한 글리칸을 갖는다. 이러한 많은 수의 글리칸은 다수의 글리칸 유형의 동시 검정을 허용한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 어레이는 다양한 글리칸 결합 단백질을 성공적으로 스크리닝하기 위해 사용되었다. 본 발명의 어레이 상의 글리칸의 조성물은 적절한 경우에 달라질 수 있다. 예를 들어 자연 발생 또는 합성 글리칸, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 박테리아 및 식물 세포 벽 글리칸 등을 포함한 많은 상이한 당접합체가 본 발명의 어레이 내로 혼입될 수 있다.
본 발명의 어레이에 상이한 글리칸을 부착하기 위한 고정화 절차는 용이하게 어레이 구축을 허용하도록 용이하게 제어된다. 일부 실시양태에서, 각각의 글리칸은 특이적 비드 유형에 부착되어, 그 비드 유형과의 글리칸-특이적 회합을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 그 특정한 비드 유형을 다른 비드 유형과 구별시켜 주는 별개의 마커를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 별개의 비드 유형에 각각 부착된 복수종의 상이한 글리칸은 멀티플렉스 반응으로 혼합될 수 있다.
어레이 표면의 고체 지지체 상의 한정된 영역에 부착된 상이한 글리칸의 고유한 라이브러리를 포함하는 어레이는 임의의 이용가능한 절차에 의해 부착될 수 있다. 일반적으로, 어레이는 본원에 기재된 글리칸-연결된 당펩티드 분자의 라이브러리를 획득하고, 라이브러리의 글리칸-연결된 당펩티드 분자 상에 존재하는 특이적 연결 모이어티와 반응하도록 변형된 표면을 갖는 기재를 획득하고, 글리칸-연결된 당펩티드 분자의 연결 모이어티와 기재의 변형된 표면 사이의 반 데르 발스 상호작용을 형성함으로써 고체 지지체에 글리칸 분자를 부착하는 것에 의해 제조된다.
변형 시약은, 비제한적 예로서 실록산 결합을 사용하여 (예를 들어 고체 기재로서 유리 또는 산화규소를 사용함) 탄소-탄소 결합을 통해 기재에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재의 표면과의 실록산 결합은 모노-, 디- 또는 트리-클로로실릴, 또는 모노-, 디- 또는 트리-알콕시실릴 기를 보유하는 유도체화 시약의 반응을 통해 형성된다. 실란 상의 비-이탈 (클로로- 또는 알콕시-) 기는 탄화수소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-이탈기는 글리칸-연결된 당펩티드의 펩티드 쇄와의 반 데르 발스 상호작용을 형성하도록 하는 선형 또는 분지형 알킬 쇄일 수 있다.
변형 시약은 코팅을 적용하기 위한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 침착 방법을 통해 기재에 적용될 수 있다. 이러한 방법은 화학 증착, 용액-상 침착, 랭뮤어-블로제 필름 형성, 반응성 표면 분자를 노출시키기 위한 화학적 플라즈마 처리, 회전-코팅, 분무-건조 또는 전기방사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형 시약은 중합체일 수 있다. 중합체는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸이민, 폴리카프로락틴, 변형된 폴리카프로락톤, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리-N,N-알킬 아크릴아미드, 폴리알킬 메타크릴레이트, 폴리알킬 아크릴레이트 또는 폴리사카라이드로부터 선택될 수 있다. 폴리사카라이드는 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 키토산, 아밀로스, 셀룰로스 아세테이트, 크산탄 검, 덱스트란, 웰란 검, 구아 검, 겔란 검, 디우탄 검 또는 풀루란일 수 있다.
각각의 유형의 글리칸은 한정된 글리칸 프로브 위치에서 고체 지지체에 접촉되거나 또는 그 상에 프린팅된다. 마이크로어레이 유전자 프린터는 다양한 글리칸-연결된 당펩티드를 한정된 글리칸 프로브 위치에 적용하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 0.1 nL 내지 약 10 nL, 또는 약 0.5 nL의 글리칸 용액이 한정된 글리칸 프로브 위치마다 적용될 수 있다. 다양한 농도의 글리칸-연결된 당펩티드 용액은 고체 지지체에 접촉되거나 또는 그 상에 프린팅될 수 있다. 예를 들어, 약 0.1 내지 약 1000 μM 글리칸-연결된 당펩티드 또는 약 1.0 내지 약 500 μM 글리칸-연결된 당펩티드 또는 약 10 내지 약 100 μM 글리칸-연결된 당펩티드의 글리칸-연결된 당펩티드 용액이 사용될 수 있다. 일반적으로, 각각의 농도를 여러개 (예를 들어, 3 내지 6개)의 한정된 글리칸 프로브 위치의 반복에 적용하는 것이 권할만 할 수 있다. 이러한 반복은 글리칸-연결된 당펩티드와 시험 분자 사이의 결합 반응이 실제 결합 상호작용인지 아닌지 여부를 확인시켜 주는 내부 대조군을 제공한다.
탄수화물 종양 항원 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Ley, SLea, 및 SLex는 탄수화물이 생물학적 유체에서 단백질 또는 항체에 대해 매우 약한 결합 강도를 갖기 때문에 암 진단학에 대해 불량한 바이오마커이다. 본 발명자들은 약한 탄수화물 결합 항원이라는 한계가 암 진단에서 바이오마커 검증을 위해 이러한 탄수화물 종양 항원을 사용하는 능력을 방해한다는 것을 인지하였다.
검출기 분자의 어레이는 병렬로 샘플 중 다중 분석물의 존재를 검출하는데 유용하다. 검출기 분자의 어레이의 요소는 기재, 기재 상의 생물활성 분자의 코팅의 제시, 코팅된 기재에 대한 1종 또는 복수종의 분석물의 제시, 분석물과 기재 상의 생물활성 분자 사이의 복합체의 형성, 및 검출의 메카니즘을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "생물활성 분자"는 관련 기술분야에서의 그의 통상의 의미를 가지며, 생물학 또는 화학에서 공지된 분자로서 존재하거나 그를 모방하고 정전기, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 공유 결합 또는 수소 결합을 통해 또 다른 분자에 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다.
본 발명의 기재는 표면일 수 있다. 표면은 편평하거나, 특색이 있거나, 둥글거나, 만곡되거나, 거칠거나, 다공성이거나, 고체이거나, 젤라틴성이거나, 중합체이거나, 올리고머이거나, 비드이다. 기재는 유리, 중합체 또는 플라스틱으로 구성될 수 있다. 비드는 둥근형, 원통형, 계란형, 타원형, 대략 둥근형, 디스크형, 정사각형, 육각형 또는 임의의 다면체형 실체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재는 또 다른 분자에 결합할 수 있는 표면에의 반응성 기를 제공하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응성 기는 카르복실산일 수 있다.
일부 실시양태에서, 기재는 또 다른 분자에 결합할 수 있는 표면에의 반응성 기를 제공할 수 있는 물질로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재를 코팅하는 물질은 니트로셀룰로스 막 또는 중합체이다. 이러한 코팅은 편평한 표면과 비교하여 검출 하한치를 가능하게 하는 고표면적을 갖는 3D 표면을 제공한다. 일부 실시양태에서, 화학적 링커는 표면에 직접적으로 또는 표면에 이전에 제공된 코팅으로, 표면에 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 하기 선택된 글리칸-연결된 당펩티드 구조 중 1종을 포함할 수 있다 (GH는 TACA를 지칭하는 것으로 본원에서 때때로 사용됨):
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
여기서 키랄 탄소 C1은 라세미 또는 키랄일 수 있고; n = 5, 6, 7, 8 또는 9이고; TACA는 하기 글리칸 중 1종으로부터 선택된다: 글로보 H, SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 또는 SLex.
글리칸-연결된 당펩티드는 도 1에서의 반응식에 따라 헥실아미노-관능화 (아미드에 대해) 또는 헥실히드록실-관능화 (에스테르에 대해) 글리칸과 지질 쇄 카르복실산 사이의 아미드 또는 에스테르 결합의 형성에 의해 합성될 수 있다. 글리칸 (종양 연관 탄수화물 항원 (TACA))은 임의의 아미드 또는 에스테르 형성 방법을 통해 지질 쇄 카르복실산과 반응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미드 형성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 표준 펩티드 커플링 방법을 통해 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미드 형성은 첨가제, 카르보디이미드, 트리아졸, 카르보닐디이미다졸 유도체, 포스포늄/우로늄/포름아미디늄 유도체를 통한 커플링, 또는 탈수를 통해 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 카르보디이미드는 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드), DCC (N,N'-디시클로헥실카르보디이미드), 1-tert-부틸-3-에틸카르보디이미드, 1,3-디-p-톨릴카르보디이미드, 및 DIC (N,N'-디이소프로필카르보디이미드)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 탈수는 유기 용매에서, 임의로 2,2-디메톡시프로판의 첨가 하에, 산-촉매된 커플링에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈수는 5-메톡시-2-아이오도페닐보론산 촉매작용에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미드 형성은 아민 및 카르복실산 반응 혼합물에 하기 시약 중 1종 이상을 첨가하는 것에 의해 달성될 수 있다: 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드, 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라히드로-2(1H)-피리미디논, 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린, 2-플루오로-1-메틸피리디늄 p-톨루엔술포네이트, 2-히드록시-1-메틸피리디늄 p-톨루엔술포네이트, 3-히드록시-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온 용액, 이소부틸 1,2-디히드로-2-이소부톡시-1-퀴놀린카르복실레이트, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸, 3-메틸-1-페닐-2-피라졸린-5-온, 3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸리드 술포닐 수지, 피옥심 또는 우드워드 시약 K, 아크릴산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트, 비스(펜타플루오로페닐) 카르보네이트, 2-브로모-1-에틸-피리디늄 테트라플루오로보레이트, N-브로모숙신이미드, N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트, N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트, 디(N-숙신이미딜) 옥살레이트, N,N'-디숙신이미딜 옥살레이트, 에틸 (히드록시이미노)시아노아세테이트, 1-히드록시벤조트리아졸 수화물, N-히드록시말레이미드, N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복실산 이미드, 3-(4-히드록시페닐)프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시프탈이미드, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시숙신이미딜 아세토아세테이트, N-히드록시술포숙신이미드 나트륨 염 , 아이오도아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 트리플루오로아세테이트, K-옥시마, 펜타플루오로페놀, 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트, 페녹시아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-숙신이미딜 N-메틸카르바메이트, 1,1'-옥살릴디이미다졸, 및 1,1'-카르보닐-디-(1,2,4-트리아졸).
일부 실시양태에서, 아미드 형성은 아민 및 카르복실산 반응 혼합물에 하기 포스포늄/우로늄/포름아미디늄 유도체 중 1종 이상을 첨가하는 것에 의해 달성될 수 있다: 1-히드록시-벤조트리아졸 (HOBt), 1-히드록시-7-아자-벤조트리아졸 (HOAt), HBTU (N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트), (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP), (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-비스(펜타메틸렌)우로늄 헥사플루오로포스페이트, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)우로늄 헥사플루오로포스페이트, (벤조트리아졸-1-일옥시)디피페리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트, (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, 브로모트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 브로모트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리디늄 헥사플루오로포스페이트, 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리디늄 테트라플루오로보레이트, 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드, 클로로디피롤리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트, 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트, 클로로트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트 (COMU), 디피롤리디노(N-숙신이미딜옥시)카르베늄 헥사플루오로포스페이트, O-[(에톡시카르보닐)시아노메틸렌아미노]-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, O-[(에톡시카르보닐)시아노메틸렌아미노]-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, 플루오로-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트, 플루오로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (HATU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 1-[(디메틸아미노)(모르폴리노)메틸렌]-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-윰 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (HDMA), O-(5-노르보르넨-2,3-디카르복스이미도)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, S-(1-옥시도-2-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸티우로늄 헥사플루오로포스페이트, S-(1-옥시도-2-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸티우로늄 테트라플루오로보레이트, O-(2-옥소-1(2H)피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, O-(2-옥소-1(2H)피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 헥사플루오로포스페이트, 및 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트.
본 발명의 유용한 글리칸은 종양-연관 탄수화물 항원 (TACA)을 포함한다. 세포-표면 글리코스핑고지질 글로보 H는 소정 범위의 암 세포주 상에서 고도로 발현되는 항원 탄수화물 패밀리의 구성원이다. 본 발명에 유용한 다른 글로보 H 글리코스핑고지질 유사체는 SSEA-3 (또는 Gb5), SSEA-4, Gb3 또는 Gb4일 수 있다. 본 발명의 다른 글리칸은 Tn, TF, sTn, 폴리시알산, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1 또는 Neu5GcGM3을 포함한다.
본 발명의 글리칸은 다양한 절차에 의해 획득되었다. 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4의 합성은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다 (Bosse F. et al., J Org Chem. 67(19):6659-70, 2002; Koeller, K. M. and Wong, C.-H., Nature, 409, 232-240, 2001; Wymer, N. and Toone, E. J., Curr. Opin. Chem. Biol., 4, 110-119, 2000; Gijsen, H. J. M.; Qiao, L.; Fitz, W. and Wong, C.-H., Chem. Rev., 96, 443-473, 1996).
에스테르 또는 아민을 포함하는 모이어티 A는 에스테르 (-O-(C=O)-R) 또는 아미드 (-NH-(C=O)-R)의 화학적 연결일 수 있으며, 여기서 R은 선형 또는 분지형 알킬 기, 헤테로알킬 기, 아릴 기 또는 헤테로아릴 기이다.
기재 X는 상기 기재된 기재 및 표면일 수 있다.
지질 쇄 Z는 선형 또는 분지형 지질 쇄일 수 있다. 쇄는 포화 또는 불포화일 수 있다. 알킬 쇄는 12 내지 40개의 탄소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 쇄는 분지형 포화 알킬 쇄이다. 일부 실시양태에서, 지질 쇄는 세라미드 쇄일 수 있다.
결합의 검출은, 예를 들어 시험 분자에 직접적으로 부착된 표지의 검출에 의해 직접적일 수 있다. 대안적으로, 검출은, 예를 들어 검출가능하게 표지된 복합체-결합제, 예를 들어 어레이 상의 탄수화물과 시험 분자 사이의 복합체에, 또는 시험 분자에 결합할 수 있는 표지된 2차 항체 또는 다른 표지된 분자를 검출하는 것에 의해 간접적일 수 있다. 결합된 표지는 임의의 이용가능한 검출 방법을 사용하여 관찰될 수 있다. 예를 들어, 어레이에 결합된 화학발광 표지된 분자를 검출하기 위해 어레이 CCD 분석기가 사용될 수 있다. 본원에 예시된 실험에서 아그니티오 바이오아이씨 분석기 (BA-G2000, 아그니티오 사이언스 앤드 테크놀로지 인크.)가 사용되었다. 이러한 어레이 CCD 분석기로부터의 데이터는 아그니티오 랩IT2.3.6 영상 분석 소프트웨어 (아그니티오 사이언스 앤드 테크놀로지 인크.)를 사용하는 것에 의해 분석될 수 있다.
정의
탄수화물 항원 글로보 H, 스테이지-특이적 배아 항원-3 (SSEA-3) 및 스테이지-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4)는 구조 또는 기능에 있어서 서로 밀접하게 관련된다. 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4는 글로보시리즈 글리코스핑고지질 1-3이며, 여기서 SSEA-3은 글로보 H의 비-푸코실화 펜타사카라이드 전구체 구조이고, SSEA-4는 SSEA-3의 갈락토스의 비-환원 말단에 대한 시알산 알파 2-3 연결을 갖는 시알릴화 SSEA-3이다. 다른 글리칸은 Ley, SLea, 및 SLex를 포함한다.
본원에 사용된 "한정된 글리칸 프로브 위치"는 모두 유사한 글리칸 구조를 갖는 소정 밀도의 글리칸 분자가 부착된 고체 지지체의 미리 한정된 영역이다. 용어 "글리칸 영역" 또는 "선택된 영역" 또는 간단히 "영역"은 용어 한정된 글리칸 프로브 위치에 대해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 한정된 글리칸 프로브 위치는, 예를 들어 원형, 직사각형, 타원형, 쐐기형 등 임의의 편리한 형상을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 한정된 글리칸 프로브 위치 및 이에 따라 각각의 별개의 글리칸 유형 또는 구조적으로 관련된 글리칸의 별개의 군이 부착된 면적은 약 1 cm2 미만, 또는 1 mm2 미만, 또는 0.5 mm2 미만이다. 일부 실시양태에서 글리칸 프로브 위치는 약 10,000 μm2 미만 또는 100 μm2 미만의 면적을 갖는다. 각각의 한정된 글리칸 프로브 위치 내에 부착된 글리칸 분자는 실질적으로 동일하다. 추가적으로, 각각의 글리칸 유형의 다중 카피는 각각의 한정된 글리칸 프로브 위치 내에 존재한다. 각각의 한정된 글리칸 프로브 위치 내의 각각의 글리칸 유형의 카피의 수는 수천개 내지 수백만개일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 어레이는 "한 유형의 글리칸 분자"를 각각 갖는 한정된 글리칸 프로브 위치를 갖는다. 사용된 "한 유형의 글리칸 분자"는 실질적으로 구조적으로 동일한 글리칸 분자의 군 또는 구조적으로 유사한 글리칸 분자의 군일 수 있다. 한정된 글리칸 프로브 위치 내의 모든 글리칸 분자가 동일한 구조를 가질 필요는 없다. 일부 실시양태에서, 단일 한정된 글리칸 프로브 위치 내의 글리칸은 구조 이성질체이거나, 가변 수의 당 단위를 갖거나, 다소 상이한 방법으로 분지된다. 그러나, 일반적으로, 한정된 글리칸 프로브 위치 내의 글리칸은 실질적으로 동일한 유형의 당 단위 및/또는 거의 동일한 비율의 각각의 유형의 당 단위를 갖는다. 한정된 글리칸 프로브 위치 내의 글리칸의 당 단위 상의 치환기의 유형은 또한 실질적으로 동일하다.
화학적 정의
구체적 관능기 및 화학 용어의 정의는 하기에서 보다 상세히 기재된다. 화학 원소는 문헌 [Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.]의 안쪽 표지의 원소 주기율표 CAS 버전에 따라 확인되며, 구체적 관능기는 일반적으로 그에 기재된 바와 같이 정의된다. 추가적으로, 유기 화학의 일반적 원리, 뿐만 아니라 구체적 관능성 모이어티 및 반응성은 문헌 [Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; 및 Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 화합물은 1개 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있고, 이에 따라 다양한 이성질체 형태, 예를 들어 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 화합물은 개별 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 기하 이성질체의 형태일 수 있거나, 또는 라세미 혼합물 및 1종 이상의 입체이성질체가 풍부한 혼합물을 포함한 입체이성질체의 혼합물의 형태일 수 있다. 이성질체는 키랄 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 키랄 염의 형성 및 결정화를 포함한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있거나; 또는 바람직한 이성질체는 비대칭 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); 및 Wilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)]을 참조한다. 본 발명은 추가적으로 본원에 기재된 화합물을 실질적으로 다른 이성질체가 없는 개별 이성질체로서 및 대안적으로 다양한 이성질체의 혼합물로서 포괄한다.
값의 범위가 열거되는 경우에, 이는 범위 내의 각각의 값 및 하위-범위를 포괄하도록 의도된다. 예를 들어, "C1-6"은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, 및 C5-6을 포괄하는 것으로 의도된다.
"알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다 ("C1-20 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-10 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-9 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-8 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-7 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-6 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-5 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-4 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-3 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-2 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-6 알킬"). C1-6 알킬 기의 예는 메틸 (C1), 에틸 (C2), n-프로필 (C3), 이소-프로필 (C3), n-부틸 (C4), tert-부틸 (C4), sec-부틸 (C4), 이소부틸 (C4), n-펜틸 (C5), 3-펜타닐 (C5), 아밀 (C5), 네오펜틸 (C5), 3-메틸-2-부타닐 (C5), 3급 아밀 (C5) 및 n-헥실 (C6)을 포함한다. 알킬 기의 추가의 예는 n-헵틸 (C7), n-옥틸 (C8) 등을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 각각의 경우의 알킬 기는 독립적으로 임의로 치환되며, 즉 비치환되거나 ("비치환된 알킬") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 알킬"). 특정 실시양태에서, 알킬 기는 비치환된 C1-10 알킬 (예를 들어, -CH3)이다. 특정 실시양태에서, 알킬 기는 치환된 C1-10 알킬이다.
"알케닐"은 2 내지 20개의 탄소 원자, 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 삼중 결합은 갖지 않는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다 ("C2-20 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-10 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-9 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-8 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-7 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-6 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-5 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-4 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-3 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2 알케닐"). 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합은 내부 (예컨대 2-부테닐에서와 같음) 또는 말단 (예컨대 1-부테닐에서와 같음)일 수 있다. C2-4 알케닐 기의 예는 에테닐 (C2), 1-프로페닐 (C3), 2-프로페닐 (C3), 1-부테닐 (C4), 2-부테닐 (C4), 부타디에닐 (C4) 등을 포함한다. C2-6 알케닐 기의 예는 상기 언급된 C2-4 알케닐 기, 뿐만 아니라 펜테닐 (C5), 펜타디에닐 (C5), 헥세닐 (C6) 등을 포함한다. 알케닐의 추가의 예는 헵테닐 (C7), 옥테닐 (C8), 옥타트리에닐 (C8) 등을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 각각의 경우의 알케닐 기는 독립적으로 임의로 치환되며, 즉 비치환되거나 ("비치환된 알케닐") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 알케닐"). 특정 실시양태에서, 알케닐 기는 비치환된 C2-10 알케닐이다. 특정 실시양태에서, 알케닐 기는 치환된 C2-10 알케닐이다.
"헤테로시클릴" 또는 "헤테로시클릭"은 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 가지며, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 황, 붕소, 인 및 규소로부터 선택된 것인 3- 내지 10-원 비-방향족 고리계의 라디칼을 지칭한다 ("3-10원 헤테로시클릴"). 특정 실시양태에서, 헤테로원자는 독립적으로 질소, 황 및 산소로부터 선택된다. 1개 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로시클릴 기에서, 원자가가 허용하는 바에 따라 부착 지점은 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로시클릴 기는 모노시클릭 ("모노시클릭 헤테로시클릴") 또는 융합, 가교된 또는 스피로 고리계, 예컨대 비시클릭 계 ("비시클릭 헤테로시클릴")일 수 있으며, 포화 또는 부분 불포화일 수 있다. 헤테로시클릴 비시클릭 고리계는 1개 또는 둘 다의 고리에 1개 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로시클릴"은 또한 상기에 정의된 바와 같은 헤테로시클릭 고리가 1개 이상의 카르보시클릴 기와 융합된 고리계 (여기서 부착 지점은 카르보시클릴 또는 헤테로시클릭 고리 상에 있음) 또는 상기에 정의된 바와 같은 헤테로시클릭 고리가 1개 이상의 아릴 또는 헤테로아릴 기와 융합된 고리계 (여기서 부착 지점은 헤테로시클릭 고리 상에 있음)를 포함하고, 이러한 경우에 고리원의 수는 헤테로시클릭 고리계 내의 고리원의 수를 계속해서 지정한다. 달리 명시되지 않는 한, 각각의 경우의 헤테로시클릴은 독립적으로 임의로 치환되며, 즉 비치환되거나 ("비치환된 헤테로시클릴") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 헤테로시클릴"). 특정 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 비치환된 3-10원 헤테로시클릴이다. 특정 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 치환된 3-10원 헤테로시클릴이다.
"아릴"은 방향족 고리계에서 6-14개의 고리 탄소 원자 및 0개의 헤테로원자를 갖는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 (예를 들어 비시클릭 또는 트리시클릭) 4n+2 방향족 고리계 (예를 들어 시클릭 어레이에서 공유된 6, 10 또는 14개의 π 전자를 가짐)의 라디칼을 지칭한다 ("C6-14 아릴"). 일부 실시양태에서, 아릴 기는 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C6 아릴"; 예를 들어, 페닐). "아릴"은 또한, 상기에 정의된 바와 같이, 아릴 고리가 1개 이상의 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴 기와 융합된 고리계 (여기서 라디칼 또는 부착 지점은 아릴 고리 상에 있음)를 포함하고, 이러한 경우에 탄소 원자의 수는 아릴 고리계 내의 탄소 원자의 수를 계속해서 지정한다. 달리 명시되지 않는 한, 각각의 경우의 아릴 기는 독립적으로 임의로 치환되며, 즉 비치환되거나 ("비치환된 아릴") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 아릴"). 특정 실시양태에서, 아릴 기는 비치환된 C6-14 아릴이다. 특정 실시양태에서, 아릴 기는 치환된 C6-14 아릴이다.
2가 가교 기인 본원에 정의된 바와 같은 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴 기는 추가로 접미어 -엔을 사용하여, 예를 들어 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 카르보시클릴렌, 헤테로시클릴렌, 아릴렌 및 헤테로아릴렌으로 지칭된다.
용어 "알콕시" 또는 "알킬옥시"는 -O-알킬 라디칼을 지칭하며, 여기서 알킬은 본원에 정의된 바와 같은 임의로 치환된 알킬이다. 알콕시의 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시 및 tert-부톡시를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "아릴옥시"는 -O-아릴을 지칭하며, 여기서 아릴은 본원에 정의된 바와 같은 임의로 치환된 아릴이다.
본원에 사용된 용어 "임의로 치환된"은 치환 또는 비치환된 모이어티를 지칭한다.
본원에 정의된 바와 같은 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴 기는 임의로 치환된다 (예를 들어, "치환된" 또는 "비치환된" 알킬, "치환된" 또는 "비치환된" 알케닐, "치환된" 또는 "비치환된" 알키닐, "치환된" 또는 "비치환된" 카르보시클릴, "치환된" 또는 "비치환된" 헤테로시클릴, "치환된" 또는 "비치환된" 아릴 또는 "치환된" 또는 "비치환된" 헤테로아릴 기). 일반적으로, 용어 "치환된"은 용어 "임의로"가 앞에 있든지 아니든지, 기 (예를 들어, 탄소 또는 질소 원자) 상에 존재하는 적어도 1개의 수소가 허용가능한 치환기, 예를 들어 치환 시에 안정한 화합물, 예를 들어 재배열, 고리화, 제거 또는 다른 반응에 의해서와 같은 변환을 자발적으로 겪지 않는 화합물을 유발하는 치환기로 대체된다는 것을 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, "치환된" 기는 기의 1개 이상의 치환가능한 위치에 치환기를 갖고, 임의의 주어진 구조에서 1개 초과의 위치가 치환되는 경우에, 치환기는 각각의 위치에서 동일하거나 상이하다. 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용가능한 치환기, 안정한 화합물의 형성을 유발하는 본원에 기재된 임의의 치환기로의 치환을 포함하는 것으로 고려된다. 본 발명은 안정한 화합물에 도달하기 위해 임의의 및 모든 이러한 조합을 고려한다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로원자 예컨대 질소는 헤테로원자의 원자가를 충족시키고 안정한 모이어티의 형성을 유발하는 수소 치환기 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 치환기를 가질 수 있다.
"할로" 또는 "할로겐"은 플루오린 (플루오로, -F), 염소 (클로로, -Cl), 브로민 (브로모, -Br), 또는 아이오딘 (아이오도, -I)을 지칭한다.
본원에 사용된 "아실"은 -C(=O)Raa, -CHO, -CO2Raa, -C(=O)N(Rbb)2, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRbb)ORaa, -C(=NRbb)N(Rbb)2, -C(=O)NRbbSO2Raa, -C(=S)N(Rbb)2, -C(=O)SRaa, 및 -C(=S)SRaa로 이루어진 군으로부터 선택된 모이어티를 지칭하며, 여기서 Raa 및 Rbb는 본원에 정의된 바와 같다.
질소 원자는 원자가가 허용하는 바에 따라 치환 또는 비치환될 수 있으며, 1급, 2급, 3급 또는 4급 질소 원자를 포함한다. 예시적인 질소 원자 치환기는 수소, -OH, -ORaa, -N(Rcc)2, -CN, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRcc)ORaa, -C(=NRcc)N(Rcc)2, -SO2N(Rcc)2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C(=S)N(Rcc)2, -C(=O)SRcc, -C(=S)SRcc, -P(=O)2Raa, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)2N(Rcc)2, -P(=O)(NRcc)2, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴을 포함하나 이에 제한되지는 않거나, 또는 질소 원자에 부착된 2개의 Rcc 기는 연결되어 3-14원 헤테로시클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하며, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rdd 기로 치환되고, 여기서 Raa, Rbb, Rcc, 및 Rdd는 상기에 정의된 바와 같다.
특정 실시양태에서, 산소 원자 상에 존재하는 치환기는 산소 보호기 (또한 히드록실 보호기로 지칭됨)이다. 산소 보호기는 -Raa, -N(Rbb)2, -C(=O)SRaa, -C(=O)Raa, -CO2Raa, -C(=O)N(Rbb)2, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRbb)ORaa, -C(=NRbb)N(Rbb)2, -S(=O)Raa, -SO2Raa, -Si(Raa)3, -P(Rcc)2, -P(Rcc)3, -P(=O)2Raa, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)(ORcc)2, -P(=O)2N(Rbb)2, 및 -P(=O)(NRbb)2를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 Raa, Rbb, 및 Rcc는 본원에 정의된 바와 같다. 산소 보호기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에 기재된 것을 포함한다.
예시적인 산소 보호기는 메틸, 메톡실메틸 (MOM), 메틸티오메틸 (MTM), t-부틸티오메틸, (페닐디메틸실릴)메톡시메틸 (SMOM), 벤질옥시메틸 (BOM), p-메톡시벤질옥시메틸 (PMBM), (4-메톡시페녹시)메틸 (p-AOM), 구아이아콜메틸 (GUM), t-부톡시메틸, 4-펜테닐옥시메틸 (POM), 실록시메틸, 2-메톡시에톡시메틸 (MEM), 2,2,2-트리클로로에톡시메틸, 비스(2-클로로에톡시)메틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 (SEMOR), 테트라히드로피라닐 (THP), 3-브로모테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 1-메톡시시클로헥실, 4-메톡시테트라히드로피라닐 (MTHP), 4-메톡시테트라히드로티오피라닐, 4-메톡시테트라히드로티오피라닐 S,S-디옥시드, 1-[(2-클로로-4-메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일 (CTMP), 1,4-디옥산-2-일, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오푸라닐, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로-7,8,8-트리메틸-4,7-메타노벤조푸란-2-일, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로에톡시)에틸, 1-메틸-1-메톡시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시-2-플루오로에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-트리메틸실릴에틸, 2-(페닐셀레닐)에틸, t-부틸, 알릴, p-클로로페닐, p-메톡시페닐, 2,4-디니트로페닐, 벤질 (Bn), p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, o-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질, 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질, p-페닐벤질, 2-피콜릴, 4-피콜릴, 3-메틸-2-피콜릴 N-옥시도, 디페닐메틸, p,p'-디니트로벤즈히드릴, 5-디벤조수베릴, 트리페닐메틸, α-나프틸디페닐메틸, p-메톡시페닐디페닐메틸, 디(p-메톡시페닐)페닐메틸, 트리(p-메톡시페닐)메틸, 4-(4'-브로모페나실옥시페닐)디페닐메틸, 4,4',4"-트리스(4,5-디클로로프탈이미도페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(레불리노일옥시페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(벤조일옥시페닐)메틸, 3-(이미다졸-1-일)비스(4',4"-디메톡시페닐)메틸, 1,1-비스(4-메톡시페닐)-1'-피레닐메틸, 9-안트릴, 9-(9-페닐)크산테닐, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴, 1,3-벤조디티올란-2-일, 벤즈이소티아졸릴 S,S-디옥시도, 트리메틸실릴 (TMS), 트리에틸실릴 (TES), 트리이소프로필실릴 (TIPS), 디메틸이소프로필실릴 (IPDMS), 디에틸이소프로필실릴 (DEIPS), 디메틸텍실실릴, t-부틸디메틸실릴 (TBDMS), t-부틸디페닐실릴 (TBDPS), 트리벤질실릴, 트리-p-크실릴실릴, 트리페닐실릴, 디페닐메틸실릴 (DPMS), t-부틸메톡시페닐실릴 (TBMPS), 포르메이트, 벤조일포르메이트, 아세테이트, 클로로아세테이트, 디클로로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트리페닐메톡시아세테이트, 페녹시아세테이트, p-클로로페녹시아세테이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-옥소펜타노에이트 (레불리네이트), 4,4-(에틸렌디티오)펜타노에이트 (레불리노일디티오아세탈), 피발로에이트, 아다만토에이트, 크로토네이트, 4-메톡시크로토네이트, 벤조에이트, p-페닐벤조에이트, 2,4,6-트리메틸벤조에이트 (메시토에이트), 메틸 카르보네이트, 9-플루오레닐메틸 카르보네이트 (Fmoc), 에틸 카르보네이트, 2,2,2-트리클로로에틸 카르보네이트 (Troc), 2-(트리메틸실릴)에틸 카르보네이트 (TMSEC), 2-(페닐술포닐) 에틸 카르보네이트 (Psec), 2-(트리페닐포스포니오) 에틸 카르보네이트 (Peoc), 이소부틸 카르보네이트, 비닐 카르보네이트, 알릴 카르보네이트, t-부틸 카르보네이트 (BOC), p-니트로페닐 카르보네이트, 벤질 카르보네이트, p-메톡시벤질 카르보네이트, 3,4-디메톡시벤질 카르보네이트, o-니트로벤질 카르보네이트, p-니트로벤질 카르보네이트, S-벤질 티오카르보네이트, 4-에톡시-1-나프틸 카르보네이트, 메틸 디티오카르보네이트, 2-아이오도벤조에이트, 4-아지도부티레이트, 4-니트로-4-메틸펜타노에이트, o-(디브로모메틸)벤조에이트, 2-포르밀벤젠술포네이트, 2-(메틸티오메톡시)에틸, 4-(메틸티오메톡시)부티레이트, 2-(메틸티오메톡시메틸)벤조에이트, 2,6-디클로로-4-메틸페녹시아세테이트, 2,6-디클로로-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페녹시아세테이트, 2,4-비스(1,1-디메틸프로필)페녹시아세테이트, 클로로디페닐아세테이트, 이소부티레이트, 모노숙시노에이트, (E)-2-메틸-2-부테노에이트, o-(메톡시아실)벤조에이트, α-나프토에이트, 니트레이트, 알킬 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미데이트, 알킬 N-페닐카르바메이트, 보레이트, 디메틸포스피노티오일, 알킬 2,4-디니트로페닐술페네이트, 술페이트, 메탄술포네이트 (메실레이트), 벤질술포네이트, 및 토실레이트 (Ts)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lane s (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); 및 Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "글리칸"은 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 지칭한다. 글리칸은 또한 당접합체, 예컨대 당단백질, 당지질, 당펩티드, 글리코프로테옴, 펩티도글리칸, 리포폴리사카라이드 또는 프로테오글리칸의 탄수화물 부분을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 글리칸은 통상적으로 모노사카라이드 사이의 O-글리코시드 연결만으로 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로스는 β-1,4-연결된 D-글루코스로 구성된 글리칸 (또는 보다 구체적으로는 글루칸)이고, 키틴은 β-1,4-연결된 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 글리칸이다. 글리칸은 모노사카라이드 잔기의 단독중합체 또는 이종중합체일 수 있으며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착된 것으로 발견될 수 있다. 이들은 일반적으로 세포의 외부 표면 상에서 발견된다. O- 및 N-연결된 글리칸은 진핵생물에서 매우 통상적이지만, 또한 원핵생물에서도 보다 덜 통상적이긴 하지만 발견될 수 있다. N-연결된 글리칸은 시퀀에서 아스파라긴의 R-기 질소 (N)에 부착된 것으로 발견된다. 시퀀은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 여기서 X는 프랄린을 제외한 임의의 아미노산이다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 면역 반응을 도출할 수 있는 임의의 물질로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "면역원성"은 면역 반응을 자극하는 면역원, 항원 또는 백신의 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "CD1d"는 다양한 인간 항원-제시 세포의 표면 상에서 발현된 당단백질의 CD1 (분화 클러스터 1) 패밀리의 구성원을 지칭한다. CD1d 제시된 지질 항원은 자연 킬러 T 세포를 활성화시킨다. CD1d는 당지질 항원이 결합하는 심부 항원-결합 홈을 갖는다. 수지상 세포 상에서 발현된 CD1d 분자는 GalCer 유사체 예컨대 C34를 포함한 당지질에 결합하여 그를 제시할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자의 부분으로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "백신"은 전체 질환-유발 유기체 (사멸 또는 약화된 것) 또는 이러한 유기체의 성분, 예컨대 단백질, 펩티드 또는 폴리사카라이드로 이루어진 항원을 함유하며, 유기체가 유발하는 질환에 대한 면역을 부여하는데 사용되는 제제를 지칭한다. 백신 제제는 천연, 합성, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 유래된 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항원 특이적"은 특정한 항원 또는 항원의 단편의 공급이 특이적 세포 증식을 유발하도록 하는 세포 집단의 특성을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 상호작용을 지칭한다. 다양한 경우에, 특이적으로 결합하는은 약 10-6 몰/리터, 약 10-7 몰/리터, 또는 약 10-8 몰/리터, 또는 그 미만의 친화도 상수에 의해 구현될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유동 세포측정법" 또는 "FACS"는 광학 및 전자 검출 장치를 통해 유체의 스트림에 현탁된 입자 또는 세포의 물리적 및 화학적 특성을 검사하기 위한 기술을 의미한다.
본원에 사용된 용어 당효소는 적어도 부분적으로 글로보시리즈 생합성 경로 내의 효소를 지칭하며; 예시적인 당효소는 알파-4GalT; 베타-4GalNAcT-I; 또는 베타-3GalT-V 효소를 포함한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리 방법에 의해 결정 시에 항체의 95 중량% 초과, 일부 실시양태에서 99 중량% 초과까지, (2) 예를 들어 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 예를 들어 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 1종의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "지지체" 또는 "기재"는 1종 이상의 분자가 직접적으로 또는 간접적으로 결합, 부착, 합성, 연결 또는 달리 회합되는 1종 또는 복수종의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 군을 지칭한다. 지지체는 생물학적, 비-생물학적, 무기, 유기 또는 이들의 조합인 물질로부터 구축될수 있다. 지지체는 특정한 실시양태 내에서 그의 용도에 기초하여 임의의 적절한 크기 또는 형상으로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표적"은 검정 내에서의 관심 종을 지칭한다. 표적은 자연 발생 또는 합성, 또는 조합일 수 있다. 표적은 비변경된 것일 수 있거나 (예를 들어, 유기체 또는 그의 샘플 내에서 직접적으로 이용됨), 또는 검정에 적절한 방식으로 변경된 것일 수 있다 (예를 들어, 정제, 증식, 여과됨). 표적은 특정 검정 내에서 적합한 수단을 통해 결합 구성원에 결합될 수 있다. 표적의 비제한적 예는 항체 또는 그의 단편, 세포 막 수용체, 특이적 항원 결정기 (예컨대 바이러스, 세포 또는 다른 물질 상의 것)와 반응성인 모노클로날 항체 및 항혈청, 약물, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 펩티드, 보조인자, 당, 렉틴, 폴리사카라이드, 세포, 세포 막 및 소기관을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 표적은 검정에 따라 임의의 적합한 크기일 수 있다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 유사한", "실질적으로 동일한", "동등한", 또는 "실질적으로 동등한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 값 (예를 들어, Kd 값, 항-바이러스 효과 등)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록 하는, 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 분자와 연관되고, 다른 것은 참조/비교 분자와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 통계적 유의성을 갖는 것으로 간주하도록 하는, 2개의 수치 값 (일반적으로 하나는 분자와 연관되고, 다른 것은 참조/비교 분자와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과 및/또는 약 50% 초과이다.
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면에, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫동안 결합된 채로 남아있는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태가 하기에 기재된다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기재일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡", 자연 발생 뉴클레오티드 중 1개 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것, 뿐만 아니라 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기는, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결이 제조되도록 활성화되거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나, 또는 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결은 대안적 연결 기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")에 의해 대체된 실시양태를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 에테르 (-O-) 연결을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일한 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 포함한, 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 반드시는 아니지만 일반적으로 길이가 약 200개 뉴클레오티드 미만으로 짧은, 일반적으로 단일-가닥의, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 대해 동일하게 및 완전하게 적용가능하다.
"항체" (Ab)" 및 "이뮤노글로불린" (IG)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타내지만, 이뮤노글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 결여된 다른 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는, 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로 및 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같음)을 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하며, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역으로 불리는 3개의 절편에 농축되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (FR)로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 부분을 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 형상을 취하는 4개의 FR 영역을 각각 포함한다. 각각의 쇄에서의 CDR은 FR 영역에 근접하게 함께 유지되어 있고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 수반되지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
항체를 파파인으로 소화시키면, "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교-연결될 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-쇄 Fv 종에서, 이러한 영역은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 경우와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 이 형상에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하고 있는 Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 명확히 별개의 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 상이한 부류로 할당될 수 있다. 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇가지는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 기재되어 있다. 항체는 항체와 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는, 보다 큰 융합 분자의 부분일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는, 하기에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 무손상 항체 내에 존재할 때 그 부분과 정상적으로 연관된 기능 중 적어도 하나 및 많게는 대부분 또는 모두를 유지하는 무손상 항체의 부분만을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하므로 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 것은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 통상적으로 연관된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나를 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득된 것이다. 예를 들어, 선택 방법은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 고유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열을 추가로 변경시켜, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양물 중에서의 그의 생성을 개선시키고, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성할 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해해야 한다. 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성에 추가로 다른 이뮤노글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득됨에 따른 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산이 요구되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 동물에서 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 유전자 중 일부 또는 모두를 갖는 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, 문헌 [WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 포함한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 하기 종설 논문 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
본원에 사용된 "정상 수준"은, 예를 들어 정상 환자 또는 정상 환자 집단으로부터의 샘플 중 TACA 결합된 항체의 수준의 측정에 기초한 참조 값 또는 범위일 수 있다. "정상 수준"은 또한, 예를 들어 정상 환자 또는 정상 환자 집단으로부터의 샘플 중 TACA의 측정에 기초한 참조 값 또는 범위일 수 있다.
본원에 사용된 "대상체"는 포유동물이다. 이러한 포유동물은 가축, 농장 동물, 실험에 사용되는 동물, 동물원 동물 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
"장애"는 본 발명의 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻게 될 임의의 상태이다. 이는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태 포함)을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비제한적 예는 암을 포함한다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적 세포 증식과 연관된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성이든 양성이든) 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은, 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
용어 "글로보시리즈-관련 장애"는 전형적으로 경로의 이상 기능 또는 제시를 특징으로 하거나 그에 기여하는 장애를 지칭하거나 기재한다. 이러한 장애의 예는 암을 포함한 과다증식성 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 글리칸의 구조적 요소의 일부는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 약기 형태로 참조된다.
과다증식성 질환 및/또는 상태의 예는 신생물/증식증, 및 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암 및 전립선암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 뇌암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암 또는 췌장암이다. 다른 실시양태에서, 과다증식성 질환 상태는 유방, 난소, 폐, 췌장, 위 (위장), 결장직장, 전립선, 간, 자궁경부, 식도, 뇌, 경구 및 신장과 연관된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (예를 들어, 합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (예를 들어, 그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (예를 들어, 합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로마파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조)); 디네미신, 예를 들어 디네미신 A; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (예를 들어, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (제이에이치에스 내츄럴 프로덕츠, 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지, 뉴저지주 프린스톤), 크레모포르-무함유 아브락산(ABRAXANE)™, 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스, 일리노이주 샤움버그) 및 탁소테레(TAXOTERE)® 독세탁셀 (롱-프랑 로러, 프랑스 안토니); 클로란부실; 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®); 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2가지 이상의 조합, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료에서 항신생물제의 치료 효능을 결정하는 방법을 제공한다: (a) 대상체로부터의 샘플을 제공하고; (b) 대상체로부터 수집된 샘플을 접촉시키고; (c) 종양 연관 항원 (TACA) 또는 항체 중 1종 이상의 결합을 검정하고; (d) 검정된 글리칸 검출 값에 기초하여 신생물에 대한 치료에서 항신생물제의 치료 효과를 결정하는 것. 본 개시내용은 암의 검출에서 링커-당접합체 (예를 들어 글로보 H)의 조합 용법의 놀라운 상가적 및/또는 상승작용적 효능 및 유용성의 증거를 제공한다. 이는 본원의 링커 및 접합체가 글로보시리즈 당단백질과 연관된 결정기 및 분자를 표적화하는 임의의 치료제에 대한 동반 진단 조성물 및 방법으로서 유용하다는 토대를 제공한다. 동반 진단 방법 및 용도로서 본 개시내용과 조합하여 사용하기에 적합한 항신생물제를 포함하는 예시적인 치료 방법 및 조성물은, 예를 들어 특허 번호: WO2015159118, WO2014107652 및 WO2015157629의 개시내용에 기재되어 있다 (OBI-822, OBI-833 및 OBI-888). 그의 각각의 내용은 참조로 포함된다.
본원에 기재 및 청구된 발명은 본 발명의 내용란에 제시 또는 기재 또는 언급된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 속성 및 실시양태를 갖는다. 이는 모두를 포함한 것으로 의도되지는 않으며, 본원에 기재 및 청구된 발명은 단지 예시할 뿐 제한하는 것은 아닌 목적으로 포함되는 본 발명의 내용란에서 확인된 특색 또는 실시양태로 제한되지 않거나 또는 그에 의해 제한되지는 않는다.
본원에 참조 또는 언급된 모든 특허, 공개, 과학 논문, 웹 사이트, 및 다른 문헌 및 자료는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준의 지표이고, 이러한 각각의 참조된 문헌 및 자료는 그 전문이 개별적으로 참조로 포함되거나 그 전문이 본원에 제시된 경우와 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 출원인은 임의의 상기 특허, 공개, 과학 논문, 웹 사이트, 전자 방식으로 이용가능한 정보, 및 다른 참조된 자료 또는 문헌으로부터의 임의의 및 모든 자료 및 정보를 물리적으로 본 명세서 내로 포함시킬 수 있는 권리를 보유한다.
본원에 기재된 구체적 방법 및 조성물은 바람직한 실시양태를 대표하고, 예시적이며, 본 발명의 범주에 대한 제한으로 의도되지 않는다. 다른 목적, 측면 및 실시양태가 본 명세서의 고찰 시에 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이며, 이는 청구범위의 범주에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 취지 내에 포괄되어 있다. 치환 및 변형을 변경하는 것이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 발명에 대해 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 본원에 예시적으로 기재된 발명은, 본원에 필수적인 것으로 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들 또는 제한 또는 제한들 없이 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원에서 각각의 경우에, 본 발명의 실시양태 또는 실시예에서, 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진", 및 "이루어진" 중 임의의 것은 명세서에서 다른 2가지 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 또한, 용어 "포함하는", "포함한", "함유하는" 등은 광범위하게 제한 없이 판독되어야 한다. 본원에 예시적으로 기재된 방법 및 과정은 상이한 순서의 단계로 적합하게 실시될 수 있고, 본원 또는 청구범위에 나타낸 단계의 순서에 반드시 제한되지는 않는다. 또한, 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 어떠한 상황 하에서도 본 특허가 본원에 구체적으로 개시된 구체적 실시예 또는 실시양태 또는 방법으로 제한되는 것으로 해석될 수 없다. 어떠한 상황 하에서도 본 특허는 특허상표국의 어떠한 심사관 또는 어떠한 다른 직원 또는 고용인에 의해 행해진 어떠한 진술도, 이러한 진술이 구체적으로는 자격 또는 권리 없이 출원인에 의한 서면 응답에서 명백히 채택되지 않는 한, 그에 의해 제한되는 것으로 해석될 수 없다.
사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 면에서 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용에서 제시 및 기재된 특색 또는 그의 부분의 임의의 등가물을 제외하려는 의도는 아니며, 청구된 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태 및 임의적 특색에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 변형 및 변경이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주됨을 이해할 것이다.
본 발명은 본원에서 광범위하게 및 포괄적으로 기재되었다. 일반적 개시내용 내에 속하는 각각의 보다 좁은 종 및 아속 분류가 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 제외되는 물질이 본원에 구체적으로 언급되어 있는지 아닌지 여부에 관계없이, 임의의 대상을 속으로부터 배제한다는 단서 또는 부정적인 제한 하의 본 발명의 일반적 기재를 포함한다.
다른 실시양태는 하기 청구범위 내에 있다. 추가로, 본 발명의 특색 또는 측면이 마쿠쉬 군의 면에서 기재되는 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 또한 그에 의해 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 면에서 기재되었음을 인식할 것이다. 다른 실시양태는 하기 청구범위 내에 있다. 추가로, 본 발명의 특색 또는 측면이 마쿠쉬 군의 면에서 기재되는 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 또한 그에 의해 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 면에서 기재되었음을 인식할 것이다.
실시예
본 개시내용 및 본원의 실시예는 본원에 기재된 바와 같은 링커, 그와 당단백질의 글로보시리즈, 예를 들어 SSEA-3, SSEA-4, 글로보 H, Ley, SLea, 및 SLex와의 당접합체의 놀라운 효능의 발견; 및 질환 상태 (예를 들어 암) 결정, 예측 및/또는 진단에서의 놀라운 효능을 달성하기 위해 어레이에서 이들을 사용하는 방법을 기록한다.
일반적 방법론
모든 출발 화학 시약을 입수하고, 추가 정제 없이 사용하였다. 디클로로메탄 (CH2Cl2)을 수소화칼슘 상에서 증류시켰다. 디에틸 에테르 (Et2O)를 나트륨 상에서 증류시켰다. 분자체 (MS, AW-300)를 사용 전에 파쇄하고 활성화시켰다. 반응을 실리카 겔 60 F254 플레이트 상에서 분석 TLC로 모니터링하고, UV (254 nm) 하에서 및/또는 산성 몰리브데넘산암모늄세륨을 사용한 염색에 의해 가시화하였다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 실리카 겔 (35-75 μm) 또는 리크로프렙 RP18 상에서 수행하였다. 1H-NMR 스펙트럼을 20℃에서 브루커 DRX-500 (500 MHz) 또는 DRX-600 (600 MHZ) 분광계 상에 기록하였다. 화학적 이동 (ppm)을 중수소화 클로로포름 중 테트라메틸실란 (δ=0 ppm) 또는 중수소화수 중 아세톤 (δ=2.05 ppm)에 대해 상대적으로 결정하였다. 커플링 상수 (Hz)를 1차원 스펙트럼으로부터 측정하였다. 13C 부착된 양성자 시험 (13C-APT) NMR 스펙트럼을 동일한 브루커 NMR 분광계 (125 또는 150 MHz)를 사용하여 수득하고, CDCl3 (δ=77 ppm)으로 보정하였다. 커플링 상수 (J)는 Hz로 기록한다. 분할 패턴은 하기 약어를 사용하여 기재한다: s, 단일선; brs, 넓은 단일선; d, 이중선; t, 삼중선; q, 사중선; m, 다중선. 1H NMR 스펙트럼은 이 순서로 기록한다: 화학적 이동; 다중도; 양성자의 수(들); 커플링 상수(들).
실시예 1. 글로보 H-지질, SSEA-3-지질 및 SSEA-4-지질의 합성
새로운 지질 쇄의 합성:
상업적으로 입수가능한 지질 쇄를 비교한 후, 본 발명자들은 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세롤이 세라미드와 유사한 log P를 갖고 다른 지질 쇄보다 더 저렴한 가격으로 입수할 수 있다는 것을 발견하였다. 검정 최적화 전략에 기초하여, 지질 쇄는 TACA와 커플링하기 위해 카르복실 기를 함유할 필요가 있다. 상업적으로 입수가능한 글리세롤은 화학적 방법에 의해 변형되어야 한다. 글리세롤을 산화제로서 TEMPO 및 BAIB로 처리하여 카르복실 생성물 (지질 쇄-1)을 98% 수율로 수득하였다. 다른 한편으로, 글리세롤을 염기성 조건 하에서 글루타르산 무수물과 반응시켜 6개의 탄소 단위를 연장시키고 카르복실 기 (지질 쇄-2)를 71% 수율로 형성하였다. 합성 반응식을 도 3에 열거하였다.
추가로, 지질-NH2를 합성하기 위한 3 단계가 존재하며, 이를 도 3에 열거하였다:
단계1. 토실화: 건조 피리딘 1.5 mL 중 1,2-O-디헥사데실-sn-글리세롤 1.0 g의 교반된 용액에, 이어서 4-니트로벤젠술포닐 클로라이드 0.6 g을 실온에서 첨가하였다. 16시간 후에, 에틸 아세테이트 100 mL를 용액에 첨가하고 1N HCl (aq) 10 mL 및 포화 NaHCO3 (aq) 10 mL로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 잔류물을 Si-겔 크로마토그래피 (EtOAc/n-헥산 1:20)에 의해 정제하여 토실화 지질 (수율: 95%)을 수득하였다.
단계2. 아지드 대체: 토실레이트 지질 (0.46 g)을 DMF 3.5 mL 중에 용해시켰다. 이어서, NaN3 (351 mg, 5 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 16시간 동안 가열하였다. 이어서, 물 30 mL를 첨가하고, EtOAc 20 mL로 추출하였다. 추출물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 잔류물을 Si-겔 크로마토그래피 (EtOAc/n-헥산 1:50)에 의해 정제하여 아지도-지질 (수율: 92%)을 수득하였다.
단계3. 아지드 환원: 아지도-지질 (0.35 g)을 EtOAc 3 mL 중에 용해시킨 다음, Pd/C (10%Pd 150 mg)를 첨가하고, 혼합물을 수소 풍선 하에서 밤새 동안 수소화하였다. 촉매를 셀라이트를 통한 여과에 의해 제거한 다음, 농축시켜 다음 단계를 위한 조 생성물을 수득하였다.
CH2Cl2 중 1 당량의 지질-NH2 및 5 당량의 DIPEA의 교반된 용액에, 이어서, 1.2 당량의 글루타르산 무수물 유도체를 실온에서 첨가하였다. 이어서, 물을 첨가하고, CH2Cl2로 추출하였다. 추출물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 잔류물을 LH-20 (MeOH/CHCl3 1:2)에 의해 정제하여 지질 유사체를 수득하였다.
글로보 H-NH2 및 지질 쇄 생성물의 커플링으로 아미드 결합 형성을 통해 새로운 조성물을 수득하였다:
글로보 H-NH2를 개별적으로 53%, 64%, 51%, 78%, 62% 및 61% 수율로 동일한 아미드 결합 형성 조건을 통해 지질 쇄-1, 지질 쇄-2, 지질 쇄-3, 지질 쇄-4, 지질 쇄-6 및 지질 쇄-1 (라세미)과 커플링시켰다. 커플링 반응식을 도 4에 열거하였다.
글로보 H-지질 1:
1H-NMR (600 MHz, CD3OD/CDCl3) δ 5.22 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 4.42-4.39 (m, 1H), 4.28-4.21 (m, 3H), 4.14 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.08-4.05 (m, 2H), 3.99 (s, 1H), 3.91-3.65 (m, 24H), 3.61-3.46 (m, 11H), 3.40-3.37 (m, 1H), 3.28-3.14 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.66-1.51 (m, 9H), 1.44-1.24 (m, 54H), 0.90-0.83 (m, 6H); 13C-NMR (150 MHz, CD3OD/CDCl3) δ 174.5 (C), 173.1 (C), 105.5 (CH), 105.3 (CH), 104.2 (CH), 103.8 (CH), 102.9 (CH), 101.1 (CH), 81.7 (CH), 81.5 (CH), 80.6 (CH), 80.3 (CH), 78.4 (CH), 76.7 (CH), 76.4 (CH), 76.35 (CH), 76.3 (CH), 75.4 (CH), 74.8 (CH), 74.7 (CH), 73.5 (CH), 72.7 (CH2), 72.6 (CH), 72.5 (CH2), 72.2 (CH2), 71.5 (CH), 70.8 (CH2), 70.7 (CH), 70.5 (CH), 70.4 (CH), 69.6 (CH), 69.5 (CH), 68.2 (CH), 62.7 (CH2), 62.6 (CH2), 62.56 (CH2), 62.0 (CH2), 61.6 (CH2), 53.1 (CH), 40.5 (CH2), 40.0 (CH2), 33.1 (CH2), 30.8 (CH2), 30.78 (CH2), 30.73 (CH2), 30.6 (CH2), 30.57 (CH2), 30.5 (CH2), 30.34 (CH2), 30.3 (CH2), 27.3 (CH2), 27.2 (CH2), 24.4 (CH2), 24.35 (CH2), 23.8 (CH2), 23.6 (CH3), 16.8 (CH3), 14.6 (CH3); HRMS (ESI, MH+) C78H145N2O33 계산치 1637.9730, 실측치 1637.9751. 질량 스펙트럼을 도 5a에 제시하였다.
지질 쇄 1 (1.2 eq)을 교반하면서 건조 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 1.2 eq)를 고체로서 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 글로보 H-펜틸아민 (1.0 eq)을 첨가하고, 생성된 용액을 20분 동안 교반한 후에 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 5 eq)을 시린지에 의해 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 메탄올에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, LH-20에 의해 정제하여 최종 생성물 (53%)을 수득하였다.
글로보 H-지질 2:
1H-NMR (600 MHz, CD3OD/CDCl3) δ 5.22 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 4.42-4.41 (m, 1H), 4.28-4.20 (m, 4H), 4.13 (s, 1H), 4.11-4.06 (m, 3H), 3.98 (s, 1H), 3.93-3.64 (m, 24H), 3.59-3.44 (m, 14H), 3.40-3.37 (m, 1H), 3.26-3.25 (m, 1H), 3.16 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.22 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 2.00 (s, 3H), 1.93-1.90 (m, 2H), 1.67-1.62 (m, 2H), 1.59-1.50 (m, 6H), 1.43-1.24 (m, 57H), 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13C-NMR (150 MHz, CD3OD/CDCl3) 175.0 (C), 174.5 (C), 174.48 (C), 105.5 (CH), 105.2 (CH), 104.2 (CH), 103.7 (CH), 102.8 (CH), 101.1 (CH), 81.4 (CH), 80.6 (CH), 80.3 (CH), 78.4 (CH), 77.9 (CH), 76.7 (CH), 76.4 (CH), 76.3 (CH), 76.29 (CH), 75.4 (CH), 74.8 (CH), 74.7 (CH), 73.4 (CH), 72.7 (CH2), 72.6 (CH), 72.57 (CH), 71.6 (CH2), 71.5 (CH), 71.4 (CH2), 70.7 (CH2), 70.5 (CH), 70.4 (CH), 69.5 (CH), 69.46 (CH), 68.1 (CH), 64.9 (CH2), 62.7 (CH2), 62.6 (CH2), 62.55 (CH2), 62.0 (CH2), 61.5 (CH2), 53.1 (CH), 40.4 (CH2), 36.1 (CH2), 34.3 (CH2), 33.1 (CH2), 31.1 (CH2), 30.8 (CH), 30.76 (CH2), 30.72 (CH2), 30.6 (CH2), 30.5 (CH2), 30.4 (CH2), 30.1 (CH2), 27.3 (CH2), 27.2 (CH2), 24.4 (CH2), 23.7 (CH2), 23.6 (CH3), 22.3 (CH), 16.8 (CH3), 14.6 (CH3); HRMS (ESI, MH+) C83H153N2O35 계산치 1738.0254, 실측치 1738.0260. 질량 스펙트럼을 도 5b에 제시하였다.
지질 쇄 2 (1.2 eq)를 교반하면서 건조 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 1.2 eq)를 고체로서 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 글로보 H-펜틸아민 (1.0 eq)을 첨가하고, 생성된 용액을 20분 동안 교반한 후에 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 5 eq)을 시린지에 의해 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 메탄올에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, LH-20에 의해 정제하여 최종 생성물 (64%)을 수득하였다.
글로보 H-지질 3:
1H-NMR (400 MHz, CD3OD 중 10% CDCl3) δ 5.21 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 4.49 (br, 1H), 4.41 (dd, J = 3.7, 3.7 Hz, 1H), 4.27 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.25-4.19 (m, 2H), 4.13 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.08-4.04 (m, 2H), 3.98-3.64 (m, 21H), 3.58-3.33 (m, 17H), 3.27-3.21 (m, 2H), 3.16 (dd, J = 7.0, 7.0 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.00 (s, 3H), 1.92-1.84 (m, 2H), 1.68-1.61 (m, 2H), 1.57-1.49 (m, 6H), 1.45-1.37 (m, 2H), 1.34-1.24 (m, 55H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13C-NMR (100 MHz, MeOD 중 10% CDCl3) δ 175.2 (C), 175.0 (C), 174.3 (C), 105.2 (CH), 105.0 (CH), 104.0 (CH), 103.5 (CH), 102.7 (CH), 100.9 (CH), 81.2 (CH), 80.4 (CH), 80.2 (CH), 79.1 (CH), 78.3 (CH), 78.3 (CH), 76.5 (CH), 76.2 (CH), 76.1 (CH), 75.1 (CH), 74.6 (CH), 74.5 (CH), 73.2 (CH), 72.5 (CH2), 72.5 (CH), 72.4 (CH), 72.3 (CH2), 71.3 (CH), 71.2 (CH2), 70.5 (CH2), 70.3 (CH), 70.2 (CH), 69.3 (CH), 69.2 (CH), 68.0 (CH), 62.5 (CH2), 62.4 (CH2), 61.8 (CH2), 61.3 (CH2), 52.9 (CH), 41.4 (CH2), 40.2 (CH2), 36.2 (CH2), 32.9 (CH2), 30.9 (CH2), 30.6 (CH2), 30.4 (CH2), 30.3 (CH2), 30.1 (CH2), 29.9 (CH2), 27.1 (CH2), 27.0 (CH2), 24.2 (CH2), 23.5 (CH2), 23.4 (CH2), 23.2 (CH2), 16.6 (CH3), 14.4 (CH3); HRMS (ESI, M+Na+) C83H153N3O34Na 계산치 1759.0256, 실측치 1759.0228. 질량 스펙트럼을 도 5c에 제시하였다.
지질 쇄 3 (1.2 eq)을 교반하면서 건조 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 1.2 eq)를 고체로서 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 글로보 H-펜틸아민 (1.0 eq)을 첨가하고, 생성된 용액을 20분 동안 교반한 후에 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 5 eq)을 시린지에 의해 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 메탄올에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, LH-20에 의해 정제하여 최종 생성물 (51%)을 수득하였다.
글로보 H-지질 4:
1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ 5.22 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 4.98 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.55-4.54 (m, 2H), 4.44-4.43 (m, 3H), 4.30 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.25 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 4.19 (dd, J = 7.2, 5.4 Hz, 1H), 4.15 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.10-4.09 (m, 1H), 4.08-4.06 (m, 1H), 4.01 (s, 1H), 3.98 (dd, J = 10.2, 3.6 Hz, 1H), 3.94-3.87 (m, 5H), 3.85-3.76 (m, 12H), 3.75-3.68 (m, 9H), 3.62-3.55 (m, 11H), 3.54-3.49 (m, 4H), 3.48-3.45 (m, 4H), 3.42-3.39 (m, 3H), 3.32-3.26 (m, 3H), 3.20 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.38-2.32 (m, 1H), 2.29-2.23 (m, 2H), 2.12-2.06 (m, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.70-1.65 (m, 3H), 1.61-1.53 (m, 8H), 1.47-1.41 (m, 3H), 1.29 (s, 53H), 1.00 (d, J = 6.6 Hz, 4H), 0.91 (t, J = 6.8 Hz, 7H); 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ 174.5 (C), 174.3 (C), 105.1 (CH), 104.8 (CH), 103.8 (CH), 103.2 (CH), 102.6 (CH), 100.9 (CH), 81.3 (CH), 80.6 (CH), 80.5 (CH), 78.1 (CH), 76.3 (CH), 76.0 (CH), 75.9 (CH), 75.7 (CH), 74.9 (CH), 74.4 (CH), 73.0 (CH), 72.6 (CH2), 72.2 (CH), 72.1 (CH2), 71.2 (CH2), 70.6 (CH2), 70.1 (CH), 69.0 (CH), 68.9 (CH), 68.0 (CH), 62.6 (CH2), 62.3 (CH2), 62.2 (CH2), 61.9 (CH2), 61.3 (CH2), 52.7 (CH), 43.7 (CH2), 41.4 (CH2), 40.1 (CH2), 32.8 (CH2), 30.9 (CH2), 30.52 (CH2), 30.5 (CH2), 30.3 (CH2), 30.2 (CH2), 30.03 (CH2), 30.0 (CH), 29.9 (CH2), 27.0 (CH2), 26.9 (CH2), 24.2 (CH2), 23.5 (CH2), 23.4 (CH2), 20.0 (CH3), 16.7 (CH3), 14.5 (CH3); HRMS (ESI, M+H+) C84H156N3O34 계산치 1751.0570, 실측치 1751.0527. 질량 스펙트럼을 도 5d에 제시하였다.
지질 쇄 4 (1.2 eq)를 교반하면서 건조 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 1.2 eq)를 고체로서 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 글로보 H-펜틸아민 (1.0 eq)을 첨가하고, 생성된 용액을 20분 동안 교반한 후에 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 5 eq)을 시린지에 의해 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 메탄올에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, LH-20에 의해 정제하여 최종 생성물 (78%)을 수득하였다.
글로보 H-지질 6:
1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ 5.23 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 4.41 (m, 1H), 4.28 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.26 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 4.23 (t, J = 6 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.08-4.06 (m, 2H), 3.99 (s, 1H), 3.93-3.66 (m, 23H), 3.60-3.43 (m, 15H), 3.42 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.39 (dt, J = 9.6, 3.6 Hz, 1H), 3.26-3.22 (m, 2H), 3.19 (td, J = 6.6, 1.8 Hz, 2H), 2.36 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 2.32 (s, 2H), 2.16 (s, 5H), 2.00 (s, 3H), 1.66-1.64 (m, 3H), 1.57-1.54 (m, 10H), 1.46-1.41 (m, 9H), 1.36-1.24 (m, 64H), 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ 174.4 (C), 174.3 (C), 174.0 (C),105.4 (CH), 105.2 (CH), 104.1 (CH), 103.7 (CH), 102.7 (CH), 100.9 (CH), 81.3 (CH), 80.4 (CH), 80.1 (CH), 79.0 (CH), 78.3 (CH), 78.1 (CH), 76.6 (CH), 76.29 (CH), 76.25 (CH), 76.2 (CH), 75.3 (CH), 74.7 (CH), 74.6 (CH), 73.3 (CH), 72.5 (CH), 72.4 (CH2), 72.2 (CH2), 71.4 (CH), 71.1 (CH2), 70.6 (CH2), 70.4 (CH), 70.2 (CH), 69.44 (CH), 69.40 (CH), 68.01 (CH), 62.54 (CH2), 62.46 (CH2), 61.9 (CH2), 61.4 (CH2), 52.9 (CH3), 41.2 (CH2), 40.2 (CH2), 37.6 (CH2), 37.4 (CH2), 33.0 (CH2), 31.1 (CH2), 30.7 (CH2), 30.6 (CH2), 30.5 (CH2), 30.4 (CH2), 30.2 (CH2), 30.1 (CH2), 27.2 (CH2), 26.9 (CH2), 24.4 (CH2), 23.6 (CH2), 23.4 (CH3), 22.5 (CH2), 16.6 (CH3), 14.5 (CH3),; HRMS (ESI, M-H-) C88H160N3O34 계산치 1803.0883, 실측치 1802.9980. 질량 스펙트럼을 도 5e에 제시하였다.
지질 쇄 6 (1.2 eq)을 교반하면서 건조 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 1.2 eq)를 고체로서 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 글로보 H-펜틸아민 (1.0 eq)을 첨가하고, 생성된 용액을 20분 동안 교반한 후에 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 5 eq)을 시린지에 의해 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 메탄올에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, LH-20에 의해 정제하여 최종 생성물 (62%)을 수득하였다.
글로보 H-지질 1 (라세미):
1H-NMR (600 MHz, CD3OD/CDCl3) δ 5.22 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 4.42-4.39 (m, 1H), 4.28-4.21 (m, 3H), 4.14 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.08-4.05 (m, 2H), 3.99 (s, 1H), 3.91-3.65 (m, 24H), 3.61-3.46 (m, 11H), 3.40-3.37 (m, 1H), 3.28-3.14 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.66-1.51 (m, 9H), 1.44-1.24 (m, 54H), 0.90-0.83 (m, 6H); 13C-NMR (150 MHz, CD3OD/CDCl3) δ 174.5 (C), 173.1 (C), 105.5 (CH), 105.3 (CH), 104.2 (CH), 103.8 (CH), 102.9 (CH), 101.1 (CH), 81.7 (CH), 81.5 (CH), 80.6 (CH), 80.3 (CH), 78.4 (CH), 76.7 (CH), 76.4 (CH), 76.35 (CH), 76.3 (CH), 75.4 (CH), 74.8 (CH), 74.7 (CH), 73.5 (CH), 72.7 (CH2), 72.6 (CH), 72.5 (CH2), 72.2 (CH2), 71.5 (CH), 70.8 (CH2), 70.7 (CH), 70.5 (CH), 70.4 (CH), 69.6 (CH), 69.5 (CH), 68.2 (CH), 62.7 (CH2), 62.6 (CH2), 62.56 (CH2), 62.0 (CH2), 61.6 (CH2), 53.1 (CH), 40.5 (CH2), 40.0 (CH2), 33.1 (CH2), 30.8 (CH2), 30.78 (CH2), 30.73 (CH2), 30.6 (CH2), 30.57 (CH2), 30.5 (CH2), 30.34 (CH2), 30.3 (CH2), 27.3 (CH2), 27.2 (CH2), 24.4 (CH2), 24.35 (CH2), 23.8 (CH2), 23.6 (CH3), 16.8 (CH3), 14.6 (CH3); HRMS (ESI, M+H+) C78H145N2O33 계산치 1637.9730, 실측치 1637.9819. 질량 스펙트럼을 도 5f에 제시하였다.
지질 1(라세미) (1.2 eq)을 교반하면서 건조 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 1.2 eq)를 고체로서 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 글로보 H-펜틸아민 (1.0 eq)을 첨가하고, 생성된 용액을 20분 동안 교반한 후에 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 5 eq)을 시린지에 의해 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 메탄올에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, LH-20에 의해 정제하여 최종 생성물 (61%)을 수득하였다.
SSEA-3-NH2 및 지질 쇄 생성물의 커플링으로 아미드 결합 형성을 통해 새로운 조성물을 수득하였다:
SSEA-3-지질 1:
1H-NMR (600 MHz, CD3OD/CDCl3) δ 4.95 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.42-4.40 (m, 1H), 4.33 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.28 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.24-4.22 (m, 1H), 4.16 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.10 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 10.7 Hz, J = 8.5 Hz, 1H), 3.99 (s, 1H), 3.94 (dd, J = 10.2 Hz, J = 3.9 Hz, 1H), 3.90-3.85 (m, 4H), 3.84-3.66 (m, 12H), 3.61-3.42 (m, 13H), 3.38 (td, J = 9.5 Hz, J = 3.3 Hz, 1H), 3.28-3.19 (m, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.68-1.61 (m, 4H), 1.59-1.52 (m, 4H), 1.44-1.28 (m, 58H), 0.89 (t, 6H, J = 7.0 Hz); 13C-NMR (150 MHz, CD3OD /CDCl3) δ 174.9 (C), 172.9 (C), 106.4 (CH), 105.3 (CH), 104.1 (CH), 104.0 (CH), 102.7 (CH), 81.6 (CH), 81.4 (CH), 81.3 (CH), 80.7 (CH), 80.1 (CH), 76.6 (CH), 76.3 (CH), 76.2 (CH), 76.17 (CH), 76.1 (CH), 74.6 (CH), 74.5 (CH), 74.4 (CH), 72.6 (CH), 72.4 (CH), 72.3 (CH), 72.1 (CH2), 70.6 (CH2), 70.4 (CH), 70.1 (CH), 69.3 (CH), 69.2 (CH), 62.6 (CH2), 62.5 (CH2), 62.45 (CH2), 61.9 (CH2), 61.4 (CH2), 53.3 (CH), 39.9 (CH2), 32.9 (CH2), 30.7 (CH2), 30.6 (CH2), 30.58 (CH2), 30.5 (CH2), 30.4 (CH2), 30.3 (CH2), 30.2 (CH2), 30.15 (CH2), 27.1 (CH2), 27.07 (CH2), 24.2 (CH2), 23.6 (CH2), 23.3 (CH3), 14.4 (CH3); HRMS (ESI, MH+) C72H135N2O29 계산치 1491.9151, 실측치 1491.9172. 질량 스펙트럼을 도 6b에 제시하였다.
지질 쇄 1 (1.2 eq)을 교반하면서 건조 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 1.2 eq)를 고체로서 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. SSEA3-펜틸아민 (1.0 eq)을 첨가하고, 생성된 용액을 20분 동안 교반한 후에 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 5 eq)을 시린지에 의해 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 메탄올에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, LH-20에 의해 정제하여 최종 생성물 (62%)을 수득하였다.
SSEA-4-NH2 및 지질 쇄 생성물의 커플링으로 아미드 결합 형성을 통해 새로운 조성물을 수득하였다:
SSEA-4-지질 1:
1H-NMR (600 MHz, CD3OD/CDCl3) δ 4.94 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.55 (s, 1H, N-H), 4.43-4.40 (m, 2H), 4.29 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.25-4.23 (m, 1H), 4.16 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 4.11 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 4.06-3.99 (m, 3H), 3.94 (dd, J = 10.2 Hz, J = 3.9 Hz, 1H), 3.91-3.81 (m, 10H), 3.81-3.64 (m, 12H), 3.63-3.44 (m, 15H), 3.39 (td, J = 9.3 Hz, J = 3.2 Hz, 1H), 3.28-3.18 (m, 4H), 2.86 (dd, J = 12.3 Hz, J = 3.7 Hz, 1H, H-3Fee), 2.01 (s, 3H, NHAc), 2.00 (s, 3H, NHAc), 1.74-1.70 (m, 1H), 1.68-1.60 (m, 4H), 1.58-1.52 (m, 4H), 1.44-1.22 (m, 64H), 0.90 (t, J = 7.1 Hz, 6H); 13C-NMR (150 MHz, CD3OD/CDCl3) δ 175.4 (C), 175.0 (C), 174.9 (C), 173.0 (C) ,106.2 (CH), 105.4 (CH), 104.3 (CH), 104.1 (CH), 102.7 (CH), 100.8 (C), 81.7 (CH), 81.4 (CH), 81.1 (CH), 80.5 (CH), 80.1 (CH), 77.6 (CH), 76.6 (CH), 76.4 (CH), 76.3 (CH), 76.2 (CH), 74.8 (CH), 74.7 (CH), 74.6 (CH), 72.8 (CH), 72.6 (CH2), 72.5 (CH), 72.47 (CH), 72.4 (CH2), 72.1 (CH2), 70.6 (CH2), 70.59 (CH), 70.5 (CH), 69.9 (CH), 69.4 (CH), 69.3 (CH), 69.2 (CH), 68.8 (CH), 64.5 (CH2), 62.8 (CH2), 62.63 (CH2), 62.6 (CH2), 61.9 (CH2), 61.4 (CH2), 55.6 (CH), 53.8 (CH), 53.1 (CH), 43.6 (CH2), 42.1 (CH2), 39.9 (CH2), 33.0 (CH2), 30.7 (CH2), 30.69 (CH2), 30.5 (CH2), 30.49 (CH2), 30.4 (CH2), 30.3 (CH2), 30.2 (CH2), 27.2 (CH2), 27.1 (CH2), 24.3 (CH), 23.7 (CH, CH2), 23.5 (CH3), 22.6 (CH3), 14.5 (CH3); HRMS (ESI, MH+) C83H152N3O37 계산치 1783.0105, 실측치 1783.0159. 질량 스펙트럼을 도 7b에 제시하였다.
지질 쇄 1 (1.2 eq)을 교반하면서 건조 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 1.2 eq)를 고체로서 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. SSEA4-펜틸아민 (1.0 eq)을 첨가하고, 생성된 용액을 20분 동안 교반한 후에 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 5 eq)을 시린지에 의해 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 메탄올에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, LH-20에 의해 정제하여 최종 생성물 (70%)을 수득하였다.
실시예 2. 글로보 H-세라미드 및 글로보 H-지질을 사용하는 ELISA 분석
효소-연결된 면역흡착 검정. 투명한 편평-바닥 면역 비멸균 96-웰 플레이트 (써모 피셔 사이언티픽 인크., Cat#442404)를 웰당 0.2 μg 내지 50 μL 에탄올에서 각각의 글리칸-연결된 당펩티드로 코팅하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 100 μL 카세인 차단 완충제 (시그마-알드리치 캄파니 엘엘씨, Cat#B6429)를 각 웰에 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 모든 후속 단계를 실온에서 수행하였다.
마이크로타이터 플레이트를 각 웰에 대해 카세인 차단 완충제 중 VK9 세포의 상이한 희석물 50 μL로 처리하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 웰을 마이크로플레이트 세척기 (스칸워시 400, 몰레큘라 디바이시스 엘엘씨.)를 사용하여 포스페이트-완충 염수 (써모 피셔 사이언티픽 인크., Cat#70011) 플러스 0.05% (vol/vol) 트윈 20 (제이.티. 베이커, Cat#JTB-X251-07)으로 3회 세척하였다. 이 시점에서, 50 μL의 2차 항체 용액 (카세인 차단 완충제 중에 1:1000 희석된 알칼리성 포스파타제-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (서던 바이오테크 어소시에이츠, 인크., Cat#1030-04))을 각 웰 내로 첨가하고, 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 웰을 포스페이트-완충 염수 플러스 0.05% (vol/vol) 트윈 20으로 3회 세척하였다.
마이크로타이터 플레이트를 ELISA를 위한 100 μL의 알칼리성 포스파타제 (pNPP) 황색 액체 기재 시스템 (시그마-알드리치 캄파니 엘엘씨, Cat#P7998)으로 37℃에서 20분 동안 처리하고, 또 다른 50 μL의 정지 용액 (3N NaOH)을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 결합된 VK9 세포를 마이크로플레이트 판독기 (스펙트라맥스 M2, 몰레큘라 디바이시스 엘엘씨.)를 사용하여 405 nm에서 가시화 모니터링하였다.
글로보 H-세라미드 및 글로보 H-지질의 결합 패턴의 비교를 도 8a에 열거하였다. 글로보 H 지질 1, 글로보 H 지질 2 및 글로보 H-세라미드를 개별적으로 0.001 내지 10 μg/mL로 마이크로타이터 플레이트 상에 고정화시켰다. 글로보 H-지질 2의 405 nm에서의 광학 밀도 (OD405)는 글로보 H-세라미드보다 더 높다. 추가로, 당 어레이를 사용하는 글로보 H-세라미드, 글로보 H-지질 1 및 글로보 H-지질 2의 IgM 결합 패턴의 비교를 도 8b에 열거하였다. 이는 글로보 H 지질 링커의 췌장 환자 임상 샘플과의 IgM 결합 효능이 글로보 H 세라미드보다 더 높다는 것을 나타냈다. 최종적으로, 췌장암의 검출에서 글리칸-연결된 표면의 비교를 표 1에 열거하였다. 이는 상이한 글리칸 (글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Gb3, Gb4, Ley, Lex, SLea, 및 SLex) 연결된 표면을 사용하여 양성 및 음성 임상 샘플 사이를 구별하기 위한 보다 우수한 해결책이 존재한다는 것을 나타냈다. 일부 실시양태에서 복합체 결합제는 본 개시내용의 복합체 결합제 또는 검출가능한 표지 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 특정의 예시적인 실시양태에서, 글로보 H 세라미드 및 글로보 H 지질은 어레이 요소이고, IgM 항체는 샘플로부터의 것이다. 그리고 이어서, 2차 표지된 항-인간 ab를 복합체 검출에 사용한다.
표 1. 췌장암의 검출에서 글리칸-연결된 표면의 비교
Figure pct00019
실시예 3. 글로보 H-세라미드 및 글로보 H-지질을 사용하는 글리칸 어레이 분석
이 시험 플랫폼은 마이크로유체 카트리지 내에서 자동적으로 ELISA 반응을 수행하는 아그니티오 바이오아이씨 시스템을 이용하였다. 각각의 카트리지는 마이크로유체 펌프 및 밸브의 어레이, 채널 네트워크, 시약 보관 저장소, 글리칸 어레이 반응 구역 및 폐기물 보관 저장소를 함유하였다. 시험을 수행하기 위해, 모든 시약 및 시험 샘플을 그의 각각의 저장소로부터 글리칸 마이크로어레이를 함유하는 반응 구역 내로 순차적으로 펌핑하여 화학 발광을 동반한 멀티플렉스화 ELISA 반응을 수행하였다. 결과 데이터를 동시에 포착하고, 데이터 분석을 아그니티오 사이언스 앤드 테크놀리지 인크에 의해 제공된 랩IT 소프트웨어에 의해 수행하였다. 아그니티오 바이오아씨 시스템의 장비 목록의 설명을 표 2에 열거한다.
표 2. OBI-868 아그니티오 바이오아이씨 시스템의 장비 목록
Figure pct00020
마이크로유체 카트리지는 아그니티오 사이언스 앤드 테크놀로지 인크에 의해 제조되었다. 마이크로유체 카트리지는 도 9에 제시된 3개의 층에 의해 구성되었다. 상부 층은 혈청 및 시약 저장소, 마이크로유체 펌프, 및 ELISA 채널 네트워크를 함유하였다. 고무 중간 층은 코팅된 니트로셀룰로스 막을 함유하였다. 글리칸 항원 (글로보 H-세라미드 및 글로보 H-지질 1)을 소수성 상호작용을 통해 니트로셀룰로스 막에 고정화시켰다. 하부 층은 폐기물 저장소로서의 탱크를 함유하였다. 원래 어레이 레이아웃 설계를 위해 120개의 스폿이 존재하였다. 스폿-대-스폿 변동 계수 (CV)가 15% 미만이었다는 것을 보장하기 위해, 본 발명자들은 단지 하기 임상 샘플 시험을 위한 중앙 64개의 스폿만을 사용하였다.
글리칸 어레이 분석 (1차 시험)
시약 제조: 66 마이크로리터 정상 인간 혈청 (NHS) 또는 췌장암 환자의 혈청을 594 μL 샘플 희석제 완충제 (바이오체크 인크., Cat#MB10175) 중에 첨가하여 10배 희석물을 형성하였다. 2차 항체 용액은 먼저 98 μL 접합체 완충제 (슈퍼블록 (TBS) 차단 완충제 플러스 0.2% 트윈 20, 써모 피셔 사이언티픽 인크., Cat#37535) 중 2 μL 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 염소 항-인간 IgG (케이피엘 인크., Cat#474-1002) / IgM (케이피엘 인크., Cat#474-1003)을 첨가하여 50배 희석물을 형성함으로써 수행하였다. 다음에, 40 μL 희석 용액을 2360 μL 접합체 완충제 내로 펌핑하여 2차 항체 용액 (3000x 희석)을 형성하였다.
검정 절차: 620 마이크로리터 세척 완충제 (포스페이트-완충 염수 (써모 피셔 사이언티픽 인크., Cat#70011) 플러스 0.2% (vol/vol) 트윈 20 (제이.티. 베이커, Cat#JTB-X251-07))를 어레이의 "세척" 홀에 첨가하였다. 다음에, 120 μL 차단 완충제 (단백질-무함유 차단 완충제, 써모 피셔 사이언티픽 인크., Cat#37571은)를 어레이의 "차단" 홀에 첨가하였다. 이 시점에서, 120 μL 2차 항체 용액 및 100 μL 혈청을 개별적으로 어레이의 "접합체" 및 "혈청" 홀에 첨가하였다. 마지막으로, 120 μL 기재 완충제 (슈퍼시그널 ELISA 펨토 최대 감도 기재, 써모 피셔 사이언티픽 인크., Cat#37074)를 10분간 어레이의 "기재" 홀에 첨가하였다.
글리칸 어레이를 30분 동안 가압하기 위해 아그니티오 바이오아이씨 펌핑 기계 상에 놓았다. 결합된 혈청을 아그니티오 바이오아이씨 분석기를 사용하여 가시화 모니터링하였다. 어레이의 흡광도 강도를 하기 계산에 기초하여 "글리칸 점수"로 전환시켰다: 특정 예에서, 글리칸 점수= (미가공 데이터-배경)/내부 대조군x10.
내부 대조군은 단지 0.5 μM 2차 항체 용액만을 사용하여 수행하였다. 글리칸 점수 시스템은 0, 1, 2... 내지 20의 정수로서 정의하였다. 전환된 점수가 20 초과인 경우에, 그의 점수화는 20으로서 정의될 것이다.
인간 IgM의 글리칸 점수: 글로보 H-세라미드 및 SSEA-3-세라미드 고정화된 어레이를 사용하여 수행된 총 175개 임상 샘플 (98개 췌장암 및 77개 건강한 혈청)이 존재하였다. 추가로, 또 다른 91개 임상 샘플 (76개 췌장암 및 15개 건강한 혈청)을 글로보 H-지질 1 고정화된 어레이를 사용하여 수행하였다. 글리칸-세라미드 및 글리칸-지질의 결합 패턴의 비교를 도 10에 열거하였다. 글로보 H-세라미드 IgM 시험의 중앙값은 2.53 (췌장암) 및 1.57 (건강한)이었다 [도 10a]. 양성 및 음성 임상 샘플 사이에 단지 약간의 차이만이 존재하는 것처럼 보였다. 그러나, 글로보 H-지질 1 IgM 시험의 중앙값은 6.64 (췌장암) 및 2.56 (건강한)이었다 [도 10b]. 이는 양성 및 음성 임상 샘플 사이를 구별하기 위한 보다 우수한 해결책이 존재한다는 것을 나타냈다. 추가로, SSEA-3-세라미드 IgM에서의 예시적인 링커/어레이의 결합 효능을 도 10c에 열거하였다. SSEA-3-세라미드 IgM 시험의 중앙값은 5.66 (췌장암) 및 3.17 (건강한)이었다.
인간 IgG의 글리칸 점수: 글로보 H-지질 1 및 SSEA-4-지질 1 고정화된 어레이를 사용하여 수행된 총 93개 임상 샘플 (74개 췌장암 및 19개 건강한 혈청)이 존재하였다. 글로보 H-지질 1 IgG에서의 예시적인 링커/어레이의 결합 효능을 도 10d에 열거하였다. 글로보 H-지질 1 IgG 시험의 중앙값은 0.54 (췌장암) 및 0.12 (건강한)이다. 추가로, SSEA-4-지질 1 IgG에서의 예시적인 링커/어레이의 결합 효능을 도 10e에 열거하였다. 이는 글로보 H-지질이 양성 및 음성 임상 샘플 사이를 구별하기 위한 유효한 진단 마커라는 것을 나타냈다.
더욱이, 로지스틱 회귀 & ROC의 방법론 하에 SPSS 통계적 소프트웨어를 사용하는 감도, 특이성 및 정확도 계산을 표 3 (1종 마커 검정), 표 4 (2종 마커 검정) 및 표 5 (3종 마커 검정)에 열거하였다. 이들 결과는 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4가 췌장암에 대한 우수한 진단 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다는 것을 나타냈다.
표 3. 췌장암의 검출에서 글리칸-연결된 표면의 감도, 특이성 및 정확도의 비교 (1종 마커)
Figure pct00021
표 4. 췌장암의 검출에서 글리칸-연결된 표면의 감도, 특이성 및 정확도의 비교 (2종 마커)
Figure pct00022
*GHC: 글로보 H-세라미드 / GHL: 글로보 H-지질 1 / SSEA3C: SSEA3-세라미드 / SSEA4L: SSEA4-지질 1
표 5. 췌장암의 검출에서 글리칸-연결된 표면의 감도, 특이성 및 정확도의 비교 (3종 마커)
Figure pct00023
* GHC: 글로보 H-세라미드 / GHL: 글로보 H-지질 1 / SSEA3C: SSEA3-세라미드 / SSEA4L: SSEA4-지질 1
글리칸 어레이 분석 (2차 시험)
시약, 장비 및 검정 절차는 전부 1차 시험과 동일하였다. 그러나, 어레이의 강도는 항-인간 글로보 H IgG에 대한 하기 계산에 기초하여 "Ab 수준 (μg/mL)"으로 전환시켰다.
각각의 칩의 내부 곡선은 선형 회귀를 사용하여 기울기 및 절편을 계산하였다. 특정 예에서, Ab 수준 (μg/mL) = [(미가공 데이터-절편)/기울기]x0.1. 내부 곡선은 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 0.75 및 1 μg/mL의 인간 IgM을 사용하여 수행하였다.
(1) 췌장암
상대 항-글리칸 인간 IgM: 글로보 H-지질 1 및 SSEA-4-지질 1 고정화된 어레이를 사용하여 수행된 총 277개 임상 샘플 (108개 췌장암 및 169 건강한 혈청)이 존재하였다. 어레이의 글리칸-지질에 대한 샘플로부터의 IgM의 결합 패턴을 도 11에 보고하였다. 글로보 H-지질 1 IgM 시험의 중앙값은 0.32 (췌장암) 및 0.25 (건강한)였다 [도 11a]. SSEA-4-지질 1 IgM 시험의 중앙값은 0.12 (췌장암) 및 0.08 (건강한)이었다 [도 11b]. 추가로, 글로보 H-지질 1 (도 11c) 및 SSEA-4-지질 1 (도 11d) 고정화된 어레이 둘 다는 스테이지 I 및 스테이지 II 췌장암을 검출할 수 있었다.
(2) 폐암
상대 항-글리칸 인간 IgM: 글로보 H-지질 1, SSEA-3-지질 1 및 SSEA-4-지질 1 고정화된 어레이를 사용하여 수행된 총 93개 임상 샘플 (73개 폐암 및 20개 건강한 혈장)이 존재하였다. 글리칸-지질의 결합 패턴을 도 12에 열거하였다. 글로보 H-지질 1 IgM 시험의 중앙값은 0.41 (폐암) 및 0.28 (건강한)이었다 [도 12a]. SSEA-3-지질 1 IgM 시험의 중앙값은 1.71 (폐암) 및 1.37 (건강한)이었다 [도 12b]. SSEA-4-지질 1 IgM 시험의 중앙값은 0.12 (폐암) 및 0.07 (건강한)이었다 [도 12c]. 추가로, 글로보 H-지질 1 (도 12d), SSEA-3-지질 1 (도 12e) 또는 SSEA-4-지질 1 (도 12f) 고정화된 어레이 어느 것이든 스테이지 I, 스테이지 II 및 스테이지 III/IV 폐암을 검출할 수 있었다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어 및 임의의 두문자어는 본 발명의 분야에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 정보를 전달하는 임의의 조성물, 방법, 키트 및 수단을 사용하여 본 발명을 실시할 수 있지만, 정보 전달을 위해 바람직한 조성물, 방법, 키트 및 수단이 본원에 기재되어 있다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 법이 허용하는 최대한으로 본원에 참조로 포함된다. 이들 참고문헌의 논의는 단지 그 저자들에 의해 이루어진 주장을 요약하기 위한 것으로 의도된다. 임의의 참고문헌 (또는 임의의 참고문헌의 일부분)이 관련된 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다. 출원인은 임의의 인용된 참고문헌의 정확도 및 적절성에 대해 이의를 제기할 권리를 보유한다.

Claims (40)

  1. 기재 상에 고정화된 탄수화물 모이어티의 어레이이며,
    어레이는 복수종의 G-A-Z 탄수화물을 포함하고, 각각의 G-A-Z 모이어티는 기재 상의 개별 위치에 놓여 있고, 여기서 G는 1종 이상의 종양 연관 탄수화물 항원 (TACA)이고;
    A는 알킬, 에스테르 또는 아미드를 포함하는 모이어티이고;
    Z는 1종 또는 복수종의 지질 쇄, 지질 쇄를 갖는 1종 또는 복수종의 스페이서 기인,
    기재 상에 고정화된 탄수화물 모이어티의 어레이.
  2. 제1항에 있어서, TACA가 글로보 H, 스테이지-특이적 배아 항원 3 (SSEA-3), 스테이지-특이적 배아 항원 4 (SSEA-4), Tn, TF, sTn, 폴리시알산, Gb3, Gb4, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1, Neu5GcGM3 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체를 포함하는 것인 어레이.
  3. 제1항에 있어서, 기재가 표면, 고체 표면, 비-투명 고체, 가시 또는 비-가시 광선의 선택된 파장에 대해 투명한 고체, 입자, 마이크로버블, 또는 비드로부터 선택된 것인 어레이.
  4. 제1항에 있어서, 기재가 니트로셀룰로스인 어레이.
  5. 제1항에 있어서, 복수종의 GAZ 탄수화물 모이어티가 기재 상에 코팅된 것인 어레이.
  6. 제5항에 있어서, 복수종의 GAZ 탄수화물에서의 Z 모이어티가 반 데르 발스 상호작용 또는 소수성 상호작용에 의해 기재에 부착된 것인 어레이.
  7. 제1항에 있어서, 탄수화물 모이어티가 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 당접합체의 탄수화물 부분, 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Tn, TF, sTn, 폴리시알산, Gb3, Gb4, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1, Neu5GcGM3 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체 중 1종 이상을 포함하는 것인 어레이.
  8. 복합체 검출, 질환 진단, 치료 모니터링 또는 재발 모니터링에 사용하기 위한 기재 상에 고정화된 탄수화물의 어레이이며, 여기서 어레이는
    (a) 기재를 제공하고;
    (b) 기재를 니트로셀룰로스로 코팅하고;
    (c) 기재의 표면 상의 개별 위치에 복수종의 G-A-Z 모이어티를 고정화시키는 것
    을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인,
    복합체 검출, 질환 진단, 치료 모니터링 또는 재발 모니터링에 사용하기 위한 기재 상에 고정화된 탄수화물의 어레이.
  9. 고정화된 G-A-Z 모이어티를 TACA에 대한 표지된 항체와 접촉시키고, 항체와 글리칸 사이의 복합체를 형성시키고, 항체와 글리칸 사이에 형성된 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 제8항의 어레이를 특징화하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 표지된 항체가 효소를 포함하는 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 나노입자 표지를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 효소가 알칼리성 포스파타제 (AP) 또는 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 항체가 항원의 고정화된 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 당접합체의 탄수화물 부분, 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Tn, TF, sTn, 폴리시알산, 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Gb3, Gb4, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1 또는 Neu5GcGM3 시리즈를 특이적으로 인식하는 것인 어레이.
  13. 화학식 1을 갖는 화합물.
    Figure pct00024

    여기서
    G는 글리칸이고;
    A는 에스테르 또는 아미드를 포함하는 모이어티이고;
    X는 기재, 고체 표면, 코팅된 표면, 중합체 표면, 니트로셀룰로스-코팅된 표면 또는 비드 표면; 표면에 부착된 스페이서 기 또는 표면에 링커를 부착하기 위한 기를 갖는 스페이서 기이고;
    Z는 1종 또는 복수종의 지질 쇄, 지질 쇄를 갖는 1종 또는 복수종의 스페이서 기이다.
  14. 화학식 2를 갖는 화합물.
    Figure pct00025
  15. 화학식 3을 갖는 화합물.
    Figure pct00026
  16. 화학식 16을 갖는 화합물.
    Figure pct00027
  17. 화학식 17을 갖는 화합물.
    Figure pct00028
  18. 화학식 18을 갖는 화합물.
    Figure pct00029
  19. 화학식 19를 갖는 화합물.
    Figure pct00030
  20. 화학식 20을 갖는 화합물.
    Figure pct00031
  21. 화학식 21을 갖는 화합물.
    Figure pct00032
  22. 하기 화학식 중 어느 하나에 따른 화합물.
    Figure pct00033

    여기서 키랄 탄소 원자 C1은 라세미 또는 키랄일 수 있고;
    여기서 n = 5, 6, 7, 8 또는 9이고;
    여기서 TACA는 글로보 H, 스테이지-특이적 배아 항원 3 (SSEA-3), 스테이지-특이적 배아 항원 4 (SSEA-4), Tn, TF, sTn, 폴리시알산, 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Gb3, Gb4, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1, Neu5GcGM3 및/또는 그의 n-펜틸아민-관능화 변이체로부터 선택된다.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 화합물의 사용을 포함하는, 어레이에서 감도를 개선시키는 방법.
  24. (a) 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 항체를 함유하는 샘플을 제공하고;
    (b) 샘플을 접촉시켜 G-A-Z 모이어티 중 1종 이상에 대한 샘플 중 항체의 결합을 가능하게 하고;
    (c) 1종 이상의 결합된 항체의 양을 검출하고;
    (d) 상기 결합된 항체의 양에 기초하여 대상체의 질환 상태를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 질환 상태는 무질환 대상체의 경우와 비교한 상대 항체 결합 수준에 기초하여 나타내어지는 것인,
    암, 암종, 신생물 또는 증식증을 갖는 것으로 의심되는, 질환 진단, 치료 모니터링 또는 재발 모니터링을 필요로 하는 대상체의 질환 진단, 치료 모니터링 또는 재발 모니터링 방법.
  25. (a) 암, 암종, 신생물 또는 증식증을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 항체를 함유하는 샘플을 제공하고;
    (b) 샘플을 접촉시켜 1종 이상의 G-A-Z 모이어티에 대한 샘플 중 항체의 결합을 가능하게 하고;
    (c) 1종 이상의 결합된 항체의 양을 검출하고;
    (d) 무질환 대상체의 경우와 비교한 상대 항체 결합 수준을 확인하는 것
    을 포함하는, 복합체를 검출하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 샘플이 혈청, 혈액, 혈장, 세포, 세포 배지, 타액, 소변 또는 림프절 유체로 이루어진 것인 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서, 암이 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  29. (a) 대상체로부터의 샘플을 제공하고;
    (b) 1종 이상의 종양 연관 항원 (TACA)을 포함하는 어레이를 샘플과 접촉시키고;
    (c) 1종 이상의 종양 연관 항원 (TACA)의 결합 또는 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 화합물에 결합된 항체를 검출하고;
    (d) 검정된 글리칸 검출 값에 기초하여 신생물에 대한 치료에서 항신생물제의 치료 효과를 결정하는 것
    을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료를 위한 항신생물제의 치료 효능을 결정하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 샘플이 혈청, 혈액, 혈장, 세포, 세포 배지, 타액, 소변, 림프절 유체, 종양 생검 또는 조직 배양물로 이루어진 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 항신생물제가 담체 단백질과 접합된 탄수화물 항원 또는 그의 면역원성 단편으로 구성된 백신을 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 탄수화물 항원 또는 그의 면역원성 단편이 글로보 H, 스테이지-특이적 배아 항원 3 (SSEA-3), 스테이지-특이적 배아 항원 4 (SSEA-4), Tn, TF, sTn, 폴리시알산, 글로보 H, SSEA-3, SSEA-4, Gb3, Gb4, Lex, Ley, Lea, sLex, SLea, GD1a, GT1b, A2B5, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, 푸코실-GM1 또는 Neu5GcGM3을 포함하는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 담체 단백질이 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌), DT-CRM 197 (디프테리아 독소 교차-반응 물질 197), 디프테리아 톡소이드 또는 파상풍 톡소이드를 포함하는 것인 방법.
  35. 제32항에 있어서, 백신이 제약 조성물로서 제공되는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 제약 조성물이 글로보 H-KLH 및 추가의 아주반트를 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 추가의 아주반트가 사포닌, 프로인트 아주반트 또는 α-갈락토실-세라미드 (α-GalCer) 아주반트로부터 선택된 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 제약 조성물이 OBI-822/OBI-821을 포함하는 것인 방법.
  39. 제29항에 있어서, 항신생물제가 1종 이상의 탄수화물 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 것인 방법.
  40. 제29항에 있어서, 암이 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
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