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KR20170020273A - 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents

향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 제조방법 및 용도 Download PDF

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KR20170020273A
KR20170020273A KR1020160102721A KR20160102721A KR20170020273A KR 20170020273 A KR20170020273 A KR 20170020273A KR 1020160102721 A KR1020160102721 A KR 1020160102721A KR 20160102721 A KR20160102721 A KR 20160102721A KR 20170020273 A KR20170020273 A KR 20170020273A
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cell
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신정민
유지민
김지혜
강아름
김혜선
김현주
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(주)차바이오텍
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Abstract

향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 항염증 효과, 혈관 재생 효과, 또는 신경 재생 효과가 있어, 다양한 질병의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 또는 세포 치료제에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 제조방법 및 용도{Enhanced umbilical cord adherent stem cells, method for producing and uses thereof}
향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
세포치료제는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 세포를 체외에서 증식 또는 선별 등의 방법으로 세포의 특성을 변화시켜 특정 질환의 예방 또는 치료의 목적으로 사용되는 의약품으로 최근 난치성 질환 및 재생의학에 각광을 받고 있는 분야이다. 분화 정도에 따라 체세포 및 줄기세포 치료제로 나눌 수 있으며, 줄기세포 치료제는 배아줄기 및 성체줄기세포로 나눌 수 있다.
현재까지 성체줄기세포 연구는 대부분 골수(bone marrow)에서 이루어져 있고 일부에서는 지방조직(adipose tissue) 혹은 제대혈(cord blood)에서 줄기세포를 분리 및 배양하여 투여하는 방식으로 이루어진바 있다. 그러나 골수 및 지방조직 세포는 침습적인 방법으로 채취되며 장년기나 노년기 환자에서 분리한 줄기세포의 경우 분화능 및 증식력이 감소한다. 또한, 제대혈의 경우 채취가 용이하나 제대혈 내 줄기세포의 함량은 낮다.
탯줄(umbilical cord:UC)은 골수 또는 지방 유래세포와는 다르게 이미 신체에서 분리된 조직에서 추출하므로 비침습적이며 추출공정도 용이하다. 또한, 배아유래 줄기세포와는 다르게 윤리적 측면에서도 자유롭다. 따라서, 최근 난치성 또는 재생의학의 유용한 재료로 각광받고 있으며, 원시세포로서 증식능과 분화능을 동시에 만족시킬 수 있어 장기재생 뿐 아니라 장기 특성에 맞게 분화 후 사용될 수 있다는 장점을 가진다. 다만, 탯줄 내부에 많은 종류의 세포가 존재하는 조직이므로 치료제로서 최적의 세포를 찾아내는 연구와 균일한 세포집단으로 분리 또는 추출할 수 있는 세포의 새로운 특성을 규명하는 연구가 필요한 실정이다.
일 양상은 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포 또는 그의 세포집단을 제공하는 것이다.
다른 양상은 분리된 탯줄을 배양 용기에 부착하여 배양하는 단계; 상기 배양된 탯줄에 분리효소를 접촉시켜 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계를 포함하는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 제공한다.
상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 것일 수 있다:
a) COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
b) CCND1, SERPINE1, PRNP, 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것;
c) 계대 배양하는 동안 부착형 섬유아세포의 형태를 유지하는 것;
d) 지방세포, 골세포, 또는 연골세포로의 분화능; 및
e) CD200+, Tra-1-60-, CD3-, CD1a-, CD11c-, CD16-, CD86-, CD8a-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+, MIC A/B- 및 SSEA4+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성.
상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 하기 (f) 내지 (i)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 더 갖는 것일 수 있다:
f) S100A10, BNIP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 많이 발현되는 것;
g) IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, 및 CPA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 적게 발현되는 것;
h) SNCA, DSG2, NRP2, 및 PLAT로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
i) TPMT, NAGK, 및 ANXA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것.
상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 상기 e)의 표면 항원 특성이 추가적으로 Oct4-, 또는 Nanog-인 것일 수 있다. 또한, 상기 e)의 표면 항원 특성 중 CD61+는 저산소 조건에서 과발현하는 표면 항원 특성일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "탯줄(umbilical cord)"은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포(enhanced Umbilical Cord Adherent Stem cells)" 또는 "탯줄 유래 부착형 줄기세포(Umbilical Cord Adherent Stem cells)"는 탯줄 또는 탯줄의 와튼 젤리(Wharton's Jelly) 조직으로부터 유래되고, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 및 배양 용기 표면에 부착해서 자라는 특성을 가지는 세포를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 세포 표면에 발현되는 세포 표지자에 대하여 CD200, CD141, CD61, CD87, 또는 SSEA4 양성 표면 마커를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,98% 또는 약 99% 발현하고, 줄기세포 표지자인 Oct4, Nanog, Tra-1-60, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD86, CD8a, MIC A/B 또는 CD40 음성 마커를 약 적어도 70% 이하, 적어도 60% 이하, 적어도 50% 이하, 적어도 40% 이하, 적어도 30% 이하, 적어도 20%이하, 적어도 10% 이하, 적어도 5%이하, 또는 적어도 1%이하로 발현하는 것일 수 있다. 본 발명에서 용어, "양성"은 줄기세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 비줄기 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 CD200에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "CD200+"이다. 본 발명에서 용어, "음성"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다. 예를 들어 CD3에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면 그 세포는 "CD3-"이다.
상기 면역학적 특성은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면 유세포분석, 면역조직화학염색, 또는 RT-PCR 등 다양한 방법이 이용될 수 있다.
일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 골수 유래 줄기세포에 비해 더 많이 발현할 수 있다. 구체적으로 상기 세포에서 COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상, 또는 3 이상의 유전자 또는 단백질, 또는 더욱 구체적으로는 모든 유전자 또는 단백질이 골수 유래 줄기세포에 비해 더 많이 발현될 수 있다. 상기 골수 유래 줄기세포에 비해 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포에서 더 많이 발현되는 유전자는 S100A10, SQSTM1, DSTN, DCN, PHGDH, FBLN1, MFGE8, HLA-A, VASN, 또는 KIAA1199를 더 포함할 수 있다. 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다. 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 골수 유래 줄기세포에 비해 상기의 유전자에 대해 2배 이상의 발현량 차이를 나타낼 수 있다. 상기의 발현 수준의 차이는 예를 들면 mRNA 수준에서 유전자의 발현량을 비교한 것일 수 있다. 또한 상기 발현 수준 차이는 예를 들면 마이크로어레이 분석에 의한 것일 수 있다.
또한 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 CCND1, SERPINE1, PRNP 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 골수 유래 줄기세포에 비해 더 적게 발현할 수 있다. 구체적으로 상기 세포에서 CCND1, SERPINE1, PRNP 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상, 또는 3 이상의 유전자 또는 단백질, 또는 더욱 구체적으로는 모든 유전자 또는 단백질이 골수 유래 줄기세포에 비해 더 적게 발현될 수 있다. 상기 골수 유래 줄기세포에 비해 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포에서 더 적게 발현되는 유전자 또는 단백질은 MTA2A, TM4SF1, HIST1H4C, 및 NME1을 포함할 수 있다. 상기 유전자 또는 단백질은 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다. 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 골수 유래 줄기세포에 비해 상기의 유전자 또는 단백질들 대해 2배 이상의 발현량 차이를 나타낼 수 있다. 상기의 발현 수준의 차이는 예를 들면 mRNA 수준에서의 유전자의 발현량을 비교한 것일 수 있다. 또한 상기 발현 수준 차이는 예를 들면 마이크로어레이 분석에 의한 것일 수 있다.
또한 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 계대 배양하는 섬유아세포의 형태를 가질 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 세포는 시험관 내에서 성장하기 위해 표면에 부착을 요하는 세포의 성질을 갖는 것일 수 있으며, 방추형의 섬유아세포의 특이적 형태를 나타낼 수 있다
다른 구체예에 있어서, 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 콜로니 형성능을 갖는 것일 수 있다. 상기 세포는 정상산조 조건에서 배양하는 것에 비해 높은 콜로니 형성능을 갖는 것일 수 있다.
또한 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 지방세포, 골세포 또는 연골세포 등으로 분화할 수 있다. 상기 세포는 예를 들면 지방세포분화, 연골세포 분화, 골아세포 분화, 조혈세포 분화, 근세포 분화, 혈관세포 분화, 신경세포 분화, 간세포 분화를 비롯한, 특정 세포 계통을 따라 분화하도록 유도될 수 있다.
용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 특정 세포 유형으로의 분화 측정은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 공지된 방법을 통해 특정 세포로 분화를 유도할 수 있다. 또한, 상기 분화들은 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지(예를 들어 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 형태의 변화를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태를 조사함으로써, 또는 PCR 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.
또한 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-3, VEGF, GRO, IFNγ, IL-1a, IL-1b, IL-1ra, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12(p40), IL12(P70), IL-13, IL-14, IFNα2, MDC, sIL-2Ra, Eotaxin, Flt-3 리간드, MCP-1, MIP-1a, MIP1b, RANTE, 프랙트알킨(Fractalkine), IP-10, EGF, FGF-2, IGF-1 SR, EpCAM, IGFBP3 또는 그들의 조합의 단백질을 분비할 수 있다. 또한 예를 들면, 상기 세포는 IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-3, VEGF, 및 GRO로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 중 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 모든 단백질을 분비할 수 있다.
또한 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 정상산소 배양 조건에 비해 저산소 배양 조건에서 배양된 세포에서 S100A10, BNIP3, IGFBP5, PGK1, TPI1, DCN, PGM1, PFKFB3, LOC644774, MME, MIR1978, SLC2A3, BHLHB2, BNIP3L, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD, 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가하는 것일 수 있다. 구체적으로 저산소 배양 조건에서 배양된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 정상산소 배양 조건에서 배양된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포보다 S100A10, BNIP3, IGFBP5, PGK1, TPI1, DCN, PGM1, PFKFB3, LOC644774, MME, MIR1978, SLC2A3, BHLHB2, BNIP3L, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD, 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 모든 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가할 수 있다. 상기 유전자 또는 단백질은 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다. 상기 발현 수준의 차이는 2배 이상일 수 있다. 상기의 발현 수준의 차이는 예를 들면 mRNA 또는 단백질 수준에서의 유전자 및 단백질의 발현량을 비교한 것일 수 있다. 또한 상기 발현 수준 차이는 예를 들면 마이크로어레이 및 프로테오믹스 분석에 의한 것일 수 있다.
또한 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 정상산소 배양 조건에 비해 저산소 배양 조건에서 배양된 세포에서 IL8, ALDH1A1, NQO1, DLC1, CTHRC1 및 CPA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 감소하는 것일 수 있다. 구체적으로 저산소 배양 조건에서 배양된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 정상산소 배양 조건에서 배양된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포보다 IL8, ALDH1A1, NQO1, DLC1, CTHRC1 및 CPA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상, 3 이상 또는 모든 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 감소할 수 있다. 상기 유전자 또는 단백질은 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다. 상기 발현 수준의 차이는 2배 이상일 수 있다. 상기의 발현 수준의 차이는 예를 들면 mRNA 또는 단백질 수준에서의 유전자 및 단백질의 발현량을 비교한 것일 수 있다. 또한 상기 발현 수준 차이는 예를 들면 마이크로어레이 및 프로테오믹스 분석에 의한 것일 수 있다.
다른 양상은 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포 집단을 제공한다.
상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포에 대해서는 상기한 바와 같다.
다른 양상은 분리된 탯줄을 배양 용기에 부착하여 배양하는 단계; 상기 배양된 탯줄에 분리효소를 접촉시켜 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계를 포함하는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 탯줄은 건강한 산모(예를 들면, HIV, HCV, HBV 음성인 산모)로부터 출산 후 분리된 태반을 사용할 수 있다. 즉, 상기 "분리된 탯줄"이라 함은 산모의 모체로부터 출산 후 분리되는 탯줄을 의미할 수 있다. 상기 분리된 탯줄은 분리된 후 신속하게 멸균된 용기 및 얼음에 담아 보관될 수 있다.
상기 탯줄을 태반으로부터 분리하는 수득하는 방법은 예를 들면, 분리된 태반으로부터 탯줄을 분리하는 단계; 상기 분리된 탯줄의 외부의 혈액을 제거하는 단계; 상기 혈액이 제거된 탯줄의 동맥과 정맥을 제거하는 단계; 및/또는 상기 동맥과 정맥이 제거된 혈액을 일정한 크기(예를 들면, 1 내지 20 mm)로 세절하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 혈액의 제거는 예를 들면, Ca/Mg free DPBS, 또는 겐타마이신 함유 Ca/Mg free DPBS를 사용할 수 있다.
다음으로, 상기 세절된 탯줄(예를 들면, 분리된 탯줄)로부터 줄기세포를 분리하는 단계가 수행될 수 있다. 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 분리하는 단계는 상기 분리된 탯줄을 배양 용기에 부착하여 5 내지 20일, 예를 들면, 10 내지 20일, 예를 들면, 10 내지 15일 배양하는 단계; 상기 배양된 탯줄 조직에서 세포가 뻗어 나오는 것을 확인하는 단계; 및/또는 탯줄 조직에 분리효소를 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 분리효소는 콜라게나아제를 포함할 수 있다. 상기 콜라게나아제는 콜라겐의 펩티드 결합을 파괴하는 효소를 의미할 수 있으며, 콜라게나아제 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 분리효소는 5 내지 30 U/ml, 예를 들면, 5 내지 25 U/ml, 10 내지 25 U/ml, 또는 20 U/ml의 콜라게나아제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 분리효소는 트립신(trypsin), 및/또는 디스파아제(Dispase)를 포함할 수 있으며, 또한, 상기 분리효소를 포함하는 용액은 콜라게나아제, 트립신, 및/또는 디스파아제를 포함하는 물, 염수(saline), 예를 들면, HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)를 포함할 수 있다. 또한, 분리효소의 처리 시간은 예를 들면, 1시간 내지 20시간, 2시간 내지 10시간, 4시간 내지 9시간, 또는 5시간 내지 6시간일 수 있다.
일구체예에 있어서, 상기 조직과 분리효소의 반응은 진탕을 수행하여 반응이 이루어질 수 있으며, 상기 진탕은 약 20 내지 40 ℃, 약 30 내지 40 ℃, 또는 35 내지 40 ℃, 예를 들면, 37 ℃에서 수행할 수 있고, 약 5 내지 60 분간 또는 10 내지 30분간 수행할 수 있으며, 또한 예를 들면 10 내지 30분간 2번을 수행할 수 있다.
추가적으로, 상기 조직과 분리 효소의 반응 후에, 분리 효소를 불활성화 하긴 위한 과정을 추가로 수행할 수 있으며, 예를 들면, FBS를 첨가하여 상기 효소 반응을 정지시킬 수 있다. 또한, 효소 반응액으로부터 조직 세포, 예를 들면, 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 분리하는 방법은 통상의 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들면 원심분리 한 후, 세포체(strainer)를 사용하여 세포를 분리할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 분리"는 처리하지 않은 포유류 탯줄에서 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 제거하는 것을 의미할 수 있다. 한 장기에서 얻은 줄기세포를 포함하는 세포군은 처리하지 않은 상태의 그 장기 속에서 그 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50% 미만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다.
다음으로, 상기 분리된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 P0으로 하여 계대 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 계대 배양하는 단계는 계대 배양을 위한 세포 이식 전 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소의 처리를 더 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) 효소"는 비동물 기원으로, 이는 효소가 동물 공급원으로부터 정제되지 않음을 의미할 수 있다. 상기 동물 유래 성분이 없는 효소는 재조합 기원일 수 있으며, 예를 들면 세균, 효모 또는 식물 기원일 수 있다. 재조합 기원의 효소는 그의 생산을 위해 미생물, 예컨대 세균, 바이러스, 효모, 식물 등의 사용을 포함하는 재조합 DNA 기술로 생산되는 임의의 효소를 의미할 수 있다. 상기 효소는 동물 유래 성분이 없는 재조합 트립신일 수 있으면, 예를 들면 옥수수 내에서 생산된 재조합 트립신일 수 있다. 상기 동물 유래 성분이 없는 재조합 트립신은 상업적으로 구매 가능하며, 예를 들면, TrypLETM Select(GIBCO Invitrogen), TrypLETM Express(GIBCO Invitrogen), TrypZeanTM(Sigma Aldrich) 또는 Recombinant Trypsin SolutionTM(Biological Industries)일 수 있다.
상기 계대 배양하는 단계는 줄기세포 배양 배지, 예를 들어 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4) 및 헤파린이 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함한다. 상기 배지 중 FGF-4 는 약 10 ng/ml 내지 약 40 ng/ml, 또는 약 20 ng/ml 내지 약 30 mg/ml의 농도로 첨가될 수 있고, 예를 들면 25 ng/ml일 수 있다. 상기 배지 중 헤파린은 약 0.5 ㎍/ml 내지 2 ㎍/ml, 또는 0.5 ㎍/ml 내지 1.5 ㎍/ml의 농도로 첨가될 수 있고, 예를 들면 1 ㎍/ml일 수 있다. 상기 배지는 예를 들면, 소 태아 혈청, 및 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 등)를 추가적으로 포함할 수 있다. 일구체예에 있어서, 10%의 소 태아 혈청, 50 ㎍/ml의 겐타마이신, 1 ㎍/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 FGF-4가 첨가된 CS-CM 배지가 사용될 수 있다. 상기 계대 배양은 약 20 내지 40 ℃, 약 30 내지 40 ℃, 또는 35 내지 40 ℃, 예를 들면, 37 ℃에서 수행할 수 있고, 각 계대 마다의 배양 시간은 예를 들면, 2 내지 7일, 또는 3 내지 5일 일 수 있다.
일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 제조 방법에 있어서, 상기 계대배양의 계대수는 특별히 제한되는 것은 아니며, 원하는 증식 세포의 수에 따라 적절히 계대수를 선택할 수 있다. 전형적으로는, 적어도 1 계대 이상, 10 계대 이상일 수 있으며, 예를 들면, 1 내지 20 계대, 3 내지 15 계대 수행함으로써 임상적으로 필요한 수의 누적 증식세포를 얻을 수 있다.
또한, 계대 배양시에도 상기한 바와 같이, 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소의 처리를 추가적으로 수행할 수 있다. 즉, 각각 계대 배양하는 단계마다 다음 단계로 세포를 계대하기 전 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 처리하여 세포를 수거함으로써 세포의 순도를 높일 수 있다. 예를 들면, P1에서 P2로 넘어가는 단계에서 P2를 위해 세포를 이식하기 전에 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 처리할 수 있다.
상기 계대 배양하는 단계 정상산소 조건인 21%에 비해 낮은 저산소 조건에서 계대 배양하는 것일 수 있다. 용어 "저산소(hypoxia)"는 통상적인 정상산소 조건인 산소 분압 21%에 비해 낮은 산소 분압 상태를 의미할 수 있다. 상기 저산소 조건은 1 내지 15%, 1 내지 12%, 1 내지 10%, 또는 1 내지 5%의 산소 분압을 갖는 상태일 수 있으며, 예를 들면, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 또는 9% 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 저산소 조건에서 계대 배양시 정상 산소 조건에 비해, S100A10, BNIP3, IGFBP5, PGK1, TPI1, DCN, PGM1, PFKFB3, LOC644774, MME, MIR1978, SLC2A3, BHLHB2, BNIP3L, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현은 증가되거나, IL8, ALDH1A1, NQO1, DLC1, CTHRC1 및 CPA4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현은 감소된 것일 수 있다.
상기 제조방법에 의해 제조된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 상기한 바와 같은 특성을 가지며, 예를 들면, 상기 제조된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 것일 수 있다:
a) COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
b) CCND1, SERPINE1, PRNP 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것;
c) 계대 배양하는 동안 부착형 섬유아세포의 형태를 유지하는 것;
d) 지방세포, 골세포, 또는 연골세포로의 분화능; 및
e) CD200+, Tra-1-60-, CD3-, CD1a-, CD11c-, CD16-, CD86-, CD8a-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+, MIC A/B- 및 SSEA4+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성.
상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 하기 (f) 내지 (i)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 더 갖는 것일 수 있다:
f) S100A10, BNIP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 많이 발현되는 것;
g) IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, 및 CPA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 적게 발현되는 것;
h) SNCA, DSG2, NRP2, 및 PLAT으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
i) TPMT, NAGK, 및 ANXA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것.
상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 상기 e)의 표면 항원 특성이 추가적으로 Oct4-, 또는 Nanog-인 것일 수 있다. 또한, 상기 e)의 표면 항원 특성 중 CD61+는 저산소 조건에서 과 발현하는 표면 항원 특성일 수 있다.
다른 양상은 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 세포치료제, 약학적 조성물 또는 제제를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 세포치료제, 약학적 조성물 또는 제제의 제조에 사용하기 위한 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액의 용도를 제공한다.
예를 들면, 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단을 포함하는 세포치료제, 약학적 조성물, 또는 제제를 제공할 수 있다:
a) COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
b) CCND1, SERPINE1, PRNP 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것;
c) 계대 배양하는 동안 부착형 섬유아세포의 형태를 유지하는 것;
d) 지방세포, 골세포, 또는 연골세포로의 분화능; 및
e) CD200+, Tra-1-60-, CD3-, CD1a-, CD11c-, CD16-, CD86-, CD8a-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+, MIC A/B- 및 SSEA4+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성.
상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 하기 (f) 내지 (i)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 더 갖는 것일 수 있다:
f) S100A10, BNIP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 많이 발현되는 것;
g) IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, 및 CPA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 적게 발현되는 것;
h) SNCA, DSG2, NRP2, 및 PLAT으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
i) TPMT, NAGK, 및 ANXA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것.
또한, 상기 양상은 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 배양액을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 또한, 예를 들면, 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단, 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환, 허혈성 질환, 및/또는 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 다른 양상은 질병, 예를 들면, 염증성 질환, 허혈성 질환, 및/또는 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포 집단 또는 그의 배양액의 용도를 제공한다.
또한 다른 양상은 유효성분의 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단, 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병, 예를 들면, 염증성 질환, 허혈성 질환, 및/또는 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포에 대해서는 상기한 바와 같다.
일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 상기한 바와 같이 질환 치료에 유리한 단백질(예를 들면, IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-3, VEGF, 또는 GRO)을 분비하고, 손상된 조직으로의 이동 능력이 현저할 뿐만 아니라, 항염증, 혈관 재생, 신경 재생 효과를 가지므로, 염증성 질환, 허혈성 질환, 및/또는 신경퇴행성 질환을 포함하는 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포 치료제 또는 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 질환의 예는 염증성 질환, 허혈성 질환, 및/또는 신경퇴행성 질환을 포함할 수 있다. 상기 염증성 질환의 예는 기관지염, 위염, 동맥경화증, 관절염, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD), 간염, 담낭염, 진균성 감염증, 위궤양, 천식, 아토피성 피부염, 건염 또는 신장염을 포함할 수 있다. 상기 허혈성 질환의 예는 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 또는 허혈성 하지질환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)" 또는 "뇌졸중(stroke)"은 뇌혈류 감소가 일정 시간 이상 지속되어 뇌조직 또는 세포의 괴사로 인해 발생하는 질병을 의미할 수 있으며, "뇌경색(cerebral infarction)"과 호환적으로 사용될 수 있다.
상기 신경퇴행성 질환의 예는 척수 손상, 다발성 경화증, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia), 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 피크병(Pick's disease), 또는 권투선수 치매 (Dementia pugilistica, DP)를 포함할 수 있다.
일 구체예 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여량은 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 기준으로 1.0 X 103 내지 1.0 X 1010 세포/kg(체중) 또는 개체, 또는 1.0 X 107 내지 1.0 X 108 세포/kg(체중) 또는 개체일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 또는 개체당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는, 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 유래세포군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다. 또한, 전형적으로 탯줄 이외의 다른 조직 유래 줄기세포가 사용되는 치료 프로토콜에서 줄기세포가 본 명세서의 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포로 대체될 수 있다.
일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다. 또한, 세포치료제는 주사용 제형으로 제형화될 수 있다. 이 경우 제형화하기 위한 공지된 통상적 성분이 이용될 수 있고, 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다.
일 양상에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포에 의하면 항염증 효과, 혈관 재생 효과, 또는 신경 재생 효과가 있어, 다양한 질병의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 또는 세포 치료제에 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 제조방법에 의하면, 탯줄 조직으로부터 줄기세포의 순도, 수득율 및 증식율을 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1a는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포 분리에 있어서, 분리효소의 전, 후의 세포 형태를 나타내는 도면이다.
도 1b는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포 분리에 있어서, 분리효소의 처리 시기에 따른 세포 형태를 나타낸 도면이다: G1: Col I 처리군, G2: 조직부착 후 Col I 처리군.
도 2는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포 배양에 있어서, 저산소 조건과 정상산소 조건에 따른 비교를 분석한 도면이다: 3%: 저산소분압(3% O2), 21%: 정상산소분압(21% O2).
도 3은 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 유전적 안정성을 핵형분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 표면 단백질을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 다분화능을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 단백질 발현을 비교 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7a는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 항염증 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다
도 7b는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 혈관 재생 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다
도 7c는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 신경 재생 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 제조, 그의 특성 분석, 및 항염증, 신경재생 및 혈관재생 효과 분석
1. 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 제조 및 배양 방법에 따른 비교 분석
(1.1) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 분리 및 배양 1
정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만 시에 수집된 태반조직으로부터 탯줄을 분리하였다. 분리된 탯줄을 Ca/Mg free DPBS로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거하였다. 이후, 외부 양막은 벗겨내지 않고, 동맥 2개와 정맥 1개를 제거한 뒤 1 내지 5 mm 정도 크기로 탯줄을 잘라내었다. 이후, 상기 탯줄을 배양용기에 부착하여 10 내지 15일 배양을 하였고, 상기 배양된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인한 후, 5 내지 6시간 동안 200 U/ml의 콜라게나아제 I을 처리하여 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 분리하였다. 상기 콜라게나아제 I 처리 전, 후에 탯줄 부착된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인하기 위하여 광학현미경하에서 40x, 100x 배율로 세포형태를 확인하였고, 그 결과를 도 1a에 나타내었다.
도 1a는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포 분리에 있어서, 분리효소의 전, 후의 세포 형태를 나타내는 도면이다.
도 1a에서 나타낸 바와 같이, 분리효소인 콜라게나아제 I의 처리 후에 균질한(homogeneous) 세포의 형태를 나타냄을 알 수 있다.
이후, 상기 분리된 세포를 P0으로 하여, 25ng/ml FGF4, 1ug/ml 헤파린, 10% FBS가 함유된 MEM alpha GlutaMAX(CS-CM 배지)에서 37℃, 저산소 배양조건 (O2 3%) 하에서 배양하였다. 이후 3 내지 4일마다 CS-CM배지를 교체하여 플라스크 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하고 첫 계대에서 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소인 Invitrogen사의 TrypLE를 37℃인큐베이터에서 단기간 (3분) 처리하여 계대 배양하였다.
(1.2) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 분리 및 배양 2
상기 (1.1)에서 콜라게나아제 I의 처리를 탯줄을 배양용기에 부착하기 전에 수행한 것만을 제외하고는 상기 (1.1)과 동일한 방법으로 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 분리 및 배양하였다.
(1.3) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 분리 및 배양 3
상기 (1.1)에서 분리된 줄기세포를 정상산소 조건(O2 21%)에서 수행한 것만을 제외하고는 상기 (1.1)과 동일한 방법으로 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 분리 및 배양하였다.
(1.4) 분리효소 처리 시기에 따른 비교 분석
상기 (1.1) 및 (1.2)에서 분리된 줄기세포의 세포 회수율을 비교하기 위해, 상기 (1.2)에서 분리된 줄기세포 및 (1.1)에서 분리된 줄기세포군을 각각 G1 및 G2로 명명하고, 분리된 세포의 형태를 광학현미경하에서 40x, 100x 배율로 세포형태 확인하였으며, 그 결과를 도 1b에 나타내었다.
도 1b는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포 분리에 있어서, 분리효소의 처리 시기에 따른 세포 형태를 나타낸 도면이다.
또한, 상기 G1 및 G2의 조직 무게, 분리효소 처리 후의 세포수 및 세포수(P0)를 비교하였다.
군 구성 조직 무게(g) 분리효소 처리 후 세포수 세포수(P0)
G1 Col I 처리군 2.71 3.1 X 105 3.02 X 105
G2 조직 부착 후 Col I 처리군 3.14 - 3.45 X 105
상기 도 1b 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 분리효소를 탯줄의 배양 전에 처리한 경우 조약돌 형태가 대부분을 차지하고, 증식이 느려 세포 수율이 낮지만, 분리효소를 탯줄의 배양 후에 처리한 경우 균질한 세포의 형태가 나타나고, 증식이 빨라 세포 수율이 높은 것을 확인할 수 있다.
(1.5) 저산소 조건과 정상산소 조건에 따른 비교 분석
상기 (1.1)의 저산소 조건 및 (1.2)의 정상 산소 조건에서 1 내지 20회 계대 배양(P1 내지 P20)된 부착형 세포의 성장 곡선 및 배가 시간 등을 비교하기 위해 각각 같은 수의 세포를 6 웰 플레이트에 접종하여 플레이트 바닥면적의 70 ~ 80% 차지할 때 세포를 수집하였다. 이후, 10 ㎕의 검체와 트리판 블루 시약 10 ㎕을 섞은 것의 10 ㎕을 혈구계산기의 한쪽 측정부에 주입하였다. 자동 세포 계수기를 이용하여 세포 수를 측정하였다. 이때 시간도 함께 기록하여 배가시간(Doubling time)을 계산하였다. 배가 시간은 세포 수가 2배에 이르는 시간으로 총 세포수와 이를 측정한 시간을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다.
또한, 세포의 콜로니 형성능을 분석하기 위하여, 100 mm 배양 디쉬에 디쉬 당 150개의 세포를 도포하였다. 이후, 12 ml 배양 배지에서 10 내지 14일 배양 후 현미경 하에서 세포 콜로니 형성 유무를 확인하였다. 다음으로, DPBS로 세척 후, 글루타알데하이드와 크리스탈 바이올렛 혼합 용액을 세포가 있는 디쉬에 2 내지 3 ml 첨가하고 30분 동안 염색을 수행하였다. 멸균수로 조심히 세척하고 현미경 하에서 콜로니 개수를 카운트 하고 평균값으로 수치화 하여 결과를 분석하였고, 그 결과를 도 2c에 나타내었다.
또한 세포의 손상된 조직으로의 이동능력을 분석하기 위하여 트랜스웰 필터의 위쪽면에 0.1% 겔라틴을 37℃ 에서 1시간 동안 코팅하였다. 5 x 105개의 세포를 100 ㎕의 혈청 프리 배지에 부유하여 트랜스웰 삽입부의 위쪽 챔버에 첨가하였다. 첨가 전에 혈청 프리 배지에서 하룻밤 동안 결핍(starvation)시켰다. 아래쪽 챔버에 케모스태트 인자가 들어있는 배지(CS-CM)를 600 ㎕ 첨가하였다. 이후, 배양기에서 하룻밤 동안 세포를 배양하였다. 필터의 위쪽 면을 콜드 PBS로 조심히 세척한 후 면봉을 사용하여 필터의 위쪽 면에 남아 있는 세포를 제거하였다. 트랜스웰 필터는 해부용 칼로 잘라서 김자 염색하고 아래쪽 면을 위로하여 슬라이드 글라스에 놓고 장착하였다. 이동된 세포는 광학 현미경을 이용하여 염색된 세포수를 카운트 하였고, 그 결과를 도 2d에 나타내었다.
도 2는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포 배양에 있어서, 저산소 조건과 정상산소 조건에 따른 비교를 분석한 도면이다.
도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 저산소 조건에서 세포는 배가시간의 단축으로 증식율이 높아지는 것을 알 수 있다. 또한, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 콜로닝 형성 개수가 약 2배 증가하였으면, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 세포의 손상된 조직으로의 이동 능력이 약 1.6배 정도 향상됨을 확인할 수 있다.
2. 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 특성 분석
(2.1) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 유전적 안전성 분석
상기 (1.1) 및 (1.3)에서 제조한 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 유전적 안전성을 분석하기 위해 GTG-Banding 분석법을 수행하였다.
구체적으로, P7, 및 P14의 세포로부터 프로메가 DNA 추출 키트(Promega DNA Extraction Kit)를 이용하여 DNA를 추출하여 시료로 사용하였다. 일루미나 휴먼옴니1-쿼드 칩(Illumina HumanOmni1-Quad Chip)을 이용하였으며 iSCAN® 스캐너를 사용하여 측정하였다. 먼저, 400 ng의 각 DNA 시료는 전체 게놈 증폭(whole genome amplification) 방법으로 증폭하여 화학적인 방법으로 무작위로 조각을 내어 2-프로판올 침전법으로 정제를 수행한 후, 칩은 DNA 시료를 넣기 전에 완충용액으로 전 처리된 칩에 DNA 시료를 가하였다. 그 다음 약 16 시간 동안 인큐베이션 시행 후, 염색, 대립 유전자 특이적 프라이머 확장(allele specific primer extension) (ASPE), 혼성화(hybridization), 표적 제거(target removal), 및 세척을 수행하였다. 이후, 일루미나아이스캔(IlluminaiScan)으로 스캐닝을 수행하여 게놈스튜디오 소프트웨어(GenomeStudio® software)를 사용하여 데이타를 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 유전적 안정성을 핵형분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 제조방법에 의해 제조된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 P14까지 유전적 변이가 일어나지 않았음을 알 수 있다.
(2.2) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 표면 단백질 분석
상기 (1.1)에서 제조한 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 표면 단백질 분석을 위해 유세포 분석 및 면역형광염색 분석을 수행하였다.
구체적으로, 유세포 분석을 위해 세포는 DPBS를 사용하여 세척 후, 2% FBS가 함유된 DPBS에 담아 Tra-1-60, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD14, CD86, CD8a, CD19, CD40, CD80, CD200, CD141, CD61, CD87, MIC A/B, SSEA4 마커를 아이스에서 20분간 반응시켰다. 이후, 유세포 분석기(FACS Calibur, Becton Bickinson)를 통해 표면 항원을 분석하였으며, 그 결과를 도 4a에 나타내었다.
배아줄기세포마커인 Oct4와 Nanog의 발현을 확인하고자 면역형광염색을 수행하였다. 먼저 세포를 DPBS로 3회 세척 후, 4% 파라포름알데하이드를 배양 용기에 각각 넣고 상온에서 10분간 고정하였다. 고정이 끝난 세포를 DPBS로 3회 세척하였다. 다음으로, 0.2% Triton X-100 용액을 넣고 상온에서 10분간 침투시킨 후 DPBS로 3회 세척하였다. 10% 정상 고트 혈청(Normal goat serum)을 넣고 상온에서 30분간 블로킹하고, 1차 항체(Oct4, Nanog)를 넣고 빛 차단한 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 반응 시켰다. 이후, DPBS로 3회 세척 후 2차 항체를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, DPBS로 3회 세척 후 형광현미경 하에서 관찰하였고, 그 결과를 도 4b에 나타내었다.
도 4는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 표면 단백질을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 CD200, CD141, CD61, CD87 SSEA4에 선택적으로 양성을 나타내는 세포이고, TRA-1, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD86, CD8a, CD40, MIC A/B에 선택적으로 음성을 나타내는 세포이며, 추가적으로, CD61은 저산소 조건에서 선택적으로 양성을 나타내는 세포이다. 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 배아줄기세포 특이적 마커인 Oct4, Nanog 단백질은 발현하지 않음을 알 수 있다.
(2.3) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 분화능 분석
(2.3.1) 지방세포 분화능 분석
향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 지방세포 분화능 분석은 하기의 방법으로 수행하였다.
상기 (1.1) 및 (1.3)에서 제조한 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 지방형성 분화 배지(Adipogenesis differentiation media)(StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit, Life Technology)에 넣고 2주 동안 3일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 Ca/Mg free DPBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데하이드를 넣고 상온에서 15 분 동안 반응시켰다. 60% 이소프로판올을 넣어 세척한 다음 오일 레드 O(Oil Red O)를 넣고 10분 동안 반응시킨 후 정제수로 세척한 후 현미경 하에서 지방세포를 관찰하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
(2.3.2) 뼈세포 분화능 분석
향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 뼈세포 분화능 분석은 하기의 방법으로 수행하였다.
상기 (1.1) 및 (1.3)에서 제조한 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 뼈형성 분화 배지(Osteogenesis differentiation media)(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit, Life Technology)에 넣고 2 주 동안 3일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하였다. 그 후 배양액을 제고하고 Ca/Mg free DPBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데하이드를 넣고 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 정제수를 넣어 세척한 다음 1% 실버 니트레이트 용액(silver nitrate solution)을 넣고 상온에서 5 분 동안 반응시킨 후 정제수로 세척한 후 5% 소듐 티오설페이트 용액(Sodium Thiosulfate solution)을 넣고 상온에서 5 분 동안 반응시켰다. 다음에, 정제수로 세척한 후, 0.1% 뉴클리어 패스트 레드 용액(nuclear Fast Red Solution)을 넣고 상온에서 5 분 동안 반응시켰다. 이후, 정제수로 세척하고 현미경하에서 칼슘 축적된 샘플을 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
(2.3.3) 연골 세포 분화능 분석
향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 연골 세포 분화능 분석은 하기의 방법으로 수행하였다.
상기 (1.1) 및 (1.3)에서 제조한 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 15 ml 튜브에 2 x 105 개를 넣고 1,500 rpm, 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포만을 남기고 연골형성 분화 배지(Chondrogenesis differentiation media)(StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit, Life Technology)를 넣고 뚜껑을 느슨하게 닫은 상태로 3 주 동안 3일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하였다. 세포덩어리를 파라핀 블록(paraffin block)으로 만든 후 세을 만든 후 절단하고 알시안 블루(Alcian blue) 염색을 수행하였다. 이후, 광학현미경으로 푸른색으로 염색된 연골세포를 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 다분화능을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화능 분석 결과에서 물방울처럼 보이는 크고 작은 물질(지방)이 적색으로 확인되었음을 알 수 있다. 또한, 뼈세포 분화능 분석 결과에서 분홍색 배경에 검은 갈색으로 침착된 파티클 칼슘 덩어리들이 확인됨을 알 수 있다. 또한, 연골세포 분화능 분석 결과에서 연골세포로 분화되면 연골의 단단함과 탄력성을 나타내는 당단백질이 분비되며, 이 부분이 푸른색으로 나타남을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, 상기 (1.1) 및 (1.3)에 따른 방법으로 제조된 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 지방세포, 뼈세포, 연골세포로 분화되어 다분화능이 있음을 알 수 있다.
(2.4) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 분비단백질 분석 프로파일링 및 정량적 분석
상기 (1.1)에서 제조한 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 분비 단백질을 분석하기 위해 멀티플렉스 비드 분석(multiplex bead analysis)(MILLIPLEX Human Cytokine/Chemokine Panel 1, Merck Millipore, Billerica, Ma, USA)를 수행하였다.
구체적으로 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 24시간 배양한 배양액을 항체-코팅 포획 비드(antibody-coated capture beads)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척하였다. 이후 상기 비드를 비오틴-라벨 항-인간 사이토킨(biotin-labeled anti-human cytokine)과 케모카인 항치(chemokine antibody)와 함께 1시간 동안 인큐베이션 하고, 스트렙타비딘 파이코에리스린(streptavidin phycoerythrin)으로 30분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 상기 비드를 세척하고 정량분석하기 위하여 Luminex 200 프로그램을 이용하여 분비단백질 발현양을 분석하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Category Cytokine ( pg /㎖) 3% 산소분압
Inflammation IFNr 46
IL-1a 19
IL-1b 5
IL-1ra 30
IL-2 0
IL-3 5
IL-4 8
IL-5 0
IL-6 744
IL-7 20
IL-8 >10,000
IL-9 1
IL-10 0
IL-12(p40) 14
IL-12(p70) 2
IL-13 1
IL-15 1
IL-17 0
TNFa 0
TNFb 0
IFNa2 50
MDC 2
sCD40L 0
sIL-2Ra 4
Chemotaxis/Recruitment/Hematopoiesis Eotaxin 117
Flt-3 Ligand 6
G-CSF 3,001
GM-CSF 46
MCP-1 >10,000
MCP-3 1,033
MIP-1a 13
MIP-1b 2
RANTES 7
Fractalkine 116
IP-10 10
Angiogenesis/Tissue remodeling VEGF 170
Growth factor/Fibrosis EGF 16
GRO >10,000
PDGF-AA 0
PDGF-AB/BB 0
FGF-2 90
TGFa 0
Growth factor/Fibrosis IGF-1 SR 197
Growth factor/Fibrosis IGFBP3 106.5
Cell adhesion epCAM 140.5
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-1, MCP-3, VEGF, GRO, IGF-1 SR, EpCAM, IGFBP3 등을 분비함을 알 수 있다.
(2.5) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 유전자 발현 분석
상기 (1.1)에서 제조된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 유전자 발현을 분석을 골수 줄기세포와 비교하여 분석하였다.
구체적으로, 골수 줄기세포와 비교시 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 유전자를 분석하기 위하여 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와 골수 줄기세포로부터 RNA를 추출한 후, 라벨링 및 정제를 수행하였다. 라벨된 cDNA를 일루미나 발현 비드칩(Illumina Expression BeadChip)에 혼성화하고 결과를 도출하였으며, 데이터를 통계처리 후, 하기 표 3 및 도 6에 나타내었다.
ACCESSIOM SYMBOL 골수 줄기세포/탯줄줄기세포.fc 골수 줄기세포/탯줄줄기세포.volume
NM_000088.3 COL1A1 -2.181493 15.1373
NM_001552.2 IGFBP4 -2.824265 14.69699
NM_003186.3 TAGLN -2.531752 14.55202
NM_053056.2 CCND1 3.063696 14.50615
NM_000602.1 SERPINE1 3.478237 14.50551
NM_001080121.1 PRNP 2.289925 14.48807
NM_002966.1 S100A10 -2.008462 14.47747
NM_003900.3 SQSTM1 -2.009802 14.37823
NM_005953.2 MT2A 2.116453 14.37452
NM_001011546.1 DSTN -2.02492 14.31394
NM_133505.2 DCN -6.032783 14.27855
NM_006623.2 PHGDH -2.777842 14.05087
NM_006486.2 FBLN1 -2.856691 14.04878
NM_014220.2 TM4SF1 2.298303 14.04031
NM_003542.3 HIST1H4C 2.048184 14.0358
NM_005928.1 MFGE8 -4.522915 14.01616
NM_000269.2 NME1 2.074511 14.00612
NM_002116.5 HLA-A -2.348384 13.95215
NM_138440.2 VASN -2.024294 13.87727
NM_018689.1 KIAA1199 -3.846874 13.85275
NM_003155.2 STC1 -76.224696 10.428439
NM_001031692.1 LRRC17 -48.150192 9.539232
NM_033439.2 IL33 -54.158215 8.92943
NM_000104.2 CYP1B1 349.556757 10.016027
상기 표 3 및 도 6에 나타낸 바와 같이, COL1A1, IGFBP4, TAGLN, S100A10, SQSTM1, DSTN, DCN, PHGDH, FBLN1, MFGE8, HLA-A, VASN, KIAA1199, STC1, LRRC17, IL33, SNCA, DSG2, NRP2, PLAT은 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포에서 많이 발현되고 CCND1, SERPINE1, PRNP, MT2A, TM4SF1, HIST1H4C, NME1, CXCL6, NTSR1, PTGS2, CYP1B1, TPMT, NAGK, ANXA4는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포에서 골수 줄기세포에 비하여 낮게 발현함을 알 수 있다.
상기 유전자 중 증가 유전자인 COL1A1은 알파-1 타입 I 콜라겐으로서 연골을 포함한 결합조직의 콜라겐에서 발현하는 것으로 알려져 있다. 다만, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
상기 유전자 중 증가 유전자인 IGFBP4는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 로서 다양한 암세포를 억제하는 단백질로 알려져 있다. IGFBP4는 제대혈의 혈청에서 검출된다는 보고가 있으나, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
상기 유전자 중 증가 유전자인 TAGLN은 섬유아세포(fibroblast)와 평활근(smooth muscle)에서 발현하는 유전자이며 그 기능은 아직 밝혀진 바가 없다. 골수 줄기세포에서 발현이 보고되었으나, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
상기 유전자 중 감소 유전자인 CCND1은 사이클린 D1(Cyclin D1)으로서 CCND1이 과발현하면 G1에서 S 기로 세포 주기를 빠르게 진행하게 하여 세포성장을 촉진한다. 주로 암 세포에서 많이 발현한다고 보고된 바 있다. 제대혈 줄기세포는 CCND1이 감소하여 C6 신경교종 증식을 억제한다는 보고가 있다. 하지만, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
상기 유전자 중 감소 유전자인 SERPINE1은 내피 플라스미노젠 활성화 억제제(endothelial plasminogen activator inhibitor)로서 알려져 있으며, 조직 플라스미노젠 활성화(tissue plasminogen activator)(tPA)의 억제제로서 기능을 한다고 알려져 있다. 다만, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
상기 유전자 중 감소 유전자인 PRNP는 주요 프리온 단백질(Major prion protein)(CD230)로서 신경계 뿐만 아니라 다양한 조직에서 발현한다고 알려져 있다. PRNP 유전자에 이상이 발생할 경우, 신경계 질환을 초래한다고 보고되었다. 다만, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
또한, 상기 (1.1) 및 (1.3)에서 제조된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 유전자 발현을 상기와 동일한 방법으로 비교분석하였고, 그 결과를 하기 표 4 및 도 6에 나타내었다.
ACCESSIOM SYMBOL 저산소조건/정산산소 조건.fc 저산소조건/정산산소 조건.volume
NM_002966.1 S100A10 2.012102 14.47873
NM_000584.2 IL8 -2.15463 14.32136
NM_000689.3 ALDH1A1 -2.96734 14.21048
NM_004052.2 BNIP3 2.986779 14.13839
NM_000599.2 IGFBP5 2.352086 13.89253
NM_000291.2 PGK1 2.558604 13.8367
NM_000365.4 TPI1 2.104472 13.77506
AV762101 -2.06732 13.66311
NM_133505.2 DCN 2.293184 13.6264
NM_002633.2 PGM1 2.334847 13.19009
NM_000903.2 NQO1 -3.74919 13.18508
NM_004566.2 PFKFB3 2.690257 13.05599
XM_927868.1 LOC644774 3.03134 13.01144
NM_000902.3 MME 2.705127 12.94125
NR_031742.1 MIR1978 2.384465 12.90422
NM_000291.2 PGK1 2.676001 12.84307
NM_006931.1 SLC2A3 2.061179 12.82325
NM_003670.1 BHLHB2 2.329298 12.81616
NM_004331.2 BNIP3L 2.235896 12.7381
NM_000599.2 IGFBP5 3.068411 12.56565
NM_020142.3 NDUFA4L2 10.462756 8.883854
상기 표 4 및 도 6 에서 나타난 바와 같이, S100A10, BNIP3, IGFBP5, PGK1, TPI1, DCN, PGM1, PFKFB3, LOC644774, MME, MIR1978, PGK1, SLC2A3, BHLHB2, BNIP3L, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD, 및 SCARA3는 저산소 조건하에서 배양한 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포에서 높게 발현되고, IL8, ALDH1A1, NQO1, DLC1, CTHRC1, 및 CPA4는 정상산소 조건하에 비해 저산소 조건하에서 배양한 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포에서 낮게 발현됨을 알 수 있다.
상기 유전자 중 증가 유전자인 S100A10은 S100 칼슘-결합 단백질 A10으로서 세포 주기와 분화를 조절한다. 또한 엑소사이토시스와 엔도사이토시스 기능을 한다고 알려져 있다. 골수 줄기세포가 뼈로 분화될 때 높게 발현하는 단백질 중의 하나로 연구가 되어 있으나, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
상기 유전자 중 증가 유전자인 BNIP3는 UCB-MSC(제대혈 유래 줄기세포)와 UCB-MNC(제대혈 유래 혈액세포)의 mRNA 수준에서의 유전자 발현을 비교하였을 때, UCB-MSC에서 증가된 유전자로서 알려져 있다. 또한, 저산소 조건 하에서 양수 줄기세포를 수집한 후, mRNA　마이크로어레이 분석한 결과, BNIP3 유전자는 저산소 조건에서 유의하게 증가한 유전자로서 알려져 있으나, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
상기 유전자 중 증가 유전자인 IGFBP5는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(Insulin-like growth factor binding protein) 5로서 발생과정(development)에 역할을 하고 세포외공간에 위치한다. 골수 줄기세포에서 IGFBP5 유전자가 발현함은 보고되었으나, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
상기 유전자 중 감소 유전자인 IL8은 염증환경에 노출될 때 식세포(phagocytes)와 간엽세포(mesenchymal cell)에서 분비되어 주화성을 유도하는 호중구를 활성화시킨다고 보고되었다. 그러나, 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
상기 유전자 중 감소 유전자인 ALDH1A1은 알데하이드 디히드로게나아제(aldehyde dehydrogenase) 1 패밀리, 멤버 A1로서 알코올 대사의 의 주요 산화 경로를 담당하는 효소이다. 상기 유전자는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다.
3. 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 항염증, 혈관재생 및 신경재생 효과 분석
(3.1) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 항염증 효과 분석
상기 (1.1)에서 제조된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 항염증 효과를 분석하기 위해 PBMC 증식 억제능 및 활성화된 PBMC로부터 분비된 IL-10을 분석하였다.
구체적으로 PBMC 증식 억제능 분석은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 농도별로 24 웰 플레이트에 접종한 후 24시간 배양하였다. 이후, CFSE로 염색된 PBMC에 PHA를 첨가하여 자극시키고 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포와 5일 동안 공배양하였다. 이후, 트랜스웰 사용 유무에 따라 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포가 분비하는 사이토카인에 의한 염증억제인지 또는 직접적으로 세포끼리 맞닿아서 나타나는 염증억제인지를 구분하였고, 그 결과를 도 7a에 나타내었다.
또한, 활성화된 PBMC로부터 분비된 IL-10 분석을 위해, 상기에서 5 시간째와 5 일간 공배양 후 위의 상층액(conditioned medium)을 수집하여 인간 IL-10 ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 IL-10 분비량을 측정하였고, 그 결과를 도 7a에 나타내었다.
도 7a는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 항염증 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 대조군에 대비하여 PBMC의 증식능이 억제됨을 확인할 수 있다. 또한 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포: PBMC 비율이 1:10일 경우, 간접적인 공배양에서 최대 약 30.51±1.74%의 증식 억제능이 나타남을 확인할 수 있다. 또한, 활성화된 PBMC로부터 분비된 IL-10 분석 결과에서, 활성화된 PBMC는 항염증 사이토카인(IL-10)을 분비하며, 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 PBMC가 IL-10 분비를 증가시키는 역할을 함을 알 수 있다.
상기의 결과로 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 염증성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
(3.2) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 혈관 재생 효과 분석
상기 (1.1)에서 제조된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 혈관 재생 효과를 분석하기 위해 혈관내피세포 증식 분석을 수행하였다.
구체적으로, EBM-2와 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 배양액(conditioned medium)을 수집하여 샘플을 준비하였다. 이후, 96 웰 플레이트에 혈관내피세포(HUVEC)를 접종하고 1일 정도 증식 되었을 때, EBM-2와 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 배양액을 각각 분주하고 4일 동안 배양하였다. Cyto XTMCell viability assay kit (WST-1) 시약을 상기 배지의 10% 씩 첨가 후 2~3 시간 인큐베이터에서 반응시켰다. 이후, 마이크로리더(Microreader)를 이용하여 450 nm에서 측정하여 내피세포의 증식률을 분석하였고, 그 결과를 도 7b에 나타내었다.
도 7b는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 혈관 재생 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7b에 나타낸 바와 같이, EBM-2 배지에서 배양한 혈관세포의 증식능이 100%일 때, 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 배양액(conditioned medium)에서 배양된 혈관세포는 172±15.22% 증식함을 확인할 수 있다.
상기의 결과로 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 혈관재생 효과가 있음을 확인할 수 있다.
(3.3) 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 신경 재생 효과 분석
상기 (1.1)에서 제조된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 신경 재생 효과를 분석하기 위해 신경세포 증식 분석을 수행하였다.
구체적으로, MEM와 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 배양액(conditioned medium)을 수집하여 샘플을 준비하였다. 이후, 96 웰 플레이트에 신경세포(SH-SY5Y)를 접종하고 1일 정도 증식 되었을 때, MEM와 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 배양액을 각각 분주하고 4일 동안 배양하였다. Cyto XTMCell viability assay kit (WST-1) 시약을 배지의 10% 씩 첨가 후 2~3 시간 인큐베이터에서 반응시켰다. 마이크로리더(Microreader)를 이용하여 450 nm에서 측정하여 신경세포의 증식률을 분석하였고, 그 결과를 도 7c에 나타내었다.
도 7c는 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 신경 재생 효과를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7c에 나타낸 바와 같이, MEM 배지에서 배양한 신경세포 증식능이 100%일 때, 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 배양액(conditioned medium)에서 배양된 신경세포는 302±15.97% 증식함을 알 수 있다.
상기의 결과로 일 구체예에 따른 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 신경 재생 효과가 있음을 확인할 수 있다.

Claims (20)

  1. 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포:
    a) COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
    b) CCND1, SERPINE1, PRNP 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것;
    c) 계대 배양하는 동안 부착형 섬유아세포의 형태를 유지하는 것;
    d) 지방세포, 골세포, 또는 연골세포로의 분화능; 및
    e) CD200+, Tra-1-60-, CD3-, CD1a-, CD11c-, CD16-, CD86-, CD8a-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+, MIC A/B- 및 SSEA4+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 하기 (f) 내지 (i)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 더 갖는 것인 세포:
    f) S100A10, BNIP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 많이 발현되는 것;
    g) IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1 및 CPA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 적게 발현되는 것;
    h) SNCA, DSG2, NRP2, 및 PLAT으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
    i) TPMT, NAGK, 및 ANXA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것.
  3. 청구항 1에 있어서, a) 및 b)의 특성은 마이크로어레이(microarray) 분석에 의하여 골수 줄기세포에 비하여 2배 이상의 발현량에 차이를 보여주는 것인 세포.
  4. 청구항 2에 있어서, 저산소 조건에서 배양한 c) 및 d)의 특성은 마이크로어레이(microarray) 분석 및 프로테오믹스(proteomics)에 의하여 정상산소 조건에 비하여 2배 이상의 발현량에 차이를 보여주는 것인 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 콜로니 형성능을 갖는 것인 세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF, MCP-3, VEGF, GRO, IFNγ, IL-1a, IL-1b, IL-1ra, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12(p40), IL12(P70), IL-13, IL-14, IFNα2, MDC, sIL-2Ra, Eotaxin, Flt-3 리간드, MCP-1, MIP-1a, MIP1b, RANTE, 프랙트알킨(Fractalkine), IP-10, EGF, FGF-2, IGF-1 SR, EpCAM, IGFBP3 또는 그들의 조합의 단백질을 분비하는 것인 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 포유동물 탯줄의 와튼 젤리(Wharton's Jelly) 조직 유래인 것인 세포.
  8. 분리된 탯줄을 배양 용기에 부착하여 배양하는 단계;
    상기 배양된 탯줄에 분리효소를 접촉시켜 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 분리하는 단계;
    상기 분리된 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계를 포함하는 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 제조하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 계대 배양하는 단계는 계대 배양을 위한 세포 이식 전 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소의 처리를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 계대 배양하는 단계는 정상산소 조건인 21%에 비해 낮은 저산소 조건에서 계대 배양하는 것인 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것인 방법:
    a) COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
    b) CCND1, SERPINE1, PRNP 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것;
    c) 계대 배양하는 동안 부착형 섬유아세포의 형태를 유지하는 것;
    d) 지방세포, 골세포, 또는 연골세포로의 분화능; 및
    e) CD200+, Tra-1-60-, CD3-, CD1a-, CD11c-, CD16-, CD86-, CD8a-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+, MIC A/B- 및 SSEA4+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 계대 배양은 3 내지 15 계대까지 수행하는 것인 방법.
  13. 청구항 8에 있어서, 상기 분리효소는 콜라게나아제인 것인 방법.
  14. 청구항 1항의 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 제제.
  15. 청구항 1의 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포 집단 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 염증성 질환은 기관지염, 위염, 동맥경화증, 관절염, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD), 간염, 담낭염, 진균성 감염증, 위궤양, 천식, 아토피성 피부염, 건염 및 신장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  17. 청구항 1의 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포 집단 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 허혈성 질환은 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  19. 청구항 1의 향상된 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포 집단 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 척수 손상, 다발성 경화증, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia), 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 피크병(Pick's disease), 및 권투선수 치매 (Dementia pugilistica, DP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
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