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KR20170020722A - T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도 - Google Patents

T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도 Download PDF

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KR20170020722A
KR20170020722A KR1020177002137A KR20177002137A KR20170020722A KR 20170020722 A KR20170020722 A KR 20170020722A KR 1020177002137 A KR1020177002137 A KR 1020177002137A KR 20177002137 A KR20177002137 A KR 20177002137A KR 20170020722 A KR20170020722 A KR 20170020722A
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plasmid
promoter
under
control
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안드레아 안톤
모니크 야노프스키-에글러
마커스 립스처
Original Assignee
와커 헤미 아게
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Abstract

본 발명은 T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 T7 프로모터의 제어 하에 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로서, 플라스미드 안정화 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터에 관한 것이다.

Description

T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도{T7 EXPRESSION SYSTEM, METHOD FOR ITS PRODUCTION AND USE THEREOF FOR PRODUCING RECOMBINANT PROTEINS}
본 발명은 T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질의 무항생제 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
T7 발현 시스템은 재조합 단백질의 발현을 위해 사용된다. 대체로 T7 프로모터 서열은 벡터 및 리보솜 결합 부위 후 이로부터 다운스트림의 재조합 단백질을 위한 코딩 영역 상에 위치한다. T7 중합효소가 발현 유기체에 의해 제조되지 않기 때문에, 이러한 발현 시스템은 T7 중합효소가 시스템 내로 인공 도입된 때에만 기능한다. 이를 위한 가장 보편적인 방법은 제조 유기체에서의 T7 발현 카세트의 유전체 앵커링(genomic anchoring)이다. BL21(DE3) 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포 중 단백질 발현을 위한 T7 중합효소 기초 원핵 시스템은 오랫동안 공지되어 있었다. 이 시스템에서, T7 중합효소의 E. 콜라이 게놈 내로의 통합은 E. 콜라이의 람다 부착 부위 내로의 DE3 람다 파지의 도움으로 이루어진다. 이 시스템에서, T7 파지 중합효소는 T7 파지 프로모터를 인식한다. 그러나, 이 시스템은 표적 유전자 발현에서 플라스미드 안정성이 낮다는 단점을 가진다. T7 발현 시스템의 발현 수준을 안정화시키기 위한 다수의 연구가 시도되었으나, 이제까지 주목할만한 성공은 없었다. 더 나아가, E. 콜라이는 약 40 kb 람다 파지 DNA를 포함한다. 이 파지 DNA는, 적어도 의약용 단백질의 발현을 위한 시스템에서는 바람직하지 않다. 추가로, T7 발현 시스템에서 발현 중의 클로닝 및 선택을 위한 선택 마커로서 항생제 내성 유전자를 포함하는 발현 벡터가 또한 지금까지 사용되어왔다.
그러나, 플라스미드의 선택을 위한 항생제의 사용은, 특히 치료 단백질의 제조에서, 치명적인 단점이다. 무항생제 방법은 규제 기관에 대해서 보다 허용적인데, 이는 그 생성물이 환자에게 보다 안전할 것이며 낮은(minor) 최종 생성물 분석(생성물 중 항생제의 제거)로 인해 현저히 보다 경제적인 공정이 구축될 수 있기 때문이다. 단백질의 무항생제 제조 방법을 가능하게 하는 발현 벡터는 예를 들어 EP1697523B1에 공지되어 있다. 그러나, 이 발현 벡터는 T7 발현 시스템에 적합하지 않다.
본 발명의 목적은, 공지된 T7 발현 시스템과 비교하여 증가된 발현 벡터 안정성을 나타내는 원핵 세포 및 발현 벡터로 이루어진 재조합 단백질의 무항생제 제조를 위한 T7 발현 시스템을 제공하는 것이다.
상기 목적은 T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포, 및 T7 프로모터의 제어 하에 발현시키고자 하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 발현 시스템으로서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 안정화 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템에 의해 해결된다.
플라스미드 안정화 시스템은 예를 들어 문헌[Sengupta and Austin, Infection and Immunity, July 2011, p.2502-2509]에 공지되어 있다. 바람직하게는, 이는 멀티머 분해 시스템(multimer resolution system, mrs), 분할 시스템(partitioning system, par) 및 분리 후 살해 시스템(postsegregational killing system, PSK)의 군으로부터 유래한 플라스미드 안정화 시스템이다. 특히 바람직하게는, 플라스미드 안정화 시스템은 멀티머 분해 시스템의 군으로부터 유래한 서열을 포함하며, 특별히 바람직하게는 이는 cer 서열이다.
유도성 프로모터는 바람직하게는 군 tac, lac, trp 및 phoA로부터의 프로모터이다. 특히 바람직하게는, 이는 유도성 프로모터 lacUV5이다.
뉴클레오티드 작제물은 바람직하게는 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, E. 콜라이 유래 lacZ 유전자의 5' 말단을 포함하는 lacUV5 프로모터의 뉴클레오티드 서열 및 T7 프로모터 서열로 이루어진 뉴클레오티드 작제물이다. 이러한 뉴클레오티드 작제물은 서열 번호 1에 나타나 있다. 특히 바람직하게는, 뉴클레오티드 작제물은 본 발명에 따른 발현 시스템의 원핵 세포의 게놈 내로 통합된다.
원핵 세포는 바람직하게는 게놈 중에 T7 RNA 중합효소 유전자를 갖는 E. 콜라이 균주의 세포이다. 이러한 균주는 균주 수집물에서 이용 가능한 것과 같은 야생형 균주로부터 자체 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 균주의 예로는 E. 콜라이 균주 BL21(미국 라 호야 소재 Stratagene사로부터 구입 가능) HMS174(DSM5932), 또는 C600(DSM426)(독일 38124 브라운슈바이히, 인호펜슈트라쎄 7B 소재 Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSMZ)[German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]사로부터 상기 DSM 번호 하에 입수 가능)가 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 T7 발현 시스템은 본 발명의 내용에 따라 개발된 T7 발현 벡터를 상기 균주 내로 도입함으로써 제조된다.
이러한 본 발명에 따른 발현 벡터는 바람직하게는 하기 구성요소:
복제 원점(ori),
조절 서열로서의 T7 프로모터,
발현시키고자 하는 재조합 단백질을 코딩하는 서열,
클로닝에 대한 선택 마커로서의 항생제 내성 유전자,
터미네이터,
리프레서 유전자,
리프레서 유전자에 적합한 오퍼레이터 서열, 및
플라스미드 안정화 시스템
을 기능적 결합으로 포함한다.
바람직하게는, 이는 이미 언급된 플라스미드 안정화 시스템 중 하나이다. 특히 바람직하게는, 플라스미드 안정화 시스템은 cer 서열을 포함한다.
바람직하게는, 복제 원점은 pBR322-ori, pUC19-ori 또는 p15A-ori이고, 특히 바람직하게는 pBR322-ori이다.
특히 바람직하게는, 터미네이터는 t0, rrnB 또는 T7 터미네이터이다.
리프레서 유전자는, 프로모터 영역에서 결합시 유전자의 전사를 방지하는 단백질을 코딩하는 임의 유전자이다. 특히 바람직하게는, 리프레서 유전자는 lacI 유전자이다.
바람직하게는, 항생제 내성 유전자는 kan, tet, bla, cmR 또는 tetA이고, 특히 바람직하게는 kan이다.
본 발명에 따른 T7 발현 시스템은 이미 공지된 T7 발현 시스템과 같이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 발현 벡터를 게놈 내에 T7 RNA 중합효소 유전자를 갖는 원핵 세포 내로 도입한다는 차이점을 가진다.
본 발명의 추가 목적은, 본 발명에 따른 T7 발현 시스템의 일부로서 원핵 세포의 바람직한 실시양태를 제조하는 방법으로서, 공정에서 발생하는 세포 내로의 파지 DNA의 통합 없이 원핵 세포 내로의 제어 영역을 포함하는 T7 RNA 중합효소의 통합을 이루는 방법을 제공하는 것이다.
이 방법은 제어 영역을 포함하는 T7 RNA 중합효소의 코딩 서열이 “부위 특이적” 재조합에 의해 원핵 세포의 게놈 내로 통합되는 것을 특징으로 한다.
이러한 “부위 특이적” 재조합은 예를 들어 박테리오파지 P1 유래 Cre-lox 시스템 및 효모 유래 FLP-FRT 시스템에 의해 실현 가능하다. 염색체 박테리아 DNA의 수식을 위한 “부위 특이적” 재조합의 이용은 예를 들어 문헌[Datsenko and Wanner, PNAS, June 6, 2000 no.12, p.6640-6645]에 기술되어 있다.
바람직하게는, T7 RNA 중합효소의 표적 통합은 E. 콜라이 게놈, 바람직하게는 E. 콜라이의 proBA 서열 중 정의된 위치 내로 유도성 프로모터의 제어 하에 이루어진다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌[Datsenko and Wanner, PNAS, June 6, 2000 no.12, p.6640-6645]에 공지되어 있다.
이 방법에 의해 제조된, 게놈 내로 통합된, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포는 람다 파지 DNA를 포함하지 않는다는 점에서 이러한 작제물을 포함하는 공지된 원핵 세포와 다르다. 아주 놀랍게도, 이러한 세포에서 종래 발현 벡터가 또한 증가된 안정성을 나타내지만, 본 발명에 따른 발현 벡터를 이용하면 여전히 추가로 증가된 안정성을 달성할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서 본 발명은 또한, 게놈 내로 통합된, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포, 바람직하게는 E. 콜라이 세포로서, 람다 파지 DNA를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 세포에 관한 것이다.
이와 별도로, 본 발명의 장점은 복합 배지 중 무항생제 발효에서의 이의 이용이며, 이로써 대체적으로 EP1697523B1에 기술된 발현 시스템을 이용한 것과 같은 무기물 염 배지를 이용하는 것에 비해 제조하고자 하는 단백질의 보다 높은 발현 효율이 달성될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
이 방법은, 본 발명에 따른 발현 벡터를, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포 내로 도입하고, 상기 세포를 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 재조합 단백질의 발현 및 T7 RNA 중합효소의 발현에 적합한 무항생제 조건 하에 발효시키고, 이로써 재조합 폴리펩티드를 발현시키고 재조합 폴리펩티드를 단리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 발효 공정, 즉 단백질 발현에 대한 실제적 과정은 완전 무항생제 환경에서 이루어진다. 그 결과, 플라스미드의 선택을 위한 항생제의 사용과 관련된 도입부에서 언급된 문제점들, 예를 들어 규제 기관의 제한, 생성물 안정성, 최종 생성물 분석(생성물 중 항생제의 제거) 및 이와 관련된 위험 및 비용이 방지된다.
본 발명의 관점에서, 단백질은 또한 펩티드 및 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 생물 반응기에서 수행된다.
도 1에서는 BL21(DE3)(선행 기술) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따름)의 게놈 중 T7 뉴클레오티드 작제물을 비교하여 개략적으로 나타낸다:
a) DE3: 수식된 람다 파지를 이용하여 람다 부착 부위 내로 통합(선행 기술)
b) Scil-T7: proBA의 동시 결실에 의한 표적 통합(본 발명에 따름)
도 2에서는 lacI, lacUV5 프로모터, lacZ의 5' 영역, T7 프로모터 및 T7 파지(T7 중합효소)의 유전자 1 및 2개의 FRT 부위에 의해 플랭크된 카나마이신 내성 유전자 kan으로 이루어진 T7 뉴클레오티드 작제물을 개략적으로 나타낸다 .
도 3에서는 T7 프로모터, t0 터미네이터, pBR322-ori, proBA, kan 및 lacI로 이루어진 발현 벡터 pSCIL006c를 개략적으로 나타낸다.
도 4에서는 T7 프로모터, t0 터미네이터, pBR322-ori, proBA, kan, lacI 및 cer로 이루어진 발현 벡터 pSCIL122 및 pSCIL123를 개략적으로 나타낸다.
도 5에서는 T7 프로모터, t0 터미네이터, pBR322-ori, proBA, tetA, lacI 및 cer로 이루어진 발현 벡터 pSCIL124 및 pSCIL125를 개략적으로 나타낸다.
도 6에서는 T7 프로모터, t0 터미네이터, pBR322-ori, kan, lacI 및 cer로 이루어진 발현 벡터 pSCIL129를 개략적으로 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명의 추가 설명을 위한 것이다.
실시예 1: 본 발명에 따른 발현 벡터 및 플라스미드의 제조
발현 플라스미드 pSCIL006c 의 제조
발현 벡터 pSCIL006c(도 3)의 제조는 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.
1. t0 터미네이터의 pUC19 내로의 삽입 = pSCIL001
시판 벡터 pUC19(SD0061, MBI Fermentas)를 발현 벡터의 제조를 위한 베이시스(basis)로서 사용하였다. pUC19를 엔도뉴클레아제 HindIII 및 AflIII로 절단하고, 이는 359 bp의 벡터 서열의 결실을 야기하였다. t0 전사 터미네이터를 프라이머 t0-OD-MCS-HindIII(서열 번호 2) 및 t0-UU-MCS-AflIII(서열 번호 3)를 이용하여 파지 람다(SD0011, MBI Fermentas)의 DNA로부터 증폭시켰다. 이후 형성된 단편을 엔도뉴클레아제 HindIII 및 AflIII로 절단하고 정제(Minielute Kit, Qiagen) 후 pUC19 Hin dIII/ Afl III 단편 내로 클로닝하였다. 결과로 생성된 플라스미드 pSCIL101를 제한 분석(restriction analysis) 및 서열분석으로 확인하였다.
2. pSCIL001 중 항생제 내성 카세트의 교체 = pSCIL002
카나마이신 내성 카세트를 프라이머 Km-OD-ApaI(서열 번호 4) 및 Km-UU-NheI(서열 번호 5)로 PCR에 의해 pACYC177(E4151 S, NEB)로부터 증폭시켰다. 단편을 겔 추출 키트(Gel Extraction Kit)(Qiagen)로 정제하고 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 클로닝하였다. 플라스미드 pSCIL101을 프라이머 pUC2541-OD-NheI(서열 번호 6) 및 pUC1496-UU-ApaI(서열 번호 7)을 이용하여 암피실린 내성 카세트 없이 증폭시키고 엔도뉴클레아제 ApaI 및 NheI로 절단하였다. 카나마이신 내성 카세트를 엔도뉴클레아제 ApaI 및 NheI로 pGEMT-T easy로부터 절단하고 pSCIL001(ΔAmp) Apa I/ Nhe I 내로 클로닝하였다. 결과로 생성된 플라스미드 pSCIL002를 제한 분석으로 확인하였다.
3. 카나마이신 내성 카세트 배향의 변경 = pSCIL002b
pSCL 벡터 중 카나마이신 내성 카세트의 배향은 카나마이신 내성 유전자의 배경(background) 발현에서 결정적인 역할을 하며, 따라서 제2 벡터 세대에서 내성 카세트의 배향은 예를 들어 pSCIL008(EP1697523B1)에 비교하여 변경된다. 이를 위해, pSCIL002의 백본이 먼저 프라이머 MunI-Km term(서열 번호 8) 및 ApaI-pSCIL002(서열 번호 9)를 이용하여 카나마이신 내성 카세트 없이 증폭된 후, 뉴클레아제 MunI(MfeI) 및 ApaI로 절단된다. 카나마이신 내성 카세트를 pSCIL002로부터 프라이머 Km 5'-MunI(서열 번호 10) 및 Km 3' ApaI(서열 번호 11)로 증폭시키고 마찬가지로 엔도뉴클레아제 MunI(MfeI) 및 ApaI로 절단하였다. 두 단편 모두를 이후 결찰시켜, 플라스미드 pSCIL002b를 유도하였다. 올바른 통합을 서열분석으로 확인하였다.
4. pSCIL002b 내로의 제2 선택 마커의 삽입 = pSCIL003b
이후 E. 콜라이의 프롤린 합성 경로에 대한 유전자인 proBA를 제2 선택 마커로서 pSCIL002b 내에 통합시켰다. 이를 위해, 먼저 proBA 오페론을 E. 콜라이 K12(DSM 9037, Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH; DNeasy 조직 키트(DNeasy Tissue Kit), Qiagen) 유래 사전 제조된 유전체 DNA로부터 프라이머 proBA-OD-ApaI(서열 번호 12) 및 proBA-UU-ApaI(서열 번호 13)를 이용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 ApaI로 절단하고, 마찬가지로 ApaI로 절단된 벡터 pSCIL002b 내로 클로닝하였다. 결과로 생성된 플라스미드 pSCIL003b를 서열분석으로 확인하였다.
5. pSCIL003b 내로의 리프레서 유전자 lacI의 삽입 = pSCIL004b
고유 프로모터 영역을 포함하는 lacI 유전자를, 프라이머 lacI OD NheI(서열 번호 14) 및 lacI UU NheI(서열 번호 15)를 사용하여 E. 콜라이 균주 K12(DSM 9037, Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH; DNeasy 조직 키트, Qiagen)의 염색체 DNA로부터 증폭시켰다. PCR 생성물을 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 클로닝하고 서열분석으로 확인하였다. 엔도뉴클레아제 NheI로의 제한 후, lacI을 pSCIL003b 내로 결찰시켰다.
6. pSCIL004b 내로의 T7 프로모터의 삽입 = pSCIL006b
lac 오퍼레이터 서열을 포함하는 T7 프로모터를, 프라이머 PrT7-MunI5'(서열 번호 16) 및 PrT7-EcoRI3'(서열 번호 17)를 이용하여 플라스미드 pSCIL006(원래 pTYB2, #6710, NEB 유래)로부터 증폭시켰다. 추가로, 프라이머 PrT7-EcoRI3'를 이용하여 후자의 리보솜 결합 부위(AGGAGA)를 PCR 생성물를 통합시켰다. PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 MunI ( MfeI )로 절단하고, EcoRI로 절단된 벡터 pSCIL004b 내로 클로닝하였다. 결과로 생성된 플라스미드 pSCIL006b를 서열분석으로 확인하였다.
7. pSCIL006b에서 1개 뉴클레오티드의 교체에 의한 복제 원점(복제의 원점)의 변경 = pSCIL006c
pUC19의 후손(descendant)으로서, 발현 플라스미드 pSCIL006b는 30℃에서보다 37℃에서 훨씬 더 큰 카피수를 나타낸다. 이에 대한 원인은 원래의 플라스미드 pBR322의 복제의 원점에서의 점 돌연변이(G→A)이다. 이러한 pSCIL006b에서의 돌연변이를 역전시키기 위해, 퓨전 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(Phusion Site Directed Mutagenesis Kit)(F-541, Finnzymes)를 사용하였다. 이를 위해, 전체 플라스미드를 프라이머 ori_mut_fwd(서열 번호 18) 및 ori_rev(서열 번호 19)로 증폭시킨 후 재결찰시켰다. 카피수가 온도와 관계 없이 약 60 카피/세포인, 결과로 얻어진 플라스미드를 서열분석으로 확인하고 pSCIL006c로 명명하였다(도 3, 서열 번호 20 참조).
발현 벡터 pSCIL122 및 pSCIL123 의 제조
1. cer의 pSCIL006c 내로의 삽입 = pSCIL122 및 pSCIL123
cer 요소를 프라이머 5'cer_NdeI(서열 번호 21) 및 3'cer_NdeI(서열 번호 22)를 이용하여 PCR에 의해 플라스미드 ColE1(퀴아프렙 스핀 미니프렙(QIAprep Spin Miniprep)(Qiagen)을 이용하여 E. 콜라이 JC411(DSM3877)(DSMZ)로부터 단리됨)로부터 증폭시키고 pSCIL006c 중 독특한 NdeI 절단 부위 내로 통합시켰다. 여기서, 2가지 배향(정방향 및 역방향)이 모두 가능하다. 결과로 얻어진 cer을 정배향으로 갖는 플라스미드를 pSCIL122로 명명하고, cer을 역배향으로 갖는 플라스미드를 pSCIL123로 명명하고 서열분석으로 확인하였다(도 4, 서열 번호 23 참조).
발현 벡터 pSCIL124 및 pSCIL125 의 제조
1. kan 의 pSCIL006c에서의 결실 = pSCIL112
카나마이신 내성 카세트의 결실에 대하여, 퓨전 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(F-541, Finnzymes)를 사용하였다. 이를 위해, pSCIL006c의 백본을 프라이머 pSCIL_Nco_P(서열 번호 24) 및 pSCIL_Spe_P(서열 번호 25)로 증폭시키고 재결찰시켰으며, 이는 카나마이신 내성 카세트의 결실을 유도하였다. 결과로 얻어진 플라스미드를 서열분석으로 확인하고 pSCIL112로 명명하였다.
2. pSCIL112 내로의 tetA의 삽입 = pSCIL105
테트라사이클린 내성 카세트를 프라이머 tetA_5'promo_NcoI(서열 번호 26) 및 tetA_3'_SpeI(서열 번호 27)로 pBR322(D1511, Promega)로부터 증폭시켰다. PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 NcoI 및 SpeI로 절단하고, 마찬가지로 NcoI 및 SpeI로 절단된 벡터 pSCIL112 내로 클로닝하였다. 결과로 얻어진 플라스미드가 테트라사이클린 내성 카세트 1개 카피 대신 2개 카피를 갖기 때문에, 1개 카피를 퓨전 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(F-541, Finnzymes)를 이용하여 제거하였다. 이를 위해, 플라스미드를 프라이머 105_fwd_P(서열 번호 28) 및 105_rev_P(서열 번호 29)로 증폭시킨 후 재결찰시켰다. 결과로 얻어진 플라스미드를 서열분석으로 확인하고 pSCIL105로 명명하였다.
3. cer의 pSCIL105 내로의 삽입 = pSCIL124 및 pSCIL125
cer 요소를 프라이머 5'cer_NdeI(서열 번호 21) 및 3'cer_NdeI(서열 번호 22)를 이용하여 PCR에 의해 플라스미드 ColE1(퀴아프렙 스핀 미니프렙(Qiagen)을 이용하여 E. 콜라이 JC411(DSM3877)(DSMZ)로부터 단리됨)로부터 증폭시키고 pSCIL105 중 독특한 NdeI 절단 부위 내로 통합시켰다. 여기서, 2가지 배향(정방향 및 역방향)이 모두 가능하다. 결과로 얻어진 cer을 정배향으로 갖는 플라스미드를 pSCIL124로 명명하고, cer을 역배향으로 갖는 플라스미드를 pSCIL125로 명명하고 서열분석으로 확인하였다(도 5, 서열 번호 30 참조).
발현 벡터 pSCIL129 의 제조
1. pSCIL123에서 proBA의 결실 = pSCIL129
발현 벡터의 플라스미드 크기를 감소시키기 위해, 다시 proBA 카세트를 제거하였다. 이를 위해, 퓨전 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(F-541, Finnzymes)를 사용하였다. 플라스미드 pSCIL123을 후속 재결찰 후 proBA 오페론이 결실되도록 프라이머 pSCIL-proBA_rev-P(서열 번호 31) 및 pSCIL-proBA_fwd-P(서열 번호 32)를 이용하여 증폭된다. 결과로 얻어진 발현 벡터를 pSCIL129로 명명하고 및 서열분석으로 확인하였다(도 6, 서열 번호 33 참조).
실시예 2: 본 발명에 따른 발현 시스템의 제조
E. 콜라이 균주 BL21(Stratagene), HMS174(DSM5932) 및 C600'(DSM426)을 Stratagene사 또는 DSMZ(Deutsche Stammsammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH, 독일 브라운슈바이히 소재)사로부터 입수하였다. 균주 BL21, HMS174 및 C600'을 각각 플라스미드 pKD46(CGSC, E. coli Genetic Stock Center, 미국 뉴 헤이븐 예일 대학교(Yale University) 소재)으로 형질전환하고, 이는 람다 파지의 Red 재조합효소를 코딩한다. 이로써, E. 콜라이 게놈 내로의 T7 작제물의 표적 통합이 가능했다. 결과로 얻어진 균주 BL21 pKD46, HMS174 pKD46 및 C600' pKD46로부터, 다시 적격 세포(competent cell)를 제조하였다. pKD46의 선택은 한천 평판 상의 암피실린 또는 액체 배양에서의 카르베니실린으로 수행하였다.
lacI, lacUV5 프로모터, lacZ의 5' 영역, T7 프로모터 및 T7 파지의 유전자 1(T7 중합효소) 및 2개의 FRT 부위에 의해 플랭크된 카나마이신 내성 유전자 kan으로 이루어진 도 2에 나타낸 DNA 작제물을 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 성분들을 개별적으로 증폭시키고 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 함께 클로닝하였다. T7 RNA 중합효소에 대한 유전자(유전자 1)를 T7 파지(310005, Bioron GmbH)의 DNA로부터 프라이머 T7　5'_BamHI_Xho(서열 번호 34) 및 T7 3'_Hind(서열 번호 35)를 이용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제(Qiaquick PCR Purification)(Qiagen)로 정제하고 오버행(overhanging) 아데닌 잔기를 이용하여 벡터 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 클로닝하였다. 형성된 플라스미드 pGEM::T7을 서열분석으로 확인하였다. lacI 유전자를, 프라이머 lacI　5'_BamHI_coli(서열 번호 36) 및 lacI 3'_UV5_Xho(서열 번호 37)를 사용하여 E. 콜라이 균주 K12(DSM 9037, Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH; DNeasy 조직 키트, Qiagen)의 유전체 DNA로부터 증폭시켰다. 또한, lacUV5 프로모터의 서열을 프라이머 lacI 3'_UV5_Xho(서열 번호 37)의 도움으로 PCR 생성물 내로 통합시켰다. PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제(Qiagen)로 정제하고 오버행 아데닌 잔기를 이용하여 벡터 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 클로닝하였다. 형성된 플라스미드 pGEM::lacI-lacUV5를 서열분석으로 확인한 후 엔도뉴클레아제 BamHI 및 XhoI로 절단하였다. 형성된 단편을 퀴아퀵 겔 추출 키트(Qiagen)로 정제하고 마찬가지로 절단 및 정제된 플라스미드 pGEM::T7 내로 클로닝하였다. 형성된 플라스미드 pGEM::lacI-lacUV5-T7을 서열분석으로 확인하였다. FRT 부위에 의해 플랭크된 카나마이신 내성 유전자를 플라스미드 pKD4(CGSC, E. coli Genetic Stock Center, 미국 뉴 헤이븐 예일 대학교 소재)로부터 프라이머 Hind_pKD4 5'(서열 번호 38) 및 pKD4 3'_Hind_coli(서열 번호 39)로 증폭시켰다. PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 HindIII로 절단하고, 마찬가지로 HindIII로 절단된 플라스미드 pGEM::lacI-lacUV5-T7 내로 클로닝하였다. 최종 플라스미드 pGEM-T easy::lacI-lacUV5-T7-kan-FRT를 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 HindIII를 이용한 제한효소 처리로 확인하였다.
DE3와 유사한 T7 뉴클레오티드 작제물을 제조하기 위해, 먼저 lacI, lacUV5 프로모터, lacZ의 5' 영역 및 T7 파지의 유전자 1의 첫 2574 bp(내부 MfeI 절단 부위까지)로 이루어진 영역을 프라이머 T7_neu_BamHI_for01(서열 번호 40) 및 T7_neu_MfeI_rev02(서열 번호 41)를 이용하여 BL21(DE3)[Novagen 69387-3]로부터 사전 단리된 유전체 DNA(유전체 DNA 정제 키트, Fermentas)로부터 증폭시켰다. 정제(Wizard® SV Gel 및 PCR, Promega) 후, 상기 PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 BamHI 및 MfeI로 절단하고 정제(Wizard® SV Gel 및 PCR, Promega) 후 플라스미드 pGEM-T easy::lacI-lacUV5-T7-kan-FRT Bam HI / Mfe I의 4647 bp 단편 내로 클로닝하였다. TOP10F'(Life Technologies) 내로의 형질전환 및 100 ㎍/ml 암피실린을 이용한 LB 플레이트상에서의 선택 후, 결과로 얻어진 플라스미드 pGEM-T easy::lacI-lacUV5_lacZ_T7-kan(서열 번호 42)를 제조하였다.
이후, 전체 작제물을 엔도뉴클레아제 EcoRI를 이용하여 플라스미드 pGEM-T easy::lacI-lacUV5_lacZ_T7-kan(서열 번호 42)로부터 절단해내었다. 이로써 형성된 6026　bp 단편을 Wizard® SV Gel 및 PCR-키트(Promega)를 이용하여 정제하였다. 균주 BL21 pKD46, HMS174 pKD46 및 C600' pKD46를 이후 이 DNA 단편으로 형질전환시키고 E. 콜라이 게놈 내로의 통합을 가능하게 하기 위해 실온에서 밤새 항온처리하였다.
proBA 오페론의 플랭킹 영역과 매칭되는 DNA 작제물의 플랭킹 영역(서열 번호 43: rec 부위 1 및 서열 번호 44: rec 부위 2)의 선택의 결과로서, proBA 오페론은 통합 중에 동시에 결실되었다. 도 2에 나타낸 T7 RNA 중합효소 작제물에 대한 선택은 배지 내 카나마이신을 이용하여 수행하였다. 헬퍼 플라스미드 pKD46의 소실은 암피실린 함유 또는 카르베니실린 함유 배지 상에서의 생장 능력의 소실을 통해 검출하였다.
적격 세포는 결과로 얻어진 균주 BL21 ΔproBA-T7lacZ::kan, HMS174 ΔproBA-T7lacZ::kan 및 C600'ΔproBA-T7lacZ::kan로부터 제조되고 헬퍼 플라스미드 pCP20(CGSC, E. coli Genetic Stock Center, 미국 뉴 헤이븐 예일 대학교 소재)로 형질전환되었다. 이 단계는, pCP20 상에 코딩된 FLP 재조합효소에 의해, 제1 단계에서 또한 게놈 내로 통합된 카나마이신 내성의 결실에 관해 작용한다. pCP20를 이용한 균주의 선택은 암피실린 함유 플레이트 상에서 수행하였다. 밤새 43℃에서 세포를 항온처리함으로써, 헬퍼 플라스미드 pCP20이 소실되었다. 결과로 얻어진 균주 BL21 ΔproBA-T7lacZ, HMS174 ΔproBA-T7lacZ 및 C600'ΔproBA-T7lacZ는 임의 항생제 내성을 갖지 않으며 게놈 내에 proBA 오페론 대신 도 1에 나타낸 T7 작제물을 포함하였다. 상기 방법으로부터의 “상흔(scar)”으로서 게놈 내에 남아 있는 1개의 FRT 부위는, FLP 재조합효소에 의해 카나마이신 내성 카세트의 결실을 통해 발생하였다. 균주를 서던 혼성화(Southern hybridization)로 검증하였다. 이 과정에서, T7 RNA 중합효소에 대한 코딩 서열의 통합 및 proBA의 결실을 검출하였다.
실시예 1 유래의 발현 플라스미드를 균주 BL21 ΔproBA-T7lacZ 내로 전기천공으로 도입하고 이로써 HMS174 ΔproBA-T7lacZ를 얻었다.
실시예 3: 본 발명에 따른 T7 발현 시스템 및 선행 기술에 따른 T7 발현 시스템의 플라스미드 안정성의 비교
BL21(DE3)(선행 기술로부터의 균주) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따른 균주)에서 선행 기술에 따른 T7 발현 플라스미드 및 본 발명에 따른 T7 발현 플라스미드의 안정성을 연구하기 위해, 진탕 플라스크 및 유가식(fed batch) 발효에서 실험을 수행하였다. 이를 위해, 유전자 합성(Geneart, 독일 레겐스부르크)으로부터 유래한 인간 생장 인자 proNGF에 대한 유전자를 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 PstI를 이용하여 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 진탕 플라스크에서의 플라스미드 안정성의 연구를 위해, 하기와 같은 절차를 이용하였다. 먼저, 연구하고자 하는 발현 균주들의 전배양물(preculture), 표준 발현 플라스미드 pSCIL006cΔproBA::proNGF를 갖는 BL21(DE3)(선행 기술), 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21(DE3)(본 발명에 따른 발현 플라스미드), 표준 발현 플라스미드 pSCIL006cΔproBA::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ(플라스미드 안정화 시스템이 없는 발현 플라스미드를 갖는 본 발명에 따른 발현 균주) 및 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따른 발현 시스템)을 50　㎍/ml 카나마이신을 갖는 복합 배지[34.5 g/l 효모 추출물(Merck 1.03753.0500), 2.475　mM MgSO4, 9.347 mM NH4Cl, 62 mM K2HPO4, 15 g/l 글루코스]에서 진탕하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침, 광학 밀도 OD600 = 0.2-0.3로 본 배양물(main culture)을 접종할 필요가 있는 세포를, 6500 rpm(5 분)에서 원심분리하여 무균 채취하였다. 이로써 접종된 본 배양물(100 ml 에를렌마이어 플라스크 중 20 ml 무항생제 복합 배지)을 OD600 = 0.8이 달성되기까지 210 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 항온처리하였다. 이때, 표적 유전자 발현을 1　mM IPTG 첨가에 의해 유도하였다. 유도 물질 첨가 후 3시간(3 h pi(유도 후(post induction)) 및 24 h(24 h pi)에, 배양물의 무균 희석물을 제조하고 LB 배지[5 g/l 효모 추출물(Merck 1.03753.0500), 10　g/l 소야 펩톤(Merck 1.07212.0500), 85.56　mM NaCl] 상에 플레이팅하였다. 이러한 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 각 경우 생장한 콜로니로부터 100개의 콜로니를 LB 및 LB + 50 ㎍/ml 카나마이신 상에 평행하게 이식하였다(prick out). 따라서 예를 들어 10%의 플라스미드 안정성은 LB 상에서 생장한 콜로니의 10%만이 또한 LB + 카나마이신 상에서 생장한다는 것을 의미한다. LB + 카나마이신에서만 생장할 수 있는 콜로니는 여전히 발현 플라스미드를 보유하였다. LB에서만 생장할 수 있는 콜로니는 발현 플라스미드를 상실하였다. 각 경우, 플라스미드 안정성에 대한 결론을 도출하기 위해 4회의 독립적인 실험을 수행하였다. 결과는 평균값 및 표준 편차로서 하기 표 1에 나타내었다.
진탕 플라스크에서의 BL21(DE3)(선행 기술에 따른 균주) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따른 균주) 중 선행 기술에 따른 표준 발현 플라스미드(pSCIL006cΔproBA::proNGF) 및 본 발명에 따른 발현 플라스미드(pSCIL129::proNGF)의 플라스미드 안정성
시간 BL21(DE3) BL21 ΔproBA-T7lacZ
pSCIL006cΔproBA::proNGF pSCIL129::proNGF pSCIL006cΔproBA::proNGF pSCIL129::proNGF
3 h pi 86% ± 4 100% 90% ± 7 100%
24 h pi 5% ± 6 88% ± 6 84% ± 18 99% ± 1
선행 기술에 따른 발현 시스템이 유도 후 3 h 86% 및 유도 후 24 h 5%뿐인 매우 낮은 플라스미드 안정성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 cer을 이용한 발현 플라스미드의 안정화를 통해, 유도 후 3 h 100% 및 유도 후 24 h 88%로의 플라스미드 안정성 증가가 BL21(DE3)에서 가능하였다. 유도 후 24 h 약 100%로의 플라스미드 안정성 증가는, 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ로 이루어진 본 발명에 따른 T7 발현 시스템의 사용을 통해서만 달성될 수 있었다. 그러나 놀랍게도, BL21 ΔproBA-T7lacZ 중의 표준 발현 플라스미드는 또한 유도 후 3 h 90% 및 유도 후 24 h 84%의 높은 플라스미드 안정성을 나타낸 반면, 동시에 BL21(DE3) 중 동일한 플라스미드는 이미 실질적으로 상실되었다(5% 24 h pi). 이러한 실험에서의 표적 유전자로서, 인간 생장 인자 proNGF가 발현된다. proNGF의 발현을 SDS-PAGE로 확인하였다.
이와 별도로, 본 발명에 따른 발현 시스템을 유가식 발효에서의 선행 기술과 비교하였다. 먼저, 연구하고자 하는 발현 균주들의 전배양물, 표준 발현 플라스미드 pSCIL006cΔproBA::proNGF를 갖는 BL21(DE3)(선행 기술), 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21(DE3)(본 발명에 따른 발현 플라스미드), 표준 발현 플라스미드 pSCIL006cΔproBA::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ(플라스미드 안정화 시스템이 없는 발현 플라스미드를 갖는 본 발명에 따른 발현 균주) 및 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따른 발현 시스템)을 50　㎍/ml 카나마이신을 갖는 복합 배지[34.5 g/l 효모 추출물(Merck 1.03753.0500), 2.475　mM MgSO4, 9.347 mM NH4Cl, 62 mM K2HPO4, 15 g/l 글루코스]에서 진탕하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 발효를 위해, 각 경우 2 l 무항생제 복합 배지[50 g/l 효모 추출물(Biospringer 0206), 2.475　mM MgSO4, 9.347 mM NH4Cl, 62 mM K2HPO4, 10　g/l 글루코스, 0.2 ml/l 안티폼 신페로닉(antifoam Synperonic)(Croda ETK0879)]를 5　l 실험실용 발효기에 위치시키고 0.06의 출발 OD600(600 nm에서의 광학 밀도)가 도달되도록 발현 균주의 전배양물로 접종하였다. 6.5　h 후, 글루코스가 소모된 후, 기질을 첨가함으로써 유가식 상(fed batch phase)을 시작하였다. 기질 공급물 흐름은 여기서 공급물 흐름(feedflow) = const*exp(μ₁*t) 형태의 지수 함수에 따라 일어난다. 여기서 μ는 μ₁ = const < μmax가 적용되는 비생장속도이며, 즉 일시적으로 가능한 글루코스 농도는 항상 미생물의 최대 일시적 요구량보다 낮으며, 이의 결과로서 준최대 생장속도가 달성되고 글루코스의 축적이 방지된다. 예를 들어, 값 μ₁ = 0.25 h-1을 설정하였다. 정의된 광학 밀도, 예를 들어 OD600 = 50 ± 5에서, 단백질 발현은 예를 들어 1　mM의 IPTG의 첨가에 의해 유도되었다. 이때, 기질 공급물 흐름은 6 h에 걸쳐 선형적으로 70%를 감소된 후 일정하게 유지되었다. 공정은 정의된 유도 기간, 예를 들어 24 h 후에 정지되었다.
OD600 = 50 ± 5 달성시, 표적 유전자 발현을 1 mM IPTG 첨가에 의해 유도하였다. 이때 및 유도 후 6　h, 8 h 및 24 h에, 플라스미드 안정성을 상기 기술된 바와 같이 분석하고 인간 생장 인자 proNGF의 발현을 확인하였다. 데이터는 하기 표 2에 제시되어 있다.
유가식 발효에서 BL21(DE3) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ에서의 표준 발현 플라스미드(pSCIL006cΔproBA::proNGF) 및 본 발명에 따른 발현 플라스미드(pSCIL129::proNGF)의 플라스미드 안정성
시간 BL21(DE3) BL21 ΔproBA-T7lacZ
pSCIL006c
ΔproBA::proNGF		 pSCIL129::proNGF pSCIL006c
ΔproBA::proNGF		 pSCIL129::proNGF
유도 OD600 51.6 52.2 46.1 47.2
PS 100% 100% 100% 100%
6 h pi OD600 97.4 101.2 99.0 106.9
PS 11% 100% 94% 100%
8 h pi OD600 97.4 103.6 101.6 108.9
PS 13% 100% 89% 100%
24 h pi OD600 106.6 98.8 113.6 122.9
PS 2% 100% 95% 100%
(PS: 플라스미드 안정성)
유가식 발효에서, 선행 기술에 따른 발현 시스템은 유도 후 6 h 발현 플라스미드의 89%를 이미 상실하였고(PS 11%), 반면 본 발명에 따른 발현 시스템은 심지어 유도 후 24 h 100%의 플라스미드 안정성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 여기서 플라스미드 안정화 시스템 cer(pSCIL129::proNGF)을 갖는 본 발명에 따른 발현 플라스미드 및 또한 본 발명에 따른 발현 균주 BL21 ΔproBA-T7lacZ 둘 모두는 선행 기술에 따른 발현 시스템에 비해 명백한 이점을 갖는데, 이는 여기서 각각 100% 및 95%인 유도 후 24 h의 플라스미드 안정성이 2%인 선행 기술에 따른 발현 시스템에서보다 현저히 높기 때문이다.
BL21(DE3) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ에서 본 발명에 따른 T7 발현 플라스미드의 안정성을 추가 연구하기 위해, 진탕 플라스크에서 추가 실험을 수행하였다. 이를 위해, 유전자 합성(Geneart, 독일 레겐스부르크)으로부터 유래한 인간 프리트롬빈(prethrombin)에 대한 유전자를 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 PstI를 이용하여 발현 벡터 pSCIL006c(통상 발현 플라스미드) 및 pSCIL123(안정한 발현 플라스미드) 내로 클로닝하였다. 진탕 플라스크에서의 플라스미드 안정성의 연구를 위해, 상기 기술된 것과 같은 절차를 이용하였다. 결과는 하기 표 3에 나타나 있다.
BL21(DE3) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ에서 표준 발현 플라스미드(pSCIL006c::프리트롬빈) 및 본 발명에 따른 발현 플라스미드(pSCIL123::프리트롬빈)의 플라스미드 안정성
시간 BL21(DE3) BL21 ΔproBA-T7lacZ
pSCIL006c::프리트롬빈 pSCIL123::프리트롬빈 pSCIL006c::프리트롬빈 pSCIL123::프리트롬빈
3 h pi 5% ± 5 100% 6% ± 3 100%
24 h pi 1% ± 0 41% ± 1 1% ± 2 78% ± 5
선행 기술에 따른 발현 시스템이 극히 낮은 플라스미드 안정성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이미 유도 후 3 h째에, 5% 플라스미드 보유 균주만이 여전히 존재했으며, 24 h 후 거의 모든 세포는 플라스미드가 없었다.
발현 플라스미드 pSCIL123::프리트롬빈의 사용을 통해, 유도 후 3 h 100%의 플라스미드 안정성이 발현 균주 BL21(DE3) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ 둘 모두에서 달성될 수 있었다. 유도 후 24 h째에, 78%인 본 발명에 따른 발현 시스템(pSCIL123::프리트롬빈을 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ)의 플라스미드 안정성은, 41%인 선행 기술에 따른 발현 균주(BL21(DE3) pSCIL123::프리트롬빈)에서보다 약 2배 높았다. 인간 프리트롬빈의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다.
[발명의 효과]
본 발명의 발현 시스템은 종래 기술에 비해 플라스미드 안정성이 높으며, 파지 DNA를 포함하지 않아 의약용 단백질의 발현을 위한 시스템에 적합하고, 항생제 내성 유전자를 포함하지 않으므로 치료 단백질 제조에 적합하며 현저히 보다 경제적인 공정을 구축할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Wacker Chemie AG <120> T7 expression system, method for its production and use thereof for antibiotic-free production of recombinant proteins <130> Wa11363F <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chromosomal T7 RNA polymerase construct <400> 1 acagtcctgc taaaacgttc gtttgatatc atttttcctg acaccatcga atggcgcaaa 60 acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg 120 aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc 180 cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg 240 atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg 300 ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg 360 gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga 420 agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg 480 ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact 540 aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc 600 tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa 660 atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg 720 cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt 780 gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg 840 atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg 900 ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt 960 tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg 1020 gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc 1080 tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 1140 ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 1200 gcgcaacgca attaatgtaa gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 1260 gcttccggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 1320 ctatgaccat gattacggat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 1380 ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc 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tatccgtgac cttgaagcta 2280 agcacttcaa gaaaaacgtt gaggaacaac tcaacaagcg cgtagggcac gtctacaaga 2340 aagcatttat gcaagttgtc gaggctgaca tgctctctaa gggtctactc ggtggcgagg 2400 cgtggtcttc gtggcataag gaagactcta ttcatgtagg agtacgctgc atcgagatgc 2460 tcattgagtc aaccggaatg gttagcttac accgccaaaa tgctggcgta gtaggtcaag 2520 actctgagac tatcgaactc gcacctgaat acgctgaggc tatcgcaacc cgtgcaggtg 2580 cgctggctgg catctctccg atgttccaac cttgcgtagt tcctcctaag ccgtggactg 2640 gcattactgg tggtggctat tgggctaacg gtcgtcgtcc tctggcgctg gtgcgtactc 2700 acagtaagaa agcactgatg cgctacgaag acgtttacat gcctgaggtg tacaaagcga 2760 ttaacattgc gcaaaacacc gcatggaaaa tcaacaagaa agtcctagcg gtcgccaacg 2820 taatcaccaa gtggaagcat tgtccggtcg aggacatccc tgcgattgag cgtgaagaac 2880 tcccgatgaa accggaagac atcgacatga atcctgaggc tctcaccgcg tggaaacgtg 2940 ctgccgctgc tgtgtaccgc aaggacaagg ctcgcaagtc tcgccgtatc agccttgagt 3000 tcatgcttga gcaagccaat aagtttgcta accataaggc catctggttc ccttacaaca 3060 tggactggcg cggtcgtgtt tacgctgtgt caatgttcaa 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gaagactgga gagattcttc 3960 gcaagcgttg cgctgtgcat tgggtaactc ctgatggttt ccctgtgtgg caggaataca 4020 agaagcctat tcagacgcgc ttgaacctga tgttcctcgg tcagttccgc ttacagccta 4080 ccattaacac caacaaagat agcgagattg atgcacacaa acaggagtct ggtatcgctc 4140 ctaactttgt acacagccaa gacggtagcc accttcgtaa gactgtagtg tgggcacacg 4200 agaagtacgg aatcgaatct tttgcactga ttcacgactc cttcggtacc attccggctg 4260 acgctgcgaa cctgttcaaa gcagtgcgcg aaactatggt tgacacatat gagtcttgtg 4320 atgtactggc tgatttctac gaccagttcg ctgaccagtt gcacgagtct caattggaca 4380 aaatgccagc acttccggct aaaggtaact tgaacctccg tgacatctta gagtcggact 4440 tcgcgttcgc gtaaaagctt gcgattgtgt aggctggagc tgcttcgaag ttcctatact 4500 ttctagagaa taggaacttc ggaataggaa cttcaagatc ccctcacgct gccgcaagca 4560 ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg 4620 gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc 4680 aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct tacatggcga tagctagact gggcggtttt 4740 atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc 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gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 360 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 420 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 480 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 540 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 600 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 660 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 720 tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 780 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 840 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 900 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg tgggccgggc 960 ccgcaaccga cgacagtcct gctaaaacgt tcgtttgata tcatttttcc taaaattgaa 1020 tggcagagaa tcatgagtga cagccagacg ctggtggtaa aactcggcac cagtgtgcta 1080 acaggcggat cgcgccgtct gaaccgtgcc catatcgttg aacttgttcg ccagtgcgcg 1140 cagttacatg 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cgttgatgaa agtgtagaga tcgctgaagc attaaaagtg atcgtcaacg 2880 cgaaaactca gcgtccgagc acatgtaata cggttgaaac gttgctggtg aataaaaaca 2940 tcgccgatag cttcctgccc gcattaagca aacaaatggc ggaaagcggc gtgacattac 3000 acgcagatgc agctgcactg gcgcagttgc aggcaggccc tgcgaaggtg gttgctgtta 3060 aagccgaaga gtatgacgat gagtttctgt cattagattt gaacgtcaaa atcgtcagcg 3120 atcttgacga tgccatcgcc catattcgtg aacacggcac acaacactcc gatgcgatcc 3180 tgacccgcga tatgcgcaac gcccagcgtt ttgttaacga agtggattcg tccgctgttt 3240 acgttaacgc ctctacgcgt tttaccgacg gcggccagtt tggtctgggt gcggaagtgg 3300 cggtaagcac acaaaaactc cacgcgcgtg gcccaatggg gctggaagca ctgaccactt 3360 acaagtggat cggcattggt gattacacca ttcgtgcgta aataaaaccg ggtgatgcaa 3420 aagtagccat ttgattcaca aggccattga cgcatcgccc ggttagtttt aaccttgtcc 3480 accggggccc gatatcgccg tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc 3540 aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca 3600 tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact 3660 caccgaggca 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agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca 5220 ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct 5280 tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac 5340 tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc 5400 gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt 5460 gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt 5520 catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg 5580 tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 5640 cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc 5700 gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc 5760 gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc 5820 tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc cagcttcaaa 5880 agcgctctga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg aactaaggag 5940 gatattcata tggaccatgg gattcacaag gccattgacg catcgcccgg ttagttttaa 6000 agctttttat cactagtgaa ttcgcggccg cctgcaggtc gaccatatgg gagagctccc 6060 aacgcgttgg atgcatagct tgagtattct atagtgtcac ctaaatagct tggcgtaatc 6120 atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 6180 agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 6240 tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 6300 aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 6360 cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 6420 ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 6480 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 6540 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 6600 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 6660 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 6720 tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 6780 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 6840 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6900 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6960 tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 7020 tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 7080 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 7140 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 7200 aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 7260 atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 7320 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 7380 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 7440 ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 7500 tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 7560 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 7620 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 7680 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 7740 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 7800 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 7860 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 7920 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 7980 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 8040 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 8100 cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 8160 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 8220 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgatgc 8280 ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggaaa ttgtaagcgt 8340 taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata 8400 ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt 8460 tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg 8520 aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact 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Claims (10)

  1. T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포, 및 T7 프로모터의 제어 하에 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 발현 시스템으로서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 안정화 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 플라스미드 안정화 시스템은 멀티머 분해 시스템(multimer resolution system, mrs), 분할 시스템(partitioning system, par) 및 분리 후 살해 시스템(postsegregational killing system, PSK)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 발현 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 원핵 세포는 게놈 내에 T7 RNA 중합효소 유전자를 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주의 세포인 것을 특징으로 하는 것인 발현 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 1을 갖는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 것인 발현 시스템.
  5. 하기 구성요소:
    복제 원점(ori),
    조절 서열로서의 T7 프로모터,
    발현시키고자 하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열,
    클로닝에 대한 선택 마커로서의 항생제 내성 유전자,
    터미네이터,
    리프레서 유전자,
    리프레서 유전자에 적합한 오퍼레이터 서열, 및
    플라스미드 안정화 시스템
    을 기능적 결합으로 포함하는 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 플라스미드 안정화 시스템은 cer 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 발현 벡터.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 T7 발현 시스템에 대한 원핵 세포의 제조 방법으로서, T7 RNA 중합효소가 “부위 특이적” 재조합에 의해 T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 원핵 세포의 게놈 내로 특이적으로 통합되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 유도성 프로모터의 제어 하의 T7 RNA 중합효소의 표적 통합은 E. 콜라이의 proBA 서열 내로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 제조 방법.
  9. 게놈 내로 통합된, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는, 제7항 또는 제8항의 방법에 의해 제조된 원핵 세포로서, 람다 파지 DNA를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 원핵 세포.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서, 제5항 또는 제6항의 발현 벡터를, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포 내로 도입하고, 상기 세포를 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 재조합 단백질의 발현 및 T7 RNA 중합효소의 발현에 적합한 무항생제 조건 하에 발효시키고, 이로써 재조합 폴리펩티드를 발현시키고 재조합 폴리펩티드를 단리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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