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KR20170009812A - 대상체의 망막 색소 상피에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 방법 및 약학적 조성물 - Google Patents

대상체의 망막 색소 상피에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 방법 및 약학적 조성물 Download PDF

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KR20170009812A
KR20170009812A KR1020167018183A KR20167018183A KR20170009812A KR 20170009812 A KR20170009812 A KR 20170009812A KR 1020167018183 A KR1020167018183 A KR 1020167018183A KR 20167018183 A KR20167018183 A KR 20167018183A KR 20170009812 A KR20170009812 A KR 20170009812A
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vector
interest
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KR1020167018183A
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크리스티앙 아멜
바실리키 칼라치스
마리 페끼노
니꼴라 세레소
Original Assignee
인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
유니베르시테 드 몽펠리에
상트르 하스피탈리에 레지오날 유니베르시테르 드 몽쁠리에
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Publication date
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Abstract

본 발명은 대상체의 망막 색소 상피에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 방법 및 약학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상체의 눈의 망막 색소 상피에서 목적 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 발현시키기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 목적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 rAAV2/5 벡터 일정량을 상기 망막 색소 상피에 형질도입하는 단계를 포함한다.

Description

대상체의 망막 색소 상피에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 방법 및 약학적 조성물 {METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR EXPRESSING A POLYNUCLEOTIDE OF INTEREST IN THE RETINAL PIGMENT EPITHELIUM OF A SUBJECT}
본 발명은 대상체의 망막 색소 상피에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 방법 및 약학적 조성물에 관한 것이다.
유전되는 망막 이영양증 (IRDs)은 유전적으로 및 임상적으로 이형인 큰 그룹의 질병이다. 법적맹 (legal blindness)에 이르게되는 연령은 가변적이나 이들은 점진적인 시력 상실로 특징지워진다. 개별적으로는 드물지만, 집합적으로 IRDs는 대략 세계의 2000명 중 1명에게 영향을 미친다 (Berger et al, 2010). IRD의 가장 일반적인 형태는 색소 망막병증 (pigmentary retinopathies) 그룹으로서, 이들은 망막의 광수용체 세포 (photoreceptor cells)의 변성 및 기저부상 색소 침착의 존재로 특징지워진다. 좋은 예는 범맥락막위축 (choroideremia, CMH)이다. CHM은 IRDs의 2%로 나타나는 X-연관 색소 망막병증이다 (Bocquet et al, 2013). 이는 아동기에 야맹증으로 특징지워진 후 40 내지 50세에 이르러 맹증을 결과하는 점진적인 시야의 손실이 뒤따르는 것으로 특징지워진다. CHM은 망막 바로 뒤에 위치하는 맥락막의 맥락막모세혈관층의 위축 및 색소 침착을 포함하는 특징적인 표현형을 갖는다. 하나의 원인 유전자, CHM가 있는데, 이는 REP1, Rab 에스코트 단백질-1 (Seabra et al, 1992) Rab GTPase의 정확한 프레닐화를 가능하게 하고 이어서 그 막 표적으로의 전달을 가능하게 하는 산재 (ubiquitous) 샤페론 단백질을 인코딩한다. 일반적으로 망막은 유전자 치료에 매우 적합한데, 그 이유는 (i) 비침습적 경로를 통하여 접근이 가능하고 ii) 적은 벡터량의 이용이 가능하도록 작고 닫혀있으며, iii) 망막 색소 상피 (RPE)의 밀착 연접 (tight junction) 및 망막 순환의 비(非)-유창 모세혈관 (non-fenestrated capillaries)으로 이루어지는 혈액-망막 배리어의 존재가 순환 혈액으로의 누수를 막고 면역-특권 (immuno-privileged)이도록 하기 때문이다 (Colella et al, 2009). 이러한 긍정적인 요인들이 2008년 망막의 유전자 치료에 대한 최초의 임상 실험을 이끌었고 (Bainbridge et al, 2008; Maguire et al, 2008) 이는 급속히 다른 실험들로 이어졌다 (Bennett et al, 2012; Hauswirth et al, 2008; Jacobson et al, 2012; Maguire et al, 2009). 표적 IRD, 레베르 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis, LCA)는 시각 회로의 핵심 효소를 인코딩하는 RPE-특이적 유전자, RPE65의 돌연변이로 인하여 발생한다 (Marlhens et al, 1997). RPE65는 재조합 아데노-관련 바이러스 혈청형 2 벡터 (AAV2/2)를 이용하여 RPE로 성공적으로 운반된다. 긍정적인 결과는 유전자 이동이 시각적으로 손상된 대상체의 시야를 개선시키고, 연구자들을, 특히 RPE의 목적 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 가장 효율적인 벡터의 동정하도록 촉발할 수 있는 이론상 증거를 제공하였다.
발명의 요약
본 발명은 대상체의 망막 색소 상피에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 방법 및 약학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 청구항에 의하여 규정된다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 발명자들은 CHM -/y 환자의 REP1-결손 섬유아세포를, 망막 색소 상피 (RPE)로 분화하는 유도 만능 줄기세포 (iPSc)로 리프로그래밍하였다. 본 발명의 발명자들은 이러한 iPSc-유도 RPE가 고전적인 형태를 갖는 분극된 단일막이고, 특징적인 마커들을 발현하며, 유체 수송 및 식균작용 기능이 있고, 환자의 생화학적 표현형을 모방한다고 입증하였다. 그 후, 본 발명의 발명자들은 일련의 AAV 벡터 혈청형을 분석하고 최초로 AAV2/5가 인간의 RPE에 가장 효율적이며 (>60% 형질도입) CHM 유전자 이동이 생화학적 표현형을 표준화할 수 있다는 것을 보여주었다. 시험관내 (in vitro) 형질도입 효율이 높고 타의 추종을 불허하는 것은 식균작용에 의하여 도움을 받는 것 같고, AAV 벡터가 생체내 (in vivo) 망막 하부 공간에서 접하게 되는 시나리오를 모방한다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 인간의 대조군 및 CHM RPE에서 AAV2/5의 우수성을 입증한다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은, 그를 필요로 하는 대상체의 눈의 망막 색소 상피에서 목적 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 발현시키는 방법으로서, 상기 목적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 rAAV2/5 일정량을 상기 망막 색소 상피에 형질도입하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "그를 필요로 하는 대상체"는 인간인 것으로 의도된다. 통상, 상기 대상체는 망막 색소 상피에 영향을 미치는 망막 질환에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있다. 따라서, 매우 다양한 망막 질환이 본 발명에서 제공되는 교시를 받아 치료될 수 있고, 통상 유전적 또는 비유전적 망막 변성, 망막 이영양증, 색소성 망막염, 황반 변성, 레버 선천적 흑암시, 콘-로드 이영양증, 눈의 신생혈관 질환, 맥락막 변성, 맥락막 경화증, 당뇨성 망막변성, 증식성 유리체 망막병증, 범맥락막 위축, 녹내장 및 대사 장애, 예컨대 슬라이 증후군 (베타-글루코로니다아제 유전자의 결손에 기인한, MPS VII) 및 망막 위축 (gyrate atrophy)(오르니틴-델타-아미노트랜스퍼라아제 유전자, OAT의 결손에 기인함), 망막 박리 또는 외상 및 망막 병증 (유전성, 수술에 의하여 유도, 외상, 독성 화합물 또는 제제, 또는 광유도에 의한 것 등 어떤 것이든)을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은, RPE 세포에서 발현시 망막 질환에 유익한 효과를 갖는 목적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV2/5 벡터를 대상체의 눈에 전달함으로써, 그를 필요로 하는 상기 대상체의 상기 망막 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 표현 "목적 폴리뉴클레오티드"는, 그 발현이 표적 세포에서 여하간의 이유로 필요로 되는, 임의의 폴리펩타이드, 구조 단백질, 유전자 등을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드를 말한다. 이는 또한, 비코딩 서열, 예컨대 안티센스 서열 또는 유전자의 발현 감소 목적의 간섭 RNA 서열을 말할 수 있다. 이 기술 분야의 숙력자는, 그 분야의 과학 문헌 지식에 의하여, 어떤 것이 특정 망막 질환을 치룔하는데 더욱 적합할 수 있는 폴리뉴클레오티드인지를 알 것이다.
본 발명의 rAAV2/5 벡터를 이용한 눈의 유전자 치료는, RPE 세포에 그 세포에서 결손인 목적 폴리뉴클레오티드의 기능적 카피 (예컨대, 유전자)를 도입하거나 (유전자 교체 요법), 또는 RPE 세포에 치료될 눈 질환에 유익한 효과를 가질 목적 폴리뉴클레오티드를 전달함으로써 (증상 요법) 수행될 수 있다.
특히, 상기 폴리뉴클레오티드 산물은 망막 색소 상피 세포의 기능을 강화할 폴리펩타이드이다. 유전자 교체 요법에 사용될 수 있는 목적 폴리뉴클레오티드의 예시는 RPE 세포에서 특이적으로 또는 우세하게 발현되는 유전자들, 예컨대 RGR (망막 색소 변성증, RP, 염색체 (chr.) 10), RDH5 (흰점 망막 병증, chr. 12), RPE65 (레버 선청성 흑암시, LCA, chr. 1), RLBP1 (RP, chr. 15), MERTK (RP, chr. 2), LRAT (RP, chr. 4), REP1 (범맥락막 위축, Xp21), RBP4 (RPE 변성, chr.10) 또는 다른 세포 유형에서도 발현되는 유전자, 예컨대 MYO7A (어셔 증후군 유형 1, chr. 11), ELOVL4 (황반 변성, chr. 6), EFEMP1 (말라티아 레벤티니즈 질환 (Malattia Leventinese disease), chr. 15), BEST1 (베스트 병, chr. 11), TIMP3 (소스비 안저 이영양증, chr. 22), AIPL1 (LCA, chr. 7), 및 CRB1 (RP, chr. 1)이다.
몇 가지 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 REP1, Rab 에스코트 단백질-1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다 (즉, CHM 유전자).
특정 구현예에 있어서, 상기 목적 폴리뉴클레오티드는 신경영양 인자를 인코딩할 수 있다. 본 발명에서 사용되는바, "신경영양 인자"는 신경 세포의 생존 및 유지, 신경세포의 분화 촉진과 같은 생리학적 작용을 갖는 단백질들의 총칭이다. 신경영양 인자의 예로는 bFGF, aFGF, BDNF, CNTF, IL-1베타, NT-3, IGF-II, GDNF, NGF 및 RdCVF를 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.
특정 조건에서, 상기 목적 폴리뉴클레오티드 산물은 유전자 기능의 부위-특이적 넉-다운을 제공하는, 예컨대 엔도뉴클리아제가 망막 질환과 관련된 대립유전자를 넉 아웃시키는, 부위-특이적 엔도뉴클리아제이다. 예컨대, 우성 대립유전자가 야생형일 때 망막 구조 단백질이고 및/또는 정상적인 망막 기능을 제공하는 유전자의 결손 카피를 인코딩한다면, 부위-특이적 엔도뉴클리아제 (예컨대, TALE뉴클리아제, 메가뉴클리아제 또는 징크 핑거 뉴클리아제)는 그 결손 대립유전자에 대한 표적이 될 수 있고 상기 결손된 대립유전자를 넉 아웃시킬 수 있다. 결손 대립유전자를 넉 아웃시키는 것 외에, 부위-특이적 뉴클리아제는 또한 상기 결손 대립유전자에 의하여 인코딩되는 단백질의 기능적 카피를 인코딩하는 주개 DNA를 이용하는 상동 재조합을 자극하는데 이용될 수 있다. 따라서, 예컨대, 본 발명의 방법은 결손 대립유전자를 넉 아웃시키는 부위-특이적 엔도뉴클리아제를 전달하는데 사용될 수 있고, 상기 견손 대립유전자의 기능적 카피를 전달하는데 사용될 수도 있으며, 그 결과 상기 결손 대립유전자가 수선됨으로써, 기능적 망막 단백질의 생성을 제공한다. 몇 가지 구현예에 있어서, 상기 벡터는 부위-특이적 엔도뉴클리아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 그 기능적 카피가 기능적 망막 단백질을 인코딩하는 경우, 결손 대립유전자의 기능적 카피를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 사용하기에 적합한 부위-특이적 엔도뉴클리아제로는, 예컨대 징크 핑거 뉴클리아제 (ZFNs); 및 전사 활성제-유사 효과자 뉴클리아제 (TALENs)를 들 수 있는데, 여기서 이러한 부위-특이적 엔도뉴클리아제들은 천연으로 존재하지 않고 특이 유전자를 표적하기 위하여 변형된다. 이러한 부위-특이적 뉴클리아제는 게놈 내의 특정 위치를 절단하도록 조작될 수 있고, 비-상동 말단 결합은 그 후 몇몇 뉴클레오티드를 삽입하거나 결실시키면서 틈을 복구할 수 있다. 이러한 부위-특이적 엔도뉴클리아제 ("INDELs"라고도 불림)는 그 후 프레임 밖의 단백질을 제거하고 상기 유전자를 효과적으로 넉 아웃시킨다. 예컨대, 미국 특허 공개 No. 2011/0301073 참고.
몇 가지 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 산물은 간섭 RNA (RNAi)이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "AAV"는 이 기술 분야의 일반적인 의미를 갖고, 아데노-과련 바이러스의 약자이며, 상기 바이러스 그 자체 또는 그 유도체들을 말하는데 사용될 수 있다. 상기 용어는 천연으로 존재하고 조작된 형태인 모든 혈청형 및 변이체 양자 모두를 아우른다. 본 발명에 따르면, 용어 "AAV"는 AAV 유형 1 (AAV-1), AAV 유형 2 (AAV-2), AAV 유형 3 (AAV-3), AAV 유형 4 (AAV-4), AAV 유형 5 (AAV-5), AAV 유형 6 (AAV-6), AAV 유형 7 (AAV-7), 및 AAV 유형 8 (AAV-8) 및 AAV 유형 9 (AAV9)를 말한다. 다양한 혈청형의 AAV의 게놈 서열, 및 본래의 말단 반복서열 (TRs), Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열이 이 기술 분야에 알려져 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 GenBank와 같은 공공의 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 예컨대, GenBank 수탁 번호 NC_001401 (AAV-2), AF043303 (AAV-2), 및 NC_006152 (AAV-5) 참고.
본 발명에서 사용되는바 "rAAV 벡터"는 RPE 세포의 유전자 형질전환을 위한 목적 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 이형 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 AAV 벡터를 말한다. rAAV 벡터는 5' 및 3' 아데노-관련 바이러스 역전 말단 반복서열 (ITRs), 및 표적 세포에서 그 발현을 조절하는 서열에 작동적으로 결합된 목적 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에서 "AAV 하이브리드 벡터"라는 용어는 rAAV 벡터 게놈 및 AAV Rep 단백질을 포함하는, AAV 캡시드를 포함하는 벡터 입자를 말하는데, 여기서 Cap, Rep 및 상기 벡터 게놈의 ITRs는 적어도 2개의 상이한 AAV 혈청형으로부터 온다. 본 발명의 혼성화 벡터는 rAAV2/5 벡터이고, AAV-5 캡시드 및 AAV-2 ITRs를 갖는 rAAV 게놈을 포함한다. 예컨대, AAV-2의 캡 유전자로부터, 이를 AAV-5의 캡 유전자의 서열로 교체함으로써 캡 유전자를 유도하는 것이 가능한데, 이런 방식으로 그 발현된 단백질은 AAV-5 캡시드를 형성할 수 있다.
본 발명의 rAAV2/5 벡터는 이 기술 분야에 알려진 방법을 이용하여 제조된다. 간단히, 상기 방법은 일반적으로 (a) rAAV 벡터의 숙주 세포로의 도입, (b) AAV 헬퍼 컨스트럭트의 숙주 세포로의 도입, 여기서 상기 헬퍼 컨스트럭트는 rAAV 벡터로부터 결여된 바이러스 기능을 포함하고 (c) 헬퍼 바이러스를 숙주 세포로 도입하는 것을 포함한다. rAAV 비리온 복제 및 패키징을 위한 모든 기능이, 상기 rAAV 벡터의 rAAV 비리온으로의 패키징 및 복제를 달성하기 위하여 존재할 필요가 있다. 상기 숙주 세포로의 도입은 표준 바이러스학적 기법들을 이용하여 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 마지막으로, 상기 숙주 세포는 배양되어 rAAV 비리온을 생산하고 CsCl 구배와 같은 표준 기법을 이용하여 정제된다. 남아있는 헬퍼 바이러스 활성은 알려진 방법, 예컨대 열 불활성화를 이용하여 불활성화될 수 있다. 정제된 rAAV 비리온은 그 후 본 발명의 방법에 사용하기 위하여 준비된다.
상기 벡터는 또한, 그 인코딩된 단백질을 발현 및 분비시킬 수 있는 조절 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보좀 엔트리 사이트 (IRES), 단백질 형질도입 도메인 (PTD)를 인코딩하는 서열 등등을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 벡터는 상기 목적 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결된 프로모터 영역을 포함하여 감염된 세포에서 단백질의 발현을 야기하거나 향상시킨다. 이러한 프로모터는 산재하고, 조직-특이적이며, 강력하고, 약하고, 조절되는, 키메라성의, 유도가능한 등등의 것이어서 그 감염된 조적에서 상기 단백질의 효율적이고 적절한 생산을 가능하게 할 수 있다. 상기 프로모터는 상기 인코딩되는 단백질에 대하여 동형이거나, 이형일 수 있고, 예컨대 세포의, 바이러스의, 곰팡이의, 식물의 또는 합성 프로모터일 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 양호한 프로모터는 RPE 세포에서 기능적이어야 한다. 이러한 조절된 프로모터의 예시로는 Tet 온/오프 요소-함유 프로모터, 라파마이신-유도 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터를 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 산재 프로모터의 예시로는 바이러스 프로모터, 특히, CMV 프로모터, CAG 프로모터 (CMV 인핸서를 갖는 닭 베타 액틴 프로모터), RSV 프로모터, SV40 프로모터 등 및 세포성 프로모터, 예컨대 PGK (포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터를 들 수 있다. 상기 프로모터는 또한, 신경특이적 프로모터, 예컨대 Synapsin 또는 NSE (Neuron Specific Enolase) 프로모터 (또는 산재 PGK 프로모터의 상류에 위치하는 NRSE (Neuron restrictive silencer element) 서열), 또는 RPE 세포 유형에 특이적인 프로모터, 예컨대 RPE65, BEST1, Rhodopsin 또는 콘 어레스틴 프로모터일 수 있다. 또한, 상기 벡터는 원치않는 세포에서 전이유전자 발현 억제를 달성하는 miRNAs에 대한 표적 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 벡터는 상기 인코딩되는 단백질의 분비를 가능케하는 리더 서열을 포함한다. 목적 폴리뉴클레오티드와 분비 신호 펩타이드 (통상 분비되는 폴리펩타이드의 N-말단에 위치)를 인코딩하는 서열과의 융합이 상기 형질도입되는 세포로부터 분비될 수 있는 형태로 그 치료 단백질을 생산하는 것을 가능하게 할 것이다. 이러한 신호 펩타이드의 예시로는 알부민, β-글루커로니다아제, 알칼라인 프로테아제 또는 피브로넥틴 분비 신호 펩타이드를 들 수 있다. 가장 양호한 구현예에 있어서, 상기 프로모터는 망막 세포, 특히 망막의 광수용체 또는 신경절 세포에서 또는 RPE 세포에서 특이적이거나 기능적이고, 즉 상기 세포에서 전이유전자의 (우세한) 발현을 가능하게 한다. 예컨대, 적절한 광수용체-특이적 조절 요소들로는, 예컨대 로돕신 프로모터, 로돕신 키나아제 프로모터 (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); 베타 포스포디에스터라아제 유전자 프로모터 (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9: 1015); 망막 색소 변성증 유전자 프로모터 (전술한 Nicoud et al. (2007) ); 광수용체간 레티노이드-결합 단백질 (IRBP) 유전자 인핸서 (전술한 Nicoud et al. (2007)); IRBP 유전자 프로모터 (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225)를 들 수 있다.
벡터의 투여량은 질환 상태, 대상체 (예컨대, 그의 체중, 대사 등에 따름), 치료 스케줄 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 문맥상 양호한 유효 투여량은 RPE 세포의 최적 형질도입을 가능하게 하는 양이다. 통상, 마우스의 투여량당 108 내지 1010 바이러스 게놈 (vg)이 투여된다. 통상, 인간에게 투여되는 AAV 벡터의 투여량은 1010 내지 1012 vg 범위일 수 있다.
본 발명의 벡터를 대상체에게 투여하는 것은 직접 망막에, 망막 하부에 또는 유리체내 주입에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 상기 벡터 입자의 투여는 좋기로는 망막 하부 전달에 의하여 수행된다.
몇몇 측면에 있어서, 본 발명은 REP1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 rAAV2/5 벡터에 관한 것이다. 몇 가지 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 CAG 프로모터의 제어하에 있다. 상기 벡터는 특히, 그를 필요로 하는 대상체의 범맥락막 위축을 치료하는데 적절하다.
REP1에 대한 아미노산 서열의 예시는 SEQ ID NO:6이고, REP1에 대한 핵산 서열의 예시는 SEQ ID NO:7이다.
SEQ ID NO:6: NCBI Reference Sequence: NP_001138886.1
Figure pct00001
SEQ ID NO:7: NCBI Reference Sequence: NM_000390.2
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명의 벡터는 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 이들 조성물은, 상기 벡터 외에도, 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 부형제, 캐리어, 완충액, 안정화제 또는 기타 물질들을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하고 활성 성분 (즉, 본 발명의 벡터)의 효능을 방해하여서는 안된다. 상기 캐리어 또는 기타 물질들의 정확한 성질은 투여 경로에 따라, 즉, 여기서는 직접 망막에, 망막 하부에 또는 유리체내 주입에 따라 숙련자에 의하여 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 통상 액체 형태이다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 액체 캐리어, 예컨대 물, 페트롤리움, 동물유 또는 식물유, 광물유 또는 합성유를 포함한다. 생리학적 염 용액, 마그네슘 클로라이드, 덱스트로스 또는 기타 새커라이드 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 주입을 위하여, 상기 활성 성분은 수용액의 형태일 것이고, 이는 발열원-무함유이고, 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는다. 이 기술 분야 관련 숙련자들은, 예컨대 Sodium Chloride Injection, Ringer's Injection, Lactated Ringer's Injection과 같은 등장성 비히클을 이용하여 적절한 용액을 준비할 수 있다. 필요하다면, 보존제, 안정화제, 완충액, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다. 지연 방출을 위하여, 상기 벡터는 이 기술 분야에 달려진 방법에 따라 생체적합성 폴리머로부터 형성된 마이크로캡슐 또는 리포좀 캐리어 시스템과 같은 서방 제제화된 약학적 조성물로 포함될 수 있다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예로 더 설명될 것이다. 그러나, 이들 실시예 및 도면은 본 발명의 범위를 제한하는 어떠한 방식으로도 해석되어서는 안된다.
도면:
도 1: iPSc -유래 RPE에서 AAV 벡터의 형질도입 효율. a) CMV 프로모터의 조절하에서 EGFP를 발현하는 일련의 AAV 벡터들 (2/2, 2/4, 2/5, 2/8, 2/9)의 형질도입 효율 비교. 이 형질도입 효율은 또한 CAG 프로모터의 조절하에서 EGFP를 발현하는 AAV2/5 벡터와도 비교되었다. 형질도입은 25 000 vg/세포로 수행되었고 EGFP-양성 세포는 FACS로 분석되었다. b) CMV 프로모터의 조절하에서 EGFP를 발현하는 AAV 벡터 2/2, 2/5, 2/8, 2/9의 매우 많은 수의 바이러스 입자 (100 000 vg/세포)를 이용하여 달성되는 형질도입 효율의 비교. EGFP-양성 세포의 수는 FACS로 분석되었다. c) 동일한 패널의 AAV 벡터들로부터의 EGFP 발현의 시간 코스. d) 야생형 및 CHM1 RPE는 AA2/5-CAG-EGFP에 의하여 동일한 효율로 형질도입된다.
도 2: CHM1 섬유아세포에서 벡터 AAV2 /5- CAG - CHM로부터의 REP1 발현. a) 야생형 섬유아세포에서 REP1 발현의 IF 연구. b) CHM1 섬유아세포에서 REP1 발현의 부재. c) CHM1 섬유아세포를 100 000 vg/세포로 형질도입한 48 시간 후 AAV2/5-CAG-CHM로부터의 REP1 발현. d) AAV2/5-CAG-CHM의 100 000 vg/세포를 이용한 형질도입 48 시간 후 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석은 REP1이 야생형 (WT)의 대략 17% 수준으로 발현되었음을 보여주었다 e) AAV2/5-CAG-CHM의 100 000 vg/세포를 이용한 형질도입 4 주 후 REP의 웨스턴 블롯 분석은 REP1이 야생형의 대략 53%의 수준으로 발현하였음을 보여주었다. d) 및 e) 모두에서 비-형질도입 (NT) CHM1 세포에서 REP1 발현이 없었다는 것에 주목해야 한다.
도 3: AAV2 /5- CAG - CHM으로 형질도입 후 CHM RPE에서의 정상적 세포 표현형의 회복. A) 시험관내 프레닐화 후 야생형, 비-형질도입 CHM1 RPE 및 AAV2/5-CAG-CHM로 형질도입된 CHM1 RPE에서, 포함된 비오틴화 프레닐 공여자의 웨스턴 블롯 분석. B) 야생형, 비-형질도입된 CHM1 RPE 및 AAV2/5-CAG-CHM 또는 AAV2/5-CAG-EGFP로 형질도입된 CHM1 RPE에서 세포질 및 막 분획의 차등적 원심분리 및 웨스턴 블롯 분석. C) 베타-액틴 로딩 수준에 대하여 표준화한 후 정량은 CHM1 RPE의 AAV2/5-CAG-CHM을 이용한 형질도입 후 야생형에 비하여 세포질 Rab 풀의 감소를 보여주었다. D) 정량 분석은 CHM1 RPE의 AAV2/5-CAG-CHM을 이용한 형질도입 후 Rab27A의 세포내 분포 프로파일의 야생형 수준까지의 회복을 보여주었다. 반대로, AAV2/5-CAG-EGFP를 이용한 형질도입 후 수준은 변화하지 않았다.
도 4: 마우스 망막에서 생체내 유전자 이동 a) AAV5-CAG-CHM 또는 -EGFP의 4.68 x 109 vg 투여 2 주 후, 전이유전자 발현은 q-PCR 연구에 의하여 검출될 수 있었다. b) 각각 AAV5-CAG-CHM 또는 -EGFP의 투여 후 REP1 및 EGFP의 특이적 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. c) AAV5-CAG-EGFP의 주입 후 안저검사 연구는, 주입 부위에서 더욱 강하게, AAV5-CAG-CHM의 투여 후 주입 부위를 넘어선 건강한 망막 및 넓게 퍼진 전이유전자 발현을 보여주었다. d) EGFP 발현은 시신경 측면에서 전(全)망막을 따라서 검출되었는데, 이는 주입 부위를 가두고 있고 (스케일 막대); 삽도, RPE 및 광수용체에서 EGFP 발현을 보여주는 확대도.
실시예 :
재료 & 방법
피부 섬유아세포의 단리 및 증폭
유전자 감각 장애 참고 센터 (Centre of Reference for Genetic Sensory Disorders)에서 범맥락막 위축으로 분자적 확진된 (RT-PCR로 확인된 CHM의 엑손 8 결실; Klinkum der Universitat, Regensburg, Germany) 16세 소년의 상완 내측에서 멸균 조건하에서 피부 생검이 수행되었다 (CHM1로 칭함)(CHRU Montpellier). 피부 생검물을 PBS로 수세하고, 작은 조각으로 잘라 5% CO2 조건하 37℃에서 10% 탈보체화된 FCS (Lonza, Verviers, Belgium), 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B (Lonza) 및 2% AmnioMax-C100 보충제 (Invitrogen, Life Technologies)를 함유하는 L-글루타민 함유 AmnioMAX C100 기본 배지 (Invitrogen, Life Technologies, Saint Aubin, France)의 35 mm 배양 디쉬 (디쉬당 2 조각)에서 배양하였다. 생검물을 일단 새 디쉬에 옮기고 새로 생긴 섬유아세포는 80% 컨플루언시에 도달하였다. 생검물을 총 4회 옮기고 각각의 개별적인 배양에서 P1 내지 P5에 이르는 세포들을 10% DMSO를 함유하는 FCS (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France)에 동결시켰다.
돌연변이 특성
제조자의 지침에 따라 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Les Ulis, France)를 이용하여 1차 섬유아세포로부터 게놈 DNA를 단리하였다. CHM 환자가 갖는 CHM의 엑손 8 결질의 경계를 확정하기 위하여, 1.6 kb의 게놈 DNA 5' 내지 엑손 8에 걸쳐 분포하는 3개의 프라이머 쌍, 및 38 kb 3' 내지 엑손 8에 걸쳐 분포하는 8개의 프라이머 쌍이, 표준 조건을 이용하여 대조군 및 환자 DNA의 PCR 증폭에 대하여 시험되었다. 일단 간격 감소가 구축되면, 엑손 8의 78 bp 업스트림에 위치하는 인트론 7 F 프라이머 (5'-TTC-ATC-TCC-TTT-TTG-TGG-GG-3') (SEQ ID NO:1) 및 엑손 8의 362 bp 다운스트림에 위치하는 8 R 프라이머 (5'-CTG-GAA-ACA-TCC-TGT-GTT-CAT-C-3') (SEQ ID NO:2)가, Applied Biosystems 3130xL Genetic Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit V3.1를 이용한 시퀀싱 전에 ExoSAP-IT PCR Clean-up Kit (GE Healthcare, VelizyVillacoublay, France)를 이용하여 정제되는 666 bp 게놈DNA 단편을 증폭하는데 사용되었다.
돌연변이 검출
여러 가지 세포 유형의 게놈 DNA에서 CHM 결실 존재를 시험하기 위하여 엑손 7, 8 및 9의 PCR 증폭에 3개의 프라이머 쌍을 이용하였다. 엑손 7에 대한 프라이머 쌍은 493-bp 단편을 증폭시켰고, 엑손 8은 177-bp 단편을, 엑손 9는 975-bp 단편을 증폭시켰다. 제조자의 지침에 따라 QiaShredder and RNeasy mini kits (Qiagen)를 이용하여 여러 가지 세포 유형으로부터 RNA가 단리되었다. 단리된 RNA를 RNase-Free DNase (Qiagen)로 처리하고 Superscript III Reverse Transcriptase kit (Life Technologies)를 이용하여 역전사하였다. 대조군 cDNA로부터의 559-bp 단편 및 환자 cDNA로부터 단편을 나타내는 엑손 7 내지 11의 PCR 증폭에 의하여 CHM 결실의 존재 또는 부존재가 수행되었다.
웨스턴 블롯 분석
세포를 완전 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (Roche, Meylan, France)를 포함하는 차가운 PBS에 긁어넣고 4℃에서 5 분간 200 g로 원심분리하였다. 펠렛을 Benzonase (Sigma Aldrich)를 함유하는 2x Laemmli 시료 완충액 (Biorad, Marne La Coquette, France)에 재현탁하였다. 용리물의 단백질 농도를 Pierce BCA Protein Assay kit (ThermoFisher Scientific, Graffenstaden, France)를 이용하여 측정하고 AnyKD precast MiniProteanTGX Stain Free gel (Biorad) 상에 로딩하였다. 분리된 단백질을 Trans-Blot® Turbo™ Mini PVDF Transfer Pack and System (Biorad)을 이용하여 전기전이시켰다. 5% 무지방 우유 중의 0.5% Tween-PBS (블로킹 용액)에서 1 시간 동안 블로킹 후, 실온에서 1 시간 동안 모노클로날 마우스 항-REP1 항체 (clone 2F1; Millipore, Saint Quentin en Yvelines, France)의 블로킹 용액에서 1/1000 희석으로 멤브레인을 반응시켰다. 0.5% Tween-PBS에서 3회 수세 후, 마우스 전체 면역글로불린에 대한 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP)-컨쥬게이션된 양 항체 (Life Technologies) 1/10000 희석으로 필터를 반응시켰다. 검출 단계를 AmershamECL prime western blotting detection reagent (GE Healthcare)를 이용하여 수행하였다.
렌티 바이러스 벡터 제조
독시사이클린 유도 전사 인자 c-MYC (FUW-tetO-hMYC; plasmid ID 20723), SOX2 (FUW-tetO-SOX2; 20724), KLF4 (FUW-tetO-KLF4; 20725), OCT4 (FUW-tetO-OCT4; 20726), 역 독시사이클린 트랜스액티베이터 M2rtTA (FUW-M2rtTA; 20342) 및 GFP (FUGW; 14883)를 함유하는 렌티바이러스계 플라스미드를 Addgene (Cambridge, MA, USA)으로부터 구매하였다. 렌티바이러스 벡터를 렌티바이러스 제조 플랫폼으로 제조하였다 (Montpellier, France). FUGW의 감염 역가는 1010 TU/ml로 계산되었다. 남은 바이러스의 감염 역가는 FUGW의 그것과 그들의 P24 농도의 비를 계산하여 추산되었다: FUW-tetO-hMYC - 2 x 109 TU/ml; FUW-tetO-SOX2 - 7 x 109 TU/ml; FUW-tetO-KLF4 - 8 x 109 TU/ml; FUW-tetO-OCT4 - 3 x 109 TU/ml 및 FUW-M2rtTA -9.8 x 109 TU/ml.
피더 세포
인간 신생아 포피 섬유아세포를 ATCC (hFF-1; LTC standards, France)에서 구입하였다. 10% FCS로 보충되고 CegelecBloodXrad 조사기 (EtablissementFrancais du Sang, Montpellier, France)를 이용하여 35 Gray 양으로 조사된 Glutamax를 함유하는 DMEM (Gibco, Life technologies)에서 세포를 배양하였다. 피더 세포를 2.5 x 105 세포/35 mm 플레이트의 밀도로 파종하였다.
리프로그래밍 및 iPSc 배양
리프로그래밍을 시작하기 전, 형질도입 실험을 위하여 적절한 MOI가 GFP-인코딩 FUGW 벡터를 이용하여 계산되었다. 그 후, CHM 환자 섬유아세포를, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B로 보충된 Glutamax 함유 DMEM에, 제0일에 6-웰 플레이트의 웰당 105 세포의 밀도로 파종하였다. 제1 일에, 8 μg/ml 폴리브렌의 존재하에서 벡터당 10 MOI (총 50의 MOI)로, 세포에 5개 바이러스 (대조군 벡터 FUGW는 리프로그래밍 실험에 사용되지 않았다)를 형질도입하였다. 제2 일에, 세포를 PBS로 수세하고 새로운 배지를 첨가하였다. 제5 일에, 배지를 새로 교체하고 2 μg/ml의 독시사이클린으로 보충하였다. 제6 일에, 형질도입된 세포를 0,25% 트립신 (Gibco)으로 풀어서 1개 웰로부터의 세포들을 피더 세포층을 함유하는 4개의 웰에 나누었다 (1/4 희석). 세포를 20% KO 혈청 교체물 (Gibco), 200 mM L-글루타민 (Gibco), 1% 비필수 아미노산 (Gibco), 0.1% B-머캅토에탄올 (Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco) 및 2 μg/ml 독시사이클린 (Sigma Aldrich)을 함유하는 10 ng/ml FGF (Peprotech, Neuilly Sur Seine, France)로 보충된 ES 배지 (KO DMEM (Gibco)에서 배양하고 매일 배지 교환하였다. 결과물인 iPSc를 ES 배지에서 피더 세포를 포함하는 35 mm 플레이트 상에서 메스를 이용하여 Lynx 입체현미경 (Vision Engineering SA, Le Plessis Plate, France) 하에서 물리적으로 계대하였다.
기형종 형성 및 분석
iPSc를 1 시간 동안 37℃에서 10 μM ROCK (Rho-associated coiled-coil forming protein serine/threonine kinase) 억제제 (Y-27632; Sigma Aldrich)로 사전 처리한 후, 37℃에서 10 분간 1x TrypLE Select (Gibco)로 효소 용해시켰다. 용해된 세포를 피더 세포층을 포함하는 10-cm 플레이트에서 5000 세포/cm2의 밀도로 파종하고, 계대 배양 후 24 시간 동안 ROCK 억제제를 포함하는 ES 배지에서 배양하였다. 주입 전에 세포를 5회 효소적으로 계대 배양하였다. 용해된 세포를 주입되는 200 μl당 2 x 106 세포의 농도로 30% BD Matrigel Basement Membrane Matrix (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France)를 함유하는 ES 배지에 재현탁하였다. 동물 식이와 실험은 실험 동물의 관리 및 이용에 대한 유럽 및 국내 가이드라인 (Europpean and National guidelines for the care and use of laboratory animals)(Council Directive 2010/63/EU)에 따라 수행되었고 기관 및 지역 윤리 위원회의 승인을 받았다 (permit number CEAA-LR-12157). NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ 마우스 (Charles River, L'Arbresle, France)를 35 mg/kg 케타민 (Merial, Lyon, France) 및 14 mg/kg 자일라진 (Bayer Healthcare, Loos, France)으로 마취하고, 좌우 후방 옆구리를 면도하여 27-게이지 니들에 부착된 1 ml 시린지를 이용하여 200 μl 세포 혼합물을 피하 주입하였다. 대조군으로서, 마우스들에 어떠한 세포도 함유하지 않거나, 이전에 특징화된 야생형 iPSc (M4C7; (Ramirez et al, 2013) 세포를 함유하는 30% Matrigel/ES 배지를 주입하였다. 마우스들을 개별 환기 케이지에 수용하고 종양이 최대 크기 1 cm2 (주입 후 ~2-mo)에 도달하는 때에 안락사시켰다. 종양을 잘라, PBS에서 수세하고 3.7% 포름알데히드에 고정시켜 파라핀에 저장하였다. 4개의 μm 섹션을 해마톡실린에오신으로 염색하고 3개 배엽의 존재에 대하여 분석하였다.
RPE 생성
iPSc를 RPE로 분화시키기 위하여, 약간의 변형을 가하여 앞서 설명한 자발적 분화 프로토콜을 이용하였다 (Liao et al, 2010). 간단히, iPSc 콜로니를 피더 세포상에 컨플루언시까지 배양하고 그 후 ES 배지로부터 FGF를 제거하였다. 분화 과정 중 배지는 매일 계속하여 교환되었다. FGF-고갈 후 1 개월 기간에 걸쳐 착색된 병소 (foci)가 나타났는데, 이를 수동으로 잘라냈다. 하나의 플레이트로부터의 병소를 모아, 0.25% 트립신으로 녹이고, 마트리겔로 코팅된 24-웰 또는 6-웰 배양 디쉬상에 파종하고 (희석 1:30) FGF-고갈 ES 배지에서 배양하였다. 일단 단층의 컨플루언시에 도달하면, 세포는 착색된 다각형 형태를 띠었고 장기간 배양에서 유지될 수 있었다. 세포를 트립신 용해로 계대 배양하고 필요한대로 증식시켰다. 모든 분석은 3계대의 RPE에서 수행되었다 (P3). 유체로 가득찬 돔이 SteREO Discovery V2.0 현미경 (Carl Zeiss S.A.S, Le Pecq, France)에서 관찰되었다.
전자 현미경
RPE를 고밀도 0.4　μM 포어를 갖는 반투명 BD Falcon 세포 배양 인서트 (BD Biosciences) 상에서 계대 배양하였다. 특징적인 형태에 도달하였을 때, 챔버로부터 필터를 떼어내, 3.3% 글루타르알데히드에 고정, 2% 오스뮴 테트라옥사이드에 후고정하고 에폭시 레진에 담갔다. 세미-씬 (700 nm) 부분을 톨루이딘 블루로 염색하고 광 현미경하에서 관찰하였다. 70 nm 부분을 우라닐 아세테이트 및 리드 시트레이트로 염색하고 Hitachi H7100 투과 전자 형미경 (Centre Regional d'ImagerieCellulaire (CRIC), Montpellier, France)으로 시각화하였다.
면역형광 현미경
면역형광 연구를 위하여, iPSc 및 RPE를 플라스틱 96-웰 디쉬에 파종한 반면 섬유아세포는 유리 커버슬립에 파종하였다. 모든 세포 유형을 3.7% 포름알데히드로 고정시키고 5% 당나귀 혈청/1% BSA에서 블로킹하였다. 세포를 0.2% Triton x-100 또는 0.05% 사포닌으로 반투과성화시켰다. 섹션들에 대하여 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시켰고, 2차 항체를 실온에서 45분간 0.2 μg/ml 비스벤즈이미드 Hoechst (Sigma-Aldrich) 및 1 ng/ml 팔로이딘-TRITC (Sigma-Aldrich)와 함께, 적절한 때에 Dako Fluorescent Mounting Media (Dako France S.A.S., Les Ulis, France)에 실장하기 전에 반응시켰다. iPSc에 대해, 사용된 1차 항체는 1:5 희석 래트 IgM 항-인간 SSEA3 (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City, IA, U.S.A.) 및 1:10 고트 항-인간 NANOG (R&D Systems Europe, Lille, France)였다. RPE에 대해, 사용된 1차 항체는 1:100 희석 래빗 항-인간 ZO-1 (Invitrogen, Life technologies), 1:250 래빗 항-인간 MERTK (AbCam, Cambridge, Great Britain), 1/150 희석 마우스 항-인간 RPE65 (AbCam) 및 1:1000 마우스 항-인간 CRALBP (재조합 단백질에 대한 것; Agrobio, La Ferte St Aubin, France)였다. 섬유아세포에 대하여, 사용된 1차 항체는 1/500 희석 마우스 항-인간 REP1 (Millipore)였다. 모두에 대하여, 2차 항체는 1:800 희석 당나귀 항-마우스 IgM-Alexa594 또는 -Alexa488 또는 1:1000 희석 당나귀 항-마우스, 항-래빗 또는 항-고트 IgG-Alexa Fluor 594 또는 -Alexa 488 (Molecular probes, Invitrogen)였다. 식균작용 연구를 위하여, 세포를 1 μm 직경의, 황-녹 (505/515 nm) 카복실레이트-변형된 마이크로스피어 (FluoSpheres; Molecular Probes, Life technologies)와, 세포당 160 비드의 양으로 반응시켰다. 세포를 Zeiss 5 live duo 고속/스펙트럼 공초점 현미경을 이용하여 관찰하고, 이미지 수집은 해당하는 수집 소프트웨어 (Carl Zeiss S.A.S.; Montpellier RIO Imaging platform)를 이용하여 수행되었다.
역전사 및 정량 PCR 연구
정량 RT-PCR (qPCR)을 이용하여 형질도입된 섬유아세포에서 외래 전이유전자의 발현 및 iPSc에서 외래 전이유전자의 침묵과 내인성 다능성 유전자의 활성화를 분석하였다. RNA 분리 및 cDNA 합성 후, LightCycler® 480 II 써멀 사이클러 (Roche)에서 유전자-특이적 프라이머 (서플리멘터리 자료, 표) 및 LightCycler® 480 SYBR Green I Master 믹스를 이용하여 qPCR 증폭이 수행되었다. 유전자 발현을 GAPDH 발현에 대하여 표준화하였다. 결과를 LightCycler® 480 소프트웨어 및 마이크로소프트 엑셀을 이용하여 분석하였다. RPE-특이적 마커의 발현을 유전자-특이적 프라이머를 이용하는 고전적인 RT-PCR 증폭을 이용하여 분석하였고 증폭 산물을 2% 아가로오스 겔 상에서 분석하였다.
시험관내 프레닐화 분석
24-웰 플레이트에서 배양된 RPE를 차가운 PBS에 수세하고, 항-프로테아제를 함유하는 PBS 내로 긁어내어, 앞서 언급된 바와 같이 신선하게 준비된 차가운, 탈가스화 프레닐화/용해 완충액에서 펠렛화 및 재현탁하였다 (Wu et al, 2007). 세포들을 얼음 위에서 15 분간 반응시킨 후, 40 Hertz에서 45 초간 3회 소니케이션하였다. 그 후, 세포들을 4℃, 1500 g에서 5 분간 원심분리하고, 상층액을 모아서 Optima MAX-TL 울트라센트리퓨즈 (Beckman, VillepinteRoissy, France)에서 4℃, 450000 g로 30 분간 추가 원심분리하였다. 새로 준비된 용해물에 대하여, 5 μM 비오틴-표지된 제라닐 피로포스페이트 (B-GPP) (Euromedex, Souffelweyersheim, France)를 프레닐기 공여자로서 이용하고, 0.5 μM 재조합 REP1 (Euromedex), 0.5 μM Rab 제라닐제라닐 트랜스퍼라아제 (RGGT; Euromedex) 및 20 μM GDP를 이용하여 37℃에서 1 시간 동안 프레닐화/용해 완충액에서 시험관내 프레닐화 분석이 수행되었다 (Nguyen et al, 2010; Wu et al, 2007). 프레닐화 반응은 6x SDS를 이용하여 종결되었고, 90℃에서 5 분간 끓여 웨스턴 블롯으로 분석되었다. 멤브레인을 1:5000 HRP-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 (Jackson ImmunoResearch, Cambridge, Great Britain) 또는 1:50 000 마우스 항 β-액틴 (Sigma Aldrich)으로 반응시켰다. 검출을 ChemiDoc MP Imaging system (Biorad)을 이용하여 수행하고, 적절한 소프트웨어 패키지를 이용하여 농도계를 스캔하여 비오틴-제라닐 포함량을 정량하고 (Image Lab, Biorad) 베타-액틴 신호의 함수로 표현하였다. 상대적 비교를 위하여, CHM RPE 내 비오틴 함유량을 100%로 설정하였다.
차등적 원심분리
24-웰 플레이트의 웰로부터 펠렛화된 RPE 세포를 전술한 바와 같이, 50 mMTris-HCl (pH 7.5), 150 mMNaCl, 2 mM MgCl2, 0.5 mMEGTA, 0.5 mMEDTA, 5 mMDTT, 0.1 mM GDP 및 단백질 억제제를 함유하는 3 부피의 Subcellular Fraction Lysis Buffer (SFLB)에서 강하게 균질화하였다 (Seabra et al, 1995). 균질화물을 4℃, 800 x g에서 원심분리하고, 펠렛을 버리고, 상층액을 4℃에서 1 시간 동안 450 000 x g에서 초원심분리하여 세포질 및 막 분획을 얻었다. 초원심분리 후, 펠렛을 1% Nonidet P-40 (Sigma Aldrich)에 조정된 1 부피의 SFLB에 재현탁하였다. 세포질 상층액 및 1% Nonidet P-40-용해된 막 분획의 단백질 함량을 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 멤브레인을 1:250 마우스 항-Rab27A (AbCam) 또는 1:50 000 마우스 항-β-액틴 항체와 반응시켰다. 세포질 및 막의 Rab27A 수준을 베타-액틴 로딩 대조군과 상대 정량하였고 각 웰에 대한 총 Rab27A 함량 백분율로 나타내었다.
AAV 벡터 제조
Viral Vector Production Platform (Nantes, France)이 이 연구에서 사용되는 모든 AAV 벡터들을 생산하였다. 간단히, 바이러스 벡터들은 293 세포들의 순간 트랜스펙션으로 제조되었고 바이러스 입자들은 PEG를 이용하여 상층액으로부터 침전되거나, AAV2/4 및 -2/5 벡터의 경우, 암모늄 술페이트를 이용하여 세포 펠렛으로부터 침전되었다. 벡터를 이중 CsCl 원심분리로 정제, 투석하고 도트 블롯 분석으로 역가분석하였다. 형질도입 효율 실험을 위하여, CMV 프로모터의 제어하에서 EGFP를 발현하는 AAV 벡터의 역가 분석은 다음과 같았다: AAV2/2-CMV-EGFP - 3.5 x 1012 벡터 게놈 (vg)/ml; AAV2/4-CMV-EGFP (Dr. F. Rolling의 중간물질에 의하여 제공됨, InsermUMR 1089, Nantes) - 3 x 1011 vg/ml; AAV2/5-CMV-EGFP - 3.3 x 1012 vg/ml; AAV2/8-CMV-EGFP - 9 x 1012 vg/ml, 및 AAV2/9-CMV-EGFP - 2.55 x 1012 vg/ml. 개념 실험의 입증을 위하여, CAG 프로모터 (CMV 인핸서를 갖는 닭 베타 액틴 프로모터)의 제어하에서 CHM 유전자 (Pr. J. Bennett 제공, University of Pennsylvania, PA, USA) 또는 EGFP 유전자 (Nantes Viral Vector Production Platform 제공) 중 하나를 포함하는 AAV 플라스미드를 사용하여 하기의 벡터들을 제조하였다: AAV2/5-CAG-CHM - 4.4 x 1012 vg/ml 및 AAV2/5-CAG-EGFP - 2.34 x 1012 vg/ml.
시험관내 AAV 형질도입
형질도입 효율 실험을 위하여, iPSc-유래 RPE를 96-웰 플레이트에 파종하였고, 웰당 2 x 105 세포들이 컨플루언시에서 추산되었다. 세포들을 최소 부피 (50 μl)의 FGF-고갈 ES 배지에서 6 시간 동안 25 000 vg (가장 낮은 역가를 갖는 혈청형으로 언급)으로 형질도입하여 벡터-세포 상호작용을 촉진시켰다. 그 후, 웰을 여분의 배지로 보충하고 배지를 매 3 내지 4일마다 교환하였다. 원하는 시간점에, 세포들을 0.25% 트립신으로 용해시키고, 3.7% 포름알데히드에 고정시키고, 형질도입 48-h, 1-, 2-, 4- 및 6-주 후 BD FACSCalibur 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 이용하여 EGFP-발현 세포들을 분석하였다. 실험을 2회 반복 수행하였다. 전이유전자 발현 실험을 위하여, 2 x 104 섬유아세포를 커버슬립을 포함하는 24-웰 플레이트에 파종하였다. 파종 24 시간 후, 세포들을 AAV2/5-CAG-CHM 100 000 vg로 48 h 동안 형질도입시켰다. 병행하여, 유세포 분석을 위하여 커버슬립이 없는 웰을 동일한 MOI로 V2/5-CHM-EGFP 형질도입하였다. 개념 입증 실험을 위하여, iPSc-유래 RPE를 24-웰 플레이트에 파종하고 컨플루언시에서 1.2 x 106 세포들이 추산되었다. 세포들을 MOI 100 000으로 형질도입하고 프레닐화 분석을 형질도입 4-주 후 수행하였다. 실험을 3회 반복으로 수행하였다.
망막하부 주입
8 주령 C57BL/6J 수컷 마우스 (Harlan France SARL, Gannat, France)를 70 mg/kg 케타민 및 28 mg/kg 자일라신으로 마취하고, 각 눈에 한 방울의 0.5% 트로픽아마이드 (Mydriaticum, Thea, France)로 동공을 확장시켰다. 각막은 한 방울의 Lacryvisc (Alcon, Rueil-Malmaison, France) 및 유리 커버슬립으로 덮여 있었다. 수술 현미경 아래, 눈은 우선 각막-공막 교차점에서 관통되었다. 뒤이어, 5 μl Hamilton 시린지 및 사면 34 G 니들을 이용하여 망막하부 주입이 수행되었다. 눈에, 2 μl의 PBS 또는 2 μl의 4.68 x 109 vg AAV2/5-CAG-CHM 또는 AAV2/5-CAG-EGFP를 주입하였다. 안저검사로 정기적인 간격으로 눈을 추적하였다 (주입 2-, 4-, 6- 및 8-주 후). 각 시간점에서, 마우스를 마취하고, 동공을 확장시키고, Retinal Imaging Microscope (Phoenix Research Laboratories, Peasanton, CA, USA)를 이용하여 안저 사진을 찍었다. 전술한대로 희생시키기 전에 막전위 연구 (Electroretinogram studies)가 수행되었다 (Chekroud et al, 2011). Kruskall Wallis ANOVA를 이용하여 통계적 비교가 수행되었고, Siegel-Castellan 2x2 비교를 이용하여 사후 비교하였다 (post-hoc comparison)(Siegel & Castellan, 1988).
전이유전자 발현 분석
주입 2주 후 마우스들을 희생시키고, 눈을 적출하여 안구 글로브의 앞 부분을 제거하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 신경망막을 잘라서 각각 용해 완충액 (50 mM Tris pH 6.8, 10% 글리세롤 및 2% SDS)에 넣었다. 이어서, RPE 및 맥락막을 포셉으로 용해 완충액 내로 긁어내어 신경망막과 함께 모았다. 일정 분율의 (7.5%) 총단백질 시료를 이동시켜 옮기고 전술한대로 항-REP1 또는 1/2000 희석 래빗 항-EGFP 혈청 (Molecular probes, Invitrogen)과 혼성화하였다. q-PCR 분석을 위하여, 신경망막 및 RPE/맥락막 시료를 RNA 분리 및 cDNA 합성 전에 스냅 동결하였다. L27 유전자 발현에 대하여 표준화된 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 Q-PCR 분석을 수행하였다.
조직학적 분석
EGFP 발현을 분석하기 위하여, 눈을 적출하여 4℃에서 6 시간 동안 3.7% 포름알데히드에서 고정시키고, OCT 매트릭스에 담구고 14 μM로 나누기 전에 10%, 20%, 30% 및 40%의 연속적인 수크로오스 욕에서 반응시켰다 (Reseau d'HistologieExperimentale de Montpellier (RHEM)). 조직학적 분석을 위하여, 눈을 적출하여 4℃에서 24 시간 동안 3.7% 포름알데히드에서 고정시키고, 연속적인 에탄올 욕에서 탈수시켜, 파라핀에 담구고 4 μm로 섹션 절단하였다 (RHEM). 광수용체 계수를 위하여, 단면을 해마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 현미경 이미지를 Slide Scanner (Hamamatsu Photonics K.K., Japan; Montpellier RIO Imaging platform)에서 수집하였다. 망막당 4개 이상의 시상 단면을 계수하였고 (주입 상태 마스킹) 광수용체 핵의 수가 평균내어졌다.
결과
환자 돌연변이의 특징화
환자 CHM1의 섬유아세포 게놈 DNA의 특징화는 엑손 8의 시작 40 bp 업스트립에 위치한 인트론 7에 7-bp (TAGTTCT) (SEQ ID NO:3) 서열의 반복을 밝혀냈다. 반복된 서열 사이에, 4-bp (GATT) (SEQ ID NO:4) 삽입이 있었다. 이러한 첫번째 반복 후 시작 후 68 bp에 위치한 엑손 8 내 15-bp (GTCATGCATTCAATT) (SEQ ID NO:5) 서열의 두번째 반복이 있었다. 두 반복 사이에 위치하는 97-bp DNA 서열, 이는 인트론 7의 말미와 엑손 8의 시작부를 포함하는 것인데, 이 서열은 결실되었다. 인트론 7 억셉터 스플라이스 위치의 손실 및 뒤이은 엑손 8의 결실은 아미노산 위치 314에서 예상된 프레임시프트를 결과하였고, REP1의 두번째 GDP 해리 억제제 (GDI) 도메인이 절단된 332 위치에서의 이른 종결 코돈을 결과하였다 (야생형 REP1은 653 aa). 야생형 및 절단된 REP1 (73.49 kDa), 및 REP2 (74.08 kDa)에 모두 존재하는 N-말단 에피토프에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯은 대조군 세포에 대하여 2개 밴드를 검출하였고 CHM 세포 (REP2에 해당)에 대해 하나의 밴드를 검출하여, 상기 절단된 단백질이 불안정하다는 것을 보였다. 두번째 REP1 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석은 대조군 세포에서와는 반대로 CHM1 세포에서 단백질을 검출하지 못하였다.
따라서, 환자 CHM1에 의하여 동반된 돌연변이는 REP1 단백질 생산을 폐하였다. 게다가, DNA, RNA 및 단백질 수준에서 개발된 검출 시험은 그 후에 생성되는 임의의 세포 유형에서 환자의 돌연변이의 존재를 확인하는데 작용할 것이다.
환자 특이적 iPS 세포의 생성 및 검증
CHM1 섬유아세포의 리프로그래밍을 위하여 Yamanaka 전사 인자 칵테일 (c-MYC, KLF4, OCT4, SOX2)을 갖는 독시사이클린-유도 렌티바이러스 벡터를 이용하였다. 각 전이유전자의 독시사이클린 유도 24 시간 후의 발현을 qPCR 연구로 확인하였다. 독시사이클린 유도 1 주 후, 섬유아세포는 시간에 따라 나타나고 사라지는 부분적으로 리프로그래밍된 콜로니들 (사전-iPSc 콜로니)로 형태를 바꾸기 시작하였다. 반대로, 독시사이클린 유도 5-주 후, 형태적으로 특징적인 콜로니가 검출되었는데, 이는 독시사이클린을 함유하지 않는 ES 배지로의 물리적 계대 배양을 견뎌내었다. CHM1 iPSc DNA의 PCR 증폭은 본래의 CHM 결실이 존재하였음을 보여주었고, 그것이 야생형으로부터 생성되는 cDNA 단편과 CHM1 iPSc RNA 사이의 226 bp 차이에서 증명되듯이 mRNA의 엑손 8의 완전한 결실을 이끌어낸다는 것을 보여주었다. 게다가, CHM1 iPSc는 핵형 분석에 의하여 보여지는 바와 같이 리프로그래밍 중 일어날 수 있는 어떤 큰 염색체 이상을 나타내지 않았다.
다양한 기법 및 양성 대조군으로서 야생형 클론 M4C7 (Ramirez et al, 2013)를 이용하여 CHM1 iPSc의 다능성을 확인하였다. 우선, mRNA 수준에서, qPCR 연구는 CHM1 iPSc에서 외래의 c-MYC, KLF4, OCT4 및 SOX2가 침묵하고 내인성 OCT4, SOX2, LIN28 및 NANOG의 발현 활성화를 입증하였다. 둘째로, 알칼라인 포스파나아제 염색은 양성이었고, 면역형광 (IF) 연구는 NANOG의 발현을 확인해 주었고, SSEA3의 발현을 나타내었다. 마지막으로, CHM1 iPSc는 면역-결핍 마우스에 피하 주사하였을 때, 기형종 형성을 유도하였고, 조직학적 분석에 의하여 3개 배엽의 마커 발현이 확인되었다: 외배엽, 중배엽 및 내배엽.
결론적으로, 본 발명의 발명자들은 CHM 환자의 진정 (bona fide) iPSc를 생성하였다.
환자 특이적 RPE의 생성 및 검증
자발적 증식 프로토콜을 이용하여 야생형 M4C7 및 CHM1 iPSc로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 생성하였다. iPSc를 컨플루언시까지 배양하고 bFGF를 배지로부터 제거한 대략 30일 후, 색소 침착된 병소가 플레이트에 나타났다. 이들 병소를 물리적으로 계대 배양하였고 컨플루언시에서 다각형의 RPE의 색소침착된 세포 특성의 하나의 층이 생겨났다. 세포들을 반투명 다공성 필터에 파종하여 절단면 및 조직학 분석을 가능하게 하였다. 세미-씬 단면의 관찰은 세포 층이 규칙적인 단층이라는 것을 입증하였다. 투과 전자 현미경은 상기 단층이 꼭대기 면에 미세융모를 갖고, 기저면에 핵을, 밀착 연접의 표시인 세포질 멜라노좀과 데스모좀을 갖는 편향된 상피라는 것을 보여주었다. 상기 상피는 RPE 세포들과 마트리겔 코팅 사이에서 검출가능한 기저판 (basal lamina)을 분비하는 것으로 보였다. RT-PCR 연구는 iPSc-유래 상피가 시각 주기 (예컨대, RLBP1, RPE65, LRAT, RDH5), 망막 발생 (PAX6), 식균작용 (MERTK), 색소 침착 (TYR), 이온 수송 (BEST1), 및 세포 접착 (ZO-1)에 대한 고전적인 유전자들을 발현한다는 것을 입증하였다. 또한, IF 연구는 그들 각각의 역할에 따라, MERTK가 꼭대기의 미세융모에 위치하고 (도 4f), CRALBP 및 RPE65는 세포질에, ZO-1는 꼭대기의 연접에 위치한다는 것을 보여주었다. 게다가, 데스모좀의 존재는 양성의 ZO-1-표지와 일치하였다. 이러한 고전적인 RPE 형태 이외에, 생체내 기능 중 2 가지가 iPSc-유래 RPE에서도 보존되었다. 첫째, 시간에 걸쳐, 유체로 채워진 다양한 크기의 돔이 플레이트 상에 나타났다. 이들은 RPE를 배양 플레이트로부터 들어올리는 꼭대기-바닥 유체 이동에 기인하여 형성되는 것 같다. 둘째로, RPE는 FluoSpheres를 식균할 수 있었는데, 이는 표면형광 현미경으로 검출될 수 있었다. FACS 분석은 내재화된 스피어의 양이 시간에 따라 증가한다는 것을 보여주었다. 마지막으로, 원래의 CHM 돌연변이는 DNA 및 RNA 수준에서 존재하였으며, REP1는 CHM1 RPE에서 부재하였다.
종합하면, 이들 결과는 이러한 야생형 및 CHM1 iPSc 양자 모두로부터의 iPSc-유래 상피가 진정한 것이고 기능적 RPE이라는 것을 확인하여 주었다.
생화학적 결손 검출
각각의 CHM1으로부터의 iPSc-유래 RPE가 환자의 생화학적 결함을 재생할 수 있는지 결정하기 위하여, 세포내 Rabs의 프레닐화 상태 및 REP1의 활성 반영을 분석하기 위한 2 가지 상이한 기법을 구축하였다. 첫째, 시험관내 프레닐화 분석을 이용하여 세포내 미프레닐화 Rab 풀의 크기를 분석하였다. 이를 위하여, 야생형 및 CHM1 세포의 용해물에 재조합 RGGT, REP1, 및 비오틴화 프레닐 공여자를 첨가하였다. 따라서, 미프레닐화 Rab 풀이 프레닐화에 이용가능하면, 포함된 비오틴이 HRP-컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 이용한 웨스턴 블롯 분석으로 검출가능할 수 있다. 비오틴화 Rabs에 대응하는 검출된 밴드는 β-액틴 로딩 대조군에 따라 표준화되었고, CHM1 RPE에서 검출된 프레닐화된 Rab 풀은 100%로 설정하여 상대적 비교가 가능하게 하였다. 평균적으로, ~4-배 낮은 비오틴화 Rab 단백질 수준이 야생형 RPE에서 검출되었는데, 이는 REP1 및 REP2의 존재하에서 대부분의 Rabs가 프레닐화되고 막-결합된다는 사실과 일치하였다. 둘째, 망막에서 크게 발현되는 Rab 단백질인 (Seabra et al, 1995), Rab27A의 세포 하위 분포를 구체적으로 분석하였다. 차등적 원심분리로, 야생형 및 CHM1 세포 용해물의 세포질 및 막 분획을 분리하였고, 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석으로 각각의 Rab27A 함량을 분석하였다. 프레닐화 분석에서와 같이, 각 분획의 Rab27A의 양은 베타-액틴 로딩 대조군에 따라서 표준화되었다. 뒤이어, 각 세포 용해물 중의 총 Rab27A의 양 (세포질 + 막)을 100%로 설정하고 각 분획의 양을 총 Rab27A 함량의 백분율로 표시하였다. 야생형 세포에서, 세포질 Rab27A의 양은 막 결합된 양보다 평균 ~4.7-배 낮았다. 반대로, CHM1 RPE에서는, 세포질 Rab27A의 양은 야생형 세포에서 관찰된 것보다 평균 ~2-배 높았고, 막-결합된 양보다 ~1.8-배 낮았다.
따라서, 결론적으로, CHM1 RPE 세포는 CHM 환자에서 보여지는 생화학적 차이, 즉 REP1의 부재로 인한 Rab 단백질의 프레닐화 저하를 모방하였다.
형질도입 RPE
iPSc-유래 RPE를 AAV 벡터로 형질도입할 수 있는지를 결정하고 가장 효율적인 혈청형을 확인하기 위하여, CMV 프로모터의 제어하에서 EGFP를 발현하는 일련의 벡터를 시험하였다: AAV2/2, -2/4, -2/5, -2/8 및 -2/9. 우선, EGFP 발현으로 결정되는 바와 같이 모든 혈청형이 iPSc-유래 RPE를 형질도입시킬 수 있었고 형질도입의 효율은 사용량-의존적이었다. 둘째, 동일한 양의 바이러스 게놈의 경우, 각각 혈청형의 효율은 2/5>2/2>2/4>2/8/>2/9 (도 1a)였다. 괄목하게, 평균적으로 AAV2/5 벡터 발현은 AAV2/2의 발현보다 1.5배 높았고 (1.45 ± 0.26, n = 5) 이는 AAV2/8 및 2/9 둘 모두보다 대략 6배 높았다. 이들 4개의 혈청형의 사용량-의존적 효과를 알아보기 위하여, 세포당 바이러스 게놈의 수를 100 000까지 증가시켰다. AAV2/5의 형질도입 효율이 EGFP 양성인 세포 55% 에서 80%로 증가하였음에도, AAV2/2 및 AAV2/8 또는 2/9의 형질도입 효율은 각각 대략 1.5배 및 6배 낮게 유지되었다 (도 1b). 또한, 가장 효과적인 혈청형 (AAV2/5)을 이용하여 두 가지 상이한 프로모터의 효율을 비교하였다: CMV 대 CAG (CMV 인핸서를 갖는 닭의 베타-액틴). 평균적으로, CAG은 CMV보다 2배 높은 발현 수준을 이끌었다 (2.04 ± 0.21, n = 5; 도 1a). 셋째, 시간-코스 실험은 형질도입 4주 후 발현이 정점에 이른다는 것을 시사하였다 (도 1c). 마지막으로, iPSc-유래 RPE의 유전자형 (즉, 야생형 대 CHM)은 형질도입 효율에 아무런 영향을 주지 않았다 (도 1d).
종합하면, 이들 결과는 AAV2/5 벡터가, 다른 혈청형, 특히 AAV2/2 및 AAV2/8보다 인간의 iPSc-유래 RPE를 더욱 잘 형질도입시킨다는 것을 입증하였다.
AAV2 /5- CAG - CHM -지시의 REP1 발현
따라서, 본 발명의 발명자들은 CAG 프로모터의 제어하에서 CHM을 발현하는 AAV2/5 벡터를 생성시켰다. AAV2/5-CAG-CHM로 형질도입된 CHM1 섬유아세포에 대한 IF 연구는 인코딩된 REP1이 발현되어 세포질에서 주로 액포를 염색시키면서 정확히 위치한다는 것을 확인하였다 (도 2a-c). 뒤이어 베타-액틴 수준에 대하여 표준화된 REP1 발현의 세미-정량이 수행되는 형질도입된 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석은 (도 2d) REP1 발현이 야생형의 ~17%와 균등하다는 것을 나타냈다. 병행하여, 웨스턴 블롯 결과에 따라, 본 발명의 발명자들은 섬유아세포를 AAV2/5-CAG-EGFP로 형질도입시키고 유세포 분석으로 14%의 EGFP-양성 세포를 검출하였다. 이와 일치하게, 웨스턴 블롯 (도 2e) 및 세미-정량이 뒤따르는 AAV2/5-CAG-CHM을 이용하는 RPE의 초기 형질도입 실험은 REP1 발현이 40%의 EGFP-양성 세포로, 야생형의 53%와 균등하였음을 보여주었다 (AAV2/5-CAG-CHM 형질도입된 RPE 세포의 유세포 분석으로 결정).
CHM 유전자 전이
그 후, CHM1 RPE를 AAV2/5-CAG-CHM 벡터로 형질도입하고, 시간-코스 실험의 결과에 기초하여 형질도입 4주 후 REP1 활성을 분석하였다. 대표적인 실험을 도 3a에 나타내었다. 전술한 바, 프레닐화 실험에서, 검출된 비오틴화 Rabs의 풀을 100%로 설정하였다. CHM1 RPE를 AAV2/5-CAG-CHM 벡터로 형질도입한 후, 비오틴화된 Rab 단백질의 양에 4.5배 감소가 있었는데, 이는 야생형 RPE에서의 수준과 균등하였다 (도 3c). 유사하게, AAV2/5-CAG-CHM 형질도입 후 Rab27A의 세포 하부 분포에 대한 분석은 (도 3b), 비-형질도입된 RPE에 비해 Rab27A의 세포질 분획이 2.4배 감소하고, 막-결합 분획이 1.3배 증가한다는 것을 보여주었는데, 이는 야생형 RPE의 수준과 균등한 것이었다 (도 3d). 게다가, CHM1 RPE의 대조군 AAV2/5-CAG-EGFP 벡터를 이용한 형질도입은 각 분획에서 Rab27A의 비율을 크게 변경시키지 않았다.
결론적으로, 본 발명의 발명자들은 AAV2/5-매개 CHM 유전자 전이는 CHM 환자의 RPE에서 정상적인 세포 표현형을 복구한다는 것을 개념 입증하였다.
생체내 유전자 전이
이들 시험관내 연구를 보완하기 위하여, 마우스의 눈에 PBS, AAV2/5-CAG-EGFP 또는 AAV2/5-CAG-CHM를 주입하고, 발현을 분석하였다. 주입 3일만에, EGFP 발현은 AAV-CAG-EGFP로 주입된 마우스의 기저부에서 살짝 인지되었다. 주입 2주 후 망막 추출물에 대하여 수행된 Q-PCR 연구는 AAV2/5-CAG-CHM-주입 마우스의 망막 추출물에서의 인간 CHM의 특이적 발현 및 CAV2/5-CAG-EGFP-주입 눈에서 EGFP의 발현을 보여주었다 (도 4a). 동일한 시간점에서의 웨스턴 블롯 분석은 단백질 수준에서 이러한 특이적 발현을 확인해 주었다 (도 4b). 본 발명의 발명자들은 주입 1주, 2주 (도 4c) 및 1월 후에 안저검사로 EGFP 발현 진전을 추적하였고, 넓게 퍼진 형질도입을 검출하였는데, 이는 안정적으로 보였다. 형광 현미경은 시신경까지 망막의 절반에의 형질도입을 확인하였고, EGFP 발현은 RPE 및 광수용체 모두에서 검출되었다 (도 4d).
결론적으로, 마우스 망막에서 생체내 AAV2/5-매개 유전자 전이는 RPE 및 광수용체 양자 모두에서 유전자 발현을 결과하였다.
논의
줄기세포는 그들이 이론적으로 체내에서 어떠한 세포 유형으로도 발생할 수 있는 다능성 세포의 불멸 전파를 대표하기 때문에 인간 세포 배양 분야의 혁명을 이루었다 (Yu & Thomson, 2008). 특히 유도된 다능성 줄기세포 (iPSc)는 그들이 성인의 체세포로부터 생성될 수 있기 때문에 특출한 수단을 대표하고 (Takahashi et al, 2007; Yu et al, 2007) 따라서 인간 배야 줄기 (ES) 세포의 사용과 관련된 윤리적 고려를 피해갈 수 있다. 또한, 줄기세포는 이론적으로 체내 임의의 세포 유형으로 분화할 수 있기 때문에, 이들은 전통적인 기법으로 분리될 수 없었던 1차 세포 유형에 대한 접근을 가능하게 한다 (Grimm, 2004). 게다가, 특정 유전적 질환을 갖는 개체로부터 유래한 출발 물질이라면, 표적 세포 유형은 그 후 질환-특이적 세포 모델을 대표할 수 있다 (Park et al, 2008).
본 발명의 발명자들은 그를 이용하여 유전자 치료에 대한 개념의 증거를 제공할 수 있었던, 질환-특이적 망막 색소 상피 (RPE) 모델을 생성하는 iPSc 기법을 이용하였다. 이는, 이러한 전략의 최초 의 예시이다. 일반적으로, iPSc-유래 세포 모델은 질환의 병생리를 더욱 이해하기 위하여 (Singh et al, 2013), 약리학적 약물의 효율을 스크리닝하기 위하여 (Egawa et al, 2012), 또는 세포 이식의 관점에서 세포 전구체를 생성하기 위하여 (Tucker et al, 2011) 이용된다. 본 발명의 발명자들은 본 발명에서 해당하는 치료적 시도에서 표적될 세포 유형의 유전자 교체 전략의 효율을 시험하기 위한 iPSc-유래 모델의 추가적인 가능성을 보여준다.
AAV 벡터는 현재 망막 유전자 치료에 안전하고 효율적인 것으로 널리 받아들여진다. 확인된 다양한 AAV 혈청형들 중에서, AAV2/2, -2/4, -2/5, -2/8 및 -2/9 모두가 종에 따라 다양한 효율로 망막 세포 유형을 형질도입시킨다는 것이 밝혀졌다 (Vandenberghe & Auricchio, 2012). 이들 혈청형 5개 모두는 RPE를 형질도입시키지만, AAV2/4를 제외한 나머지만 광수용체를 형질도입시킨다 (Weber et al, 2003). 또한, 광수용체 형질도입과 관련하여, AAV2/5, -2/8 및 -2/9가 AAV2/2보다 더 큰 효율을 보인다는 것이 마우스와 돼지의 눈에서 밝혀졌다 (Allocca et al, 2007; Mussolino et al, 2011). 지금까지 인간에게서는, 2 가지 혈청형 AAV2/2 (Bainbridge et al, 2008; Hauswirth et al, 2008; Maguire et al, 2008) 및 -2/4 (미공개)가 시험되었고 누적 독성 결과는 이들 벡터가 인간의 눈에 안전하다는 것을 시사하지만, 가장 효율적인 벡터는 미정으로 남아있다.
본 발명의 발명자들은 iPSc-유래 인간의 RPE에서 전술한 AAV 혈청형들의 형질도입 효율을 분석하였다. 문헌과 일치하게, 동일한 프로모터에 대하여 AAV2/5가 AAV2/2보다 2배 높은 발현 수준을 결과하였다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 AAV2/8이, 예기치 않게 AAV2/2에서 관찰된 것보다 낮다는 것을 보였다. 처음에 본 발명의 발명자들은 이것이 우리가 사용했던 최초의 AAV2/8 스톡이 다른 혈청형들과 상이한 벡터 생산 플랫폼에 의하여 제조되었기 때문이라고 생각하였다. 따라서, 우리는 동일한 생산 플랫폼으로부터 두번째 스톡을 얻었으나 결과는 동일하였다. 게다가, 우리는 사용량-의존적 효과를 조사하였으나, AAV2/5는 인간의 RPE에서 AAV2/8보다 일관되게 더 효율적이었다. 또한, 상기 결과는 AAV2/9에 대하여도 유사하였다. 이것이 세포 표면 수용체의 차이 때문이라는 것이 가능한데, AAV2/5는 알파-2-3 N-결합 살리실산 중 하나와 결합하지만 AAV2/2, 2/8 및 2/9는 이 수용체를 사용하지 않기 때문이다 (검토를 위하여 (Agbandje-McKenna & Kleinschmidt, 2011) 참조). 우리가 인간 iPSc-유래 RPE 세포들이 기능적 생체내 RPE의 고전적인 성질을 특징으로 한다는 것을 밝혔기 때문에, 시험관 내에서 관찰되는 모든 사용량에서 AAV2/5의 AAV2/8 및 AAV2/9를 넘어서는 우수성은 생체내에서도 적용되어야 한다. 따라서, 인간의 RPE에서, 적은 사용량의 AAV2/5 바이러스 벡터는 다른 혈청형들에 비하여 우수한 형질도입을 제공할 것이고, 이는 중요한 안전상 의미를 갖는다.
우리는 RPE의 AAV2/5 형질도입이 사용량-의존적이라는 것을 밝혔고, CMV 프로모터와는 반대로 CAG 프로모터를 사용하여 형질도입 효율이 더욱 증가될 수 있다는 것을 밝혔다. 우리는 형질도입 효율 85%까지 달성하였는데, 이는 시험관내 형질도입용으로 AAV 벡터를 사용하는 악명높은 어려움을 고려한다면 놀라운 것이었다. 형질도입은 RPE의 식균작용 성질에 의하여 도움을 받을 것 같은데, 이것은 눈에서 그 핵심적인 역할이다 (Sparrow et al, 2010). 생체내에서, 광수용체는 끊임없이 그들의 외곽 분절 디스크를 새로이 하고, RPE-면에서 매일 과거의 분절을 제거한다. RPE는 상기 제거된 디스크의 식균 작용을 책임지는데, 그들이 축적되면 독성일 수 있다. 따라서, iPSc-유래 RPE의 식균 능력은 망막 하부 공간으로 투여된 AAV 벡터가 맞닥뜨릴 상황을 모당하고 이러한 모델의 특출한 가능성을 더욱 강조한다. 생체내에서, 광수용체는 끊임없이 그들의 외곽 분절 디스크를 꼭대기 면에서 재생하고 따라서 그 바닥에서 과거의 분절을 매일 제거한다. RPE는 상기 제거되는 디스크의 식균 작용을 책임지는데, 이들이 축적되면 독성일 수 있다. 이러한 성질은 또한 모든 종에서 AAV를 이용하는 광수용체의 그것과 비교하여 RPE의 더 높은 형질도입 효율을 성명할 수 있다 (Vandenberghe et al, 2011). 마지막으로, 일단, RPE가 배양시 컨플루언지에 이르면, 세포 분열이 멈추고, 따라서 AAV 벡터는 시간에 따라 손실되지 않으므로 장시간에 걸친 전이유전자 발현 추적이 가능하게 만든다.
AAV2/5-매개 유전자 전이 접근법의 효율을 시험하기 위하여 인간의 RPE 세포 모델을 사용할 수 있는지를 결정하기 위하여, 우리는 범맥락막 위축을 갖는 개체의 섬유아세포로부터 iPSc-유래 RPE를 생성하였다. 범맥락막 위축은 RPE의 분해가 그 병생리에서 핵심 역할을 하는 망막 이영양증이다 (Krock et al, 2007; Tolmachova et al, 2010). 또한, 이는 iPSc-유래 접근법의 완벽한 후보인데, 유전자 구조 연구에 대한 정보제공적인 질환-특이적 동물 모델이 존재하지 않기 때문이다 (Tolmachova et al, 2013; Tolmachova et al, 2012). 우리는 본 발명에서 범맥락막 위축-특이적 RPE가 특징적인 단백질을 발현하고, 기능적이며, 환자에게서 나타나는 생화학적 결함을 모방한다는 것을 보여주고 있다: 인코딩되는 단백질 REP1의 부재는 Rab 단백질의 프레닐화 저하를 결과하고, 괄목하게는 Rab27A의 프레닐화 저하를 결과하고, 막-결합 Rabs의 수를 감소시키고 세포질 풀의 증가를 유도한다. 이는, 그를 이용하여 기능의 회복을 평가할 정량적 판독을 제공하였다. 두 가지 독립적인 분석을 이용하여, 우리는 CHM 유전자 전이가 일반적으로 세포질 Rabs의 풀을 감소시킬 수 있다, 구체적으로 Rab27A를 감소시킬 수 있다는 것을 보였다. 이는 인간 RPE에서, AAV2/5-매개 CHM 유전자 전이가 정상적인 세포 표현형을 복구할 수 있다는 개념의 입증을 제공한다.
본 발명에서 설명된 작업은 적절한 동물 모델의 부재하에서 개념을 입증하는 연구를 위한 인간 질환-특이적 세포 모델을 이용할 가능성을 입증한다. 이는 비히클 그 자체는 (여러 가지 혈청형에도 불구하고) 망막을 표적으로 하는 임상 시험에서 이미 검증되었고, 따라서 시험관내 연구는 주로 전이유전자의 기능성을 평가하였다는 사실에 의하여 도움을 받았다. AAV-매개 망막 유전자 치료의 분야가 긍정적으로 진전을 계속한다면, 이러한 동일한 전략이 RPE가 영향을 미치는 다수의 IRDs에 적용될 수 있으며, 따라서 임상적 해석에 도움을 줄 것이다.
질환에 걸린 망막의 적절한 인간 세포 모델에 있어서 개념의 입증을 제공하는 우리의 접근법은 그 종류의 최초의 예시이고 <<전임상적>> 고려에 혁명이 되었다. 범맥락막 위축에 대한 표현형 연구의 조건화된 마우스 회복 모델을 이용하고 세포 모델 (CHM 섬유아세포 및 iPSc)에 대하여 기본적인 개념의 증거를 제공하는 것에 대한 어려움을 확인하여 주는 2개의 논문이 간행되었다 (Tolmachova et al, 2013; Vasireddy et al, 2013). 본 발명에서, 우리는 한 걸음 나아가 영향을 받는 기본적인 세포 유형인 RPE 세포에서 개념에 대한 입증을 제공하여, 따라서 질환 발병에 관여하지 않는 세포 유형으로부터의 외삽을 피하였다. 또한, 전술한 이들 논문은 AAV2/2-매개 CHM 유전자 치료의 효율을 평가하였는데, 우리가 보여준 그 효율은 인간 RPE에서 AAV2/5보다 덜 효율적이었다.
결론적으로, 이들 결과는 우리가 CAG 프로모터의 제어하에서 CHM 유전자를 전달하기 위하여 사용한 AAV2/5 벡터가 AAV2/2, AAV2/4, AAV2/8 및 AAV2/9 벡터보다 범맥락막 위축을 갖는 환자들의 인간 RPE 세포에 대한 유전자 치료용으로 더 훌륭한 벡타라는 것에 대한 최초의 입증을 제공한다.
참고:
본 출원을 통하여, 다양한 참고 문헌들이 본 발명이 속하는 기술 상태를 설명한다. 이들 참고 문헌의 개시 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> INSERM <120> METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR EXPRESSING A POLYNUCLEOTIDE OF INTEREST IN THE RETINAL PIGMENT EPITHELIUM OF A SUBJECT <130> CV - 636/PCT <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 ttcatctcct ttttgtgggg 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 ctggaaacat cctgtgttca tc 22 <210> 3 <211> 7 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tagttct 7 <210> 4 <211> 4 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gatt 4 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gtcatgcatt caatt 15 <210> 6 <211> 653 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Asp Thr Leu Pro Ser Glu Phe Asp Val Ile Val Ile Gly Thr 1 5 10 15 Gly Leu Pro Glu Ser Ile Ile Ala Ala Ala Cys Ser Arg Ser Gly Arg 20 25 30 Arg Val Leu His Val Asp Ser Arg Ser Tyr Tyr Gly Gly Asn Trp Ala 35 40 45 Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Leu Ser Trp Leu Lys Glu Tyr Gln Glu 50 55 60 Asn Ser Asp Ile Val Ser Asp Ser Pro Val 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Cys Ser Ser Thr 485 490 495 Met Thr Cys Met Lys Gly Thr Tyr Leu Val His Leu Thr Cys Thr Ser 500 505 510 Ser Lys Thr Ala Arg Glu Asp Leu Glu Ser Val Val Gln Lys Leu Phe 515 520 525 Val Pro Tyr Thr Glu Met Glu Ile Glu Asn Glu Gln Val Glu Lys Pro 530 535 540 Arg Ile Leu Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Met Arg Asp Ser Ser Asp Ile 545 550 555 560 Ser Arg Ser Cys Tyr Asn Asp Leu Pro Ser Asn Val Tyr Val Cys Ser 565 570 575 Gly Pro Asp Cys Gly Leu Gly Asn Asp Asn Ala Val Lys Gln Ala Glu 580 585 590 Thr Leu Phe Gln Glu Ile Cys Pro Asn Glu Asp Phe Cys Pro Pro Pro 595 600 605 Pro Asn Pro Glu Asp Ile Ile Leu Asp Gly Asp Ser Leu Gln Pro Glu 610 615 620 Ala Ser Glu Ser Ser Ala Ile Pro Glu Ala Asn Ser Glu Thr Phe Lys 625 630 635 640 Glu Ser Thr Asn Leu Gly Asn Leu Glu Glu Ser Ser Glu 645 650 <210> 7 <211> 5442 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 taatagtcac atgacacgtt tcccgtcaag atggcggata ctctcccttc ggagtttgat 60 gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt 120 ggccggagag ttctgcatgt 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tatgaatatt taaagactca aaaattaacc 1020 cccaacctcc aatatattgt catgcattca attgcaatga catcagagac agccagcagc 1080 accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac 1140 actccatttt tgtttccttt atatggccaa ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg 1200 tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac 1260 aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata gatcagtttg gtcagagaat aatctctgag 1320 catttcctcg tggaggacag ttactttcct gagaacatgt gctcacgtgt gcaatacagg 1380 cagatctcca gggcagtgct gattacagat agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa 1440 cagatttcca ttttgacagt gccagcagag gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt 1500 gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg aaaggcacct atttggttca tttgacttgc 1560 acatcttcta aaacagcaag agaagattta gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca 1620 tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt 1680 tacttcaata tgagagattc gtcagacatc agcaggagct gttataatga tttaccatcc 1740 aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag 1800 gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat 1860 cctgaagaca ttatccttga tggagacagt ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc 1920 ataccagagg ctaactcgga gactttcaag gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag 1980 tcctctgaat aatggatata caccaaactg gatacccaac tttggaaatt ctgactggtc 2040 tcagagtcta cttgatagaa ggactgtttg agaaatgtta gaaagcagca gcaattataa 2100 ggcaaaatag gtaatagaaa tccaaaaggg gattttcctt atagaggaca ttccaagaac 2160 acacaacact tataaagcac attgacttgc tcattttaaa taccaaactt gtgtgactag 2220 cagatgaaaa ttataaatca attgattctc aggaatgtaa ctgtggatat gaaagtgatc 2280 ctatgcattg ttaataattc catggtctta ggacaatttt gcttaccact ttggatcttt 2340 gtttgaaagc cacattttca gaaccagctc atgtattttc tttggttatt tgaattttat 2400 tttctttatg gacaagagca tcataacata atgataaaaa catatagaaa aactaaagta 2460 tcatgatcta gatagaagcc tgtatttgga atacaggttt gttttgcttt ctatgttgag 2520 aagcattgaa aatgctaata taaaggtgtt tagacatttt tacgaataag tcagtagtgt 2580 tttttagtat cagtagtgat atttgtttgt aaattattta catattggga aaggtcaata 2640 atgaagaaat gaaagaatgg aaggaaaggt gtggataggc tcattggtat ttgaatattc 2700 tgtctgtcaa gtaactagag tattaggcta attgtctaca gacctaattt aatcctggct 2760 gtcctactga tgatatttgg taaattgttt aacttctgag cctacgtttc tccatatata 2820 aagtggaaat agtattacta tgcctactat atgagaatgg ttatgaagac aatgcaatgc 2880 catgtttaga atcggtttgc cagaagaaaa ttgttttaga attttcccat tgacttgatg 2940 aatctcaaaa gtctcacgca ggaaataatt gcttgctgtc agtcaacttc caaacaaaat 3000 agatcacagt gtttttattg cattaagctt tttaaatgaa aatttctttt ttaaagtagt 3060 attttatagt cttacagacc agtaaaaata gtaacaagta gaattgtggt tttgaaatat 3120 tactaaggaa aacactctat aaattgtttt attccttttc tggtaggtaa acctgcaacc 3180 accaaggact ccaaattgtg tatgacagtt ggtaagccct aatatacact acataaaaac 3240 gttagggctg cctgtaatcc cagcactttg ggaagctgag gtgggtagat cacttgaggt 3300 caggagttcg agaccagcct ggccaacatg gcgaaaccct gtctctacta aaaatacaaa 3360 attttagctg ggtgttatgg tgggcacctg taatcccagc tactttgaag atgaggtagc 3420 agactcactt gaaccaggga ggcggaggtt gcagtgagcc aagattttgc cactgcactc 3480 cagcctgggt gacagagcaa gactctgtct cacaaaaaaa aaaaaagggg gctgtacata 3540 ggcagcaaac taagctgcag tgatgttgcc tatatttaaa ttttctcaaa tggccaagct 3600 ctgatggtct actttatttg agcaatagtt gagacttata attgcctata aataaacaaa 3660 caaatgaact atttgttttt ttttctcaca acatctggcc tatattgtct gtcaggaagc 3720 catggctcca atgtaaagta catagttctt acatacttca actgcagctg gtccctgacc 3780 tcaccaggtt tcagagatgt tcttaaagga agccagctgt ggcaggtcac agattcatgg 3840 gaaatggaaa gaaccaagga atatagctct tgcctcacct ttctacccac tgcagatata 3900 gttcaagcca gagtaatgga agaacttaac ttactagcct ctcaggctgc tcctatccct 3960 acctcccagt gtacagcccc tccccatctc tttagtcccc tttccctcac ttcccctttt 4020 ataatgtcac acaaatcagg gacagtagga tcacattata acctactttg tcatagggat 4080 tcgatttttc ttatatcaaa tcatgtttcc tgaaacccag ctggggcata tgcactcaat 4140 gtctaataca tacttattaa tgtaccggat attggccttg cccctggata tcagcaatat 4200 attataaaag gttccagtag atgagacgat tgagtctgaa tacaattgca gtaaattgtg 4260 ccaataaaga tattgtactg ttacggtctt agagttaaag ccgcttgaat gcagcatgca 4320 cattcatgta aacagacaat cagggtaggc ctagaataac cacaaaaatt ctattggcct 4380 tactgcagcc acctatatgt agaacaatgg aggagatagt ttgtggtcca ttattgtacc 4440 ctgtttcatc cattagcatc agaatctctc tttcaggtca tttattaaat atgattgaaa 4500 tgtttaaaag ttcctgaaca tgattcatga tgattaaaat atcatacaac tgataaaaga 4560 ctttaagaac tttatatatt tcctgttgcc tcaaaatgta acagaaatta ttcttagagc 4620 tttgatttta gctatcctaa ttactgcaaa taaatatttg ttcttatagt tttaaatcaa 4680 aaagaaaagt cttgttataa aaccttaagc ttgaaatcat attaataaaa tatattgtac 4740 atagtggaaa attttcagta gctaatttaa aatttcagaa aatgctatta aagaattttg 4800 attcaagtat ttaaactgtt tagttatgca tgcttcttat taaccgaaaa tgataatacc 4860 atttagttta gtgatcagta tgagaagcaa tacctaatcc tatgttgcta ttgtattttt 4920 tcctagttgg tgtgcctgct cagaaaaaca tatactgtat gtgtatacat acctgtgtat 4980 atataaaagg tcaatttata tatttttcta taggaaaatg gagtaacaag ttccctatct 5040 cccatattta tttgtccata gtaaaatggc cacattgatg ataatttcta gaactagttt 5100 ctgagattgt cagccctttg tctaaaataa tggcagtatt aatgattgac ttctgtcact 5160 gccatagtta cctggattgt cagccttggt agcctttgtc taaagtccta aagagttcca 5220 aaaaaaatgt gttgaaattt aattgctaaa tagtggttgg tgattcttta cagtaggaat 5280 tgtaataatt ttcttgcaaa taagttattt actgctattg atattgaata atttgtcttt 5340 tattcagata tatttcaaaa agcatgaata tatgattatt cataaattgt atactttacc 5400 agtaagtttt cagaggaaat aaagactttt aaatcctttt ca 5442

Claims (11)

  1. REP1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV2/5 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 CAG 프로모터의 제어하인 것인 rAAV2/5 벡터.
  3. 제1항에 기재된 rAAV2/5 벡터의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써, 그를 필요로 하는 상기 대상체의 범맥락막 위축을 치료하는 방법.
  4. 목적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV2/5 벡터 일정량으로 망막 색소 상피를 형질도입시킴으로써, 그를 필요로 하는 대상체의 눈의 상기 망막 색소 상피에 상기 목적 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 발현시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 rAAV2/5는 CAG 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 대상체는 유전적 또는 비유전적 망막 변성, 망막 이영양증, 색소성 망막염, 황반 변성, 레버 선천적 흑암시 (LCA), 콘-로드 이영양증, 눈의 신생혈관 질환, 맥락막 변성, 맥락막 경화증, 당뇨성 망막변성, 증식성 유리체 망막병증, 범맥락막 위축, 녹내장 및 대사 장애, 예컨대 슬라이 증후군 (MPS VII) 및 망막 위축 (gyrate atrophy), 망막 박리 또는 외상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 망막 색소 상피에 영향을 미치는 망막 질환에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 목적 폴리뉴클레오티드는 유전자 교체 치료용으로 사용되고, RGR (망막 색소 변성증, RP, 염색체 (chr.) 10), RDH5 (흰점 망막 병증, chr. 12), RPE65 (레버 선천성 흑암시, LCA, chr. 1), RLBP1 (RP, chr. 15), MERTK (RP, chr. 2), LRAT (RP, chr. 4), REP1 (범맥락막 위축, Xp21), RBP4 (RPE 변성, chr.10) 또는 다른 세포 유형에서도 발현되는 유전자, 예컨대 MYO7A (어셔 증후군 유형 1, chr. 11), ELOVL4 (황반 변성, chr. 6), EFEMP1 (말라티아 레벤티니즈 질환 (Malattia Leventinese disease), chr. 15), BEST1 (베스트 병, chr. 11), TIMP3 (소스비 안저 이영양증, chr. 22), AIPL1 (LCA, chr. 7), 및 CRB1 (RP, chr. 1)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 목적 폴리뉴클레오티드는 REP1을 인코딩하는 것인 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 목적 폴리뉴클레오티드는 신경영양 인자를 인코딩하는 것인 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 목적 폴리뉴클레오티드 산물은 유전자 기능의 위치-특이적 넉-다운을 제공하는 위치-특이적 엔도뉴클리아제인 것인 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 목적 폴리뉴클레오티드 산물은 간섭 RNA (RNAi)인 것인 방법.
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