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KR20160124086A - 항-vista 항체 및 단편 - Google Patents

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KR20160124086A
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잔센파마슈티카엔.브이.
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Abstract

본 발명은 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 신규한 항체 및 단편, 및 이를 제조하고 이용하는 방법에 관한 것이다. 이용 방법은 백혈병, 림프종, 고형 종양 및 흑색종을 포함하는 암의 치료 방법을 포함한다.

Description

항-VISTA 항체 및 단편{ANTI-VISTA ANTIBODIES AND FRAGMENTS}
관련 출원(들)
본 출원은 2013년 12월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 61/920,695호 및 2014년 11월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 62/085,086호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시내용은 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 배경
종양 미세환경에서의 암세포 또는 면역 세포에 의한 음성 면역 관문 조절인자의 발현은 종양에 대한 숙주의 면역 반응을 억제할 수 있다. 암에 효과적으로 대항하기 위해, 숙주 면역 반응의 종양-매개 억제를 차단하는 것이 바람직하다. 따라서, 항-종양 면역 반응을 억제하는 종양 미세환경에서의 음성 면역 관문 조절인자를 억제하는 새롭고 효과적인 치료제가 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 및 항체 단편에 관한 것이다. VISTA는 면역 반응을 음성적으로 억제하는 관문 조절인자이다. 문헌[Wang et al., "VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses," J. Exp. Med ., 208(3) 577-92 (2011)]을 참조하라. 이는 정상 인간 호중구, 단핵구 및 T 세포 서브셋에서 발현된다. 또한, 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이 세포는 정상 인간 세포와 유사한 패턴으로 VISTA를 발현한다. VISTA는 또한 암 환자의 말초 혈액 세포에서 발현된다.
VISTA로의 항체 또는 항체 단편의 결합은 면역 반응을 조절하거나, 향상시킨다. 항체 단편은, 예를 들어, Fab, F(ab')2, 또는 scFv 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 조혈 세포, 예를 들어, 골수 세포 및/또는 림프구, 단핵구 또는 호중구, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 종양 세포, 및/또는 종양 미세환경(TME)에서 발현되는 VISTA에 결합할 수 있다. 종양 미세환경은 종양의 세포 환경이다.　이는 주위 면역 세포, 섬유모세포, 혈관, 다른 세포, 신호전달 분자, 및 세포외 기질을 포함할 수 있다.
항체 또는 항체 단편은 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 지정된 항체를 포함하는 본원에 기재된 항-VISTA 항체 중 임의의 항체의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 중쇄 CDR, 3개 모두의 경쇄 CDR, 또는 6개 모두의 CDR)을 포함하는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이의 단편은 VSTB112, VSTB95, VSTB116, VSTB50, VSTB53 및 VSTB60으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 항체 또는 단편은 본원에 기재된 항-VISTA 항체 중 임의의 항체의 하나 이상의 중쇄 CDR 및 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 항-VISTA 항체 중 임의의 항체의 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 적어도 하나의 중쇄, 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 적어도 하나의 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 전체 항체이다. 일부 구체예에서, 단편은 항-VISTA 결합 일원이다. 일부 구체예에서, 항체의 중쇄 CDR은 SEQ ID NO:1, 2, 및 3에 기재되어 있고, 경쇄 CDR은 SEQ ID NO:4, 5, 및 6에 기재되어 있다. 일부 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:7 및 8에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체와 실질적으로 유사한 항-VISTA 항체를 포함한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 항체 또는 단편은 SEQ ID NO:1과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, SEQ ID NO:2와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:3과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO:4와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, SEQ ID NO:5와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 및 SEQ ID NO:6과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항-VISTA 항체를 경쟁적으로 억제하거나, 본원에 기재된 항-VISTA 항체로의 결합에 대해 경쟁하는 항-VISTA 항체에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 항-VISTA 항체는 컨쥬게이트, 예를 들어, 세포독성 분자 또는 본원에 기재된 또 다른 작용제를 포함하는 컨쥬게이트의 일부이다. 상기 분자는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 모노클로날 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO:9 내의 VISTA의 에피토프에 특이적이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 적어도 1x10-7 리터/몰, 예를 들어, 적어도 1x10-8 리터/몰, 예를 들어, 적어도 1x10-9 리터/몰의 친화성으로 VISTA의 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, 면역 반응의 조절은 CD45+ 백혈구, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포에서의 증가를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 반응의 조절은 (예를 들어, T-세포) 사이토카인(예를 들어, IFNγ, IL-10, TNFα, IL-17)의 향상된 생성, 향상된 T-세포 반응, 및/또는 조절된 Foxp3 발현을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항-VISTA 항체) 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 조성물은 VISTA에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편, 및 백신(예를 들어, 바이러스 벡터 백신, 박테리아 백신, DNA 백신, RNA 백신, 펩티드 백신)을 포함하는 VISTA 길항제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 약학적 조성물이며, VISTA로의 항체 또는 항체 단편의 결합은 면역 반응을 조절하거나 향상시킨다.
본 발명은 또한 유효량의 본원에 기재된 적어도 하나의 항체, 항체 단편, 또는 조성물을 암을 치료하거나 예방할 필요가 있는 개체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 비인간 동물)에 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 VISTA에 결합함으로써 암에 대한 면역원성 반응을 조절하거나 향상시킨다. 일부 구체예에서, 암은 백혈병, 림프종, 골수형성이상 증후군 및/또는 골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 임의의 종류 또는 유형의 백혈병, 예를 들어, 림프구성 백혈병 또는 골수성 백혈병, 예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 골수성(골수성) 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 털모양 세포 백혈병, T-세포 전림프구성 백혈병, 거대 과립 림프구성 백혈병, 또는 성인 T-세포 백혈병일 수 있다. 일부 구체예에서, 림프종은 조직구성 림프종이고, 일부 구체예에서, 암은 다발골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 고형 종양, 예를 들어, 흑색종, 또는 방광암이다. 일부 구체예에서, 암은 폐암(예를 들어, 비소세포폐암종(NSCLC))이다. 일부 치료 방법은 백신(예를 들어, 바이러스 벡터 백신, 박테리아 백신, 세포-기반 백신, DNA 백신, RNA 백신, 펩티드 백신, 또는 단백질 백신)을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 효과적인 항체 또는 항체 단편 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 종양 성장을 억제할 필요가 있는 개체에서 종양 성장을 억제하기 위한 방법에 관한 것이다.
조성물, 항체 또는 단편 또는 다른 약학적 작용제(예를 들어, 백신)은 임의의 비경구 또는 비-비경구 수단, 예를 들어, 정맥내(IV), 피하(SQ) 또는 경구(PO) 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물, 항체 또는 단편은 1년에 4회, 매주, 2주에 1회, 3주에 1회, 또는 4주에 1회 투여된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 항체, 단편 및 조성물 전, 동안 또는 후에 다른 약학적 또는 치료 작용제가 공동 투여된다. 공동 투여되는 작용제는 항체, 단편 또는 조성물과 동일한 경로, 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 항체의 생성을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체, 단편 및 조성물을 제조하는 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 항체 또는 단편을 생성시키는 방법을 포함한다. 상기 방법은 항체를 분리시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 항체 및 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 예를 들어, 분리된 핵산, 예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항-VISTA 항체를 포함하는 조성물 및 용기를 포함하고, 조성물이 암을 치료하기 위해 이용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물 또는 라벨을 추가로 포함하는 키트 및 제조 물품에 관한 것이다.
본 발명은 또한 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 분리된 항체 또는 이의 항체 단편을 제공하며, 항체는 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 및 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 인간화 또는 인간 프레임워크 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 SEQ ID NO:37을 포함하는 항체 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO:44를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 항체는 중쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 중쇄 불변 영역) 및/또는 경쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 경쇄 불변 영역, 예를 들어, SEQ ID NO:56에 제공된 경쇄 불변 영역)을 포함한다. 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역(예를 들어, SEQ ID NO:61에 제공된 IgG1 중쇄 불변 영역)이다. 특정 구체예에서, IgG1 중쇄 불변 영역은 항체의 프로테아제 내성을 향상시키도록 변형되었다. 프로테아제 내성을 향상시키도록 변형된 IgG1 중쇄 불변 영역의 예는 SEQ ID NO:60에 제공된 IgG1 중쇄 불변 영역이다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 SEQ ID NO:60을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:56을 포함하는 경쇄, 또는 SEQ ID NO:61을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:56을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 푸코실화 효소가 결핍된 세포(예를 들어, 푸코실화 효소가 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)에서 발현된다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 및 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편, 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 유효량의 항체 또는 항체 단편을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암을 치료할 필요가 있는 개체에서 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 항체는 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 및 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 암은 폐암이다. 추가 구체예에서, 폐암은 비소세포폐암종(NSCLC)이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 제2의 암 치료(예를 들어, 수술, 화학요법, 방사선 요법, 생물학적 요법, 면역조절 요법, 및 이들의 조합)를 제공하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편을 제공하며, 항체는 VISTA(예를 들어, 인간 VISTA) 내 입체형태 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 입체형태 에피토프는 인간 VISTA(SEQ ID NO:46)의 잔기 103-111(NLTLLDSGL(SEQ ID NO:62)) 및 136-146(VQTGKDAPSNC(SEQ ID NO:63))을 포함하거나 이들 내에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 입체형태 에피토프는 인간 VISTA(SEQ ID NO:46)의 잔기 24-36(LLGPVDKGHDVTF(SEQ ID NO:64)), 54-65(RRPIRDLTFQDL(SEQ ID NO:65) 및 100-102(TMR)를 포함하거나 이들 내에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 입체형태 에피토프는 인간 VISTA(SEQ ID NO:46)의 FG 루프 내의 아미노산 잔기를 포함한다.
또한, 본 발명은 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 VISTA에 결합하는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항체 단편을 개체에 투여함으로써 암에 대한 면역 반응을 향상시키는 것을 포함하는, 면역 반응을 향상시킬 필요가 있는 개체에서 면역 반응을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 면역 반응은 항종양 면역 반응이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 VISTA에 결합하는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항체 단편을 개체에 투여함으로써 암에 대한 면역 반응을 향상시키는 것을 포함하는, 생물학적 반응을 유도할 필요가 있는 개체에서 생물학적 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 생물학적 반응의 예는 단핵구의 활성화, T-세포 증식 및 사이토카인 분비의 유도, VISTA를 발현하는 세포의 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 및 VISTA를 발현하는 세포의 항체-의존성 세포 포식작용(ADCP)을 포함한다.
특허 또는 출원 파일은 색으로 제작된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 색 도면(들)을 갖는 상기 특허 또는 특허 출원의 카피는 요청시 필요한 요금의 지불과 함께 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1a-1c: 흐름세포측정법에 의해 VISTA 단백질의 TF1 AML 세포 발현에서의 VISTA 발현을 나타내는 그래프가 TF-1 AML 세포주에 제시된다.
도 2a-2e: 인간 골수 및 림프계 서브셋의 확인을 위한 염색 및 게이팅(gating) 전략을 나타내는 그래프.
도 3a-3g: 한 건강한 정상 공여자로부터의 인간 골수 및 림프계 서브셋에서의 VISTA의 발현을 나타내는 그래프.
도 4: 다수의 건강한 정상 공여자 전체에 걸친 인간 골수 및 림프계 서브셋에서의 VISTA의 발현을 나타내는 그래프.
도 5a-5b: 인간 단핵구 및 대식세포에서의 VISTA의 발현의 확인을 위한 염색 및 게이팅 전략을 나타내는 그래프.
도 6a-6c: 인간 단핵구 및 대식세포에서의 VISTA의 발현을 나타내는 그래프.
도 7a-7e: 인간 T 및 NK 세포 서브셋에서의 VISTA의 발현의 확인을 위한 염색 및 게이팅 전략을 나타내는 그래프.
도 8a-8g: 한 건강한 정상 공여자로부터의 인간 T 및 NK 세포 서브셋에서의 VISTA의 발현을 나타내는 그래프.
도 9: 다수의 건강한 정상 공여자 전체에 걸친 인간 T 및 NK 세포 서브셋에서의 VISTA의 발현을 나타내는 그래프.
도 10a-10d: 인간 수지상 세포 서브셋에서의 VISTA의 발현의 확인을 위한 염색 및 게이팅 전략을 나타내는 그래프.
도 11a-11c: 한 건강한 정상 공여자로부터의 인간 수지상 세포 서브셋 및 호염기구에서의 VISTA의 발현을 나타내는 그래프.
도 12: 다수의 건강한 정상 공여자 전체에 걸친 인간 수지상 세포 서브셋 및 호염기구에서의 VISTA의 발현을 나타내는 그래프.
도 13a-13d: 건강한 인간 말초 혈액 세포에서의 VISTA 발현의 분석. 다색 흐름세포측정 분석을 이용한 건강한 인간 말초 혈액 세포에서의 VISTA 발현의 프로파일: 2명의 상이한 개체로부터의 전체 혈액 샘플이 (도 13a) 단핵구 SSClo,CD11bhiCD14hiCD16-veCD33+veHLA-DR+veCD19-ve) (도 13B) 호중구(SSChiCD177+CD11bhiCD14loCD16+veCD33+veHLA-DR-veCD19-ve)에서의 VISTA 발현에 대해 분석되었다. 말초 혈액 단핵 세포가 (도 13c) CD4+ T 세포(CD3+ veCD4+ ve), 및 (도 13d) CD8+ T 세포(CD3+ veCD8+ ve)의 분석을 위해 피콜(Ficoll) 구배를 이용하여 분리되었다.
도 14a-14c: 폐암 환자 및 건강한 대조군 공여자로부터의 말초 혈액 세포에서의 VISTA 발현의 분석. 다색 흐름세포측정 분석을 이용한 폐암 환자 말초 혈액 세포에서의 VISTA 발현의 프로파일: 한 개체로부터의 대표적 FACS 플롯(도 14a)이 제시된다. 말초 혈액 단핵 세포가 피콜에 의해 분리되었고, (도 14b) 단핵구(CD14+ CD11b+ CD33+ HLADR+ CD15-) 및 (도 14c) 골수 유래 억제 세포(CD14- CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+)에서의 VISTA 발현에 대해 분석되었다.
도 15a-15c: 다색 흐름세포측정 분석을 이용한 결장암을 갖는 환자로부터의 말초 혈액 세포에서의 VISTA 발현의 프로파일: 한 개체로부터의 대표적 FACS 플롯(도 15a)이 제시된다. 말초 혈액 단핵 세포가 피콜에 의해 분리되었고, (도 15b) 단핵구(CD14+ CD11b+ CD33+ HLADR+ CD15-) 및 (도 15c) 골수 유래 억제 세포(CD14- CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+)에서의 VISTA 발현에 대해 분석되었다.
도 16a-16d: 다색 흐름세포측정 분석을 이용한 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 세포에서의 VISTA 발현의 프로파일: 4마리의 상이한 원숭이로부터의 전체 혈액이 (도 16a) 단핵구(SSCloCD11bhiCD14hiHLA-DRhiCD16- veCD19- ve 및 (도 16b) 호중구 CD11bhiCD14loHLA-DR-veCD16-veCD19-ve에서의 VISTA 발현에 대해 분석되었다. 3마리의 원숭이로부터의 말초 혈액 단핵 세포가 (도 16c) CD4+ T 세포(TCRα/β+ veCD4+ ve) 및 (도 16d) CD8+ T 세포(TCRα/β+ veCD8+ ve)의 분석을 위해 피콜 구배를 이용하여 분리되었다.
도 17: 헴 세포주에서의 VISTA RNA의 절대 발현 값을 나타내는 그래프.
도 18: 마우스 A20 세포가 GFP 또는 인간 VISTA로 안정적으로 트랜스펙션되었다. 이들은 ova 펩티드 및 DO11.10 T 세포와 함께 인큐베이션되었다. T 세포에 의한 CD25 발현이 인큐베이션 시작 24시간 후에 측정되었다. A20-huVISTA 세포는 T 세포에 의한 CD25 발현을 억제하나, 이러한 판독은 VSTB95와의 인큐베이션에 의해 유의하게 회복된다.
도 19a-19f: 인간 VISTA ELISA 결과를 나타내는 그래프.
도 20a-20f: 인간 VISTA를 발현하는 세포에 결합하는 항-VISTA 항체를 나타내는 인간 VISTA FACS 결과.
도 21a-21d: 30 ㎍/㎖로부터 0.0 ㎍/㎖로의 혼합된 림프구 반응에서의 6개의 항-VISTA 항체 후보의 희석 연구.
도 22a-22b: 30 ㎍/㎖로부터 0.0 ㎍/㎖로의 SEB 검정(개별적 CPM 카운트 및 IFN-g 농도)에서의 6개의 항-VISTA 항체 후보의 희석 연구.
도 23: Proteon SPR 칩 상에 코팅된 항-VISTA 항체 VSTB85 및 칩 상에서의 표시된 경쟁자(표 16에 나열된 경쟁자) 유동과 함께 VISTA 단백질을 이용한 센소그램(sensorgram) 플롯.
도 24: MB49 뮤린 방광 종양 모델에 대한 실험 계획.
도 25a-25b: 암컷 C57Bl/6 마우스에서의 MB49 종양 성장. 그래프는 항-마우스 VISTA 항체(도 25b) 또는 대조군 IgG(도 25a)로 처리된 개별적 마우스에서의 종양 성장을 예시한다.
도 26: 인간 VISTA의 아미노산 서열(SEQ ID NO:46).
도 27: VISTA 오쏠로그(orthologue)의 다중 서열 정렬.
도 28: HDX에 의해 결정된 바와 같은 VSTB50 및 VSTB60 항체(상부) 또는 VSTB95 및 VSTB112 항체(하부)에 의해 결합된 인간 VISTA의 영역.
도 29: VSTB112에 의해 결합된 VISTA 에피토프. (상부) VISTA는 표지된 가닥으로 도면에 제시된다. 복합체 내의 VSTB112의 5Å 내에 적어도 하나의 원자를 갖는 잔기가 청색으로 표시된다. 청색 및 오렌지색 구체는 사슬 중단을 강조하고, 청록색 및 녹색 구체는 각각 VISTA 구조의 N-말단 및 C-말단을 표시한다. (하부) 구조 결정에서 사용된 VISTA 작제물의 서열. 서열 아래의 원은 주쇄만 VSTB112와 접촉하도록 하는 잔기를 나타내기 위해 사용되며, 삼각형은 측쇄 접촉을 나타내고, 사각형은 측쇄 접촉이 PISA에 의해 계산되는 바와 같이 수소 결합 또는 염 브릿지 상호작용을 발생시키는 것을 나타낸다. 형태는 제공된 잔기에 의해 접촉된 원자의 가장 큰 수를 갖는 CDR을 나타내기 위해 색으로 표시되며, CDR 색은 도 59에 규정되어 있다. 이차 구조 요소는 프로그램 MOE에서 규정되는 바와 같고, 황색 화살표는 β-가닥을 나타내고, 적색 직사각형은 α-헬릭스를 나타낸다.
도 30: VSTB112 파라토프. (상부) VISTA 항원이 도해에 제시되고, VISTA의 5 옹스트롬(Å) 내의 VSTB112가 하기 서열에 특정된 바와 같이 CDR 정체를 표시하기 위해 사용되는 색으로 표면에 제시된다. CDR에 인접한 접촉 프레임워크 잔기는 VSTB112 Fv 영역의 해당 CDR(하부) 서열과 유사하게 색으로 표시된다. 색으로 표시된 백그라운드는 케이뱃(Kabat) 정의에 따라 CDR을 명시한다. 서열 아래의 원은 주쇄만 VISTA와 접촉하도록 하는 잔기를 나타내기 위해 사용되며, 삼각형은 측쇄 접촉을 나타내고, 사각형은 측쇄 접촉이 PISA에 의해 계산되는 바와 같이 수소 결합 또는 염 브릿지 상호작용을 발생시키는 것을 나타낸다.
도 31: 결정학 및 수소 중수소 교환(HDX)에 의해 확인된 에피토프 영역의 비교. 구조 결정에서 사용된 VISTA 작제물의 서열. 서열 아래의 원은 주쇄만 VSTB112와 접촉하도록 하는 잔기를 나타내기 위해 사용되며, 삼각형은 측쇄 접촉을 나타내고, 사각형은 측쇄 접촉이 PISA에 의해 계산되는 바와 같이 수소 결합 또는 염 브릿지 상호작용을 발생시키는 것을 나타낸다.
도 32: VSTB174(VSTB112로부터 유래됨)에 의한 전체 PBMC에서의 CD14+ 단핵구의 활성화. 실험의 각각의 부분에서, 세포는 1, 0.1 또는 0.01 ㎍/㎖의 PBS, IgG1 대조군 항체, 또는 VSTB174와 함께 인큐베이션되었다. 좌측 패널은 CD80 MFI를 나타내고, 우측 패널은 HLA-DR MFI를 나타낸다(대표적 결과가 제시된 2명의 공여자).
도 33: K562-VISTA 세포에 대해 특이적인 VSTB174의 ADCC 활성을 나타내는 그래프.
도 34: K562-VISTA 세포에 대해 특이적인 VSTB174의 ADCC 활성을 나타내는 그래프. 도시된 둘 모두의 항체는 동일한 Fab를 갖지만, VSTB174는 IgG1 Fc를 갖고, VSTB140은 Fc 침묵 IgG2를 갖는다.
도 35: K562-VISTA에 대한 VSTB174, VSTB149 또는 VSTB140 mAb에 의해 매개된 포식작용을 나타내는 그래프. 각각의 mAb는 0.0008 ㎍/㎖ 내지 0.56 ㎍/㎖ 범위의 7 반 로그 용량으로 시험되었다.
도 36: 골수종 세포주 K562 세포에 대한 VSTB174, VSTB149 또는 VSTB140 mAb에 의해 매개된 포식작용을 나타내는 그래프. 각각의 mAb는 0.0008 ㎍/㎖ 내지 0.56 ㎍/㎖ 범위의 7 반 로그 용량으로 시험되었다.
도 37: 암컷 VISTA-KI 마우스에서 VSTB123 1, 5, 7.5, 및 10 ㎎/㎏을 평가하는 MB49 종양 효능 연구. 종양 부피는 투여가 이식 6일 후에 시작한 경우에 약 50 mm3였다. VSTB123은 마우스 Fc 스캐폴드 상에 이식된 VSTB112 Fab이며, VISTA-KI 마우스에서 인간 VISTA에 결합한다.
도 38: 그래프는 높은/중간 수준의 VISTA를 발현하는 CD14+ 세포가 13/13 폐암 샘플 뿐만 아니라 환자의 원위의 폐 조직 및 말초 혈액에서 발견되는 것을 나타낸다.
도 39: GG8을 이용한 폐암에서의 VISTA에 대한 IHC 염색.
발명의 상세한 설명
본 발명의 예시적 구체예의 설명이 후속된다.
본 발명은 T 세포 활성화의 V-도메인 면역글로불린 억제인자(VISTA)(Genbank: JN602184)(Wang et al., 2010, 2011)로 표시된 신규한 면역글로불린 패밀리 리간드에 대한 항체에 관한 것이다. VISTA는 PD-L1에 대한 상동성을 갖지만, 조혈 구획으로 제한되는 독특한 발현 패턴을 나타낸다. 특히, VISTA는 CD11bhigh 골수 세포에서 항시적으로 고도로 발현되며, CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 낮은 수준으로 발현된다. 인간 동족체는 뮤린 VISTA와 약 85% 상동성을 공유하고, 유사한 발현 패턴을 갖는다(Lines et al., Cancer Research 74:1924, 2014). 항원 제시 세포(APC)에서 발현된 VISTA는 PD-1과 독립적인 인지체 수용체를 통해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 억제한다. 수동 EAE(실험 자가면역 뇌척수염) 질병 모델에서, VISTA 특이적 모노클로날 항체는 T-세포 의존성 면역 반응 및 악화된 질병을 개선시켰다. 종양 세포에서의 VISTA 과발현은 종양을 갖는 숙주에서 보호적 항-종양 면역성을 손상시켰다. 인간 VISTA의 연구는 인간 T 세포에 대한 이의 억제 기능을 입증하였다(Lines et al Cancer Research 74:1924, 2014). 문헌[Flies et al.]으로부터의 연구는 또한 효능 있는 면역 억제 분자로서 VISTA(PD-1H로 언급됨)를 확인하였다(Flies et al., 2011). VISTA는 모두의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 공개 출원 US 20130177557 A1호 및 미국 특허 번호 7,919,585호 및 8,236,304호에 추가로 상세히 기재되어 있다.
VISTA는 면역 반응을 억제하는 신규한 음성 관문 조절인자이다. 본원의 실시예 12에 기재된 바와 같이, 뮤린 종양 모델에서 VISTA-특이적 모노클로날 항체를 이용한 처리가 종양 면역 미세환경의 억제 특성을 역전시키고 보호적 항-종양 면역성을 향상시키는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이는 암 면역요법을 위한 신규한 치료제로서의 VISTA 모노클로날 항체의 잠재성을 입증한다.
본 발명의 항체 및 단편
용어 "항체"는 임의의 공지된 기술, 비제한적인 예로, 효소적 분해, 펩티드 합성 또는 재조합 기술에 의해 제공되는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(mAb), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 항-이디오타입(항-Id) 항체 뿐만 아니라 이들의 단편, 영역 또는 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 항-VISTA 항체는 면역 반응을 조정하거나, 조절하거나, 향상시키는 VISTA의 부분과 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 본원에 기재된 항-VISTA 항체 중 하나 이상을 경쟁적으로 억제한다. 2개 이상의 항체가 동일 표적으로의 결합에 대해 경쟁하는지의 여부를 결정하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 하나의 항체가 표적으로의 또 다른 항체의 결합을 차단하는지 결정하기 위해 경쟁적 결합 검정이 이용될 수 있다. 통상적으로, 경쟁적 결합 검정은 고체 기질 또는 세포에 결합된 정제된 표적 항원(예를 들어, PD-1), 표지되지 않은 시험 결합 분자, 및 표지된 참조 결합 분자의 이용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 결합 분자의 존재하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 보통, 시험 결합 분자는 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁 결합 분자가 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통의 항원으로의 참조 결합 분자의 특이적 결합을 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 또는 그 초과까지 억제할 것이다. 일부 구체예에서, 경쟁적 억제는 경쟁적 억제 ELISA 검정을 이용하여 결정된다.
폴리클로날 항체는 항원으로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자의 이종성 집단이다. 모노클로날 항체는 항원에 특이적인 항체의 실질적으로 동종의 집단을 함유하며, 상기 집단은 실질적으로 유사한 에피토프 결합 부위를 함유한다. 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해 획득될 수 있다. 예를 들어, 모든 내용이 참조로서 본원에 완전히 포함되는 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); U.S. Pat. No. 4,376,110; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); 및 Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)]을 참조하라. 상기 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, GILD 및 이들의 임의의 서브클래스를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스일 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생성시키는 하이브리도마는 시험관 내, 제자리 또는 생체 내에서 배양될 수 있다.
본 발명은 또한 항체 모방체를 포함하거나 항체 또는 이의 특정 단편 또는 일부의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 일부, 예를 들어, 단일쇄 항체 및 이의 단편을 포함하는 항체의 분해 단편, 특정된 일부 및 변이체를 포함한다. 기능성 단편은 포유동물 VISTA 단백질에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, VISTA 또는 이의 일부에 결합할 수 있는 항체 단편, 비제한적인 예로, Fab(예를 들어, 파파인 분해에 의함), Fab'(예를 들어, 펩신 분해 및 부분적 감소에 의함) 및 F(ab')2(예를 들어, 펩신 분해에 의함), facb(예를 들어, 플라스민 분해에 의함), pFc'(예를 들어, 펩신 또는 플라스민 분해에 의함), Fd(예를 들어, 펩신 분해, 부분적 감소 및 재응집에 의함), Fv 또는 scFv(예를 들어, 분자생물학 기술에 의함) 단편이 본 발명에 의해 포함된다(예를 들어, 문헌[Colligan, Immunology](상기) 참조). 본 발명의 항체 단편은 또한 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Aaron L. Nelson, mAbs 2:1, 77-83 (January/February 2010)]에 논의되고 기재된 것을 포함한다.
상기 단편은, 예를 들어, 당 분야에 공지된 바와 같고/같거나 본원에 기재되는 바와 같은 효소적 분해, 합성 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 정지 코돈이 자연 정지 부위의 업스트림에 도입된 항체 유전자를 이용하여 다양한 트렁케이션된 형태로 생성될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 중쇄 부분을 인코딩하는 조합 유전자가 중쇄의 CH1 도메인 및/또는 힌지 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 항체의 다양한 부분이 통상적인 기술에 의해 화학적으로 함께 연결될 수 있거나, 유전 공학 기술을 이용하여 연속 단백질로서 제조될 수 있다.
한 구체예에서, 면역글로불린 사슬 또는 이의 일부(예를 들어, 가변 영역, CDR)의 아미노산 서열은 본원에 기재된 해당 가변 서열 사슬의 아미노산 서열과 약 70-100%의 동일성(예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 이 안의 임의의 범위 또는 값)을 갖는다. 바람직하게는, 70-100% 아미노산 동일성(예를 들어, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 이 안의 임의의 범위 또는 값)이 당 분야에 공지된 바와 같은 적합한 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정된다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열의 예가 본원에 제공된다.
본 발명의 항체 또는 이의 특정 변이체는 본 발명의 항체로부터의 임의의 수의 연속 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 상기 수는 항-TNF 항체 내의 연속 잔기의 수의 10-100%로 구성되는 정수의 그룹으로부터 선택된다. 임의로, 연속 아미노산의 상기 하위서열은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250개 이상의 아미노산 길이, 또는 이 안의 임의의 범위 또는 값이다. 추가로, 상기 하위서열의 수는 1 내지 20으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 정수, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 또는 5일 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 생물학적 활성 항체를 포함한다. 생물학적 활성 항체는 천연(비-합성), 내인성 또는 관련 및 공지된 항체의 특정 활성의 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 또는 95%-100%의 특정 활성을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성의 정도를 검정하고 정량하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
실질적 유사성은 천연(비-합성), 내인성 또는 관련 및 공지된 항체의 적어도 85%(예를 들어, 적어도 95%)의 동일성 및 적어도 85%(예를 들어, 적어도 95%)의 활성을 갖는 화합물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 단백질의 실질적으로 모든 부분(예를 들어, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인(예를 들어, CH1, CH2, CH3), 힌지(VL, VH))이 인간에서 실질적으로 비-면역원성인 단지 약간의 서열 변화 또는 변동을 갖는 항체를 나타낸다. 유사하게, 영장류(원숭이, 비비, 침팬지 등), 설치류(마우스, 래트 등) 및 다른 포유동물 표시된 항체는 상기 종, 아속, 속, 아과, 과 특이적 항체를 표시한다. 추가로, 키메라 항체는 상기의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 변화 또는 변동은 임의로 및 바람직하게는 변형되지 않은 항체에 비해 인간 또는 다른 종에서 면역원성을 유지시키거나 감소시킨다. 따라서, 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체와 별개의 항체이다. 인간 항체가 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비-인간 동물 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에 의해 생성될 수 있음이 지적된다. 추가로, 인간 항체가 단일쇄 항체인 경우, 이는 자연 인간 항체에서 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 연결시키는 링커 펩티드, 예를 들어, 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 링커 펩티드는 인간 기원인 것으로 간주된다.
적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체인 이특이적, 이종특이적, 헤테로컨쥬게이트 또는 유사한 항체가 또한 이용될 수 있다. 본 발명의 경우에서, 결합 특이성 중 하나는 적어도 하나의 VISTA 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 이특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 할 수 있으며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)). 또한, 각각이 전체적으로 참조로서 본원에 포함되는 WO 93/08829호, 미국 특허 번호 6,210,668호, 6,193,967호, 6,132,992호, 6,106,833호, 6,060,285호, 6,037,453호, 6,010,902호, 5,989,530호, 5,959,084호, 5,959,083호, 5,932,448호, 5,833,985호, 5,821,333호, 5,807,706호, 5,643,759호, 5,601,819호, 5,582,996호, 5,496,549호, 4,676,980호, WO 91/00360호, WO 92/00373호, EP 03089호, 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]을 참조하라.
한 구체예에서, 본 발명은 VISTA 및 제2의 표적 단백질(예를 들어, 면역 관문 단백질)을 표적으로 하는 이특이적 항체에 관한 것이다. 예시적 이특이적 항체는 VISTA 및 PD-L1을 표적으로 하는 이특이적 항체 및 VISTA 및 PD-L2를 표적으로 하는 이특이적 항체를 포함한다.
인간 VISTA 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 인간 항체는 적절한 면역원성 항원, 예를 들어, VISTA 단백질 또는 이의 일부(합성 분자, 예를 들어, 합성 펩티드를 포함함)에 대해 발생될 수 있다.
다른 특이적 또는 일반적 포유동물 항체가 유사하게 생성될 수 있다. 면역원성 항원 제조물 및 모노클로날 항체 생성은 임의의 적합한 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 하이브리도마는 적합한 무한증식 세포주(예를 들어, 골수종 세포주, 비제한적인 예로, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A 등, 또는 이종 골수종, 이의 융합 생성물, 또는 이로부터 유래된 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 당 분야에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적합한 세포주(예를 들어, www.atcc.org참조))와 항체-생성 세포를 융합시킴으로써 생성된다. 항체-생성 세포는 분리되거나 클로닝된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도, 또는 다른 면역 세포(예를 들어, B 세포), 또는 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 발현하는 임의의 다른 세포를 포함할 수 있다. 상기 항체-생성 세포는 재조합 또는 내인성 세포일 수 있고, 또한 원핵생물 또는 진핵생물(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 설치류, 말과, 양과, 염소, 양, 영장류) 세포일 수 있다. 예를 들어, 전체적으로 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Ausubel, 상기, 및 Colligan, Immunology, 상기, chapter 2]을 참조하라.
항체 생성 세포는 또한 관심 항원으로 면역화된 인간 또는 다른 적합한 동물의 말초 혈액 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 획득될 수 있다. 임의의 다른 적합한 숙주 세포가 또한 본 발명의 항체, 이의 특정 단편 또는 변이체를 인코딩하는 이종성 또는 내인성 핵산을 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 융합된 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적 배양 조건 또는 다른 적합한 공지된 방법을 이용하여 분리될 수 있고, 제한 희석 또는 세포 분류, 또는 다른 공지된 방법에 의해 클로닝될 수 있다. 요망되는 특이성을 갖는 항체를 생성시키는 세포는 적합한 검정(예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA))에 의해 선택될 수 있다.
펩티드 또는 단백질 라이브러리(비제한적인 예로, 박테리오파지, 리보솜, 올리고뉴클레오티드, RNA, cDNA 등), 디스플레이 라이브러리, 예를 들어, Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; Bioinvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, Calif.; Ixsys로부터 이용가능한 디스플레이 라이브러리로부터 재조합 항체를 선택하는 방법(예를 들어, 각각 전체적으로 참조로서 본원에 포함되는 PCT/GB91/01134호; PCT/GB92/01755호; PCT/GB92/002240호; PCT/GB92/00883호; PCT/GB93/00605호; PCT/GB94/01422호; PCT/GB94/02662호; PCT/GB97/01835호; WO90/14443호; WO90/14424호; WO90/14430호; PCT/U594/1234호; WO92/18619호; WO96/07754호; EP 614 989호; WO95/16027호; WO88/06630호; WO90/3809호; 미국 특허 번호 4,704,692호; PCT/US91/02989호; WO89/06283호; EP 371 998호; EP 550 400호; EP 229 046호; PCT/US91/07149호; 또는 추계학적으로 생성된 펩티드 또는 단백질--미국 특허 번호 5,723,323호; 5,763,192호; 5,814,476호; 5,817,483호; 5,824,514호; 5,976,862호; WO 86/05803호, EP 590 689호 참조), 또는 당 분야에 공지되고/되거나 본원에 기재된 바와 같은 인간 항체의 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, SCID 마우스)의 면역화에 의존하는 방법(각각 전체적으로 참조로서 포함되는 문헌[Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93:154-161 (1998)] 뿐만 아니라 관련 특허 및 출원 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 필요한 특이성의 항체를 생성시키거나 분리시키는 다른 적합한 방법이 이용될 수 있다. 상기 기술은 리보솜 디스플레이(Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (November 1998)); 단일 세포 항체 생성 기술(미국 특허 번호 5,627,052호, Wen et al., J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)); 겔 미세소적 및 흐름세포측정법(Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, Mass.; Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)); B-세포 선택(Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
비-인간 또는 인간 항체를 조작하거나 인간화시키기 위한 방법이 또한 이용될 수 있으며, 당 분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 또는 조작된 항체는 비-인간, 비제한적인 예로, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물인 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 인간 아미노산 잔기는 공지된 인간 서열의 "유입(import)" 가변, 불변 또는 다른 도메인으로부터 통상적으로 취해지는 "유입" 잔기로 종종 언급된다. 공지된 인간 Ig 서열은, 예를 들어, 각각이 전체적으로 참조로서 본원에 포함되는 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html에 개시되어 있다.
이러한 유입된 서열은 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화성, 결합성, 특이성, 반감기 또는 당 분야에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적합한 특징을 감소시키거나, 향상시키거나, 변형시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 유지되는 한편, 프레임워크 및/또는 불변 영역의 비-인간 서열의 일부 또는 전부는 인간 또는 다른 아미노산으로 대체된다. 항체는 또한 임의로 당업자에게 공지된 3차원 면역글로불린 모델을 이용하여 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 바람직한 생물학적 특성의 보유와 함께 인간화될 수 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 제시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 제시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서의 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능케 한다. 이러한 식으로, 프레임워크(FR) 잔기가 선택될 수 있고, 컨센서스 및 유입 서열로부터 조합될 수 있어, 요망되는 항체 특징, 예를 들어, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 있어서 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 관련된다. 본 발명의 항체의 인간화 또는 조작은 임의의 공지된 방법, 비제한적인 예로, 각각 그 안에 인용된 참고문헌을 포함하여 전체적으로 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)], 미국 특허 번호 5,723,323호, 5,976862호, 5,824514호, 5,817483호, 5,814476호, 5,763,192호, 5,723,323호, 5,766,886호, 5,714,352호, 6,204,023호, 6,180,370호, 5,693,762호, 5,530,101호, 5,585,089호, 5,225,539호; 4,816,567호에 기재된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
항-VISTA 항체는 또한 임의로 본원에 기재된 바와 같고/같거나 당 분야에 공지된 바와 같이 인간 항체의 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 비-인간 영장류 등)의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 인간 항-VISTA 항체를 생성시키는 세포는 상기 동물로부터 분리될 수 있고, 적합한 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 이용하여 무한증식될 수 있다.
인간 항원에 결합하는 인간 항체의 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물은 공지된 방법(비제한적인 예로, 각각 전체적으로 참조로서 본원에 포함되는 Lonberg et al.에 의해 발행된 미국 특허 번호 5,770,428호, 5,569,825호, 5,545,806호, 5,625,126호, 5,625,825호, 5,633,425호, 5,661,016호 및 5,789,650호; Jakobovits et al. WO 98/50433호, Jakobovits et al. WO 98/24893호, Lonberg et al. WO 98/24884호, Lonberg et al. WO 97/13852호, Lonberg et al. WO 94/25585호, Kucherlapate et al. WO 96/34096호, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B1호, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1호, Surani et al. 미국 특허 번호 5,545,807호, Bruggemann et al. WO 90/04036호, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1호, Lonberg et al. EP 0814 259 A2호, Lonberg et al. GB 2 272 440 A호, Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) 및 Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996))에 의해 생성될 수 있다. 일반적으로, 이들 마우스는 기능적으로 재배열되거나, 기능적 재배열을 겪을 수 있는 적어도 하나의 인간 면역글로불린 유전자좌로부터의 DNA를 포함하는 적어도 하나의 트랜스진(transgene)을 포함한다. 상기 마우스에서의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 유전자에 의해 인코딩되는 항체를 생성하는 동물의 능력을 제거하기 위해 붕괴되거나 결실될 수 있다.
유사한 단백질 또는 단편으로의 특이적 결합을 위한 스크리닝 항체는 펩티드 디스플레이 라이브러리를 이용하여 편리하게 달성될 수 있다. 이러한 방법은 요망되는 기능 또는 구조를 갖는 개별적 일원에 대한 펩티드의 큰 집합체의 스크리닝을 수반한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리의 항체 스크리닝은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 디스플레이된 펩티드 서열은 3 내지 5000개 또는 그 초과의 아미노산 길이, 종종 5-100개의 아미노산 길이, 흔히 약 8 내지 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드 라이브러리를 발생시키기 위한 직접적 화학 합성 방법에 더하여, 여러 재조합 DNA 방법이 기재되었다. 한 유형은 박테리오파지 또는 세포의 표면 상에서의 펩티드 서열의 디스플레이를 수반한다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 특정 디스플레이된 펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 상기 방법은 PCT 특허 공개 번호 91/17271호, 91/18980호, 91/19818호, 및 93/08278호에 기재되어 있다. 펩티드의 라이브러리를 발생시키기 위한 다른 시스템은 시험관내 화학 합성 및 재조합 방법 둘 모두의 양태를 갖는다. 예를 들어, PCT 특허 공개 번호 92/05258호, 92/14843호, 및 96/19256호를 참조하라. 또한, 미국 특허 번호 5,658,754호; 및 5,643,768호를 참조하라. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 Invitrogen(Carlsbad, Calif.), 및 Cambridge antibody Technologies(Cambridgeshire, UK)와 같은 공급업체로부터 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,704,692호, 4,939,666호, 4,946,778호, 5,260,203호, 5,455,030호, 5,518,889호, 5,534,621호, 5,656,730호, 5,763,733호, 5,767,260호, 5,856,456호; 5,223,409호, 5,403,484호, 5,571,698호, 5,837,500호(Dyax에 양도됨), 5,427,908호, 5,580,717호; 5,885,793호(Cambridge antibody Technologies에 양도됨; 5,750,373호(Genentech에 양도됨), 5,618,920호, 5,595,898호, 5,576,195호, 5,698,435호, 5,693,493호, 및 5,698,417호를 참조하라.
본 발명의 항체는 또한 밀크에서 상기 항체를 생성하는 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 염소, 소, 양 등을 제공하기 위해 적어도 하나의 항-VISTA 항체 인코딩 핵산을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 동물은 공지된 방법을 이용하여 제공될 수 있다. 각각이 전체적으로 참조로서 본원에 포함되는 비제한적인 예의 미국 특허 번호 5,827,690호; 5,849,992호; 4,873,316호; 5,849,992호; 5,994,616호; 5,565,362호; 5,304,489호 등을 참조하라.
본 발명의 항-VISTA 항체는 또한 공지된 방법에 따라 트랜스제닉 식물을 이용하여 생성될 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌[Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (October, 1999), Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) 및 이 안에 인용된 참고문헌; Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994); 및 이 안에 인용된 참고문헌]을 참조하라. 상기 참고문헌 각각은 전체적으로 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명의 항체는 광범위한 친화성(KD)으로 인간 VISTA에 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 적어도 하나의 인간 모노클로날 항체는 임의로 높은 친화성으로 인간 VISTA에 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체는 약 10-7 M 이하, 비제한적인 예로, 0.1-9.9(또는 이 안의 임의의 범위 또는 값) x 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 또는 이 안의 임의의 범위 또는 값의 KD로 인간 VISTA에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 적어도 1x10-7 리터/몰, 예를 들어, 적어도 1x10-8 리터/몰, 예를 들어, 적어도 1x10-9 리터/몰 리터/몰의 친화성으로 인간 VISTA에 결합할 수 있다.
항원에 대한 항체의 친화성 또는 결합성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 여기에 기재된 방법 참조). 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화성은 다양한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정되는 경우 다양할 수 있다. 따라서, 친화성 및 다른 항원-결합 파라미터(예를 들어, KD, Ka, Kd)의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액으로 이루어진다.
핵산 분자
본원에 제공된 정보, 예를 들어, 특정된 단편 중 적어도 하나의 연속 아미노산, 이의 변이체 또는 컨센서스 서열의 적어도 70-100%를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이들 서열 중 적어도 하나를 포함하는 기탁된 벡터를 이용하여, SEQ ID NO:1, 2 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역 모두 및/또는 SEQ ID NO:4, 5 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역 모두를 포함하는 적어도 하나의 항-VISTA 항체를 인코딩하는 본 발명의 핵산 분자가 본원에 기재되거나 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 획득될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 클로닝에 의해 획득되거나 합성적으로 생성되는 RNA, 예를 들어, mRNA, hnRNA, tRNA의 형태 또는 임의의 다른 형태, 또는 DNA, 비제한적인 예로, cDNA 및 유전체 DNA의 형태, 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. DNA는 삼중-가닥, 이중-가닥 또는 단일-가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 한 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 공지된 코딩 가닥일 수 있거나, 이는 안티-센스 가닥으로도 공지된 비-코딩 가닥일 수 있다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 본원에 기재된 바와 같고/같거나 당 분야에 공지된 바와 같은 열린해독틀(ORF), 비제한적인 예로, 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3와 같은 적어도 하나의 CDR의 적어도 하나의 특정된 부분을 포함하는 핵산 분자; 항-VISTA 항체 또는 단편, 예를 들어, 가변 영역을 포함하는 단편에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상기 기재된 것과 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 유전 부호의 축퇴성으로 인해 적어도 하나의 항-VISTA 항체를 여전히 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 특이적 항-VISTA 항체를 코딩하는 상기 축퇴성 핵산 변이체를 생성시키는 것은 당업자에게 일상적인 일일 것이다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상기]을 참조하며, 상기 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다.
본원에 나타낸 바와 같이, 항-VISTA 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는 항체 단편의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자; 전체 항체 또는 이의 일부에 대한 코딩 서열; 항체, 단편 또는 일부에 대한 코딩 서열, 뿐만 아니라 추가 서열, 예를 들어, 스플라이싱 및 아데닐중합체형성 신호(예를 들어, 리보솜 결합 및 mRNA의 안정성)를 포함하는 전사, mRNA 처리에서 역할을 하는 전사된 비번역 서열과 같은 비-코딩 5' 및 3' 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 비-코딩 서열과 함께 적어도 하나의 인트론과 같은 상기 언급된 추가 코딩 서열을 갖거나 갖지 않는 적어도 하나의 신호 선도 또는 융합 펩티드의 코딩 서열; 추가의 아미노산, 예를 들어, 추가의 기능을 제공하는 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 항체를 인코딩하는 서열은 마커 서열, 예를 들어, 항체 단편 또는 일부를 포함하는 융합된 항체의 정제를 촉진하는 펩티드를 인코딩하는 서열에 융합될 수 있다.
본 발명의 항체, 단편 및 영역의 불변(C) 영역을 인코딩하는 인간 유전자는 공지된 방법에 의해 인간 태아 간 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 인간 C 영역 유전자는 인간 면역글로불린을 발현하고 생성하는 인간 세포를 포함하는 임의의 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 인간 CH 영역은 γ, μ, α, δ 또는 ε 및 이의 서브타입, 예를 들어, G1, G2, G3 및 G4를 포함하는 인간 H 사슬의 공지된 부류 또는 아이소형 중 임의의 부류 또는 아이소형으로부터 유래될 수 있다. H 사슬 아이소형은 항체의 다양한 효과기 기능을 담당하므로, CH 영역의 선택은 요망되는 효과기 기능, 예를 들어, 보체 결합, 또는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)에서의 활성에 의해 좌우될 것이다.
조성물
본원에 개시된 약학적 조성물은 표준 절차에 따라 제조되며, 치료되는 질환을 치료하기 위해, 예를 들어, 감소시키거나, 예방하거나, 제거하기 위해, 또는 치료되는 질환의 진행을 늦추거나 정지시키기 위해 선택되는 투여량으로 투여된다(예를 들어, 인간 치료를 위해 다양한 작용제를 투여하기 위한 방법의 전반적 설명에 대해 내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, and Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.] 참조). 개시된 항체 및 작용제를 포함하는 조성물은 조절 또는 지속-방출 전달 시스템(예를 들어, 캡슐, 생물분해성 매트릭스)을 이용하여 전달될 수 있다. 개시된 화합물의 조성물의 투여에 적합한 약물 전달을 위한 지연-방출 전달 시스템의 예는, 예를 들어, 전체 교시내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 US 5,990,092호; 5,039,660호; 4,452,775호; 및 3,854,480호에 기재되어 있다.
본 발명의 항-VISTA 항체 및/또는 단편으로부터 약학적 조성물을 제조하기 위해, 약학적으로 허용되는 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 형태 제조물은 분말, 정제, 환약, 캡슐, 샤세(cachet), 좌약, 및 분산성 과립을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 전달시에 재구성을 위한 분말 형태로 존재할 수 있다. 고체 담체는 희석제, 착향제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제, 보존제, 정제 붕해제, 또는 캡슐화 물질로도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질일 수 있다. 분말에서, 담체는 미세하게 나누어진 활성 성분과 혼합된 미세하게 나누어진 고체이다.
분말 및 정제는 바람직하게는 약 1 내지 약 70 퍼센트의 활성 성분을 함유한다. 적합한 담체는 마그네슘 카르보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 탤크, 당, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트래거캔쓰, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 저-융해 왁스, 코코아 버터 등이다. 정제, 분말, 샤세, 로젠지, 신속-융해 스트립, 캡슐 및 환약이 경구 투여에 적합한 활성 성분을 함유하는 고체 투여 형태로 사용될 수 있다.
액체 형태 제조물은 용액, 현탁액, 정체 관장제, 및 에멀젼, 예를 들어, 물 또는 물 프로필렌 글리콜 용액을 포함한다. 비경구 주사를 위해, 액체 제조물이 수성 폴리에틸렌 글리콜 용액 중 용액으로 제형화될 수 있다.
약학적 조성물은 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 상기 형태에서, 조성물은 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 다시 나뉘어진다. 단위 투여 형태는 패키징된 제조물, 별개의 양의 단위 용량을 함유하는 패키지일 수 있다. 투여량은 환자의 필요조건, 치료되는 질환의 중증도, 이용되는 화합물 및 투여 경로에 따라 다양할 수 있다. 특정 상황에 대한 적절한 투여량의 결정은 당 분야의 기술 범위 내이다.
또한, 약학적 조성물은 요망시 다른 양립되는 작용제, 예를 들어, 약학적, 치료적 또는 예방적 작용제를 함유할 수 있다. 치료적 또는 예방적 작용제는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 모방체 작용제, 합성 약물, 무기 분자, 및 유기 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 작용제(예를 들어, 항암 작용제)의 부류의 예는 세포독소, 혈관형성 억제제, 면역조절제, 면역-종양학 작용제, 및 하나 이상의 치료제의 동통 경감을 제공하거나 유해한 효과를 상쇄시키기 위해 이용되는 작용제(예를 들어, 비스포스포네이트가 글루코코르티코이드의 고칼슘혈증 효과를 감소시키기 위해 이용됨)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
혈관형성 억제제, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 작용제 및 치료제는 안지오스타틴(angiostatin)(플라스미노겐 단편); 항혈관형성 항트롬빈 III; 안지오자임(angiozyme)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비스포스포네이트는 알렌드로네이트(alendronate), 클로드로네이트(clodronate), 에티드로네이트(etidronate), 이반드로네이트(ibandronate), 파미드로네이트(pamidronate), 리세드로네이트(risedronate), 틸루드로네이트(tiludronate), 및 졸레드로네이트(zoledronate)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 면역조절제 및 치료제는 항-T 세포 수용체 항체, 예를 들어, 항-CD3 항체(예를 들어, 누비온(Nuvion)(Protein Design Labs), OKT3(Johnson & Johnson), 또는 항-CD20 항체 리툭산(Rituxan)(IDEC)), 항-CD52 항체(예를 들어, CAMPATH 1H(Ilex)), 항-CD11a 항체(예를 들어, 자넬림(Xanelim)(Genentech)); 항-사이토카인 또는 항-사이토카인 수용체 항체 및 길항제, 예를 들어, 항-IL-2 수용체 항체(제나팍스(Zenapax)(Protein Design Labs)), 항-IL-6 수용체 항체(예를 들어, MRA(Chugai)), 및 항-IL-12 항체(CNTO1275(Janssen)), 항-TNF알파 항체(레미케이드(Remicade)(Janssen)) 또는 TNF 수용체 길항제(엔브렐(Enbrel)(Immunex)), 항-IL-6 항체(BE8(Diaclone) 및 실툭시맙(siltuximab)(CNTO32(Centocor)), 및 종양-관련 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, 트라스투지맙(trastuzimab)(Genentech))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 면역-종양학 작용제는 이필리무맙(ipilimumab)(항-CTLA-4), 니볼루맙(nivolumab)(항-PD-1), 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(항-PD-1), 항-PD-L1 항체, 및 항-LAG-3 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
조성물은 바람직하게는 치료적 유효량의 항체 또는 단편을 함유하는 투여 단위 형태로 제조된다. 투여 단위의 예는 정제 및 캡슐이다. 치료 목적을 위해, 정제 및 캡슐은 활성 성분에 더하여 통상적인 담체, 예를 들어, 결합제, 예를 들어, 아카시아 검, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 소르비톨, 또는 트래거캔쓰; 충전제, 예를 들어, 칼슘 포스페이트, 글리신, 락토스, 옥수수-전분, 소르비톨, 또는 수크로스; 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 실리카, 또는 탤크; 붕해제, 예를 들어, 감자 전분, 착향제 또는 착색제, 또는 허용되는 습윤제를 함유할 수 있다. 수용액 또는 오일성 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭서 형태의 경구 액체 제조물은 일반적으로 통상적인 첨가물, 예를 들어, 현탁제, 에멀젼화제, 비-수성 작용제, 보존제, 착색제 및 착향제를 함유할 수 있다. 액체 제조물을 위한 첨가물의 예는 아카시아, 아몬드유, 에틸 알콜, 분획화된 코코넛 오일, 젤라틴, 글루코스 시럽, 글리세린, 수소처리된 식용 지방, 레시틴, 메틸 셀룰로스, 메틸 또는 프로필 파라-하이드록시벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 또는 소르브산을 포함한다.
본원에 기재된 화합물 및 조성물을 제조하고 이용하는 방법과 관련한 다른 일반적 세부사항은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 전체내용이 포함되는 미국 특허 번호 7,820,169호를 참조하라.
치료 방법
당업자, 예를 들어, 임상의는 선택된 작용제, 약학적 제형 및 투여 경로, 다양한 환자 요인 및 다른 고려사항을 고려하여 개체로 투여하기 위한 특정 항체, 단편 또는 조성물에 대한 적합한 투여량 및 투여 경로를 결정할 수 있다. 바람직하게는, 투여량은 최소의 부작용을 야기시키거나 발생시키거나, 부작용을 야기시키거나 발생시키지 않는다. 표준 다중-투여 요법에서, 약리학적 작용제는 치료를 받는 대상체에서 소정의 농도 또는 최적의 혈장 농도를 유지시키도록 설계된 투여 스케줄로 투여될 수 있다. 항체, 단편 및 조성물은 임의의 적절한 투여 범위 또는 치료적 유효량, 예를 들어, 0.1 ㎎/㎏, 0.2 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 0.4 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 0.6 ㎎/㎏, 0.7 ㎎/㎏, 0.8 ㎎/㎏, 0.9 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 1.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 2.5 ㎎/㎏, 3.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏, 5.0 ㎎/㎏, 6.0 ㎎/㎏, 7.0 ㎎/㎏, 8.0 ㎎/㎏, 9.0 ㎎/㎏, 10.0 ㎎/㎏, 11.0 ㎎/㎏, 12.0 ㎎/㎏, 13.0 ㎎/㎏, 14.0 ㎎/㎏, 15.0 ㎎/㎏, 16.0 ㎎/㎏, 17.0 ㎎/㎏, 18.0 ㎎/㎏, 19.0 ㎎/㎏, 20.0 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 40 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏, 70 ㎎/㎏, 80 ㎎/㎏, 90 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏으로 첨가될 수 있다. 한 구체예에서, 투여되는 조성물, 항체 또는 단편의 투여량은 투여 당 0.1-15 ㎎/㎏이다.
항체 또는 단편은 하루에 1회, 적어도 1회, 2회, 적어도 2회, 3회, 또는 적어도 3회 투여될 수 있다. 항체 또는 단편은 1주일에 1회, 적어도 1회, 2회, 적어도 2회, 3회, 적어도 3회, 4회, 적어도 4회, 5회, 적어도 5회, 6회, 또는 1주일에 적어도 6회 투여될 수 있다. 항체 또는 단편은 1개월에 1회, 1개월에 적어도 1회, 1개월에 2회, 1개월에 적어도 2회, 1개월에 3회 또는 1개월에 적어도 3회 투여될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 1년에 1회, 1년에 적어도 1회, 1년에 2회, 1년에 적어도 2회, 1년에 3회, 1년에 적어도 3회, 1년에 4회, 1년에 적어도 4회, 1년에 5회, 1년에 적어도 5회, 1년에 6회 또는 1년에 적어도 6회 투여될 수 있다.
항-VISTA 항체, 단편 및 조성물은, 예를 들어, 정맥내, 피하, 경구, 직장, 근내, 복막내, 경점막, 경피, 수막강내, 비내, 또는 국소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 비경구 또는 비-비경구 수단을 통해 투여될 수 있다. 당업자는 하기 투여 형태가 활성 성분으로서 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물의 상응하는 약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 활성 성분으로서 화합물 또는 화합물의 상응하는 약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 항-VISTA 항체는 조합 요법(예를 들어, 서로 함께, 또는 하나 이상의 다른 치료제와 함께)의 일부로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 치료제 전, 하나 이상의 다른 치료제 후, 또는 하나 이상의 다른 치료제와 동반하여 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물 및 다른 치료제는 별개의 제형으로서 또는 공동 제형으로서 동시(예를 들어, 동반)적으로 공동 투여될 수 있다. 대안적으로, 작용제는 숙련된 임상의에 의해 결정되는 바와 같은 적절한 기간(예를 들어, 치료제의 약학적 효과의 중첩을 가능케 하기에 충분한 시간) 내에 별개의 조성물로서 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 다른 치료제는 요망되는 치료 효과를 달성하기에 적합한 순서 및 스케줄로 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 악성 질병을 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 암을 치료하거나 에방하기 위해 이용된다. 암은 임의의 기관 또는 신체 시스템의 임의의 악성 또는 양성 종양을 포함할 수 있다. 예로는 유방, 소화/소화관, 내분비, 신경내분비, 눈, 비뇨생식기, 생식 세포, 부인과, 두경부, 혈액작용/혈액, 근골격, 신경, 호흡/흉부, 방광, 결장, 직장, 폐, 자궁내막, 신장, 췌장, 간, 위, 고환, 식도, 전립선, 뇌, 자궁경부, 난소, 갑상선 암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 암은 백혈병, 흑색종, 및 림프종, 및 본원에 기재된 임의의 암을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 고형 종양은 골수 및/또는 T-세포로 침윤된다. 일부 구체예에서, 암은 백혈병, 림프종, 골수형성이상 증후군 및/또는 골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 임의의 종류 또는 유형의 백혈병, 예를 들어, 림프구성 백혈병 또는 골수성 백혈병, 예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 골수성(골수성) 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 털모양 세포 백혈병, T-세포 전림프구성 백혈병, 거대 과립 림프구성 백혈병, 또는 성인 T-세포 백혈병일 수 있다. 일부 구체예에서, 림프종은 조직구성 림프종, 소포 림프종 또는 호지킨 림프종이며, 일부 구체예에서, 암은 다발골수종이다. 일부 구체예에서, 암은 고형 종양, 예를 들어, 흑색종, 또는 방광암이다. 특정 구체예에서, 암은 폐암, 예를 들어, 비소세포페암(NSCLC)이다.
본 발명은 또한 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수구성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 털모양 세포 백혈병, 골수형성이상 증후군(MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발골수종, 카포시 육종, 결장직장 암종, 췌장 암종, 코인두 암종, 악성 조직구증, 신생물딸림 증후군/악성종양의 고칼슘혈증, 고형 종양, 샘암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질병, 암 관련 골흡수, 암-관련 골 동통 등 중 적어도 하나를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 적어도 하나의 악성 질병을 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 고형 종양은 골수 및/또는 T-세포로 침윤된다. 특정 구체예에서, 고형 종양은 폐암, 예를 들어, 비소세포폐암(NSCLC)이다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 화합물 및 치료제는 백신(예를 들어, 바이러스 벡터 백신, 박테리아 백신, 세포-기반 백신, DNA 백신, RNA 백신, 펩티드 백신, 또는 단백질 백신)과 공동 투여된다. 상기 백신은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 전체내용이 본원에 포함되는 문헌[Jeffrey Schlom, "Therapeutic Cancer Vaccines: Current Status and Moving Forward," J Natl Cancer Inst; 104:599-613 (2012)]을 참조하라.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 화합물 및 치료제는 화학요법을 위한 작용제, 호르몬 치료제 및 생물학적 치료제, 및/또는 비스포스포네이트와 공동 투여된다. 일부 구체예에서, 화학요법을 위한 작용제(들)은 아르보플라틴(arboplatin)(파라플라틴(Paraplatin)), 시스플라틴(cisplatin)(플라티놀(Platinol), 플라티놀-AQ), 사이클로포스파미드(사이톡산(Cytoxan), 네오사르(Neosar)), 독소루비신(doxorubicin)(아드리아마이신(Adriamycin)), 에토포시드(etoposide)(베페시드(VePesid)), 플루오로우라실(5-FU), 젬시타빈(gemcitabine)(젬자르(Gemzar)), 이리노테칸(irinotecan)(캄프토사르(Camptosar)), 파클리탁셀(paclitaxel)(탁솔(Taxol)), 토포테칸(topotecan)(하이캄틴(Hycamtin)), 빈크리스틴(vincristine)(온코빈(Oncovin), 빈카사르(Vincasar) PFS), 빈블라스틴(vinblastine)(벨반(Velban)) 중 하나 이상을 포함한다.
다른 구체예에서, 본원에 기재된 항-VISTA 화합물 및 치료제는 하나 이상의 면역 관문 항체, 예를 들어, 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-TIM-3 항체, 항-LAG-3v, 항-OX40 항체 및 항-GITR 항체와 공동 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 항-VISTA 화합물 및 치료제는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO)의 소분자 억제제와 공동 투여된다.
본 발명의 항-VISTA 화합물 및 조성물은 암을 예방(암 재발의 예방을 포함함)하거나 치료(예를 들어, 암 또는 이의 하나 이상의 증상의 관리 또는 개선)하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 암 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 개선에 유용한 것으로 공지되거나, 사용되어 왔거나, 현재 사용되는 임의의 작용제 또는 치료제(예를 들어, 화학요법제, 방사선 요법제, 표적화된 요법제, 예를 들어, 이마티니브(imatinib), 소라페니브(sorafenib) 및 베무라페니브(vemurafenib), 호르몬 요법제, 및/또는 생물학적 요법제 또는 면역요법제)가 본원에 기재된 본 발명의 화합물 또는 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 항암제는 5-플루오로우라실; 아시비신(acivicin); 알데스류킨(aldesleukin); 알트레타민(altretamine); 아미노글루테티미드(aminoglutethimide); 암사크린(amsacrine); 아나스트로졸(anastrozole); 안트라마이신(anthramycin); 아스파라기나제; 아자시티딘(azacitidine); 아제테파(azetepa); 아조토마이신(azotomycin); 바티마스타트(batimastat); 비칼루타미드(bicalutamide); 블레오마이신(bleomycin) 설페이트; 브레퀴나르(brequinar) 소듐; 브로피리민(bropirimine); 부술판busulfan); 카르보플라틴(carboplatin); 카르무스틴(carmustine); 카루비신(carubicin) 하이드로클로라이드; 카르젤레신(carzelesin); 세데핑골(cedefingol); 클로람부실(chlorambucil); 시롤레마이신(cirolemycin); 시스플라틴(cisplatin); 클라드리빈(cladribine); 크리스나톨 메실레이트(crisnatol mesylate); 사이클로포스파미드(cyclophosphamide); 사이타라빈(cytarabine); 다카르바진(dacarbazine); 닥티노마이신(dactinomycin); 다우노루비신(daunorubicin) 하이드로클로라이드; 데시타빈(decitabine); 덱소르마플라틴(dexormaplatin); 데자구아닌(dezaguanine); 데자구아닌 메실레이트(dezaguanine mesylate); 디아지쿠온(diaziquone); 도세탁셀(docetaxel); 독소루비신(doxorubicin); 독소루비신 하이드로클로라이드; 드롤록시펜(droloxifene); 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론(dromostanolone) 프로피오네이트; 두아조마이신(duazomycin); 에다트렉세이트(edatrexate); 에플로르니틴(eflornithine) 하이드로클로라이드; 엔로플라틴(enloplatin); 엔프로메이트(enpromate); 에피프로피딘(epipropidine); 에피루비신(epirubicin) 하이드로클로라이드; 에르불로졸(erbulozole); 에소루비신(esorubicin) 하이드로클로라이드; 에스트라무스틴(estramustine); 에스트라무스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸(etanidazole); 에토포시드(etoposide); 에토포시드 포스페이트; 파자라빈(fazarabine); 펜레티니드(fenretinide); 플록스우리딘(floxuridine); 플루다라빈(fludarabine) 포스페이트; 플루오로우라실(fluorouracil); 플루오로시타빈(flurocitabine); 포스퀴돈(fosquidone); 포스트리에신(fostriecin) 소듐; 젬시타빈(gemcitabine); 젬시타빈 하이드로클로라이드; 하이드록시우레아; 이다루비신(idarubicin) 하이드로클로라이드; 이포스파미드(ifosfamide); 일모포신(ilmofosine); 인터루킨 II(재조합 인터루킨 II, 또는 rIL2를 포함함), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-m; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-Ia; 인터페론 감마-Ib; 이프로플라틴(iproplatin); 이리노테칸(irinotecan) 하이드로클로라이드; 란레오티드(lanreotide) 아세테이트; 레트로졸(letrozole); 류프롤리드(leuprolide) 아세테이트; 리아로졸(liarozole) 하이드로클로라이드; 로메트렉솔(lometrexol) 소듐; 로무스틴(lomustine); 로소잔트론(losoxantrone) 하이드로클로라이드; 마소프로콜(masoprocol); 메클로레타민(mechlorethamine) 하이드로클로라이드; 메게스트롤(megestrol) 아세테이트; 멜렌게스트롤(melengestrol) 아세테이트; 멜팔란(melphalan); 메노가릴(menogaril); 메르캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 메토트렉세이트 소듐; 메토프린(metoprine); 메투레데파(meturedepa); 미토마이신(mitomycin); 미토스퍼(mitosper); 미토탄(mitotane); 미톡산트론(mitoxantrone) 하이드로클로라이드; 미코페놀산; 노코다졸(nocodazole); 오르마플라틴(ormaplatin); 파클리탁셀(paclitaxel); 페가스파르가스(pegaspargase); 포르프로마이신(porfromycin); 프레드니무스틴(prednimustine); 프로카르바진(procarbazine) 하이드로클로라이드; 퓨로마이신(puromycin); 로글레티미드(rogletimide); 사핑골(safingol) 하이드로클로라이드; 세무스틴(semustine); 심트라젠(simtrazene); 스파르포세이트(sparfosate) 소듐; 스파르소마이신(sparsomycin); 스피로무스틴(spiromustine); 스피로플라틴(spiroplatin); 스트렙토니그린(streptonigrin); 스트렙토조신(streptozocin); 설로페누르(sulofenur); 탈리소마이신(talisomycin); 테가푸르(tegafur); 텔록산트론(teloxantrone) 하이드로클로라이드; 테모포르핀(temoporfin); 테니포시드(teniposide); 테록시론(teroxirone); 테스토락톤(testolactone); 티아미프린(thiamiprine); 티오구아닌(thioguanine); 티오테파(thiotepa); 티아조푸린(tiazofurin); 티라파자민(tirapazamine); 토포테칸(topotecan); 트리메트렉세이트(trimetrexate); 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트리프토렐린(triptorelin); 우라실 머스타드(uracil mustard); 우레데파(uredepa); 바프레오티드(vapreotide); 베르테포르픈(verteporfn); 빈블라스틴(vinblastine) 설페이트; 빈크리스틴(vincristine) 설페이트; 빈데신(vindesine); 빈데신 설페이트; 비네피딘(vinepidine) 설페이트; 빈글리시네이트(vinglycinate) 설페이트; 빈류로신(vinleurosine) 설페이트; 비노렐빈(vinorelbine) 타르트레이트; 빈로시딘(vinrosidine) 설페이트; 빈졸리딘(vinzolidine) 설페이트; 보로졸(vorozole); 제니플라틴(zeniplatin); 지노스타틴(zinostatin); 조루비신(zorubicin) 하이드로클로라이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 표적화된 요법제는 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 이마티니브(imatinib), 소라페니브(sorafenib), 및 베무라페니브(vemurafenib))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 또한 x-선, 감마선 및 암 세포를 파괴하기 위한 다른 방사선원의 사용을 포함하는 방사선 요법과 함께 본 발명의 항-VISTA 화합물의 투여를 포함한다. 암 치료는 당 분야에 공지되어 있으며, 문헌[Physician's Desk Reference (57th ed., 2003)]과 같은 문헌에 기재되었다.
본원에 기재된 항-VISTA 항체는, 예를 들어, 만성 감염성 질병, 예를 들어, 특히 HIV, HBV, HCV, 및 HSV의 치료에서 또한 유용하다.
본 발명의 선택된 항-VISTA 항체에 대한 다양한 특성 및 서열 정보가 본원의 표 1A, 1B 및 2에 제공된다.
표 1A: 선택된 완전한 인간 또는 인간화 항-인간 VISTA 항체의 CDR 서열
Figure pct00001
표 1B: 선택된 완전한 인간 또는 인간화 항-인간 VISTA 항체의 중쇄 및 경쇄 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
*VSTB140, VSTB149 및 VSTB174의 불변 영역 서열은 밑줄로 표시된다.
ΔVSTB149의 중쇄에서 프로테아제 내성을 제공하는 아미노산 잔기는 굵은 글씨로 표시된다.
표 2: 선택된 항-VISTA 항체에 대한 해리 상수(KD)
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예
실시예 1: 인간 조혈 세포에서의 VISTA 발현의 분석
방법:
VISTA 발현을 위한 새로운 인간 PBMC의 제조 및 염색
여러 공여자로부터의 새로이 분리된 인간 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)에 대해 VISTA의 발현을 시험하였다. 항-인간 VISTA-비오틴(GA-1)을 염색에 사용하였다(5 ㎍/㎖). 마우스 IgG1, K-비오틴(5 ㎍/㎖의 클론 MOPC-21)을 아이소형 대조군으로 사용하였다.
공여자 물질
혈액 샘플을 Biological Specialty Corp.(Colmar, PA)로부터 획득하고, 같은 날에 수거하고 분석하였다. 헤파린 설페이트를 함유하는 10 ㎖의 전체 혈액을 분석을 위해 배송시켰다.
샘플 제조
혈액을 멸균 PBS 중에서 1:1 희석시켰다. 22 ㎖의 희석된 제대혈을 50 ㎖ 코니컬 튜브(conical tube) 중 20㎖ 멸균 Ficoll-Hypaque(GE Healthcare Cat# 17-144003) 상에 층화시켰다. 튜브를 실온에서 20분 동안 1800 rpm에서 원심분리시켰다. 원심분리 후에 계면의 단핵 세포를 1 ㎖ 피펫을 이용하여 수거하고, 2개의 50 ㎖ 코니컬 튜브로 조합시켰다. 멸균 PBS를 각각의 튜브에 첨가하여 부피가 50 ㎖까지 되도록 하고, 세포를 4℃에서 10분 동안 300g에서 원심분리시켰다. 상층액을 폐기하였다. 세포를 50 ㎖의 멸균 PBS에 재현탁시키고, 튜브를 4℃에서 10분 동안 300g에서 회전시켰다. 상층액을 폐기하였다. 세포를 조합시키고, 카운팅 전에 50 ㎖ 멸균 PBS에 재현탁시켰다.
염색 프로토콜: 5x107 PBMC를 함유하는 동결된 바이알을 상쇄 대조군 및 염색을 위한 대조군으로 사용하였다.
하기 시약 및/또는 소모품을 이용하였다:
0.2% EDTA가 보충된 BD Biosciences로부터의 FACS 염색 완충액(BSA)(Cat# 554657); 인산염-완충 염수(PBS)(Gibco cat#14190); 96-웰 폴리프로필렌 둥근-바닥 플레이트(BD #3077); 1.2 ㎖ 폴리프로필렌 클러스터 튜브(Corning #4451); ImmunoNext Lot# 080612B로부터의 비오티닐화된 항-VISTA 클론 GA-1(5 ㎍/㎖로 사용됨); 비오티닐화된 mIgG1, K 아이소형 대조군(Clone MOPC-21); Biolegend cat#400104, Lot#B116649(5 ㎍/㎖로 사용됨); 항-인간 항체(하기 염색 표 참조; 근적외선 라이브/데드(live/dead) 염료(Invitrogen, cat# L10119); 및 스트렙타비딘 시약, 예를 들어, STP-APC(BD Biosciences cat#554067, Lot#04251)(FACS 완충액 중 1:200 희석액으로 사용됨), STP-PE(Biolegend cat# 405203, Lot#B139688)(FACS 완충액 중 1:200 희석액으로 사용됨), STP-PE Cy7(아이소형 대조군 샘플에서 비특이적 결합을 나타냄), STP-Q605(Invitrogen cat# Q10101MP, Lot#53449A)(FACS 완충액 중 1:200 희석액으로 사용됨).
세포 표면 염색 프로토콜
염색 전에, 1x106 세포를 96-웰 둥근-바닥 플레이트로 옮기고, 150 ㎕ PBS로 세척하였다. 이후, 플레이트를 3분 동안 4℃에서 1300 rpm에서 원심분리시켰다.
이후, 세포를 PBS 중에서 다시 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 원심분리시켰다.
이후, 0.25 ㎕의 근적외선 라이브/데드 염료를 함유하는 50 ㎕ PBS 중에서 라이브/데드 염색을 수행하였다. 실온에서 10분 후, 웰을 150 ㎕ FACS 염색 완충액으로 세척하고, 3분 동안 4℃에서 1300 rpm에서 원심분리시켰다. 상층액을 폐기하였다.
세포를 50 ㎕ FACS 염색 완충액 중 1:100의 인간 혈청으로 블로킹시켰다. 플레이트를 15분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 이후, 웰을 150 ㎕ FACS 염색 완충액으로 세척하고, 3분 동안 4℃에서 1300rpm에서 원심분리시켰다. 상층액을 폐기하였다.
이후, 하기 항체를 함유하는 칵테일을 표면 염색을 위해 각각의 웰에 첨가하였다: 칵테일은 하기 표 3-6에 기재되어 있다. 각각의 칵테일은 관심 집단에 따라 다른 것들과 개별적으로 이용될 것이다.
표 3: 계통 염색
Figure pct00007
표 4: T 세포 염색
Figure pct00008
표 5: DC 염색
Figure pct00009
표 6: 골수 염색
Figure pct00010
표면 염색 후, 세포를 FACS 염색 완충액을 이용하여 이전에 기재된 바와 같이 2회 세척하고, 5분 동안 4℃에서 1300 rpm에서 원심분리하였다. 샘플을 적절한 형광-표지된 스트렙타비딘을 함유하는 50 ㎕의 FACS 염색 완충액에 재현탁시켰다. 샘플을 30분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 150 ㎕ FACS 염색 완충액으로 세척하고, 5분 동안 4℃에서 1300 rpm에서 원심분리시켰다. 샘플을 250 ㎕의 FACS 염색 완충액에 재현탁시키기 전에 상기 세척 단계를 반복하였다. 샘플을 같은 날에 BD LSRFortessa™ 세포 분석기(BD Biosciences)에서 분석하였다.
데이터 분석
흐름세포측정 데이터를 FlowJo Version 9 소프트웨어를 이용하여 재분석하여 특정 표현형 집단을 게이팅시켰다. 다양한 T 세포 서브셋에서의 VISTA 발현을 비교하기 위해 기하 평균의 계산을 이용하였다. 항-VISTA 처리된 샘플의 평균 값으로부터 아이소형 대조군 값을 공제함으로써 각각의 집단을 백그라운드에 대해 표준화시켰다. Prism에서 그래프를 제조하고, 단지 2개의 샘플을 비교하는 경우 스튜던츠 T-검정(student's T-test), 또는 본페로니(Bonferroni) 사후 검정과 함께 일원 분산 분석을 이용하여 통계를 수행하였다.
결과:
인간 골수 및 림프계 서브셋에서의 VISTA의 발현:
도 2a-2e, 3a-3g, 4, 5a-5b 및 6a-6c에 제시된 바와 같이, CD14+ 단핵구에서의 VISTA 발현은 모든 다른 집단과 유의하게 상이하였다(p < 0.001). 다른 집단 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 단핵구는 말초 혈액에서 가장 높은 수준의 VISTA를 발현하였고, CD14+CD16- 서브셋은 CD14loCD16+ 세포보다 유의하게 더 높은 발현을 가졌다. APC는 중간 발현의 VISTA를 나타낸 한편, 림프계 서브셋은 낮은 발현 수준을 나타내었다.
인간 T 및 NK 서브셋에서의 VISTA의 발현:
도 7a-7e, 8a-8g 및 9에 제시된 바와 같이, NK 서브셋과 함께, CD56lo 세포는 CD56Hi NK 세포보다 유의하게 높은 발현 수준의 VISTA를 나타내었다. T 세포 서브셋 중, CD8+ 기억 세포는 가장 높은 발현 수준을 나타내었으나, 이들은 CD8+ 나이브 또는 CD4+ T 세포보다 유의하게 높지는 않다.
인간 수지상 세포 서브셋에서의 VISTA의 발현:
도 10a-10d, 11a-11c 및 12에 제시된 바와 같이, VISTA 발현에서의 유의한 차이가 관찰되지 않았고; DC 및 호염기구는 낮은 발현의 VISTA를 나타내었고, 형질세포형 수지상 세포(pDC)는 일반적으로 더 높으나, 유의한 정도로 높진 않았다.
결론: 이들 결과는 다양한 면역 세포 서브셋에서의 VISTA의 발현을 나타내며, VISTA가 단핵구에서 가장 높게 발현되고, 다양한 T 세포 서브셋 및 NK 세포에서 일부 발현되고, B 세포에서 거의 발현되지 않거나, 발현되지 않는 것을 나타낸다.
실시예 2: 말초 혈액 세포에서의 VISTA 발현
방법:
전체 혈액의 염색: 새로이 분리된 전체 혈액(100 ㎕)을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션에 의해 하기 표시된 바와 같은 항체 칵테일로 염색시켰다. 적혈구(RBC)를 RBC 용해 완충액으로 용해시키고, 나머지 세포를 염색 완충액으로 1회 세척하였다. 세포를 200 ㎕의 염색 완충액에 재현탁시켰다. MACSQuant 흐름세포측정기를 이용하여 데이터를 수집하고, FlowJo 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 염색: 말초 혈액 단핵 세포를 피콜 구배를 이용하여 전체 혈액으로부터 분리시켰다. 새로이 분리된 1x106 PBMC를 100 ㎕의 염색 완충액 중 항체 칵테일로 염색시켰다. 샘플을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 염색 완충액으로 1회 세척하였다. 세포를 100 ㎕의 염색 완충액에 재현탁시켰다. MACSQuant® 흐름세포측정기(Miltenyi Biotec)를 이용하여 데이터를 수집하고, FlowJo 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
사용된 항체는 CD11b, CD33, CD177, CD16, CD15, CD14, CD20, HLADR, CD3, CD4, CD8, CD127, CD69, 및 FOXP3 항체(Biolegend, San Diego, CA)였다. APC-컨쥬게이션된 마우스 항-인간 VISTA(클론 GG8)는 ImmuNext(Lebanon, NH)에 의해 제조되었다.
결론:
건강한 인간 말초 혈액 세포에서의 VISTA의 발현
전체 혈액 및 말초 혈액 단핵 세포를 다색 흐름세포측정기를 이용하여 VISTA 발현에 대해 분석하였다. 도 15a 및 15b에 제시된 바와 같이, 가장 높은 수준의 VISTA 발현이 단핵구에서 검출되었고, 그 다음이 호중구였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두는 도 13c 및 13d에 제시된 바와 같이 낮은 수준의 VISTA를 발현하였다.
암 환자 말초 혈액 세포에서의 VISTA의 발현
도 14a-c에 제시된 바와 같이, 폐암 환자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분석하였다. 도 14a는 CD14+ 단핵구 및 CD15+ 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 분석을 나타내는 대표적 플로우 플롯(flow plot)이다. 결과는 표현형적으로 CD15+인 세포가 호중구 유래 MDSC인 것을 암시한다. 추가로, 이들 세포는 건강한 혈액 샘플에는 부재한다. 도 14b는 건강한 단핵구 및 암 환자 유래 단핵구에서의 VISTA 발현의 대표적 히스토그램이며, 건강한 대조군에 비해 암 환자 세포에서 더 높은 수준의 VISTA 발현을 암시한다. 도 14c에 제시된 바와 같이 유사하게 높은 수준의 VISTA가 암 환자의 MDSC에서 발견되었다.
도 15a는 결장암 환자의 혈액에서의 호중구 유래 MDSC의 존재를 나타내는 대표적 FACS 플롯이다. 도 15b 및 15c는 건강한 공여자 혈액 샘플에 비해 암 환자의 단핵구에서의 더 높은 수준의 VISTA 발현을 나타내는 대표적 히스토그램이다.
시노몰구스 원숭이 말초 혈액 세포에서의 VISTA의 발현
도 16a 및 16b에 제시된 바와 같이, 원숭이 전체 혈액의 흐름세포측정 분석은 인간 세포와 유사한 VISTA 발현 패턴을 나타내었다. 단핵구 및 호중구 둘 모두는 CD4+(도 16c) 및 CD8+(도 16d) T 세포에 비해 가장 높은 수준의 VISTA를 발현하였다.
실시예 3: RNA 수준 및 단백질 수준에서의 헴 악성종양 세포주에서의 VISTA 발현
VISTA는 헴 악성종양에서 발현되므로, 항-VISTA 항체는 파괴를 위한 악성종양 세포를 잠재적으로 표적화할 수 있을 뿐만 아니라 VISTA를 차단하고, 항-종양 면역 반응을 촉진시킨다.
데이터는 ~140 헴 악성종양 세포주(일부 세포주는 분석에서 반복됨)의 RNAseq 분석을 포함한다. 데이터는 도 17에 제시된다.
RNAseq 값은 FPKM(맵핑된 백만개의 단편 당 엑손의 킬로베이스 당 단편) 값으로 나열된다.
본질적으로, 이는 유전자의 엑손 영역에 속하는 모든 판독이 카운트되고, 유전자의 길이 및 샘플 당 판독의 전체 수(샘플간 차이를 설명하기 위함) 둘 모두에 의해 표준화된 것을 의미한다. 컷오프(cutoff) 값은 1이고; 1초과는 VISTA 발현에 대해 양성(RNA 수준)이고, 1 미만은 VISTA 발현에 대해 음성이다.
결과는 많은 세포주가 주로 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병으로 RNA 수준에서 양성임을 나타내었다. 상기는 예상될 수 있는데, 이는 VISTA가 정상 골수 세포에서 고도로 발현되고, 이의 기능이 항-종양 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 약화시키는 것으로 생각되기 때문이다.
실시예 4: VISTA에 대한 모노클로날 항체의 생성
파지 패닝(panning)
Cyno VISTA-His에 반응성인 파지를 농축시키기 위해 24 파지 패닝 실험을 수행하였다. 이들 실험을 위해 시노몰구스 VISTA 단백질을 이용하였는데, 이는 인간 VISTA 단백질보다 나은 비오틴 컨쥬게이션을 나타내었기 때문이다. 파지 실험의 성공을 결정하기 위해, 개별적 패닝 라운드로부터의 파지 풀(pool)을 비오티닐화된 cyno VISTA-His로 코팅된 뉴트라비딘(neutravidin) 플레이트에 첨가하고, HRP-컨쥬게이션된 항-M13 항체로 검출하였다. 개별적 콜로니를 파지 선택 라운드로부터 채집하고, 96 웰 플레이트에서 Fab 단백질을 생성시켰다. 발현된 Fab 상층액을 비오티닐화된 cyno VISTA-His로의 결합에 대해 검정하였다. 이는 200개 초과의 히트(hit)를 발생시켰다.
Fab 플레이트로부터의 VH 및 VL 영역을 증폭시키고, DNA 시퀀싱을 위해 제공하고, FASTA 파일로 내보냈다. MAB로 전환되고 시험되어야 하는 클론을 채집하는 경우, 서열 다양성을 기초로 할 뿐만 아니라 제한된 번역후 변형 위험을 갖고 가능한 한 적은 소수성 잔기를 갖는 클론을 선택하였다.
파지 클론으로부터의 VH 및 VL을 포유동물 IgG1/카파 발현 벡터로 서브클로닝하고, HEK293 세포로 트랜스펙션시켰다. 항체를 Protein A Sepharose Fast Flow 친화성 수지에서 정제하였다. 파지 MAB의 농도를 Nanodrop 측정을 이용한 정량 ELISA에 의해 결정하였다. 항체 패널을 높은 수준으로 발현시켰다. SDS-PAGE 분석은 각각의 발현된 항체 변이체의 온전성을 입증하였다.
VL에서 다양성을 갖는 파지 벡터로의 클로닝을 위한 마지막 라운드의 패닝으로부터의 폴리클로날 항체 혼합물로부터 VH 도메인을 증폭시킴으로써 파지 항체의 인-라인(in-line) 성숙을 수행하였다. 이는 VL에서 추가 다양성을 갖는 것으로 샘플링된 농축된 VH 풀을 발생시켰다. VISTA ECD His 단백질에 대한 매우 높은 친화성 결합체를 확인할 가능성을 갖는 파지를 1-2 라운드의 엄격한 패닝을 통해 획득하였다. 성숙의 성공을 결정하기 위해 모노클로날 Fab ELISA를 수행하였다. ELISA 및 발현 데이터를 본래의 새로운 패닝 실험으로부터 100%로 설정된 참조 클론으로 표준화시키고, 참조 클론보다 cyno VISTA 항원에 대해 더 높은 결합 신호를 갖는 친화성 성숙된 클론을 확인하였다. 이러한 과정은 낮은 항원 농도(1 nM)에서 스크리닝되는 경우 200% 까지의 결합을 나타낸 여러 클론을 발생시켰고, 가장 높은 친화성을 갖는 클론을 시퀀싱하고, MAB로서 생성시켰다.
하이브리도마 생성
한 그룹의 BALB/cAnNCrl 마우스에 완전 프로인트 애쥬번트 중에 에멀젼화된 50 ㎍ Hu VISTA-Ig 재조합 단백질(Sino)의 1회 복막내(IP) 주사를 투여하였고, 2주 후에 불완전 프로인트 애쥬번트 중에 에멀젼화된 50 ㎍ Hu VISTA-Ig 재조합 단백질의 1회 IP 주사를 투여하였다. 2주 후, 마우스에 불완전 프로인트 애쥬번트 중에 에멀젼화된 50 ㎍ cyno VISTA-Fc 재조합 단백질의 1회 IP 주사를 투여하였다. 모든 마우스에 융합을 위한 비장 수거 5일 전에 꼬리 기부에서 PBS 중 25 ㎍ 인간 및 25 ㎍ cyno VISTA의 최종 주사를 투여하였다.
또 다른 그룹의 BALB/cAnNCrl 마우스에 완전 프로인트 애쥬번트 중에 에멀젼화된 50 ㎍ Hu VISTA-His 재조합 단백질의 1회 IP 주사를 투여하였다. 2주 후, 마우스에 불완전 프로인트 애쥬번트 중에 에멀젼화된 50 ㎍ Hu VISTA-His 재조합 단백질의 1회 IP 주사를 투여하였다. 2주 후, 마우스에 불완전 프로인트 애쥬번트 중에 에멀젼화된 50 ㎍ Cyno VISTA-His 재조합 단백질의 1회 IP 주사를 투여하였다. 2주 후, 모든 마우스에 융합을 위한 비장 수거 3일 전에 PBS 중 25 ㎍ Hu VISTA-His 및 25 ㎍ Cyno VISTA-His의 최종 주사를 투여하였다.
융합일에, 마우스를 CO2 질식에 의해 안락사시키고, 비장을 분리시키고, 10 ㎖의 저온 인산염-완충 염수에 두었다. 작은 막자를 이용하여 미세 메쉬(mesh) 스크린을 통해 비장을 분쇄시키고, 실온에서 PBS로 헹굼으로써 비장세포의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 세포를 PBS 중에서 1회 세척하고, RBC 용해에 적용시켰다. 간단히, 세포를 모든 비장 당 3㎖의 RBC 용해 완충액(Sigma #R7757)에 재현탁시키고, 5분 동안 얼음 상에 두었다. 세포를 다시 실온에서 PBS 중에서 1회 세척하고, 자기 분류를 위해 표지하였다. 제조업체의 설명서에 따라, 세포를 항-뮤린 Thy1.2, 항-뮤린 CD11b 및 항-뮤린 IgM 자기 비드(각각 Miltenyi Biotec # 130-049-101, 130-049-601 및 130-047-301)로 표지한 후, Midi MACS와 함께 MS 컬럼을 이용하여 분류하였다. 음성 세포 분획(양성 세포 분획은 폐기함)을 FO 세포에 융합시켰다. 융합을 뮤린 골수종 세포 대 살아 있는 비장 세포의 1:1 비로 수행하였다. 간단히, 비장 및 골수종 세포를 함께 혼합하고, 펠렛화시키고, 50 ㎖의 PBS 중에서 1회 세척하였다. 펠렛을 30초 동안 37℃에서 10e8 비장세포 당 1 ㎖의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 용액(2 g PEG 분자량 4000, 2 ㎖ DMEM, 0.4 ㎖ DMSO)으로 재현탁시켰다. 세포/융합 혼합물을 이후 가벼운 진탕과 함께 약 60초 동안 37℃ 수조에 담궜다. 1분에 걸쳐 37℃ DMEM을 천천히 첨가함으로써 융합 반응을 중지시켰다. 융합된 세포를 실온에서 5분 동안 휴지시킨 후, 5분 동안 150 x g에서 원심분리시켰다. 이후, 세포를 HAT(Sigma cat#H0262)를 함유하는 배지 E-HAT (배지E)(StemCell Technologies cat#03805)에 재현탁시키고, 96-웰 편평 바닥 폴리스티렌 조직 배양 플레이트(Corning # 3997)에 시딩하였다.
cyno VISTA에 특이적인 항체에 대한 하이브리도마 상층액을 스크리닝하기 위해 포획 EIA를 이용하였다. 간단히, 플레이트(Nunc-Maxisorp #446612)를 코팅 완충액(Thermo 28382) 중 염소 항-마우스 IgG(Fc) 항체(Jackson #115-006-071)로 적어도 60분 동안 4 ㎍/㎖로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 200 ㎕/웰의 PBS 중 0.4%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹시켰다. 플레이트를 1회 세척하고, 50 ㎕/웰의 하이브리도마 상층액을 첨가하고, 적어도 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 1회 세척하고, 50 ㎕/웰의 0.1 ㎍/㎖의 cyno VISTA-huIg를 첨가하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 1회 세척하고, 0.4% BSA/PBS 중 1:40,000 스트렙타비딘 HRP(Jackson 016-030-084)을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척한 후, 실온에서 약 10분 동안 인큐베이션하여 100 ㎕/웰의 TMB Turbo 기질(Thermo Scientific 34022)을 이용하여 발달시켰다. 25 ㎕/웰의 4N 황산을 이용하여 반응을 중지시키고, 흡광도를 자동화 플레이트 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 제한 희석에 의한 서브클로닝을 위해 일차 히트 중 15개를 선택하고, 동일한 일차 스크린 포맷으로 스크리닝하였다.
교차반응성을 평가하기 위해 인간 VISTA-Ig를 이용하여 모든 cyno VISTA 반응성 하이브리도마 세포주를 교차 스크리닝하였다. 간단히, 플레이트(Nunc-Maxisorp #446612)를 4℃에서 밤새 0.1M 소듐 카르보네이트-바이카르보네이트 완충액, pH 9.4(Pierce 28382 BupH™) 중 염소 항-ms Fc(Jackson#115-006-071)를 이용하여 4㎍/㎖로 코팅하였다. 세척 없이, 웰을 4℃에서 밤새 200 ㎕의 블록(PBS(Invitrogen) 중 0.4% BSA(Sigma)(w/v))으로 블로킹시켰다. 블록 용액을 제거한 후, 희석되지 않은 하이브리도마 상층액을 실온에서 30분 동안 코팅된 플레이트에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST(PBS 중 0.02% Tween 20(Sigma)(w/v))로 1회 세척한 후, 블록 중에 100 ng/㎖로 희석된 Hu VISTA-Ig와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1회 세척하고, 실온에서 30분 동안 블록 중 1:10,000 희석된 염소 항인간-Fc-HRP(Jackson #109-036-098)로 프로빙시켰다. 플레이트를 다시 세척한 후, 실온에서 약 10분 동안 인큐베이션하여 100㎕/웰의 TMB Turbo 기질(Thermo Scientific 34022)을 이용하여 발달시켰다. 25㎕/웰의 4N 황산을 이용하여 반응을 중지시키고, 흡광도를 자동화 플레이트 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
인간 및 시노몰구스 VISTA 둘 모두에 반응성인 것으로 밝혀진 하이브리도마는 클로닝된 이들의 V 영역 항체 서열을 가졌다. Invitrogen의 SuperScript III 세포 Direct cDNA System을 이용한 역전사효소(RT) 반응 전에 하이브리도마 세포를 제조하였다. 간단히, 배양 배지를 폐기하고, 플레이트를 얼음 상에 두고, 200 ㎕ 저온 PBS 중에 재현탁시켰다. 40 마이크로리터를 MicroAmp fast 96웰 반응 PCR 플레이트로 옮기고, 플레이트를 저온 금속 플레이트 베이스에 두고, 플라스틱 필름으로 밀봉시키고, 3분 동안 700 rpm에서 회전시켰다. PBS를 폐기시키고, 각각의 웰에 10 ㎕의 재현탁 완충액 및 1 ㎕의 용해 인핸서(Lysis Enhancer)를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉시키고, 10분 동안 75℃에서 인큐베이션시키고, -80℃에서 저장하였다.
RT 반응을 위해, 각각의 웰은 5 ㎕ 물, 1.6 ㎕ 10X DNase 완충액, 1.2 ㎕ 50 mM EDTA, 2 ㎕ 올리고(dT)20 (50 mM) 및 1 ㎕ 10 mM dNTP 믹스(Mix)를 함유하였다. 플레이트를 5분 동안 70℃에서 인큐베이션시킨 후, 2분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시킨 후, 다음과 같은 시약을 각 웰에 첨가하였다; 6 ㎕ 5X RT 완충액, 1 ㎕ RNaseOUT™(40 U/㎕), 1 ㎕ SuperScript™ III RT(200 U/㎕) 및 1 ㎕의 0.1M DTT. 플레이트를 밀봉시키고, 50℃로 미리 가열된 열 싸이클러(thermal cycler) 상에 두고, 50분 동안 50℃에서 인큐베이션시킨 후, 비활성화(85℃에서 5분 인큐베이션)시켰다. 반응물을 얼음 상에서 냉각시키고, 단일-가닥 cDNA를 추가 사용 때까지 -80℃에 저장하였다.
V 영역 증폭을 위해, 20 ㎕ PCR 반응을 설정하였다. 각각의 웰은 16.2 ㎕ 물, 2.0 ㎕ 10X PCR 반응 완충액, 0.8 ㎕ MgSO4(50 mM), 0.4 ㎕ 10mM dNTP, 0.15 ㎕ 100 uM 정방향 프라이머 믹스, 0.05 ㎕ 100 uM 역방향 프라이머, 0.2 ㎕ HiFi Tag 효소를 함유하였다. 상기 기재된 바와 같이 제조된 cDNA를 PCR 성분 혼합물로 전달(2 ㎕/웰)하고, 플레이트를 밀봉시키고, 증폭 반응을 수행하였고; VH에 대해 프로그램은 (i) 1분 동안 94℃ (ii) 15초 동안 94℃ (iii) 30초 동안 55℃ (iv) 1분 동안 68℃였다. 단계 (ii - iv)를 전체 35 주기 동안 반복한 후, 3분 동안 68℃에서 최종 신장시켰다. VL에 대해 프로그램은 (i) 1분 동안 94℃ (ii) 15초 동안 94℃ (iii) 30초 동안 55℃ (iv) 30초 동안 65℃, (v) 1분 동안 68℃였다. 단계 (ii - v)를 전체 35 주기 동안 반복한 후, 3분 동안 68℃에서 최종 신장시켰다.
정방향 프라이머를 미리 혼합하고, 상기 혼합물을 역방향 프라이머와 3:1 할당량으로 사용하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔에서 확인하였다. 인핸서(In-Fusion HC Cloning Kit, cat #639650, Clontech)의 첨가에 의해 주입 클로닝을 위한 반응물을 제조하였다. 5 마이크로리터의 PCR 반응물을 PCR 플레이트로 옮긴 후, 2 ㎕의 인핸서/웰을 전달하였다. 플레이트를 밀봉시키고, 열 사이클러에서 인큐베이션(37℃에서 15분 및 80℃에서 15분)시켰다. Esp3I 분해에 의해 목적 벡터(vDR243 또는 vDR301)를 제조하였다; (1.5㎍ 벡터를 2시간 동안 37℃에서 30 ㎕ 반응으로 3 ㎕ Tango 완충액, 2 l Esp3I 및 물 중에서 분해시켰다).
주입 클로닝을 위해, 2 ㎕의 인핸서 처리된 PCR 생성물을 100 ng의 Esp3I 분해된 벡터 및 2 ㎕의 5X 주입 효소(Clontech)와 혼합하였다. 주입 반응을 96-웰 PCR 플레이트 포맷으로 수행하였다. 플레이트를 PCR 기계 상에서 50℃에서 15분 동안 인큐베이션시키고, Stella 적격 세포를 진탕 없이 42℃에서 40초 동안 열 충격에 의해 형질전환시키고, 선택된 항생제를 갖는 LB 아가 플레이트 상에 스프레딩시키고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날, 콜로니를 LB/카르베니실린(Carbenicillin) 배지를 함유하는 96-웰 딥(deep) 웰 플레이트로 채집하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 동결된 스톡을 동등한 부피의 30% w/v 글리세롤과 혼합하여 밤새 배양물로부터 제조하였다. V 영역을 시퀀싱 프라이머 SPF0052를 이용하여 시퀀싱하였다. 서열을 분석하고, 하이브리도마 vH 및 vL 당 1개의 양성 웰을 선택하고, 새로운 플레이트에 재어레이시키고, 앰피실린을 갖는 농축 배지에서 밤새 성장시켰다. 이후, 클론은 96-웰 플레이트 중에 소규모 트랜스펙션을 위해 제조된 미니프렙 DNA를 가졌다.
중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대한 48개의 선택된 마우스 하이브리도마 서열을 내부 소프트웨어 프로그램을 이용하여 인간 프레임워크 적합화시켰다. 마우스 vH 또는 vL의 각각의 하나에 대해 1개의 인간 프레임워크를 선택하였다. V 영역 DNA 서열을 역-번역을 통해 획득하였다. HFA 아미노산 서열에 해당하는 합성 DNA 영역을 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)로부터 주문하였다. 클로닝을 미리 절단된 vDR149 및 vDR157, 인간 IgG1 및 인간 카파 각각으로 수행하였다. DNA를 제조하기 위해 Qiagen Endo-free Maxi-prep 키트를 사용하였다. 상기 항체 패널을 발현시키기 위해 Expi293(100 ㎖) 배양물을 이용하였다.
실시예 5: 시험관 내에서 인간 VISTA-Ig T 세포 억제 검정을 위한 프로토콜
마우스 A20 세포를 GFP 또는 인간 VISTA로 안정적으로 트랜스펙션시켰다. 이들을 ova 펩티드 및 DO11.10 T 세포와 함께 인큐베이션시켰다. T 세포에 의한 CD25 발현을 인큐베이션 시작 24시간 후에 측정하였다. A20-huVISTA 세포는 T 세포에 의한 CD25 발현을 억제하나, 이러한 판독은 VSTB95와의 인큐베이션에 의해 유의하게 회복된다(도 18).
실시예 6: 항-VISTA 항체의 인간 프레임워크 영역 적합화
중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대한 마우스 하이브리도마 서열을 내부 소프트웨어 프로그램을 이용한 CDR-이식(Jones, et al. Nature, 321: 522-525 (1986))에 의해 인간 프레임워크 적합화시켰다. 상기 프로그램은 케이뱃(Kabat) 정의(Wu, T. T. & Kabat, E. A. (1970). J Exp Med , 132, 211-50)에 따라 V 영역 서열의 상보성 결정 영역(CDR)을 기술하며, Blast를 이용하여 프레임워크 영역과 인간 점라인 유전자를 비교한다. 마우스 프레임워크와 가장 높은 서열 동일성을 갖는 인간 점라인을 인간 프레임워크 적합화(HFA)를 위한 수용체 유전자로 선택하였다. 소수 경우에서, 잘-표현된 인간 프레임워크를 이용한 이전의 경험을 기초로 하여 밀접하게 관련된 인간 점라인 유전자를 대신 선택하였다. 마우스 vH 또는 vL V 영역 중 각각 하나에 대해 선택된 인간 프레임워크에 대한 DNA 서열을 역-번역을 통해 획득하였다. HFA 아미노산 서열에 해당하는 합성 DNA 영역을 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)로부터 주문하였다. 클로닝을 인간 IgG1 및 인간 카파로 각각 수행하였다.
실시예 7: 항-VISTA 항체 작제물
세포주 개발을 위한 분자에 대한 플라스미드 및 서열 정보: VSTB112 가변 영역 및 IgG1κ 불변 영역(VSTB174, 불변 영역 내에서의 동종이형 변화로 인해 새로운 번호), IgG2시그마 불변 영역(VSTB140) 또는 IgG1 프로테아제-내성 불변 영역(VSTB149)을 갖는 항-VISTA 항체에 대해 플라스미드 작제물을 생성시켰다.
론자(Lonza) 벡터
포유동물 발현 세포주에서 치료 mAb의 생성을 위한 일차 발현 시스템으로서 pEE6.4 및 pEE12.4 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 발현 벡터 시스템(Lonza Biologics, PLC)을 Biologics Research(BR) 및 Pharmaceutical Development & Manufacturing Sciences(PDMS)에서 확립시켰다. 각각의 벡터는 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC)의 발현을 유도하기 위해 인간 사이토메갈로바이러스(huCMV-MIE) 프로모터를 함유하고, 앰피실린 내성 유전자를 함유한다. pEE12.4 벡터는 또한 글루타민 신세타제(GS) 효소를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 발현 벡터(GS Gene Expression System Manual Version 4.0)를 유지시키기 위해 글루타민 신세타제 활성을 필요로 하는 성장 조건이 세포에 대해 선택압으로 두어진다. 단일 유전자 벡터로서 HC 유전자를 클로닝하기 위해 pEE6.4를 사용하였고, LC 유전자를 클로닝하기 위해 pEE12.4를 사용하였다. 이들 2개의 론자 단일 유전자 벡터로부터 론자 이중 유전자 플라스미드를 생성시켰다.
선택된 VISTA mAb의 가변 중쇄 영역의 아미노산 서열
> VSTB112 중쇄 (SEQ ID NO:37)
Figure pct00011
> VSTB50 중쇄 (SEQ ID NO:38)
Figure pct00012
> VSTB53 중쇄 (SEQ ID NO:39)
Figure pct00013
> VSTB95 중쇄 (SEQ ID NO:40)
Figure pct00014
선택된 VISTA mAb의 가변 경쇄 영역의 아미노산 서열
>VSTB50 경쇄 (SEQ ID NO:41)
Figure pct00015
>VSTB53 경쇄 (SEQ ID NO:42)
Figure pct00016
>VSTB95 경쇄 (SEQ ID NO:43)
Figure pct00017
>VSTB112 경쇄 (SEQ ID NO:44)
Figure pct00018
>VSTB116 경쇄 (SEQ ID NO:45)
Figure pct00019
실시예 8: 항-VISTA 항체의 ELISA 및 FACS 스크리닝
이들 실험은 ELISA에서 인간 또는 시노몰구스 VISTA 단백질에 결합하는 생성된 항체의 능력을 결정할 뿐만 아니라 FACS 스크리닝을 이용하여 인간 또는 시노몰구스 VISTA 단백질을 발현하는 K562 세포(인간 골수성 백혈병 세포주)의 표면 상의 VISTA 단백질에 결합하는 항체의 능력을 결정하기 위한 것이었다.
방법:
ELISA 절차 요약: 플레이트를 각각의 종으로부터의 VISTA의 세포외 도메인인 1 ㎍/㎖의 SB0361(인간) 또는 SB0361(cyno(시노몰구스)) 단백질로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 항체를 전체 4개의 농도에 대해 1:4의 단계적 희석과 함께 시작 농도로서 1 ㎍/㎖로 희석시키고, 2시간 동안 실온(RT)에서 인큐베이션하였다. 검출을 위해 마우스 항-인간 IgG1-HRP(호스라디쉬 퍼옥시다제)를 이용하였고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 세척을 PBS-Tween(0.05%)을 이용하여 수행하였다.
FACS 절차 요약: 2 x 105 K562-G8(인간) 또는 K562-C7(cyno) 세포를 5 ㎍/㎖의 각각의 시험 항체로 염색하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 염소 항-인간 IgG1-PE(피코에리트린) 항체를 5 ㎍/㎖로 이차 검출 항체로서 사용하였다. 세포를 BD Fortessa에서 유동시키고, 살아 있는 집단의 MFI(평균 형광 강도)에 대해 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., Ashlang, OR)를 이용하여 분석하였다.
데이터 분석/결과: 각각의 항체에 대해, 4개의 검정 각각에 대한 ELISA 및 FACS 분석 둘 모두에 대해 항체가 확실하게 결합되었는지 아닌지 결정하는 것과 관련하여 주관적 스코어(있음/없음)를 제공하였다. 항체가 어느 한 검정에서의 결합에 대해 "없음" 결과를 제공한 경우, 이는 음성인 것을 확인하기 위해 이를 반복하였다. 결과는 하기 표 7 및 도 19a-19f 및 20a-20f에 제시된다.
표 7.
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 9: 혼합된 림프구 반응(MLR) 및 스태필로코커스(Staphylococcus) 장독소 B(SEB) 활성화 검정을 이용한 항-인간 VISTA 항체의 스크리닝 결과
본 연구의 목적은 혼합된 림프구 반응(MLR) 검정 뿐만 아니라 스태필로코커스 장독소 B 활성화(SEB) 검정에서 세포 면역 반응을 향상시키는 다수의 기능성 α-VISTA 항체의 확인을 뒷받침하는 데이터를 제시하기 위한 것이었다.
혼합된 림프구 반응(MLR)은 동종이형 T 세포 반응을 유도하기 위해 MHC 클래스 I 및 II 미스매칭에 의존하는 표준 면역학적 검정이다. 말초 혈액 단핵 세포를 2개의 미스매치된 개체로부터 분리시키고, 함께 인큐베이션시키고, 이들 미스매치의 결과로서, 증식 및 사이토카인 생성이 발생하였다.
재료 및 방법:
500 ㎖의 RPMI와 50 ㎖의 인간 AB 혈청, 5 ㎖의 페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/㎖), 5 ㎖의 L-글루타민(100x) 및 10 ㎖의 HEPES(1M)를 조합시킴으로써 10% AB 배지를 제조하였다. 배지를 14일 이하 동안 저장하였다. 0.2 ㎖의 티미딘 스톡(1 mCi/㎖)을 9.8 ㎖의 RPMI 중에 희석시킴으로써 1 mCi 적정된 티미딘을 제조하였다.
가용성 VISTA 항체를 10% AB 혈청 배지 중에서 20 ㎍/㎖로 희석시켰다. 100 ㎕의 적절한 항체 용액을 96 웰 U-바닥 플레이트(Falcon product #353077 또는 동등물)의 적절한 웰에 첨가하였다. 다양한 세포 집단을 첨가한 후, 최종 농도는 10 ㎍/㎖였다.
백혈구의 분리: 공여자는 적어도 18세 연령이었고, 전반적으로 건강하고, 국소 집단으로부터 무작위적으로 선택하였다. 분리 튜브로부터 공여자 혈액을 50 ㎖ 코니칼로 옮겼다. 25 ㎖ 혈액 당 15 ㎖의 Ficoll 1077을 혈액과 혼합되지 않도록 조심스럽게 밑에 놓았다. 제동 없이 실온에서 25분 동안 1250g에서 세포를 원심분리시켰다. 백혈구를 Ficoll과 혈청의 인터페이즈(interphase)에서 분리시키고, 세포를 40 ㎖의 행크 평형 염 용액(HBSS)으로 희석시켰다. 세포를 4℃에서 10분 동안 453g(1500 rpm)에서 원심분리시켰다. 세포를 50 ㎖의 HBSS에 재현탁시키고, 500 ㎕를 별개의 튜브로 옮김으로써 카운팅하였다.
혼합된 림프구 반응(MLR) 96 웰 플레이트 설정: 분석되는 샘플의 수를 기초로 하여 검정에 필요한 "자극자 세포" 및 "반응자 세포"의 적절한 수를 결정하였다. 자극자 집단을 96 웰 U-바닥 플레이트의 웰 당 0.5 x 105 세포로 시딩하고, 반응자 집단을 96 웰 U-바닥 플레이트의 웰 당 1.0 x 105 세포로 시딩하였다. 모든 조건은 삼중으로 수행해야 한다. 적절한 수의 "자극자 세포"를 새로운 코니칼로 피페팅하고, 이전에 기재된 바와 같이 원심분리시켰다. 세포를 10 ㎖에 재현탁시키고, 4000 래드로 조사하였다. 이전에 기재된 바와 같이 세포를 원심분리시키고, 10% AB 혈청 배지 중에 1 x 106/㎖의 농도로 재현탁시키고, 적절한 웰에 50 ㎕를 첨가하였다. 필요한 수의 반응자 세포를 분리시키고, 이전에 기재된 바와 같이 원심분리시키고, 10% AB 혈청 배지 중에 2 x 106/㎖의 농도로 재현탁시키고, 적절한 웰에 50 ㎕를 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 5일 동안 세포를 인큐베이션시켰다. 5일째에, 인터페론 감마(IFN-γ) 생성의 분석을 위해 30 ㎕의 상층액을 분리시켰다. 5일째에, 각각의 웰에 25 ㎕의 40 μCi/㎖ 적정된 티미딘 용액을 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 8시간 동안 인큐베이션하였다. 제조업체의 설명서에 따라 세포를 96 웰 마이크로 신틸레이션 플레이트로 옮겼다. 제조업체의 설명서에 따라 마이크로 신틸레이션 카운터를 이용하여 카운팅하였다. 제조업체의 프로토콜을 이용하여 ELISA(eBioscience cat# 88-7316-88)에 의해 IFN-γ 농도를 결정하였다.
데이터 분석: 처리되지 않은 웰에 대한 평균 분당 카운트(CPM) 또는 IFN-γ 농도를 계산하였다. 시험 그룹 각각에 대해 평균 CPM 또는 IFN-γ를 계산하였다. 데이터 세트를 Log10 변환시켰다. 각각의 화합물에 대해 12 MLR 배수-스코어를 이용하여, 각각의 화합물의 12개의 시험 그룹의 세트에 대한 평균을 계산하였다. 12개의 실험에 대한 평균 스코어 = ∑ [(log10 (시험 화합물에 대한 삼중의 평균 CPM)) - (log10 (비처리에 대한 삼중의 평균 CPM))]/12
인수 기준(acceptance criteria): 모든 시험 시약 및 적절한 대조군을 검정을 수행하기 전에 내독소에 대해 시험하고, < 0.1 EU/㎎의 수준을 갖는다. 반응자 세포 단독은 평균적으로 700 CPM 미만의 CPM 카운트를 가졌고, 이는 세포가 단독으로 인큐베이션되는 경우에 정지 세포인 것을 나타낸다. MLR 그룹에 대한 CPM은 단독으로 인큐베이션된 반응자 세포에 대한 CPM보다 적어도 2배 더 높았고, 이는 반응이 발생하고, 공여자가 미스매치인 것을 나타낸다. 모든 MLR 검정은 인간 IgG1 음성 대조군 단백질을 포함하였다. 인간 IgG1 음성 대조군의 결과는 스튜던츠 t-검정의 사용을 기초로 하여 처리되지 않은 샘플과 통계적으로 상이하지 않았다.
MLR에서의 항-VISTA 항체의 스크리닝: 모든 화합물의 최초 스크린. 항-VISTA 항체를 이용한 MLR을 수행하기 전에, 항체는 FACS 분석을 통해 세포 결합된 VISTA 및 ELISA를 통해 VISTA 단백질 둘 모두에 결합하는 것을 확인하였다. 항체 S26(VSTB77), S30(VSTB86), S31(VSTB88), S32(VSTB90) 및 S39(VSTB74)는 상기 최초 스크린에 실패하였으나, 본 검정에서 또한 시험하였다. 최초 스크리닝의 목적을 위해, 모든 항체를 MLR에서 10 ㎍/㎖로 시험하였고, 증식 및 IFN-γ가 측정된 파라미터였다(도 21a-21d 및 22a-22b).
6개의 선도 항체의 선택. 최초 스크린으로부터, 추가 분석을 위해 6개의 후보를 선택하였다: VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47).
MLR에서 상위 6개의 후보의 희석 연구: 프로토콜 조정. 프로토콜은 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01 및 0 ㎍/㎖의 농도로 항체를 희석시킨 조정과 함께 이전에 기재된 것과 동일하다.
IC50 값의 결정: 항체 각각에 대한 IC50을 결정하기 위해 미가공 CPM 카운트 및 IFN-γ 농도를 이용하였다. 프로그램 "EZ-R 스탯(stats)"의 사용을 통해 IC50의 계산을 결정하였다. IC50 값을 결정하기 위해 6개의 개별적 반응자를 이용하였다. 선도 후보의 용량 적정과 함께 MLR에서의 개별적 CPM 카운트 및 IFN-γ 농도.
표 8: MLR에서의 CPM 및 IFN-γ 둘 모두에 대한 IC50 값
Figure pct00022
결론: 최초 스크린은 다수의 VISTA 특이적 항체가 MLR 세포 면역 반응을 향상시킬 수 있는 것을 나타내었다. 이후, 효능 및 분산 및 상기 결과를 기초로 하여 항체의 등급을 나누고, 용량-적정 실험에서 평가하기 위해 VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 및 VSTB60을 선택하였다. VSTB60은 용량-적정 실험에서 다른 5개의 항체보다 약한 반응을 유도하였다.
스태필로코커스 장독소 B(SEB) 활성화 검정: SEB는 특이적 Vβ+ T 세포의 활성화를 유도하는 박테리아 초항원이다. 말초 혈액 단핵 세포를 분리시키고, 배양시 SEB 항원과 함께 인큐베이션시켰고, 이는 강한 사이토카인 생성을 유도한다. 본 검정을 5개의 선도 후보에 대해 수행하였다.
10% AB 배지의 제조, 1 mCi 적정된 티미딘의 제조, 가용성 VISTA 항체의 제조, 및 백혈구의 분리를 모두 MLR에서 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다.
SEB 96 웰 플레이트 설정: 분석되는 샘플의 수를 기초로 하여 검정에 대해 필요한 반응자 세포의 적절한 수를 결정하였다. 반응자 집단을 96 웰 U-바닥 플레이트의 웰 당 2.0 x 105 세포로 시딩하였다. 모든 조건은 삼중으로 수행해야 한다. 세포를 이전에 기재된 바와 같이 원심분리시키고, 10% AB 혈청 배지 중에 4 x 106/㎖의 농도로 재현탁시키고, 적절한 웰에 50 ㎕를 첨가하였다. 40 ng/㎖의 농도로 SEB 항원을 함유하는 50 ㎕의 10% AB 혈청 배지를 첨가하였다. 기재된 실험에서, SEB를 Sigma Aldrich(cat# S0812)로부터 획득하였다. 웰 내에서의 최종 농도는 10 ng/㎖였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 3일째에, IFN-γ 생성의 분석을 위해 30 ㎕의 상층액을 분리시켰다. 각각의 웰에 25 ㎕의 1 mCi/㎖ 적정된 티미딘 용액을 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 8시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 제조업체의 설명서에 따라 96 웰 마이크로 신틸레이션 플레이트로 옮겼다. 제조업체의 설명서에 따라 마이크로 신틸레이션 카운터를 이용하여 카운팅하였다. IFN-γ 농도를 제조업체의 프로토콜을 이용하여 ELISA(eBioscience cat # 88-7316-88)에 의해 결정하였다.
프로토콜: 데이터 분석. 모든 농도에서 항체 각각에 대한 평균 분당 카운트(CPM) 또는 IFN-γ 농도를 계산하였다. 인수 기준을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. IC50 값의 결정을 기재된 바와 같이 수행하였다. 선도 후보의 용량 적정과 함께 SEB 검정에서의 개별적 CPM 카운트 및 IFN-γ 농도.
표 9: SEB에서의 CPM 및 IFN-γ 둘 모두에 대한 IC50 값.
Figure pct00023
결론: VISTA 특이적 항체는 SEB 검정에서 용량 의존 방식으로 사이토카인 생성 및 증식을 향상시켰다. SEB 연구로부터의 IC50 값은 일반적으로 MLR 희석 연구로부터의 결과와 유사하였다.
실시예 10: 에피토프 비닝(BINNING) 검정
방법: 에피토프 비닝을 수행하기 위해 ProteOn XPR36 시스템(BioRad)을 이용하였다. ProteOn GLC 칩(BioRad, Cat#176-5011)을 아민-커플링 화학(BioRad, cat #176-2410)을 위한 제조업체의 설명서를 이용하여 2개 세트의 6개의 모노클로날 항체(mAbs)로 코팅하였다.
경쟁 mAb를 실온에서 4시간 동안 인간 VISTA(25 nM 최종 농도)와 함께 과량(250 nM 최종 농도)으로 예비 인큐베이션하고, 한번에 6개를 4분의 회합 시간 후 5분의 해리 시간과 함께 코팅된 mAb의 패널로 코팅된 칩 상에 유동시켰다. 각각의 유동 후, 칩을 100 mM 인산으로 재생시켰다.
데이터 분석은 리간드에 의해 모든 센소그램을 그룹화시키고, X 및 Y 축 정렬, 및 아티팩트 제거(artifact removal)를 자동적으로 수행하는 정렬 위저드(wizard)를 적용시키는 것을 수반하였다. 이후, 인터스팟(Interspot) 정정을 데이터에 적용시켰다.
비-경쟁 mAb는 동일하거나 > A1 신호(인간 VISTA 단독으로의 결합)의 결합 신호를 갖는 것으로 규정되었다.
경쟁 mAb는 << A1 신호(즉, 인간 VISTA 단독으로의 결합)의 결합 신호를 갖는 것으로 규정되었다.
결과: 도 23에 제시된 센소그램의 예에서, VSTB85 항체를 Proteon SPR 칩 상에 코팅하고, 표시된 경쟁자와 함께 예비 인큐베이션된 VISTA 단백질을 칩 상에서 유동시켰다. VSTB50은 비-경쟁 항체의 예인데, VISTA/VSTB50 복합체가 유동된 경우에 양성 반응이 관찰되었기 때문이다. VISTA와 복합체화된 GG8, VSTB49 및 VSTB51은 칩 상에 코팅된 VSTB85에 결합하지 않았고, 따라서 VSTB85와 VISTA 상의 동일한 결합 부위에 대해 경쟁하는 것으로 분류되었다.
표 10:
Figure pct00024
Figure pct00025
실시예 11: ProteOn 친화성 결정
항체를 항-IgG Fc 코팅된 표면을 이용하여 ProteOn 칩 상에서 포획시켰다. 항체를 0.39 nM 내지 100 nM 범위의 VISTA 단백질의 농도로 인간 및 시노몰구스(cyno) VISTA 세포외 도메인(ECD)의 결합에 대해 시험하였다. 항원을 4분 동안 항체-코팅된 칩에 결합/회합시키고, 이시간 후 해리를 30분 동안 모니터하였다. 칩을 18초 동안 100 mM 인산의 2회 처리로 재생시켰다. 모든 실험을 25℃에서 수행하고, 데이터를 1:1 랑무이(Langmuir) 결합 모델로 적합화시켰다.
실시예 12: MB49 뮤린 방광 종양 모델에서의 항-VISTA 처리의 효과
방법:
C57Bl/6 마우스에 MB49 종양 세포를 주사하였다. 종양이 확립된 후, 항-VISTA 처리를 개시시켰다. 이후, 종양 성장을 주 당 3회로 모니터하였다. 종양이 임의의 치수에서 15 mm에 도달한 후 IACUC 규정에 따라 마우스를 안락사시켰다.
각각의 실험에 대해, MB49 세포의 동결된 바이알을 해동시키고, 10% 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 갖는 RPMI 1640(+ L-Glut)에서 성장시켰다. 배양 3일 후, 세포를 StemPro Accutase를 이용하여 수거하고, 5x106 세포/㎖의 농도로 RPMI에 재현탁시키고, 마우스 당 50 ㎕ 주사하였다.
6-8주령의 암컷 C57Bl/6 마우스를 National Cancer Institute로부터 구입하였다. 도착시, 이들을 1일 동안 순응시킨 후, 이들의 우측 옆구리를 면도하고, 이들의 꼬리를 문신하였다. 이후, 3-5일 후에 이들에게 주사하였다.
종양 주사(피내): 마우스의 면도된 옆구리에 50 ㎕의 MB49 세포 현탁액(~250,000 세포)을 피내(i.d.) 주사하였다.
종양 성장 모니터링: 종양 성장을 먼저 가장 넓은 치수(L) 전체에 걸쳐 그리고 둘째로 첫번째 측정에 대해 90° 각도(W)로 전자 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 종양 부피를 하기와 같이 유도하였다:
부피 = (L 2 *W 2 )/2
종양은 이들이 ~5mm 직경(~60 mm3 부피)에 도달한 경우에 확립된 것으로 간주하였다. 확립된 후, 처리를 개시하였다. 종양 성장을 처리 과정에 걸쳐 실험이 종료될 때까지 주 당 3회 측정하였다.
항-VISTA 처리: 키메라화된 13F3-mIgG2a 모노클로날 항체를 10 ㎎/㎏로 복막내 주사하였다. 주사 스케줄은 4주 동안 매주 3회였다.
마우스 안락사: IACUC 필요조건에 따라, 종양이 가장 긴 치수에 있어서 15mm에 도달한 후에 동물을 안락사시켰다.
효능 분석: 마우스 종양 부피를 데이터 관리를 위해 Excel, 및 그래프화를 위해 GraphPad Prism을 이용하여 분석하였다. R 통계 계산 소프트웨어에 대한 매크로(macro)를 이용하여 통계 분석을 수행하였다.
실험 계획은 도 24에 제시되어 있다.
결과:
암컷 마우스에서의 Ch13F3-mIgG2a 처리는 동물 중 70%에서 완전한 종양 거부(CR) 및 30%에서 부분적 완화(PR)를 발생시켰다(n=7)(표 13 및 도 25b). 대조적으로, 대조군 mIgG2a-처리된 마우스 모두는 종양의 점진적 성장(6/6)을 나타내었다(도 25a). 이들 데이터는 항-VISTA 처리가 종양 성장에 대해 현저한 효과를 가질 수 있음을 입증한다.
표 11: 완전 완화(CR) 대 부분적 완화(PR)
Figure pct00026
전체내용이 본원에 포함되는 문헌[Wang et al., 2011, 상기]로부터 적합화된 인간 VISTA 서열이 도 26 및 27에 제시되어 있다.
실시예 13: 수소/중수소(H/D) 교환 연구를 이용한 항-VISTA 항체의 에피토프 맵핑
인간 VISTA에 대한 VSTB50, 60, 95 및 112에 대한 에피토프를 확인하기 위해, 해당 Fab를 이용하여 용액 수소/중수소 교환-질량분광법(HDX-MS)을 수행하였다. H/D 교환을 위해, Fab 변동(perturbation)을 분석하기 위해 사용된 절차는 일부 변형과 함께 이전에 기재된 것과 유사하였다(Hamuro et al., J. Biomol. Techniques 14:171-182, 2003; Horn et al., Biochemistry 45:8488-8498, 2006). Fab를 Pierce Fab 제조 키트(Thermo Scientific, Cat# 44985)를 이용하여 파파인 분해 및 단백질 A 포획에 의해 IgG로부터 제조하였다. 인간 VISTA 단백질 서열은 6개의 N-결합된 당화 부위를 함유한다. 서열 범위를 개선시키기 위해 단백질을 PNGase F로 탈당화시켰다. 탈당화된 VISTA 단백질을 교환 가능한 수소 원자에서 중수소 혼입을 발생시키는 소정의 시간 동안 중수소화 수용액 중에서 인큐베이션시켰다. 중수소화 VISTA 단백질을 30초, 2분, 10분 및 60분 동안 4℃에서 46 ㎕ 중수소 옥사이드(D2O) 중에서 VSTB50, VSTB60, VSTB95 또는 VSTB112의 Fab와의 복합체 상태로 두었다. 교환 반응을 낮은 pH에 의해 켄칭시키고, 단백질을 펩신으로 분해시켰다. 확인된 펩티드에서의 중수소 수준을 LC-MS에서의 질량 변화로부터 모니터하였다. 참조 대조군으로서, VISTA 단백질을 Fab 분자와 복합체 상태로 두지 않는 것을 제외하고는 유사하게 처리하였다. Fab에 결합된 영역은 교환으로부터 비교적 보호된 부위이고, 따라서 참조 VISTA 단백질보다 높은 분획의 중수소를 함유하는 것으로 추측하였다. 특정 펩티드에 대해 약 94%의 단백질이 맵핑될 수 있었다.
VSTB50/VSTB60, 및 VSTB95/VSTB112을 이용한 VISTA의 용액 HDX-MS 변동 맵이 각각 도 28 상부 및 하부에 제시된다. 2개의 에피토프 그룹이 확인되었다. 항-VISTA VSTB50은 VSTB60이 인지하는 것과 동일한 에피토프를 인지하고; VSTB95는 VISTA에 대해 VSTB112가 결합하는 것과 또 다른 에피토프 영역에 결합한다. 항-VISTA VSTB50 및 60은 세그먼트, 103NLTLLDSGL111(SEQ ID NO:62), 및 136VQTGKDAPSNC146(SEQ ID NO:63)를 포함하는 동일한 에피토프를 공유한다(도 28 상부). 항-VISTA VSTB95 및 112는 세그먼트 27PVDKGHDVTF36(SEQ ID NO:75), 및 54RRPIRDLTFQDL65(SEQ ID NO:65)를 포함하는 유사한 에피토프를 표적화하는 것으로 보인다(도 28 하부). 잔기 39-52 및 118-134를 포함하는 VSTB95 및 112에 의해 약한 변동을 나타내는 2개의 다른 세그먼트가 존재한다. 그러나, 감소의 수준은 차분 맵(differential map)에서 이전 영역(27-36 및 54-65)만큼 강하지 않았다. VSTB95 및 112에 의해 강한 변동을 나타내는 한 펩티드인 100TMR102가 VISTA 표면의 다른 면에 위치하나, 이는 에피토프 영역 27-36 및 54-65로부터 멀리 떨어져 있다. 이러한 변동은 알로스테리 효과로 인한 것이었을 수 있다. 이들 HDX-MS 결과는 항-VISTA 항체에 대한 펩티드 수준 에피토프를 제공한다. 이들 2개의 에피토프 그룹에 대해 중첩 에피토프 영역이 존재하지 않았다. 이들 결과는 이들이 서로 경쟁하지 않는다는 이전의 경쟁 비닝 데이터와 일치한다.
실시예 14: 단백질 결정학에 의한 인간 VISTA ECD:VSTB112 Fab 복합체의 구조 결정
VISTA 구조를 결정하고, VISTA 세포외 도메인(ECD)과 선도 항체 VSTB112의 Fab 단편 사이의 상호작용을 규정하는 에피토프 및 파라토프를 설명하기 위해, 복합체를 결정화시키고, 구조를 1.85 Å 해상도로 결정하였다. 항체 VSTB112의 Fab 단편과 복합체화된 인간 VISTA의 ECD의 구조를 VISTA ECD 자체의 구조를 결정하고, 상기 상호작용에 대해 에피토프/파라토프를 규정하기 위해 결정하였다. 구조는 VISTA가 TCR Vα 사슬과 유사한 사슬 토폴로지(topology)를 갖는 IgV 폴드를 채택하는 것을 나타낸다. β-샌드위치의 후면 및 전면에서 B 및 F 가닥을 가교시키는 정준 이황화 결합에 더하여, 구조는 ECD가 하나는 CC' 루프를 전면 시트에 구속시키고, 두번째 것은 A'과 G' 가닥 사이를 구속시키는 2개의 추가 이황화 결합을 갖는 것을 나타낸다. VISTA 분자 사이의 결정 접촉이 존재하나, 이들은 작고, 이들 구조에 기초하여 VISTA ECD의 이합체에 대한 증거가 없다. VSTB112 에피토프는 전면 베타 시트(C'CFG)의 가장 가까운 루프의 잔기와 함께 VISTA BC, CC', 및 FG 루프의 일부를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 파라토프는 주로 CDR L3과의 중쇄 상호작용으로 편향되어 최소 접촉을 이룬다.
VISTA:VSTB112 상호작용을 규정하는 에피토프/파라토프
VSTB112 Fab는 VISTA ECD 결합시 1024.3 Å2의 표면 영역을 묻으며, 중쇄 표면의 묻힘은 상기 전체의 715.3 Å2에 해당한다. VISTA와 VSTB112 경쇄 사이에 7개의 수소결합 및 4개의 염 브릿지 상호작용이 형성되고, VISTA와 VSTB112 중쇄 사이에 10개의 수소결합 및 2개의 염 브릿지 상호작용이 형성된다. VSTB112는 FG 루프에 가까운 말단에서 전면 시트 가닥 C', C, F, 및 G 내의 잔기 뿐만 아니라 BC, FG, 및 CC' 루프 내의 잔기를 인지한다(도 29 및 30). CC' 루프와의 상호작용은 Fab 경쇄와의 접촉 대부분을 담당하며, FG 루프 내의 잔기 E125 및 R127만 추가 경쇄 상호작용을 이룬다. VISTA FG 루프에 해당하는 잔기 119 내지 127이 VSTB112 결합시에 묻힌 전체 1034.8 Å2의 표면 영역의 38%를 담당한다. 특히, 서열 -IRHHHSEHR-(SEQ ID NO:76)로 구성된 상기 루프는 매우 극성이다. 또한, VSTB112 CDR H3 내의 W103는 VISTA 잔기 H122 및 H123의 백본에 대해 정밀하게 패킹되고, VISTA H121은 CDR H2 내의 F55의 방향족 고리와 상호작용시 가장자리를 이룬다.
결정학 및 HDX에 의해 확인된 에피토프 영역의 비교가 도 31에 제시된다.
실시예 15: 항-VISTA 항체에 의한 세포 및 단핵구의 활성화
항-VISTA 항체의 기능성 효과를 2개의 시험관내 검정인 혼합된 백혈구 반응(MLR) 및 SEB(스태필로코쿠스 장독소 B)에서 평가하였다. 둘 모두의 검정은 이들의 일차 판독으로서 T 세포 증식 및 사이토카인 유도를 측정하나, 이들 효과는 상이한 메터니즘으로 인한 것이다. MLR에서, 2명의 상이한 인간 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 함께 인큐베이션하였고, 한 공여자의 T 세포와 다른 공여자의 수지상 세포 사이의 주 조직적합성 복합체(MHC) 미스매치는 T 세포 증식 및 인테페론(IFNγ) 생성을 발생시켰다. SEB 검정에서, 단일 공여자로부터의 PBMC를 박테리아 초항원과 함께 인큐베이션하였고, 이는 항원 제시 세포(APC)의 표면 상의 MHC 클래스 II 단백질을 T 세포 상의 T-세포 수용체(TCR)에 직접 연결시켜, T 세포 활성화, 증식, 및 사이토카인 분비를 야기시켰다. 둘 모두의 검정에서, VSTB174의 모 분자인 VSTB112는 T 세포 증식 및 사이토카인 생성의 용량-의존성 유도를 나타내었고, 후보 중에서 가장 효능이 있었다(도 21a-21d, 표 12).
표 12. MLR 검정 판독을 위한 EC50 값. VSTB112(VSTB174의 모)가 가장 효능있는 분자였다.
Figure pct00027
단핵구 활성화 검정
표 12에 제시된 검정 데이터를 VSTB174의 모 분자인 VSTB112로 생성시켰다. VSTB174의 활성을 더 잘 이해하기 위해, 단핵구 활성화 검정을 수행하였다. 결과는 전체 PBMC와의 VSTB174의 인큐베이션이 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커(CD80 및 HLA-DR)의 상향조절을 유도한 것을 나타내었고, 이는 높은 수준의 VISTA를 발현하는 것으로 공지된 면역 세포 서브셋에 대한 항체 결합의 효과를 나타낸다(도 32). 추가 의문은 전체 PBMC에서의 단핵구 활성화에 대한 효과가 VISTA에 결합하고 IgG1 Fc를 갖는 임의의 항체에 의해 촉진될 수 있는지의 여부이다. 항체 VSTB103 및 VSTB63은 높은 친화성(각각 KD 6.36E-10 및 8.30E-10)으로 VISTA에 결합하고, VISTA 단백질을 발현하는 세포에 결합하며, 이는 VSTB112 및 VSTB111과 유사하다. VSTB103은 VSTB112와 동일한 에피토프 빈(bin) 내에 존재하는 한편, VSTB63은 상이한 에피토프 빈 내에 존재하며; 어느 항체도 단핵구 활성화를 촉진하지 않았다. 종합하면, 이들 결과는 VSTB174가 T 세포 활성화/증식에 대해 이의 효과를 발휘할 수 있는 한 메커니즘이 NK 세포에 의해 촉진되는 단핵구 활성화를 통하는 것임을 나타낸다.
배지의 제조
500 ㎖의 RPMI 1640(Corning, 10-040-CV)을 50 ㎖의 인간 AB 혈청(Valley Biomedical, Inc, Lot # 3C0405), 5 ㎖의 페니실린/스트렙토마이신(Lonza, 17-602E) 10,000 U/㎖, 5 ㎖의 L-글루타민(100x)(Gibco, 25030-081) 및 10 ㎖의 HEPES(1M)(Fisher BP299-100, Lot#-1)와 조합시켰다. 배지를 4℃에서 14일 이하 동안 저장하였다.
가용성 VISTA 및 대조군 항체의 제조
항체를 10% AB 혈청 배지: VSTB174: lot VSTB174.003 중 2X의 요망되는 농도로 희석시켰다.
100 ㎕의 적절한 항체 용액을 96 웰 U-바닥 플레이트(Falcon, 353077)의 적절한 웰에 첨가하였다. 다양한 세포 집단을 100 ㎕에 첨가한 후, 각각의 항체의 최종 농도는 1, 0.1 또는 0.01 g/㎖였다. IgG1 대조군 항체 CNTO 3930(Lot 6405, ENDO <0.1 EU/㎎)를 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다.
PBMC를 분리시켰다.
공여자는 적어도 18세 연령이었고, 전반적으로 건강하고, 국소 집단으로부터 무작위로 선택하였다.
공여자 혈액을 분리 튜브로부터 50 ㎖ 코니칼로 옮겼다.
15 ㎖의 Ficoll 1077(SIGMA, 10771)을 혈액과 혼합되지 않도록 조심스럽게 밑에 놓았다. 이는 25 ㎖의 혈액 당이었다.
세포를 제동 없이 실온에서 25분 동안 1250g에서 원심분리시켰다.
백혈구를 Ficoll과 혈청의 인터페이즈에서 분리시키고, 세포를 40 ㎖의 행크 평형 염 용액(HBSS)으로 희석시켰다.
세포를 4 C에서 10분 동안 453g(1500 rpm)에서 원심분리시켰다.
세포를 50 ㎖의 HBSS에 재현탁시키고, 500　l를 별개의 에펜도르프 튜브로 옮김으로써 카운팅하였다.
또한, Miltenyi로부터의 Pan 단핵구 분리 키트를 여러 처리 그룹에서의 음성 선택에 의해 CD14+ 세포를 분리시키기 위해 제조업체의 설명서(cat# 130-096-537)에 따라 사용하였다.
시험관내 배양 설정
필요한 적절한 수의 세포를 분석되는 샘플의 수를 기초로 하여 검정을 위해 결정하였다. 반응자 집단을 96-웰 U-바닥 플레이트의 웰 당 2.0x105 세포로 시딩하였다. CD14 음성 선택된 집단에 대해, 0.5x105 세포를 시딩하였다. 모든 조건을 삼중으로 수행하였다.
세포를 상기 기재된 바와 같이 원심분리시키고, 10% AB 혈청 배지 중에서 전체 PBMC 집단에 대해 2x106/㎖ 및 CD14 음성 선택된 집단에 대해 0.5x106/㎖의 농도로 재현탁시키고, 적절한 웰에 100　l의 시험 항체를 첨가하여, 각각의 웰 내의 전체 부피를 200　l가 되도록 하였다.
세포를 37℃ 및 5% CO2에서 1, 2, 또는 3일 동안 인큐베이션하였다.
항체 염색 및 흐름세포측정법
96 웰 U-바닥 플레이트를 453g에서 5분 동안 원심분리시키고, 상층액을 제거하였다.
세포를 200 ㎕ PBS로 세척하고, 단계 5.5.1에서와 같이 원심분리시켰다.
상층액을 폐기시키고, 하기 항체를 함유하는 50　㎕의 PBS에 재현탁시켰다:
● CD14-APC (클론 HCD14) 1:250 (Biolegend cat #325608)
● HLA-DR-PE Cy7 (클론 L243) 1:250 (Biolegend cat # 307616)
● CD80-PE (클론 2D10) 1:250 (Biolegend cat # 305208)
● Hu FcR 결합 억제제 (eBioscience cat # 14-9161-73)
어두운 곳에서 습윤 아이스 상에서 20분 동안 인큐베이션시켰다.
150 ㎕의 PBS를 첨가하고, 단계 5.5.1에서와 같이 원심분리시켰다.
150　l의 PBS 완충액을 첨가하고, FACS를 통해 분석하였다.
샘플을 Miltenyi MACSQuant 10-파라미터 흐름측정기에서 유동시키고, CD14+ 집단에서의 HLA-DR 및 CD80의 발현에 대해 FlowJo 9.7.5를 이용하여 분석하였다. 한 세트의 수의 중심 경향을 규정하는 통계인 기하 평균 형광 강도(MFI)를 처리를 비교하기 위한 규정 통계로 사용하였다.
통계 분석
모든 통계를 Prism GraphPad, 버전 6으로 수행하였다. 그룹 사이에서의 쌍을 이룬 비교를 다중성에 대해 터키 교정(Tukey correction)과 함께 일원 분산분석을 이용하여 각각의 시점에서 수행하였다. 모든 시험에 대해 0.05 미만의 P-값 및 비교는 유의한 것으로 간주되었다. 모든 그래프 및 표에 대해, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, ****p<0.0001.
실시예 16: 항-VISTA 항체의 ADCC 및 ADCP 활성
VSTB174는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 항체-의존성 세포-매개 포식작용(ADCP) 활성을 제공할 수 있는 IgG1 Fc를 갖는다. 둘 모두의 유형의 검정을 수행하였고, VSTB174가 K562-VISTA 세포를 용해시키거나 포식작용할 수 있으나(도 33-34), K562 골수종 세포주 모 세포는 그렇지 않은 것(데이터는 제시하지 않음)을 나타내었다. VISTA의 억제 작용을 조절하는 VSTB174의 작용의 추가 메커니즘은 높은 수준의 VISTA를 발현하는 세포의 용해 또는 포식일 수 있고, 따라서 이들을 국소 미세환경으로부터 제거한다.
실시예 17: 추가 항-VISTA 항체의 ADCP 활성
항-인간 VISTA mAb(VSTB173 및 VSTB174)에 의한 VISTA를 이소성으로 발현하는 세포의 대식세포-매개 포식작용의 향상을 연구하기 위해 시험관내 포식작용 검정을 이용하였다. 이들 mAb를 다양한 Fc 백본(IgG1 WT(야생형), IgG1 PR(프로테아제 내성), 및 IgG2σ)으로 클로닝하고, 포식작용을 향상시키는 것과 관련하여 다양한 활성을 잠재적으로 갖는 것으로 가정하였다. IgG1 및 IgG1 PR 백본은 Fc 수용체에 결합할 수 있고 ADCP를 야기시키는 잠재성을 갖는 한편, IgG2σ는 Fc 수용체에 결합하지 않고 당연히 ADCP를 매개하지 않는다.
항-VISTA 항체를 K562 모 및 K562-VISTA 표적 세포와 함께 ADCP 검정에서 시험하였다. 도 35-36에 제시된 바와 같이, VSTB174, VSTB149, VSTB173 및 VSTB145는 K562-VISTA 세포의 hMac 포식작용을 향상시켰다. Fc 수용체에 결합하지 않은 IgG2σ를 갖는 VISTA 항체 VSTB140 또는 VSTB132는 예상된 바와 같이 포식작용을 향상시키지 않았다. IgG1 Fc를 갖는 VISTA mAb VSTB174 및 VSTB173은 IgG1PR Fc를 갖는 VSTB149 및 VSTB145보다 더 강한 포식작용을 나타내었다(EC50 값에 대해 표 13 및 14 참조).
표 13. 항-인간 VISTA mAb EC50 값.
Figure pct00028
표 14. 항-인간 VISTA mAb EC50 값.
Figure pct00029
VSTB174 및 VSTB173은 가장 높은 농도에서 K562 모 세포의 포식작용의 약한 향상을 나타내었고(도 35-36), 이는 K562 세포에 의한 VISTA의 낮은 발현으로 인한 것일 수 있다. 다른 항-VISTA 항체는 K562 세포의 포식작용을 향상시키지 않았다.
음성 대조군 항체를 K562-VISTA 포식작용 검정에서 2개의 상이한 농도에서 각각 시험하였으나, 어떠한 포식작용도 유도하지 않았다. 이러한 결과는 항-VISTA 항체에 의해 매개되는 포식작용이 특이적인 것이며, K562-VISTA 세포에 의한 VISTA 항원 발현으로 인한 것임을 나타낸다.
실시예 18: 추가 항-VISTA 항체의 ADCC 활성
ADCC를 유도하는 이들의 능력을 시험하기 위해, 하기 3개의 인간 항-VISTA 항체를 시험하였다:
VSTB174 (IgG1)
VSTB149 (IgG1 PR)
VSTB174.LF (IgG1 LF (저 푸코스)).
각각의 항체를 전체 6개의 데이터 포인트에 대해 2개의 별개의 실험에 걸쳐 삼중으로 동일 플레이트 내에서 6개의 상이한 농도로 시험하였다.
VSTB174, VSTB149, 및 VSTB174.LF는 각각 10, 1, 0.1 및 0.01 ㎍/㎖에서 측정가능한 ADCC 활성을 나타낸 반면, LF 항체만 0.001 ㎍/㎖에서 측정가능한 ADCC 활성을 나타내었고; 항체 어느 것도 0.0001 ㎍/㎖에서 ADCC를 나타내지 않았다. 이들 항체 각각이 IgG1 또는 IgG1 변이체 Fc를 가짐에 따라, 이러한 결과는 예상된 것이다. LF 항체는 정규의 IgG1 항체 곡선(0.02381 ㎍/㎖)에 비해 LF 항체 곡선(0.002293 ㎍/㎖)에 대해 더 작은 EC50 값을 나타냄에 따라 증가된 ADCC 효능을 입증하였다. IgG1 PR 항체 곡선은 정규의 IgG1 곡선(0.01846 ㎍/㎖)과 유사한 EC50 값을 가졌다.
표 15. ADCC 분석에 의해 결정된 바와 같은 3개의 시험된 항-VISTA 항체의 EC50 값(㎍/㎖).
Figure pct00030
인간 IgG1, 인간 IgG1 PR 및 인간 IgG1 LF 항체는 모두 10, 1, 0.1 및 0.01 ㎍/㎖ 항체 농도에서 측정가능한 ADCC 매개 사멸을 나타낸 반면, LF 항체만 0.001 ㎍/㎖ 항체 농도에서 사멸을 나타내었다. 항-VISTA 항체 어느 것도 0.0001 ㎍/㎖ 항체 농도에서 사멸을 나타내지 않았다.
LF 항체는 EC50 값에서 관찰되는 바와 같이 정규의 IgG1 항체 또는 IgG1 PR 항체보다 약 10배 더 효능 있는 ADCC 사멸을 나타내었다.
실시예 19: 인간 및 시노몰구스 VISTA에 대한 VSTB174의 친화성
인간 및 시노몰구스 원숭이 VISTA 세포외 도메인(ECD)에 대한 VSTB174의 친화성을 ProteOn 기계에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 방법에 의해 결정하였다. VSTB174는 인간 VISTA ECD에 대해 1.56E-10 M 및 시노몰구스 VISTA에 대해 8.66E-11 M의 각각의 단백질에 대한 매우 유사한 KD 값을 나타내었다.
실시예 20: 뮤린 종양 모델에서 효능을 나타내는 VISTA 항체
마우스 계통, 시약 및 종양 모델
생체내 연구를 위해, C57Bl/6 백그라운드로 역교배시킨 인간 VISTA 녹인(knockin)(VISTA-KI) 마우스를 이용하였다.
마우스 Fc IgG2a(VSTB123)로 이식된 VSTB174 가변 영역을 이용하여 VISTA-KI 마우스에서 시험을 가능케 하기 위해 항-인간 VISTA 항체를 생성시켰다.
MB49 방광암을 VISTA KI 마우스에서 평가하였다.
항-VISTA 항체 요법이 야생형 마우스에서 종양 성장을 억제하는 것을 나타내는 확립된 연구(Le Mercier et al., 2014)에 더하여, 다양한 투여 스케줄을 이용한 wt 마우스 및 VSTB123으로 처리된 VISTA-KI 마우스에서 대용 햄스터 항체를 이용하여 항-종양 효능이 입증되었다.
VISTA-KI 마우스에서 MB49 종양 모델에서의 생체내 효능 연구
1-10 ㎎/㎏ 범위의 여러 용량에서 VSTB123를 시험하는 MB49 효능 연구를 암컷 VISTA-KI 마우스에서 수행하였다. 마우스에 0일에 250,000 MB49 종양 세포를 피내 주사하였다. 6일에, 투여를 도 37에 표시된 바와 같이 시작하였다(10 ㎎/㎏의 아이소형 대조군 mIgG2a, 또는 표시된 용량의 VSTB123; 10 마우스/그룹).
VSTB123은 도 37에 제시된 바와 같이 낮은 용량에 비해 높은 용량에서 더욱 효과적이었다. 10 ㎎/㎏ 및 7.5 ㎎/㎏의 용량은 동등한 반면, 종양은 5 또는 1 ㎎/㎏이 투여된 마우스에서 더 신속히 성장하였다.
실시예 21: 항-VISTA 항체를 이용한 인간 종양에서의 VISTA 발현의 검출
도 1은 AML 종양 세포주에 의한 VISTA 발현을 나타내며 - 이러한 데이터 및 도 17에서의 RNA seq 발현 데이터는 VISTA가 AML 세포에 의해 발현되고, 항-VISTA 약물이 면역 조절 또는 항체-매개 사멸을 위해 상기 세포를 직접적으로 표적화함으로써 효과가 있다는 생각을 뒷받침한다.
폐암에서의 VISTA 발현을 평가하기 위한 데이터를 수술 절제로부터의 폐 종양 샘플로부터 획득하였다. 세포를 해리시키고, VISTA 및 많은 다른 마커의 발현에 대해 특성규명하였다. 결과는 13/13 폐 종양(편평 또는 샘암종)이 CD14+ VISTA+ 골수 세포를 함유한 것을 나타내었다(도 38).
실시예 22: 항-VISTA 항체를 이용한 폐 종양에서의 VISTA 발현의 검출
클론 GG8, 항-인간 VISTA 마우스 IgG1을 이용하여 면역조직화학 검정을 개발하였다. 비소세포폐암(NSCLC) FFPE 종양 섹션에서 VISTA의 염색을 연구하기 위해 상기 mAb를 이용하였다.
FFPE 종양 섹션을 염색 전에 표준 항원 재생 방법으로 처리하였다. GG8 마우스 항-인간 VISTA 항체를 1:500 희석으로 사용하였다. 토끼 항-마우스 폴리클로날 항체, 및 이후 항-토끼 중합체 HRP를 이용하여 GG8 결합을 검출하였다. 헤마톡실린을 이용한 대조염색을 후속시킨 후, 종양 섹션의 스코어를 매겼다.
폐암에서의 VISTA 발현은 대부분 면역 침윤물로 제한되었고(도 39에 제시된 예), 높은 수준의 VISTA 양성 세포가 많은 폐암 샘플에 존재하였다.
실시예 23: VSTB174의 Fab 단편과 복합체화된 인간 VISTA의 세포외 도메인(ECD)의 구조
VISTA 항원 변이체를 생성시키고, 결정학을 위해 정제하였다. 재조합 his-태깅된 VSTB174 Fab를 내부적으로 발현시키고, 정제하였다. 결정을 생성시키고, 싱크로트론 방사선을 이용하여 VISTA ECD:VSTB174 Fab 복합체에 대한 더 높은 해상도의 데이터를 수집하기 위해 이용하였고, 상동성 모델링 및 전자 밀도 분석의 조합을 이용하여 구조적 결정을 해결하였다(도 29(상부)).
VISTA ECD:VSTB174 Fab 복합체의 구조를 1.85Å의 해상도로 x-선 결정학에 의해 결정하여, VISTA ECD의 첫번째 구조를 제공하고, VSTB174 에피토프 및 파라토프를 기술하였다. VISTA ECD는 CTLA-4 ECD와 유사한 토폴로지를 갖는 IgV 폴드를 채택하나, β-샌드위치의 전면 시트에 연장된 독특한 G' 가닥을 갖는다. A' 및 G'은 A' 가닥 내의 잔기 C12와 G' 가닥 내의 C146 사이에 형성된 이황화 브릿지를 통해 화학적으로 추가로 구속된다. 6개의 시스테인은 3개의 분자내 이황화 결합으로 속박되어 있는 것으로 밝혀졌고, 결정 접촉을 기초로 하여, 이합체 VISTA에 대한 증거는 없었다.
VSTB174는 FG 루프에 가까운 말단 상의 전면 시트 가닥 C', C, F, 및 G 내의 잔기 뿐만 아니라 BC, FG, 및 CC' 루프 내의 잔기를 인지한다.
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 간행물 및 참고문헌의 교시내용은 전체내용이 참조로서 포함된다.
본 발명은 특별히 이의 예시적 구체예를 참고로 하여 제시되고 기재되었으나, 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화가 첨부된 청구항에 포함된 본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceutica NV; Linda Snyder; Gordon Powers; <120> Anti-VISTA Antibodies and Fragments <130> 0148.1142-003 <140> PCT/IB2014/0002868 <141> 2014-12-22 <150> 61/920,695 <151> 2013-12-24 <150> 62/085,086 <151> 2014-11-26 <160> 79 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Ile Phe Pro Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Ser Val Asp Thr Tyr Ala Asn Ser Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Ala Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Arg Thr 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ile Ile Pro 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Leu Ser Pro 275 280 285 Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp 290 295 300 Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile 305 310 <210> 68 <211> 312 <212> PRT <213> Macropus rufus <400> 68 Met Asn Val Pro Thr Ser Val Leu Glu Ser Gly Gly Arg Arg Trp Gly 1 5 10 15 Pro Leu Leu Leu Ala Phe Phe Leu Ala Ala Ser Arg Gly Leu Val Ala 20 25 30 Ala Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly 35 40 45 Glu Asn Ile Thr Leu Ala Cys Gln Leu Leu Gly Pro Val Pro Lys Gly 50 55 60 His Asp Val Ser Phe Tyr Lys Thr Trp Phe Arg Ser Ser Arg Gly Glu 65 70 75 80 Val Gln Val Cys Ser Glu His Arg Pro Ile Arg Asn Val Thr Leu Gln 85 90 95 Asn Leu His Pro Tyr His Gly Gly His Gln Ala Ser Asn Thr Ser His 100 105 110 Asn Leu Leu Gln Ser His Gly Leu Glu Thr Ala Ser Asp His His Gly 115 120 125 Asn Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Val Gln Asp Gly Gly Leu 130 135 140 Tyr Cys Cys Leu Val Val Glu Met Arg His Arg His Ser Glu His Arg 145 150 155 160 Val His Ala Ala Asn Glu Leu Gln Val Gln Lys Gly Lys Asp Ala Pro 165 170 175 Ser Lys Cys Ile Thr Tyr Pro Ser Ser Pro Glu Glu Ser Asp Asn Ile 180 185 190 Thr Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys 195 200 205 Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Val Ala Ser 210 215 220 His Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Ser Pro Gln Gly 225 230 235 240 Ile Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Pro Pro Ser Ser Gln Gly Leu Pro 245 250 255 Glu Ala Lys Val Arg Pro Pro Leu Ser Tyr Met Ala Gln Arg Gln Pro 260 265 270 Ser Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Asn Thr Pro Leu Ser 275 280 285 Pro Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro 290 295 300 Asp Ser Pro Asn Ser Glu Phe Asn 305 310 <210> 69 <211> 310 <212> PRT <213> Delphinus delphis <400> 69 Met Gly Val Pro Pro Val Pro Glu Ala Gly Ser Trp Arg Arg Gly Pro 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Phe Phe Leu Ala Ala Ser Arg Gly Leu Val Ala Ala 20 25 30 Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln 35 40 45 Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Leu Ala Lys Gly His 50 55 60 Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val 65 70 75 80 Gln Ala Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp 85 90 95 Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Asn Ser Ser Gln Asp Leu 100 105 110 Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn Phe 115 120 125 Thr Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Gly Gly Leu Tyr Cys 130 135 140 Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His Arg His Ser Glu Gln Arg Leu Tyr 145 150 155 160 Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Arg Gly Glu Glu Ala Pro Ser Lys 165 170 175 Cys Thr Val Tyr Pro Pro Ser Ser Lys Glu Ser Glu Ser Ile Thr Ala 180 185 190 Ala Ala Leu Ala Thr Ser Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu Pro 195 200 205 Leu Ile Leu Ile Leu Val Trp Lys Gln Arg Gln Val Ala Ser Asn Arg 210 215 220 Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Thr Gln Gly Ile Glu 225 230 235 240 Asn Pro Gly Phe Glu Thr Ser Pro Pro Ser His Gly Met Pro Glu Thr 245 250 255 Lys Pro Arg Gln Pro Leu Thr Tyr Met Ala Arg Arg Gln 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145 150 155 160 Thr Phe His Thr Ala Thr Ser Lys Asp Ile Thr Ala Ala Ala Leu Ala 165 170 175 Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu Pro Leu Ile Leu Leu 180 185 190 Leu Ile Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Val Ser His Arg Arg Ala His Glu 195 200 205 Leu Val Arg Met Glu Ser Ser Ala Gln Gly Ile Glu Asn Pro Val Phe 210 215 220 Glu Ala Leu Pro Ala Gly Ser Thr Glu Gln Arg Pro Arg Pro Gln Leu 225 230 235 240 Ser Tyr Leu Gly Gly Arg Gln Leu Ser Glu Ser Gly Arg His Leu Leu 245 250 255 Ser Glu Pro Asn Thr Pro Leu Ser Pro Pro Ala Pro Gly Glu Cys Phe 260 265 270 Phe Pro Thr Leu Asp Pro Val Pro Asp Ser Pro Asn Ser Leu Lys Ala 275 280 285 <210> 71 <211> 261 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 71 Asp Ala Ile Thr Ala Phe Ser Val Ser Ala Leu Tyr Ser His Ile Thr 1 5 10 15 Cys Pro Glu Gly Gln Asn Val Asn Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly His 20 25 30 Val Ala Asp Lys His Asp Val Leu Phe Ser Leu Trp His Phe Ser Lys 35 40 45 Asp Lys Asn Ser Asn Cys Leu Glu Arg Arg His Ile Gln Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Arg Asp His Leu His Lys Glu His Leu Ser His Ser Met Met His 65 70 75 80 Asn Gly Ala Phe Gln Ile Thr Leu Thr Asn Val Ser Gln Gln Asp Ser 85 90 95 Gly Gly Tyr Cys Cys Tyr Val Ile Glu Ala Ser Lys Lys His His Thr 100 105 110 Arg His Tyr Ser Tyr Ile Glu Phe Gln Val Lys Thr Asp Asp Leu Asn 115 120 125 Leu Tyr Thr Cys Met Phe His Ser Pro Thr Glu Gly Asp Asn Ser Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ile Val Ser Cys Val Ile Gly Ile Leu Cys 145 150 155 160 Met Pro Leu Ile Leu Phe Leu Val Tyr Lys Gln Arg Arg Ala Ile Ser 165 170 175 His Arg Arg Ser Tyr His Phe Val Phe Ile Asp Phe Ser Glu Ala Gln 180 185 190 Gly Ile Glu Asn Pro Val Phe Asp Asp Pro Pro Pro Ala Asn Val Val 195 200 205 Glu Gln Arg Pro Arg Leu Ala Phe Met Ala Ser Arg Gln Gln Ser Glu 210 215 220 Ser Asp Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Asn Thr Pro Leu Ser Pro Ser 225 230 235 240 Cys Pro Asn Glu Cys Phe Phe Pro Ser Leu Pro Val Pro Asp Ser Pro 245 250 255 Asp Pro Gly Asn Val 260 <210> 72 <211> 315 <212> PRT <213> Taeniopygia guttata <400> 72 Gly His Pro Ala Thr Met Gly Thr Ala Ser Pro Arg Pro Gly Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Cys Leu Leu Ala Ser His Gly Gly Ala Asp Ala Phe 20 25 30 Leu Ile Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Cys Val Cys Pro Glu Gly Gln Asn 35 40 45 Val Thr Leu Ser Cys Arg Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu Arg His Asp 50 55 60 Leu Leu Tyr Lys Thr Trp Tyr Phe Ser Ser Thr Gly Asp Gln Ser Cys 65 70 75 80 Ser Asp Lys Arg His Ile Arg Asn Val Thr Asp Lys Glu Leu Arg His 85 90 95 Asp Leu Gly Arg His His Glu Leu Pro Gly Asn Ala Ser Gln Lys Pro 100 105 110 Pro Phe Gly Trp Gln Ser Gly His His Gly Val Glu Leu Val Leu Asp 115 120 125 His His Gly Ala Phe His Leu Val Val Met Asn Leu Thr Leu Gln Asp 130 135 140 Ser Gly Asn Tyr Cys Cys Tyr Ala Val Glu Val Arg Arg Glu Gly His 145 150 155 160 Ser Lys Pro His Thr Val Gln Ala Ala His Gly Phe Val Glu Leu Gln 165 170 175 Ile Gln Arg Gly Glu Pro Cys Ser His Ala Arg Ala Gln Ser Gln Arg 180 185 190 Ala Ala Asp Asp Ile Thr Ala Ala Val Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile 195 200 205 Val Gly Ile Leu Cys Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ile Tyr Lys Gln 210 215 220 Arg Gln Ala Ala Ser Ser Arg Arg Ala His Glu Leu Val Arg Met Asp 225 230 235 240 Ser Gly Ala Gln Gly Ile Glu Asn Pro Val Phe Glu Ala Val Pro Ser 245 250 255 Ala Gly Ala Glu Pro Arg Pro Arg Ala Gln Leu Ser Tyr Val Ala Ser 260 265 270 Arg Leu Pro Ser Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr 275 280 285 Pro Leu Ser Pro Pro Gly Pro Gly Asp Cys Phe Phe Pro Thr Leu Asp 290 295 300 Pro Val Pro Asp Ser Pro Asn Ser Leu Lys Ala 305 310 315 <210> 73 <211> 275 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 73 Met Asp Val Phe Arg Ala Val Leu Leu Cys Phe His Val Phe Thr Ala 1 5 10 15 Ile Gln Ala Ser Gly Asp His His Ser Leu Arg Val Ser Val Pro His 20 25 30 Arg Thr Tyr Glu Cys Pro Glu Gly Ala Asp Val Ile Leu Lys Cys Val 35 40 45 Pro Ser Gly Thr Lys Ala Tyr Pro Gln Asp Thr Phe Trp Thr Thr Trp 50 55 60 Leu Tyr Thr Pro Arg Ser Gln Asp His Cys Gln Lys Gly Ala His Pro 65 70 75 80 Arg Lys Ala Asn His Thr Asn Arg Ser Leu Gly Val Val Tyr Ser Ser 85 90 95 Gly Asp Lys Val Phe Ser Val Ser Leu Lys Asn Val Lys His Thr Asp 100 105 110 Gln Gly Lys Tyr Cys Cys Trp Leu Leu Asp Leu His Gly Arg His Lys 115 120 125 Glu Gln Glu Ala His Asp Phe Met Tyr Leu Ser Val Met Pro Thr Pro 130 135 140 Lys Asp Ala His Asn Gly Ser Leu Lys Cys Leu Glu Tyr Ser His Thr 145 150 155 160 Ala Ser Asp Asp Ser Val Ala Glu Gly Leu Ala Ile Ala Ala Cys Val 165 170 175 Ala Phe Val Leu Cys Leu Pro Leu Ile Leu Met Leu Val Tyr Arg Gln 180 185 190 Arg Gln Thr Val Glu Arg His Arg Arg Ala His Glu Leu Val Arg Met 195 200 205 Asp Ser Glu Ala Gln Gly His Glu Asn Pro Val Phe Leu Gly Asp Ser 210 215 220 Pro Glu Pro Lys Met Arg Thr Val Ser Gln Ile Met Met Arg Gln Pro 225 230 235 240 Ser Glu Thr Gly His His Leu Leu Ser Glu Pro Gly Thr Pro Phe Ser 245 250 255 Pro Asn Ile Gln Gly Glu Leu Phe Phe Ser Ala Gln Gly Leu Pro Glu 260 265 270 Ser Asn Ile 275 <210> 74 <211> 293 <212> PRT <213> Fugu rubripes <400> 74 Leu Glu Lys Phe Thr Ser Ala His His Thr Lys Gln Thr Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gly Leu Asn Leu Leu Cys Leu Thr Lys Ser Asn Ala His His Gly His 20 25 30 Pro Ala Met Ser Val Ser Ala Ser His Leu Tyr Tyr Thr Cys Pro Glu 35 40 45 Gly Ala Asn Ala Thr Leu Val Cys Asn Gln Arg Gly Gly Ala Leu His 50 55 60 Pro Asn Asp Ser Leu Trp Arg Leu Trp Phe Phe Thr Pro His Lys Asp 65 70 75 80 Gln His Cys Thr Lys His Gly Pro Arg Asn Val Thr Phe Lys His Ser 85 90 95 Lys Leu Ser Ser Gly Leu His Phe Gly Ala Thr Gln Glu Asn Phe Trp 100 105 110 Val Gln Leu Gln Asn Val Thr His Ala Asp Gln Gly Arg Tyr Cys Cys 115 120 125 Ala Ala Leu Glu Ile Glu Ser Ile His His Glu Ala Val Gln Arg Thr 130 135 140 His Ser His Met Phe Leu Asn Ile Ile Pro Arg Gly Thr Gly Ser Pro 145 150 155 160 Asn Cys Thr Val Ser Ala Pro Ser Ala Pro Glu Gly Asn Ala Thr Leu 165 170 175 Cys Thr Val Pro Val Ala Leu Ala Met Gly Ala Cys Ile Leu Ala Leu 180 185 190 Leu Ser Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Arg Gln Arg Gln Ser 195 200 205 Ala Gln Ser Arg Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Glu 210 215 220 Ala His Gly His Glu Asn Pro Val Phe Leu Gly Gly Ser Pro Gln Ile 225 230 235 240 Lys Asn Arg Thr Val Ser Gln Ile Met Ala Arg Gln Ser Ser Glu Thr 245 250 255 Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Gly Thr Pro Leu Ser Pro Pro Ala 260 265 270 His Gly Asp Val Phe Phe Pro Ala Glu Asp Thr Ile Phe Glu Thr Pro 275 280 285 Glu Leu Arg Gln Val 290 <210> 75 <211> 168 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His 20 25 30 Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Asn Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val 35 40 45 Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asp Leu Thr Pro Gln Asp 50 55 60 Leu Leu Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asp Thr Ser His Asp 65 70 75 80 Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn 85 90 95 Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr 100 105 110 Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg Met Met Met Ser Glu Met Arg Val 115 120 125 Met Gly Ala Asn Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser 130 135 140 Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Glu Ser Glu Asn Ile Thr 145 150 155 160 Ala Ala His His His His His His 165 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Ile Arg His His His Ser Glu His Arg 1 5 <210> 77 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Ala Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly 20 25 30 His Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu 35 40 45 Val Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Gln Leu Thr Phe Gln 50 55 60 Asp Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Gln Thr Ser His 65 70 75 80 Asp Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly 85 90 95 Asn Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu 100 105 110 Tyr Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg 115 120 125 Val His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro 130 135 140 Ser Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Glu Ser Glu Gln Ile 145 150 155 160 Thr Ala Ala His His His His His His 165 <210> 78 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Thr Arg 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Tyr Asn Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Gln Gln Val Gln Leu Val Gln Ser 115 120 125 Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe 165 170 175 Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr 180 185 190 Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg 195 200 205 Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Trp 210 215 220 Ser Tyr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser <210> 79 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ala Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly 20 25 30 His Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu 35 40 45 Val Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Gln Leu Thr Phe Gln 50 55 60 Asp Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Gln Thr Ser His 65 70 75 80 Asp Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly 85 90 95 Asn Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu 100 105 110 Tyr Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg 115 120 125 Val His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro 130 135 140 Ser Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Glu Ser Glu Gln Ile 145 150 155 160 Thr Ala Ala His His His His His His 165

Claims (103)

  1. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 분리된 항체 또는 이의 항체 단편으로서, VISTA로의 항체 또는 항체 단편의 결합이 면역 반응을 조절하거나 향상시키는, 분리된 항체 또는 이의 항체 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 항체 단편이 Fab, F(ab')2, 또는 scFv 항체 단편인 항체 또는 항체 단편.
  3. 제 1항에 있어서, 항체 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  4. 제 1항에 있어서, VISTA가 조혈 세포에서 발현되는 항체 또는 항체 단편.
  5. 제 1항에 있어서, 조혈 세포가 골수 계통 세포 및/또는 림프구인 항체 또는 항체 단편.
  6. 제 1항에 있어서, 조혈 세포가 단핵구 또는 호중구인 항체 또는 항체 단편.
  7. 제 1항에 있어서, 조혈 세포가 T 세포인 항체 또는 항체 단편.
  8. 제 1항에 있어서, 조혈 세포가 B 세포, 자연 살해(NK) 세포 또는 자연 살해 T(NKT) 세포인 항체 또는 항체 단편.
  9. 제 1항에 있어서, VISTA가 종양 세포에서 발현되는 항체 또는 항체 단편.
  10. 제 1항에 있어서, VISTA가 종양 미세환경(TME)에서 발현되는 항체 또는 항체 단편.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 하나 이상의 경쇄 CDR을 추가로 포함하고, 하나 이상의 중쇄 CDR이 SEQ ID NO:1-3, 7-9, 13-15, 19-21, 25-27, 31-33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 하나 이상의 경쇄 CDR이 SEQ ID NO:4-6, 10-12, 16-18, 22-24, 28-30, 34-36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항체 단편.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄를 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  13. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 중쇄가 SEQ ID NO:1-3을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  14. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 경쇄가 SEQ ID NO:4-6을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  15. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 중쇄가 SEQ ID NO:1-3을 포함하고, 적어도 하나의 경쇄가 SEQ ID NO:4-6을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  16. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 중쇄가 SEQ ID NO:37-40에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  17. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 경쇄가 SEQ ID NO:41-45에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  18. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 중쇄가 SEQ ID NO:37-40에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 적어도 하나의 경쇄가 SEQ ID NO:41-45에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 항체 또는 항체 단편.
  20. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 항체 또는 항체 단편.
  21. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  22. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 아미노산 서열 SEQ ID NO:46 내의 에피토프에 특이적인 항체 또는 항체 단편.
  23. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 적어도 1x10-9 리터/몰의 친화성으로 VISTA의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  24. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 적어도 1x10-8 리터/몰의 친화성으로 VISTA의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  25. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 적어도 1x10-7 리터/몰의 친화성으로 VISTA의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  26. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응의 조절이 CD45+ 백혈구, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합물에서의 증가, 또는 VISTA-발현 면역 세포에서의 감소를 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  27. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응의 조절이 사이토카인의 향상된 생성, 향상된 T-세포 반응을 포함하고/하거나, Foxp3 발현을 조절하는 항체 또는 항체 단편.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  29. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 VISTA 길항제, 및 백신을 포함하는 조성물.
  30. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편, 및 백신을 포함하는 약학적 조성물로서, VISTA로의 항체 또는 항체 단편의 결합이 면역 반응을 조절하거나 향상시키는, 약학적 조성물.
  31. 유효량의 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료할 필요가 있는 개체에서 암을 치료하기 위한 방법.
  32. 유효량의 제 28항 내지 제 30항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하거나 예방할 필요가 있는 개체에서 암을 치료하거나 예방하기 위한 방법.
  33. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 치료적 유효량의 VISTA 길항제를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료할 필요가 있는 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 항체 또는 항체 단편이 VISTA에 결합함으로써 암에 대한 면역 반응을 조절하거나 향상시키는, 방법.
  34. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 개체가 포유동물인 방법.
  35. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 개체가 인간인 방법.
  36. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 치료적 유효량의 VISTA 길항제를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료할 필요가 있는 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 항체 또는 항체 단편이 VISTA에 결합함으로써 암에 대한 면역 반응을 조절하거나 향상시키는, 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 암이 백혈병, 림프종, 골수형성이상 증후군 또는 골수종, 또는 이들의 조합인 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 백혈병이 림프구성 백혈병 또는 골수성 백혈병인 방법.
  39. 제 37항에 있어서, 백혈병이 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 골수성(골수성) 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML); 털모양 세포 백혈병, T-세포 전림프구성 백혈병, 거대 과립 림프구성 백혈병, 또는 성인 T-세포 백혈병인 방법.
  40. 제 36항에 있어서, 암이 급성 골수성(골수성) 백혈병(AML)인 방법.
  41. 제 36항에 있어서, 암이 만성 골수성 백혈병(CML)인 방법.
  42. 제 36항에 있어서, 암이 고형 종양인 방법.
  43. 제 36항에 있어서, 고형 종양이 골수 세포, T-세포, 또는 골수 세포와 T-세포의 조합물을 포함하는 종양 기질에 의해 둘러싸여 있는 방법.
  44. 제 42항 또는 제 43항에 있어서, 고형 종양이 골수 세포, T 세포 또는 골수 세포와 T-세포의 조합물로 침윤되어 있는 방법.
  45. 제 35항에 있어서, 백신을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  46. 효과적인 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 종양 성장을 억제할 필요가 있는 개체에서 종양 성장을 억제하기 위한 방법.
  47. 제 31항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물, 항체 또는 단편이 비경구 또는 비-비경구, 예를 들어, 정맥내, 피하 또는 경구 투여되는 방법.
  48. 제 31항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 조성물, 항체 또는 단편의 투여량이 투여 당 0.1-15 ㎎/㎏인 방법.
  49. 제 31항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물, 항체 또는 단편이 매주, 2주에 1회, 3주에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 또는 3개월에 1회 투여되는 방법.
  50. VISTA에 결합하고, SEQ ID NO:1과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, SEQ ID NO:2와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:3과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO:4와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, SEQ ID NO:5와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 및 SEQ ID NO:6과 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
  51. 제 12항에 있어서, 가변 경쇄 VL 도메인이 인간 프레임워크 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  52. 제 1항에 있어서, 전체 항체를 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  53. 제 1항의 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  54. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제 51항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  55. 제 52항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  56. 제 1항의 항체 또는 단편의 생성을 위한 조건하에서 제 53항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 제 1항의 항체 또는 이의 단편을 생성하는 방법.
  57. 제 54항에 있어서, 상기 항체를 분리시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  58. 제 30항의 조성물 및 용기를 포함하고, 조성물이 암을 치료하기 위해 이용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물 또는 라벨을 추가로 포함하는, 제조 물품.
  59. 항체 또는 이의 항체 단편으로서, 항체가 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항체 단편.
  60. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 하나 이상의 경쇄 CDR을 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  61. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄를 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  62. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 중쇄가 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 3개 모두의 중쇄 CDR을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  63. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 경쇄가 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 3개 모두의 경쇄 CDR을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  64. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 중쇄가 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 3개 모두의 중쇄 CDR을 포함하고, 적어도 하나의 경쇄가 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 3개 모두의 경쇄 CDR을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  65. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 중쇄가 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  66. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 경쇄가 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  67. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 중쇄가 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 적어도 하나의 경쇄가 VSTB112(S2), VSTB116(S5), VSTB95(S16), VSTB50(S41), VSTB53(S43) 및 VSTB60(S47)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  68. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 치료적 유효량의 VISTA 길항제를 개체에 투여하고, 제2의 암 치료를 제공하는 것을 포함하는, 암을 치료할 필요가 있는 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 항체 또는 항체 단편이 VISTA에 결합함으로써 암에 대한 면역 반응을 조절하거나 향상시키는, 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 제2의 암 치료가 수술, 화학요법, 방사선 요법, 생물학적 요법, 표적화 요법, 또는 면역조절 요법, 또는 이들의 조합인 방법.
  70. 백신이 바이러스 벡터 백신, 박테리아 백신, DNA 백신, RNA 백신, 펩티드 백신, 또는 단백질 백신인 제 29항의 조성물, 제 30항의 약학적 조성물, 또는 제 45항의 방법.
  71. 제 36항에 있어서, 암이 폐암인 방법.
  72. 제 69항에 있어서, 폐암이 비소세포폐암종(NSCLC)인 방법.
  73. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 분리된 항체 또는 이의 항체 단편으로서, 항체가 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 및 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 추가로 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 항체 단편.
  74. 제 73항에 있어서, 하나 이상의 인간화 또는 인간 프레임워크 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  75. 제 74항에 있어서, 항체 VH 도메인이 SEQ ID NO:37을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  76. 제 74항 또는 제 75항에 있어서, 항체 VL 도메인이 SEQ ID NO:44를 포함하는 항체.
  77. 제 73항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  78. 제 77항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 인간 중쇄 불변 영역인 항체 또는 항체 단편.
  79. 제 77항 또는 제 78항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 IgG1 중쇄 불변 영역인 항체 또는 항체 단편.
  80. 제 79항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역이 SEQ ID NO:61에 존재하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  81. 제 79항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역이 항체의 프로테아제 내성을 향상시키도록 변형된 항체 또는 항체 단편.
  82. 제 81항에 있어서, 항체의 프로테아제 내성을 향상시키도록 변형된 IgG1 중쇄 불변 영역이 SEQ ID NO:60에 존재하는 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  83. 제 77항 내지 제 82항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  84. 제 83항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 인간 경쇄 불변 영역인 항체 또는 항체 단편.
  85. 제 84항에 있어서, 인간 경쇄 불변 영역이 SEQ ID NO:56에 존재하는 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  86. 제 73항 내지 제 85항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:60을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:56을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  87. 제 73항 내지 제 85항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:61을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:56을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  88. 제 73항 내지 제 87항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 푸코실화 효소가 결핍된 세포에서 발현되는 항체 또는 항체 단편.
  89. 제 88항에 있어서, 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 항체 또는 항체 단편.
  90. 제 73항 내지 제 89항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  91. 유효량의 제 73항 내지 제 89항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편, 또는 제 90항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료할 필요가 있는 개체에서 암을 치료하기 위한 방법.
  92. 제 91항에 있어서, 암이 폐암인 방법.
  93. 제 91항 또는 제 92항에 있어서, 제2의 암 치료를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  94. 제 93항에 있어서, 제2의 암 치료가 수술, 화학요법, 방사선 요법, 생물학적 요법, 표적화 요법, 또는 면역조절 요법, 또는 이들의 조합인 방법.
  95. 유효량의 제 73항 내지 제 89항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편, 또는 제 90항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 비소세포폐암종(NSCLC)을 치료할 필요가 있는 개체에서 비소세포폐암종(NSCLC)을 치료하기 위한 방법.
  96. 제 22항에 있어서, 에피토프가 입체형태 에피토프인 항체 또는 항체 단편.
  97. 제 96항에 있어서, 입체형태 에피토프가 인간 VISTA(SEQ ID NO:46)의 잔기 103-111(NLTLLDSGL(SEQ ID NO:62)) 및 136-146(VQTGKDAPSNC(SEQ ID NO:63))을 포함하거나 이들 내에 존재하는 항체 또는 항체 단편.
  98. 제 96항에 있어서, 입체형태 에피토프가 인간 VISTA(SEQ ID NO:46)의 잔기 24-36(LLGPVDKGHDVTF(SEQ ID NO:64)), 및 54-65(RRPIRDLTFQDL(SEQ ID NO:65))을 포함하거나 이들 내에 존재하는 항체 또는 항체 단편.
  99. 제 96항에 있어서, 입체형태 에피토프가 인간 VISTA(SEQ ID NO:46)의 FG 루프 내의 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  100. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 VISTA에 결합하는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항체 단편을 개체에 투여함으로써 암에 대한 면역 반응을 향상시키는 것을 포함하는, 면역 반응을 향상시킬 필요가 있는 개체에서 면역 반응을 향상시키는 방법.
  101. 제 100항에 있어서, 면역 반응이 항종양 면역 반응인 방법.
  102. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 VISTA에 결합하는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항체 단편을 개체에 투여함으로써 암에 대한 면역 반응을 향상시키는 것을 포함하는, 생물학적 반응을 유도할 필요가 있는 개체에서 생물학적 반응을 유도하는 방법으로서, 생물학적 반응이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법:
    a. 단핵구의 활성화;
    b. T-세포 증식 및 사이토카인 분비의 유도;
    c. 단핵구의 증가된 생존;
    d. VISTA를 발현하는 세포에서의 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)의 유도; 및
    e. VISTA를 발현하는 세포에서의 항체-의존성 세포 포식작용(ADCP)의 유도.
  103. 인간 VISTA(SEQ ID NO:46)에 대한 제 1항의 항체 또는 항체 단편의 결합을 경쟁적으로 억제하는 분리된 항체 또는 이의 항체 단편.
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