KR20160114184A

KR20160114184A - 화합물들의 효과적인 생산을 위한 미생물 엔지니어링

Info

Publication number: KR20160114184A
Application number: KR1020167025628A
Authority: KR
Inventors: 웨이 공; 수단슈 돌; 타미 그라바; 앤드류 크리스토퍼 콜라드; 재니스 지. 페로; 알. 로져스 요컴
Original assignee: 미리안트 코포레이션
Priority date: 2009-11-18
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2016-10-04
Also published as: CN102666838B; JP2013511277A; CN102666838A; BR112012011990A2; US20120220000A1; EP2501797A4; WO2011063055A3; KR20120099258A; US9017976B2; WO2011063055A2; EP2501797A2

Abstract

본 발명은 유전적으로 엔지니어링된 및 대사적으로 진화된 미생물들로부터의 화합물들의 생산에 관한 것이다. 화학적 생산에서의 향상들이 달성되었고, 또한 그러한 향상들을 유도하는 특정 돌연변이들이 확인되었다. 구체적인 실시예들이 숙신산을 생산하도록 유전적으로 엔지니어링된 박테리아 스트레인의 대사적 진화 과정 동안 발생하였던 돌연변이들의 확인에 대하여 제공되었다. 본 발명은 또한 증가된 숙신산 생산을 위한 대사적 진화 과정 동안 선택되었던 돌연변이들의 산업적 적용 가능성을 평가하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 추가적으로 대사적 진화 과정 동안 선택되었던 돌연변이들을 포함하고 또한 숙신산, 다른 유기산들 및 상업적 관심의 다른 화합물들의 향상된 생산에 대하여 기여하도록 엔지니어링된 미생물들을 제공한다.

Description

화합물들의 효과적인 생산을 위한 미생물 엔지니어링{ENGINEERING MICROBES FOR EFFICIENT PRODUCTION OF CHEMICALS}

본 출원은 2009년 11월 18일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/281,481에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 수여 번호(Award Number) DE-EF0002878/001 하에 미국 에너지 부(US Department of Energy)로부터 수여된 계약 하에 미합중국 정부 지원과 함께 이루어졌다. 미합중국 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.

지난 10년 동안, 미생물 게놈들(microbial genomes), 세포 내 생화학적 경로들, 대사 흐름 분석(metabolic flux analysis), 마이크로어레이 분석에 관한 우리의 지식 및 실리코 분석(silico analysis)에서의 폭발과 함께, 산업적 미생물학은 생체 촉매들(biocatalysts)을 사용하는 재생 가능한 공급 재료(renewable feedstock)로부터 화합물들을 제조하는 것으로 도전되어 왔다.

2004 미국 에너지 부 리포트, "바이오매스(biomass)로부터 최고의 가치가 추가된 화합물(Top value added chemicals from biomass)"로 명명된, 는 생체 촉매들을 사용하여 재생 가능한 공급 재료들로부터 생산될 수 있는 15개 빌딩 블록 화합물들(building block chemicals)을 확인하였다. 상기 15개 빌딩 블록들은 1,4-이중산들 (1,4-diacids)(숙신산의(succinic), 푸마르산의(fumaric) 및 말산의(malic)), 2,5-퓨란 디카르복실산(2,5-furan dicarboxylic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 글루칸산(glucaric acid), 글루탐산(glutamic acid), 이타콘산(itaconic acid), 레불린산(levulinic acid), 3-하이드록시부티로락톤(3-hydroxybutyrolactone), 글리세롤(glycerol), 소르비톨 (sorbitol), 자일리톨(xylitol), 및 아라비니톨(arabinitol)이다. 미국 에너지 부에 의해 규정된 15개의 화합물들 중에서, 생체 촉매들을 사용하는 산업적 규모에서의 숙신산 생산이 상당히 발전되어 왔다(커즈락 및 웨스터-보츠(Kurzrock and Weuster-Botz), 2009; 리 외.(Lee et al.), 2008; 앤더슨 외.(Andersson, et al.), 2007; 루 외.(Lu et al.), 2009; 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0073577).

소(cattle)의 반추위(rumen)에 존재하는 박테리아가 혐기성 성장 조건들 하에서의 숙신산을 생산하는 것으로 알려져 있다. 악티노바실러스 수시노진스 (Actinobacillus succinogens ), 에어로바이로스프릴룸 숙시니프로듀슨스 (Anaerobiosprillum succiniproducens ) 및 만하이미아 숙시니프로듀슨스 (Mannheimia succiniproducens )와 같은 많은 수의 반추위 박테리아가 분리되어 왔고 또한 숙신산 생산을 위한 생체 촉매로서 개발되어 왔다. 상업적인 가능성에 도달한 타이터(titers), 속도(rates) 및 수율(yields)로 숙신산의 생산을 가능하게 하는 대장균( Escherichia coli) 스트레인들(strains)이 미생물적 탄소 대사 및 미생물 유전학의 결합된 지식을 사용하여 또한 제조되어 왔다. 미국 특허 번호 7,223,567은 풍부한 성장 배지 내에서 숙신산을 생산하는 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인 SBS550MG의 제조를 기재하고 있다. 미국 특허 번호 6,455,284는 숙신산 생산을 위한 생체 촉매로서 외인성 피루베이트 카르복실라제 유전자(exogenous pyruvate carboxylase gene)를 사용하는 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인의 제조를 기재하고 있다. 피루베이트 카르복실라제는 야생형 이 . 콜리 (E. coli ) 스트레인에는 결여되어 있다. 리조비움 엘티(Rhizobium elti)와 같은 다른 미생물 기관들로부터 얻어진 피루베이트 카르복실라제 유전자가 숙신산 생산을 증진시키기 위하여 구조적 프로모터(constitutive promoter) 하에서 발현될 수 있다. PCT 특허 출원 번호들 WO/2008/115958 및 WO/2010/115067 은 최소한의 성장 배지 내에서 숙신산 생산을 위한 생체 촉매들인 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인 KJ122의 제조를 기재하고 있다.

숙신산 및 다른 화합물들의 상업적으로 매력적인 생합성적 생산에 도달하기 위하여, 추가적인 유전적 조작들이 요구된다. 새로운 유전적 접근들을 사용하여 세포 내부에서 생화학적 경로들을 조작하는 방법에 의하여 미생물들(microoranisms)에 의한 숙신산염 및 다른 화합물들의 생산에 있어서의 전체적인 "효율성 (Efficiency)"(이에 제한되는 것은 아니나. 타이터, 속도 및 수율을 포함하는 것으로 정의되는)을 향상시키고자 하는 요구가 여전히 존재한다. 화합물 생산이 세포 성장과 결합되어 있는 만큼, 숙신산 또는 다른 화합물 생산의 효율에 있어서의 향상은 바람직한 화합물을 생산하는 미생물적 세포들의 성장 속도를 향상시키는 방법에 의하여 또한 도달될 수 있다. 이. 콜리 (E. coli ) 내에서의 숙신산 생산에 대한 이론적인 수율의 최대값은 소비되는 글루코오스의 1 그램에 대하여 1.12 그램의 숙신산의 질량 수율을 제공하는 글루코오스 1 몰 당 1.714 몰의 숙신산으로 계산된다 (베무리, 외(Vemuri, et al.), 2002).

미국 특허 출원 공개 번호 2008/0009041은 야생형 이 . 콜리 (E. coli ) 스트레인의 것보다 적어도 470kb 짧은 염색체 DNA를 포함하는 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인을 기재하고 있다. 이 돌연변이체 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인은 더 많은 세포 매스(cell mass)를 축적하고 또한 축적되는 트레오닌(threonine)의 양에 있어서 상당한 증가를 나타낸다.

미국 특허 출원 공개 번호 2009/0075333은 또한 부모의 스트레인과 비교하여 하나 이상의 동일한 또는 향상된 성장 속도, 변형 효율성(transformation efficiency), 단백질 발현, DNA 생산, DNA 수율 및/또는 DNA 퀄리티를 갖는 감소된 게놈 사이즈를 갖는 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인을 기재하고 있다.

미국 특허 출원 공개 번호 2009/0221055는 유전자 파괴를 통하여 유도되는 다양한 효소들의 우수한 생산성을 갖는 새로운 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 돌연변이체 스트레인을 기재하고 있다.

향상된 성장 속도에 도달하기 위하여 게놈 사이즈를 줄이는 이러한 접근법들은 주 발효조(fermentor) 내에서 성장하는 박테리아가 삭제될 수 있는 많은 비-본질적인 유전자들을 포함하고 있다는 사실을 바탕으로 한다. 적인 환경에서 살아가는 박테리아는 온도, 스트레스, 또는 식량 공급의 부족의 다른 환경적인 조건들에서 생존하기 위한 메카니즘을 제공하는 많은 조건-반응적인 유전자들을 가지고 있다. 이러한 유전자들을 복제하는 것은, 이것은 주 발효조 내에서는 불필요한 것이다, 그렇지 않을 경우 이러한 불필요한 유전자들의 결여에서 보존될 수 있는 세포적인 에너지의 소비를 요구한다.

게놈 사이즈를 감소시키는 것의 접근이 재조합 단백질들, 핵산 및 아미노산을 생산하는 스트레인들의 성장 능력을 향상시키기 위하여 유용할 수 있는 반면, 그것은 크레브 회로(Krebs cycle) (또한 트리카르복실산 회로(tricarboxylic acid cycle) 또는 TCA 회로로도 알려져 있는) 내에서의 중간체들(intermediates)인 숙신산, 푸마릭산, 및 말산과 같은 다른 화합물들을 생산하는 스트레인들의 성능을 향상시키기 위한 유용한 접근으로 보여지지는 않아 왔다. 이러한 및 다른 화합물들의 생산 효율은 또한 중앙의 대사적 경로들에서 다른 경로들을 통한 탄소 흐름의 속도에, 또한, 어떤 경우들에 있어서는, 혐기성 및 미세 호기성 성장 과정 동안에 선호되는 레독스 균형에 도달하는 것에 의존된다.

미국 특허 출원 공개 2009/0075352, 및 리 외(Lee et al.)(2005)는 실리코 분석 내(in-silico analysis)를 바탕으로 하는 박테리아 스트레인을 향상시키기 위한 방법을 기재하고 있다. 이러한 접근에서, 만하이미아 숙시니프로듀슨스 (Mannheimia succiniproducens )의 게놈 서열, 상당한 양으로 숙신산을 생산하는, 은 야생형의 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인을 숙신산을 생산하는 스트레인으로 변환하기 위한 목적을 위하여 이. 콜리 (E. coli ) 에서 삭제되어야 할 최적의 유전자들을 식별하기 위하여 이. 콜리(E. coli)의 게놈 서열과 비교된다. 이러한 접근이 표면에서 매력적으로 보일지라도, 그것은 엠. 숙시니프로듀슨스 (M. succiniproducens )로부터 유도되는 유전적 정보가 상업적으로 성장 가능한 숙신산염 생산 스트레인에 도달하기 위한 이. 콜리(E. coli)에 까지 추정될 수 있는가 보여지는 것으로 남아있다. 상기 언급된 미국 특허 출원로부터 추천되는 삭제들은 ptsG , pykA , 및 pykF의 조합이었다. 그러나, 그러한 스트레인으로부터 실질적으로 달성되는 숙신산염 타이터는 단지 8.16 mM (0.96 g/l)였고, 이것은 상업적으로 매력적인 생산을 위해 요구되는 수준 근처가 결코 아니며, 또한 상기 스트레인의 성장은 매우 열악하였다. 나아가, 상기 참조된 출원에서 추천되는 것과 유사한 삭제 돌연변이들(pykA , pykF, 및 ptsHI)의 조합은 보다 먼저 보고되어져 왔고, 또한 그 결과적인 스트레인은 글루코오스 상에서 매우 열악하게 성장하였다(폰세, 외.(Ponce et al.), 1995). 따라서, 리 외.(Lee et al.)(2005)에 의하여 기재된 돌연변이들의 조합은 상업적으로 성장할 수 있는 스트레인을 제조하는데 충분하지 않았고, 또한 상기 돌연변이들은 그들이 상업적으로 성장 가능한 스트레인을 위해 필요한지 또는 적합한지를 입증할 수 있는 스트레인 내용물(strain context) 중에서 테스트되지 않았다. 따라서, 본 기술 분야에서 숙련된 자에 있어서, 글루코오스 및 다른 값싼 탄소 공급원상에서 잘 성장하는 것 및 적어도 20 g/l 숙신산염(170 mM)을 생산하는 것을 요구되는, 상업적으로 성장 가능한 숙신산염 생산 스트레인에 대해 상기 개시들로부터의 명확한 경로가 존재하지 않는다.

모든 참조 문헌들이 독자의 편의를 위하여 하기에 목록화되었다. 각 문헌은 그것의 전체로서 참조에 의하여 포함되었다.

미국 특허 번호 6,455,284 미국 특허 번호 6,962,794 미국 특허 번호 6,989,265 미국 특허 번호 7,223,567 미국 특허 번호 7,229,794 미국 특허 번호 7,303,906 미국 특허 번호 7,371,558 미국 특허 번호 7,524,660 미국 특허 번호 7,629,162 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0214294 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0146966 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0181488 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0176114 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0221455 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0073577 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0111294 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0009041 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0176302 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0293100 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0047719 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0075333 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0075352 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0221055 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0325243 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0143997 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0261239 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0248311 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0279369 국제 특허 출원 공개 번호 WO2008/115958 국제 특허 출원 공개 번호 WO2010/115067 유럽 특허 출원 EP2,241,630

화합물 합성을 위한 석유화학적 프로세스와 경쟁하기 위하여, 화합물 생산을 위한 더욱 효과적인 생체 촉매들을 개발하기 위한 기술 분야에서의 요구가 존재한다. 제1 단계는 증진된 화학물 생산에 기여할 수 있는 숙주 염색체에 있어서의 유전적 변화들을 찾아내는 것이다. 이러한 환경의 관점에서, 본 발명의 목적은 상업적인 사용을 위해 선택되는 미생물 스트레인들에 의하여 화합물 생산을 향상시키는데 사용될 수 있는 새로운 돌연변이들을 찾아내는 것이다. 구체적인 실시예에서, 본 발명의 목적은 유기산들의 미생물적 생산의 효율성을 향상시키는 것이다. 더욱 구체적인 실시예에서, 상기 목적은 숙신산 생산의 효율성을 향상시키는 것이다. 본 발명의 또 다른 관점에서, 목적은 미생물로부터 대사적 진화와 같은 노동력-집약적인 방법들에 의존해야 하는 것 없이 일반적으로 숙신산과 같은 화합물들의 생산을 합리적으로 향상시키는 방법을 습득하는 것이다.

리버스 엔지니어링(reverse engineering)의 타입이 높은 라이신 생산을 위해 돌연변이화되고 또한 스크린되어져 온 코리네박테리움 글루타미쿰 ( Corynebacterium glutamicum) 스트레인들에 대하여 수행되어져 왔다. 상당히 개조된 라이신 생산 스트레인의 게놈은 야생형 스트레인의 그것과 비교되며, 또한 그 차이점들은 최소한으로 돌연변이화된 스트레인을 재 조작(re-engineer)하기 위하여 사용되었다(이케다 외.(Ikeda et al.), 2006). 그러나, 수백 개의 돌연변이들이 발견되었고, 또한 단지 이들 중 몇 개 만이 라이신 초과 생산에서 주요한 역할을 하는 것으로 보임에도 불구하고, 타당성을 위하여 수백 개의 돌연변이들의 모두를 테스트하는 것은 상당힌 비실용적일 것이다. 표면 상으로, 여기 기재되는 본 발명은 이러한 종래 기술에 기재되어 있는 것과 유사한 것으로 보일 수 있으나, 주요 차이는 본 발명의 시작 스트레인(starting srtain)은 돌연변이화되지 않았고, 단지 오히려 자발적으로 돌연변이하도록 허용되었다는 것이며, 또한 그것은 스크린되지 않았고, 단지 오히려 대사적 진화의 프로세스 내에서 선택되었다는 것이다. 이것은 본 발명을 구분하는 적어도 두 개의 주요한 차이점들을 도출한다: (1) 돌연변이들의 밀도가 상당히 낮으며, 거의 두 단위(two orders of magnitude) 정도로, 또한 (2) 본 발명에서 테스트되는 돌연변이들의 여덟 개 모두가 향상된 성장 또는 향상된 화합물 생산의 효율 중 어느 것에 대하여 관련되어 있다는 것이 증명된다. 따라서 본 발명의 방법들 및 물건들은 종래 기술의 그것들에 비하여 훨씬 향상된 것이다.

본 발명은 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 갖는 미생물들 (microorganisms)을 제공한다.

본 발명은 또한 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 갖는 미생물들(microorganisms)을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 가지며 또한 돌연변이화된 pykA 유전자를 갖는 미생물(microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 가지며 또한 돌연변이화된 pykF 유전자를 갖는 미생물(microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 가지며 또한 돌연변이화된 pykA 및 pykF 유전자들을 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 가지며 또한 비활성화되거나 또한 돌연변이화된 galS 유전자들을 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 가지며 또한 비활성화되거나 또한 돌연변이화된 galR 유전자들을 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 가지며 또한 galP 유전자의 다중 복제들(multiple copies)을 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력, galP 유전자의 다중 복제들(multiple copies) 및 그 세포 내부로의 글루코오스 이송에 대한 돌연변이화된 포스포트랜스퍼라제 시스템(phosphotransferase system)(PTS)을 갖는 미생물(microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력 및 염색체 DNA의 48kb 영역 내에서의 유전자들 ydcC 내지 ydcF를 포함하는 다중 유전자들을 포함하는 게놈의 큰 영역의 결실(deletion)을 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력 및 그 rpoA 유전자 내에서 미스센스 돌연변이(missense mutation)를 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력 및 그 rpoA 유전자의 아미노산 포지션 322에서 돌연변이(mutation)를 갖는 미생물(microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력 및 그 rpoA 유전자의 아미노산 포지션 322에서 프로린을 류신으로의 돌연변이 (proline to leucine mutation)를 갖는 미생물(microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력 및 그 rpoC 유전자 내에 돌연변이(mutation)를 갖는 미생물(microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력 및 rpoC 유전자의 F 영역 내에 돌연변이(mutation)를 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력 및 rpoC 유전자의 F 영역 내 포지션 747에서의 아미노산 내에서 미스센스 돌연변이(missense mutation)를 갖는 미생물(microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력 및 rpoC 유전자의 F 영역 내 포지션 747에서 메티오닌을 이소류신으로의 돌연변이(methionine to isoleucine mutation)를 갖는 미생물(microorganism)이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 가지며 또한 그 gldA 유전자 내에 돌연변이(mutation)를 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 가지며 또한 그 ftsI 유전자 내에 돌연변이(mutation)를 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 숙신산과 같은 화합물들을 생산하는 향상된 능력을 가지며 또한 그 dhaM 유전자 내에 돌연변이(mutation)를 갖는 미생물 (microorganism)이 제공된다.

(1) 돌연변이들의 밀도가 상당히 낮으며, 거의 두 단위 정도로, 또한 (2) 본 발명에서 테스트되는 돌연변이들의 여덟 개 모두가 향상된 성장 또는 향상된 화학적 생산의 효율 중 어느 것에 대하여 관련되어 있다는 것이 증명된다. 따라서 본 발명의 방법들 및 물건들은 종래 기술의 그것들에 비하여 훨씬 향상된 것이다.

본 발명에 개시되는 것은 발효적 프로세스(fermentative process)를 통해 숙신산의 생산을 위하여 적합한 미생물들이다. 본 발명이 유전적으로 변형된 박테리아 스트레인들에 의하여 탄소 화합물로부터 상업적으로 상단한 양으로 숙신산의 생산을 위한 프로세스를 제공한다고 하더라도, 본 발명의 가르침은 다른 많은 수의 산업적 생산에 대하여 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명의 기재의 목적을 위하여, 하기의 정의들이 사용될 것이다.

많은 수의 산업적으로 유용한 화합물들이 본 발명을 사용하여 제조될 수 있다. 그러한 화합물들의 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 에탄올(ethanol), 부탄올(butanols), 락트산염(lactate), 숙신산염(succinate), 푸마르산염(fumarate), 말산염(malate), 트레오닌(threonine), 메티오닌(methionine) 및 라이신(lysine)을 포함한다. 유기산들이 자유산들(free acids)으로서 및 염들(예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 소듐(sodium), 포타슘(potassium), 마그네슘(magnesium), 칼슘( calcium), 암모늄(ammonium), 클로라이드(chloride), 설페이트(sulfate), 카보네이트(carbonate), 바이카보네이트(bicarbonte) 등의 염들)로서 양자로 존재할 수 있기 때문에, 숙신산(succinic acid), 푸마르산(fumaric acid), 말산(malic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 트레오닌(threonine), 메티오닌(methionine), 및 라이신(lysine)과 같은 화학명들은 그 자유산 및 그들의 어떤 염 양자를 포함하는 것으로 의미될 것이다. 이와 마찬가지로, 숙신산염(succinate), 푸마르산염 (fumarate), 말산염(malate), 아스파르트산염(aspartate) 등과 같은 어떤 염은 자유산 역시 포함하는 것으로 의미될 것이다.

본 발명은 탄수화물 기질을 갖는 미네랄 염 배지 내에서의 혐기성 또는 미세 호기성 성장 조건들 하에서 숙신산 생산을 위한 높은 수율, 타이터 및 부피 생산성(volumetric productivity)을 나타내는 스트레인들을 얻기 위하여 특이적 유전자 변형들의 기술(technique of specific genetic modifications)과 대사적 진화 (metabolic evolution)의 프로세스를 결합한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "타이터(titer)"는 발효 배지 (fermentation broth) 내에서의 특정 화합물의 몰 농도를 의미한다. 따라서 본 발명에 따르는 숙신산의 생산을 위한 발효 프로세스에서, 100 mM의 숙신산 타이터는 측정의 시간에서의 발효 배지가 발효 배지의 리터(liter) 당 100 mMoles의 숙신산을 함유하였다는 것을 의미할 것이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수율(yield)"은 발효 프로세스 동안에 소모되는 공급 재료(feedstock)의 몰 당 생산되는 특정 화합물의 몰을 의미한다. 따라서 공급 재료로서 글루코오스를 사용하는 숙신산의 생산을 위한 발효적 프로세스에서, 상기 용어 수율은 소모되는 글루코오스 몰 당 생산되는 숙신산의 몰 수(the number of moles)를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부피 생산성(volumetric productivity)"은 단위 시간 당 단위 부피 당 생산되는 그램으로서의 특정 화합물의 양을 의미한다. 따라서 0.9 g L^-1h^-1의 숙신산의 부피 생산성 값은 0.9 그램의 숙신산이 성장의 1 시간 동안 발효 배지의 1 리터 내에 축적된다는 것을 의미할 것이다.

여기 기재된 바와 같은 용어들 "유전적으로 엔지니어링된(genetically engineered)" 또는 "유전적으로 변형된(genetically modified)"은 그 미생물들의 게놈 DNA를 조작하는 것을 통해 그 미생물들 내에서의 하나 이상의 효소들의 발현을 개조하는 것의 실행을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자(gene)"는 그 유전자의 개방 리딩 프레임(reading frame) 및 상부 및 하부 조절 서열들(upstream and downstream regulatory sequences)을 포함한다. 상기 상부 조절 영역은 또한 그 유전자의 프로모터 영역을 의미한다. 상기 하부 조절 영역은 또한 그 터미네이터 영역을 의미한다.

"대립 유전 형질(Allele)"은 특정 유전자의 DNA 서열의 둘 또는 초과의 형태들 중 하나이다. 어떠한 돌연변이도 없는 유전자는 돌연변이를 포함하는 상응하는 유전자와 비교될 때 야생형 대립 형질(wild type allele)로서 참조된다.

"상동체(Homolog)"는 공통의 조상의(ancestral) DNA 서열로부터 전해져 온 이차적 유전자(second gene)에 관련된 유전자이다. 이 용어, 상동체는 종분화 (speciation)의 사건에 의하여 구분되는 유전자들 사이에서의 관계에 대하여 또는 유전적 듀플리케이션의 사건에 의하여 구분되는 유전자들 사이에서의 관계에 대하여 적용될 수 있다. "오쏘로그들(Orthologs)"은 종분화에 의해 공통의 조상 유전자로부터 진화된 다른 종(species) 내의 유전자들이다. 보통, 오쏘로그들은 진화의 과정에서 동일한 기능을 유지한다. 오쏘로그들에 대한 식별(identification)은 새롭게 서열화된 게놈들 내에서의 유전자 기능에 대한 신뢰할 만한 예측을 위하여 중요하다. 종분화는 그것이 발생하는 종으로부터의 새로운 방법으로 살아가는 것을 가능하게 하는 새로운 종의 기원이다. 이러한 프로세스의 일부로서 그것은 그 부모 종과의 유전적 교환에 대하여 어떤 장벽을 또한 획득하였다. "파라로그들 (Paralogs)"은 게놈 내부에서의 듀플리케이션에 의해 관련되는 유전자들이다. 오쏘로그들은 진화의 과정에서 동일한 기능을 유지하는 반면, 파라로그들은 그들이 그 고유의 것에 관련되어 있기는 함에도 불구하고, 새로운 기능들을 진화시킨다.

구절 "기능적으로 유사한(functionally similar)"은 여기 기재된 방법들에 의하여 동일한 또는 다른 생물 내에서 발견되는 어떤 야생형 또는 돌연변이화된 DNA 서열, 유전자, 효소, 단백질과 동일하거나 또는 유사한 생물적 기능을 갖는, 어떤 생물(organism)로부터의 어떤 야생형 또는 돌연변이화된 DNA 서열, 유전자, 효소, 단백질을 광범위하게 의미한다. 기능적으로 유사성은 서열 상동(homology)을 요구할 필요가 없다. 예로서, 본 발명에서, 우리는 이. 콜리 (E. coli .) 내에서 총 피루베이트 키나제(pyruvate kinase) 활성을 감소시키는, 그러나 삭제하지는 않는 pykA 내에서의 돌연변이가 보다 효과적인 숙신산염 생산을 유도한다는 것을 발견하였다. 확장하여, 피루베이트 키나제를 감소시키는, 생물체의 또 다른 타입, 예로서 이스트 사카로마이스(yeast Saccharomyces), 에서의 돌연변이는 기능적으로 유사하며, 또한 사카로마이스(Saccharomyces) 내부의 관련성 있는 유전자, 예로서, PYK1 또는 PYK2 유전자는 이. 콜리(E. coli.)의 pykA 유전자와 기능적으로 동일할 것이다.

"개조된 활성(altered activity)"을 갖는 유전자 또는 단백질은 관련성 있는 야생형의 유전자 또는 단백질과 비교되었을 때에 측정 가능한 특성에서 측정 가능한 차이점을 생산하는 유전자 또는 단백질로서 광범위하게 정의된다. 상기 개조된 활성은 개조된 유전자 또는 단백질을 포함하는 스트레인의 숙신산염 생산에 대한 성장 속도 또는 효율을 증가시키거나 또는 감소시키는 일반적인 방법에서 그 자체로 명확할 수 있다. 다른 측정 가능한 특성들은, 그러나 이에 제한되는 것은 아닌, 효소 활성, 효소의 기질 특이성, 기질에 대한 친화도 또는 속도와 같은 효소의 동력학적 파라미터들, 효소의 안정도, 효소의 조절 특성들, 유전자 발현 수준, 다양한 조건들 하에서의 유전자 발현의 조절 등을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어 돌연변이는 개방 리딩 프레임, 상부 조절 영역 및 하부 조절 영역을 포함하는 유전자에 대하여 이루어지는 유전자 변형들을 의미한다. 상기 유전자 돌연변이들은 상방 조절(up regulation) 또는 하방 조절(down regulation) 또는 그 유전자의 개방 리딩 프레임의 전사의 완전한 저해 중 어느 것을 유도한다. 상기 유전자 돌연변이들은, 그 유전자의 전체적인 코딩하는 영역 또는 그 코딩하는 뉴클레오티드 서열 부분을 삭제함으로써, 또는 프레임 이동 돌연변이(frame shift mutation), 미스센스 돌연변이(missense), 또는 삽입 (insertion)을 도입함으로써, 또는 중지 코돈(stop codon) 또는 그들의 조합들을 도입함으로써의 어느 것에 의하여 달성된다. 돌연변이들은 효소 반응 또는 세포 멤브레인을 관통하는 유기 분자들의 이송과 같은 생물학적 기능들에 직접적으로 관련되는 단백질들에 대하여 코딩하는 구조 유전자들(structual genes)에서 발생할 수 있다. 대체적으로, 돌연변이들은 그 생물학적 기능들에 직접적으로 관련된 단백질에 대하여 코딩하는 유전자들의 발현을 조절하는 단백질들에 대하여 코딩하는 조절 유전자들(regulatory genes)에서 발생할 수 있다. 다른 유전자들의 발현을 조절하는 단백질들은 조절 단백질들(regulatory proteins)로서 참조되며, 또한 이러한 조절 단백질들에 대하여 코딩하는 유전자들은 조절 유전자들(regulatory genes)로서 참조된다.

"돌연변이(Mutation)"는 또한 관련성 있는 야생형 생물의 그것에 대하여 상대적인 DNA 서열 내에서의 어떤 변화를 포함한다. 예로서, 스트레인 KJ122 내에서 발견되는 돌연변이는, 그 돌연변이된 영역의 DNA 서열이 부모의 야생형 스트레인, 이. 콜리 (E. coli .) C, 또한 ATCC 8739로도 알려져 있는, 의 그것과 비교될 때 발견될 수 있는 DNA 서열 내에서의 어떤 변화이다. 돌연변이는 어떤 수의 염기 짝들 (base pairs)에 대한 부가적인 DNA의 삽입 또는 어떤 수의 염기 짝들(base pairs)에 대한 DNA의 결실(deletion)일 수 있다. 삽입 돌연변이의 특정한 타입은 유전자 듀플리케이트(gene duplicate)이다. 유전자는 자발적인 돌연변이적 사건에 의해 듀플리케이트될 수 있고, 이때 상기 유전자의 이차적 카피(secondary copy)는 고유 카피(original copy)에 인접하여 위치될 수 있거나, 또는 유전자는 유전적 조작에 의해 듀플리케이트 될 수 있고, 여기서 상기 유전자의 이차적 카피(secondary copy)는 상기 고유 카피(original copy)로부터 이격되어 있는 게놈 내의 사이트에 위치될 수 있다. 돌연변이는 예로서 아데닌으로부터 구아닌 염기로의 변화와 같이, 하나의 염기 타입으로부터 또 다른 염기 타입으로의 변화일 수 있다. 유전학의 표현(vernacular)에서, 돌연변이는 미스센스(missense)(코돈에 의하여 그를 위해 코딩된 아미노산을 변화시키는), 비인식의(nonsense)(코돈을 중지 코돈으로 변화시키는), 프레임 이동(frameshift)(세 개의 다중적인 것이 아닌 염기들의 수의 삽입 또는 결실인, 또한 상기 리딩 프레임을 변화시키고 및 돌연변이로부터 하부로 인코딩된 아미노산 서열을 개조하는, 또한 종종 상기 돌연변이로부터 하부로 중지 코돈을 도입하는), 또한 변환(inversion)(극성(polarity)에서 스위치된 그러나 삭제되지는 않은 DNA 서열로부터 도출되는) 일 수 있다.

"제로 돌연변이(null mutation)"는 그 관련성 있는 유전자의 전체적인 개방 리딩 프레임의 결실의 그것과 실질적으로 동일한, 또는 그 관련성 있는 유전자의 모든 측정 가능한 활성을 제거하는, 표현형(phenotype)을 부여하는 돌연변이이다.

"돌연변이체(mutant)"는 그것의 게놈이 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는 미생물이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성(exogenous)"은 세포의 외부로부터 유도되는 분자 또는 활성이 그 숙주 미생물체 내부로 도입되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 상기 미생물 세포 내부로 도입되는 외인성 핵산 분자의 경우에 있어서, 상기 도입된 핵산은 독립적인 플라스미드로서 존재할 수 있거나 숙주 염색체 DNA 내부로 집적될 수 있다(integrated). 단백질에 대하여 코딩하는 외인성 핵산은 프로모터 또는 터미네이터 서열들과 같은 그 고유의 조절 서열들과 함께 발현 가능한 형태로 미생물 세포 내부로 도입될 수 있다. 대체적으로, 상기 외인성 핵산 분자는 숙주 염색체 DNA 내부로 집적될 수 있고 또한 상기 숙주 조절 서열들의 조절 하에 있을 수 있다.

용어 "내인성(endogenous)"은 그 숙주 세포 내부에 존재하는 분자들 또는 활성을 의미한다. 생합성적 활성에 대한 참조로서 사용될 때, 상기 용어 "외인성 (exogenous)"은 그 숙주 기준 생물 내부로 도입되는 활성을 의미한다. 상기 소스 (source)는 예로서 상기 숙주 미생물체 내부로의 도입에 따라 기준이 되는 활성을 발현하는 상동의(homologous) 또는 이종의(heterologous) 인코딩하는 핵산일 수 있다. 만약 단백질에 대하여 코딩하는 핵산이 미생물체의 동일한 종으로부터 얻어지는 것이라면, 그것은 상동성 DNA로서 참조된다. 만약 상기 핵산이 다른 미생물 종으로부터 유도되는 것이라면, 그것은 이종의 DNA로서 참조된다. 상기 DNA의 성질과 관계없이, 그것이 상동이거나 또는 이종의 것이거나, 숙주 세포 내부로 도입될 때에, 상기 DNA 및 도입된 DNA로부터 유도되는 활성은 외인성인 것으로 참조된다. 따라서, 본 발명의 인코딩하는 핵산의 외인성 발현은 이종의 및 상동의 양자의 인코딩하는 핵산 중 어느 것을 이용할 수 있다.

"미생물(Microorganism)"은 어떤 박테리아(bacterium), 이케온(archeon), 이스트(yeast), 사상균(filamentous fungus), 단세포 알가(unicellular alga), 또는 쌍편모충류(dinoflagellate)를 포함할 수 있다.

본 발명에 대하여 적합한 재조합 미생물들은 많은 수의 박테리아 과들 (bacterial familis)으로부터, 바람직하게는 엔테로박테리아케 과 (Enterobacteriaceae family)으로부터 유도된다. 상기 적합한 미생물들은 에셰리 키아(Escherichia), 에르위니아 ( Erwinia ), 프로비덴시아 ( Providencia ), 및 세라티아(Serratia) 속(genera)으로부터 선택된다. 상기 에셰리키아 ( Escherichia ) 속이 특히 바람직하다. 에셰리키아 ( Escherichia ) 속 내부에서의 에셰리키아 콜리 (Escherichia coli ) 종이 특히 바람직하다. 이. 콜리 비(E. coli B), 이. 콜리 씨 (E. coli C), 이. 콜리 더블유(E. coli W) 또는 기타와 같은 어떤 하나의 스트레인이 본 발명에 대하여 유용하다.

상당한 양으로 유기산들을 생산하는 것을 가능하게 하는 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예로서, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0148914는 화학적으로 순수한 아세트산염 및/또는 피루브산염의 생산에 대하여 생체 촉매로서의 이. 콜리(E. coli)의 스트레인들을 제공한다. 미국 특허 7,629,162는 락트산의 생산을 위하여 제조된 이. 콜리 K011(E. coli K011) 스트레인의 유도체들을 제공한다. 특허 협정 조약 번호들 WO 2008/115958 및 WO 2010/115067 하에 공개된 국제 특허 출원들은 pH-조절된 배치 발효 내에서 탄소의 소스로서 글루코오스를 포함하는 최소한의 미네랄 염 배지 내에서 숙신산염 및 말산염을 생산하도록 엔지니어링된 미생물을 제공한다.

본 발명의 어떤 실시예들에서, 본 발명에 따라 변형될 수 있는 박테리아는 이에 제한되는 것은 아니나 아크로모박터 델마바(Achromobacter delmarvae ), 아크로모박터 비스코서스 ( Achromobacter viscosus ), 아크로모박터 락티컴 (Achromobacter lacticum ), 악티노마두라 마두라 ( Actinomadura madurae ), 악티노마이스 바이오아케오크로모진스 ( Actinomyces violaceochromogenes ), 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida ), 아그로박테리움 투메파시언스 ( Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터 ( Agrobacterium radiobacter ), 알칼리진스 페칼리스 ( Alcaligenes faecalis ), 아트로박터 시트레우스 ( Arthrobacter citreus), 아트로박터 투메슨스 ( Arthrobacter tumescens ), 아크로박터 파라피누스 (Arthrobacter paraffineus ), 아크로박터 하이드록카보글루타미커스 ( Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아크로박터 옥시단스 ( Arthrobacter oxydans ), 아우레오박테리움 사퍼다 ( Aureobacterium saperdae ), 아조박터 인디커스 (Azotobacter indicus ), 바실러스 아밀로리퀴파시언스 (Bacillus amyloliqyefaciens), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans ), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans ), 바실러스 리체니포미스 (Bacillus licheniformis ), 바실러스 퍼밀러스 (Bacillus pumilus ), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ), 바실러스 티아미노리티커스 (Bacillus thiaminolyticus ), 브레비박테리움 암모니아진스 (Brevibacterium ammoniagenes ), 디배리카툼 ( divaricatum ), 브레비박테리움 락토퍼멘툼 (Brevibacterium lactofermentum ), 브레비박테리움 플라붐 ( Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 글로보숨 ( Brevibacterium globosum ), 브레비박테리움 퍼스쿰 (Brevibacterium fuscum ), 브레비박테리움 케토글루타미쿰 ( Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비 박테리움 헬로콜룸 ( Brevibacterium helcolum ), 브레비박테리움 퍼실룸 (Brevibacterium pusillum ), 브레비박테리움 테스타세움 ( Brevibacterium testaceum), 브레비박테리움 로세움 ( Brevibacterium roseum ), 브레비박테리움 이마리오필리움(Brevibacterium immariophilium ), 브레비박테리움 리넨스 (Brevibacterium linens), 브레비박테리움 프로토파미아 ( Brevibacterium protopharmiae), 시트로박터 프룬디 ( Citrobactor freundii ), 코린박테리움 아세토필룸 (Corynebacterium acetophilum ), 코린박테리움 글루타미쿰 ( Coryneb acterium glutamicum), 코린박테리움 칼루나 ( Corynebacterium callunae ), 코린박테리움 아세 토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum ), 코린박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum ), 엔테로박터 에어로진스 ( Enterobacter aerogenes), 에르위니아 아밀로보라 ( Erwinia amylovora ), 에르위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora ), 에르위니아 허비콜라( Erwinia herbicola ), 에르위니아 크리산테미 (Erwinia chrysanthemi ), 에셰리키아 프룬디 ( Escherichia freundii ), 프라보 박테리움 페레그리눔 ( Flavobacterium peregrinum ), 플라보박테리움 퍼카툼 (Flavobacterium fucatum ), 플라보박테리움 오란티눔 ( Flavobacterium aurantinum ), 플라보박테리움 레나눔 ( Flavobacterium rhenanum ), 플라보박테리움 세와넨스 (Flavobacterium sewanense ), 플라보박테리움 브레베 ( Flavobacterium breve ), 플라 보박테리움 메닌고셉티쿰 ( Flavobacterium meningosepticum ), 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans ), 글루코노박터 아사이 ( Gluconobacter asaii ), 키타사토스포리아 파룰로사 ( Kitasatosporia parulosa ), 클레브시엘라 옥시토카 ( Klebsiella oxytoca ), 클레브시엘라 뉴모니아 ( Klebsiella pneumonieae ), 마이크로박테리움 암모니아필룸 ( Microbacterium ammoniaphilum ), 마이크로코커스 종 CCM825(Micrococcus sp . CCM825 ), 모르가넬라 모르가니 ( Morganella morganii ), 노카디아 오파카 ( Nocardia opaca ), 노카디아 루고사 ( Nocardia rugosa ), 플라노코커스 유시나투스(Planococcus eucinatus ), 프로테우스 레트게리 ( Proteus rettgeri ), 프 로피오니박테리움 세르마니 ( Propionibacterium shermanii ), 슈도모나스 신크산타 (Pseudomonas synxantha ), 슈도모나스 아조토포만스 ( Pseudomonas azotoformans ), 슈도모나스 플루오레슨스 ( Pseudomonas fluorescens ), 슈도모나스 오발리스 (Pseudomonas ovalis ), 슈도모나스 스투트제리 ( Pseudomonas stutzeri ), 슈도모나스 아시도볼란스(Pseudomonas acidovolans ), 슈도모나스 머시도렌스 ( Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 테스토스테로니 ( Pseudomonas testosteroni ), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa ), 로도코커스 에리트로폴리스 ( Rhodococcus erythropolis), 로도코커스 로도크러스 ( Rhodococcus rhodochrous ), 로도코커스 종 ATCC 15592( Rhodococcus sp . ATCC 15592), 로도코커스 종 ATCC 19070( Rhodococcus sp. ATCC 19070), 세라티아 마세슨스 ( Serratia marcescens ), 스포로사키나 우레아 (Sporosarcina ureae ), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus ), 스트 렙토마이스 코엘리컬러 ( Streptomyces coelicolor ), 스트렙토마이스 플라벨루스 (Streptomyces flavelus ), 스트렙토마이스 그리세올러스 ( Streptomyces griseolus ), 스트렙토마이스 리비단스 ( Streptomyces lividans ), 스트렙토마이스 올리바세우스 (Streptomyces olivaceus ), 스트렙토마이스 타나시엔시스 ( Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이스 버지니아 ( Streptomyces virginiae ), 스트렙토마이 스 안티비오티커스 ( Streptomyces antibioticus ), 스트렙토마이스 카카오 (Streptomyces cacaoi ), 스트렙토마이스 라벤둘라 ( Streptomyces lavendulae ), 스트렙토마이스 비리도크로모진스 ( Streptomyces viridochromogenes ), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium ), 살모넬라 쇼트뮬레리 (Salmonella schottmulleri), 비브리오 메츠니코비 ( Vibrio metschnikovii ), 비브리오 티로진 스(Vibrio tyrogenes), 크산토모나스 시트리 ( Xanthomonas citri ) 및 기타의 것을 포함한다.

본 발명은 발효 프로세스에 대한 기질로서 탄소원을 포함하는 미네랄 염 배지 내에서 발효적인 조건들 하에서 성장되는 숙신산에 대하여 인상적인 타이터, 높은 수율 및 상당한 부피 생산성을 나타내는 유전적으로 변형된 박테리아 스트레인들을 제공한다. 그 대상 발명의 미생물들은 헥소스(hexoses), 펜토스(pentoses), 디사카라이드(disaccharides) 및 글리세롤(glycerol)과 같은 다른 탄소 화합물들과 같은 다양항 당(sugar)들을 사용하는 단일 단계 생산 프로세스에서 사용될 수 있다.

어떤 내용들 중에서의 용어 "발효(fermentation)" 및 "발효하다(ferment)"는 생물체에 의한 혐기성 성장 또는 대사를 의미한다. 그러나, 본 개시에서, 우리는 용어들 "발효(fermentation)" 및 "발효하다(ferment)"가 호기성, 혐기성, 또는 미세 호기성, 또는 이들의 조합을 포함하는 어떤 조건 하에서의 미생물들의 상업적 또는 실험적 성장으로 광범히 하게 참조될 수 있는 것으로 사용할 것이다.

많은 화합물들의 생합성 생산은 상기 생산 생물체의 성장이 산소 또는 공기가 결여되거나 또는 제한된 조건들 하에서 수행될 때에 더욱 효과적으로 진행될 수 있다(예로서 더 높은 수율로서). 이것은 대부분 산소의 존재가 일반적으로 상대적으로 낮은 값 부산물인 이산화탄소로의 탄소원들의 대사의 결과를 가져오기 때문이다. 산소 또는 공기의 고의적인 공급의 결여에서의 발효가 통상적으로 "혐기성 (anaerobic)"으로 불린다. 그러나, 엄격한 혐기성 조건들에 도달하는 것은 비용이 많이 들고 및 종종 달성하기가 어렵다. 나아가, 어떤 발효들을 위해, 엄격한 혐기성 조건들은 요구되지 않거나 또는 종종 최적의 것이 아니다. 산소 또는 공기가 엄격하게 결여되도록 이루어진 것이 아닌, 또는 산소 또는 공기가 고의적으로 낮은, 조절된 속도로 공급되는 발효에 대하여, 우리는 용어 "미세 호기성(microaerobic)"을 사용할 것이다.

본 발명의 실행을 위한 적합한 미생물들은 호기성적으로(산소의 존재하에) 또는 혐기성적으로(산소의 완전한 결여에서) 또는 미세 호기성적으로(최소 량의 산소 공급을 가지고) 성장될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 숙신산의 생산을 위해 선택되는 미생물은 혐기성 조건에서 성장된다. 대체적으로 본 발명을 위한 적합한 미생물들은, 상기 미생물이, 상업적으로 상당한 양으로 숙신산의 생산에 도달하기 위하여 그것을 혐기성 성장 조건으로 이동시키기 전에 세포 성장의 어떤 수준에 도달할 때까지 호기성 성장 조건에서 최초로 성장되는, 이중-상 성장 레짐 (double-phase growth regime) 내에서 성장될 수 있다. 본 발명의 미생물들에 의한 숙신산의 생산에 대한 이중-상 성장 과정에서, 숙신산의 생산 및 축적은 혐기성 발효적 성장 상 동안에 발생한다.

본 발명에서, 유전자 돌연변이들의 고유의 및 유리한 조합들이 숙신산 생산으로의 탄소 흐름을 지시하기 위하여 사용되어 왔다. 이에 더하여, 상기 숙신산 생산은, 차례로 세포의 ATP 수준 및 레독스 균형과 결합되어 있는 미생물 성장과 결합되어 있다.

상기 용어 "레독스 균형(redox balance)"은 NAD⁺에 대한 NADH의 적합한 비율을 유지하는 세포의 능력을 의미한다. 다른 의미에서, 상기 세포들은 NADH를 산화할 수 있어 그에 따라 혐기성 발효적 성장 동안에 탄수화물 기질들을 산화시키기 위한 충분한 NAD⁺가 존재한다. 호기성 성장 과정에서, 상기 NAD⁺ 풀(pool)은 NADH를 포함하는 산화성 인산화(phosphorylation)을 통하여 재생산된다. 그러나, 혐기성 성장 조건들 하에서 상기 NAD⁺ 풀(pool)의 재생산은 NADH를 산화시킬 수 있는 세포 내부에서의 다양한 대사적 경로들을 통하여 탄소의 흐름을 조작하는 방법에 의하여만 단지 달성될 수 있다.

"탄소 분해 대사질 억제(Carbon catabolite repression)"는 하나 이상의 유전자들의 발현들이 그 상에서 생물체가 성장하는 탄소원에 의하여 부분적으로 조절되는 어떤 생물학적 시스템으로 광범위하게 참조된다. 예로서, 이. 콜리 (E. coli ) 내에서, 야생형 생물체 내에서의 당신생(gluconeogenesis)으로 기능하는 유전자들은 그 배지 내의 글루코오스의 존재에 의해 억제된다. 특히, pck 유전자는 대부분의 야생형 이 . 콜리 (E. coli ) 스트레인들 내에서 글루코오스에 의하여 하향 조절된다. 또 다른 예로서, 이스트 사카로마이스 세레비시아(yeast Saccharomyces cerevisiae)의 야생형 스트레인들 내에서, 갈락토오스(galactose)와 같은 글루코오스 이외의 다른 탄소원들의 사용은 그 배지 내의 글루코오스 존재에 의하여 저해된다.

"트리카르복실산 회로(tricarboxylic acid cycle)" 또는 "TCA" 회로는 대부분의 미생물들 내에서 전체 또는 부분적으로 존재하는 생화학적 반응들의 세트이다. 많은 생물체에서, 예로서 유박테리아(eubacteria) 및 이스트(yeast), 상기 TCA 회로는 호기성 성장 과정에서 실질적(true) 회로로서 수행한다. 이러한 경우에서, 상기 TCA 회로는 두 개의 탄소 단위들(아세테이트와 같은)을 이산화탄소로 이화하는, 또한 글루탐산염(glutamate), succinate(숙신산염), 및 aspartate(아스파르트산염)과 같은 생합성에 대한 생화학적 중간체들을 생산하는, 두 개의 주요 기능들을 가진다. 혐기성 또는 미세 호기성 성장 과정에서, 상기 TCA 회로는 실질적인 회로로서 수행되지 않을 수 있고, 오히려 하나 이상의 선형적 경로들이 수행될 수 있다. 예로서, 이. 콜리 (E. coli ) 내에서 낮은 산소의 조건들 하에서 상기 TCA 회로 효소들은, 말산염을 통하여 숙신산염을 유도하는 소위 환원성 경로, 및 시트레이트를 통하여 α-케토글루타르산염(α-ketoglutarate)을 유도하는 소위 산화성 경로를 포함하는, 두 개의 분지된 경로로서 작동한다. 이러한 경우에서, 상기 TCA 회로의 기능은 주로 생화학적 중간체들 글루탐산염(glutamate), 숙신산염(succinate), 및 아스파르트산염(aspartate)을 생산하는 것이다. 어떤 탄소는 글리옥실산 션트 (glyoxylate shunt)를 통하여 두 개의 브랜치들 사이에서 이송될 수 있다. 호기성, 혐기성, 및 미세 호기성 성장 과정에서, 생합성을 위하여 사용되는 생화학적 중간체의 각 분자에 대하여, 상기 TCA 회로 내에서의 분자는 대체되어야 하며, 그렇지 않을 경우 상기 회로 내에서의 화합물들은 고갈될 것이다. 이러한 대체 반응은 아나플루로틱 반응(anapleurotic reaction)이라 불린다.

통상적인 아나플루로틱 반응들은, 피루브산염 또는 포스포에놀 피루브산염 (phosphoenol pyruvate(PEP))과 같은 세 개 탄소의 화합물을 사용하고, 또한 이차적 기질로서 이산화탄소를 사용하여 그것을 옥살로아세트산염(oxaloacetate) 또는 말산염(malate)과 같은 네 개 탄소의 화합물로 전환한다.

유박테리아(eubacteria) 또는 이스트(yeasts)와 같은 많은 생물체들 내에서, TCA 회로 및 글리옥실산 션트(glyoxylate shunt)의 효소들을 인코딩하는 유전자들의 발현은 글루코오스에 의하여 억제되고 및/또는 산소에 의하여 유도된다(크로난 및 라포르테(Cronan and Laporte), 1996). 이러한 조절의 컨트롤은 복잡하다. 문헌에 따르면, 숙신산염 및 다른 화합물들의 효율적인 생산은, 특히 낮은 산소의 조건들 하에서, 환원성 TCA 회로 효소들과 상기 글리옥실산 션트의 그것들의 미세한 균형을 요구한다(버뮤리 외.(Vermuri et al.), 2002; 왕 외.(Wang et al.), 2006; 산체츠 외.(Sanchez et al.) 2005).

그러나, 본 기술 분야의 상황은, 스트레인들을 최적의, 또는 최적에 근접하게, 숙신산염과 같은 화합물들의 생합성을 위한 TCA 회로 및 글리옥실산 션트 경로들의 사용을 달성할 수 있도록 합리적으로 디자인할 만큼 충분히 발전되어 있지 않다. 본 발명의 목적들 중 하나는 TCA 회로의 화합물의 생산을 위하여 최적에 근접하게 상당히 진화된 미생물을 DNA 서열의 수준에서 절단하는 것으로, 이에 따라 미래에, 더욱 합리적인 스트레인 디자인 및 제조가 숙신산염 및 다른 화합물들의 생산을 위한 스트레인들을 엔지니어링하는데 있어서 사용될 수 있다. 본 발명에서 발견된 돌연변이들은, 여기 기재된 돌연변이들이, 그러한 화합물들을 생산하는 야생형 생물체, 유전자들 및 효소들이 복잡한 방법들로 네거티브하게 조절되는 글루코오스(또는 다른 당) 바탕의 배지 내 낮은 산소의 조건들 하에서 옥살로아세테이트산염으로 및 그로부터의 대사적 흐름을 증가시키는데 있어서 유용하기 때문에, TCA 회로 중간체들, 및 TCA 회로 중간체들의 유도체들로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 숙신산염(succinate), 푸마르산염(fumarate), 말산염(malate), 글루탐산염 (glutamate), 아스파르트산염(aspartate), 트레오닌(threonine), 라이신(lysine), 메티오닌(methionine) 및 이소류신(isoleucine)을 포함하는, 특히 옥살로아세트산염(oxaloacetate)으로부터 유도되는 화합물들을 포함하는, TCA 회로와 관련된 화합물들의 생합성을 향상시키는데 있어 유용하다.

박테리아에서 자주 발견되는 당들의 이송을 위한 하나의 메카니즘은 포스포트랜스퍼라제 시스템(phosphotransferase system (PTS))이다. 이것은 두 개-에너지-커플링 단백질들(two-energy-coupling proteins), 엔자임 I 및 HPr(Enzyme I and HPr), 및 몇 개의 당-특이적 엔자임 II 단백질들(sugar-specific Enzyme II proteins) 또는 단백질 복합체들(protein complexes)로 구성되며, 이는 전형적으로 세 개의 단백질 도메인들, EIIA, EIIB 및 EIIC로 이루어진다. EII 도메인들의 구조는 박테리아 사이에서 다르다. EII는 하나의 융합된 단백질 또는 다른 융합된 및 융합되지 않은 도메인들로 이루어진다. 멤브레인을 통한 특정 당의 위치이송 (translocation)은 인테그랄 멤브레인 도메인(들) EIIC(integral membrane domain(s) EIIC) 및 종종 EIID에 의하여 촉진된다. 그러나, 함께 작용하여 상기 당 기질의 이송 및 인산화를 가져오며, 결과적으로 인산화된 탄수화물의 세포 간 풀 (intracellular pool)을 유도하는 것은, 상기 세 개의 효소 도메인들 또는 단백질들의 복합체이다. 상기 PTS 를 위한 에너지 및 포스페이트의 소스는 포스포에놀 피루브산염(phosphoenol pyruvate (PEP))이다. 그러나 PEP 는 또한 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 아스파르트산염, 및 그러한 네 개-탄소 화합물들로부터 만들어지는 다른 화합물들과 같이 네 개-탄소 화합물들의 생합성을 위한 기질일 수 있고, 따라서 PTS 및 생합성 경로들 사이에서의 PEP에 대한 세포 내부에서의 경쟁이 존재할 수 있다. 이. 콜리 (E. coli ) 내부에서, 글루코오스에 대한 PTS 시스템은 ptsH, I, G 및 crr 유전자들에 의해 코딩된다. 당들을 PTS를 포함하지 않는 미생물들로 이송시키기 위한 다른 메카니즘들이 존재한다. 우리는 기질로서 PEP를 직접적으로 사용하지 않는 이러한 다른 이송 메카니즘에 관여되는 단백질들을 "비-PTS(non-PTS)" 당 이송자(sugar transporters)라 부른다. 비-PTS 이송자들의 예들은 이. 콜리(E. coli)의 GalP 및 XylE와 같은 프로톤 심포터들(proton symporters), 사카로마이스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae )의 HEX1,2,6, 및 7 및 짐모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis )의 Glf와 같은 촉진된 디퓨저들(facilitated diffusers), 및 이. 콜리(E. coli)의 XylFGH와 같은 ABC-타입 이송자들(ABC-type transporters)이다.

박테리아의 당 이송자들의 가장 큰 분류군(group)은 ATP 결합 카세트(ABC) 이송자들로서 알려져 있다. 상기 이름이 의미하는 바와 같이, ABC 이송자들은 박테리아 세포 내로 이송되는 당의 모든 분자에 대하여 APT 분자를 요구한다. XylFGH는 자일로스(xylose), 펜토스 당(pentose sugar)의 세포 내부로의 이송에 대한 ABC 이송자이다. AraFGH는 아라비노스(arabinose), 역시 또 다른 펜토스 당(pentose sugar)의 이송에 대한 이송자이다.

비-PTS 박테리아 당 이송자들의 다른 타입은 주요 촉진자 상과(Major Facilitator Super family (MFS)) 하에 분류된다. 상기 MFS 당 이송자들 내에서, 이송자들의 두 개의 다른 카테고리들이 인식되어 있다. MFS 는 H⁺-연결된 심포터들 (symporters), Na⁺-연결된 심포터들(symporters)-안티포터들(antiporters) 및 유니포터들(uniporters)을 포함한다. 상기 유니포터들은 당 이송을 위한 간단한 촉진제들이다. 상기 H⁺-연결된 심포터들(symporters)은 세포 내부로 이송된 모든 당 분자에 대하여 프로톤을 요구한다. 이. 콜리(E. coli) 내의 GalP 단백질은 갈락토오스, 헥소스 당의 세포 내로의 이송을 위한 심포터이다. GalP 단백질은 12 트랜스-멤브레인 루프들을 갖는 매우 잘 특성화된 심포터이다. GalP는 또한 세포 멤브레인을 통과하여 글루코오스를 이송시키는 능력을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. AraE는 세포 멤브레인을 통하여 아라비노스(arabinose)의 이송에 대한 프로톤-연결된 심포터이다. 마찬가지로 XylE 단백질은 자일로스(xylose)의 이송에 대한 프로톤-연결된 심포터이다.

포스포트랜스퍼라제 시스템(phosphotransferase system (PTS))에 의하여 섭취되는 글루코오스의 제거는 미생물 세포 내로의 글루코오스 섭취에 대해 사용되는 에너지를 감소시키는데 도움을 줄 수 있다. PTS를 조작하는 것에 의해 보존되는 에너지는 유기산 생산의 효율을 향상시키기 위하여 보내어질 수 있다. 포스포트랜스퍼라제 시스템(phosphotransferase system) 유전자 ptsH 및 ptsG는 글루코오스 섭취에서 에너지를 보존하도록 및 이에 따라 그 미생물에 의한 숙신산 생산의 효율을 향상시키도록 조작될 수 있다. 따라서 미생물 대사적 경로들의 영역에서 입수 가능한 데이터를 탐색함으로써, 유전자들의 세트를 삭제할 수 있고, 따라서 대사적 경로들의 대부분을 차단하고 또한 탄소 흐름을 큰 효율로 숙신산 생산으로 보낼 수 있다. PTS-매개된 글루코오스 섭취의 저해로, 글루코오스 섭취를 위한 다른 시스템들이 활성화 될 수 있어 산업적으로 유용한 화합물들의 생산을 위한 세포 내에서의 글루코오스의 연속된 입수 가능성을 확실히 한다. 예로서, 글루코오스 퍼미아제 (glucose perease), 글루코오스 유니포터(glucose uniporter)에 대한 glf 유전자는 PTS 매개된 글루코오스 섭취의 손실에 대하여 대체하는 것으로 보여져왔다. 마찬가지로 galP 및 glk 유전자들의 과 발현은 이. 콜리(E. coli)의 pts ^- 스트레인 내에서의 글루코오스 섭취 및 인산화를 증진시키는 것으로 보고되어 있다. GalP는 갈락토오스, 헥사로스 당의 섭취에 대한 심포터이다. GalP는 pts ^- 스트레인 내에서 글루코오스를 이송시키는 것으로 보고되어 있다. GalP 매개된 글루코오스 섭취의 중요성은 pts ^- 돌연변이 내에서의 galP 유전자 비활성화가 치명적인 것으로 나타났다는 사실에 의하여 증명되었다(위 외.(Yi et al.), 2003). Glk는 그것이 당분해 (glycolysis) 내로 들어갈 수 있기 이전에 글루코오스 분자의 인산화를 달성하는데 있어서 요구된다. pts ^- 스트레인 내에서 GalP 단백질의 발현은 구조적 프로모터 하에서 외인성 유전자를 발현시킴으로써 또는 galS 및 galR과 같은 galP 유전자의 억제자에 대하여 코딩하는 유전자들 내에서의 돌연변이들을 통해 상기 galP 발현의 억제를 완화하는 방법에 의하여 중 어느 것으로 달성될 수 있다.

미생물 세포 내에서의 대사적 경로들에 대한 우리의 현재의 이해를 사용하여, 상당한 양으로 숙신산을 생산하도록 디자인된 스트레인을 합리적으로 제조하는 것은 가능하다. 효율적인 숙신산을 생산하는 미생물의 제조를 위한 합리적인 디자인은, 숙신산이 혐기성 또는 미세-호기성 조건들 하에서 세포 내부에서 탄소의 흐름에 대한 다른 잠재적인 발효적 경로들이 유전적 조작을 통해 차단될 때에 축적될 수 있다는 가정을 바탕으로 한다. 세포 내부에서 탄소의 흐름에 대한 특정 경로들을 차단하기 위하여 요구되는 유전적 조작들은 차단되도록 소망되어지는 경로의 작동에 관여되는 효소들에 대하여 코딩하는 하나 이상의 유전자들 활성을 감소시키거나 또는 제거하는 것을 포함한다. 아세트산염, 푸마르산염, 에탄올 및 락트산염에 대한 탄소 흐름은 적합한 유전적 방법들을 통하여 차단될 수 있다. 예로서, adhE에 대한 유전자를 삭제함으로써, 혐기성 알콜 생산이 차단될 수 있고, 또한 아세트산염으로의 탄소 흐름은 ack 및/또는 ptaA 유전자들을 삭제함으로써 차단될 수 있다.

이론적으로 세포 내에서 탄소 흐름에 대한 특정한 원하지 않는 경로들을 차단하고 또한 그 탄소 흐름을 숙신산 생산으로 보내는 것이 이론적으로 직접적인 것이라 하더라도, 실제에 있어서 합리적으로 디자인된 유전자 결실들은 바람직한 표현형(phenotype)의 결과를 가져오지 않는다. 잔타마 외(Jantama et al.)(2008a; 2008b)에 의하여 기재된 바와 같이, 합리적으로 디자인된 유전자 결실들은 처음에는 열악한 성장을 갖는 박테리아 스트레인들의 결과를 가져왔다. 열악한 성장을 갖는 유전자-삭제된 스트레인들은 후속적으로 성장 속도를 향상시키기 위한 대사적 진화 하에 놓여졌다. 따라서, 숙신산 생산을 위한 이. 콜리(E. coli) 스트레인을 제조하는데 있어서, IdhA , adhE , 및 ack 유전자들을 제거하는 결실들의 제1 라운드가 수행되었고, 대사적 진화의 제1 단계에 의해 후속되었다.

대사적 진화의 제1 단계 후에, 유전자 결실들의 제2 라운드는 focA 및 pflB 유전자들을 제거하였다. 다음으로 대사적 진화의 제2 라운드가 수행되었다. 삭제의 제3 라운드에서, mgsA 유전자가 제거되었다. 다음으로 대사적 진화의 제3 단계가 수행되었다. 삭제의 제4 라운드에서, poxB 유전자가 제거되었다. 다음으로 대사적 진화의 제4 단계가 수행되었다.

"대사적 진화(metabolic evolution)"는 그것에 의하여 미생물(종종 유전적으로 조작된 미생물)의 배양균(culture)(보통, 그러나 필수적인 것은 아닌, 액상의 q배양균)이 희석 및 재-성장(소위 "이동(tranfers)")의 반복된 사이클들 하에 놓여지는 프로세스이며, 이에 따라 많은 수의 이동 후에, 향상된 성장 특성들 및/또는 숙신산, 락트산, 에탄올, 또는 부탄올과 같은 성장에 대하여 결합되어 있는 화합물의 향상된 생산을 보유하는 스트레인을 얻는 것이 가능하다. 대사적 진화는 특히 미생물의 성장이 발효에 의하여 바람직한 화합물을 생산하는 것에 의존적이도록 되었을 때에 스트레인 향상을 위한 방법으로서 효과적이다. 예로서, 야생형 이 . 콜리 (E. coli )와 같은 이종 발효적 미생물(heterofermentative microorganism)은, 글루코오스와 같은 당 상에서 혐기성적으로 또는 미세 호기성적으로 성장될 때에, 화합물들, D-락트산염, L-락트산염, 포름산염, 숙신산염, 아세트산염, 이산화탄소, 수소, 및 에탄올의 혼합물을 생산한다. 이러한 화합물들에 대한 경로는 소위 "발효적 경로들(fermentative pathways)"로 명명된다. 다른 미생물들 내에서, 발효적 경로들은 부탄올, 다른 알콜들, 다른 유기산들, 에스테르들, 3-하이드록시 알칸산들(3 -hydroxy alkanoic acids), 지방산들, 알칸들, 알켄들, 카로네노이드들 (carotenoids), 아미노산들, 비타민들, 및 많은 이상의 것과 같은 큰 다양성의 화합물들을 유도할 수 있다. 야생형 이 . 콜리(E. coli)에 의해 만들어지는 화합물들 중에서, 적어도 D-락트산염, 숙신산염 및 에탄올은 상업적으로 관심이 있으며, 또한 따라서 "바람직한 화합물(desired compound)"로서 간주될 수 있다. 원하지 않는 화합물들에 대한 경로들을 컨트롤하는 유전자들을 삭제하는 것에 의하여, 그 미생물은 상기 바람직한 화합물에 대한 하나 이상의 경로로만으로 남겨지고, 또한 따라서 성장은 상기 바람직한 화합물에 의존적이거나 또는 그에 대하여 결합된다. 대체적으로, 그 숙주 미생물로부터의 모든 발효적 경로들은 삭제될 수 있고, 또한 그 숙주 미생물들 내에서는 적으로 생산되지 않는 바람직한 화합물을 유도하는 다른 미생물로부터의 새로운 외인성 경로가 유전적 엔지니어링에 의하여 도입될 수 있다. 대사적 진화는 다음으로 성장 및 그에 따라 바람직한 화합물의 생산을 향상시키기 위하여 돌연변이화된 및 조작된 스트레인에 대하여 적용될 수 있다. 대사적 진화가 고의적인 돌연 변이 유발(mutagenesis)을 요구하지 않기 때문에, 진화된 스트레인 상의 돌연변이적 로드는 최소한이며, 또한 대부분의, 전체는 아니지만, 축적되는 돌연변이들은 바람직한 화합물의 성장 및/또는 생산에 대해 유리할 수 있다. 대사적 진화의 좋은 예는 스트레인 KJ122이며, 이는 바람직한 화합물로서 숙신산염을 생산하기 위하여 엔지니어링되고, 또한 그런다음 대사적 진화 하에 놓이게 된다(잔타마 외.(Jantama et al.), 2008b).

본 명세서에서, 용어들 "화합물(chemical)" 및 "화합물(compound)"은 상호 교환적으로 사용될 것이며, 또한 양자는 통상적인 의미로 사용될 것이다.

대사적 진화의 과정에서, 선택된 배양균은 신선한 최소 배지(minimal medium) 내로 연속적으로 반복적으로 이동되며 또한 희석되어 자발적인 돌연변이들이 발생하고 또한 집단으로 고정되는 클론들 사이에서 부수하는 경쟁(attendant competition)을 갖는 수 많은 성장의 세대들(generations)에 도달한다. 어떤 돌연변이들은 공급되는 탄소원(들)의 더욱 효율적인 사용, 그 배양균 내에서의 독성 화합물들을 내성하는 더 나은 능력, 및 바람직한 화합물, 여기서 이러한 예는 숙신산이었다, 생산에 있어서 더 높은 효율을 부여한다. 대사적 진화의 과정에서, 주의는 바람직한 표현형들을 가진 클론들을 선택하는 것에 모아지며, 그러나 이는 바람직하지 않는 부산물들의 낮은 또는 결여된 생산을 또한 포함한다.

따라서, 일반적으로, 특정 화합물을 과생산하도록 디자인되고 또한 유전적으로 엔지니어링된 미생물은 적합한 성장 속도를 가지지 않을 수 있고, 또한 결과적으로 그 특정 화합물을 생산하기 위한 기대되는 또는 바람직한 효율을 보이지 않을 수 있다. 대사적 진화는 그 특정 화합물의 생산을 위한 향상된 속도와 함께 향상된 성장 및 생산 내성(product tolerance)을 갖는 스트레인을 위한 선택을 하는데에서 사용될 수 있다. 그러나, 대사적 진화가 자발적인 돌연변이들로부터의 결과이기 때문에, 향상된 성장, 생산 내성 및 화합물 생산의 효율을 가져오는 정확한 유전적 변화들은 분명하거나, 예측 가능하거나 또는 대사적 진화 방법에 의해 재생산 가능하지 않을 수 있다. 그 진화된 미생물의 게놈 DNA 서열의 결정은 축적되는 돌연변이들의 상세함을 제공할 수 있다. 그런다음, 상동의 야생형 대립 형질(allele)으로 진화된 스트레인 내부의 각 개별적인 돌연변이를 대체하는 것, 또는 대체적으로, 스트레인 성능의 비교 분석에 의해 후속되는, 나이브(naive)의, 비진화된 스트레인 내부로 돌연변이화된 대립 형질을 도입하는 것에 의해, 어떤 돌연변이들이 바람직한 표현형에 기여하는지를 나타낼 수 있다. 진화된 스트레인 내에 남아있는 어떤 돌연변이들은 바람직한 프로세스에 대해 불리한 것일 가능성이 있다. 이들은 진화 내 초기 단계에서는 유리한 것이었을 수 있거나, 또는 진화하기 위한 시간을 가지지 않았을 수 있다. 어떤 경우에서는, 돌연변이들이 유리한 것인지 및 그들 돌연변이들의 정확한 특성을 아는 것은, (1) 미래의 유전적 조작을 위한 더욱 합리적인 디자인, 예를들어 긴 진화 프로세스에 대한 필요성 없이 숙신산 생산에 대한 새로운 스트레인 또는 미생물을 엔지니어링하는 것, 및 (2) 나아가, 차례로 더욱 합리적인 스트레인 향상들을 유도할 수 있는 스트레인 성능을 향상시키는 미묘한 또는 예측 가능하지 않은 돌연변이들에 대한 통찰력을 허용한다. 예로서, 억제 유전자 내에서 발견되는 프레임 이동 돌연변이가 진화된 스트레인 내에서 발견되는 경우라면, 그러면 유전적 엔지니어링이, 동일한 표현형을 부여하는, 복귀할 수 없는(non-reverable), 및 따라서 더욱 안정적인 대립 형질을 생성하는 그 억제 유전자의 완전한 삭제를 형성하는데 있어 사용될 수 있다.

미생물이 특정한 바람직한 표현형을 획득하도록 강제하는 어떤 선택적인 압력을 사용하는 대사적 진화의 과정 동안에, 두 개의 가능한 변화들이 일어날 수 있다. 그 미생물은 간단히 그 자체로 선택적인 압력에 대하여 순응할 수 있고 또한 변화된 유전자형(genotype)을 보일 수 없다. 대체적으로, 그 미생물은 선택적인 압력 하에서 특정 유전적 변화들을 경험하고 더욱 영원한 변화된 표현형을 나타낼 수도 있다. 단지 순응(adaptation)이 존재할 때에 및 어떠한 유전적 변화가 존재하지 않을 때에 그 미생물은 상기 선택 압력이 일단 완화되면 그것의 본래의 표현형으로 복귀할 것이다. 이러한 미생물들은 "순응된(adapted)" 미생물들로 참조된다. "순응된" 미생물들은 변화된 표현형을 나타내기 위하여 또 다른 새로운 라운드(fresh round)의 선택 압력을 경험해야 한다. 다른 한편, 수반하는 유전적 변화가 존재할 때에, 그 변화된 표현형은 심지어 선택 압력이 존재하지 않을 때에도 계속해서 존재할 것이다. 특정한 유전적 변화들에 의해 수반되는 대사적 진화가 바람직하다. 대사적 진화의 과정 동안 안정적인 유전적 변화를 획득하는 미생물은 그 선택 압력을 갖는 신선한 배지로 그것을 이동시키기 이전에 어느 정도의 시간 동안 어떤 선택 압력 없이도 고유의 성장 배지 내에서 그 미생물을 성장시키는 방법에 의하여 용이하게 식별될 수 있다. 만약 이러한 미생물들이 우수한 성장 및 어떤 지연 기간 (leg period) 없이 기대되는 표현형을 보일 수 있다면, 그 미생물은 대사적 진화의 과정 동안 그 표현형을 수반하는 변화된 유전자형을 획득하였다고 간주된다.

상당한 양으로 숙신산을 생산하는 미생물을 만들기 위하여, 당분해 (glycolytic) 경로, 트리카르복실산 회로(또한 크레브(Krebs) 회로 또는 TCA 회로로 알려져 있는) 및 글리옥실산 션트(glyoxylate shunt), 를 포함하는, 많은 수의 미생물의 대사적 경로들에 관련되는 다양한 효소들이, 상기 구절들 내에서 참조에 의해 언급되고 또한 포함된 과학적 및 특허 문헌 내에 기재된 다양한 유전적 엔지니어링 기술들을 사용하여 조작될 수 있다. 다양한 미생물 대사적 경로들에 대한 상세는 르닝거에 의한 생화학의 이론(Principles of Biochemistry, by Lehninger) 및 루버트 스트라이어에 의한 미생물학(Biochemistry by Lubert Stryer) 과 같은 표준 생화학 교과서들에서 찾아질 수 있다. 세인트 루이스, MO, USA에 있는 시그마 화학 회사(Sigma Chemical Company in St. Louis, MO, USA) 로부터의 지. 마이클 (G. Michael)에 의한 생화학적 경로들 포스터는 또한 박테리아 세포를 갖는 다양한 생화학적 경로들에 대한 상세함을 제공한다.

호기성 성장 과정 동안, 미생물적 탄소 대사는 당분해, 트리카르복실산 회로 및 산화성 인산화를 포함한다. NADPH 및 NADH와 같은 환원된 효소 보조 인자들은 세포 성장을 위해 요구되는 ATP 생산에 의해 수반되는 산화성 인산화의 작동에 의해 재생산된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서의 혐기성 성장 조건들 하에서, 환원된 보조 인자들 NADPH 및 NADH의 재생산은 숙신산 생산을 위한 트리카르복실산 회로로의 그 탄소 흐름을 지시하는 것 및 NADP⁺ 및 NAD⁺의 재생산을 위한 모든 다른 발효적 경로들을 제거하는 것에 의해 달성된다.

바람직한 유기산의 타입에 의존적으로, 상기 대사적 경로들은 특히 미생물이 우리의 선택의 특정 유기산을 생산하도록 조작된다. 그 미생물들은 락트산, 아세트산, 말산, 피루브산, 포름산 및 숙신산을 포함하는 많은 수의 유기산들을 합성하는 것이 가능하다. 따라서 숙신산의 생산을 위한 생체 촉매의 개발에서, 아세트산, 락트산, 피루브산 및 푸마르산의 생산을 위한 경로들은 차단되고 또한 숙신산 생산으로의 탄소 흐름이 세포 내부의 탄소 대사에 포함되는 하나 이상의 효소들을 조작하는 것을 통해 촉진된다. 알려져 있는 유전적 엔지니어링 기술들을 사용하여 조작될 수 있는 미생물 발효적 경로 내에서 활성인 효소들의 목록은 이에 제한되는 것은 아닌, 이소시트레이트 신터타제(isocitrate synthetase (aceA)), 말레이트 신타제 (malate synthase (aceB)), 글리옥실산 션트 오페론(glyoxylate shunt operon (aceBAK)), 아세테이트 키나제-포스포트랜스아세틸라제(acetate kinase- phosphotransacetylase (ackA -pta)); 아코니타제 하이드라타제 1 및 2(aconitase hydratase 1 and 2 (acnA and acnB)); 아세틸-CoA 신터타제(acetyl- CoA synthetase (acs)); 시트레이트 리아제(citrate lyase (citDEF)); 알콜 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase (adhE)); 시트레이트 신타제(citrate synthase (citZ)); 푸마레이트 리듀스타제(fumarate reductase (frd)); 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenases (Idh)); 말레이트 디하이드로게나제(malate dehydrogenase (mdh)); aceBAK 오페론 억제자 (aceBAK operon repressor (iclR)); 포스포에놀 피루베이트 카르복실라제(phosphoenol pyruvate carboxylase (pepC)); 피루베이트 포메이트 리아제(pyruvate formate lyase (pflB)); 피루베이트 옥시다제(pyruvate oxidase (poxB)); 피루베이트 카르복시 키나제(pyruvate carboxy kinase (pck)); 및 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase (pyc))를 포함한다.

탄소원들의 당분해는 포스포에놀 피루베이트(phosphoenol pyruvate(PEP))의 생산의 결과를 가져온다. PEP는 나아가 혼합된 산 경로(mixed acid pathway)에 의해 대사된다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어 "혼합된 산 경로(mixed acid pathway)"는 트리카르복실산 회로 및 혐기성 조건들에서 작동하는 다양한 발효적 경로들 양자를 통한 PEP로부터의 탄소의 흐름을 의미한다. 혐기성 조건들 하에서, 피루브산염의 대사를 위한 적어도 네 개의 다른 발효적 경로들이 인식될 수 있다. 피루브산염은 DNAH를 사용하며 또한 이에 따라 탄소원의 계속적인 대사를 위해 요구되는 세포의 레독스 균형을 유지하기 위하여 NAD⁺를 생산하여 락트산염으로 환원될 수 있다. 피루브산염으로부터 유도되는 아세틸-CoA은 또한 NADH의 NAD⁺로의 산화에 의해 수반되는 에탄올을 생산하도록 환원될 수 있다. 피루브산염은 또한 포름산염 또는 아세트산염으로 전환될 수 있다.

TCA 회로 내에서, 두 개의 다른 수단들이 인식된다. 이소시트르산염 (isocitrate)을 통하여 옥살로아세트산염(oxaloacetate)로부터 숙신산으로의 탄소 흐름을 포함하는 산화성 수단으로서 참조되는 TCA 회로의 하나의 수단에서는, NADP⁺이 NADPH의 결과적인 형성과 함께 이소시트르산염을 산화시키는데에 사용된다. 말산염 및 푸마르산염을 통하여 옥살로아세트산염으로부터 숙신산으로의 탄소 흐름을 포함하는 TCA 회로의 환원성 수단으로서 참조되는 TCA회로의 다른 수단에서는, NADH가 NAD⁺를 생산하도록 산화되고 또한 이에 따라 세포가 레독스 균형을 유지하도록 돕는다.

본 발명의 일 실시예에서, 발효적 경로들을 통한 PEP로부터의 탄소 흐름이 그 발효적 경로들에 포함되는 효소들에 대하여 코딩하는 유전자들을 비활성화하는 수단에 의하여 방지된다. 이러한 발효적 경로들을 통한 탄소 흐름을 차단하는데 적합한 유전자들은 IdhA , pflB , adhE , pta, ackA , 및 poxB 을 포함한다. 이러한 유전자들의 하나 이상의 제거는 상기 발효적 경로들을 통한 PEP로부터의 탄소 흐름을 감소시킬 것으로 기대된다. 본 발명의 또 다른 관점에서, 메틸글리옥살(methylglyoxal)의 락트산으로의 전환에 대하여 원인이 되는 메틸글리옥살 신타제(methylglyoxal synthase (mgsA))를 코딩하는 mgsA 유전자가 상기 발효적 경로들에 관여되는 여섯 개의 다른 유전자들의 비활성화와 함께 비활성화된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 발효적 경로들에 관여되는 기능적인 상동체들(functional homologues)은 또한 하나 이상의 발효적 경로에 관여되는 것으로 잘 알려져 있는 유전자들을 비활성화시키는 것과 함께 비활성화된다. 아세테이트 키나제 활성을 갖는 프로피오네이트 키나제(propionate kinase)(tdcD)는 트레오닌의 분해를 위해서만 생산되는 tdcD 유전자에 의해 인코딩된다. 그러나, 10%(w/v) 글루코오스를 갖는 혐기성 성장 과정 동안에, tdcD의 발현은 기능적으로 ackA를 대체할 수 있다. 이에 더하여, 동일한 오페론 내에서 인접한 tdcE 유전자는 pflB와 유사하고 또한 피루베이트 포메이트-리아제 활성(pyruvate formate-lyase activity)을 갖는 α-케토부티레이트 포메이트 리아제(α-ketobutryate formate lyase)를 인코딩한다. 본 발명의 일 관점에서, tdcDE 유전자들은 발효적 경로들로의 탄소의 유입을 방지하기 위하여 및 TCA 회로 내로의 탄소의 흐름을 확실히하기 위하여 비활성화된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 발효적 경로들을 통하는 탄소 흐름을 차단하는 것과 함께, TCA 회로 내부에서의 탄소의 흐름이 개조되어 이에 따라 숙신산의 생산으로 지시된 탄소의 흐름이 존재하게 된다. 본 발명의 일 관점에서 TCA 내부의 탄소의 흐름에 대한 조작은 하나 이상의 유전자들의 발현을 상향-조절하는 수단에 의하여 달성된다. 본 발명의 또 다른 관점에서, TCA 회로 내부에서 기능하는 하나 이상의 유전자들이 숙신산으로의 증가된 탄소 흐름을 촉진하기 위하여 비활성화될 수 있다.

본 발명의 바람직한 관점에서, 말레이트 디하이드로게나제(malate dehydrogenase)에 대하여 인코딩하는 유전자 mdh 는 말산염의 푸마르산염 및 숙신산염으로의 전환을 향상시키도록 상향 조절될 수 있다. 말산염 및 푸마르산염을 통한 옥살로아세트산염으로부터 숙신산으로의 탄소의 흐름은 TCA 회로의 환원성 수단으로서 참조된다. 옥살로아세트산으로부터 숙신산으로의 이러한 TCA 회로의 환원성 수단을 통한 탄소의 흐름은 생산되는 숙신산의 매 몰(every mole)에 대하여 두 몰 (two moles)의 NADH를 소비할 것이며 또한 이에 따라 혐기성 조건 하에서 세포의 레독스 균형을 유지하는데 있어서 도움을 줄 것이다. 다른 한편, mdh의 상향-조절은 세포의 레독스 균형을 유지하기 위하여 요구되는 NAD⁺를 재생산하는데 있어서 도움이 될 것이다. mdh 유전자 발현의 상향-조절은 mdh 유전자에 대한 의 프로모터를 어떤 다른 강한 프로모터 서열로 대체하는 수단에 의하거나 또는 대체적으로 mdh 유전자의 프로모터 영역을 mdh 유전자의 증가 전사(increase transcription)가 존재하도록 돌연변이시키는 수단에 의하여 달성될 수 있다. 대체적으로, mdh 유전자의 추가적인 카피들(copies)이 스트레인 내부에 부가될 수 있거나 또는 mdh 유전자의 발현을 조절하는 유전자들이 mdh 유전자의 발현(icresae expression)을 증가시키도록 조작될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, mdh 유전자 발현의 상향 조절은 유전적으로 그것의 프로모터 영역을 조작하는 수단에 의하여 달성될 수 있다.

TCA 회로의 조절 작동에서, 숙신산은 TCA 회로 수단의 산화성 작동을 통하여 생산된다. 시트레이트(citrate), 시스-아코니테이트(cis-aconitate), 이소시트레이트(isocitrate), α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate), 및 숙시닐-CoA를 통한 옥살로아세트산염으로부터 숙신산으로의 탄소의 흐름은 TCA 회로의 산화성 수단으로서 참조된다. 숙신산은 또한 글리옥실레이트 바이패스(glyoxylate bypass)의 작동을 통하여도 생산될 수 있다. 글리옥실레이트 바이패스(glyoxylate bypass)의 작동의 과정에서, 이소시트레이트 리아제(isocitrate lyase)의 작용에 의하여, 숙신산염 및 글리옥살산염은 이소시트르산염(isocitrate)으로부터 생산된다. 이에 따라 TCA 회로의 산화성 수단의 작동으로부터 또는 글리옥실레이트 바이패스의 작동으로부터 생산된 숙신산염은, 숙시네이트 디하이드로게나제(succinate dehydrogenase (sdh))에 의하여 푸마르산 및 그런 다음 말산을 생산하기 위하여 작용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 유전자 비활성화는 세포 간 숙신산 생산을 증가시키기 위하여 숙신산염의 탈수소화(dehydrogenation)를 방지하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 글리옥실레이트 바이패스(glyoxylate bypass)를 통한 탄소의 흐름은 숙신산 생산에서의 증가를 달성하기 위하여 조작될 수 있다. 이소시트레이트 리아제 효소는 이소시트르산염(isocitrate)의 글리옥살산염 (glyoxalate) 및 숙신산염(succinate)로의 절단을 촉매한다. 이소시트레이트 리아제는 aceBAK 오페론에 의하여 코딩된다. 이소시트레이트 리아제 활성은 iclR 유전자들에 의하여 억제된다. 다른 표현으로, iclR 유전자의 발현은 글리옥살레이트 션트의 작동을 방지한다. 본 발명의 일 관점에서, iclR 유전자는 발효적 대사에 관여되는 유전자들의 비활성화와 함께 비활성화된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 발효적 경로들의 작동을 방지하고 유전자 조작을 통하여 숙신산 생산으로 TCA 회로 내부에서의 탄소의 흐름을 증가시키는 것과 함께, 숙신산 생산을 증가시키기 위하여 TCA 회로로부터 다른 대사적 경로들로의 외부로의 탄소 흐름 또한 유전적 수단들을 통하여 차단될 수 있다. 예로서, TCA 회로로부터 아미노산 대사로의 탄소의 흐름이 숙신산으로의 탄소 흐름을 향상시키기 위하여 차단될 수 있다. 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 유전자(aspartate aminotransferase gene (aspC))는 아스파르트산의 합성에서 글루탐산으로부터의 아미노 그룹을 옥살로아세트산으로 이동시키고 또한 이에 따라 TCA 회로로부터의 외부로의 탄소 흐름을 촉진한다. 본 발명의 일 관점에서, aspC 유전자의 비활성화는 TCA 회로의 산화성 또는 환원성 수단의 어느 것을 통하여 옥살로아세트산염으로부터 숙신산 생산으로 탄소 흐름을 향상시키기 위하여 TCA 회로로부터 탄소의 외부로의 흐름을 차단하는 것에 대하여 후속될 수 있다.

TCA 회로로부터 탄소의 다른 외부로의 흐름은 말산염으로부터 일어난다. 말산의 효소(malic enzyme(sfcA))에 의한 말산염의 탈카르복실화(decarboxylation)는 피루브산염의 생산의 결과를 가져온다. 본 발명의 일 관점에서, sfcA 유전자에 대하여 코딩하는 유전자는 TCA 회로로부터 탄소의 외부로의 흐름을 줄이기 위하여 비활성화된다. 본 발명의 또 다른 관점에서, aspC 및 sfcA 유전자들 양자는 숙신산 축적을 증진시키도록 TCA 회로로부터 외부로의 탄소 흐름을 방지하기 위하여 비활성화된다.

본 발명의 또 다른 관점에서, TCA 회로로부터 외부로의 탄소 흐름은 시트르산의 옥살로아세트산염 및 아세트산염으로의 절단의 원인이 되는 시트레이트 리아제 유전자(citrate lyase gene ( citDEF ))를 비활성화시키는 것에 의해 방지된다. 발효적 경로들 및 그들의 기능적 유사물에 관여되는 유전자들을 비활성화시키는 것 이외에, 숙신산 수율과 결합되어 있는 성장은 미생물 세포들 내부의 카르복실화 효소들(carboxylating enzymes)의 유전적 조작에 의하여 더욱 향상될 수 있다. 유전적 및 효소 분석을 수행하는 것을 통한 대사적 진화 과정에서 발생했던 변화들을 특성화하는 과정에서, 세포 내에서의 카르복실화 효소들(carboxylating enzymes)은 또한 향상된 숙신산 수율에 달성하기 위한 유전적 조작에 대하여 또 다른 타겟이 될 수 있다.

당분해 중간체들(glycolytic intermediates) 포스포에놀 피루브산염 (phosphoenol pyruvate (PEP)) 및 피루브산(pyruvic acid)은 TCA 회로로의 탄소 흐름을 향상시키기 위하여 카르복실화될 수 있다. 정상적인 조건들 하에서, TCA 회로로의 탄소 유입은, 시트르산을 생산하기 위하여, 피루브산염으로부터 유도된 아세틸-CoA를 TCA 회로에서의 중간체인 옥살로아세트산염과 결합시키는 시트레이트 신타제(citrate synthase)의 작용에 의하여 달성된다. 세포 내부에 존재하는 하나 이상의 카르복실화 효소들의 효율을 향상시키는 수단에 의하여 포스포에놀 피루브산염 및 피루브산염을 옥살로아세트산염으로 카르복실화하는 것이 가능하다. 이에 따라 카르복실화 반응으로부터 생산된 옥살로아세트산염은 숙신산을 생산하기 위하여 TCA 회로의 환원성 수단을 통하여 추가적으로 환원될 수 있다.

세포 내부에 존재하는 카르복실화 효소들을 조작하는 것은 혐기성 발효적 성장 과정에서의 숙신산 수율을 증가시키는 수단이다. 본 기술 분야에서는 외인성 소스로부터 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase (pyc))를 도입하는 것에 의해 피루베이트를 옥살로아세트산으로 카르복시화하는 것이 가능하다는 것이 잘 알려져 있다. 이. 콜리(E. coli)와 같은 유전적 조작에 적합한 미생물적 스트레인들은 pyc 유전자를 가지고 있지 않다. 리조피움 엘티(Rhizopium elti) 및 락토바실러스 락티(Lactobacillus lacti)와 같은 다른 박테리아 종으로부터 유도된 pyc 유전자들이 숙신산 생산을 향상시키기 위하여 유전적으로 변형된 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인 내부로 도입되어 왔다.

네 개의 다른 외인성 카르복실화 효소들이 이. 콜리 (E. coli ) 내에 알려져 있다. 두 개의 이들 효소들은 포스포에놀 피루브산염을 카르복실화하는데에 원인이 되고 또한 두 개의 다른 효소들은 피루베이트 키나제 효소의 작용으로부터 유도되는 포스포페놀 피루브산으로부터 유도된 피루브산염의 카르복실화의 원인이 된다. 효소 포스포에놀 피루베이트 카르복실라제(phosphoenol pyruvate carboxylase (ppc))는 포스포에놀 피루브산염을 숙신산염을 생산하는 TCA 회로의 환원성 수단으로 들어갈 수 있는 옥살로아세트산염으로 카르복실화한다. 두 번째 카르복실화 효소 포스포에놀 피루베이트 카르복실라제(phosphoenol pyruvate carboxylase (ppk))는 또한 옥살로아세트산염을 생산하기 위하여 피루브산염을 카르복실화하지만, 그러나 정상적으로는 그것이 글루코오스의 존재 하에서 발현되지 않을 때에 역 환원을 촉매한다. 두 개의 다른 카르복실화 효소들 즉 NADH-연결된 말산 효소(NADH- linked maleic enzyme (maeB)) 및 NADH-연결된 말산 효소(NADPH-linked maleic enzyme (maeA / sfcA)) 는 피루브산을 말산으로 카르복실화한다. 상기 maeB 및 sfcA효소들은 피루베이트 키나제의 작용에 의하여 포스포에놀 피루브산염으로부터 유도되는 피루브산염을 카르복실화한다.

세포 내에 존재하는 네 개의 카르복실화 효소들의 어느 하나는 당분해 회로 중간체들로부터 TCA 회로로의 탄소 흐름을 향상시키기 위하여 그것의 효소적 활성을 증가시키도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이. 콜리 (E. coli ) 내에 존재하는 네 개의 적인 카르복실화 효소들 중에서, PPC-촉매화되는 반응이 강하게 선호된다. PEP 내에 포함된 에너지는 무기 인산염의 방출과 함께 이 반응에서 손실된다. 다른 세 개의 카르복실화 효소들, 즉, pck , maeA 및 sfcA(maeB)는 이들 세 개의 카르복실화 효소들이 글루코오스에 의하여 억제되므로, 기질로서 글루코오스를 사용하는 발효적 성장 과정에서 기능할 것으로 기대되지 않는다. 이러한 세 개의 카르복실화 효소들은 세포들이 산화적으로 유기산들을 대사할 때에 당신생(gluconeogenesis) 과정에서 역 방향으로 기능할 것으로 생각된다.

당신생적 PEP 카르복시키나제(gluconeogenic PEP carboxykinase (pck))는 TCA 회로 내로 탄소의 흐름을 향상시키도록 유전적으로 조작될 수 있다. pck의 활성을 향상시키는데 있어서의 유리한 점은 이러한 효소가 포스포에놀 피루브산염을 옥살로아세트산염으로 카르복실화시키는 반면, 생산되는 옥살로아세트산염의 매 분자에 대하여 ATP 분자의 생산의 결과를 가져온다는 사실에 있다. ATP 수율에서의 증가는 세포들의 성장 속도를 증가시킬 수 있다.

발효적 숙신산염 생산에 대한 자연적 당신생 pck (native gluconeogenic pck)의 유입은 pck 유전자의 전사에 긍정적으로 영향을 미치는 어떤 돌연변이에 의하여 달성될 수 있다. PCK 활성의 수준에서의 증가는 그 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있는 자연적 프로모터 또는 어떤 다른 프로모터 서열을 가지고 있는 다중복제 플라스미드(mulicopy plasmid) 내에서의 pck 유전자의 발현에 의해 달성될 수 있다. 세포 내에서 pck 유전자의 발현을 증가시키기 위한 또 다른 방법은 pck 유전자의 추가적인 카피들(copies)을 집적하는 것이다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, pck 유전자의 자연적인 프로모터가 활성의 수준을 증진시키는 것으로 알려져 있는 어떤 다른 프로모터 성분들에 의하여 대체될 수 있다. pck 유전자의 증가된 발현은 또한 유전자의 프로모터 영역 내에서의 돌연변이에 의하거나 또는 pck 유전자의 프로모터 영역과 상호 작용하는 것으로 알려져 있는 조절 성분들의 유전적 조작에 의하거나 중 어느 것에 의해 달성될 수 있다. pck 유전자의 조절 단백질에 대하여 코딩하는 유전자는 pck 유전자의 발현을 증가시키기 위한 어떤 방법으로 돌연변이화되거나 또는 삭제되거나 또는 과발현될 수 있다. 싱글 포인트 돌연변이 (single point mutation) (pck 유전자의 ATG 시작 코돈에 관련된 포지션 64에서 G 에서 A로의 전이)가 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 효소 활성(phosphoenol pyruvate carboxykinase enzyme activity)에 있어서 상응하는 증가에 수반되는 pck 유전자의 전사를 증가시킬 수 있다. pck 유전자 발현에서의 유사한 증가는 pck 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있는 단백질들에 대하여 코딩하는 유전자들을 유전적으로 조작하는 것에 의하여 또한 달성될 수 있다. 예로서, 크라(Cra) 단백질은 이. 콜리 (E. coli ) 내에서의 pck 유전자의 발현을 활성화하는 것으로 보여졌다(사이어 및 람사이어(Saier and Ramseier), 196). 유사하게 csrA 시스템(csrA , csrB , csrC , csrD , uvrY 또는 bar A을 포함하는) 은 pck 및 mRNA 안정화도를 개조하는 것에 의하여 글루코오스 대사에 관여되는 다른 유전자들의 수준을 조절하는 것으로 또한 보고되어져 왔다(바비츠케 및 로메오(Babitzke and Romeo), 2007; 퍼네스티그 외.(Pernestig et al), 2003; 스즈키 외.(Suzuki K et al,) 2002).

본 발명에서, 유전적으로 조작된 및 바람직한 표현형을 보여주는 대사적으로 진화된 스트레인은, 예로서 숙신산 생산의 효율을 향상시켰고, 또한 유전적으로 조작된 및 대사적으로 진화된 스트레인의 제조에서 사용되는 야생형 스트레인은 게놈 DNA 서열 분석 하에 놓여진다.

야생형 부모 스트레인 및 유전적으로 조작된 및 대사적으로 진화된 스트레인들의 전체적인 게놈 서열화는 DNA 서열화의 높은 생산량의 필드에서 경험이 쌓인 자에게 잘 알려져 있는 서열화 기술들에 의해 달성될 수 있다. 많은 수의 서열화 기술들이 비용-효율적인 방법으로, 예를 들어 일루미나, 주식회사 및 454, 주식회사(Illumina, Inc., and 454, Inc.)에 의해 제공되는 하드웨어, 소프트웨어, 및 방법들, 게놈 서열 정보를 제공할 수 있는 시장에서 입수 가능하다.

야생형 및 진화된 박테리아 스트레인들로부터 얻어지는 서열 데이터가 적합한 소프트웨어를 사용하여 비교될 수 있으며 또한 두 스트레인들 사이에서의 유전적 변화들이 얻어질 수 있다. 두 개의 스트레인들 사이에서의 유전적 변화들의 모든 리스트로부터, 유전적 엔지니어링의 단계에서 의도적으로 도입된 유전적 변화들이 실증될 수 있고, 또한 대사적 진화의 프로세스 과정 동안 발생하였던 또한 고정되었던 추가적인 유전적 변화들이 확인될 수 있다.

일단 대사적 진화 과정에서 발생되었던 돌연변이들이 확인되면, 바람직한 화합물의 생산을 향상시키는데 있어서의 이들 돌연변이들의 중요성은 역 유전적 분석법을 사용하여 결정된다. 예로서, 측정 가능한 타이터들에서 숙신산을 생산하고 또한 그것의 염색체 DNA 내에서의 최소한의 수의 유전자 변화들을 포함하는 나이브 (naive) 박테리아 스트레인이 사용될 수 있다. 다른 스트레인들 중에서, pck 및 pstl 의 돌연변이화된 형태들 및 pflB 내에서의 결실을 포함하는 양자, 이 콜리 (E. coli) 스트레인 XZ722 및 동일한 공개된 스트레인 XZ721는 이러한 목적을 위해 적합하다(장 외.(Zhang et al.) , 2009). 스트레인 KJI122( 또는 관심의 다른 어떤 스트레인)의 대사적 진화의 과정 동안 발생하였던 유전적 돌연변이는 본 기술 분야에 잘 알려져 있는 기술들을 사용하여 스트레인 XZ721 및 XZ722 내에 장착될 수 있다. 두 단계 유전자 대체 방법들이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다(장 외.(Zhang et al.) , 2009a; 장 외.(Zhang et al.) , 2009b; 잔타마 외.(Jantama et al.), 2008b ). 본 발명의 스트레인들을 제조하기 위하여 사용되는 "두 단계 유전자 대체 방법(two step gene replacement method)"에 대하여, 제1 단계은 60 g/l 수크로스에 대하여 민감성을 부여하는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 sacB 유전자와 함께, cat(30 mg/l 에서 클로람페니콜(chloramphenicol)에 대하여 저항성인) 또는 kan(50 mg/l 에서 카나마이신(kanamycin)에 대하여 저항성인)과 같은 약물 저항성 유전자를 포함하는 선택 가능한 및 카운터-선택 가능한 카세트를 장착시키는 것이다. cat- sacB 또는 kan - sacB 카세트가 템플레이트로서 각각 pLOI4151(SEQ ID NO. 33) 또는 pGW162 (SEQ ID NO. 34)를 사용하는 PCR에 의하여 얻어진다. PCR 프라이머들은, 서열을 기폭하는(priming) 약 18 내지 25 염기들에 더하여, 상동적 재조합을 촉진하기 위하여, 염색체 타겟 서열의 5' 및 3' 말단들에 대해 상동인 약 50 염기들을 포함한다. 선형의 PCR 생성물은 전기 천공법 (electroporation)에 의해, 플라스미드 pKD46으로 이미 이동되었던 수여 스트레인 (recipient strain) 내로 이동되며, 그것은 그 수여 스트레인의 염색체 내로의 바람직한 PCR 파편의 집적의 빈도를 증가시키기 위하여 파지 람다 Red 재조합 효소 (phage lambda Red recombinase)를 발현한다. pKD46은 30℃에서 100 mg/l에서 앰피실린(ampicillin) 저항성에 의하여 선택된다. 그것은 리플리케이션의 온도 민감성 기원을 가지며 또한 42℃에서의 성장에 의하여 그 숙주 스트레인으로부터 보존될 수 있다. pkD46은 다첸코 및 워너((Datsenko and Wanner (2000))에 기재되어 있고, 또한 콜리 유전적 스톡 센터, 예일 대학, 뉴 해븐, CT, USA(Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA)로부터 입수 가능하다. 두 단계 유전자 대체 방법의 제2 단계에 대하여, 제2의 PCR 생성물이 템플레이트로서 예를들어 KJ122 염색체 DNA를 사용하여, 장착되는 것이 바람직한 대립 형질 (allele)의 5' 및 3' 말단들에서 촉진하는 PCR 프라이머들의 제2 쌍을 사용하여 만들어진다. 이러한 두 개의 프라이머들의 쌍은, 또한 PCR 프라이머들의 제1 쌍과 유사한, 상동의 재조합을 촉진하기 위하여 염색체 타겟 서열의 5' 및 3' 말단들과 상동인 약 50 염기쌍들을 포함할 수 있다. 그러나, 만약 삽입된 대립 형질에 대한 염색체 타겟이 삽입될 대립 형질의 자연적 로커스(locus)라면, 제2 단계를 위한 상동의 서열들은 단지 증폭된 DNA 서열의 일부일 수 있다. 다른 표현으로, 염색체 내의 제2 사이트에 유전자의 제2 카피(copy)를 장착시키는에 있어서와 같이, 염색체 타겟에 대해 상동인 50 염기쌍 서열들은 염색체 타겟이 그 대립 형질의 자연적 로커스와 다른 사이트라면, 단지 PCR 프라이머들의 5' 말단들에 대하여 부가되는 것이 필요하다. 제2 단계에서 변화된 대립 형질의 장착은 선형의 제2 PCR 생성물을 상동의 재조합을 자극하기 위한 pKD46을 여전히 포함하는, 수여 스트레인(이것은 제1 단계에서 형성되었던 스트레인이다) 내로 전기 천공하는 것 및 60 g/l 수크로스를 포함하고 있는 플레이트들 상에서 선택하는 것에 의하여 달성될 수 있다. 이러한 두 단계 방법에서, 상동적 재조합이 바람직한 모든 조작들에 대하여, 세포들은 헬퍼 플라스미드 pKD46으로부터의 람다 Red 재조합 효소 유전자들의 발현을 유발하기 위하여 5 g/l 아라비노스를 포함하는 풍부 배지 내에서 성장된다. 자발적인 sacB 돌연변이들이 수크로스 선택의 과정에서 일어날 수 있기 때문에, 결과적인 클로니들은 클로람페니콜 또는 카나마이신 민감성에 대하여 또한 바람직한 대립 형질 변화를 획득한 클로니들을 식별하는 진단적 PCR에 의하여 스크린된다. 포인트 돌연변이들과 같은, 미묘한 돌연변이들에 대하여, 바람직한 대립 형질이 장착되었는지 분명히 하기 위하여 장착된 대립 형질의 DNA 서열을 획득하는 것이 필요하다. 이것은 장착된 대립 형질의 PCR 증폭된 카피를 획득하고 또한 그 PCR 생성물을 서열화하는 것에 의하여 달성될 수 있다. 상업적인 서비스로서 DNA 서열화를 수행하는 많은 기관들,예로서 터프스 대학 코어 퍼실리티, 터프스 대학 메디칼 스쿨, 보스톤, MA, USA(Tufts University Core Facility, Tufts University Medical School, Boston, MA, USA), 이 존재한다.

두 단계 유전자 대체에 대하여 사용되는 PCR 프라이머들의 예들은 표 2에 주어진다.

각 돌연변이의 영향을 결정하는데 있어서의 대체적인 접근은, 상기 기재된 동일한 두 단계 유전자 대체 방법을 사용하여, 진화된 스트레인(예로서 KJ122) 내에서의 싱글 돌연변이 대립 형질을 부모 스트레인, 이. 콜리 (E. coli ) C (ATCC 8739)로부터의 상동의 야생형 대립 형질로 대체하는 것이다. 스트레인 제조는 또한 일반화된 박테리오파지 형질 도입(transduction), 예로서 파지 P1 vir(실해비 외. (Silhavy et al.), 1984)를 사용하여 달성될 수 있다.

기술들은 또한 이. 콜리 (E. coli ) 염색체 내에서의 특정한 작은 또는 큰 결실들(deletions)을 생성하는 것에 대하여 잘 알려져 있으며, 이들 기술들은 다른 박테리아, 아케아 이스트(archaea yeasts), 및 곰팡이(filamentous fungi)에 대하여 적용 가능하여야 한다. 예로서, 콜린스니켄코 외(Kolisnychenko et al. (2002)) 는 염색체 DNA로부터의 특정 유전자 서열을 제거하는 것에 대하여 후속될 수 있는 기술을 기재하며, 또한 이는 참조로서 이에 의하여 포함된다.

야생형 또는 돌연변이 대립 형질을 포함하는 스트레인들의 동질 유전자형 쌍들이 제조된 후에, 상기 쌍의 멤버들은 적합한 작은 스케일 발효제들에서의 성장 및 화학적 생산에 대하여 테스트될 수 있다. 예로서, 혐기성 또는 미세-호기성 조건들 하에서의 pH 컨트롤에 의한 성장 및 숙신산 생산은 이미 기재된 바와 같이 테스트 될 수 있다(장 외.(Zhang et al.), 2009a; 장 외.(Zhang et al.), 2009b; 잔타마 외.(Jantama et al.), 2008a; 잔타마 외.(Jantama et al.), 2008b). 작은 스케일 발효제들에서의 스트레인 성능을 테스트하기 위하여, 그것이 생산됨에 따라 숙신산을 중성화하는데 사용되는 알카라인 용액은 2.4 M 포타슘 카보네이트 플러스 1.2 M 포타슘 하이드록사이드일 수 있거나, 또는 대체적으로 그것은 스트레인 성능을 테스트하기 위한 6 M 암모늄 하이드록사이드 플러스 3 M 암모늄 바이카보네이트일 수 있다.

한꺼번에 XZ722와 같은 숙신산염-생산 이 . 콜리 (E. coil) 스트레인 내로 하나의 돌연변이를 도입하는 것, 또는 한꺼번에(즉, 하나 이상의 돌연변이화된 유전자들의 야생형 대립 형질을 재-도입하는 것) 하나의 돌연변이를 KJ122와 같은 숙신산염-생산 이. 콜리 (E. coil) 스트레인으로부터 제거하는 것에 의하여, 성장 또는 화학적 생산을 향상시키는데 기여하는 유전적 변화들을 결정할 수 있다. 이에 더하여, 돌연변이들의 조합들로 인하여 어떤 부가적인 또는 시너지적인 효과가 존재하는지를 결정하기 위하여 돌연변이의 하나 초과의 타입이 화학적-생산 스트레인 내로 도입되거나 또는 제거될 수 있다. 돌연변이들의 이러한 스크리닝을 통하여, 효과적인 성장 및 화학적 생산에 도달하기 위해 중요한 돌연변이들을 식별하는 것이 가능하다. 일단 화학적 생산을 향상시키기 위한 그러한 신규한 돌연변이들이 식별되면, 그러한 돌연변이들은 숙신산 또는 다른 화학적 생산을 위한 박테리아 스트레인을 합리적으로 디자인하고 및 그에 의해 바람직한 표현형을 갖는 스트레인을 선택하는데 있어서 대사적 진화의 프로세스에 대한 필요성을 제거하는데 유용한 유전자 변형들의 목록에 더해질 수 있다.

본 발명의 개시에서, 특정 실시예들은 이. 콜리(E. coil)의 스트레인에 의한 숙신산염의 생산에 관련되는 것으로 주어진다. 그러나, 본 발명에서 발견된 이론들은 광범위한 적용 가능성을 가지고, 따라서 특정 실시예들의 언급이 어떤 방법에서 상기 광범위한 의미들을 제한하는 데에 사용되어서는 안된다. 예로서, 특정 유전자에서의 특정 타입의 돌연변이가 이. 콜리 (E. coil) 내에서의 숙신산염 생합성에 대하여 유용하다는 발견은 다른 박테리아 및 다른 미생물들에 대하여 과도한 실험 없이도 적용될 수 있다. 관심의 유전자 내에서의 돌연변이가 일단 확인되면, 유사 돌연변이, 또는 동일한 기능이나 목적을 달성하는 돌연변이가 광범위한 다양성의 미생물들 내로 도입될 수 있다.

예로서, 본 발명은 피루베이트 키나제를 인코딩하는 유전자의 발현에서의 감소가 이. 콜리(E. coil)의 매우 발전된 숙신산염 생산 스트레인의 내용 중에서 숙신산염 생산에 대하여 유용하다는 것을 개시한다. 현재 다른 미생물들 내에서 피루베이트 키나제를 인코딩하는 유전자를 식별하고 및 결실(deletion) 또는 다른 돌연변이에 의하여, 숙신산염 생산을 향상시키기 위하여, 새로운 미생물 내에서의 그 유전자의 발현을 감소시키는 것은 용이하다. 클레브시엘라 ( Klebsiella ), 세라티아 (Serratia), 시트로박터 ( Citrobacter ), 에르위니아 ( Erwinia ), 또는 살모넬라 (Salmonella) 속(genus)과 같은, 이. 콜리(E. coil)의 가까운 친척들에 대하여, 관련성 있는 유전자는 유전자 은행(GenBank) 또는 DNA이나 단백질 서열들에 대한 다른 공공의 데이터베이스를 통한 상동 관계 서치에 의하여 용이하게 발견될 수 있다. 무엇이 상동 관계이고, 또는 아니고를 정의하는데 사용될 수 있는 예리한 컷오프(cutoff)가 존재하지 않음에도 불구하고, 조회 서열의 "상동 관계(homology)"는 조회 서열에 진화적으로 관련된 DNA 서열이며, 또한 통상적으로 1) 유전자 은행을 통하여 입수 가능한 BLASTN 프로그램을 사용하는 결실들 및 삽입들, 또한 디폴트 파라미터들을 선택하는 것("예측되는(Expected)" 수를 10의 디폴트로부터 더 큰 수로 증가시키는 것과 마찬가지로, "기재(Decription)", "도시적 관찰(Graphical overview)", 및 "정렬(Alignment)" 셋팅들을 포맷 요구 형태(Format Request form)에서 1000 또는 초과로 셋팅하는 것은 더 많은 수의 상동체들(homologs)을 생성할 수 있다)을 허용하여, 그 안에서 길이에 있어서 50 또는 초과의 염기들인 서열, 또는 서열의 일부가 조회 서열과 50% 또는 초과의 동일성의 매치를 갖는 유전자 또는 DNA 서열로서, 또는 2) 유전자 은행을 통하여 입수 가능한 BLASTP 프로그램의 디폴트 파라미터들을 사용하는 결실들 및 삽입들을 허용하여, 길이에 있어서 25 또는 초과의 아미노산들이며, 또한 조회 서열과 25% 또는 초과의 동일성 또는 50% 또는 초과의 유사성을 갖는 단백질 서열, 또는 단백질 서열의 일부로서 발견된다. 상동 관계 서치를 수행하기 위하여 유전자 은행 데이터베이스 및 다양한 BLAST 프로그램을 사용할 때에, 조회의 가장 근접한 친척들의 게놈들을 선택하지 않는 것(또는 선택 해제하는 것)이 종종 필요하다. 예로서, 에셰리키아 ( Escherichia) 속(genus)의 멤버들의 많은 수의 게놈들은 상동체 히트 목록에서 클레브시엘라(Klebsiella)와 같은 더 먼 친척들에서 존재하는 이. 콜리 (E. coli ) 조회의 상동체들을 밀어낼 수 있으나, 에셰리키아(Escherichia)의 멤버들의 게놈들을 선택 해제하는 것은 클레브시엘라 (Klebsiella) "히트(hit)" 가 발견되는 것을 허용한다. 덜 관련된 미생물들에 대하여, 관련성 있는 유전자는 상동체가 아닐 수 있거나, 또는 DNA 또는 단백질 서열 상동체에 의해 식별 가능하지 않을 수 있으나, 그 유전자는 여전히 키 워드 서치에 의하여 발견될 수 있다. 예로서, 서치에서의 키워드들로서 "사카로마이스 (Saccharomyces)" 및 "피루브베이트 키나제(pyruvate kinase)"를 사용하여, 유전자 은행을 서치하는 것에 의해 피루브베이트 키나제를 인코드하는 사카로마이스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae ) 유전자를 찾는 것은 용이하다. 그러한 서치가 행해졌고, 또한 CDC19(또한 PYK1으로서도 알려져 있는) 및 PYK2의 두 개 유전자들이 발견되었으며, 양자는 피루베이트 키나제에 대하여 코딩한다.

간단하게, 본 발명은 대사적 진화의 노동-집약적인 프로세스를 통하지 않고 산업적으로 유용한 미생물에 대한 바람직한 표현형들을 수여하는 새로운 유전자 돌연변이들을 식별하기 위하여 감하는(subtractive) 또는 가하는(additive) 게놈 분석을 제공한다. 이러한 방법에서 산업적 미생물들은 합리적 디자인을 사용하여 전체적으로 제조될 수 있다. 이러한 발견이 미생물들을 사용하는 유기산들의 생산, 및 더욱 특별하게 생체 효소를 사용하는 숙신산의 생산을 상세하게 기재함에도 불구하고, 산업적 미생물학의 분야에서 숙련된 자는 광범위한 다양성의 미생물 생체 효소들을 사용하여 여기 기재된 방법들을 다른 산업적 화합물들의 생산성을 향상시키기 위하여 적용할 수 있을 것이다.

실험 섹션

일반적 기술들

스트레인, 배지 및 성장 조건들(Strains, media and growth conditions)

이. 콜리 C(E. coli C(ACTT 8739))의 새로운 유도체들이 성장-기반의 선택과 결합된 유전자 결실의 고유의 조합을 사용하여 숙신산염 생산을 위해 개발되었다.

본 발명의 미생물은 미생물학 분야에서 잘 알려져 있는 많은 수의 다른 배양 배지에서 성장될 수 있다. 예로서, 이. 콜리(E. coli)의 야생형 및 돌연변이체 스트레인들이 1%(w/v) 트립톤(tryptone), 0.5%(w/v) 이스트 추출물, 및 0.5%(w/v) NaCl을 포함하는 루리아-버타니(Luria-Bertani)(LB) 배지에서 성장되었다. 생체 효소로서 유전적으로 변형된 미생물을 포함하는 발효적 프로세스를 사용하는 유기산의 상업적 생산을 위하여, 탄소원으로 보충된 최소한의 미네랄 염 배지가 선호된다. LB 배지와 같은 풍부 배지에 반대되는 것으로서 최소 미네랄 염 배지의 사용은 상업적 스케일로 유기산들의 생산을 위한 경비를 감소시킨다.

본 발명을 위해 적합한 최소한의 미네랄 배지들은 NBS 배지(코지 외.(Causey et al.), 2007) 및 AM1 배지(마티네즈(Martinez et al.), 2007)을 포함한다. NBS 배지는 1 mM 베타인(betaine), 25.72 mM KH₂P0₄, 28.71 mM KH₂P0₄, 26.50 mM (NH₄)2HP0₄, 1 mM MgS0₄.7H₂0, 0.1 mM CaCl₂.2H₂0, 0.15 mM 티아민(Thiamine) HCl, 5.92 μM FeCl₃6H₂0, 0.84 μM C0C1₂.6H₂0, 0.59 μM CuCl₂. 2H₂0, 1.47 μM ZnCl₂, 0.83 μM Na₂Mo0₄ 2H₂0, 및 0.81 μM H₃B0₃을 포함한다. AM1 배지는 1 mM 베타인 (betaine), 19.92 mM (NH₄)2HP0₄, 7.56 mM NH₄H2P0₄, 1 .5 mM MgS0₄.7H₂0, 1.0 mM 베타인(Betaine)-KCl, 8.88μM FeCl₃6H₂0, 1,26 μM C0C1₂.6H₂0, 0.88 μM CuCl₂.2H₂0, 2.20 μM ZnCl₂, 1.24 μM Na₂Mo0₄2H₂0, 1.21 μM H₃B0 및 2,50 μM MnCl₂4H₂0을 포함한다. 미량 성분들은 1000X 스톡(stock)으로 준비되며 및 하기 성분들을 포함했다: 1.6 g/L FeCl₃, 0.2 g/L CoCl₂ㆍ6H₂0, 0.1 g/L CuCl₂, 0.2 g/L ZnCl₂ㆍ4H₂0, 0.2 g/L NaMo0₄, 0.05 g/L H₃B0₃, 및 0.33 g/L MnCl₂ㆍ4H₂0.

유기산의 미생물적 생산을 위한 미네랄 배지는 탄소원으로 보충된다. 본 발명에서 유용한 탄소원들은 이에 제한되는 것은 아니나 자일로스와 같은 펜토스 당들, 글루코오스, 프럭토스, 및 갈락토오스와 같은 헥소스 당들, 또는 수크로스 및 말토스와 같은 디사카라이드들을 포함한다. 상기 탄소원은 또한 글루코오스 및 자일로스의 조합과 같이 다른 당들의 조합을 제공하는 것에 의해 만족될 수도 있다. 탄소원은 또한 스타치(starch) 또는 리그노셀룰로오스(lignocellulose)의 가수분해로부터 유도될 수도 있다. 스타치(starch) 또는 리그노셀룰로오스(lignocellulose)와 같은 복합 탄수화물들의 가수분해는 본 기술 분야에서 잘 알려져 있는 열-화학적 전화 프로세스 또는 효소적 방법들 중 어느 것을 사용하여 달성될 수 있다. 미생물적 발효를 사용하는 유기산의 산업적인 생산을 위한 바람직한 탄소원은 농업적 (agricultural) 또는 임업적(forestly) 폐기물로부터 유도되는 리그노셀룰로오스 가수분해물이다. 리그노셀룰로오스 가수분해물은 추가적으로 헥소스-풍부한 및 펜토스-풍부한 분획을 생산하도록 추가적으로 분할될 수 있으며, 또한 그러한 분획들은 미생물적 발효 프로세스를 사용하는 유기산들의 상업적 생산을 위한 탄소의 소스로서 작용할 수 있다. 상기 리그노셀룰로오스 가수분해물은 추가적으로 어떤 농도들 이상에서 많은 수의 미생물들에 대하여 독성인 것으로 발견된 푸르푸랄 (furfural)과 같은 어떤 화합물들을 제거하기 위하여 해독될 수 있다.

스트레인 제조의 과정에서, 배양균들은 2%(w/v) 글루코오스 또는 5%(w/v) 아라비노스를 포함하는 루리아 배지(Luria broth)(10 gl^-1 디프코 트립톤(Difco tryptone), 5 gl^-1 디프코 이스트 추출물(Difco yeast extract) 및 5 gl^-1 NaCl)내에서 30, 37, 또는 39℃에서 호기적으로 성장되었다. 항생 물질에 대한 내성(antibiotic resistance)을 인코딩하는 유전자들, 플라스미드들 또는 외부 유전자들 어느 것도 숙신산염 생산을 위해 개발된 최종 스트레인들 내에 존재하지 않는다. 그러나, 다른 스트레인들의 제조의 초기 단계들에서, 다양한 항생 물질에 대한 내성(antibiotic resistance) 마커들이 사용되었다. 앰피실린(ampicillin) (50 mg l^-1), 카나마이신(kanamycin) (50 mg l^-1), 또는 클로람페니콜(chloramphenicol) (40 mg l^- ¹)이 항생 물질 선택 프로세스(antibiotic selection process)를 위해 요구되는 것으로서 부가되었다.

시드(seed) 배양균들 및 발효제들은 37℃에서 100 rpm으로 글루코오스, 100 mM KHCO₃ 및 1 mM 베타인 HCl을 포함하는 NBS 또는 AM1 미네랄 염 배지에서 성장되었다. 어떤 실시예들에서, 콘 스티프 리쿼(corn steep liquor)가 사용되었다. 그것은 콘 습식-제분 산업으로부터의 부산물이다. 이스트 추출물 및 펩톤(peptone)과 비교할 때, 그것은 비타민 및 미량 성분들의 저렴한 소스이다.

발효적 숙신산염 생산에 대하여, 스트레인들은 다른 언급이 없다면 항생제 없이 37℃에서 10%(w/v) 글루코오스 및 100 mM 포타슘 바이카보네이트로 보충된 NBS 미네랄 염 배지(코지 외.(Causey et al.), 2004) 에서 성장되었다. 발효를 위한 예비-접종물(Pre-inocula)이 신선한 클로니들을 250 ml 플라스크(100 ml NBS 배지, 2% 글루코오스) 내로 이동시키는 것에 의하여 성장되었다. 16 시간 후에(37℃, 120 rpm), 이러한 배양균은 0.033 g 세포 건조 무게(CDW) l^- ¹ 의 접종물(inoculum)을 제공하기 위하여 300 ml NBS 배지(10% 글루코오스, 100 mM 포타슘 바이카보네이트)을 포함하는 작은 발효 용기 내로 희석되었다.

성장 배지 내에서의 유기산들의 축적이 배지 내에서의 pH를 감소시키는 경향이 있기 때문에, 배양 배지(culture medium)에 대하여 요구되는 적합한 중성화시키는 제재들을 부가하는 것이 필요하다. 배양 용기의 pH는 pH 프로브를 사용하여 연속적으로 모니터될 수 있고, 또한 적합한 염기가 그 성장 배지의 pH를 중성 pH 주위로 유지시키기 위하여 부가될 수 있다. 미생물 배양의 pH를 유지하기 위하여 적합한 염기들은 이에 제한되는 것은 아니나, NaOH, KOH, NH₄S0₄, Na₂C0₃, NaHC0₃, 및 NH₄CO₃를 포함한다. 이러한 목적을 위한 적합한 염기들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.

어떤 실험들에서, 발효는 부가적인 CO₂(1.2 M 포타슘 하이드록사이드 내에서의 2.4 M 포타슘 카보네이트)를 포함하는 염기를 부가함으로써 자동적으로 pH 7.0으로 자동적으로 유지되었다. 후속적으로, pH는 3M K₂CO₃ 및 6N KOH의 1:1 혼합물을 부가하는 것에 의하여 유지될 수 있었다. 발효 용기들은 샘플 제거를 위한 벤트 (vent) 로서 기능하는 16 게이지 니들를 제외하고 밀봉되었다. 혐기 생활 (anaerobiosis)이 CO₂의 대기를 보장하도록 작용하는 부가된 바이카보네이트를 갖는 성장 과정에서 빠르게 도달되었다.

세포 성장: 세포 매스(Cell mass)는 써모 일렉트로닉 스펙트로닉 20 스펙트로포토미터(Thermo Electronic Spectronic 20 spectrophotometer)를 사용하여 550 nm(OD₅₅₀)에서 광학적 밀도를 측정하는 것에 의하여 측정되었다.

유기산 및 당 분석: 다양한 유기산들 및 당들의 농도가 HPLC에 의하여 측정되었다. 발효 배지 내에 존재하는 숙신산 및 다른 유기산들은 바이오라드 아미넥스 HPX-87H 컬럼을 구비한 에질런트 1200 HPLC 장치(Agilent 1200 HPLC apparatus with BioRad Aminex HPX-87H column) 상에서 분석되었다. 바이오라드 마이크로가드 카타이온(BioRad Microguard Cation) H⁺가 보호 컬럼(guard column)으로서 사용되었다. HPLC 분석에 대한 표준들은 0.008 N 황산 내에서 준비되었다. HPLC 컬럼 온도는 50℃로 유지되었다. 0.008 N 농도에서의 황산은 0.6 m/분의 흐름 속도에서의 이동상으로서 사용되었다. 다양한 성분들의 정량화가 210 nm에서의 그들의 흡광도를 측정하는 것에 의하여 이루어졌다.

실시예

실시예 1

KJ122 및 이. 콜리(E. coil) C 야생형(ATCC 8739)의 게놈 서열의 비교

일련의 유전적 조작들 및 많은 수 또는 라운드의 대사적 진화를 통하여 KJ122 스트레인이 이. 콜리 (E. coil) C 스트레인으로부터 유도되었다. KJ122 스트레인의 제조에 대한 상세는 공개된 PCT 특허 출원 번호들로서 참조로서 여기에 포함된 WO/2008/15958 및 WO/2010/115067에서 제공된다. 잔타마 외.(Jantama et al.) (2008a 및 2008b)에 의한 두 개의 과학적 공개물들 및 장 외.(Zhang et al.) (2009a; 2009b)에 의한 두 개의 과학적 공개물이 또한 KJ122 스트레인의 제조를 기술하고 있다. 이들 과학적 공개물들 양자는 참조로서 여기 포함된다. 스트레인 KJ122는 2008년 2월 20일 스트레인 지정 번호 B-50115로 USDA-ARS 배양균 컬렉션에 수탁되었다.

KJ122의 게놈 서열은 터프스 대학 코어 퍼실리티(Tufts University Core Facility)에서 일루미나 서열화 시스템(Illumina sequencing system)을 사용하여 얻어졌고, 또한 상기 서열은 유전자 은행으로부터 입수 가능한(수납 번호 CP000946) 주석 달린 야생형 이 . 콜리 (E. coil) C 서열과 비교되었다. 이러한 비교 게놈 분석으로부터, 이들 두 개의 스트레인들 사이에서의 많은 수의 유전적 차이점들이 검출되었다. 이러한 개시에서, 개방 리딩 프레임 내에서 발생하는 돌연변이들의 위치가, 염기 번호 1로서 개방 리딩 프레임(상기 참조된 유전자 은행 서열에서 주석 달린 바로서)의 개시 코돈의 제1 염기를 카운트하는, 많은 수의 뉴클레오티드 염기를 바탕으로 하는 좌표들을 사용하여 주어질 것이다. KJ122 및 이. 콜리 (E. coli) C 사이에서의 유전적 차이점의 목록으로부터, KJ122 제조 내의 다양한 단계들에서 집약적으로 도입되었던 결실들(deletions)이 입증되었고, 또한 대사적 진화의 프로세스 동안 발생하였던 유전적 변화들의 부가적인 목록이 확인되었다. KJ122의 게놈 내에 고정된 돌연변이들의 목록 내에 포함된 것은 1) 두 개의 피루베이트 키나제들 중 하나를 인코딩하는 pykA (SEQ ID NO.1) 내의 프레임 이동 돌연변이, 2) 당 운송자 유전자 galP와 같은 갈락토오스 유도성 유전자들의 억제자를 인코딩하는 galS 유전자(SEQ ID NO.2), 3) 이. 콜리 (E. coli ) 게놈의 ydcC 내지 ydcF를 포함하는 많은 유전자들을 포함하는 이. 콜리 (E. coli ) 게놈의 영역에서의 48 킬로베이스 결실(SEQ ID NO. 3), 4) RNA 폴리머라제의 서브유닛을 인코딩하는 rpoA 유전자 (SEQ ID NO. 4)의 C-터미널 도메인 내에서의 포인트 미스센스 돌연변이(point missense mutation), 5) RNA 폴리머라제의 다른 서브유닛을 인코딩하는 rpoC 유전자 (SEQ ID NO. 5)의 F 영역 내에서의 포인트 미스센스 돌연변이(point missense mutation), 6) 글리세롤 디하이드로게나제를 인코딩하는 gldA 유전자 (SEQ ID NO. 6) 내의 프레임 이동 돌연변이, 7) PEP-의존성 디하이드로아세톤 키나제(PEP-dependent dihydroxyacetone kinase)의 서브유닛을 인코딩하는 dhaM 유전자 (SEQ ID NO. 7) 내의 프레임 이동 돌연변이, 및 8) 세포 벽 합성 및 세포 형태에 관여된 유전자를 인코딩하는 ftsl 유전자 (SEQ ID NO. 8) 내에서의 포인트 미스센스 돌연변이(point missense mutation)였다.

실시예 2

KJ122 내에서 돌연변이화된 pykA 유전자의 큐어링

야생형 이 . 콜리 (E. coli ) 및 많은 다른 박테리아가 글루코오스 포함 배지 내에서 성장될 때에, 세포 내부에서의 피루브산염 생성은 피루브산염의 분자의 결과적인 형성을 가져오는 글루코오스를 이송시키고 또한 인산화하기 위해 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate (PEP)) 분자를 사용하는, 포스포트랜스퍼라제 시스템(phosphotransferase system (PTS))의 작용을 통해 일어난다. 피루브산염 형성은 또한 pykA 및/또는 pykG 유전자들에 의해 코딩되는 피루베이트 키나제 효소의 작용으로부터도 일어날 수 있다. PykA 및 PykF 단백질들은 동위 효소들 (isoenzymes)이다. 글루코오스가 탄소의 소스일 때, 피루베이트 키나제들의 동위 효소들이 피루브산염 생합성에서 활발한 역할을 갖는다. 그러나, 트리플 돌연변이체, pts , pykA 및 pykF는, 피루브산염을 형성하는 세포의 능력이 결여되었거나 또는 많이 감소되었기 때문에 단독 탄소원으로서 글루코오스 상에서 성장할 수 없다(폰세 외.(Ponce et al.), 1995).

KJ122가 PTS의 성분인(장 외.(Zhang et al.), 2009a 장 외.(Zhang et al.), 2009b), 단백질 ptsI에 대하여 코딩하는 ptsI 내에서의 돌연변이를 포함하고 있기 때문에, 대사적 진화의 과정에서 pykA 유전자가 KJ122 내에서 또한 돌연변이화되었다는 것의 관찰은 기대되지 않았다. 이러한 돌연변이가 숙신산 생성에 대해 기여하는지를 결정하기 위하여, 새로운 스트레인 WG85a를 공급하는 야생형 pykA 대립 형질이 KJ122 내에 장착되었고, 또한 숙신산 생산에 대한 이러한 돌연변이의 효과의 관점에서 표현형적 변화들이 평가되었다. WG85a는 상기 기재된 두 단계 유전자 대체 방법을 사용하여 두 단계들에서 제조되었다. 제1 단계에서, WG84를 공급하기 위하여 cat- sacB 카세트가 스트레인 KJ122의 pykA 로커스에 장착되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO.21 및 22였다(표 1 참조). 제2 단계에서, 스트레인 WG85a을 공급하기 위하여 이. 콜리 (E. coli ) C로부터의 야생형 pykA 유전자가 WG84 내로 장착되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO.23 및 24였다(표 1 참조). KJ122에 대한 약 550 mM과 비교할 때 WG85a은 약 160 mM 숙신산염을 생산하였다. 분명하게도 KJ122 내에서의 pykA 돌연변이는 숙신산염 생산에 대하여 중요하다. KJ122 내에서의 pykA 돌연변이는 프레임 이동이기 때문에, pykA 의 결실을 포함하는 스트레인은 유사하게 작용할 것이라는 것이 추론된다. 중간체 스트레인, WG84는 pykA 개방 리딩 프레임의 완전한 결실을 포함하며, 또한 예상되는 바와 같이, WG84는 540 mM의 숙신산염 타이터를 갖는 KJ122와 유사하게 작용하였고, 이는 KJ122 내에서의 프레임 이동 돌연변이가 제로 돌연변이(null mutation)와 유사하다는 것을 보여준다. 이러한 발견을 이룸과 함께, 발명자들은 다음으로 피루베이트 키나제 활성의 감소된 수준이 KJ122에 대하여 중요하며 또한 이러한 상태는 관련된 많은 접근법들 중 어떤 하나에 의해 달성될 수 있다는 것을 추론할 수 있었다. 예로서, KJ122 내에서의 ptsI ^* 활성은 추가적으로 감소되거나 또는 제거될 수 있고, PykF 활성은 작아지거나 또는 제거될 수 있으며, 또는 PykA, PykF, 및/또는 ptsI 의 감소된 활성의 조합이 현재 숙신산염 생성에 있어서 중요한 것으로 알려져 있는 총 피루베이트 키나제 활성에서의 감소를 달성하는데 있어서 사용될 수 있었다.

제2 피루베이트 키나제 유전자, pykF에서의 결실이 pykA에서의 결실을 대체할 수 있는지를 결정하기 위하여, 스트레인 WG89를 공급하는 pykF에서의 결실이 스트레인 WG85a 내로 장착되었다. 이것은 두 단계 유전자 대체 방법을 사용하여 완성되었다. 제1 단계에 대하여, 스트레인 WG87을 공급하기 위하여 kan - sacB 카세트가 WG85a의 pykF 로커스에 장착되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO.36 및 37이었다(표 1 참조). 제2 단계에 대하여, 새로운 스트레인 WG89를 공급하기 위하여 pykF 개방 리딩 프레임의 결실이 WG87 내로 장착되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO.38 및 39였고(표 1 참조), 또한 템플레이트는 pGW191(SEQ ID NO. 35)이었다. 작은 스케일 발효제들에서, WG89는 더욱 열악하게 성장하였고, KJ122에 대한 510 mM과 비교하여, 단지 115 mM 숙신산염을 생산하였다. 따라서, pykF의 결실은 숙신산염 생산을 향상시키기 위하여 pykA의 결실 또는 프레임 이동에 대해 대체할 수 없다. WG89 및 WG85a가 다른 실험들에서 테스트되었다고 하더라도, WG89가 WG85a보다 더욱 열악하게 수행하였다는 것은 분명하고, 이는 KJ122에서의 성장 및 숙신산 생산에 대한 피루베이트 키나제의 최적의 수준이 존재하며, 그러나 pykF의 결실은 우수한 숙신산염 생산에 대하여 최적이지 않은 총 피루베이트 키나제 활성의 수준의 결과를 가져온다는 것을 보여준다. 따라서, 대사적 진화는 최적의 수준으로 근접한 피루베이트 키나제의 수준을 갖는 스트레인을 생산하였다. 나아가 미국 특허 출원 공개 2009/0075352 및 리 외(Lee et al.)(2005)에 제시된 바와 같이 피루베이트 키나제를 인코딩하는 모든 유전자들(pykA , pykF 및 하나 이상의 pts 유전자들)의 결실은, 총 피루베이트 키나제 활성이 그러한 스트레인 내에서 너무 낮을 수 있기 때문에, 숙신산염 생산을 향상시키지 않을 것이다. 새로운 스트레인, 예로서 사카로마이스 세레비시아 ( Saccharomyces cerevisiae ) 내에서 새로운 숙신산염 생산 스트레인을 제조할 때에, 본 발명에 따르면, 원하지 않는 경로들을 차단한 후에, 총 피루베이트 키나제의 수준은 숙신산염 생산을 위한 우수한 효율을 제공하도록 조정될 것이다. 이는 예로서 PYK2, 비본질적인 피루베이트 키나제 유전자를 삭제하는 것 및 그런 다음 PYK1 의 앞부분에 길이를 변화시키는 프로모터들을 장착시키거나, 또는 PYK1 개방 리딩 프레임의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터의 진행하는 결실(progressive deletion)을 만듦으로서 남아있는 PYK1의 발현 또는 활성 수준을 변화시키는 것, 및 향상된 숙신산염 생산에 대해 테스팅하는 것에 의해 달성될 수 있다.

실시예 3

XZ722 내에서의 galS 돌연변이화

이. 콜리 (E. coli ) C 및 KJ122 스트레인 사이에서의 비교 게놈 서열 분석은 galS 유전자 내에서의 프레임 이동 돌연변이를 나타내었다. 이 유전자는 갈락토오스 퍼미아제(galactose permease), GalP를 인코딩하는 galS 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다. GalP 단백질은, PTS의 성분인 PtsI 단백질에 대하여 코딩하는 ptsI가 돌연변이화되는 KJ122 스트레인에서의 경우와 같이, 글루코오스 이송에 대하여 완전히 기능적인 포스포트랜스퍼라제 시스템의 결여 하에서 적어도 부분적으로 원인이 되는 것으로 보고되어 있다(장 외.(Zhang et al.), 2009a). 따라서 KJ122 내에서의 galS 돌연변이가 글루코오스 섭취 또는 숙신산염 생산의 속도에 대한 어떤 다른 영향의 관점에서 어떤 기능적인 의미를 갖는다는 것이 가능하다. 이것은 새로운 스트레인 WG86a을 공급하기 위하여 galS의 KJ122 대립 형질을 이. 콜리(E. coli) 스트레인 XZ722(ㅿpflB , ptsI ^* , pck _* )으로 이동시키는 것 및 이러한 스트레인 내에서의 숙신산 생산의 속도에 대한 돌연변이의 영향을 평가하는 것에 의해 테스트된다. WG86a는 상기 기재된 두 단계 유전자 대체 방법을 사용하여 두 단계들에서 제조되었다. 제1 단계에서, 스트레인 WG83을 공급하기 위하여 kan - sacB 카세트가 스트레인 XZ722의 galS 로커스에 장착되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO. 17 및 18이었다(표 1 참조). 제2 단계에서, WG86a를 공급하기 위하여 KJ122 유전자로부터의 galS의 프레임 이동된 대립 형질이 장착되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO. 19 및 20이었다(표 1 참조). 작은 스케일 발효제들 내에서, XZ722로부터의 숙신산염 타이터는, WG86a의 그것이 210 mM이었던 것에 비해, 175 mM이었으며 이는 galS 돌연변이가 향상된 숙신산염 생산에 기여할 수 있다는 것을 제공한다. galS 돌연변이는 프레임 이동이며, 따라서 galS에서의 결실은 유사하게 작용할 것이고, 그러나 유전적으로 더욱 안정적일 것으로 추론될 수 있다. 중간체 스트레인 WG83은 galS 개방 리딩 프레임의 결실을 포함하고, 또한 그것은 WG86a와 유사하게 행동하였으며, 220 mM 숙신산염을 생산하였다. 이에 더하여, 발명자들은 galP 발현의 다른 억제자를 인코딩하는 것으로 알려져 있는, galR 유전자를 돌연변이하는 것이 또한 세포의 글루코오스 유입 능력을 증가시킴으로써 숙신산 생산을 증진시킬 것이라는 것을 추론할 수 있다. 나아가, 발명자들은 galP 유전자의 카피(copy) 수에 있어서의 증가가 동일한 효과를 가지며 또한 숙신산염 생산의 효율을 증가시키는 다른 접근법을 제공한다는 것을 추론할 수 있다. 조절 사이트를 가지거나 또는 가지지 않는, galP 유전자 및 프로모터와 터미네이터를 포함하는 인접하는 상부 및 하부 DNA는 PCR에 의하여 증폭될 수 있고 또한 다음으로 자연적인 galP 로커스로부터 이격되어 있는 하나 이상의 사이트들에서 이. 콜리 (E. coli ) 스트레인을 생산하는 숙신산염의 염색체에 장착될 수 있어, 하나 초과의 galP 유전자의 카피를 포함하는 스트레인을 제공한다. 결과적인 스트레인은 더 높은 수준의 GalP 단백질을 갖는 것에 의해 숙신산 생산에 대하여 향상될 것이다(실시예 11 참조).

실시예 4

염색체 DNA로부터의 48 kbp 영역 결실

이. 콜리 (E. coli ) C 및 KJ122 스트레인 사이에서의 비교 게놈 서열 분석은 대사적 진화의 프로세스 과정 동안 KJ122 내 게놈의 유전자들 ydcC 내지 ydcF 을 포함하는 48 킬로베이스(kilobase) 영역의 결실을 나타내었다. 이러한 결실은 이. 콜리(E. coli ) ATCC 8739의 뉴클레오티드 좌표들 2,416,108 및 2,464,284(양자 모두 포함되는 뉴클레오티드들) 사이에서의 서열에 대응한다. 이러한 유전자 결실의 기능적인 중요성 및 숙신산 생산에 대한 그것의 영향력은 스트레인 WG110을 공급하는 KJ122 내에 48 킬로베이스 서열을 재장착하는 것에 의하여 측정된다. 이것은 유전자 대체 방법 및 P1 vir 형질 도입의 조합을 사용하는 두 단계들에서 완성된다. 제1 단계에 대하여, 스트레인 WG51을 공급하기 위하여 KJ122의 결실 종점들 사이에 cat-sacB 카세트가 장착되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO. 31 및 32였다 (표 1 참조). 제2 단계에서, 새로운 스트레인 WG110을 제공하기 위하여, 제공자로서 이. 콜리 (E. coli ) C와 함께 P1 vir을 사용하여, 수크로스 저항성 및 염색체 민감성에 대하여 WG51이 형질 도입되며, 이제 이것은 48 킬로베이스 서열이 KJ122 스트레인 배경 내에서의 그것의 자연적인 로커스에서 원상 복구되게 한다. 이 . 콜리 (E. coli )의 스트레인들의 특정 영역들의 결실은 미국 특허 출원들 공개들 2009/0075333 및 2008/0009041에 기재되어 있는 방법들을 사용하여 달성될 수 있다. KJ122의 특정 48 킬로베이스 결실은 (1) WG51로부터 상기 수여 스트레인 (recipient strain) 내로 형질 도입하여, 클로람페니콜(chloramphenicol) 저항성에 대하여 선택하고, 및 (2) KJ122로부터 단계 1 내에서 제조된 스트레인으로 형질 도입하여, 수크로스 저항성에 대하여 선택하며 또한 클로람페니콜(chloramphenicol) 민감성에 대하여 스크리닝하는 것에 의한 두 단계들로 다른 수여 이. 콜리(E. coli) 스트레인들 내에 장착될 수 있다.

분명하게도, 48 킬로베이스 결실 하에 포함되는 유전자들은 최소한의 글루코오스 배지 내에서의 성장을 위하여 또는 숙신산 생산을 위하여 필수적이지 않다. 48 kb 결실의 유리한 점은 결과적인 염색체가 약간 짧아, 이것이 성장의 속도에서의 약간의 증가를 제공할 것이라는 점이다. 나아가, 결실 하의 적어도 4 유전자들이 존재하고, 이들은 단독으로 삭제될 때에, 최소한의 글루코오스 배지 내에서의 성장에 대해 더 높은 밀도의 결과를 가져온다. 각각 유전자들 ydcl , ydcL , ydcO , 및 ydcV 내에서의 결실들을 포함하는, 케이오 결절 컬렉션(Keio deletion collection)의 스트레인들 JW5226, JW1427, JW5229, 및 JW1438은, 모두 최소한의 글루코오스 배지 내에서, 48 시간에서 상당히 더 높은 OD600까지로 성장한다(바바, 티. 외(Baba, T. et al)(2006) 내의 보충적 표 3 참조).

실시예 5

KJ122 내에서의 돌연변이화된 rpoA 유전자의 큐어링

RNA 폴리머라제의 코어 엔자임은 화학양론 α₂ββ'ω 내의 네 개의 다른 폴리펩티드 서브 유닛들: 알파(α), 베타(β), 베타'(β') 및 오메가(ω)를 포함한다. RNA 폴리머라제의 알파 서브 유닛은 rpoA 유전자에 의해 코딩된다. 이러한 서브 유닛은 상기 효소의 조합을 위하여 요구되며 또한 그것은 어떤 조절 단백질들과 상호 작용한다. KJ122 및 이. 콜리 (E. coli ) C 스트레인들 사이에서의 비교 게놈 서열 분석은 상기 rpoA 유전자 내에서의 미스센스 포인트 돌연변이(missense point mutation)를 나타내었다. 더욱 구체적으로, 이러한 돌연변이는 RNA 폴리머라제 알파 서브 유닛 C-터미널 도메인(α-CTD) 내에서의 아미노산 포지션 322에 위치된다. 야생형 이. 콜리 (E. coli ) C 스트레인 내에서의 프롤린 잔기는 상기 KJ122 스트레인 내 류신 잔기로 변환되었다.

프롤린 322을 알라닌으로 변화시키는 다른 돌연변이는 종래 metE 유전자의 발현에 대하여 부정적인 효과를 가지는 것으로 기재되었다(프리취 외.(Fritsh et al.), 2000). 다른 보고에서, RpoA 단백질 내의 이 위치에서 프롤린에서 알라닌으로의 돌연변이는 이. 콜리 (E. coli ) 내의 rhaS 프로모터의 사이클적인 AMP 수용자 단백질(CRP) 활성화를 감소시키는 것으로 발견되었다. KJ122의 RpoA 단백질 내에서 프롤린에서 류신으로의 포인트 돌연변이의 영향은 새로운 스트레인 RY859A1을 공급하기 위해 rpoA 돌연변이의 상기 야생형 대립 형질을 KJ122 내로 이동시키는 것 및 숙신산 생산에 대한 이 돌연변이의 영향을 결정하는 것에 의해 평가될 수 있었다. RY859A1은 P1 vir 형질 도입을 사용하는 두 단계들로 제조되었다. 일차적으로, 연결된 aroE :: kan 대립 형질이 제공자로서 케이오 결실 컬렉션(Keio deletion collection)(콜리 유전적 스톡 센터, 예일 대학, 뉴 해븐, CT, USA(Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA)로부터 입수 가능한)으로부터의 JW3242를 사용하여 KJ122 내로 형질 도입되었고, 또한 카나마이신 저항성에 대하여 선택하였다. 제2 단계에 대하여, 야생형 이 . 콜리 (E. coli ) C가 제공자로서 사용되었고, 선택은 성장 및 최소한의 글루코오스 배지 상에서의 성장에 대한 것이었다. RY859A1의 rpoA 유전자 서열이 결정되었고, 또한 야생형인 것으로 보여졌다. 작은 스케인 발효제들 내 48 시간에서, RY859A1은 370 mM의 숙신산염을 생산하였고, 이는 385 mM을 생산하였던 KJ122 보다 약간 적은 것이었다. 발효는 듀플리케이트에서 수행되었고, 또한 재생 가능하였다.

실시예 6

KJ122 내에서 돌연변이화된 rpoA 유전자의 큐어링

KJ122 및 이. 콜리 (E. coli ) C 스트레인 사이에서의 비교 게놈 서열 분석은 rpoC 유전자에 의하여 코딩되는 RNA 폴리머라제의 β' 서브 유닛의 F 영역에서의 미스센스 포인트 돌연변이(missense point mutation)를 나타내었다. RpoC 단백질은 RNA 합성의 과정에서 DNA 템플레이트에 결합한다. 포지션 747에서의 메티오닌 잔기는 KJ122 내 이소류신으로 대체되었다. KJ122의 RpoC 단백질 내에서의 이러한 포인트 돌연변이의 영향은 새로운 스트레인 RY862A를 제공하기 위하여 rpoC 돌연변이의 야생형 대립 형질을 KJ122로 이동시키고, 또한 숙신산 생산에서의 이러한 돌연변이의 영향을 결정하는 것에 의하여 평가되었다. RY862A는 P1 vir 형질 도입을 사용하여 제조되었다. 연결된 thiG :: kan 대립 형질이 제공자로서 케이오 결실 컬렉션 (Keio deletion collection)(콜리 유전적 스톡 센터, 예일 대학, 뉴 해븐, CT, USA (Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA)로부터 입수 가능한)으로부터의 JW5549를 사용하여 KJ122 내로 형질 도입되었고, 또한 카나마이신 저항성에 대하여 선택하였다. RY862A의 rpoC 유전자의 서열이 결정되었고, 또한 야생형인 것으로 보여졌다. 5 mg/리터에서의 티아민 HCl이 RY862A의 성장을 보장하기 위하여 RY862A 및 컨트롤 KJ122에 대한 발효 배지에 더하여졌다. 작은 스케인 발효제들 내 48 시간에서, RY862A의 숙신산염 타이터는 KJ122의 그것, 425 mM 보다 상당히 적은 320 mM 였다. RY862A의 개시 성장 속도는 또한 KJ122의 그것에 비해 느렸고, 0.23 OD550/hr에 대하여 비교되는 0.15 OD550/hr이었다. 발효는 듀플리케이트에서 수행되었고 또한 재생 가능하였다.

실시예 7

KJ122 내 돌연변이화된 gldA 유전자의 큐어링

NAD⁺-의존성 글리세롤 디하이드로게나제(NAD⁺-dependent glycerol dehydrogenase) 는 gldA 유전자에 의해 인코딩된다. GldA 단백질은 글리세롤의 디하이드록시아세톤으로의 가역적인 산화를 촉매하며, 또한 메틸글록살 (methylgloxal)의 R-락트알데히드(R-Lactaldehyde)로의 환원을 촉매할 수 있다. 비교 게놈 서열 분석은 KJ122 내 gldA 유전자가 프레임 이동 돌연변이를 포함한다는 것을 나타내었다. 숙신산 생산에 대한 gldA 유전자의 돌연변이화된 형태의 영향은, 새로운 스트레인 AC6를 제공하기 위해, 상기 기재된 두 단계 유전자 대체 방법을 사용하여, 야생형 gldA 유전자를 KJ122 내로 장착하는 것에 의해 평가되었다. 제1 단계에서, cat- sacB 카세트가 새로운 스트레인 AC5를 제공하기 위해 스트레인 KJ122의 gldA 로커스에 장착되었다. 사용된 프라이머들은 SEQ ID NO. 9 및 10이었다(표 1 참조). 제2 단계에서, 이. 콜리(E. coli)로부터의 야생형 gldA 유전자가 새로운 스트레인 AC6를 제공하기 위하여 AC5 내로 장착되었다. 사용된 프라이머들은 SEQ ID NO. 13 및 14였다(표 1 참조). 작은 스케일 발효제들 내 96 시간에서, AC6의 숙신산염 타이터는, 530 mM이었던 KJ122의 그것에 대해 약간 높은, 580 mM이었다. 그러나 AC6의 개시 성장 속도는 0.20 OD550/hr 였던 KJ122의 그것에 비해 약간 느린, 0.16 OD550/hr였다. 따라서, 돌연변이화된 gldA는 KJ122의 대사적 진화의 과정을 위해 선택될 수 있는 약간의 성장 장점을 제공한다.

실시예 8

KJ122 내 돌연변이화된 dhaM 유전자의 큐어링

디하이드록시아세톤 키나제(Dihydroxyacetone kinase)는, 하나의 오페론, dhaKLM 내 세 개의 유전자들에 의해 인코딩되는, 포스포트랜스퍼라제 시스템 (phosphotransferase (PTS) system)에 관련된 다중 서브 유닛 단백질이다. DhaM 서브 유닛은 만노스 이송자(mannose transporter)의 IIA 도메인, 포스포릴 캐리어 단백질 Hpr 및 효소 1의 N-터미널 도메인에 대해 서열 유사성을 갖는다. 이. 콜리(E. coli)에서, DhaM은 디하이드록시아세톤의 인산화에서의 인산염에 대한 제공자로서 ATP 대신 PEP를 사용한다. DhaM은 효소 1 및 포스포릴 캐리어 단백질 HPr을 통해 PEP에 의해 인산화된다. KJ122의 dhaM 유전자는 프레임 이동 돌연변이를 포함한다. KJ122 내에서의 dhaM 돌연변이의 영향을 평가하기 위하여, 야생형 dhaM 유전자가 새로운 스트레인 AC2를 제공하기 위하여 상기 기재된 두 단계 유전자 대체 방법을 사용하여 KJ122 내로 장착되었다. 제1 단계에서, 새로운 스트레인 AC1을 제공하기 위하여 cat- sacB 카세트가 스트레인 KJ122의 dahM 로커스에 장착되었다. 사용된 프라이머들은 SEQ ID NO. 11 및 12였다(표 1 참조). 제2 단계에서, 이. 콜리(E. coli)로부터의 야생형 dahM 유전자가 새로운 스트레인 AC2를 제공하기 위하여 AC1 내로 장착되었다. 사용된 프라이머들은 SEQ ID NO. 15 및 16이었다(표 1 참조). 작은 스케일 발효제들 내 96 시간에서, AC2의 숙신산염 타이터는, 530 mM이었던 KJ122의 그것에 대해 약간 높은, 560 mM이었다. 그러나 AC6의 개시 성장 속도는 0.20 OD550/hr 였던 KJ122의 그것에 비해 약간 느린, 0.16 OD550/hr였다. 따라서, dahM를 돌연변이화 하는 것은 KJ122의 대사적 진화의 과정동안 선택될 수 있는 약간의 성장 장점을 제공한다. DhaKLM은 숙신산 생합성에 대한 기질인 PEP를 소비하기 때문에, PEP의 전환은 KJ122의 성장 장점을 위한 메카니즘이다. dahKLM 오페론 내에서의 유전자들을 돌연변이화 하는 것에 더하여, 또는 대신에, 어떤 다른 PTS-의존성 디하이드록시아세톤 키나제의 서브 유닛을 인코딩하는 유전자는 또한 그들의 숙신산 생산에서의 중요성을 테스트하기 위하여 돌연변이화 될 수 있다.

실시예 9

KJ122 내 ftsI 유전자 내에서의 미스센스 돌연변이의 큐어링

ftsI 유전자는 세포 벽 및/또는 격벽(septation) 내에 포함된 필수 단백질을 인코딩한다. KJ122의 ftsI 유전자는 C 로부터 T 로의 코딩하는 서열의 염기 619를 변화시키는 미스센스 돌연변이를 포함하며, 이는 아르기닌 207을 시스테인으로 변화시킨다. KJ122의 FtsI 단백질 에서의 아르기닌의 시스테인으로의 포인트 돌연변이의 효과는 ftsI 돌연변이의 야생형 대립 형질을 새로운 스트레인 RY858G1을 제공하기 위하여 KJ122 내로 이동시키고 또한 숙신산 생산에 대한 이러한 돌연변이의 효과를 결정하는 것에 의해 평가되었다. FstI이 필수적인 단백질이기 때문에, 두 단계 유전자 대체 방법은 작동하지 않을 것이고, 따라서 두 단계 P1 vir 형질 도입이 RY858G1을 제조하는 데에 대신 사용되었다. 제1 단계에서, 연결된 leuA :: kan 대립 형질이 제공자로서 케이오 결실 컬렉션(Keio deletion collection)(콜리 유전적 스톡 센터, 예일 대학, 뉴 해븐, CT, USA(Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA)로부터 입수 가능한)으로부터의 JW0073을 사용하여 KJ122 내로 형질 도입되었고, 또한 새로운 스트레인 RY853G1을 제공하기 위하여, 카나마이신 저항성에 대하여 선택하였다. 제2 단계에 대하여, 이. 콜리 (E. coli) C가 제공자로서 사용되었고, RY853G1이 수여자였으며, 선택은 최소한의 글루코오스 배지 상에서의 성장에 대한 것이었다. RY858G1의 ftsI 유전자의 서열이 결정되었고, 또한 야생형인 것으로 보여졌다. 작은 스케인 발효제들 내에서, RY853G1는 KJ122에서와 거의 동일한 개시 성장 속도로 성장하였으나, 72시간에서, RY853G1는 460 mM을 생산하였던 KJ122 보다 약간 적은 숙신산염 440 mM을 생산하였다. 따라서 KJ122의 ftsI 유전자 내에서의 미스센스 돌연변이는 숙신산염 타이터에서의 증가에 대해 약간 기여한다.

실시예 10

재조합 돌연변이들의 부가적인 효과

상기 실시예들에 상세하게 기재된 스트레인 비교들의 결과들은 표 3에 요약되어 있다. 동시에 테스트되었던 돌연변이들의 많은 수가 숙신산 타이터 또는 성장 속도에서의 단지 약간의 증가만을 제공하였다. 그러나, 이러한 증가들은 그것의 조상들에 대하여 상대적으로 KJ122에 대하여 발견되었던 모든 향상(잔타마 외. (Jantama et al.), 2008a; 잔타마 외.(Jantama et al.), 2008b)을 제공하는데 있어서 부가적인 및/또는 시너지적임에 틀림이 없다. 예로서, rpoA에서의 미스센스 돌연변이 및 rpoC에서의 미스센스 돌연변이 양자에 대하여 큐어링된 KJ122의 유도체는, 야생형 rpoC 유전자를, 야생형 rpoA 유전자를 포함하는 RY859A1으로 형질 도입함으로써 제조되었고, 새로운 스트레인 RY860A의 결과를 가져왔다. RY860A의 제조는, 그 수여 스트레인이 KJ122 대신 RY859A1이었던 것을 제외하고, 실시예 6에 상기 기재된 RY862A와 동일한 방법으로 수행되었다. 작은 스케일 발효제들에서 48 시간에서 5 mg/l의 티아민 HCl의 보충으로, RY860A는 KJ122(425 mM) 보다 및 단지 rpoC 돌연변이에 대해 큐어링되었던, RY862A(320 mM) 보다 상당히 적은 양의 숙신산염(300 mM)을 생산하였다.

실시예 11

나이브(naive) 스트레인으로부터의 새로운 숙신산염 생산자의 제조

스트레인 TG128은 유전자형(genotype) ㅿfrdABCD, ㅿadhE, ㅿmgsA, 및 ㅿack를 가지고, 이. 콜리 (E. coli ) W(ATCC 9637)로부터 유도되었던 D-락테이트 생산자이다. TG128은 2005년 7월 25일 농업 리서치 서비스 배양균 컬렉션, 1815N. 유니버시티 스트리트, 페오리아, 일리노이, 61604, 미국(Agricultural Research Services Culture Collection, 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604 U.S. A.)으로 수탁되었고, 스트레인 접근 번호 NRRL B-30962를 갖는다. TG128은 그런 다음 일차적으로 수크로스 상에서의 성장에 대해, 이차적으로 섭씨 39도에서 성장 대해, 및 삼차적으로 섭씨 40도에서의 성장에 대해 선택함으로써 대사적으로 진화되었다. 결과적인 스트레인은 TR160으로 명명되었다. TG160은 그런 다음 숙신산 생산 스트레인으로 재조작되었다. KJ122로부터의 대립 형질들이, 상기 기재된 두 단계 유전자 대체 방법을 사용하여 하기의 연대순으로 장착되었다: pck ^* , ㅿ ldhA , frdABCD ⁺ , 및 ptsI ^*. pck ^*및 ptsI ^* 돌연변이들은 KJ122 게놈 내에서 발견되었거나 숙신산 생산의 효율을 증가시키는 것으로 보여졌던 양자의 돌연변이들이었다(장 외.(Zhang et al.), 2009a). 결과적인 스트레인, WG32b는 그런 다음 작은 미생물 발효제들 내에서, 스트레인 WG32b-T23을 제공하기 위하여, 약 126 세대들(23 이동들) 에 대하여 성장되었다. WG32b-T23은 작은 스케일 발효제들 내에서 약 260 mM 숙신산을 제조하였던 적당히 우수한 숙신산 생산자이다. 다음으로, 두 개의 부가적인 돌연변이들이, KJ122의 게놈에서의 본 발명의 발견들을 바탕으로 하여, WG32b-T23에 부가되었다. 일차적으로, 자연적인 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 서열들 측면에 위치하도록 함께 포함하는 galP 유전자의 두번 째 카피가, 두 단계 유전자 대체 방법을 사용하여, dnaA 유전자 근처의 로커스에서 게놈 내에 집적되었다. 삽입 사이트에서의 DNA 서열은 하기와 같다: attaaattttccaatatgcggcgtaaatcgtgcccgcctcgcggcaggatcgtttacacttagcgagttctggaaagtcctgtggataa atcgggaaaatctgtgagaaacagaagatct - 삽입 사이트 - cttgcgcagtttaggctatgatccgcggtcccgatcgttttgcaggatcttgactcgggcatataaccgcagacagcggt. 제1 단계에서, kan - sacB 카세트가 스트레인 WG62를 제공하기 위하여 dnaA 로커스에서 삽입되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO. 25 및 26이었다(표 1 참조). 제2 단계에서, galP의 두 번째 카피가 dnaA 로커스에 장착되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO. 27 및 28이었다(표 1 참조). 결과적인 스트레인, WG74로 명명된, 은 작은 스케일 발효들 내에서 약 320 mM의 숙신산을 생산하였다. 이차적으로, pykA 유전자의 완전한 개방 리딩 프레임이 WG74로부터 삭제되었고 또한 새로운 스트레인 WG96을 제공하기 위하여 cat- sacB 카세트로 대체되었다. 사용된 PCR 프라이머들은 SEQ ID NO. 29 및 30이었다(표 1 참조). 작은 스케일 발효들 내에서, WG96은 450 mM의 숙신산을 생산하였고, 이것은 전구체 스트레인들 WG32b-T23 및 WG74의 그것에 대하여 분명한 향상이다. 따라서, 본 발명자들은 KJ122 내에서의 돌연변이들의 추출물 성질을 발견하는 것이 다른, 덜 진화된 부모 스트레인들로부터 어떻게 새로운, 향상된 숙신산을 생산하는 스트레인들을 제조할 것이냐에 대한 고유한 정보 및 통찰력을 제공한다는 것을 분명히 확립하였다. 나아가, 본 발명의 발견들은 광범위하게 적용 가능하다. 예로서, galS 돌연변이에 대한 수득 (learning)은 새로운 스트레인 내에 KJ122 안에서 발견되는 동일한 돌연변이를 장착하는 것에 의해서 뿐만 아니라, GalS 억제의 타켓, galP 유전자를 듀플리케이트 하는 것에 의해서도 적용될 수 있다. 또 다른 예로서, pykA 돌연변이의 수득은 새로운 스트레인 내에 KJ122 안에서 발견되는 동일한 돌연변이를 장착하는 것에 의해서 뿐만 아니라, pykA의 결실을 장착하는 것에 의해서도 적용될 수 있다.

여기 개시된 발명은 숙신산 외 다른 화합물들을 생산하기 위한 스트레인들 및 프로세스들을 향상시키는 것에 대하여 일반화될 수 있다. 제공된 실시예들은, 제한하는 것이 아니라, 예시적인 것으로 의도된다.

GalP 단백질은 글루코오스 및 다른 당들을, ATP의 대강 1/3의 세포를 소모하는, 프로톤 심포트 메카니즘(proton symport mechanism)에 의해 유입하기 위해 작용한다. 유입 후에, 글루코오스와 같은 당는 부가적인 ATP를 소모하는, 약 총 1.33 ATP의 소모에 대하여, 인산화되는 것을 요구한다. 대사적 에너지의 관점에서, 이것은, 에너지적으로 약 2 ATP와 동일한, 하나의 PEP를 소모하는, PTS 시스템에 의해 글루코오스와 같은 당를 유입하는 것보다 덜 비싼 것이다. 따라서, GalP에 의한 글루코오스와 같은 당를 유입하는 것은 PTS를 사용하는 것에 의하는 것보다 더 효율적이다.

나아가. 많은 발효적 프로세스에서, 특히 그러나 혐기성 및 미세 호기성 프로세스에 제한되는 것이 아닌, PEP는 숙신산 이외의 화합물들, 말산, 푸마르산, 아스파르트산염, 트레오닌, 메티오닌, 라이신, 및 기타와 같은, 의 생합성에 대한 중간체일 수 있다. 따라서 PEP를, PTS를 대신하여 GalP를 사용하는 것에 의해, 또한 일반적으로 피루베이트 키나제 활성을 감소시키는 것에 의해 전환함으로써 생합성의 효율이 향상될 수 있다.

많은 발효들에서, 최소한의 배지 내에서의 더 효과적인 성장이 바람직하며, 또한 KJ122 내에서 발견되는 48 kb 결실은 최소한의 배지에서 이. 콜리(E. coli)를 사용하는 어떤 발효에서의 효율을 향상시키는 것을 도울 것이다.

KJ122에서 발견되는 ftsI 돌연변이는 더 작은 또는 더 큰 구형 세포를 유도하는 것에 의해 효율성을 향상시킬 것이며, 이것은 차례로 더 높은 부피에 대한 표면 영역 비를 유도한다. 이것은, 차례로, 더욱 효율적인 글루코오스, 수크로스, 말토스, 글리세롤 등과 같은 영양분의 유입을 유도할 것이고, 숙신산염, 말산염, 푸마르산염, 아스파르트산염, 트레오닌, 메티오닌, 라이신 등과 같은 생성물의 더 효율적인 유출을 유도할 것이다.

rpoA 및 rpoC에서 발견되는 돌연변이들은 글루코오스에 의한 분해 대사질 (catabolite) 억제의 일반적인 손실의 결과를 가져온다. 예로서, 저렴한 당들의 바람직한 소스들인 바이오 매스 가수분해물들은 통상적으로 글루코오스를 포함하는 당들의 혼합물을 포함한다. 다양한 다른 당들이 글루코오스와 함께 동시적으로 사용되는 것이 바람직하며 또한 분해 대사질 억제의 제거는 글루코오스와 함께 비-글루코오스 당들을 효율적으로 소비하고 대사하는 것에 대한 세포의 능력을 향상시킨다. 나아가, 분해 대사질의 제거는 바람직한 유전자들, pck , galP , mdh . fumA , xylE, lacZ , lacY,fumB , 및 frdABCD와 같은, 의 발현을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 RNA 폴리머라제 돌연변이들은 다양한 상업적으로 유용한 스트레인들 및 발효 프로세스들에 대한 광범위한 적용 가능성을 갖는다.

따라서, 본 발명에서 개시된 돌연변이들은 숙신산 생산을 증가시키기 위하여 유용하며, 그들은 그들이 숙신산 생산 또는 다른 유기산 생산에 대하여 종래 기재되지 않았다는 점에서 새롭고, 또한 그들은 본 기술 분야에서 숙련된 자가 본 발명들의 개별적인 돌연변이들 또는 그들 돌연변이들의 조합이 숙신산 또는 다른 유기산 생산을 향상시킬 것이라고 기대할 수 없었다는 점에서 진보적이다.

KJ122의 게놈 서열 내에서 발견되었던 몇 개의 돌연변이들이 한번에 하나씩 개조될 때에 성장 또는 숙신산 생산에 대하여 단지 약간의 효과만을 생산하였다 하더라도, 성장의 속도에서의 단지 작은 증가는, 시간 주기가 많은 세대들을 커버함에 따라 대사적 진화의 과정 동안 선택될 수 있다는 점이 강조되어야 한다. 나아가, 그 안에서 각 개별적인 돌연변이가 부가적으로 또는 시너지적으로 기여하는 몇 가지 돌연변이들의 조합은, 성장의 효율 및/또는 숙신산 생산에서의 더 큰 증가를 부여할 것이다.

실시예 11에 기재된 바와 같이, 새로운, 이차적 부모 스트레인으로부터의 발효에 의한 바람직한 화합물을 생산하는 목적을 위하여 미생물들 제조하는 것에 대한 방법은 광범위하게 다양한 화합물들 및 스트레인들에 대하여 일반화될 수 있다. 일반적인 방법은 하기를 포함한다: (A) 상기 바람직한 화합물로부터 이격된 발효 생성물에 대한 생합성적 경로에서의 단계를 촉매하는 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 일차적 부모 스트레인으로부터 삭제하는 것으로, 제1 중간체 스트레인을 유도하는 것, (B) 제2 중간체 스트레인을 유도하기 위해 상기 제1 중간체 스트레인에 대한 대사적 진화를 수행하는 것, (C) 상기 부모 스트레인 및 상기 제2 중간체 스트레인의 게놈 DNA 서열을 결정하는 것, (D) 상기 대사적 진화의 과정을 위해 선택되었던 돌연변이들을 확인하기 위하여 상기 게놈 DNA 서열들을 비교하는 것, (E) 상기 돌연변이들의 어느 것이 성장 속도 또는 상기 바람직한 화합물의 생산의 효율을 증가시키기 위하여 유리한지 결정하기 위하여 상기 돌연변이들의 적어도 하나를 테스트하는 것, (F) 적어도 하나의 상기 유리한 돌연변이들을 선택하는 것, 및 (G) 적어도 하나의 상기 유리한 돌연변이들, 또는 하나의 상기 유리한 돌연변이들과 기능적으로 유사한 적어도 하나의 돌연변이들을 이차적 부모 스트레인에서 장착하여 상기 미생물을 유도하는 것.

이러한 일반적인 방법은 숙신산염 이외의 화합물들, 푸마르산염, 말산염, 아스파르트산염, 글루탐산염 및 이들 화합물들의 어떤 것의 유도체들과 같은, 및 이. 콜리(E. coli ) 이외의 다른 미생물들, 다른 박테리아, 아르콘들(archons), 이스트들(yeasts), 곰팡이(filamentous fungi), 조류(algae), 및 디노플라겔레이트들 (dino flagellates)을 포함하는, 에 대하여 적용될 것이다.

출원인들의 발명은 바람직한 실시예들에 대한 특별한 참조로서 상기 상세하게 기재되었다. 상기 상세한 설명에 익숙해진 숙련된 수행자는 후술하는 청구항들의 범위로부터 벗어나는 일 없이 어떤 변형을 이룰 수 있다.

사용된 프라이머들의 서열들
SEQ ID NO.	프라이머 이름	서열 (5'>3')
9	BY60	caggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagcagagcggcgtaaacctgtgacggaagatcacttcgcagaataa
10	BY61	gtgagtttgaccgctatctgctgagccaaataacccgaatatggtcattgaagcacttcactgacaccctcatca
11	BY62	tctctggcggtggtcataaaaaaccgtaacggcctgcatgtacgtccggcgtgacggaagatcacttcgcagaataaat
12	BY63	aaccctgacggttgaaacgttgcgttttaacgtccagcgttagcgtttctgaagcacttcactgacaccctcatca
13	AC 16	gcattgtctgttatctacaccgatgagg
14	AC 17	tcccactcttgcaggaaacgct
15	AC33	gactgggagaaggtgtcggtgaat
16	AC34	catcattaaacagcggccctaataaaata
17	91A	aaacgccaatgcccaggcgctggcaactcaggttagcgacaccattggcgtggtggtgat ctagcgcatgcatccattta
18	91B	aatcaacgcattacaacgctggcgaattaacacctcaatggcgtgacgctctttttccgc ggcgaagaactccagcatga
19	90A	gaataacagcacgctggtca
20	90B	tcaacgcactcatccagcct
21	60A	atgtccagaaggcttcgcagaacaaaaatcgttaccacgttaggcccagcaacagatcgc gacggaagatcacttcgcag
22	60B	ttactctaccgttaaaatacgcgtggtattagtagaacccacggtactcatcacgtcgccaagaaataaaagaaaatgcc
23	59A	tacatgtccagaaggcttcg
24	59B	catccggcaacgtacttact
25	75A	ccaggacgatccttgcgctttacccatcagcccgtataatcctccacccggcgcgccatgctagcgcatgcatccattta
26	75B	ccgcgctatccgcaccttttcgcagggaaaatgtacgacctcacaccagtggaaaccagc ggcgaagaactccagcatga
27	76A	ccaggacgatccttgcgctttacccatcagcccgtataatcctccacccggcgcgccatgccgattacaccaaccacaac
28	76B	ccgcgcttttccgcaccttttcgcagggaaaatgtacgacctcacaccagtggaaaccagc ggcgaatttcatagctttcc
29	60A	atgtccagaaggcttcgcagaacaaaaatcgttaccacgttaggcccagcaacagatcgc gacggaagatcacttcgcag
30	60B	ttactctaccgttaaaatacgcgtggtattagtagaacccacggtactcatcacgtcgccaagaaataaaagaaaatgcc
31	67A	ggctgggacggaagtcgctgtcgttctcaaaatcggtggagctgcatgacaaggtcatcggacggaagatcacttcgcag
32	67B	atggagcagattagcggttaaccctgctatttgcctgataaatctaaaacccggtaagcaaagaaataaaagaaaatgcc
36	87A	atgaaaaagaccaaaattgtttgcaccatcggaccgaaaaccgaatctgaagagatgtctagcgcatgcatccattta
37	87B	ttacaggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccagtgcaccagaaaggcgaagaactccagcatga
38	78A	acacattccttctgcacgctt
39	78B	aggatgcttccatcggattc

프라이머 쌍들 및 사용된 DNA 템플레이트 및 형성된 박테리아 스트레인들
PCR 프라이머 쌍	DNA 템플레이트	형성된 스트레인
BY60 / BY61	pCA2	AC5
BY62 / BY63	pCA2	AC1
AC16 / AC17	E. Coli C	AC6
AC33 / AC34	E. Coli C	AC2
91A/ 91B	pGW162	WG83
90A / 90B	KJ122	WG86
60A /60B	pL014151	WG84
59A / 59B	E. Coli C	WG85
75A / 75B	pGW162	WG62
76A / 76B	KJ122	WG74
60A / 60B	pL014151	WG96
67A / 67A	pL014151	WG51
87A / 87B	pGW162	WG87
78A / 78B	pGW191	WG89

전체 게놈 서열화를 통해 검출된 돌연변이들의 상세
관련 유전자(들)	스트레인 이름	부모 스트레인	대립 형질 타입	숙신산염 타이터	개시 성장 속도 0D550/hr	주어진 타이터에 대한 발효 시간(시간)
pykA	KJ122	-	프레임 이동	550 mM	0.21	96
pykA	WG85a	KJ122	야생형	160 mM	0.022	96
pykA	WG84	KJ122	결실	540 mM	0.21	96

pykA,F	KJ122	-	pykAl ^fs , pykF+	510 mM	0.20	97
pykA,F	WG89	KJ122	pykA ⁺ , DpykF	115 mM	0.021	97

galS	XZ722	-	야생형	175 mM	0.017	144
galS	WG86a	XZ722	프레임 이동	210 mM	0.019	144
galS	WG83	XZ722	결실	220 mM	0.018	144

rpoA	KJ122	-	미스센스	385 mM	0.24	48
rpoA	RY859A1	KJ122	야생형	370 mM	0.23	48

rpoC	KJ122		미스센스	425 mM	0.23	48
rpoC	RY862A	KJ122	야생형	320 mM	0.15	48
rpoA , rpoC	RY860A	RY859A1	배지에 대한 야생형	300 mM	0.14	48

gldA	KJI22	-	프레임 이동	530 mM	0.20	96
gldA	AC6	KJ122	야생형	580 mM	0.16	96

dhaM	KJ122	-	프레임 이동	530 mM	0.20	96
dhaM	AC2	KJ122	야생형	560 mM	0.16	96

ftsI	KJ122	-	미스센스	460 mM	0.20	72
ftsI	RY858G1	KJ122	야생형	440 mM	0.20	72

SEQUENCE LISTING <110> Myriant Technologie LLC Gong, Wei Dole, Sudhanshu Graber, Tammy Collard,, Andrew Pero, Janice Yocum, Rogers <120> Engineering Microbes for Efficient Production of Chemicals <130> MT2010_04PCT <150> US 61/281,481 <151> 2009-11-18 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> SEQ ID NO. 1 <211> 1445 <212> DNA <213> Escherichia coli KJ122 <220> Feature: pykA gene coding region <223> Other Information: Frame shift mutation, insertion of GC after base 1023 <400> Sequence atgtccagaa ggcttcgcag aacaaaaatc gttaccacgt taggcccagc aacagatcgc 60 gataataatc ttgaaaaagt tatcgcggcg ggtgccaacg ttgtacgtat gaacttttct 120 cacggctcgc ctgaagatca caaaatgcgc gcggataaag ttcgtgagat tgccgcaaaa 180 ctggggcgtc atgtggctat tctgggtgac ctccaggggc ccaaaatccg tgtatccacc 240 tttaaagaag gcaaagtttt cctcaatatt ggggataaat tcctgctcga cgccaacctg 300 ggtaaaggtg aaggcgacaa agaaaaagtc ggtatcgact acaaaggcct gcctgctgac 360 gtcgtgcctg gtgacatcct gctgctggac gatggtcgcg tccagttaaa agtactggaa 420 gttcagggca tgaaagtgtt caccgaagtc accgtcggtg gtcccctctc caacaataaa 480 ggtatcaaca aacttggcgg cggtttgtcg gctgaagcgc tgaccgaaaa agacaaagca 540 gacattaaga ctgcggcgtt gattggcgta gattacctgg ctgtctcctt cccacgctgt 600 ggcgaagatc tgaactatgc ccgtcgcctg gcacgcgatg caggatgtga tgcgaaaatt 660 gttgccaagg ttgaacgtgc ggaagccgtt tgcagccagg atgcaatgga tgacatcatc 720 ctcgcctctg acgtggtaat ggttgcacgt ggcgacctcg gtgtggaaat tggcgacccg 780 gaactggtcg gcattcagaa agcgttgatc cgtcgtgcgc gtcagctaaa ccgagcggta 840 atcacggcga cccagatgat ggagtcaatg attactaacc cgatgccgac gcgtgcagaa 900 gtcatggacg tagcaaacgc cgttctggat ggtactgacg ctgtgatgct gtctgcagaa 960 actgccgctg ggcagtatcc gtcagaaacc gttgcagcca tggcgcgcgt ttgcctgggt 1020 gcgcggaaaa aatcccgagc atcaacgttt ctaaacaccg tctggacgtt cagttcgaca 1080 atgtggaaga agctattgcc atgtcagcaa tgtacgcagc taaccacctg aaaggcgtta 1140 cggcgatcat caccatgacc gaatcgggtc gtaccgcgct gatgacctcc cgtatcagct 1200 ctggtctgcc aattttcgcc atgtcgcgcc atgaacgtac gctgaacctg actgctctct 1260 atcgtggcgt tacgccggtg cactttgata gcgctaatga cggcgtagca gctgccagcg 1320 aagcggttaa tctgctgcgc gataaaggtt acttgatgtc tggtgacctg gtgattgtca 1380 cccagggcga cgtgatgagt accgtgggtt ctactaatac cacgcgtatt ttaacggtag 1440 agtaa 1445 <210> SEQ ID NO. 2 <211> 1042 <212> DNA <213> Escherichia coli KJ122 <220> Feature: galS coding sequence <223> Other Information: frameshift mutation,insertion of A after base 246 <400> Sequence atgatcacca ttcgtgatgt agcgcgtcag gctggcgtct ctgtggcaac ggtttcccgg 60 gtgctcaata acagcacgct ggtcagtgcc gacacgcgtg aagcagtaat gaaagccgtg 120 agtgagctgg attatcggcc aaacgccaat gcccaggcgc tggcaactca ggttagcgac 180 accattggcg tggtggtgat ggacgtttct gatgcgtttt tcggcgcgct ggtaaaagcg 240 gtggatacta gtcgctcagc agcatcagaa atacgtgcta atcggcaata gctatcatga 300 agcggaaaaa gagcgtcacg ccattgaggt gttaattcgc cagcgttgta atgcgttgat 360 tgttcactca aaagcattga gtgacgatga actggcgcaa tttatggata acattcccgg 420 tatggtgtta atcaaccgcg ttgtgccggg gtacgcccat cgttgcgttt gcctggataa 480 tctcagcggt gcccgaatgg cgacgcgcat gttgctgaat aacggtcatc aacgtattgg 540 ttatctttct tccagtcacg gcattgaaga tgacgccatg cgtaaagcag gctggatgag 600 tgcgttgaaa gagcaggata ttattccgcc ggaaagctgg attggcactg gtacgccgga 660 catgccgggc ggtgaggcgg cgatggttga actgctgggg cgcaatctac aacttaccgc 720 tgtatttgct tataacgaca atatggccgc tggcgcactg acagcattaa aagataatgg 780 cattgcgatt ccgttacatc tctcaatcat cggtttcgat gatattccca tcgcccgtta 840 caccgacccg caattaacga ccgtgcgtta tcccattgct tcaatggcta aattagccac 900 cgaactggcc ttgcaggggg cagcaggcaa tattgatcct cgtgccagcc actgttttat 960 gccgacgtta gtgcgtcgcc attctgtcgc aacgcgccag aatgcggcgg cgatcactaa 1020 ctcaacaaat caggcgatgt aa 1042 <210> SEQ ID NO. 3 <211> 906 <212> DNA <213> Escherichia coli KJ122 <220> Feature: 48 kilobase deletion <223> Other Information: Deletion between bases 448 and 449 Deletion removes genes ydcI, ydcL, ydcO, ydcV and many others <400> Sequence cagtcggtaa cctcgcgcat acagccgggc agtgacgtca tcgtctgcgc ggaaatggac 60 gaacagtggg gctacgtcgg tgctaaatca cgtcagcgct ggctgtttta cgcgtatgac 120 aggatacgga ggacagttgt ggcgcacgtt ttcggtgaac gcactctggc cacactggag 180 cgtcttctga gcctgctgtc ggcctttgag gtcgtggtat ggatgacgga tggctggccg 240 ctgtatgaat cacgcctgaa gggaaagctg cacgttatca gcaagcgtta cactcagcgc 300 attgagcgac ataatctgaa tctgagacaa catctggcaa ggctgggacg gaagtcgctg 360 tcgttctcaa aatcggtgga gctgcatgac aaggtcatcg ggcattatct gaacataaaa 420 cactatcagt aagttggagt cactaccctg aattcctgaa tttttgtcct taccgtttta 480 gaattaataa aaaacccggc gctaaatgct taccgggttt tagatttatc aggcaaatag 540 cagggttaac cgctaatctg ctccatcgcc tgcaaaatac gcttatctga aatcggataa 600 ggcgtaccaa gttgttgagc gaagtaacta acgcgcagct cttctatcat ccaacggatc 660 tctttcacgt cttcatcctc acgacgtgca ggcggcagtt tgttgatcca ttgctgccac 720 gcctgctgga cgttttcgac tttcagcatc tgagcacggt cgcgatgtgg atcaaccgcc 780 agtttttcca gtcgtttttc aatcgcctgc aaatatcgca gcgtgtcgcc cagccgtttg 840 aagccgttac cagtgacaaa accgcgatat accaacccgc ccatctgcgc tttaatgtca 900 gaaagc 906 <210> SEQ ID NO. 4 <211> 990 <212> DNA <213> Escherichia coli KJ122 <220> Feature: rpoA gene coding sequence <223> Other Information: missense mutation C965T; P322L mutation <400> Sequence atgcagggtt ctgtgacaga gtttctaaaa ccgcgcctgg ttgatatcga gcaagtgagt 60 tcgacgcacg ccaaggtgac ccttgagcct ttagagcgtg gctttggcca tactctgggt 120 aacgcactgc gccgtattct gctctcatcg atgccgggtt gcgcggtgac cgaggttgag 180 attgatggtg tactacatga gtacagcacc aaagaaggcg ttcaggaaga tatcctggaa 240 atcctgctca acctgaaagg gctggcggtg agagttcagg gcaaagatga agttattctt 300 accttgaata aatctggcat tggccctgtg actgcagccg atatcaccca cgacggtgat 360 gtcgaaatcg tcaagccgca gcacgtgatc tgccacctga ccgatgagaa cgcgtctatt 420 agcatgcgta tcaaagttca gcgcggtcgt ggttatgtgc cggcttctac ccgaattcat 480 tcggaagaag atgagcgccc aatcggccgt ctgctggtcg acgcatgcta cagccctgtg 540 gagcgtattg cctacaatgt tgaagcagcg cgtgtagaac agcgtaccga cctggacaag 600 ctggtcatcg aaatggaaac caacggcaca atcgatcctg aagaggcgat tcgtcgtgcg 660 gcaaccattc tggctgaaca actggaagct ttcgttgact tacgtgatgt acgtcagcct 720 gaagtgaaag aagagaaacc agagttcgat ccgatcctgc tgcgccctgt tgacgatctg 780 gaattgactg tccgctctgc taactgcctt aaagcagaag ctatccacta tatcggtgat 840 ctggtacagc gtaccgaggt tgagctcctt aaaacgccta accttggtaa aaaatctctt 900 actgagatta aagacgtgct ggcttcccgt ggactgtctc tgggcatgcg cctggaaaac 960 tggctaccgg caagcatcgc tgacgagtaa 990 <210> SEQ ID NO.5 <211> 4224 <212> DNA <213> Escherichia coli KJ122 <220> Feature: rpoC coding sequence <223> Other Information: missense mutation G2441A; M747I mutation <400> Sequence gtgaaagatt tattaaagtt tctgaaagcg cagactaaaa ccgaagagtt tgatgcgatc 60 aaaattgctc tggcttcgcc agacatgatc cgttcatggt ctttcggtga agttaaaaag 120 ccggaaacca tcaactaccg tacgttcaaa ccagaacgtg acggcctttt ctgcgcccgt 180 atctttgggc cggtaaaaga ttacgagtgc ctgtgcggta agtacaagcg cctgaaacac 240 cgtggcgtca tctgtgagaa gtgcggcgtt gaagtgaccc agactaaagt acgccgtgag 300 cgtatgggcc acatcgaact ggcttccccg actgcgcaca tctggttcct gaaatcgctg 360 ccgtcccgta tcggtctgct gctcgatatg ccgctgcgcg atatcgaacg cgtactgtac 420 tttgaatcct atgtggttat cgaaggcggt atgaccaacc tggaacgtca gcagatcctg 480 actgaagagc agtatctgga cgcgctggaa gagttcggtg acgaattcga cgcgaagatg 540 ggggcggaag caatccaggc tctgctgaag agcatggatc tggagcaaga gtgcgaacag 600 ctgcgtgaag agctgaacga aaccaactcc gaaaccaagc gtaaaaagct gaccaagcgt 660 atcaaactgc tggaagcgtt cgttcagtct ggtaacaaac cagagtggat gatcctgacc 720 gttctgccgg tactgccgcc agatctgcgt ccgctggttc cgctggatgg tggtcgtttc 780 gcgacttctg acctgaacga tctgtatcgt cgcgtcatta accgtaacaa ccgtctgaaa 840 cgtctgctgg atctggctgc gccggacatc atcgtacgta acgaaaaacg tatgctgcag 900 gaagcggtag acgccctgct ggataacggt cgtcgcggtc gtgcgatcac cggttctaac 960 aagcgtcctc tgaaatcttt ggccgacatg atcaaaggta aacagggtcg tttccgtcag 1020 aacctgctcg gtaagcgtgt tgactactcc ggtcgttctg taatcaccgt aggtccatac 1080 ctgcgtctgc atcagtgcgg tctgccgaag aaaatggcac tggagctgtt caaaccgttc 1140 atctacggca agctggaact gcgtggtctt gctaccacca ttaaagctgc gaagaaaatg 1200 gttgagcgcg aagaagctgt cgtttgggat atcctggacg aagttatccg cgaacacccg 1260 gtactgctga accgtgcacc gactctgcac cgtctgggta tccaggcatt tgaaccggta 1320 ctgatcgaag gtaaagctat ccagctgcac ccgctggttt gtgcggcata taacgccgac 1380 ttcgatggtg accagatggc tgttcacgta ccgctgacgc tggaagccca gctggaagcg 1440 cgtgcgctga tgatgtctac caacaacatc ctgtccccgg cgaacggcga accaatcatc 1500 gttccgtctc aggacgttgt actgggtctg tactacatga cccgtgactg tgttaacgcc 1560 aaaggcgaag gcatggtgct gactggcccg aaagaagcag aacgtctgta tcgctctggt 1620 ctggcttctc tgcatgcgcg cgttaaagtg cgtatcaccg agtatgaaaa agatgctaac 1680 ggtgaattag tagcgaaaac cagcctgaaa gacacgactg ttggccgtgc cattctgtgg 1740 atgattgtac cgaaaggtct gccttactcc atcgtcaacc aggcgctggg taaaaaagca 1800 atctccaaaa tgctgaacac ctgctaccgc attctcggtc tgaaaccgac cgttattttt 1860 gcggaccaga tcatgtacac cggcttcgcc tatgcagcgc gttctggtgc atctgttggt 1920 atcgatgaca tggtcatccc ggagaagaaa cacgaaatca tctccgaggc agaagcagaa 1980 gttgctgaaa ttcaggagca gttccagtct ggtctggtaa ctgcgggcga acgctacaac 2040 aaagttatcg atatctgggc tgcggcgaac gatcgtgtat ccaaagcgat gatggataac 2100 ctgcaaactg aaaccgtgat taaccgtgac ggtcaggaag agaagcaggt ttccttcaac 2160 agcatctaca tgatggccga ctccggtgcg cgtggttctg cggcacagat tcgtcagctt 2220 gctggtatgc gtggtctgat agcgaagccg gatggctcca tcatcgaaac gccaatcacc 2280 gcgaacttcc gtgaaggtct gaacgtactc cagtacttca tctccaccca cggtgctcgt 2340 aaaggtctgg cggataccgc actgaaaact gcgaactccg gttacctgac tcgtcgtctg 2400 gttgacgtgg cgcaggacct ggtggttacc gaagacgatt gtggtaccca tgaaggtatc 2460 atgatgactc cggttatcga gggtggtgac gttaaagagc cgctgcgcga tcgcgtactg 2520 ggtcgtgtaa ctgctgaaga cgttctgaag ccgggtactg ctgatatcct cgttccgcgc 2580 aacacgctgc tgcacgaaca gtggtgtgac ctgctggaag agaactctgt cgacgcggtt 2640 aaagtacgtt ctgttgtatc ttgtgacacc gactttggtg tatgtgcgca ctgctacggt 2700 cgtgacctgg cgcgtggcca catcatcaac aagggtgaag caatcggtgt tatcgcggca 2760 cagtccatcg gtgaaccggg tacacagctg accatgcgta cgttccacat cggtggtgcg 2820 gcatctcgtg cggctgctga atccagcatc caagtgaaaa acaaaggtag catcaagctc 2880 agcaacgtga agtcggttgt gaactccagc ggtaaactgg ttatcacttc ccgtaatact 2940 gaactgaaac tgatcgacga attcggtcgt actaaagaaa gctacaaagt accttacggt 3000 gcggtactgg cgaaaggcga tggcgaacag gttgctggcg gcgaaaccgt tgcaaactgg 3060 gacccgcaca ccatgccggt tatcaccgaa gtaagcggtt ttgtacgctt tactgacatg 3120 atcgacggcc agaccattac gcgtcagacc gacgaactga ccggtctgtc ttcgctggtg 3180 gttctggatt ccgcagaacg taccgcaggt ggtaaagatc tgcgtccggc actgaaaatc 3240 gttgatgctc agggtaacga cgttctgatc ccaggtaccg atatgccagc gcagtacttc 3300 ctgccgggta aagcgattgt tcagctggaa gatggcgtac agatcagctc tggtgacacc 3360 ctggcgcgta ttccgcagga atccggcggt accaaggaca tcaccggtgg tctgccgcgc 3420 gttgcggacc tgttcgaagc acgtcgtccg aaagagccgg caatcctggc tgaaatcagc 3480 ggtatcgttt ccttcggtaa agaaaccaaa ggtaaacgtc gtctggttat caccccggta 3540 gacggtagcg atccgtacga agagatgatt ccgaaatggc gtcagctcaa cgtgttcgaa 3600 ggtgaacgtg tagaacgtgg tgacgtaatt tccgacggtc cggaagcgcc gcacgacatt 3660 ctgcgtctgc gtggtgttca tgctgttact cgttacatcg ttaacgaagt acaggacgta 3720 taccgtctgc agggcgttaa gattaacgat aaacacatcg aagttatcgt tcgtcagatg 3780 ctgcgtaaag ctaccatcgt taacgcgggt agctccgact tcctggaagg cgaacaggtt 3840 gaatactctc gcgtcaagat cgcaaaccgc gaactggaag cgaacggcaa agtgggtgca 3900 acttactccc gcgatctgct gggtatcacc aaagcgtctc tggcaaccga gtccttcatc 3960 tccgcggcat cgttccagga gaccactcgc gtgctgaccg aagcagccgt tgcgggcaaa 4020 cgcgacgaac tgcgcggcct gaaagagaac gttatcgtgg gtcgtctgat cccggcaggt 4080 accggttacg cgtaccacca ggatcgtatg cgtcgccgtg ctgcgggtga agctccggct 4140 gcaccgcagg tgactgcaga agacgcatct gccagcctgg cagaactgct gaacgcaggt 4200 ctgggcggtt ctgataacga gtaa 4224 <210> SEQ ID NO. 6 <211> 1105 <212> DNA <213> Escherichia coli KJ122 <220> gldA codiing sequence <223> Other Information: frameshift mutation; insertion of C after base 717 <400> Sequence atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60 ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 120 ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa 180 attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg 240 gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc 300 aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc 360 gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat 420 ctgctgttgc caaataaccc gaatatggtc attgtcgaca ccaaaatcgt cgctggcgca 480 cctgcacgtc tgttagcggc gggtatcggc gatgcgctgg caacctggtt tgaagcgcgt 540 gcctgctctc gtagcggcgc gaccaccatg gcgggcggca agtgcaccca ggctgcgctg 600 gcactggctg aactgtgcta caacaccctg ctggaagaag gcgaaaaagc gatgcttgct 660 gccgaacagc atgtagtgac tccggcgctg gagcgcgtga ttgaagcgaa cacctatctt 720 aagcggtgta ggctttgaaa gtggtggtct ggctgcggcg cacgcagtgc ataacggcct 780 gaccgctatc ccggacgcgc atcactatta tcacggtgaa aaagtggcat ttggtacgct 840 gacgcagctg gttctggaaa acgcaccggt tgaggaaatc gaaaccgtag ctgcacttag 900 ccatgcggta ggtttgccaa taactctcgc tcaactggat attaaagaag atgtcccggc 960 gaaaatgcga attgtggcag aagcggcatg tgcagaaggt gaaaccatcc acaacatgcc 1020 tggcggcgcg acgccagatc aggtttacgc cgctctgctg gtagccgacc agtacggtca 1080 gcgtttcctg caagagtggg aataa 1105 <210> SEQ ID NO. 7 <211> 1417 <212> DNA <213> Escherichia coli KJ122 <220> Feature: dhaM coding sequence <223> Other Information: frameshift mutation; deletion of TS between bases 1256 and 1266 <400> Sequence atggtaaacc tggtcatagt ttcacatagc agccgactgg gagaaggtgt cggtgaatta 60 gcccgtcaga tgttaatgag tgatagttgt aaaatcgcca ttgccgcggg aattgacgat 120 ccacaaaatc ccattggtac cgatgccgtc aaagtgatgg aggccatcga atctgttgct 180 gatgccgacc atgtgctggt catgatggat atgggtagcg cattattgag tgctgaaact 240 gcgctggaat tgctggctcc cgagatcgcc gcaaaagtac gtttgtgtgc tgcgccgttg 300 gtcgaaggta cactggcagc aacggtcagc gcggcctcgg gggcggatat cgacaaagtt 360 atctttgacg ccatgcatgc gctggaagcc aaacgtgaac aactgggttt accgtcctcc 420 gacactgaaa tctctgacac atgtcctgcg tacgatgaag aagcccgttc tctggcggtg 480 gtcataaaaa accgtaacgg cctgcatgta cgtccggcct cccggctggt ttatacctta 540 tcgacattta atgccgatat gttgctggaa aaaaacggca aatgcgtcac accagagagt 600 attaaccaga ttgcgttact acaagttcgc tataacgata cgctgcgcct gattgcgaaa 660 gggccagaag ctgaagaggc actgatcgct ttccgtcagc tggctgaaga taactttggt 720 gaaacggagg aagtcgctcc acctactctg cgtcccgttc cgcctgtttc gggtaaagcc 780 ttttattatc aaccagtttt atgtacggta caggcaaaat caaccctgac cgtggaagaa 840 gaacaagatc gattacgcca ggctattgac ttcacgttat tagatctgat gacgttaaca 900 gcgaaagcag aagccagcgg gcttgacgat attgccgcaa tcttttctgg tcaccataca 960 ctgttagatg atccggaact gctggcggcg gcaagcgaac tccttcagca tgaacattgc 1020 acggcagaat atgcctggca gcaagttctt aaagaactta gccagcaata ccagcaactg 1080 gatgatgaat atctacaagc tcgctatatt gatgtggacg atcttctgca tcgcaccctg 1140 gtccacctga cccaaacgaa agaagaactc ccgcagttta actcgccaac tattctactg 1200 gcggagaaca tttatccttc cacagtactg caactggatc cggcggttgt aaaaggtatc 1260 tgcctgcgcc ggaagtccgg tatcccacag cgccctaatc gcccgtgaac tggggattgg 1320 ctggatttgc cagcagggtg agaaactgta tgcgatacaa ccagaagaaa cgctaacgct 1380 ggacgttaaa acgcaacgtt tcaaccgtca gggttaa 1417 <210> SEQ ID NO. 8 <211> 1767 <212> DNA <213> Escherichia coli KJ122 <220> Feature: ftsI coding region <223> Other Information: missense mutation C619T; R206C <400> Sequence atgaaagcag cggcgaaaac gcagaaacca aaacgtcagg aagaacatgc caactttatc 60 agttggcgtt ttgcgttgtt atgcggctgt attctcctgg cgctggcttt tctgctcgga 120 cgcgtagcgt ggttacaagt tatctccccg gatatgctgg tgaaagaggg cgacatgcgt 180 tctcttcgcg ttcagcaagt ttccacctcc cgcggcatga ttactgaccg ttctggtcgc 240 ccgttagcgg tgagcgtgcc ggtaaaagcg atttgggctg acccgaaaga agtgcatgac 300 gctggcggta tcagcgtcgg tgaccgctgg aaggcgctgg ctaacgcgct caatattccg 360 ctggatcagc tttcagcccg cattaacgcc aacccgaaag ggcgctttat ttatctggcg 420 cgtcaggtga accctgacat ggcggactac atcaaaaaac tgaaactgcc ggggattcat 480 ctgcgtgaag agtctcgccg ttactatccg tccggcgaag tgactgctca cctcatcggc 540 tttactaacg tcgatagtca agggattgag ggcgttgaga agagtttcga taaatggctt 600 accgggcagc cgggtgagtg cattgtgcgt aaagaccgct atggtcgcgt aattgaagat 660 atttcttcta ctgacagcca ggcagcgcac aacctggcgc tgagtattga tgaacgcctg 720 caggcgctgg tttatcgcga actgaacaac gcggtggcct ttaacaaggc tgaatctggt 780 agcgccgtgc tggtggatgt caacaccggt gaagtgctgg cgatggctaa cagcccgtca 840 tacaacccta acaatctgag cggcacgccg aaagaggcga tgcgtaaccg taccatcacc 900 gacgtgtttg aaccgggctc aacggttaaa ccgatggtgg taatgaccgc gttgcaacgt 960 ggcgtggtgc gggaaaactc ggtactcaat accattcctt atcgaattaa cggccacgaa 1020 atcaaagacg tggcacgcta cagcgaatta accctgaccg gggtattaca gaagtcgagt 1080 aacgtcggtg tttccaagct ggcgttagcg atgccgtcct cagcgttagt agatacttac 1140 tcacgttttg gactgggaaa agcgaccaat ttggggttgg tcggagaacg cagtggctta 1200 tatcctcaaa aacaacggtg gtctgacata gagagggcca ccttctcttt cggctacggg 1260 ctaatggtaa caccattaca gttagcgcga gtctacgcaa ctatcggcag ctacggcatt 1320 tatcgcccac tgtcgattac caaagttgac cccccggttc ccggtgaacg tgtcttcccg 1380 gaatccattg tccgcactgt ggtgcatatg atggaaagcg tggcgctacc aggcggcggc 1440 ggcgtgaagg cggcgattaa aggctatcgt atcgccatta aaaccggtac cgcgaaaaag 1500 gtcgggccgg acggtcgcta catcaataaa tatattgctt ataccgcagg cgttgcgcct 1560 gcgagtcagc cgcgcttcgc gctggttgtt gttatcaacg atccgcaggc gggtaaatac 1620 tacggcggcg ccgtttccgc gccggtcttt ggtgccatca tgggcggcgt attgcgtacc 1680 atgaacatcg agccggatgc gctgacaacg ggcgataaaa atgaatttgt gattaatcaa 1740 ggcgagggga caggtggcag atcgtaa 1767 <210> SEQ ID NO. 9 <211> 77 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer BY60 <400> Sequence caggaaacgc tgaccgtact ggtcggctac cagcagagcg gcgtaaacct gtgacggaag 60 atcacttcgc agaataa 77 <210> SEQ ID NO. 10 <211> 76 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer BY61 <400> Sequence gtgagtttga ccgctatctg ctgttgccaa ataacccgaa tatggtcatt gaagcacttc 60 actgacaccc tcatca 76 <210> SEQ ID NO. 11 <211> 79 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Priemr BY62 <400> Sequence tctctggcgg tggtcataaa aaaccgtaac ggcctgcatg tacgtccggc gtgacggaag 60 atcacttcgc agaataaat 79 <210> SEQ ID NO. 12 <211> 76 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer BY63 <400> Sequence aaccctgacg gttgaaacgt tgcgttttaa cgtccagcgt tagcgtttct gaagcacttc 60 actgacaccc tcatca 76 <210> SEQ ID NO. 13 <211> 28 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer AC16 <400> Sequence gcattgtctg ttatctacac cgatgagg 28 <210> SEQ I D NO. 14 <211> 22 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer AC17 <400> Sequence tcccactctt gcaggaaacg ct 22 <210> SEQ ID NO. 15 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer AC33 <400> Sequence gactgggaga aggtgtcggt gaat 24 <210> SE ID NO. 16 <211> 29 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer AC34 <400> Sequence catcattaaa cagcggccct aataaaata 29 <210> SEQ ID NO. 17 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 91A <400> Sequence aaacgccaat gcccaggcgc tggcaactca ggttagcgac accattggcg tggtggtgat 60 ctagcgcatg catccattta 80 <210> SEQ ID NO. 18 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 91B <400> Sequence aatcaacgca ttacaacgct ggcgaattaa cacctcaatg gcgtgacgct ctttttccgc 60 ggcgaagaac tccagcatga 80 <210> SEQ ID NO. 19 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 90A <400> Sequence gaataacagc acgctggtca 20 <210> SEQ ID NO.20 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 90B <400> Sequence tcaacgcact catccagcct 20 <210> SEQ ID NO. 21 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 60A <400> Sequence atgtccagaa ggcttcgcag aacaaaaatc gttaccacgt taggcccagc aacagatcgc 60 gacggaagat cacttcgcag 80 <210> SEQ ID NO. 22 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 60B <400> Sequence ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc acggtactca tcacgtcgcc 60 aagaaataaa agaaaatgcc 80 <210> SEQ ID NO. 23 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 59A <400> Sequence tacatgtcca gaaggcttcg 20 <210> SEQ ID NO.24 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 59B <400> Sequence catccggcaa cgtacttact 20 <210> SEQ I D NO.25 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 75A <400> Sequence ccaggacgat ccttgcgctt tacccatcag cccgtataat cctccacccg gcgcgccatg 60 ctagcgcatg catccattta 80 <210> SEQ ID NO. 26 <211> 81 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 75B <400> Sequence ccgcgctttt ccgcaccttt tcgcagggaa aatgtacgac ctcacaccag tggaaaccag 60 cggcgaagaa ctccagcatg a 81 <210> SEQ ID NO,27 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 76A <400> Sequence ccaggacgat ccttgcgctt tacccatcag cccgtataat cctccacccg gcgcgccatg 60 ccgattacac caaccacaac 80 <210> SEQ ID NO. 28 <211> 81 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 76B <400> Sequence ccgcgctttt ccgcaccttt tcgcagggaa aatgtacgac ctcacaccag tggaaaccag 60 cggcgaattt catagctttc c 81 <210> SEQ ID No. 29 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 60A <400> Sequence atgtccagaa ggcttcgcag aacaaaaatc gttaccacgt taggcccagc aacagatcgc 60 gacggaagat cacttcgcag 80 <210> SEQ ID NO.30 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 60B <400> Sequence ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc acggtactca tcacgtcgcc 60 aagaaataaa agaaaatgcc 80 <210> SEQ ID No. 31 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 67A <400> Sequence ggctgggacg gaagtcgctg tcgttctcaa aatcggtgga gctgcatgac aaggtcatcg 60 gacggaagat cacttcgcag 80 <210> SEQ ID NO. 32 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 67B <400> Sequence atggagcaga ttagcggtta accctgctat ttgcctgata aatctaaaac ccggtaagca 60 aagaaataaa agaaaatgcc 80 <210> SEQ ID NO. 33 <211> 7929 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> FEATURE: cat sacB, amp; PLasmid template for PCR of cat-sacB cassette <221> misc_feature <222> (1545)..(1545) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (3474)..(3475) <223> n is a, c, g, or t <400> Sequence tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420 actctagagg atccccgggt accgagctcg aattcccgcg cccgatgaat tgatccgaag 480 ttcctattct ctagaaagta taggaacttc gaattgtcga caagctagca tgtgacggaa 540 gatcacttcg cagaataaat aaatcctggt gtccctgttg ataccgggaa gccctgggcc 600 aacttttggc gaaaatgaga cgttgatcgg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat 660 gaaataagat cactaccggg cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa 720 gctaaaatgg agaaaaaaat cactggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt 780 aaagaacatt ttgaggcatt tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag 840 ctggatatta cggccttttt aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc 900 tttattcaca ttcttgcccg cctgatgaat gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa 960 gacggtgagc tggtgatatg ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa 1020 actgaaacgt tttcatcgct ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac 1080 atatattcgc aagatgtggc gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt 1140 attgagaata tgtttttcgt ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta 1200 aacgtggcca atatggacaa cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg 1260 caaggcgaca aggtgctgat gccgctggcg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc 1320 ttccatgtcg gcagaatgct taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg 1380 gcgtaatttt tttaaggcag ttattggtgc ccttaaacgc ctggtgctac gcctgaataa 1440 gtgataataa gcggatgaat ggcagaaatt cgaaagcaaa ttcgacccgg tcgtcggttc 1500 agggcagggt cgttaaatag ccgcttatgt ctattgctgg tttantcggt acccggggat 1560 cgcggccgcg gaccggatcc catcacatat acctgccgtt cactattatt tagtgaaatg 1620 agatattatg atattttctg aattgtgatt aaaaaggcaa ctttatgccc atgcaacaga 1680 aactataaaa aatacagaga atgaaaagaa acagatagat tttttagttc tttaggcccg 1740 tagtctgcaa atccttttat gattttctat caaacaaaag aggaaaatag accagttgca 1800 atccaaacga gagtctaata gaatgaggtc gaaaagtaaa tcgcgcgggt ttgttactga 1860 taaagcaggc aagacctaaa atgtgtaaag ggcaaagtgt atactttggc gtcacccctt 1920 acatatttta ggtctttttt tattgtgcgt aactaacttg ccatcttcaa acaggagggc 1980 tggaagaagc agaccgctaa cacagtacat aaaaaaggag acatgaacga tgaacatcaa 2040 aaagtttgca aaacaagcaa cagtattaac ctttactacc gcactgctgg caggaggcgc 2100 aactcaagcg tttgcgaaag aaacgaacca aaagccatat aaggaaacat acggcatttc 2160 ccatattaca cgccatgata tgctgcaaat ccctgaacag caaaaaaatg aaaaatatca 2220 agttcctgaa ttcgattcgt ccacaattaa aaatatctct tctgcaaaag gcctggacgt 2280 ttgggacagc tggccattac aaaacgctga cggcactgtc gcaaactatc acggctacca 2340 catcgtcttt gcattagccg gagatcctaa aaatgcggat gacacatcga tttacatgtt 2400 ctatcaaaaa gtcggcgaaa cttctattga cagctggaaa aacgctggcc gcgtctttaa 2460 agacagcgac aaattcgatg caaatgattc tatcctaaaa gaccaaacac aagaatggtc 2520 aggttcagcc acatttacat ctgacggaaa aatccgttta ttctacactg atttctccgg 2580 taaacattac ggcaaacaaa cactgacaac tgcacaagtt aacgtatcag catcagacag 2640 ctctttgaac atcaacggtg tagaggatta taaatcaatc tttgacggtg acggaaaaac 2700 gtatcaaaat gtacagcagt tcatcgatga aggcaactac agctcaggcg acaaccatac 2760 gctgagagat cctcactacg tagaagataa aggccacaaa tacttagtat ttgaagcaaa 2820 cactggaact gaagatggct accaaggcga agaatcttta tttaacaaag catactatgg 2880 caaaagcaca tcattcttcc gtcaagaaag tcaaaaactt ctgcaaagcg ataaaaaacg 2940 cacggctgag ttagcaaacg gcgctctcgg tatgattgag ctaaacgatg attacacact 3000 gaaaaaagtg atgaaaccgc tgattgcatc taacacagta acagatgaaa ttgaacgcgc 3060 gaacgtcttt aaaatgaacg gcaaatggta cctgttcact gactcccgcg gatcaaaaat 3120 gacgattgac ggcattacgt ctaacgatat ttacatgctt ggttatgttt ctaattcttt 3180 aactggccca tacaagccgc tgaacaaaac tggccttgtg ttaaaaatgg atcttgatcc 3240 taacgatgta acctttactt actcacactt cgctgtacct caagcgaaag gaaacaatgt 3300 cgtgattaca agctatatga caaacagagg attctacgca gacaaacaat caacgtttgc 3360 gccaagcttc ctgctgaaca tcaaaggcaa gaaaacatct gttgtcaaag acagcatcct 3420 tgaacaagga caattaacag ttaacaaata aaaacgcaaa agaaaatgcc gatnnccggt 3480 ttattgacta ccggaagcag tgtgaccgtg tgcttctcaa atgcctcagg ctgtctatgt 3540 gtgactgttg agctgtaaca agttgtctca ggtgttcaat ttcatgttct agttgctttg 3600 ttttactggt ttcacctgtt ctattaggtg ttacatgctg ttcatctgtt acattgtcga 3660 tctgttcatg gtgaacagct ttaaatgcac caaaaactcg taaaagctct gatgtatcta 3720 tcttttttac accgttttca tctgtgcata tggacagttt tccctttgat gctagcttgc 3780 atgcctgcag gtcgactcta gaggatcccc gtactatcaa caggttgaac tgcggatctt 3840 gcggccagct ttatgcttgt aaaccgtttt gtgaaaaaat ttttaaaata aaaaagggga 3900 cctctagggt ccccaattaa ttagtaatat aatctattaa aggtcattca aaaggtcatc 3960 caccggatca attcccctgc tcgcgcaggc tgggtgccaa gctctcgggt aacatcaagg 4020 cccgatcctt ggagcccttg ccctcccgca cgatgatcgt gccgtgatcg aaatccagat 4080 ccttgacccg cagttgcaaa ccctcactga tccggctcac ggtaactgat gccgtatttg 4140 cagtaccagc gtacggccca cagaatgatg tcacgctgaa aatgccggcc tttgaatggg 4200 ttcatgtgca gctccatcag caaaagggga tgataagttt atcaccaccg actatttgca 4260 acagtgccgt tgatcgtgct atgatcgact gatgtcatca gcggtggagt gcaatgtcgt 4320 gcaatacgaa tggcgaaaag ccgagctcat cggtcagctt ctcaaccttg gggttacccc 4380 cggcggtgtg ctgctggtcc acagctcctt ccgtagcgtc cggcccctcg aagatgggcc 4440 acttggactg atcgaggccc tgcgtgctgc gctgggtccg ggagggacgc tcgtcatgcc 4500 ctcgtggtca ggtctggacg acgagccgtt cgatcctgcc acgtcgcccg ttacaccgga 4560 ccttggagtt gtctctgaca cattctggcg cctgccaaat gtaaagcgca gcgcccatcc 4620 atttgccttt gcggcagcgg ggccacaggc agagcagatc atctctgatc cattgcccct 4680 gccacctcac tcgcctgcaa gcccggtcgc ccgtgtccat gaactcgatg ggcaggtact 4740 tctcctcggc gtgggacacg atgccaacac gacgctgcat cttgccgagt tgatggcaaa 4800 ggttccctat ggggtgccga gacactgcac cattcttcag gatggcaagt tggtacgcgt 4860 cgattatctc gagaatgacc actgctgtga gcgctttgcc ttggcggaca ggtggctcaa 4920 ggagaagagc cttcagaagg aaggtccagt cggtcatgcc tttgctcggt tgatccgctc 4980 ccgcgacatt gtggcgacag ccctgggtca actgggccga gatccgttga tcttcctgca 5040 tccgccagag ggcgggatgc gaagaatgcg atgccgctcg ccagtcgatt ggctgagctc 5100 atgagcggag aacgagatga cgttggaggg gcaaggtcgc gctgattgct ggggcaacac 5160 gtgaaaggcg agatcaccaa ggtagtcggc aaataatgtc taacaattcg ttcaagccga 5220 cgccgcttcg cggcgcggct taactcaagc gttagatgca ctaagcacat aattgctcac 5280 agccaaacta tcaggtcaag tctgctttta ttatttttaa gcgtgcataa taagccctac 5340 acaaattggg agatatatca tgaaaggctg gctttttctt gttatcgcaa tagttggcga 5400 agtaatcgca acatccgcat taaaatctag cgagggcttt actaagctga tccggtggat 5460 gaccttttga atgaccttta atagattata ttactaatta attggggacc ctagaggtcc 5520 ccttttttat tttaaaaatt ttttcacaaa acggtttaca agcataaagc tcgatgaatt 5580 gatccgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttcg aattgtcgac aagctccccg 5640 gggagcttga tctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcgt 5700 aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 5760 tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 5820 taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 5880 aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 5940 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 6000 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 6060 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 6120 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 6180 caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 6240 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 6300 ctcaaagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 6360 gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 6420 agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 6480 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 6540 acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 6600 gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 6660 gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 6720 cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 6780 caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 6840 gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 6900 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 6960 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 7020 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 7080 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 7140 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 7200 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 7260 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 7320 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 7380 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 7440 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 7500 cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 7560 tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 7620 gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 7680 atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 7740 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 7800 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 7860 acgtctaaga aaccattatt atgatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 7920 cctttcgtc 7929 <210> SEQ ID NO. 34 <211> 4163 <212> DNA <213> Escherichia coli KJ122 <220> Feature: kan, sacB <223> Other Information: Plasmid template fro PCR of kan-sacB <400> Sequence tcgagaggcc tgacgggatt taaatcgcta gcgggctgct aaaggaagcg gaacacgtag 60 aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg ggctatctgg 120 acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct tacatggcga 180 tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc 240 tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc 300 tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt 360 gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat 420 gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 480 gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac 540 gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac 600 gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc 660 ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg 720 ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 780 cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat 840 caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag 900 gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc 960 ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 1020 ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 1080 ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 1140 ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat 1200 cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc 1260 gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacg 1320 ctagtttaaa caccccgagt ccactgagcg tcagacccct taataagatg atcttcttga 1380 gatcgttttg gtctgcgcgt aatctcttgc tctgaaaacg aaaaaaccgc cttgcagggc 1440 ggtttttcga aggttctctg agctaccaac tctttgaacc gaggtaactg gcttggagga 1500 gcgcagtcac caaaacttgt cctttcagtt tagccttaac cggcgcatga cttcaagact 1560 aactcctcta aatcaattac cagtggctgc tgccagtggt gcttttgcat gtctttccgg 1620 gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcggactgaa cggggggttc 1680 gtgcatacag tccagcttgg agcgaactgc ctacccggaa ctgagtgtca ggcgtggaat 1740 gagacaaacg cggccataac agcggaatga caccggtaaa ccgaaaggca ggaacaggag 1800 agcgcacgag ggagccgcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 1860 gccaccactg atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc aggggggcgg agcctatgga 1920 aaaacggctt tgccgcggcc ctctcacttc cctgttaagt atcttcctgg catcttccag 1980 gaaatctccg ccccgttcgt aagccatttc cgctcgccgc agtcgaacga ccgagcgtag 2040 cgagtcagtg agcgaggaag cggaatatat cctgtatcac atattctgct gacgcaccgg 2100 tgcagccttt tttctcctgc cacatgaagc acttcactga caccctcatc agtgccaaca 2160 tagtaagcca gtatacactc cgctagcgca tgcatccatt taaatggaag aaataaaaga 2220 aaatgccaat aggatattgg cattttcttt tgcgttttta tttgttaact gttaattgtc 2280 cttgttcaag gatgctgtct ttgacaacag atgttttctt gcctttgatg ttcagcagga 2340 agctcggcgc aaacgttgat tgtttgtctg cgtagaatcc tctgtttgtc atatagcttg 2400 taatcacgac attgtttcct ttcgcttgag gtacagcgaa gtgtgagtaa gtaaaggtta 2460 catcgttagg atcaagatcc atttttaaca caaggccagt tttgttcagc ggcttgtatg 2520 ggccagttaa agaattagaa acataaccaa gcatgtaaat atcgttagac gtaatgccgt 2580 caatcgtcat ttttgatccg cgggagtcag tgaacaggta ccatttgccg ttcattttaa 2640 agacgttcgc gcgttcaatt tcatctgtta ctgtgttaga tgcaatcagc ggtttcatca 2700 cttttttcag tgtgtaatca tcgtttagct caatcatacc gagagcgccg tttgctaact 2760 cagccgtgcg ttttttatcg ctttgcagaa gtttttgact ttcttgacgg aagaatgatg 2820 tgcttttgcc atagtatgct ttgttaaata aagattcttc gccttggtag ccatcttcag 2880 ttccagtgtt tgcttcaaat actaagtatt tgtggccttt atcttctacg tagtgaggat 2940 ctctcagcgt atggttgtcg cctgagctgt agttgccttc atcgatgaac tgctgtacat 3000 tttgatacgt ttttccgtca ccgtcaaaga ttgatttata atcctctaca ccgttgatgt 3060 tcaaagagct gtctgatgct gatacgttaa cttgtgcagt tgtcagtgtt tgtttgccgt 3120 aatgtttacc ggagaaatca gtgtagaata aacggatttt tccgtcagat gtaaatgtgg 3180 ctgaacctga ccattcttgt gtttggtctt ttaggataga atcatttgca tcgaatttgt 3240 cgctgtcttt aaagacgcgg ccagcgtttt tccagctgtc aatagaagtt tcgccgactt 3300 tttgatagaa catgtaaatc gatgtgtcat ccgcattttt aggatctccg gctaatgcaa 3360 agacgatgtg gtagccgtga tagtttgcga cagtgccgtc agcgttttgt aatggccagc 3420 tgtcccaaac gtccaggcct tttgcagaag agatattttt aattgtggac gaatcaaatt 3480 cagaaacttg atatttttca tttttttgct gttcagggat ttgcagcata tcatggcgtg 3540 taatatggga aatgccgtat gtttccttat atggcttttg gttcgtttct ttcgcaaacg 3600 cttgagttgc gcctcctgcc agcagtgcgg tagtaaaggt taatactgtt gcttgttttg 3660 caaacttttt gatgttcatc gttcatgtct ccttttttat gtactgtgtt agcggtctgc 3720 ttcttccagc cctcctgttt gaagatggca agttagttac gcacaataaa aaaagaccta 3780 aaatatgtaa ggggtgacgc caaagtatac actttgccct ttacacattt taggtcttgc 3840 ctgctttatc agtaacaaac ccgcgcgatt tacttttcga cctcattcta ttagactctc 3900 gtttggattg caactggtct attttcctct tttgtttgat agaaaatcat aaaaggattt 3960 gcagactacg ggcctaaaga actaaaaaat ctatctgttt cttttcattc tctgtatttt 4020 ttatagtttc tgttgcatgg gcataaagtt gcctttttaa tcacaattca gaaaatatca 4080 taatatctca tttcactaaa taatagtgaa cggcaggtat atgtgatggg ttaaaaagga 4140 tcggcggccg ctcgatttaa atc 4163 <210> SEQ ID NO. 35 <211> 3350 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> Feature: pykF coding region <223> Other Information: Sequence use for deletion of pykF <400> Sequence gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat 60 acattcctct gcacgctttt tcgatgtcac ctatccttag agcgaggcac caccactttc 120 gtaataccgg attcgctttc cggcagtgcg cccagaaagc aagtttctcc catccttctc 180 aacttaaaga ctaagactgt catgaaaaag accaaaattg tttgcaccgc atctgttcac 240 gtcctgtaat attgcttttg tgaattaatt tgtatatcga agcgccctga tgggcgcttt 300 ttttatttaa tcgataacca gaagcaataa aaaatcaaat cggatttcac tatataatct 360 cactttatct aagatgaatc cgatggaagc atcctatcac tagtgaattc gcggccgcct 420 gcaggtcgac catatgggag agctcccaac gcgttggatg catagcttga gtattctata 480 gtgtcaccta aatagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 540 tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 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aaaccaccgc 1440 tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 1500 agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 1560 agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 1620 atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 1680 cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 1740 actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 1800 aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 1860 cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 1920 ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 1980 cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 2040 ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 2100 cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 2160 ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 2220 tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 2280 ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 2340 aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 2400 gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 2460 gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 2520 ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 2580 catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 2640 atttccccga aaagtgccac ctgatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 2700 aataccgcat caggaaattg taagcgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg 2760 ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa 2820 agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa 2880 gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg 2940 tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa 3000 ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa 3060 ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct 3120 gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca 3180 ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag 3240 ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag 3300 tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata 3350 <210> SEQ ID NO.36 <211> 78 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 87A <400> Sequence atgaaaaaga ccaaaattgt ttgcaccatc ggaccgaaaa ccgaatctga agagatgtct 60 agcgcatgca tccattta 78 <210> SEQ ID NO. 37 <211> 79 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 87B <400> Sequence ttacaggacg tgaacagatg cggtgttagt agtgccgctc ggtaccagtg caccagaaag 60 gcgaagaact ccagcatga 79 <210> SEQ ID NO. 38 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 78A <400> Sequence acacattcct ctgcacgctt 20 <210> SEQ ID NO. 39 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic DNA <220> Feature: PCR Primer 78B <400> Sequence aggatgcttc catcggattc 20

Claims

비-자연적으로 발생하는 미생물의 자연적으로 발생하는 야생형 대응부 (counterpart)에서의 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 효소 활성에 비해 증가된 수준의 내인성 pck 유전자에 의해 인코딩된 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 효소 활성 및 피루베이트 키나제 효소 활성의 감소된 수준을 유발하는 pykA 유전자 또는 그의 상동체에서의 돌연변이를 포함하는 비-자연적으로 발생하는 미생물에 있어서, 상기 증가된 수준의 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 효소 활성은 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 효소의 활성을 증가시키는 돌연변이로부터 기인하는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
비-자연적으로 발생하는 미생물의 자연적으로 발생하는 야생형 대응부에서의 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 효소 활성에 비해 증가된 수준의 내인성 pck 유전자에 의해 인코딩된 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 효소 활성은, 내인성 pck 유전자의 프로모터 영역에서의 돌연변이 또는 상기 내인성 pck 유전자의 프로모터 영역과 상호작용하는 것으로 알려진 하나 이상의 조절 요소의 유전자 조작 중 어느 하나에 기인한 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
포스포에놀 피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템의 기능성을 저하시키는 하나 이상의 유전자 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
(a) 포스포에놀 피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템의 기능성을 저하시키는 하나 이상의 유전자 변형; 및
(b) 비-포스포트랜스퍼라제 시스템 당 이송자의 활성을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 4항에 있어서,
상기 비-포스포트랜스퍼라제 시스템 당 이송자는 갈락토오스 퍼미아제 (galactose permease)인 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 5항에 있어서,
상기 갈락토오스 퍼미아제의 활성의 증가는 상기 갈락토오스 퍼미아제를 코딩하는 galP 유전자의 복제 수를 증가시키는 것에 의하여 달성되는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 5항에 있어서,
상기 갈락토오스 퍼미아제의 활성의 증가는, 하나 이상의 돌연변이를 통해 상기 galP 유전자 억제자의 음성 조절을 완화하는 것에 의하여 달성되는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 7항에 있어서,
상기 갈락토오스 퍼미아제의 억제자는 galS 또는 galR 유전자에 의하여 인코딩되는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
락테이트 디하이드로게나제 A(lactate dehydrogenases A), 피루베이트 포메이트 리아제(pyruvate formate lyase), 알콜 디하이드로게나제 E(alcohol dehydrogenase E), 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase), 아세테이트 키나제 A(acetate kinase A) 및 피루베이트 옥시다제 B(pyruvate oxidase B)로 이루어진 군으로부터 선택된 발효적 경로에 관련된 유전자들 중 적어도 하나의 기능성을 저하시키는 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
트리카르복실산 회로의 작동과 관련된 말레이트 디하이드로게나제(malate dehydrogenase) 유전자에서의 돌연변이를 더 포함하되, 상기 돌연변이는 말레이트 디하이드로게나제 효소 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
RNA 폴리머라제의 알파 서브유닛을 인코딩하는 서열번호: 4로 제시된 rpoA 유전자에서의 돌연변이를 더 포함하되, 상기 돌연변이는 상기 rpoA 유전자의 뉴클레오티드 위치 956에서 시토신 잔기를 티민 잔기로 치환하는 점 돌연변이이며, 이에 의하여 상기 RNA 폴리머라아제의 알파 서브유닛의 아미노산 위치 322에서 프롤린 잔기가 류신 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
RNA 폴리머라제의 서브유닛을 인코딩하는 서열번호: 5로 제시된 rpoC 유전자에서의 돌연변이를 더 포함하되, 상기 돌연변이는 상기 rpoC 유전자의 뉴클레오티드 위치 2241에서 구아닌 잔기를 아데닌 잔기로 치환하는 점 돌연변이이며, 이에 의하여 상기 RNA 폴리머라아제의 서브유닛의 아미노산 위치 747에서 메티오닌 잔기가 이소류신 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 미생물의 염색체 DNA 내에서의 결실을 더 포함하되, 상기 결실은 ydcC , ydcD, ydcE , 및 ydcF 유전자를 제거하는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
세포벽 합성 및 세포 분리에 관련된 단백질을 코딩하는 서열번호: 8로 제시된 ftsI 유전자에서의 돌연변이를 더 포함하되, 상기 돌연변이는 상기 ftsI 유전자의 뉴클레오티드 위치 619에서 시토신 잔기를 티민 잔기로 치환하는 것이며, 이에 의하여 상기 세포벽 합성 및 세포 분리에 관련된 단백질의 아미노산 위치 207에서 아르기닌 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
글리세롤 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 서열번호: 6으로 제시된 gldA 유전자에서의 돌연변이를 더 포함하되, 상기 돌연변이는 상기 글리세롤 디하이드로게나제 효소 활성의 감소를 유발하는 틀 이동 돌연변이(frame shift mutation)인 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
제 1항에 있어서,
포스포트랜스퍼라제-의존성 디하이드록시아세톤 키나제 효소의 서브유닛을 인코딩하는 서열번호: 7로 제시된 dhaM 유전자에서의 돌연변이를 더 포함하되, 상기 돌연변이는 상기 포스포트랜스퍼라제-의존성 디하이드록시아세톤 키나제 효소 활성의 감소를 유발하는 틀 이동 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 비-자연적으로 발생하는 미생물.
(a) 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계;
(b) 탄소원을 제공하는 단계;
(c) 상기 미생물이 상기 탄소원을 대사하도록 허용하는 단계; 및
(d) 임으로, 숙신산을 분리하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 숙신산을 생산하는 방법.