KR20160097881A - 금나노입자 및 자성비드입자를 이용한 비-증폭 dna 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 제조하는 단계;(b) 금나노입자(Gold Nanoparticle; GNP)에 상기 (a) 단계에서 제조된 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 결합하는 단계; (c) 자성비드입자(Magnetic Bead Particle; MP)에 상기 (a) 단계에서 제조된 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 결합하는 단계; (d) 상기 (b) 단계 및 (c) 단계에서 제조된 물질과 표적 DNA의 샌드위치 포메이션(sandwich formation) 형태의 DNA 결합을 유도하는 단계; 및 (e) 은 증강 검출(silver enhancement)을 이용하여 표적 DNA를 검출하는 단계를 포함하는, 비-증폭 DNA 검출방법에 관한 것으로, 검출 한도를 높여 미량 존재하는 질병 관련 유전자로부터 특징적인 유전정보를 빠른 시간 내에 안정적으로 수집하여 분석함으로써 질병의 조기 진단 가능성을 높이는 효과가 있으므로, 의료산업분야, 분자진단산업분야 등에 널리 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 나노입자 기반의 센싱 플랫폼은 표준화하기 쉽고 공정 순서를 확립하기에 용이하므로, 진단기기의 소형화 연구에 기초적인 기반 기술을 마련할 수 있으며, 고감도/다중감지재료 및 센싱기법에 대한 원천기술과 정보통신기술의 융합을 통하여 유비쿼터스한 센싱 시스템 개발에 활용될 수 있다. 이를 통해, 질병 관련 물질의 검출뿐만 아니라, 환경 유해인자 등 여러 물질을 검출하기 위한 기술로 응용될 수 있다.

Description

금나노입자 및 자성비드입자를 이용한 비-증폭 DNA 검출방법{Non-Amplification Method for DNA Detection Using Gold Nanoparticle and Magnetic Bead Particle}

본 발명은 (a) 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 제조하는 단계; (b) 금나노입자(Gold Nanoparticle; GNP)에 상기 (a) 단계에서 제조된 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 결합하는 단계; (c) 자성비드입자(Magnetic Bead Particle; MP)에 상기 (a) 단계에서 제조된 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 결합하는 단계; (d) 상기 (b) 단계 및 (c) 단계에서 제조된 물질과 표적 DNA의 샌드위치 포메이션(sandwich formation) 형태의 DNA 결합을 유도하는 단계; 및 (e) 은 증강 검출(silver enhancement)을 이용하여 표적 DNA를 검출하는 단계를 포함하는, 비-증폭 DNA 검출방법에 관한 것이다.

고령화 및 웰빙 시대를 맞이하여 질병의 치료보다는 조기 진단을 통한 사전 예방의 중요성이 부각되고 있으며, 이를 위해 검출 장비의 고감도와 정확성뿐만 아니라 휴대성을 갖춘 질병 진단용 검출 장비의 개발이 요구되고 있다. 또한, 분자진단 시장은 여러 분야의 접목으로 기술적 진일보가 확연한 시장으로, 실시간 PCR의 단점을 보완한 제품들이 개발, 출시되고 있는 실정이다.

특정 염기 서열을 갖는 DNA의 검출은 병원성 질병이나 유전성 질병을 진단에 응용될 수 있기 때문에 많은 관심을 받고 있다. 기술적 측면에서 치료에 머물렀던 과거 의료기술에서 예측 또는 예방 중심의 의료기술로 기술개발의 패러다임이 전환되고 있으며, 질환별 유전자 검사와 같은 신개념 진단법 개발을 시작으로, 개개인의 유전적 차이에 대한 치료법을 적용하는 맞춤치료 실현을 위한 기술의 개발을 필요로 하고 있다.

최근 질병의 조기 진단에 대한 관심이 높아지면서 관련 의료 사업 및 새로운 진단 방법에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 특히 진단, 약물전달, 나노구조물, 질병치료 등 다양한 분야에서 나노입자의 유용성이 입증되면서 나노입자를 이용한 다양한 진단 기법이 개발되고 있다. 대한민국 등록특허공보 제10-1062183호에는 나노입자를 이용한 단백질 정량 방법이 개시되어 있다. 이러한 방법은 정량에 있어서 항체를 필요로 하고, 이에 따라 일정하게 반응성을 유지할 수 없는 문제점이 있다.

의학산업을 포함한 생명산업의 지대한 발전과 더불어 현재 생명분야를 포함한 다양한 학계 및 산업 기반에서 가장 주목받고 있고 발전을 거듭하고 있는 분야 중 하나인 현장 진단(Point of care; POC) 관련 연구는 유기물인 생물체의 특정한 기능을 가지는 효소, 단백질, 항체, DNA, 미생물, 동식물 세포/기관, 신경세포와 같은 생체 물질을 실리콘, 유리, 고분자로 구성된 매니폴드(manifold)에 조합시킴으로써, 사용 목적에 맞게 재설계된 디바이스로서, 1970년대에 생물조직체가 가지고 있는 새로운 기능, 즉, 다중처리 기능, 무한대의 기억기능, 자기 조립기능을 응용하기 위하여 시작되었으며, 생체물질의 특이 반응을 이용한 질병진단 및 생물물질 분석 및 측정에 많은 발전을 보이고 있다. 전자공학, 화학, 생물학 등 과학 전반에 걸친 기술을 융합할 수 있는 미래형 융합산업으로 높은 성장성이 전망되고 있으며, 미래의 유망 산업 중 하나로 각광받고 있다.

POC의 장점은 다른 분석방법과는 달리 현장에서 직접 측정하고자 하는 시료와 반응하여 신속하고 정확하게 물질을 분석하는 데 있다. 또한 분석 물질에 대해 신속하고 정확한 검출이 가능하여 의료 분야의 질병 진단의 감지 한계 축소, 측정의 단순화, 신속화, 민감성을 향상시킬 수 있다. 특정 물질에 대한 인식 과정이 가역적으로 진행되어 연속적인 측정이 가능하며 생체 감지 물질에 의해 분석 물질만 선택적으로 검출 가능하다.

POC에서 바이오 리셉터가 측정하고자 하는 물질을 선택적으로 검출하여 검출 신호로 보여주는 능력인 선택성(Selectivity), 어느 농도(밀도) 범위까지 분석 물질(analyte)을 측정할 수 있는 지에 대한 측정 한계(Detection Limit)를 나타내는 측정 범위(Range & Linear Range), 스탠다드 시험(Standard Test)을 통해 일정기간 이후에 효소와 같은 생체 감지 물질의 활동성을 검증할 수 있는 재현성(Reproducibility), 생화학적 반응 이후에 측정 결과가 나오기까지의 반응시간(Response Time), 및 유기 물질의 기능이 시간이 지남에 따라 퇴화하면서 발생하는 바이오 센서의 수명(Life Time Limits) 문제 측면의 연구가 요구되고 있다.

최근 들어 POC로서 바이오칩은 빠르고 저렴하면서도 정확하게 질병을 진단하는 분석 시스템뿐만 아니라, 바이오 신약을 개발하고 맞춤형 치료를 위한 대용량 고속 분석 분야에까지 점차로 응용 영역이 넓어지고 있으며 이러한 혁신적인 진단 및 분석 시스템은 다양한 학제 간 협력과 새로운 원리개발에 힘입어 빠른 속도로 발전하고 있기 때문에, 바이오칩 초기에 연구되었던 DNA 칩뿐만 아니라, 단백질 칩, 세포칩 등 다양한 칩을 개발하고 응용된다. 예를 들면, 패혈증이나, 성병 또는 간염 등 박테리아나 바이러스 감염 등의 유무를 검사하기 위해서는 DNA/RNA 칩이 주로 사용되고, 단백질 바이오마커가 존재하는 암을 포함한 종양관련 질환이나 심장질환 질병은 DNA 칩을 이용하기도 하나, 단백질 칩을 주로 이용한다. 최근에 특정한 질병에 관련하여 맞춤형 치료를 위한 치료제 개발에는 자신의 세포를 이용한 세포 칩을 이용한다. 이러한 다양한 바이오칩 분야에서 최근에 중요성이 부각되는 분야는 다시료 동시측정이 가능한 마이크로어레이 분야, 극저농도 측정을 위한 나노기술을 이용한 나노-센서 분야, 측정 및 분석이 전 공정으로 이루어지는 랩온어칩(lab-on-a-chip) 분야이다.

랩온어칩을 이용한 질병 진단용 검출 장비는 바이오칩을 이용하여 임상실험 등에서 사용되기 위해서 피, 소변, 침과 같은 최초의 시료에서 측정 신호를 얻을 때까지의 필요한 전공정을 완전 자동화하여 사용하기 편리하게 한 바이오칩으로써, 이를 위해서는 단위 칩 상에 시료 분석에 필요한 모든 구성요소가 포함되어야 하고, 각각의 구성요소는 마이크로 플루이딕 도관을 통해 연결되어 있어야 한다. 이를 위한 연구 결과 및 상업적인 성과물은 생물체 분석에서 적은 양의 시료 (<1μL)를 사용하고, 분석 시 사용되는 시약의 양 또한 감소시켜 한 시료당 요구되는 분석 비용을 절감할 수 있게 한다.

침, 소변, 혈액 등 인간 신체에서 제공할 수 있는 시료나 식수 등 각종 생활 환경 내에 존재하는 감염성 병원균 및 바이러스를 측정하기 위해서는 DNA/RNA 등의 핵산을 이용하는 핵산기반기술(Gene-based technology)과 특이 항체를 이용하는 항체기반기술(Antibody-based technology)로 구분되는 분자진단방법이 주로 이용된다. 항체기반기술과 달리 핵산기반기술은 PCR(Polymerase Chain Reaction)의 강력한 시료증폭기술에 의해 진단 감도를 높일 수 있어 DNA를 주로 이용하는 측정 기술이 고감도 병원균 유무 측정에 주로 사용된다. 이러한 DNA를 이용한 분자진단 시장은 현재 DNA 칩 어레이를 비롯하여 실시간 PCR 기기로 양분된다. 이러한 방법은 기존의 박테리아 및 감염성 박테리아를 측정하는 대표적인 방법인 존재-부존재법(Presense-Absence Method), 최대-선호-수법(Most-Propable-Number Method), MMOMUG(minimal medium o-nitrophenyl-β-galactosidase-4-methylumbelliferyl -β-D-glucuronide)법, 막여과법(Membrane filter(MF) Method) 등이, 정확하기는 하나, 측정 시간이 오래 걸리고, 형태학적인 방법에 의존한 동정방법에 의해 결과 해석이 어렵다는 단점을 극복하기 위해 고안되었다.

핵산기반기술을 이용하여 박테리아 및 바이러스를 측정하기 위해서는 항체 기반기술과 달리 다음과 같은 기본적인 연속 공정이 필요하다: 1. 세포 파괴 공정; 2. 핵산정제/농축 공정; 3. 시료증폭 공정; 및 4. 시료 측정 공정. 이러한 연속적인 공정은 기존의 세포배양 측정방법과 같은 정도의 노동력이 필요하고, 측정을 위한 전문가가 필요하며, 측정 오류가 측정자의 실수에 의해 발생할 확률이 높고, 측정비용이 상대적으로 높다는 문제점이 있다.

이런 문제점을 해결하기 위해 제안되고 개발되고 있는 방법이 병원균 측정을 위한 모든 공정을 한 칩에서 수행할 수 있는 랩온어칩(Lab-On-a-Chip; LOC)이다. MEMS 기술과 마이크로플루이딕 기술을 기반으로 한 LOC 기술은 나노바이오기술이 융합되면서 최근 수년간 많은 발전을 이루고 있다. 특히 전체 프로세스를 자동화할 수 있는 LOC 기술은 진단 프로세스 이동시 샘플 노출에 의한 오염 가능성에 의한 진단 오류 문제점이 빈번히 발생하는 핵산기반진단에 적합한 개념으로 핵산 분석을 요구하는 측정방법에는 꼭 필요한 기술일 뿐만 아니라, 데스크톱 방식에서 소형 휴대방식으로 전환에 필수적인 방법이다.

특히 바이러스성 감염질환 관련 물질과 같이, 검출하기 힘든 농도의 미량의 물질은 PCR 등의 증폭 공정이 없이는 검출되지 않거나 불명확한 신호로서 검출되는 문제가 있다. 바이러스성 감염질환 관련 물질의 일종인 HBV(Hepatitis B virus) 유전자 또는 단백질을 검출하기 위한 방법이 대한민국 등록특허공보 제10-1093783호 및 대한민국 등록특허공보 제10-1209312호에 개시되어 있으나, 이 역시 PCR 등의 증폭 공정을 포함하는 문제가 있다.

이에 본 발명자들은 DNA 등 분자 진단기술에 대해 지속적인 연구를 하였으며, 금나노입자 및 자성비드입자를 이용한 샌드위치 포메이션을 응용한 비-증폭 검출방법으로, 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 이용함으로써, 증폭 등의 추가공정 없이, 검출하기 힘든 농도의 물질에 대한 유전정보를 빠른 시간 내에 안정적으로 검출할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 비-증폭 방법으로 검출 한도를 높여 미량 존재하는 질병 관련 유전자로부터 특징적인 유전정보를 빠른 시간 내에 안정적으로 수집하여 분석함으로써 질병의 조기 진단 가능성을 높이는 효과가 있는, 비-증폭 DNA 검출방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 제조하는 단계; (b) 금나노입자(Gold Nanoparticle; GNP)에 상기 (a) 단계에서 제조된 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 결합하는 단계; (c) 자성비드입자(Magnetic Bead Particle; MP)에 상기 (a) 단계에서 제조된 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 결합하는 단계; (d) 상기 (b) 단계 및 (c) 단계에서 제조된 물질과 표적 DNA의 샌드위치 포메이션(sandwich formation) 형태의 DNA 결합을 유도하는 단계; 및 (e) 은 증강 검출(silver enhancement)을 이용하여 표적 DNA를 검출하는 단계를 포함하는, 비-증폭 DNA 검출방법을 제공한다(도 1).

본 발명에 있어서, "나노입자"는 평균 크기가 100 나노미터 또는 그 미만, 바람직하게는 10 나노미터 또는 그 미만(1 나노미터는 10^-9 미터이다)인 입자를 의미한다.

본 발명에 있어서, 표적 유전자가 바이러스성 감염질환 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 바이러스성 감염질환은 간염바이러스, 인플루엔자바이러스, 리노바이러스, 아데노바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 또는 포진바이러스 등에 의해 감염되는 질환인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 표적 유전자가 서열번호 1의 HBV(B형간염바이러스 DNA이고, 상기 (b) 단계의 표적 유전자와 상보적인 DNA 프로브가 서열번호 8로 구성된 것을 특징으로 하며, 상기 (c) 단계의 표적 유전자와 상보적인 DNA 프로브가 서열번호 9로 구성된 것을 특징으로 하고 있으나, 이는 하나의 실시예에 불과할 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 표적 DNA가 플라스미드 DNA 형태인 경우, 상기 (a) 단계 이전에 표적 DNA를 전-변성(pre-denature)시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 95℃에서 표적 DNA를 전-변성시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 금나노입자가 농축된 금나노입자(cGNP)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브의 말단에 티올기(thiol group)를 표지하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (c) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브의 말단에 아민기(amine group)를 표지하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브의 농도가 1 내지 5 μM인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 DTT(dithiothreitol) 또는 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)를 이용하여 활성화하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계 또는 (c) 단계의 반응 효율을 증가시키기 위하여, 진탕 배양기를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 진탕 배양기의 속도가 바람직하게는 300 내지 1350 rpm, 보다 바람직하게는 650 내지 1350 rpm, 가장 바람직하게는 1350 rpm인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 은 증강 검출이 바람직하게는 50℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (e) 단계의 은 증강 검출 시 표적 유전자의 농도가 10^-7 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 비-증폭 DNA 검출방법에 따르면, 분자진단에서 보편적으로 사용되는 실시간 PCR 검사 대비 검사시간을 획기적으로 줄이고 (최대 20%), DNA 추출부터 반응까지, One-Step 검출이 가능하다.

본 발명에서, "정성분석"이란 화학분석법 중에서 시료가 어떤 성분으로 구성되어 있는지 알아내기 위한 분석법을 총칭하는 것으로 물질을 구성하고 있는 화학종(化學種: 예를 들면 원소 및 이온 등)이 가지는 특유한 반응 및 물리적 성질(예를 들면 스펙트럼 및 회전편광세기)을 이용해서 검출 및 확인하는 방법을 말한다. 이는 화학분석의 하나로서 물질이 어떤 성분, 즉 어떤 원소, 기(基) 또는 근(根)으로 되어 있는가를 검출하는 분석법을 말한다. 각각 특유한 화학 반응을 하거나 물리적 성질을 지니고 있으므로 그 특성을 이용하여 분석하는 기술이다.

본 발명에서, "정량분석"이란 물질을 구성하는 양적 관계를 명확하게 하는 분석법을 총칭하는 것으로 분석방법에 의해 분류하면 물리화학적인 기계·기구를 사용해서 수행하는 기기분석과 화학반응을 이용해서 성분의 양을 결정하는 화학분석으로 크게 나뉘는데 기기분석은 조작이 간단해서 정밀도가 높고, 개인차가 적어 많이 이용되고 있다. 기존에는 질량 분석과 부피 분석이 주종이었으나 최근에는 흡광(吸光) 분석, 발광 분석, 폴라로그래피, 전기 화학적 방법 등에 의한 정량법이 많이 사용되고 있는 기술이다.

본 발명에서, "실시간(real-time) PCR"이란 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 이러한 실시간 PCR은 SYBR 그린(SYBR Green)을 사용하는 방법과 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로 나누어진다. SYBR 그린 기법은 실시간 PCR 증폭 과정에서 증폭된 DNA에 SYBR 그린 염색약이 끼어 들어가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광신호를 발생하게 되고 이러한 형광신호를 검출하여 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 또한, 이중 표지된 프로브(dual labeled probe)를 이용한 실시간 PCR 기법은 5'말단에 형광물질이 표지되어 있고 3'말단에 소광물질(Quencher)이 표지된 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로서, 이중 표지된 프로브에 의한 형광신호를 통해 이중 표지된 프로브가 표적 유전자의 PCR 증폭 산물과 어닐링되었는지 여부를 확인할 수 있고, 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다.

본 발명에서, "분자진단"이란 DNA, RNA 등의 유전물질을 대상으로 분자생물학, 분자유전학적 기술을 이용한 검사 분야를 총칭하는 것으로 세포 내에서 일어나는 다양한 분자 수준의 변화를 수치나 영상으로 평가하는 진단기법이다. 병리적 변화를 간접적으로 판독하는 혈액 또는 소변검사보다 정확도가 높고 조직검사를 피할 수 있으며 DNA 및 유전자 분석, 단백질 또는 대사체 분석, 분자 영상 의학으로 나눌 수 있는 기술이다.

본 발명에서, "현장진단(Point of care)"이란 자원이 제한된 지역에서 전염성 질병을 감지하고 모니터링하는 큰 잠재력을 제공하는 기술로써 샘플 준비 및 실험을 준비하는 단계에서 발생할 수 있는 불필요한 단계를 제거함으로써 제한적인 상황이 있는 곳에서도 사용 가능한 기술이다.

본 발명에서, "상보적인"이란 왓슨/크릭 쌍형성 규칙에 따른 뉴클레오티드 서열들의 짝지음을 의미한다. 예를 들면, 서열 5'-GCGGTCCCA-3'는 상보적 서열 5'-TGGGACCGC-3'를 가진다. 또한 상보적 서열은 DNA 서열에 상보적인 RNA 서열일 수 있다. 천연 핵산에서 일반적으로 발견되지 않는 소정의 염기들이 제한적이지 않지만 인도신, 7-디아자구아닌, 잠금 핵산들 (LNA), 및 펩티드 핵산들 (PNA)을 포함한 상보적 핵산들에 포함될 수 있다. 상보성은 완전할 필요는 없다; 안정한 이중가닥은 불일치된 염기 쌍들을 가질 수 있다, 퇴행성, 또는 미일치 (unmatched) 염기들을 가질 수 있다. 핵산 기술 분야의 통상의 기술자들은 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 길이, 올리고뉴클레오티드 염기 조성 및 서열, 이온 강도 및 불일치 염기 쌍들 빈도를 포함한 여러 변수들을 고려하여 실험적으로 이중가닥 안정성을 결정할 수 있다.

본 발명에서, "혼성화"란 두 개의 상보적 핵산 가닥들이 적합한 엄격 조건들에서 서로 복원되는 과정을 의미한다. 혼성화에 적합한 올리고뉴클레오티드들 또는 탐침들은 길이가 10-100 뉴클레오티드들 (예를 들면, 길이가 18- 50, 12-70, 10-30, 10-24, 18-36 뉴클레오티드들)이다. 핵산 혼성화 기술은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다(Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989).

본 발명에서, "프로브(probe)"란 가변 길이 (예를 들면, 3-1000 염기 길이)의 DNA 또는 RNA 단편을 의미하며, 프로브 서열과 상보적인 표적 뉴클레오티드 서열들 존재를 검출하기 위하여 사용된다. 전형적으로, 프로브는 프로브 및 표적 간의 상보성에 의한 염기 서열로 인하여 프로브-표적 염기쌍이 가능한 단일-가닥 핵산(DNA 또는 RNA)과 혼성화된다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 비-증폭 DNA 검출방법은 검출 한도를 높여 미량 존재하는 질병 관련 유전자로부터 특징적인 유전정보를 빠른 시간 내에 안정적으로 수집하여 분석함으로써 질병의 조기 진단 가능성을 높이는 효과가 있으므로, 의료산업분야, 분자진단산업분야 등에 널리 활용될 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 나노입자 기반의 센싱 플랫폼은 표준화하기 쉽고 공정 순서를 확립하기에 용이하므로, 진단기기의 소형화 연구에 기초적인 기반 기술을 마련할 수 있으며, 고감도/다중감지재료 및 센싱기법에 대한 원천기술과 정보통신기술의 융합을 통하여 유비쿼터스한 센싱 시스템 개발에 활용될 수 있다. 이를 통해, 질병 관련 물질의 검출뿐만 아니라, 환경 유해인자 등 여러 물질을 검출하기 위한 기술로 응용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 DNA 검출방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 실시예 1-1의 HBV 표적 DNA 및 프로브 DNA의 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1-2의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2-1의 GNP 프로브의 활성화 방법 및 완충액 조성에 따른 GNP 중합 결과를 나타낸 것이다. (A)는 DTT를 이용하여 활성화한 경우, (B)는 TCEP를 이용하여 활성화한 경우의 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 2-1의 GNP와 GNP 프로브의 농도에 따른 중합 효율을 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 5-1의 합성 표적 올리고뉴클레오티드를 이용한 가능성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 5-2의 합성 HBV 유전자의 온도에 따른 은 증강 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 5-3의 올리고뉴클레오티드 표적 DNA를 이용한 은 증강 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 5-4의 플라스미드 표적 DNA 종류별, 은 증강 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 5-5의 플라스미드 표적 DNA의 전-변성 과정의 유용성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 5-6의 플라스미드 표적 DNA 농도별, 은 증강 검출 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 표적 DNA 및 프로브( probe ) DNA 의 준비

1-1 : 표적 DNA 및 프로브 DNA 의 준비

HBV 표적 DNA 서열(서열번호 1)을 선정하였다. 구체적인 선정 방법은 다음과 같다. 우선, 6가지 가닥(strand)의 시퀀싱 데이터를 이용하여(서열번호 2 내지 7), 각각의 가닥에 공통적으로 존재하는 보존 영역을 검색하였다. BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; NCBI 홈페이지 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 표적 서열과 기존에 보고된 HBV 유전자와의 연관성을 확인하였다.

이어서, 나노입자에 부착될 프로브 DNA 서열(서열번호 8 및 9)을 선정하였다. 나노입자 부착을 위해 프로브의 말단에 티올기와 아민기를 각각 표지하였다(도 2). 구체적으로, 표적 DNA의 양쪽 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열을 설정하였다. 나노입자와의 중합을 위해 문헌조사를 통해(Edgar D. Goluch et al., Lab on a Chip, 6:1293-1299, 2006) 각 올리고뉴클레오티드 서열의 변형 종류 및 방향을 설정하였다.

요약하면, 82 염기의 HBV 표적 DNA 서열을 설정하고, 양 말단에 20bp를 형성하도록 상보적인 서열을 설정하고, 공간 확보를 위해 10 염기의 올리고 d(T) 서열을 추가하였다. GNP 및 MP와의 결합을 위해 말단을 변형시켰다(terminal modification). 시각적 검출을 위하여 각 프로브 서열에 형광물질을 표지하였다.

1-2 : 표적 DNA 와 프로브 DNA 의 서열 상보성 확인

표적 DNA와 프로브 DNA의 서열의 상보성을 확인하기 위하여 폴리아크릴아마이드 전기영동을 수행하였다(도 3). 그 결과, ①번 레인에 감지된 82mer인 HBV 표적 DNA와 비교할 때, ③~⑤ 및 ⑦~⑨번 레인의 GNP 프로브 또는 MP 프로브와 반응시켜 혼성화된 경우 이중나선 형성으로 인한 이동성 감소에 의해 밴드 이동(band shift)이 일어난 것을 확인할 수 있었다.

1-3 : 플라스미드 DNA 의 전-변성

인체에서 유래된 시료를 플라스미드 DNA의 형태로 바꾸어 사용하였다. 플라스미드 DNA는 이중나선의 구조를 가지고 있으므로, 프로브와의 결합단계에서 이중나선 구조를 해체하여 단일나선 구조를 만들어 반응시켰다. 대조군으로 샌드위치 형태의 바이오어세이가 일어나지 않는 증류수(DW)를 사용하였고, 실험군으로 인체 유래 샘플에서 DNA를 추출하고, 클로닝을 통해 양을 증폭시킨 플라스미드 DNA를 사용하였다(에스케이텔레콤 제공; HBV 간염 환자로부터 채취한 혈액으로부터 분리된 혈청을 이용하여 추출한 HBV DNA, 각 실험군에 임의의 번호(2219, 2515, 2618, 2633) 지정).

실시예 2. 금나노입자 중합체의 제조 ( GNP Conjugation )

1.5 mL의 마이크로원심분리 튜브에 금나노입자(GNP)와 농축된 금나노입자(cGNP)를 준비한다. cGNP는 GNP를 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 상등액의 90%를 버린 후 남은 용액을 섞어(볼텍싱 또는 태핑) 제조하였다. GNP 프로브(probe)인 올리고뉴클레오티드 DNA를 두 그룹에 1, 2, 3, 5 μM이 되도록 첨가한 후, 상온에서 16시간 동안 배양하였다. 1x 인산칼륨 완충액 (pH 7)을 튜브에 1/10 부피로 첨가하고, 피펫팅 및 태핑하여(볼텍싱하지 않고) 잘 섞었다.

그 후, 상온에서 24시간 동안 배양하였다. 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 상등액을 제거한 후, 1x 인산칼륨 완충액 (pH 7)을 첨가하였다. 상등액을 완전히 제거하려고 하면, 유질의 침전제인 GNP가 딸려오므로, 주의하여 최대한 제거한 후, 동일량의 1x 인산칼륨 완충액 (pH 7)을 첨가하였다. 피펫팅 및 태핑하여(볼텍싱하지 않고) 잘 섞었다.

상기 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 상등액을 제거한 후, 1x 인산칼륨 완충액 (pH 7)을 첨가하는 과정을 반복하여 GNP를 헹구었다.

96-웰 플레이트로 옮긴 후, 450~700nm의 파장 범위에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 대조군으로써 GNP와 cGNP를 준비하여 동일한 조건에서 실험군과 같이 흡광도를 측정하였다.

2-1 : GNP 프로브의 활성화 방법 및 완충액 조성에 따른 GNP 중합 결과

GNP 프로브를 DTT(dithiothreitol; 도 4의 A) 또는 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine; 도 4의 B)를 이용하여 환원시켜 활성화하였다. DTT를 이용한 경우에는 아세트산에틸(ethyl acetate)로 후처리하였다. 또한, pH 7.0 또는 7.5의 KPB 또는 Tris 완충액을 이용하였다. 상기와 같은 각각의 GNP 프로브의 활성화 방법 및 완충액 조성에 따라 흡광도를 측정하여 GNP 중합 결과를 확인하였다(도 4). 그 결과, TCEP 활성화 pH 7.0 인산칼륨 완충액을 이용한 경우 효율이 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다.

2-2 : GNP 와 GNP 프로브의 농도에 따른 중합 효율

GNP 원액(도 5의 A)과 10배 농축된 GNP(cGNP; 도 5의 B), 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 및 TCEP-활성화된 올리고뉴클레오티드 DNA를 이용하여, GNP 프로브의 농도를 1, 2, 3, 5 μM으로 달리하여 흡광도(520~530nm)를 측정하여 GNP 중합 효율을 확인하였다(도 5). 그 결과, GNP 프로브를 결합시킨 경우, 결합시키지 않은 경우 보다 최고점(peak)이 이동된 것(흡광도 이동, absorbance shift)을 확인할 수 있는바, 혼성이 잘 일어난 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 자성비드입자 중합체의 제조 ( MP - probe conjugation )

가루 형태의 자성 비드를 200μL의 부유 완충액(suspend buffer)으로 녹여 (10⁶개/μL) 아민-변형 올리고뉴클레오티드 DNA(100ng/μL)와 혼합하였다. 볼텍싱 또는 피펫팅을 통해 충분히 혼합한 후, 50℃에서 밤새 반응시켰다(진탕; 1350rpm). 샘플이 담긴 튜브를 자성 분리기에 위치시킨 후 3분 동안 자성 비드를 분리하였다. 상등액을 새로운 튜브에 옮긴 후에 5번 세척하였다. 자성 비드가 1mg/mL이 되도록 증류수로 재부유 후 4℃에서 보관하였다.

3-1 : 진탕 배양기의 rpm 속도에 따른 MP 중합 효율

진탕 배양기의 rpm 속도를 300, 650, 1350 rpm으로 달리하여, MP 중합 효율을 측정하였다. C1은 반응 전, C2는 각각의 rpm에서 반응하고 난 후의 결과 값을 의미한다. 그 결과, 진탕 배양기의 rpm 속도가 650~1350 rpm일 때, 결합효율이 높은 것을 확인할 수 있었다(표 1).

샘플 ID	핵산 농도	단위	A260	A280	A260/280	A260/230	결합효율(%)
C1	16.4	ng/μl	0.490	0.307	1.60	0.65
300rpm (C2, 8hr)	7.3	ng/μl	0.146	0.099	1.47	1.76	70.20
650rpm (C2, 8hr)	1.2	ng/μl	0.024	0.014	1.69	0.47	95.10
1350rpm (C2, 8hr)	0.7	ng/μl	0.02	0.004	5.41	0.42	95.91

(A: 흡광도, 단위 nm)

3-2 : 세척 용액의 종류에 따른 MP 중합 효율

세척 용액을 달리하여, MP 중합 효율을 측정하였다. 그 결과, 키트(BcMag^TM Quick Oligo-DNA Conjugation Kit, Bioclon Inc., USA)와 비교할 때, DW와 인산칼륨 완충액은 세척 용액으로 적합하나, PBS는 적합하지 않은 것을 확인할 수 있었다(표 2).

샘플 ID	핵산 농도	단위	A260	A280	260/280	260/230
pre-결합 MP 용액	24.2	ng/μl	0.483	0.292	1.65	1.25
키트	3	ng/μl	0.06	0.018	3.39	0.05
D.W	2.4	ng/μl	0.049	0.02	2.38	0.39
PBS (pH 7.4)	29.7	ng/μl	0.595	0.049	12.22	0.05
인산칼륨 완충액 (pH 7)	2.7	ng/μl	0.053	0.024	2.19	0.53

실시예 4. 표적 결합 - 샌드위치 포메이션( Sandwich Formation )

실시예 2 및 3에서 제조된 GNP 중합체 및 MP 중합체의 반응 비율을 결정하였다(부피:부피, 입자 수:입자 수). 프로브가 결합된 GNP와 프로브가 결합된 MP를 비율대로 섞은 후 방열판(heat block)에서 5분 동안 95℃에서 반응시켰다. MP 중합체 제조와 동일하게, 혼성화 온도를 50℃로 설정하여 1시간 동안 진탕 배양기(1350rpm)에서 반응시켰다. 농도 비교를 위해 분리기에서 분리한 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 담았다. 비드에 1xKPB (pH 7.0) 10μL를 첨가하였다(Edgar D. Goluch et al., Lab on a Chip, 6:1293-1299, 2006).

DNA 칩(Agilent High Sensitivity DNA Analysis Kit (82mer), Agilent Technology, USA)을 이용하여 82bp 표적 DNA의 농도를 측정하고, 나노드롭(Nanodrop)을 이용하여 표적 DNA의 농도만 특정하게 측정하고, DNA 칩 분석(assay)과 나노드롭 측정 결과를 비교하여 정리하였다(표 3).

표적 DNA 농도/ 혼성화 온도	나노드롭 (ng)		Agilent High Sensitivity DNA Analysis Kit (82mer)
	투입(input)	결합	투입(input)	결합
0μM/ 25℃	0	0	0	0
0.5μM/ 25℃	16.04	14.08	16.04	13.41
1μM/ 25℃	31.547	18.687	31.547	22.967
0μM/ 50℃	0	0	0	0
0.5μM/ 50℃	16.04	14.34	16.04	7.31
1μM/ 50℃	31.547	18.157	31.547	17.587

실시예 5. DNA 검출 - 은 증강 검출( Silver enhancement )

실시예 4에서 샌드위치 포메이션된 결과물(50μM)을 50mL에 튜브 바닥에 첨가하였다. 은 증강 검출 용액 A 및 B(Silver Enhancement Kit(SE100, Sigma-Aldrich, USA)에 포함된 은 증강 검출 용액)를 각각 100μL씩 섞어서 반응시켰다(1:1의 비율로 반응시킴). 전극을 이용하여 전기 저항 측정을 통해 은 증강 검출 결과를 확인하였다.

5-1 : 합성 HBV 유전자의 은 증강 검출 가능성 평가

실시예 1의 프로브를 이용하여, 실시예 4의 샌드위치 포메이션 및 실시예 5의 은 증강 검출이 합성 표적 올리고뉴클레오티드를 통해 가능한지, 그 가능성을 평가하였다. 그 결과, 단순 저항값 측정을 통해 바이오어세이가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다(도 6).

5-2: 합성 HBV 유전자의 온도에 따른 은 증강 검출 결과

합성 HBV 유전자의 은 증강 검출 가능성을 평가하기 위하여, 온도를 25℃ 또는 50℃로 달리하여, 은 증강 검출 결과를 확인하였다. 그 결과, 50℃에서 은 증강 검출 실험을 진행하는 경우 대조군과의 저항값이 더 큰 차이를 보이는바, 안정적인 결과 도출이 가능한 것을 확인할 수 있었다(도 7).

5-3 : 올리고뉴클레오티드 표적 DNA 를 이용한 은 증강 검출 결과

표적 DNA의 농도를 1, 0.5, 0.1, 0 μM으로 달리하고, 온도를 25℃ 또는 50℃로 달리하여, 은 증강 검출 결과를 확인하였다. 그 결과, 은 증강 검출은 온도보다 표적 DNA의 농도에 영향을 많이 받는다는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

5-4 : 비교 기준별, 은 증강 검출 결과

25℃ 또는 95℃에서 25분간 반응시켜, 은 증강 검출 결과를 확인하였다. 비드를 포함하는 용액의 양(도 9의 A 및 B) 또는 비드의 개수(도 9의 C 및 D)를 기준으로 은 증강 검출 결과를 비교하여 효율성을 확인하였다. 그 결과, 95℃에서 실험하는 경우, 낮은 온도에서 보다 효율성이 높다는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 비드의 개수를 기준으로 비교하는 경우가 효율성이 더 높다는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

5-5 : 플라스미드 표적 DNA 의 전-변성 과정의 유용성 평가

실시예 1과 같이, 플라스미드 표적 DNA의 형태로 바꾸어 사용하는 경우, 플라스미드 DNA는 이중나선의 구조를 가지고 있으므로, 프로브와의 결합단계에서 이중나선 구조를 해체하여 단일나선 구조를 만들어 반응시켰다. 따라서, 플라스미드 표적 DNA의 전-변성 과정의 유용성을 평가하였다. 그 결과, 전-변성 과정을 거친 경우 실험군과 대조군이 상당한 차이를 나타내므로, 다양한 농도에서 실험이 가능한바, 전-변성 과정의 유용성을 확인할 수 있었다(도 10).

5-6 : 플라스미드 표적 DNA 농도별, 은 증강 검출 결과

플라스미드 표적 DNA의 농도를, 10⁰(30μg/μl), 10^-1(3μg/μl) 10^-2(300ng/μl), 10^-3(30ng/μl), 10^-4(3ng/μl), 10^-5(300pg/μl), 10^-6(30pg/μl), 10^-7(3pg/μl), 10^-8(300fg/μl), 10^-9(30fg/μl)로 달리하여 95℃에서 25분간 반응시켰다. 그 결과, 대조군과 비교하였을 때, 플라스미드 표적 DNA의 농도가 10^-7 이상인 경우의 저항값이 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 11). 이는, 플라스미드 표적 DNA의 농도가 10^-7까지 검출이 가능하다는 것을 나타낸다.

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며, 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

<110> SK TELECOM CO., LTD. <120> Non-Amplification Method for DNA Detection Using Gold Nanoparticle and Magnetic Bead Particle <130> SP-53774 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV <400> 1 ctgctcaagg aacctctatg tttccctctt gttgctgtac aaaaccttcg gacggaaact 60 gcacttgtat tcccatccca tc 82 <210> 2 <211> 1280 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> HBV DNA <400> 2 agattacccg gaccttgaca ggctccggcc gccatggcgg ccgcgggaat tcgatttgct 60 ggtggctcca gttccggaac aataaaccct gttccgacta ctgcctcacc catatcgtca 120 atcttcttga ggactgggga ccctgcaccg aacatggaga gcacaacatc aggattccta 180 ggacccctgc tcgtgttaca ggcggggttt ttcttgttga caagaatcct cacaataccg 240 cagagtctag actcgtggtg gacttctctc aattttctag ggggagcacc aaagtgtcct 300 ggccaaaatt cgcagtcccc aacctccaat cactcaccaa cctcttgtcc tccaatttgt 360 cctggctatc gctggatgtg gctgcggcgt tttatcatat tcctcttcat cctgctgcta 420 tgcctcatct tcttgttggc tcttctggac taccaaggta tgttgcccgt ttgtcctcta 480 cttccagaaa catcaactac 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actagtgcca tttgttcagt ggttcgcagg gctttccccc actgtttggc 720 tttcggttat gtggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacaacatc ttgagtccct 780 ttttacctct attaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttgaacc ctaataaaac 840 caaacgttgg ggctactccc ttaacttcat gggatatgta attggaagtt ggggtacttt 900 accacaagaa catattgtat taaaaatcaa acaatgtttt cgaaaactgc ctgtaaatag 960 acctattgat tggaaagtct gtcaaagaat tgtgggtctt ttgggctttg ctgccctttt 1020 acacaatgtg gctatcctgc ctgatgcctt tatatgcatg tatacaatct aagcagcttt 1080 cactttctcg cacttacagc tttctatcac tatgaattcc cgccgcctgc agtcgaacat 1140 atgggagagc tccccaccgc gtggatgcat agctgagaaa ttctaaggta actaatagct 1200 ggcgatacat gcctaatccg gttcttgtga aatgttatcg ctccattcgc catcgaccgg 1260 agcataaagg tgagagcctc cg 1282 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA probe <400> 8 tttttttttt gacgagttcc ttggagatac 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA probe <400> 9 tgaacataag ggtagggtag tttttttttt 30

Claims (16)

1. 다음 단계를 포함하는 비-증폭 DNA 검출방법:
   (a) 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 제조하는 단계;
   (b) 금나노입자(Gold Nanoparticle; GNP)에 상기 (a) 단계에서 제조된 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 결합하는 단계;
   (c) 자성비드입자(Magnetic Bead Particle; MP)에 상기 (a) 단계에서 제조된 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 결합하는 단계;
   (d) 상기 (b) 단계 및 (c) 단계에서 제조된 물질과 표적 DNA의 샌드위치 포메이션(sandwich formation) 형태의 DNA 결합을 유도하는 단계; 및
   (e) 은 증강 검출(silver enhancement)을 이용하여 표적 DNA를 검출하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서, 표적 DNA가 바이러스성 감염질환 유전자인 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
   
3. 제1항에 있어서, 표적 DNA가 서열번호 1의 HBV(B형간염바이러스) DNA인 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
   
4. 제1항에 있어서, 표적 DNA가 플라스미드 DNA 형태인 경우, 상기 (a) 단계 이전에 표적 DNA를 전-변성(pre-denature)시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
   
5. 제4항에 있어서, 95℃에서 표적 DNA를 전-변성시키는 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 금나노입자가 농축된 금나노입자(cGNP)인 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브가 서열번호 8로 구성된 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브의 말단에 티올기(thiol group)를 표지하는 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브의 농도가 1 내지 5 μM인 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브를 DTT(dithiothreitol) 또는 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)를 이용하여 활성화하는 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브의 말단에 아민기(amine group)를 표지하는 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
    
12. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 표적 DNA와 상보적인 DNA 프로브가 서열번호 9로 구성된 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
    
13. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계 또는 (c) 단계의 반응 효율을 증가시키기 위하여, 진탕 배양기를 이용하는 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
    
14. 제13항에 있어서, 진탕 배양기의 속도가 300 내지 1350 rpm인 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
    
15. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 은 증강 검출이 50℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.
    
16. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 은 증강 검출 시 표적 유전자의 농도가 10^-7 이상인 것을 특징으로 하는, 비-증폭 DNA 검출방법.

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