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KR20160060857A - Extract of medicinal herbs for preventing or healing imflammatory joint disease and method of preparing the same - Google Patents

Extract of medicinal herbs for preventing or healing imflammatory joint disease and method of preparing the same Download PDF

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KR20160060857A
KR20160060857A KR1020140162727A KR20140162727A KR20160060857A KR 20160060857 A KR20160060857 A KR 20160060857A KR 1020140162727 A KR1020140162727 A KR 1020140162727A KR 20140162727 A KR20140162727 A KR 20140162727A KR 20160060857 A KR20160060857 A KR 20160060857A
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김영란
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Abstract

The present invention relates to extract of medicinal herbs for preventing or treating inflammatory joint diseases and a method for preparing the same. The method for preparing extract of medicinal herbs for preventing or treating inflammatory joint diseases according to the present invention comprises the steps of: (a) adding ethanol to medicinal herb materials including tumeric and further including at least three ingredients selected from the group consisting of Lonicera japonica, Angelica gigas, Clematis florida Thunb, phellodendron bark, Sinomenium acutum, citrus shell, Paeonia lactiflora Pall, Atractylodes japonica Koidz, Aurantii Fructus Immaturus and Glycyrrhiza uralensis to carry out extraction, wherein each ingredient is mixed at a weight ratio of 1:0.3-2 based on tumeric; (b) filtering the extract obtained from step (a); and (c) concentrating the extract filtered from step (b). The medicinal herb extract proliferates chondrocytes and reduces inflammatory cytokines, and thus can be used effectively for preventing or treating inflammatory joint diseases.

Description

염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 및 그 제조방법{Extract of medicinal herbs for preventing or healing imflammatory joint disease and method of preparing the same}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a medicinal herb extract for preventing or treating an inflammatory joint disease and a method for preparing the medicinal herb,

본 발명은 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 연골세포를 증식시키고 염증성 사이토카인을 감소시켜 염증성 관절 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 한약재 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a herbal medicine extract for preventing or treating an inflammatory joint disease and a method for preparing the same, and more particularly to a herbal medicine extract which can proliferate cartilage cells and reduce inflammatory cytokines to prevent or treat inflammatory joint disease .

관절에 노화 등의 퇴행이 발생하면 관절을 구성하는 연골세포 (chondrocytes)에서 관절의 기질물질들인 유형 II콜라겐 (type-II collagen) 및 프로테오글리칸 (proteoglycan) 등의 합성 저해가 일어나며 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β) 및 종양괴사인자-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 등 염증성 사이토카인(cytokine)이 생성된다. 관절염은 이러한 기작을 통해 관절 기질을 분해하는 기질 금속 단백질 분해효소 (matrix metalloproteinase, MMP)의 합성 및 활성이 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴되어 유발되는 질병이다.When degeneration occurs in the joints, chondrocytes constituting the joints inhibit the synthesis of type II collagen (type-II collagen) and proteoglycan, which are substrate substances of the joint, and interleukin-1β (interleukin- Inflammatory cytokines, such as IL-1β, IL-1β, and tumor necrosis factor-α, TNF-α, are produced. Arthritis is a disease caused by destruction of joint tissue due to increased synthesis and activity of matrix metalloproteinase (MMP), which degrades joint matrix through such a mechanism.

또한 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소 (NO)의 생성과 생성된 일산화질소에 의한 자가 증폭적인 사이토카인의 생성으로 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되게 되어 관절 기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 관절염이 진행되면 MMP-1, 2, 3, 8, 9, 13 등의 발현과 활성이 증가한다(Wieland HA et al., Nat RevDrug Discov 4: 331-344, 2005). 이와 동시에 염증성 사이토카인은 지질대사산물인 프로스타글란딘 E2 (prostaglandin E2, PGE2)의 생성을 증가시켜 관절에서 염증반응을 유발시킨다. 그 원인은 불확실하나, 노쇠 현상이나 과다한 체중과 관계가 깊은 질환으로 알려져 있으며, 이 질환에서는 일차적으로 관절 연골의 퇴행성 변화가 나타난다. 퇴행성 변화는 관절 연골에서 시작되어 연골 세포가 괴사하게 되고, 기질이 카텝신 B (cathepsin B), 카텝신 D (cathepsin D), 콜라게나아제 (collagenase) 등에 의해 파괴된다. 프로테오글리칸(proteoglycan)과 콜라겐 (collagen)의 생성이 파괴 정도를 따라가지 못하면 외력에 대한 연골의 적응 능력이 점점 감소하여 결국 연골 하골 조직에 미세 골절 등이 발생하게 된다. 질환이 진행되면, 연골 하골의 경화, 관절 주위에 골의 과잉형성 및 관절의 변형 등이 발생하고 연골의 표면이 거칠어져 관절막으로 싸인 관절강 안에 염증 반응이 반복되어 나타나게 된다. 따라서, 관절염은 반복적인 동통, 관절의 강직감, 관절의 점진적인 운동 장애 등을 일으키게 된다.Furthermore, arthritis is further exacerbated by the production of nitric oxide (NO) by inflammatory cytokines and by the production of self-amplifying cytokines by the produced nitric oxide, which leads to the synthesis of more MMPs and promotes the degradation of joint matrix. When arthritis develops, expression and activity of MMP-1, 2, 3, 8, 9, and 13 are increased (Wieland HA et al., Nat RevDrug Discov 4: 331-344, 2005). At the same time, inflammatory cytokines increase the production of the lipid metabolites prostaglandin E2 (prostaglandin E2, PGE2), resulting in inflammatory reactions in the joints. The cause is uncertain, but it is known to be related to senility and excessive body weight. In this disease, degenerative changes of articular cartilage occur first. Degenerative changes start from articular cartilage and cartilage cells become necrotic, and the substrate is destroyed by cathepsin B, cathepsin D, collagenase, and the like. If the production of proteoglycan and collagen fails to follow the degree of destruction, the ability of the cartilage to adapt to external forces gradually decreases, resulting in fine fractures in the cartilaginous tissue. When the disease progresses, hardening of the cartilage, excessive formation of the bone around the joint, and deformation of the joint occur, and the surface of the cartilage becomes rough and the inflammatory reaction repeatedly appears in the joints enclosed by the joint. Thus, arthritis causes repeated pain, a strong gut feeling of the joint, and a gradual movement disorder of the joint.

관절염이 발생하면 관절 내 염증 반응과 함께 통증이 증가하게 되는데, 이러한 통증은 이미 언급된 PGE2의 생성 때문이다. PGE2는 사이클로옥시제네이즈-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)라는 효소에 의해 합성되며, 이는 NO, TNF-α, IL-1β와 같은 염증성 사이토카인이나 기타 다른 자극에 의해 활성이 증가된다. 또한 골관절염이 진행되면 연골이 파괴되면서 사이토카인, 케모카인, 단백질 분해효소 등과 같은 염증 관련 인자들이 분비되어 활액막에 염증을 일으켜 혈청 히알루론산 (hyaluronic acid, HA) 농도가 상승되기도 한다. IL-1β와 TNF-α는 활액막에 분포하는 생체에 직접 손상을 주거나 활액막에 분포되어 있는 감각신경 섬유 및 유해수용기 (nociceptor)를 자극하여 손상을 줄 수 있다. 이러한 염증성 사이토카인들은 연골 세포와 비만 세포로부터 PGE2와 히스타민을 유리시키며, 이는 다시 유해수용기를 자극하므로 통증을 느끼게 된다.When arthritis occurs, the pain is increased with inflammation in the joint, which is due to the production of PGE2 already mentioned. PGE2 is synthesized by an enzyme called cyclooxygenase-2 (COX-2), which is activated by inflammatory cytokines such as NO, TNF-α, IL-1β or other stimuli. In addition, when osteoarthritis progresses, cartilage is destroyed, and inflammation related factors such as cytokines, chemokines, and proteolytic enzymes are secreted and inflammation of the synovium leads to elevated serum hyaluronic acid (HA) concentration. IL-1β and TNF-α may damage the synovial membrane directly or indirectly by stimulating sensory nerve fibers and nociceptors distributed in the synovium. These inflammatory cytokines release PGE2 and histamine from chondrocytes and mast cells, which in turn stimulates the noxious receptors and makes them feel pain.

현재 사용되고 있는 관절염의 치료방법은 1차로 적당한 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAIDs)을 사용하여 염증의 완화를 시도하고 염증이 심하거나 NSAIDs의 효능이 없으면 스테로이드 제제를 사용한다. 난치성인 경우 면역 억제제나 수술요법을 실시하게 된다. 염증 완화에 사용되는 NSAIDs는 주로 COX를 억제하여 염증반응에 관여하는 프로스타글란딘 (prostaglandin)의 생성을 억제함으로써 관절염의 항염증 작용을 나타내지만 위장 장애, 간 장애, 신 기능 장애 등의 부작용을 야기하여 장기간의 사용이 어렵다. 스테로이드 제제 역시 환자에게 사용할 수 있는 가장 빠른 방법으로, 관절염의 항염증 효과가 빠르고 극적으로 나타나는 약물이지만 세균 감염에 대한 저항력을 약하게 하고, 당뇨병의 악화, 부신부전증, 정신 기능 장애 등을 일으키는 것으로 독성이 매우 심각할 뿐만 아니라 치료를 시작하면 중지하기가 어렵기 때문에 사용상 주의가 필요하며, 가능하면 금해야 하는 것으로 알려져 있어 효력이 강하면서도 비교적 부작용이 적은 관절염 치료제의 개발이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다.Currently, the treatment of arthritis is primarily based on the use of appropriate non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) to try to relieve inflammation, and steroids are used if inflammation is severe or NSAIDs are not efficacious. If intractable, immunosuppressive drugs or surgery will be performed. NSAIDs used for relieving inflammation mainly exhibit anti-inflammatory effects of arthritis by inhibiting the production of prostaglandin which is involved in the inflammatory reaction mainly by inhibiting COX, but they cause adverse effects such as gastrointestinal disorder, hepatic disorder, It is difficult to use. Steroids are also the fastest method available to patients, which is a rapid and dramatic anti-inflammatory effect of arthritis, but it weakens resistance to bacterial infections, causes diabetes mellitus, adrenal insufficiency, and mental dysfunction. In addition to being very serious, it is difficult to stop treatment when it is started. Therefore, it is necessary to pay attention to the use and it is known that it should be inhibited if possible. Therefore, there is a constant demand for the development of a therapeutic agent for arthritis which is effective and relatively low in side effects.

이에, 본 발명의 발명자는 관절염 대사 경로 관련 유전자들과 관절염을 유발시키는 유전자들을 표적으로 하는 한약재들을 선정, 이들을 이용하여 제조된 한약재 추출물이 연골세포를 증식시키고 염증성 사이토카인 생성을 억제 또는 감소시켜 염증성 관절 질환 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명에 이르렀다.Accordingly, the inventors of the present invention selected herbal medicines targeting genes for arthritic metabolic pathway and genes causing arthritis, and found that the medicinal herb extracts produced using them inhibit or reduce inflammatory cytokine production, Thereby preventing or treating the joint disease, and reached the present invention.

대한민국 공개특허공보 제10-2014-0118945호(2014.10.08.)Korean Patent Publication No. 10-2014-0118945 (Oct.

본 발명의 목적은 연골세포를 증식시키고 염증성 사이토카인을 감소시켜 염증성 관절 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 한약재 추출물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide an herbal medicine extract capable of proliferating chondrocytes and reducing inflammatory cytokines to prevent or treat inflammatory joint diseases.

본 발명의 다른 목적은 연골세포를 증식시키고 염증성 사이토카인을 감소시켜 염증성 관절 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 한약재 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing an herbal medicine extract capable of proliferating chondrocyte cells and reducing inflammatory cytokines to prevent or treat inflammatory joint diseases.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물로, 상기 한약재는 강활을 포함하고 또한 금은화, 당귀, 위령선, 황백, 방기, 진피, 적작약, 창출, 지각 및 감초로 이루어지는 군에서 적어도 3 가지 이상 선택되는 성분들을 포함하되, 상기 선택된 한약재 성분의 각각의 배합 비율은 강활을 기준으로 중량비로 1 : 0.3 ~ 2인 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물을 제공한다.In order to achieve the above-mentioned object, the present invention provides a medicinal herbal extract for preventing or treating inflammatory joint diseases, wherein the medicinal herb contains ganghwam, and further contains ganghwada, angelica, gestational, yellow, white, dermis, Wherein the compounding ratio of each of the selected herbal ingredients is 1: 0.3 to 2, based on the hardness, of the herbal medicine extract for preventing or treating inflammatory joint disease.

또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, (a) 강활을 포함하고 또한 금은화, 당귀, 위령선, 황백, 방기, 진피, 적작약, 창출, 지각 및 감초로 이루어지는 군에서 적어도 3 가지 이상 선택되는 성분들을 포함하되, 상기 성분의 각각의 배합 비율은 강활을 기준으로 중량비로 1 : 0.3 ~ 2인 한약재에 주정을 가하여 추출하는 단계; According to another aspect of the present invention, there is provided a method of manufacturing a chewing gum, comprising the steps of: (a) selecting at least three or more selected from the group consisting of ginger, Extracting the herbal medicine by adding the ingredients to the medicinal herb having a weight ratio of 1: 0.3 to 2 based on the mixing ratio of each of the ingredients;

(b) 상기 (a) 단계에서 추출된 추출물을 여과하는 단계; 및(b) filtering the extract extracted in step (a); And

(c) 상기 (b) 단계에서 여과된 추출물을 농축하는 단계를 포함하는 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법을 제공한다.(c) concentrating the extract filtered in the step (b). The present invention also provides a method for producing an extract of herbal medicines for preventing or treating an inflammatory joint disease.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 한약재가 강활, 금은화, 당귀, 위령선 및 황백이고, 이들의 배합 비율은 중량 기준으로 1 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2인 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, in the step (a), the medicinal herb is selected from the group consisting of ginseng, ginseng, Angelica gonorrhea, : 0.3 to 2.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 주정은 20 내지 70%인 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, in the step (a), the alcohol may be 20 to 70%.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 추출은 70 내지 100℃에서 실시할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the extraction in step (a) may be carried out at 70 to 100 ° C.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 한약재에 독활, 복령, 택사, 목통, 목과, 등심초, 조각자, 인동등 및 포영공으로 이루어지는 군에서 적어도 하나 이상의 성분이 더 포함될 수 있다.In one embodiment of the present invention, in the step (a), the medicinal herb may further include at least one ingredient selected from the group consisting of chewing gum, gyeongryeong, taxa, gum, neck, shoulder, sculptor,

본 발명의 한약재 추출물은 연골세포를 증식시키고 IL-1β, TNF-α 등의 염증성 사이토카인을 감소시켜 염증성 관절 질환 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.The herbal medicine extract of the present invention can be effectively used for prophylaxis or treatment of inflammatory joint disease by proliferating chondrocytes and reducing inflammatory cytokines such as IL-1β and TNF-α.

또한, 본 발명의 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물은 천연물에서 유래된 것이므로 인체에 부작용을 일으키지 않아 안정적으로 장기간 사용가능하다.In addition, the herbal medicine extract for preventing or treating inflammatory joint diseases of the present invention is derived from a natural product, so that it can be used for a long period of time without adverse effects on the human body.

본 발명의 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물은 본 발명의 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 제조에 사용될 수 있다.The medicinal plant extract for the prevention or treatment of inflammatory joint disease of the present invention can be used for the production of a pharmaceutical composition containing the medicinal plant extract of the present invention as an active ingredient.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 한약재 추출물 하에서 Hela 세포의 증감 비율을 나타내는 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 한약재 추출물의 SW1353 세포 증식 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 한약재 추출물의 NF-KB 활성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 한약재 추출물의 IL-6 억제 효과를 나타내는 그래프이고, 도 4c 및 도 4d는 본 발명의 한약재 추출물의 TNF-α 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 한약재 추출물의 COX-2 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 한약재 추출물의 iNOS 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 CFA 관절염 유발 쥐의 족부 이미지로, 도 7A는 무처리군, 도 7B는 본 발명의 실시예 1의 한약재 추출물(GHJTY-1) 투여군, 도 7C는 본 발명의 실시예 2의 한약재 추출물(GHJTY-2) 투여군, 도 7D는 본 발명의 실시예 3의 한약재 추출물(GHJTY-3) 투여군 및 도 7E는 본 발명의 실시예 4의 한약재 추출물(GHJTY-4) 투여군을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 한약재 추출물이 CFA 관절염 유발 쥐에 있어 족부종 용적에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9A는 정상 쥐의 족부 이미지이고, 도 9B 내지 도 9E는 CFA 관절염 유발 쥐의 족부 이미지로, 도 9B는 무처리군, 도 9C는 본 발명의 실시예 1의 한약재 추출물 125 mg/kg 투여군(GHJTY-A), 도 9D는 본 발명의 실시예 1의 한약재 추출물 250 mg/kg 투여군(GHJTY-B), 도 9E는 본 발명의 실시예 1의 한약재 추출물 500 mg/kg 투여군(GHJTY-C)을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 한약재 추출물 투여량이 CFA 관절염 유발 쥐에 있어 족부종 용적에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 CFA 관절염 유발 쥐에 있어 본 발명의 한약재 추출물 투여 후 무릎 관절의 병리조직 변화(HE 염색)를 나타내는 이미지이다(HE-stain, Scale bars = 100㎛).
도 12는 CFA 관절염 유발 쥐에 있어 본 발명의 한약재 추출물 투여 후 무릎 관절의 병리조직 변화(Safranin O-fast green 염색)를 나타내는 이미지이다(Safranin O-fast stain, Scale bars = 100㎛).
도 13 및 도 14는 키토산이 코팅된 알지네이트 비드의 약물 방출 효과를 나타내는 도이다.
도 15a는 알지네이트 비드 제조 과정을 나타내는 도이고, 도 15b는 제조된 알지네이트 비드의 전자현미경 이미지이다.
도 16a는 키토산이 코팅된 알지네이트 비드 제조 과정을 나타내는 도이고, 도 16b는 제조된 키토산이 코팅된 알지네이트 비드의 전자현미경 이미지이다.
도 17은 알지네이트 비드와 키토산이 코팅된 알지네이트 비드의 약효 지속성을 나타내는 그래프이다.
FIGS. 1A and 1B are graphs showing the increase / decrease ratio of Hela cells under the herbal medicine extract of the present invention. FIG.
FIGS. 2A and 2B are graphs showing SW1353 cell proliferation effects of the medicinal herb extract of the present invention. FIG.
Figures 3a and 3b are graphs showing the NF- K B activation inhibitory effect of the Chinese medicine extract of the present invention.
FIGS. 4A and 4B are graphs showing IL-6 inhibitory effects of the medicinal herb extract of the present invention, and FIGS. 4C and 4D are graphs showing TNF-α inhibitory effect of the medicinal herb extract of the present invention.
5A and 5B are graphs showing the inhibitory effect of COX-2 on the herbal medicine extract of the present invention.
6A and 6B are graphs showing the iNOS expression inhibitory effect of the medicinal herb extract of the present invention.
Fig. 7 is a photograph of the foot of a CFA arthritis-induced mouse, Fig. 7A is a non-treatment group, Fig. 7B is a group of the herbal medicine extract (GHJTY-1) administration of Example 1 of the present invention, (GHJTY-2), FIG. 7D shows the herbal medicine extract (GHJTY-3) administration group of Example 3 of the present invention, and FIG. 7E shows the herbal medicine extract group (GHJTY-4) administration group of the present invention.
FIG. 8 is a graph showing the effect of the medicinal herb extract of the present invention on the foot volume of the CFA arthritis-induced rats.
Fig. 9A is a foot image of a normal mouse, Fig. 9B to Fig. 9E are images of a foot of a CFA arthritis-induced mouse, Fig. 9B is a no treatment group, Fig. 9C is a group of 125 mg / kg of herbal medicine extract (GHJTY-A), FIG. 9D is a group (GHJTY-B) administered with 250 mg / kg of herbal medicine extract of Example 1 of the present invention, .
10 is a graph showing the effect of the herbal medicine extract dose of the present invention on the volume of the foot species in the CFA arthritis-induced rats.
Fig. 11 is an image showing the pathological change (HE stain) of the knee joint (HE-stain, Scale bars = 100 탆) after administration of the medicinal herb extract of the present invention in CFA arthritis-induced rats.
FIG. 12 is an image (Safranin O-fast green stain, Scale bars = 100 μm) showing a pathological change in the knee joint (Safranin O-fast green staining) after administration of the herbal medicine extract of the present invention in CFA arthritis-induced rats.
13 and 14 are diagrams showing drug release effects of alginate beads coated with chitosan.
FIG. 15A is a view showing an alginate bead manufacturing process, and FIG. 15B is an electron microscope image of the alginate bead produced.
16A is a view showing a process for producing alginate beads coated with chitosan, and FIG. 16B is an electron microscope image of alginate beads coated with chitosan.
17 is a graph showing the efficacy persistence of alginate beads and alginate beads coated with chitosan.

본 발명의 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물은 한약재로 강활을 포함하고 또한 금은화, 당귀, 위령선, 황백, 방기, 진피, 적작약, 창출, 지각 및 감초로 이루어지는 군에서 적어도 3 가지 이상 선택되는 성분들을 포함하되, 상기 선택된 한약재 성분의 각각의 배합 비율은 강활을 기준으로 중량비로 1 : 0.3 ~ 2인 것을 특징으로 한다. The medicinal plant extract for the prevention or treatment of inflammatory joint disease according to the present invention is a medicinal herb which contains at least three or more selected from the group consisting of ginseng and ginseng and belonging to the group consisting of ginseng, angelica, gestorian, yellowish white, bark, dermis, Wherein the blend ratio of the selected herbal ingredients is 1: 0.3 to 2 in weight ratio based on the hardness.

본 발명의 한약재 추출물에 있어서, 상기 한약재에 독활, 복령, 택사, 목통, 목과, 등심초, 조각자, 인동등 및 포영공으로 이루어지는 군에서 적어도 하나 이상의 성분이 더 포함될 수 있다. In the medicinal herb extract of the present invention, the medicinal herb may further contain at least one or more ingredients selected from the group consisting of chewing gum, gum, gum, gum, neck, shoulder, sculptor,

이어, 본 발명의 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법에 대하여 설명한다. Next, a method for producing a herbal medicine extract for preventing or treating inflammatory joint disease of the present invention will be described.

본 발명의 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법은,The method for producing an extract of medicinal materials for the prevention or treatment of inflammatory joint diseases according to the present invention comprises:

(a) 강활을 포함하고 또한 금은화, 당귀, 위령선, 황백, 방기, 진피, 적작약, 창출, 지각 및 감초로 이루어지는 군에서 적어도 3 가지 이상 선택되는 성분들을 포함하되, 상기 성분의 각각의 배합 비율은 강활을 기준으로 중량비로 1 : 0.3 ~ 2인 한약재에 주정을 가하여 추출하는 단계;(a) at least three or more selected from the group consisting of gangbyeol and further comprising at least three elements selected from the group consisting of gold, silver, angelic, gentian, yellow, white, bark, dermis, Extracting the herbal medicine with a weight ratio of 1: 0.3 to 2 based on the hardness;

(b) 상기 (a) 단계에서 추출된 추출물을 여과하는 단계; 및(b) filtering the extract extracted in step (a); And

(c) 상기 (b) 단계에서 여과된 추출물을 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. (c) concentrating the extract filtered in the step (b).

본 발명의 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법을 보다 구체적으로 설명하면, 우선 강활을 포함하고 또한 금은화, 당귀, 위령선, 황백, 방기, 진피, 적작약, 창출, 지각 및 감초로 이루어지는 군에서 적어도 3 가지 이상 선택되는 성분을 포함하는 한약재에 주정을 가하여 추출한다. 상기한 성분 각각의 배합 비율은 강활을 기준으로 중량비로 1 : 0.3 ~ 2이다((a) 단계). 보다 바람직한 각 성분의 배합 비율은 강활을 기준으로 1 : 0.5 ~ 1.4이다. The method for producing the medicinal extract for the prevention or treatment of inflammatory joint diseases according to the present invention will be described in more detail below. First, the method for producing the medicinal extract for inflammatory joint diseases according to the present invention comprises: Extract the herbal medicinal material containing at least three or more selected ingredients by adding the alcohol. The mixing ratio of each of the above-mentioned components is 1: 0.3 to 2 (weight ratio) (step (a)). More preferably, the mixing ratio of each component is 1: 0.5 to 1.4 based on the strength.

상기 (a) 단계에서 추출은 70 내지 100℃에서 실행되는 것이 바람직하다. 추출시 70℃ 미만의 온도에서 추출하면 한약재에 함유된 유효성분의 추출 효율이 떨어지는 문제점이 있다. 보다 바람직한 추출 온도는 93 내지 98℃이다. 또한 추출 시간은 1 내지 3 시간이 바람직하다. 추출 시간이 1 시간 미만이면 한약재에 함유된 유효성분의 추출 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 3시간을 초과하면 추출 효율 증진없이 에너지가 낭비되는 문제점이 있다.In the step (a), the extraction is preferably carried out at 70 to 100 ° C. There is a problem that the extraction efficiency of the active ingredient contained in the medicinal herb is deteriorated when it is extracted at a temperature lower than 70 ° C during the extraction. A more preferable extraction temperature is 93 to 98 占 폚. The extraction time is preferably 1 to 3 hours. If the extraction time is less than 1 hour, there is a problem that the extraction efficiency of the active ingredient contained in the herbal medicine is deteriorated. If the extraction time exceeds 3 hours, energy is wasted without increasing extraction efficiency.

상기 (a) 단계에서 주정은 20 내지 70%인 것이 바람직하고, 보다 바람직한 주정의 농도는 25 내지 50%이다. In the step (a), the alcohol is preferably 20 to 70%, more preferably 25 to 50%.

본 발명의 한약재 추출물 제조방법에서는 발효 주정 추출법을 이용함으로써 한약재에 함유된 유효성분의 추출율을 높일 수 있다. In the method for preparing the medicinal herb extract of the present invention, the extraction rate of the active ingredient contained in the medicinal herb can be increased by using the fermented spirit extraction method.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 한약재가 강활, 금은화, 당귀, 위령선 및 황백이고, 이들의 배합 비율은 중량 기준으로 1 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the herbal medicines in step (a) are selected from the group consisting of ginseng, ginseng, Angelica gonorrhea, Can be from 0.3 to 2.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 한약재가 강활, 금은화, 당귀, 위령선, 방기, 진피, 적작약 및 황백이고, 이들의 배합 비율은 중량 기준으로 1 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the herbal medicine in step (a) is selected from the group consisting of liquefied ginseng, ginseng, Angelica gonorrhea, 2: 0.3 to 2: 0.3 to 2: 0.3 to 2: 0.3 to 2: 0.3 to 2.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 한약재가 강활, 황백, 창출, 방기, 적작약, 지각이고, 이들의 배합 비율은 중량 기준으로 1 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the herbicide in step (a) is selected from the group consisting of strong, yellow, white, 2: 0.3 to 2: 0.3 to 2.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 한약재가 강활, 방기, 위령선, 당귀이고, 이들의 배합 비율은 중량 기준으로 1 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2일 수 있다.In one embodiment of the present invention, in step (a), the medicinal herb is a combination of strong, vigorous, gongjin, and angelica, and the mixing ratio thereof may be 1: 0.3~2: 0.3~2: 0.3~2 .

한편, 상기 (a) 단계에서 상기 한약재에 독활, 복령, 택사, 목통, 목과, 등심초, 조각자, 인동등 및 포영공으로 이루어지는 군에서 적어도 하나 이상의 성분이 더 포함될 수 있다. 이때, 각 성분의 배합 비율은 강활을 기준으로 하여 그에 대하여 0.3 ~ 2의 비율로 포함되는 것이 바람하고 더 바람직하게는 0.5 ~ 1의 비율로 포함된다.In the step (a), the herbal medicine may further contain at least one ingredient selected from the group consisting of chewing gum, gum, gum, throat, neck, shoulder, sculptor, At this time, the compounding ratio of each component is preferably contained in a ratio of 0.3 to 2, more preferably 0.5 to 1, based on the strength.

상기 (a) 단계에서 한약재와 주정의 혼합 비율은 중량 기준으로 1 : 1 ~ 5가 바람직하고, 보다 바람직한 비율은 1 : 2 ~ 3이다.In the step (a), the mixture ratio of the herbal medicine and the alcohol is preferably 1: 1 to 5, more preferably 1: 2 to 3.

이어, 상기 (a) 단계에서 추출된 추출물을 20~50℃로 식힌 후 여과한다((b) 단계).Next, the extract extracted in step (a) is cooled to 20 to 50 ° C and then filtered (step (b)).

이어, 상기 (b) 단계에서 여과된 추출물을 농축시킨다((c) 단계). 이때 농축은 50 내지 70℃에서 실행되는 것이 바람직하다. 농축시 진공증발건조기 또는 회전감압농축기를 이용하여 농축시킬 수 있다.Next, the extract filtered in step (b) is concentrated (step (c)). At this time, the concentration is preferably carried out at 50 to 70 캜. The concentrate can be concentrated using a vacuum evaporator or rotary evaporator.

한편, 상기 (c) 단계에서 농축된 농축물을 동결건조시킬 수 있다((d) 단계). 이때 동결건조는 -90 내지 -60℃에서 실행되는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 동결건조 온도는 -85 내지 -75℃이다.Meanwhile, the concentrate concentrated in the step (c) may be lyophilized (step (d)). In this case, freeze-drying is preferably carried out at -90 to -60 캜. A more preferable freeze-drying temperature is -85 to -75 占 폚.

한편, 본 발명의 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 및 그 제조방법에서 한약재 구성 성분 및 비율은 동일하게 적용된다. In the medicinal plant extracts for the prevention or treatment of inflammatory joint diseases according to the present invention and the preparation method thereof, the constituents and ratios of herbal medicines are the same.

본 발명의 한약재 추출물은 염증성 관절 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 유효성분으로 포함되어 사용될 수 있다.The herbal medicine extract of the present invention can be used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory joint diseases.

상기한 염증성 관절 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 치료학적으로 유효한 양의 한약재 추출물이 포함된다. 바람직하게는 약학조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 5.0 중량%의 한약재 조성물이 포함된다. 보다 바람직한 양은 0.01 내지 1.0 중량%이다.The pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory joint disease includes a therapeutically effective amount of herbal medicine extract. Preferably, 0.001 to 5.0% by weight of the herbal composition composition is contained relative to the total weight of the pharmaceutical composition. A more preferable amount is 0.01 to 1.0% by weight.

상기한 염증성 관절 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 유효성분인 한약재 추출물 이외 당업계의 공지된 담체 및 희석제와 함께 적절한 제형으로 투여될 수 있다. 또한, 목적하는 방법에 따라 비경구투여, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하주사, 좌제 등의 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 한약재 조성물이 함유된 약학조성물이 경구로 투여될 때는 정제, 캡슐, 입자, 분말, 환제, 현탁제, 유화제 또는 시럽 등의 제형으로 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory joint disease may be administered in a suitable formulation together with known carriers and diluents known in the art other than the herbal medicine extract, which is an effective ingredient. In addition, parenteral administration can be administered according to the desired method, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, and the like. When the pharmaceutical composition containing the herbal composition composition of the present invention is orally administered, it can be administered in the form of tablets, capsules, particles, powders, pills, suspensions, emulsions or syrups.

본 발명에 있어서, 통상의 알지네이트 비드 제조 기술을 이용하여 본 발명의 한약재 추출물이 담지된 알지네이트 비드(alginate beads)를 제조할 수 있다. 알지네이트는 알진산 또는 알긴산으로 불리는 다당류로 김, 파래, 우뭇가사리 등의 해조류의 표면에 풍부하게 포함되어 있다. 알지네이트는 아이스크림, 과일쥬스, 사탕류 등의 식품에서 촉각 개선과 안정성 향상을 위해 많이 사용되고 있으며, 소화관에 들어가면 위산에 의한 방어막을 형성하여 제산제와 같은 의약품에 사용되고 있다. In the present invention, alginate beads carrying the herbal medicine extract of the present invention can be produced using conventional alginate bead manufacturing techniques. Alginate is a polysaccharide called alginic acid or alginic acid. It is abundantly contained on the surface of seaweeds such as Kim, Paula and Mugwort. Alginate is widely used for improving tactile sense and stability in foods such as ice cream, fruit juice, and candy. When it enters the digestive tract, it forms a barrier by gastric acid and is used in pharmaceuticals such as antacids.

본 발명의 한약재 추출물이 담지된 알지네이트 비드 표면에 키토산을 코팅할 수 있다. 키토산은 생체 적합성이 뛰어나고 생체 내 존재하는 효소에 의해 분해되는 성질이 있어 조직재생공학, 약물 전달 등의 의료 분야에 응용되고 있다. 알지네이트 비드 표면에 키토산 흡착이 알지네이트 비드로부터의 약물 등의 유효성분 방출을 지연시켜 약효 지속성을 조절할 수 있다(도 13 내지 17 참조).The chitosan can be coated on the surface of the alginate beads carrying the herbal medicine extract of the present invention. Chitosan has excellent biocompatibility and is decomposed by existing enzymes in vivo, and has been applied to medical fields such as tissue regeneration engineering and drug delivery. Adsorption of chitosan on the alginate bead surface can delay the release of the active ingredient such as a drug from the alginate bead to control the efficacy persistence (see Figs. 13 to 17).

알지네이트 비드 표면에 키토산을 코팅할 때 키토산 용액을 형광물질로 표시하여 알지네이트 비드 표면에 키토산이 코팅됨을 확인할 수 있다. 제조되는 알지네이트 비드의 사이즈는 직경 0.5 ~ 2.0 mm (예: 1 mm, 1.5 mm 등)이다. 비드의 크기는 바늘의 직경과 유속에 의해 조절된다. When chitosan is coated on the alginate bead surface, the chitosan solution is indicated as a fluorescent substance, so that chitosan is coated on the alginate bead surface. The size of alginate beads produced is 0.5 to 2.0 mm in diameter (e.g., 1 mm, 1.5 mm, etc.). The size of the bead is controlled by the diameter and flow rate of the needle.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명의 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법을 보다 자세하게 설명한다.
Hereinafter, the method for producing an extract of medicinal materials for the prevention or treatment of inflammatory joint diseases according to the present invention will be described in more detail with reference to the following Examples.

<실시예 1~4> 한약재 추출물 제조&Lt; Examples 1 to 4 > Preparation of herbal medicine extract

본 실시예에서 사용하는 한약재는 화림제약(부산, 한국)으로부터 구입하였고 한약재 시료의 종류와 배합 비율은 표 1에 나타내었다. 표 1에 제시된 시료들을 배합 비율에 따라 배합한 후 세절하였다. 세절한 한약재 시료를 둥근 플라스크에 넣고 30% 주정을 가하여 95~100℃에서 2시간씩 2회 추출하였다. 상기 추출물을 30~40℃로 식힌 후 감압여과장치를 이용하여 여과하였다. 상기 여과된 추출액을 회전감압농축기를 사용하여 50~55℃(수조 온도)에서 농축시켰다. 상기 농축된 추출물을 동결건조기(삼원냉열엔지니어링, 한국)를 이용하여 -80℃의 진공감압 하에서 동결건조시켜 파우더 형태의 한약재 추출물(강활제통음(Ganghwaljetongyeum, GHJTY) 추출물)을 제조하였다.The medicinal herbs used in this example were purchased from Hwangrim Pharmaceutical (Busan, Korea), and the types and blend ratios of medicinal herb samples are shown in Table 1. The samples shown in Table 1 were blended according to the blend ratio and then cut. A sample of herb medicine was placed in a round flask and 30% ethanol was added and extracted twice at 95 to 100 ° C for 2 hours. The extract was cooled to 30 to 40 ° C and filtered using a vacuum filter. The filtered extract was concentrated using a rotary vacuum concentrator at 50-55 캜 (bath temperature). The concentrated extract was lyophilized under vacuum at -80 ° C using a freeze drier (Samwon Cooling Engineering Co., Ltd., Korea) to prepare a powdery herbal medicine extract (Ganghwaljetongyeum (GHJTY) extract).

구성 한약재
(배합 비율, 중량 기준)
Organic herbal medicine
(Mixing ratio, weight basis)
수율
(%)
yield
(%)
실시예 1Example 1 강활 : 금은화 : 당귀: 위령선 : 황백
(6 : 4 : 4 : 4 : 3)
Ganghwam: Gwanghwha: Gangwon: Majesty: Yellowish white
(6: 4: 4: 4: 3)
18.2618.26
실시예 2Example 2 강활 : 금은화 : 당귀 : 위령선 : 방기 : 진피 : 적작약 : 황백
(6 : 4 : 4 : 4 : 4 : 4 : 4 : 3)
Ganghwam: Gwanghwha: Gangwon: Majesty: Bangui: Dermis: White medicine: Yellowish white
(6: 4: 4: 4: 4: 4: 4: 3)
25.5525.55
실시예 3Example 3 황백 : 창출 : 강활 : 방기 : 적작약 : 지각
(4 : 4 : 3 : 3 : 3 : 3)
Hwang Baek: Creation: Ganghwam: Bangui:
(4: 4: 3: 3: 3: 3)
19.5419.54
실시예 4Example 4 강활 : 방기 : 위령선 : 당귀
(6 : 4 : 4 : 4)
Ganghwam: Bangui: Wise Line: Angelica
(6: 4: 4: 4)
22.122.1

실시예에서 제조된 GHJTY 추출물을 이용하여 하기의 실험을 실시하였다. GHJTY 추출물은 PBS(phosphate buffer saline) 1 ml 당 0.03 ~ 1.0 mg의 농도로 사용되었다.
The following experiment was carried out using the GHJTY extract prepared in the examples. GHJTY extract was used at a concentration of 0.03 ~ 1.0 mg per 1 ml of PBS (phosphate buffer saline).

<실험예 1> <Experimental Example 1>

1. 실험 세포주1. Experimental cell line

HeLa 세포(Human cervical adenocarcinoma cell line), 마우스 대식세포 RAW 264.7, 사람 연골육종 세포 SW1353, 토끼 무릎 활막세포 HIG-82를 이용하였다. HIG-82 세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10% FBS(fatal bovine serum)(GIBCO, Invitrogen)를 함유한 F-12(Ham's F-12 nutrient mix medium)(GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. HeLa 세포와 RAW 264.7 세포(한국 세포주은행, 한국)를 각각 DMEM(GIBCO, Invitrogen)와 RPMI(GIBCO, Invitrogen)로 배양하였다. (* p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001)
HeLa cells (human cervical adenocarcinoma cell line), mouse macrophage RAW 264.7, human chondrosarcoma SW1353, and rabbit knee synovial cell HIG-82 were used. HIG-82 cells (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) were mixed with F-12 (Ham's F- 12 nutrient mix medium (GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in a 5% CO 2 incubator. HeLa cells and RAW 264.7 cells (Korean Cell Line Bank, Korea) were cultured with DMEM (GIBCO, Invitrogen) and RPMI (GIBCO, Invitrogen), respectively. (* p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; *** p < 0.001)

2. GHJTY 추출물의 안전성 확인 (In vitro) 2. Safety of GHJTY extract (in vitro)

HeLa 세포에 실시예의 한약재 추출물을 가하고 MTS assay를 실시한 후 Hela 세포의 증감비율을 도 1에 그래프로 나타내었다. 도 1a 및 도 1b에 도시되어 있는 바와 같이, 실시예 1~4의 한약재 추출물이 Hela 세포 증식률을 감소시키지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 한약재 추출물이 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
Fig. 1 graphically shows the increase / decrease ratio of Hela cells after addition of herbal medicinal extracts of the examples to HeLa cells and MTS assay. As shown in FIGS. 1A and 1B, it was found that the Herbal Extracts of Examples 1 to 4 do not decrease Hela cell proliferation rate. Therefore, it was confirmed that the herbal medicine extract of the present invention does not show toxicity.

3. 사람 연골세포 SW1353 증식 효과3. Propagation effect of human cartilage cell SW1353

SW1353 세포에 실시예에서 제조된 한약재 추출물을 가하고 MTS assay를 실시하였다. 도 2a 및 도 2b에 도시되어 있는 바와 같이, 실시예 1~4의 한약재 추출물이 SW1353 세포 증식에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
The herbal extracts prepared in the examples were added to SW1353 cells and subjected to MTS assay. As shown in FIGS. 2A and 2B, it was confirmed that the herbal medicine extracts of Examples 1 to 4 were effective for SW1353 cell proliferation.

4. HIG-82 세포에서 IL-1β에 의해 유도된 NF-KB 활성 억제 효과4. The NF- K B activation inhibitory effect induced by IL-1β in the cell 82-HIG

HIG-82 세포에서 IL-1β를 처리하여 염증을 유도한 후 실시예에서 제조된 한약재 추출물을 가하고 Reporter assay를 이용하여 염증성 사이토카인의 생성조절 물질인 NF-KB 활성화 과정의 억제 효과를 측정하였다. NF-KB가 활성화되어 시토졸(cytosol)에서 핵으로 전좌(translocation) 되는 것에 대한 억제 효과를 확인하였다. 도 3a 및 도 3b에 도시되어 있는 바와 같이, 실시예 1~4의 한약재 추출물이 NF-KB의 활성을 억제함을 확인할 수 있었다.
To process the IL-1β in HIG-82 cells after inducing inflammation was added to the Chinese medicine extract prepared in Example using the Reporter assay to measure the inhibitory effect of the NF- K B activation process produced regulators of inflammatory cytokines . The inhibitory effect of NF- K B on cytosol-to-nuclear translocation was confirmed. As shown in Figure 3a and 3b, the medicinal herb extracts of Examples 1-4 and confirmed that inhibiting the activity of NF- K B.

5. 관절염 유도 원인 물질인 사이토카인 억제 효과5. Cytokine inhibitory effect, the causative agent of arthritis

RAW 264.7 세포에 실시예에서 제조된 한약재 추출물을 가하고 ELISA assay kit를 이용하여 IL-6 및 TNF-α 량을 측정하고 그 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4a 및 도 4b에 도시되어 있는 바와 같이, 실시예 1~4의 한약재 추출물이 RAW 264.7 세포에서 IL-6 량을 감소시킴을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4c 및 도 4d에 도시되어 있는 바와 같이, 실시예 1~4의 한약재 추출물이 RAW 264.7 세포에서 TNF-α 량을 감소시킴을 확인할 수 있었다.
The amount of IL-6 and TNF-alpha was measured by adding the herbal medicine extract prepared in Example to RAW 264.7 cells using ELISA assay kit, and the result is shown in FIG. As shown in FIGS. 4A and 4B, it was confirmed that the herbal medicine extracts of Examples 1 to 4 reduced IL-6 levels in RAW 264.7 cells. 4C and 4D, it was confirmed that the herbal medicine extracts of Examples 1 to 4 decreased the amount of TNF-α in RAW 264.7 cells.

6. RAW 264.7 세포에서 Cyclooxygenase(COX-2) 저해 활성 효과 6. Effect of Cyclooxygenase (COX-2) Inhibitory Activity on RAW 264.7 Cells

RAW 264.7 세포에 실시예에서 제조된 한약재 추출물을 처리한 후 LPS(lipopolysaccharide)를 가하여 COX-2를 유도하였다. 세포를 분쇄(lysis)하여 웨스턴 블럿 분석법으로 COX-2 단백질 양을 측정하였다. 대조군으로 COX-2 저해제(inhibitor)로서 비스테로이드성 항염증약물인 셀레콕시브(Celecoxib)를 사용하였다. 도 5a 및 도 5b에 도시되어 있는 바와 같이, 실시예 1~4의 한약재 추출물이 RAW 264.7 세포에서 COX-2의 발현을 감소시킴을 확인할 수 있었다.
RAW 264.7 cells were treated with the herbal medicine extracts prepared in the examples and LPS (lipopolysaccharide) was added to induce COX-2. Cells were lysed and the amount of COX-2 protein was determined by Western blot analysis. As a control, Celecoxib, a non-steroidal anti-inflammatory drug, was used as a COX-2 inhibitor. As shown in FIGS. 5A and 5B, it was confirmed that the herbal medicine extracts of Examples 1 to 4 reduced the expression of COX-2 in RAW 264.7 cells.

7. RAW 264.7 세포에서 iNOS 저해 활성 효과 7. Effect of iNOS inhibitory activity on RAW 264.7 cells

RAW 264.7 세포에 실시예에서 제조된 한약재 추출물을 처리한 후 LPS를 가하여 iNOS를 유도하였다. 세포를 분쇄하여 웨스턴 블럿 분석법으로 iNOS 단백질 양을 측정하였다. 도 6a 및 6b에 도시되어 있는 바와 같이, 실시예 1~4의 한약재 추출물이 RAW 264.7 세포에서 iNOS 발현을 감소시킴을 확인할 수 있었다.
RAW 264.7 cells were treated with the herbal medicine extracts prepared in the examples, and LPS was added to induce iNOS. The cells were pulverized and the amount of iNOS protein was measured by Western blot analysis. As shown in FIGS. 6A and 6B, it was confirmed that the herbal extract extracts of Examples 1 to 4 reduced iNOS expression in RAW 264.7 cells.

<실험예 2> <Experimental Example 2>

1. 실험 재료1. Experimental material

체중이 약 200~210 g의 Sprague Dawley계의 흰쥐를 항온항습 환경의 사육장(실내온도 24~26℃, 습도 40~60%) 내에서 고형사료(Pellet, GMO, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 1주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험기간 동안에도 물과 고형사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
A Sprague Dawley rats weighing about 200-210 g were fed with a solid feed (Pellet, GMO, Korea) and water in a constant temperature and humidity environment (24-26 ° C, humidity 40-60% After the adaptation to the laboratory environment for more than one week, it was used in the experiment. During the experiment, water and solid feed were freely consumed.

2. 실험 방법2. Experimental Method

(1) 군 분리(1) Group separation

1차 실험에서는 정상군(normal group), 관절염 유발시킨 후 무처리한 대조군(control group), 관절염 유발시킨 후 실시예 1의 한약재 추출물 500 mg/kg 투여 군(GHJTY-1), 실시예 2의 한약재 추출물 500 mg/kg 투여군(GHJTY-2), 실시예 3의 한약재 추출물 500 mg/kg 투여군(GHJTY-3), 실시예 4의 한약재 추출물 500 mg/kg 투여군(GHJTY-4)으로 나누었다.(GHJTY-1) in Example 1, the herbal medicine extract group (GHJTY-1) in Example 1, and the control group (control group) after arthritis induction in the first experiment, (GHJTY-2), 500 mg / kg of herbal medicine extract (GHJTY-3) and 500 mg / kg of herbal medicine extract of Example 4 (GHJTY-4).

2차 실험에서는 정상군(normal group), 관절염 유발시킨 후 무처리한 대조군(control group), 관절염 유발시킨 후 실시예 1의 한약재 추출물 125 mg/kg 투여군(GHJTY-A), 실시예 1의 한약재 추출물 250 mg/kg 투여군(GHJTY-B), 실시예 1의 한약재 추출물 500 mg/kg 투여군(GHJTY-C)로 나누었다.
(GHJTY-A) in Example 1, the herbal medicine extract of Example 1 (GHJTY-A), the herbal medicine extract of Example 1, the control group (GHJTY-B), 250 mg / kg of extract, and 500 mg / kg of herbal medicine extract (GHJTY-C).

(2) CFA 관절염 유발(2) induced CFA arthritis

관절염 1차 유발은 Complete Freund's Adjuvant(Sigma, St. Louis, MD, USA, CFA)로 흰쥐의 왼쪽 슬관절에 살균 피하주사기(Sterile Hypodermic syringe)(Korea vaccine co, Korea)로 0.25 ㎖ 씩 투여하였다. 7일 경과 후, 관절염 2차 유발은 CFA로 흰쥐의 왼쪽 슬관절 아래 방향으로 0.05 ㎖ 씩 투여하고 왼쪽 발바닥에 0.05 ㎖ 씩 투여하였다.
The first induction of arthritis was performed with 0.25 ml of Sterile Hypodermic syringe (Korea vaccine co., Korea) in the left knee of the rats with Complete Freund's Adjuvant (Sigma, St. Louis, MD, USA, CFA). After 7 days, the second induction of arthritis was administered 0.05 ㎖ in the direction of the left knee of the rat with CFA, and 0.05 ml was administered to the left footpad.

(3) 약물 투여(3) Drug administration

각 한약재 추출물 투여는 관절염 유발 후 10일째부터 시작하였으며, 1일에 각 1회씩 총 10회에 걸쳐 시행되었다. 각 약재 추출물은 경구 존대(oral zonde)를 이용하여 구강 투여하였다.
The administration of each medicinal herb extract started 10 days after arthritis induction and was performed 10 times for 1 time each day. Each drug extract was orally administered by oral zonde.

(4) 발목 이하 부종 측정(4) ankle swelling measurement

이소플루레인(isoflurane) 2.5%와 O2로 혼합된 가스 마취상태 하에서 Digital Plethymometer(LE7500, Panlab, Spain)를 이용하여 흰쥐의 발목 이하 부종을 측정하였다. 측정은 실험시작 전, 유발 후 10일, 12일(약물투여 후 3일), 14일(약물투여 후 5일), 16일(약물투여 후 7일), 18일(약물투여 후 9일), 20일(약물투여 후 10일)에 각각 시행하였다.
Under anesthesia with 2.5% isoflurane and O 2 , anesthesia was measured with a digital plethysmometer (LE7500, Panlab, Spain). Measurements were taken at 10 days, 12 days (3 days after drug administration), 14 days (5 days after drug administration), 16 days (7 days after drug administration), 18 days (9 days after drug administration) , And 20 days (10 days after drug administration), respectively.

(5) 혈액 및 혈청학적 검사(5) Blood and serological tests

채혈에 의하여 얻어진 혈액 중 약 100 ㎕를 EDTA-bottle에 넣은 후 곧바로 Multispecies Hematology Analyser(950, Hemavet, USA)에 주입하여 Leukocytes, Erythrocytes, WBC, RBC, HGB, HCT를 측정하였다. 나머지 혈액은 고속원심분리기(Centricon T-42K, Italy)에서 3,500 rpm으로 20분간 시행하여 혈청을 분리하였으며, 혈청 분석으로는 AST와 ALT를 측정하였다.
Approximately 100 μl of the blood obtained by blood collection was placed in an EDTA-bottle and immediately injected into Multispecies Hematology Analyzer (950, Hemavet, USA) to measure Leukocytes, Erythrocytes, WBC, RBC, HGB and HCT. The remaining blood was separated from the serum by centrifugation at 3,500 rpm for 20 minutes on a high-speed centrifuge (Centricon T-42K, Italy). AST and ALT were measured by serum analysis.

(6) TNF-α 측정(6) Measurement of TNF-alpha

TNF-α측정은 Rat TNF-α(Invitrogen, USA)를 사용하여 측정하였다. Rat TNF-α가 코팅된 microplate에 Rat TNF-αstandard, serum, control 100 ㎕를 첨가하고 plate cover로 tapping한 후에 1분간 혼합하고 실온에 2시간 방치하였다. Washing solution 400 ㎕로 4회 세척 후 Rt TNF-αBiontin Conjugate 100 ㎕를 첨가하고 plate cover를 덮고 실온에서 1시간 방치하였다. Washing solution 400 ㎕로 4회 세척한 후 Streptavidin-HRP Working solution 100 ㎕를 첨가하고 plate cover를 덮고 실온에서 30분간 방치하였다. Washing solution 400 ㎕로 4회 세척 후 Stabilized Chromogen 100 ㎕를 첨가하고 plate cover를 덮고 실온(어두운 상태) 30분간 방치하였다. Stop solution 100 ㎕를 plate에 넣고 발색반응을 중지시킨 후 Spectramax(M2, Molecular Devices, USA)로 450 ㎚에서 OD(Optical density)를 측정하였다. Standard Curve를 만들어 샘플의 TNF-α양을 assay하였다.
TNF-α was measured using Rat TNF-α (Invitrogen, USA). After adding 100 μl of Rat TNF-αstandard, serum, and control to a microplate coated with Rat TNF-α, the mixture was taped with a plate cover, mixed for 1 minute, and left at room temperature for 2 hours. After washing with 400 μl of washing solution 4 times, 100 μl of Rt TNF-αBiontin Conjugate was added, and the plate cover was covered and left at room temperature for 1 hour. After washing 4 times with 400 μl of washing solution, 100 μl of Streptavidin-HRP Working solution was added, and the plate cover was covered and left at room temperature for 30 minutes. After washing with 400 ㎕ of washing solution 4 times, 100 ㎕ of Stabilized Chromogen was added, and the plate cover was covered and allowed to stand at room temperature (dark state) for 30 minutes. After stopping the color reaction, 100 μl of stop solution was added to the plate and OD (optical density) was measured at 450 nm with Spectramax (M2, Molecular Devices, USA). A standard curve was made to assay the amount of TNF-α in the sample.

(7) Interleukin-1β (IL-1β) 측정(7) Measurement of interleukin-1? (IL-1?)

IL-1β 측정은 Rat IL-1β(R&D Systems, USA)를 사용하여 측정하였다. Microplate의 각 well에 Assy Diluent RD1-21 50 ㎕을 넣고 Rat IL-1β standard, serum, control 50 ㎕를 첨가하고 plate cover로 tapping한 후에 1분간 혼합하고 실온에 2시간 방치하였다. Washing solution 400 ㎕로 5회 세척 후 Rat IL-1β conjugate 100 ㎕를 첨가하고 plate cover를 덮고 실온에 2시간 방치하였다. Washing solution 400 ㎕로 5회 세척 후 Substrate solution 100 ㎕를 첨가하고 plate cover를 덮고 실온(어두운 상태) 30분간 방치하였다. Stop solution 100 ㎕를 plate에 넣고 발색반응을 중지시킨 후 Spectramax(M2, Molecular Devices, USA)로 450 ㎚에서 OD(Optical density)를 측정하였다. Standard curve를 만들어 샘플의 IL-1β 양을 assay하였다.
IL-1β was measured using Rat IL-1β (R & D Systems, USA). 50 μl of Assy Diluent RD1-21 was added to each well of the microplate, and 50 μl of Rat IL-1β standard, serum, and control were added. The mixture was taped with a plate cover, mixed for 1 minute, and left at room temperature for 2 hours. After washing with 400 μl of washing solution 5 times, 100 μl of Rat IL-1β conjugate was added, and the plate cover was covered and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing with 400 μl of washing solution 5 times, 100 μl of the substrate solution was added, and the plate cover was covered and allowed to stand at room temperature (dark state) for 30 minutes. After stopping the color reaction, 100 μl of stop solution was added to the plate and OD (optical density) was measured at 450 nm with Spectramax (M2, Molecular Devices, USA). A standard curve was generated to assay the amount of IL-1β in the sample.

(8) Interleukin-6 (IL-6) 측정(8) Interleukin-6 (IL-6) measurement

IL-6 측정은 Rat IL-6(Invitrogen, USA)를 사용하여 측정하였다. Rat IL-6가 코팅된 microplate에 Rat IL-6 standard 100 ㎕, serum, control 50 ㎕에 incubation Buffer 50 ㎕를 첨가하고 plate cover로 tapping한 후에 1분간 혼합하고 37℃에 2시간 방치하였다. Washing solution 400 ㎕로 4회 세척 후 Rt Biotinylated anti IL-6 100 ㎕를 첨가하고 plate cover를 덮고 실온에 1시간 30분간 방치하였다. Washing solution 400 ㎕로 4회 세척 후 Streptavidin-HRP Working solution 100 ㎕를 첨가하고 plate cover를 덮고 실온에 30분간 방치하였다. Washing solution 400 ㎕로 4회 세척 후 Stabilized Chromogen 100 ㎕를 첨가하고 plate cover를 덮고 실온(어두운 상태) 30분간 방치하였다. Stop solution 100 ㎕를 plate에 넣고 발색반응을 중지시킨 후 Spectramax(M2, Molecular Devices, USA)로 450 ㎚에서 OD(Optical density)를 측정하였다. Standard curve를 만들어 샘플의 IL-6 양을 assay하였다.
IL-6 measurements were measured using Rat IL-6 (Invitrogen, USA). After adding 50 μl of incubation buffer to 100 μl of Rat IL-6 standard and 50 μl of Rat IL-6 standard on a microplate coated with Rat IL-6, the plate was taped with a plate cover and mixed for 1 minute and left at 37 ° C for 2 hours. After washing 4 times with 400 μl of washing solution, 100 μl of Rt biotinylated anti-IL-6 was added, and the plate cover was covered and left at room temperature for 1 hour and 30 minutes. After washing 4 times with 400 μl of washing solution, 100 μl of Streptavidin-HRP working solution was added and the plate cover was covered and left at room temperature for 30 minutes. After washing with 400 ㎕ of washing solution 4 times, 100 ㎕ of Stabilized Chromogen was added, and the plate cover was covered and allowed to stand at room temperature (dark state) for 30 minutes. After stopping the color reaction, 100 μl of stop solution was added to the plate and OD (optical density) was measured at 450 nm with Spectramax (M2, Molecular Devices, USA). A standard curve was generated to assay the amount of IL-6 in the sample.

(9) 조직학적 검사(9) Histological examination

① 조직 제작① Organization

우측 슬관절을 적출하여 Bouin 용액에 24 시간 이상 고정하였으며, 2.5% 질산(nitric acid) 용액에서 7일 동안 매일 질산액을 교환하면서 탈회(decalcification)를 실시하였다. 파라핀 블록의 제작을 위해 채취한 조직은 Tissue Processor(Tissue-Tex Ⅱ, Japan)를 사용하여 조직탈수 과정을 거치게 하였다.
The right knee was extracted and fixed in Bouin solution for 24 hours or more, and decalcification was performed in a 2.5% nitric acid solution while exchanging the nitric acid solution for 7 days. For the preparation of the paraffin block, the tissues were subjected to a tissue dehydration process using a Tissue Processor (Tissue-Tex II, Japan).

② Hematoxylin & Eosin (H&E) stain② Hematoxylin & Eosin (H & E) stain

조직은 탈파라핀(deparaffin)을 거친 후 Hematoxylin(Muto, Japan)과 Eosin(Muto, Japan)으로 염색한 후 물로 세척하고 탈수(dehydration) 과정을 거쳐 광학 현미경(Nikon, Japan)으로 관찰하였다.
The tissues were stained with hematoxylin (Muto, Japan) and Eosin (Muto, Japan) after deparaffin treatment, washed with water, dehydrated and observed with an optical microscope (Nikon, Japan).

③ Safranin O - fast stain③ Safranin O - fast stain

조직은 탈파라핀(deparaffin) 거친 후 Weigert's Iron Hematoxylin(Sigma, USA) 용액에 10분간 반응시킨 후 10분간 흐르는 물에 세척하였고, 0.001% Fast green(Sigma, USA) 용액에 5분 동안 염색하고, 다시 1% 아세트산 용액에 10초간 반응시킨 후 0.1% Safranin O(Sigma, USA) 용액에 5분간 염색하였다. 그 다음 10분간 충분히 세척하여 탈수 과정을 거쳐 광학 현미경(Nikon, Japan)으로 관찰하였다.
Tissues were incubated in Weigert's Iron Hematoxylin (Sigma, USA) for 10 minutes, washed in 10 minutes of water, stained for 5 minutes in 0.001% Fast green (Sigma, USA) After incubating for 10 seconds with 1% acetic acid, the cells were stained with 0.1% Safranin O (Sigma, USA) for 5 minutes. Then, it was thoroughly washed for 10 minutes, dehydrated and observed with an optical microscope (Nikon, Japan).

3. 통계 분석3. Statistical Analysis

본 연구의 통계학적 분석은 SPSS 14.0 ver. for windows를 사용하였다. 관절염 유발 후 용량별 투여에 따른 각 군간의 통계학적 분석은 One-Way ANOVA test를 시행하였고 사후검정은 LSD test로 분석하였다. 실험의 분석에서 유의수준은 p<0.05로 설정하여 검정하였다.
The statistical analysis of this study was SPSS 14.0 ver. for windows. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of each group according to dose after arthritis induction, and the post test was analyzed by LSD test. In the analysis of the experiment, significance level was set by setting p <0.05.

4. 결과4. Results

가) 1차 실험: 한약재 추출물의 유효성 확인 실험A) 1st experiment: validation test of herbal medicine extract

(1) 족부 육안 관찰(1) Visual observation of the foot

도 7A 내지 도 7E에 도시되어 있는 바와 같이, CFA로 유발된 관절염으로 인하여 흰쥐의 좌측 후지에 발적과 종창이 발현되었다. 도 7A의 무처리군은 발적과 종창이 심하게 발현된 것에 비하여 도 7B 내지 도 7D의 본 발명의 실시예 1~4의 한약재 추출물 투여군(GHJTY-1 ~ GHJTY-4)들은 발적과 종창이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히, GHJTY-1군(도 7B)과 GHJTY-3군(도 7D)에서 발적과 종창이 많이 줄어들었음을 육안으로 확인할 수 있었다.
As shown in Figs. 7A to 7E, arthritis induced by CFA caused redness and swelling in the left hind paw of the rat. 7A to 7D. In contrast, the untreated group of FIG. 7A severely showed redness and swelling, whereas those of the herbal medicine extract-administered groups (GHJTY-1 to GHJTY-4) of Examples 1 to 4 of the present invention of FIGS. 7B to 7D showed decreased redness and swelling I could confirm. In particular, it was visually confirmed that the redness and swelling of the GHJTY-1 group (FIG. 7B) and the GHJTY-3 group (FIG. 7D)

(2) 족부종 변화에 미치는 영향(2) Effect on the change of foot species

표 2 및 도 8에 도시되어 있는 바와 같이, 본 발명의 한약재 추출물 투여군(GHJTY-1 ~ GHJTY-4)이 대조군에 비하여 CFA 관절염 유발 쥐에 있어 족부종 용적이 감소함을 확인할 수 있었다. 대조군에 비하여 GHJTY-1군은 투여 후 6일째와 8일째(p<0.01)에 유의하게 감소하였고, GHJTY-2군, GHJTY-3군, GHJTY-4군에 있어서는 투여 후 4일째 이후 감소의 경향을 보였다.As shown in Table 2 and FIG. 8, it was confirmed that the volume of the foot species decreased in the CFA arthritis-induced rats compared with the control group of the herbal medicine extract-administered groups (GHJTY-1 to GHJTY-4) of the present invention. In the GHJTY-2, GHJTY-3, and GHJTY-4 groups, the GHJTY-1 group decreased significantly after 6 days and 8 days (p <0.01) Respectively.

Figure pat00001
Figure pat00001

(3) Serum aminotransferase에 미치는 영향(3) Effect on serum aminotransferase

1) Aspartate Aminotransferase (AST) 함량1) Aspartate Aminotransferase (AST) content

GHJTY 투여가 AST 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비하여 GHJTY-1군과 GHJTY-4군은 감소의 경향을 나타내었다(표 3).GHJTY-1 and GHJTY-4 groups showed a tendency to decrease compared to the control group (Table 3).

Figure pat00002
Figure pat00002

2) Alanine Aminotransferase (ALT) 함량2) Alanine Aminotransferase (ALT) content

GHJTY 투여가 ALT 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비하여 실험군 모두 감소의 경향을 보였다(표 4).The effect of GHJTY on ALT changes was observed in all of the experimental groups compared to the control group (Table 4).

Figure pat00003
Figure pat00003

(4) 혈액 Complete Blood Count(CBC) 함량 변화에 미치는 영향(4) Effect on blood total blood count (CBC) content change

1) 백혈구(leukocytes) 1) Leukocytes (leukocytes)

GHJTY 투여가 혈액 CBC 중 백혈구 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 각 지표 모두 대조군에 비하여 GHJTY-1군, GHJTY-2군, GHJTY-3군, GHJTY-4군은 모두 유의한 차이를 나타내지 않았고 비슷한 수준을 나타내었다(표 5).GHJTY-2 group, GHJTY-3 group and GHJTY-4 group showed no significant difference in all indicators compared to the control group as a result of observing the effect of GHJTY administration on leukocyte change in blood CBC (Table 5).

Figure pat00004
Figure pat00004

2) 적혈구(erythrocytes)와 혈소판(thrombocytes)2) Erythrocytes and thrombocytes

GHJTY 투여가 혈액 CBC 중 적혈구와 혈소판 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 각 지표 모두 대조군에 비하여 GHJTY-1군, GHJTY-2군, GHJTY-3군, GHJTY-4군은 모두 유의한 차이를 나타내지 않았고 비슷한 수준을 나타내었다(표 6).GHJTY-1, GHJTY-2, GHJTY-3, and GHJTY-4 showed significant differences in the levels of red blood cells and platelets in the blood CBC. (Table 6).

Figure pat00005
Figure pat00005

나) 2차 실험: 선정약재 용량별 투여에 의한 유효성 실험B) Second experiment: efficacy experiment by dosing of selected medicament dose

(1) 족부 육안 관찰(1) Visual observation of the foot

GHJTY 투여가 육안적 소견에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군(도 9A)에 비하여 대조군(도 9B)의 경우 CFA로 유발된 좌측 후지에 발적 및 종창이 관찰되었으며, GHJTY-A군(도 9C)과 GHJTY-B군(도 9D), GHJTY-C군(도 9E)에서 발적과 종창의 발현은 점차 줄어들었다.
(Fig. 9B) compared to the normal group (Fig. 9A). The GHJTY-A group (Fig. 9C) and the GHJTY- ) And GHJTY-B (Fig. 9D) and GHJTY-C (Fig. 9E), the expression of redness and swelling gradually decreased.

(2) 족부종 변화에 미치는 영향(2) Effect on the change of foot species

GHJTY 투여가 족부종 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비하여 GHJTY-A군은 투여 후 4일째와 6일째(p<0.01), 8일째와 10일째(p<0.01)에 유의하게 감소하였고, GHJTY-B군은 투여후 4일째, 6일째와 10일째(p<0.05)에 유의하게 감소하였고, GHJTY-C군은 8일째와 10일째(p<0.05)에 유의하게 감소하였다(표 7 및 도 10).The effect of GHJTY on the change of foot was significantly decreased in the GHJTY-A group on the 4th day and 6th day (p <0.01), 8th day and 10th day (p <0.01) , And GHJTY-B group significantly decreased on day 4, day 6 and day 10 (p <0.05), whereas GHJTY-C group decreased significantly on day 8 and day 10 (p <0.05) And Fig. 10).

Figure pat00006
Figure pat00006

(3) Serum aminotransferase에 미치는 영향(3) Effect on serum aminotransferase

1) Aspartate Aminotransferase (AST) 함량1) Aspartate Aminotransferase (AST) content

GHJTY 투여가 AST 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비하여 GHJTY-A군과 GHJTY-B군은 유의한 차이는 없었으나 감소의 경향을 보였고, GHJTY-C군은 유의한 감소(P<0.05)를 나타내었다(표 8).The GHJTY-C group showed a significant decrease (P <0.05), while the GHJTY-B and GHJTY-B groups did not show any significant difference ) (Table 8).

Figure pat00007
Figure pat00007

2) Alanine Aminotransferase (ALT) 함량2) Alanine Aminotransferase (ALT) content

GHJTY 투여가 ALT 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비하여 GHJTY-B군은 유의한 차이는 없었으나 감소의 경향을 보였고, GHJTY-C군은 유의한 감소(P<0.05)를 나타내었다(표 9).The GHJTY-C group showed a significant decrease (P <0.05) in the GHJTY-B group compared to the control group, but not in the GHJTY-B group Table 9).

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Figure pat00008

(4) Anti-inflammatory factor에 미치는 영향(4) Effect on Anti-inflammatory Factor

1) Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α) 함량1) Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) content

GHJTY 투여가 TNF-α 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비하여 GHJTY-A군, GHJTY-B, GHJTY-C군은 유의한 감소(P<0.01)를 나타내었다(표 10).GHJTY-A, GHJTY-B, and GHJTY-C groups showed a significant decrease (P <0.01) compared to the control group (Table 10).

Figure pat00009
Figure pat00009

2) Interleukin-1β(IL-1β) 함량2) Interleukin-1? (IL-1?) Content

GHJTY 투여가 IL-1β 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비하여 GHJTY-A군, GHJTY-C군은 유의한 감소(P<0.05)를 나타내었다(표 11).GHJTY-A and GHJTY-C groups showed a significant decrease (P <0.05) compared with the control group (Table 11).

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Figure pat00010

3) Interleukin-6(IL-6) 함량3) Interleukin-6 (IL-6) content

GHJTY 투여가 IL-6 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비하여 GHJTY-A군, GHJTY-B군, GHJTY-C군은 유의한 감소(P<0.01)를 나타내었다(표 12).GHJTY-B and GHJTY-C groups showed a significant decrease (P <0.01) compared to the control group (Table 12).

Figure pat00011
Figure pat00011

(5) 혈액 Complete Blood Count(CBC) 함량 변화에 미치는 영향(5) Effect on blood total blood count (CBC) content change

1) 백혈구(leukocytes) 1) Leukocytes (leukocytes)

GHJTY 투여가 혈액 CBC 중 백혈구 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군에 비하여 대조군은 림프구(lymphocytes)와 단핵구(monocytes)에서 유의하게 증가된 상태를 나타내었고(p<0.05), WBC와 호중구(neutrophils)에서는 유의하지는 않았으나 증가된 경향을 나타내었다. 대조군에 비하여 GHJTY-A군, GHJTY-B군, GHJTY-C은 각 지표에서 유의성은 인정되지 않았으나 감소의 경향을 나타내었다(표 13).The effect of GHJTY on leukocyte changes in blood CBC was significantly increased in the lymphocytes and monocytes compared to the normal group (p <0.05), and WBC and neutrophils neutrophils), but this tendency was increased. The GHJTY-A, GHJTY-B, and GHJTY-C groups showed no significant difference but showed a tendency to decrease (Table 13).

Figure pat00012
Figure pat00012

2) 적혈구(erythrocytes)와 혈소판(thrombocytes) 2) Erythrocytes and thrombocytes

GHJTY 투여가 혈액 CBC 중 적혈구와 혈소판 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 각 지표 모두 대조군에 비하여 GHJTY-A군, GHJTY-B군, GHJTY-C군은 모두 유의한 차이를 나타내지 않았고 비슷한 수준을 나타내었다(표 14).GHJTY-A, GHJTY-B, and GHJTY-C did not show any significant differences in the levels of erythrocytes and platelets in the blood CBC, (Table 14).

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Figure pat00013

(6) 조직학적 소견(6) Histological findings

1) HE 염색 1) HE staining

GHJTY 투여가 조직학적 소견에 미치는 영향을 HE 염색을 한 후 관찰한 결과, 대조군(도 11A)에서는 윤활막의 일부분이 손상되어 있었으며, 대조군에 비하여 GHJTY-A군(도 11B), GHJTY-B군(도 11C) 및 GHJTY-C군(도 11D)에서는 윤활막 세포(*), 연골소강, 연골세포가 뚜렷한 것을 확인할 수 있었다. 도 11에서 활막(synovial membrane)은 화살표(arrow)로 연골세포는 별표(*)로 표시되어 있다.
11A) and GHJTY-B group (FIG. 11B), compared with the control group. In contrast, the GHJTY-A group 11C) and the GHJTY-C group (FIG. 11D), it was confirmed that the synovial cells (*), cartilage lobules and chondrocytes were distinct. In Fig. 11, the synovial membrane is indicated by an arrow, and the cartilage cells are indicated by an asterisk (*).

2) Safranin O-fast green 염색2) Safranin O-fast green staining

GHJTY 투여가 조직학적 소견에 미치는 영향을 safranin O-fast stain으로 관찰한 결과, 대조군(도 12A)의 관절연골은 정상군에 비하여 프로테오글리칸 양성반응이 낮게 나타났다. GHJTY-A군(도 12B), GHJTY-B군(도 12C), GHJTY-C군(도 12D)에서는 대조군에 비하여 뼈조직과 인접한 속층의 연골층에서 프로테오글리칸 양성반응이 다소 높게 관찰되었다. 도 12에서 프로테오글리칸 양성 부분이 별표(★)로 표시되어 있다.
The effect of GHJTY on histologic findings was observed with safranin O-fast stain, and the cartilage of the control group (Fig. 12A) was lower in the proteoglycan-positive reaction than in the normal group. In the GHJTY-A group (FIG. 12B), the GHJTY-B group (FIG. 12C) and the GHJTY-C group (FIG. 12D), the proteoglycan positive reaction was somewhat higher in the cartilaginous layer adjacent to the bone tissue than the control group. In Figure 12, the proteoglycan positive portion is marked with an asterisk (*).

이상에서 본 발명의 구체예가 제시되어 있지만 본 발명이 상기에 한정되는 것은 아니며 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 다양하게 변형 가능하고 이러한 변형은 하기한 본 발명의 청구범위에 속한다 할 것이다. While the present invention has been described in connection with certain exemplary embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, but, on the contrary, is intended to cover various modifications and equivalent arrangements included within the spirit and scope of the appended claims.

Claims (6)

염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물로, 상기 한약재는 강활을 포함하고 또한 금은화, 당귀, 위령선, 황백, 방기, 진피, 적작약, 창출, 지각 및 감초로 이루어지는 군에서 적어도 3 가지 이상 선택되는 성분들을 포함하되, 상기 선택된 한약재 성분의 각각의 배합 비율은 강활을 기준으로 중량비로 1 : 0.3 ~ 2인 것을 특징으로 하는 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물.Wherein the medicinal herb comprises at least three or more selected from the group consisting of gangbyeol, and further comprising at least three selected from the group consisting of gold ginger, angelica gruel, goryeon, yellow whitish, bark, dermis, Wherein the compounding ratio of each of the selected herbal ingredients is 1: 0.3 to 2 by weight based on the hardness, and the herbal medicine extract for preventing or treating an inflammatory joint disease. (a) 강활을 포함하고 또한 금은화, 당귀, 위령선, 황백, 방기, 진피, 적작약, 창출, 지각 및 감초로 이루어지는 군에서 적어도 3 가지 이상 선택되는 성분들을 포함하되, 상기 성분의 각각의 배합 비율은 강활을 기준으로 중량비로 1 : 0.3 ~ 2인 한약재에 주정을 가하여 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 추출된 추출물을 여과하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 여과된 추출물을 농축하는 단계를 포함하는 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법.
(a) at least three or more selected from the group consisting of gangbyeol and further comprising at least three elements selected from the group consisting of gold, silver, angelic, gentian, yellow, white, bark, dermis, Extracting the herbal medicine with a weight ratio of 1: 0.3 to 2 based on the hardness;
(b) filtering the extract extracted in step (a); And
(c) concentrating the extract filtered in the step (b).
제2항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 한약재가 강활, 금은화, 당귀, 위령선 및 황백이고, 이들의 배합 비율은 중량 기준으로 1 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2 : 0.3 ~ 2인 것을 특징으로 하는 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법. 3. The method of claim 2, wherein the herbicide of step (a) is selected from the group consisting of Lactic, Gingko, Angelica, 2 &lt; / RTI &gt; for the prevention or treatment of inflammatory joint disease. 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 주정은 20 내지 70%인 것을 특징으로 하는 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법.[3] The method according to claim 2, wherein the alcohol in step (a) is 20 to 70%. 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 추출은 70 내지 100℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법.The method according to claim 2, wherein the extraction in step (a) is carried out at 70 to 100 ° C. 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 한약재에 독활, 복령, 택사, 목통, 목과, 등심초, 조각자, 인동등 및 포영공으로 이루어지는 군에서 적어도 하나 이상의 성분이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 제조방법.The method according to claim 2, wherein in step (a), the medicinal herb further comprises at least one component selected from the group consisting of chewing gum, bamboo shoot, tarsier, neck, neck, shoulder, A method for preparing a medicinal plant extract for the prevention or treatment of joint diseases.
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