KR20160052562A

KR20160052562A - 항체 안정성의 개선 방법

Info

Publication number: KR20160052562A
Application number: KR1020167005951A
Authority: KR
Inventors: 후베르트 케텐베르거; 슈테판 클로슈테르만; 플로리안 리프슈마이어; 아폴론 파파디미트리우; 야스민 시도브-안데르젠
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2014-09-03
Publication date: 2016-05-12
Also published as: EP3761033A3; JP6580570B2; EP3042205A1; EP3042205B1; JP2016530288A; CA2918191A1; CN105518461A; DK3042205T3; RU2711719C2; US20200066372A1; CN105518461B; EP3761033A2; MX2016002720A; US10418126B2; RU2016111352A3; HK1223684A1; US20160275238A1; RU2016111352A; WO2015032776A1

Abstract

본원에는 하기 단계를 포함하는, 항체의 선별 또는 탈락 방법이 보고되어 있다: a) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계, b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 Asp 또는 Asn 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계, 및 c) C_α-원자가 형태적으로 유연하지 않고/거나 Asp 또는 Asn 이 큰 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체를 선별하는 단계, 또는 C_α-원자가 중간 내지 높은 형태적 유연성을 갖고/거나 Asp 또는 Asn 이 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체를 탈락시키는 단계.

Description

항체 안정성의 개선 방법 {METHOD FOR IMPROVING ANTIBODY STABILITY}

본원에는 구조-기반 접근법에 기반하여 항체 아미노산 서열 내의 아스파라긴 및 아스파르테이트 분해 부위의 식별 및 제거와 관련한 항체 안정성의 개선 방법이 보고된다.

모노클로날 항체 및 항체 도메인-기반 분자가 임상 연구 하에 있는 대부분의 단백질 치료법을 구성한다 (1, 2). 모노클로날 항체는 다양한 범위의 치료적 징후에서 강력하고, 쉽게 발생된다. 항체의 특이성은 가변 도메인 내에 위치한 CDR 내의 서열에 의해 일차적으로 결정된다. 임상적 후보자의 선별 과정은 다수의 모노클로날 항체의 기능적 특성에 대한 스크리닝으로 출발한다. 스크리닝 다음에는 모든 바람직한 기능적 기준을 충족하고 부가적으로 화학적 및 생물리학적 안정성을 나타내는 모노클로날 항체를 식별하기 위한 수 백개까지의 분자의 상세화된 시험관 내 프로파일링이 후속된다. 그러므로, 이들의 구조 및 생물학적 기능에 영향을 줄 수 있는 불안정성 화제를 가진 모노클로날 항체는 제조 및 저장 동안, 및 적용 후 생체 내에서 원치 않는 분해를 피하기 위해 식별되고 탈락되어야만 한다.

단백질에서 발생하는 하나의 분해 반응은 아스파라긴 (Asn) (3) 및 아스파르테이트 (Asp) 잔기의 화학적 분해이다 (4, 5). 상기 반응은 적합한 제형화 조건에 의해 통제 하에 유지될 수 있다 (6-9). Asn 및 Asp 잔기가 항체 인지에 관여되는 경우, 이들의 화학적 변경은 항체의 효능 감소를 초래할 수 있다 (10-14).

대부분 펩티드에서 (52, 53, 57-59), 그러나 또한 단백질 문맥에서 (7, 10, 35, 60), Asn 및 Asp 잔기의 분해 성향, 예를 들어, 일차 서열 (3, 5, 16, 33, 40, 51-56), 용매 유전 상수, 온도, 및 pH 에 영향을 줄 수 있는 다양한 파라미터가 제안되었다. 이미 1980 년대에, 여러 개의 구조적 요건이 단백질 탈아미드화에 대한 주요한 결정요인인 것으로 제안되었고 (5, 61) 이것은 이후 확인되고 확장되었다 (34, 37, 38, 40, 46, 51, 62-64).

분해 메커니즘과 이의 환경 요건에 대한 축적된 지식에도 불구하고, 모노클로날 항체 내의 자발적 탈아미드화 및 이성질화는 풀리지 않는 화제로 남아있다.

본원에서는 폴리펩티드 내의 Asp 및 Asn 잔기 및 구조적 파라미터의 세트의 분해 사이의 상관관계가 보고된다. 분해 핫-스팟 (hot-spot) 이 (i) 이들의 형태적 유연성, (ii) C-말단으로 측면하는 아미노산 잔기의 크기, 및 (iii) 2 차 구조적 파라미터에 의해 특징화될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 상기 파라미터를 사용하는, Asn 및 Asp 잔기의 분해 경향에 대한 예측 방법이 성립되었다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 분해 (= 변형) 안정성을 가진 항체의 선별 방법이다:

a) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블 (ensemble) 로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 Asp 또는 Asn 잔기에 직접적으로 C-말단 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,

c) C_α-원자가 형태적으로 유연하지 않고/거나 Asp 또는 Asn 잔기가 큰 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체를 선별하는 단계.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 분해 (= 변형) 안정성을 가진 하나 이상의 항체의 선별 방법이다:

a) 2 개 이상의 항체를 제공하는 단계,

b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

c) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 Asp 또는 Asn 잔기에 직접적으로 C-말단 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,

d) C_α-원자가 형태적으로 유연하고/거나 Asp 또는 Asn 잔기가 큰 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 하나 이상의 항체를 선별하는 단계,

및 이에 의해, 분해 (= 변형) 안정성을 가진 하나 이상의 항체를 선별하는 것.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 항체의 탈락 (= 다수의 항체로부터 제거하기 위해 선별함) 방법이다:

a) 항체 Fv 영역 (다수의 항체 Fv 영역의) 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

c) C_α-원자가 중간 내지 높은 형태적 유연성을 갖고/갖거나 Asp 또는 Asn 잔기가 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체를 탈락/제거 (다수의 항체 Fv 영역으로부터) 하는 단계.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 하나 이상의 항체의 탈락 (= 다수의 항체로부터 제거하기 위해 선별함) 방법이다:

a) 2 개 이상의 항체를 제공하는 단계,

b) 항체 Fv 영역 (다수의 항체 Fv 영역의) 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

d) C_α-원자가 중간 내지 높은 형태적 유연성을 갖고/갖거나 Asp 또는 Asn 잔기가 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 하나 이상의 항체를 탈락/제거 (다수의 항체 Fv 영역으로부터) 하는 단계.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 아스파라긴 (Asn) 분해 (탈아미드화 및/또는 숙신이미드-형성) 되기 쉬운 항체의 식별 또는 탈락 방법이다:

a) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

b) 작은 C-말단 아미노산 잔기를 가진 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 백본 이면각 (dihedral angle) phi 를 측정하는 단계,

c) 작은 C-말단 아미노산 잔기 및 -75.2 도 초과의 백본 이면각 phi 를 갖는 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 용매 노출 및 Asn 잔기에 대해 N-말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생/존재 및 Asn 잔기에 대한 상기 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를 측정하는 단계, 및

d) 하기와 같은 경우, 아스파라긴 (Asn) 분해 (탈아미드화 및/또는 숙신이미드-형성) 되기 쉬운 항체의 식별 또는 탈락 단계:

i) Asn 잔기가 CDR 루프 1 내에 있고, 이의 C_α-원자가 형태적으로 유연하고, C-말단 아미노산 잔기가 Asp, Pro, Thr 또는 Asn 인 경우,

ii) Asn 의 C_α-원자가 형태적으로 유연하고, -75.2 도 미만의 백본 이면각 phi 를 갖고, Asn 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기가 작은 경우, 또는

iii) Asn 잔기의 C_α-원자가 형태적으로 유연하고, -75.2 도 초과의 백본 이면각 phi 를 갖고, 높은 용매 노출을 갖고, 아미노-말단 2차 구조 내의 변화가 Asn 잔기에 대해 3 개 초과의 아미노산 잔기의 스트레치 내에서 발생하는 경우.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 아스파라긴 (Asn) 분해 (탈아미드화 및/또는 숙신이미드-형성) 되기 쉬운 하나 이상의 항체의 식별 또는 탈락 방법이다:

a) 2 개 이상의 항체를 제공하는 단계,

b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

c) 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 백본 이면각 phi 를 측정하는 단계,

d) 작은 C-말단 아미노산 잔기 및 -75.2 도 초과의 백본 이면각 phi 를 갖는 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 용매 노출 및 Asn 잔기에 대해 N-말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생/존재 및 Asn 잔기에 대한 상기 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를 측정하는 단계, 및

e) 하기와 같은 경우, 아스파라긴 (Asn) 분해 (탈아미드화 및/또는 숙신이미드-형성) 되기 쉬운 하나 이상의 항체의 식별 또는 탈락 단계:

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 개선된 아스파라긴 (Asn) 안정성 (감소된 탈아미드화 및/또는 숙신이미드-형성) 을 가진 하나 이상의 항체의 선별 방법이다:

a) 2 개 이상의 항체를 제공하는 단계,

b) 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

c) 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 백본 이면각 phi 를 측정하는 단계,

d) 각각의 항체 Fv 영역 내의 작은 C-말단 아미노산 잔기 및 -75.2 도 초과의 백본 이면각 phi 를 가진 각각의 Asn 잔기에 대해, 용매 노출 및 Asn 잔기에 대해 N-말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생/존재 및 Asn 잔기에 대한 상기 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를 측정하는 단계, 및

e) 2 개 이상의 항체로부터 하기 중 하나 이상을 갖는 상기 항체를 제거/결실/탈락시키는 단계:

i) 형태적으로 유연성을 갖는 C_α-원자를 갖고 C-말단 아미노산 잔기로서 Asp, Pro, Thr 또는 Asn 을 갖는 CDR 루프 1 내의 Asn 잔기,

ii) 형태적으로 유연성인 C_α-원자, -75.2 도 미만의 백본 이면각 phi 를 갖고, 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 Asn 잔기, 또는

iii) 형태적으로 유연한 C_α-원자를 갖고, -75.2 도 초과의 백본 이면각 phi 를 갖고, 높은 용매 노출을 갖는 Asn 잔기, 및 아미노-말단 2차 구조 내의 변화가 Asn 잔기의 3 개 초과의 아미노산 잔기의 스트레치 내에서 발생함

및 이에 의해 개선된 아스파라긴 (Asn) 안정성을 갖는 하나 이상의 항체를 선별하는 단계.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는, 감소된 아스파라긴 (Asn) 분해 (탈아미드화 및/또는 숙신이미드-형성) 를 가진 항체의 수득 방법이다:

- C_α-원자의 형태적 유연성을 감소시키는 단계,

- Asn 잔기에 대해 C-말단 아미노산 잔기의 크기를 증가시키는 단계.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 아스파르테이트 (Asp) 분해 (이성질화 및/또는 숙신이미드-형성) 되기 쉬운 항체의 식별 또는 탈락 방법이다:

a) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 C-말단으로 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,

c) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 C 말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생/존재 및 Asp 잔기에 대한 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를 측정하는 단계, 및

d) 하기와 같은 경우 Asp 분해 (이성질화 및/또는 숙신이미드-형성) 되기 쉬운 항체의 식별 또는 탈락 단계:

i) Asp 잔기의 C_α-원자가 높은 형태적 유연성을 갖고, Asp 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기가 작은 경우, 또는

ii) Asp 잔기의 C_α-원자가 중간 형태적 유연성을 갖고, Asp 잔기에 대한 아미노산 잔기가 작고, 카르복시-말단 2차 구조 내의 변화가 Asp 잔기에 대해 3 개 미만의 아미노산 잔기의 스트레치 내에서 발생하는 경우, 또는

iii) Asp 잔기의 C_α-원자가 중간 형태적 유연성을 갖고, Asp 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기가 Gly 잔기이고, 카르복시-말단 2차 구조 내의 변화가 Asp 잔기에 대해 3 개 초과의 아미노산 잔기의 거리에서 발생하는 경우.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 아스파르테이트 (Asp) 분해 (이성질화 및/또는 숙신이미드-형성) 되기 쉬운 하나 이상의 항체의 식별 또는 탈락 방법이다:

a) 2 개 이상의 항체를 제공하는 단계,

b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

c) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 C-말단으로 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,

d) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 C-말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생/존재 및 Asp 잔기에 대한 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를 측정하는 단계, 및

e) 하기와 같은 경우 Asp 분해 (이성질화 및/또는 숙신이미드-형성) 되기 쉬운 하나 이상의 항체를 식별 또는 탈락시키는 단계:

i) Asp 잔기의 C_α-원자는 높은 형태적 유연성을 갖고 Asp 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기가 작은 경우, 또는

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 개선된 아스파르테이트 (Asp) 안정성 (감소된 이성질화 및/또는 숙신이미드-형성) 을 가진 하나 이상의 항체의 식별 방법이다:

a) 2 개 이상의 항체를 제공하는 단계,

b) 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

c) 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 대해 C-말단으로 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,

d) 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 C 말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생/존재 및 Asp 잔기에 대한 상기 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를 측정하는 단계, 및

e) 2 개 이상의 항체로부터 하기 중 하나 이상을 갖는 항체를 제거/결실/탈락시키는 단계:

i) 형태적으로 유연한 C_α-원자를 갖고 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 Asp 잔기,

ii) 중간 형태적 유연성을 갖는 C_α-원자를 갖고, 작은 C-말단 아미노산을 갖는 Asp 잔기, 및 카르복시-말단 2차 구조 내의 변화가 Asp 잔기의 3 개 미만의 아미노산 잔기의 스트레치 내에서 발생함, 또는

iii) 중간 형태적 유연성을 갖는 C_α-원자를 갖고, C-말단 아미노산 잔기로서 Gly 를 갖는 Asp 잔기, 및 카르복시-말단 2차 구조 내의 변화가 Asp 잔기의 3 개 초과의 아미노산 잔기의 거리에서 발생함,

및 이에 의해 개선된 아스파르테이트 (Asp) 안정성을 갖는 하나 이상의 항체를 선별하는 것.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계 중 하나 또는 모두를 포함하는, 감소된 아스파르테이트 (Asp) 분해 (이성질화 및/또는 숙신이미드-형성) 를 가진 항체의 수득 방법이다:

- C_α-원자의 형태적 유연성을 감소시키는 단계,

- Asp 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기의 크기를 증가시키는 단계.

하나의 구현예에서 Asp 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기는 큰 아미노산 잔기로 변화된다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 장 기간 저장 안정성을 갖는 항체의 선별 방법이다:

a) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블로/내에서/을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,

b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 Asp 또는 Asn 잔기에 대해 C-말단 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,

c) C_α-원자가 형태적으로 유연하지 않고/거나 Asp 또는 Asn 가 큰 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체를 선별하는 단계.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 장 기간 저장 안정성을 갖는 하나 이상의 항체의 선별 방법이다:

a) 2 개 이상의 항체를 제공하는 단계,

c) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 Asp 또는 Asn 잔기에 C-말단으로 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,

d) C_α-원자가 형태적으로 유연하지 않고/거나 Asp 또는 Asn 이 큰 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체를 선별하는 단계,

및 이에 의해 장 기간 저장 안정성을 갖는 하나 이상의 항체를 선별하는 것.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법이다:

a) 본원에 보고된 방법으로 선별된, 또는 본원에 보고된 방법으로 수득된 항체를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 포유류 세포를 배양하는 단계,

b) 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하고 이에 의해 항체를 제조하는 단계.

a) 본원에 보고된 방법으로 선별된 항체를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 포유류 세포를 배양하는 단계,

b) 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하고 이에 의해 항체를 생성하는 단계.

이제 본원에 보고된 모든 양상의 구현예가 제시된다. 개별 구현예의 임의의 조합이 또한 상기 목록에 의해 포함된다는 것이 표현적으로 언급된다.

하나의 구현예에서, 형태적 유연성은 상동성 모델 앙상블 내의 각각의 Asn/Asp 잔기의 Cα-원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD) 이다. 하나의 구현예에서, 상동성 모델 앙상블은 앙상블 (5 의 세트) 이다.

하나의 구현예에서,

i) 형태적으로 유연하지 않은 것은 0.01 Å 이하의 RMSD 이고,

ii) 형태적으로 유연한 것은 0.01 Å 초과의 RMSD 이고,

iii) 중간 형태적 유연성은 0.145 Å 내지 0.485 Å 의 RMSD 이고,

iv) 높은 형태적 유연성은 0.485 Å 초과의 RMSD 이다.

하나의 구현예에서, 상동성 모델 앙상블은 항체 Fv 단편으로 제조된다.

하나의 구현예에서, 작은 아미노산 잔기는 Gly, Ala, Ser, Cys 또는 Asp 이다. 하나의 구현예에서, 작은 아미노산 잔기는 Gly, Ala, Ser 또는 Cys 이다.

하나의 구현예에서, 상기 방법은 추가의 단계를 포함한다:

- 항체 Fv 영역의 아미노산 서열을 제공하는 단계.

하나의 구현예에서, 높은 용매 노출은 89.4 Å² 초과의 SASA 값이다.

하나의 구현예에서, 균일한 실험 질량 분광스펙트럼 데이터 세트가 상동성 모델 앙상블을 생성하기 위해 사용된다.

하나의 구현예에서, 모든 CDR 을 루프 모델링 절차에 적용하여, 5-원 상동성 모델 앙상블을 산출한다.

하나의 구현예에서, 상기 방법은 분자 역학 시뮬레이션을 필요로 하지 않는다.

하나의 구현예에서, 5-원 앙상블의 하나 이상의 일원이 그대로 분류되었던 경우 잔기는 분해 스팟으로서 계수된다.

하나의 구현예에서, 단일-트리 미리보기-가능한 반복 분할 알고리즘의 Pipeline Pilot 실행이 사용된다.

하나의 구현예에서, 후속하는 백본 질소의 용매 접근가능 표면적은 컴퓨터로 측정되었고, 수소 결합의 수가 계수되었다.

하나의 구현예에서, 전이 상태-유사 형태는 N_n+1-원자에 대한 측쇄 C_γ-원자, 측쇄 이면각 χ1, 원자 C_γ, O, N_n+1, 및 C 사이의 각도로서 규정되었던 이면각 CGONC 사이의 거리를 측정함으로써 입증되었다.

하나의 구현예에서, 각각의 Asp 또는 Asn 의 용매-접근가능 표면적이 측정되었다.

하나의 구현예에서, C-말단 (후임자 (successor)) 아미노산 크기 및 백본 이면각 φ (C'_n-1-N-C_α-C') 및 ψ (N-C_α-C'-N_n+1) 이 측정된다.

하나의 구현예에서, 상동성 모델 앙상블 (5 의 세트) 내의 Asn/Asp 잔기의 C_α-원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD) 는 앙상블 내의 구조적 다양성을 반영하고 가능한 형태적 유연성의 지표로서 제시된다.

하나의 구현예에서, 2차 구조 요소 (잔기는 헬릭스, 시이트, 턴 또는 코일 내에 내포됨), 및 다음의 상이한 N- 및 C-말단 2차 구조 요소에 대한 거리가 파라미터로서 포함된다.

하나의 구현예에서, n-1 및 n+ 1 잔기의 C_α-원자 사이의 거리가 측정된다.

발명의 상세한 설명

모노클로날 항체는 다양한 증상 영역에서 가장 촉망받는 단백질 치료법이다. 모노클로날 항체 생성에 대한 표준 접근법은 항상 여러 적합한 후보자를 초래한다. 상기 후보자로부터, 제조, 저장 동안, 및 생체 내에서 분해를 피하기 위해, 화학적으로 안정한 높은 치료 효능을 가진 모노클로날 항체가 선택되어야만 한다. 항체는 종종 아스파라긴 (Asn) 탈아미드화 및 아스파르테이트 (Asp) 이성질화에 의해 분해된다.

Asn 및 Asp 잔기는 시클릭 숙신이미드 중간체의 형성을 통해 진행하는 통상의 분해 경로를 공유한다 (도 1) (3, 5, 33). 숙신이미드 형성은 Asn/Asp 측쇄 γ-카르보닐 기 상의 후속 아미노산의 백본 질소의 친핵성 공격에 의한 Asn 의 탈아미드화 또는 Asp 의 탈수 후 분자내 재배열로부터 산출된다. 준안정 시클릭 이미드는 가수분해 조건 및 형태적 제약에 따라, 상이한 비율로 아스파르틸 또는 이소-아스파르틸 연결을 형성하기 위해 이의 2 개의 카르보닐 기 중 하나에서 가수분해될 수 있다 (3, 5, 20, 34-36). 또한, 대안적인 분해 메커니즘은 시클릭 이소이미드를 형성하기 위한 백본 카르보닐 산소에 의한 친핵성 공격 (5, 37, 38) 또는 Asn 에서 Asp 로의 직접적인 물-조력 가수분해 (39, 40) 와 같이 제안되었다 (10). 여러 가지 분석 방법, 주로 전하-민감성 방법, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전위 초점이, 분해 생성물, 즉, 숙신이미드, Asp 또는 isoAsp 를 검출하기 위해 기술되었다 (13, 41, 42). 정량화 및 단백질 내 분해 부위의 위치화에 가장 적합한 것은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광분석 (LC-MS/MS) 을 통한 분석이다 (12, 13, 38, 43-50).

상동성 모델로부터 유도된 구조적 파라미터와 조합하여, 37 개의 모노클로날 항체 내의 부위-특이적 분해 사건의 균일한 실험 질량 분광스펙트럼 데이터 세트에 기반하여, 분해 경로에 기여하는 파라미터 및 이들의 각각의 기여가 확인되었다. 방법은 화학적으로 안정한 모노클로날 항체의 식별 및 선별을 위해 개발되었다.

용어 "상동성 모델" 은 관련된 상동 아미노산 서열의 실험적으로-측정된 참조 구조에 근거한 논의의 아미노산 서열의, 3-차원 모델, 하나의 구현예에서, 3-차원 원자-해상 모델을 구축함으로써 수득되었던 아미노산 서열의 3-차원 모델을 나타낸다. 상동성 모델의 생성은 논의의 아미노산 서열 내의 (일반적인) 서열 요소(들) 의 측정 및 동일한 구조를 가질 것 같은 참조 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열의 (3-차원) 정렬에 기반한다.

단백질 구조가 고도로 보존되어 있기 때문에, 높은 수준의 서열 유사성은 통상적으로 상당한 구조적 유사성을 함축한다 (Marti-Renom, M.A., et al. (2000) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29: 291-325).

하나의 구현예에서, 상동성 모델은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다:

- 참조 구조 선별,

- 참조 구조를 가진 논의의 서열의 정렬,

- 모델 구축, 및

- 모델 평가.

서열의 정렬은 임의의 정렬 프로토콜, 예컨대 예를 들어, FASTA, BLAST, PSI-BLAST 를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 상동성 모델은 임의의 상동성 모델, 예컨대 SWISS-모델, CPHmodels, MODELER 또는 LOOPER 을 사용하여 수득되는 모델일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상동성 모델은 MODELER 및 LOOPER 알고리즘을 사용함으로써 수득된다.

상동성 모델은 프로그램 MODELER 9v7 에 대한 자동화된 소프트웨어 스크립트로 성립되었다 (83). 모델링 템플레이트는 2.8 Å 의 최소 해상률을 가지고, 이들의 가변 영역 내에 손실된 내부 잔기가 없는, 인간, 마우스, 및 키메라 항체 Fab 단편 결정 구조로 이루어지는 참조 구조 데이터베이스로부터의 서열 보존성에 근거하여 선택되었다. 각각의 모노클로날 항체에 대한 최고의 산출 모델이 루프 개량 절차에 대한 기반으로서 사용되었다 (LOOPER, Discovery Studio, Accelrys Inc., San Diego, USA) (84). 차례로, 루프 개량으로부터 5 개의 가장 유망한 해법을 선택하고 각각의 모노클로날 항체에 대한 구조의 앙상블로서 사용하였다. 파라미터를 상기 상동성 모델 앙상블로부터 컴퓨터로 추출하였다 (표 2). 파라미터 "다음의 상이한 N-말단 2차 구조", "다음의 상이한 C-말단 2차 구조" 및 "코일 내 위치" 는 Pipeline Pilot 에서 실행된 Boolean 법칙을 사용하는 주변 잔기의 2차 구조 정보로부터 추론되었다 (Accelrys Inc., San Diego, USA). 용어 "C-말단 아미노산 잔기의 크기" 는 용매 접근가능 표면적 (SASA, 85) (Å²) 을 표시하고, 하기와 같이 정의된다: Ala, 64.78; Cys, 95.24; Asp, 110.21; Glu, 143.92; Phe, 186.7; Gly, 23.13; His, 146.45; Ile, 151.24; Lys, 177.37; Leu, 139.52; Met, 164.67; Asn, 113.19; Pro, 111.53; Gln, 147.86; Arg, 210.02; Ser, 81.22; Thr, 111.6; Val, 124.24; Trp, 229.62; Tyr, 200.31. 작은 C-말단 아미노산 잔기는 111 Å² 미만의 SASA 를 갖는다. 큰 C-말단 아미노산 잔기는 111 Å² 이상의 SASA 를 갖는다.

항체의 아미노산 서열은 각각의 폴리펩티드 사슬에 대해 N-말단에서 C 말단으로 제시된다. 아미노산 서열에서 각각의 아미노산 잔기 (N-말단 아미노산 잔기는 제외) 는 선행 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 선행 아미노산 잔기는 논의의 아미노산 잔기에 대해 N-말단에 위치한다. 또한 아미노산 서열에서 각각의 아미노산 잔기 (C-말단 아미노산 잔기는 제외) 는 후임 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 후임 아미노산 잔기는 논의의 아미노산 잔기에 대해 C-말단에 위치한다. 따라서, 용어 "C-말단 아미노산 잔기" 는 아미노산 서열 내에서 논의의 Asn 또는 Asp 잔기에 대해 직접적으로 C-말단인 아미노산 잔기, 즉, 각각의 Asn 또는 Asp 잔기에 대해 N-말단 아미드 결합을 갖는 아미노산 잔기를 나타낸다.

용어 Fv-영역은 동족 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍을 나타낸다.

용어 "카르복시-말단 2차 구조 내의 변화" 는 제 1 의 2차 구조에서 제 2 의 상이한 2차 구조로의 변화를 나타낸다. 용어 "2차 구조" 는 2차 구조 (알파-)헬릭스, (베타-)시이트, 턴, 및 코일을 나타낸다. 따라서, 2차 구조 내의 변화는 예를 들어, 헬릭스에서 시이트, 턴 또는 코일 중 하나로의 변화, 또는 시이트에서 헬릭스, 턴 또는 코일로의 변화, 또는 코일에서 헬릭스, 시이트 또는 턴으로의 변화이다.

항체 분해 부위 및 속도의 실험적 조사

37 개의 상이한 치료적 IgG1 및 IgG4 모노클로날 항체의 집합을 조사하였다 (표 1).

표 1: 실험적 Asn 및 Asp 핫-스팟 집합. 주요 변형은 굵은 글씨로 적혀있다. 37 개의 분석된 모노클로날 항체 중 15 개는 CDR 중 하나에 하나 이상의 Asn/Asp 핫-스팟을 함유하였다.

상기 항체를 6.0 의 전형적인 형성 pH 에서 40℃ 에서 2 주 동안 통제된 열 스트레스에 적용시키고 (스트레스를 받은 샘플), 이어서 질량 스펙트럼 분석에 의해 분해 사건에 대해 분석하였는데, 이것은 영향을 받은 잔기에 위치하고 스트레스를 받은 및 상응하는 참조 샘플 내의 변형의 양을 정량하였다.

37 개의 모노클로날 항체의 Fv 영역 중의 모든 559 개의 Asn 및 Asp 잔기 중에서, 60 개의 잔기 (11 %) 는 정량가능한 양의 변형을 나타낸다. 이들은 19 개의 핫-스팟, 13 개의 약한-스팟, 및 28 개의 반응성-스팟으로 세분화되었다. 용어 핫-스팟은 3 % 이상, 용어 약한-스팟은 1 % 이상 3 % 미만, 용어 반응성-스팟은 1 % 미만의, 스트레스를 받은 샘플 내의 변형에 상응한다.

분해 부위의 위치

3 % 이상의 변형을 가진 분해 핫-스팟이 CDR 루프 내에 위치하는 것이 밝혀졌다 (표 1 참조). 가장 많은 핫-스팟이 경쇄 CDR 1 및 중쇄 CDR 3 에 위치하는 반면, 중쇄 CDR 1 은 어떠한 핫-스팟도 함유하지 않는다. 37 개의 분석된 모노클로날 항체 중 15 개는 CDR 중 하나에 하나 이상의 Asn/Asp 핫-스팟을 함유한다. 모노클로날 항체 mAb3, mAb 4, mAb 9, mAb 10, mAb 12, mAb16, mAb18, mAb19, mAb21, mAb27, mAb28, mAb29, mAb31, mAb33, Bevacizumab, Cetuximab, Adalimumab, Denosumab, Efalizumab, Basiliximab, Pavilizumab, 및 Panitumab 의 Fv 영역에서 핫-스팟이 관찰되지 않았다.

본원에 보고된 모든 양상의 하나의 구현예에서 경쇄 CDR 1 또는/및 중쇄 CDR 3 중의 탈아미드화/이성질화/숙신이미드-형성 (또는 Asn/Asp 분해) 핫-스팟의 측정 방법이 보고된다.

Asn 및 Asp 에 후속하는 아미노산 잔기가 단백질 내의 숙신이미드 형성 속도에 영향을 준다는 것이 이전 연구에서 제시되었다 (40, 51). 지금까지, 치료적 항체의 Fv 영역 내에 화학적 분해에 관여하는 8 개의 상이한 서열 모티프가 기술되어 있다 (Asn 에 후속하는 Gly, Ser, 또는 Thr, 및 Asp 에 후속하는 Gly, Ser, Thr, Asp, 또는 His) (10-14, 35, 46, 65-73). 이전 관찰에 따라, Asn-Gly 및 Asp-Gly 모티프는 변형되기 가장 쉬우며, 각각 CDR 모티프 내의 핫-스팟의 67% 및 36% 에 상응한다 (도 2).

분해 부위 구조의 조직적인 분석

항체의 Fv 단편 내의 모든 Asn 및 Asp 잔기의 구조적 환경 (즉, 분해 및 비-분해) 은 분해 메커니즘에서 추정적인 역할을 가지는 20 개의 파라미터 세트에 의해 특징화되었다. Fab 단편의 상동성 모델을 최신 상동성 모델링 소프트웨어에 의해 생성하였고, 프로그램으로부터 산출되는 해법을 모델링 점수에 기반하여 평가하였다. 파라미터를 자동화된 절차에 의해 상동성 모델로부터 인 실리코 (in silico) 로 추출하였다. 일반적으로, 템플레이트 구조에 대한 높은 상동성은 프레임워크 및 짧은 CDR 영역의 정확한 상동성 모델을 산출한다. 그러나, 긴 CDR 루프의 모델링은 부분적으로 이러한 루프의 높은 고유의 유연성으로 인해, 모델링 불확실성이 크기 쉽다 (74-77). 따라서, 모든 CDR 을 루프 모델링 절차에 적용하여, 5-원 상동성 모델 앙상블을 산출하였다. 이와 같이, 요구되는 분자 역학 시뮬레이션의 필요성 없이, 상이한 가능한 CDR 형태에 대한 부가적인 정보를 포착하였다. 구조적 파라미터와 시험관 내 분해 사이의 상관관계를 기계-학습 알고리즘에 의해 조사하였다. 예측 모델이 통상의 서열 모티프-기반 방법에 비해 충분한 정확성 및 낮은 오류-예측성을 보인다는 것을 발견하였다.

오로지 일차 서열에 기반한 안정한 Asn/Asp 잔기로부터의 두 Asn/Asp 분해 핫-스팟의 구별은 대량 과-예측되기 쉽기 때문에 (51), 20 개의 구조적 파라미터 세트가 상기 아미노산의 3 차원 환경을 반영하기 위해 식별되었다. 상기 파라미터가 하기에 기재된다. 이들은 분해 메커니즘에서 이들의 추정적 역할에 기반하여 확인되었고 (도 1 및 3, 표 2 참조), 상동성 모델 앙상블로부터 컴퓨터로 추출되었다.

표 2: Asn 및 Asp 잔기의 2 차원 및 3 차원 환경을 규정하는 파라미터. 도 3 에 그려진 파라미터를 별표로 표시한다.

시클릭 이미드 형성에 대한 전제조건은 Asp 또는 Asn 측쇄의 히드록실 또는 아미노 기 각각의 이탈 경향이다. 상기 경향을 추정하기 위해, 측쇄 산소 원자에 대한 수소 결합의 수, 또는 측쇄 질소 원자에 대한 수소 결합의 수를 계수하였다. 숙신이미드 형성이 발생하기 위해, Asp 측쇄의 카르복실 기는 양자화되어야만 한다 (33, 78). 가망성있는 양자화 상태는 성립된 PROPKA 알고리즘을 사용하여 구조-의존적 Asp pKa 값을 계산함으로써 수득되었다 (79). 후임 백본 질소의 접근성 및 높은 친핵성은 숙신이미드 형성을 위한 다른 잠재적인 전제조건이다 (도 1 참고). 따라서, 후임 백본 질소의 용매 접근가능 표면적은 컴퓨터로 계산하였고, 수소 결합의 수를 계수하였다.

숙신이미드 형성 반응의 전이 상태는 후임 잔기의 백본 질소에 접근하기 위해 Asp 또는 Asn 헤드 기를 필요로 한다. 전이 상태-유사 형태는 N_n+1-원자에 대한 측쇄 C_γ-원자의 거리 (도 1, 3 (61)), 측쇄 이면각 χ1, 및 원자 C_γ, O, N_n+1, 및 C 사이의 각으로서 정의되었던 이면각 CGONC 를 측정함으로써 입증되었다. 부가적으로, 각각의 Asp 또는 Asn 의 용매-접근가능 표면적을 컴퓨터로 측정하였다. n+1 측쇄가 숙신이미드 형성 속도에 영향을 준다는 것이 제시되었다 (3, 5, 16, 29, 33, 51, 52, 54). 그러므로, 후임 아미노산 크기 뿐 아니라, 국부적 구조적 형태에 대한 필수적인 3-차원 정보 및 따라서 전이 상태의 잠재적인 접근성을 제공하는 백본 이면각 φ (C'_n-1-N-C_α-C') 및 ψ (N-C_α-C'-N_n+1) 을 기록하였다.

추가의 파라미터는 광범위한 구조적 환경을 기술한다. 상동성 모델 앙상블 내의 Asn/Asp 잔기의 C_α-원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD) 는 앙상블 내의 구조적 다양성을 반영하고, 가능한 형태적 유연성의 지표로서 제시된다. 2차 구조 요소 (잔기는 헬릭스, 시이트, 턴 또는 코일 내에 내포됨) (34, 62), 및 다음의 상이한 N- 및 C-말단 2차 구조 요소까지의 거리 (51) 가 부가적인 파라미터로서 포함된다. 잔기가 코일 2차 구조 내에 위치하는 경우, 코일 내의 이의 위치 (가장자리 또는 중심) 에 주석이 달려있다. 코일 팁 (coil tip) 의 "벤드 (bend)" 를 정량하기 위해, n-1 과 n+1 잔기의 C_α-원자 사이의 거리를 측정하였다. 마지막으로, Fab 단편 내의 위치를 각각의 잔기, 즉, CDR 중 하나 내, 프레임워크 내 또는 CH1/CL 도메인 내에 귀속시켰다.

항체의 Fv 부분 내의 유일한 잔기를, CH1/CL 핫-스팟이 관찰되지 않기 때문에 분류를 위해 사용하였다. 185 개의 상동성 모델 (37 × 5 모델) 로부터 유래된 2460 개의 Asn 및 Asp 잔기 (492 잔기 × 5 모델) 를 통계 분석을 위해 사용하였고, 스트레스를 받은 샘플 내에 3 % 이상의 변형이 있는 95 개의 핫-스팟 (19 × 5 모델) 뿐 아니라, 모두 397 개의 비-핫-스팟을 포함한다. 분류기의 트레이닝을 허위 분류를 피하기 위해 말단 잔기 뿐 아니라 약한-스팟 및 반응성-스팟을 제외하고, 랜덤 75 % 트레이닝 데이터세트 (항상 5-원 앙상블을 함께 유지함) 로 수행하였다. 바예시안 (Bayesian) 분류, 반복 분할, 지지 벡터 기계, 랜덤 포레스트, 규칙화 판별 분석, 및 신경 네트워크를 모든 20 개의 파라미터를 사용하여, 랜덤 트레이닝 세트 과제의 40 회 반복에서 시험하였다 (도 4 및 5).

표 3: 위-양성 및 위-음성 Asn/Asp 잔기의 평균 수; TPR (참 양성율) = 양성의 수에 의해 나뉘어진 참 양성의 수; FPR (위 양성율) = 음성의 수에 의해 나뉘어진 위 양성의 수.

Asn 분해가 상이한 메커니즘에 따를 수 있었기 때문에 Asn 및 Asp 분류를 별도로 취급하였다 (5, 37-40), (도 1). 상기 구별은 최종적으로 개선된 분류 도식을 야기하였다. 5-원 앙상블의 하나 이상의 일원이 이와 같이 분류되었던 경우, 잔기를 예측된 핫-스팟으로서 계수한다. 9 개의 상이한 분류 모델 중에서 가장 적합한 분류기를 확인하기 위해, 2원 분류 시스템의 수행을 예시하기 위해 통상 적용되는 수용자 작업 특징분석 (ROC) 분석을 사용하였다. 그 안에, 양성 중 참 양성의 분획 (참 양성율, TPR) 을 음성 중 위 양성의 분획 (위 양성율, FPR) 에 대항하여 플롯팅한다. 가장 중요한 기준으로서 높은 참-양성률 칭량은, 단일-트리 미리보기-가능한 반복 분할 알고리즘의 Pipeline Pilot 실행을 가장 적합한 분류기로서 선택하였다 (도 4 및 5). 각 단계에서, 반복 분할 알고리즘은 데이터세트를 하나의 계열에 속하는 균질한 서브세트 내로 분할하는데 최고인 파라미터를 선택하는 반면 (핫-스팟 또는 비-핫-스팟), 분할 지점은 노드 (node) 로 불리고, 계열은 리프 (leaf) 로 불린다. 통합 미리보기 기능은 선택된 분할 파라미터 및 값이 제공된 단계 뿐 아니라 또한 후속 단계에도 최적이라는 것을 확실히 한다. 이와 같이, 모델은 핫-스팟과 비-핫-스팟을 구별하기 위해 가장 중요한 파라미터를 식별한다. 상기 분류기는 심지어 예측 목적을 위한 후속 최적화 절차 후에도, 높은 TPR, Asn 및 Asp 분해 경향의 예측을 위한 여전히 허용가능한 FPR, 및 양호한 알고리즘 해석능력의 최고 조합을 산출한다.

새로운 데이터에 대한 모델 성능을 향상시키고 과-피팅 (over-fitting) 을 피하기 위해 Asn 및 Asp 단일-트리 미리보기-가능한 반복 분할 알고리즘을 최적화시켰다. 따라서, Asn 및 Asp 트리를 가지치기 (pruned) 하였다, 즉, 작은 트리를 산출하기 위해 가지를 조직적으로 제거하였다. 가지치기 모델의 예측성을 시험하기 위해, 이들을 40 회의 독립적인 실행으로 25 % 시험 세트에 대항하여 입증하였다 (도 6). 최종 Asn 및 Asp 알고리즘을 100 % 의 데이터로 트레이닝하였고, 상응하는 ROC 플롯 (도 6) 뿐 아니라 의미있는 트리 해석능력의 기반 하에 선택되었다. 이들은 도 7 및 8 에서 결정 트리로서 제시된다.

랜덤화된 75 % 트레이닝 세트로 트레이닝된 모델에 대항하여 시험 세트 검증의 40 회 실시 후, 8 개의 Asp-핫-스팟 중 평균 0.5 개는 인지되지 않았던 반면, 285 개의 Asp 비-핫-스팟 중 평균 6.6 개는 위-양성으로 할당되었다. 이것은 양성의 수 (8) 에 의해 나뉘어진 참 양성의 수 (7.5) 인 0.94 의 TPR, 및 음성의 수 (285) 에 의해 나뉘어진 위 양성의 수 (6.6) 로서 정의된 0.02 의 FPR (도 4 a) 에 상응한다. Asn 의 경우, 11 개의 Asn-핫-스팟 중 평균 0.6 은 위-음성 (TPR = 0.95) 으로 할당되었고, 188 개의 비-핫-스팟 중 8.1 은 위-양성 (FPR = 0.04) 으로서 수득되었다 (도 4 b). 이것은 단독으로 일차 서열 정보에 기반한 예측에 대한 상당한 개선이며, 이것은 강한 과-예측을 야기하였다 (Asp TPR = 1.0, FPR = 0.31; Asn TPR = 0.91, FPR = 0.43) (도 4).

Asp 및 Asn 분해 경향은 잔기 유연성, 후임자 크기, 및 2차 구조에 따라 다르다

Asp 의 경우, 데이터세트는 비-핫-스팟 Asp 잔기로부터 구별되어야 할 필요가 있는 오로지 2.7 % 핫-스팟으로 이루어진다. 첫번째 2 개의 결정 트리 분할은 모든 비-핫-스팟 중 93 % 를 분할할 수 있다 (1105, 첫번째 분할; 260, 두번째 분할). 비-핫-스팟은 유연하지 않거나 또는 큰 카르복시-말단 아미노산, 예컨대 예를 들어, Pro, Thr, asn, Val, Leu, Glu, His, Gln, Ile, Met, Lys, Phe, Tyr, Arg 또는 Trp 가 후속된다. 그러므로, 분류되어야 하는 남아있는 Asps 는 유연하고, Gly, Ala, Ser, Cys, 또는 Asp 일 수 있는 작은 아미노산에 의해 후속된다. 이 중에서, 첫번째 및 가장 큰 Asp 핫-스팟 계열은 분할되고, 높은 형태적 유연성 (RMSD > 0.485 Å) 및 후임자로서 Asp, Cys, Ser, Ala 또는 Gly 를 특징으로 한다. 이것은 5 개의 핫-스팟 (각각 5 개의 일원) 뿐 아니라 2 개의 위 양성 Asp 잔기 (각각 5 개의 일원) 를 함유한다.

다음 노드에서, 핫-스팟 계열 2 가 분할된다. 이의 3 개의 일원 (5 개의 상동성 모델 일원을 가진 1, 2 개의 일원을 가진 1, 및 오로지 1 개의 일원만을 가진 1) 은 중간 형태적 유연성 (0.145 Å 내지 0.485 Å 의 RMSD) 을 특징으로 하고, Asp, Cys, Ser, Ala 또는 Gly 및, 3 개 미만의 아미노산의 스트레치 내의 카르복시-말단 2차 구조 내의 변화가 후속될 수 있다.

핫-스팟 계열 3 은 Asp-Gly 모티프 내의 Asp 잔기를 특징으로 한다. 부가적으로, 계열 2 로서, 이것은 중간 형태적 유연성 (RMSD 0.145 Å - 0.485 Å) 및 3 개 초과의 잔기 내에 카르복시-말단 2차 구조의 변화를 특징으로 한다. 이것은 2 개의 핫-스팟 (4 개의 상동성 모델 일원을 가진 1, 및 3 개의 일원을 가진 1) 및 1 개의 위-양성 Asp (5 개의 일원) 를 함유한다.

또한 Asn 분해 핫-스팟 분류에 대해, 주요 기준은 카르복시-말단 아미노산의 크기 및 형태적 유연성 (도 8) 이다. Asp 데이터세트와 비교하여, 비-핫-스팟과 비교하여 2 배 많은 Asn 핫-스팟이 있고, 이것은 5.5 % 에 상응한다. 또한 여기서, 첫번째 2 개의 결정 트리 분할은 비-핫-스팟의 벌크를 분리할 수 있다 (72 %; 395, 첫번째 분할; 320, 두번째 분할). 비-핫-스팟은 큰 카르복시-말단 아미노산 (Val, Leu, Glu, His, Gln, Ile, Met, Lys, Phe, Tyr, Arg 또는 Trp) 에 의해 후임되거나 또는 유연하지 않다 (RMSD < 0.01 Å). 그 다음 분할 기준은 후임자 크기이고, 102.7 Å² 미만 또는 초과의 후임자 크기를 갖는 Asn 잔기를 함유하는, 2 개의 분지를 초래한다. 이것은 CDR 루프 위치에 의해 추가로 분류된다. 따라서, 첫번째 Asn 핫-스팟 계열은 CDR 루프 1 내의 잔기를 함유하고, 카르복시-말단 잔기 Asp, Pro, Thr, 또는 Asn 를 추가로 특징으로 하고, 유연하지 않다 (RMSD > 0.01 Å). 이것은 3 개의 핫-스팟 일원 (각각 5 개의 상동성 모델 일원) 을 함유한다.

102.7 Å² 미만의 후임자 크기를 갖는 잔기는 이들의 백본 이면각 phi 에 의해 추가로 분류된다. 유연하지 않고 이의 phi 각도가 -75.2 도보다 작은 Gly, Ala, Ser, 또는 Cys (< 102.7 Å²) 가 후속하는 Asn 잔기는 두번째 및 가장 큰 핫-스팟 계열 2 를 구성한다. 이것은 6 개의 핫-스팟 일원 (5 개의 상동성 모델 일원을 가진 4, 4 개의 일원을 가진 1, 및 2 개의 일원을 가진 1) 뿐 아니라, 4 개의 위-양성 (5 개의 상동성 모델 일원을 가진 1, 3 개의 일원을 가진 2, 및 1 개의 일원을 가진 1) 을 함유한다.

핫-스팟 계열 3 은 계열 2 와 같은 동일한 유연성 및 후임자 특성에 의해 정의되나, 이의 4 개의 일원 (5 개의 상동성 모델 일원을 가진 2, 3 개의 일원을 가진 1, 및 오로지 1 개의 일원을 가진 1) 은 -75.2 도 초과의 phi 각도, 높은 용매 노출 (SASA > 89.4 Å²) (예를 들어, PyMOL 에 의해 계산됨) 및 3 개 초과의 아미노산의 스트레치 내의 아미노-말단 2차 구조의 변화를 특징으로 한다. 2 개의 위-양성 Asn 잔기 (1 및 2 상동성 모델 일원) 는 또한 본 계열의 일부이다.

요약

치료 단백질 중의 Asn 및 Asp 잔기의 자발적인 분해가 제조, 저장 동안, 및 생체 내에서 발생할 수 있다. 표적 결합에의 관여의 경우, 분해 산물 숙신이미드, isoAsp, 및 CDR 내에 내포된 Asp 의 형성은 표적 결합 효능의 감소 및 약물 효능의 감소를 야기할 수 있다.

인 실리코 예측 도구가 안정한 항체 후보자의 선별을 용이하게 하기 위해 개발되었다. 이것을 위해 먼저 항체 분해 생성물에 대한 정성적 및 정량적 데이터를 함유하는 균일한 데이터 세트가 유래되었다. 상기 검출된 변형은 공지된 핫-스팟 정보에 따른 것이다.

아스파르틸 잔기에서, 측쇄 카르복실 기는 카르복실산의 히드록실 기가 상응하는 음이온보다 더욱 양호한 이탈 기이므로, 분해 메커니즘이 발생하기 위해 양성자화될 필요가 있다. pH 를 증가시키는 것은 이것을 좀더 친핵성이 되게 하는 후속 잔기의 백본 질소 원자의 이온화를 촉진시킨다. pH 가 6 초과의 값에 도달하였을 때, 이들 반대 추진력은 서로 상쇄되는 경향이 있고, pH 의존성을 명백하게 볼 수 없다 (81).

관련 Asn 분해의 검출은 약간의 산성 pH 에서 가장 적합한데, 히드록실 이온 농도의 상승이 관련 분해 부위로부터 방법-유도된 pH-인공물의 구별을 허용하지 않는 인공적으로 높은 탈아미드화 속도를 산출하기 때문이다 (49).

알칼리 pH 안정성 연구로부터의 정보를 약간의 산성 조건 하에서 잃어버리지 않는다는 것을 발견하였다. 알칼리 pH 의존성 핫-스팟은 발효 과정 (pH 7.4) 에서 변경되며, 참조 및 스트레스 샘플에서의 유사한 분해 속도 및, 따라서 pH 6 에서 유도된 분해 후 상당한 증가가 없음을 특징으로 한다. 통상, Asp 및 iso-Asp 의 혼합물은 숙신이미드 가수분해 후 변동 비율로 수득된다 (3, 53, 57). Asp 인 것으로 제시되는 유일한 하나의 생성물의 발생은, 가능하게는 - 이소이미드를 산출하는 대안적인 친핵성 공격 메커니즘을 통해 (37) 또는 직접 Asn 측쇄 가수분해를 통해 (39) - 숙신이미드-독립적 분해 경로에 대해 설득될 것이다. 상기 현상은 Trastuzumab 내의 Asn-Thr 모티프에서 관찰하였다.

두드러지게는, 모든 관찰된 핫-스팟은 시험되는 항체의 CDR 루프 내에 위치한다 (표 1). 따라서, Fab 단편 및 Fv 프레임워크는 안정한 골격을 나타낸다. 자연 발생적 항체와 관련하여 본 치료적 모노클로날 항체 수집물의 적합성을 평가하기 위해, 공지된 Asn 및 Asp 분해 서열 모티프의 빈도 (NG, NN, NS, NT, DG, DS, DT, DD, DH) 를 본 모노클로날 항체 수집물의 CDR (조합된 Kabat and Chothia 정의 (82)) 및 국제 ImMunoGeneTics (IMGT) 정보 시스템의® 모노클로날 항체 데이터베이스 (www.IMGT.org) 로부터의 16286 개의 자연 발생적 인간 모노클로날 항체 서열 (9990 개의 V-D-J 및 6296 개의 V-J 서열) 과 비교하였다. 비교된 데이터베이스의 크기에서의 거대한 차이에도 불구하고, Asn 및 Asp 모티프가 발생하는 빈도는 비교적 동등하게 분포되고, 조사된 항체 분자의 서열 조성이 편향되지 않음을 보여준다 (도 2). 유일한 예외는 IMGT 에서보다 치료적 모노클로날 항체에서 2 배 흔한 것으로 밝혀진 NT 모티프이다. 명백하게는, 분해와 관련하여 가장 관련있는 모티프 - Asn-Gly 및 Asp-Gly - 는 다른 서열 모티프와 비교하여 모든 데이터 세트에서 흔히 발생하지 않는다.

당업계에 보고된 바와 같이, Asn/Asp 분해 경향의 예측은 일차 서열 정보 및 3 차원 구조 정보에 근거하여 실시될 수 있다 (5, 34, 37, 38, 40, 46, 51, 61-64). 단백질 내 Asn 탈아미드화의 예측을 위한 도구는 2001 년에 Robinson & Robinson 에 의해 제시되었다 (51). 이들 저자는 매우 다양한 실험 조건 하에서 관찰되었던 23 개의 상이한 단백질 내의 198 개의 Asn 잔기 및 61 개의 인간 헤모글로빈 변이체 내의 70 개의 Asn 잔기의 보고된 탈아미드화 속도를 사용하였다. 본 연구에 대한 주요 차이점은 (i) 예측이 Asn 에 대해서 유일하게 적용가능하고, (ii) 핫-스팟 수집물 - 따라서 예측에 대한 근거 - 은 균일한 실험적 배경을 갖지 않으며, (iii) 3 차원 정보가 상동성 모델로부터가 아닌, 실험 X-선 구조로부터 유래하고, (iv) 일반적인 사용자에 대해 예측이 단백질에 있어서 2001 년까지 PDB 내의 입력물을 갖는 것을 가능하게 하고, (v) 이것은 오직 X-선 정보가 이용가능한 경우 신규한 단백질에 적용될 수 있다는 것이다. 상기 방법과 반대로, 본원에 보고된 방법은 치료적 항체의 가변 영역에 적응되고, 실험적 X-선 구조에 대한 필요성을 우회하는, 인 실리코 계산에 근거한다. 본원에 보고된 방법의 전제조건은 (i) 항체 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열, (ii) 상동성 모델링 도구, (iii) 분자 가시화 소프트웨어 스위트 (suite), 및 (iv) 본원에 보고된 바와 같은 통계 모델이다. 서열-유일 기반 예측 (31 % Asp, 43 % Asn) 과 비교한 위 할당된 핫-스팟 (2.3 % Asp, 4.3 % Asn) 의 감소는 시간 및 자원을 절약하기 위해 유리하다. 비-핫-스팟 대 핫-스팟의 비는, 오로지 가변 영역이 분해되기 쉬운 Asn 및 Asp 를 함유하고 있기 때문에 Fab 단편의 Fv 부분 만을 가지고 작업함으로써 저하되었다. CDR 루프 내에 내포된 유일한 잔기를 갖는 부류는 덜 예측적인 통계 값을 산출하였다.

본원에는 항체 분해의 예측 부위에 대한 도구가 보고되고, 모노클로날 항체의 가변 영역 내의 불안정한 및 안정한 Asn 및 Asp 아미노산을 구별해내는 주요 특성을 밝히고: 높은 유연성 및 작은 후임자를 가진 Asn 및 Asp 잔기가 분해되기 쉽다. 이들은 2차 구조 요소에 의해 추가로 특징화될 수 있다. 놀랍게도 카르복시-말단 아미노산의 C_γ 원자 및 백본 질소 원자 사이의 거리, Asp pK_a 값, 또는 측쇄 이면각 χ1 로서 반응 메커니즘 (도 1) 을 가장 즉시 기술하는 파라미터가, 분류에 대해 관련있는 것이 아니었다는 것이 밝혀졌다.

본원에 보고된 방법으로 모노클로날 항체의 좀더 효율적인 예비-선별이 수행될 수 있다. 추가의 개발과 임상으로 진행될 수 있는 가장 안정한, 그리고 동시에 가장 효과적인 선도 후보자 분자의 발견 과정에서, 최종 단계 실패가 회피될 수 있고 환자에 대한 최대 이득이 확보될 수 있다.

핫-스팟 경고에 대한 법칙은 하기와 같다: 5 개의 상동성 모델 세트 중의 하나 이상의 Asn/Asp 가 핫-스팟인 것으로 예측되는 경우, 잔기 그 자체는 그대로 분류된다. 핫-스팟 분류를 위한 확률은 앙상블의 각 일원에 대해 0.5 최소에서 1.0 최대까지의 범위일 수 있다. 따라서, 예측 출력값은 정성적일 뿐 아니라 또한, 표준 편차를 포함하는 핫스팟인 것에 대해 각각의 일원의 확률 평균으로 표현되는, 정량적이다. 이와 같이, 앙상블의 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 일원이 핫-스팟 형태로 있는 경우 정보는, 예측 출력값에 함유된다.

도 1 아스파라긴 및 아스파르테이트 분해 경로. 아스파라긴의 탈아미드화 또는 아스파르트산의 탈수는 C-측면 아미노산의 α-아미노 기의 친핵성 공격에 의해 일어난다. 이것은 준안정 숙신이미드 (시클릭 이미드) 중간체의 형성을 초래하며, 이것은 아스파르틸 및 이소-아스파르틸 연결의 혼합물로 가수분해된다. 대안적으로, 백본 카르보닐 산소에 의한 친핵성 공격은 시클릭 이소이미드 중간체를 산출하여, 도입 물 분자의 공격 지점과 독립적인 가수분해 후 오로지 아스파르틸 잔기를 산출한다. 아스파라긴 잔기는 직접적인 물-조력 가수분해에 의해 Asp 로 탈아미드화될 수 있다. 표준 아미노산 (Asn, Asp) 은 흑색 박스에 의해 테두리가 표시된다.
도 2 치료 mAb 수집물의 CDR 내의 Asn 및 Asp 아미노산 모티프 및 자연 발생적 항체 세트 (IMGT) 의 발생. 흑색 삼각형은 37 개의 mAb 의 실험 수집물의 Asn 및 Asp 모티프 내의 핫스팟의 백분율을 보여준다. 막대는 가변 영역 (상부 패널) 또는 유일한 CDR 영역 (하부 패널) 내의 모든 Asn 또는 Asp 잔기 중의 묘사된 서열 모티프의 백분율을 나타낸다. 색칠된 막대로서 제시되는 백분율은 37 개의 분석적으로 평가된 치료 모노클로날 항체의 비-풍부한 수집물을 나타내고, 밝은 회색으로 빗금쳐진 막대는 IMGT 데이터베이스로부터 자연 발생적 항체의 9990 개의 V-D-J- 및 6296 개의 V-J 영역의 수집물에 속한다; a) Asn 서열 모티프, b) Asp 서열 모티프.
도 3 예시적 Asp 잔기에서 개략화된 구조적 환경 중의 Asn 및 Asp 잔기를 특징화하는 파라미터. 카르복실/아미노 기 이탈 경향, 전이 상태 접근성, N_n+1 친핵성, 및 구조적 환경을 기술하는 파라미터는 각각 분홍색, 밝은 청색, 보라색 및 암청색으로 묘사된다. 파라미터 명칭은 표 2 에서와 같이 사용된다.
도 4 서열-기반 예측을 위한 3 차원 분류기의 비교를 위한 ROC 플롯은 위-양성 비율의 상당한 감소를 보여준다. 상이한 통계 방법의 평가는 오로지 서열-기반 예측과 비교된다. 통계 분류 방법에 대해, 위-양성 및 위-음성 Asn/Asp 잔기의 평균 수는 시험 세트 입증의 40 회 실시의 결과이다. TPR (참 양성율) = 양성의 수에 의해 나뉘어진 참 양성의 수. FPR (위 양성율) = 음성의 수에 의해 나뉘어진 위 양성의 수. 트리 (X), rpart (◇), PP (Pipeline Pilot) 트리 (빗금친 ○), 및 RandomForest (○) 는 반복 분할 알고리즘이고; svm (△), ksvm (□) 는 지지 벡터 기계 알고리즘이고; rda

는 규칙화 판별 분석 알고리즘이고; nnet (+) 는 신경 네트워크이고; 서열-기반은 서열 모티프 NG, NS, NT, 및 DG, DS, DT, DD, DH 기반의 예측에 상응한다. 채워진 원으로서 제시되는 Pipeline Pilot 트리는 가지치기 수준 4 에서 예측 알고리즘으로서 선택되었다; a) 아스파르테이트 입증, b) 아스파라긴 입증.
도 5 3 차원 분류기의 비교를 위한 ROC 플롯 (도 4) 및 표로의 확대. 위-양성 및 위-음성 Asn/Asp 잔기의 평균 수는 시험 세트 입증의 40 회 실시의 결과이다. TPR (참 양성율) = 양성의 수에 의해 나뉘어진 참 양성의 수. FPR (위 양성율) = 음성의 수에 의해 나뉘어진 위 양성의 수. 트리, rpart, PP (Pipeline Pilot) 트리, 및 RandomForest 는 반복 분할 알고리즘이고; svm, ksvm 은 지지 벡터 기계 알고리즘이고; rda 는 규칙화 판별 분석 알고리즘이고; nnet 는 신경 네트워크이다. 채워진 원으로서 제시되는 Pipeline Pilot 트리는 가지치기 수준 4 에서 예측 알고리즘으로서 선택되었다; a) 아스파르테이트 입증, b) 아스파라긴 입증.
도 6 결정 트리의 상이한 가지치기 수준의 비교를 위한 ROC 플롯. 결정 트리를 Pipeline Pilot (Accelrys Inc., San Diego, USA) 에서 실행된 바와 같이 자동적으로 가지치기하였다. 위-양성 및 위-음성 Asn/Asp 잔기의 평균 수는 시험 세트 (25%) 입증의 40 회 실시의 결과이다. TPR (참 양성율) = 양성의 수에 의해 나뉘어진 참 양성의 수. FPR (위 양성율) = 음성의 수에 의해 나뉘어진 위 양성의 수. 트리 1-3 및 5-6 은 구체로서 제시되고, 트리 4 는 흑색 삼각형으로서 제시된다. 트리 1 은 비-가지치기된 트리 모델이다. 트리 4 는 예측을 위해 선택되었다. 전반적인, 가지치기 수준 입장은 ROC 플롯에 기반하고, 줌 영역은 상이한 가지치기 수준의 표준 입증의 중복을 보여준다.
도 7 가지치기 수준 4, 미리보기 깊이 4, 및 7 미리보기 대안을 가진 아스파르테이트 결정 트리. 모델은 1425 개의 비-핫스팟 (백색) 및 40 개의 핫스팟 (흑색) 으로 트레이닝되었다. 노드 및 리프의 개요는 존재하는 계열의 칭량된 다수에 의해 착색된다. 각각의 노드/리프의 오른손 면 상의 막대의 채움 수준은 데이터 세트의 분획을 말한다. 노드/리프에서의 각각의 계열의 분획을 원의 착색된 분획에 의해 제시한다. 주요 결정 기준은 형태적 유연성 (RMSD) 및 C-말단 아미노산 (후임자 크기) 의 크기이다; 백색 = 비-핫-스팟; 흑색 = 핫-스팟.
도 8 가지치기 수준 4, 미리보기 깊이 4, 및 7 미리보기 대안을 가진 아스파라긴 결정 트리. 모델은 940 개의 비-핫-스팟 (백색) 및 55 개의 핫-스팟 (흑색) 으로 트레이닝되었다. 노드 및 리프의 개요는 존재하는 계열의 칭량된 다수에 의해 착색된다. 각각의 노드/리프의 오른손 면 상의 막대의 채움 수준은 데이터 세트의 분획을 말한다. 노드/리프에서의 각각의 계열의 분획을 원의 착색된 분획에 의해 제시한다. 주요 결정 기준은 후임 아미노산의 크기 및 형태적 유연성 (RMSD) 이다; 백색 = 비-핫-스팟; 흑색 = 핫-스팟.

실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 참 범주는 특허청구범위에 언급된다. 본 발명의 취지로부터 벗어남 없이 언급된 절차 내에서 변형이 이루어질 수 있다는 것으로 이해된다.

재료 및 방법

모노클로날 항체 기원

24 개의 모노클로날 항체는 인간 또는 인간화된 IgG1 또는 IgG4 항체이다. 13 개의 모노클로날 항체는 Avastin (Bevacizumab, Genentech/Roche); CYT387 (Nimotuzumab, Oncoscience, Ch.B.: 911017W002); Erbitux (Cetuximab, Bristol-Myers Squibb and Eli Lilly and Company, Lot: 7666001); Herceptin (Trastuzumab, RO-45-2317/000, Lot. HER401-4, Genentech); Humira (Adalimumab, Abbott, Ch.B.: 90054XD10); Prolia (Denosumab, Amgen, Ch.B.: 1021509); Raptiva (Efalizumab, Genentech, Merck Serono, Lot: Y11A6845); Remicade (Infliximab, Centocor, Ch.B.: 0RMA66104); Simulect (Basiliximab, Novartis, Ch.B.: S0014); Synagis (Pavilizumab, Medimmune, Lot.: 122-389-12); Tysabri (Natalizumab, Biogen Idec and Elan, LotA: 080475); Vectibix (Panitumumab, Amgen, Ch.B.: 1023731); 및 Xolair (Omalizumab, Genentech/Novartis, Ch.B.: S0053) 를 포함하여 시판 제품이다.

실시예 1

분해가 유도된 샘플의 발생

모든 치료적 모노클로날 항체를 유도된 분해 (스트레스를 받은 샘플) 에 적용하였다. 2 mg 의 각각의 항체를 밤새 4℃ 에서 D-Tube Dialyzers (Novagen, MWCO 6-8 kDa) 중의 희석 완충액 (20 mM 히스티딘-클로라이드, pH 6.0) 내에서 투석하였다. 농도를 측정하고 (Nanodrop) 희석 완충액을 이용해 5 mg/ml 로 조정하였다. 멸균 여과 (Pall Nanosep MF, 0.2 μm) 및 멸균 스크류 캡 튜브로 옮긴 후, 모든 모노클로날 항체 샘플을 2 주 동안 40℃ 에서 조용하게 인큐베이션하였다.

실시예 2

트립신 펩티드 맵핑 실험을 위한 모노클로날 항체 샘플 제조

80 μg 의 모노클로날 항체 참조 및 스트레스를 받은 샘플을, 최종 부피 124.5 μL 의 100 mM Tris, 5.6 M 구아니디늄 히드로클로라이드, 10 mM TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀, Pierce Protein Biology Products, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), pH 6.0, 37℃ 에서, 1 시간 동안 변성 및 환원시켰다. 완충액을 0.5 ml Zeba Spin Desalting Columns (Pierce Protein Biology Products, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 중의 20 mM 히스티딘 클로라이드, 0.5 mM TCEP, pH 6.0 로 교환하였다. 모노클로날 항체를 140 μL 의 최종 부피 내의 μg 항체 당 0.05 μg 트립신 (Promega, Madison) 을 첨가함으로써 37℃ 에서 밤새 소화시켰다. 7 μL 의 10% 포름산 (FA) 용액을 첨가하여 소화를 중단시키고, 샘플을 추가 분석까지 -80℃ 에서 동결시켰다.

실시예 3

액체-크로마토그래피 텐덤 질량-분광분석에 의한 개질된 펩티드의 검출

14 μg 의 소화된 항체를 분리를 위해 Varian (Darmstadt, Germany) 사의 Varian Polaris 3 C18 - Ether 컬럼 (1 x 250 mm; 3 μm 입자 직경, 180 Å 공극 크기) 상에서 RP-HPLC (Agilent 1100 Cap LC, Agilent Technologies, Boeblingen, Germany) 에 적용하였다. mAb2, mAb14, 및 Nimotuzumab 소화물을 RP-UPLC (ACQUITY BEH300 C18 컬럼, 1 x 150 mm, 1.7 μm 비이드 크기, 300 Å 공극 크기, Waters, Manchester, UK) 에 의해 부가적으로 분리하였다. HPLC 또는 UPLC 용리액을 Triversa NanoMate (Advion, Ithaca, NY, USA) 을 사용하여 분할하였고, 380 nL/분을 양이온 방식으로 작동하는 LTQ Orbitrap 고전적 텐덤 질량 분광분석기 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 내로 주입하였다. RP-HPLC 의 이동상은 물 중 0.1% 포름산 (용매 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (용매 B) 으로 이루어졌다. HPLC 를 2% 용매 B 에서 시작하여, 5 분에서 15 분까지 15%, 15 분에서 70 분까지 32%, 70 분에서 80 분까지 38%, 80 분에서 90 분까지 100% 로 상승시키고, 마지막으로 92 분에서 110 분까지 60 μL/분의 유속으로 2% 로 하강시키는 단계식 구배를 사용하여 실시하였다. UPLC 를 1 내지 40% 용매 B 로의 선형 구배를 0 내지 130 분 동안 실행하였다. 220 및 280 nm 의 파장에서 UV 흡수를 측정하였다. 데이터 습득을 Xcalibur™ 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 에 의해 통제하였다. MS/MS 측정을 위해, 단편화를 LTQ 에서 35% 충돌 에너지를 갖는 충돌 기체로서 헬륨을 사용하여 저-에너지 CID 에 의해 유도하였다. mAb14 및 Nimotuzumab 에 대한 단편 이온의 높은 해상도를 수득하기 위해, 단편화를 모 (parent) 질량 목록, 3 의 단리 폭, 0.2 Da 의 모 질량 폭, AGC Target 400000, 및 5000 ms 의 습득 시간을 사용하는 Orbitrap 에서 수행하였다.

실시예 4

MS/MS 평가를 위한 mAb14 및 Nimotuzumab 샘플 제조

추가의 특징 분석을 위해, mAb14 및 Nimotuzumab 스트레스를 받은 샘플을 하기와 같이 처리하였다. 250 μg 의 모노클로날 항체를 변성 완충액 (0.4 M Tris (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany), 8 M 구아니디늄 히드로클로라이드 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany), pH 8) 를 240 μL 의 최종 부피로 첨가함으로써 변성시켰다. 변성 완충액 내에 새롭게 제조된 20 μL 의 0.24 M 디티오트레이톨 (DTT) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 의 첨가 및 37℃ 에서 60 분 동안의 인큐베이션에 의해 환원을 달성하였다. 이후, 어둠 속, 실온에서 15 분 동안 물 중 20 μL 의 0.6 M 요오도아세트산 (Merck KgaA, Darmstadt, Germany) 의 첨가에 의해 샘플을 알킬화하였다. 과량의 알킬화 시약을 30 μL 의 DTT 용액의 첨가에 의해 비활성화시켰다. 샘플을 이후 NAP5 Sephadex G-25 DNA 등급 컬럼 (GE Healthcare, Germany) 을 사용하여 대략 480 μL 의 50 mM Tris/HCl, pH 7.5 로 완충액 교환하였다. 모노클로날 항체를 500 μL 의 최종 부피로 단백질 μg 당 0.03 μg 트립신 (Promega, Madison) 의 첨가에 의해 37℃ 에서 5 시간 소화시켰다. 소화를 20 μL 의 10% 포름산 용액의 첨가에 의해 중단시키고, 샘플을 추가 분석까지 -80℃ 에서 동결시켰다.

실시예 5

변경 수준의 정량화를 위한 데이터 분석

SIEVE 소프트웨어 버전 2.0 (VAST Scientific Inc., Cambridge, MA) 을 스트레스를 받은 샘플과 참조 샘플 사이의 차이에 대해 데이터를 예비-필터하는데 사용하였다. 중대한 SIEVE 설정은 1.0 분의 프레임 시간 폭, 8.0 ppm 의 m/z 폭, 및 50,000 계수의 강도 역치였다. 모노동위원소 (monoisotopic) 질량에 대해 필터된 SIEVE 데이터 (prelement = 0) 를 마크로-가능한 EXCEL 워크북 뿐 아니라, 개질된 및 비개질된 펩티드의 이론적 질량-대-전하 비를 함유하는, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 인 실리코 (in silico) 트립신 소화로부터의 데이터 내로 불러왔다. 펩티드의 관련 m/z 값의 신호 강도 또는 체류 시간에서의 차이 (참조 대 스트레스) 를 마크로-가능한 EXCEL 워크북 (Microsoft, Redmond, WA, USA) 에 의해 반-자동화 방식으로 검출하였다. 76 개의 펩티드 맵으로부터 산출되는 미리-필터링된 펩티드를 실험 질량 스펙트럼 내의 이들의 m/z-값에 의해 Asn 및 Asp 개질을 입증하기 위해 수동으로 점검하였다. 정량화를 위해, 관심의 펩티드의 추출된 이온 크로마토그램 (XIC) 을 이들의 모노동위원소 질량에 근거하여 발생시키고 Xcalibur 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 를 사용하여 전하 상태를 검출하였다. 개질된 대 비개질된 펩티드의 관련 양을 상응하는 피크 영역의 수동 통합 후 계산하였다. 부가적으로, 데이터의 완결성을 확실히 하기 위해 SIEVE 소프트웨어 분석 후 심지어 변경되지 않더라도, 추정적 핫스팟 모티프를 함유하는 CDR 영역 내에 놓여있는 모든 펩티드 (Asn-Gly, Asn-Thr, Asn-Ser, Asn-Asn, Asp-Gly, Asp-Thr, Asp-Ser, Asp-Asp, Asp-His) 를 분석하였다.

실시예 6

2 차원 및 3 차원 파라미터의 상동성 모델링 및 추출

상동성 모델을 프로그램 MODELER 9v7 에 대한 자동화된 소프트웨어 스크립트로 설립하였다 (83). 모델링 템플레이트를 2.8 Å 의 최소 해상도를 갖고, 이들의 가변 영역 내에 실종된 내부 잔기가 없는 인간, 마우스, 및 키메라 항체 Fab 단편 결정 구조로 이루어지는 참조 구조 데이터베이스로부터의 서열 보존성에 기반하여 선택하였다. 각각의 모노클로날 항체에 대한 최고의 산출 모델을 루프 개량 (loop refinement) 절차에 대한 기반으로서 사용하였다 (LOOPER, Discovery Studio, Accelrys Inc., San Diego, USA) (84). 차례로, 루프 개량으로부터 5 개의 최대 가망성 있는 용액을 선택하고 각각의 모노클로날 항체에 대한 구조의 앙상블로서 사용하였다. 파라미터를 상기 상동성 모델 앙상블로부터 컴퓨터로 추출하였다 (표 2). pKa 값을 pdb2pqr 의 일부로서 프로그램 propka 를 사용하여 계산하였다 (79). 2차 구조 요소 (시이트, 헬릭스, 턴, 코일) 를 Discovery Studio (Accelrys Inc., San Diego, USA) 를 사용하는 제작 스트립트로 추출하였다. 파라미터 "다음의 상이한 N-말단 2차 구조", "다음의 상이한 C-말단 2차 구조" 및 "코일 내 위치" 를 Pipeline Pilot (Accelrys Inc., San Diego, USA) 에서 시행되는 Boolean 법칙 (표 2) 을 사용하는 주변 잔기의 2차 구조 정보로부터 추정하였다. "가장자리" "코일 내 위치" 는 다음의 상이한 2차 구조 요소가 N- 또는 C-말단 방향으로, 1 또는 2 개의 잔기만큼 떨어져 있는 경우 할당된다. "중심" "코일 내 위치" 는 두 N- 및 C-말단 방향으로, 2차 구조가 4 개의 잔기에 대해 동일하거나 또는 4 개 초과의 잔기에 대해 두 방향으로 있는 경우 할당된다. 파라미터 "Fab 위치" 는 항체에 대해 조합된 Chothia and Kabat CDR 정의로부터 추론되었던 수이다 (82) (Kabat). "Fab 위치" 번호 1 은 중쇄 (FR H) 의 프레임워크 1, CDR H 1 에 대해 2, FR H 2 에 대해 3, CDR H 2 에 대해 4, FR H 3 에 대해 5, CDR H 3 에 대해 6, FR H 4 에 대해 7, 경쇄 (FR L) 의 프레임워크 1 에 대해 8, CDR L 1 에 대해 9, FR L 2 에 대해 10, CDR L 2 에 대해 11, FR L 3 에 대해 12, CDR L 3 에 대해 13, 및 FR L 4 에 대해 14 에 상응한다. "CDR 루프" 는 경쇄 및 중쇄에 대해 동일한, 1 내지 3 의 범위의 수이다. "후임자 크기" 는 용매 접근가능한 표면적 (85) (Å²) 이고, 하기와 같이 정의된다: Ala, 64.78; Cys, 95.24; Asp, 110.21; Glu, 143.92; Phe, 186.7; Gly, 23.13; His, 146.45; Ile, 151.24; Lys, 177.37; Leu, 139.52; Met, 164.67; Asn, 113.19; Pro, 111.53; Gln, 147.86; Arg, 210.02; Ser, 81.22; Thr, 111.6; Val, 124.24; Trp, 229.62; Tyr, 200.31. 말단 잔기 (phi 및 psi 가 결핍됨) 는 본 데이터 수집물에 표시된다. 모든 다른 파라미터를 PyMOL 에서 자가-기록 python script 가 있는 PDB 파일로부터 추출하였다 (5) (표 2).

실시예 7

분류 평가에 대해 사용되는 기계 학습 알고리즘

최고의 가능한 분류기를 찾기 위해, 상기 유형의 분류 문제에 최고로 적합했던 여러 상이한 방법, 즉, 지지 벡터 기계, 반복 분할 알고리즘, 규칙화 판별 분석 및 신경 네트워크를 사용하였다. 이들은 통계 소프트웨어 R 또는 Pipeline Pilot (Accelrys Inc., San Diego, USA) 에 대한 패키지로서 이용가능하였다. 지지 벡터 기계 (SVM) 는 소위 커넬 (kernel) 함수의 도움을 받아 제시된 데이터 세트를 고차원으로 변환시키기 위한 상이한 방식을 제공한다. 여기서, 패키지 e1071 로부터 svm 방법 (86) 및 kernlab 패키지 (87) 로부터 ksvm 방법을 사용하였다. 반복 분할 방법은 제시된 데이터 세트를 하위세트로 분할함으로써, 결정 트리를 생성하기 위한 단계-방식 방법으로 파라미터를 식별한다. 알고리즘 사이의 차이는 주로 제시된 단계에서 최고의 분할 파라미터를 결정하기 위한 상이한 방법으로 인한 것이다. "트리" (88) 및 "rpart" (89) 방법이 R 에서 사용되었고 이에 의해 여러 개의 상이한 분할 방법이 시험되었다. 좀더 일반화된 형태의 분류기는 본래의 트레이닝 세트의 하위세트에 기반한 결정 트리를 소위 랜덤 포레스트 (random forest) 내로 조합시킴으로써 달성될 수 있다. 규칙화 판별 분석은 최고의 가능한 구별을 달성하기 위해 본격화 그룹 공분산 매트릭스를 사용하는 이용가능한 파라미터의 하위세트를 조합함으로써 분류기를 성립시킨다. 본 방법은 klaR 패키지 내의 "rda" 함수로서 실행된다 (90). 신경 네트워크는 뉴런의 하나의 또는 여러개의 상호연결된 층의 기본 기능성을 모방하기 위해 시도된다. R 의 "nnet" 방법에서 실행되는 바와 같은 (91) 소위 단일-숨겨진-층 신경 네트워크가 적용되었다. 마지막으로, 나이브 (naive) Bayes 분류기, 특정 계열에 속하는 데이터 샘플의 확률을 계산하기 위해 Bayes 의 theorem 을 사용하는 확률적 방법 (트레이닝 데이터 제시됨) 을 R 의 "NaiveBayes" 방법으로 실행되는 바와 같이 시험하였다.

매우 적은 핫스팟이 있으나, 많은 비-핫스팟을 가진 고도로 불균형이 있는 데이터세트를 다뤄야만 하기 때문에, 분류 중량을 소수 부류에 좀더 강조를 하기 위해 도입하였다. 표준 중량화 도식은 분류 빈도의 역을 사용하여, 위 음성률에 대한 특별한 강조로 분류 오차와 관련하여 최고인 것으로서 식별되었다.

실시예 8

반복 분할 및 예측

실시예 7 에서 방법의 비교 평가 후, 최고-수행 분류 알고리즘은 Pipeline Pilot (Accelrys Inc., San Diego, USA) 에서의 단일-트리 미리보기-가능한 반복 분할 알고리즘이었다. 모델을 상동성 모델의 Fv 영역으로부터의 오로지 잔기와 함께 Asn 및 Asp 예측에 대해 개별적으로 트레이닝하였다. 따라서, 트레이닝을 1045 개의 Asn 및 1520 개의 Asp 잔기로 달성하였고, 이 중 60 개 및 35 개는 각각 핫스팟이었고, 습득된 특성은 핫스팟으로서 정의되었다. 스트레스를 받은 샘플 (약한 스팟 및 반응성 스팟) 중의 말단 잔기 뿐 아니라 3% 미만의 개질률을 가진 잔기를 트레이닝으로부터 배제하였다. 기재된 모든 20 개의 파라미터를 트레이닝 세트로 공급하였다. Pipeline Pilot 에서의 단일-트리 반복 분할 분류 알고리즘의 주요 특징은 좀더 대안적인 분할을 시험하므로 더욱 양호한 분류를 허용하는 특정 "미리보기" 깊이를 할당하기 위한 기회이다.

2 개의 산출 예측 모델을 신규한 데이터에 적용한다. 핫-스팟 알람에 대한 법칙은 다음과 같다: 5 개의 상동성 모델의 세트 중의 하나 이상의 Asn/Asp 가 핫-스팟인 것으로 예측되는 경우, 잔기는 그 자체가 그대로 분류된다. 핫-스팟 분류에 대한 확률은 앙상블의 각 일원에 대해 0.5 최소 내지 1.0 최대의 범위일 수 있다. 따라서, 예측 산출량은 정성적일 뿐 아니라 또한, 표준 편차를 포함하여 핫-스팟인 경우 각 일원의 확률의 평균으로 표현되는 정량적이다. 이와 같이, 앙상블의 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 일원이 핫-스팟 형태로 있는 경우의 정보가 예측 산출량에 함유된다.

참고문헌 목록

Claims

하기 단계를 포함하는, 분해 안정성을 가진 항체의 선별 방법:
a) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블 (ensemble) 을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,
b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 Asp 또는 Asn 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,
c) C_α-원자가 형태적으로 유연하지 않고 Asp 또는 Asn 이 큰 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체를 선별하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 아스파라긴 (Asn) 분해 되기 쉬운 항체의 식별 방법:
a) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,
b) 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 백본 이면각 (dihedral angle) phi 를 측정하는 단계,
c) 작은 C-말단 아미노산 잔기 및 -75.2 도 초과의 백본 이면각 phi 를 갖는 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 용매 노출 및 Asn 잔기에 N-말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생 및 Asn 잔기에 대한 상기 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를 측정하는 단계, 및
d) 하기와 같은 경우, 아스파라긴 (Asn) 분해 되기 쉬운 항체를 식별하는 단계:
i) Asn 잔기가 CDR 루프 1 내에 있고, 이의 C_α-원자가 형태적으로 유연하고, C-말단 아미노산 잔기가 Asp, Pro, Thr 또는 Asn 인 경우,
ii) Asn 잔기의 C_α-원자가 형태적으로 유연하고, -75.2 도 미만의 백본 이면각 phi 를 갖고, Asn 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기가 작은 경우, 또는
iii) Asn 잔기의 C_α-원자가 형태적으로 유연하고, -75.2 도 초과의 백본 이면각 phi 를 갖고, 높은 용매 노출을 갖고, 아미노-말단 2차 구조 내의 변화가 Asn 잔기로부터 3 개 초과의 아미노산 잔기에 일어나는 경우.
하기 단계를 포함하는, 개선된 아스파라긴 (Asn) 안정성을 가진 하나 이상의 항체의 선별 방법:
a) 2 개 이상의 항체를 제공하는 단계,
b) 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,
c) 작은 C-말단 아미노산 잔기를 가진 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asn 잔기에 대해 백본 이면각 phi 를 측정하는 단계,
d) 용매 노출 및 Asn 잔기에 N-말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생 및 Asn 잔기에 대한 상기 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를, 각각의 항체 Fv 영역 내에 작은 C-말단 아미노산 잔기 및 -75.2 도 초과의 백본 이면각 phi 를 가진 각각의 Asn 잔기에 대해 측정하는 단계, 및
e) 2 개 이상의 항체로부터 하기 중 하나 이상을 갖는 이들 항체를 제거하는 단계:
i) 형태적 유연성을 갖는 C_α-원자 및 C-말단 아미노산 잔기로서 Asp, Pro, Thr 또는 Asn 을 갖는 CDR 루프 1 내의 Asn 잔기,
ii) 형태적으로 유연한 C_α-원자, -75.2 도 미만의 백본 이면각 phi, 및 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 Asn 잔기, 또는
iii) 형태적으로 유연한 C_α-원자를 갖고, -75.2 도 초과의 백본 이면각 phi 를 갖고, 높은 용매 노출을 갖는 Asn 잔기, 및 아미노-말단 2차 구조 내의 변화가 Asn 잔기로부터 3 개 초과의 아미노산 잔기에 발생함
및 이에 의해 개선된 아스파라긴 (Asn) 안정성을 갖는 하나 이상의 항체를 선별하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 아스파르테이트 (Asp) 분해 되기 쉬운 항체의 식별 방법:
a) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,
b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 C-말단으로 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,
c) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 C-말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생 및 Asp 잔기에 대한 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를 측정하는 단계, 및
d) 하기와 같은 경우, Asp 분해 되기 쉬운 항체를 식별하는 단계:
i) Asp 잔기의 C_α-원자가 높은 형태적 유연성을 갖고, C-말단 아미노산 잔기가 작은 경우, 또는
ii) Asp 잔기의 C_α-원자가 중간 형태적 유연성을 갖고, C-말단 아미노산 잔기가 작고, 카르복시-말단 2차 구조 내의 변화가 3 개 미만의 아미노산 잔기의 스트레치 내에서 발생하는 경우, 또는
iii) Asp 잔기의 C_α-원자가 중간 형태적 유연성을 갖고, C-말단 아미노산 잔기가 Gly 이고, 카르복시-말단 2차 구조 내의 변화가 Asp 잔기로부터 3 개 초과의 아미노산 잔기에서 발생하는 경우.
하기 단계를 포함하는, 개선된 아스파르테이트 (Asp) 안정성을 가진 하나 이상의 항체의 선별 방법:
a) 2 개 이상의 항체를 제공하는 단계,
b) 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,
c) 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 C-말단으로 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,
d) 각각의 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 잔기에 대해 Asp 잔기에 C-말단으로 2차 구조 내의 변화의 발생 및 Asp 잔기에 대한 상기 변화의 발생의 아미노산 잔기 내의 거리를 측정하는 단계, 및
e) 2 개 이상의 항체로부터 하기 중 하나 이상을 갖는 상기 항체를 제거하는 단계:
i) 작은 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 형태적으로 유연한 C_α-원자를 가진 Asp 잔기,
ii) 중간 형태적 유연성을 갖는 C_α-원자를 갖고, 작은 C-말단 아미노산을 갖는 Asp 잔기, 및 카르복시-말단 2차 구조 내의 변화가 Asp 잔기로부터 3 개 미만의 아미노산 잔기의 스트레치 내에 발생함, 또는
iii) 중간 형태적 유연성을 갖는 C_α-원자를 갖고, C-말단 아미노산 잔기로서 Gly 를 갖는 Asp 잔기, 및 카르복시-말단 2차 구조 내의 변화가 Asp 잔기로부터 3 개 초과의 아미노산 잔기에서 발생함,
및 이에 의해 개선된 아스파르테이트 (Asp) 안정성을 갖는 하나 이상의 항체를 선별하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 장 기간 저장 안정성을 가진 항체의 선별 방법:
a) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 상동성 모델 앙상블을 사용하여 C_α-원자의 형태적 유연성을 측정하는 단계,
b) 항체 Fv 영역 내의 각각의 Asp 및 Asn 잔기에 대해 Asp 또는 Asn 잔기에 대한 C-말단 아미노산 잔기의 크기를 측정하는 단계,
c) C_α-원자가 형태학적으로 유연하지 않고 Asp 또는 Asn 이 큰 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 항체를 선별하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법:
a) 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 선별되었던 항체를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 포유류 세포를 배양하는 단계,
b) 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하고 이에 의해 항체를 생성하는 단계.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 형태적 유연성이 상동성 모델 앙상블 내의 각각의 Asn/Asp 잔기의 C_α-원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD) 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 방법:
i) 형태적으로 유연하지 않은 것은 0.01 Å 이하의 RMSD 이고,
ii) 형태적으로 유연한 것은 0.01 Å 초과의 RMSD 이고,
iii) 형태적으로 중간 유연한 것은 0.145 Å 내지 0.485 Å 의 RMSD 이고,
iv) 형태적으로 매우 유연한 것은 0.485 Å 초과의 RMSD 임.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상동성 모델 앙상블이 항체 Fv 단편으로 제작되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 작은 아미노산 잔기가 Gly, Ala, Ser, Cys, 또는 Asp 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 작은 아미노산 잔기가 Gly, Ala, Ser, 또는 Cys 인 것을 특징으로 하는 방법.