KR20150138700A

KR20150138700A - 건 또는 인대 손상 치유를 위한 자가 및 동종의 지방유래 중간엽줄기세포 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20150138700A
Application number: KR1020140067032A
Authority: KR
Inventors: 이성구; 김미형; 최윤정
Original assignee: (주)안트로젠
Priority date: 2014-06-02
Filing date: 2014-06-02
Publication date: 2015-12-10
Also published as: WO2015186906A1

Abstract

본 발명은 자가 및 동종의 지방유래 중간엽줄기세포를 포함하는 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 지방유래 중간엽줄기세포를 단독으로 투여하거나 또는 하이드로겔과 함께 투여함으로써 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염, 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상, 건 박리 등의 건 질환 또는 십자인대 손상, 족관절 인대 손상, 측부인대 손상 등의 인대 질환 부위에 본 발명에 따른 지방유래 중간엽줄기세포를 투여하는 경우, 콜라겐, 세포외기질(ECM) 단백질, 및 각종 성장인자를 분비함으로써 건 또는 인대 질환을 개선 또는 치료하는 효과를 나타낸다.

Description

건 또는 인대 손상 치유를 위한 자가 및 동종의 지방유래 중간엽줄기세포 조성물 및 이의 제조방법{COMPOSITION COMPRISING AUTOLOGOUS AND ALLOGENIC ADIPOSE TISSUE-DERIVED STROMAL STEM CELLS FOR TREATMENT OF TENDON OR LIGAMENT INJURY AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 자가 또는 동종의 지방유래 중간엽줄기세포를 함유하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 지방유래 중간엽줄기세포를 단독으로 투여하거나 또는 하이드로겔과 함께 투여함으로써 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염, 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상, 건 박리 등과 같은 건 질환 또는 십자인대 손상, 족관절 인대 손상, 측부인대 손상 등과 같은 인대 질환을 개선 또는 치료하기 위한 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cells, MSCs)는 자가 재생 능력과, 높은 생존력, 다양한 세포로의 잠재적인 분화 능력을 가진 세포주로 재생 의학에서 세포 치료제로서 가능성이 있다. 이러한 재생 능력은 중간엽 줄기세포의 조직세포로의 직적접인 분화능력에 의한 것보다 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 사이토카인, 성장인자 등에 의한 간접적인 요인에 의한 영향이 더 크다(Fox, J.M. et al. (2007) Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. Br. J. Haematol. 137:491-502)는 것이 밝혀져 있다.

한편 중간엽줄기세포는 침습적인 방벙을 통해 주로 골수로부터 획득하였으나 지방조직에 존재하는 중간엽줄기세포는 골수에 비해 1,000배 정도 다량 존재할 뿐만 아니라 지방유래 중간엽줄기세포의 군집 형성 능력은 골수줄기세포 보다 뚜렷하게 더 높고, 형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGFβ), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 등과 같은 성장인자 분비에 있어서도 차이가 있는 것으로 확인되고 있다(Dmitrieva RI et al. (2012) Bone marrow- and subcutaneous adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: differences and similarities. Cell Cycle. 15;11(2):377-83).

또한 지방은 조직이 풍부하고 개체로부터 분리하는데 있어 위험요소가 매우 적으며 분리된 세포를 바로 사용하거나 장래의 자가 또는 동종의 적용을 위해 저온 보존될 수 있다는 장점이 있다.

따라서 중간엽줄기세포의 성장인자와 같은 분비물질을 치료 목적의 약학적 유효량으로 수득하기 위해서 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 이용해 이를 대량으로 배양하는 방법이 필요하다.

한편 건(tendon)과 인대(ligament)는 섬유성 연부조직이며 콜라겐을 주요 구성성분으로 하여 각각 뼈와 뼈, 뼈와 근육으로 부착점만 다를 뿐 기계적 특성뿐만 아니라 구조적인 면까지 유사하다.

인체 조직 중 건(힘줄)이나 인대는 혈류의 공급이 인체의 다른 조직보다 상대적으로 부족하여 한 번 손상되면 재생되는 데 상당한 시간이 소요되고 또 재생되어 치료된다 하더라도 정상적이던 건이나 인대처럼 그 기능이 완전히 회복되지 못하는 것으로 알려져 있다. 이들은 재생된 후 생역학적 강도가 정상적인 건이나 인대에 비하여 저하되는 것으로 나타났고 이러한 생역학적 강도는 이들 조직을 구성하는 콜라겐에 의하여 그 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 한편 건과 인대의 치료에 미치는 다양한 성장인자에 대한 연구도 보고되었다(Molly T. et al. (2003) The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Medicine 33, 5: 381-394).

건이나 인대의 외상으로 인한 손상은 운동이나 작업, 일상생활에서도 흔하게 발생하며 노화로 인한 퇴행성 변화에 의한 건의 염증이나 부분 파열 등은 사소한 외상으로도 발생할 수 있다.

그러나 지금까지 이 같은 노화(퇴행성 변화)및 외상으로 인한 건의 염증, 부분 파열(염좌) 또는 완전 파열되어 손상된 건이나 인대에 대하여는 끊어진 건이나 인대를 봉합하는 수술적 치료 및 증상 완화에 그치는 스테로이드 주사, 물리적용법 외에는 특별한 치료법이 개발되어 있지 않다.

따라서 손상된 건을 재생하고 복구하여 실질적으로 건 또는 인대 질환을 개선 또는 치료할 수 있는 건 또는 인대 질환 치료가 요구되어 진다.

한국등록특허 제1,219,624호는 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker) 및 지방조직 유래 줄기세포를 유효성분으로 하여 손상 근육의 재생 시 과도한 섬유화의 억제 또는 손상 근섬유의 융합 또는 새로운 근섬유로의 분화를 조절하는 줄기 세포의 미세환경(Niche)을 형성하게 함으로써 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진할 수 있다는 점이 개시되어 있으나 안지오텐신 수용체 차단제를 포함하는 것만으로 줄기세포의 분화가 결정되는 것은 아닌바 임상에 적용시 그 효과가 명확하다고 단정하기 어렵고 근거가 되는 실험예 또한 동물실험에 그치고 있어 더욱이 그 효과를 장담할 수 없다.

한편 한국공개특허 제2013-0000397호에는 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF)를 포함하는 조성물을 투여함으로써 건 질환을 치료할 수 있다는 점이 기재되어 있으나 상기 혈소판-유래 성장인자는 혈액을 비롯한 생물학적 유체를 통해 분리하는 과정이 복잡하고 재조합 DNA 기법을 이용해 수득하는 경우 역시 여러 과정을 거쳐야 하기 때문에 경제성이 낮다. 또한 인공물질 및 동종 유래 물질이 아닌 물질을 임상에 적용할 경우 개체 내에서 완벽히 착생되어 부작용 없이 기대기능을 수행할 것이라고 장담할 수 없다.

상기 선행기술들은 줄기세포의 분화를 조절하거나 성장인자를 건질환 부위에 투여하여 건질환을 치료하는 방법을 제시하고 있다. 하지만 자가 및 동종 유래의 세포 또는 물질이 아닌 이상 부작용 없이 명확한 효과를 나타낼 수 있다고 확증하기 어려우며 복잡한 단계가 요구되는 경우 경제성이 떨어진다.

한편 국제특허 WO2007/127698호에는 간 이외의 조직에서 유래한 줄기세포로부터 유래하는 간줄기세포를 제조하는 방법이 기재되어 있고, 간줄기세포가 지방줄기세포로부터 유래하며, 지방줄기세포(ASC)에서 HGF와 같은 간 사이토카인을 생산하여 생체 내 이식되는 경우 간조직의 재생에 유용하다는 점이 개시되어 있고, 한국등록특허 제995,133호에는 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구로부터 세포성장인자를 생산하는 방법 및 상기 생산방법으로 수득된 배양물의 조직재생 용도에 대하여 개시되어 있으며, 한국등록특허 제955,212호에는 인간의 지방유래 줄기세포를 이용하여 인간의 성장인자를 대량으로 생산하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기 문헌에는 지방유래 중간엽줄기세포를 이용하여 건 관련 질환을 효율적으로 치료하는 방법, 및 최적 배양조건에 대하여는 나타나있지 않다.

따라서 상기 단점을 모두 보완할 수 있는 부작용이 없고, 간단한 방법으로 약학적 유효량이 제조될 수 있으며, 임상에 적용해 그 효과가 증명된 건 또는 인대 질환의 개선 및 치료 방법이 요구되어 진다.

한국등록특허 제1,219,624호 한국공개특허 제2013-0000397호 WO2007/127698호 한국등록특허 제995,133호 한국등록특허 제955,212호

Fox, J.M. et al. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. Br. J. Haematol, 2007, 137:491-502 Dmitrieva RI et al. Bone marrow- and subcutaneous adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: differences and similarities. Cell Cycle, 2012, 15;11(2):377-83 Molly T, Wang Y, and Murrell GAC. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Medicine. 2003, 33;5: 381-394 Nixon AJ, DahlgrenL A, Haupt JL et al. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. Am J Vet Res 68, 2008, 928-937 Armando de Mattos Carvalho, MSc, Ana Liz Garcia Alves et al. Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells for Experimental Tendinitis Therapy in Equines. Journal of Equine Veterinary Science, 31, 2011, 26-34 Chong AK, Ang AD, Goh JC et al. Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Influence Early Tendon-Healing in a Rabbit Achilles Tendon Model. Journal of Bone&Joint Surgery 2007;89-A:74-81 DelBue M, Ricco S, Ramoni R et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Vet Res Commun 2008;32:S51-55 Guest DJ, Smith MRW, Allen WR et al. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Verterinary Journal 2008;40:178-181 Young M. stem cell applications in tendon disorders: a clinical perspective. Stem Cells International. Jan 2012;Vol. 2012:1-12

본 발명의 목적은 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염, 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상, 건 박리 등 각종 건 질환 또는 십자인대 손상, 족관절 인대 손상, 측부인대 손상 등과 같은 인대 질환을 개선 또는 치료할 수 있는 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적 달성을 위하여, 본 발명은 자가 또는 동종의 지방조직으로부터 유래한 중간엽줄기세포를 함유하는 건 또는 인대 질환 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 배양 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물인, 자가 또는 동종의 지방조직유래 중간엽줄기세포를 약학적 유효량으로 배양하여 단독으로 혹은 하이드로겔과 함께 건 또는 인대 질환에 적용함으로써 부작용 없이 손상 부위의 조직을 재생 및 재구축 하여 건 또는 인대 질환을 개선 또는 치료 할 수 있다.

도 1a는 지방 줄기세포의 표면 표현형 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 인간 지방유래 중간엽줄기세포에서 발현되는 CD29 및 CD44를 세포자동해석·분리장치(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)를 통해 확인 후 기저배지에서 배양한 세포와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 인간 지방유래 중간엽줄기세포에서 분비되는 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGFb), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor-1, IGF-1)의 양을 효소면역측정법(enzyme linked immunoassay, ELISA)으로 정량하여 기저배지에서 배양한 세포와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 지방 줄기세포를 힘줄세포와 함께 공동 배양하였을 때, 기질배지 대비 증식배지에서 공동 배양하였을 때, 힘줄세포의 증식을 보여주는 도면이다.
도 4는 증식배지에서 배양한 인간 지방유래 중간엽줄기세포 배양액을 처리하였을 때, 기질배지에서 배양한 배양액을 처리한 세포 대비 힘줄세포의 증식을 보여주는 그래프이다.
도 5는 증식배지에서 4일간 배양한 5개의 서로 다른 lot(로트)의 지방 줄기세포들의 세포 증식율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 인간 지방유래 중간엽줄기세포에서 분비되는 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF)의 양을 효소면역측정법(enzyme linked immunoassay, ELISA)으로 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 증식배지에서 4일간 배양한 세포들에서 분비되는 콜라겐을 측정한 그래프이다.
도 7b는 증식배지에서 배양한 지방 줄기세포의 콜라겐 타입 I 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 7c는 콜라겐 타입 I 단백질의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 7d는 지방유래 중간엽줄기세포를 콜라겐 타입 I으로 염색하여 관찰한 형광현미경 사진이다(X 40).
도 8은 증식배지에서 4일간 배양한 5개의 서로 다른 lot의 지방 줄기세포들을 힘줄세포와 함께 공동 배양하였을 때, 힘줄세포의 증식율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 지방 줄기세포를 생분해성 지지체와 함께 이식 후 힘줄손상 치유의 유효성을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 지방유래 중간엽줄기세포를 포함하는 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 자가 또는 동종 유래인 것이다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 1계대 이상 계대배양된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 하기의 특징 중 적어도 하나 이상의 특징을 가지는 것이다.

(a) CD29 및 CD44에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;

(b) 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGFb), 및 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)로 이루어진 그룹으로부터 어느 하나 이상의 성장인자를 분비함.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)를 1,000 pg/ml 이상 분비하는 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 2계대 이상 배양해 수집한 지방유래 중간엽줄기세포를 1.0×10⁵ 양으로 24-웰 플레이트에 접종 후, 증식배지 1 mL를 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 배양한 중간엽줄기세포에서 측정하였을 때 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)를 1,000 pg/ml 이상 분비하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF)를 200 pg/ml 이상 분비하는 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 2계대 이상 배양해 수집한 지방유래 중간엽줄기세포를 1.0×10⁵ 양으로 24-웰 플레이트에 접종 후, 증식배지 1 mL를 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 배양한 중간엽줄기세포에서 측정하였을 때 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF)를 200 pg/ml 이상 분비하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGFb)를 150 pg/ml 이상 분비하는 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 2계대 이상 배양해 수집한 지방유래 중간엽줄기세포를 1.0×10⁵양으로 24-웰 플레이트에 접종 후, 증식배지 1 mL를 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 배양한 중간엽줄기세포에서 측정하였을 때 형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGFb)를 150 pg/ml 이상 분비하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 500 pg/ml 이상 분비하는 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 2계대 이상 배양한 지방유래 중간엽줄기세포를 1.0×10⁵양으로 24-웰 플레이트에 접종 후, 10% 혈청용액(fetal bovine serum FBS), 1 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)가 포함된 배양배지를 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 배양한 중간엽줄기세포에서 측정하였을 때 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 500 pg/ml 이상 분비하는 것일 수 있다.

실험조건 및 실험기구에 따라 결과는 다소 달라질 수 있으나, 본 발명에 따른 증식배지를 사용할 경우, 성장인자의 경우 기질배지에서 배양한 세포보다 IGF의 경우 3배 이상, 보다 구체적으로 3.5배 이상, HGF의 경우 3배 이상, 보다 구체적으로 5배 이상, TGFβ의 경우 1.2배 이상, 보다 구체적으로 1.3배 이상 증가하는 것으로 나타났다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 세포증식 및 혈관형성을 촉진할 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 세포외기질 단백질을 분비할 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 콜라겐을 분비할 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 지방유래 중간엽 줄기세포는 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 형질전환성장인자베타-1((transforming growth factor beta-1, TGF-β1), 혈소판 유도성 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF) 및 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자를 함유하는 배지에서 배양되는 것이다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 조성물은 환부에 주사되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 환부는 골-건 또는 골-인대 접합부일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 환부는 건 또는 인대일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 건 질환은 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염, 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상 및 건 박리로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니고, 여기에서 외측 상과염은 테니스 엘보를, 내측 상과염은 골퍼스 엘보를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 인대 질환은 십자인대 손상, 족관절 인대 손상, 측부인대 손상, 인대 파열, 인대 염좌로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 조성물은 단일 용량 또는 단일 용량 초과량으로서 투여되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 조성물은 단일 주사에 의해 투여되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 조성물의 투여량은 투여경로, 치료 회수, 치료가 필요한 개체의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인을 고려하여 적절한 유효량을 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 조성물은 투여 약 6주 이내에 기준선과 비교하여 건 또는 인대 질환 병변의 크기가 10% 이상 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 조성물은 생분해성 지지체를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 생분해성 지지체는 하이드로겔로서, 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스, 펙틴, 키틴, 폴리글라이콜산, 및 폴리유산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 줄기세포 및 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 (a) 지방조직으로부터 중간엽줄기세포-혈관 분획을 분리하고 기질배지에서 배양하는 단계; (b) 스트로마-혈관 분획을 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 형질전환성장인자베타-1((transforming growth factor beta-1, TGFβ-1), 혈소판 유도성 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF) 및 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자를 함유하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 배양된 중간엽줄기세포를 1계대 이상 계대배양하는 단계;를 포함하는, 건 또는 인대 질환 개선 또는 치료용 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)에서 수득된 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 생분해성 지지체와 함께 단일 주사에 의해 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 생분해성 지지체는 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스, 펙틴, 키틴, 폴리글라이콜산 및 폴리유산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 따라 증식배지를 사용하여 제조하는 경우, 기존 기질배지에서 배양한 경우와 비교하여 CD29가 5% 이상 발현이 증가하며 CD44의 경우 30% 이상 발현이 증가하는 것으로 나타났고, 성장인자의 경우에도 기질배지에서 배양한 세포보다 IGF의 경우 3.5배, HGF의 경우 5배, TGFβ의 경우 1.3배 가량 증가한 것으로 나타났다.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 중간엽줄기세포의 배양방법에 대하여 설명하면 다음과 같다:

(1) 중간엽줄기세포의 배양

해당 조직에서 얻은 중간엽줄기세포를 기질배지에 현탁시켜 10,000-40,000 cells/㎠의 농도로 배양용기에 접종한 후 배양한다. 기질배지는 10% 우혈청이 포함되어 있는 DMEM 또는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지로, 약 24 시간 배양한다.

(2) 증식배지(expansion media)에서 배양

기질배지를 제거한 후, 증식배지에서 배양하여 부착성세포를 증식시킨다. 증식배지는 10% 우혈청, 0.1~100 ng/㎖ 농도의 bFGF (basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM 또는 DMEM/F12로, 부착성인 지방유래 중간엽줄기세포를 신속하게 증식시켜 세포 양을 단기간에 다량으로 증가시키는 작용을 한다.

(3) 계대 배양

세포가 배양용기 바닥의 80~90%를 채우면 증식배지를 제거하고 트립신 처리를 통해 세포를 배양용기에서 떼어낸다. 계대배양을 위해서는 세포를 1:3~1:4로 희석하여 새로운 배양용기에서 증식배지와 함께 배양한다. 이와 같은 방법으로 추가적인 계대배양이 가능하다.

(4) 콜라겐 및 성장인자 분비 확인

동종의 지방유래 중간엽줄기세포는 그 종류(개체)에 따라서도 생물학적 특성이 다르게 나타나므로, 적어도 1계대이상 계대배양한 지방유래 중간엽줄기세포에서의 콜라겐 및 성장인자 분비를 확인하여 힘줄손상의 치유에 효과적인 동종의 지방유래 중간엽줄기세포를 선택하여 사용할 경우 자가세포에 비해 임상적으로 효과적이다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 세포배양용 배지는 DMEM 또는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 세포배양용 배지는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 소 태아 혈청, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 항생제 및 항진균제 등을 사용 할 수 있다.

[정의]

“건(tendon)”은 근육을 뼈에 부탁시키는 섬유성 연부조직으로 근육의 수축력을 전달하여 관절 운동이 일어날 수 있도록 하며 운동 시 힘을 조절하고 물리적 안정화 기능을 수행해 에너지를 보관하고 고효율로 회복시키는 역할을 한다.

“인대(ligament)”는 뼈와 뼈 사이를 연결하는 섬유성 연부조직으로 주로 관절에 위치하여 관절을 안정하게 유지하는 역할을 한다.

“지방유래 중간엽줄기세포(adipose-derived stromal stem cells)”는 중간엽줄기세포-혈관 분획에서 얻어지는 중간엽줄기세포를 의미한다. 지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cells, ASC), 지방유래 성체 줄기세포(adipose-derived adult stem cells, ADAS), 지방 줄기세포와 동일하게 표현될 수 있다.

“동종 이식”은 타인 또는 같은 종의 다른 개체로부터 특정 조직이나 장기, 또는 세포를 이식받는 것으로, 자기 조직이나 장기, 세포를 사용하지 못할 경우 다른 사람이나 다른 동물로부터 조직이나 장기 또는 세포를 이식받는 것을 의미한다.

“CD29 및 CD44”는 중간엽줄기세포의 표지자로 면역형광법과 면역세포화학법으로 나타나는 양성반응 결과를 통해 중간엽줄기세포를 확인하게 해준다.

“간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)는 산란 인자로서 알려져 있으며, 유사분열, 이동, 침습 및 형태발생을 촉진하는 다기능성 사이토카인이다. HGF-의존성 시그널링은 응집 및 세포 유착을 촉진시킴으로써 인테그린 기능을 조절한다. HGF/SF 유도 효과는 리간드 결합 후에 MET 티로신 키나아제 수용체의 시그널링을 통해 발생한다.

“인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF)”는 IGF-I 및 IGF-II는 인슐린과 50%의 구조적 상동성을 공유한다. IGF는 세포 증식의 유사분열 자극물질 뿐만 아니라 세포 아폽토시스 경로의 억제물질로서 작용한다. 성장 호르몬 (GH)의 조절 하에서, 간은 IGF 생성의 주요 부위이다. IGF-I 수준은 또한 영향 및 발생 단계에 의해 영향을 받는다. IGF의 오토크린 및 파라크린 생성은 성장 조절을 위해 이용 가능한 IFG의 수준에 기여한다.

“형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGFβ)”는 23개 aa의 시그널 서열, 256개 aa의 프로(pro)-영역 및 112개 aa의 성숙한 세그먼트로 구성된 55 kDa의 391개 아미노산 (aa) 프레프로단백질(preproprotein)이다. 분비 전에, 프로-영역은 퓨린 유사 프로테아제에 의해 RxxR 부위에서 절단된다. 이는 선부착(previously attached) 이황화물 결합된 프로-영역과 비공유결합하여 "잠재 복합체”를 형성하는 글리코실화되지 않은 25 kDa의 이황화물 결합된 성숙한 이량체를 생성시킨다. 이러한 복합체가 분비된다. 활성화는 거의 확실하게는 트랜스멤브레인 세린/트레오닌 키나아제를 통해 다양한 조건하에서 세포외부에서 일어나서, 전사 인자의 Smad 패밀리에 의해 매개되는 세포내 시그널 캐스케이드를 개시시킨다.

“혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)”는 내피 세포에 대한 성장 및 생존 인자로서 최초로 확인되었다. 이는 내피 세포증식을 유도하고, 혈관형성 및 맥관형성을 조절한다. VEGF는 45 kDa 동종이량체로서 분비되는 헤파린 결합 당단백질이다. 통상적으로 내피 세포 자체는 아닌 다수의 세포 유형이 VEGF를 분비한다.

“세포외기질 단백질”은 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 엘라스틴 등의 단백질로 세포와 세포 사이의 결합 및 완충 작용을 한다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 이는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것이지, 본 발명의 권리범위를 이로 한정하려는 의도는 아니다.

[실시예]

실시예 1: 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 배양 방법

지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방유래 중간엽줄기세포를 분리하였다(지방조직은 보통 지방흡입술로 얻을 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다).: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 케이알비(Krebs-Ringer bicarbonate, KRB)용액으로 3∼4 회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37 ℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20 ℃, 1200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기질배지를 넣어 현탁시킨 후, 20 ℃, 1200 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 중간엽줄기세포-혈관 분획으로, 상층액을 제거하였다.

중간엽줄기세포-혈관 분획을 기질배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기질배지, 또는 기질배지에 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF)가 1 ng/㎖ 농도로 포함된 증식배지를 이용하여 증식시켰다. 지방유래 중간엽줄기세포가 배양용기의 80-90% 정도로 자라면 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:3∼1:4로 희석하여 계대 배양을 수행하였다.

[실험예]

실험예 1: 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 표면형 분석

상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 지방유래 중간엽줄기세포를 수집하여 1.5 ㎖ 원심분리용 튜브에 옮겨 FACS염색 용액 (1% 우태아혈청이 포함된 인산염 완충용액) 1 ㎖를 넣고 잘 섞은 다음, 10,000 rpm으로 5 초 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 FACS 염색용액 1 ㎖에 재부유하여 10,000 rpm으로 5 초 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 FACS 염색 용액 300 ㎕에 재부유하였다. 샘플 수에 따라 원심분리용 튜브 당 약 2×10⁵개의 세포가 포함되도록 새로운 튜브에 분주하고 항체를 첨가한 후 얼음에서 30 분 동안 반응하였다. FACS 염색 용액 1 ㎖에 재부유하여 10,000 rpm으로 5초 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. FACS 고정액 400∼500 ㎕를 첨가하여 재부유하고 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 하기 도 1a와 도 1b에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 지방 줄기세포는 기질배지에서 배양한 세포와 비교하여 CD29, CD44의 발현이 증가하는 면역학적 특성을 나타냄을 확인하였다.

실험예 2: 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 성장인자 분비

상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 지방유래 중간엽줄기세포를 수집하여 1.0×10⁵세포를 24-웰 플레이트에 접종 후, 기질배지 또는 증식배지 1 mL를 첨가하였다. 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 배양한 후 상층액을 수집한 후, 힘줄손상 치유에 관계되어 있는 대표적인 성장인자인 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor-1, IGF-1), 형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGFb)의 양을 효소면역측정법(enzyme linked immunoassay, ELISA)을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 보여주는 바와 같이, 증식배지에서 배양한 세포는 3,000~5,000 pg/mL(기질배지 대비 10배 이상의 고농도)의 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)와 357~378 pg/mL 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF)(기질배지 대비 3.5배 이상의 고농도)를 분비하였다. 또한 본 발명에 따라 배양한 중간엽줄기세포는 형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGFβ)를 200~214 pg/mL로 기질배지 대비 1.3배의 성장인자를 분비하였다. 따라서 본 발명에 따라 배양한 중간엽줄기세포를 힘줄손상 부위에 적용하면 세포증식 및 치유를 촉진하는 다양한 성장인자들이 지속적으로 분비됨으로써 상처 치유를 용이하게 할 수 있다는 것을 확인하였다.

실험예 3: 동종 지방유래 중간엽줄기세포의 힘줄세포 증식예 1

상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 지방유래 중간엽줄기세포를 수집하여 cm²당 5,000개의 세포를 트랜스웰(transwell) 플레이트에 힘줄세포와 공동 배양하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 배양 후 힘줄세포의 증식을 확인하였다.

도 3은 힘줄세포를 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 7일 동안 공동 배양하였을 때 기질배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 공동 배양한 줄기세포 대비 증가한 힘줄세포의 증식을 나타내는 그래프이다. 기질배지에서 배양한 줄기세포와 공동배양한 힘줄세포는 1.53배 증가한 반면 증식배지에서 배양한 줄기세포와 공동배양한 힘줄세포는 2.35배 증가한 것을 확인하였다.

실험예 4: 동종 지방유래 중간엽줄기세포의 힘줄세포 증식예 2

상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 지방유래 중간엽줄기세포를 수집하여 cm²당 5,000개의 세포를 96-웰 플레이트에 접종 후, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 배양 후 배양액을 수집하여, 기질배지 또는 증식배지를 사용하여 25, 50, 75%가 되도록 희석한 후 힘줄세포에 처리하여 7일간 배양 후 힘줄세포의 증식을 확인하였다.

도 4는 힘줄세포를 지방유래 줄기세포 배양액과 7일 동안 배양하였을 때 기질배지에서 배양한 배양액을 처리하였을 때와 비교하여 25, 50, 75%에서 각각 1.09, 1.30, 1.34배 농도별로 증가하였으며, 기질배지에서 배양한 배양액을 처리한 경우에는 농도에 따른 변화를 확인할 수 없었다.

실험예 5: 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 증식능

상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 5개의 로트(lot)의 지방유래 중간엽줄기세포를 수집하여 cm²당 5,000개의 세포를 96-웰 플레이트에 접종 후 10% 혈청용액(fetal bovine serum FBS), 1 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)가 포함된 배양배지를 첨가한 후 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 4일 동안 배양하였다. 배양 4일째 테트라졸리움 솔트(tetrazolium salts, WST-1)을 첨가하여 5개의 로트(lot) 간의 세포증식 정도를 측정하였다.

도 5는 5개의 서로 다른 로트(lot) 에서의 줄기세포의 증식능력을 테트라졸리움염(tetrazolium salts, WST-1)을 이용하여 정량적으로 측정하여 나타낸 그래프로 5번 로트의 줄기세포가 가장 잘 증식함을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 성장인자 분비

상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 5개의 로트(lot)의 지방유래 중간엽줄기세포를 수집하여 1.0×10⁵세포를 24-웰 플레이트에 접종 후, 10% 혈청용액(fetal bovine serum FBS), 1 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)가 포함된 배양배지를 첨가하였다. 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 배양한 후 상층액을 수집한 후, 중간엽줄기세포에서 분비되는 대표적인 성장인자인 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor-1, IGF-1)의 양을 효소면역측정법(enzyme linked immunoassay, ELISA)을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 6에서 보여주는 바와 같이, 상기 세포는 619.9~1641.2 pg/mL의 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 37~402 pg/mL 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF)를 분비하였다. 5 개의 서로 다른 로트(lot)의 지방유래 중간엽줄기세포 중에서 5번 로트(lot)에서 분비되는 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF)의 분비량이 많은 것을 확인하였다.

즉, 본 발명에 따라 배양한 중간엽줄기세포를 힘줄손상 부위에 적용하면 세포증식 및 혈관형성을 촉진하는 다양한 성장인자들이 지속적으로 분비됨으로써 상처 치유를 용이하게 할 수 있다는 것을 확인하였다.

실험예 7: 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 콜라겐 타입 I 발현

상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 5개의 로트(lot)의 지방유래 중간엽줄기세포를 수집하여 콜라겐 분비되는 정도 및 발현정도를 확인하였다.

도 7 a는 배양 4일째의 지방유래 중간엽줄기세포의 배양액을 취하여 콜라겐의 분비 정도를 Sircol assay를 통해 측정한 것으로 5번 로트(lot)에서 5.7 ug/ml의 콜라겐이 많이 분비됨을 확인하였다.

도 7b는 배양 4일째의 지방유래 중간엽줄기세포에서 RNA를 추출하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 기법을 사용하여 콜라겐 mRNA 발현수준을 확인하였다. 4일 동안 배양한 세포를 수집하여 지방유래 중간엽줄기세포에서 분비되는 기질 중 콜라겐 타입 I (Collagen Type I; COLI)의 발현을 인간유래 유전자 특이적으로 반응하는 프라이머(primer) (hcol I-F 5'-CAGCCGCTTCACCTACAGC, hcol I-R 5'-TTTTGTATTCAATCACTGTC)를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)으로 확인하였다.

도 7c는 4일 동안 배양한 세포를 수집하여 지방유래 중간엽줄기세포에서 분비되는 기질 중 콜라겐 타입 I (Collagen Type I; COLI)의 발현을 인간유래 단백질 특이적으로 반응하는 항체를 사용하여 확인한 것으로, 5번째 로트(lot)의 지방유래 중간엽줄기세포에서 5번째 로트(lot)의 지방유래 중간엽줄기세포에서의 콜라겐 타입 I이 가장 많이 발현하는 것을 확인하였다.

또한 콜라겐 타입 I의 발현되는 정도를 형광면역염색방법으로 관찰하였다. 실시예 1에서와 같이 배양한 5개의 로트(lot)의 지방유래 중간엽줄기세포를 3.7% 포름알데히드를 포함하는 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 30분 동안 고정시켰다. 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 3회 세척하고 5% 정상 염소 혈청 (normal goat serum)과 0.1% triton-X100을 포함하는 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 30분 동안 침투(permeablization) 및 블로킹(blocking)을 수행하였다. 1차 항체를 포함하는 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)를 첨가한 후 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 3회 세척하고, 2차 항체를 첨가한 후 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 3회 세척한 후 마운팅 하고 형광현미경으로 관찰하였다.

도 7d는 지방유래 중간엽줄기세포의 세포외기질단백질 (extracellular matrix; ECM) 중 힘줄을 95%를 구성하는 단백질인 콜라겐 타입 I의 분비능을 보여주는 사진으로 (x 40), 여기에 나타난 바와 같이 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포에서는 전체적으로 콜라겐 타입 I에 양성반응을 나타내었다. 즉, 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포는 힘줄손상 치유에 필수적인 세포외기질 단백질을 다량 분비할 뿐만 아니라 분비된 콜라겐이 체내에 이식하였을 때 다양한 기질을 제공함으로써 힘줄손상 치유를 용이하게 할 수 있다는 것을 확인하였다.

실험예 8: 동종 지방유래 중간엽줄기세포의 힘줄세포 증식예

상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 5개의 로트(lot)의 지방유래 중간엽줄기세포를 수집하여 트랜스웰(transwell) 플레이트에 힘줄세포와 공동 배양하여 10% 혈청용액(fetal bovine serum FBS), 1 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)가 포함된 배양배지를 첨가한 후 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 72시간 배양 후 힘줄세포의 증식을 확인하였다.

도 8는 힘줄세포를 지방유래 줄기세포와 7일 동안 공동 배양하였을 때 힘줄세포만을 배양한 대조군과 비교하여 1.67배~2.2배 증가하였으며 5개의 로트(lot) 중에서 5번째의 지방유래 중간엽줄기세포가 힘줄세포의 증식을 가장 많이 증가시키는 것을 확인하였다.

실험예 9: 동종 지방유래 중간엽줄기세포의 힘줄손상 치료예

상기 실시예 1의 방법으로 배양한 지방유래 중간엽줄기세포의 임상적 적용을 위해 외측상과염으로 진단 받은 환자를 대상으로 연구자 임상시험을 실시하였다. 제조된 세포들은 1계대 이상 계대 배양하였고 그룹 1(1×10⁶cells/mL)과 그룹 2(10×10⁶cells/mL)의 두 농도의 세포를 피브린 글루함께 힘줄손상 부위에 1 mL의 용량으로 초음파상으로 관찰하면서 이식하였다.

도 9a는 이식 후 6주와 12주에 힘줄손상 치유 및 통증 정도를 통증척도 지수(VAS score)와 변형된 메이요(Mayo) 활동지수를 나타내는 그래프이다. 휴식 시와 활동 시 통증척도(VAS)(통증 지표는 그룹 1과 그룹 2 모두 주사 전과 대비하여 6주와 12주에서 현저히 감소하였으며, 통증과 기능적 상태를 종합적으로 평가하는 척도인 변형 메이요(Mayo) 활동 지수를 또한 6주부터 통계적으로 유의하게 호전되는 양상이 관찰되었다.

도 9b는 임상시험 대상자의 힘줄 결손부위의 해부학적인 구조를 조사하기 위하여 초음파 영상으로 관찰한 병변 크기를 측정한 사진으로, 그룹 1과 그룹 2 모두 주사 전과 비교하여 주사 후 6주에 병변 부위의 크기가 줄어들어 12주에는 그 크기가 현저히 줄어들었다. 특히 주사 후 12주 초음파 상의 병변 부위에는 치밀한 조직이 관찰되어 해부학적으로도 손상부위가 재생 및 재구축으로 기능이 개선되었음을 확인하였다.

Claims

지방유래 중간엽줄기세포를 포함하는 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지방유래 중간엽줄기세포는 자가 또는 동종 유래인 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지방유래 중간엽줄기세포는 1계대 이상 계대배양된 것임을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지방유래 중간엽줄기세포는 하기의 특징 중 적어도 하나 이상의 특징을 가지는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물:
(a) CD29 및 CD44에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
(b) 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGFb), 및 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)로 이루어진 그룹으로부터 어느 하나 이상의 성장인자를 분비함.
제4항에 있어서,
지방유래 중간엽줄기세포가 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)를 1,000 pg/ml 이상 분비하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제4항에 있어서,
지방유래 중간엽줄기세포가 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF)를 200 pg/ml 이상 분비하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제4항에 있어서,
지방유래 중간엽줄기세포가 형질전환성장인자베타(transforming growth factor beta, TGF-β)를 150 pg/ml 이상 분비하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제4항에 있어서,
지방유래 중간엽줄기세포가 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 500 pg/ml 이상 분비하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지방유래 중간엽줄기세포는 세포증식 및 혈관형성을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지방유래 중간엽줄기세포는 세포외기질 단백질을 분비하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지방유래 중간엽줄기세포는 콜라겐을 분비하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
조성물은 환부에 주사되는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제12항에 있어서,
상기 환부가 골-건 접합부 또는 골-인대 접합부인 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제12항에 있어서,
상기 환부가 건 또는 인대인 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 건 질환은 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염 , 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상 및 건 박리로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인대 질환은 십자인대 손상, 족관절 인대 손상, 측부인대 손상, 인대 파열 및 인대 염좌로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지방유래 중간엽 줄기세포를 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 형질전환성장인자베타-1((transforming growth factor beta-1, TGF-β1), 혈소판 유도성 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF) 및 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자를 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
조성물이 단일 용량 또는 단일 용량 초과량으로서 투여되는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
조성물이 단일 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
조성물이 투여 약 6주 이내에 기준선과 비교하여 건 또는 인대 질환 병변의 크기가 10 % 이상 감소하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
생분해성 지지체를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
제21항에 있어서,
생분해성 지지체는 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스, 펙틴, 키틴, 폴리글라이콜산 및 폴리유산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물.
(a) 지방조직으로부터 중간엽줄기세포-혈관 분획을 분리하고 기질배지에서 배양하는 단계;
(b) 스트로마-혈관 분획을 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 형질전환성장인자베타-1((transforming growth factor beta-1, TGF-β1), 혈소판 유도성 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF) 및 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자를 함유하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(c) 배양된 중간엽줄기세포를 1계대 이상 계대배양하는 단계;를 포함하는, 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 포함하는 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제23항에 있어서,
단계(c)에서 수득된 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 생분해성 지지체와 함께 단일 주사에 의해 투여하는 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제24항에 있어서,
생분해성 지지체는 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스, 펙틴, 키틴, 폴리글라이콜산 및 폴리유산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 건 또는 인대 질환의 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.