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KR20150125402A - 고효율 분비능을 가지는 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터 - Google Patents

고효율 분비능을 가지는 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터 Download PDF

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KR20150125402A
KR20150125402A KR1020140052752A KR20140052752A KR20150125402A KR 20150125402 A KR20150125402 A KR 20150125402A KR 1020140052752 A KR1020140052752 A KR 1020140052752A KR 20140052752 A KR20140052752 A KR 20140052752A KR 20150125402 A KR20150125402 A KR 20150125402A
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주식회사 엘지생명과학
주식회사 엘지생명과학
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Abstract

본 발명은 인간 LBFL313 유전자 유래의 단백질 분비 인자, 상기 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 표적 단백질 분비 발현용 벡터 및 상기 표적 단백질 분비 발현용 벡터가 도입된 형질전환체 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체 세포를 이용하여 표적 단백질 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간 LBFL313 유전자 유래의 단백질 분비 인자를 이용할 경우, 기존 단백질 분비 인자들에 비하여 표적 단백질의 분비가 월등히 증가하였으며, 특히 항체에 대해서 본 발명의 인간 LBFL313 유전자 유래의 단백질 분비 인자를 이용하여 기존의 분비 서열보다 월등히 우수한 분비 효과를 가지는 단백질 분비 인자 조합을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 단백질 분비 인자는 단백질 대량 생산 분야, 특히 항체 생산 분야에서 널리 활용될 수 있다.

Description

고효율 분비능을 가지는 단백질 분비 인자 및 이를 포함하는 발현 벡터{A protein secretory factor with a high secretory efficiency and a expression vector comprising the same}
본 발명은 인간 LBFL313 유전자 유래의 단백질 분비 인자, 상기 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 표적 단백질 분비 발현용 벡터 및 상기 표적 단백질 분비 발현용 벡터가 도입된 형질전환체 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체 세포를 이용하여 표적 단백질 생산하는 방법에 관한 것이다.
항체를 포함한 재조합 폴리펩티드, 혹은 단백질은 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 광범위한 종류의 유전자 조작 유기체를 이용하여 생산된다. 이들 의료, 연구 등의 목적으로 사용되는 많은 단백질은 당단백질이기 때문에, 박테리아와 같은 원핵세포에서 생산하기에는 적합하지 않다. 이러한 이유로, 진핵세포, 예컨대 효모세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포를 이용하는 단백질 발현 시스템이 개발되어 많이 사용되고 있다.
이종 단백질을 생산하고자 하는 생명공학 기술분야에서 주요한 문제점은, 유전자 조작 유기체에서 용이하게 발현 또는 분비되지 않는 단백질 또는 단백질 서브유닛(subunit) 등의 재조합 폴리펩티드의 생산 및 회수이다. 종종 이들 단백질 또는 단백질 서브유닛은 세포 내에서 아주 낮은 수준, 혹은 보통 수준으로만 발현되기 때문에, 원하는 양만큼의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 얻기 위해서는 배양과 정제의 규모가 커지는 경향이 있다.
이러한 문제점들을 해결하기 위한 방법 중 대표적인 것은, 세포에서 발현되는 단백질 또는 단백질 서브유닛을 가능한 높은 비율로 배양 배지로 분비하도록 유도하는 것이다. 세포에서 발현된 단백질 또는 단백질 서브유닛을 세포 외 배지로 분비되도록 하는 것은 단백질 정제를 용이하게 하기 때문에 정제 측면에서도 매우 유용한 전략이다. 아울러, 세포 외 배지로 분비된 재조합 단백질 또는 단백질 서브유닛은 세포 내에서 일어나는 단백질 분해를 피할 수 있고, 정확한 단백질 접기(Protein Folding)가 된 단백질 산물을 얻을 수 있다는 장점을 가진다.
진핵세포에서 발현된 단백질이 세포 바깥으로 성공적으로 분비되기 위해서는 세포 내 망상조직(Endoplasmic Reticulum)을 횡단하는 단백질의 이동(translocation) 과정이 필요하다. 이러한 횡단 과정에서 단백질의 활성화에 필요하거나 하는 여러 가지 modification 과정 또한 동시에 일어나기 때문에, 분비 과정을 통해 세포 외로 분비된 단백질은 곧 당화나 modification이 진행된 성숙한 단백질이라고 볼 수 있다.
세포막을 통해 세포로부터 분비되는 단백질들은 일반적으로 세포 내에서 전구체(precursor) 형태로 생성되며, 이는 "preprotein"으로 지칭된다. 이러한 "preprotein" 형태는 단백질의 아미노 말단(NH3-terminal)에 추가의 펩티드 서열을 포함하는데, 이 서열은 발현된 단백질을 세포 내 망상 조직으로 타겟팅시켜 분비 경로로 진입할 수 있게 하는데, 이 추가적인 펩티드 서열을 단백질 분비 인자 또는 신호서열(Signal Sequence 혹은 Signal peptide)로 지칭한다.
재조합 단백질의 경우, 분비가 기대한 대로 작동되지 않는 경우가 있는데, 이것은 재조합 단백질의 천연 신호서열이 숙주 세포에서 잘 작동하지 않기 때문이다. 특정 재조합 단백질의 분비에 유용할 수 있는 많은 신호 서열들이 알려져 있지만, 포유류 숙주 세포에서 재조합 단백질, 특히 면역글로불린의 유효한 분비를 촉진시킬 수 있는 추가의 신호서열에 대한 요구는 여전히 존재한다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 다양한 재조합 또는 표적 단백질을 숙주 세포에서 보다 효과적으로 분비생산할 수 있는 발현 카세트를 개발하기 위해 예의 연구노력한 결과, 본 발명의 단백질 분비 인자를 이용하고, 특히 항체에 대해서 최적의 단백질 분비 인자 조합을 통하여 기존의 분비 서열보다 월등히 우수한 분비 효과를 가지는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 인간 LBFL313 유전자 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 생산하고자 하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 표적 단백질 분비 발현용 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동물 숙주 세포에 상기 표적 단백질 분비 발현용 벡터가 도입된 형질전환체 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 생산하고자 하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 표적 단백질 분비 발현용 벡터를 제조하는 단계; 동물 숙주 세포에 상기 표적 단백질 분비 발현용 벡터를 도입하여 형질전환체 세포를 수득하는 단계; 및 상기 형질전환체 세포를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 표적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 LBFL313 유전자 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 제공한다.
본 발명의 용어, "단백질 분비 인자"는 단백질과 연결되어 단백질이 세포 외로 분비될 수 있도록 유도하는 인자를 의미하며, 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 단백질 분비 인자는 신호서열, 시그널 펩타이드(signal peptide, SP) 등과 혼용될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 단백질 분비 인자는 서열번호 1 내지 8로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있고, 표적 단백질 즉, 내재 단백질 및/또는 외래 단백질의 분비를 촉진하는 것일 수 있으며, 특히 항체의 경쇄 또는 중쇄의 세포 외 분비를 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "인간 LBFL313 유전자"는 본 발명자들이 선행된 연구(대한민국 공개특허 제10-2007-0119250호)에서 정상 췌장 조직과 비교하여 췌장 선암 조직 내에 다르게 발현된 췌장암 마커로 신규하게 밝혀낸 유전자를 의미한다. 특히, 본 발명에서 인간 LBFL313 유전자는 서열번호 47의 cDNA 서열을 가질 수 있다. 해당 유전자는 췌장암을 감지하거나 샘플 내의 정상 조직과 췌장 선암을 식별하기 위한 진단 약제 또는 마커로 사용될 수 있음이 알려져 있으나, 해당 유전자의 분비 인자 여부는 알려진 바 없었다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명자들은 본 발명자들이 새로이 밝혀낸 유전자에 대하여 구성을 분석하던 중 분비 인자로 사용될 여지가 있는 펩티드 서열을 추정한 결과 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 분비 인자 후보(SP7.2 및 SP7.3)를 선정하였다. 상기 분비 인자 후보 서열을 선정한 후 기존 알려진 6개의 분비 인자들(SP1 내지 SP6)과 분비 촉진능을 비교하였다.
각각의 분비 인자들의 루시퍼라제 분비 효능 측정 결과, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 LBFL313 유전자로부터 유래한 2개의 신호서열을 포함하여, 기존의 2개의 신호서열까지 총 4개의 신호서열 (SP2, SP6, SP7.2 및 SP7.3)이 루시퍼라제의 분비를 기존 신호서열(SP1)보다 개선시켰다 (도 9). 특히, SP7.2 및 SP7.3 벡터의 경우 배양 초반(2d 및 3d)에 현저히 대량 분비되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 상기 표적 단백질은 숙주 세포에 내재적으로 발현되는 단백질이거나 외래에서 도입된 유전자에 의해 발현되는 단백질일 수 있으며, 본 발명의 분비 서열에 의해 세포 외 분비 효율이 증진되는 한 제한되지 않는다. 상기 표적 단백질은 항체, 인간 성장호르몬, 혈청단백질, 면역글로불린, 사이토카인, α-, β- 또는 γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제 및 글루코우로니다제로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 특히, 항체의 중쇄 또는 경쇄 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 제공한다.
본 발명에서 상기 단백질 분비 인자, 단백질 등은 상기 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 용어, "발현 카세트"란, 하나 이상의 유전자 및 이들의 발현을 조절하는 서열, 예컨데 다양한 cis-작용 전사 조절 요소들의 임의의 조합을 포함하는핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 발현 카세트에는 단백질 분비 인자 및 표적 단백질을 암호화하는 핵산 서열 뿐 아니라, 발현 조절에 필요하다고 당업계에서 인정되는 다양한 요소들, 예를 들어 프로모터, 인핸서 등의 핵산 서열들을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 유전자의 발현, 즉 이의 전사 및 그 전사 생산물의 발현을 조절하는 서열은 통상 조절 유닛(unit)으로 지칭된다. 조절 유닛의 대부분은 표적 유전자의 코딩 서열의 상류에 작동 가능하게 연결되어 위치한다. 또한, 상기 발현 카세트는 3' 말단에 폴리아데닐화(poly-adenylation) 부위를 포함하는 3' 비번역 영역(3' non-transcriptional region)을 포함할 수 있다.
본 발명에서 발현 카세트는 특히 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열;과 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결되어, 숙주 세포, 특히 동물 숙주 세포에서 표적 단백질을 세포 외로 분비 발현시키는 폴리뉴클레오티드들의 조합일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 표적 단백질 분비 발현용 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명의 상기 표적 단백질 분비 발현용 벡터는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 표적 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 추가로 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 표적 단백질 분비 발현용 벡터는 항체 분비 발현용 벡터로서, a) 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 항체 경쇄를 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 제1발현 카세트; 및 b) 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 항체 중쇄를 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 제2발현 카세트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 b)의 단백질 분비 인자는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자일 수 있다. 특히, 상기 a)의 단백질 분비 인자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자이고, 상기 b)의 단백질 분비 인자는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자일 수 있다.
바람직하게는, a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자;와 항체 경쇄를 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 제1발현 카세트; 및 b) 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자;와 및 항체 중쇄를 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 제2발현 카세트를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 항체 경쇄는 서열번호 48의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있으며, 상기 항체 중쇄는 서열번호 49의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질 분비 인자, 단백질 및 발현 카세트 등은 상기 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 용어, "표적 단백질 분비 발현용 벡터"는 단백질 분비 인자와 표적 단백질을 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결되어, 해당 벡터를 숙주세포에 도입 후 발현시 표적 단백질의 세포 외 분비를 유도하는 발현 벡터를 의미한다.
본 발명의 용어 "발현 벡터(발현용 벡터)"는 통상 표적 DNA의 단편이 삽입된 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미하며, 당업계에서 단백질을 발현하는데 사용되는 발현 벡터는 제한없이 사용될 수 있다. 여기서, 표적 DNA는 발현을 목적으로 하는 단백질을 암호화하는 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 삽입된 표적 DNA가 발현될 수 있다. 당업계에 주지된 바와같이, 숙주 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, pTOP-BA-RL-pA vector (대한민국 공개특허 제10-2012-0059222호; 'CMVe'와 'CB', 그리고 'Beta-actin Intron'을 가지고 있음)를 기반으로 하여 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열과 생산하고자 하는 단백질을 암호화하는 유전자가 작동가능하여 연결하여, 표적 단백질 분비 발현용 벡터를 제조하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서 본 발명자들은 상기 루시퍼라제 분비 측정 실험에서 우수한 분비 유도 효과를 나타낸 신호서열 중에서 SP2(서열번호 4), SP6(서열번호 8) 및 SP7.2(서열번호 1)를 선택하여, 산업적으로 대량생산이 요구되는 단백질인 단일클론항체 (monoclonal anitoby)에 대해서도 분비 유도능이 뛰어난지 확인해 보기 위해, 항체발현 벡터를 제조하였다(실시예 5). 해당 실험에서 단일클론항체로는 대표적으로 Rx 항체를 이용하였으며, 본 발명에서 사용한 상기 Rx 항체는 서열번호 48의 아미노산 서열로 구성된 항체 경쇄와 서열번호 49의 아미노산 서열로 구성된 항체 중쇄로 구성되어 있다.
본 발명자들은 최적의 항체 분비 인자 구성을 파악하기 위하여 항체를 구성하는 항체 경쇄 및 항체 중쇄의 분비 인자를 각각 달리하여 조합하고 분비 효율을 확인하였다. 즉, SP1(서열번호 3), SP2(서열번호 4), SP6(서열번호 8) 및 SP7.2(서열번호 1)로 이루어진 군에서 선택된 분비 신호서열을 각각 항체 경쇄 및 항체 중쇄와 연결하여 제작한 벡터에서 발현시 항체의 분비 효율을 확인하였다.
상기 분비 신호서열 (Signal Sequence)의 세포 바깥으로의 분비효능을 in vitro cell culture system에서 조사하기 위하여 CHO 세포에 형질 전환한 뒤 ELISA를 통해 단일클론항체의 분비 수준을 조사하였다.
상기 ELISA 실험을 통해 항체 분비 정도를 측정한 결과, LBFL313 유전자로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 SP7.2 신호서열을 포함한 발현 벡터 pCB-Rx71_v5.4에서 높은 분비를 확인할 수 있었다(도 12). 특히, 항체 경쇄에 SP7.2 신호서열을 연결하고, 항체 중쇄에 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 SP1 신호서열을 연결한 조합에서 분비량이 월등한 것을 확인하였으며, 배양 기간이 지날수록 더욱 분비량이 증가하는 효과를 확인하여 이는 SP7.2을 이용한 경우 단기간에 분비량이 월등한 상기 루시퍼라제 분비 실험에서의 결과에 비하여 해당 조합에 의해서 장기간 배양에도 분비량이 월등해지는 효과를 가지는 것을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 숙주 세포에 상기 표적 단백질 분비 발현용 벡터가 도입된 형질전환체 세포를 제공한다.
본 발명의 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주 세포로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 형질전환에 사용될 수 있는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포 모두를 포함할 수 있다.
본 발명에서 숙주 세포는 예를 들어, 세균, 예를 들어 에스케리키아, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10 등의 동물세포 등일 수 있다. 본 발명에서 숙주 세포는 본 발명의 목적상, 동물 숙주 세포일 수 있으며 특히 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary Cell, CHO)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 재조합 단백질 생산에서 널리 사용되는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포주를 숙주 세포로 사용하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 ⅰ) 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 표적 단백질 분비 발현용 벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 숙주 세포에 상기 ⅰ) 단계의 표적 단백질 분비 발현용 벡터를 도입하여 형질전환체 세포를 수득하는 단계; 및 ⅲ) 상기 ⅱ) 단계의 형질전환체 세포를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 표적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 표적 단백질을 생산하는 방법은 회수한 표적 단백질의 정제 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 표적 단백질의 정제는 필요에 따라 당업계에서 통상적으로 사용되는 단백질 정제 방법을 통해 이루어질 수 있다. 예컨대, 면역친화성 크로마토그래피, 수용체친화성 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 역상 HPLC 등을 포함하는 종래의 크로마토그래피 방법에 의해 숙주 세포의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 분리될 수 있다. 또한, 원하는 단백질이 특이적 태그, 라벨 또는 킬레이트 모이어티를 가지는 융합 단백질인 경우 특이적 결합 파트너 또는 제제에 의해 정제하는 방법이 있다. 정제된 단백질은 분비 인자 등이 제거되는 등 원하는 단백질 부분으로 절단되거나 그 자체로 남아있을 수 있다. 융합 단백질의 절단으로 절단 과정에서 부가적인 아미노산을 가지는 원하는 단백질 형태가 만들어질 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질 분비 인자, 단백질, 발현 카세트, 표적 단백질 분비 발현용 벡터, 형질전환, 숙주 세포 등은 상기 설명한 바와 동일하다.
상기 방법에 사용된 숙주 세포는 동물 숙주 세포일 수 있으며, 특히 중국 햄스터 난소 세포(CHO, Chinese Hamster Ovary)일 수 있다. 또한 상기 형질전환된 숙주 세포는 필요에 따라 당업계에서 통상적으로 사용되는 배양 방법을 통하여 배양될 수 있다.
본 발명의 인간 LBFL313 유전자 유래의 단백질 분비 인자를 이용할 경우, 기존 단백질 분비 인자들에 비하여 표적 단백질의 분비가 월등히 증가하였으며, 특히 항체에 대해서 본 발명의 인간 LBFL313 유전자 유래의 단백질 분비 인자를 이용하여 기존의 분비 서열보다 월등히 우수한 분비 효과를 가지는 단백질 분비 인자 조합을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 단백질 분비 인자는 단백질 대량 생산 분야, 특히 항체 생산 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명자들이 제조한 단백질 분비 인자 SP6를 가지고 있는 루시퍼라제 발현 벡터 pCBIN-CLUC6의 플라스미드 지도이다.
도 2는 본 발명자들이 제조한 단백질 분비 인자 SP1을 가지고 있는 루시퍼라제 발현 벡터 pCBIN-CLUC1의 플라스미드 지도이다.
도 3은 본 발명자들이 제조한 단백질 분비 인자 SP2를 가지고 있는 루시퍼라제 발현 벡터 pCBIN-CLUC2의 플라스미드 지도이다.
도 4는 본 발명자들이 제조한 단백질 분비 인자 SP3를 가지고 있는 루시퍼라제 발현 벡터 pCBIN-CLUC3의 플라스미드 지도이다.
도 5는 본 발명자들이 제조한 단백질 분비 인자 SP4를 가지고 있는 루시퍼라제 발현 벡터 pCBIN-CLUC4의 플라스미드 지도이다.
도 6은 본 발명자들이 제조한 단백질 분비 인자 SP5를 가지고 있는 루시퍼라제 발현 벡터 pCBIN-CLUC5의 플라스미드 지도이다.
도 7은 본 발명자들이 제조한 단백질 분비 인자 SP7.2를 가지고 있는 루시퍼라제 발현 벡터 pCBIN-CLUC7.2의 플라스미드 지도이다.
도 8은 본 발명자들이 제조한 단백질 분비 인자 SP7.3를 가지고 있는 루시퍼라제 발현 벡터 pCBIN-CLUC7.3의 플라스미드 지도이다.
도 9는 본 발명자들이 제조한 루시퍼라제 유전자가 삽입된 8종류의 플라스미드 벡터 (pCBIN-CLUC1, pCBIN-CLUC2, pCBIN-CLUC4, pCBIN-CLUC5, pCBIN-CLUC6, pCBIN-CLUC7.2 및 pCBIN-CLUC7.3)를 CHO 세포주에 형질전환한 다음, 2일, 3일, 5일 및 6일째 되는 날 배양 배지에 존재하는 루시퍼라제 분비량을 측정하는 루시퍼라제 측정 실험한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 IgG1 형태의 단일클론항체(Rx 항체)의 경쇄와 중쇄 유전자에 단백질 분비 인자(SP)를 작동 가능하게 in-frame으로 연결하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 11은 단백질 분비 인자를 달리하여 Rx 항체의 경쇄와 중쇄 유전자에 연결하여 제작되는 pCB-Rx_v5.4 플라스미드의 개괄적인 형태를 나타낸 플라스미드 지도이다. 본 발명에서 pCB-Rx_v5.4 계열의 플라스미드들은 해당 플라스미드 지도의 경쇄 SP와 중쇄 SP 위치에 삽입되는 단백질 분비 인자만이 달라지고 다른 부분은 동일하게 제작되었다.
도 12는 Rx 항체의 경쇄와 중쇄 유전자에 연결된 단백질 분비 인자의 조합에 따른 항체 분비능을 ELISA를 통해 측정한 도이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 일반 분자 생물학적 기술
제한 효소(Restriction enzyme)의 처리, 아가로즈 겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis), 겔 추출 키트(QIAGEN, Gel Extraction Kit), 플라스미드 DNA ㅈ정제, 중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), DNA 절편의 접합 및 대장균의 형질전환 등과 같은 분자생물학에서 일반적으로 사용한 방법들은 Sambrook 등의 Molecular Cloning(2판)에 소개된 방법들에 최소한의 변형을 가하여 실시하였다.
실시예 2. 신호 서열 선정
2-1. 실험 방법
동물 숙주 세포를 이용하여 이종 단백질을 발현시킴에 있어 분비를 증진시키기 위한 신호 서열을 동정하기 위하여, 대한민국 등록특허 제10-0954322호, '췌장암과 관련된 신규한 LBFL313 유전자'로부터 고효율 분비 신호서열에 대한 가능성을 확인하고자 하였다.
구체적으로, LBFL313 유전자로부터 신호서열로 예상되는 펩티드 서열들을 추정하고, 추정된 서열들을 동물세포에서 신호서열로 일반적으로 사용되고 있는 6개의 기존 이용되는 신호 서열들과 비교 실험하였다. 이때, 1차 비교 시험을 위하여 재조합 단백질 생산에서 널리 사용되는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포주를 숙주세포로 사용하고 분비 루시퍼라제(Secretory luciferase) 유전자를 목적 유전자로 사용하였다. 루시페린(Luciferin)을 기질로 이용하여 세포 바깥으로 분비된 루시퍼라제에 의해서 산화되어 방출되는 빛을 루미노미터(Luminometer)로 측정하여 분비의 정도를 결정하였다.
이 후, 1차 비교 시험에서 선택된 신호서열에 대하여, 루시퍼라제가 아닌 산업적으로 유용한 단백질인 단일클론항체(Monoclonal Antibody)의 분비를 비교하기 위한 2차 비교 시험으로 CHO 세포주를 숙주세포로 하여 항체의 경쇄(Light chain)과 중쇄(Heavy Chain)의 신호서열의 다양한 조합에 의해 분비되는 항체의 양을 ELISA를 통해 측정하였다. 중쇄 Fc 부분을 잡는 F(ab')2로 ELISA plate를 피복하여 세포 바깥으로 분비된 항체를 고정하고, 경쇄의 kappa 부분과 결합하는 항체를 HRP(Horseradish Peroxidase)로 표지하여, 기질로 사용한 TMB가 산화되어 나타나는 것을 분광 광도계(Spectrophotometer)로 측정하여 분비된 정도를 결정하였다.
2-2. 실험에 사용한 신호 서열
상기 실시예 2-1에서 LBFL313 유전자로부터 신호서열로 예상되는 펩티드 서열들을 추정한 결과 SP7.2 및 SP7.3을 선정하였다.
※ SP7.2 (서열번호 1)
NH3-MHRPEAMLLLLTLALLGGPTWA-CO2H
※ SP7.3 (서열번호 2)
NH3-MWRVPGTTRRPVTGESPGMHRPEAMLLLLTLALLGGPTWA-CO2H
상기 추정된 서열과 비교 실험을 위하여 사용된 6개의 기존 이용되는 신호 서열들은 SP1 내지 SP6로 명명하였으며 그 서열은 하기와 같다.
※SP1 (서열번호 3)
NH3-MGWSYIILFLVATATDVHS-CO2H
※SP2 (서열번호 4)
NH3-MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR-CO2H
※SP3 (서열번호 5)
NH3-MDFQVQIISFLLISASVIMSRG-CO2H
※SP4 (서열번호 6)
NH3-MGWSLILLFLVAVATRVLS-CO2H
※SP5 (서열번호 7)
NH3-MLLLLLLLGLRLQLSLG-CO2H
※SP6 (서열번호 8)
NH3-MKTLILAVALVYCATVHC-CO2H
본 실험에서 사용된 SP1은 mouse IgG2로부터 유래한 신호서열; SP2는 HSA (human serum albumin) 으로부터 유래한 신호서열; SP3는 mouse IkC로부터 유래한 신호서열; SP4는 천연이 아닌 인공적으로 합성된 신호서열로 미국특허 US7,381,560에서 사용된 신호서열; SP5는 SEAP (secretory alkaline phosphatase) 로부터 유래한 신호서열; SP6는 분비 루시퍼라제인 CLUC (Cypridina noctiluca luciferase) 로부터 유래한 신호서열이다.
본 실험에서는 이러한 플라스미드 벡터들 중 최적의 조합을 통해 높은 목적 단백질 분비를 나타내는 플라스미드 벡터를 선별하기 위하여, 대표적으로 측정이 용이한 분비 루시페라아제인 CLUC (Cypridina noctiluca Luciferase) 유전자와 IgG1 형태의 항체인 Rx 항체의 유전자를 reporter로 사용하였다.
상기 8개 신호서열을 암호화하는 DNA 서열과 리포터 유전자(CLUC, Cypridina noctiluca luciferase 또는 IgG1 형태의 항체인 Rx 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자) 서열을 in-frame으로 연결하여 다음과 같이 다양한 조합의 플라스미드 벡터를 제작하여 사용하였다. 제작된 플라스미드 벡터의 조합 및 구성요소의 순서는 하기 표 1과 같다.
플라스미드 명칭 구성요소
pCBIN-CLUC1 SP1 + CLUC
pCBIN-CLUC2 SP2 + CLUC
pCBIN-CLUC3 SP3 + CLUC
pCBIN-CLUC4 SP4 + CLUC
pCBIN-CLUC5 SP5 + CLUC
pCBIN-CLUC6 SP6 + CLUC
pCBIN-CLUC7.2 SP7.2 + CLUC
pCBIN-CLUC7.3 SP7.3 + CLUC
pCB-Rx11_v5.4 (SP1 + 항체경쇄) + (SP1 + 항체중쇄)
pCB-Rx12_v5.4 (SP1 + 항체경쇄) + (SP2 + 항체중쇄)
pCB-Rx16_v5.4 (SP1 + 항체경쇄) + (SP6 + 항체중쇄)
pCB-Rx17_v5.4 (SP1 + 항체경쇄) + (SP7.2 + 항체중쇄)
pCB-Rx21_v5.4 (SP2 + 항체경쇄) + (SP1 + 항체중쇄)
pCB-Rx22_v5.4 (SP2 + 항체경쇄) + (SP2 + 항체중쇄)
pCB-Rx26_v5.4 (SP2 + 항체경쇄) + (SP6 + 항체중쇄)
pCB-Rx27_v5.4 (SP2 + 항체경쇄) + (SP7.2 + 항체중쇄)
pCB-Rx31_v5.4 (SP3 + 항체경쇄) + (SP1 + 항체중쇄)
pCB-Rx32_v5.4 (SP3 + 항체경쇄) + (SP2 + 항체중쇄)
pCB-Rx36_v5.4 (SP3 + 항체경쇄) + (SP6 + 항체중쇄)
pCB-Rx37_v5.4 (SP3 + 항체경쇄) + (SP7.2 + 항체중쇄)
pCB-Rx61_v5.4 (SP6 + 항체경쇄) + (SP1 + 항체중쇄)
pCB-Rx62_v5.4 (SP6 + 항체경쇄) + (SP2 + 항체중쇄)
pCB-Rx66_v5.4 (SP6 + 항체경쇄) + (SP6 + 항체중쇄)
pCB-Rx67_v5.4 (SP6 + 항체경쇄) + (SP7.2 + 항체중쇄)
pCB-Rx71_v5.4 (SP7.2 + 항체경쇄) + (SP1 + 항체중쇄)
pCB-Rx72_v5.4 (SP7.2 + 항체경쇄) + (SP2 + 항체중쇄)
pCB-Rx76_v5.4 (SP7.2 + 항체경쇄) + (SP6 + 항체중쇄)
pCB-Rx77_v5.4 (SP7.2 + 항체경쇄) + (SP7.2 + 항체중쇄)
CLUC를 이용한 시험에서는 루시페라아제 분석법 (Luciferase Assay) 으로, 항체인 Rx를 이용한 시험에서는 ELISA를 통해 각 시험에서 세포 외로의 분비 정도를 측정하였다.
실시예 3. 루시퍼라제 플라스미드 벡터 제작
상기 실시예 2-2에서 설계한 분비 서열을 달리하고 분비 루시퍼라제(CLUC)를 리포터 유전자로 가지는 플라스미드 벡터를 제작하였다.
3-1. pCBIN - CLUC6 의 제작
CMVe (CMV enhancer) 와 CB (CMV/beta-actin fusion promoter) 를 가지고 있는 리포터 벡터를 만들기 위하여, pTOP-BA-RL-pA vector (대한민국 공개특허 제10-2012-0059222호; 'CMVe'와 'CB', 그리고 'Beta-actin Intron'을 가지고 있음)를 EcoRI 과 BamHI을 처리하여 얻어진 DNA 단편(1762 bp)을, pCLuc-Basic2 (NEB, Cat# : N0317S) 벡터를 같은 제한효소로 절단한 부위에 삽입하여 제조하였다. 이와 같이 만들어진 벡터는 신호서열 'SP6'를 가지고 있다 (pCBIN-CLUC6) (도 1).
3-2. pCBIN - CLUC1 의 제작
Mouse IgG2 신호서열(SP1; 서열번호 3)의 펩티드 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 pCB-Ix6_v5.4를 주형으로 사용하고 2개의 프라이머 (서열번호 9 및 10) 로 PCR 증폭한 산물을 BamHI 및 NdeI으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (80 bp) 과, 상기 pCLuc-Basic2 벡터를 주형으로 하고 2 개의 프라이머를 (서열번호 11 및 12) 이용하여 CLUC 유전자를 PCR하고 증폭된 산물을 NdeI 및 XbaI으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (1654 bp) 을, 상기 pCBIN-CLUC vector를 BamHI 및 XbaI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (6049bp) 의 절단한 부위에 삽입하여 pCBIN-CLUC1 vector를 제조하였다 (도 2).
상기 사용한 프라이머들은 하기와 같다.
※ oSP1-f (서열번호 9)
5'-tt GGATCC gcc acc atg gga tgg agc tat-3'
※ oSP1-r (서열번호 10)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gga gtg gac atc tgt-3'
※ oCLUC-N1-f (서열번호 11)
5'-tt c CATATG aa cct gat cca cca aa-3'
※ oBasic-r (서열번호 12)
5'-tca gaa gcc ata gag ccc acc gca t-3'
3-3. pCBIN - CLUC2 의 제작
인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA) 신호서열의 펩티드 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 2 개의 oligonucleotide (서열번호 13 및 14) 를 annealing하여 주형으로 사용하고, 2 개의 프라이머(서열번호 15 및 16)로 PCR을 통해 증폭된 산물을 BamHI 및 NdeI으로 자른 후 얻어진 DNA 단편(95 bp)과, 상기 pCLuc-Basic2 vector를 주형으로 하고 하고 2 개의 프라이머를 (서열번호 11 및 12) 이용하여 CLUC 유전자를 PCR 하고 증폭된 산물을 NdeI 및 XbaI으로 자른 후 얻어진 DNA 단편(1654 bp)을, 상기 pCBIN-CLUC vector를 BamHI 및 XbaI으로 자른 후 얻어진 DNA 단편(6049bp)의 절단한 부위에 삽입하여 pCBIN-CLUC2 vector를 제조하였다 (도 3).
상기 사용한 프라이머들은 하기와 같다.
※ oHSAL-U (서열번호 13)
5'-atg aag tgg gtg acc ttc atc tcc ctg ctg ttc ctg ttc tcc tcc gcc tac tcc agg ggc gtg ttc agg agg-3'
※ oHSAL-L (서열번호 14)
5'-cct cct gaa cac gcc cct gga gta ggc gga gga gaa cag gaa cag cag gg-3'
※ oSP2-f (서열번호 15)
5'-tt GGATCC gcc acc atg aag tgg gtg acc-3'
※ oSP2-r (서열번호 16)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg cct cct gaa cac gcc -3'
3-4. pCBIN - CLUC3 의 제작
Mouse-human chimeric IgG1 monoclonal antibody를 발현하는 pCB-Rx vector (당사에서 보유하고 있는 발현 벡터로 'SP3'과 'SP4'를 신호서열로 사용한다.) 를 주형으로 사용하고, 2 개의 프라이머 (서열번호 17 및 18) 로 PCR하고 증폭된 산물을 BamHI 및 NdeI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (89 bp) 과, 상기 pCLuc-Basic2 vector를 주형으로 하고 2 개의 프라이머를 (서열번호 11 및 12) 이용하여 CLUC 유전자를 PCR하고 증폭된 산물을 NdeI 및 XbaI으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (1654 bp)을, 상기 pCBIN-CLUC vector를 BamHI 및 XbaI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (6049bp) 의 절단한 부위에 삽입하여 pCBIN-CLUC3 vector를 제조하였다 (도 4).
상기 사용한 프라이머들은 하기와 같다.
※ oSP3-f (서열번호 17)
5'-tt GGATCC gcc acc atg gac ttc cag gtg-3'
※ oSP3-r (서열번호 18)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gcc cct gga cat gat -3'
3-5. pCBIN - CLUC4 의 제작
Mouse-human chimeric IgG1 단일클론항체를 발현하는 pCB-Rx vector를 주형으로 사용하고, 2 개의 프라이머 (서열번호 19 및 20) 로 PCR하고 증폭된 산물을 BamHI 및 NdeI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (80 bp) 과, 상기 pCLuc-Basic2 vector를 주형으로 하고 하고 2 개의 프라이머 를 (서열번호 11 및 12) 이용하여 CLUC 유전자를 PCR하고 증폭된 산물을 NdeI 및 XbaI으로 자룬 후 얻어진 DNA 단편 (1654 bp) 을, 상기 pCBIN-CLUC vector를 BamHI 및 XbaI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (6049bp) 의 절단한 부위에 삽입하여 pCBIN-CLUC4 vector를 제조하였다 (도 5).
※ oSP4-f (서열번호 19)
5'-tt GGATCC gcc acc atg ggc tgg agc ctg-3'
※ oSP4-r (서열번호 20)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gga cag cac cct ggt -3'
3-6. pCBIN - CLUC5 의 제작
Secretory Alkaline Phosphatase (SEAP)를 이용한 reporter vector인 pSEAP-Basic2 vector를 주형으로 사용하고, 2 개의 프라이머 (서열번호 21 및 22) 로 PCR하고 증폭된 산물을 BamHI 및 NdeI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (74 bp) 과, 상기 pCLuc-Basic2 vector를 주형으로 하고 하고 2 개의 프라이머 를 (서열번호 11 및 12) 이용하여 CLUC 유전자를 PCR하고 증폭된 산물을 NdeI 및 XbaI으로 자룬 후 얻어진 DNA 단편 (1654 bp) 을, 상기 pCBIN-CLUC vector를 BamHI 및 XbaI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (6049bp) 의 절단한 부위에 삽입하여 pCBIN-CLUC5 vector를 제조하였다 (도 6).
※ oSP5-f (서열번호 21)
5'-tt GGATCC gcc acc atg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctg g-3'
※ oSP5-r (서열번호 22)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gcc cag gga gag ctg-3'
3-7. pCBIN - CLUC7 .2의 제작
LBFL313 유전자를 가지고 있는 pLFG250 (한국특허, 특허출원 제10-0954322) 를 주형으로 사용하고, 2 개의 프라이머 (서열번호 23 및 24) 로 PCR하고 증폭된 산물을 BamHI 및 NdeI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (89 bp) 과, 상기 pCLuc-Basic2 vector를 주형으로 하고 하고 2 개의 프라이머를 (서열번호 11 및 12) 이용하여 CLUC 유전자를 PCR하고 증폭된 산물을 NdeI 및 XbaI으로 자룬 후 얻어진 DNA 단편 (1654 bp) 을, 상기 pCBIN-CLUC vector를 BamHI 및 XbaI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (6049bp) 의 절단한 부위에 삽입하여 pCBIN-CLUC7.2 vector를 제조하였다 (도 7).
※ oSP7-B1-f2 (서열번호 23)
5'-tt GGATCC gcc acc atg cac cgg cca gag-3'
※ oSP7-N1-r (서열번호 24)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg tgc cca ggt ggg gcc-3'
3-8. pCBIN - CLUC7 .3의 제작
LBFL313 유전자를 가지고 있는 pLFG250 (대한민국 등록특허 제10-0954322호)를 주형으로 사용하고, 2 개의 프라이머 (서열번호 24 및 25) 로 PCR하고 증폭된 산물을 BamHI 및 NdeI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (143 bp) 과, 상기 pCLuc-Basic2 vector를 주형으로 하고 하고 2 개의 프라이머 를 (서열번호 11 및 12) 이용하여 CLUC 유전자를 PCR하고 증폭된 산물을 NdeI 및 XbaI으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (1654 bp) 을, 상기 pCBIN-CLUC vector를 BamHI 및 XbaI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (6049bp) 의 절단한 부위에 삽입하여 pCBIN-CLUC7.2 vector를 제조하였다 (도 8).
※ oSP7-B1-f3 (서열번호 25)
5'-tt GGATCC gcc acc atg tgg agg gtg ccc-3'
실시예 4. 루시퍼라제 플라스미드 벡터의 in vitro 효능 실험
상기 실시예 3에서 제작한 벡터에는 Cypridina noctiluca 에서 유래한 분비 루시퍼라제(Secretory Luciferase) 유전자가 리포터로 삽입되어 있다. 신호서열 (Signal Sequence)의 세포 바깥으로의 분비효능을 in vitro cell culture system에서 조사하기 위하여 CHO 세포에 형질 전환한 뒤 루시퍼라제 분석법을 통해 해당 신호서열의 분비 유도 수준을 조사하였다.
구체적으로는, 열로 비활성화된 FBS (Fetal bovine serum, GIBCO-BRL사) 10%를 함유하고 있는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagles's medium, GIBCO-BRL사)로 배양된 CHO 세포에 Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, Cat.#:11668-019)를 이용하여 상기 실시예 3에서 제작한 벡터를 형질전환하였다. 형질전환 하루 전 24-well plate (Falcon사)의 각 well당 6 x 104 개의 CHO 세포를 배양한 후 다음날 각 루시퍼라제 유전자가 삽입된 8종류의 플라스미드 벡터(pCBIN-CLUC1, pCBIN-CLUC2, pCBIN-CLUC4, pCBIN-CLUC5, pCBIN-CLUC6, pCBIN-CLUC7.2 및 pCBIN-CLUC7.3)를 500ng, Opti-MEM®I (Invitrogen, Cat.# 31985-070) 을 이용하여 50 uL를 넣은 Tube 1 (1 well 반응량)과 Lipofectamine™ 2000 2uL, Opti-MEM®I 48 uL를 넣은 Tube2 (1 well 반응량)를 각각 실온에서 5분 둔 후, 두 Tube를 혼합하여 20분간 실온에서 반응시켰다. 이 혼합액을 Opti-MEM®I 배지 250 uL로 바꾸어 준 CHO 세포에 각 100uL씩 넣고 3시간 동안 37 ℃ incubator (5% CO2)에서 배양한 후 20% FBS를 함유하고 있는 DMEM 배지를 각 well에 250 uL씩 넣어주고 6일간 배양하였다. 형질전환 후 2일, 3일, 5일, 6일차에 각 well의 배지를 100 ul씩 sampling하여 -20 degC에 보관하였다가, 6일차에 모두 녹여 20 uL씩 Assay plate에 옮겨 Luciferase Assay를 수행하였다.
상기 루시퍼라제 분비 효능 측정 결과, 도 9에서 확인할 수 있듯이 LBFL313 유전자로부터 유래한 2개의 신호서열을 포함하여, 기존의 2개의 신호서열까지 총 4개의 신호서열 (SP2, SP6, SP7.2 및 SP7.3)이 루시퍼라제의 분비를 기존 신호서열(SP1)보다 개선시켰다 (도 9). 특히, SP7.2 및 SP7.3 벡터의 경우 배양 초반(2d 및 3d)에 현저히 대량 분비되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 항체 발현 플라스미드 벡터 제작
상기 실시예 4에서 효과를 나타낸 신호서열 중에서 SP2, SP6 및 SP7.2를 선택하여, 산업적으로 대량생산이 요구되는 단백질인 단일클론항체 (monoclonal anitoby)에 대해서도 분비 유도능이 뛰어난지 확인해 보기 위해, 하기의 다양한 항체발현 벡터를 제조하였다.
5-1. pCB - Rx11 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC1 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 9, 26, 27 및 28) 로 PCR하여 SP1과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC1 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 29, 30, 31 및 32) 로 PCR하여 SP1과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 2), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx11_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 3).
상기 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다.
※ oIxLs-r1 (서열번호 26)
5'-cag cag gat gtc gcc cct gga cat gat cac -3'
※ oRx-LF1 (서열번호 27)
5'-cag atc gtg ctg tct cag tct-3'
※ oIkC-M1X1-r (서열번호 28)
5'-tt ACGCGT CTCGAG tca aca ctc tcc c-3'
※ oRHn-f (서열번호 29)
5'-tt GGCGCGCC atg gga tgg agc tat-3'
※ oIxLs-r2 (서열번호 30)
5'-cag cag gat gtc gga cag cac cct ggt ggc cac ggc-3'
※ oRx_HF1 (서열번호 31)
5'-cag gtg cag ctg cag cag ccc-3'
※ oIgG1-X1N1-r (서열번호 32)
5'-aa CTCGAG GCGGCCGC tca ttt acc cgg aga c-3'
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 9 E 29
B 26 F 30
C 27 G 31
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx11_v5.4 SP1 SP1
5-2. pCB - Rx12 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC1 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 9, 26, 27 및 28) 로 PCR하여 SP1과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 33, 34, 35 및 32) 로 PCR하여 SP2과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 4), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx12_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 5).
상기 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다.
※ oAscI_SP2-f (서열번호 33)
5'-ctg gcg cgc cat gaa gtg ggt gac c-3'
※ oSP2_RH-r (서열번호 34)
5'-gca gct gca cct gcc tcc tga aca c-3'
※ oSP2_RH-f (서열번호 35)
5'-ctg ttc att gcc agg tgc agc tgc-3'
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 9 E 33
B 26 F 34
C 27 G 35
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx12_v5.4 SP1 SP2
5-3. pCB - Rx16 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC1 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 9, 26, 27 및 28) 로 PCR하여 SP1과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 36, 37, 38 및 32) 로 PCR하여 SP6과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 6), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx16_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 7).
※ oAscI_SP6-f (서열번호 36)
5'-CAG GCG CGC CAT GAA GAC CTT AAT TC-3'
※ oSP6_RH-r(서열번호 37)
5'-GCA GCT GCA CCT GGC AAT GAA CAG-3'
※ oSP6_RH-f(서열번호 38)
5'-CTG TTC ATT GCC AGG TGC AGC TGC-3'
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 9 E 36
B 26 F 37
C 27 G 38
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx16_v5.4 SP1 SP6
5-4. pCB - Rx17 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC1 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 9, 26, 27 및 28) 로 PCR하여 SP1과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 39, 40, 41 및 32) 로 PCR하여 SP7.2과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 8), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx17_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 9).
※ oAscI_SP7.2-f(서열번호 39)
5'-cag gcg cgc cat gca ccg gcc aga g-3'
※ oSP7.2_RH-r(서열번호 40)
5'-gca gct gca cct gtg ccc agg tgg g-3'
※ oSP7.2_RH-f(서열번호 41)
5'-ccc acc tgg gca cag gtg cag ctg c-3'
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 9 E 39
B 26 F 40
C 27 G 41
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx17_v5.4 SP1 SP7.2
5-5. pCB - Rx21 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 15, 42, 43 및 28) 로 PCR하여 SP2과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC1 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 39, 40, 41 및 32) 로 PCR하여 SP1과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 10), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx21_v5.4 vector를 제조하였다 (도 10 및 표 11).
※ oSP7.2_RH-r(서열번호 42)
5'-gca gct gca cct gtg ccc agg tgg g-3'
※ oSP7.2_RH-f(서열번호 43)
5'-ccc acc tgg gca cag gtg cag ctg c-3'
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 9 E 39
B 42 F 40
C 43 G 41
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx21_v5.4 SP2 SP1
5-6. pCB - Rx22 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 15, 42, 43 및 28) 로 PCR하여 SP2과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 33, 34, 35 및 32) 로 PCR하여 SP2과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 12), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx22_v5.4 vector를 제조하였다 (도 10 및 표 13).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 9 E 33
B 42 F 34
C 43 G 35
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx22_v5.4 SP2 SP2
5-7. pCB - Rx26 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 15, 42, 43 및 28) 로 PCR하여 SP2과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 36, 37, 38 및 32) 로 PCR하여 SP6과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 14), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx26_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 15).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 15 E 36
B 42 F 37
C 43 G 38
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx26_v5.4 SP2 SP6
5-8. pCB - Rx27 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 15, 42, 43 및 28) 로 PCR하여 SP2과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 39, 40, 41 및 32) 로 PCR하여 SP6과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 16), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx27_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 17).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 15 E 39
B 42 F 40
C 43 G 41
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx27_v5.4 SP2 SP7.2
5-9. pCB - Rx32 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 33, 34, 35 및 32) 로 PCR하여 SP2과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 18), pCB-Rx_v5.4의 AscI 및 NotI 절단부위에 삽입하여 pCB-Rx32_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 19).
프라이머 서열번호
E 33
F 34
G 35
H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx32_v5.4 SP3 SP2
5-10. pCB - Rx36 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 36, 37, 38 및 32) 로 PCR하여 SP6과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 20), pCB-Rx_v5.4의 AscI 및 NotI 절단부위에 삽입하여 pCB-Rx36_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 21).
프라이머 서열번호
E 36
F 37
G 38
H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx36_v5.4 SP3 SP6
5-11. pCB - Rx37 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 39, 40, 41 및 32) 로 PCR하여 SP7.2과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 22), pCB-Rx_v5.4의 AscI 및 NotI 절단부위에 삽입하여 pCB-Rx37_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 23).
프라이머 서열번호
E 39
F 40
G 41
H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx37_v5.4 SP3 SP7.2
5-12. pCB - Rx61 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 44, 45, 46 및 28) 로 PCR하여 SP6과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC1 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 29, 30, 31 및 32) 로 PCR하여 SP1과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 24), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx61_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 25).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 44 E 29
B 45 F 30
C 46 G 31
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx61_v5.4 SP6 SP1
※ oSP6-f(서열번호 44)
5'-tt GGATCC gcc acc atg aag acc tta att-3'
※ oSP6_RL-r(서열번호 45)
5'-ACA GCA CGA TCT GGC AAT GAA CAG-3'
※ oSP6_RL-f(서열번호 46)
5'-CTG TTC ATT GCC AGA TCG TGC TGT-3'
5-13. pCB - Rx62 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 44, 45, 46 및 28) 로 PCR하여 SP6과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 33, 34, 35 및 32) 로 PCR하여 SP2과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 26), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx62_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 27).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 44 E 33
B 45 F 34
C 46 G 35
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx62_v5.4 SP6 SP2
5-14. pCB - Rx66 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 44, 45, 46 및 28) 로 PCR하여 SP6과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 36, 37, 38 및 32) 로 PCR하여 SP6과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 28), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx66_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 29).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 44 E 36
B 45 F 37
C 46 G 38
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx66_v5.4 SP6 SP6
5-15. pCB - Rx67 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 44, 45, 46 및 28) 로 PCR하여 SP6과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 39, 40, 41 및 32) 로 PCR하여 SP7.2과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 30), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx67_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 31).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 44 E 39
B 45 F 40
C 46 G 41
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx67_v5.4 SP6 SP7.2
5-16. pCB - Rx71 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 23, 42, 43 및 28) 로 PCR하여 SP7.2과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC1 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 29, 30, 31 및 32) 로 PCR하여 SP1과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 32), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx71_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 33).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 23 E 29
B 42 F 30
C 43 G 31
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx71_v5.4 SP7.2 SP1
5-17. pCB - Rx72 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 23, 42, 43 및 28) 로 PCR하여 SP7.2과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 33, 34, 35 및 32) 로 PCR하여 SP2과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 34), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx72_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 35).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 23 E 33
B 42 F 34
C 43 G 35
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx72_v5.4 SP7.2 SP2
5-18. pCB - Rx76 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 23, 42, 43 및 28) 로 PCR하여 SP7.2과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 36, 37, 38 및 32) 로 PCR하여 SP6과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 36), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx76_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 37).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 23 E 36
B 42 F 37
C 43 G 38
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx76_v5.4 SP7.2 SP6
5-19. pCB - Rx77 _ v5 .4의 제작
상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 23, 42, 43 및 28) 로 PCR하여 SP7.2과 항체 경쇄가 연결된 산물을 BamHI 및 XhoI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편과, 상기 pCBIN-CLUC7.2 vector와 pCB-Rx_v5.4 vector를 주형으로 사용하고 4개의 프라이머 (서열번호 39, 40, 41 및 32) 로 PCR하여 SP7.2과 항체 중쇄가 연결된 산물을 AscI 및 NotI 으로 자른 후 얻어진 DNA 단편을 (도 10 및 표 38), pCB-Rx_v5.4의 BamHI 및 XhoI 절단 부위와 AscI 및 NotI 절단부위에 각각 삽입하여 pCB-Rx77_v5.4 vector를 제조하였다 (도 11 및 표 39).
프라이머 서열번호 프라이머 서열번호
A 23 E 39
B 42 F 40
C 43 G 41
D 28 H 32
플라스미드 경쇄 SP 종류 중쇄 SP 종류
pCB-Rx77_v5.4 SP7.2 SP7.2
실시예 6. 항체 발현 플라스미드 벡터의 in vitro 효능 실험
상기 실시예 5에서 제작된 벡터들은 mouse-human chimeric IgG1 형태의 단일클론항체(monoclonal antibody)를 세포 바깥으로 분비하도록 되어 있다. 신호서열 (Signal Sequence)의 세포 바깥으로의 분비효능을 in vitro cell culture system에서 조사하기 위하여 CHO 세포에 형질 전환한 뒤 ELISA를 통해 단일클론항체의 분비 수준을 조사하였다.
열로 비활성화된 FBS (Fetal bovine serum, GIBCO-BRL사) 10%를 함유하고 있는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagles's medium, GIBCO-BRL사)로 배양된 CHO 세포로의 형질전환은 Lipofectamine™2000 (Invitrogen, Cat.#:11668-019)를 이용해 이루어졌다. 형질전환 하루 전 phi-100 dish (Falcon사)를 사용하여 각 dish 당 5 x 106 개의 CHO 세포를 배양한 후 다음날 각 루시페라아제 유전자가 삽입된 16종류의 플라스미드 벡터 를 36 ug, Opti-MEM®I (Invitrogen, Cat.# 31985-070) 을 이용하여 1.5 mL를 넣은 Tube 1 (1 dish 반응량)과 Lipofectamine™ 2000 90 uL, Opti-MEM®I 1410 uL를 넣은 Tube2 (1 dish 반응량)를 각각 실온에서 5분 둔 후, 두 Tube를 혼합하여 20분간 실온에서 반응시켰다. 이 혼합액을 Opti-MEM®I 배지 5 mL로 바꾸어 준 CHO 세포에 각 3 mL씩 넣고 3시간 동안 37℃ incubator (5% CO2)에서 배양한 후 20% FBS를 함유하고 있는 DMEM 배지를 각 dish에 5 mL씩 넣어주고 8일간 배양하였다. Transfection후 2일, 4일, 6일, 8일차에 각 well의 배지를 500 ul씩 sampling하여 -20 degC에 보관하였다가, 8일차에 모두 녹여 100uL씩 Assay plate에 옮겨 ELISA를 수행하였다.
ELISA는 F(ab')2 fragment of goat anti-human IgG, Fc gamma fragment specific (Pierce, 31163) 를 0.2 ug/mL로 하여, 4 degC에서 O/N 피복한 96-well plate와 Anti-human Kappa Light chains-peroxidase(A7164-1mL, sigma) 를 이용하여 수행하였다.
상기 ELISA 실험을 통해 항체 분비 정도를 측정한 결과, 도 12에서 확인할 수 있듯이 LBFL313 유전자로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 SP7.2 신호서열을 포함한 발현 벡터 pCB-Rx71_v5.4에서 높은 분비를 확인할 수 있었다. 특히, 항체 경쇄에 SP7.2 신호서열을 연결하고, 항체 중쇄에 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 SP1 신호서열을 연결한 조합에서 분비량이 월등한 것을 확인하였으며, 배양 기간이 지날수록 더욱 분비량이 증가하는 효과를 확인하여 이는 SP7.2을 이용한 경우 단기간에 분비량이 월등한 상기 루시퍼라제 분비 실험에서의 결과에 비하여 해당 조합에 의해서 장기간 배양에도 분비량이 월등해지는 효과를 가지는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> LG Life Sciences Ltd. <120> A protein secretory factor with a high secretory efficiency and a expression vector comprising the same <130> KPA140186-KR <160> 49 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> signal peptide_SP7.2 <400> 1 Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Thr Trp Ala 20 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> signal peptide_SP7.3 <400> 2 Met Trp Arg Val Pro Gly Thr Thr Arg Arg Pro Val Thr Gly Glu Ser 1 5 10 15 Pro Gly Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala 20 25 30 Leu Leu Gly Gly Pro Thr Trp Ala 35 40 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> signal peptide_SP1 <400> 3 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> signal peptide_SP2 <400> 4 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> signal peptide_SP3 <400> 5 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly 20 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> signal peptide_SP4 <400> 6 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> signal peptide_SP5 <400> 7 Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu Ser Leu 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> signal peptide_SP6 <400> 8 Met Lys Thr Leu Ile Leu Ala Val Ala Leu Val Tyr Cys Ala Thr Val 1 5 10 15 His Cys <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP1-f primer <400> 9 ttggatccgc caccatggga tggagctat 29 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP1-r primer <400> 10 ttcatatgga cagtcctggg agtggacatc tgt 33 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oCLUC-N1-f primer <400> 11 ttccatatga acctgatcca ccaaa 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oBasic-r primer <400> 12 tcagaagcca tagagcccac cgcat 25 <210> 13 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oHSAL-U primer <400> 13 atgaagtggg tgaccttcat ctccctgctg ttcctgttct cctccgccta ctccaggggc 60 gtgttcagga gg 72 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oHSAL-L primer <400> 14 cctcctgaac acgcccctgg agtaggcgga ggagaacagg aacagcaggg 50 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP2-f primer <400> 15 ttggatccgc caccatgaag tgggtgacc 29 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP2-r primer <400> 16 ttcatatgga cagtcctgcc tcctgaacac gcc 33 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP3-f primer <400> 17 ttggatccgc caccatggac ttccaggtg 29 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP3-r primer <400> 18 ttcatatgga cagtcctggc ccctggacat gat 33 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP4-f primer <400> 19 ttggatccgc caccatgggc tggagcctg 29 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP4-r primer <400> 20 ttcatatgga cagtcctggg acagcaccct ggt 33 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP5-f primer <400> 21 ttggatccgc caccatgctg ctgctgctgc tgctgctgg 39 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP5-r primer <400> 22 ttcatatgga cagtcctggc ccagggagag ctg 33 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP7-B1-f2 primer <400> 23 ttggatccgc caccatgcac cggccagag 29 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP7-N1-r primer <400> 24 ttcatatgga cagtcctgtg cccaggtggg gcc 33 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP7-B1-f3 primer <400> 25 ttggatccgc caccatgtgg agggtgccc 29 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oIxLs-r1 primer <400> 26 cagcaggatg tcgcccctgg acatgatcac 30 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oRx-LF1 primer <400> 27 cagatcgtgc tgtctcagtc t 21 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oIkC-M1X1-r primer <400> 28 ttacgcgtct cgagtcaaca ctctccc 27 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oRHn-f primer <400> 29 ttggcgcgcc atgggatgga gctat 25 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oIxLs-r2 primer <400> 30 cagcaggatg tcggacagca ccctggtggc cacggc 36 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oRx_HF1 primer <400> 31 caggtgcagc tgcagcagcc 20 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oIgG1-X1N1-r primer <400> 32 aactcgaggc ggccgctcat ttacccggag ac 32 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oAscI_SP2-f primer <400> 33 ctggcgcgcc atgaagtggg tgacc 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP2_RH-r primer <400> 34 gcagctgcac ctgcctcctg aacac 25 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP2_RH-f primer <400> 35 gtgttcagga ggcaggtgca gctgc 25 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oAscI_SP6-f primer <400> 36 caggcgcgcc atgaagacct taattc 26 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP6_RH-r primer <400> 37 gcagctgcac ctggcaatga acag 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP6_RH-f primer <400> 38 ctgttcattg ccaggtgcag ctgc 24 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oAscI_SP7.2-f primer <400> 39 caggcgcgcc atgcaccggc cagag 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP7.2_RH-r primer <400> 40 gcagctgcac ctgtgcccag gtggg 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP7.2_RH-f primer <400> 41 cccacctggg cacaggtgca gctgc 25 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP2_RL-r primer <400> 42 acagcacgat ctgcctcctg aacac 25 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP2_RL-f primer <400> 43 gtgttcagga ggcagatcgt gctgt 25 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP6-f primer <400> 44 ttggatccgc caccatgaag accttaatt 29 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP6_RL-r primer <400> 45 acagcacgat ctggcaatga acag 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSP6_RL-f primer <400> 46 ctgttcattg ccagatcgtg ctgt 24 <210> 47 <211> 196 <212> DNA <213> human LBFL313 cDNA <220> <221> CDS <222> (53)..(196) <223> human LBFL313 cDNA <400> 47 cgcttcttcc ttctggatgg gggcccaggg ggcccaggag agtataaagg cg 52 atg tgg agg gtg ccc ggc aca acc aga cgc cca gtc aca ggc gag agc 100 Met Trp Arg Val Pro Gly Thr Thr Arg Arg Pro Val Thr Gly Glu Ser 1 5 10 15 cct ggg atg cac cgg cca gag gcc atg ctg ctg ctg ctc acg ctt gcc 148 Pro Gly Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala 20 25 30 ctc ctg ggg ggc ccc acc tgg gca ggg aag atg tat ggc cct gga gga 196 Leu Leu Gly Gly Pro Thr Trp Ala Gly Lys Met Tyr Gly Pro Gly Gly 35 40 45 <210> 48 <211> 213 <212> PRT <213> Rx antibody light chain a.a. <400> 48 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 49 <211> 451 <212> PRT <213> Rx antibody heavy chain a.a. <400> 49 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450

Claims (15)

  1. 인간 LBFL313 유전자 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 내재 단백질 또는 외래 단백질인 것인, 단백질 분비 인자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 인간 성장호르몬, 혈청단백질, 면역글로불린, 사이토카인, α-, β- 또는 γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제 및 글루코우로니다제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 분비 인자.
  4. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 표적 단백질 분비 발현용 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 표적 단백질은 인간 성장호르몬, 혈청 단백질, 항체, 면역글로불린, 사이토카인, α-, β- 또는 γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGRP), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제 및 글루코우로니다제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 표적 단백질 분비 발현용 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 추가로 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 표적 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 것인, 표적 단백질 분비 발현용 벡터.
  7. 제4항에 있어서, 상기 표적 단백질 분비 발현용 벡터는 항체 분비 발현용 벡터로서, a) 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 항체 경쇄를 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 제1발현 카세트; 및 b) 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 항체 중쇄를 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 제2발현 카세트를 포함하는 것인, 표적 단백질 분비 발현용 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 b)의 단백질 분비 인자는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자인 것인, 표적 단백질 분비 발현용 벡터.
  9. 제7항에 있어서, 상기 a)의 단백질 분비 인자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자이고, 상기 b)의 단백질 분비 인자는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자인 것인, 표적 단백질 분비 발현용 벡터.
  10. 제7항에 있어서, 상기 항체 경쇄는 서열번호 48의 아미노산 서열로 구성되고 상기 항체 중쇄는 서열번호 49의 아미노산 서열로 구성된 것인, 표적 단백질 분비 발현용 벡터.
  11. 동물 숙주 세포에 제4항에 따른 표적 단백질 분비 발현용 벡터가 도입된 형질전환체 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO, Chinese Hamster Ovary)인 것인, 형질전환체 세포.
  13. ⅰ) 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질 분비 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및 표적 단백질을 암호화하는 유전자;가 작동 가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는, 표적 단백질 분비 발현용 벡터를 제조하는 단계;
    ⅱ) 동물 숙주 세포에 상기 ⅰ) 단계의 표적 단백질 분비 발현용 벡터를 도입하여 형질전환체 세포를 수득하는 단계; 및
    ⅲ) 상기 ⅱ) 단계의 형질전환체 세포를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 표적 단백질을 생산하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    회수한 표적 단백질의 정제 단계를 추가로 포함하는, 표적 단백질을 생산하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO, Chinese Hamster Ovary)인 것인, 표적 단백질을 생산하는 방법.
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