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KR20150056826A - 단백질로의 노르류신 오혼입을 방지하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

단백질로의 노르류신 오혼입을 방지하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20150056826A
KR20150056826A KR1020157009711A KR20157009711A KR20150056826A KR 20150056826 A KR20150056826 A KR 20150056826A KR 1020157009711 A KR1020157009711 A KR 1020157009711A KR 20157009711 A KR20157009711 A KR 20157009711A KR 20150056826 A KR20150056826 A KR 20150056826A
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미카엘 더블유. 레어드
카씨크 비라발리
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 박테리아에서의 재조합 단백질 생산 동안 노르류신이 단백질로 혼입되는 것을 방지하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 미생물 숙주 세포 및 핵산 분자를 제공한다.

Description

단백질로의 노르류신 오혼입을 방지하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREVENTING NORLEUCINE MISINCORPORATION INTO PROTEINS}
관련 출원
본원은 2013년 3월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 61/777,700, 및 2012년 9월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 61/703,142 (둘 다 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함됨)를 우선권 주장한다.
서열 목록
본원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 2013년 9월 17일에 생성된 상기 ASCII 복사본의 명칭은 P4967R1_WO_SequenceListing.txt이고, 크기는 45,847 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 박테리아에서의 재조합 단백질 생산 동안 단백질로의 노르류신의 오혼입을 방지하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 미생물 숙주 세포 및 핵산 분자를 제공한다.
아미노산 메티오닌의 유사체인 노르류신은 메티오닌 잔기 대신에 단백질로 오혼입될 수 있다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (이. 콜라이(E. coli))에서 발현되는 경우, 많은 이종 단백질이 메티오닌 잔기가 나타나야 할 장소에 잘못 혼입된 노르류신을 갖는다. 일반적으로 단백질, 특히 재조합 수단에 의해 생산된 이종 단백질에서의 노르류신의 오혼입은 부분적으로 바람직하지 않은 특성을 갖는 변경된 단백질의 생산으로 인해 바람직하지 않은 것으로 여겨진다.
이. 콜라이에서의 재조합 단백질 생산 동안 메티오닌 위치에서의 노르류신의 오혼입이 50년 넘게 관찰되었다. (예를 들어, 문헌 [Munier and Cohen (1959) Biochim Biophys Acta 31:378-391; Cohen and Munier (1956) Biochim Biophys Acta 21:592-593; Cohen and Munier (1959) Biochim Biophys Acta 31:347-356; 및 Cowie et al., (1959) Biochim Biophys Acta 34:39-46] 참조.) 예를 들어, 메티오닐 소 소마토트로핀 (MBS)에서 대략 14%의 메티오닌 잔기가 이. 콜라이에서의 이러한 단백질의 재조합 생산 동안 노르류신 오혼입을 나타내었으며, 천연 이. 콜라이 단백질에서 대략 6%의 메티오닌 잔기가 또한 노르류신으로 치환되었다. (문헌 [Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:531-9] 참조.) 또 다른 예에서, 최소 배지 이. 콜라이 발효에서의 인터류킨-2의 생산은 재조합 단백질에서 대략 19%의 메티오닌 잔기가 노르류신으로 치환되도록 하였다. (문헌 [Tsai et al., (1988) Biochem Biophys Res Commun 156:733-739] 참조.) 다른 연구는 단백질로의 노르류신 잔기 오혼입이 내부 메티오닌 잔기 및 아미노 말단 메티오닌 잔기 둘 다에서 일어날 수 있다는 것을 보여주었다. (문헌 [Brown (1973) Biochim Biophys Acta 294:527-529; 및 Barker and Bruton (1979) J Mol Biol 133:217-231] 참조.)
노르류신은 효소 메티오닐 tRNA 신테타제 (MetG)의 복잡한 특성으로 인해 단백질로의 혼입에 대해 메티오닌과 경쟁한다. (문헌 [Trupin et al., (1966) Biochem Biophys Res Commun 24:50-55; 및 Fersht and Dingwall (1979) Biochemistry 18:1250-1256]을 참조한다.) 이. 콜라이 MetG 효소의 동역학적 연구는 MetG의 아실화가 노르류신에서에 비해 메티오닌에서 대략 4-배 더 높다는 것을 밝혀내었다. (문헌 [van Hest et al., (2000) Am Chem Soc 122:1282-1288] 참조.) MetG의 완화된 기질 특이성으로 인해, 노르류신이 아실화 반응에서 메티오닌 대신 치환되어, 단백질에 메티오닌 대신 노르류신이 오혼입될 수 있다.
재조합 단백질 생산에서 메티오닌 잔기 대신 노르류신 잔기가 오혼입되는 것은 일반적으로 바람직하지 않은 것으로 간주된다. 오혼입된 노르류신 잔기를 함유하는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드는 변경된 구조적 및 기능적 특성, 예컨대 예를 들어 단백질분해에 대한 변경된 감수성, 감소된 생물학적 활성, 또는 증가된 면역원성을 나타낼 수 있다.
재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하기 위한 다양한 전략이 개발되었다. 예를 들어, 발효 공정 동안 (메티오닌의 연속적 또는 볼루스 공급/첨가에 의해) 세포 배양 배지에 메티오닌을 보충하는 것을 이용하여 세포가 과량의 메티오닌을 이용할 수 있도록 하였으며, 이에 따라 메티오닐 tRNA가 노르류신으로 잘못 채워질 확률이 감소하였다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,599,690 참조.) 메티오닌의 연속적 또는 볼루스 공급/첨가가 재조합 단백질에서의 노르류신 오혼입의 범위는 감소시키지만, 발효 공정의 작동상 복잡성 및 비용은 증가시킬 수 있다. 또한, 발효 동안 메티오닌의 연속적 또는 볼루스 공급/첨가는 발효기 내용물의 바람직하지 않은 희석으로 이어질 수 있으며, 이는 보다 낮은 세포 밀도 및 보다 낮은 생성물 수율을 발생시킬 수 있다.
노르류신 생합성 경로에 관련된 유전자의 결실, 예컨대 예를 들어 류신 오페론의 유전자 (leuA, leuB, leuC, 및 leuD)의 결실 또는 트랜스아미나제 코딩 유전자, 예컨대 ilvE 또는 tyrB의 결실이 또한 단백질에서의 노르류신 오혼입을 감소시키는데 사용되었다. (문헌 [Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:531-539; Tsai et al., (1989) Biochem Biophys Res Commun 156:733-739; 및 Randhawa et al., (1994) Biochemistry 33:4352-4362] 참조.) 그러나, 노르류신 오혼입을 방지하기 위해 생합성 경로 유전자를 결실시키는 것은 노르류신 생합성에 관련된 많은 유전자가 또한 분지쇄 아미노산의 생합성에 관련되기 때문에 발효 동안 배양 배지에 다른 아미노산 (예컨대, 류신 또는 이소류신)을 첨가하는 것을 필요로 한다. (문헌 [Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:531-539] 참조; 본 명세서의 도 8 참조.)
노르류신 오혼입을 방지하는데 이용되는 또 다른 전략은, 예를 들어 아미노산 데히드로게나제 및 아미노산 옥시다제를 포함하는 노르류신 분해 효소의 공동-발현을 수반하였다. 그러나 이러한 접근법은 이들 효소의 과다발현을 필요로 하였고, 이는 재조합 단백질 생산 동안 바람직하지 않을 수 있으며, 보다 낮은 재조합 단백질 수율로 이어질 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 US2007/0009995 참조.) 또한, 이러한 효소의 과다 발현은 발효 공정 동안 다른 유사한 아미노산의 분해를 일으킬 수 있다. 또한 노르류신 오혼입을 방지하기 위해 메티오닌 코돈을 다른 코돈으로 치환하여 발현될 폴리펩티드의 일차 아미노산 서열을 변경시킬 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,698,418 참조.) 그러나, 이러한 치환은 감소된 활성 또는 생성된 단백질의 구조 변화를 초래할 수 있으며, 이는 생명공학 산업에서의 재조합 단백질 생산에 있어 가장 바람직하지 않은 결과이다.
상기 언급된 바와 같이, 미생물에서의 재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입을 방지하는데 이용되는 현재의 방법이 다양한 불리한 점과 연관이 있으며; 이에 따라 미생물, 예컨대 이. 콜라이에서, 특히 재조합 단백질 생산 동안 단백질로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는데 유용한 신규 방법이 요망된다.
본 발명은 미생물, 예컨대 예를 들어 박테리아에서의 재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입을 방지하는데 효과적인 조작된 미생물 숙주 세포를 제공함으로써 이러한 요구를 만족시킨다. 본 발명은 미생물이 단백질 및 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하게 하는 돌연변이된 metA 및 metK 대립유전자 (즉, 변경된 metA 및 metK 핵산 서열)를 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포를 사용하여 생산된 재조합 단백질의 분석은 메티오닌 잔기를 대신한 노르류신 잔기의 오혼입이 제거되었음을 보여주었다. 본 발명은 또한 이러한 이. 콜라이 숙주 세포를 사용한 발효 공정 성능 (숙주 세포의 성장 포함) 및 이러한 이. 콜라이 숙주 세포를 사용한 재조합 단백질 생성물 역가가 대조 숙주 세포에서 관찰된 것과 대등하다는 것을 입증한다.
본 발명은 부분적으로 단백질 및 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 미생물, 예컨대 예를 들어 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이)에 의해 발현되는 이종 (예를 들어, 재조합) 단백질 및 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는데 유용하다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에 의해 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 미생물은 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산한다. 일부 실시양태에서, 미생물은 피드백-저항성 또는 피드백-비감수성 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 미생물이다. 다른 실시양태에서, 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자, 돌연변이체 metK 대립유전자, 또는 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 아미노산 위치 27에서의 아르기닌에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 64에서의 글루타민에서 글루탐산으로의 치환, 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환, 및 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환 및 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환을 포함하는 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 여기에 기재된 MetA 아미노산 위치는 도 7a 및 서열 29에 제시된 바와 같은 야생형 MetA 아미노산 서열에 대한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 미생물에 의해 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 미생물은 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 메티오닌 생산에 대해 억제해제된 미생물인, 미생물에 의해 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 미생물은 S-아데노실메티오닌 신타제의 부분적 기능-상실로 인해 메티오닌 생산에 대해 억제해제된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 것인, 미생물에 의해 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metK 대립유전자는 MetK의 부분적 기능-상실을 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 아미노산 위치 185에서의 발린에서 글루탐산으로의 치환을 포함하는 MetK에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 metK 대립유전자의 핵산 잔기 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 여기에 기재된 MetK 아미노산 위치는 도 8a 및 서열 30에 제시된 바와 같은 야생형 MetK 아미노산 서열에 대한 것이다. 본 명세서에서 여기에 기재된 metK 핵산 위치는 도 8b 및 서열 32에 제시된 바와 같은 야생형 metK 핵산 서열에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 metK 대립유전자를 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA의 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 MetK의 아미노산 위치 185에서의 발린에서 글루탐산으로의 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA의 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 metK 대립유전자의 핵산 잔기 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 24의 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27의 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 24의 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 28의 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 미생물 숙주 세포에 의해 발현되는 단백질 및 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는데 유용한 미생물 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 미생물 숙주 세포에 의한 단백질 또는 폴리펩티드의 발현에 사용하기 위한 미생물 숙주 세포를 제공하며, 여기서 발현된 단백질 또는 폴리펩티드는 노르류신 오혼입이 없다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 박테리아이다. 다른 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 이. 콜라이이다.
본 발명은 미생물에 의해 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하는 미생물 (예를 들어, 미생물 숙주 세포)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 피드백-비감수성 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 미생물인 미생물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 아미노산 위치 27에서의 아르기닌에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 64에서의 글루타민에서 글루탐산으로의 치환, 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환, 및 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 박테리아이다. 다른 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 이. 콜라이이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA에서의 하나 초과의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA에서의 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환 및 MetA에서의 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 박테리아이다. 다른 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 이. 콜라이이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 박테리아이다. 다른 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 이. 콜라이이다.
본 발명은 미생물에 의해 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하는 미생물 (예를 들어, 미생물 숙주 세포)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 메티오닌 생산에 대해 억제해제된 미생물을 제공한다. 일부 측면에서, 메티오닌 생산에 대해 억제해제된 미생물은 S-아데노실메티오닌 신타제의 부분적 기능-상실로부터 생성된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metK 대립유전자는 아미노산 위치 185에서의 발린에서 글루탐산으로의 치환을 포함하는 MetK에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metK 대립유전자는 metK 대립유전자에서의 핵산 잔기 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 박테리아이다. 다른 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 이. 콜라이이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 박테리아이다. 다른 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 이. 콜라이이다.
본 발명은 또한 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자의 다양한 조합을 포함하는 미생물 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환을 포함하는 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 아미노산 위치 185에서의 발린에서 글루탐산으로의 치환을 포함하는 MetK에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환을 포함하는 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 metK 대립유전자의 핵산 잔기 1132에서의 핵산 시토신의 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 24의 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27의 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 24의 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 28의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 박테리아이다. 다른 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 이. 콜라이이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 단리된 metA 핵산 분자 (즉, MetA를 코딩하는 단리된 핵산 분자)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 단리된 metA 핵산 분자를 제공하며, 여기서 metA 핵산 분자는 아미노산 위치 27에서의 아르기닌에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 64에서의 글루타민에서 글루탐산으로의 치환, 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환, 및 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 단리된 metA 핵산 분자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는데 사용하기 위한 미생물의 생산을 위한 이들 단리된 metA 핵산 분자 및 그의 서열의 용도가 특히 본 발명에 의해 본원에서 제공된다.
본 발명은 또한 단리된 metK 핵산 분자 (즉, MetK를 코딩하는 단리된 핵산 분자)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 metK 핵산 분자를 제공하며, 여기서 metK 핵산 분자는 아미노산 위치 185에서의 발린에서 글루탐산으로의 치환을 포함하는 MetK에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 metK 핵산 분자를 제공하며, 여기서 metK 핵산 분자는 metK 대립유전자의 핵산 잔기 1132에서의 핵산 시토신의 결실을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 metK 핵산 분자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는데 사용하기 위한 미생물의 생산을 위한 이들 단리된 metK 핵산 분자 및 그의 서열의 용도가 특히 본 발명에 의해 본원에서 제공된다.
본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 46의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 47의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 46의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 서열 33의 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 서열 47의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열 34의 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 33에 해당하는 핵산 서열을 갖는 핵산 및 서열 34에 해당하는 핵산 서열을 갖는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이이다.
본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 미생물은 서열 46의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 47의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 46의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 서열 33의 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 서열 47의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열 34의 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 33에 해당하는 핵산 서열을 갖는 핵산 및 서열 34에 해당하는 핵산 서열을 갖는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이이다.
본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 46의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 47의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 46의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 서열 33의 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 서열 47의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열 34의 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 33에 해당하는 핵산 서열을 갖는 핵산 및 서열 34에 해당하는 핵산 서열을 갖는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이이다.
본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 48의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 49의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이이다.
본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 48의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 49의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이이다.
본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 48의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 49의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이이다.
본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 50의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 서열 51의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 및 서열 52의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이이다.
본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 50의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 서열 51의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 및 서열 52의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이이다.
본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 미생물은 서열 50의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 서열 51의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 및 서열 52의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이이다.
본 발명은 또한 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현시켜 노르류신 오혼입이 없는 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함하며, 여기서 박테리아 숙주 세포는 돌연변이체 metA 대립유전자, 돌연변이체 metK 대립유전자, 또는 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 것인, 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산을 발현시켜 노르류신 오혼입이 없는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 것을 포함하며, 여기서 박테리아 숙주 세포는 돌연변이체 metA 대립유전자, 돌연변이체 metK 대립유전자, 또는 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 것인, 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명에 따른 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 방법은 박테리아 숙주 세포에서 항체 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 항체 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 중쇄 폴리펩티드는 항체 Fab 단편 중쇄 폴리펩티드이고, 항체 경쇄 폴리펩티드는 항체 Fab 단편 경쇄 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산을 발현시켜 노르류신 오혼입이 없는 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 생산하는 것을 포함하며, 여기서 박테리아 숙주 세포는 돌연변이체 metA 대립유전자, 돌연변이체 metK 대립유전자, 또는 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 것인, 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 박테리아 숙주 세포에서 항-VEGF 항체 중쇄 폴리펩티드 또는 항-VEGF 항체 단편 중쇄 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 및 항-VEGF 항체 경쇄 폴리펩티드 또는 항-VEGF 항체 단편 경쇄 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 항-VEGF 항체 중쇄 및 항-VEGF 항체 경쇄는 전장 중쇄 및 경쇄 항-VEGF 항체 폴리펩티드이다. 다른 측면에서, 항-VEGF 항체 중쇄는 항체 Fab 단편 중쇄 폴리펩티드이고, 항-VEGF 항체 경쇄는 항체 Fab 단편 경쇄 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체 중쇄는 서열 47의 아미노산 서열을 포함하고, 항-VEGF 항체 경쇄는 서열 46의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 47의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 서열 34의 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 서열 46의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열 33의 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산된 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 제공하며, 여기서 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편은 노르류신 오혼입이 없다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 코딩하는 핵산을 발현시켜 노르류신 오혼입이 없는 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 생산하는 것을 포함하며, 여기서 박테리아 숙주 세포는 돌연변이체 metA 대립유전자, 돌연변이체 metK 대립유전자, 또는 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 것인, 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 박테리아 숙주 세포에서 항-인자 D 항체 중쇄 폴리펩티드 또는 항-인자 항체 단편 중쇄 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 및 항-인자 D 항체 경쇄 폴리펩티드 또는 항-인자 D 항체 단편 경쇄 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 항-인자 D 항체 중쇄 및 항-인자 D 항체 경쇄는 전장 중쇄 및 경쇄 항-인자 D 항체 폴리펩티드이다. 다른 측면에서, 항-인자 D 항체 중쇄는 항체 Fab 단편 중쇄 폴리펩티드이고, 항-인자 D 항체 경쇄는 항체 Fab 단편 경쇄 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항-인자 D 항체 중쇄는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항-인자 D 항체 경쇄는 서열 48의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산된 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 제공하며, 여기서 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편은 노르류신 오혼입이 없다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 코딩하는 핵산을 발현시켜 노르류신 오혼입이 없는 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 생산하는 것을 포함하며, 여기서 박테리아 숙주 세포는 돌연변이체 metA 대립유전자, 돌연변이체 metK 대립유전자, 또는 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 것인, 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 박테리아 숙주 세포에서 항-MET 항체 중쇄 폴리펩티드 또는 항-MET 항체 단편 중쇄 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 및 항-MET 항체 경쇄 폴리펩티드 또는 항-MET 항체 단편 경쇄 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 항-MET 항체 중쇄 및 항-MET 항체 경쇄는 전장 중쇄 및 경쇄 항-MET 항체 폴리펩티드이다. 다른 측면에서, 항-MET 항체 중쇄는 항체 Fab 단편 중쇄 폴리펩티드이고, 항-MET 항체 경쇄는 항체 Fab 단편 경쇄 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항-MET 항체 중쇄는 서열 51의 아미노산 서열을 포함하고, 항-MET 항체 중쇄 단편은 서열 52의 아미노산 서열을 포함하고, 항-MET 항체 경쇄는 서열 50의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산된 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 제공하며, 여기서 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편은 노르류신 오혼입이 없다.
다양한 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 돌연변이체 미생물은 박테리아이고; 다른 측면에서 이러한 미생물은 이. 콜라이이다. 본 발명은 특히 이종 (예를 들어, 재조합) 폴리펩티드 및 이종 (예를 들어, 재조합) 단백질의 생산을 위한 본원에 기재된 돌연변이체 미생물의 용도를 제공하며, 여기서 이종 폴리펩티드 및 이종 단백질로의 노르류신의 오혼입은 감소되거나, 실질적으로 감소되거나, 실질적으로 제거되거나, 또는 방지된다.
도 1은 서열 23에 해당하는 metA(R27C)의 핵산 서열을 보여준다.
도 2는 서열 24에 해당하는 metA(Y294C)의 핵산 서열을 보여준다.
도 3은 서열 25에 해당하는 metA(I296S/P298L)의 핵산 서열을 보여준다.
도 4는 서열 26에 해당하는 metA(Q64E)의 핵산 서열을 보여준다.
도 5는 서열 27에 해당하는 metK(V185E)의 핵산 서열을 보여준다.
도 6은 서열 28에 해당하는 metK(c1132del)의 핵산 서열을 보여준다.
도 7a 및 7b는 각각 서열 29 및 서열 31에 해당하는 야생형 MetA의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 보여준다.
도 8a 및 8b는 각각 서열 30 및 서열 32에 해당하는 야생형 MetK의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 보여준다.
도 9는 노르류신 및 노르류신 유사체의 구조를 보여준다. 노르류신은 메티오닌의 구조 유사체이며, 여기서 황 (S) 원자가 메틸렌 기 (즉, -CH2)에 의해 대체된다.
도 10은 이. 콜라이에서 노르류신 생합성 경로의 개략도를 보여준다. 점선 화살표는 여러 단계가 관련된다는 것을 나타낸다. 피루베이트는 류신 오페론 leuABCD에 의해 코딩된 효소에 의해 촉매되는 케토 산 쇄 신장 과정을 3회 통과하여 α-케토카프로에이트로 전환된다. 중간체 α-케토카프로에이트는 트랜스아미나제 IlvE 또는 TyrB에 의해 노르류신으로 아미노기 전이된다.
도 11은 이. 콜라이에서의 메티오닌 생합성 및 조절을 보여준다. 점선 화살표는 피드백 억제를 나타내고, 개방 화살표는 억제를 나타낸다. 메티오닌 및 S-아데노실메티오닌 (SAM)은 효소 MetA의 피드백 억제제이다. 리프레서 MetJ 및 그의 코-리프레서 SAM은 메티오닌 레귤론에서 효소의 전사를 억제한다.
도 12a, 12b, 및 12c는 10 L 이. 콜라이 발효물의 OD550 (도 12a) 및 iOD550 (도 12b)에 의해 측정된 바와 같은, 성장 경향을 제시한다. 대조 숙주 (60E4) 발효를 연속적 메티오닌 (■) 또는 연속적 물 공급 (□) (도 12a) 하에 수행하였다. 60E4 metA(Y294C) 숙주 발효를 연속적 물 공급 (△) 또는 공급 없음 (▲) (도 12a) 하에 수행하였다. 도 12c는 공급 없음 하의 대조 숙주 60E4 (사각형), 메티오닌 공급 하의 대조 숙주 60E4 (원형), 및 공급 없음 하의 숙주 60E4 metA(Y294C) (삼각형)에 대한 성장 경향을 보여준다. 모든 다른 돌연변이체를 사용하는 발효는 연속적 물 공급 하에 수행하였다.
도 13a 및 13b는 연속적 물 공급 하에 수행된 대조 숙주 (□) 및 60E4 metA(Y294C) (△) 숙주 세포 발효에서의 세포외 (도 13a) 및 세포내 (도 13b) 메티오닌 수준을 보여준다. 연속적 물 공급 하에 수행된 대조 숙주 세포 (□) 및 60E4 metA 숙주 세포 (Y294C) (△) 발효에서의 세포외 배지 중의 포스페이트 수준이 또한 점선 플롯 (도 13a) 및 (도 13b)으로 표시된다.
도 14a 및 14b는 본 발명의 돌연변이체 숙주 세포 균주에서의 세포외 (도 14a) 및 세포내 (도 14b) 메티오닌 수준을 보여준다. 각각 연속적 메티오닌 (■) 또는 연속적 물 공급 (□) 하에 수행된 2개의 대조 숙주 세포 발효에서의 세포외 및 세포내 메티오닌 수준이 또한 제시된다.
도 15는 발효 동안 세포외 포스페이트 수준을 보여준다.
도 16a 및 16b는 이. 콜라이 숙주 세포 발효의 실행 종료시의 역가 (도 16a) 및 시간 경과에 따른 역가 (도 16b)를 보여준다. 대조 숙주 세포 (60E4) 발효는 연속적 메티오닌 (■) 또는 연속적 물 공급 (□) 하에 수행하였다. 60E4 metA 숙주 세포 (Y294C) 발효는 연속적 물 공급 (△) 또는 공급 없음 (▲) 하에 수행하였다. 다른 모든 돌연변이체 숙주 세포를 사용하는 발효는 연속적 물 공급 하에 수행하였다.
도 17a 및 17b는 각각 60E4 숙주 세포 (대조 숙주 세포) 및 60E4 metA 숙주 세포 (Y294C) 발효 동안 수득한 전세포 브로쓰 샘플 상에서 수행된 웨스턴 블롯의 결과를 제시한다.
도 18a 및 18b는 각각 서열 33 및 서열 34에 해당하는 항-혈관 내피 성장 인자 (항-VEGF) 항체 Fab 단편 경쇄 및 중쇄의 핵산 서열을 보여준다.
도 19a 및 19b는 OD550에 의해 측정된 바와 같은 10 L 이. 콜라이 발효물의 성장 경향을 제시한다. 대조 숙주 (66F8 또는 64B4) 발효 공정 AF2 또는 AF3은 각각 공급 없음 (사각형) 또는 연속적 메티오닌 공급 (원형) 하에 수행하였다. 66F8 metA(Y294C) 및 64B4 metA(Y294C) 숙주 발효는 공급 없음 (삼각형) 하에 수행하였다.
도 20a, 20b, 및 20c는 각각 숙주 균주 60E4 (대조 숙주) 및 60E4 metA(Y294C), 66F8 (대조 숙주) 및 66F8 metA(Y294C), 및 64B4 (대조 숙주) 및 64B4 metA(Y294C)를 사용한 재조합 단백질 생성물 수율을 제시한다.
도 21a 및 21b는 각각 서열 46 및 서열 47에 해당하는 항-혈관 내피 성장 인자 (항-VEGF) 항체 Fab 단편 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
도 22a 및 22b는 각각 서열 48 및 서열 49에 해당하는 항-인자 D 항체 Fab 단편 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
도 23a, 23b, 및 23c는 항-MET 항체 경쇄 (서열 50), 중쇄 (서열 51), 및 중쇄 단편 (서열 52)의 아미노산 서열을 보여준다.
본 발명은 특히, 미생물에서 특히 재조합 단백질 생산 동안 단백질 및 폴리펩티드로의 노르류신의 오혼입을 방지하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 미생물 숙주 세포 및 핵산 분자를 제공한다.
일반적 방법
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이며, 이들은 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 이용가능하다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 [Molecular Cloning: A laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); 및 Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]에 기재되어 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523에 기재되어 있다. (또한, 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] (이. 콜라이에서 항체 단편의 발현 기재) 참조.)
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
정의
용어 "이종 단백질" 또는 "이종 폴리펩티드"는 관심 세포 또는 유기체 (예를 들어, 미생물)에 의해 자연적으로 합성되거나 또는 생산되지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 이. 콜라이 세포는 인간 단백질 또는 인간 폴리펩티드를 생산할 수 있고, 이와 같이 생산된 인간 단백질 또는 인간 폴리펩티드는 이종 단백질 또는 이종 폴리펩티드이다. 본 발명의 내용에서 특히 관심있는 것은 메티오닌을 포함하는 이러한 이종 단백질 또는 이종 폴리펩티드이다. 본원에 사용된 이종 단백질 또는 이종 폴리펩티드는 또한 재조합 단백질 또는 재조합 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 "노르류신 오혼입"은 메티오닌 잔기가 그 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 상응하는 핵산에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 잔기의 혼입을 지칭한다.
용어 "돌연변이체 대립유전자" 또는 "돌연변이된 대립유전자"는 야생형 대립유전자 (즉, 관심 세포 또는 미생물 내에서 자연적으로 발현되는 것)의 핵산 서열과 상이하거나 또는 이러한 핵산 서열로부터 변경된 핵산 서열을 갖는 대립유전자를 지칭한다.
용어 "돌연변이체 미생물" 또는 "돌연변이된 미생물"은 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자 또는 돌연변이된 대립유전자를 함유하는 미생물을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 통상의 기술자가 2개의 수치 값 (예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 함량)에 의해 측정된 생물학적 특성의 맥락 내에서 상기 2개의 값 사이의 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주하도록 상기 2개의 수치 값 (일반적으로 하나는 분자와 연관되고, 다른 것은 참조/비교 분자와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 지칭한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"단리된 metA 핵산 분자" 또는 "단리된 metK 핵산 분자"는 각각 MetA 또는 MetK를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다. "단리된 metA 핵산 분자" 또는 "단리된 metK 핵산 분자"는 또한 돌연변이체 metA 대립유전자 또는 돌연변이체 metK 대립유전자를 지칭한다.
어구 "노르류신 오혼입이 없는 단백질 또는 폴리펩티드"는 검출가능하지 않은 수준의 노르류신 잔기를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 단수 형태는 달리 나타내지 않는 한 복수 언급대상을 포함한다.
본원에서 값 또는 파라미터에서 "약"의 언급은 이러한 기술 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 값 또는 파라미터에서 "약"의 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 측면을 포함(하고 이를 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는 방법
본 발명은 부분적으로 미생물에서 특히 재조합 단백질 생산 동안 단백질 및 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는데 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
이. 콜라이에서의 재조합 단백질 생산 동안 메티오닌 잔기를 대신한 노르류신 잔기의 오혼입은 이전에 기재되었다. 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기 위해 현재 사용되는 하나의 접근법은 발효 공정 동안 배양 배지에의 메티오닌의 연속적 또는 볼루스 공급에 의한 것이다. 이러한 전략은 노르류신 오혼입을 감소시키는데 효과적이지만, 여러 작동상 불리한 점이 발효 공정 동안 메티오닌의 연속적 또는 볼루스 공급 또는 첨가와 연관이 있었다. 예를 들어, 배양물에의 연속적 또는 볼루스 공급은 작동상 복잡성 및 발효 공정의 전체 비용을 증가시킨다. 또한, 메티오닌 공급은 발효 배지의 바람직하지 않은 희석을 초래하여 보다 낮은 세포 밀도를 발생시킬 것이며 생성물 수율을 낮출 가능성이 있다.
이러한 불리한 점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 이종 단백질 또는 폴리펩티드 생산에서의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기 위한 연속적 또는 볼루스 메티오닌 공급에 대한 대안을 제공하였다. 특히, 본 발명은 높은 숙주 세포 밀도에서 수행되는 재조합 단백질 생산을 포함하는 재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하도록 조작된 미생물 (예를 들어, 이. 콜라이) 숙주 세포를 제공한다.
대규모 메티오닌 생산에 유용한 이. 콜라이 숙주 세포 돌연변이체가 이전에 보고되었다. (예를 들어, 문헌 [Chattopadhyay et al., (1991) J Gen Microbiol 137:685-691; Nakamori et al., (1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:179-185; Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234]; 국제 특허 출원 공보 번호 WO2005/111202 2005; 및 미국 특허 출원 공보 번호 US2009/0298135 참조.) 다수의 이러한 돌연변이체 이. 콜라이 균주는 메티오닌 생합성의 조절과 연관된 3종의 유전자: metJ, metA, 및 metK에 돌연변이를 함유하였다.
이. 콜라이의 메티오닌 생합성의 전사 조절은 효소 MetJ (metJ 유전자 생성물)를 포함한다. MetJ는 그의 코-리프레서 S-아데노실메티오닌 (SAM)에 결합되었을 때 메티오닌 레귤론에서 유전자의 전사를 저해하여 세포에서 메티오닌의 수준을 조절하는 전사 리프레서이다. (예를 들어, 문헌 [Marincs (2006) et al., Biochem J 396:227-234] 참조.) 이전에 보고된 바와 같이, 이. 콜라이의 화학적 돌연변이유발에 이어 에티오닌 (독성 메티오닌 유사체) 상에서의 성장에 대한 선택은 MetJ에서의 아미노산 위치 54에서의 세린에서 아르파라긴 (S54N)으로의 단리로 이어지며, 이는 메티오닌 생합성 효소의 억제해제 및 증가된 메티오닌 생산을 발생시킨다. (문헌 [Nakamori et al., (1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:179-185] 참조.) metJ 유전자의 완전한 분해는 또한 메티오닌 생합성 경로에 관련된 효소의 억제해제 및 메티오닌 과다생산을 발생시킨다. (문헌 [Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234] 참조.)
이. 콜라이에서의 메티오닌 생합성은 또한 메티오닌 생합성의 제1 단계에 관련된 효소인 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 (metA 유전자 생성물)의 피드백 억제 (메티오닌 및 SAM에 의함)에 의해 조절된다. (예를 들어, 문헌 [Born and Blanchard (1999) Biochemistry 38:14416-14423] 참조.) 메티오닌 생합성의 탈조절을 일으키는 이. 콜라이의 피드백 저항성 MetA (metA 유전자 생성물) 돌연변이체는 독성 메티오닌 유사체 α-메틸 메티오닌 상의 성장에 대해 선택됨으로써 이전에 단리되었다. (문헌 [Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234]; 및 국제 특허 출원 공보 번호 WO2005/111202 참조.)
metK 유전자는 메티오닌을 S-아데노실메티오닌으로 전환시키는 효소 S-아데노실메티오닌 신타제를 코딩한다. (문헌 [Markham et al., (1980) J Biol Chem 255:9082-9092] 참조.) 낮은 수준의 SAM 및 이에 따른 메티오닌 생합성 효소의 억제해제 (SAM은 MetJ에 대한 코-리프레서임)를 발생시키는 부분적 기능-상실 MetK 돌연변이체는 독성 메티오닌 유사체, 노르류신, 및 에티오닌의 성장에 대해 선택됨으로써 이전에 단리되었다. (문헌 [Chattopadhyay et al., (1991) Gen Microbiol 137:685-691; Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234]; 및 국제 특허 출원 공보 번호 WO2005/111202 참조.)
본 발명에서, 야생형 metA 유전자의 특정 핵산 잔기가 돌연변이되어, MetA에서의 하기 아미노산 치환을 발생시킨다 (야생형 MetA 아미노산 서열에 대해 도 7a 및 서열 29 참조): 아미노산 위치 27에서의 아르기닌에서 시스테인으로의 치환 (R27C); 아미노산 위치 64에서의 글루타민에서 글루탐산으로의 치환 (Q64E); 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환 (Y294C); 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환 (I296S); 및 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환 (P298L). 이러한 MetA 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포는 발현된 이종 단백질에서의 노르류신 오혼입을 방지하기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하였다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 R27C, Q64E, Y294C, I296S, 및 P298L의 MetA에서의 아미노산 치환 (야생형 MetA 아미노산 서열과 비교; 도 7 및 서열 29)을 코딩하는 다양한 돌연변이체 metA 대립유전자를 제공한다. 이러한 돌연변이체 metA 대립유전자는 피드백 저항성 MetA 효소를 발생시킨다. 돌연변이체 metA 대립유전자를 대립유전자 교환 방법 (하기 물질 및 방법 참조)을 이용하여 이. 콜라이 숙주 세포 (60E4)에 도입하여 돌연변이체 이. 콜라이 숙주 세포 균주 66H6 (60E4 metA(R27C)), 66H8 (60E4 metA(Y294C)), 67B8 (60E4 metA(Q64E)), 및 67B9 (60E4 metA(I296S P298L))를 수득한다. 수득한 생성된 돌연변이체 이. 콜라이 숙주 세포를 연속적 메티오닌 공급 없이 수행된 재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입에 대해 평가하였다. (하기 실시예 4 참조.)
MetA에서의 아미노산 위치에 대한 모든 언급은 서열 29 및 서열 31에 해당하는, 도 7a 및 7b에 제시된 이. 콜라이의 metA 유전자에 의해 코딩되는 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제에 기초하여 이루어진다. 아미노산 위치에 대한 언급은 첫번째 아미노산 메티오닌을 아미노산 위치 번호 1로 카운팅하여 이루어진다. 다른 유기체로부터의 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 효소에서 상응하는 영역의 상대적 위치는 통상의 기술자에 의해, 예를 들어 단순 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에서, 야생형 metK 유전자의 핵산이 돌연변이되어, 아미노산 위치 185에서의 발린에서 글루탐산으로의 MetK에서의 아미노산 치환 (V185E)이 발생한다. (야생형 MetK 아미노산 서열에 대해 도 8a 및 서열 30 참조.) 또한, 특정 핵산이 metK 유전자에서 시토신 염기 위치 1132에서 결실 (c1132del)되었다. 이러한 돌연변이체 metK 대립유전자 중 하나 이상을 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포는 발현된 이종 단백질에서의 노르류신 오혼입을 방지하지에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 아미노산 치환 V185E 또는 metK 대립유전자에서의 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실 (c1132del)을 코딩하는 다양한 돌연변이체 metK 대립유전자를 제공한다. 이러한 돌연변이체 metK 대립유전자는 부분적 기능-상실 MetK 효소를 발생시킨다. 돌연변이체 metK 대립유전자를 대립유전자 교환 방법 (하기 물질 및 방법 참조)을 이용하여 다양한 이. 콜라이 숙주 세포 (66H8; 60E4 metA(Y294C), 상기 참조)에 도입하여 각각 이. 콜라이 숙주 세포 균주 67C2 (66H8 metK(V185E)) 및 67C3 (66H8 metK(c1132del))을 수득한다. 수득한 생성된 돌연변이체 이. 콜라이 숙주 세포는 연속적 메티오닌 공급 없이 수행된 재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입에 대해 평가하였다. (하기 실시예 4 참조.)
MetK에서의 아미노산 위치에 대한 모든 언급은 서열 30 및 서열 32에 해당하는, 도 8a 및 8b에 제시된 이. 콜라이의 metK 유전자에 의해 코딩되는 S-아데노실메티오닌 신타제에 기초하여 이루어진다. 아미노산 위치에 대한 언급은 첫번째 아미노산 메티오닌을 아미노산 위치 번호 1로 카운팅하여 이루어진다. 다른 유기체로부터의 S-아데노실메티오닌 신타제 효소에서 상응하는 영역의 상대적 위치는 통상의 기술자에 의해, 예를 들어 단순 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다.
metA 및 metK 에 대한 핵산 분자
예를 들어, 본 발명은 야생형 metA 및 metK의 핵산 서열과 상이한 metA 및 metK의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 사용하였다. 본 발명에 의해 제공된 metA 및 metK의 핵산 서열은 야생형 metA에 의해 코딩되는 것에 대한 다양한 아미노산 치환 (아미노산 위치 27에서 시스테인으로 대체된 아르기닌 (R27C); 아미노산 위치 64에서 글루탐산으로 대체된 글루타민 (Q64E); 아미노산 위치 294에서 시스테인으로 대체된 티로신 (Y294C); 아미노산 위치 296에서 세린으로 대체된 이소류신 (I296S); 아미노산 위치 298에서 류신으로 대체된 프롤린 (P298L); 및 아미노산 위치 296에서 세린으로 대체된 이소류신 (I296S) 및 아미노산 위치 298에서 류신으로 대체된 프롤린 (P298L)); 및 야생형 metK에 의해 코딩되는 것에 대한 다양한 아미노산 치환 (아미노산 위치 185에서 글루탐산으로 대체된 발린 (V185E) 및 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실을 포함하는 핵산 서열 (cdel1132del))을 코딩한다. 이러한 아미노산 치환을 발생시키는 metA 대립유전자 또는 metK 대립유전자를 코딩하는 임의의 핵산 서열의 사용은 특히 본 발명의 방법에 사용하기 위해 본원에서 고려된다.
본 발명은 또한 다양한 변경된 MetA 효소를 코딩하는 (즉, 다양한 돌연변이체 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 효소를 코딩하는) 단리된 metA 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 핵산 분자 서열 23, 서열 24, 서열 25 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 다양한 변경된 MetK 효소를 코딩하는 (즉, 다양한 돌연변이체 S-아데노실메티오닌 효소를 코딩하는) 단리된 metK 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한, 예를 들어 돌연변이체 metA 대립유전자, 및 MetA에서의 하기 아미노산 치환: 아미노산 위치 27에서 시스테인으로 치환된 아르기닌 (R27C); 아미노산 위치 64에서 글루탐산으로 치환된 글루타민 (Q64E); 아미노산 위치 294에서 시스테인으로 치환된 티로신 (Y294C); 아미노산 위치 296에서 세린으로 치환된 이소류신 (I296S); 아미노산 위치 298에서 류신으로 치환된 프롤린 (P298L); 및 아미노산 위치 296에서 세린으로 치환된 이소류신 (I296S) 및 아미노산 위치 298에서 류신으로 치환된 프롤린 (P298L)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 해당하는 단리된 핵산 분자의 다양한 조합을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명에 의해 제공된 돌연변이체 metA 대립유전자는 피드백-저항성 (즉, 피드백-비감수성) MetA 효소를 발생시킨다. 아미노산 위치는 도 7a 및 서열 29에 제시된 바와 같은 야생형 MetA 아미노산 서열이다.
또한, 본 발명에 의해 예를 들어 돌연변이체 metK 대립유전자 및 MetK에서의 하기 아미노산 치환: 아미노산 위치 185에서 글루탐산으로 치환된 발린 (V185E)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 해당하는 단리된 핵산 분자의 다양한 조합이 제공된다. 본 발명은 또한 metK 대립유전자의 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실 (c1132del)을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명에 의해 제공된 돌연변이체 metK 대립유전자는 부분적 기능-상실 MetK 효소를 발생시킨다. 아미노산 위치는 도 8a 및 서열 30에 제시된 바와 같은 야생형 MetK 아미노산 서열에 대한 것이다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 미생물
본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 이. 콜라이 숙주 세포는 박테리아에 대해 높은 숙주 세포 밀도에서 수행된 재조합 단백질 생산을 포함하는 재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하도록 조작되었다. 따라서, 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 본 발명은 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하기에 충분한 정도 또는 범위 (예를 들어, 재조합 단백질 또는 재조합 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하기에 충분한 정도 또는 범위, 또는 이종 단백질 또는 이종 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하기에 충분한 정도 또는 범위)로 메티오닌을 생산하는 돌연변이체 미생물 균주 (즉, 돌연변이체 미생물 숙주 세포)를 제공한다.
본원에 제공된 방법에 사용하기 적합한 출발 이. 콜라이 숙주 세포는, 예를 들어 (비제한적으로) 이. 콜라이 W3110, 이. 콜라이 294, 이. 콜라이 X1776 등을 포함한다. 이러한 이. 콜라이 숙주 세포의 예는 제한적이기 보다는 예시적이다. 이. 콜라이 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상의 숙주 균주이다. 임의의 상기-언급된 이. 콜라이 숙주 세포 균주의 돌연변이체 이. 콜라이 숙주 세포가 또한 출발 숙주 세포로 사용될 수 있으며, 이는 이어서 본원에 기재된 돌연변이된 metA 및/또는 metK 대립유전자를 함유하도록 추가로 변형된다.
본 발명은 재조합 단백질 생산에서 metA 및 metK에 대한 다양한 돌연변이체 대립유전자 및 돌연변이체 대립유전자의 조합을 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포의 사용이 발현된 재조합 단백질로의 노르류신 오혼입을 방지하는데 효과적이었다는 것을 보여준다. (하기 실시예 4 참조.)
본 발명은 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하는 미생물을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 피드백-비감수성 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 미생물인 미생물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA에서의 R27C 아미노산 치환, MetA에서의 Q64E 아미노산 치환, MetA에서의 Y294C 아미노산 치환, MetA에서의 I296S 아미노산 치환, 또는 MetA에서의 P298L 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은, 예를 들어 MetA에서의 I296S 아미노산 치환 및 P298L 아미노산 치환을 코딩하는 돌연변이체 metA 대립유전자를 비롯하여, 상기 기재된 하나 초과의 아미노산 치환을 코딩하는 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 다양한 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물은 박테리아이고; 다른 측면에서, 미생물은 이. 콜라이이다. 본 발명은 특히 이종 (예를 들어, 재조합) 폴리펩티드 및 이종 (예를 들어, 재조합) 단백질의 생산을 위한 본원에 기재된 미생물의 용도를 제공하며, 여기서 이종 폴리펩티드 및 이종 단백질로의 노르류신의 오혼입이 감소되거나 또는 방지된다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 하나 이상의 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 일부 실시양태에서, MetA에서의 R27C 아미노산 치환을 코딩하거나, MetA에서의 Q64E 아미노산 치환을 코딩하거나, MetA에서의 Y294C 아미노산 치환을 코딩하거나, 또는 MetA에서의 I296S 아미노산 치환 및 P298L 아미노산 치환을 코딩하는 돌연변이체 metA 대립유전자는 각각 서열 23 (R27C), 서열 26 (Q64E), 서열 24 (Y294C), 또는 서열 25 (I296S 및 P298L)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 미생물은 서열 23 (R27C), 서열 26 (Q64E), 서열 24 (Y294C), 또는 서열 25 (I296S 및 P298L)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함한다. 다양한 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물은 박테리아이고; 다른 측면에서, 미생물은 이. 콜라이이다. 본 발명은 특히 이종 (예를 들어, 재조합) 폴리펩티드 및 이종 (예를 들어, 재조합) 단백질의 생산을 위한 본원에 기재된 미생물의 용도를 제공하며, 여기서 이종 폴리펩티드 및 이종 단백질의 노르류신의 오혼입은 감소되거나 또는 방지된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 미생물에 의해 발현된 단백질 및 폴리펩티드로의 노르류신 혼입을 방지하거나 또는 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 미생물은 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하는 미생물이다. 일부 측면에서, 본 발명은 메티오닌 생산에 대해 억제해제된 미생물인 미생물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metK 대립유전자는 MetK에서의 V185E 아미노산 치환을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공하며, 여기서 돌연변이체 metK 대립유전자는 metK 대립유전자의 핵산 잔기 1132에서의 핵산 시토신의 결실을 포함한다. 다양한 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물은 박테리아이고; 다른 측면에서 미생물은 이. 콜라이이다. 본 발명은 특히 이종 (예를 들어, 재조합) 폴리펩티드 및 이종 (예를 들어, 재조합) 단백질의 생산을 위한 본원에 기재된 미생물의 용도를 제공하며, 여기서 이종 폴리펩티드 및 이종 단백질의 노르류신의 오혼입은 감소되거나 또는 방지된다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 하나 이상의 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 일부 실시양태에서, MetK에서의 V185E 아미노산 치환을 코딩하거나 또는 metK 대립유전자의 핵산 잔기 1132에서의 핵산 시토신의 결실을 코딩하는 돌연변이체 metK 대립유전자는 각각 서열 27 (V185E)을 포함하는 핵산 서열 또는 서열 28 (c1132del)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 미생물은 서열 27 (V185E) 또는 서열 28 (c1132del)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함한다. 다양한 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물은 박테리아이고; 다른 측면에서 미생물은 이. 콜라이이다. 본 발명은 특히 이종 (예를 들어, 재조합) 폴리펩티드 및 이종 (예를 들어, 재조합) 단백질의 생산을 위한 본원에 기재된 임의의 미생물의 용도를 제공하며, 여기서 이종 폴리펩티드 및 이종 단백질의 노르류신의 오혼입은 감소되거나 또는 방지된다.
본원에 기재된 아미노산 치환을 발생시키는 metA 또는 metK 대립유전자를 코딩하는 임의의 핵산 서열의 사용은 특히 본 발명의 방법에 사용하기 위해 본원에서 고려된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 제공된 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물이고, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA에서의 Y294C 아미노산 치환을 코딩하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 MetK에서의 V185E 아미노산 치환을 코딩한다. 본 발명에 의해 제공된 일부 실시양태에서, 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물이고, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA에서의 Y294C 아미노산 치환을 코딩하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 metK 대립유전자의 핵산 잔기 1132에서의 핵산 시토신의 결실을 포함한다. 다양한 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물은 박테리아이고; 다른 측면에서, 미생물은 이. 콜라이이다. 본 발명은 특히 이종 (예를 들어, 재조합) 폴리펩티드 및 이종 (예를 들어, 재조합) 단백질의 생산을 위한 본원에 기재된 임의의 미생물의 용도를 제공하며, 여기서 이종 폴리펩티드 및 이종 단백질의 노르류신의 오혼입은 감소되거나 또는 방지된다.
미생물 균주의 생산
본 발명은 폴리펩티드 및 단백질로의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하지에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하는 미생물 (예를 들어, 이. 콜라이 숙주 세포)을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 돌연변이체 metA 대립유전자 및/또는 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 및 이전에 기재된 바와 같이 대립유전자 교환 방법을 이용하여 생성되었다. (문헌 [Metcalf et al., (1994) Gene 138:1-7; 및 Bass et al., (1996) J Bacteriol 178: 1154-61] 참조; 본 명세서의 물질 및 방법 섹션 참조.) 본 발명은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포를 생산하는 수단으로 제한되지 않는다. 돌연변이체 대립유전자를 도입하거나 또는 다르게는 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 미생물 균주 (예를 들어, 박테리아, 이. 콜라이)를 생산하는 다양한 방법이 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
노르류신 오혼입의 방지 또는 감소
본 발명의 방법 및 조성물은 이종 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 생산에 적용될 수 있고, 대규모 및 소규모 단백질 또는 폴리펩티드 생산 둘 다에 이용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 특히 재조합 단백질 및 폴리펩티드의 생산을 위한, 미생물, 예컨대 예를 들어 이. 콜라이 숙주 세포의 고밀도 발효에 유용하다. 본 발명에 의해 제공된 방법 및 조성물은 단백질 및 폴리펩티드의 재조합 생산, 특히 노르류신 오혼입이 바람직하지 않은 단백질 및 폴리펩티드의 재조합 생산, 예컨대 예를 들어 다양한 연구 및 치료 용도에 사용하기 위한 재조합 단백질 및 폴리펩티드에 유용하다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 피드백-저항성 또는 피드백-비감수성 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 미생물인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 메티오닌 생산에 대해 억제해제된 미생물인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 피드백-저항성 또는 피드백-비감수성 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하는 미생물이다. 일부 실시양태에서, 메티오닌 생산에 대해 억제해제된 미생물은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물이다. 다른 실시양태에서, 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는데 사용하기 위한 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 26, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 R27C, Q64E, Y294C, I296S, 및 P298L로 이루어진 군으로부터 선택된 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 핵산 서열은 I296S 및 P298L 둘 다로 이루어진 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩한다. 아미노산 위치는 도 7a 및 서열 29에 제시된 바와 같은 야생형 MetA 아미노산 서열에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 MetK를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 MetK에서의 아미노산 치환 V185E를 코딩하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 핵산 서열은 metK 대립유전자에서의 핵산 잔기 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실을 포함한다. 아미노산 위치는 도 8a 및 서열 30에 제시된 바와 같은 야생형 MetK 아미노산 서열에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하고, 추가로 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 24의 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27의 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 24의 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 28의 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA에서의 아미노산 치환 Y294C를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 MetK에서의 아미노산 치환 V185E를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 돌연변이체 metA 대립유전자 및 metK 대립유전자를 포함하고, 돌연변이체 metA 대립유전자는 MetA에서의 아미노산 치환 Y294C를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 metK 대립유전자는 metK 대립유전자에서의 핵산 잔기 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리펩티드에서의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 아미노산 위치는 도 7a 및 서열 29에 제시된 바와 같은 야생형 MetA 아미노산 서열 및 도 8a 및 서열 30에 제시된 바와 같은 야생형 MetK 아미노산 서열에 대한 것이다.
본원에 제공된 미생물에 의해 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지하는 방법의 일부 측면에서, 미생물은 박테리아, 특히 이. 콜라이이다. 다른 측면에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 이종 단백질 또는 이종 폴리펩티드, 또는 재조합 단백질 또는 재조합 폴리펩티드이다. 예를 들어, 미생물은 미생물에 대해 이종성인 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하고; 예를 들어, 미생물은 재조합 발현 벡터를 사용하여 미생물에 대해 이종성인 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, DNA (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)일 수 있음)으로 형질전환된다. 다른 측면에서, 방법은 단백질 또는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 미생물을 배양하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물은 낮은 농도의 메티오닌을 함유하는 배양 배지에서 성장시킨다. 이어서, 단백질 또는 폴리펩티드는 회수되거나, 정제되거나 등일 수 있으며; 회수는 예를 들어 미생물의 주변세포질 또는 배양 배지로부터 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 배양은 발효기에서 일어나며, 예컨대 예를 들어 높은 세포-밀도 발효의 조건 하에 배양된다.
이종 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 핵산은 적합하게는 적합한 프로모터의 제어 하에 미생물에서의 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입된다. 다수의 벡터가 이러한 목적에 이용가능하고, 적절한 벡터의 선택은 예를 들어 벡터로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정한 미생물 숙주 세포에 의존할 것이다. 적합한 벡터는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명에 의해 제공된 방법 및 조성물은, 예컨대 예를 들어 다양한 치료, 의학, 연구 및 진단 용도에 사용하기 위한 재조합 단백질 및 폴리펩티드에서 노르류신 오혼입이 바람직하지 않은 재조합 단백질 및 폴리펩티드의 생산에 특히 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 의학 및 제약 용도를 위한 치료 항체, 예컨대 예를 들어 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 재조합 생산에 적용가능하다. 의학 및 제약 용도를 위한 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 예는 항-VEGF 항체, 항-인자 D 항체, 항-간세포 성장 인자 수용체 항체 (예를 들어, 항-MET 항체) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법 및 조성물은 또한 항체 단편의 생산에 유용하다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법, 조성물 및 미생물에 의해 제공되는 재조합 항체의 생산은 상기 기재된 미생물 (예를 들어, 박테리아 숙주 세포, 이. 콜라이)내에서의 항체 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현 및 항체 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현에 의해 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄는 전장 중쇄 및 경쇄 항체 폴리펩티드이다. 다른 측면에서, 항체 중쇄는 항체 Fab 단편 중쇄이고, 항체 경쇄는 항체 Fab 단편 경쇄이다.
본 발명의 방법 및 조성물은 또한 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체의 생산에 유용하다. 다중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 다중특이적 항체는 단백질의 2종의 상이한 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 2종의 상이한 단백질의 2종의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다. 다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)]; 국제 출원 공보 번호 WO 93/08829; [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 치료 및 연구 적용을 위한 다른 생체분자, 예컨대 예를 들어 인간 성장 호르몬 (소마트로핀), 인슐린 등의 생산에 유용하다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있는 것으로 이해된다.
물질 및 방법
박테리아 균주, 플라스미드 및 성장 조건
본원에 기재된 실시예에 사용된 박테리아 균주는 이. 콜라이 균주 W3110의 유도체이다. (문헌 [Bachmann (1972) Bacteriol Rev 36:525-557] 참조.) 항생제 선택은 모든 마커에 대해 하기 농도로 유지되었다: 카르베니실린 (플라스미드 또는 염색체), 50 μg/ml; 카나마이신 (염색체), 30 μg/ml; 테트라시클린 (플라스미드 또는 염색체), 10 μg/ml.
균주 및 플라스미드 구축
플라스미드 및 박테리아 균주 (즉, 이. 콜라이)의 구축에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기 표 1에 열거된다. 클로닝, DNA 분석, PCR 증폭, 형질전환, 전기천공, 및 P1 형질도입을 위한 표준 기술을 이용하였다. 염색체 대립유전자를 P1 형질도입에 의해 이동시켰다. metJ::KanR 대립유전자는 더 콜라이 제네틱 스톡 센터(The Coli Genetic Stock Center) (CGSC, 예일 대학교)로부터 입수한 박테리아 균주 JW3909-1로부터 유래되었다. 모든 대립유전자 대체는 PCR 분석에 의해 확인하였다.
Figure pct00001
metA 유전자를 박테리아 균주 W3110 (Bachmann (1972) Bacteriol Rev 36:525-557)로부터 프라이머 SacI-metAflank-F 및 SalI-metAflank-R을 사용하여 PCR 증폭시키고, SacI 및 SalI로 소화시키고, SacI 및 SalI 소화된 플라스미드 pS1080에 라이게이션하여 플라스미드 pS1080-metAflank를 수득하였다. 플라스미드 pS1080-metAflank(R27C), pS1080-metAflank(Q64E), pS1080-metAflank(Y294C), 및 pS1080-metAflank(I296SP298L)를 퀵체인지(QuikChange) 키트 (스트라타진(Stratagene)) 및 하기 프라이머 세트: 각각 (QC-metAR27C-F;QC-metAR27C-R), (QC-metAQ64E-F;QC-metAQ64E-R), (QC-metAY294C-F;QC-metAY294C-R) 및 (QC-metAI296SP298L-F;QC-metAI296SP298L-R)을 이용하는 플라스미드 pS1080-metAflank의 돌연변이유발에 의해 구축하였다.
metK 유전자를 박테리아 균주 W3110으로부터 프라이머 SacI-metKflank-F 및 SalI-metKflank-R을 사용하여 PCR 증폭시키고, SacI 및 SalI로 소화시키고, SacI 및 SalI 소화된 플라스미드 pS1080에 라이게이션하여 플라스미드 pS1080-metKflank를 수득하였다. 플라스미드 pS1080-metKflank(V185E) 및 pS1080-metKflank(c1132del)를 퀵체인지 키트 (스트라타진) 및 하기 프라이머 세트: 각각 (QC-metKV185E-F;QC-metKV185E-R), 및 (QC-metKc1132del-F;QC-metKc1132del-R)을 이용하는 플라스미드 pS1080-metKflank의 돌연변이유발에 의해 구축하였다.
대립유전자 교환은 이전에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다. (문헌 [Metcalf et al., (1994) Gene 138:1-7; 및 Bass et al., (1996) J Bacteriol 178: 1154-61] 참조.)
상기 언급된 바와 같이, 대립유전자 교환은 문헌 [Bass et al. (상기 문헌)]에서 변형된 바와 같은 문헌 [Metcalf et al. (상기 문헌)]에 기재된 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 공동통합물을 60E4 숙주 세포 백그라운드 또는 66H8 숙주 세포 백그라운드로 전달하였다. 수크로스 역-선택에 따라, 수크로스-저항성 콜로니를 카르베니실린 감수성에 대해 카르베니실린을 함유하는 LB 한천 및 LB 한천 플레이트 상에서의 복제 스트리킹에 의해 스크리닝하였다. 이후에, 카르베니실린-감수성 콜로니를 단리하고, 대립유전자 교환을 전체 metA 또는 metK 리딩 프레임의 PCR 증폭에 의해 확인하고, 이어서 DNA 서열분석을 수행하였다. 자살 플라스미드 벡터 pS1080은 조건적 R6Kγ 기점 및 카르베니실린 저항성 선택가능한 마커 뿐만 아니라, 수크로스 감수성을 부여하는 역-선택가능한 sacB 유전자를 함유한다.
본원에 기재된 실험에서 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드는 하기 표 2에 열거된다.
Figure pct00002
발효
이. 콜라이 숙주 균주 60E4를 항-VEGF 항체 항원 결합 (Fab) 단편의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 폴리핵산 (각각 서열 33 및 서열 34)을 함유하는 pBR322-기반 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. (각각 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함되는, 국제 출원 공보 번호 WO1998/45331 (항-VEGF 항체 Y0317); 국제 출원 공보 번호 WO2002/40697 (실시예 2, 항-VEGF 항체 Y0317의 발효 기재); 및 문헌 [Chen et al., (1999) J Mol Biol 293:865-881] (항-VEGF 항체 Y0317) 참조.)
이. 콜라이 숙주 균주 66F8을 각각 서열 48 및 서열 49의 아미노산 서열에 해당하는, 항-인자 D 항체 항원 결합 (Fab) 단편의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 폴리핵산을 함유하는 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. (각각 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함되는, 국제 출원 공보 번호 WO2009/134711 (항-인자 D 항체 번호 238-1) 및 국제 출원 공보 번호 WO2008/055206 (항-인자 D 항체 번호 111) 참조.)
이. 콜라이 숙주 균주 64B4를 각각 서열 50, 서열 51, 및 서열 52의 아미노산 서열에 해당하는, 항-MET 항체의 경쇄, 중쇄, 및 중쇄 단편을 코딩하는 폴리핵산을 함유하는 발현 플라스미드로 형질전환시켰다.
재조합 중쇄 및 경쇄 Fab 단편 폴리펩티드의 발현은 phoA 프로모터에 의해 제어되며, 배지 중의 무기 포스페이트의 고갈시에 유도가 발생한다. (문헌 [Laird et al., (2005) Protein Expr Purif 39:237-246] 참조.) 중쇄 및 경쇄 Fab 단편 폴리펩티드는 STII-신호 서열에 의해 이. 콜라이 주변세포질로의 유출에 대해 지시되고, 여기서 생성물이 어셈블리되었다. 10 L 작업 부피 (WV)에서의 높은 세포 밀도 발효를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. (문헌 [Simmons et al., (2002) J Immunol Methods 263:133-147] 참조.) 대략 200 OD550의 세포 밀도에서, 연속적 3% 메티오닌 또는 물 공급을 개시하고, 나머지 발효 공정에 걸쳐 공급하였다.
3가지 상이한 발효 공정을 숙주 세포 60E4 (발효 공정 AF1), 숙주 세포 66F8 (발효 공정 AF2), 및 숙주 세포 64B4 (발효 공정 AF3)를 사용하여 조사하였다. (하기 실시예 5 및 표 4 참조.)
정제
발효가 완료된 후에, 전세포 브로쓰를 발효기에서 <15℃로 냉각시키고, 냉각된 브로쓰를 단백질 정제를 위해 처리하였다. 1 부피의 냉각된 브로쓰를 0.06 부피의 MgSO4 (60 mM 최종 농도)와 혼합하고, 시트르산 (1 M)을 사용하여 pH 3.8까지 적정하였다. 이어서, 세포를 대략 12,000 psi에서 마이크로플루이다이저 (마이크로플루이딕스(Microfluidics), 캘리포니아주 레드우드 쇼어)를 이용하여 분쇄하고, 분쇄된 세포를 연속적으로 진탕시키면서 35℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 균질물을 차가운 정제수로 3-배 희석하고, 희석된 균질물을 4℃에서 20분 동안 고정각 로터를 이용하여 6,000xg에서 원심분리하였다. 상청액을 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하고, 1.5 M 트리스 염기를 사용하여 pH 7.5까지 적정하였다.
재조합 Fab 단백질을 다음과 같이 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 폴리-정제용 크로마토그래피 칼럼 (바이오 라드(Bio Rad))을 단백질 G 세파로스 4 패스트 플로우(Fast Flow) 수지 (지이 헬스케어(GE Healthcare))로 패킹하고, 적어도 5 칼럼 부피의 PBS, pH 7.2로 평형화시켰다. 여과된 상청액을 단백질 G 패킹된 칼럼 상에 로딩하고, PBS로 2회 세척하고, 50 mM 시트르산으로 용리하였다. 최종 Fab 단백질 풀을 1.5 M 트리스 염기를 사용하여 pH 7까지 적정하고, 하기 기재된 바와 같이 노르류신 함량에 대해 분석하였다. 이는 발효 공정 AF1을 위한 정제에 해당한다.
3가지 상이한 재조합 단백질 생성물 정제 공정이 이용되었으며, 이들은 각각 발효 공정 AF1 (숙주 세포 60E4의 경우), AF2 (숙주 세포 66F8의 경우), 또는 AF3 (숙주 세포 64B4의 경우)에 특이적이다. (하기 실시예 7 및 표 6 참조.)
아미노산 분석
세포내 메티오닌 수준을 결정하기 위해, 87.6x109개 세포를 함유하는 전세포 브로쓰 샘플을 17,000xg에서 5분 동안 4℃에서 펠릿화시키고, PBS에서 1회 세척하고, 이어서 추출 완충제 (10 mM 트리스, 5 mM EDTA, 5 mM 아이오도아세트아미드 (IAM), 0.2 mg/ml 리소자임, pH 6.8)에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 2 사이클의 음파처리에 의해 용해시킨 후에, 20분 동안 13,500 rpm에서 원심분리하여 세포 잔해물을 제거하였다. 상청액을 0.2 μm 마이크로원심분리 튜브 필터 (바이오 라드)로 전달하고, 17,000xg에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 여과물을 희석하고, 아미노산을 이전에 기재된 바와 같이 분석하였다 (Feeney et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097). 세포외 메티오닌 수준을 결정하기 위해, 3분 동안 14,000xrpm에서 원심분리한 후에 발효 동안 수집된 전세포 브로쓰로부터 제조된 상청액 샘플을 희석하고, 아미노산을 하기 기재되는 바와 같이 분석하였다. (문헌 [Feeney et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097] 참조.)
아미노산 농도를 역상 HPLC 방법을 이용하여 분석하였다. 아미노산을 함유하는 샘플을 6-아미노퀴놀릴-N-히드록시숙신이미딜 카르바메이트로 처리하여 고도의 형광 유도체를 생산하였다. (문헌 [Cohen and Michaud (1993) Anal Biochem 211:279-287] 참조.) 이용된 HPLC 검정은 하기 아미노산을 0.01 mM의 검출 한계로 검출하였다: 히스티딘, 아스파라긴, 세린, 글루타민, 아르기닌, 글리신, 아스파르테이트, 글루타메이트, 트레오닌, 알라닌, 프롤린, 오르니틴, 시스테인, 리신, 티로신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 트립토판.
포스페이트 수준
포스페이트 수준을 이전에 공개된 방법에 따라 코바스 인테그라 400(COBAS Integra 400) (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))을 이용하여 측정하였다. (문헌 [Taussky and Shorr (1953) J Biol Chem 202:675-685] 참조.)
역가 측정
전세포 브로쓰 샘플을 추출 완충제 (10 mM 트리스, 5 mM EDTA, 5 mM IAM, 0.2 mg/ml 리소자임, pH 6.8)로 6-배 희석하고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 2 라운드의 음파처리 후에, 샘플을 17,000xg에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 생성물 역가를 상청액으로터 HPLC를 사용하여 결정하였다.
적분 OD 550 측정
적분 OD550을 하기 식을 사용하는 사다리꼴 적분을 이용하여 결정하였다:
Figure pct00003
상기 식에서,
j = 배양 시점에서 또는 배양 시점 24시간 후에 수행된 제1 측정의 인덱스; k = 수행된 OD550 측정의 전체 수; ti = 측정 i에서 경과된 배양 시간(시간); OD550,i = 측정 i에서의 OD550.
노르류신 분석
노르류신 함량의 분석을 위해, 정제된 재조합 단백질 샘플을 이전에 기재된 방법에 기초하여 트립신 분해에 적용하였다. (문헌 [Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290] 참조.) 펩티드 맵 분석을 이전에 기재된 바와 같이 역상 HPLC 및 온라인 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광측정법 (LC/MS)을 이용하여 수행하였다. (문헌 [Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290; 및 Yu et al., (2011) Anal Chem 83:5912-5919] 참조.) 고해상도 질량 결정을 m/z 400에서 60,000으로 해상도 설정된 완전-MS 측량 스캔에 이어 관심 이온에 대한 이온 트랩 MS2 스캔을 이용하여 LTQ-오비트랩 XL(LTQ-Orbitrap XL) 기기 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 산 호세)에서 수행하였다. 폴리펩티드 내의 노르류신의 상대 수준을 결정하기 위해, 단일동위원소 m/z ± 10 ppm의 추출 윈도우에서 가장 풍부한 하전 상태를 이용하여 메티오닌-함유 및 노르류신-함유 펩티드 둘 다에 대한 추출된 이온 크로마토그램을 생성하였다. 메티오닌-함유 종에 비한 노르류신-함유 종의 상대량을 각각의 적분된 피크 면적을 이용하여 계산하였다.
웨스턴 블롯
발효 동안 수득한 전세포 브로쓰 샘플을 추출 완충제 (10 mM 트리스, 5 mM EDTA, 5 mM IAM, 0.2 mg/ml 리소자임, pH 6.8)로 6-배 희석하고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 2 라운드의 음파처리 후에, 샘플을 17,000xg에서 25분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 샘플을 비-환원 조건 하에 4-12% 트리스-글리신 겔 상에 로딩하였다. 단백질을 아이블롯 블롯팅 시스템(iBlot Blotting System) (인비트로젠(Invitrogen))을 이용하여 니트로셀룰로스 막으로 전달하였다. 막을 NET 완충제 (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM 트리스, 0.05% 트리톤X-100) 중에서 0.5% 겔라틴으로 30분 동안 차단하고, 이어서 차단 완충제 중에서 인간 IgG Fab (MP 바이오메디컬(MP Biomedical))에 대해 퍼옥시다제 접합된 염소 IgG 분획을 1:300,000 희석하여 인큐베이션하였다. NET 완충제로 3회 세척한 후에, 블롯을 X선 필름 상에서 웨스턴 라이트닝 ECL 기질(Western Lightning ECL Substrate) (퍼킨엘머(PerkinElmer))을 사용하여 5초 노출 후에 시각화하였다.
실시예 1. 이. 콜라이 발효 동안 노르류신 오혼입
상기 기재된 바와 같이, 노르류신 오혼입은 종종 이. 콜라이에서의 재조합 단백질 생산 동안 발생한다. 재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입의 범위는 여러 요인, 예컨대 예를 들어 재조합 단백질의 특성, 사용되는 발효 공정, 및 발효 배지의 함량에 따라 달라진다. (예를 들어, 문헌 [Bogosian et al., (1989) Biol Chem 264:531-539] 참조.)
재조합 단백질 발현 발효 공정에서의 노르류신 오혼입을 조사하기 위해, 하기 연구를 수행하였다. 이. 콜라이 숙주 균주 60E4를 Fab 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 서열 (각각 서열 31 및 서열 32)을 함유하는 플라스미드로 형질전환시키고, 상기 기재된 방법에 따라 물 공급 또는 메티오닌 공급을 이용하여 후속 발효 연구에 사용하였다. 이어서, 발현된 재조합 단백질을 상기 기재된 방법을 이용하여 노르류신 함량에 대해 분석하였다.
하기 표 3에서 나타난 바와 같이, 연속적 메티오닌 공급의 부재 하 (즉, 물 공급)의 이. 콜라이 숙주 세포 60E4에서 발현된 각각의 재조합 폴리펩티드에서 대략 5-10% 노르류신 오혼입이 관찰되었다. 예상한 바와 같이, 연속적 메티오닌 공급의 부재 하에, 발현된 재조합 폴리펩티드에서 노르류신은 검출되지 않았다 (ND).
Figure pct00004
이러한 결과는 노르류신 오혼입이 메티오닌 공급의 부재 하의 박테리아에서의 재조합 단백질 생산에서 일어난다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 메티오닌 생합성 경로 돌연변이체 이. 콜라이 숙주 세포의 구축
상기 언급된 바와 같이, 재조합 단백질 발효 동안 메티오닌의 연속적 공급이 종종 노르류신 오혼입을 방지하는데 이용된다. 실시예 1에서 상기에 나타난 바와 같이, 연속적 메티오닌 공급은 숙주 세포가 충분한 메티오닌을 이용할 수 있도록 보장하여, 재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입을 감소시키거나 또는 방지한다. 돌연변이체 metA 및/또는 metK 대립유전자를 함유하는 이. 콜라이 숙주 세포를 사용하는 것이 노르류신 오혼입에 미치는 효과를 조사하기 위해, 연속적 메티오닌 공급을 이용하는 대신, 하기 연구를 수행하였다.
본 연구에서, 피드백-저항성 MetA를 발생시키는, 돌연변이 R27C, Q64E, Y294C, I296S, 및 P298L을 함유하는 metA 대립유전자를, 대립유전자 교환 방법 (상기 물질 및 방법 참조)을 이용하여 60E4 숙주 세포에 도입시켜 각각 박테리아 숙주 세포 균주 66H6 (60E4 metA(R27C)), 66H8 (60E4 metA(Y294C)), 67B8 (60E4 metA(Q64E)), 및 67B9 (60E4 metA(I296S P298L))를 수득하였다 (상기 표 2 및 3 참조.)
MetK 효소의 부분적 기능-상실을 발행시키는, 돌연변이 V185E 및 c1132del (metK 유전자에서 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실)을 함유하는 metK 대립유전자를, 대립유전자 교환 방법 (상기 물질 및 방법 참조)을 이용하여 66H8 (60E4 metA(Y294C)) 숙주 세포에 도입시켜 가각 박테리아 숙주 세포 균주 67C2 (66H8 metK(V185E)) 및 67C3 (66H8 metK(c1132del))를 수득하였다. (상기 표 2 및 3 참조.)
이러한 이. 콜라이 숙주 세포를 연속적 메티오닌 공급 없이 수행된 발효 공정에서의 재조합 단백질 생산 동안 노르류신 오혼입에 대해 평가하였다. (하기 실시예 3 참조.)
실시예 3. 발효 결과
연속적 메티오닌 공급이 없는 소규모 발효 (10 L)를 본 연구에서 구축된 메티오닌 생합성 경로 돌연변이체 박테리아 균주를 사용하여 수행하였다. (표 1 참조.) 메티오닌 공급은 물 공급 또는 공급 없음으로 대체되어, 이들 실험에서 발효 공정 동안 사용되었다. 3가지 10 L 발효를 다음과 같이 대조 숙주 세포 균주 60E4를 사용하여 수행하였다: 1) 연속적 메티오닌 공급, 2) 연속적 물 공급, 및 3) 공급 없음.
OD550에 의해 모니터링된 바와 같은 세포 성장에 대한 발효물 경향이 도 12a에 제시된다. 공급물 (메티오닌, 물, 또는 공급 없음)의 특성에 관계없이, 메티오닌 생합성 경로 돌연변이체 박테리아 숙주 세포 60E4 metA(R27C), 60E4 metA(Y294C), 60E4 metA(Y294C) metK(V185E), 및 60E4 metA(Y294C) metK(c1132del)의 성장은 발효 (5-28시간)의 성장 단계 동안 대조 숙주 세포에서 관찰된 것과 대등하였다. 그러나, 이중 돌연변이체 숙주 세포 60E4 metA(Y294C) metK(V185E), 및 60E4 metA(Y294C) metK(c1132del)는 대조 숙주 세포 발효에서 관찰된 것에 비해 보다 낮은 iOD550 (24시간에서부터 발효 종료까지 성장 곡선 아래 면적)를 가졌다. (도 12b 참조.) 숙주 세포 60E4 및 60E4 metA(Y294C)를 사용하여 물 공급 하에 수행된 발효는 각각 메티오닌 공급 하에 수행된 대조 숙주 세포 발효 및 공급 없음 하에 수행된 60E4 metA(Y294C) 숙주 세포 발효에서 관찰된 것에 비해 약간 더 높은 iOD550을 가졌다. 돌연변이체 세포 60E4 △metJ::kanR 및 60E4 metA(I296S P298L)는 보다 긴 적응 단계를 가졌으며, 그 결과 대조 숙주 세포 발효에서 관찰된 것에 비해 보다 낮은 iOD550을 가졌다. (도 12a 및 12b 참조.) 돌연변이체 숙주 세포 60E4 metA(Q64E)는 발효기에서 잘 성장하지 않아서, 150의 최대 OD550에 도달하였으며, 이는 다른 돌연변이체 숙주 세포를 사용한 발효에서 관찰된 최대 OD550에 비해 대략 30-40% 더 낮은 것이다. (도 12a 참조.) 20시간 후에, 돌연변이체 숙주 세포 60E4 metA(Q64E)의 성장이 포화에 도달하였고, 그 결과 이러한 돌연변이체 숙주 세포를 사용한 발효는 가장 낮은 iOD550을 가졌다. (도 12a 및 12b 참조.)
발효 동안 메티오닌 공급의 존재 또는 부재는 60E4 숙주 세포의 성장에 영향을 미치지 않았다. (도 12c 참조.)
메티오닌 생합성 경로 돌연변이체를 사용하는 발효는 대조 숙주 세포 발효에서 관찰된 것에 비해 생체내 (즉, 세포내) 및 세포외 배지 둘 다에서 보다 높은 수준의 메티오닌을 축적시켰다. (도 13a, 13b, 14a, 및 14b 참조.) 발효 공정의 시작 시에, 발효 배지에 과량의 메티오닌 (>3 mM)이 존재한다. 세포가 성장하기 시작하면, 이들은 단백질 합성, 메틸 공여자 역할, 및 다른 기능을 위해 메티오닌을 흡수한다. 그 결과, 세포가 계속 성장함에 따라 세포외 메티오닌 농도는 점진적으로 감소하고, 세포외 메티오닌 수준은 대략 16시간에 검출가능한 수준 (<10 μM) 미만의 수준에 도달한다. (도 13a 및 14a 참조.)
16시간에, 세포내 메티오닌 농도는 상이한 숙주 사이에서 0.5-2.5 mM 범위 (농도는 세포 부피에 기초함) 내에서 변화한다. (도 13b 및 14b 참조.) 이러한 높은 세포내 메티오닌 농도에서, 야생형 MetA는 강하게 억제될 것이나; 피드백 저항성 MetA 돌연변이체는 단지 약하게 억제될 수 있으며, 이에 따라 돌연변이체 숙주 세포가 생합성 경로를 통해 메티오닌을 생산하도록 허용한다. (문헌 [Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234] 참조.) 그러나, 세포내 메티오닌 수준은 약 28시간까지 계속 감소하며, 이 시점에서 세포 성장은 상당히 느려졌다. 발효의 박테리아 성장 단계 (5-28시간) 동안, 단백질 합성 및 다른 세포 기능을 위해 메티오닌이 사용되는 속도가 생체내에서 메티오닌이 합성되는 속도를 초과할 수 있는 것이 가능하다. 이는 성장 단계 종료까지 세포내 메티오닌 수준의 점진적 감소를 설명할 수 있다.
발효의 재조합 단백질 생산 단계 (발효 종료까지 28시간) 동안, 메티오닌 과다생산 숙주 세포는 생체내에서 메티오닌을 계속 합성하고, 발효 공정의 이러한 단계 동안 세포내 메티오닌 수준이 계속 증가한다. (도 13b 및 14b 참조.) 이러한 결과는 발효의 재조합 단백질 생산 단계 동안, 메티오닌 생합성 속도가 다양한 세포내 기능을 위해 메티오닌이 사용되는 속도를 초과한다는 것을 시사한다.
연속적 물 공급 하에 수행된 대조 숙주 세포 발효 동안, 세포외 및 세포내 메티오닌 수준은 둘 다 계속 감소하여, 세포외 메티오닌의 경우에는 약 16시간 및 세포내 메티오닌의 경우에는 약 24시간에 검정의 검출 한계 (10 μM) 미만의 수준에 도달하였다. 연속적 메티오닌 공급 하에 수행된 대조 숙주 발효에서, 공급은 공급이 개시되는 시점인 대략 26시간 후에 세포에 과량의 메티오닌이 존재하도록 한다. 발효의 생산 단계 동안, 이중 돌연변이체 숙주 세포 60E4 metA(Y294C) metK(V185E)는 연속적 메티오닌 공급 하에 수행된 대조 숙주 세포 발효에서 관찰된 것에 비해 보다 많은 세포내 메티오닌을 축적시켰다.
대조 숙주 세포에서 관찰된 것에 비해 숙주 세포 60E4 metA(I296S P298L) 및 60E4 △metJ::kanR의 보다 긴 적응 단계 및 숙주 세포 60E4 metA(Q64E)의 부족한 성장은 잠재적으로 메티오닌 생합성 경로에서 독성 중간체인 호모시스테인의 높은 수준의 축적으로 인한 것일 수 있다. (문헌 [Roe et al., (2002) Microbiology 148:2215-2222] 참조; 도 12a 참조.) 이소류신 생합성 경로의 제1 단계에 관련된 효소인 트레오닌 데아미나제를 억제하여 성장 억제를 일으킨다는 것이 이전에 입증되었다. (문헌 [Tuite et al., (2005) J Bacteriol 187:4362-4371] 참조.) 이는 돌연변이체 숙주 세포에서 세포내 이소류신 수준을 측정함으로써 조사하였다. 분석은 세포내 이소류신 수준이 발효 동안 대조 숙주 세포에서 관찰된 것과 대등하였다는 것을 보여주었다 (데이터는 제시되지 않음). 호모시스테인이 세포 성장에 대해 다른 독성 영향을 미칠 가능성을 완전히 배제할 수는 없다. 그러나, 이 시점에서, 돌연변이체 사이에서 성장에 있어서의 이러한 차이는 완전하게 이해되지 않는다.
시간 경과에 따른 단백질 생성물 역가 및 웨스턴 블롯 데이터는 도 16a, 16b, 및 17에 제시된다. 숙주 세포 60E4 metA(Q64E)를 접종한 발효는 다른 숙주 세포에서 관찰된 것보다 적은 생성물을 생산하였다. 45-50시간의 짧은 기간을 제외하고, 포스페이트 수준은 60E4 metA(Q64E) 숙주 발효 동안 전혀 고갈되지 않았으며 (도 15); 따라서 재조합 단백질 합성이 낮았다. 돌연변이체 숙주 세포 60E4 metA(I296S P298L) 및 60E4 △metJ::kanR의 연장된 적응 단계는 40시간 후 (통상적으로 관찰되는 것보다 약 12시간 뒤임)에 포스페이트 고갈을 발생시켰으며, 따라서 이러한 숙주 세포를 사용한 발효는 먼저 포스페이트가 고갈된 다른 돌연변이체 숙주 세포에서 관찰된 것에 비해 보다 낮은 단백질 생성물 역가를 가졌다. (도 12a, 15 및 16a 참조.) 숙주 세포 60E4 metA(R27C) 및 60E4 metA(Y294C)를 사용하는 발효는 조사된 모든 돌연변이체 숙주 세포 중에서 가장 높은 단백질 생성물 역가를 생성하였다.
metA metK 이중 돌연변이체 숙주 세포, 60E4 metA(Y294C) metK(V185E) 및 60E4 metA(Y294C) metK(c1132del)를 사용한 발효는 대조군 숙주 세포와 대등한 성장을 가짐에도 불구하고 다소 낮은 단백질 생성물 역가를 생성하였다. 이러한 이중 돌연변이체 숙주 세포는 MetK의 부분적 기능-상실을 발생시키는 metK 유전자의 돌연변이를 갖는다. MetK의 생성물은 s-아데노실메티오닌 (SAM)으로, 이는 박테리아 세포에서 수많은 반응에서의 메틸 공여자이다. 그러나, 감소된 SAM 수준이 단백질 생성물 역가에 영향을 미치는 이유는 알려져 있지 않다. 발효 공정 동안 연속적 공급은 배양 배지를 희석시킬 수 있고, 이는 아마도 보다 낮은 세포 밀도를 발생시킬 것이며 생성물 역가를 낮출 가능성이 있다. 어떠한 공급도 없는 숙주 세포 60E4 metA(Y294C) 발효에서의 성장 및 역가는 연속적 물 공급 하에 수행된 동일한 숙주 세포를 사용한 발효에서 관찰된 것과 대등하였다.
실시예 4. 노르류신 오혼입
상기 기재된 바와 같이, 세포 중의 메티오닌의 수준으로 인한 단백질에서의 노르류신 오혼입은 노르류신이 단백질 합성 동안 메티오닐 tRNA의 충전에서 메티오닌 잔기와 경쟁할 수 있도록 충분히 낮다. 상기 실시예 1에 제시된 바와 같이, 메티오닌 공급 없이 수행된 대조 숙주 세포 발효는 재조합 단백질에서 높은 수준의 노르류신 오혼입을 발생시켰다 (표 3). 메티오닌 공급 없이 수행된 대조 숙주 세포 발효의 생산 단계 동안 낮은 세포내 메티오닌 수준은 노르류신 잔기가 재조합 단백질에서 메티오닌 잔기와 경쟁할 수 있다는 것을 나타내었다. 그러나, 돌연변이체 숙주 세포 발효의 생산 단계 동안에서는 높은 수준의 세포외 및 세포내 메티오닌이 관찰되었다. (도 13b 및 14b 참조.) 상승된 세포내 메티오닌 수준의 결과로서, 이러한 숙주 세포 발효를 이용할 때 노르류신 오혼입은 최소가 되거나 또는 제거될 것으로 예상된다.
재조합 단백질의 트립신 소화는 2개의 메티오닌 함유 펩티드를 생성하였다: 펩티드 1: LSCAASGYDFTHYGM 34 NWVR (서열 35); 및 펩티드 2: STAYLQM 83 NSLR (서열 36). 펩티드 맵 분석은 메티오닌 공급 없이 수행된 대조 숙주 세포 발효에서 메티오닌 함유 펩티드 둘 다에 높은 수준의 노르류신이 축적된 반면, 돌연변이체 숙주 세포 발효로부터 정제된 재조합 단백질 풀은 검출가능한 수준 미만의 노르류신 오혼입을 함유하였다는 것을 나타내었다. (표 3 참조.) 이러한 결과는 본 발명의 이. 콜라이 숙주 세포 균주의 사용이 이종 (예를 들어, 재조합) 폴리펩티드로의 노르류신 혼입을 감소시키거나 또는 방지한다는 것을 보여주었다.
실시예 5. 추가 박테리아 숙주 세포
숙주 세포 60E4 또는 60E4로부터 유래된 숙주 세포를 사용하여 수행된 실험 뿐만 아니라, 2가지 다른 박테리아 숙주 세포를 개발하고, 다음과 같이 성장, 노르류신 오혼입, 및 재조합 단백질 생산에 대해 조사하였다.
박테리아 숙주 세포 66F8 및 64B4 (뿐만 아니라 박테리아 숙주 세포 60E4)는 표 2에서 상기에 기재되어 있다. 표 2에서 나타난 바와 같이, 숙주 세포 66F8 및 64B4 (유사한 유전자형을 공유함)와 비교하여 숙주 세포 60E4의 유전자형에 몇몇 차이가 존재한다.
숙주 세포 60E4 (발효 공정 AF1), 숙주 세포 66F8 (발효 공정 AF2), 및 숙주 세포 64B4 (발효 공정 AF3)를 사용하는 3가지 상이한 발효 공정을 조사하였다. 하기 표 4는 조사된 각각의 발효 공정 (AF1, AF2, 및 AF3)의 다양한 발효 파라미터 (pH, 교반, 배양 지속시간, 및 공급 시작 시간)의 차이를 보여준다.
Figure pct00005
metA(Y294C) 대립유전자를 숙주 세포 60E4에 대해 실시예 1에서 상기 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 숙주 세포 66F8 및 64B4에 도입하였다. 각각 발효 공정 AF2 및 AF3을 이용하여 66F8 metA(Y294C) 및 64B4 metA(Y294C)를 사용하여 수행된 발효는 그의 모 숙주 세포에서 관찰된 것과 대등한 숙주 세포 성장을 보여주었다. (도 19a 및 19b; 및 하기 표 5 참조.)
실시예 6. 이. 콜라이 숙주 세포 성장 속도 및 재조합 단백질 생성물 수율의 비교
성장 속도 및 재조합 단백질 생성물 수율을 각각 발효 공정 AF1, AF2, AF3을 이용하는 각각의 이. 콜라이 숙주 균주 60E4 metA(Y294C), 66F8 metA(Y294C), 및 64B4 metA(Y294C)에서 조사하였다. 10L 발효는 각각의 발효 공정에 대해 표 4에서 상기 개략된 바와 같은 발효 공정 변형을 이용하여, 균주 60E4의 숙주 세포에 대해 실시예 3에서 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
균주 60E4의 다양한 숙주 세포에서 관찰된 성장 속도 및 재조합 단백질 생성물 수율은 실시예 3에서 상기에 상세하게 논의된다.
도 20a, 20b, 및 20c에서 나타난 바와 같이, 숙주 균주 60E4 metA(Y294C), 66F8 metA(Y294C), 및 64B4 metA(Y294C)를 사용하여 수득한 재조합 단백질 생성물 수율은 숙주 균주 60E4, 66F8, 및 64B4를 사용하여 관찰된 것과 대등하였다. (또한, 하기 표 5 참조.) 메티오닌 공급의 존재 또는 부재는 60E4 숙주 세포 발효로부터 수득한 재조합 단백질 수율에 영향을 미치지 않았다.
Figure pct00006
실시예 7. 노르류신 오혼입의 비교
3가지 상이한 재조합 단백질 생성물 정제 공정을 이용하였으며, 이들은 각각 발효 공정 AF1 (숙주 세포 60E4의 경우), AF2 (숙주 세포 66F8의 경우), 및 AF3 (숙주 세포 64B4의 경우)에 특이적이다. 하기 표 6은 조사된 각각의 발효 공정 (즉, AF1, AF2, 및 AF3)에 이용된 다양한 정제 공정의 차이를 보여준다.
Figure pct00007
노르류신 정량화를 상기 기재된 바와 같이 각각의 재조합 단백질 생성물에 대한 트립신 펩티드 상에서 LC-MS 분석을 이용하여 수행하였다.
60E4 숙주에 의해 생산된 재조합 단백질의 트립신 소화는 2개의 메티오닌-함유 펩티드를 생성하였다 (표 7). 66F8 숙주에 의해 생산된 재조합 단백질의 트립신 소화는 3개의 메티오닌-함유 펩티드를 생성하였다 (표 8). 64B4 숙주에 의해 생산된 재조합 단백질의 트립신 소화는 6개의 메티오닌-함유 펩티드를 생성하였다 (표 9).
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
60E4 숙주를 사용하여 메티오닌 공급 없이 수행된 AF1 발효 공정으로부터 정제된 재조합 단백질에서 이 단백질 내의 2개의 메티오닌 잔기에 5.1% 및 10% 노르류신이 축적되었다 (표 7). 숙주 60E4 metA ( Y294C ) (표 7), 60E4 metA ( R27C ), 60E4 metA ( Y294C ) metK ( V185E ), 및 60E4 metA ( Y294C ) metK(c1132del)를 사용하여 메티오닌 공급 없이 수행된 AF1 발효로부터 정제된 재조합 단백질에서는 노르류신이 검출되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
60E4 metA ( Y294C ) 숙주 발효에서 발효 배지에 노르류신 (0.15 mM 최종 농도)을 보충하였을 때, 재조합 단백질에서 노르류신이 관찰되지 않았으며, 이는 본 발명의 박테리아 숙주 세포가 재조합 단백질 합성 동안 노르류신 오혼입을 방지하기에 충분한 메티오닌을 세포에서 만든다는 것을 나타낸다.
66F8 숙주를 사용하여 메티오닌 공급 없이 수행된 AF2 발효 공정을 이용하여 생산된 재조합 단백질로부터 수득한 3개의 메티오닌-함유 트립신 펩티드에서 약 2.7%, 0.7%, 및 1% 노르류신 오혼입이 관찰되었다. (표 8 참조.) 유사하게, 64B4 숙주를 사용하여 met 공급 없이 수행된 AF3 공정을 이용하여 생산된 재조합 단백질로부터 수득한 6개의 메티오닌-함유 트립신 펩티드에 약 1.3%, 1.3%, 2.4%, 2.2%, 1.5%, 및 1.3% 노르류신 오혼입이 존재하였다. (표 9 참조.) 그러나, 각각 66F8 metA(Y294C) 숙주 및 64B4 metA(Y294C) 숙주를 사용하는 AF2 및 AF3 발효 공정으로부터 정제된 재조합 단백질에서는 노르류신이 검출되지 않았다. (상기 표 8 및 9 참조.)
트립신 펩티드 맵 분석은 메티오닌 공급 없이 수행된 대조 숙주 세포 발효에서 메티오닌-함유 펩티드에 높은 수준의 노르류신이 축적된 반면, 돌연변이체 숙주 세포 발효로부터 정제된 재조합 단백질 풀은 검출가능한 수준 미만의 노르류신 오혼입을 함유하였다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명의 이. 콜라이 숙주 세포 균주의 사용이 이종 (예를 들어, 재조합) 폴리펩티드로의 노르류신 혼입을 감소시키거나 또는 방지한다는 것을 보여주었다.
상기 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREVENTING NORLEUCINE MISINCORPORATION INTO PROTEINS <130> P4967R1-WO <140> <141> <150> 61/777,700 <151> 2013-03-12 <150> 61/703,142 <151> 2012-09-19 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 cacacgagct cctcattttg ctcattaacg ttgg 34 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 cacacgtcga cgcgaatgga agctg 25 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 cacacgagct cgtatgcaaa gcagagatgc 30 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 4 cacacgtcga ccgtcattgc cttgtttg 28 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> 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gaccaaattt ctgatgccgt tttagacgcg atcctcgaac aggatccgaa agcacgcgtt 120 gcttgcgaaa cctacgtaaa aaccggcatg gttttagttg gcggcgaaat caccaccagc 180 gcctgggtag acatcgaaga gatcacccgt aacaccgttc gcgaaattgg ctatgtgcat 240 tccgacatgg gctttgacgc taactcctgt gcggttctga gcgctatcgg caaacagtct 300 cctgacatca accagggcgt tgaccgtgcc gatccgctgg aacagggcgc gggtgaccag 360 ggtctgatgt ttggctacgc aactaatgaa accgacgtgc tgatgccagc acctatcacc 420 tatgcacacc gtctggtaca gcgtcaggct gaagtgcgta aaaacggcac tctgccgtgg 480 ctgcgcccgg acgcgaaaag ccaggtgact tttcagtatg acgacggcaa aatcgttggt 540 atcgatgctg tcgtgctttc cactcagcac tctgaagaga tcgaccagaa atcgctgcaa 600 gaagcggtaa tggaagagat catcaagcca attctgcccg ctgaatggct gacttctgcc 660 accaaattct tcatcaaccc gaccggtcgt ttcgttatcg gtggcccaat gggtgactgc 720 ggtctgactg gtcgtaaaat tatcgttgat acctacggcg gcatggcgcg tcacggtggc 780 ggtgcattct ctggtaaaga tccatcaaaa gtggaccgtt ccgcagccta cgcagcacgt 840 tatgtcgcga aaaacatcgt tgctgctggc ctggccgatc gttgtgaaat tcaggtttcc 900 tacgcaatcg gcgtggctga accgacctcc atcatggtag aaactttcgg tactgagaaa 960 gtgccttctg aacaactgac cctgctggta cgtgagttct tcgacctgcg cccatacggt 1020 ctgattcaga tgctggatct gctgcacccg atctacaaag aaaccgcagc atacggtcac 1080 tttggtcgtg aacatttccc gtgggaaaaa accgacaaag cgcagctgct gcgcgatgct 1140 gccggtctga agtaa 1155 <210> 33 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 33 gatatccagt tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgca gcgcaagtca ggatattagc aactatttaa actggtatca acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaaagtact gatttacttc acctcctctc tccactctgg agtcccttct 180 cgcttctctg gatccggttc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagcca 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcaacag tatagcaccg tgccgtggac gtttggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgct tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 34 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 34 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggcta cgacttcacg cactacggta tgaactgggt ccgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg ggttggatgg attaacacct ataccggtga accgacctat 180 gctgcggatt tcaaacgtcg tttcactttt tctttagaca cctccaaaag cacagcatac 240 ctgcagatga acagcctgcg cgctgaggac actgccgtct attactgtgc aaagtacccg 300 tactattatg ggacgagcca ctggtatttc gacgtctggg gtcaaggaac cctggtcacc 360 gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt cgacaagaaa 660 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac ctc 693 <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 35 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 15 Trp Val Arg <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 36 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 37 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg 1 5 10 15 <210> 38 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 38 Gln Ala Pro 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Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 47 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 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85 90 95 Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 51 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 52 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225

Claims (36)

  1. 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키기에 충분한 정도 또는 범위로 메티오닌을 생산하는 돌연변이체 미생물인, 단백질 또는 폴리펩티드로의 노르류신 오혼입을 방지하거나 또는 감소시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 미생물이 박테리아인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 미생물이 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 미생물이 피드백-저항성 또는 피드백-비감수성 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 미생물인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 미생물이 메티오닌 생산에 대해 억제해제되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 미생물이 돌연변이체 metA 대립유전자, 돌연변이체 metK 대립유전자, 또는 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 미생물에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 배양 배지에 외인성으로 첨가되는 메티오닌의 부재 하에 또는 메티오닌 공급 없이 수행하는 것인 방법.
  8. 돌연변이체 metA 대립유전자, 돌연변이체 metK 대립유전자, 또는 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 미생물이 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 아미노산 위치 27에서의 아르기닌에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 64에서의 글루타민에서 글루탐산으로의 치환, 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환, 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환, 및 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환 및 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 미생물이 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인 미생물.
  11. 제8항에 있어서, 돌연변이체 metK 대립유전자가 아미노산 위치 185에서의 발린에서 글루탐산으로의 치환을 포함하는 MetK에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열 또는 metK 대립유전자의 핵산 잔기 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 것인 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 미생물이 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하며, 여기서 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인 미생물.
  13. 제8항에 있어서, 미생물이 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 아미노산 위치 27에서의 아르기닌에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 64에서의 글루타민에서 글루탐산으로의 치환, 아미노산 위치 294에서의 티로신에서 시스테인으로의 치환, 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환, 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환, 및 아미노산 위치 296에서의 이소류신에서 세린으로의 치환 및 아미노산 위치 298에서의 프롤린에서 류신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 MetA에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 추가로 돌연변이체 metK 대립유전자는 아미노산 위치 185에서의 발린에서 글루탐산으로의 치환을 포함하는 MetK에서의 아미노산 치환을 코딩하는 핵산 서열 또는 metK 대립유전자의 핵산 잔기 위치 1132에서의 시토신 염기의 결실을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 것인 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 미생물이 돌연변이체 metA 대립유전자를 포함하며, 여기서 돌연변이체 metA 대립유전자는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하고, 추가로 미생물이 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하며, 여기서 돌연변이체 metK 대립유전자는 서열 27 및 서열 28로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인 미생물.
  15. 제8항에 있어서, 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 미생물.
  16. 제15항에 있어서, 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산이 서열 46의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 47의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산인 미생물.
  17. 제15항에 있어서, 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산이 서열 33을 포함하는 핵산 서열 및 서열 34를 포함하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 미생물.
  18. 제8항에 있어서, 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 미생물.
  19. 제18항에 있어서, 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 코딩하는 핵산이 서열 48의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 49의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산인 미생물.
  20. 제8항에 있어서, 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 미생물.
  21. 제20항에 있어서, 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 코딩하는 핵산이 서열 50의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 서열 51의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 및 서열 52의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 미생물.
  22. 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 단백질 또는 폴리펩티드의 발현을 허용하는데 적합한 배양 조건 하에 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현시켜 노르류신 오혼입이 없는 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함하며, 여기서 박테리아 숙주 세포는 돌연변이체 metA 대립유전자, 돌연변이체 metK 대립유전자, 또는 돌연변이체 metA 대립유전자 및 돌연변이체 metK 대립유전자를 포함하는 것인, 박테리아 숙주 세포에서 노르류신 오혼입이 없는 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 박테리아 숙주 세포가 제9항의 미생물, 제10항의 미생물, 제11항의 미생물, 제12항의 미생물, 제13항의 미생물 및 제14항의 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 단백질 또는 폴리펩티드가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 단백질 또는 폴리펩티드가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산이 서열 46의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 47의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편을 코딩하는 핵산이 서열 33을 포함하는 핵산 서열 및 서열 34를 포함하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제24항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편을 코딩하는 핵산이 서열 48의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 서열 49의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산인 방법.
  31. 제24항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편을 코딩하는 핵산이 서열 50의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 서열 51의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 및 서열 52의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제22항에 있어서, 박테리아 숙주 세포에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 배양 배지에 외인성으로 첨가되는 메티오닌의 부재 하에 또는 메티오닌 공급 없이 수행하는 것인 방법.
  34. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따라 생산된 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체 단편.
  35. 제29항 또는 제30항의 방법에 따라 생산된 항-인자 D 항체 또는 항-인자 D 항체 단편.
  36. 제31항 또는 제32항의 방법에 따라 생산된 항-MET 항체 또는 항-MET 항체 단편.
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