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KR20150033649A - 메티오닌의 발효적 생산을 위한 재조합 미생물 - Google Patents

메티오닌의 발효적 생산을 위한 재조합 미생물 Download PDF

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KR20150033649A
KR20150033649A KR1020157000939A KR20157000939A KR20150033649A KR 20150033649 A KR20150033649 A KR 20150033649A KR 1020157000939 A KR1020157000939 A KR 1020157000939A KR 20157000939 A KR20157000939 A KR 20157000939A KR 20150033649 A KR20150033649 A KR 20150033649A
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Abstract

본 발명은, 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제 MetE의 활성이 감쇠되는, 메티오닌의 발효적 생산에 최적화된 재조합 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 발효에 의한 메티오닌의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

메티오닌의 발효적 생산을 위한 재조합 미생물{RECOMBINANT MICROORGANISM FOR THE FERMENTATIVE PRODUCTION OF METHIONINE}
본 발명은, 메티오닌의 생산을 위한 재조합 미생물, 및 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 내에서 재조합 미생물을 배양함으로써 메티오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 미생물은 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제의 활성의 감쇠에 의해 메티오닌/탄소 공급원 수율이 증가되는 방식으로 변형된다. 구체적으로, 유전자 metE가 재조합 미생물에서 결실된다.
황 함유 화합물 예컨대 시스테인, 호모시스테인, 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌은 세포 대사에 결정적이고, 식품 또는 사료 첨가제 및 의약으로 사용되도록 산업적으로 생산된다. 특히 동물에 의해 합성될 수 없는 필수 아미노산인 메티오닌은 많은 신체 기능에서 중요한 역할을 담당한다. 단백질 생합성에서 그의 역할과 별도로, 메티오닌은 트란스메틸화 및 셀레늄 및 아연의 생체이용가능성에 관련된다. 메티오닌은 또한 알레르기 및 류마티스성 열과 같은 장애를 위한 치료에도 직접 사용된다. 그럼에도 불구하고, 생산되는 메티오닌의 대부분은 동물 사료에 첨가된다.
BSE 및 조류 독감의 결과로서 동물 유래 단백질의 사용이 감소되면서, 순수 메티오닌에 대한 수요가 증가되었다. 흔히, D,L-메티오닌이 아크롤레인, 메틸 메르캅탄 및 시안화수소로부터 화학적으로 생산된다. 그러나, 라세미 혼합물은 순수 L-메티오닌만큼의 성능이 없다(문헌[Saunderson, 1985]). 또한, 순수 L-메티오닌이 예컨대, N-아세틸-D,L-메티오닌의 아실라제 처리를 통해 라세미 메티오닌으로부터 생성될 수 있음에도 불구하고, 이는 생산 비용을 극적으로 증가시킨다. 이에 따라, 환경적 관심과 결부된 순수 L-메티오닌에 대한 증가되는 수요가 메티오닌의 미생물 생산을 매력적인 전망으로 만든다.
미생물로부터의 화학물질의 생산의 최적화는 통상적으로 생합성 경로에 관련된 단백질의 과발현, 생합성 경로의 억제에 관련된 단백질의 감쇠, 또는 원치 않는 부산물의 생산에 관련된 단백질의 감쇠에 관련된다. 미생물에서 L-메티오닌 생산의 최적화를 위한 모든 이들 접근법은 이전에 기재되었지만(예컨대, 특허 또는 특허 출원 제US 7,790,424호, 제US 7,611,873호, 제WO 2002/010209호, 제WO 2005/059093호 및 제WO 2006/008097호 참조), 그러나 미생물로부터의 L-메티오닌의 산업적 생산은 추가 개선을 필요로 한다.
에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)과 같은 다른 미생물에서, 두 가지 구분되는 효소가 메티오닌의 신규(de novo) 생합성의 최종 단계를 촉매한다(문헌[Foster et al ., 1961]; 문헌[Gonzalez et al ., 1992]). 코발라민 의존적 메티오닌 신타아제(MetH, EC 2.1.1.13)는 metH 유전자에 의해 코딩되고 활성을 위해 요구되는 보결 원자단을 함유한다. 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제(MetE, EC 2.1.1.14)는 metE 유전자에 의해 코딩되고 비타민 유래된 보결 원자단에 대한 알려진 요구조건을 갖고 있지 않다.
많은 특허 출원이 메티오닌 생합성의 마지막 단계를 강화하기 위한 MetH 및 MetE 효소의 과다 생산에 관련되며, 예컨대:
- 바스프(BASF)의 제WO2007/012078호 및 제WO2007/135188호는 유전자 metH 및/또는 metE의 과발현으로 이어지는 유전적 변형을 기재하고,
- 에보닉(EVONIK)의 제WO2009/144270호는 코브(I)알라민 의존성 MetH 재활성화 시스템의 증가된 양 및/또는 활성을 나타내는 미생물에 의한 메티오닌의 제조 방법을 기재한다.
발명자들은, 놀랍고 예상치 못하게도, 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제(MetE)의 양 및/또는 활성의 감쇠가 개선된 메티오닌의 생산으로 이어짐을 발견했다. 이는 메티오닌 생합성 경로에 속하는 효소 중 하나의 활성의 손실이 메티오닌 생산에 이로운 것으로 최초로 제안된 것이다.
본 발명은, 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제 MetE의 활성이 감쇠되는, 메티오닌의 생산에 최적화된 재조합 미생물에 관한 것이다. 바람직하게는, MetE 효소를 코딩하는 유전자 metE가 결실되거나 또는 돌연변이화된다. 재조합 미생물은
- 유전자 ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, thrA, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 민감성을 갖는 효소를 코딩하는 metA 대립유전자(metA*), thrA, 또는 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제성을 갖는 효소를 코딩하는 thrA, 대립유전자(thrA*) 중 하나 이상의 증가된 발현 및/또는
- 유전자 metJ , pykA , pykF , purU , ybdL , 또는 yncA 중 하나의 감쇠된 발현
과 같은 다른 유전적 변형을 또한 포함할 수 있다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 a) 유전자 metE가 결실되고, b) 유전자 metA *, metH, cysPUWAM , cysJIH , gcvTHP , metF , serA , serB , serC , cysE , thrA * 및 pyc의 발현이 강화되고; 및 c) 유전자 metJ , pykA , pykF , purU 및 yncA의 발현이 감쇠된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, a) 발효가능한, 글루코스를 함유하는 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 내에서 본 발명에 따른 재조합 미생물을 배양하는 단계 및 b) 배양 배지로부터 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 발효적 과정으로 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 이 발명이 구체적으로 예시된 방법에 제한되지 않고 당연히 가변적일 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 오직 본 발명의 특정 실시양태를 기재할 목적일 뿐이지 제한할 목적이 아니며, 이는 오직 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것임을 또한 이해해야 한다.
상기에서든 하기에서든 본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 그의 전부가 본원에 참조문헌으로 포함된다. 그러나, 본원에서 언급된 공개문헌은 그 공개문헌에서 보고되고 본 발명과 관련되어 사용될 수 있는 프로토콜, 시약 및 벡터를 기재하고 개시할 목적으로 인용된다. 어떤 경우에도 본 발명이 선행 발명에서 선행하는 이러한 개시로 인해 권리가 없음을 인정하는 것으로 고려되지 않는다.
추가적으로, 본 발명의 실시는 달리 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내의 종래의 미생물 및 분자생물학 기법을 이용한다. 이러한 기법은 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있고, 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예컨대, 문헌[Prescott et al. (1999)] 및 문헌[Sambrook et al. (1989) (2001)] 참조.
본원과 첨부된 청구항에서 사용되는 것과 같이, 단수 형태 "한", "하나의", 및 "그"는 문맥상 명확히 달리 지시되지 않는 한 복수의 의미를 포함함에 주목해야 한다. 따라서, 예컨대, "하나의 미생물"의 언급은 복수의 이러한 미생물을 포함하고, "하나의 내생 유전자"의 언급은 하나 이상의 내생 유전자의 언급 등이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속한 당업계의 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 물질 및 방법은 본 발명을 실시하거나 또는 테스트하는데 사용될 수 있으며, 바람직한 물질 및 방법이 하기에 기재된다.
하기되는 본 발명의 청구항 및 계속되는 발명의 상세한 설명에서, 언어 표현상 또는 필요한 암시를 위해 문법상 달리 필요로 하는 경우 외에는, 단어 "포함하는", "함유하는", "관련되는" 또는 "연관되는" 또는 "포함한", "포함하다", "함유한", "관련된", "연관된", "연관된다"와 같은 변화형은 포괄적 의미로, 즉 언급된 특성의 존재를 명시하지만 그러나 본 발명의 다양한 실시양태에서의 추가적 특성의 존재나 첨가를 배제하지는 않는 것으로 사용된다.
정의
용어 "메티오닌"은 화학식 HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3 및 특이적 L-이성질체에 대한 CAS 번호 59-51-8 또는 63-68-3를 갖는 필수 황 함유 아미노산을 표시한다.
"메티오닌의 유도체"는 동일한 화학적 골격을 나타내지만 그러나 하나 이상의 화학 기가 메티오닌과 상이한, 메티오닌과 유사한 분자를 의미한다. 이 발명에서, 바람직한 메티오닌 유도체는 N-아세틸 메티오닌(NAM), S-아데노실 메티오닌(SAM) 및 히드록시-메티오닌이다.
본원에 사용된 용어 "미생물"은 인공적으로 변형되지 않은 박테리아, 효모, 또는 균류를 의미한다. 바람직하게는, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 미생물은 에셰리키아, 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella), 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 종이다. 보다 더 바람직하게는, 미생물은 에셰리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
본원에 사용된 용어 "재조합 미생물" 또는 "유전적으로 변형된 미생물"은 자연에서 발견되지 않는 박테리아, 효모 또는 균류를 의미하고, 자연에서 발견되는 그의 동등물과 유전적으로 상이하다. 이는 이것이 유전적 요소의 도입에 의해, 또는 결실에 의해, 또는 변형에 의해 변형됨을 의미한다. 이는 특정 선택 압력 하에서의 진화 및 유도된 돌연변이 유발을 결함함으로써, 신규 대사 경로의 개발 및 진화를 촉진함으로써 또한 전환될 수도 있다(예컨대, 제WO 2004/076659호 참조).
외생 유전자가 숙주 미생물 내에서 이들이 발현되게 하는 모든 요소를 갖춘 미생물로 도입된다면, 미생물은 이들 외생 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. 외생 DNA에 의한 미생물의 변형 또는 "형질전환"은 당업계의 통상의 기술자에게 일상적인 작업이다.
미생물은 내생 유전자의 발현 수준을 조정하기 위해 변형될 수 있다.
용어 "내생 유전자"는, 야생형 균주에서, 유전자가 임의의 유전적 변형 이전의 미생물에 존재했음을 의미한다. 내생 유전자는 염색체 또는 플라스미드에 이종 기원의 서열을 도입함으로써, 및/또는 내생 조절 요소를 교체함으로써, 또는 하나 이상의 보충적 유전자 카피를 도입함으로써 과발현될 수 있다. 내생 유전자는 그의 발현 및/또는 활성을 조정하기 위해 또한 변형될 수 있다. 예컨대, 유전자 생성물을 변형시키기 위해 코딩 서열로 돌연변이가 도입될 수 있거나 또는 내생 조절 요소에 추가로 또는 이를 교체하도록 이종기원의 서열이 도입될 수 있다. 내생 유전자의 조정은 유전자 생성물의 활성의 상향 조절 및/또는 강화나, 아니면 내생 유전자 생성물의 활성의 하향 조절 및/또는 저하를 야기할 수 있다.
이들의 발현을 조정하는 또다른 방식은, 내생 유전자의 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해 더 강력하거나 또는 더 약한 프로모터로 유전자의 내생 프로모터(예컨대, 야생형 프로모터)를 교환하는 것이다. 이들 프로모터는 동종기원이거나 또는 이종기원일 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 적절한 프로모터를 쉽게 선택할 수 있다.
용어 " 외생 유전자"는, 이 유전자가 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 수단에 의해 미생물에 도입되었지만 이 유전자가 미생물 내에 자연적으로 등장하지는 않음을 의미한다. 외생 유전자는 플라스미드 또는 벡터에 의해 숙주 염색체로 인테그레이션될 수 있거나, 또는 염색체 외(extra chromosome)에서 발현될 수 있다. 세포 내에서 그의 복제 기점 및 그의 카피수가 상이한 다양한 플라스미드가 당업계에 공지되어 있다. 이들 유전자는 이종기원이거나 또는 동종기원일 수 있다.
용어 "이종기원 유전자"는 유전자가 이를 발현하는 수여(recipient) 미생물과 상이한 미생물의 종으로부터 유래됨을 의미한다. 이는 미생물 내에서 자연적으로 등장하지 않는 유전자를 의미한다.
본 출원에서, 모든 유전자는 이. 콜라이에서의 그의 통칭으로 언급된다. 그의 뉴클레오티드 서열은 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene 또는 http://www.ebi.ac.uk/embl/에서 이용가능하다.
공지된 유전자에 대해 진뱅크(Genbank)에 제공된 참조문헌을 사용하여, 당업계의 통상의 기술자는 다른 생물, 박테리아 균주, 효모, 균류, 포유류, 식물 등에서 동등한 유전자를 결정할 수 있다. 이 일상적 작업은 다른 미생물로부터 유래된 유전자와의 서열 정렬을 수행하고, 또다른 생물에서 해당 유전자를 클로닝하기 위한 유추 프로브(degenerate probe)를 설계함으로써 결정될 수 있는 컨센서스 서열을 사용하여 유리하게 수행된다. 분자생물학의 이들 일상적 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예컨대, 문헌[Sambrook et al , (1989) and (2001)]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "개선된 메티오닌 생산", "메티오닌 생산의 개선" 및 그의 문법적 동등 표현은 증가된 메티오닌/탄소 공급원 수율(퍼센트로 표현될 수 있는, 소모된 탄소 공급원 그램/몰 당 생산된 메티오닌 그램/몰의 비)을 의미한다. 소모된 탄소 공급원 및 생산된 메티오닌의 양을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 수율은 상응하는 비변형 미생물에 비해 재조합 미생물에서 더 높다.
용어 "메티오닌의 발효적 생산을 위해 최적화된 미생물"은 상응하는 야생형 미생물의 내생적 생산에 비해 개선된 메티오닌 생산을 나타내는 진화된 및/또는 유전적으로 변형된 미생물을 의미한다. 메티오닌 생산을 위해 "최적화된" 이러한 미생물은 당업계에 잘 알려져 있고, 구체적으로 특허 출원 제WO2005/111202호, 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 개시되었다.
본 발명에 따른 용어 "발효적 생산", "배양" 또는 "발효"는 박테리아의 성장을 표시하기 위해 사용된다. 이 성장은 사용되는 미생물에 맞춰지고, 하나 이상의 단순 탄소 공급원 및 만약 필요하다면 보조 기질을 함유하는 적절한 배양 배지와 함께 발효조에서 일반적으로 수행된다.
"적절한 배양 배지"는 탄소 공급원 또는 탄소 기질, 질소 공급원, 예컨대, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 니트레이트 및 암모늄 포스페이트; 인 공급원, 예컨대, 모노포타슘 포스페이트 또는 디포타슘 포스페이트; 미량 원소(예컨대, 금속 염), 예컨대, 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망간 염; 및 성장 인자 예컨대, 아미노산 및 비타민과 같이, 세포의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 이로운 영양분을 포함하는 배지(예컨대, 멸균 액체 배지)를 표시한다.
본 발명에 따른 "탄소 공급원" 또는 "탄소 기질" 또는 "탄소의 공급원"은, 모노사카라이드 (예컨대, 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 프룩토스 또는 락토스), 올리고사카라이드, 디사카라이드(예컨대, 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스), 당밀, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스 및 그의 조합을 포함하는, 미생물의 정상 성장을 지지하기 위해 당업계의 통상에 기술자에 의해 사용될 수 있는 임의의 탄소의 공급원을 표시한다. 특히 바람직한 단순 탄소 공급원은 글루코스이다. 또다른 바람직한 단순 탄소 공급원은 수크로스이다. 탄소 공급원은 재생가능한 공급원료로부터 유래될 수 있다. 재생가능한 공급원료는 원하는 생성물로의 그의 전환을 가능하게 하는 충분한 양으로 짧은 지연 내에 재생될 수 있는 특정 산업 공정에 요구되는 원료 물질로서 정의된다. 처리되거나 또는 처리되지 않은 식물성 바이오매스는 흥미로운 재생가능한 탄소 공급원이다.
본 발명에 따른 용어 "황의 공급원"은 술페이트, 티오술페이트, 히드로겐 술파이드, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸술피드 및 다른 메틸 캐핑된 술파이드 또는 상이한 공급원의 조합을 의미한다. 보다 바람직하게는, 배양 배지 내의 황 공급원은 술페이트 또는 티오술페이트 또는 그의 혼합물이다.
용어 "질소의 공급원"은 암모늄 염 또는 암모니아 가스에 해당한다. 질소 공급원은 암모늄 또는 암모니아의 형태로 공급된다.
용어 "감쇠" 또는 "감쇠된 발현"은 이 문맥에서 유전자 또는 효소의 발현이 변형되지 않은 미생물에 비해 감소되거나 또는 억제된다는 것을 의미한다. 효소의 발현의 감소 또는 억제는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현의 감쇠에 의해 얻어진다.
유전자의 감쇠는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 수단 및 방법에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 유전자 발현의 감쇠는
- 코딩 영역 또는 프로모터 영역의 돌연변이화 또는,
- 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역의 전부 또는 일부의 결실 또는,
- 상동 재조합에 의한 유전자의 코딩 영역의 결실 또는,
- 코딩 영역 또는 프로모터 영역으로의 외부 요소의 삽입 또는
- 약한 프로모터의 통제 하에서 유전자의 발현
에 의해 달성될 수 있다.
당업계의 통상의 기술자는 상이한 강도를 나타내는 다양한 프로모터를 알고 있으며, 약한 유전적 발현을 위해 어떤 프로모터를 사용해야 하는지 알고 있다.
용어 효소의 "활성"은 용어 "기능성"과 교환가능하게 사용되며, 본 발명의 맥락에서, 효소에 의해 촉매되는 반응을 표시한다. 당업계의 통상의 기술자는 상기 효소의 효소 활성을 측정하는 방법을 알고 있다. 구체적으로, 단백질 MetE의 활성의 측정을 위해서는, 실시예 5를 참조.
용어 효소의 " 감쇠된 활성" 또는 용어 효소의 "감소된 활성"은 아미노산 서열의 돌연변이에 의해 얻어진, 단백질의 감소된 특이적 촉매 활성 및/또는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 또는 유전자의 코딩 영역의 결실에 의해 얻어진 세포 내 단백질의 감소된 농도를 의미한다.
용어 효소의 "강화된 활성" 또는 "증가된 활성"은, 예컨대, 효소를 코딩하는 유전자의 과발현에 의한, 세포 내 효소의 증가된 특이적 촉매 활성 및/또는 효소의 증가된 양/이용가능성을 표시한다.
용어 " 증가된 발현", "강화된 발현" 또는 "과발현" 및 그의 문법적 동등 표현은 본 텍스트에서 교환가능하게 사용되고 유사한 의미를 지닌다. 이들 용어는 유전자 또는 효소의 발현이 변형되지 않은 미생물에 비해 증가됨을 의미한다. 효소의 발현 증가는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현 증가에 의해 얻어진다.
유전자의 발현을 증가시키기 위해, 당업계의 통상의 기술자는 다음의 상이한 기법을 알고 있다:
- 미생물에서 유전자의 카피수를 증가시키기. 유전자는 염색체에서 또는 염색체 외에서 코딩된다. 유전자가 염색체 상에 좌위되면, 유전자의 수 개의 카피는 당업계의 전문가에게 공지된 재조합의 방법에 의해 염색체에 도입될 수 있다(유전자 교체를 포함함). 유전자가 염색체 외에 좌위되면, 그의 복제 기점 및 따라서 세포에서의 그들의 복제수가 상이한 다른 유형의 플라스미드에 의해 운반될 수 있다. 이들 플라스미드는, 타이트(tight)하게 복제되는 낮은 카피수 플라스미드(pSC101, RK2), 낮은 카피수 플라스미드(pACYC, pRSF1010) 또는 높은 카피수 플라스미드(pSK 블루스크립트(bluescript) II)처럼 플라스미드의 성질에 따라 미생물에 1 내지 5 카피, 또는 약 20 카피, 또는 500 카피 이하로 존재한다.
- 유전자의 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터의 사용. 당업계의 통상의 기술자는 어떤 프로모터가 가장 편리한지, 예컨대, Ptrc, Ptac, Plac, 또는 람다 프로모터 cI가 광범위하게 사용된다는 것을 알고 있다. 이들 프로모터는 특정 화합물에 의해 또는 온도 또는 빛과 같은 특정 외부 조건에 의해 "유도가능"할 수 있다. 이들 프로모터는 동종기원이거나 또는 이종기원일 수 있다.
- 유전자에 특이적이거나 또는 비특이적인 전사 억제자의 활성 또는 발현의 감쇠
- 해당 메신저 RNA를 안정화시키는 요소(문헌[Carrier and Keasling, 1998]) 또는 단백질을 안정화시키는 요소(예컨대, GST 태크, GE 헬스케어(Healthcare))의 사용.
용어 "인코딩" 또는 "코딩"은 전사 및 번역의 메커니즘을 통해 폴리뉴클레오티드가 아미노산 서열을 생산하는 과정을 의미한다. 효소(들)을 코딩하는 유전자(들)은 외생적이거나 또는 내생적일 수 있다.
용어 "피드백 민감성" 또는 "피드백 억제"는 물질이 특정 수준으로 축적되었을 때 세포에서 특정 물질의 생산을 촉매하는 하나 또는 수 개의 효소가 억제되거나 또는 덜 활성화되는 세포 메커니즘 통제를 의미한다. 따라서 용어 "감소된 피드백 민감성" 또는 "감소된 피드백 억제"는 변형되지 않은 미생물에 비해 이러한 메커니즘의 활성이 감소되거나 또는 억제됨을 의미한다. 당업계의 통상의 기술자는 이 결과를 얻기 위해 효소를 변형하는 방법을 알고 있다. 이러한 변형은 특허 출원 제WO 2005/111202호 또는 특허 제US 7,611,873호에 개시되었다.
본 발명은 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제 MetE의 활성이 감쇠된, 메티오닌의 발효적 생산에 최적화된 재조합 미생물에 관한 것이다.
당업계의 통상의 기술자는 단백질 돌연변이화, 유전자 돌연변이화 또는 유전자 발현의 감쇠와 같은 효소 활성을 감쇠시키는 많은 수단 및 방법을 알고 있다. 단백질 돌연변이화는 효소의 촉매작용 위치에 존재하는 특이적 아미노산을 교체함으로써, 또는 추가적 아미노산을 도입함으로써, 또는 특정 아미노산을 결실시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 첫째 측면에서, 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제 MetE를 코딩하는 metE 유전자의 발현이 감쇠된다. 이. 콜라이 metE 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 20에 나타난다.
유전자 감쇠는 유전자를 비활성화시키기 위해 유전자에 외부 DNA를 도입함으로써 또는 약한 프로모터 또는 유도가능 프로모터의 통제 하에 유전자를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 상이한 발현 강도 및/또는 상이한 유도 파라미터를 나타내는 광범위한 프로모터를 알고 있고, 야생형 프로모터를 변형시킴으로써, 예컨대, 그의 컨센서스 서열, 리보좀 결합 부위 또는 개시 코돈을 변형시킴으로써 발현 강도를 낮추기 위한 프로모터의 변형 방법을 알고 있다. 따라서, 당업계의 통상의 기술자는 metE의 감쇠된 발현으로 이어지는 프로모터를 선택할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, metE 유전자의 적어도 일부가 결실된다. 바람직하게는 이 결실된 부위는 코딩 서열의 10 % 이상, 보다 바람직하게는 코딩 서열의 적어도 20 %, 30 %, 40 %, 또는 50 %을 나타낸다. 보다 바람직하게는, 코딩 서열의 80 % 이상이 결실된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, metE 유전자는 완전히 결실된다. 당업계의 통상의 기술자는 상동 재조합과 같이 유전자 부분을 결실시키는 많은 기법을 알고 있다.
본 발명의 둘째 측면에서, metE 유전자는 감쇠된 활성을 나타내는 변형된 단백질을 코딩하기 위해 돌연변이화된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유전자 metE의 돌연변이는 비활성의 절삭(truncated)된 MetE 단백질의 번역으로 이어진다. 보다 바람직하게는 돌연변이화는, 그의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 20에 나타나는 이. 콜라이 유전자의 417 번 내지 429 번 염기의 13 염기쌍(bp)의 부분의 결실이며, 이는 프레임 시프트 돌연변이로 이어진다. 결과적으로, 단백질의 번역은 단축되고(종결 코돈이 프레임 시프트에 의해 도입됨), 서열번호 21에서 나타나는 야생형 서열에서의 753 개의 아미노산 대신 서열번호 22에 나타나는 152 개의 아미노산의 절삭된 단백질이 생기게 한다. 임의의 미생물 종으로부터 metE 유전자 내에 종결 코돈이 도입되게 하는 임의의 동등한 돌연변이화 또한 본 발명의 일부이다.
메티오닌 생합성 경로의 최적화
본 발명에 따른 재조합 미생물은 메티오닌의 생산을 개선하기 위해 변형된다. 메티오닌 생산에 관련된 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 메티오닌 특이적 생합성 경로에 관련된 유전자 뿐만 아니라 전구체 제공 경로에 관련된 유전자 및 메티오닌 소모 경로에 관련된 유전자를 포함한다.
메티오닌의 효율적 생산은 메티오닌 특이적 경로 및 수 개의 전구체 제공 경로의 최적화를 필요로 한다. 메티오닌 생산 균주는 구체적으로 특허 출원 제WO2005/111202호, 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 이미 기재되어 있다. 이들 출원은 이 출원에 참조문헌으로 포함된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 재조합 미생물은 다음에 기재된 것과 같이 변형된다: 유전자 ptsG , pyc , pntAB , cysP , cysU , cysW , cysA , cysM , cysJ , cysI , cysH, gcvT , gcvH , gcvP , lpd , serA , serB , serC , cysE , metF , metH , metA , S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 민감성을 갖는 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자(MetA *), thrA, 및 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제성을 갖는 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자(thrA *) 중 하나 이상의 발현이 증가된다.
● ptsG는 특허 출원 제EP11305829호에 기재된 PTS 효소 IICBGlc를 코딩한다.
● pyc는 특허 출원 제EP11305829호에 기재된 피루베이트 카복실라제를 코딩한다. 바람직한 실시양태에서, pyc 유전자는 이종기원이며, 리조비움 에틀리(Rhizobium etli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 또는 코리네박테리움 종의 pyc 유전자로부터 선택되고,
● pntAB는 특허 출원 제WO2012/055798호에 기재된 것과 같이, 막-결합 트랜스히드로게나제의 서브유닛을 코딩하고,
● cysP는 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 주변세포질 술페이트 결합 단백질을 코딩하고,
● cysU는 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 술페이트 ABC 수송체의 구성요소를 코딩하고,
● cysW는 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 막 결합 술페이트 수송체 단백질을 코딩하고,
● cysA는 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 술페이트 투과효소를 코딩하고,
● cysM는 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, O-아세틸 세린 술프히드릴라제를 코딩하고,
● cysI 및 cysJ는 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 술파이트 환원효소의 알파 및 베타 서브유닛을 각각 코딩한다. 바람직하게는 cysI 및 cysJ는 함께 과발현되고,
● cysH는 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 아데닐일술페이트 환원효소를 코딩한다.
C1 대사의 증가는 또한 개선된 메티오닌 생산으로 이어지는 변형이다. 이는 GcvTHP, Lpd, MetF 또는 MetH 중에서 선택된 C1 대사에 관련된 하나 이상의 효소의 활성의 증가에 관련된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 1 탄소 대사는 다음 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성을 강화시킴으로써 증가된다.
● 특허 출원 제WO 2007/077041호에 기재된 것과 같이, 글리신 절단 복합체를 코딩하는 gcvT , gcvH , gcvP, 및 lpd . 글리신-절단 복합체(GCV)는 글리신의 산화를 촉매하여, 이산화탄소, 암모니아, 메틸렌-THF 및 감소된 피리딘 뉴클레오티드를 생성하는 다효소 복합체이다. GCV 복합체는 P-단백질로 불리는 글리신 데히드로게나제(GcvP), H-단백질로 불리는 리포일-GcvH-단백질(GcvH), T-단백질로 불리는 아미노메틸트랜스퍼라제(GcvT), 및 L-단백질로 불리는 디히드로리포아미드 데히드로게나제(GcvL 또는 Lpd)의 네 개의 단백질 구성요소로 구성된다. P-단백질은 글리신으로부터 피리독살 포스페이트 의존적 CO2의 방출을 촉매하여, 메틸아민 부분을 남긴다. 메틸아민 부분은 H-단백질의 리포산 기로 전달되어, 글리신의 탈카복시화 전에 P-단백질에 결합된다. T-단백질은 메틸아민 기로부터 NH3의 방출을 촉매하고, 나머지 C1 단위을 THF로 전달하여, 메틸렌-THF를 형성한다. 그 다음 L 단백질은 H-단백질의 리포산 구성요소를 산화시키고 전자를 NAD+로 전달하여 NADH를 형성한다;
● 특허 출원 제WO 2007/077041호에 기재된 것과 같이, 메틸렌테트라히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 MetF;
● 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 MetH (B12-의존적 호모시스테인-N5-메틸테트라히드로폴레이트 트랜스메틸라제).
세린 생합성에 관련된 하나 이상의 하기 유전자의 과발현도 또한 이소류신 부산물의 생성을 감소시킨다:
● 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 포스포글리세레이트 데히드로게나제를 코딩하는 serA ,
● 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 serB ,
● 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 serC .
하기 유전자의 과발현은 메티오닌의 생산을 개선하는 것으로 이미 나타났다:
● cysE는 세린 아실트랜스퍼라제를 코딩하고, 제WO2007/077041호에 기재된 것처럼 그의 과발현은 메티오닌 생산이 증가되게 하고;
● metA는 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩한다. 대립유전자 MetA*는 S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대해 감소된 피드백 민감성을 갖는 효소를 코딩한다. 바람직하게는, 특허 출원 제WO 2005/111202호에 기재된 대립유전자 MetA*가 사용된다;
● thrA는 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제를 코딩하고, thrA * 대립유전자는 제WO 2005/111202호에 기재된 것과 같이, 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제성을 갖는 효소를 코딩한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 유전자는 유도가능 프로모터의 통제 하에 있을 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 이들 유전자 중 하나 이상은 온도 유도가능 프로모터의 통제 하에 있다. 바람직하게는, 유전자 thrA, cysE, metA 중 하나 이상의 발현은 직간접적으로 유도가능 프로모터의 통제 하에 있다. 보다 바람직하게는, 유전자 thrA, cysE 및 metA는 직간접적으로 유도가능 프로모터의 통제 하에 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, thrA 유전자의 발현은 유도가능 프로모터의 직접 통제 하에 있고, cysE 유전자의 발현은 thrA 유전자의 유도가능 발현의 극성 효과 하에 있다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, thrA 유전자의 발현은 유도가능 프로모터의 직접 통제 하에 있고, cysE 및 metA 유전자의 발현은 thrA 유전자의 유도가능 발현의 극성 효과 하에 있다.
가장 바람직한 실시양태에서, 온도 유도가능 프로모터는 PR 프로모터 계열에 속한다. 유도가능 프로모터의 통제 하에 있는 유전자를 갖는 메티오닌 생산 균주는 특허 출원 제WO2011/073122호에 기재된다.
본 발명의 또다른 특정 실시양태에서, 미생물은 추가 변형되었고, 유전자 metJ, pykA , pykF , purU , ybdL 또는 yncA 중 하나 이상의 발현이 감쇠된다.
● 유전자 metJ는 특허 출원 제JP 2000/157267호에서 제안된 바와 같이, 메티오닌 레귤론(regulon)의 하향 조절을 담당하는 억제자 단백질 MetJ(진뱅크(GenBank) 1790373)를 코딩한다.
● 유전자 pykA 및 pykF는 효소 '피루베이트 키나제'를 코딩한다. 피루베이트 키나제 중 적어도 하나 또는 둘 다의 발현의 감쇠는 포스포에놀 피루베이트(PEP)의 소모를 낮춘다. PEP의 증가된 이용가능성은, 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것처럼, 아스파르테이트의 중요한 전구체이며, 결과적으로 메티오닌의 전구체인 옥살로아세테이트의 생산을 증가시킬 수 있다.
● purU는 포밀-THF 탈포밀라제 반응을 촉매하는 효소인 포밀테트라히드로폴레이트 탈포밀라제를 코딩한다. 탈포밀라제 활성의 감쇠는 호모시스테인의 메틸화에 요구되는 메틸-THF의 생산을 증가시킨다. 탈포밀화에 의한 C1 대사물질의 손실은 메티오닌으로 전환될 수 없는 호모시스테인의 증가된 생산으로 이어진다. 그 다음 호모시스테인은, 제WO2007/077041호 및 제WO2009/043803호에 기재된 것과 같이, 호모란티오닌의 생산을 야기하는 호모시스테인과 O-숙시닐호모세린 사이의 반응을 촉매할 수 있는 효소 시스타티오닌 감마 신타아제(MetB)에 대한 기질일 수 있고,
● ybdL은 특허 출원 제PCT/FR2010/052937호에 기재된 것과 같이 아미노트랜스퍼라제를 코딩하고,
● yncA는 특허 출원 제WO 2010/020681호에 기재된 것과 같이 N-아실트랜스퍼라제를 코딩한다.
본 발명의 보다 바람직한 실시양태에서, 주 탄소 공급원으로서 글루코스로부터, 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제 MetE의 활성이 감쇠된, 재조합 미생물에 의한 메티오닌의 발효적 생산이 상기 미생물에서 상기 논의된 변형의 조합을 통해 달성될 수 있으며, 예컨대:
▷ 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 민감성을 갖는 효소를 코딩하는 metA 대립유전자(MetA*)의 발현은 강화되고;
▷ 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 민감성을 갖는 효소를 코딩하는 metA 대립유전자(MetA*)의 발현은 강화되고; 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제성을 갖는 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자의 발현(thrA *)은 강화되고;
▷ 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 민감성을 갖는 효소를 코딩하는 metA 대립유전자(MetA*)의 발현은 강화되고; 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제성을 갖는 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자(thrA *)의 발현은 강화되고; 유전자 cysE의 발현은 강화되고;
▷ 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 민감성을 갖는 효소를 코딩하는 metA 대립유전자(MetA*)의 발현은 강화되고; 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제성을 갖는 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자(thrA *)의 발현은 강화되고; 유전자 cysE의 발현은 강화되고; 유전자 metF 및/또는 metH의 발현은 강화된다.
본 발명의 구체적 측면에서, 재조합 미생물은 하기 유전적 변형을 포함한다:
● 유전자 metE가 결실되고,
● 유전자 metA *, metH , cysPUWAM , cysJIH , gcvTHP , metF , serA , serB , serC, cysE , thrA * 및 pyc의 발현이 강화되고,
● 유전자 metJ , pykA , pykF , purU 및 yncA가 감쇠된다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 미생물은 박테리아 과 엔테로박테리아세아에 또는 코리네박테리아세아에로부터인 것이다.
바람직하게는, 미생물은 에셰리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
배양 조건
본 발명은 또한,
- 발효가능한 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 내에서 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및,
- 배양 배지로부터 메티오닌 또는 그의 유도체를 회수하는 단계
를 포함하는 메티오닌의 제조 방법에 관한 것이다.
당업계의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 미생물을 위한 배양 조건을 정의할 수 있다. 구체적으로 박테리아는 20 ℃ 내지 55 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃, 보다 특별히는 씨. 글루타미쿰에 대해 약 30 ℃에서, 이. 콜라이에 대해 약 37 ℃에서 발효된다.
이. 콜라이에 대해, 배양 배지는 M9 배지(앤더슨(Anderson), 1946), M63 배지(밀러(Miller), 1992); 또는 섀퍼(Schaefer) 등(1999)에 의해 정의된 것과 같은 배지와 동일하거나 유사한 조성물일 수 있다.
씨. 글루타미쿰에 대해, 배양 배지는 BMCG 배지(리블(Liebl) 등, 1989) 또는 리델(Riedel)(2001) 등에 의해 기재된 것과 같은 배지와 동일하거나 유사한 조성물일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 배양물은 하나 또는 수 개의 무기질의 제한 또는 결핍을 받는다. 이는 미생물의 성장이 계속해서 약한 성장을 허용하도록 공급된 무기 화학물질의 양에 의해 지배되는 조건을 의미한다. 미생물 성장에서 이러한 제한은 특허 출원 제WO 2009/043372호에 기재되었다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 배양물은 포스페이트 제한을 받는다.
"배양 배지로부터 메티오닌 또는 그의 유도체의 회수"의 동작은 L-메티오닌 및/또는 그의 유도체, 특히 N-아세틸 메티오닌(NAM) 및 S-아데노실 메티오닌(SAM) 및 유용할 수 있는 모든 다른 유도체 중 하나를 회수하는 동작을 나타낸다. 생산된 화합물의 회수 및 정제 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있다(구체적으로 제WO 2005/007862호, 제WO 2005/059155호 참조).
발효 배지 내의 생성물의 양은 당업계에 공지된 많은 방법, 예컨대, 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 가스 크로마토그래피(GC)를 사용하여 결정될 수 있다. 예컨대, 배지에서 얻은 메티오닌의 양은 표준으로서 L-메티오닌(플루카(Fluka), Ref 64319)을 사용한 OPA/Fmoc 유도체화 이후에 HPLC에 의해 측정된다. NAM의 양은 표준으로서 NAM(시그마(Sigma), Ref 01310)을 사용한 굴절계 HPLC를 사용하여 결정된다.
< 실시예 >
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만 오직 예시로서 제공됨을 이해해야 한다. 상기 개시 및 이들 실시예로부터, 당업계의 통상의 기술자는 본 발명의 핵심적 수단을 변형시키지 않고 본 발명이 다양한 용도 및 조건에 적응되도록 본 발명의 다양한 변화를 만들 수 있다.
구체적으로, 실시예는 변형된 에셰리키아 콜라이(이. 콜라이) 균주를 보여주지만, 그러나 이들 변형은 동일한 과의 다른 미생물에서 쉽게 수행될 수 있다.
에셰리키아 콜라이는 그람 음성이고, 막대 형태이며, 포자를 형성하지 않고, 통상적으로 1-5 ㎛의 길이인 구성원을 포함하는 엔테로박테리아세아 과에 속한다. 대부분의 구성원은 이동하는데 사용되는 편모를 갖지만, 일부 속은 비이동성이다. 이 과의 많은 구성원은 인간 및 다른 동물의 장에서 발견되는 장내 세균총(gut flora)의 정상 부분인 반면, 다른 것들은 물 또는 토양에서 발견되거나, 또는 다양한 상이한 동물 및 식물에 기생한다. 이. 콜라이는 가장 중요한 모델 생물 중 하나이지만, 그러나 엔테로박테리아세아 과의 다른 중요한 구성원은 클레브시엘라, 구체적으로 클레브시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena), 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola) 또는 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 및 살모넬라를 포함한다.
더욱이, 수 개의 특허 출원은, 메티오닌 생산을 위한 최적화가 과도한 실험 없이 이. 콜라이 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서 쉽게 적용될 수 있음을 지적한다.
실시예 1: 프로토콜
수 개의 프로토콜을 하기 예시에서 메티오닌 생산 균주를 구축하는데 사용했다.
프로토콜 1 : 상동 재조합 및 재조합체의 선택에 의한 염색체 변형(다트센코(Datsenko), & 와너(Wanner), (2000)).
명시된 염색체 좌위 내의 대립유전자 교체 또는 유전자 삽입을 다트센코 & 와너(2000)에 의해 기재된 대로 상동 재조합으로 수행했다. Flp 인식 부위에 인접한 카나마이신(Km) 저항성 kan를 주형으로 pKD4 플라스미드를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 λ 레드(Red)(γ, β, exo) 재조합효소를 발현하는 플라스미드 pKD46를 장착한 수여 이. 콜라이 균주를 형질전환하는데 사용했다. 그 다음 항생제 저항성 형질전환체를 선택하여 변형된 좌위의 염색체 구조를 표 3에 나열된 적절한 프라이머로 PCR 분석에 의해 확인했다.
kan 저항성 유전자를 다트센코 & 와너(2000)에 의해 기재된 대로 Flp 재조합효소를 코딩하는 유전자를 운반하는 플라스미드 pCP20을 사용하여 절제할 수 있다. pCP20 플라스미드를 적절한 균주에 도입했고 형질전환체를 30 ℃에서 암피실린이 보충된 LB 상에 스프레딩했다. flp 유전자를 발현시키고 카나마이신 카세트를 제거하기 위해, 형질전환체를 37 ℃에서 배양했다. 그 다음 단리 후에, 항생제 민감성 클론을 표 3에 나열된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 확인했다.
프로토콜 2 : 파지 P1의 트랜스덕션
제공된 수여 이. 콜라이 균주에 염색체 변형물을 P1 트랜스덕션에 의해 전달했다. 이 프로토콜은 (i) 저항성 연관 염색체 변형물 함유하는 공여 균주에서의 파지 용해물의 제조 및 (ii) 이 파지 용해물에 의한 수여 균주의 감염의 2 단계를 포함한다.
파지 용해물의 제조
- 원하는대로 염색체 변형된 균주 MG1655의 밤새 동안의 배양물 100 ㎕를 10 ml의 Km 50 ㎍/ml + 글루코스 0.2 % + CaCl2 5 mM에 접종했다.
- 진탕하면서 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션했다.
- 공여 균주 MG1655에서 제조된 P1 파지 용해물 100 ㎕를 첨가했다(대략 1 x 109 파지/ml).
- 세포가 완전히 용해될 때까지 3 시간 동안 37 ℃에서 진탕했다.
- 클로로폼 200 ㎕를 첨가하고 볼텍싱했다.
- 세포 파괴물을 제거하기 위해 4500 g에서 10 분 동안 원심분리했다.
- 멸균 튜브에 상층액을 옮겼다.
- 4 ℃에서 용해물을 저장했다.
트랜스덕션
- LB 배지에서 배양된 이. 콜라이 수여 균주의 밤새 동안의 배양물 5 ml를 1500 g에서 10 분 동안 원심분리했다.
- 2.5 ml의 MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM에 세포 펠렛을 현탁시켰다.
- 100 ㎕의 세포를, 염색체 변형된 균주 MG1655의 P1 파지 100 ㎕(테스트 튜브), 및 대조용 튜브로서 P1 파지가 없는 100 ㎕의 세포 및 세포가 없는 100 ㎕ P1 파지로 감염시켰다.
- 진탕 없이 30 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션했다.
- 각 튜브에 100 ㎕ 소듐 시트레이트 1 M를 첨가하고 볼텍싱했다.
- 1 ml의 LB를 첨가했다.
- 진탕하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션했다.
- 7000 rpm에서 3 분 동안 원심분리했다.
- LB + Km 50 ㎍/ml에 플레이팅했다.
- 밤새 37 ℃에서 인큐베이션했다.
<표 1: 하기 실시예에 인용되거나 또는 기재된 균주(번호 및 유전자형)>
Figure pct00001
<표 2: 특허 출원 제EP10306164호에 기재된 균주 1의 유전자형에 대한 이전 및 현재 명명법 사이의 관련성>
Figure pct00002
<표 3: 하기 실시예에 사용되는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 2: 균주 5, MG1655 metA *11 P trc 01 *2/ RBS08 *1- metH P trc 01 - cysPUWAM P trc 01- cysJIH P trc 01 / RBS01 - gcvTHP P trc 01 / ARN01 / RBS01 - metF P trc 94 - serB Δ metJ Δ p y kF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: RN / PRM - CI857 - TT adcca - PR01 / RBS01 *4- thrA * 1- cysE Δ pgaABCD :: RN / PR01 / RBS01 - thrA *1- cysE - P gapA - metA *11 Δ uxaCA ::RN/PR01/RBS01- thrA *1- cysE -P gapA - metA *11 Δ CP4 -6 :: RN / PR01 / RBS01 - thrA *1- cysE -P gapA - metA *11 Δ wcaM :: RN / PR01 / RBS01 - thrA * 1- cysE - P gapA - metA *11 Δ treBC ::RN/ serA-serC Δ yjbI :: RN / P trc 01 / RBS01 - gcvTHP - TT07 :: Km ( pCL1920 - P gapA - pycre -TT07) ( pCC1BAC - TT02 - P trc 30 / RBS01 - serC - TT07 *2- P trc 30 / RBS01 - serA - TT adcca )의 구축
1. 균주 1
메티오닌 생산 균주 1(표 1의 유전자형)은 이 출원에 참조문헌으로 포함된 특허 출원 제EP10306164호에 기재되었다.
2. 균주 2의 구축
세포로의 메틸렌-테트라히드로폴레이트 풀을 증가시키기 위해, gcvTHP 오페론에 의해 코딩되는 글리신 절단 복합체를 yjbI 좌위의 염색체 상에 이 오페론의 한 카피를 첨가하여 과다 생산시켰다. 이 gcvTHP의 부가적 카피를 인공 유도가능 trc 프로모터 및 최적화된 리보좀 결합 부위를 사용하여 발현시켜, ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 염색체 인테그레이션을 제공했다.
yjbI 유전자를 결실시키고 Ptrc01/RBS01- gcvTHP -TT07 영역으로 이를 교체하기 위해, 다트센코 & 와너(2000)에 의해 기재된 상동 재조합 전략을 사용했다. 이 전략은 클로람페니콜 또는 카나마이신 저항성 카세트, 뿐만 아니라 부가적 DNA가 삽입되게 하는 반면, 관련된 대부분의 유전자를 결실시킨다. 이 목적을 위해, pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 플라스미드를 구축했다.
이 pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 플라스미드는 pUC18 벡터로부터 유래됐고(문헌[Norrander et al ., 1983]), Ptrc01/RBS01- gcvTHP -TT07 영역에 연관된 카나마이신 저항성 카세트를 장착하며, 둘 모두 yjbI의 업스트림 및 다운스트림 영역 사이에서 클로닝됐다.
pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km의 구축을 위해, 먼저 pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC 플라스미드를 구축했다. 이 플라스미드는 전사 종결자(이. 콜라이의 rrnB 유전자의 T1, TT02로 명명됨)에 의해 분리된 yjbI의 업스트림 및 다운스트림 영역 및 다중 클로닝 부위(BstZ17I, HindIII, AvrII, ApaI 및 PacI 제한효소 절단부위로 구성되고, SMC로 명명됨)을 운반한다. 이 마지막 영역을 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 게놈 DNA로부터 PCR로 증폭했다:
YjbIup-F (서열번호 1)
CGTAGGCGCCGGTACCgagtgcagatcggctggaaggcg
- yjbI 영역의 서열(4247987-4248009)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- SfoI 및 KpnI 제한효소 절단부위 및 여분의 염기의 영역(대문자)
을 갖음.
YjbIup-R (서열번호 2)
GCTTGTATACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGcatttctgtagaattttacacttatagtatcattactgattgagacttca
- yjbI 영역의 서열(4248931-4248980)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- 이. 콜라이의 rrnB 유전자의 전사 종결자 T1의 영역(굵은 대문자)(문헌[Orosz et al , 1991]),
- 다중 클로닝 부위의 BstZ17I 제한효소 절단 부위 및 HindIII 제한효소 절단부위의 부분의 영역(대문자)
을 갖음.
YjbIdown-F (서열번호 3)
AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTTACCTAGGGCCCTTAATTAAataatgaataagggtgtttaagtaaaggaaaacatcaccgttcctggcat
- yjbI 영역의 서열(4250286-4250335)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- 이. 콜라이의 rrnB 유전자의 전사 종결자 T1의 부분의 영역(굵은 대문자)(문헌[Orosz et al , 1991]),
- 전체 다중 클로닝 부위의 영역(대문자)
을 갖음.
YjbIdown-R (서열번호 4)
CGTAGGCGCCGGTACCcagcataatcattcaccacacatccg
- yjbI 영역의 서열(4251224-4251249)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- SfoI 및 KpnI 제한효소 절단부위 및 여분의 염기의 영역(대문자)
을 갖음.
첫째로, YjbIup-F / YjbIup-R 및 YjbIdown-F / YjbIdown-R 올리고뉴클레오티드를 사용하여 MG1655 게놈 DNA로부터 "upYjbI" 및 "downYjbI" 단편을 각각 PCR 증폭했다. 둘째로, YjbIup-F / YjbIdown-R 올리고뉴클레오티드를 사용하여 "upYjbI-downYjbI" 단편을 "upYjbI" 및 "downYjbI" PCR 단편으로부터 증폭했다(이. 콜라이의 rrnB 유전자의 전사 종결자 T1의 부분 및 다중 클로닝 부위의 부분을 포함하는 중복 영역을 갖음). "upYjbI-downYjbI" PCR 단편을 제한 효소 SfoI로 절단했고 pUC18 벡터의 블런트 EcoRI / HindIII 부위로 클로닝하여, pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC 플라스미드를 생성했다.
그 다음, 카나마이신 저항성 카세트를 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 pKD4 벡터로부터 PCR로 증폭했다.
Km-F (서열번호 5)
TCCCCCGGGGTATACcatatgaatatcctccttag
- 카나마이신 저항성 카세트의 증폭의 영역(소문자)(참조 서열은 다트센코 & 와너, 2000에 있음),
- SmaI 및 BstZ17I 제한효소 절단부위 및 여분의 염기의 영역(대문자)
을 갖음.
Km-R (서열번호 6)
GCCCAAGCTTtgtaggctggagctgcttcg
- 카나마이신 저항성 카세트의 증폭의 영역(소문자)(참조 서열은 다트센코 & 와너, 2000에 있음),
- HindIII 제한효소 절단부위 및 여분의 염기의 영역(대문자)
을 갖음.
PCR 단편을 제한 효소 BstZ17I 및 HindIII로 절단하고 pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC 플라스미드의 BstZ17I / HindIII 부위로 클로닝하여, pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC::Km 플라스미드를 생성했다.
최종적으로, Ptrc01/RBS01-GcvTHP-F / GcvTHP-TT07-R 올리고뉴클레오티드(하기 기재됨)를 사용하여 Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 단편을 균주 1의 게놈 DNA로부터 PCR 증폭했다. PCR 단편을 제한 효소 ApaI 및 PacI로 절단하고 pUC18-ΔyjbI::TT07-SMC::Km 플라스미드의 ApaI / PacI 부위로 클로닝하여, pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 플라스미드를 생성했다.
재조합 플라스미드를 DNA 서열분석으로 확인했다.
Ptrc01/RBS01-GcvTHP-F (서열번호 7)
CGTAGGCCTGGGCCCgagctgttgacaattaatcatccg
- 균주 1에서 gcvTHP 오페론의 업스트림에 위치된 인공적으로 유도가능 trc 프로모터의 부분과 상동인 영역(소문자)
- StuI 및 ApaI 제한효소 절단부위 및 여분의 염기의 영역(대문자)
을 갖음.
GcvTHP-TT07-R (서열번호 8)
CGAAGGCCTTTAATTAAGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGCGGCCGCttactggtattcgctaatcggtacg
- gcvP 유전자의 서열(3044190-3044214)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- TT07로 명명된, T7te 전사 종결자 서열의 영역(굵은 대문자)(문헌[Harrington et al ., 2001]),
- PacI, StuI 제한효소 절단부위 및 여분의 염기의 영역
을 갖음.
최종적으로, 프로토콜 1에 따라 ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 절편을 KpnI 제한 효소로 pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 플라스미드를 절단하고 그 다음 전기천공법에 의해 MG1655 metA*11 pKD46 균주로 도입함으로써 얻었다. 그 다음 카나마이신 저항성 형질전환체를 선택했고, ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 단편의 삽입을 올리고뉴클레오티드 yjbI-gcvTHP-F 및 yjbI-gcvTHP-R에 의한 PCR 분석으로 확인했다. 확인되고 선택된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km이라 불렀다.
yjbI-gcvTHP-F (서열번호 9)
cagaccacccaactggcgacc
- yjbI 영역의 서열(4247754-4247774)과 상동성임(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음)
yjbI-gcvTHP-R (서열번호 10)
gccattggaatcgaccagcc
- yjbI 영역의 서열(4251489-4251508)과 상동성임(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음)
그 다음 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 염색체 변형물을 프로토콜 2에 따라 균주 1에 트랜스덕션했다.
카나마이신 저항성 트랜스덕션 생성물을 선택했고, ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 염색체 변형물의 존재를 프라이머 yjbI-gcvTHP-F 및 yjbI-gcvTHP-R로 PCR 분석에 의해 확인했다.
생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ Δp y kF ΔpykA ΔpurU Δ yncA ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA *1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC Δ yjbI :: RN/Ptrc01/RBS01- gcvTHP -TT07::Km를 균주 2라 불렀다.
3. 균주 3의 구축
균주 3의 구축을 위해, 균주 2의 염색체 인테그레이션 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km와 연관된 저항성 카세트를 프로토콜 1에 따라 제거했다.
카나마이신 민감성 클론을 선택했고 카나마이신 카세트의 부재를 프라이머 yjbI-gcvTHP-F 및 yjbI-gcvTHP-R로 PCR에 의해 확인했다. 생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU Δ yncA Δm a lS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA *1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA - serC Δ yjbI :: RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07를 균주 3이라 명명했다.
4. 균주 4의 구축
특허 출원 제PCT/FR2010/052937호(이 출원에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 플라스미드 pCL1920-PgapA-pycre-TT07를 균주 2에 도입하여, 균주 4라 명명된 다음 균주 MG1655 metA*11 Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA Δp u rU Δ yncA ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA *1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA - serC ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km (pCL1920-PgapA-pycre-TT07)를 생성했다.
5. 균주 5의 구축
세린 경로로의 플럭스를 증가시키기 위해, serC 및 serA 유전자를 인공 프로모터 및 최적화된 리보좀 결합 부위로 인해, 박테리아 인공 염색체 pCC1BAC(에피센터(Epicentre))를 사용하여 과발현시켰다. 이 목적에서, 다음 플라스미드 pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca를 구축했다.
pCC1BAC-TT02-Ptrc30 / RBS01 - serC -TT07*2-Ptrc30 / RBS01 - serA -TTadcca의 구축을 위해, "TT02-Ptrc30 / RBS01 - serC -TT07*2" 및 "Ptrc30 / RBS01 - serA -TTadcca" 영역을 PCR로 증폭했다.
"TT02-Ptrc30 / RBS01 - serC -TT07*2" 영역에 대해, 전사 종결자(rrnB의 T1,TT02라 표시됨), 인공 프로모터(Ptrc30), 최적화된 리보좀 결합 부위(RBS01) 및 serC 유전자의 개시부분을 장착한 첫번째 메가프라이머를 매트릭스 첨가 없이 올리고뉴클레오티드 Ptrc30/RBS01-F 및 Ptrc30/RBS01-serC-R(하기에 기재됨)를 사용한 쇼트 PCR로 합성했다. 둘째로, "TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2" 절편을 매트릭스로서 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA, 및 합성 메가프라이머 및 serC-TT07*2-R 올리고뉴클레오티드(하기에 기재됨)를 사용하여 PCR로 증폭했다.
Ptrc30/RBS01-F (서열번호 11)
tcggcgccttaattaaCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTtacgtaGAGCTGTTGACGATTAATCATCCGGCTCGTATACTGTGTGGAA TAAGGAGGTATATT
- 이. 콜라이의 rrnB 유전자의 전사 종결자 T1의 영역(굵은 대문자)(문헌[Orosz et al .,1991]),
- 인공 유도가능 trc 프로모터와 상동인 영역(밑줄 대문자),
- 최적화된 리보좀 결합 부위와 상동인 영역(이탤릭체 대문자),
- NarI, PacI 제한효소 부위 및 여분의 염기의 영역(소문자)
을 갖음.
Ptrc30/RBS01-serC-R (서열번호 12)
ccagaactaaaattgaagatttgagccatAATATACCTCCTTA TTCCACACAGTATACGAGC
- 인공 유도가능 trc 프로모터와 상동인 영역(밑줄 대문자),
- 최적화된 리보좀 결합 부위와 상동인 영역(이탤릭체 대문자),
- serC 유전자의 서열(956876-956904)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음)
을 갖음.
serC-TT07*2-R (서열번호 13)
CCCAAGCTTGCATGCGCTAGCGAGCTCGAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGttaaccgtgacggcgttcg
- 29 번 위치에서 염기 결실을 갖는 T7te 전사 종결자 서열(문헌[Harrington et al ., 2001])의 영역(굵은 대문자)(TT07*2라 명명됨),
- serC 유전자의 서열(957946-957964)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- HindIII, SphI, SacI, 및 NheI 제한효소 부위 및 여분의 염기의 영역(대문자)
을 갖음.
동일한 방식으로, "Ptrc30 / RBS01 - serA -TTadcca" 단편을 매트릭스로서 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA, 및 Ptrc30/RBS01-serA-F 및 serA-TTadcca-R 올리고뉴클레오티드(하기에 기재됨)를 사용하여 PCR로 증폭했다.
Ptrc30/RBS01-serA-F (서열번호 14)
TACGTAGCTAGCGAGCTGTTGACGATTAATCATCCGGCTCGTATACTGTGTGGAA TAAGGAGGTATATTatggcaaaggtatcgctggagaaag
- 인공 유도가능 trc 프로모터와 상동인 영역(밑줄 대문자),
- 최적화된 리보좀 결합 부위와 상동인 영역(이탤릭 대문자),
- serA 유전자의 서열(3056408-3056432)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- NheI 제한효소 절단부위 및 여분의 염기의 영역(대문자)
을 갖음.
serA-TTadcca-R (서열번호 15)
CCCAAGCTTGCATGCCCTAGGTAAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAttagtacagcagacgggcgcg
- TTadc 전사 종결자 서열(pSLO1 메가플라스미드의 179847 번 내지 179807 번과 상동인 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 adc 유전자의 전사 종결자)의 영역(굵은 대문자),
- serA 유전자의 서열(3055200-3055220)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- AvrII, SphI, HindIII 제한효소 부위 및 여분의 염기의 영역(대문자)
PCR 단편, "TT02-Ptrc30 / RBS01 - serC -TT07*2" 및 "Ptrc30 / RBS01 - serA -TTadcca"을 각각 제한 효소 NarI / NheI, 및 NheI / SphI으로 절단했고, 둘 다 pCC1BAC 플라스미드의 NarI / SphI 부위로 클로닝하여, pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca 플라스미드를 생성했다. 재조합 플라스미드를 DNA 서열분석으로 확인했다.
최종적으로, 플라스미드 pCC1BAC-TT02-Ptrc30 / RBS01 - serC -TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca를 균주 4에 도입하여, 균주 5라 명명된 다음 균주 MG1655 metA*11 Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA Δp u rU Δ yncA ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA *1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA - serC ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca)를 생성했다.
6. 균주 5의 metE 돌연변이의 동정
균주 5의 메티오닌 신타아제 활성(METE)을 측정함으로써, 우리는 metE 유전자가, 절삭된 MetE 단백질을 생성하는 일부 돌연변이 때문에 기능성이 없음을 동정했다.
돌연변이는 프레임 시프트 돌연변이로 이어지는 metE 유전자의 13 bp(유전자의 417 번 내지 429 번 염기)의 결실이다. 결과적으로, 단백질의 번역이 (프레임 시프트에 의해 도입된 종결 코돈으로 인해) 단축되고 753 개 대신 152 개의 아미노산의 절삭된 단백질을 생성한다.
다음은 WT MetE 단백질의 서열이다(서열번호 21):
MTILNHTLGFPRVGLRRELKKAQESYWAGNSTREELLAVGRELRARHWDQQKQAGIDLLPVGDFAWYDHVLTTSLLLGNVPARHQNKDGSVDIDTLFRIGRGRAPTGEPAAAAEMTKWFNTNYHYMVPEFVKGQQFKLTWTQLLDEVDEALALGHKVKPVLLGPVTWLWLGKVKGEQFDRLSLLNDILPVYQQVLAELAKRGIEWVQIDEPALVLELPQAWLDAYKPAYDALQGQVKLLLTTYFEGVTPNLDTITALPVQGLHVDLVHGKDDVAELHKRLPSDWLLSAGLINGRNVWRADLTEKYAQIKDIVGKRDLWVASSCSLLHSPIDLSVETRLDAEVKSWFAFALQKCHELALLRDALNSGDTAALAEWSAPIQARRHSTRVHNPAVEKRLAAITAQDSQRANVYEVRAEAQRARFKLPAWPTTTIGSFPQTTEIRTLRLDFKKGNLDANNYRTGIAEHIKQAIVEQERLGLDVLVHGEAERNDMVEYFGEHLDGFVFTQNGWVQSYGSRCVKPPIVIGDISRPAPITVEWAKYAQSLTDKPVKGMLTGPVTILCWSFPREDVSRETIAKQIALALRDEVADLEAAGIGIIQIDEPALREGLPLRRSDWDAYLQWGVEAFRINAAVAKDDTQIHTHMCYCEFNDIMDSIAALDADVITIETSRSDMELLESFEEFDYPNEIGPGVYDIHSPNVPSVEWIEALLKKAAKRIPAERLWVNPDCGLKTRGWPETRAALANMVQAAQNLRRG*
다음은 절삭된 MetE * 단백질의 서열이다(서열번호 22):
MTILNHTLGFPRVGLRRELKKAQESYWAGNSTREELLAVGRELRARHWDQQKQAGIDLLPVGDFAWYDHVLTTSLLLGNVPARHQNKDGSVDIDTLFRIGRGRAPTGEPAAAAEMTKWFNTNYHYMVPEFVKGQQFKLTWTKWTRRWRWATR*
실시예 3: 균주 7, MG1655 metA *11 metE :: Km P trc 01 *2/ RBS08 *1- metH P trc 01 - cysPUWAM P trc 01 - cysJIH P trc 01 / RBS01 - gcvTHP P trc 01 / ARN01 / RBS01 - metF P trc 94 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: RN / PRM - CI857 - TT adcca -PR01/RBS01*4- thrA* 1- cysE Δ pgaABCD :: RN / PR01 / RBS01 - thrA *1- cysE - P gapA - metA *11 Δ u xa CA :: RN / PR01 / RBS01 - thrA *1- cysE - P gapA - metA *11 Δ CP4 -6 :: RN / PR01 / RBS01 - thrA *1- cysE -P gapA - metA *11 Δ wcaM :: RN / PR01 / RBS01 - thrA * 1- cysE - P gapA - metA *11 Δ treBC ::RN/ serA-serC Δ yjbI :: RN / P trc 01 / RBS01 - gcvTHP - TT07 ( pCL1920 - P gapA - pycre -TT07) ( pCC1BAC - TT02 - P trc 30 / RBS01 - serC - TT07 *2- P trc 30 / RBS01 - serA - TT adcca )의 구축
1. 균주 6의 구축
기능성 MetE 단백질의 회복이 균주 5의 메티오닌 생산을 변화시킬 수 있을지를 연구하기 위해, 우리는 다트센코 & 와너(2000)에 의해 기재된 상동 재조합 전략을 사용하여 절삭된 metE 유전자를 야생형으로 교체했다.
이 목적에서, metE 영역과 상동성인 절편과 인접한 카나마이신 카세트, "metE::Km" 절편을 올리고뉴클레오티드 metE-Km-F 및 metE-Km(하기에 기재됨)를 사용하여 PCR 증폭했다. "metE::Km" 절편을 metE 유전자의 기능성 버전을 갖는 MG1655 metA*11 pKD46 균주로 도입했다.
metE-Km-F (서열번호 16)
agaaacccgcgcggcactggcgaacatggtgcaggcggcgcagaacttgcgtcgggggtaaaatccaaaccgggtggtaataccacccggtcttttctcaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
- metE 영역의 서열(4013277-4013376)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- 카나마이신 저항성 카세트의 증폭의 영역(대문자)(참조 서열은 다트센코 & 와너, 2000에 있음)
을 갖음.
metE-Km-R (서열번호 17)
gcagaagatggctggcagcgtatgctggaatggtttaagcagtatggtgggaagaagtcgctgtaaGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGACATATGAATATCCTCCTTAG
- metE 영역의 서열(4013377-4013442)과 상동성인 영역(소문자)(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음),
- T7te 전사 종결자 서열(문헌[Harrington et al ., 2001])의 영역(굵은 대문자),
- 카나마이신 저항성 카세트의 증폭의 영역(대문자)(참조 서열은 다트센코 & 와너, 2000에 있음)
을 갖음.
카나마이신 저항성 재조합물을 선택했고, metE 유전자의 다운스트림의 Km 카세트의 존재를 올리고뉴클레오티드 metE-F 및 metE-R(하기에 기재됨)으로 PCR에 의해 확인했다. 확인되고 선택된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 metE::Km이라 불렀다.
metE-F (서열번호 18)
cgtttgggactggatgtgctgg
- metE 영역의 서열(4012495-4012516)과 상동성임(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음).
metE-R (서열번호 19)
gcgtggtacggcaaactgac
- metE 영역의 서열(4013672-4013691)과 상동성임(참조 서열은 웹사이트 http://www.ecogene.org/에 있음).
그 다음 프로토콜 2에 따라 metE::Km 염색체 변형물을 균주 3에 트랜스덕션했다.
카나마이신 저항성 재조합물을 선택했고, metE 유전자의 다운스트림의 Km 카세트의 존재를 올리고뉴클레오티드 metE-F 및 metE-R(하기에 기재됨)로 PCR에 의해 확인했다. 야생형 서열을 갖는 metE 유전자의 존재를 DNA 서열분석으로 확인했다.
생성된 균주 MG1655 metA*11 metE　::Km Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU Δ yncA ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δu xa CA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA-serC Δ yjbI ::RN/Ptrc01/RBS01- gcvTHP -TT07를 균주 6이라 명명했다.
2. 균주 7의 구축
플라스미드 pCL1920-PgapA-pycre-TT07(특허 출원 제PCT/FR2010/052937호에 기재됨) 및 플라스미드 pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca(하기에 기재됨)을 균주 6에 도입하여, 균주 7이라 명명된 균주 MG1655 metA*11 metE::Km Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA Δp u rU Δ yncA ΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA *1-cysE ΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::RN/serA - serC ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca)를 생성했다.
균주 6의 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제(MS, MetE) 활성의 측정으로 MetE 단백질이 기능성이 있음을 확인했다.
실시예 4: 생물반응장치 내에서 발효에 의한 L-메티오닌의 생산
상당량의 메티오닌을 생산하는 균주를 페드배치 전략을 사용하여 0.5 L 발효조(GX, GPC) 내의 생산 조건 하에서 후속하여 테스트했다.
간략하게, 최소 배지(B1a)에서의 24 시간 사전배양물을 접종시키기 위해 2.5 g.L-1 글루코스를 갖는 10 mL LB 배지에서 성장된 24 시간 배양물을 사용하였다. 이들 인큐베이션을 회전 진탕기(200 RPM)에서 40 mL의 최소 배지(B1a)를 함유하는 500 ml 배플 플라스크에서 수행했다. 제1 사전배양을 30 ℃의 온도에서 실현시켰고, 제2 사전배양을 34 ℃의 온도에서 실현시켰다.
제3 사전배양 단계를 5 mL의 농축 사전배양물을 갖는 1.2 g.L-1의 바이오매스 농축액에 접종된 200 mL의 최소 배지(B1b)로 충전된 생물반응장치(식스포어스(Sixfors))에서 수행했다. 사전배양 온도를 34 ℃에서 일정하게 유지했고, 10 % NH4OH 용액을 사용하여 6.8의 값으로 pH를 자동 조절했다. 용존 산소 농도를 급기 및/또는 교반에 의해 30 %의 부분 공기압 포화의 값으로 계속하여 조절했다. 배치 배지로부터 글루코스 고갈 이후 페드배치를 0.7 mL.h-1의 초기 유속으로 개시했고 약 20 g.L-1의 최종 세포 농도를 얻기 위해 0.13 h-1의 성장 속도로 24 시간 동안 지수함수적으로 증가시켰다.
<표 4: 사전배양 배치 무기질 배지 조성물(B1a 및 B1b)>
Figure pct00005
<표 5: 사전배양 페드배치 무기질 배지 조성물(F1)>
Figure pct00006
<표 6: 배양 배치 무기질 배지 조성물(B2)>
Figure pct00007
<표 7: 배양 페드배치 배지 조성물(B2)>
Figure pct00008
후속적으로, GX 0.5 L 발표조(GPC)를 220 mL의 최소 배지(B2)로 충전했고, 20 내지 30 mL 범위의 사전배양 부피로 2.1 g.L-1의 바이오매스 농도로 접종시켰다.
배양 온도를 37 ℃로 일정하게 유지했고, NH4OH 용액(NH4OH 10 %)의 자동 첨가에 의해 pH를 작업 값(6.8)으로 유지했다. 초기 교반 속도를 배치 단계 동안 200 RPM으로 설정했고 페드배치 단계 동안 1000 RPM으로 증가시켰다. 초기 기류 속도를 배치 단계 동안 0.3 L.min-1로 설정했고 페드배치 단계의 개시시 0.7 L.min- 1 로 증가시켰다. 용존 산소 농도를 교반을 증가시키면서 20 내지 40 %, 바람직하게는 30 % 포화의 값으로 유지시켰다.
세포 매스가 5 g.L-1에 근접한 농도에 도달했을 때, 페드배치를 1.9 mL.h-1의 초기 유속으로 개시했다. 피딩 용액을 26 시간 후에 8.8 mL.h-1에 도달하도록 유속이 증가되는 S자 형 프로필로 주입했다. 정밀 피딩 조건을 방정식
Figure pct00009
로 계산했으며, 여기서 Q(t)는 600 mL의 배치 부피에 대한 mL.h-1 단위의 피딩 유속이고, p1 = 0.66, p2 = 8.21, p3 = 0.27, p4 = 6.50이다.
페드배치 26 시간 후, 피딩 용액 펌핑을 중단했고 글루코스 완전 소모 이후 배양을 종료했다.
세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 이후 HPLC로 정량화했고, 다른 관련 대사산물을 굴절 검출(유기산 및 글루코스) 및 실릴화 이후 GC-MS에 의해 HPLC를 사용하여 분석했다.
<표 8: 상이한 균주에 의한 페드배치 배양에서 생산된 글루코스의 g 당 메티오닌의 g의 %로의 최종 메티오닌 수율(Ymet 최종). 메티오닌/글루코스 수율의 정의에 대해 하기 참조. 각 균주를 1 회 평가하였다.>
Figure pct00010
상기 표 8에서 알 수 있는 것처럼, 메티오닌 생산의 수율은 metE 유전자 돌연변이 이후 상당히 증가했다. 돌연변이화된 metE 유전자를 함유하는 균주 5는 기능성 MetE 단백질을 함유하는 균주 7에 비해 4 퍼센트 더 높은 수율을 가진다.
반응장치의 초기 부피에, pH를 조절하고 배양물을 피딩하기 위해 첨가된 용액의 양을 더하고, 샘플링을 위해 사용되고 증발에 의해 손실된 부피를 뺌으로써 발효조 부피를 계산했다.
그 다음 계속적으로 페드배치 부피를 피딩 스톡을 칭량하였다. 그 다음, 용액의 주입된 중량, 밀도 및 브릭스(Brix)의 방법에 의해 결정된 글루코스 농도([글루코스])를 기준으로 주입된 글루코스의 양을 계산했다. 메티오닌 수율을 하기와 같이 표현했다:
Figure pct00011
배양 동안 얻은 최종 수율이 각 균주에 대해 여기에 나타낸다.
메티오닌O 및 메티오닌t는 각각 초기 및 최종 메티오닌 농도를 나타내고 V0 및 Vt는 초기 및 최종 부피를 나타낸다.
소모된 글루코스는 하기와 같이 계산된다.
Figure pct00012
주입된 글루코스t = 피딩된 부피t * [글루코스]
소모된 글루코스t = [글루코스]0 * V0 + 주입된 글루코스 - [글루코스]잔여 * Vt ([글루코스]0, [글루코스], [글루코스]잔여는 각각 초기, 피딩된, 및 잔여 글루코스 농도임)
실시예 5: 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제( MetE ) 활성의 측정
코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제(MS, MetE) 활성의 체외(in vitro) 결정을 위해, 상기 실시예 3에서 기재된 대로 각각 야생형 또는 돌연변이화된 metE 유전자를 운반하는 이. 콜라이 균주 7 및 5를 최소 배지에서 배양했고 원심분리에 의해 로그 단계의 종반에서 수확했다. 펠렛을 단백질 분해효소 억제제와 EDTA의 칵테일을 함유하는 차가운 20 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.2에서 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 프리셀리스(Precellys) 시스템으로 비드 비팅(베르틴 테크놀로지스(Bertin Technologies); 6500 rpm에서 2x10 s)에 의해 분쇄한 후 30 분 동안 4 ℃에서 12000 g에서 원심분리했다. 상층액을 탈염화시켜 효소 분석을 위해 사용했다. 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 분석 시약(브래드포드, 1976)을 사용하여 결정했다.
MS 활성의 결정을 위해, 40 ㎍의 조 세포 추출물을 100 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.2, 5 mM MgSO4에서 1 mM DL-호모시스테인 및 0.25 mM 메틸-테트라히드로프테로일-트리글루타메이트로 37 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제에 의해 생산된 메티오닌을 tert-부틸디메틸실릴트리플루오로아세타미드(TBDMSTFA)에 의한 유도체화 이후 GC-MS에 의해 정량화했다. 아스파르테이트 및 노르류신을 내부 표준으로서 포함시켰다.
코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제 활성의 결과가 하기 표 9에 나타난다.
<표 9: 야생형 또는 돌연변이 효소를 운반하는 이. 콜라이 균주의 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제 활성(mUI/mg 단백질). 각 균주를 1 회 평가했다.>
Figure pct00013
표 9에서 볼 수 있는 것처럼, 균주 5(ΔmetE)는 그의 MS 활성이 완전히 손실된 반면 균주 7은 상당량을 유지했다. 이 활성의 손실은 메티오닌 생산의 상당한 개선과 연관된다.
실시예 6: L-메티오닌의 생산에서 METE 유전자의 결실의 효과
L-메티오닌의 생산에서 metE 유전자의 완전한 결실의 효과를 평가하기 위해, 우리는 균주 5의 돌연변이화된 metE 유전자를 결실시켰다. 우리는 이전에 기재된 것처럼 상동 재조합을 사용하고 다트센코 & 와너(2000)에 의해 제공된 전략을 사용하여 그 균주에서 metE 유전자의 깨끗한 결실을 도입했다.
카나마이신 카세트에 의한 돌연변이화된 metE 유전자의 교체 이후, 카나마이신 저항성 재조합물을 선택했고 DNA 서열분석에 의해 확인했다.
이들 중 하나를 실시예 4에 기재된 것처럼 배양했고 생산된 L-메티오닌을 HPLC에 의해 정량화했다.
metE가 깨끗하게 결실된 균주는 기능성 MetE 단백질을 갖는 균주 7보다 메티오닌을 더 생산했다: metE의 결실은 15 % 초과의 메티오닌의 증가된 수율을 가져왔다.
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Oligonucleotide <400> 5 tcccccgggg tataccatat gaatatcctc cttag 35 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 gcccaagctt tgtaggctgg agctgcttcg 30 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 cgtaggcctg ggcccgagct gttgacaatt aatcatccg 39 <210> 8 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 8 cgaaggcctt taattaagca gaaaggccca cccgaaggtg agccaggcgg ccgcttactg 60 gtattcgcta atcggtacg 79 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 cagaccaccc aactggcgac c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 10 gccattggaa tcgaccagcc 20 <210> 11 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 11 tcggcgcctt aattaacatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg 60 ttttatctgt ttacgtagag ctgttgacga ttaatcatcc ggctcgtata ctgtgtggaa 120 taaggaggta tatt 134 <210> 12 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 12 ccagaactaa aattgaagat ttgagccata atatacctcc ttattccaca cagtatacga 60 gc 62 <210> 13 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 13 cccaagcttg catgcgctag cgagctcgag aaaggcccac ccgaaggtga gccaggttaa 60 ccgtgacggc gttcg 75 <210> 14 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 14 tacgtagcta gcgagctgtt gacgattaat catccggctc gtatactgtg tggaataagg 60 aggtatatta tggcaaaggt atcgctggag aaag 94 <210> 15 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 15 cccaagcttg catgccctag gtaaaaaaaa taagagttac catttaaggt aactcttatt 60 tttattagta cagcagacgg gcgcg 85 <210> 16 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 16 agaaacccgc gcggcactgg cgaacatggt gcaggcggcg cagaacttgc gtcgggggta 60 aaatccaaac cgggtggtaa taccacccgg tcttttctca tgtaggctgg agctgcttcg 120 <210> 17 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 17 gcagaagatg gctggcagcg tatgctggaa tggtttaagc agtatggtgg gaagaagtcg 60 ctgtaagcag aaaggcccac ccgaaggtga gccagtgtga catatgaata tcctccttag 120 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 18 cgtttgggac tggatgtgct gg 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 19 gcgtggtacg gcaaactgac 20 <210> 20 <211> 2262 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 20 atgacaatat tgaatcacac cctcggtttc cctcgcgttg gcctgcgtcg cgagctgaaa 60 aaagcgcaag aaagttattg ggcggggaac tccacgcgtg aagaactgct ggcggtaggg 120 cgtgaattgc gtgctcgtca ctgggatcaa caaaagcaag cgggtatcga cctgctgccg 180 gtgggcgatt ttgcctggta cgatcatgta ctgaccacca gtctgctgct gggtaacgtt 240 ccggcgcgtc atcagaacaa agatggttcg gtagatatcg acaccctgtt ccgtattggt 300 cgtggacgtg cgccgactgg cgaacctgcg gcggcagcgg aaatgaccaa atggtttaac 360 accaactatc actacatggt gccggagttc gttaaaggcc aacagttcaa actgacctgg 420 acgcagctgc tggacgaagt ggacgaggcg ctggcgctgg gccacaaggt gaaacctgtg 480 ctgctggggc cggttacctg gctgtggctg gggaaagtga aaggtgaaca atttgaccgc 540 ctgagcctgc tgaacgacat tctgccggtt tatcagcaag tgctggcaga actggcgaaa 600 cgcggcatcg agtgggtaca gattgatgaa cccgcgctgg tactggaact accacaggcg 660 tggctggacg catacaaacc cgcttacgac gcgctccagg gacaggtgaa actgctgctg 720 accacctatt ttgaaggcgt aacgccaaat ctcgacacga ttactgcgct gcctgttcag 780 ggtctgcatg ttgacctcgt acatggtaaa gatgacgttg ctgaactgca caagcgcctg 840 ccttctgact ggttgctgtc tgcgggtctg atcaatggtc gtaacgtctg gcgcgccgat 900 cttaccgaga aatatgcgca aattaaggac attgtcggca aacgtgattt gtgggtggca 960 tcttcctgct cgttgctgca cagccccatc gacctgagcg tggaaacgcg tcttgatgca 1020 gaagtgaaaa gctggtttgc cttcgcccta caaaaatgcc atgaactggc actgctgcgc 1080 gatgcgctga acagtggtga cacggcagct ctggcagagt ggagcgcccc gattcaggca 1140 cgtcgtcact ctacccgcgt acataatccg gcggtagaaa agcgtctggc ggcgatcacc 1200 gcccaggaca gccagcgtgc gaatgtctat gaagtgcgtg ctgaagccca gcgtgcgcgt 1260 tttaaactgc cagcgtggcc gaccaccacg attggttcct tcccgcaaac cacggaaatt 1320 cgtaccctgc gtctggattt caaaaagggc aatctcgacg ccaacaacta ccgcacgggc 1380 attgcggaac atatcaagca ggccattgtt gagcaggaac gtttgggact ggatgtgctg 1440 gtacatggcg aggccgagcg taatgacatg gtggaatact ttggcgagca cctcgacgga 1500 tttgtcttta cgcaaaacgg ttgggtacag agctacggtt cccgctgcgt gaagccaccg 1560 attgtcattg gtgacattag ccgcccggca ccgattaccg tggagtgggc gaagtatgcg 1620 caatcgctga ccgacaaacc ggtgaaaggg atgctgacgg ggccggtgac catactctgc 1680 tggtcgttcc cgcgtgaaga tgtcagccgt gaaaccatcg ccaaacagat tgcgctggcg 1740 ctgcgtgatg aagtggccga tctggaagcc gctggaattg gcatcatcca gattgacgaa 1800 ccggcgctgc gcgaaggttt accgctgcgt cgtagcgact gggatgcgta tctccagtgg 1860 ggcgtagagg ccttccgtat caacgccgcc gtggcgaaag atgacacaca aatccacact 1920 cacatgtgtt attgcgagtt caacgacatc atggattcga ttgcggcgct ggacgcagac 1980 gtcatcacca tcgaaacctc gcgttccgac atggagttgc tggagtcgtt tgaagagttt 2040 gattatccaa atgaaatcgg tcctggcgtc tatgacattc actcgccaaa cgtaccgagc 2100 gtggaatgga ttgaagcctt gctgaagaaa gcggcaaaac gcattccggc agagcgcctg 2160 tgggtcaacc cggactgtgg cctgaaaacg cgcggctggc cagaaacccg cgcggcactg 2220 gcgaacatgg tgcaggcggc gcagaacttg cgtcgggggt aa 2262 <210> 21 <211> 753 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 21 Met Thr Ile Leu Asn His Thr Leu Gly Phe Pro Arg Val Gly Leu Arg 1 5 10 15 Arg Glu Leu Lys Lys Ala Gln Glu Ser Tyr Trp Ala Gly Asn Ser Thr 20 25 30 Arg Glu Glu Leu Leu Ala Val Gly Arg Glu Leu Arg Ala Arg His Trp 35 40 45 Asp Gln Gln Lys Gln Ala Gly Ile Asp Leu Leu Pro Val Gly Asp Phe 50 55 60 Ala Trp Tyr Asp His Val Leu Thr Thr Ser Leu Leu Leu Gly Asn Val 65 70 75 80 Pro Ala Arg His Gln Asn Lys Asp Gly Ser Val Asp Ile Asp Thr Leu 85 90 95 Phe Arg Ile Gly Arg Gly Arg Ala Pro Thr Gly Glu Pro Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Glu Met Thr Lys Trp Phe Asn Thr Asn Tyr His Tyr Met Val Pro 115 120 125 Glu Phe Val Lys Gly Gln Gln Phe Lys Leu Thr Trp Thr Gln Leu Leu 130 135 140 Asp Glu Val Asp Glu Ala Leu Ala Leu Gly His Lys Val Lys Pro Val 145 150 155 160 Leu Leu Gly Pro Val Thr Trp Leu Trp Leu Gly Lys Val Lys Gly Glu 165 170 175 Gln Phe Asp Arg Leu Ser Leu Leu Asn Asp Ile Leu Pro Val Tyr Gln 180 185 190 Gln Val Leu Ala Glu Leu Ala Lys Arg Gly Ile Glu Trp Val Gln Ile 195 200 205 Asp Glu Pro Ala Leu Val Leu Glu Leu Pro Gln Ala Trp Leu Asp Ala 210 215 220 Tyr Lys Pro Ala Tyr Asp Ala Leu Gln Gly Gln Val Lys Leu Leu Leu 225 230 235 240 Thr Thr Tyr Phe Glu Gly Val Thr Pro Asn Leu Asp Thr Ile Thr Ala 245 250 255 Leu Pro Val Gln Gly Leu His Val Asp Leu Val His Gly Lys Asp Asp 260 265 270 Val Ala Glu Leu His Lys Arg Leu Pro Ser Asp Trp Leu Leu Ser Ala 275 280 285 Gly Leu Ile Asn Gly Arg Asn Val Trp Arg Ala Asp Leu Thr Glu Lys 290 295 300 Tyr Ala Gln Ile Lys Asp Ile Val Gly Lys Arg Asp Leu Trp Val Ala 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Leu Leu His Ser Pro Ile Asp Leu Ser Val Glu Thr 325 330 335 Arg Leu Asp Ala Glu Val Lys Ser Trp Phe Ala Phe Ala Leu Gln Lys 340 345 350 Cys His Glu Leu Ala Leu Leu Arg Asp Ala Leu Asn Ser Gly Asp Thr 355 360 365 Ala Ala Leu Ala Glu Trp Ser Ala Pro Ile Gln Ala Arg Arg His Ser 370 375 380 Thr Arg Val His Asn Pro Ala Val Glu Lys Arg Leu Ala Ala Ile Thr 385 390 395 400 Ala Gln Asp Ser Gln Arg Ala Asn Val Tyr Glu Val Arg Ala Glu Ala 405 410 415 Gln Arg Ala Arg Phe Lys Leu Pro Ala Trp Pro Thr Thr Thr Ile Gly 420 425 430 Ser Phe Pro Gln Thr Thr Glu Ile Arg Thr Leu Arg Leu Asp Phe Lys 435 440 445 Lys Gly Asn Leu Asp Ala Asn Asn Tyr Arg Thr Gly Ile Ala Glu His 450 455 460 Ile Lys Gln Ala Ile Val Glu Gln Glu Arg Leu Gly Leu Asp Val Leu 465 470 475 480 Val His Gly Glu Ala Glu Arg Asn Asp Met Val Glu Tyr Phe Gly Glu 485 490 495 His Leu Asp Gly Phe Val Phe Thr Gln Asn Gly Trp Val Gln Ser Tyr 500 505 510 Gly Ser Arg Cys Val Lys Pro Pro Ile Val Ile Gly Asp Ile Ser Arg 515 520 525 Pro Ala Pro Ile Thr Val Glu Trp Ala Lys Tyr Ala Gln Ser Leu Thr 530 535 540 Asp Lys Pro Val Lys Gly Met Leu Thr Gly Pro Val Thr Ile Leu Cys 545 550 555 560 Trp Ser Phe Pro Arg Glu Asp Val Ser Arg Glu Thr Ile Ala Lys Gln 565 570 575 Ile Ala Leu Ala Leu Arg Asp Glu Val Ala Asp Leu Glu Ala Ala Gly 580 585 590 Ile Gly Ile Ile Gln Ile Asp Glu Pro Ala Leu Arg Glu Gly Leu Pro 595 600 605 Leu Arg Arg Ser Asp Trp Asp Ala Tyr Leu Gln Trp Gly Val Glu Ala 610 615 620 Phe Arg Ile Asn Ala Ala Val Ala Lys Asp Asp Thr Gln Ile His Thr 625 630 635 640 His Met Cys Tyr Cys Glu Phe Asn Asp Ile Met Asp Ser Ile Ala Ala 645 650 655 Leu Asp Ala Asp Val Ile Thr Ile Glu Thr Ser Arg Ser Asp Met Glu 660 665 670 Leu Leu Glu Ser Phe Glu Glu Phe Asp Tyr Pro Asn Glu Ile Gly Pro 675 680 685 Gly Val Tyr Asp Ile His Ser Pro Asn Val Pro Ser Val Glu Trp Ile 690 695 700 Glu Ala Leu Leu Lys Lys Ala Ala Lys Arg Ile Pro Ala Glu Arg Leu 705 710 715 720 Trp Val Asn Pro Asp Cys Gly Leu Lys Thr Arg Gly Trp Pro Glu Thr 725 730 735 Arg Ala Ala Leu Ala Asn Met Val Gln Ala Ala Gln Asn Leu Arg Arg 740 745 750 Gly <210> 22 <211> 152 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 22 Met Thr Ile Leu Asn His Thr Leu Gly Phe Pro Arg Val Gly Leu Arg 1 5 10 15 Arg Glu Leu Lys Lys Ala Gln Glu Ser Tyr Trp Ala Gly Asn Ser Thr 20 25 30 Arg Glu Glu Leu Leu Ala Val Gly Arg Glu Leu Arg Ala Arg His Trp 35 40 45 Asp Gln Gln Lys Gln Ala Gly Ile Asp Leu Leu Pro Val Gly Asp Phe 50 55 60 Ala Trp Tyr Asp His Val Leu Thr Thr Ser Leu Leu Leu Gly Asn Val 65 70 75 80 Pro Ala Arg His Gln Asn Lys Asp Gly Ser Val Asp Ile Asp Thr Leu 85 90 95 Phe Arg Ile Gly Arg Gly Arg Ala Pro Thr Gly Glu Pro Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Glu Met Thr Lys Trp Phe Asn Thr Asn Tyr His Tyr Met Val Pro 115 120 125 Glu Phe Val Lys Gly Gln Gln Phe Lys Leu Thr Trp Thr Lys Trp Thr 130 135 140 Arg Arg Trp Arg Trp Ala Thr Arg 145 150

Claims (13)

  1. 재조합 미생물 내에서 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제 MetE의 활성이 감쇠되는, 메티오닌의 발효적 생산에 최적화된 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 코발라민 비의존적 메티오닌 신타아제 MetE가, 발현이 감쇠된 metE 유전자에 의해 코딩되는 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, metE 유전자의 적어도 일부가 결실된 미생물.
  4. 제1항에 있어서, MetE 단백질이 돌연변이화된 metE 유전자에 의해 코딩된 미생물.
  5. 제4항에 있어서, metE 유전자의 돌연변이가 417 번 내지 429 번 위치를 차지하는 염기의 결실인 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, thrA, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 민감성을 갖는 효소를 코딩하는 metA 대립유전자(metA*), thrA, 또는 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제성을 갖는 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자(thrA*) 중 하나 이상의 발현이 증가된 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 하나 이상의 유전자가 유도가능 프로모터의 통제 하에 있는 미생물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 metJ , pykA , pykF , purU , ybdL 또는 yncA 중 하나 이상의 발현이 감쇠된 미생물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 유전자 metE가 결실되고;
    b. 유전자 metA *, metH , cysPUWAM , cysJIH , gcvTHP , metF , serA , serB , serC, cysE , thrA * 및 pyc의 발현이 강화되고;
    c. 유전자 metJ , pykA , pykF , purU 및 yncA의 발현이 감쇠된
    미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 과 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 또는 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)에 속하는 미생물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)인 미생물.
  12. a. 발효가능한 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 내에서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및
    b. 배양 배지로부터 메티오닌 또는 그의 유도체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 메티오닌의 발효적 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, 재조합 미생물의 성장이 배양 배지 내에서 하나 또는 수 개의 무기질(들), 특히 포스페이트 및/또는 포타슘의 제한 또는 결핍 하에 이루어지는 것인, 메티오닌의 발효적 생산 방법.
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