KR20150008166A - 응고 인자 xi 및/또는 그의 활성화 형태 인자 xia에 결합할 수 있는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 응고 인자 XI 및/또는 그의 활성화 형태 인자 XIa에 결합할 수 있는 항체 및 그의 사용 방법, 특히 혈소판 응집을 억제하고 이에 의해 혈전 형성을 억제하는 작용제로서의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

응고 인자 XI 및/또는 그의 활성화 형태 인자 XIA에 결합할 수 있는 항체 및 그의 용도 {ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO THE COAGULATION FACTOR XI AND/OR ITS ACTIVATED FORM FACTOR XIA AND USES THEREOF}

본 발명은 응고 인자 XI 및/또는 그의 활성화 형태 인자 XIa에 결합할 수 있는 항체 및 그의 사용 방법, 특히 혈소판 응집을 억제하고 이에 의해 혈전 형성을 억제하는 작용제로서의 사용 방법에 관한 것이다.

1964년에 맥팔레인(Macfarlane) 및 데이비 & 래트노프(Davie & Ratnoff) [Macfarlane RG. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier. Nature 1964; 202: 498-9.; Davie EW, Ratnoff OD. Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science 1964; 145: 1310-2.]는 혈액 응고 과정에 대한 그들의 캐스케이드 가설을 도입하였다. 그 이후, 생체내에서의 응고의 기능에 대한 본 발명자들의 지식이 확대되었다. 근년에, 응고가 개시되고 공통의 경로로 수렴되어 궁극적으로는 트롬빈 생성 및 피브린 침착으로 이어진다는 2가지의 별개의 경로, 소위 외인성 및 내인성 경로의 이론이 수정되었다. 최근의 모델에서, 응고의 개시는 혈장 프로테아제 활성화 인자 VII가 조직 인자 (TF)와 접촉하고 이에 의해 복합체를 형성하는 경우에 발생한다. 이러한 조직 인자-FVIIa 복합체는 지모겐 FX을 그의 활성 형태 FXa로 활성화시킬 수 있고, 이는 그로써 프로트롬빈 (응고 인자 II)을 트롬빈 (IIa)으로 전환시킬 수 있다. 응고에서의 핵심 역할자인 트롬빈은, 차례로 피브리노겐의 피브린으로의 전환을 촉매할 수 있다. 추가로, 트롬빈은 혈소판에 의해 발현된 특이적 수용체를 활성화하여 후자의 활성화를 이끈다. 활성화된 혈소판은 피브린과 함께 응괴 형성에 필수적이며, 따라서 정상 지혈에 핵심적인 역할자이다.

제2 증폭 경로는 응고 인자 XI (FXI)에 의해 형성된다. FXI는, 응고 캐스케이드의 다른 구성원과 마찬가지로, 생체내에서 혈액 응고의 초기 단계 및 증폭 단계를 가교하는데 핵심적인 역할을 하는 혈장 세린 프로테아제 지모겐임이 널리 확인되었다 [Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry 1991;30:10363-70; Gailani D, Broze Jr GJ. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991;253:909-12; Kravtsov DV, Matafonov A, Tucker EI, Sun MF, Walsh PN, Gruber A, et al. Factor XI contributes to thrombin generation in the absence of factor XII. Blood 2009;114: 452-8.3-5]. FXI 결핍은 통상적으로 자발성 출혈로 이어지지는 않지만, 지혈 유발에 의한 증가된 출혈의 위험과 연관되고, 한편 출혈의 중증도는 FXI의 혈장 수준과 거의 관련이 없다. 인간에서의 중증 FXI 결핍은 혈전성 질환에 대한 특정한 보호 효과를 갖는다 [Salomon O, Steinberg DM, Zucker M, Varon D, Zivelin A, Seligshon U. Patients with severe factor XI deficiency have a reduced incidence of deep-vein thrombosis. Thromb Haemost 2011;105:269-73; Salomon O, Steinberg DM, Koren-Morag N, Tanne D, Seligsohn U. Reduced incidence of ischemic stroke in patients with severe factor XI deficiency. Blood 2008;111:4113-7]. 그러나, 높은 수준의 FXI는 혈전성 사건과 연관된다 [Meijers JC, Tekelenburg WL, Bouma BN, Bertina RM, Rosendaal FR. High levels of coagulation factor XI as a risk factor for venous thrombosis. N Engl J Med 2000;342:696-701]. 따라서 FXI의 억제는 개선된 이익-위험 비를 달성하기 위한 새로운 항혈전제의 개발에 있어서 신규한 접근법으로서 제안되어 왔다. 따라서, 지혈을 약화시키지 않으면서 혈관내 혈전증을 효과적으로 차단하는 항혈전, 항혈소판 약물에 대한 높은 의학적 필요성이 여전히 존재한다.

최근 몇 년 동안, 신규 항혈전제의 개발은 많은 진전이 있었음에도 불구하고, 이들 작용제에 의해 유발되는 목적하지 않은 출혈 사건이 여전히 심각한 문제로 남아있다. 따라서, 혈전증을 이상적으로 억제하지만 지혈은 보존하는 최적의 항혈전 화합물은 여전히 연구되고 있다.

응고 인자 XI (FXI/FXIa)는 혈소판 수용체 apoER2와 상호작용한다. 본 발명은 FXI/FXIa 활성을 억제하는 것이 전단 흐름 조건하에서 병적인 혈소판 활성화 및 혈소판 응집의 과정을 방해한다는 것을 최초로 입증한다. 생체외 혈전증 모델에서, FXI/FXIa의 억제는 CD62P와 같은 혈소판 활성화 마커의 유의한 감소 뿐만 아니라 콜라겐 표면상에서의 생리학적 흐름 조건 하에서 전혈에서의 하류 미세응집체의 감소로 이어진다. 따라서, 혈소판-의존성 동맥-유형 혈전 형성의 영장류 모델에서 FXIa의 억제는 혈소판-의존성 일차 지혈을 손상시키지 않으면서 혈소판-침착을 감소시킨다. 명백한 항혈소판 효과에도 불구하고, 조직 인자-의존성 일차 지혈 플러그 형성에 필수적인 혈소판과 혈관외 매트릭스 단백질 사이의 초기 상호작용은 놀랍게도 영향을 받지 않는다. 따라서, FXI/FXIa 활성의 억제는 출혈-관련 부작용을 유발하지 않으면서 항혈전 활성을 나타내는 이상적인 약리학적 원칙을 나타낸다. 명확화를 위해: 지혈을 손상시키지 않는다는 것은 응고 인자 XI 및/또는 XIa의 억제가 다른 항응고 화합물 및/또는 항혈소판 화합물의 존재 하에서도 원치않는, 주목할 만한 출혈 사건으로 이어지지 않음을 의미한다. C형 혈우병 환자에 대해 제시된 바와 같이, 출혈 사건은 집중적인 수술 및/또는 중증 손상과 관련해서만 발생한다.

응고 인자 XI의 그의 지모겐 형태 및/또는 그의 활성화 형태, 응고 인자 XIa 형태에 대해 지시된 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체는 혈소판의 응집을 억제 또는 감소시키고, 미세응집체 및/또는 혈전성 응괴의 생성을 억제 또는 감소시키는 것에 의해 항혈소판 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명의 이들 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체, 항원-결합 항체 단편, 및 항체 및 단편의 변이체를 사용하는 것은 지혈을 손상시키지 않으면서 혈소판 응집을 억제하고 이에 의해 혈전증을 억제한다.

또한, 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체의 투여는 중화 항체이고, 항응고제, 항혈전 요법으로서의 본 발명의 이들 항체, 항원-결합 항체 단편, 및 항체 및 단편의 변이체는 원치않는 출혈 사건의 증가된 위험을 야기하지 않는 것으로 본원에 기재되어 있다.

본 발명은 혈장 인자 XI의 활성화된 형태, FXIa에 선택적으로 결합할 수 있으며, 이에 의해 지혈을 손상시키지 않으면서 혈소판 응집 및 연관 혈전증을 억제할 수 있는 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 조성물은 응고 인자 XI의 중쇄 및/또는 응고 인자 XIa의 경쇄의 규정된 에피토프에 결합할 수 있는 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체를 포함한다. 이들 항체는 응고 인자 XIa의 단백질분해적 활성을 차단하는 것에 의해 및/또는 응고 인자 XI을 응고 인자 FXIIa 및/또는 트롬빈을 통해 그의 활성화 형태, 응고 인자 XIa로의 전환을 억제하는 것에 의해 중화 활성을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 항체의 인간 이외의 다른 종, 주로 토끼로부터의 응고 인자 XI 및/또는 XIa에 대한 교차 반응성을 추가로 포함하며, 이는 심도있는 약리학적 및 독성학적 분석을 가능하게 한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 방법은 항-약물 항체의 개발의 위험을 감소시키기 위해 본 발명의 조성물의 면역원성을 최적화 및 감소시키는데 사용된다.

본 발명은 본원에 기재된 항체 중 하나와 경쟁하는 인간 항체를 추가로 포함한다.

추가로, 조성물은 본 발명의 항원-결합 항체 단편, 및 항체 및 단편의 변이체, 이들 항체를 생산하는 세포주, 및 이들 항체의 아미노산을 코딩하는 단리된 핵산을 포함한다. 본 발명은 제약상 허용되는 담체 및/또는 용액 중에 본 발명의 항응고 인자 XI 및/또는 항응고 인자 XIa 항체, 또는 항원-결합 항체 단편, 및 항체 및 단편의 변이체를 포함하는 제약 조성물을 또한 포함한다.

본 발명의 방법은 혈소판 응집을 억제하고 이에 의해 혈전증을 억제하거나, 혈전증의 치료에 있어서 임의의 다른 항응고제 또는 항혈전제의 필요한 용량을 감소시키거나, 급성 염증 반응을 치료하거나, 암을 치료하거나, 또는 응고 캐스케이드의 활성화와 연관된 임의의 다른 질환을 치료할 목적으로 상기 기재된 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 항응고 인자 XI 및/또는 항-FXIa 항체, 또는 항원-결합 항체 단편, 및 항체 및 단편의 변이체를 생성하는 방법을 또한 제공한다.

도 1:
인간 FXIa를 억제하는, 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 서열 19 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열 20을 포함하는 항-FXIa 항체 076D-M007-H04의 용량-반응 곡선 (EC50은 IC50과 동일함). 이 항체는 CDRH1로서 서열 21, CDRH2로서 서열 22 및 CDRH3으로서 서열 23을 포함한다. 이 항체는 추가로 CDRL1로서 서열 24, CDRL2로서 서열 25 및 CDRL3으로서 서열 26을 포함한다. 패닝/스크리닝 캠페인에서 확인된 이 항체는 인간 FXIa의 단백질분해적 활성을 억제하는 그의 능력에 대해 표시된 농도에서 시험되었다. 관련 DNA 서열은 서열 1 내지 서열 8에 제시된 바와 같다.
도 2:
토끼 FXIa를 억제하는 항-FXIa 항체 076D-M007-H04의 용량 반응 곡선. 패닝/스크리닝 캠페인에서 확인된 항체는 토끼 FXIa의 단백질분해적 활성을 억제하는 그의 능력에 대해 표시된 농도에서 시험되었다.
도 3:
인간 FXIa를 억제하는, 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 서열 27 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열 28을 포함하는 항-FXIa 항체 076D-M007-H04-CDRL3-N110D의 용량-반응 곡선. 패닝/스크리닝 캠페인에서 확인된 항체는 인간 FXIa의 단백질분해적 활성을 억제하는 그의 능력에 대해 표시된 농도에서 시험되었다.
도 4:
항-FXIa 항체 076D-M007-H04-CDRL3-N110D의 용량 반응 곡선. 패닝/스크리닝 캠페인에서 확인된 항체는 토끼 FXIa의 단백질분해적 활성을 억제하는 그의 능력에 대해 표시된 농도에서 시험되었다.
도 5:
응고 인자 XIIa에 의한 인간 FXI의 FXIa로의 전환을 억제하는, 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 서열 29 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대해 서열 30을 포함하는 항-FXI 항체 076D-M028-H17의 용량-반응 곡선. 이 항체는 CDRH1로서 서열 31, CDRH2로서 서열 32 및 CDRH3으로서 서열 33을 포함한다. 이 항체는 추가로 CDRL1로서 서열 34, CDRL2로서 서열 35 및 CDRL3으로서 서열 36을 포함한다. 패닝/스크리닝 캠페인에서 확인된 항체는 지모겐 FXI의 그의 활성화 형태 FXIa로의 전환을 억제하는 그의 능력에 대해 표시된 농도에서 시험되었다. 관련 DNA 서열은 서열 11 내지 서열 18에 제시된 바와 같다.
도 6:
응고 인자 IIa에 의한 인간 FXI의 FXIa로의 전환을 억제하는 항-FXI 항체 076D-M028-H17의 용량-반응 곡선. 패닝/스크리닝 캠페인에서 확인된 항체는 지모겐 FXI의 그의 활성화 형태 FXIa로의 전환을 억제하는 그의 능력에 대해 표시된 농도에서 시험되었다.
도 7:
응고 인자 XIIa에 의한 토끼 FXI의 FXIa로의 전환을 억제하는 항-FXI 항체 076D-M028-H17의 용량-반응 곡선. 패닝/스크리닝 캠페인에서 확인된 항체는 지모겐 FXI의 그의 활성화 형태 FXIa로의 전환을 억제하는 그의 능력에 대해 표시된 농도에서 시험되었다.
도 8:
응고 인자 IIa에 의한 토끼 FXI의 FXIa로의 전환을 억제하는 항-FXI 항체 076D-M028-H17의 용량-반응 곡선. 패닝/스크리닝 캠페인에서 확인된 항체는 지모겐 FXI의 그의 활성화 형태 FXIa로의 전환을 억제하는 그의 능력에 대해 표시된 농도에서 시험되었다.
도 9:
인간 FXIa의 촉매 도메인에 대한 076D-M007-H04의 결합 및 차단 활성. 076D-M007-H04는 인간 FXIa의 단백질분해적 활성을 억제하는 반면에, 076D-M028-H17은 이러한 활성을 나타내지 않으며, 이는 076D-M007-H04가 FXIa의 촉매 도메인에 결합함을 나타낸다.
도 10:
라인위버-버크(Lineweaver-Burk) 플롯을 사용한 076D-M007-H04의 결합 양식의 특성화는 이 항체가 경쟁 유형 억제 활성을 나타냄을 보여준다.
도 11:
CD62P 발현 및 혈소판 미세응집체 형성에 대한 유동 세포측정 분석. 광 산란 및 FITC-CD41/CD61 (GPIIbIIIa) 형광의 조합에 의해 단일 혈소판을 검출하였다. (A) FITC-CD41 및 PE-CD62P 형광을 사용한 도트 플롯에 의한 CD62P 발현의 결정. 관류 전 (좌측) 및 후 (우측)의 게이팅된 혈소판을 나타낸다. (B) 혈소판 미세응집체 형성은 증가된 크기로 규정되었고 (전방 산란), 원으로 나타낸다. 관류 전 (좌측) 및 후 (우측)에 수집된 샘플의 도트 플롯을 나타낸다.
도 12:
혈소판 CD62P 발현은 FXI(a) 항체에 의해 감소되었다.
전혈을 (A) 076D-M007-H04 및 (B) 076D-M028-H17로 처리하고, 재석회화 직후에 콜라겐-코팅된 표면 위로 관류시켰다. 동시에, 비히클 또는 억제제로 처리한 후 전혈 샘플을 수집하고, TRAP6 (10 μg/ml)의 존재 또는 부재하에 5분 동안 인큐베이션하였다. 도 11에 제시된 바와 같은 유동 세포측정법에 의해 혈소판 CD62P 발현을 분석하였다. 데이터는 적어도 5회의 실험의 게이팅된 집단에서 CD62P-양성 혈소판의 평균 ± SEM 백분율로서 보고한다. 각 처리에서 5분 관류 동안의 최대 CD62P 발현 수준을 그래프로 나타낸다.
도 13:
혈소판 미세응집체 형성은 FXI(a) 항체에 의해 억제되었다.
전혈을 (A) 076D-M007-H04 및 (B) 076D-M028-H17로 처리하고, 재석회화 직후에 콜라겐-코팅된 표면 위로 관류시켰다. 도 13에 제시된 바와 같은 유동 세포측정법에 의해 혈소판 미세응집체를 분석하고, 그와 같이 나타내었다. 데이터는 적어도 5회의 실험의 10⁴ 게이팅된 단일 혈소판에 대한 평균 ± SEM 응집체 수로서 보고한다. 각 처리에서 5분 관류 동안의 최대 응집체 수를 그래프로 나타낸다.
도 14:
염화제2철 유발된 혈전증 (a) 및 귀 출혈 시간 (b)에 대한 076D-M007-H04의 생체내 효과. 076D-M007-H04는 귀 출혈 시간을 증가시키지 않으면서 용량-의존적으로 혈전 중량을 감소시킴을 증명할 수 있었다.
도 15:
염화제2철 유발된 혈전증 (a) 및 귀 출혈 시간 (b)에 대한 076D-M007-H04-CDRL3-N110D의 생체내 효과 (실시예 xxx에 기재됨). 076D-M007-H04-CDRL3-N110D는 귀 출혈 시간을 증가시키지 않으면서 용량-의존적으로 혈전 중량을 감소시킴을 증명할 수 있었다.
도 16:
생체내 효과는 076D-M028-H17의 염화제2철 유발된 혈전증 (a) 및 귀 출혈 시간 (b)에 대한 효과를 보여준다 (실시예 xxx에 기재됨). 076D-M028-H17은 귀 출혈 시간을 증가시키지 않으면서 용량-의존적으로 혈전 중량을 감소시킴을 증명할 수 있었다.
도 17:
본 도면은 Fab 076D-M007-H04의 (하부) FXIa (상부)와의 복합체의 카툰 표현을 나타낸다.
도 18a:
본 도면은 - FXIa C500S에 대한 Fab 076D-M007-H04 (카툰)의 결합 에피토프에 대한 상세도를 나타낸다. FXIa C500S는 표면 표현으로 나타내어진다.
도 18b:
본 도면은 Fab 076D-M007-H04와, 중첩된 펩티드성 X선 구조의 표면 표현으로 제시된 FXIa C500S를 나타낸다. 활성 부위 틈은 적색 타원체로 강조표시한다.
도 19a:
본 도면은 지모겐 FXI (odb 엔트리 2F83)와 중첩된 Fab 076D-M007-H04의 결정 구조를 나타낸다.
도 19b:
본 도면은 동일한 관점에서 도시한 것이나, 지모겐의 FXI의 촉매 도메인이 Fab 076D-M007-H04:FXIa C500S의 복합체 구조의 FXIa C500S의 촉매 도메인으로 대체된 것이다. FXI 및 FXIa C500S의 촉매 도메인은 표면 표현으로 제시되고, 모든 다른 도메인은 카툰으로 제시된다. Fab 076D-M007-H04에 대한 계면에서의 적절하지 않게 규칙화된 루프를 도 19에서 강조표시한다.
도 20:
076D-M007-H04 투여 이후 개코원숭이에서 수집된 혈장 샘플에서 결정된 시험관내 aPTT 응고 시간에서의 증가.
도 21:
투여후 5분에서 투여후 504시간에 걸친 2.5mg/kg 076D-M007-H04 투여 (i.v. 볼루스) 이후의 ACT 측정치.
도 22:
2.5mg/kg 076D-M007-H04 투여 (i.v. 볼루스) 이후 처음 24시간의 ACT 측정치.
도 23:
투여후 5 분에서 투여후 504시간에 걸친 2.5mg/kg 076D-M007-H04 투여 (i.v. 볼루스) 이후의 aPTT 측정치.
도 24:
2.5mg/kg 076D-M007-H04 투여 (i.v. 볼루스) 이후 처음 24시간의 aPTT 측정치.
도 25:
2mm i.d. 콜라겐-코팅된 ePTFE 혈관 그라프트 내에서의 혈소판 침착.
도 26:
실시예 12에 기재된 바와 같은 콜라겐-코팅된 ePTFE 혈관 그라프트 상에서의 혈소판 침착.
도 27:
섹션 실시예 12 하에 기재된 바와 같은 정맥 확장 챔버 내 (및 콜라겐-코팅된 그라프트 및 실리콘 챔버 사이의 링커 섹션 내)에서의 혈소판 침착.
도 28:
076D-M007-HO4 투여 이후에 개코원숭이 혈장에서 측정된 TAT 수준.
도 29:
0.5mg/kg 076D-M007-H04 및 2mg/kg 076D-M007-H04 (24시간 후)로 단독 처리되거나 또는 32mg/kg의 농도로 씹어먹는 아스피린이 제공된 이후에 처리된 개코원숭이에서의 출혈 시간.

정의

지혈: 용어 지혈은 손상 부위에서 혈액의 흐름을 막고 상처 치유 동안 혈관 개방성을 회복시키는 각각의 주요 메카니즘을 나타낸다. 정상 지혈 및 병리학적 혈전증 동안, 3종의 메카니즘이 동시에 활성화되기 시작하며: 지혈은 주로 활성화된 혈소판과 혈관 벽의 상호작용, 피브린의 형성, 및 섬유소용해로 불리는 과정을 의미한다 [Arthur A. Sasahara, Joseph Loscalzo(2002) New Therapeutic Agents for Thrombosis and Thrombolysis (2nd Edition) Marcel Dekker Inc. New York, NY, ISBN 0-8247-0795-8].

응고 및 응고 캐스케이드: 응고 캐스케이드라 불리는 단백질 기반 시스템은 형성된 응괴를 안정화시키고 상처를 더욱 밀봉하는 역할을 한다. 응고 경로는 단백질분해적 캐스케이드이다. 경로의 각각의 효소는 혈장 내에서 지모겐 (불활성 형태)으로 존재하며, 이는 활성화시에 단백질분해적으로 절단되어 전구체 분자로부터 활성 인자를 방출한다. 응고 캐스케이드는 활성화 과정을 제어하는 일련의 양성 및 음성 피드백 루프로서 기능한다. 경로의 궁극적인 목표는 트롬빈을 생산하는 것이며, 이는 이어서 가용성 피브리노겐을 응괴를 형성하는 피브린으로 전환시킬 수 있다. 트롬빈 생성 과정은 3 단계로 나뉠 수 있다: 활성 응고 인자: FXa (활성화 인자-X)의 생성을 위한 대안적 경로를 제공하는 내인성 및 외인성 경로, 및 트롬빈 형성을 야기하는 최종 공통 경로 [Hoffman M.M. and Monroe D.M. (2005) Rethinking the coagulation cascade. Curr Hematol Rep. 4:391-396; Johne J, Blume C, Benz PM, Pozgajova M, Ullrich M, Schuh K, Nieswandt B, Walter U, Renne T. (2006) Platelets promote coagulation factor XII-mediated proteolytic cascade systems in plasma. Biol Chem. 387:173-178]).

혈소판 응집: 혈관에 파손이 발생한 경우에, 정상적으로는 혈류와 직접 접촉되지 않는 물질이 노출된다. 이들 물질 (주로 콜라겐 및 폰 빌레브란트 인자)은 혈소판이 파손된 표면에 부착되게 한다. 혈소판이 표면에 부착되면, 이는 추가의 혈소판을 손상된 영역으로 유인하는 화학물질을 방출하며, 이는 혈소판 응집으로 지칭된다. 이들 2종의 과정이 출혈을 막기 위한 첫번째 반응이다.

응고 인자 XI 및 응고 인자 XIa

응고 인자 XI (FXI)은 간에서 합성되며, 고분자량 키니노겐과 복합체화된 디술피드 결합-연결된 이량체로서 혈장 내에서 순환한다. 이러한 이량체의 각각의 폴리펩티드 쇄는 대략 80 kD이다. 지모겐 인자 XI은 혈액 응고의 접촉 단계를 통해 또는 혈소판 표면 상에서의 트롬빈-매개 활성화를 통해 그의 활성 형태, 응고 인자 XIa (FXIa)로 전환된다. 이러한 인자 XI의 활성화 동안, 각각의 2개의 쇄 내의 내부 펩티드 결합이 절단되어 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 세린 프로테아제인 활성화 인자 XIa를 생성한다. 이러한 세린 프로테아제 FXIa는 응고 인자 IX를 IXa로 전환시키고, 이는 후속해서 응고 인자 X를 활성화시킨다 (Xa). 이어서 Xa는 응고 인자 II/트롬빈 활성화를 매개할 수 있다. 이러한 인자의 결손은 손상으로부터의 장시간 출혈, 빈번하거나 다량의 코피, 소변에서의 혈흔, 및 여성에서의 다량의 월경 출혈을 특징으로 하는 혈액 응고 이상인 로젠탈 증후군 (C형 혈우병으로도 공지됨)으로 이어진다. 본원에 사용된 "응고 인자 XI", "인자 XI", 또는 "FXI"는 단백질을 발현하는 임의의 포유동물 종으로부터의 임의의 FXI를 지칭한다. 예를 들어, FXI는 인간, 비-인간 영장류 (예컨대 개코원숭이), 마우스, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 토끼, 및 혈류 조절, 응고, 및/또는 혈전증에 수반되는 응고 인자 XI을 나타내는 임의의 다른 종 유래의 것일 수 있다.

응고 인자 XIIa에 의한 응고 인자 XI의 활성화를 위한 절단 부위는 각 폴리펩티드 쇄 내의 Arg-369와 Ile-370 사이의 내부 펩티드 결합이다 [Fujikawa K, Chung DW, Hendrickson LE, Davie EW. (1986) Amino acid sequence of human factor XI, a blood coagulation factor with four tandem repeats that are highly homologous with plasma prekallikrein. Biochemistry 25:2417-2424]. 응고 인자 XIa의 각각의 중쇄 (369개의 아미노산)는 애플 도메인이라 불리는 90-91개의 아미노산의 4개의 일렬 반복부 (A1-A4로 표시됨) 및 그에 더하여 짧은 연결 펩티드를 함유한다 [Fujikawa K, Chung DW, Hendrickson LE, Davie EW. (1986) Amino acid sequence of human factor XI, a blood coagulation factor with four tandem repeats that are highly homologous with plasma prekallikrein. Biochemistry 25:2417-2424; Sun MF, Zhao M, Gailani D. (1999) Identification of amino acids in the factor XI apple 3 domain required for activation of factor IX. J Biol Chem.274:36373-36378]. 응고 인자 XIa의 경쇄 (각각 238개의 아미노산)는 세린 프로테아제의 트립신 패밀리의 전형적인 서열을 갖는 효소의 촉매 부분을 함유한다 [Fujikawa K, Chung DW, Hendrickson LE, Davie EW. (1986) Amino acid sequence of human factor XI, a blood coagulation factor with four tandem repeats that are highly homologous with plasma prekallikrein. Biochemistry 25:2417-2424]. 활성화 인자 XIa는 인자 IX를 활성화하는 것에 의해 혈액 응고의 내인성 경로의 중간 단계를 촉발한다.

보존적 아미노산 변이체

본원에 기재된 항체 펩티드 서열의 전체적인 분자 구조가 보존된 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다. 당업자는 개별 아미노산의 특성을 고려하여 일부 합리적인 치환을 인식할 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은, 예를 들어 수반되는 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다.

예를 들어, (a) 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; (b) 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하고; (c) 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; (d) 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 치환은 전형적으로 군 (a)-(d) 내에서 이루어질 수 있다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 파괴하는 그의 능력에 기초하여 서로 치환될 수 있다. 유사하게, 특정 아미노산, 예컨대 알라닌, 시스테인, 류신, 메티오닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 및 리신은 α-나선에서 보다 통상적으로 발견되는 반면, 발린, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 트레오닌은 β-병풍 시트에서 보다 통상적으로 발견된다. 글리신, 세린, 아스파르트산, 아스파라긴 및 프롤린은 통상적으로 턴에서 발견된다. 일부 바람직한 치환은 하기 군 사이에서 이루어질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I. 공지된 유전자 코드, 및 재조합 및 합성 DNA 기술을 고려하여, 숙련된 과학자는 보존적 아미노산 변이체를 코딩하는 DNA를 용이하게 구축할 수 있다.

본원에 사용된 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 사이에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. "서열 상동성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드 서열은 적어도 60%, 보다 바람직하게는, 적어도 70% 또는 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 CDR 영역 내의 서열 동일성을 갖는다. 또한, 바람직한 항체는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 95%의 CDR 영역 내의 서열 상동성을 갖는다.

본 발명의 DNA 분자

본 발명은 또한 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다. 이들 서열은 서열 1 내지 18에 기재된 DNA 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 DNA 분자는 본원에 개시된 서열에 제한되지 않고, 그의 변이체도 또한 포함한다. 본 발명에 속하는 DNA 변이체는 혼성화에서의 그의 물리적 특성을 참조하여 기재될 수 있다. 당업자는 핵산 혼성화 기술을 사용하여, DNA가 그의 상보물을 확인하는데 사용될 수 있고, DNA가 이중 가닥이기 때문에 그의 등가물 또는 상동체를 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 100% 미만의 상보성으로 혼성화가 일어날 수 있다는 것도 또한 인지할 것이다. 그러나, 조건들의 적절한 선택 하에, 혼성화 기술을 사용하여 DNA 서열들을 특정한 프로브에 대한 이들의 구조적 관련성에 기초하여 구별할 수 있다. 이러한 조건과 관련한 지침에 대해, 하기를 참조한다: Sambrook et al., 1989 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)] 및 Ausubel et al., 1995 [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons].

2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 구조적 유사성은 2개의 서열이 서로 혼성화할 조건의 "엄격성"의 함수로서 표현될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "엄격성"은 조건이 혼성화에 불리한 정도를 지칭한다. 엄격한 조건은 혼성화에 강하게 불리하고, 이러한 조건 하에서는 구조적으로 가장 관련된 분자들만 서로 혼성화할 것이다. 반대로, 엄격하지 않은 조건은 보다 낮은 정도의 구조적 관련성을 나타내는 분자들의 혼성화에 유리하다. 따라서, 혼성화 엄격성은 2개의 핵산 서열의 구조적 관계와 직접적으로 상호연관된다. 하기 관계가 혼성화와 관련성을 상호연관시키는데 유용하다 (여기서, T_m은 핵산 듀플렉스의 용융 온도임):

a. T_m = 69.3 + 0.41(G+C)%

b. 미스매칭된 염기 쌍의 개수가 매 1% 증가시마다 듀플렉스 DNA의 T_m은 1℃만큼 감소함.

c. (T_m)_μ2-(T_m)_μ1= 18.5 log₁₀μ2/μ1

여기서 μ1 및 μ2는 2종의 용액의 이온 강도임.

혼성화 엄격성은 전체적인 DNA 농도, 이온 강도, 온도, 프로브 크기, 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 존재를 비롯한 다수의 인자의 함수이다. 혼성화를 촉진하는 인자는 높은 DNA 농도, 높은 이온 강도, 낮은 온도, 보다 긴 프로브 크기, 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 부재를 포함한다. 혼성화는 전형적으로 2개의 단계: "결합" 단계 및 "세척" 단계에서 수행된다.

먼저, 결합 단계에서, 혼성화에 유리한 조건 하에 프로브가 표적에 결합된다. 통상적으로, 온도를 변경시키는 것에 의해 이 단계에서 혼성화가 제어된다. 높은 엄격성의 경우에는, 짧은 (< 20 nt) 올리고뉴클레오티드 프로브가 사용되지 않는 한, 온도가 통상적으로 65℃ 내지 70℃이다. 대표적인 혼성화 용액은 6x SSC, 0.5% SDS, 5x 덴하르트 용액 및 100 μg 비특이적 운반 DNA를 포함한다 [15 참조]. 물론, 다수의 상이하지만 기능적으로 등가인 완충제 조건이 공지되어 있다. 관련성 정도가 더 낮은 경우에는, 더 낮은 온도가 선택될 수 있다. 저 엄격성 결합 온도는 약 25℃ 내지 40℃이다. 중간 엄격성은 약 40℃ 이상 내지 약 65℃ 미만이다. 고 엄격성은 약 65℃ 이상이다.

다음으로, 과량의 프로브가 세척에 의해 제거된다. 이 단계에서 더욱 엄격한 조건이 통상적으로 적용된다. 따라서, 이러한 "세척" 단계가 혼성화를 통해 관련성을 결정하는데 있어서 가장 중요하다. 세척 용액은 전형적으로 더 낮은 염 농도를 함유한다. 한 예시적인 중등도 엄격성 용액은 2X SSC 및 0.1% SDS를 함유한다. 높은 엄격성 세척 용액은 약 0.2X SSC 미만의 등가물 (이온 강도 면에서)을 함유하고, 바람직한 엄격한 용액은 약 O.1X SSC를 함유한다. 다양한 엄격성과 연관된 온도는 "결합"에 대해 상기에서 논의된 바와 동일하다. 또한 전형적으로 세척 용액은 세척 동안 여러 번 교체된다. 예를 들어, 전형적인 고 엄격성 세척 조건은 55℃에서 30분 동안 2회 및 60℃에서 15분 동안 3회 세척을 포함한다.

따라서, 본 발명의 대상은 본 발명의 항체 및/또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 항체를 코딩하는 상기 언급된 단리된 핵산 서열이다. 따라서, 본 발명은 고 엄격성 결합 및 세척 조건 하에서 언급된 분자에 혼성화하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 이러한 핵산 분자는 본원에 기재된 바와 같은 특성을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편을 코딩한다. 바람직한 분자 (mRNA 관점으로부터)는 본원에 기재된 DNA 분자 중 하나와 적어도 75% 또는 80% (바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%)의 서열 동일성을 갖는 것이다. DNA는 응고 인자 XI의 그의 활성 형태 인자 XIa로의 전환을 감소 및/또는 억제하고/거나 응고 인자 XIa의 촉매 활성을 직접 차단하는 분자를 코딩한다.

재조합 DNA 구축물 및 발현

본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 중 1개 이상을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 추가로 제공한다. 본 발명의 재조합 구축물은 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 분자가 그 내부에 삽입되는 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 함께 사용된다.

코딩된 유전자는 문헌 (Sambrook et al., 1989, and Ausubel et al., 1989. [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA; Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons])에 기재된 기술에 의해 생산될 수 있다. 대안적으로, DNA 서열은 예를 들어 합성기를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Oligonucleotide Synthesis [Gait, M.J. (1984) "An introduction to modern methods of DNA Synthesis" In Oligonucleotide Synthesis a Practical Approach. Ed. M.J. Gait, IRL Press Oxford UK])에 기재된 기술을 참조하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 당업자는 가변 도메인을 코딩하는 DNA를 돌연변이된 또는 비-돌연변이된 다양한 인간 IgG 이소형 또는 그의 유도체의 불변 영역을 코딩하는 유전자 단편과 융합할 수 있다. 당업자는 링커, 예컨대 글리신-글리신-글리신-글리신-세린을 3회 함유하는 15개 아미노산의 스트레치를 사용하여 단일 쇄 포맷으로 양쪽 가변 도메인을 융합하기 위해 재조합 DNA 기술을 적용할 수 있다. 본 발명의 재조합 구축물은 코딩된 DNA(들)의 RNA 및/또는 단백질 생성물을 발현할 수 있는 발현 벡터에 포함된다. 벡터는 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 벡터는 추가로 선택 마커 서열을 포함할 수 있다. 또한, 특이적인 개시 및 박테리아 분비 신호는 삽입된 표적 유전자 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 필요할 수 있다.

본 발명은 추가로 본 발명의 DNA 중 적어도 하나를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 실질적으로 발현 벡터가 이용가능한 임의의 세포일 수 있다. 이는, 예를 들어, 고등 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 하등 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있고, 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있다. 재조합 구축물의 숙주 세포 내로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE, 덱스트란 매개 형질감염, 전기천공 또는 파지 감염에 의해 실시될 수 있다.

박테리아 발현

목적하는 단백질을 코딩하는 구조적 DNA 서열을 적합한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 기능적 프로모터가 있는 작동가능한 판독 상 내에 삽입함으로써 박테리아 사용에 유용한 발현 벡터가 구축된다. 벡터는 벡터의 유지를 보증하고 바람직한 경우에는 숙주 내에서의 증폭을 제공하도록 하나 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기점을 포함할 것이다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 내의 다양한 종을 포함한다.

박테리아 벡터는, 예를 들어 박테리오파지-, 플라스미드- 또는 파지미드-기반일 수 있다. 이들 벡터는 널리 공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소를 전형적으로 함유하는 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 선택 마커 및 박테리아 복제 기점을 함유할 수 있다. 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적절한 세포 밀도로의 성장 후에, 선택된 프로모터를 적절한 수단 (예를 들어, 온도 변환 또는 화학적 유도)에 의해 탈억제/유도하고, 세포를 추가의 기간 동안 배양한다. 세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수확하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴하고, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 유지한다.

박테리아 시스템에서, 발현시킬 단백질에 대해 의도되는 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체를 생성하거나 또는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우에는, 예를 들어 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 본 발명의 신규한 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터이다.

포유동물 발현 및 단백질 정제

포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 그의 서열에 관한 추가의 기재는 [스틴스키(Stinski)의 U.S. 5,168,062; 벨(Bell) 등의 U.S. 4,510,245; 샤프너(Schaffner) 등의 U.S. 4,968,615]를 참조한다. 재조합 발현 벡터도 또한 복제 기점 및 선택 마커를 포함할 수 있다 [벨 등의 U.S. 4,510,245; 샤프너 등의 U.S. 4,968,615; 악셀(Axel) 등의 U.S. 4,399,216 참조]. 적합한 선택 마커는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 내성을 부여한다.

숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질감염은 표준 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, 및 DEAE-덱스트란 형질감염을 사용하여 수행할 수 있다.

본원에 제공된 항체, 그의 항원 결합 부분 또는 유도체를 발현하는데 적합한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포)를 포함한다 (예를 들어, 악셀 등에 의한 U.S. 5,179,017에 기재된 바와 같이 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는 악셀 등의 U.S. 4,634,665에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함). NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 발현된 단백질이 숙주 세포를 성장시키는 배양 배지 중으로 분비되도록 설계된다. 항체, 그의 항원 결합 부분 또는 유도체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포-셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")가 또한 정제에 사용될 수 있다 ([Urlaub G, Chasin LA. (1980) Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 77:4216-4220]; 예를 들어 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10을 참조하고, 그 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다). 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 비롯한 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기재되어 있다 ([Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA); Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons, chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20] 참조). 따라서, 본 발명의 목적은 또한 벡터 또는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포이고, 여기서 숙주 세포는 고등 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 하등 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있고, 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하고 항체를 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체 및 항원 결합 단편을 생산하기 위해 숙주 세포를 사용하는 방법이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 숙주 세포에 의해 생산되고 적어도 95 중량%의 균질성으로 정제된 항체 005-C04이다.

친화도

"친화도" 또는 "결합 친화도" K_D는 종종 평형 회합 상수 (ka) 및 평형 해리 상수 (kd)의 측정 및 ka에 대한 kd의 몫을 계산함으로써 결정된다 (K_D = kd/ka). 용어 "면역특이적" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체가 응고 인자 XI 및/또는 그의 활성화 형태, 응고 인자 XIa에 10^-6M (1가 친화도) 이하의 친화도 K_D로 결합하는 것을 의미한다. 용어 "높은 친화도"는 항체가 응고 인자 XI 및/또는 그의 활성화 형태, 응고 인자 XIa에 10^-7M (1가 친화도) 이하의 친화도 K_D로 결합하는 K_D를 의미한다. 항체는 다른 비관련된 분자와 비교하여 표적 항원에 대해 실질적으로 보다 큰 친화도를 가질 수 있다. 또한, 항체는 상동체와 비교하여 표적 항원에 대해 실질적으로 보다 큰 친화도, 예를 들어 표적 항원에 대해 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배, 10^-3배, 10^-4배, 10^-5배, 10^-6배 또는 이보다 더 큰 상대적인 친화도를 가질 수 있다. 이러한 친화도는 통상의 기술을 사용하여, 예컨대 평형 투석에 의해; 제조업체에 의해 요약된 일반적 절차를 사용하여 비아코어(BIAcore) 2000 기기의 사용에 의해; 방사성 표지된 표적 항원을 사용한 방사성면역검정에 의해; 또는 당업자에게 공지된 또 다른 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 친화도 데이터는, 예를 들어 문헌 [Kaufman RJ, Sharp PA. (1982) Amplification and expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary dna gene. J Mol Biol.159:601-621]에 기재된 방법에 의해 분석될 수 있다.

항체

본원에 사용된 어구 "응고 FXI 및/또는 그의 활성화 형태, 응고 인자 XIa를 차단하는 항체"는 응고 인자 FXI 및/또는 FXIa 활성의 완전한 또는 부분적인 억제를 야기하는 본 발명의 항체에 의한 FXI 및/또는 FXIa의 차단을 지칭하는 것으로 의도된다. 아미노산 서열은 서열 19 내지 36에 기재된 DNA 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 완전히 조립된 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항원에 결합할 수 있는 항체 단편 (예를 들어, Fab', F'(ab)2, Fv, 단일 쇄 항체, 디아바디), 카멜 바디 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 전술한 것을 포함하는 재조합 펩티드를 포함한다. 항체는 바람직하게는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 이소형으로부터 유래된 그의 중쇄 상에 상이한 불변 도메인 (Fc 도메인)을 보유할 수 있다 (하기 참조). 이펙터 기능의 변형을 위한 돌연변이가 도입될 수 있다. 보체 단백질 C1q 및 Fc 수용체와 상호작용하는데 있어서 우세한 역할을 하는 Fc-도메인 내의 아미노산 잔기가 확인되었고, 이펙터 기능에 영향을 미치는 돌연변이가 기재되어 있다 (검토를 위해 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)] 참조). 특히, IgG1의 비글리코실화는 아미노산 위치 297에서 아스파라긴을 알라닌으로 또는 아스파라긴을 글루타민으로 돌연변이시키는 것에 의해 달성될 수 있으며, 이는 항체-유래 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 없애는 것으로 보고되어 있다 [Labrijn AF, Aalberse RC, Schuurman J. (2008) When binding is enough: nonactivating antibody formats. Curr Opin Immunol. 20:479-485]. 위치 322에서의 리신의 알라닌에 의한 대체는 ADCC의 감소 및 보체-유래 세포독성 (CDC)의 제거로 이어지며, 한편 위치 234 및 235에서의 2개의 류신의 알라닌에 의한 동시 대체는 ADCC 및 CDC의 회피로 이어진다 [Sazinsky SL, Ott RG, Silver NW, Tidor B, Ravetch JV, Wittrup KD. (2008) Aglycosylated immunoglobulin G1 variants productively engage activating Fc receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 105:20167-20172]. IgG4 이소형을 2가 치료제로서 결합력을 보유한 채로 생체내에 적용하기 위해, '코어 힌지 영역'에 세린→프롤린 교환과 같은 변형 [Schuurman J, Van Ree R, Perdok GJ, Van Doorn HR, Tan KY, Aalberse RC. (1999) Normal human immunoglobulin G4 is bispecific: it has two different antigen-combining sites. Immunology. 97:693-698]을 도입할 수 있다. 인간 IgG2 분자가 이종 공유 이량체를 형성하는 경향은 위치 127, 232 및 233에서의 시스테인 중 하나를 세린으로 교환하는 것에 의해 회피할 수 있다 [Simmons LC, Reilly D, Klimowski L, Raju TS, Meng G, Sims P, Hong K, Shields RL, Damico LA, Rancatore P, Yansura DG. (2002) Expression of full-length immunoglobulins in Escherichia coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies. J Immunol Methods. 263:133-147]. 감소된 이펙터 기능을 갖는 대안적 포맷은 4개의 IgG4-특이적 아미노산 잔기 변화를 보유한 IgG2로부터 유래된 IgG2m4 포맷일 수 있다 [Hezareh M, Hessell AJ, Jensen RC, van de Winkel JG, Parren PW. (2001) Effector function activities of a panel of mutants of a broadly neutralizing antibody against human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 75:12161-1218]. 항체 단편은 재조합 DNA 기술 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있고, 하기 추가로 기재된다. 모노클로날 항체의 비제한적 예는 뮤린, 키메라, 인간화, 인간, 및 휴먼 엔지니어드(Human Engineered)™ 이뮤노글로불린, 항체, 이뮤노글로불린 유래의 서열을 갖는 키메라 융합 단백질, 또는 그의 뮤테인 또는 유도체를 포함하며, 이들은 각각 하기 추가로 기재된다. 화학적으로 유도체화된 항체를 포함하여, 무손상 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체가 또한 고려된다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 상기 집단에 포함된 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 그의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 균일한 배양액에 의해 합성되고, 상이한 특이성 및 특성을 갖는 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.

수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 코흘러(Kohler) 등에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나 [Allen MJ, Guo A, Martinez T, Han M, Flynn GC, Wypych J, Liu YD, Shen WD, Dillon TM, Vezina C, Balland A. (2009) Interchain disulfide bonding in human IgG2 항체 probed by site-directed mutagenesis. Biochemistry. 48:3755-3766], 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 ([An Z, Forrest G, Moore R, Cukan M, Haytko P, Huang L, Vitelli S, Zhao JZ, Lu P, Hua J, Gibson CR, Harvey BR, Montgomery D, Zaller D, Wang F, Strohl W. (2009) IgG2m4, an engineered antibody isotype with reduced Fc function. MAbs. 1:572-579] 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 재조합, 키메라, 인간화, 인간, 휴먼 엔지니어드™ 또는 항체 단편일 수 있다.

"이뮤노글로불린" 또는 "천연 항체"는 사량체 당단백질이다. 자연 발생 이뮤노글로불린에서, 각 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각 쌍은 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 "가변" 영역을 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단부는 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 규정한다. 이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 중쇄는 뮤 (μ), 델타 (Δ), 감마 (γ), 알파 (α), 및 엡실론 (ε)으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 규정한다. 이들 중 몇몇은 하위부류 또는 이소형, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉘어질 수 있다. 상이한 이소형은 상이한 이펙터 기능을 갖고; 예를 들어, IgG1 및 IgG3 이소형은 종종 ADCC 활성을 갖는다. 인간 경쇄는 카파 (K) 및 람다 (λ) 경쇄로 분류된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다 (일반적으로 [Koehler G, Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256:495-497] 참조).

항체/이뮤노글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 본원에서 항원-결합 영역을 보유하는 항체/이뮤노글로불린의 단편 (예를 들어, IgG의 가변 영역)으로 정의된다. 항체의 "항원-결합 영역"은 전형적으로 항체의 1개 이상의 초가변 영역(들), 즉 CDR-1, -2 및/또는 -3 영역에서 발견되지만; 가변 "프레임워크" 영역은, 예컨대 CDR에 대한 스캐폴드를 제공함으로써 항원 결합에서 또한 중요한 역할을 할 수 있다. 바람직하게는, "항원-결합 영역"은 적어도 가변 경쇄 (VL)의 아미노산 잔기 4 내지 103 및 가변 중쇄 (VH)의 5 내지 109, 보다 바람직하게는 VL의 아미노산 잔기 3 내지 107 및 VH의 4 내지 111을 포함하고, 특히 바람직한 것은 완전한 VL 및 VH 쇄이다 [VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 1 내지 113, 한편 아미노산 위치의 넘버링은 카바트(Kabat) 데이터베이스에 따른다 [미국 특허 번호 4,816,567]]. 본 발명에서 사용하기 위한 이뮤노글로불린의 바람직한 부류는 IgG이다.

용어 "초가변" 영역은 항원-결합을 담당하는 항체 또는 기능적 단편의 가변 도메인 VH 및 VL의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 CDR로부터의 아미노산 잔기 [즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) 및 88-97 (LCDR3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 29-36 (HCDR1), 48-66 (HCDR2) 및 93-102 (HCDR3)] 및/또는 초가변 루프로부터의 잔기 [즉, [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]에 기재된 바와 같이 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (LCDR1 내), 50-52 (LCDR2 내) 및 91-96 (LCDR3 내) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (HCDR1 내), 53-55 (HCDR2 내) 및 96-101 (HCDR3 내)]를 포함한다.

항체 단편의 비제한적 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 (dAb), 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일-쇄 항체 (scFv), 단일 쇄 항체 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 선형 항체 [Johnson G, Wu TT. (2000) Kabat database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res. 28:214-218]; 킬레이팅 재조합 항체, 트리바디 또는 비바디, 인트라바디, 나노바디, 소형 모듈 면역제약 (SMIP), 항원-결합-도메인 이뮤노글로불린 융합 단백질, 카멜화 항체, VHH 함유 항체, 또는 그의 뮤테인 또는 유도체, 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 한, CDR 서열과 같이 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하는데 충분한 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다 [Chothia C, Lesk AM. (1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol. 196:901-917; Zapata G, Ridgway JB, Mordenti J, Osaka G, Wong WL, Bennett GL, Carter P. (1995) Engineering linear F(ab')2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity. Protein Eng. 8:1057-1062]. "이중특이적" 또는 "이관능성" 항체 이외의 항체는 그의 각 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. F(ab')₂ 또는 Fab는 C_H1과 C_L 도메인 사이에 발생하는 분자간 디술피드 상호작용을 최소화하거나 또는 완전히 제거하도록 조작될 수 있다. 항체를 파파인으로 소화시키면, "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 "Fv" 단편을 갖는 F(ab')2 단편을 생성시킨다. "Fv" 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소의 항체 단편이다. 이 영역은 밀접한 비-공유 회합 상태로 있는 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 배위에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면에 항원 결합 부위를 규정한다. 전체적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄로 존재한다.

바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 Fv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하게 하는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해 문헌 [C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press]을 참조한다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇몇 잔기의 추가에 의해 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다.

"프레임워크" 또는 FR 잔기는 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.

어구 "불변 영역"은 이펙터 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 지칭한다.

용어 "뮤테인" 또는 "변이체"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 뮤테인 또는 변이체가 목적하는 결합 친화도 또는 생물학적 활성을 보유한다는 것을 단서로, 가변 영역 또는 가변 영역에 동등한 부분에 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 함유하는 항체의 폴리펩티드 서열을 지칭한다.

뮤테인은 모 항체에 대해 실질적으로 상동성이거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다.

용어 "유도체"는 유비퀴틴화, 치료제 또는 진단제에의 접합, 표지 (예를 들어, 방사성핵종 또는 다양한 효소에 의함), 공유적 중합체 부착, 예컨대 PEG화 (폴리에틸렌 글리콜에 의한 유도체화) 및 비-천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기술에 의해 공유적으로 변형된 항체를 지칭한다.

"인간" 항체 또는 기능적 인간 항체 단편은 본원에서 키메라 또는 "인간화"가 아니고, (전체적으로 또는 부분적으로) 비-인간 종으로부터 유래되지 않은 것으로서 규정된다. 인간 항체 또는 기능적 항체 단편은 인간으로부터 유래될 수 있거나 또는 합성 인간 항체일 수 있다. "합성 인간 항체"는 전적으로 또는 부분적으로, 공지된 인간 항체 서열의 분석에 기반한 합성 순서로부터 인 실리코(in silico) 유래의 서열을 갖는 항체로서 본원에서 정의된다. 인간 항체 서열 또는 그의 단편의 인 실리코 설계는, 예를 들어 인간 항체 또는 항체 단편 서열의 데이터베이스를 분석하고 그로부터 얻은 데이터를 사용하여 폴리펩티드 서열을 고안함으로써 달성될 수 있다. 인간 항체 또는 기능적 항체 단편의 또 다른 예는 인간 기원의 항체 서열의 라이브러리 (즉, 이러한 라이브러리는 인간 천연 공급원으로부터 얻은 항체를 기반으로 함)로부터 단리된 핵산에 의해 코딩되는 것이다. 인간 항체의 예는 문헌 [Kontermann R. and & Duebel S., editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag; Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Carlsson R, Soederlind E. (2001) n-CoDeR concept: unique types of antibodies for diagnostic use and therapy. Expert Rev Mol Diagn. 1:102-108]에 기재된 바와 같은 n-CoDeR-기반 항체를 포함한다.

"인간화 항체" 또는 기능적 인간화 항체 단편은 본원에서 (I) 비-인간 공급원 (예를 들어, 이종 면역계를 보유하는 트랜스제닉 마우스)으로부터 유래되고, 인간 배선 서열을 기반으로 하는 항체; 또는 (II) 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크가 인간 기원이고 불변 도메인이 (존재할 경우에) 인간 기원이면서 가변 도메인의 CDR이 비-인간 기원인 CDR-그라프팅된 항체인 것으로 규정된다.

본원에 사용된 어구 "키메라 항체"는 전형적으로가 상이한 종에서 비롯된 2종의 상이한 항체로부터 유래된 서열을 함유하는 항체를 지칭한다. 가장 전형적으로, 키메라 항체는 인간 및 뮤린 항체 단편, 일반적으로 인간 불변 및 마우스 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 항체는 재조합 항체 유전자 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 재조합 인간 항체 유전자의 레퍼토리 제조 및 필라멘트형 박테리오파지의 표면 상에 코딩된 항체 단편의 디스플레이를 위한 기술의 개발은 직접적으로 인간 항체를 제조하고 선택하기 위한 재조합 수단을 제공하였고, 이것은 또한 인간화, 키메라, 뮤린 또는 뮤테인 항체에도 적용될 수 있다. 파지 기술에 의해 생산된 항체는 박테리아에서 항원 결합 단편 - 통상적으로 Fv 또는 Fab 단편 -으로서 생산되고, 따라서 이펙터 기능이 결여된다. 이펙터 기능은 이하의 2가지 전략 중 하나에 의해 도입될 수 있다: 단편은 포유동물 세포에서 발현을 위한 완전한 항체로, 또는 이펙터 기능을 촉발할 수 있는 제2 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 단편으로 조작될 수 있다. 전형적으로, 항체의 Fd 단편 (VH-CH1) 및 경쇄 (VL-CL)를 PCR에 의해 별개로 클로닝하고, 조합 파지 디스플레이 라이브러리에서 무작위로 재조합한 후, 특정한 항원에 대한 결합에 대해 선택할 수 있다. Fab 단편은 파지 표면 상에 발현되며, 즉 이들을 코딩하는 유전자에 물리적으로 연결된다. 따라서, 항원 결합에 의한 Fab의 선택은 Fab 코딩 서열을 동시에 선택하고, 이 서열은 후속적으로 증폭될 수 있다. 수 회차의 항원 결합 및 재-증폭, 즉 패닝으로 불리는 절차에 의해, 항원에 특이적인 Fab를 풍부하게 하고, 최종적으로 단리한다.

파지-디스플레이 라이브러리로부터 인간 항체를 유도하기 위한 다양한 절차가 기재되어 있다. 이러한 라이브러리는 단일 마스터 프레임워크에 구축될 수 있고, 다양한 생체내 형성된 (즉 인간-유래의) CDR이 미국 특허 번호 6,989,250; 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합될 수 있다. 대안적으로, 이러한 항체 라이브러리는 인 실리코로 설계되고 합성에 의해 제작된 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 기반으로 할 수 있다. 항체 서열의 인 실리코 설계는, 예를 들어 인간 서열의 데이터베이스를 분석하고 그로부터 얻은 데이터를 사용하여 폴리펩티드 서열을 고안함으로써 달성된다. 인 실리코-제작 서열을 설계하고 수득하는 방법이 기재되어 있고; 예를 들어 문헌 [Carlsson R, Soederlind E. (2001) n-CoDeR concept: unique types of antibodies for diagnostic use and therapy. Expert Rev Mol Diagn. 1:102-108; 미국 특허 번호 6,989,250; Knappik A, Ge L, Honegger A, Pack P, Fischer M, Wellnhofer G, Hoess A, Woelle J, Plueckthun A, Virnekaes B. (2000) Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J Mol Biol. 296:57-86]을 참조한다. 파지 디스플레이 기술의 검토를 위해, 문헌 [Krebs B, Rauchenberger R, Reiffert S, Rothe C, Tesar M, Thomassen E, Cao M, Dreier T, Fischer D, Hoess A, Inge L, Knappik A, Marget M, Pack P, Meng XQ, Schier R, Soehlemann P, Winter J, Woelle J, Kretzschmar T. (2001) High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies. J Immunol Methods. 254:67-84]을 참조한다.

대안적으로, 본 발명의 항체는 동물로부터 유래될 수 있다. 이러한 항체는 문헌 [Krebs B, Rauchenberger R, Reiffert S, Rothe C, Tesar M, Thomassen E, Cao M, Dreier T, Fischer D, Hoess A, Inge L, Knappik A, Marget M, Pack P, Meng XQ, Schier R, Soehlemann P, Winter J, Woelle J, Kretzschmar T. (2001) High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies. J Immunol Methods. 254:67-84]에 요약되어 있는 인간화된 것 또는 휴먼 엔지니어드일 수 있고; 이러한 항체는 트랜스제닉 동물로부터 유래될 수 있다 ([Krebs B, Rauchenberger R, Reiffert S, Rothe C, Tesar M, Thomassen E, Cao M, Dreier T, Fischer D, Hoess A, Inge L, Knappik A, Marget M, Pack P, Meng XQ, Schier R, Soehlemann P, Winter J, Woelle J, Kretzschmar T. (2001) High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies. J Immunol Methods. 254:67-84] 참조).

본원에 사용된 항원의 상이한 '형태', 예를 들어 응고 인자 XI 및/또는 응고 인자 XIa는 본원에서 상이한 번역 및 번역후 변형, 예컨대 제한되지는 않지만, 일차 FXI 전사체의 스플라이싱에서의 차이, 글리코실화에서의 차이, 및 번역후 단백질분해적 절단에서의 차이로 인해 생성된 상이한 단백질 분자로서 규정된다.

본원에 사용된 용어 '에피토프'는 이뮤노글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기로 이루어지며, 통상적으로 특이적인 3차원 구조적 특성, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다. 당업자에게 널리 공지된 임의의 방법에 의해, 경쟁적 결합 검정에서 1개의 항체가 2차 항체와 경쟁하는 것으로 나타난 경우에, 및 바람직하게는 에피토프의 모든 아미노산이 2개의 항체에 의해 결합되는 경우에, 2개의 항체는 '동일한 에피토프에 결합하는' 것으로 언급된다.

용어 '성숙 항체' 또는 '성숙 항원-결합 단편' 예컨대 성숙 Fab 변이체는 FXI와 같은 주어진 항원에 대해 보다 강하고/거나 개선된 결합 - 즉 친화도가 증가된 결합 -을 나타내는 항체 또는 항체 단편의 유도체를 포함한다. 성숙은 이러한 친화도 증가로 이어지는 항체 또는 항체 단편의 6개의 CDR 내에서의 소수의 돌연변이를 확인하는 과정이다. 성숙 과정은 항체에의 돌연변이의 도입을 위한 분자 생물학적 방법 및 개선된 결합제를 확인하기 위한 스크리닝의 조합이다.

제약 조성물 및 투여

또한, 본 발명은 FXI/FXIa 항체를 단독으로, 또는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 포함하고 이에 제한되지는 않는 임의의 멸균, 생체적합성 제약 담체 내에서 투여될 수 있는 적어도 하나의 기타 작용제, 예컨대 안정화 화합물과 조합되어 포함할 수 있는 제약 조성물에 관한 것이다. 임의의 이들 분자는 단독으로, 또는 부형제(들) 또는 제약상 허용되는 담체와 혼합되는 제약 조성물 중에 기타 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합되어 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 제약상 불활성이다.

본 발명은 또한 제약 조성물의 투여에 관한 것이다. 이러한 투여는 비경구로 시행된다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥내 (종양에 직접적으로), 근육내, 피하, 수질내, 척수강내, 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내 또는 비강내 투여를 포함한다. 활성 성분뿐만 아니라, 이들 제약 조성물은 활성 화합물의 제약상 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제제화 및 투여를 위한 기술에 대한 추가의 상세사항은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)]의 최신판에서 찾아볼 수 있다.

비경구 투여용 제약 제제는 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 주사용으로, 본 발명의 제약 조성물이 수용액 중에, 바람직하게는 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거액 또는 생리학상 완충 염수 중에 제제화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예컨대 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 임의로, 현탁액은 또한 고도로 농축된 용액의 제조가 가능하게 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.

국소 또는 비강 투여를 위해, 침투시킬 특정한 장벽에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.

비경구 투여는 또한 동맥내, 근육내, 피하, 수질내, 척수강내, 및 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 질내, 또는 비강내 투여를 또한 포함하는 비경구 전달 방법을 포함한다.

키트

본 발명은 추가로 본 발명의 상기 언급된 조성물의 성분 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 및 키트에 관한 것이다. 이러한 용기(들)와 함께, 인간 투여를 위한 제품의 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 당국에 의한 승인을 반영하는, 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태의 통지서가 있을 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 이들 항체를 코딩하는 DNA 서열은 숙주 세포 내로의 형질감염 및 숙주 세포에 의한 발현에 적합한 플라스미드 내에 제공된다. 플라스미드는 숙주 세포에서의 DNA의 발현을 조절하기 위한 프로모터 (종종 유도성 프로모터)를 함유할 수 있다. 플라스미드는 또한 다양한 항체를 생산하기 위해 다른 DNA 서열의 플라스미드 내로의 삽입을 용이하게 하기 위한 적절한 제한 부위를 함유할 수 있다. 플라스미드는 또한 코딩된 단백질의 클로닝 및 발현을 용이하게 하기 위한 다수의 다른 요소를 함유할 수 있다. 이러한 요소는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 선택 마커, 개시 코돈, 종결 코돈 등을 포함한다.

제조 및 저장

본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 연화, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.

제약 조성물은 사용 전에 완충제와 조합되는, 4.5 내지 5.5의 pH 범위에서 1 mM-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 2%-7% 만니톨 중의 동결건조 분말로서 제공될 수 있다.

허용되는 담체 중에 제제화된 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제조한 후, 이를 적절한 용기에 넣고, 지시된 상태의 치료에 대한 라벨을 붙인다. 항응고 인자 XI 및/또는 항응고 인자 XIa 항체의 투여의 경우에, 이러한 라벨링은 투여의 양, 빈도 및 방법을 포함할 것이다.

IC50/EC50

FDA에 따르면, IC50은 주어진 생물학적 과정의 50% 억제에 요구되는 화합물의 농도를 나타낸다. 본 발명의 항체는 100 μM, 바람직하게는 1 μM, 보다 바람직하게는 0.1 μM, 보다 바람직하게는 0.01 μM, 보다 바람직하게는 0.001 μM, 보다 바람직하게는 0.0001 μM의 IC50 값을 나타낸다.

치료 유효 용량

본 발명에 사용하기에 적합한 제약 조성물은 의도된 목적, 즉 응고 인자 XI 및/또는 응고 인자 XIa를 특징으로 하는 특정한 질환 상태의 치료를 달성하기 위해 유효량의 활성 성분이 함유된 조성물을 포함한다. 유효 용량의 결정은 충분히 당업자의 능력 내에 속한다.

치료 유효 용량은 증상 또는 상태를 개선하는 단백질 또는 그의 항체, 길항제, 또는 억제제의 양을 지칭한다. 이러한 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차, 예를 들어 ED₅₀ (집단의 50%에서 치료상 유효한 용량) 및 LD₅₀ (집단의 50%에 치사성인 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 사이의 용량 비가 치료 지수이고, 이는 ED₅₀/LD₅₀ 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간 사용을 위한 투여량의 범위를 확립하는데 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED₅₀을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 이러한 범위 내에서, 사용되는 투여 형태, 환자의 감수성 및 투여 경로에 따라 달라진다.

정확한 투여량은 치료할 환자를 고려하여 개별 의사에 의해 선택된다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 모이어티를 제공하거나 또는 목적 효과를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 추가의 인자는 질환 상태의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합물(들), 반응 감수성, 및 요법에 대한 허용성/반응을 포함한다. 장기 작용성 제약 조성물은 특정한 제제의 반감기 및 청소율에 따라 3 내지 4일마다, 매주, 또는 2주마다 1회, 또는 1개월에 1회 투여될 수 있다.

통상적인 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 100,000 마이크로그램, 최대 총 약 2 g의 용량까지 달라질 수 있다. 특정한 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 하기 문헌에서 제공된다 [미국 특허 번호 6,300,064 참조]. 당업자는 단백질 또는 그의 억제제의 경우와 달리 폴리뉴클레오티드의 경우에는 상이한 제제를 활용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정한 세포, 상태, 위치 등에 따라 특이적일 것이다. 방사성표지된 항체의 경우에 바람직한 비활성은 0.1 내지 10 mCi/단백질 mg의 범위일 수 있다 [WO08/022295, US. 4,657,760; US 5,206,344; US 5,225,212; Riva P, Franceschi G, Frattarelli M, Lazzari S, Riva N, Giuliani G, Casi M, Sarti G, Guiducci G, Giorgetti G, Gentile R, Santimaria M, Jermann E, Maeke HR. (1999) Loco-regional radioimmunotherapy of high-grade malignant gliomas using specific monoclonal antibodies labeled with 90Y: a phase I study. Clin Cancer Res. 5(10 Suppl):3275s-3280s].

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 기재된다. 실시예는 단지 구체적 실시양태를 참조함으로써 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 이들 예시는 본 발명의 특정의 구체적 측면을 예시하지만, 개시된 발명의 제한을 나타내거나 그의 범위를 제한하지는 않는다.

상세하게 달리 기재된 경우를 제외하고는, 모든 실시예는 당업자에게 널리 공지되어 있고 상용되는 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 하기 실시예의 상용 분자 생물학 기술은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

완충제 중에서의 응고 인자 XI 및/또는 응고 인자 XIa 억제의 측정

상기 열거된 물질의 인자 Xa 억제를 결정하기 위해 생물학적 시험 시스템을 구축하고, 여기서 인자 XIa 기질의 전환이 인간 인자 XIa의 효소적 활성을 결정하기 위해 사용된다. 결정은 마이크로타이터 플레이트에서 수행한다.

항응고 활성의 결정

시험 물질의 항응고 활성을 인간 혈장 및/또는 토끼 혈장 및/또는 래트 혈장에서 시험관내에서 결정한다. 이를 위해, 0.11 몰의 시트르산나트륨 용액을 수용제로서 사용하여 시트르산나트륨/혈액 혼합비 1/9로 채혈한다. 채혈 직후에 이를 철저히 혼합하고, 약 4000 g에서 15분 동안 원심분리한다. 상청액을 피펫으로 뽑아낸다.

프로트롬빈 시간 (PT, 동의어: 트롬보플라스틴 시간, 퀵 시험)을 다양한 농도의 시험 물질 또는 상응하는 용매의 존재 하에 시판되는 시험 키트 (로슈(Roche)(이전 베링거 만하임(Boehringer Mannheim))의 네오플라스틴(Neoplastin)® 또는 인스트루멘테이션 래보러토리(Instrumentation Laboratory)의 헤몰리언스(Hemoliance)® 리콤비플라스틴(RecombiPlastin)))를 사용하여 결정한다. 시험 화합물을 혈장과 함께 37℃에서 3분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 트롬보플라스틴을 첨가하여 응고가 시작되게 하고, 응고가 발생한 시간을 결정한다. 프로트롬빈 시간을 배가시키는 시험 물질의 농도를 결정한다.

트롬빈 시간 (TT)은 다양한 농도의 시험 물질 또는 상응하는 용매의 존재 하에 시판되는 시험 키트 (로슈의 트롬빈 시약)를 사용하여 결정한다. 시험 화합물을 혈장과 함께 37℃에서 3분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 트롬빈 시약을 첨가하여 응고가 시작되게 하고, 응고가 발생한 시간을 결정한다. 트롬빈 시간을 배가시키는 시험 물질의 농도를 결정한다.

활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)은 다양한 농도의 시험 물질 또는 상응하는 용매의 존재 하에 시판되는 시험 키트 (로슈의 PTT 시약)를 사용하여 결정한다. 시험 화합물을 혈장 및 PTT 시약 (세팔린, 카올린)과 함께 37℃에서 3분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 25 mM 염화칼슘을 첨가하여 응고가 시작되게 하고, 응고가 발생한 시간을 결정한다. aPTT를 배가시키는 시험 물질의 농도를 결정한다.

본 발명의 항체의 농도는 100 μM의 농도, 바람직하게는 1 μM의 농도, 보다 바람직하게는 0.1 μM의 농도, 보다 바람직하게는 0.01 μM의 농도, 보다 바람직하게는 0.001 μM의 농도, 보다 바람직하게는 0.0001 μM의 농도, 보다 바람직하게는 0.00001 μM의 농도에서 aPTT를 배가시킨다.

치료 용도

본 발명의 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체는 응고 캐스케이드의 억제 및 혈소판 응집의 억제 및 혈전증의 억제가 유익할 임의의 대상체에게 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명의 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체는 인간 뿐만 아니라 동물에서 응고-관련 질환의 치료 및/또는 예방에 적합하다.

용어 "혈전색전성 질환"은 ECG의 ST 상승을 동반 및 비동반하는 심근경색 (MI) 또는 급성 심근경색 (AMI) (STEMI 및 비-STEMI), 안정형 협심증 뿐만 아니라 불안정형 협심증, 혈관성형술 또는 관상 동맥 우회로 이식 (CABG)과 같은 관상동맥 개입 후 재-폐쇄 및 재-협착, 말초 동맥 폐쇄성 질환 (PAOD), 폐 색전증 (PE), 심부 정맥 혈전증 (DVT) 뿐만 아니라 신정맥 혈전증, 일과성 허혈 발작 (TIA), 혈전성 졸중 및 혈전색전성 졸중과 같은 질환을 포함한다.

이들 항체는 또한 뇌 허혈, 졸중 발작 뿐만 아니라 전신 혈전색전증과 같은 심인성 혈전색전증의 치료 및 예방, 불규칙한 심장박동 또는 비정상적 심장 리듬을 갖는 환자, 예를 들어 심방 세동 환자, 인공 심장 판막에 의한 심장 판막 질환 환자의 치료에 유용하다. 이에 더하여, 이들 항체는 파종성 혈관내 응고 (DIC) 환자의 치료에 도움이 될 수 있다.

혈전색전성 합병증은 혈관 벽의 아테롬성동맥경화성 병변, 특히 내피 기능의 장애에 의해 유발될 수 있으며, 이는 급성 혈전성 폐쇄로 이어질 수 있다. 아테롬성동맥경화증은 수많은 심혈관 위험 인자에 의존한 다인성 장애이다. 임상 연구는 항응고제에 의한 예방이 동맥 혈관 장애의 경과에 명확하게 영향을 미치지 않음을 보여주고 있다. 항혈전 요법과 관련된 위험 인자의 표적화된 치료가 따라서 유익하다. 관상, 말초 및 뇌 혈관 장애에 대한 위험 인자는, 예를 들어 상승된 혈청 콜레스테롤 수준, 동맥 고혈압, 흡연 및 당뇨병이다. 예방 의학의 원리는 이들 위험 인자의 제거에 기초한다. 생활방식에서의 변화에 더하여, 또한, 예를 들어 항고혈압 요법, 지질-강하 의약 또는 혈전증 예방과 같은 약리학적 측정이 포함된다. 또한, 관상동맥 치료제와의 조합은 기존에 관상동맥 심장 질환이 있었던 치료에 적합하다.

혈전색전성 합병증은 미세혈관병증성 용혈성 빈혈 (MAHA); 혈액투석 및 대동맥판 치환과 같은 체외 혈액 순환에 수반된다.

또한, 본 발명의 항체는 류마티스 관절염 (RA)과 같은, 또는 알츠하이머병 (AD)과 같은 신경계 질환과 같은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 유용하다. 이에 더하여, 이들 항체는 암 및 전이, 혈전성 미세혈관병증 (TMA), 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신병증, 뿐만 아니라 다른 미세혈관 질환의 치료에 유용할 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 종양 환자의 수술 후 혈전색전성 합병증 또는 화학- 및/또는 방사선요법을 받은 종양 환자의 치료에 유용하다.

본 발명의 항체는 또한 투석 환자의 치료 및/또는 예방, 특히 혈액투석에서의 단락 혈전증의 시미노-누공 방지에 유용하다. 혈액투석은 천연 동정맥루, 합성 루프 그라프트, 대형-구멍 중심 정맥 카테터 또는 인공 표면으로 이루어진 다른 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 항체의 투여는 투석 동안 및 그 직후 둘 다에서 누공 내에 응괴의 형성 (및 폐동맥 내의 색전성 응괴의 증식)을 방지할 것이다.

본 발명의 항체는 또한 심폐 우회로 수술 (예를 들어 ECMO: 체외 막 산소화) 이후 심장내 및 폐내 혈전증을 겪는 환자의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

전신 항응고, 및 장치의 기계적 안정성 및 지속기간에 대한 요건 하에, 심실 보조 장치의 주요 한계는 혈전색전성 사건의 발생률이 높다는 것이다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 좌심실 보조 장치를 보유한 환자의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

원치않는 출혈 사건의 위험을 증가시키지 않으면서 투석 환자에서 및 정맥 혈전색전증 (VTE) 및 심방 세동 (예를 들어 혈액투석 환자에서 말기 신장 질환)의 발생률이 이러한 집단에서 높은 경우에 항응고에 대한 높은 필요성이 존재한다. 본 발명의 항체는 또한 이들 유형의 환자의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

본 발명의 항체는 또한 특발성 혈소판감소성 자반증 (IPT)이 발생한 환자의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 이들 환자는 일반적인 집단과 비교하여 증가된 혈전성 위험을 갖는다. 응고 인자 FXI의 농도는 대조군과 비교하여 ITP 환자에서 유의하게 더 높으며, aPTT는 ITP 환자에서 유의하게 더 길다.

본 발명의 항체는 또한 폐고혈압의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

용어 "폐고혈압"은 세계 보건 기구 WHO가 규정한 지침 (Clinical Classification of Pulmonary Hypertension, Venice 2003)에 따르며, 예를 들어 폐동맥 고혈압, 좌심실 질환에 의해 유발된 폐고혈압, 폐 질환 및/또는 저산소증, 혈전, 동맥 수축에 의해 유발된 폐고혈압, 및 만성 혈전색전성 폐고혈압 (CTEPH)과 같은 기타 질환이 있다.

용어 "폐 고혈압"은 또한 특발성 폐동맥 고혈압 IPAH; 가족성 폐동맥 고혈압 (FPAH); 콜라겐증, 선천성 전신 폐 단락 결손, HIV 감염, 또는 특정 약물의 투여, 및 갑상선 질환, 글리코겐 축적 질환 (GSD), 고셔병, 유전성 출혈 모세혈관확장증, 혈색소병증 및/또는 골수증식성 장애와 같은 질환과 연관될 수 있는 연관된 폐동맥 고혈압 (APAH)과 같은 질환을 포함한다.

본 발명의 항체는 폐 정맥-폐쇄 질환, 폐 모세관 혈관종증 (PCH), 뿐만 아니라 신생아의 지속적 폐고혈압과 같은 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

용어 "폐고혈압"은 또한 만성 폐쇄성 폐 질환 (CODP), 간질성 폐 질환 (ILD), 수면 무호흡, 폐포 과다호흡, 고산병, 뿐만 아니라 체질성 이형성증과 같은 질환을 포함한다.

만성 혈전색전성 폐고혈압 (CTEPH)에 의해 유발되는 질환은 근위 및/또는 원위 폐동맥 폐쇄, 또는 암, 기생충 또는 오염물과 같은 비-혈전성 폐 색전과 연관될 수 있다.

이에 더하여, 본 발명의 항체는 사르코이드증, 조직구증 X 및 림프관종증에 의해 유발된 폐고혈압의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 폐 및/또는 간 섬유증의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 패혈증, 전신 염증 증후군 (SIRS), 기관 기능장애, 다발성 기관 기능장애 증후군 (MODS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 급성 폐 손상 (ALI), 파종성 혈관내 응고 (DIC)의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

용어 "패혈증"은 감염 또는 전신 염증 반응 증후군 (SIRS)의 발생을 규정한다. SIRS는 주로 감염에 의해 유발되지만, 또한 병변, 화상, 쇼크, 수술, 허혈, 췌장염, 재생 또는 종양 발생에 따라 일어날 수 있다. 패혈증의 경과에서, 파종성 혈관내 응고 또는 짧게는 DIC라 불리는 과정인 응고 캐스케이드가 활성화될 수 있다. 이는 미세혈전의 형성 및 이차 합병증으로 이어질 수 있다.

또한, 패혈증 또는 SIRS는 내피 기능장애로 이어질 수 있으며, 이는 투과성 혈관의 증가로 이어진다. 패혈증 또는 SIRS의 경과에서, 여러 기관의 복합 부전, 예를 들어 신부전, 간부전, 폐부전, 심혈관계 부전이 일어날 수 있다.

패혈증 또는 SIRS를 유발하는 병원성 유기체는 그람-양성 및 그람-음성 박테리아, 진균, 바이러스 및/또는 진핵 병원체이다.

DIC 및/또는 SIRS는 패혈증과 함께 발생할 수 있지만, 또한 수술, 종양 질환, 화상 또는 다른 유형의 손상으로 인해 발생할 수 있다.

DIC 동안, 손상된 혈관 또는 다른 유형의 조직 표면에서 응고 캐스케이드의 활성화가 일어난다. 이는 미세혈전의 형성으로 이어질 수 있으며, 이는 그 부위에서의 소혈관의 폐쇄로 이어진다.

한 실시양태에서, 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체는 이미 언급된 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 다른 약물과 함께 사용된다.

하기에, 적합한 조합에 대한 예가 열거되어 있고, 따라서 이는 바람직한 것으로 언급된다:

- 지질 강하 화합물, 특히 로바스틴 (메바코르; US 4,231,938), 심바스타틴 (조코르; US 4,444,784), 프라바스타틴 (프라바콜; US 4,346,227), 플루바스타틴 (레스콜; US 5,354,772), 및 아토르바스타틴 (리피토르; US 5,273,995)과 같은 3-히드록시-3-메틸-글루타릴-CoA 리덕타제의 억제제와의 조합.

- 관상동맥 질환의 치료에 적합한 화합물 및/또는 혈관확장 활성을 나타내는 화합물, 특히 캅토프릴, 리시노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 실라자프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 퀴나프릴 및 페린도프릴과 같은 안지오텐신 전환 효소의 억제제, 또는 엠부사르탄 (US 5,863,930), 로사르탄, 발사르탄, 이르베사르탄, 칸데사르탄, 에프로사르탄 및 텔미사르탄과 같은 안지오텐신 II 수용체의 길항제, 또는 카르베딜롤, 알프레놀롤, 비소프롤롤, 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 카르테올롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 펜부톨롤, 핀돌롤, 프로파놀롤 및 티몰롤과 같은 β-아드레날린성 수용체의 길항제와의 조합, 또는 프라조신, 부나조신, 독사조신 및 테라조신과 같은 알파1 아드레날린성 수용체의 길항제와의 조합.

- 이뇨제 히드로클로로티아지드, 푸로세미드, 부메타니드, 피레타니드, 토라세미드, 아밀로리드 및 디히드랄라진과의 조합.

- 베라파밀 및 딜티아젬, 디히드로피리딘 유도체, 예컨대 니페디핀 (아달라트(Adalat)), 니트렌디핀 (베이오텐신(Bayotensin)), 이소소르비드-5-모노니트라트, 이소소르비드-디니트라트 및 글리세롤트리니트라트와 같은 칼슘 채널 억제제와의 조합.

- 가용성 구아닐레이트시클라제의 자극제와 같은 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP)의 농도를 증가시키는 화합물 (WO 98/16223, WO 98/16507, WO 98/23619, WO 00/06567, WO 00/06568, WO 00/06569, WO 00/21954, WO 00/66582, WO 01/17998, WO 01/19776, WO 01/19355, WO 01/19780, WO 01/19778, WO 07/045366, WO 07/045367, WO 07/045369, WO 07/045370, WO 07/045433)과의 조합.

- 플라스미노겐 활성화제와 같은 응고 캐스케이드의 기타 억제제 (혈전용해제/섬유소용해제) 뿐만 아니라 혈전용해 및/또는 섬유소용해를 증가시키는 화합물 또는 플라스미노겐 활성화제의 억제제 또는 조직 플라스미노겐 활성화제 (t-PA), 스트렙토키나제, 레테플라제 및 우로키나제와 같은 트롬빈-활성화 섬유소용해-억제제 (TAFI-억제제)의 억제제와의 조합.

- 미분획 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파리노이드, 히루딘, 비발리루딘 및/또는 아르가트로반과 같은 항응고제와의 조합.

추가의 조합 요법은 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체와 항생제 요법, 항진균 치료제 및 항바이러스 치료제의 공-투여이다.

추가로, 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체와 하기의 조합.

- 노르에피네프린, 도파민 및 바소프레신과 같은 혈관수축제

- 수축촉진 요법, 예를 들어 도부타민

- 히드로코르티손 또는 플루드로코르티손과 같은 코르티코스테로이드

- 재조합적으로 발현된 활성화 단백질 C

- 신선 동결 혈장, 적혈구 농축물 및/또는 혈전구 농축물과 같은 혈액 생성물

본 발명의 또 다른 실시양태는 응고 인자 XI 및/또는 응고 인자 XIa를 함유하는 혈액 프로브, 혈액 보존, 다른 혈장 생성물 또는 생물학적 샘플을 위한 항응고제로서 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체의 사용이다. 이들 샘플은 시험관내 응고를 피하기 위해 유효 농도의 항체가 첨가되는 방식으로 특성화된다.

본 발명의 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체는 또한 응고 인자 XI 및/또는 응고 인자 XIa를 함유하는 혈액 카테터 또는 다른 의약 첨가제 또는 장치의 제조와 같이 생체외 응고의 억제를 위해, 생체내의 인공 표면을 코팅하기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 생체외의 의약 첨가제, 장치 또는 다른 생물학적 샘플에서 사용될 수 있다.

실시예 1: 항체의 확인

파지 선택에 사용된 도구:

본 발명의 인간 항체의 단리에 사용되는 단백질은 표 1에 열거된 바와 같은 다양한 공급원에서 수득하였다. 대략 2배 몰 과량의 비오틴-LC-NHS (피어스(Pierce); Cat. NO: 21347)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 단백질을 비오티닐화하고, 제바(Zeba) 탈염 칼럼 (피어스; Cat. NO: 89889)을 사용하여 탈염시켰다.

<표 1> 파지 선택 및 스크리닝에 사용된 단백질의 목록

파지 선택:

본 발명의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 단리는 천연 및 합성 다양성을 조합한 Fab 라이브러리인 디액스(DYAX) 인간 Fab 항체 라이브러리 FAB-310 (디액스 코포레이션(DYAX Corp.), 매사추세츠주 캠브리지; [Hoet et al., Nat. Biotech. 2005, 23:344-8]에 기재됨)을 사용하여 파지 디스플레이 기술에 의해 수행하였다. 표 2 내지 6은 다중 에피토프를 포함하는 항체를 선택하기 위해 사용된 다양한 전략을 요약한다.

<표 2> 선택 전략 I: 각 선택 라운드 이전에 비오티닐화 칼리크레인/프리-칼리크레인 (500 nM)에 대한 고갈 단계를 포함시켰다.

<표 3> 선택 전략 II: 전략 I에 기재된 바와 같이, 각 선택 라운드 이전에 비오티닐화 칼리크레인/프리-칼리크레인 (500 nM)에 대한 고갈 단계를 포함시켰다. 이에 더하여, 복합체 hFXIa (500 nM) / 아프로티닌 (25 μM)의 존재 하에 선택을 수행하였다.

<표 4> 선택 전략 III: 각 선택 라운드 이전에 비오티닐화 칼리크레인/프리-칼리크레인 (500 nM)에 대한 고갈 단계를 포함시켰다.

<표 5> 선택 전략 IV: 전략 III에 기재된 바와 같이, 각 선택 라운드 이전에 비오티닐화 칼리크레인/프리-칼리크레인 (500 nM)에 대한 고갈 단계를 포함시켰다. 이에 더하여, 복합체 hFXIa (500 nM) / 아프로티닌 (25 μM)의 존재 하에 선택을 수행하였다.

<표 6> 선택 전략 V: 각 선택 라운드 이전에 비오티닐화 칼리크레인/프리-칼리크레인 (500 nM) 및 비오티닐화 hFXI (500 nM)에 대한 고갈 단계를 포함시켰다.

본 실시예에서 사용된 표준 완충제는 다음과 같다:

1x PBS: 시그마(Sigma) (D5652-50l)

PBST: 0.05% 트윈20(Tween20) (시그마, P7949)으로 보충된 1x PBS

차단 완충제: 3% BSA (시그마 A4503)로 보충된 PBST

침전 완충제: 2.5 M NaCl 중의 20% PEG6000 (칼바이오켐(Calbiochem), 528877)

세포 패닝-완충제: 3% FBS (깁코(GIBCO), 10082) 및 0.01% NaN₃ (시그마, 71289)으로 보충된 PBS

라이브러리 선택에 사용되는 일반적인 방법은 호에트(Hoet) 등에 의해 기재되어 있다 (Hoet RM, Cohen EH, Kent RB, Rookey K, Schoonbroodt S, Hogan S, Rem L, Frans N, Daukandt M, Pieters H, van Hegelsom R, Neer NC, Nastri HG, Rondon IJ, Leeds JA, Hufton SE, Huang L, Kashin I, Devlin M, Kuang G, Steukers M, Viswanathan M, Nixon AE, Sexton DJ, Hoogenboom HR, Ladner RC. (2005) Generation of high-affinity human antibodies by combining donor-derived and synthetic complementarity-determining-region diversity. Nat Biotechnol. 23:344-348). 간략하게, 1/5 부피의 침전 완충제를 첨가한 후 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 원심분리 단계 (5500 rpm에서 1시간)를 거쳐 Fab 항체 라이브러리를 침전시켰다. 후속해서 침전된 라이브러리를 1 ml 차단 완충제 중에 재현탁시키고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

한편, 스트렙타비딘-코팅된 디나비즈(Dynabeads) M280 (인비트로젠(Invitrogen), 11206D)의 분취액을 PBST로 3회 세척하여 준비하였다. 그 후, 표 2 내지 6에 나타낸 바와 같이 일부 분취액은 비오티닐화 칼리크레인/프리-칼리크레인 (500 nM) 또는 비오티닐화 hFXI (500 nM)와 혼합하고, 나머지는 비오티닐화 표적 단백질과 혼합하였다. 혼합물을 종단간 연결 회전기 상에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 후속해서 1 ml PBST 중에서 5회 세척하였다. 코팅된 비드를 최종적으로 1 ml 차단 완충제 중에의 재현탁에 의해 차단하고, 5개의 튜브에 분취한 후, 비드를 수집하고 상청액을 제거하였다.

차단된 라이브러리 (상기 기재됨)를 차단된 비오티닐화 칼리크레인/프리-칼리크레인 (500 nM) 또는 비오티닐화 hFXI (500 nM)로 코팅된 디나비즈에 첨가하여 5 단계의 순차적 고갈 단계를 나타낸 바와 같이 행하고, 회전시키면서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 자기 랙 상에서 비드를 수집한 후, 원심분리에 의해 상청액을 청정화하고, 표적 단백질로 코팅된 차단된 디나비즈와 혼합하였다. 종단간 연결 회전기 상에서 30분 인큐베이션 후, 샘플을 차단 완충제로 3회 세척하고, 이어서 PBST로 9회 세척하였다. 이어서 표 2 - 6에 묘사된 전략에 따라 다음 선택 라운드에서 사용되는 새로운 파지 원액을 제조하기 위해, 풍부화된 파지를 함유하는 재현탁된 비즈 절반을 사용하여 기하급수적으로 성장하고 있는 이. 콜라이 TG1 (스트라타진(Stratagene))을 감염시켰다. 보다 상세하게는, TG1-배양물 6 ml를 디나비드/파지 현탁액 500 μl로 30분 동안 37℃에서 진탕없이 감염시켰다. 그 후, 산출물 적정을 위해 분취액을 취하였다. 남은 배양물은 5000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 생성된 펠릿은 2 ml 2xYT 중에 재현탁시키고, 한천 플레이트 (2xYT, 100 μg/ml 암피실린, 2% 글루코스) 상에 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 세포를 5 ml 2xYT로 긁어내고, 신선한 배양물 20 ml 2xYT (100 μg/ml Amp)를 OD600 0.05로 접종시키는데, 및 글리세롤 원액을 제조하는데 사용하였다. OD600 0.5 내지 0.8에 이를 때까지 신선한 액체 배양물을 37℃에서 약 2시간 동안 진탕한 다음, 5 ml 배양물을 M13 헬퍼파지 M123K07 (인비트로젠 420311)과 약 20의 감염 다중도 (MOI)로 혼합하였다. 37℃에서 30분 동안 천천히 진탕한 후, 30 ml의 사전가온한 2xYT (100 μg/ml 암피실린, 20 μg/ml 카나마이신, f.c.)를 첨가하고, 배양물을 30℃에서 밤새 진탕하였다. 다음날 오전, 6000 rpm에서 원심분리하여 상청액을 수확하고, 스테리플립(Steriflip) (0.22μm; 밀리포어(Milipore) SCGP00525)을 통해 여과하여 청정화하였다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 파지를 침전시키고, 다음 선택 라운드에서 사용하기 위해 1 ml 차단 완충제 (또는 세포 패닝 완충제) 중에 재현탁시켰다. 분취액은 투입물 역가의 결정을 위해 사용하였다.

효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA):

파지 ELISA:

상이한 선택 라운드 이후의 파지 풀에 대해, 비오티닐화 표적 단백질에 대한 ELISA에 의해 특이적 결합제의 풍부화를 분석하였다. 간략하게, 글리세롤 원액으로부터의 분취액을 2xYT (100 mg/ml 암피실린, 1% 글루코스) 상에 37℃에서 밤새 플레이팅하였다. 단일 콜로니를 100 μl 배지 (2xYT, 100 μg/ml 암피실린, 1 % 글루코스)를 함유하는 MTP의 벽에 집어 넣고, 37℃에서 밤새 진탕시켰다. 밤샘 배양물 10 μl를 헬퍼파지 M123K07 (인비트로젠 420311)을 함유하는 신선한 배지 (100 μg/ml 암피실린으로 보충된 2xYT) 190 μl에 첨가하고, OD600이 ~0.5에 이를 때까지 96-웰 MTP 내에서 200 rpm 및 37℃에서 인큐베이션하여 파지 발현을 수행하였다.

스트렙타비딘 (피어스, 15500)으로 사전 코팅된 96-웰 ELISA-플레이트를 1μg/ml 비오티닐화 표적 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBST로 7회 세척하고, 차단 시약으로 처리하고, PBST로 다시 3회 세척하였다. 한편, 밤샘 파지 배양물을 100 μl 차단 완충제와 혼합하였다. 그 후, 차단된 파지 100 μl를 웰마다 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 7회 세척한 후, HRP (지이 헬스케어(GE Healthcare), 27-9421-01; PBST 중에 1:2500으로 희석됨)에 커플링된 항 M13 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 웰을 다시 7회 세척하였다. 100 μl TMB (인비트로젠, 2023)를 첨가하여 발색 반응을 전개시키고, 5-15분 후에 100 μl H₂SO₄ (머크(Merck), 1120801000)를 첨가하여 중단시켰다. 비색 반응을 플레이트 판독기 (테칸(Tecan))로 450 nM에서 기록하였다.

<표 7> Fab/파지 ELISA에서의 상이한 전략으로부터의 풀의 적중률: 수치는 각각 인간/토끼/표적 둘 다 (교차반응성)에 대한 % 적중률을 지칭함; n.a.: 해당사항 없음.

sFab 스크리닝을 위한 GenIII-제거에 의한 sFab의 재클로닝

가용성 Fab 단편 (sFab)의 생성을 위해, 선택 라운드 2, 3 및 4로부터 플라스미드 DNA를 단리하고, 공급업체의 지시에 따라 제한 효소 MluI (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biloabs), R0198L)로 소화시켰다. 유전자 III 함유 단편을 제거하기 위해, 벡터를 겔-추출하고 NdeI (뉴잉글랜드 바이오랩스, R0111S)로 사멸-절단하였다. EtOH-침전 이후에, 생성된 단편을 재-라이게이션시키고, 구축물을 표준 방법을 사용하여 화학적으로 적격인 이. 콜라이 톱10으로 형질전환시켰다.

실시예 2: 항응고 인자 XI 항체 및/또는 항응고 인자 XIa 항체

본 발명의 항체, 항원-결합 항체 단편, 및 항체 및 단편의 변이체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 구성된다. 본 발명에서 고려되는 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체는 응고 인자 XI 및/또는 응고 인자 XIa에 대한 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 결합 활성이 유지되어 있는 분자이다.

본 발명은 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며,

- 여기서 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 아미노산 서열은 가변 경쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 1 및 아미노산 서열에 대한 서열 19, 및 가변 중쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 2 및 아미노산 서열에 대한 서열 20과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 또는 90%, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 동일하거나, 또는

- 여기서 이들 항체의 성숙한 형태의 경우에, 가변 중쇄 및 경쇄 도메인의 아미노산 서열은 그에 대해 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 또는 90%, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 동일하다.

- 여기서 CDR의 아미노산 서열은 중쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 3, 4 및 5 및 아미노산 서열에 대한 서열 21, 22 및 23, 및 가변 경쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 6, 7 및 8 및 아미노산 서열에 대한 서열 24, 25 및 26과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 동일하다.

본 발명은 항체 또는 항원-결합 단편을 추가로 제공하며,

- 여기서 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 아미노산 서열은 가변 경쇄에 대한 DNA 서열에 대한 서열 9 및 아미노산 서열에 대한 서열 27, 및 가변 중쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 2 및 아미노산 서열에 대한 서열 20과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 또는 90%, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 동일하거나, 또는

- 여기서 이들 항체의 성숙한 형태의 경우에, 가변 중쇄 및 경쇄 도메인의 아미노산 서열은 그에 대해 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 또는 90%, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 동일하다.

- 여기서 CDR의 아미노산 서열은 가변 경쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 10 및 아미노산 서열에 대한 서열 28과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 동일하다.

본 발명은 항체 또는 항원-결합 단편을 또한 제공하며,

- 여기서 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 아미노산 서열은 가변 경쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 11 및 아미노산 서열에 대한 서열 29, 및 가변 중쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 12 및 아미노산 서열에 대한 서열 30과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 또는 90%, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 동일하거나, 또는

- 여기서 이들 항체의 성숙한 형태의 경우에, 가변 중쇄 및 경쇄 도메인의 아미노산 서열은 그에 대해 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 또는 90%, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 동일하다.

- 여기서 CDR의 아미노산 서열은 중쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 13, 14 및 15 및 아미노산 서열에 대한 서열 31, 32 및 33, 및 가변 경쇄 도메인에 대한 DNA 서열에 대한 서열 16, 17 및 18 및 아미노산 서열에 대한 서열 34, 35 및 36과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 또는 보다 더 바람직하게는 95% 동일하다.

실시예 3: 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 검정을 사용한 항응고 활성의 결정

활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 검정을 사용하여 항체 076D-M007-H04, 076D-M007-H04-CDRL3-N110D 및 076D-M028-H17의 항응고 활성을 시험하였다.

인간 및 토끼 혈장에서 aPTT를 배가시키는데 필요한 농도에 대한 값은 표 8에 제시되어 있다:

<표 8> 인간 및 토끼 혈장의 aPTT를 배가시키는데 필요한 항체 농도.

<표 9> 본 발명의 항체의 예 및 서열을 제시함.

실시예 4: FXIa 항체의 항응집 활성의 결정

유동 조건하에서의 혈소판 활성화를 측정하기 위해, 유리 슬라이드 (멘첼-글래저(Menzel-Glaeser) 슈퍼프로스트(SUPERFROST) 76 x 26 mm; 게르하르트 멘첼 게엠베하(Gerhard Menzel GmbH), 독일 브라운슈바이크)를 콜라겐 (150 μg/ml)으로 4℃에서 밤새 코팅한 다음, BSA (5 mg/ml)로 차단하고, 그후 자이스 악시오베르트(Zeiss Axiovert) 135 현미경 (칼 자이스(Carl Zeiss), 독일 괴팅겐) 스테이지 상에서 유동계로 어셈블리시켰다. 시트레이트 처리된 전혈을 GPRP (3 mM 최종) 및 비히클 또는 FXI 항체와 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. CaCl₂ (5 mM)의 첨가 후, 혈액을 1000 s^-1의 초기 전단 속도로 5분 동안 콜라겐-코팅된 슬라이드 상에 즉시 관류시켰다. 상기 기재된 바와 같이 전혈의 관류 이후에, 각 1분에 포스트-챔버 전혈을 시트르산나트륨 (1:10 vol/vol)으로 수집하였다. 또한, 프리-챔버 혈액을 샘플링하고, 양성 대조군 (10 μg/ml)으로서 TRAP6으로 또는 TRAP6 없이 5분 동안 처리하였다.

프리- 및 포스트-챔버 혈액 샘플을 세포 세척액 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 독일 하이델베르크) 중에 희석시키고, 항체와 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 빙냉-세포 세척액을 첨가하여 항체 반응을 중단시키고, 모든 샘플을 측정시까지 얼음 상에서 유지시켰다. 10000개의 단일 혈소판이 FITC-접합된 혈소판 마커 (CD41a 또는 CD61a) 양성 및 유동 세포측정법 (팩스칼리버(FACSCalibur); BD 바이오사이언시스, 독일 하이델베르크)에 의한 특징적인 가벼운 산란 패턴을 갖는 것으로 결정되었다. CD62P 발현에 대해, 단일 혈소판은 비표지된 대조군 샘플로 확인된 PE-CD62P 형광 역치를 갖는 분리된 산란 플롯으로 게이팅되었다. 역치를 초과하는 혈소판 집단은 활성화된 것으로 고려되었고, 정량화되었다. 혈소판 미세응집체는 전방 산란 (FSC) 및 FITC-형광에 대한 임의적 역치로 규정되었다.

실시예 5: 토끼에서의 FeCl₂ 유발된 혈전증 및 귀 출혈 시간.

동맥 혈전증 모델에서 076D-M007-H04, 076D-M007-H04-CDRL3-N110D 및 076D-M028-H17의 항혈전 활성을 결정하였다. 076D-M007-H04 (0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg), 076D-M007-H04-CDRL3-N110D (0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1mg/kg) 또는 076D-M028-H17 (0.075 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.3 mg/kg)의 i.v. 볼루스 투여 후 15분에, 토끼에서 염화제2철에 의해 경동맥을 화학적으로 손상시켜 혈전증을 유발시켰다. 크실라진 및 케타민 (롬푼(Rompun), 바이엘(Bayer) 5 mg/kg 및 케타베트 파마시아 & 업존 게엠베하(Ketavet Pharmacia & Upjohn GmbH), 40 mg/체중 kg)의 혼합물을 i.m. 주사에 의해 제공하여 수컷 토끼 (Crl:KBL (NZW)BR, 찰스 리버(Charles River))를 마취시켰다. 보충적 마취제는 우측 귀의 변연 정맥에 마취 혼합물의 주입에 의해 투여하였다. 우측 총경 동맥을 노출시킨 후, 혈액 흐름이 영향을 받지 않도록 우측 총경 동맥 아래에 파라필름(Parafilm) ® 스트립 (25 mm x 12 mm) 상에 한 장의 블롯팅 종이 (10 mm x 10 mm)를 놓고 혈관을 손상시켰다. 블롯팅 종이는 100 μl FeCl₂ (염화철 (II) 4수화물, 에이. 데스트(A. dest)(시그마) 중 13%)로 포화되었다. 5분 후, 여과지를 제거하고, 혈관을 0.9% NaCl로 2회 헹구었다. 손상 후 30분에 경동맥을 제거하고, 혈전을 빼내어 즉시 칭량하였다. 각 그룹 당 5-7마리의 동물을 사용하였다. 귀 출혈 시간은 FeCl₂-손상 후 2분에 결정하였다. 좌측 귀를 면도하고, 외과용 칼 (번호 10-150-10, 마르틴(Martin), 독일 투틀링겐)을 사용하여 귀의 긴 축에 평행하게 표준화된 절개부 (3 mm 길이)를 만들었다. 가시적인 혈관의 손상을 피하기 위해 주의하였다. 상처와 접촉되지 않도록 주의하면서 절개부 부위를 여과지로 30초 간격으로 블롯팅하였다. 혈액이 더 이상 여과지를 물들이지 않을 때까지 절개부로부터 시간을 측정하여 출혈 시간을 결정하였다.

실시예 6: 토끼에서의 FeCl₂ 유발된 혈전증 및 귀 출혈 시간의 결정.

076D-M007-H04는 도 14에 제시된 바와 같이, 혈전 중량을 용량 의존적으로 감소시키고, 귀 출혈 시간을 연장시키지 않는다. 도 15는 귀 출혈 시간을 증가시키지 않으면서 076D-M007-H04-CDRL3-N110D의 항혈전 효과를 증명한다. 도 16에서, 076D-M028-H17의 항혈전 효과 및 비-출혈 시간 연장이 제시되어 있다.

실시예 7: Fab 076D-M007-H04:FXIa 복합체의 복합체 형성, 결정화 및 X선 구조 결정.

복합체 형성 및 결정화.

FXIa C500S (아미노산 388 - 625)를 프로테로스 바이오스트럭쳐스(Proteros Biostructures)에서 구입하였다. 정제된 Fab 076D-M007-H04를 FXIa C500S와 1:1 비로 혼합하였다. 복합체 형성이 가능하도록, 용액을 빙상에서 18시간 동안 저장하였다. 복합체 용액을 슈퍼덱스(Superdex) 200 HR 16/60 칼럼 상에 로딩하고, pH 7.5의 20 mM 트리스(Tris) / HCl 및 75 mM NaCl 중에 20mg/ml의 최종 농도로 추가로 농축시켰다. Fab 076D-M007-H04 및 FXIa C500S를 포함하는 단백질 복합체의 결정을 시팅-드롭 방법을 사용하여 20℃에서 성장시키고, 동등 부피의 단백질 복합체 용액 및 웰 용액 (100mM 트리스 pH 8.25, 0.05% PEG20000), 및 침전제로서 2.4M NH4SO4를 혼합하여 결정화시켰다. 대략 5일 후에 장미 모양과 유사한 결정이 나타났다.

데이터 수집 및 프로세싱.

결정을 동결-완충제를 사용하지 않고 액체 질소 중에서 신속-동결시켰다. 결정의 데이터를 MAR CCD 검출기 상의 빔라인 BL14.1, 베시(BESSY) 싱크로트론 (베를린)에 모았다. 데이터를 지수화하여 XDS와 통합하고 (Kabsch, W. (2010) Acta Cryst. D66, 125-132), 포인트레스(POINTLESS)와의 크기조정을 위해 준비하고, 스칼라(SCALA)로 크기조정하였다 (P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82). 결정은 2.7 Å까지 회절되었고, 비대칭 단위 내에 셀 상수 a=61.9, b=70.7, c=185.9 및 1개의 Fab 076D-M007-H04:FXIa C500S 복합체를 갖는 사방정계 공간군 P2(1)22(1)을 보유한다.

구조 결정 및 정밀화.

다른 단계에서 분자 대체에 의해 FXIa 및 모노클로날 항체 Fab 076D-M007-H04의 복합체-구조를 분해하였다. 먼저, 탐색 모델로서 pdb 코드 3GJE를 갖는 발베스(BALBES) (F.Long, A.Vagin, P.Young and G.N.Murshudov (2008) Acta Cryst. D64, 125-132)를 사용하여 H-쇄를 위치시켰다. 이어서, 탐색 모델로서 내부 FXIa 결정 구조를 갖는 프로그램 MolRep를 사용하여 FXIa C500S를 추가하였다. REFMAC5.5 (G.N. Murshudov et al. (1997) Acta Cryst. D53, 240-255)에 의한 초기 정밀화는 R1 = 39.4% 및 R유리 = 44.1%인 것으로 나타났다. 마지막으로, H-쇄를 탐색 모델로서 pdb 엔트리 3IDX의 L-쇄를 사용하여 위치시키고, 처음에 정밀화한 H-쇄 및 FXIa C500S 솔루션의 좌표를 고정시켰다. COOT (P. Emsley et al. (2010) Acta Cryst. D66:486-501)에 의한 반복적 모델 구축 라운드 및 REFMAC5.5를 사용한 최대 가능도 정밀화로 모델을 완성시켰다. 데이터 세트 및 정밀화 통계는 표 10에 요약되어 있다.

<표 10> Fab 076D-M007-H04:FXIa 복합체에 대한 데이터 세트 및 정밀화 통계

실시예 8: X선 구조-기반 에피토프 맵핑.

Fab 076D-M007-H04 및 FXIa C500S의 복합체 (도 17)는 비대칭 단위당 1개의 복합체 카피로 결정화되었다. FXIa C500S (에피토프)와 접한 Fab 076D-M007-H04의 잔기 (파라토프)를 결정하였고, 표 Xa 및 Xb에 열거되어 있다. 매립된 표면은 CCP4 프로그램 AREAIMOL (P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38), 및 각각 결합된 상태 및 결합되지 않은 상태의 Fab 076D-M007-H04 (표 11a) 및 FXIa C500S (표 11b)에서 계산된 전체 면적 차이를 보여주는 잔기로 분석하였다.

<표 11a> Fab 076D-M007-H04와 접한 FXIa의 잔기

에피토프:

<표 11b> FXIa와 접한 Fab 076D-M007-H04의 잔기

파라토프:

요약하면, FXIa C500S 에피토프는 하기 잔기에 의해 형성된다:

HIS A 406, PRO A 410, THR A 411, GLN A 412, ARG A 413, HIS A 414, ASN A 450, GLN A 451, SER A 452, ILE A 454, LYS A 455, ARG A 522, LYS A 523, LEU A 524, ARG A 525, ASP A 526, LYS A 527, ILE A 528, GLN A 529, ASN A 530, THR A 531

Fab 076D-M007-H04는 알로스테릭 경쟁적 억제제로서의 역할을 한다. 이는 FXIa의 활성 부위를 직접 차단하지는 않지만, 그에 인접해서 결합한다. 이러한 인접 결합은 FXIa의 활성 부위의 일부를 재배열시켜 활성화된 FXIa에 결합하는 천연 기질을 방해한다 (도 18).

대조적으로, Fab 076D-M007-H04는 지모겐 FXI에 결합하지 않는다. 보고되어 있는 지모겐 FXI (pdb 엔트리 2F83)의 X선 구조에서 활성 부위 뿐만 아니라 Fab 076D-M007-H04에 대한 에피토프를 구축하는 다양한 루프는 적절하게 정렬되지 않는다. 특히 에피토프 영역은 Fab 076D-M007-H04:FXIa C500S 복합체 내에서 잘 구조화된다.

실시예 9: 수소/중수소-교환 질량 분광측정법-기반 에피토프 맵핑.

위탁 연구 기관 ExSAR [ExSAR 코포레이션; 미국 08852 뉴저지주 몬머스 정션 11 디어 파크 드라이브 스위트 103]에 의해 상이한 에피토프 맵핑 분석을 수행하였다. 이 경우에, FXIa C500S (아미노산 388 - 625; 프로테로스 바이오스트럭쳐스에서 구입)와 정제된 Fab 076D-M007-H04 및 076D-M049-O15 각각의 상호작용을 시차 수소/중수소 교환 질량 분광측정 방법에 의해 분석하였다 [검토를 위해 문헌 (Percy AJ, Rey M, Burns KM, Schriemer DC. (2012) Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry-a review. Anal Chim Acta. 721:7-21) 참조]. 이에 따라, 10%를 초과하는 중수소화 수준에서의 차이는 상응하는 항원의 Fab에 의한 강력한 보호를 나타낸다. 5 및 10% 사이의 값은 약한 결합을 나타내며, 5% 미만의 중수소화 수준의 차이는 전혀 보호가 없음을 나타낸다.

표 12a 및 표 12b는 FXIa와 접한 Fab 076D-M007-H04 및 Fab 076D-M049-O15의 잔기를 각각 요약하고 있다.

<표 12a> FXIa와 접한 Fab 076D-M007-H04의 잔기

<표 12b> FXIa와 접한 Fab 076D-M049-O15의 잔기

이들 데이터는 FXIa 내의 200개의 아미노산의 에피토프 (FXIa C500S의 아미노산 408 - 609)를 커버하는 것이 FXIa 단백질분해적 활성의 억제로 이어진다는 것을 분명하게 보여준다.

실시예 10: 본 발명의 항체에 의한 FXIa의 기능적 중화

인간 FXIa (헤마톨로직 테크놀로지스, 인크.(Haematologic Technologies, Inc.), 카탈로그 번호 HCXIA-0160) 활성을 특이적인, 형광원-표지된 기질 (I-1575, 바켐(Bachem), 최종 농도 25 μM)의 절단을 측정하는 것에 의해 결정하고, 스펙트라플루오르플러스 리더(SpectraFluorplus Reader) (테칸)를 사용하여 360/465 nm에서 계속적으로 형광을 모니터링한다. 억제 활성을 시험하기 위해, 항체를 50mM 트리스/HCl, 100mM NaCl, 5mM CaCl2 및 0.1% BSA를 함유하는 완충제 중의 최종 농도 10 nM의 FXIa와 37℃에서 60분 동안 사전-인큐베이션한다. 이러한 인큐베이션 단계 이후에, 기질 I-1575를 첨가하고, 반응으로부터의 신호를 측정한다. 도 1, 도 2, 도 3 및 도 4에 제시된 바와 같이 그래프패드프리즘(GraphPadPrism) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제공하고, n= 4이다. 일부 실험의 경우에는, 전장 인간 FXIa (헤마톨로직 테크놀로지스, 인크, 카탈로그 번호 HCXIA-0160) 대신 단리된 FXIa C500S의 촉매 도메인 (아미노산 388 - 625; 프로테로스 바이오스트럭쳐스에서 구입)을 사용한다. 모든 다른 조건은 상기 기재된 바와 같다.

실시예 11: 본 발명의 항체에 의한, FXI의 그의 활성 형태 FXIa로의 전환의 기능적 중화.

FXIIa 또는 트롬빈 (트롬빈은 IIa임)에 의한 FXI (헤마톨로직 테크놀로지스, 인크. 카탈로그 번호 HCXIA-0150)의 그의 활성 형태 FXIa로의 전환의 억제를 시험하기 위해, 10 nM의 인간 FXI을 50mM 트리스/HCl, 100mM NaCl, 5mM CaCl2 및 0.1% BSA 중에서 상이한 농도의 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 다음 단계에서, 10 nM 최종 농도의 인간 FXIIa (엔자임 리서치(Enzyme Research), 카탈로그 번호 HFXIIa 1212a) 또는 1 단위/mg의 최종 농도의 트롬빈 (엔자임 리서치, 카탈로그 번호 HT 1002a)을 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 최종 농도 200 nM의 콘 트립신 억제제(Corn Trypsin Inhibitor) (엔자임 리서치, CTI) 및 형광원-표지된 기질 (I-1575, 바켐, 최종 농도 25 μM)을 첨가한다. 스펙트라플루오르플러스 리더 (테칸)를 사용하여 360/465 nm에서 계속적으로 형광을 모니터링한다. FXI의 FXIIa 매개된 전환에 대해서는 도 5 및 도 7에 제시된 바와 같이, FXI의 그의 활성화 형태 FXIa로의 트롬빈 유발된 전환에 대해서는 도 6 및 도 8에 제시된 바와 같이, 그래프패드프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제공하고, n= 4이다.

실시예 12: 영장류의 실험적 혈전증 생체내 모델에서의 항-FXIa 항체 076D-M007-H04의 항혈전 활성의 평가.

실험 절차

체중 9 - 11 kg의 비-항응고처리된 깨어있는 소아 개코원숭이에서 실험을 수행하였다. 이들 동물은 다른 문헌에 기재된 바와 같이 (Hanson et al. (1993) Journal of Clinical Investigation 92:2003-2012) 대퇴 동맥과 정맥 사이에 위치한 동맥-정맥 (AV) 단락이 만성적으로 노출된 상태이다. 기준선 단락 혈류는 모든 연구 동물에서 250 ml/분을 초과하였다. 불안은 저용량의 케타민 (< 2mg/kg/시간)으로 관리하였다. 전혈 세포수를 매일, 실험 전후에 측정하였다. 혈액 손실은 임의의 실험일에 계산된 총 혈액량의 4%를 초과하지 않았다.

기존에 기재된 바와 같이 (Hanson et al. [1993] J. Clin. Invest. 92:2003-2012) 보철 혈관 그라프트 (ePTFE, WL 고어 & 캄파니(WL Gore & Co.), 애리조나주 플래그스태프)의 혈전형성 절편을 개재시켜 개코원숭이 AV 단락 내에 혈전 형성이 개시되게 하였다. 혈소판-의존적인 혈전 형성이 지속적으로 일어나도록, 임상 그라프트 절편을 고정된 콜라켄으로 코팅하였다. 내부 직경 (i.d.)이 2 또는 4 mm인 20mm 길이의 그라프트를 말 유형 I 콜라겐 (1 mg/ml; 니코메드 아르첸미텔(Nycomed Arzenmittel), 독일 뮌헨)으로 15분 동안 충전시킨 다음, 멸균 기류하에 밤새 건조시켰다. 이러한 방법으로 그라프트 내강 내에 주사 전자 현미경에 의해 결정된 바와 같은 균일한 콜라겐 코팅이 생성되었다. 또한, 일부 실험에서는, 각각 평균 정맥 및 동맥 전단 속도를 이루기 위해 9mm i.d.의 20mm 길이의 챔버에 이어 4mm i.d.를 갖는 20mm 길이의 그라프트를 연결시켰다. 이어서 혈전형성 콜라겐-코팅된 그라프트를 실리콘 고무 튜브 절편 사이에 포함시키고, AV 단락으로 배치하였다. 그라프트를 혈액에 최대 60분 동안 노출시켰다. 각 실험 동안에, 근위 실리콘 고무 단락 절편을 클램핑하여 그라프트를 통과하는 혈류 속도를 100 ml/분으로 제한함으로써, 2 mm 그라프트 내에의 초기 평균 벽 전단률 (MWSR)은 2120/초였지만 4 mm 그라프트 내의 MWSR이 265/초가 되게 하였다. 초음파 유량계 (트랜소닉스 시스템즈(Transonics Systems), 뉴욕주 이타카)를 사용하여 유속을 계속적으로 모니터링하였다. 혈전형성 그라프트 절편이 60분에 제거될 때까지 4 mm 그라프트는 폐쇄되지 않았고, 펄스형 유량은 100 ml/분으로 유지되었다. 기준선 혈류는 각 실험 이후에 영구적인 단락을 통해 회복되었다. 2 mm 직경 그라프트에서, 혈류 속도는 혈전 형성으로 인해 점진적으로 감소되었다. 유량이 100 ml/분에서 폐쇄가 임박함을 암시하는 20 ml/분 아래로 떨어졌을 때 그라프트를 AV 단락에서 제거하였다. 혈류의 개시에서 그라프트 제거 (<20 ml/분 혈류)까지의 시간을 폐쇄 시간으로 제공하였다.

혈소판 침착의 영상화를 위해, 자가 개코원숭이 혈소판을 기존에 기재된 바와 같이 (Hanson et al. [1993] J. Clin. Invest. 92:2003-2012) 1 mCi의 111In-옥신으로 표지하였다. 연구를 수행하기 전 적어도 1시간 동안, 표지된 혈소판을 주입하여 순환하게 하였다. 혈전형성 그라프트 및 실리콘 챔버에서의 표지된 혈소판의 축적을 감마 섬광 카메라를 사용하여 5-분 간격으로 측정하였다. 상동성의 125I-표지된 개코원숭이 피브리노겐 (4 μCi, >90% 응고성)을 각 연구 10분 전에 주입하고, 111In이 붕괴되도록 >30일이 지나서 감마 계수기를 사용하여 혈전 내의 표지된 피브린의 혼입을 평가하였다. 침착된 방사능 (cpm)을 본래 연구 시점에 취득한 샘플의 응고성 피브린(오겐) 방사능으로 나누었다 (cpm/mg).

높은 초기 벽 전단율 (100 ml/분 클램핑된 혈류에서 2120/초)을 야기하는 20 mm 길이, 2 mm i.d.의 콜라겐-코팅된 장치를 사용하여 폐쇄 연구를 수행하였다. 2 mm 혈전형성 그라프트에 대한 표지된 혈소판의 축적을 감마 섬광 카메라를 사용하여 3-분 간격으로 측정하였다. 유량은 가능한 한 오래 근위 클램핑에 의해 100 ml/분으로 유지시켰고, 이어서 이는 증식되는 혈전이 장치를 폐쇄하기 시작함에 따라 감소되게 되었다. 완전히 폐쇄된 혈전 및 장치를 통과하는 혈류의 부족은 단락의 폐쇄 및 동물에서의 유의한 혈액 손실로 이어질 수 있기 때문에 폐쇄에 대한 한계로서 20 ml/분의 최종 혈류 속도를 사용하였다.

혈액 샘플 분석. 혈액 세포수는 마이크로-60 자동화 세포 계수기 (호리바-ABX 다이아그노스틱스(Horiba-ABX Diagnostics))를 사용하여 결정하였다. 혈액 샘플을 0.32% 시트르산나트륨의 최종 농도로 수집하였다. 모든 샘플을 12,900 g에서 5분 동안 원심분리하고, 혈장을 수집하여 -80℃에서 저장하였다. 교차-반응 ELISA 검정을 사용하여 트롬빈-항트롬빈 복합체 (TAT, 엔지그노스트-TAT(Enzygnost-TAT), 다데-베링(Dade-Behring); LOD: 2 ng/mL)를 결정하였다. 이들 연구에 사용된 모든 ELISA 시험 키트는 기존에 개코원숭이 마커에 대해 감수성을 나타내었다.

중단 연구에서 (4mm i.d. 콜라겐-코팅된 그라프트 단독), 076D-M007-H04가 급성 혈전 증식을 중단시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해 이 항체를 연구에 볼루스로서 30분 동안 투여하였다 (0.5mg/kg, 10초에 걸쳐 i.v. 볼루스). 폐쇄 연구에서 (2mm i.d. 콜라겐-코팅된 그라프트 단독), 076D-M007-H04를 실험 3시간 전에 볼루스로서 투여하였다 (0.5mg/kg 용량, i.v.에 이어 24시간 후 0.5mg/kg 또는 2mg/kg). 방지 연구에서 (4mm i.d. 콜라겐-코팅된 그라프트에 이어, 9mm i.d. 실리콘 챔버), 076-M007-H04를 실험 1시간 전에 볼루스로서 투여하였다 (0.5mg/kg 용량, i.v.에 이어 24시간 후 0.5mg/kg 또는 2mg/kg).

지혈 평가. 개코원숭이에서 일차 지혈에 대한 FXIa 억제의 효과는 표준 템플릿 피부 출혈 시간 시험 (서지컷(Surgicutt)®, 인터내셔널 테크니딘 코포레이션(International Technidyne Corp))을 사용하여 평가하였다. 실험상, 본 시험 및 유사한 시험 (예를 들어, 심플레이트(Simplate) 출혈 시간)은 인간 및 비-인간 영장류에서 치료적 항응고제, 항혈소판제, 및 응고 이상의 효과에 민감한 것으로 나타났다 (Gruber et al. [2007] Blood 109:3733-3740; Smith et al. [1985] Am. J. Clin. Pathol. 83:211-215; Payne et al. [2002] J. Vasc. Surg. 35:1204-1209). 모든 출혈 시간 측정은 동일한 전문 기술자에 의해 수행되었다. 지혈의 간접 평가를 위해, 실험 전, 실험 동안 및 실험 후 다양한 시점에서 aPTT (활성화 부분 트롬보플라스틴 시간; SynthASil, HemosIL; 인스트루멘테이션 래보러토리 캄파니, 매사추세츠주 베드포드) 및 ACT (활성화된 응고 시간, LupoTek KCT; r2 다이아그노스틱스(r2 Diagnostics), 인디아나주 사우스벤드) 측정을 또한 수행하였다.

시험관내 aPTT. 다양한 농도의 076D-M007-H04를 aPTT 검정 개시 전 10분 동안 혈장 중에서 인큐베이션하였다. 도 20에 제시된 바와 같이, aPTT 응고 시간은 "사전" 시점, 즉 임의의 처리를 투여하기 이전에 개코원숭이로부터 수집한 혈장 샘플에서 결정하였다. 결과는 076D-M007-H04가 혈전증 연구에 사용된 모든 6마리의 실험 개코원숭이로부터의 혈장에서 항응고제인 것으로 밝혀졌다.

생체내 응고 연구. 3마리의 개코원숭이를 이들 연구에 사용하였다: 2마리의 개코원숭이에는 32m/kg 씹어먹는 아스피린을 제공한 후 076D-M007-H04 (2.5mg/kg H04, i.v. 볼루스)를 투여하고, 1마리의 개코원숭이에는 0.5mg/kg 076D-M007-H04 (i.v. 볼루스)를 투여한 다음 24시간 후에 2mg/kg 용량을 투여하였다 (i.v. 볼루스). ACT (도 21 및 도 22) 및 aPTT (도 23 및 도 24)를 투여 후 다양한 시점에 측정하였다.

단락 실험 동안의 혈소판 침착

혈전증 폐쇄 실험. 076D-M007-H04 처리가 소혈관의 폐쇄를 방지할 수 있는지 또는 폐쇄까지의 시간을 연장시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해 사용된 혈전형성 장치는 2mm i.d., 20mm 길이의 콜라겐-코팅된 그라프트로 이루어졌다.

도 25에 제시된 바와 같이, 혈소판 침착은 60분 동안, 또는 적용가능한 경우에는 그라프트 폐쇄시까지 나타난다. 12/14 대조군 장치는 60분 이내에 폐쇄되었고, 2/5 076D-M007-H04 (0.5mg/kg) 및 2/5 076D-M007-H04 (0.5mg/kg + 2mg/kg) 장치는 폐쇄되었다. 데이터는 평균 ± SEM이다.

혈전증 방지 실험. 혈전 개시 및 증식에 대한 076D-M007-H04의 효과를 평가하기 위해 사용된 혈전형성 장치는 4mm i.d., 20mm 길이의 콜라겐-코팅된 ePTFE 그라프트에 9mm i.d., 20mm 길이의 실리콘 고무 챔버가 이어진 것으로 이루어졌다. 도 26에 제시된 바와 같은 혈소판 침착의 기울기는 항혈소판 활성의 표시이다. 076D-M007-H04의 용량은 둘 다 (0.5mg/kg 및 0.5mg/kg에 이어 24시간 후 2mg/kg) 혈전 형성 개시로부터 다양한 시점에서 혈소판 침착 속도의 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 효능을 나타내었다. 데이터는 실험들 간의 혈소판 수 변동을 고려하여 정규화시켰다. 데이터는 평균 ± SEM이다.

도 27에 제시된 바와 같이, 076D-M007-H04의 용량은 둘 다 (0.5mg/kg 및 0.5mg/kg에 이어 24시간 후 2mg/kg) 혈전 형성 개시로부터 다양한 시점에서 실리콘 챔버 내의 혈소판 침착 속도의 급격한 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 효능을 나타내었다. 데이터는 평균 + SEM이다.

트롬빈 항트롬빈 복합체. FXI의 억제가 트롬빈-매개된 혈소판 활성화 및 피브린 형성을 제한함으로써 및/또는 혈전용해를 증가시킴으로써 둘 다에 의해 생체내 혈전 형성을 감소시킬 수 있기 때문에, 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트를 사용하여 트롬빈 항트롬빈 (TAT)의 수준을 측정하였다. 도 28에 제시된 바와 같이, 076D-M007-H04 (0.5mg/kg 및 0.5mg/kg에 이어 24시간 후 2mg/kg)를 사용한 개코원숭이의 전처리는 TAT 수준의 증가를 방지하였으며, 이는 FXIa 활성 부재하에 트롬빈 생성이 급격하게 감소됨을 의미한다.

출혈 시간. FDA에 의해 소아와 성인에서 사용하는 것이 승인된 성인용 서지컷 장치 (http://www.itcmed/com/products/surgicutt-bleeding-time-device)를 사용하여 일차 지혈을 평가하였다. 출혈 시간 (BT)을 수동으로 기록하였다. 30분 동안 재출혈에 대해 상처를 관찰하고, 다음날 멍, 점상출혈, 혈종 및 광범피하출혈에 대해 피부를 평가하였다. 이들 지혈 평가 중 1종 이상은 실질적으로 모든 시판 항혈전제 (항혈소판 약물, 항응고제, 혈전용해제)의 항지혈 효과에 민감하며 예측가능한 것으로 밝혀져 있다.

개코원숭이에게 076D-M007-H04 (0.5mg/kg 및 24시간 후 2mg/kg)를 단독으로 투여하거나, 또는 씹어먹는 아스피린 (ASA, 32mg/kg)을 제공한 후에 투여하였다. 도 29에 제시된 바와 같이, 기준선과 비교하여 076D-M007-H04 처리 중 어떤 것도 출혈 시간을 증가시키지 않았다. 아스피린-처리된 동물에의 076D-M007-H04의 투여는 아스피린을 단독 처리한 것과 비교하여 출혈 시간을 더 증가시키지 않는 것으로 보였다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer Pharma Aktiengesellschaft <120> Antibodies capable of binding to the coagulation Factor XI and/or its activated form factor XIa and uses thereof <130> BHC121014 <160> 184 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc aggcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttatgat gcgagcaacc tggaaaccgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccttta ccattagcag cctgcagccg 240 gaagatattg cgacctatta ttgccagcag gcgaacagct ttccggtgac ctttggcggc 300 ggcaccaaag tggaaattaa a 321 <210> 2 <211> 360 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 2 gaagtgcagc tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc cagtatggca tggattgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcggc attggcccga gcggcggcag caccgtgtat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240 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Homo Sapiens <400> 179 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Val Pro Ser Gly Gly Trp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Trp Gly Asp Ser Trp Gly Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 180 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 180 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu 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40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asn Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 183 <211> 118 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 183 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Val Pro Ser Gly Gly Trp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Trp Gly Asp Ser Trp Gly Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 184 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 184 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Ile 85 90 95 Ala Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (14)

1. 지혈을 손상시키지 않으면서 혈소판 응집을 억제하고 이에 의해 혈전증을 억제하는 것을 특징으로 하는, 응고 인자 XI 및/또는 그의 활성화 형태 인자 XIa에 결합할 수 있는 인간 모노클로날 항체.
2. 제1항에 있어서, 인간 FXIa를 억제하는, 표 9에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열 중 적어도 1개를 포함하는 인간 항-FXIa.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 FXIa를 억제하는, 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 서열 19 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 서열 20을 포함하는 인간 항-FXIa.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 FXIa를 억제하는, 표 9에 제시된 바와 같은 적어도 1개의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 인간 항-FXIa.
5. 제4항에 있어서, CDRH1로서 서열 21, CDRH2로서 서열 22 및 CDRH3으로서 서열 23, 및 CDRL1로서 서열 24, CDRL2로서 서열 25 및 CDRL3으로서 서열 26을 포함하는 인간 항-FXIa.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 서열 29 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 서열 30을 포함하는 인간 항-FXI 항체.
7. 제6항에 있어서, CDRH1로서 서열 31, CDRH2로서 서열 32 및 CDRH3으로서 서열 33, 및 CDRL1로서 서열 34, CDRL2로서 서열 35 및 CDRL3으로서 서열을 포함하는 인간 항-FXI 항체.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가변 경쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 서열 27 및 가변 중쇄 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 서열 28을 포함하는 인간 항-FXI 항체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 중 하나와 경쟁하는 인간 항체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 제약 조성물.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 의약.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 중 하나 이상을 코딩하는 핵산.
13. 제12항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
14. 제13항의 벡터를 포함하는 숙주.
    

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