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KR20150004906A - 항-코넥신 화합물 및 그의 용도 - Google Patents

항-코넥신 화합물 및 그의 용도 Download PDF

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KR20150004906A
KR20150004906A KR1020147033485A KR20147033485A KR20150004906A KR 20150004906 A KR20150004906 A KR 20150004906A KR 1020147033485 A KR1020147033485 A KR 1020147033485A KR 20147033485 A KR20147033485 A KR 20147033485A KR 20150004906 A KR20150004906 A KR 20150004906A
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KR
South Korea
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connexin
peptide
antisense
compounds
seq
Prior art date
Application number
KR1020147033485A
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English (en)
Inventor
콜린 알. 그린
데이비드 엘. 벡커
Original Assignee
코다 테라퓨틱스 (엔지) 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은, 예를 들어, 상처 및 다른 지표를 위한 심혈관, 혈관, 신경학적 치료에 사용하기 위한 것을 포함하는, 코넥신의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 화합물 및 방법은 직접적인 세포-세포 신호전달에서의 국부화된 혼란 또는 헤미채널 개방의 저해를 목적으로 하는 질환 및 장애에 연관된 역효과의 심각도를 감소시키는 데 치료적으로 사용될 수 있다.

Description

항-코넥신 화합물 및 그의 용도 {ANTI-CONNEXIN COMPOUNDS AND USES THEREOF}
<관련 출원의 교차 참조>
본 출원은 콜린 알. 그린(Colin R. Green) 및 데이비드 엘. 베커(David L. Becker)에 의해 2005년 2월 3일자로 출원된, 제목 "항-코넥신 화합물 및 사용 방법"의 가출원 U.S.S.N. 60/650,075호로부터 우선권을 청구하며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시는, 예를 들어, 심혈관성, 신경학적 및 혈관성 질환, 장애 및 상태에 제한되지 않지만 이를 포함하는 다양한 질환, 장애 및 상태의 예방 및 치료에 유용한, 갭-정션(gap-junction) 및 헤미채널(hemichannel) 조절을 위한 작용제, 화합물, 조성물, 제제를 포함한 제약, 및 방법에 관한 것이다.
하기에는 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보가 포함된다. 본원에서 제공되는 임의의 정보는 현재 기재되거나 청구된 발명에 대한 종래 기술, 또는 이에 관련되거나 또는 구체적 또는 함축적으로 참조된 임의의 개시물 또는 문헌이 종래 기술인 것으로 인정되지 않는다.
관상동맥 심장 질환은 대부분의 서구 국가에서 사망 원인을 야기한다. 심혈관 질환에 대한 사망율은 캐나다에서 100,000명 당 29명 (남성, 여성 24) 내지 러시아에서 213명 (남성, 여성 154)으로 다양한 것으로 보고된 바 있다. 다른 서구 국가에 대해서, 사망율은 31 - 55 (43 - 26)이다. 졸중에 기인할 수 있는 사망의 대략 절반이 의학적 합병증의 결과, 예컨대 폐렴 및 패혈증이고, 절반이 신경학적 합병증, 예컨대 새로운 대뇌 경색증 및 대뇌 부종에 기인할 수 있다. 문헌 [Brott, T. and Bogousslavsky, J., New Engl J. Med. 343: 710 - 722 (2000)].
졸중은 개도국에서의 제3 사망 유도 원인이고, 공중보건에서 압도적인 영향력을 갖는다. 약 700,000건의 새로운 졸중 사안이 매년 미국에서 발생한다 (미국 졸중 협회). 졸중 환자 중 약 25％는 졸중 또는 이에 따른 합병증의 결과로서 사망한다. 추가적으로, 거의 50％의 졸중 희생자는 중등증 내지 중증의 건강 손상 및 장기 장애를 갖는다. 허혈성 졸중의 발병률이 과거 20년에 걸쳐 감소하고 있기는 하지만, 인구의 평균 연령이 높아지면서, 이에 따라, 졸중의 절대수가 계속해서 증가하고 있다. 최근 예측에서는 2050년 경까지는, 미국에서 1 백만 이상의 졸중이 매해 발생할 것이라고 나타났다. 졸중은 일반적으로 뇌로의 혈액 유입을 감소시키는 몇몇 잠재적인 상태의 결과이고, 장애 또는 사망을 발생시킨다. 대략 85％의 졸중은 본질적으로 허혈성이다 (혈관의 혈병 또는 차단물). 문헌 [Foulkes MR, et al, Stroke; 19:547-54 (1988)]. 허혈성 졸중은 뇌의 동맥 내부에 형성된 혈병에 의해 (혈전성 졸중), 또는 신체 어딘가에서 형성되어 뇌로 이동하는 혈병에 의해 (색전성 졸중) 발병될 수 있으며, 혈전성 졸중은 전체 허혈성 졸중의 약 52％를 나타낸다. 혈전성 졸중은 일반적으로 아테롬성동맥경화증의 결과이다 (여기서, 혈관은 지방 침착물, 칼슘, 및 혈병화 인자, 예컨대 피브리노겐 및 콜레스테롤의 축적으로 막힘).
염증은 다요인성 과정이고, 막대한 축적 건강 결론을 갖는 다수의 질환, 장애 및 상태에서 명백하다. 류마티스 관절염, 루푸스, 건선, 다발성 경화증 및 천식을 비롯한 염증성 질환은 세계적으로 사망률 및 이환률의 주요 원인으로 남아 있다. 자가면역 질환은 또한 염증과 연관되어 있고, 오름세의 경향으로 미국에서 5 천만명 이상의 인구에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. 다수의 자가면역 질환에서, 세포, 조직, 관절 및 기관 손상은 염증성 경로의 광대한 어레이의 제어되지 않는 활성화로부터 생성된다. 류마티스 관절염 (RA)은 관절의 염증, 부종 유도, 동통 및 기능 손실을 특징으로 하는 이러한 만성 염증성 질환 중 하나이다. RA는 미국에서 대략 2백 5십만명 이상에 영향을 미치고, 초기 감염 또는 손상, 비정상 면역 반응, 및 유전 인자를 비롯한 사건 조합에 의해 야기된다. 80종 이상의 상이한 자가면역 질환 중 임의의 하나는 면역계가 조절되지 않고 건강한 조직을 공격하는 경우에 발생할 수 있다.
갭-정션 단밸질로서도 공지된 코넥신은 세포질성 C 및 N 말단을 갖는 4-관통 막횡단 단백질이다. 6개의 코넥신이 함께 합쳐져 "코넥손(connexon)"이라고 불리는 헤미채널을 형성한다
갭 정션은 직접적인 세포-대-세포 신호전달을 제공하는 구조이다. 이러한 갭 정션은 2개의 연결 코넥손으로 구성되고, 하나는 기능성 갭 정션을 도킹(docking) 형성함에 따라 접경한 세포 각각에 의해 기여된다.
이들이 리보솜에 의해 번역됨에 따라, 코넥신은 소포체의 막 내로 삽입된다. 문헌 [Bennett MV, Zukin RS. Electrical coupling and neuronal synchronization in the Mammalian Brain. Neuron. 2004 Feb 19;41(4):495-511]. 여기서 이들은 함께 헤미채널 (코넥손)을 형성하고, 이는 액포에 있는 세포막에 운반되어, 이들이 다른 세포로부터의 헤미채널을 만날 때까지 세포막을 통해 확산되며, 이들은 도킹되어 채널을 형성할 수 있다. Id. 코넥신 상의 분자는 코넥신이 이들의 헤미채널에 있는 다른 코낵신 및 다른 세포의 헤미채널에 있는 다른 코넥신을 "인식"하도록 하고, 상기 채널을 정확하게 정렬 및 형성한다. 문헌 [Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM. Principles of Neural Science, 4th ed., pp.178-180. McGraw-Hill, New York (2000)].
코넥신 단백질은 일반적인 막횡단 형상을 가지며, 4개의 알파-헬릭스 막횡단 도메인, 2개의 세포외 루프, 세포질성 루프, 및 세포질성 N- 및 C-말단 도메인을 갖는다. 서열은 막횡단 및 세포외 도메인에서 가장 보존되어 있고, 코넥신 간의 다수의 주요 기능 차이는 이러한 매우 보존된 도메인에 있는 아미노산 차이에 의해 결정된다. 각각의 세포외 루프는 채널 기능을 위해 요구되는 불변의 이격 (하나의 이소형을 줄임)을 갖는 3개의 시스테인을 함유한다. 정션 채널은 2개의 말단-대-말단 헤미채널로 구성되며, 이들 각각은 코넥신 서브유닛의 헥사머이다. 정션 채널에서, 세포외 루프에 있는 시스테인은 단량체간 또는 헤미채널간 결합이 아닌 2개의 루프 사이에 단량체내 황-황 결합을 형성한다. 헤미채널 사이의 말단-대-말단 동일분자의 결합은 비공유 상호작용을 통한 것이다. 돌연변이유발 연구는 도킹 영역이 베타 구조를 함유하고, 포린(porin) 채널의 베타-바렐(beta-barrel) 구조의 일부 정도와 유사할 수 있다고 제안한다. 정션 채널을 구성하는 2개의 해미채널을 서로 대략 30 도씩 회전적으로 진동시켜, 각각의 코넥신 단량체의 알파-헬릭스를 나란히 놓인 헤미채널 중 2개의 인접한 단량체의 알파-헬릭스와 함께 축방향으로 정렬시킨다.
막 내에 있는 각각의 코넥손 또는 헤미채널은 정상 조건하에 이것이 이웃 세포의 코넥손과 도킹할 때까지 닫여있다. 그러나, 발명자들은 헤미채널을 발현하는 세포가 스트레스(예를 들어, 물리학적, 기계학적 스트레스 등)를 받을 때, 헤미채널은 이들이 도킹되지 않더라도 개방될 수 있는 것으로 여겨졌다. 세포외 헤미채널 신호전달의 억제는, 세포외 또는 막간 공간으로 및 이로부터, 개방된 헤미채널을 통한 소분자 흐름의 억제도 포함한다. 임의의 메카니즘에 한정되거나 국한되기를 원하지 않지만, 활동 모드는 헤미채널의 (부분 또는 완전) 차단, 코넥손의 내재화 촉발 (이어서 막으로부터 제거됨), 코넥신 폐쇄를 초래하는 코넥신 단백질의 형상 변화 유도, 및 채널 개방을 촉발하는 것을 포함하는 부위 (칼슘 결합 부위)의 차단 또는 이러한 부위로의 결합을 포함한다.
코넥신 및 그의 용도에 대한 안티센스 (AS) 뉴클레오티드는 기재된 바 있다. WO 00/44409호 (Becker et al, filed January 27, 2000, "Formulations Comprising Antisense Nucleotides to Connexins") 참조.
<발명의 요약>
본원에 기재되고 청구된 본 발명은 이 발명의 요약에서 언급되거나 기재되거나 참조되는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 속성 및 실시양태를 갖는다. 본원에 기재되고 청구된 본 발명은 본 발명의 요약에서 확인되는 특징 또는 실시양태에 또는 이들에 의해 제한되지 않고, 단지 설명 목적을 위해 포함될 뿐 제한하지 않는다.
본원에 기재되고 청구된 본 발명은 선택된 조직, 세포 및 환자 (예를 들어, 심혈관 상태, 염증성 상태, 신경학적 상태, 혈관 상태, 상처 및 다른 상태 및 장애, 및 이의 합병증에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 환자)에서 코넥신, 헤미채널 및 갭 정션의 조절을 위한, 폴리펩티드 (예를 들어, 모방체 펩티드 및 펩티디토모방체, 항체, 및 항체 단편 및 합성 구조물) 및 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 항-코넥신 화합물에 관한 것이다.
코넥신, 헤미채널 및 갭 정션의 조절이 유리한 다양한 질환, 상태 및 장애, 예를 들어 심혈관, 신경학적, 혈관 및 다른 상태 또는 장애 (상처 포함)의 치료에 유용한 항-코넥신 화합물 및 조성물이 제공된다. 또한, 이러한 화합물 및 조성물 뿐만 아니라, 예를 들어 제약 제제, 키트 및 의료 장치를 사용하는 방법이 제공된다.
한 측면에서는, 혈관 장애에 걸린 대상체를 치료하기 위한 화합물, 조성물 및 방법이 제공된다. 이러한 방법은 코넥신, 헤미채널 또는 갭 정션의 발현, 형성 또는 활성화를 억제할 수 있는, 본원에서 제공되는 것들을 비롯한 항-코넥신 화합물, 예를 들어, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 또는 항-코넥신 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또다른 측면에서, 염증성 장애에 걸린 대상체를 치료하기 위한 항-코넥신 화합물, 조성물 및 방법이 제공된다. 이러한 방법은 코넥신, 헤미채널 또는 갭 정션의 발현, 형성 또는 활성을 억제할 수 있는, 본원에 제공된 것들을 비롯한 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 다른 항-코넥신 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또다른 측면에서, 상처를 갖는 대상체를 치료하기 위한 항-코넥신 화합물, 조성물 및 방법이 제공된다. 이러한 방법은 코넥신, 헤미채널 또는 갭 정션의 발현, 형성, 활동 또는 활성을 억제할 수 있는, 본원에 제공되는 것들을 비롯한 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 다른 항-코넥신 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또다른 측면에서, 이식조직 또는 이식편 수술과 연관된 대상체를 치료하기 위한 항-코넥신 화합물, 조성물 및 방법이 제공된다. 이러한 방법은 코넥신, 헤미채널 또는 갭 정션의 발현, 형성, 활동 또는 활성을 억제할 수 있는, 본원에 제공되는 것들을 비롯한 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 다른 항-코넥신 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 또한 이식조직 및 이식편 수술과 연관된 조직 부종을 억제 및/또는 예방할 수 있다.
또다른 측면에서, 모방체 펩티드, 항체, 항체 단편 등을 비롯한 항-코넥신 결합 단백질은 코넥신 헤미채널에 결합하거나 코넥신 헤미채널의 발현, 형성, 활동 또는 활성을 조절할 수 있다. 결합 단백질은 갭 정션 및 헤미채널의 조절제로서 유용하다.
특정 비제한적인 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 코넥신의 막횡단 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함한 펩티드를 포함한다. 이러한 코넥신에는, 예를 들어, 코넥신 45, 43, 26, 30, 31.1 및 37이 포함된다. 인간 코넥신이 바람직한 종이다.
비제한적이지만 바람직한 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 코넥신 45의 막횡단 영역 일부에 상응하는 아미노산 서열을 포함한 펩티드를 포함한다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 예를 들어, 항-코넥신 화합물은 서열 62의 약 3 내지 약 30개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 서열 62의 약 5 내지 약 20개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 서열 62의 약 8 내지 약 15개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 서열 62의 약 11, 12 또는 13개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 다른 비제한적인 실시양태는 서열 62의 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 또는 30개 이상의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 항-코넥신 화합물을 포함한다. 본원에 제공된 특정 항-코넥신 화합물에서, 모방체 펩티드는 서열 62의 위치 46-75 및 199-228에서 아미노산에 상응하는 코넥신 45의 세포외 도메인을 근거로 한다. 따라서, 본원에 기재된 특정 펩티드는 서열 62의 위치 46-75 및 199-228에서의 영역에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 펩티드는 서열 62의 일부에 일치하는 아미노산 서열을 가질 필요는 없고, 보존 아미노산 변화는 펩티드가 본원에 기재된 검사법 및 당업계에 다르게 공지된 검사법에서 결합 활성 또는 기능성 활성을 유지하도록 만들어질 수 있다. 다른 실시양태에서, 모방체 펩티드는 세포외 도메인 이외의 코넥신 단백질 내의 펩티드 표적 영역을 기초로 한다 (예를 들어, 서열 62의 일부는 위치 46-75 및 199-228에 상응하지 않음).
또다른 비제한적이지만 바람직한 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 코넥신 43의 막횡단 영역의 일부에 상응하는 아미노산 서열을 포함한 펩티드를 포함한다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 서열 63의 약 3 내지 약 30개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 서열 63의 약 5 내지 약 20개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 서열 63의 약 8 내지 약 15개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 서열 63의 약 11, 12 또는 13개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 다른 비제한적인 실시양태는 서열 63의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 또는 30개 이상의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 항-코넥신 화합물을 포함한다. 다른 항-코넥신 화합물에서, 모방체 펩티드는 서열 63의 위치 37-76 및 178-208에서 아미노산에 상응하는 코넥신 43의 세포외 도메인을 기초로 한다. 따라서, 본원에 기재된 특정 펩티드는 서열 63의 위치 37-76 및 178-208에서 상기 영역에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 펩티드는 서열 63의 이러한 일부에 일치하는 아미노산 서열을 가질 필요는 없지만, 보존 아미노산 변화는 펩티드가 본원에 기재된 분석법 및 당업계에서 다르게 공지된 분석법에서 결합 활성 또는 기능성 활성을 유지하도록 만들어질 수 있다. 다른 실시양태에서, 모방체 펩티드는 세포외 도메인 이외의 코넥신 단백질 내에 있는 펩티드 표적 영역을 기초로 한다 (예를 들어, 서열 63의 일부는 위치 37-76 및 178-208에 상응하지 않음).
다른 특정 화합물, 이러한 화합물의 제조 방법 및 이들 활성의 측정 방법은 본원에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
다르게는, 특정 실시양태에서 제공되고 사용되는 것들을 비롯한 항-코넥신 화합물은 하나 이상의 안티센스 화합물을 포함한다. 적합한 안티센스 화합물은, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 데옥시리보자임, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, RNAi 분자, siRNA 분자, PNA 분자, DNA자임, 및 5'-말단-돌연변이된 U1 소핵 RNA, 및 이들의 동족체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 및 다른 화합물은 단독으로 또는 하나 이상의 모방체 또는 다른 결합 펩티드와 함께 사용될 수 있다.
안티센스 화합물 또는 모방체 펩티드와 같은 항-코넥신 화합물은, 예를 들어, 하나 이상의 코넥신 45, 43, 26, 37, 30 및/또는 31.1에 표적화될 수 있다. 특정 비제한적이지만 바람직한 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 모방체 펩티드는 코넥신 45 또는 코넥신 43을 표적으로 한다. 특정의 비제한적이지만 바람직한 실시양태에서, 항-코넥신 화합물, 예컨대 안티센스 화합물은 서열 12-31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화된다. 안티센스 화합물은, 예를 들어, 서열 12-31로부터 선택되는 핵염기 서열을 갖는 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 약 12개 이상의 핵염기에 표적화되는 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 특정의 다른 실시양태에서, 안티센스 화합물은 서열 1-11로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 안티센스 화합물은, 예를 들어, 길이가 약 15 내지 약 35개, 예를 들어 약 25 내지 30개 또는 약 30개의 핵염기인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
안티센스 화합물은, 예를 들어, 천연 발생 핵염기 및 비변형 뉴클레오시드 사이 연결 (예를 들어, 하나 이상의 변형 뉴클레오시드 사이 연결)을 포함한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형 뉴클레오시드 사이 연결은 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 다른 안티센스 화합물은, 예를 들어, 하나 이상의 변형 당 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 안티센스 화합물은, 예를 들어, 하나 이상의 변형 핵염기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-코넥신 화합물, 예컨대 안티센스 화합물 또는 모방체 펩티드는 조직 손상을 감소시키거나 치유를 촉진하는 데 유용한 제2 화합물과 함께 사용될 수 있다. 상기 제2 화합물은, 예를 들어, 성장 인자 또는 사이토킨(cytokine) 등 일 수 있다. 적합한 공동투여 화합물로는, 예를 들어, FGF, NGF, NT3, PDGF, TGF, VEGF, BDGF, EGF, KGF, 인테그린(integrin), 인터류킨(interleukin), 플라스민(plasmin) 및 세마포린(semaphorin)이 포함된다. 인간 요법에서, 상기 열거된 것과 같은 이러한 공동투여 화합물은 인간 또는 인간 기원의 것이다.
항-코넥신 화합물을 대상체에 투여하는 방법, 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포가 제공되며, 여기서 헤미채널 조절이 유리할 것이다.
항-코넥신 화합물을 대상체에 투여하는 방법, 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포가 제공된다. 따라서, 특정 비제한적인 실시양태에서는, 대상체는 하기: 심혈관 질환, 관상동맥 심장 질환, 심부전, 심근 경색증, 아테롬성동맥경화증, 허혈성 심장 질환, 심장정지 또는 다른 기관 운반 또는 저장 매질, 재관류 손상, 호흡기성 또는 대사성 산증, 폐 부종 (이산화질소와 같은 독성 기체에 대한 노출 포함), 내피 세포가 파괴되는 것에 의한 혈관 병리생리학 (예를 들어, 식이 유도성 고콜레스테롤혈증성 병변), 혈관 장애 (미세혈관 및 대혈관), 졸중, 뇌혈관 질환 (뇌허혈), 혈전증, 외상으로부터 생성된 혈관 손상 (예를 들어, 피하 상처, 스텐트 삽입, 재협착 또는 혈관형성술), 상승된 글루코스 수준으로부터 생성된 혈관 손상 (당뇨병), 사지의 혈관 질환, 기관 허혈, 시신경병증, 염증, 및 류마티스 관절염 (RA), 아-만성 또는 만성 염증, 간질 (간질성 사건 및 간질성 사건 후의 병변 전파), 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 및 문헌 [Harrison's, Principles of Internal Medicine 15th Edition (McGraw Hill, Inc., New York)](본원에 참고로 포함됨)에 더 상세히 기재된 특정의 다른 징조 중 하나 이상에 대해 헤미채널에 결합할 수 있거나 헤미채널을 조절할 수 있는 항-코넥신 화합물을 투여함으로써 치료된다.
특정의 다른 비제한적인 실시양태에서, 대상체는 하기, 예를 들어: (1) 예를 들어, 허혈 또는 외상 이후에 또는 이의 결과로서의 척수 부종의 예방 또는 치료; (2) 예를 들어, 허혈 또는 외상 (예를 들어, 뇌, 시신경, 척수 및 심장에서) 이후에 또는 이의 결과로서 조직에서의 혈관벽 퇴화의 예방 또는 치료; (3) 예를 들어, 부종 및/또는 염증은 전신성이거나, 또는 한 예로서 혈관 지고병은, 예를 들어, 지속성 염증의 결과로서 발생하는, 염증성 관절염 및 다른 염증성 장애의 예방 또는 치료; (4) 아-급성 또는 만성 상처, 예를 들어, 한 예로서, 혈관 지고병 예방이 윤부 허혈로부터의 회복을 허용하는 눈의 각막에 대한 상처의 예방 또는 치료; (5) 아-급성 또는 만성 상처, 예를 들어, 한 예로서, 재-상피화를 촉발하는 수단으로서 눈의 각막에 대한 상처의 예방 또는 치료; (6) 화상, 예를 들어, 한 예로서, 상피 회복을 촉발하고 아-급성 윤부 허혈로부터의 회복을 야기하는 순서로 눈에서의 화학 화상의 치료; (7) 예를 들어, 한 예로서, 계속된 혈관 지고병의 예방이 조직 허혈로부터의 회복을 허용할 당뇨병성 궤양을 비롯한 아-급성 또는 만성 피부 상처의 예방 또는 치료; (8) 한 예로서, 예를 들어 앞쪽 연부에서 코넥신 43의 계속적인 발현이 재-상피화를 예방하는, 예를 들어, 당뇨병성 궤양을 비롯한 만성 상처의 치료; (9) 예를 들어, 뇌실에 직접 또는 척수골 및/또는 척수를 통해 전달될 수 있는 코넥신 모방체 펩티드를 사용하는, 주산기 허혈의 예방 또는 치료; (10) 예를 들어, 뇌실에 직접 또는 척수골 및/또는 척수를 통해 전달될 수 있는 코넥신 모방체 펩티드를 사용하는, 주산기 허혈 후의 부종의 억제 또는 예방; (11) 예를 들어, 전신적으로 전달되는 코넥신 모방체 펩티드를 사용하는, 주산기 허혈의 치료; (12) 예를 들어, 전신적으로 및/또는 뇌실에 직접 또는 척수골 및/또는 척수를 통해 전달되는 코넥신 모방체 펩티드를 사용하는, 졸중 또는 CNS 허혈의 치료; (13) 허혈 후의 발작성 활성을 비롯한, 뇌에서의 발작성 활성 (예를 들어, 간질)의 예방; 및/또는 (14) 기관 이식 후 재관류를 갖는 부종 (및 거부), 병변 전파의 예방 중 하나 이상을 위해 헤미채널에 결합하거나 헤미채널을 다르게 조절할 수 있는 항-코넥신 화합물을 투여함으로써 치료된다. 상기 방법의 예방 및/또는 치료를 위해 코넥신 및 갭 정션을 결합하거나 조절할 수 있는 항-코넥신 화합물이 제공된다.
항-코넥신 화합물은 다양한 소정 시간에 투여될 수 있다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 코넥신 헤미채널의 활성, 활동, 발현 또는 형성은 내피 세포에서 억제된다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 코넥신 헤미채널 활성, 활동, 발현 또는 형은 상피 세포에서 억제된다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 대상체는 졸중을 포함한 혈관 장애에 대해 치료될 수 있다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 대상체는 허혈을 포함한 혈관 장애에 대해 치료될 수 있다. 이러한 허혈은, 예를 들어, 조직 허혈, 심근 허혈 또는 뇌허혈일 수 있다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 본원에서 치료되는 대상체에는 허혈에 의한 신경학적 기능 손실의 위험이 있다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 대상체는 허혈에 의해 일어날 수 있는 중추 또는 말초 신경계에서의 세포 사멸 또는 퇴행을 치료 또는 완화시키는 것을 포함하여, 혈관 장애 대해 치료될 수 있다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 대상체는 혈관 장애에 대해 치료될 수 있으며, 여기서 항-코넥신 화합물, 예를 들어, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 또는 다른 결합 펩티드는 대상체에 대해 수행되는 혈관 또는 관상동맥 시술과 함께 투여될 수 있다. 다른 비제한적인 실시양태에서, 항-코넥신 화합물, 예를 들어, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 또는 다른 결합 펩티드는 상기 혈관 또는 관상동맥 시술 동안 투여된다. 항-코넥신 화합물은 또한 혈관 또는 관상동맥 시술 전 또는 후, 또는 둘다에 투여될 수 있다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 또는 다른 결합 펩티드를 비롯한 항-코넥신 화합물은 혈관 또는 관상동맥 시술을 수행한 후 약 1 시간 내에 또는 예를 들어, 혈관 또는 관상동맥 시술을 수행한 후 약 2 시간 내에 투여된다. 다른 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 약 24 시간 내에 투여된다. 항-코넥신 화합물은 또한 목적하거나 필요한 경우 이러한 시간틀을 벗어나 투여될 수도 있다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 또는 다른 결합 펩티드를 비롯한 항-코넥신 화합물은 환자에게 수행되는 심장 시술, 예컨대 심장 수술과 함께 투여된다.
특정의 다른 실시양태에서, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 또는 다른 결합 펩티드를 비롯한 항-코넥신 화합물 혈관 또는 다른 시술을 수행하기 위한 의료 장치와 관련하여 투여된다.
또다른 측면에서, 대상체에게 투여하기 위한 제약 제제가 제공되며, 이러한 제약 제제는, 예를 들어, 헤미채널 발현, 형성, 활동 및/또는 활성을 차단 또는 완화시킴으로써 코넥신 헤미채널 및 그후 코넥손 형성을 조절할 수 있는 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 실시는 당업계의 기술에 속하는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 다양한 통상적인 기술을 이용할 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989)] 및 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001)](본원에서는 함께 또는 개별적으로 "Sambrook"으로 지칭함); [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)]; [Animal cell Cuture (R. I. Freshney, ed., 1987)]; [Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir ＆ C. C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller ＆ M. P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 2001년까지의 보충물 포함)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; [The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994)]; [Bioconjugate Techniquess (Greg T. Ilermanson, ed., Academic Press, 1996)]; [Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)], [Harlow and Lane(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, and Harlow and Lane(1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY](본원에서는 함께 또는 개별적으로 "Harlow and Lane"으로 지칭함), [Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, 2000)]; 및 [Agrawal, ed., Protocols for Oligonucleotides and Analogues, Synthesis and Properties Humana Press Inc., New Jersey, 1993)] 등에 상세하게 설명되어 있으며, 이들에 포함되나 이에 제한되지 않는다.
<정의>
일반적으로 그리고 다양한 비제한적 특정 실시양태를 통해 본 발명의 보다 상세하게 기재하기 전에, 본 발명을 기재하는데 있어 본원에 사용된 특정 용어들을 설명한다. 달리 지시되지 않는 한, 하기 용어는 본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용될 때 하기 의미를 갖는다. 명세서에서 하기에 또는 어디에서든 정의하지 않은 용어는 당업계에 인식되어 있는 의미를 가져야 한다.
본원에서 제공되는 화합물 (예를 들어, 펩티드 및 단백질)에 사용되는 아미노산은 유전학적으로 코딩된 아미노산, 천연 발생의 비-유전학적으로 코딩된 아미노산 또는 합성 아미노산일 수 있다. 이러한 임의의 아미노산의 L- 및 D-거울상이성질체 둘다가 화합물에서 사용될 수 있다. 하기의 약어가 하기 유전학적으로 코팅된 아미노산 (및 그의 잔기)에 대해 사용될 수 있다: 알라닌 (Ala, A); 아르기닌 (Ar g, R); 아스파라긴 (Asn, N); 아스파르트산 (Asp, D); 시스테인 (Cys, C); 글리신 (Gly, G); 글루탐산 (Glu, E); 글루타민 (Gln, Q); 히스티딘 (His, H); 이소루이신(Ile, I); 루이신 (Leu, L); 라이신 (Lys, K); 메티오닌 (Met, M); 페닐알라닌 (Phe, F); 프롤린 (Pro, P); 세린 (Ser, S); 트레오닌 (Thr, T); 트립토판 (Trp, W); 티로신 (Tyr, Y); 및 발린 (Val, V).
유전적으로 코딩되지는 않지만 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 특정의 일반적인 대항 아미노산에는 β-알라닌 (b-Ala) 및 다른 오메가-아미노산, 예컨대 3-아미노프로피온산 (Dap), 2,3-디아미노프로피온산 (Dpr, Z), 4-아미노부티르산 등; α-아미노이소부티르산 (Aib); ε-아미노헥산산 (Aha); δ-아미노발레르산 (Ava); 메틸글리신 (MeGly); 오르니틴 (Orn); 시트룰린 (Cit); t-부틸알라닌 (t-BuA); t-부틸글리신 (t-BuG); N-메틸이소루이신 (MeIle); 페닐글리신 (Phg); 시클로헥실알라닌 (Cha); 노르루이신 (Nle, J); 2-나프틸알라닌 (2-Nal); 4-클로로페닐알라닌 (Phe(4-Cl)); 2-플루오로페닐알라닌 (Phe(2-F)); 3-플루오로페닐알라닌 (Phe(3-F)); 4-플루오로페닐알라닌 (Phe(4-F)); 페니실라민 (Pen); 1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-3-카르복실산 (Tic); 베타-2-티에닐알라닌 (Thi); 메티오닌 술폭시드 (MSO); 호모아르기닌 (hArg); N-아세틸 라이신 (AcLys); 2,3-디아미노부티르산 (Dab); 2,3-디아미노부티르산 (Dbu); p-아미노페닐알라닌 (Phe(pNH2)); N-메틸 발린 (MeVal); 호모시스테인 (hCys); 3-벤조티아졸-2-일-알라닌 (BztAla, B); 및 호모세린 (hSer)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예상되는 추가적인 아미노산 동족체로는 포스포세린, 포스포트레오닌, 포스포티로신, 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 히푸르산, 옥타히드로인돌-2-카르복실산, 스타틴, α-메틸-알라닌, 파라-벤조일-페닐알라닌, 프로파르길글리신 및 사르코신이 포함된다. 본 발명의 범주 내에 포함되는 펩티드는 L- 또는 D-형상의 상기 임의의 아미노산, 또는 본원에 기재되거나 현재 또는 미래에 당업계에 공지되는 임의의 다른 아미노산을 가질 수 있다.
서로 치환가능한 아미노산은 일반적으로 유사한 부류 또는 하위부류에 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 아미노산은 우선적으로 아미노산 측쇄의 화학적 및 물리적 성질에 따라 의존적인 상이한 부류에 분류될 수 있다. 예를 들어, 일부 아미노산은 일반적으로 친수성 또는 극성 이마노산인 것으로 여겨지고, 다른 것들은 소수성 또는 비극성 아미노산인 것으로 여겨진다. 극성 아미노산으로는 산성, 염기성 또는 친수성 측쇄를 갖는 아미노산이 포함되고, 비극성 아미노산으로는 방향족 또는 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이 포함된다. 비극성 아미노산은 추가로 하위분류되어, 이들 중에는 지방족 아미노산이 포함될 수 있다. 본원에 사용되는 아미노산 부류의 정의는 하기와 같다:
"비극성 아미노산"은 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않고 극성이 아니고 일반적으로 수용액에 의해 반발되는 측쇄를 갖는 아미노산을 지칭한다. 유전학적으로 코딩되는 소수성 아미노산의 예로는 Ala, Ile, Leu, Met, Trp, Tyr 및 Val이 포함된다. 유전학적으로 코딩되지 않는 비극성 아미노산의 예로는 t-BuA, Cha 및 Nle가 포함된다.
"방향족 아미노산"은 공액 π-전자계를 갖는 고리 (방향족 기) 하나 이상을 함유한 측쇄를 갖는 비극성 아미노산을 지칭한다. 방향족 기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 히드록실, 술포닐, 니트로 및 아미노 아미노기 등과 같은 치환기로 추가 치환될 수 있다. 유전학적으로 코딩되는 방향족 아미노산의 예로는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이 포함된다. 통상적으로 발견되는 유전학적으로 코딩되지 않는 방향족 아미노산의 예로는 페닐글리신, 2-나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 3-벤조티아졸-2-일-알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌 및 4-플루오로페닐알라닌이 포함된다.
"지방족 아미노산"은 포화 또는 불포화된 직쇄, 분지형 또는 고리형 탄화수소 측쇄를 갖는 비극성 아미노산을 지칭한다. 유전학적으로 코딩되는 지방족 아미노산의 예로는 Ala, Leu, Val 및 Ile가 포함된다. 코딩되지 않는 지방족 아미노산의 예로는 Nle이 포함된다.
"극성 아미노산"은 생리학적 pH에서 전하를 띠거나 전하를 띠지 않고 보통 2개의 원자에 의해 공유되는 전자 쌍이 하나의 원자에 더 가까이 잡혀있는 결합을 가진 측쇄를 갖는 친수성 아미노산을 지칭한다. 극성 아미노산은 일반적으로 친수성이며, 이는 극성 아미노산이 수용액에 끌리는 측쇄를 갖는 아미노산을 가짐을 의미한다. 유전학적으로 코딩되는 극성 아미노산의 예로는 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 라이신 및 세린이 포함된다. 유전학적으로 코딩되지 않는 극성 아미노산의 예로는 시트룰린, 호모시스테인, N-아세틸 라이신 및 메티오닌 술폭시드가 포함된다.
"산성 아미노산"은 측쇄 pK 값이 7 미만인 친수성 아미노산을 지칭한다. 산성 아미노산은 수소 이온의 손실로 인해 측쇄가 생리학적 pH에서 전형적으로 음전하를 갖는다. 유전학적으로 코딩되는 산성 아미노산의 예로는 아스파르트산 (아스파르테이트) 및 글루탐산 (글루타메이트)이 포함된다.
"염기성 아미노산"은 측쇄 pK 값이 7 초과인 친수성 아미노산을 지칭한다. 염기성 아미노산은 히드로늄 이온과의 회합으로 인해 측쇄가 생리학적 pH에서 전형적으로 양전하를 갖는다. 유전학적으로 코딩되는 염기성 아미노산의 예로는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 포함된다. 유전학적으로 코딩되지 않는 염기성 아미노산의 예로는 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산 및 호모아르기닌이 포함된다.
"이온화가능한 아미노산"은 생리학적 pH에서 전하를 띨 수 있는 아미노산을 지칭한다. 이러한 이온화가능한 아미노산으로는 산성 및 염기성 아미노산, 예를 들어, D-아스파르트산, D-글루탐산, D-히스티딘, D-아르기닌, D-라이신, D-히드록시라이신, D-오르니틴, L- 아스파르트산, L-글루탐산, L-히스티딘, L-아르기닌, L-라이신, L-히드록시라이신 또는 L-오르니틴이 포함된다.
당업자들이 인식하는 바와 같이, 이러한 상기 분류는 절대적인 것은 아니다. 몇몇 아미노산은 하나 이상의 특성을 나타내고, 따라서 하나 이상의 카테고리에 포함될 수 있다. 예를 들어, 티로신은 비극성 방향족 고리와 극성 히드록실 기 둘다를 갖는다. 따라서, 티로신은 비극성, 방향족 및 극성으로서 기재될 수 있는 몇몇 특징을 갖는다. 그러나, 비극성 고리가 우세하고, 따라서 티로신은 일반적으로 비극성인 것으로 여겨진다. 유사하게, 이황 연결을 형성할 수 있는 것 이외에도, 시스테인은 또한 비극성 특성을 갖는다. 따라서, 소수성 또는 비극성 아미노산으로서 엄격하게 분류되지 않으면서, 많은 예에서 시스테인은 펩티드에 소수성 또는 비극성을 부여하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 의도되는 극성 아미노산으로는, 예를 들어, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 호모시스테인, 라이신, 히드록시라이신, 오르니틴, 세린, 트레오닌 및 구조적으로 관련된 아미노산이 포함된다. 한 실시양태에서, 극성 아미노산은 이온화가능한 아미노산, 예컨대 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 히드록시라이신, 라이신 또는 오르니틴이다.
사용될 수 있는 극성 또는 비극성 아미노산 잔기의 예로는, 예를 들어, 알라닌, 발린, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신 등이 포함된다.
"항-코넥신 화합물"로는 코넥신, 코넥신 헤미채널 (코넥손) 또는 갭 정션의 활성, 발현 또는 형성에 영향을 미치거나 이를 조절하는 화합물이 포함된다. 항-코넥신 화합물로는 안티센스 화합물 (예를 들어, 안티센스 폴리뉴클레오티드), 항체 및 이의 결합 단편, 및 "펩티도모방체" 및 "모방체" 펩티드를 비롯한 펩티드 및 폴리펩티드가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
"안티센스 화합물"은 치료에 사용하였을 때 mRNA를 서열-특이적으로 표적화하여 작용하는 것들을 포함하는, 유전자의 발현, 번역 또는 기능을 억제하는 데 작용하는 상이한 유형의 분자를 포함한다. 안티센스 화합물로는 안티센스 DNA 화합물 및 안티센스 RNA 화합물이 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 안티센스 화합물의 바람직한 형태인 경우, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 모방체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 올리고머성 안티센스 화합물을 포함한다. 본 발명에 따른 안티센스 화합물은 바람직하게는 약 8 내지 약 50개의 핵염기 (즉, 약 8 내지 약 50개의 연결된 뉴클레오시드)를 포함한다. 특히 바람직한 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 약 12 내지 약 30개의 핵염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 화합물에는, 표적 핵산을 가수분해시키고 이의 발현을 조절하는, 라이보자임, 외부 안내 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드 (올리고자임), 및 다른 짧은 촉매성 RNA 또는 촉매성 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 이들은 또한 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 (S-ODN)를 포함한다.
따라서, 안티센스 화합물에는, 예를 들어, 주요 핵산 기재의 유전자-스플라이싱 분자, 예를 들어, 화학 변형된 안티센스 올리고데옥시리보핵산 (ODN), 라이보자임 및 siRNA가 포함된다 (문헌 [Scherer, L. J. and Rossi, J. J. Nature Biotechnol. 21: 1457-1465 (2003)]). 안티센스 화합물로는 또한 안티센스 분자, 예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA) (문헌 [Braasch, D. A. and Corey, D. R., Biochemistry 41, 4503-4510 (2002)]), 모르폴리노 포스포로디아미데이트 (문헌 [Ileasman, J., Dev. Biol, 243, 209-214 (2002)]), DNA자임 (문헌 [Schubert, S. et al., Necleic Acids Res. 31, 5982-5992 (2003)], [Chakraborti, S. and Banerjea, A. C, MoL Ther. 7, 817-826 (2003)], [Santoro, S. W. and Joyce, G. F. Proc, Natl Acad. ScL USA 94, 4262-4266 (1997)]), 및 최근 개발된 5'-말단-돌연변이된 U1 소핵 RNA (문헌 [Fortes, P. et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 100, 8264-8269 (2003)])가 포함될 수 있다.
용어 "안티센스 서열"은 안티센스 화합물 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 예를 들어 RNA 서열에 대해 상보적이거나 부분적으로 상보적이거나 또는 이에 상응하는 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 안티센스 서열은, 예를 들어 mRNA 또는 그의 일부에 결합하여 리보솜에 의한 mRNA의 전사를 차단하는 핵산 서열을 포함한다. 안티센스 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO 94/12633, 및 문헌 [Nielsen et al., Science 254:1497 (1991)]; [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, edited by F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991)]; [Antisense Research and applications(1993), CRC Press]] 참조). 선택된 표적에 대한 안티센스 서열은 비-표적 서열에 비특이적으로 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있다. 비-표적 서열에 최소 결합하거나, 결합하지 않거나 또는 검출할 수 없는 비특이적으로 결합하는 안티센스 서열이 바람직하다.
본원에 사용된 "메신저(messenger) RNA"는 3개의 문자 유전자 코드를 이용하는 단백질 코딩에 대한 서열 정보 및 5'-비번역 영역, 3'-비번역 영역 및 5-'캡 영역을 형성하는 관련 리보뉴클레오티드 서열, 및 다양한 2차 구조를 형성하는 리보뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 상기 서열에 전체적으로 또는 부분적으로 표적화된 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따라 제조될 수 있다.
일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드 포함)은 "DNA-유사" (즉, 2'-데옥시 당을 갖고, 일반적으로 U 염기보다 T 염기를 가짐) 또는 "RNA-유사" (즉, 2'-히드록실 또는 2'-변형된 당을 갖고, 일반적으로 T 염기보다 U 염기를 가짐)로 기재될 수 있다. 핵산 나선(helix)은 1종 이상의 구조, 가장 통상적으로는 A-형 및 B-형을 채택할 수 있다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-유사"인 것으로 여겨지고, A-형-유사 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-유사"인 것으로 여겨진다.
용어 "상보적"은 일반적으로, 예를 들어 허용되는 염 및 온도 조건하에서 염기쌍 형성에 의해 폴리뉴클레오티드가 자연적으로 결합함을 나타낸다. 예를 들어, 서열 "A-G-T"는 상보적 서열 "T-C-A"에 결합한다. 2개의 단일-가닥 분자 사이의 상보성은 "부분적"이어서 핵산의 일부만이 결합할 수 있거나, 또는 "완전"하여서 단일 가닥 분자 사이에 전체적인 상보성이 존재할 수 있다. 핵산 분자 사이의 상보성 정도는 이들 사이의 혼성화 효율 및 강도에 유의한 영향을 끼친다. "혼성화가능한" 및 "상보적"은, 예를 들어 결합, 바람직하게는 의도된 작용을 수행하기에 충분히 안정한 결합이 DNA 또는 RNA 표적과 올리고뉴클레오티드 사이에 생성될 정도로 충분한 상보성 정도를 나타내는 데 사용되는 용어이다. 올리고뉴클레오티드는 혼성화될 그의 표적 핵산 서열에 100％ 상보적일 필요는 없는 것으로 이해되며, 또한 상기 결합은 표적-특이적이거나 또는 비-특이적인 결합이 치료 목적 또는 다른 목적을 유의하게 또는 바람직하지 못하게 간섭하지 않는 한 다른 비-표적 분자에 결합할 수도 있는 것으로 이해된다. 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적 분자의 정상적인 기능을 간섭함으로써 활성을 손실 또는 감소시키며, 충분한 정도의 상보성이 존재하여 특정 결합이 바람직한 조건하에, 즉 생체내 분석 또는 치료적 처치의 경우에는 생리학적 조건하에, 또는 시험관내 분석의 경우에는 분석이 수행되는 조건하에 올리고뉴클레오티드가 비-표적 서열과 비-특이적이거나 원하지 않는 결합을 형성하는 것을 방지한다. 절대적 상보성은 필요하지 않다. 폴리뉴클레오티드는 충분한 상보성을 가져서 생리학적 조건하에 20℃, 30℃ 또는 40℃ 초과의 융점을 갖는 이중가닥을 형성하는 것이 일반적으로 바람직하다.
"장애"는 본원에 기재 또는 청구된 것을 비롯하여, 본 발명의 분자 또는 조성물로 처리하였을 때 유익해지는 임의의 증상이다. 이는 포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 증상을 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
본원에 사용되는 "대상체"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠 동물 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 포유동물로 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 바람직한 대상체는 인간이다.
선택된 핵산 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 "표적화"는 다단계 과정일 수 있다. 이 과정은 기능을 조절하고자 하는 핵산 서열을 확인하는 것으로 시작할 수 있다. 이는, 예를 들어 발현이 특정 질환 상태와 관련된 세포내 유전자 (또는 유전자로부터 만들어진 mRNA)일 수 있다. 또한, 표적화 과정은 원하는 효과, 즉 단백질 발현의 억제, 다른 활성 조절 등이 나타나도록 발생하는 올리고뉴클레오티드 상호작용을 위한 핵산 서열 내의 부위(들)을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일단 표적 부위(들)이 확인되면, 표적에 충분하거나 바람직하게 상보적인 안티센스 화합물, 즉 충분하게 혼성화되고 적당한 또는 다른 원하는 특이성을 갖는 안티센스 화합물 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)을 선택하여 원하는 활성을 수득한다. 본 발명에서, 표적은 하나 이상의 코넥신을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 또한, 표적화 과정은 원하는 효과가 나타나도록 발생하는 안티센스 상호작용 생성을 위한 부위(들)을 결정하는 것을 포함할 수도 있다. 바람직한 유전자내 부위는, 예를 들어 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 번역 개시 또는 종결 코돈을 포함하는 영역이다. 번역 개시 코돈은 통상적으로 5'-AUG (전사된 mRNA 분자에서; 상응하는 DNA 분자에서는 5'-ATG)로 지칭되고, 또한 "AUG 코돈", "개시 코돈" 또는 "AUG 개시 코돈"으로 지칭될 수도 있다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG을 갖는 번역 개시 코돈을 가지며, 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체내에서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 용어 "번역 개시 코돈" 및 "개시 코돈"은, 각각의 경우에 통상적인 개시자 아미노산이 메티오닌 (진핵생물에서) 또는 포르밀메티오닌 (원핵생물에서)이지만, 다수의 코돈 서열을 포함할 수도 있다. 진핵생물 및 원핵생물 유전자는 2가지 이상의 다른 개시 코돈을 가질 수 있으며, 이 중 어느 하나가 특정 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정 조건 세트하에 번역 개시에 우선적으로 사용될 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 천연 발생 염기, 당 및 당내 (백본; backbone) 연결로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 중합체를 포함한다. 또한, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 유사한 기능을 갖는 비-천연 발생 단량체 또는 그의 일부를 포함하는 올리고머 또는 중합체를 포함한다. 상기 변형되거나 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 종종, 예를 들어 향상된 세포 흡수성, 뉴클레아제 존재하에서의 증가된 안정성, 또는 향상된 표적 친화성과 같은 특성 때문에 천연 형태보다 바람직하기도 하다. 다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 변형은 올리고뉴클레오티드가 천연 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)보다 뉴클레아제 분해에 대해 더 높은 내성을 갖도록 만드는 것으로 밝혀졌다. 뉴클레아제 내성은 통상적으로 올리고뉴클레오티드를 세포 추출물 또는 단리된 뉴클레아제 용액과 함께 인큐베이션하고, 보통 겔 전기영동에 의해 손상되지 않은 잔존 올리고뉴클레오티드의 정도를 시간에 따라 측정함으로써 측정된다. 뉴클레아제 내성이 향상되도록 변형된 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 더 오랜 시간 동안 손상되지 않은 상태로 생존할 수 있다. 또한, 다수의 변형이 올리고뉴클레오티드의 그의 표적에 대한 결합 (친화성)을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 올리고뉴클레오티드의 그의 표적에 대한 친화성은 통상적으로 올리고뉴클레오티드와 표적이 분리되는 온도인 올리고뉴클레오티드/표적 쌍의 Tm(융점)을 측정함으로써 결정된다. 분리는 분광 광도계로 검출한다. Tm이 높을수록, 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성이 커진다. 몇몇 경우에는, 표적-결합 친화성을 향상시키는 올리고뉴클레오티드 변형이 뉴클레아제 내성도 향상시킬 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 여러 개의 뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, 용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고데옥시뉴클레오티드" 모두는 뉴클레오티드의 헤테로중합체 또는 이러한 뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 또한, 이들 어구는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으며, 펩티드 핵산(PNA) 또는 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질에 대한 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는, 게놈에서 유래하거나 합성된 DNA 또는 RNA를 나타낸다.
코넥신, 코넥신 단편 또는 코넥신 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로는, 자연에서 발견되는 코넥신의 성숙한 형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(천연 발생 및 그의 변이체); 자연에서 발견되는 코넥신의 성숙한 형태를 코딩하는 서열과 추가의 코딩 서열, 예를 들어 리더(leader) 또는 신호 서열, 또는 전구단백질 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(천연 발생 및 그의 변이체); 상기 서열 중 하나와 비-코딩 서열 (예를 들어, 천연적으로 발견되는 폴리펩티드의 성숙한 형태(들)에 대한 코딩 서열의 인트론 또는 5' 및/또는 3'의 비-코딩 서열)을 갖는 폴리뉴클레오티드; 자연에서 발견되는 코넥신의 성숙한 형태(들)의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 논의된 바와 같이 천연적으로 발견되는 코넥신의 성숙한 형태(들)의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 있다. 따라서, "코넥신-코딩 폴리뉴클레오티드" 등은 원하는 코넥신, 단편 또는 변이체에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서, 메신저 RNA는 3개의 문자 유전자 코드를 이용하는 단백질 코딩에 대한 위한 정보 뿐만 아니라, 5'-비번역 영역, 3'-비번역 영역, 5'-캡 영역 및 인트론/엑손 정션 리보뉴클레오티드로서 당업자에게 공지된 영역을 형성하는 관련 리보뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 상기 관련 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 정보 리보뉴클레오티드에 전체적으로 또는 부분적으로 표적화된 올리고뉴클레오티드를 본 발명에 따라 제작할 수 있다. 이에 따라, 올리고뉴클레오티드는 전사 개시 부위 영역, 번역 개시 코돈 영역, 5'-캡 영역, 인트론/엑손 정션, 코딩 서열, 번역 종결 코돈 영역 또는 5'-비번역 영역 또는 3'-비번역 영역의 서열과 특이적으로 혼성화될 수 있다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG를 갖는 번역 개시 코돈을 가지며, 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체내에서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 용어 "번역 개시 코돈" 및 "개시 코돈"은, 각각의 경우에 개시자 아미노산이 메티오닌 (진핵생물에서) 또는 포르밀메티오닌 (원핵생물에서)이지만, 다수의 코돈 서열을 포함할 수도 있다. 진핵생물 및 원핵생물 유전자는 2가지 이상의 다른 개시 코돈을 가질 수 있으며, 이 중 어느 하나가 특정 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정 조건 세트하에서 번역 개시에 우선적으로 사용될 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 본원에서, "개시 코돈" 및 "번역 개시 코돈"은 상기 코돈의 서열(들)과는 상관없이 코넥신을 코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA 분자의 번역을 개시하기 위해 생체내에서 사용되는 코돈(들)을 나타낸다. 유전자의 번역 종결 코돈 (또는 "정지 코돈")은 3가지 서열, 즉 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA (상응하는 DNA 서열은 각각 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA임) 중 하나를 가질 수 있다는 것도 당업계에 공지되어 있다. 용어 "개시 코돈 영역", "AUG 영역" 및 "번역 개시 코돈 영역"은 번역 개시 코돈으로부터 어느 한 방향 (즉, 5' 또는 3')으로 약 25 내지 50개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상기 mRNA 또는 유전자의 일부를 나타낸다. 이 영역은 바람직한 표적 영역이다. 이와 마찬가지로, 용어 "정지 코돈 영역" 및 "번역 종결 코돈 영역"은 번역 종결 코돈으로부터 어느 한 방향(즉, 5' 또는 3')으로 약 25 내지 50개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상기 mRNA 또는 유전자의 일부를 나타낸다. 이 영역은 바람직한 표적 영역이다. 번역 개시 코돈과 번역 종결 코돈 사이의 영역을 나타내는 것으로 당업계에 공지되어 있는 오픈 리딩 프레임 (ORF) 또는 "코딩 영역"은 또한 효과적으로 표적화될 수 있는 영역이다. 다른 바람직한 표적 영역은, 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향에 있는 mRNA의 일부를 나타내는 것으로 당업계에 공지되어 있는 5'-비번역 영역 (5'UTR)을 포함하고, 이에 따라 번역 종결 코돈으로부터 3' 방향에 있는 mRNA의 일부를 나타내는 것으로 당업계에 공지되어 있는 3'-비번역 영역(3'UTR)과 유전자 상에서 mRNA 또는 상응하는 뉴클레오티드의 5'-캡 부위와 번역 개시 코돈 사이에 존재하는 뉴클레오티드를 포함하며, 따라서 상기 유전자 상에서 mRNA 또는 상응하는 뉴클레오티드의 번역 종결 코돈과 3'-말단 사이에 있는 뉴클레오티드를 포함한다. mRNA의 5'-캡은 5'-5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA의 5'-최말단 잔기에 결합된 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5'-캡 영역은 5'-캡 구조 자체 뿐만 아니라 캡에 바로 인접하고 있는 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주된다. 5'-캡 영역 또한 바람직한 표적 영역일 수 있다.
몇몇 진핵생물 mRNA 전사체는 직접 번역되지만, 다수의 전사체는 전-mRNA 전사체로부터 절단되어 하나 이상의 성숙한 mRNA를 제공하는 하나 이상의 영역 ("인트론"으로 공지되어 있음)을 함유한다. 나머지 (및 이에 따라 번역되는) 영역은 "엑손"으로 공지되어 있으며, 이들은 함께 스플라이싱되어 연속적인 mRNA 서열을 형성한다. mRNA 스플라이싱 부위, 즉 엑손-엑손 또는 인트론-엑손 정션도 바람직한 표적 영역일 수 있으며, 이들은 변종 스플라이싱이 질환과 연관되어 있거나, 또는 특정 mRNA 스플라이싱 생성물의 과다생성이 질환과 연관되어 있는 상황에 특히 유용하다. 재배열 또는 결실에 의한 변종 융합 정션도 바람직한 표적이다. 다르게 스플라이싱된 mRNA에서 특정 엑손을 표적화하는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 인트론도 효과적일 수 있으며, 이에 따라 예를 들어 DNA 또는 전-mRNA에 표적화된 안티센스 화합물에 대한 표적 영역이 바람직할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
용어 "펩티도모방체" 및 "모방체"에는 이들이 모방하는 단백질 영역과 실질적으로 동일한 구조적 및 기능적 특성을 가질 수 있는 천연 발생 및 합성 화학 화합물이 포함된다. 코넥신에 대하여, 이들은, 예를 들어, 코넥손-코넥손 도킹 및 세포-세포 채널 형성에 포함되는 마주보는 코넥신의 세포외 루프를 모방할 수 있다.
주형 펩티드와 유사한 특성을 갖는 펩티드 동족체는 비-펩티드 약물일 수 있다. "펩티드 모방체" 또는 "펩티도모방체"는 펩티드-기재의 화합물을 포함하며, 또한 비-펩티드 기재의 화합물도 포함한다 (문헌 [Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)]; [Veber and Freidinger; TINS; 392 (1985)]; [Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987)]; [Beeley N., Trends Biotechnol., Jun; 12(6):213-6 (1994)]; [Kieber-Emmons T, et al.; Curr Opin Biotechnol., Aug; 8(4):435-41 (1997)]). 치료상 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체를 사용하여 동등하거나 향상된 치료 또는 예방 효과를 생성할 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 이론적인 폴리펩티드 (즉, 생물학적 또는 약리학적 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 동일 또는 유사하지만, 예를 들어 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 이루어진 군으로부터 선택된 연결에 의해 임의로 치환될 수 있는 하나 이상의 펩티드 연결을 가질 수도 있다. 모방체는 전체가 천연 아미노산 또는 아미노산의 합성 비-천연 동족체로 구성될 수 있거나, 또는 일부는 천연 펩티드 아미노산으로 이루어지고 다른 일부는 아미노산의 비-천연 동족체로 이루어진 키메라 분자이다. 또한, 모방체는 천연 아미노산 보존적 치환이 모방체의 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 한, 임의의 양의 천연 아미노산 보존적 치환을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 모방체 조성물이 코넥신 단백질 또는 코넥손의 생물학적 활동 또는 활성을 하향 조절할 수 있다면, 예를 들어, 갭-정션-매개의 세포-세포 신호전달을 형성하는 코넥손 도킹을 방지하거나, 세포외 환경에 세포 세포질을 노출시키는 코넥손 개방을 방지할 수 있다면 본 발명의 범주내에 포함된다. 펩티도모방체, 모방체 펩티드 및 코넥신 조절 펩티드는 본원에 개시된 펩티도모방체, 모방체 펩티드 및 코넥신 조절 펩티드 뿐만 아니라 현재 공지되거나 이후에 개발되는 당업계에 공지될 수 있는 것들도 포함한다.
용어 "조성물"은 하나 이상의 성분을 포함하는 생성물을 포함하는 것으로 간주된다.
다양한 형태로 본원에 사용된 용어 코넥신 활성의 "조절제" 및 "조절"은 코넥신의 발현 또는 활동 또는 활성을 전체적으로 또는 부분적으로 억제하는 것을 포함하는 것으로 간주된다. 이러한 조절제는 코넥신 기능 또는 발현의 소분자 길항제, 안티센스 분자, 리보자임, 삼중가닥 분자, 및 RNAi 폴리뉴클레오티드, 유전자 요법 등을 포함한다.
어구 "동일성 비율(％)"은 둘 이상의 서열을 비교하였을 때 발견되는 서열 유사성의 비율을 나타낸다. 동일성 비율(％)은 예를 들어 임의의 적합한 소프트웨어를 이용하여 전자적으로 결정할 수 있다. 이와 마찬가지로, 2가지 서열 (또는 이들의 하나 이상의 부분 중 하나 또는 둘 모두) 사이의 "유사성"은 하나의 서열을 제2 서열에 대해 비교함으로써 결정된다.
조성물 또는 제제의 "제약상 허용되는" 화합물 및 다른 성분, 예를 들어 담체, 희석제 또는 부형제는 그의 수혜자에게 투여하기 적합한 것들이다.
일반적으로, 용어 "단백질"은 펩티드 결합을 통해 연결된 2개 이상의 개별 아미노산 (천연 발생 아미노산 또는 비천연 발생 아미노산)의 임의의 중합체를 나타내며, 상기 펩티드 결합은 한 아미노산 (또는 아미노산 잔기)의 α-탄소에 결합된 카르복실산기의 카르복실 탄소 원자가 인접한 아미노산의 α-탄소에 결합된 아미노기의 아미노 질소 원자에 공유 결합하여 생성된다. 이러한 펩티드 연결, 및 여기에 포함되는 원자 (즉, α-탄소 원자, 카르복실 탄소 원자 (및 이들의 치환기 산소 원자), 및 아미노 질소 원자 (및 이들의 치환기 수소 원자))는 단백질의 "폴리펩티드 백본"을 형성한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "단백질"은 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"(본원에서 때때로 상호교환적으로 사용될 수 있음)를 포함하는 것으로 이해된다. 이와 마찬가지로, 단백질 단편, 동족체, 유도체 및 변이체는 본원에서 "단백질"로 지칭될 수 있으며, 달리 지시되지 않는 한 "단백질"로 간주되어야 한다. 용어 단백질의 "단편"은 단백질의 모든 아미노산 잔기보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 단백질의 "도메인"은 또한 단편이며, 활성 또는 기능을 부여하는데 종종 필요한 단백질의 아미노산 잔기를 포함한다.
용어 "엄격한 조건"은 폴리뉴클레오티드 사이의 혼성화를 허용하는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 염 농도, 유기 용매 (예를 들어, 포름아미드)의 농도, 온도, 및 당업계에 공지된 다른 조건에 의해 정해질 수 있다. 엄격도는 염의 농도를 감소시키거나, 유기 용매 (예를 들어, 포름아미드)의 농도를 증가시키거나, 또는 혼성화 온도를 상승시킴으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 엄격한 염 농도는 보통 약 750 mM 미만의 NaCl 및 75 mM 미만의 3시트르산나트륨, 바람직하게는 약 500 mM 미만의 NaCl 및 50 mM 미만의 3시트르산나트륨, 가장 바람직하게는 약 250 mM 미만의 NaCl 및 25 mM 미만의 3시트르산나트륨일 것이다. 낮은 엄격도의 혼성화는 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 부재하에 달성할 수 있는 반면, 높은 엄격도의 혼성화는 유기 용매 (예를 들어, 약 35％ 이상의 포름아미드, 가장 바람직하게는 약 50％ 이상의 포름아미드)의 존재하에 달성될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 보통 약 30℃ 이상, 보다 바람직하게는 약 37℃ 이상, 가장 바람직하게는 약 42℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 부가적인 가변 파라미터, 예를 들어 혼성화 시간, 디터전트 (예를 들어, 나트륨 도데실 술페이트(SDS))의 농도, 및 담체 DNA의 도입 또는 배제 여부는 당업자에게 공지되어 있다. 다양한 수준의 엄격도는 요구되는 상기 다양한 조건들을 조합함으로써 달성되며, 이는 당업계 기술 범위에 속하는 것이다. 또한, 엄격한 혼성화 조건은 표적 서열의 융점 (Tm) 미만인 약 5℃ 내지 약 20℃ 또는 25℃ 범위의 온도, 및 표적과 정확하게 또는 거의 정확하게 상보적인 프로브에 의해 정해질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 융점은 이중 가닥 핵산 분자 집단 중 절반이 단일 가닥으로 분리되는 온도이다. 핵산의 Tm을 계산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Berger and Kimmel, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego (1987): Academic Press, Inc.] 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning (1989): A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory] 참조). 표준 참고문헌에 나타난 바와 같이, Tm 값은 핵산이 1M NaCl의 수용액 중에 존재하는 경우에 식 Tm = 81.5 + 0.41(％ G + C)에 계산하여 간단하게 추정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Anderson and Young, "Quantitative Filter Hybridization" in Nucleic Acid Hybridization (1985)] 참조). 하이브리드의 융점 (및 이에 따른 엄격한 혼성화에 대한 조건)은 다양한 요인, 예컨대 프로브의 길이 및 성질 (DNA, RNA, 염기 조성)과 표적 (용액 중에 존재하거나 고정되어 있는 DNA, RNA, 염기 조성물 등)의 성질, 및 염 및 다른 성분의 농도 (예를 들어, 포름아미드, 덱스트란 술페이트, 폴리에틸렌 글리콜이 존재하거나 부재함)에 의해 영향을 받는다. 이러한 요인의 효과는 공지되어 있으며, 당업계의 표준 참고문헌에 논의되어 있다 (예를 들어, 삼브룩(Sambrook)의 상기 문헌 및 오수벨(Ausubel)의 상기 문헌 참조). 통상적으로, 엄격한 혼성화 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 나트륨 이온의 농도가 약 1.0 M 미만, 통상적으로는 약 0.01 내지 1.0 M인 염 농도, 및 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)의 경우에는 약 30℃ 이상, 긴 프로브 (예를 들어, 50개를 초과하는 뉴클레오티드)의 경우에는 약 60℃ 이상의 온도이다. 언급한 바와 같이, 엄격한 조건은 또한 보다 낮은 온도가 이용될 수 있는 경우에 탈안정화제, 예컨대 포름아미드를 첨가하여 달성할 수 있다. 본 발명에서, 폴리뉴클레오티드는 높은 엄격도를 갖는 매질의 조건, 예컨대 약 50 내지 약 60℃의 온도에서 0.03 M 염화나트륨 및 0.03 M 시트르산나트륨의 조건하에 코넥신 mRNA에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
용어 "치료상 유효량"은 원하는 반응, 예를 들어 연구원, 수의사, 의학 전문의 또는 다른 임상의에 의해 관찰되는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도해 내는 대상 화합물의 양이다.
"처치"는 치료 및 예방적 처치, 또는 예방적 측정을 나타낸다. 처치가 필요한 대상체는 이미 장애를 갖고 있는 대상체 뿐만 아니라 장애를 예방하고자 하는 대상체를 포함한다.
용어 "벡터"는 플라스미드, 파지 또는 바이러스가 박테리아, 효모, 무척추 동물 및/또는 포유동물 숙주 세포에서 기능할 수 있는 경우에 핵산을 세포에 전달하기 위한 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 다른 시스템 (천연 발생 또는 합성임) 형태의 핵산 분자 증폭, 복제 및/또는 발현 비히클을 나타낸다. 벡터는 숙주 세포 게놈 DNA와는 별개로 잔류할 수 있거나 또는 게놈 DNA와 전부 또는 부분적으로 통합될 수 있다. 벡터는 일반적으로 그와 상용가능한 임의의 숙주 세포에서 기능할 수 있기 위해 필요한 모든 요소를 함유할 것이지만, 반드시 그럴 필요는 없다. "발현 벡터"는 적절한 조건하에 외생 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 결합 도메인 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 벡터이다.
본원에 기재된 용어 "상동성 및 상동적인"은 코넥신 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 서열과 상동적일 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 관련 서열과, 예를 들어 (상동적인 서열의) 약 15, 20, 30, 40, 50, 100개 이상의 인접 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 통상적으로는 약 70％ 이상의 상동성, 바람직하게는 약 80％, 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 이상의 상동성을 갖는다.
상동성은 당업계의 임의의 방법에 기초하여 계산될 수 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성 계산에 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (예를 들어, 디폴트(default) 세팅에서 사용됨)(문헌 [Devereux et al. Nucleic Acids Research 12, p387-395 (1984)]). PILEUP 및 BLAST 알고리즘을 이용하여 (통상적으로는, 이들의 디폴트 세팅에서) 상동성 또는 정렬된 서열을 계산할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Altschul S. F.; J Mol Evol 36:290-300 (1993)]; [Altschul, S. F. et al.; J Mol Biol 215:403-10 (1990)]에 기재되어 있음). BLAST 분석을 수행하는데 사용되는 소프트웨어는 생물기술 정보를 위한 국립 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 사용할 수 있다(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/L). 이 알고리즘은 우선, 데이타베이스 서열에서 동일한 길이의 워드(word)와 정렬하였을 때 상당한 양성값을 나타내는 역치 스코어 (T)와 일치하거나 또는 이를 만족시키는 질의(query) 서열의 짧은 길이 (W)의 워드를 식별함으로써 높은 스코어의 서열 쌍을 식별하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 역치로 지칭된다 (Altschul et al., 상기 문헌). 이들 초기 이웃 워드 히트(hit)는 이들을 함유하는 HSP를 찾기 위한 검색을 시작할 때 사용하는 시드(seed)로서 작용한다. 워드 히트는 누적된 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양 방향 모두로 연장된다. 워드 히트의 각 방향으로의 연장은 누적된 정렬 스코어가 그의 최대 달성값으로부터 X만큼의 양이 감소하는 경우, 하나 이상의 음성-스코어 잔기 정렬의 축적에 의해 누적된 스코어가 0 이하가 되는 경우, 또는 어느 한 서열의 말단에 도달한 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터인 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 워드 길이(W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌 [Ilenikoff and Ilenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992)]) 정렬 (B), 10의 기대값 (E), M=5, N=4, 및 두 가닥의 비교를 이용한다.
BLAST 알고리즘은 2가지 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 하나의 유사성 측정은 최저 합계 확률 (P(N))로, 2가지 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 우연히 서로 쌍을 이룰 확률의 기준을 제공한다. 예를 들어, 제1 서열의 비교에서 최저 합계 확률값이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 이 서열을 다른 서열과 유사한 것으로 간주한다.
상동성 서열은 통상적으로 적어도 (즉, 이를 넘지 않는) 약 1, 2, 5, 10, 15, 20개 이상의 돌연변이(치환, 결실 또는 삽입 돌연변이일 수 있음)에 의해 관련 서열과 구분된다. 이들 돌연변이는 상동성 계산과 관련하여 상기 언급된 임의의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다. 상동성 서열은 통상적으로 배경보다 유의하게 높은 수준으로 원래 서열에 선택적으로 혼성화한다. 선택적인 혼성화는 통상적으로 높은 엄격도의 배지 조건(예를 들어, 약 50 내지 약 60℃의 온도에서 0.03 M 염화나트륨 및 0.03 M 시트르산나트륨) 이용하여 달성된다. 그러나, 이러한 혼성화는 당업계에 공지된 임의의 적합한 조건하에 수행될 수도 있다 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)]). 예를 들어, 높은 엄격도가 요구된다면, 적합한 조건은 60℃에서 0.2 x SSC를 포함한다. 보다 낮은 엄격도가 요구된다면, 적합한 조건은 60℃에서 2 x SSC를 포함한다.
"세포"는 원하는 용도에 적합한 임의의 생존 세포를 의미한다. 세포는 진핵생물 및 원핵생물 세포를 포함한다.
용어 "유전자 생성물"은 유전자로부터 전사된 RNA 분자, 또는 유전자에 의해 코딩되거나 RNA로부터 번역된 폴리펩티드를 나타낸다.
용어 "재조합"은 시험관내 합성되거나 달리 조작된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, "재조합 폴리뉴클레오티드"), 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 유전자 생성물을 제조하는 방법, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드 ("재조합 단백질")를 나타낸다. 따라서, "재조합" 폴리뉴클레오티드는 그의 제조 방법 또는 구조에 의해 정의된다. 그의 생성 방법과 관련하여, 이 과정은 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 인위적인 간섭, 통상적으로 선별 또는 생성을 포함하는 재조합 핵산 기술을 나타낸다. 별법으로, 이것은 서로 자연적으로 인접하지 않은 2개 이상의 단편의 융합을 포함하는 서열을 생성함으로써 제조된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 따라서, 예를 들어 임의의 비-자연 발생 벡터로 세포를 형질전환시켜 제조한 생성물이, 임의의 합성 올리고뉴클레오티드 과정을 이용하여 유래된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서 포함된다. 이와 마찬가지로, "재조합" 폴리펩티드는 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 것이다.
"재조합 숙주 세포"는 벡터 (예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 함유하는 세포, 또는 재조합 기술에 의해 해당 단백질을 발현하도록 조작된 세포이다.
코넥신 유전자 패밀리는 서열분석된 인간 게놈에서 20개의 확인된 구성원으로 다양해진다. 상이한 코넥신 유전자 생성물을 합쳐서 공극 전도성, 크기 선택성, 전하 선택성, 전압 게이팅 성질 및 화학적 게이팅 성질을 비롯한 상이한 성질을 갖는 갭 정션을 형성하고, 상이한 조직에서 상이한 발생 시점 또는 질환 과정 동안 발현된다. 최근 문헌에서, 코넥신은 이들의 분자량에 따라 가장 일반적으로 명명되며, 예를 들어 Cx26은 26 Kd의 코넥신 단백질이다. 이것은 상이한 종으로부터의 코넥신 유전자를 비교할 경우 혼란을 야기할 수 있는데, 예를 들어 인간 Cx36은 제브라피쉬(zebrafish) Cx35와 상동성이다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, 이들의 분자량이 상이하더라도 특정 코넥신에 대한 참조는 이들의 모든 종 변이체에 대한 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, "코넥신 43"에 대한 참조는 인간 코넥신 43 뿐만 아니라 서로 다른 종의 유사 코넥신을 의미하고, 이들이 또한 43Kd임을 나타내는 데 문제가 없다. 유사하게, 비-인간 "코넥신 43"에 대한 참조는 임의의 종에서 코넥신 43 동족체 또는 변이체에 대한 참조이다. 따라서, 예를 들어, "말 코넥신 43"에 대한 참조는 43Kd 분자량을 갖지 않더라도 말에서 인간 코넥신 43의 해당하는 동족체 또는 변이체에 대한 참조이다.
<화합물>
본원에 기재된 화합물은 심혈관성, 염증성, 신경학적 및 혈관 증상을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 장애 및 증상의 완화, 치료 또는 예방 뿐만 아니라 상처 치료에도 유용하다. 화합물은 또한 제약 조성물에서 및 의료 장치 및 시술, 예를 들어, 수술, 이식편 수술, 및 기관 또는 조직 이식과 관련하여 유용하다. 본원에 기재된 특정의 바람직한 화합물은 분자의 세포 내로 및 밖으로의 전달을 조절하거나 이에 영향을 미칠 수 있다 (예를 들어, 차단 또는 억제). 따라서, 본원에 기재된 특정 항-코넥신 화합물은 세포 신호전달 (예를 들어, 세포-대-세포)을 조절한다. 특정 항-코넥신 화합물은 세포 세포질과 막간 공간 또는 세포외 공간 사이의 분자 전달을 조절하거나 이에 영향을 미친다. 헤미채널이 독립적으로 세포 세포질과 세포외 공간 또는 조직 사이의 소분자 교환에 포함되기 때문에, 이러한 화합물은 일반적으로 헤미채널 (코넥손)에 표적화된다. 따라서, 본원에 제공된 화합물은 세포 사이 또는 세포와 세포외 공간 또는 조직 사이의 커플링을 직간접적으로 감소시킬 수 있고, 세포로부터 세포외 공간으로의 분자 전달의 조절은 특정 화합물의 범주내에 있으며 본 발명의 실시양태 내에 있다.
갭 정션 또는 코넥신 헤미채널을 통한 분자의 통과 (예를 들어, 전달)의 목적하는 억제를 도출할 수 있는 임의의 분자는 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있다. 갭 정션 또는 코넥신 헤미채널을 통한 분자 통과를 조절하는 화합물 (예를 들어, 세포의 세포질로부터 세포외 공간으로의 분자 통과를 조절하는 화합물)은 또한 특정 실시양태에서 제공된다. 이러한 화합물은 갭 정션 비커플링과 함께 또는 없이 갭 정션 또는 코넥신 헤미채널을 통해 분자의 통과를 조절할 수 있다 (갭 정션을 통한 분자 전달을 차단함). 이러한 화합물로는, 예를 들어, 단백질 및 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 임의의 다른 유기 화합물이 포함되며, 이들은, 예를 들어 갭 정션, 또는 헤미채널의 기능 또는 발현을 전체적으로 또는 부분적으로 차단할 수 있다. 일부 갭 정션 억제제 목록에 대하여, 예를 들어 문헌 [Evans, W.H. and Boitano, S. Biochem. Soc. Trans. 29: 606 - 612 (2001)]를 참조한다.
<펩티드 및 폴리펩티드 코넥신 억제제>
펩티드, 펩티드 모방체, 항체, 항체 단편 등을 비롯한 결합 단백질은 특정 실시양태에서 갭 정션 및 헤미채널과 갭 정션의 적합한 조절제이다. 결합 단백질로는, 예를 들어, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2 및 Fv 단편; 단일쇄 항체; 단일쇄 Fvs; 및 단일쇄 결합 분자, 예를 들어, 결합 도메인, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 분자, 2002년 7월 25일에 공개된 WO 02/056910 (Ledbetter et al.)에 모두 기재됨); 특정 항체 또는 다른 결합 분자와 접촉하게 하는 항원성 결정인자 (즉, 일반적으로 에피토프로서 지칭되는 분자의 부분)를 결합할 수 있는 재조합 항체 및 항체 단편이 포함된다. 항체, 항체 단편 등을 비롯한 이러한 결합 단백질은 키메라성 또는 인간화된 것일 수 있거나, 또는 다르게는 투여되는 대상체에서 덜 면역원성으로 만들 수 있고, 합성되거나, 재조합적으로 생성되거나 또는 발현 라이브러리에서 생성될 수 있다. 당업계에 공지되거나 이후에 밝혀질 임의의 결합 분자가, 예컨대 본원에 참조된 것들 및/또는 당업계에 더 상세히 기재된 것들을 계획한다. 문헌 [Harlow, E., and Lane, D., "Antibody: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988)] (본원에 참고로 포함됨)을 참조한다. 예를 들어, 결합 단백질은 항체 등 뿐만 아니라 표적 (예를 들어, 코넥신, 헤미채널, 또는 회합 분자)에 결합하는 리간드, 수용체, 모방체 펩티드 또는 다른 결합 단편 또는 분자 (예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 생성됨)도 포함된다.
결합 분자는 일반적으로 결합 특이성을 포함하나 이에 제한되지 않는 목적하는 특이성, 및 목적하는 친화성을 가질 것이다. 친화성은, 예를 들어, Ka가 약 104 M-1 이상, 약 106 M-1 이상, 약 107 M-1 이상, 약 10 M-1 이상일 수 있다. 약 108 M-1 초과의 친화성이 적합하고, 예를 들어 109 M-1, 약 1010 M-1, 약 1011 M-1 및 약 1012 M-1 이상의 친화성이 적합하다. 본 발명에 따른 결합 단백질의 친화성은 공지된 기술, 예를 들어 문헌 [Scatchard et al, 1949 Ann. NJ. Acad. Sci. 51: 660]에 기재된 기술을 이용하여 용이하게 측정될 수 있다.
갭 정션 및 헤미채널의 펩티드 억제제 (예를 들어, 모방체 펩티드)는 본원에 제공된 특정 실시양태에서 바람직하다. 예를 들어 문헌 [Berthoud, V.M. et al, Am J. Physiol. Lung Cell MoL Physiol. 279: L619 - L622 (2000)]; [Evans, W.H. and Boitano, S. Biochem. Soc. Trans. 29: 606 - 612] 및 [De Vriese A.S., et al. Kidney Int. 61: 177 - 185 (2001)]를 참조한다.
친수도 도표로부터 얻어진 데이타를 이용하여, 코넥신이 4개-막횡단-스패닝 영역 및 2개의 짧은 세포외 루프를 함유하는 것으로 제안된 바 있다. [Paul DL. J Cell Biol 103: 123-134 (1996)]. 제1 및 제2 세포외 영역에서의 코넥신의 위치화는 분열 갭 정션에 상응하는 에피토프의 면역국재화를 위해 사용되는 항-펩티드 항체의 보고된 생산을 추가 특징으로 한다. 문헌 [Goodenough D.A. J Cell Biol 107: 1817-1824 (1988)]; [Meyer R.A., J Cell Biol 119: 179-189 (1992)].
헤미채널의 세포외 도메인은 완전한 갭 정션 채널을 형성하기 위해 2개의 인점 세포가 서로 "도킹"하는 것에 의해 기인한다. 이러한 세포외 도메인의 상호작용에 간섭하는 시약은 세포-대-세포 신호전달을 손상시킬 것이다. 코넥신의 세포외 루프 내에 있는 서열에 상응하는 짧은 펩티드는 세포내 신호전달의 억제제로서 보고되었다. 문헌 [Boitano S. and Evans W. Am J Physiol Lung Cell MoI Physiol 279: L623-L630 (2000)]. 쌍을 이룬 제노퍼스 난모세포에서 발현되는 코넥신 (Cx) 32에 의해 생성된 세포-세포 채널 형성의 억제제로서 팹티드의 사용이 보고된 바 있다. 문헌 [Dahl G, et al, Biophys J 67: 1816-1822 (1994)]. 문헌 [Berthoud, V.M. and Seul, K.H., summarized some of these results. Am J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279: L619 - L622 (2000)]. 티로신 잔기의 인산화에 의한 헤미채널 기능의 조절은 US2004/0092429 (Jensen et al.)에 보고되어 있으며, 이의 교시는 본원에서 제공된 항-코넥신 화합물 및 방법을 포함하지 않는다.
또다른 측면에서, 항-코넥신 화합물은 코넥신 (예를 들어, 코넥신 45, 43, 26, 30, 31.1 및 37)의 막횡단 영역 (예를 들어, 1st 내지 4th)에 상응하는 아미노산 서열을 포함한 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 코넥신 45의 막횡단 영역 부분에 상응하는 아미노산 서열을 포함한 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 서열 62의 5 내지 20개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 서열 62의 8 내지 15개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 서열 62의 11 내지 13개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 다른 실시양태는 서열 62의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 또는 30개 이상의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 항-코넥신 화합물에 관한 것이다. 본원에 제공된 특정 항-코넥신 화합물에서, 서열 62의 위치 46-75 및 199-228에서 아미노산에 상응하는 코넥신 45의 세포외 도메인은 특정 펩티드 서열을 개발하기 위해 사용된다. 따라서, 본원에 기재된 특정 펩티드는 서열 62의 위치 46-75 및 199-228에서 영역에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 펩티드는 서열 62의 이러한 부분에 일치하는 아미노산 서열을 가질 필요는 없으며, 보존성 아미노산 변화는 본원에 기재되고 당업계에 다르게 공지된 분석법에서 결합 활성 또는 기능성 활성을 유지하도록 만들어질 수 있다. 다른 실시양태에는, 세포외 도메인 이외의 코넥신 단백질의 펩티드 표적 영역 (예를 들어, 서열 62의 부분이 위치 46-75 및 199-228에 상응하지 않음)이 있다.
다른 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 코넥신 43의 막횡단 영역 일부에 상응하는 아미노산 서열을 포함한 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 서열 63의 5 내지 20개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 서열 63의 8 내지 15개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 서열 63의 11 내지 13개의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 다른 실시양태는 서열 63의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 또는 30개 이상의 인접 아미노산을 포함한 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 항-코넥신 화합물에 관한 것이다. 다른 항-코넥신 화합물에서, 서열 63의 위치 37-76 및 178-208에서 아미노산에 상응하는 코넥신 43의 세포외 도메인은 특정 펩티드 서열을 개발하는 데 사용된다. 따라서, 본원에 기재된 특정 펩티드는 서열 63의 위치 37-76 및 178-208에서 영역에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 펩티드는 서열 63의 이러한 일부와 일치하는 아미노산을 가질 필요는 없고, 보존성 아미노산 변화는 본원에 기재되고 당업계에 다르게 공지된 검사법에서 결합 활성 또는 기능적 활성을 유지하도록 만들어질 수 있다. 다른 실시양태에는, 세포외 도메인 이외의 코넥신 단백질의 펩티드 표적 영역 (예를 들어, 서열 63의 일부는 위치 37-76 및 178-208에 상응하지 않음)이 있다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 항-코넥신 펩티드는 보존성 아미노산 치환을 갖는 코넥신 세포외 도메인의 일부에 상응하는 서열을 포함하며, 이로써 펩티드가 기능적으로 활성인 항-코넥신 화합물이도록 한다. 예시적인 보존성 아미노산 치환으로는, 예를 들어 비극성 아미노산의 또다른 비극성 아미노산으로의 치환, 방향족 아미노산의 또다른 방향족 아미노산으로의 치환, 지방족 아미노산의 또다른 지방족 아미노산으로의 치환, 극성 아미노산의 또다른 극성 아미노산으로의 치환, 산성 아미노산의 또다른 산성 아미노산으로의 치환, 염기성 아미노산의 또다른 염기성 아미노산으로의 치환, 및 이온화가능한 아미노산의 또다른 이온화가능한 아미노산으로의 치환이 포함된다.
코넥신 43에 표적하된 예시적인 펩티드는 하기 표 1에 나타낸다. M1, 2, 3 및 4는 코넥신 43 단백질 각각의 1st 내지 4th 막횡단 영역을 지칭한다. E2는 각각 제1 및 제2 세포외 루프를 지칭한다.
Figure pat00001
표 2는 헤미채널 또는 갭 정션 기능을 억제하는 데 사용된 추가 예시적이 코넥신 펩티드를 제공한다. 다른 실시양태에서, 보존성 아미노산 변화는 펩티드 또는 그의 단편에 만들어진다.
Figure pat00002
표 3은 본원에 기재된 펩티드 억제제를 개발하기 위해 사용되는 코넥신 패밀리 구성원을 위한 세포외 루프를 제공한다. 표 3에서 제공된 펩티드, 및 그의 단편은 특정 비제한적인 실시양태에서 펩티드 억제제로 사용된다. 다른 비제한적인 실시양태에서, 상기 표에서의 펩티드의 약 8 내지 약 15개, 약 11 내지 약 13개의 아미노 인접 아미노산을 포함한 펩티드가 본 발명의 펩티드 억제제이다. 다른 실시양태에서, 보존성 아미노산 변화는 펩티드 또는 그의 단편에 이루어진다. 문헌 [Boitano S. and Evans W. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279: L623-L630 (2000)] 참조.
Figure pat00003
상이한 코넥신 이소형의 E2 도메인 서열은 굵은 글자로 나타낸 펩티드 서열 35 및 펩티드 서열 36에 상동성인 아미노산을 갖는 것으로 나타난다. 펩티드 서열 36의 마지막 4개 아미노산은 4번째 막 도메인의 부분임을 주의한다. 표 4는 본원에 기재된 펩티드 억제제를 개발하기 위해 사용되는 코넥신 패밀리 구성원을 위한 세포외 도메인을 제공한다. 표 4에 제공된 펩티드 및 그의 단편은 특정 비제한적인 실시양태에서 펩티드 억제제로서 사용된다. 다른 비제한적인 실시양태에서, 상기 표에서 펩티드의 약 8 내지 약 15개, 약 11 내지 약 13개의 아미노 인접 아미노산을 포함한 펩티드가 본 발명의 펩티드 억제제이다. 다른 실시양태에서, 보존성 아미노산 변화는 펩티드 또는 그의 단편에서 이루어진다.
Figure pat00004
표 5는 코넥신 40의 세포외 루프 (E1 및 E2)와 관련된 것으로 나타난 코넥신 40의 펩티드 억제제를 제공한다. 굵은 아미노산은 코넥신 40의 막횡단 영역에 관한 것이다.
Figure pat00005
표 6은 코넥신 45의 세포외 루프 (E1 및 E2)와 관련된 것으로 나타난 코넥신 45의 펩티드 억제제를 제공한다. 굵은 아미노산은 코넥신 45의 막횡단 영역에 관한 것이다.
Figure pat00006
특정 실시양태에서는, 특정 펩티드 억제제가 갭 정션의 목적하는 차단없이 헤미채널을 차단하는 것이 바람직하다. 특정 이론 또는 메카니즘에 국한되기 원하지 않지만, 또한 특정 모방체 펩티드 (예를 들어, VCYDKSFPISHVR, 서열 53)는 갭 정션의 비커플링을 야기하지 않고 헤미채널을 차단한다고 여겨진다 (문헌 [Leybeart et al., Cell Commun Adhes 10: 251 - 257 (2003)] 참조). 펩티드 SRPTEKTIFII (서열 54)는 또한, 예를 들어 갭 정션의 비커플링 없이 헤미채널을 차단하는 데 사용될 수 있다. 펩티드 SRGGEKNVFIV (서열 61)는 대조군 서열로서 사용될 수 있다 (문헌 [DeVriese et al., Kidney Internat. 61: 177 - 185 (2002)]). 코넥신 45에 대한 펩티드 억제제의 예로는 YVCSRLPCHP (서열 132), QVHPFYVCSRL (서열133), FEVGFLIGQYFLY (서열 134), GQYFLYGFQVHP (서열 135), GFQVHPFYVCSR (서열136), AVGGESIYYDEQ (서열 137), YDEQSKFVCNTE (서열 138), NTEQPGCENVCY (서열139), CYDAFAPLSHVR (서열 140), FAPLSHVRFWVF (서열 141) 및 LIGQY (서열 142), QVHPF (서열 143), YVCSR (서열 144), SRLPC (서열 145), LPCHP (서열 146) 및 GESIY (서열 147), YDEQSK (서열 148), SKFVCN (서열 149), TEQPGCEN (서열 150), VCYDAFAP (서열 151), LSHVRPWVFQ (서열 152)이 있다. 펩티드는 길이가 단 3개 아미노산일 수 있으며, SRL, PCH, LCP, CHP, IYY, SKF, QPC, VCY, APL, HVR 등을 포함하고, 예를 들어: LIQYFLYGFQVHPF (서열 153), VHPFYCSRLPCHP (서열 154), VGGESIYYDEQSKFVCNTEQPG (서열 155), TEQPGCENVCYDAFAPLSHVRF (서열 156), AFAPLSHVRFWVFQ (서열 157)이 있다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 화학식 1A에서 펩티드의 3 내지 약 30개, 약 8 내지 약 15개, 약 11 내지 약 13개의 인접 아미노산를 포함하는 펩티드는 본 발명의 펩티드 억제제이다.
[화학식 1A]
Figure pat00007
상기 식 중, X1 및 X37은 Leu, Ile, Met 및 Val로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X2는 Thr, Asn, Ser 및 Ala로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X3은 Ala, Ser, Gly 및 Thr로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X4, X18, X29, X40 및 X44는 Val, Ile, Met 및 Leu로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X5는 Gly, Glu, Asp, Ser 및 Ala로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X7, X13, X22 및 X27은 Glu, Asp, Gln 및 Lys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X8, X15 및 X38은 Ser, Ala, Asn 및 Thr로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X9는 Ile, Val, Leu 및 Met로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X10, X11 및 X31은 Tyr, Phe, Trp 및 His로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X12 및 X32는 Asp, Glu 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X14 및 X23은 Gln, Glu, Arg 및 Lys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X16은 Lys, Arg, Glu 및 Gln로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X17 및 X34는 Phe, Tyr 및 Trp로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X20 및 X28은 Asn, Ser, His 및 Asp로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X21은 Thr 및 Ser로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X33 및 X35는 Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X39는 His, Tyr 및 Asn로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X41은 Arg, Lys 및 Gln로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X42 및 X45는 Phe, Tyr, Cys, Leu 및 Tyr로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X43은 Trp, Tyr, Arg, Lys, Cys 및 Phe로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X46은 Gln, His, Glu, Lys, Arg, Asn 및 Asp로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 화학식 1B에서 펩티드의 약 3 내지 약 30게, 약 8 내지 약 15개, 약 11 내지 약 13개의 인접 아미노산을 포함한 펩티드가 본 발명의 펩티드 억제제이다.
[화학식 1B]
Figure pat00008
상기 식 중, X22는 Val, Ile, Met 및 Leu로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X4는 Gly, Glu, Asp, Ser 및d Ala로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X6, X12 및 X26은 Leu, Ile, Met 및 Val로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X7, X32, X38, X44 및 X48은 Ile, Val, Leu 및 Met로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X9 및 X16은 Gln, Glu, Arg 및 Lys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X10, X13 및 X21은 Tyr, Phe, Trp 및 His로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X11, X15, X20 및 X35는 Phe, Tyr 및 Trp로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X18 및 X29는 His, Tyr 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X24 및 X37은 Ser, Ala, Asn 및 Thr로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X25 및 X38은 Arg, Lys 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X31 및 X42는 Lys, Arg, Glu 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X33은 Asp, Glu 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X40 및 X43은 Thr 및 Ser로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X41은 Glu, Asp, Gln 및 Lys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X46 및 X47은 Val, Ile, Met, Leu 및 Phe로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 화학식 2A에서 펩티드의 약 3 내지 약 30게, 약 8 내지 약 15개, 약 11 내지 약 13개의 인접 아미노산을 포함한 펩티드가 본 발명의 펩티드 억제제이다.
[화학식 2A]
Figure pat00009
상기 식 중, X1 및 X44는 Leu, Ile, Met, Val 및 Pro로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X2는 Gly, Glu, Asp, Ser 및 Ala로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X3은 Thr, Ser, Asn 및 Ala로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X4는 Ala, Ser, Gly 및 Thr로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X5, X28, X39 및 X43은 Val, Ile, Met 및 Leu로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X6, X12 및 X26은 Glu, Asp, Gln 및 Lys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X7, X14, X33 및 X37은 Ser, Ala, Asn 및 Thr로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X8 및 X15는 Ala 및 Ser로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X9는 Trp, Tyr 및 Phe로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X11 및 X31은 Asp, Glu 및 Asn로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X13, X21 및 X22는 Gln, Glu, Arg 및 Lys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X16 및 X34는 Phe, Tyr 및 Trp로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X17 및 X40은 Arg, Lys 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X19 및 X27은 Asn, Ser, His 및 Asp로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X20은 Thr 및 Ser로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X30은 Tyr, Phe, Trp 및 His로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X32는 Lys, Arg, Glu 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X36은 Ile, Val, Leu 및 Met로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X38은 His, Tyr 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X41은 Phe, Tyr, Cys, Leu 및 Trp로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X42는 Trp, Tyr, Phe, Arg, Lys 및 Cys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X45는 Gln, His, Glu, Lys, Arg, Asn 및 Asp로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정의 비제한적인 실시양태에서, 화학식 2B에서 펩티드의 약 3 내지 약 30게, 약 8 내지 약 15개, 약 11 내지 약 13개의 인접 아미노산을 포함한 펩티드가 본 발명의 펩티드 억제제이다.
[화학식 2B]
Figure pat00010
상기 식 중, X1, X5 및 X45는 Phe, Tyr, Cys, Trp 및 Leu로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X2는 Glu, Asp, Gln, Gly, His, Arg, Asn 및 Lys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X3, X17 및 X22는 Val, Ile, Met 및 Leu로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X4는 Gly, Glu, Asp, Ser 및 Ala로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X6, X12 및 X26은 Leu, Ile, Met 및 Val로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X7, X32, X36, X44 및 X48은 Ile, Val, Leu 및 Met로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X9 및 X16은 Gln, Glu, Arg 및 Lys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X1O, X13 및 X21은 Tyr, Phe, Trp 및 His로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X11, X15, X20 및 X35는 Phe, Tyr 및 Trp로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X18 및 X29는 His, Tyr 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X24 및 X37은 Ser, Ala, Asn 및 Thr로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X25 및 X38은 Arg, Lys 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X31 및/또는 X42는 Lys, Arg, Glu 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X33은 Asp, Glu 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X40 및 X43은 Thr 및 Ser로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X41은 Glu, Asp, Gln 및 Lys로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; X46 및 X47은 Val, Ile, Met, Leu 및 Phe로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
<펩티드에 대한 친화성 결합 분석법>
풀-다운 분석법(pull-down assay)은 단백질-펩티드 상호작용을 입증하는 데 사용될 수 있다. 이 분석법에서는, 펩티드를 단백질-반응성 또는 융합 태그(tag), 즉 GST (글루타티온-S-트랜스퍼라제)로 태깅할 수 있고, 여기서, GST는 셀룰로스, 아가로스 또는 니켈 비드로의 부착을 통해 단백질-결합 파트너를 포획하고 '풀-다운'하는 데 사용될 것이다. SDS-PAGE 로딩 완충액 또는 별법의 경쟁적 분석물 용출액을 사용하여 복합체를 용출시킨 후, 복합체를 SDS-PAGE 겔에 전개시키고 웨스턴 분석 검출법(Western Analysis detection method)을 이용함으로써 시각화한다. 결합 분석법을 수행하기 위한 당업계에 공지된 방법은 문헌 [Einarson, M.B. and Orlinick, J.R., "Identification of Protein-Protein Interactions with Glutathione S-Transferase Fusion Proteins" In Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 37-57 (2002)], [Einarson, M.B. Detection of Protein-Protein Interactions Using the GST Fusion Protein Pulldown Technique, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.18.55-18.59 (2001)] 및 [Vikis, H.G. and Guan, K.L. Glutathione-S-Transferase-Fusion Based Assays for Studying Protein-Protein Interactions, In Protein-Protein Interactions, Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, 261, Fu, H. Ed. Humana Press, Totowa, N.J., pp. 175-186 (2004)]에 기재되어 있고, 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
단백질 및 펩티드의 상호작용 및 친화성은 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 평가될 수 있고, 이러한 상호작용은 실시간으로 측정될 수 있다 (BIAcore로부터 구입). 이러한 접근법은 저친화성 단백질 상호작용을 검출하는 이점을 갖는다. 표면 플라즈몬 공명은 생체특이적 표면에서 분자의 용액 농도의 변화를 측정하기 위해 사용되는 광학 현상에 따른다. 이러한 신호는 전체 내부 반사의 조건하에 얇은 금속 필름에서 발생한다. 이 신호는 표면과 접촉한 용액의 굴절률에 의존적이다. 용액 중 분자는 굴절률에 있어서 변화를 나타내고, 따라서 생체특이적인 상호작용이 발생하면 측정가능한 신호로 발생한다. 전형적으로, 단백질은 카르복시메틸화된 덱스트란-금 표면 상에 몇몇 가능한 방법 중 하나에 의해 고정된다. 관심있는 상호작용 펩티드는 표면 위에 주입되고, 결합의 동역학은 실시간으로 측정된다. 걸합 분석법을 수행하기 위한 당업계에 공지된 방법은 문헌 [Schuck, P., "Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors", Currrent Opinion in Biotechnology, 8(4):498-502 (1997)] 및 [Zhang, X., Oglesbee, M. "Use of surface plasmon resonance for the measurement of low affinity binding interactions between HSP72 and measles virus nucleocapsid protein." Biological Procedures Online. 5(1): 170-181 (2003)]에 기재되어 있다.
<기능 분석법>
기능 분석법은 모방체 펩티드가 헤미채널의 개방을 차단할 수 있는지 없는지 결정하는 데 이용될 수 있다. IleLa 인간 경부 암 세포주에 Cx43, Cx45, 또는 관심있는 또다른 특정 코넥신을 안정적으로 형질감염시킨다. 세포를 칼슘 무함유 용액 (1 mM EGTA를 함유한 HBSS-HEPES) 중에 인큐베이션시키고, 이는 코넥신 헤미채널을 활성화시키는 것으로 보인다 (문헌 [Braet, K., et al, "Pharmacological sensitivity of ATP release triggered by photoliberation of inositol-1,4,5 -trisphosphate and zero extracellular calcium in brain endothelial cells, Journal of Cellular Physiology", 197(2): p. 205-213 (2003)], [DeVries, S.H. and E.A. Schwartz, "Ilemi-gap-junction channels in solitary horizontal cells of the catfish retina." Journal of Physiology, 445: p. 201-230 (1992)] 및 [Li, H., et al, Properties and regulation of gap junctional hemichannels in the plasma membranes of cultured cells. Journal of Cell Biology, 134(4): p. 1019-1030 (1996)] 참조). 이어서, 세포를 1 mM EGTA 및 2 mM 프로피듐 요오디드를 함유한 HBSS-HEPES 용액 중 30 분 동안 인큐베이션할 것이다. 프로피듐 요오디드는 막 불투과이지만 작은 분자량 때문에 헤미채널을 통과할 수 있는 형광 염료이다. 프로피듐 요오디드 흡수는 형광 현미경을 이용하여 측정될 것이다. 모방체 펩티드의 존재하에 세포를 프로피듐 요오디드과 함께 인큐베이션하여 염료 흡수가 방지될 수 있는지 측정할 것이다.
<폴리뉴클레오티드 및 핵산 코넥신 억제제>
안티센스 화합물은 또한 특정 실시양태에서 사용될 수 있다. 안티센스 화합물은 특이적인 코넥신 이소형에 표적화되는, 안티센스 데옥시뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, RNAi 및 데옥시라이보자임과 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이는 단백질 이소형의 번역을 감소시키고 세포 갭 정션의 기능을 간섭한다. 이러한 안티센스 화합물의 투여는 코넥신 발현이 하향조절되는 부위에서 갭-정션-매개의 세포-세포 신호전달을 감소시킨다.
안티센스 화합물은, 예를 들어, 바이러스성, 진균성 및 대사성 질환에 연관된 유전자의 발현을 조절하는 데 사용된다. 미국 특허 제5,166,195호는 HIV의 올리고뉴클레오티드 억제제를 제안한다. 미국 특허 제5,004,810호는 헤르페스 심플렉스 바이러스 Vmw65 mRNA에 혼성화하여 복제를 억제하는 올리고머를 제안한다.
올리고뉴클레오티드를 비롯한 안티센스 화합물은 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 기능을 조절하고, 생산되는 코넥신 양을 치밀하게 조절하는 데 있어서의 용도를 위해 제공된다. 이는, 예를 들어, 코넥신을 코딩하는 핵산, 바람직하게는 mRNA와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 달성된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 코넥신 mRNA의 전체 또는 일부에 혼성화한다. 전형적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 코넥신 mRNA의 리보솜 결합 영역 또는 코딩 영역에 혼성화한다. 폴리뉴클레오티드는 코넥신 mRNA 영역의 전부 또는 일부에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 코넥신 mRNA의 전부 또는 일부에 정확히 상보적일 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 코넥신의 전사 및/또는 번역을 억제할 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 코넥신 유전자 전사 및/또는 번역의의 특이적인 억제제이고, 다른 유전자의 전사 및/또는 번역을 억제하지 않는다. 생성물은 (i) 코딩 서열의 5'으로, 및/또는 (ii) 코딩 서열로, 및/또는 (iii) 코딩 서열의 3'으로 코넥신 유전자 또는 mRNA에 결합할 수 있다. 일반적으로 안티센스 폴리뉴클레오티드는 세포에서 코넥신 mRNA 및/또는 단백질의 발현을 감소시킬 것이다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 코넥신 mRNA에 대한 안티센스이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 코넥신 mRNA에 혼성화할 수 있고, 전사, mRNA 프로세싱, 핵으로부터의 mRNA 전달, 번역 또는 mRNA 퇴화를 포함한 코넥신 mRNA 대사의 하나 이상의 관점을 간섭함으로써 코넥신 발현을 억제할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 코넥신 mRNA에 혼성화하여 이중나선을 형성하고, 이는 mRNA의 직접적인 번역 억제 및/또는 탈안정화를 야기할 수 있다. 이러한 이중나선은 뉴클레아제에 의해 퇴화되기 쉬울 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드와 mRNA의 혼성화는 mRNA의 하나 이상의 정상 기능을 간섭한다. 간섭받는 mRNA의 기능으로는, 모든 생체 기능, 예를 들어, 단백질 번역 부위로의 RNA의 전위, RNA로부터 단백질로의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 수득하기 위한 RNA의 스플라이싱, 및 RNA에 의해 보증될 수 있는 촉매적 활성이 포함된다. RNA에 대한 특이적 단백질(들)의 결합은 또한 RNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 혼성화에 의해 간섭될 수 있다.
mRNA 기능 간섭의 총체적인 효과는 코넥신 발현의 조절이다. 본원에서, "조절"은 억제 또는 촉진; 즉, 발현에 있어서의 감소 또는 증가를 포함한다. 이러한 조절은 당업계의 통상적인 방법으로, 예를 들어 mRNA 발현의 노던 블로팅 검사법(Northern blot assay), 또는 역 트랜스크립타제 PCR (본 출원의 실시예에 교시된 바와 같음), 또는 단백질 발현의 웨스턴 블로팅(Western blot) 또는 ELISA 검사법, 또는 단백질 발현의 면역침강 분석법에 의해 측정될 수 있다. 세포 증식 또는 종양 세포 성장에 대한 효과는 본 출원의 실시예에 교시된 바와 같이 측정될 수 있다. 현재 억제가 바람직하다.
표적 부위(들)이 일단 확인되면, 표적에 충분히 상보적이도록, 즉 충분히 잘 혼성화하고 충분한 특이성을 가져서 목적하는 조절을 얻도록 올리고뉴클레오티드를 선택한다. 안티센스 핵산 (DNA, RNA, 변형, 동족체 등)은 핵산을 제조하기 위한 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 다른 코넥신 단백질에 대한 올리고데옥시뉴클레오티드는 임의의 당업계의 인지된 접근법, 예를 들어, 컴퓨터 프로그램 MacVector 및 OligoTech (Oligos etc.Eugene, Oregon, USA)에 의해 이들의 뉴클레오티드의 관점에서 선택될 수 있다. MacVector 및 OligoTech (from Oligos etc. Eugene, Oregon, USA)를 포함하여, 이러한 합성을 위한 장치는 몇몇 판매처로부터 구입할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드와 관련한 일반적인 방법에 대해서는, 문헌 [Antisense RNA and DNA, D. A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988))]를 참조한다. 또한, 문헌 [Dagle et al, Nucleic Acids Research, 19: 1805 (1991)]를 참조한다. 안티센스 요법에 대하여, 예를 들어, 문헌 [Uhlmann et al, Chem. Reviews, 90: 543-584 (1990)]을 참조한다. 전형적으로, 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 발현 억제를 목적으로 하는 코넥신에 대해 공지된다. 폴리뉴클레오티드 표적은 유전자 워킹 기술(gene walking technique) 및 워킹 PCR에 의해 추가로 확인될 수 있다. 공지된 뉴클레오티드 서열에 인접한 공지되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하기 위한 이러한 접근법은 당업계에 공지되어 있다. 워킹 PCR의 기재에 대하여, 예를 들어, 문헌 [Parker J.D., et al. Nucleic Acids Res 19:3055-60 (1991)]를 참조한다. 상기 모든 문헌들 뿐만 아니라 본원에 참조된 다른 문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 바람직하게는, 안티센스 화합물은 하나 이상의 특이적인 코넥신 이소형에 표적화된다. 특정 코넥신 이소형은, 예를 들어, 이들의 일시적인 또는 공간적인 발현에 기초하여 표적화될 수 있다. 갭 정션은 혈관 조직에서 발현되고, 특정 실시양태에서, 혈관 조직 (예를 들어, 내피 세포)에서 발현된 코넥신 이소형이 표적화된다. 문헌 [Camelliti P. et al., Cardiovasc. Res. 62: 414 - 425 (2004)]을 참조한다. 내피 세포, 내피 전구 세포 및 평활근 세포는 코넥신 37, 40, 43 및 45를 발현하는 것으로 보고된 바 있다. 문헌 [De Wit, (2004)]; [Haefliger et al, (2004)], [Sohl and Willecke, (2004)] 및 [Szmitko et al, (2003)] 참조. 또한, 코넥신 43은 상처 부위에 인접한 혈관에서 상승조절되는 것으로 보고된 바 있다. 문헌 [Qiu C et al, Current Biology, 13: 1967 - 1703 (2003)].
다른 실시양태에서는, 다른 이소형이 표적화된다. 안티센스 화합물에 의해 표적화될 수 있는 특이적 이소형의 코넥신은 제한 없이 45, 43, 37, 31.1, 26, 및 본원에 기재된 다른 것들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-코넥신 화합물은 코넥신 43, 45 및/또는 40을 표적으로 하고, 다르게는, 항-코넥신 화합물은 코넥신 7, 32 및/또는 26을 표적으로 한다. 하나 이상의 코넥신이 표적화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나의 항-코넥신 화합물은 하나 이상의 코넥신 (예를 들어, 코넥신 43 및 코넥신 45)을 표적으로 한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 항-코넥신 화합물은 제제 또는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)에 포함된다. 임의의 코넥신이 본원에 개시되거나 당업계에 공지되거나 이후에 밝혀지는 하나 이상의 항-코넥신 화합물에 의해 표적화될 수 있다는 것이 본 발명에서 예상되었다.
표적 코넥신이 인간인 것이 바람직하지만 필수적이지는 않다. 코넥신은, 예를 들어, 서열 12-31로부터 선택된 핵염기 서열을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 서열 12-31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 8개 이상의 핵염기에 표적화된다.
코넥신 표적은 조작하거나 리모델링하고자 하는 조직의 유형에 따라 달라질 것이며, 본 발명에 사용된 안티센스 폴리뉴클레오티드의 정확한 서열은 표적 코넥신 단백질에 따라 좌우될 것이다. 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 코넥신 단백질(들)은 하향조절이 직접 관련된 부위에 따라 좌우될 것이다. 이것은 코넥신 하위-단위 조성물의 관점에서 신체를 통해 상이한 부위에서 갭 정션(들)의 불균일 제조를 반영한다. 그러나, 일부 코넥신 단백질은 조직 파괴에 있어서 다른 것들보다 더 편재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 단독으로 또는 조합으로 코넥신 45, 43, 26, 37, 30 및/또는 31.1 (예를 들어, 서열 12-31 참조)에 대해 표적화될 수 있고, 이것은 각막의 조작 또는 리모델링 적용에 적합하다. 본 발명의 한 측면에서, 올리고데옥시뉴클레오티드는 비변형 포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 본 발명의 또다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
특정의 비제한적인 예에서, 안티센스 화합물은 엑손, 인트론, mRNA 스플라이싱 부위 (엑손-엑손 또는 인트론-엑손 정션), 5 '-비번역 영역 및 3 '-비번역 영역을 비롯한 코넥신 mRNA 또는 전-mRNA 분자의 특이적 영역에 표적화된다.
또한, 별도의 코넥신 단백질에서 표적화된 올리고뉴클레오티드는 조합으로 사용될 수 있는 것으로 예상된다 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 상이한 코넥신이 표적화될 수 있음). 예를 들어, 코넥신 45에 표적화된 ODN, 및 코넥신 패밀리의 하나 이상의 구성원 (예컨대, 코넥신 43, 26, 30, 31.1, 37 및 43)은 함께 사용될 수 있다. 또한, 개별 안티센스 폴리뉴클레오티드가 특정 코넥신에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 표적 1, 2, 3 또는 그 이상의 싱이한 코넥신을 표적으로 할 수 있음이 예상된다. 특이적인 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 코넥신 사이에 보존되지 않은 코넥신 유전자 또는 mRNA에 있는 서열을 표적으로 할 것이지만, 비-특이적인 폴리뉴클레오티드는 보존 서열을 표적으로 할 것이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 인간 코넥신 26, 코넥신 30, 코넥신 31.1, 인간 코넥신 37, 코넥신 43, 코넥신 45를 코딩하는 핵산 분자의 8개 이상의 핵염기에 표적화되고, 여기서 상기 안티센스 화합물은 상기 환자의 눈과 연관된 세포에서 인간 코넥신 단백질의 발현을 억제한다.
특정 실시양태에서, 코넥신에 상응하는 핵산 분자는 본 출원에 열거된 서열에 포함된 서열 12-31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는다 (예를 들어 상보적, cDNA 부분, 코넥신 단백질 코딩 부분 등을 포함하는 것에 상응함). 특정 실시양태에서, 조성물은 2개 이상의 인간 코넥신 단백질을 표적으로 하고, 2개 이상의 인간 코넥신 단백질 발현을 억제한다. 추가의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 코넥신 43에 대한 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC (서열 1); GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (서열 2); 및 GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (서열 3)이 포함된다. 코넥신 26에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA (서열 4)를 갖는다. 선택된 코넥신 37에 대한 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로는 5' CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC 3' (서열 5) 및 5' CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG 3' (서열 6)이 포함된다. 선택된 코넥신 30에 대한 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로는 5' CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC 3' (서열 7) 및 5' TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG 3' (서열 8)이 포함된다. 선택된 코넥신 31.1에 대한 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로는 5' CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C 3' (서열 9); 5' AGA GGC GCA CGT GAG ACA C 3' (서열 10); 및 5' TGA AGA CAA TGA AGA TGT T 3'(서열 11)이 포함된다.
추가 실시양태에서, 하기 서열로부터 선택된 올리고데옥시뉴클레오티드는 특히 코넥신 43 발현의 하향조절에 적합하다:
5' GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC 3' (서열 1)
5' GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC 3' (서열 2); 및
5' GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT 3 ' (서열 3)
또다른 실시양태에서, 하기 서열의 군으로부터 선택된 올리고데옥시뉴클레오티드는 특히 코넥신 26, 37, 30 및 31.1에 적합하다:
5' TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA 3' (코넥신 26) (서열 4)
5' CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC 3' (코넥신 37) (서열 5)
5' CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG 3 ' (코넥신 37) (서열 6)
5' CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC 3' (코넥신 30) (서열 7)
5' TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG 3' (코넥신 30) (서열 8)
5' CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C 3'(코넥신 31.1) (서열 9)
5' AGA GGC GCA CGT GAG ACA C 3 ' (코넥신 31.1) (서열 10)
5' TGA AGA CAA TGA AGA TGT T 3' (코넥신 31.1) (서열 11)
본원에 제공되는 안티센스 화합물은 일반적으로 약 8 내지 약 40개의 핵염기 (즉 약 8 내지 약 40개의 연결된 뉴클레오시드), 및 보다 전형적으로 약 12 내지 약 40개의 핵염기, 및 보다 더 전형적으로 약 30개의 핵염기를 포함하는 것들을 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함한 안티센스 화합물은 약 40개 이상, 예를 들어 약 60개 이상 또는 약 80개 이상 길이의 뉴클레오티드, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 또는 3000개 이상까지 길이의 뉴클레오티드일 수 있다. 적합한 안티센스 화합물로는, 예를 들어, 30 mer ODN이 포함된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 서열 12-31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화된다. 다른 실시양태에서, 안티센스 화합물은 서열 12-31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 약 10개 이상, 약 12개 이상, 약 14개 이상, 약 16개 이상, 약 18개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 약 30개 이상, 및 약 35개 이상의 핵염기에 표적화된다. 인간 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 약 8 내지 35개 이상의 핵염기에 표적화되는 올리고뉴클레오티드를 비롯한 안티센스 화합물의 크기는 길이가 8개 이상의 핵염기, 8 내지 100개의 핵염기, 8 내지 50개의 핵염기, 8 내지 40개의 핵염기, 10 내지 50개의 핵염기, 12 내지 50개의 핵염기, 14 내지 50개의 핵염기, 16 내지 50개의 핵염기, 18 내지 50개의 핵염기, 20 내지 50개의 핵염기, 25 내지 50개의 핵염기, 15 내지 35개의 핵염기 등일 수 있다. 본 발명의 다른 안티센스 화합물은 더 작거나 더 큰 크기일 수 있으며, 예를 들어 길이가 100개 이상의 핵염기일 수 있다.
안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드(ODN), 안티센스 폴리뉴클레오티드, 데옥시라이보자임, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, RNAi 분자 또는 그의 동족체, siRNA 분자 또는 그의 동족체, PNA 분자 또는 그의 동족체, DNA자임 또는 그의 동족체, 5'-말단-돌연변이된 U1 소형 핵 RNA 및 그의 동족체를 포함한다.
본원에 제공된 안티센스 화합물은 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)의 사용을 포함할 수 있다. ODN은 일반적으로 그 길이가 뉴클레오티드 약 20개이며, 전-mRNA 및 mRNA에 혼성화되어 리보뉴클레아제 H(RNase H)(형성된 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 가닥을 특이적으로 분해함)에 대한 기질을 형성함으로써 작용한다. RNase H의 활동을 억제하는 방식으로 변형된 경우, ODN은 입체적 장애를 통해 mRNA의 번역을 억제하거나, 또는 전-mRNA의 스플라이싱을 억제할 수 있다. ODN 및 이들의 변형물은 삼중 나선의 형성에 의해 전사를 억제하기 위해 dsDNA를 표적하는 데 사용되어 왔다. ODN은 당업계의 인지된 자동화 합성 방법에 의해 수득할 수 있으며, 이는 임의의 서열을 갖는 ODN을 수득하고 안티센스 염기쌍을 통해 유전자 발현을 차단하기가 비교적 수월하다.
특정 측면에서, ODN의 포스포디에스테르 주쇄는 변형되어 유전자 발현을 차단하기 위한 표적-특이적인 제제로서의 효능을 증가시킬 수 있다. 이러한 주쇄 변형물을 개발하여 ODN의 안정성을 개선시키고 이들의 세포 흡수성을 향상시킨다. 가장 널리 사용되는 변형물은 비가교 산소를 황 원자로 대체하여 포스포로티오에이트 ODN을 생성한 것이다. 하나 이상의 포스포로티오에이트 ODN이 FDA에 의해 승인되었으며, 여러 가지 다른 포스포로티오에이트 안티센스 ODN은 다양한 암 및 염증성 질환에 대한 초기 단계의 임상 시험이 진행중인 중이다.
유전자 기능 차단과 연관된 ODN의 활동 메카니즘은 ODN의 주쇄에 따라 달라진다(문헌 [Branch, A. D. Hepatology 24, 1517-1529(1996)]; [Dias, N. and Stein, C. A. Mol. Cancer Thor. 1, 347-355(2002)]; [Stein, C. A. and Cohen, J. S., Cancer Res. 48, 2659-2668(1988)]; [Zon, G. Ann. N. Y. Acad Sci., 616, 161-172(1990)]). 순 음성으로 하전된 ODN, 예컨대 포스포디에스테르 및 포르포로티오에이트는 표적 mRNA의 RNAse H-매개된 절단을 유도한다. RNAse H를 보충하지 않은 다른 주쇄 변형은, 전하 또는 표적 RNA와 형성된 나선 유형의 부족 때문에 입체적 장애 ODN으로 분류될 수 있다. 일반적으로 사용되는 후자 군의 구성원은 모르폴리노, U-O-메틸, 2"-O-알릴, 잠긴(locked) 핵산 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. 이들 ODN은 다른 억제 표적에서 스플라이싱, 번역, 핵-세포질 수송 및 번역을 차단할 수 있다.
또다른 측면에서, 코넥신 발현의 조절은 라이보자임의 사용을 포함한다. 라이보자임은 단백질의 완전한 부재하에서도 효소로서 작용하는 RNA 분자이다. 이들은 현저한 특이성을 갖는 공유 결합을 파괴하고/하거나 형성하여, 표적화된 반응의 자발적인 속도를 수십배 가속시키는 촉매 활성을 갖는다.
라이보자임은 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 RNA에 결합하고, 포스포디에스테르 주쇄의 가수분해를 촉매함으로써 표적 RNA를 분해하는 작용을 한다. 여러 가지 상이한 군의 라이보자임이 존재하며, 이 중 '해머헤드(hammerhead)' 라이보자임이 가장 널리 연구되고 있다. 그의 명칭이 암시하는 바와 같이, 해머헤드 라이보자임은 그의 표적 mRNA와 혼성화되었을 때 독특한 2차 구조를 형성한다. 라이보자임에서 촉매적으로 중요한 잔기는 표적 RNA 절단 부위 측면에 존재하는 표적-상보적 서열의 측면에 위치한다. 라이보자임에 의한 절단은 2가의 이온, 예컨대 마그네슘 이온을 필요로 하며, 또한 표적 RNA의 구조 및 접근가능성에 의존적이다. 세포 내에서 위치 신호를 사용하여 라이보자임을 표적 RNA와 함께 국부화시키면, 이들의 사일런싱 효율이 크게 증가한다. 해머헤드 라이보자임은 화학적으로 합성되거나 벡터로부터 전사될 수 있을 정도로 충분히 짧아, 세포 내에서 라이보자임이 계속 생성되도록 한다.
촉매로서 작용하는 RNA의 능력은 처음 테트라히메나 테르모필라(Tetrahymena thermophila)의 자가-스플라이싱 I군 인트론 및 RNAse의 RNA 잔기에 대해 입증되었다. 상기 2가지 RNA 효소가 발견된 후에, RNA-매개된 촉매작용은 효모, 진균 및 식물 미토콘드리아(및 엽록체) 단일-가닥 식물 비로이드(viroid) 및 바이러스양(virusoid) RNA, 델타 간염 바이러스 및 뉴로스포사 크라사(Neurospora crassa) 미토콘드리아의 위성 RNA의 자가-스플라이싱 II군 인트론과 연관된 것으로 밝혀졌다. 라이보자임은 천연적으로 발생하지만, 시스(동일한 핵산 가닥 상) 또는 트랜스(비공유 결합 핵산)로 특정 서열을 발현 및 표적화하기 위해 인공적으로 조작될 수도 있다. 시험관내 선별 프로토콜을 이용하여 새로운 생화학적 활동이 개발되고 있을 뿐만 아니라, RNA보다는 기질 상에서 작용하는 새로운 라이보자임 모티프가 생성되고 있다.
T. 테르모필라 I군 인트론은 우선 라이보자임을 시스-절단하여 트랜스-반응 형태(본 발명자들은 인트론/라이보자임으로 지칭함)로 전환시켜 게놈 연구 및 가능한 치료 둘다에 유용하게 만든다. 트랜스-스플라이싱 반응에서, 표적화된 mRNA에 결손된 엑손은 인트론/라이보자임에 공유 결합에 의해 부착된 정확한 엑손으로 교환할 수 있다. 이는 스플라이싱 반응을 통해 일어나는데, 여기서 인트론에 부착된 엑손을 염기쌍에 의해 표적 mRNA에 위치시킴으로써 에스테르교환 반응에서 표적 전사체의 5" 말단에 공유 결합될 수 있도록 한다. 이 반응은 야생형 서열을 겸상적혈구 글로빈 전사체 및 돌연변이 p53 전사체로 트랜스-스플라이싱하고, 근긴장성이영양증 대립유전자 중 단백질 키나제 전사체의 3"-UTR에서 확장된 3중 가닥을 대체하는 데 사용되어 왔다.
엔도리보뉴클레아제 RNAse P는 자연 전체의 유기체에서 발견되었다. 이 효소는 RNA 및 자신이 단리되는 유기체에 따라 하나 이상의 단백질 성분을 갖는다. 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 효소로부터의 RNA 성분은 단백질 교환자인 특정 염 및 이온성 조건의 부재하에 부위-특이적인 절단제로서 작용할 수 있다. 인간 및 박테리아 효소에 필요한 기질에 대한 연구는 효소에 대한 최소 기질이 수송 RNA 분자의 절편과 유사하다는 것을 밝혀내었다. 이러한 구조는 표적 RNA와 쌍을 형성하는 독특하게 설계된 안티센스 RNA에 의해 모방할 수 있으며, 시험관 및 세포 둘다에서 RNAse P-매개된 부위-특이적 절단에 대한 기질로서 작용한다. 또한, 안티센스 성분이 RNAse P RNA에 공유 결합되어 효소만을 해당 표적 RNA로 향하게 할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 연구자들은 해당 표적 mRNA와 쌍을 형성하여 표적의 부위-특이적 절단을 자극하고, 세포 배양물에서 허피스 심플렉스 바이러스 및 사이토메갈로바이러스를 표적화시켜 억제하기 위한 안티센스 RNA의 설계에 상기 특성을 이용하였다.
다수의 작은 식물 병원성 RNA(비로이드, 위성 RNA 및 바이러스양 RNA), N. 크라사 미토콘드리아 DNA 플라스미드로부터의 전사체 및 동물 델타 간염 바이러스는 단백질의 부재하에 시험관내에서 자가-절단 반응을 수행한다. 이 반응은 중성 pH 및 Mg2 +를 필요로 한다. 자가-절단 반응은 생체내 롤링-서클(rolling-circle) 복제 메카니즘의 필수 부분이다. 이러한 자가-절단 RNA는 서열 및 절단 부위 부근에 형성된 2차 구조에 따라 하위군으로 분류될 수 있다. 작은 라이보자임은 단일-가닥 식물 비로이드 및 바이러스양 RNA에서 발견되는 모티프로부터 유래되었다. 공유된 2차 구조 및 뉴클레오티드의 보존된 세트에 기초하여, 용어 "해머헤드"가 상기 자가-절단 도메인 중 하나의 군에 주어졌다. 해머헤드 라이보자임은 30개의 뉴클레오티드로 이루어져 있다. 해머헤드 촉매 도메인은 그의 간단한 구조 때문에 트랜스-작용 라이보자임 설계시 널리 선택된다. 왓슨-크릭 염기쌍을 사용하여, 해머헤드 라이보자임은 임의의 표적 RNA를 절단하도록 설계될 수 있다. 절단 부위에 필요한 것은 상대적으로 간단하고, 사실상 임의의 UH 서열 모티프(H가 U, C 또는 A임)가 표적화될 수 있다.
제2의 식물-유래된 자가-절단 모티프(처음에 타바코 윤문병 위성 RNA의 음성 가닥에서 확인됨)는 "헤어핀(hairpin)" 또는 "페이퍼크립(paperclip)"으로 지칭한다. 헤어핀 라이보자임은 가역 반응으로 RNA 기질을 절단하여 2"를 생성하고, 이 촉매적 모티프의 Y-시클릭 포스페이트 및 5"-히드록스T1 말단-조작된 형태도 다양한 표적의 다수 카피를 트랜스로 절단하여 턴오버(turn over)시킨다. 헤어핀에 대한 기질 요건은 GUC를 포함하는 것이며, G의 바로 위 상류에서 절단이 일어난다. 헤어핀 라이보자임은 절단 반응에 보다 자주 사용되기는 하지만 라이게이션 반응을 촉매하기도 한다.
해머헤드 및 헤어핀 라이보자임 둘다는 세포에서 특이적인 세포 및 바이러스 표적을 하향조절하는 데 널리 사용되어 왔다. 하셀로프(Haseloff) 및 겔라흐(Gerlach)는 염기쌍이 올바른 표적을 갖도록 아암(arm)을 변형시킴으로써 임의의 표적을 절단하도록 조작될 수 있는 해머헤드 모티프(문헌 [Haseloff and Gerlach; Nature. Aug 18; 334(6183):585-91(1988)])를 설계하였다. 라멤자니(Ramemzani) 등은 연구를 통해 상기 해머헤드 라이보자임 모티프가 잠재적인 치료 용도를 갖는다는 것을 입증하였으며, 상기 연구에서는 항-인간 면역결핍 바이러스(HIV) gag 라이보자임을 발현하도록 조작된 세포를 사용하여 바이러스 유전자의 발현 및 복제를 사실상 완전하게 억제하였다(문헌 [Ramezani A. et al., Frontiers in Bioscience 7:a, 29-36;(2002)]).
또다른 측면에서, 코넥신 발현의 조절은 촉매적 DNA(또는 DNA자임)의 사용을 포함한다. RNA 표적을 부위 특이적으로 절단할 수 있는 작은 DNA를 시험관내 시험을 통해 개발하였다(공지되어 있는 천연 발생 DNA 효소가 없기 때문임). 상이한 절단 부위 특이성을 갖는 2가지 상이한 촉매 모티프가 확인되었다. 가장 통상적으로 사용되는 10 내지 20개의 효소는, 해머헤드 및 헤어핀 라이보자임과 마찬가지로 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 이들의 RNA 기질에 결합하고 표적 RNA를 부위 특이적으로 절단하여 2; 3"-시클릭 포스페이트 및 5"-OH 말단을 생성한다. 표적 mRNA는 절단되어 분해되고, DNA자임은 재순환되어 다수의 기질을 절단한다. 촉매적 DNA는 합성에 비용이 비교적 적게 들고 양호한 촉매 특성을 갖기 때문에, 안티센스 DNA 또는 라이보자임에 대한 대안으로 유용하다.
veg FmRNA의 억제 및 그의 결과로서의 혈관신생 방지, 및 만성 골수성 백혈병의 특징인 bcr/abl 융합 전사체 발현의 억제와 같은, 세포 배양물에서의 여러가지 DNA자임의 용도가 공개되어 있다. 촉매적 DNA는 외부에서 전달될 수 있으며, 이들은 담체의 부재하에 전신 전달에 가장 적합하도록 하기 위해 주쇄를 변형시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 구성적 코넥신 유전자의 조절은 모르폴리노 주쇄 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다(미국 특허 제5,034,506호(Summerton, J. E. and Weller, D. D.)).
본 발명의 다른 측면에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시키고 세포 진입 효율을 증가시키기 위해 화학적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 포스포티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드의 절편 및 변형된 올리고데옥시 또는 올리고리보뉴클레오티드의 적절하게 위치한 절편을 포함하는 혼합된 주쇄 올리고뉴클레오티드(MBO)가 사용될 수 있다. MBO는 포스포로티오에이트 결합의 절편 및 다른 변형된 올리고뉴클레오티드의 다른 절편, 예컨대 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, N3'P5'-포스포르아미데이트 및 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 및 이들의 2'-O-알킬 동족체, 및 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트를 가질 수 있으며, 이들은 비-이온성이고 뉴클레아제 또는 2'-O-알킬올리고리보뉴클레오티드에 대한 내성이 높다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 통상적으로 헤테로시클릭 염기이다. 상기 헤테로시클릭 염기의 2가지 가장 공통적인 군은 퓨린 및 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유 결합된 포스페이트기를 더 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드의 경우, 포스페이트기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 잔기에 결합할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 형성시, 포스페이트기는 인접한 뉴클레오시드와 서로 공유 결합하여 선형 중합체성 화합물을 형성한다. 이어서, 상기 선형 중합체 구조의 각 말단은 추가로 결합되어 고리형 구조를 형성할 수 있으나, 개방된 선형 구조가 일반적으로 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트기는 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 사이 주쇄를 형성하는 것으로 지칭된다. RNA 및 DNA의 정상적인 결합 또는 주쇄는 3'-5' 포스포디에스테르 결합이다.
본 발명에 유용한 안티센스 화합물은 변형된 주쇄 또는 비-천연 뉴클레오시드 사이 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드는 주쇄에 인 원자를 보유하는 것과 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본원에서, 뉴클레오시드 사이 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드도 올리고뉴클레오시드로 간주될 수 있다.
본 발명에 유용한 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄를 갖는 안티센스 화합물은, 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트(3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트 포함), 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 비롯한 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 결합된 동족체, 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2' 결합되어 있는 전도된 극성을 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리산 형태도 포함된다.
한 측면에서, 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄가 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 사이 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 사이 연결, 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드 사이 연결에 의해 형성된 주쇄를 갖는다는 것이 고려된다. 이들은 모르폴리노 결합(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 주쇄; 실록산 주쇄; 술피드, 술폭시드 및 술폰 주쇄; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 주쇄를 함유하는 알켄; 술파메이트 주쇄; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 주쇄; 술포네이트 및 술폰아미드 주쇄; 아미드 주쇄; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분부를 갖는 다른 주쇄를 포함한다.
한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 모방체의 당과 뉴클레오시드 둘 사이의 연결, 즉 뉴클레오티드 단위 주쇄가 신규한 군으로 대체되는 것을 고려한다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지되었다. 올리고머 화합물이 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 상기 올리고뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산(PNA)으로 지칭한다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-주쇄는 주쇄, 특히 아미노에틸글리신 주쇄를 함유하는 아미드로 대체된다. 핵염기는 주쇄 아미드 부분의 아자 질소 원자를 보유하여 이에 직접 또는 간접적으로 결합한다. PNA 화합물에 대한 추가의 교시 내용은 문헌 [Nielsen et al.(Science, 254, 1497-1500(1991))]에서 찾아볼 수 있다.
한 측면에서, 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드 및 헤테로원자 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오시드, 및 특히 --CH2--NH--O--CH2--, --CH--2N(CH)3--O--CH--2[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 주쇄으로 공지되어 있음], --CH2--O--N(CH3)--CH2-, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --O--N(CH3)--CH2--CH2--[천연 포스포디에스테르 주쇄는 --O--P--O--CH2--로 나타냄]를 갖는 것이 고려된다. 또다른 측면에서, 모르폴리노 및 아미드 주쇄 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드도 고려된다.
또다른 측면에서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 치환된 당 잔기를 함유할 수 있다는 것도 고려된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 OH; F; O--, S-- 또는 N-알킬, O-알킬-O-알킬, O--,S--, N-알케닐, 또는 O--, S-- 또는 N-알키닐(여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬 또는 C2-C10 알케닐 및 알키닐임) 중 하나를 포함한다. O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)2ON(CH3)2, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2(여기서, n 및 m은 1 내지 약 10임)가 특히 바람직하다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 C1-C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 개재된 기(intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약물동력학 특성을 개선시키기 위한 기 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학 특성을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기 중 하나를 포함할 수 있다. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시(2'--O--CH2CH2OCH3, 2'--0--(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 공지되어 있음)(문헌 [Martin et al. Helv. Chim. Acta 1995, 78, 486-504]), 알콕시알콕시기일 수 있다. 다른 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉 O(CH2)2ON(CH3)2기(2'-DMAOE로도 공지되어 있음), 및 2'-디메틸아미노-에톡시에톡시(2'-DMAEOE), 즉 2'--O--CH2--O--CH2--N(CH2)2를 포함한다.
변형이 2'-메톡시(2'--O--CH3), 2'-아미노프로폭시(2'--OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 더 포함할 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 유사한 변형이 올리고뉴클레오티드의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상에 존재하는 당의 3' 위치, 또는 2'-5' 결합된 올리고뉴클레오티드 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 일어날 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 당 모방체, 예컨대 시클로부틸 잔기를 가질 수도 있다.
또다른 측면에서, 핵염기(당업계에서 간단하게 "염기"라고도 지칭함)의 변형 또는 치환을 포함할 수 있다는 것이 고려된다. 본원에 사용된 "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C 또는 m5c), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티오-1,8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히, 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호, 문헌 [Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering 1990, pages 858-859(1990), [Kroschwitz, J. John Wiley ＆ Sons, Englisch et al. (Angewandte Chemie, International Edition, 30, 613-722(1991))] 및 [Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press(1993)]에 개시된 것을 포함한다. 상기 핵염기 중 몇몇은 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 비롯한 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6 내지 1.2℃만큼 핵산 이중가닥 안정성을 증가시키는 것으로 나타났으며(문헌 [Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, pages 276-278(1993)]), 현재는 염기 치환이 바람직하며, 보다 더 구체적으로는 이를 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합하는 것이 바람직하다.
또다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드의 변형이 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포내 분포 또는 세포내 흡수를 향상시키는 하나 이상의 잔기 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드와 화학적으로 결합시키는 것을 포함한다는 것이 고려된다. 상기 잔기는 지질 잔기, 예컨대 콜레스테롤 잔기(문헌 [Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6553-6556(1989)]), 콜산(문헌 [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 4, 1053-1059(1994)]), 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올(문헌 [Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 660, 306-309(1992)]; [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765-2770(1993)]), 티오콜레스테롤(문헌 [Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 20, 533-538(1992)]), 지방족쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌 [Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 10, 1111-1118(1991)]; [Kabanov et al., FEBS Lett., 259, 327-330(1990)]; [Svinarchuk et al., Biochimie 1993, 75, 49-54(1993)]), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651-3654(1995)]; [Shea et al., Nucl. Acid Res., 18, 3777-3783(1990)]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜쇄(문헌 [Manoharan et al., Nucleosides ＆ Nucleotides, 14, 969-973(1995)]), 아다만탄 아세트산(문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654(1995)]), 팔미틸 잔기(문헌 [Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237(1995)]), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 잔기(문헌 [Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277, 923-937(1996)])을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 키메라 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드의 사용이 고려된다. 본원의 "키메라" 올리고뉴클레오티드 또는 "키메라"는 각각 하나 이상의 뉴클레오티드를 구성하는 둘 이상의 화학적으로 별개인 영역을 함유하는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는, 통상적으로 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 분해에 대한 내성이 증가하고, 세포 흡수성이 증가하고/하거나 표적 핵산에 대한 결합 친화성이 증가하도록 하기 위해 변형시키는 영역을 하나 이상 함유한다. 올리고뉴클레오티드의 부가적인 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 이중가닥의 RNA 가닥을 절단하는 세포내 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H가 활성화되면 RNA 표적을 절단하여 유전자 발현에 대한 안티센스 억제 효율을 현저하게 향상시킨다. RNA 표적의 절단은 통상적으로 겔 전기영동법, 및 필요한 경우에는 당업계에 공지된 관련 핵산 혼성화 기술에 의해 검출될 수 있다. 이러한 RNA 표적의 RNAse H-매개된 절단은 라이보자임을 사용하여 핵산을 절단하는 것과는 명확하게 구별된다.
키메라 올리고뉴클레오티드의 예에는 3개의 구분된 영역에 존재하고, 정상적으로는 화학적으로 서로 동등하지만 갭과는 별개인 2개의 영역 측면에 위치하는 중앙 영역을 갖는 "갭머(gapmer)"가 있으나, 이에 한정되지 않는다. 갭머의 바람직한 예는 올리고뉴클레오티드의 중앙 부분("갭")이 RNase H에 대한 기질로 작용하는 올리고뉴클레오티드이며, 바람직하게는 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 한편 측면에 위치하는 부분(5' 및 3' "윙(wing)")은 변형되어 보다 큰 표적 RNA 분자에 대한 친화성을 갖지만 뉴클레아제 활성(예를 들어, 플루오로- 또는 2'-O-메톡시에틸-치환됨)을 지지할 수는 없다. 키메라 올리고뉴클레오티드는 당 위에서 변형된 것들로만 한정되지 않으나, 변형된 주쇄, 예를 들어 포스포로티오에이트(P=S) 및 포스포디에스테르(P=O) 주쇄 결합 영역 또는 MMI 및 P=S 주쇄 결합 영역을 갖는 올리고뉴클레오시드를 포함할 수도 있다. 다른 키메라는 "윙머(wingmer)"를 포함하며, 이는 당업계에 "헤미머(hemimer)"로도 공지되어 있는 2개의 구분된 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 윙머의 바람직한 예에서, 올리고뉴클레오티드의 5' 부분은 RNase H에 대한 기질로서 작용하며 바람직하게는 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되어 있고, 3' 부분은 보다 큰 표적 RNA 분자에 대한 친화성을 갖도록 하는 방식으로 변형되지만 뉴클레아제 활성(예를 들어, 2'-플루오로- 또는 2'-O-메톡시에틸-치환됨)을 지지하기 못하거나, 또는 이와 반대일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당 잔기 위에 2'-O-메톡시에틸(2'--O--CH2CH2OCH3) 변형을 함유한다. 이러한 변형은 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성 및 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성 둘다를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 하나의, 다수의 또는 모든 뉴클레오티드 하위단위가 2'-O-메톡시에틸(--O--CH2CH2OCH3) 변형을 보유할 수 있다. 2'-O-메톡시에틸 변형을 갖는 다수의 뉴클레오티드 하위단위를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 내에서 임의의 뉴클레오티드 하위단위 상에 상기 변형을 가질 수 있으며, 키메라 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 21-O-메톡시에틸 변형과는 별도로 또는 이에 더하여, 안티센스 효과, 효능 또는 표적 친화성을 향상시키는 다른 변형을 함유하는 올리고뉴클레오티드도 고려된다.
또한, 본 발명은 이중-가닥 또는 이중가닥 코넥신 핵산(예를 들어, 코넥신 RNA의 폴딩된 영역 또는 코넥신 유전자)에 결합하여 삼중 나선-함유, 또는 "삼중가닥" 핵산을 형성하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA, RNA, PNA 등)를 제공한다. 삼중 나선이 형성되면 예를 들어, 코넥신 유전자의 전사를 방지하여 세포에서 코넥신 활성을 감소시키거나 제거함으로써 코넥신 발현을 억제한다. 임의의 특정 메카니즘에 얽매이는 것은 아니지만, 삼중 나선 형성은 폴리머라제, 전사 인자 또는 조절 분자가 결합하기에 충분하게 개방되는 이중 나선의 능력을 손상시킨다.
삼중가닥 올리고- 및 폴리뉴클레오티드는 삼중 나선 형성에 대한 염기쌍 형성 규칙(예를 들어, 문헌 [Cheng et al., J. Biol. Chem. 263:15110(1988)]; [Ferrin and Camerini-Otero, Science 354:1494(1991)]; [Ramdas et al., J. Biol. Chem. 264:17395(1989)]; [Strobel et al., Science 254:1639(1991)]; 및 [Rigas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9591(1986)] 참조), 및 코넥신 mRNA 및/또는 유전자 서열을 이용하여 제작하였다. 통상적으로, 삼중가닥-형성 올리고뉴클레오티드는 코넥신 RNA 또는 유전자의 특이적인 서열에 "상보적"인 약 10 내지 약 25개, 또는 이보다 긴(즉, 안정한 삼중 나선을 형성할 정도도 크고, 바람직한 경우에는 전달하는 방식에 따라 다르지만 생체내 투여하기에 충분할 정도로 갖음) 뉴클레오티드로부터의 특이적인 서열을 포함한다. 본원에서, "상보적"은 안정한 삼중 나선을 형성할 수 있는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드를 코넥신 유전자의 조절 영역(예를 들어, 코넥신 5'-측면에 위치한 서열, 프로모터 및 인헨서) 또는 전사 개시 부위(전사 개시 부위로부터 -10 내지 +10 영역)에 특이적으로 결합하도록 설계한다. 최근의 삼중가닥 DNA를 이용한 치료적 진보를 검토하기 위해, 문헌 [Gee et al., in Huber and Carr, 1994, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NY] 및 [Rininsland et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :5854(1997)]를 참조한다.
또한, 본 발명은 코넥신 활성의 억제에 유용한 라이보자임을 제공한다. 라이보자임은 코넥신 mRNA에 결합하고 이를 특이적으로 절단하여 불활성화시킨다. 유용한 라이보자임은 코넥신 mRNA에 상보적인 5'- 및 3'-말단 서열을 포함할 수 있으며, 코넥신 mRNA 서열에 기초하여 당업자에 의해 조작될 수 있다. I군 인트론 라이보자임(문헌 [Cech, Biotechnology 13:323(1995)]) 및 다른 해머헤드 라이보자임(문헌 [Edgington, Biotechnology 10:256(1992)])의 특성을 갖는 것을 포함한다는 것이 고려된다.
라이보자임은 절단 부위, 예컨대 GUA, GUU 및 GUC를 갖는 것을 포함한다. 절단 부위를 함유하는 표적 코넥신 유전자의 영역에 상응하는 길이가 15 내지 20개 리보뉴클레오티드인 짧은 RNA 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 보다 바람직하게 할 수 있는 2차 구조 특성에 대해 평가할 수 있다. 또한, 절단 부위의 적합성은 리보뉴클레아제 보호 분석을 이용하여 상보적 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대한 접근가능성을 시험하거나, 공지된 표준 절차에 따라 시험관내 라이보자임 활성에 대해 시험함으로써 평가할 수 있다.
안티센스 및 라이보자임 기능이 단일 올리고뉴클레오티드에서 조합될 수 있는 안티센스 화합물이 추가로 고려된다. 또한, 라이보자임은 본원에 제공된 예시적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 기재와 함께 상기에 기재된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사이의 변형된 결합을 포함한다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭(RNAi)과 같은 방법에 의해 코넥신 활성을 억제하는 데 유용한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 유전자를 억제시키는 상기 기술 및 다른 기술이 당업계에 공지되어 있다. 상기 기술에 대한 내용은 문헌 [Science 288 :1370-1372(2000)]에 기재되어있다. RNAi는 전사후 수준에서 작동하며, 서열 특이적이다. 상기 과정은 부분적이거나 완전한 이중-가닥 특성을 갖는 RNA, 상기 RNA의 전구체 또는 이를 코딩할 수 있는 전구체를 세포 또는 세포외 환경에 도입하는 것을 포함한다.
미국 특허 제6,506,559호(Fire et al.)에 기재된 바와 같이, RNA는 하나 이상의 중합체화된 리보뉴클레오티드 가닥을 포함할 수 있다. 이중-가닥 구조는 단일 자가-상보적 RNA 가닥 또는 2가지 상보적 RNA 가닥에 의해 형성될 수 있다. RNA는 포스페이트-당 주쇄 또는 뉴클레오시드 중 하나에 대한 변형을 포함한다. RNA 이중가닥 형성은 세포의 내부 또는 외부에서 개시될 수 있다.
몇몇 연구에서 하나 이상의 리보뉴클레아제가 이중-가닥 RNA에 특이적으로 결합하여 짧은 단편으로 절단한다는 것을 입증하였다. 리보뉴클레아제(들)은 상기 단편과 결합된 상태로 남아있고, 이어서 상보적 mRNA, 즉 코넥신 유전자에 대해 전사된 mRNA 가닥에 특이적으로 결합한다. 이 코넥신 유전자에 대한 mRNA는 또한 리보뉴클레아제(들)에 의해 짧은 가닥으로 분해되어 코넥신 유전자의 번역 및 발현을 방지함으로써 코넥신 활성을 억제한다. 또한, RNA 폴리머라제는 짧은 단편의 다수의 카피의 합성을 용이하게 하는 작용을 할 수 있고, 이로써 시스템의 효율이 기하급수적으로 증가한다. 이러한 유전자 억제 경로의 독특한 특성은 사일런싱이 이것이 개시되는 세포에만 한정되지 않는다는 것이다. 유전자-사일런싱 효과는 유기체의 다른 부분으로 전해질 수 있고 생식 계열을 통해 수 세대에 걸쳐 전달될 수도 있다.
한 측면에서, RNAi의 이중-가닥(ds)RNA-의존성 유전자 특이적인 전사후 사일런싱 전략은 짧은 간섭 RNA(siRNA)의 사용을 포함한다. 일반적인 RNAi 접근법의 이용은 특정 용도, 예컨대 긴 dsRNA 분자에 대한 반응에서 활성화된 포유동물 세포에서의 비특이적인 항바이러스 방어 메카니즘 등으로 제한된다(문헌 [Gil J, Esteban M, "Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase(PKR): Mechanisms of action". Apoptosis 2000, 5:107-114]). 21개 뉴클레오티드 RNA의 합성 이중가닥이 일반적인 항바이러스 방어 메카니즘을 유발하지 않고 포유동물 세포에서 유전자 특이적인 RNAi를 매개할 수 있다는 것을 입증함으로써 본 발명의 분야가 진보하였다(문헌 [Elbashir S, et al., "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature, 411:494-498(2001)]; [Caplen N. et al., Proc Natl Acad Sci, 98:9742-9747(2001)]). 따라서, siRNA는 점점 유전자-특이적인 조절에 대한 강력한 도구로서 인정받고 있다.
본원에 기재된 바와 같이, RNAi는 말단 이펙터 분자가, 예를 들어 작은 21 내지 23개-뉴클레오티드 안티센스 RNA 등인 다수의 공통적인 생화학적 성분을 공유하는 일종의 관련 유전자-사일런싱 메카니즘을 포함한다. 한 메카니즘은 상대적으로 긴 dsRNA 트리거(trigger)를 사용하며; 이는 세포내 효소 다이서(Dicer)에 의해, 짧은, 예를 들면 21 내지 23개-뉴클레오티드 dsRNA(siRNA로 지칭함)로 프로세싱된다. 표적 RNA에 상보적인 siRNA의 가닥은 다중-단백질 복합체(RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC)로 지칭함)로 혼입되며, 여기서 표적 부위 내에서의 mRNA의 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 대한 안내자로 작용한다. 이로써 전체 mRNA가 분해되고, 이어서 안티센스 siRNA가 재순환될 수 있다. 보다 하등한 유기체에서, RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 또한 프라이머로서 어닐링된 안내자 siRNA를 사용하고(표적 앞으로 보다 많은 dsRNA를 생성함), 이어서 다이서 기질로서 작용한다(보다 많은 siRNA를 생성하여 siRNA 신호를 증폭시킴). 이러한 경로는 통상적으로 식물에서 바이러스 방어 메카니즘으로 이용된다.
본원에 기재된 바와 같이, siRNA는 2가지 별개의 어닐링된 단일 가닥(예를 들어, 21 내지 23개 뉴클레오티드 등)으로 구성될 수 있으며, 여기서 2개의 말단 3"-뉴클레오티드는 분리되어 있다(3" 오버행(overhang)). 별법으로, siRNA는 단일 스템-루프(stem-loop) 형태일 수 있으며, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로 지칭되기도 한다. 통상적으로는, shRNA의 안티센스 가닥도 si/shRNA의 센스 파트너 가닥에 대해 완전하게 상보적이지만, 항상 그런 것은 아니다.
포유동물 세포에서, 긴 dsRNA(보통, 길이가 뉴클레오티드 30개를 초과함)는 단백질 키나제 R 및 2;5"-올리고아데닐레이트 신테타제를 활성화시키는 인터페론 경로를 촉진한다. 인터페론 경로의 활성화는 번역의 광범위한 하향조절 뿐만 아니라 광범위한 RNA 분해를 초래할 수 있다. 그러나, 포유동물 세포에 대해 외부에서 도입된 보다 짧은 siRNA가 인터페론 경로를 우회하는 것으로 보고되었다.
또한, siRNA 안티센스 생성물이 내생 마이크로RNA로부터 유래될 수 있다. 인간 세포에서는, 초기 형태(siRNA 및 마이크로RNA) 또는 프로세싱 경로와는 상관없이, mRNA와 완전하게 상동성인 성숙한 최종(예를 들어, 21 내지 23개-뉴클레오티드 등의) 안티센스 RNA가 mRNA를 직접 절단할 것이다. 일반적으로, siRNA와 표적 부위 사이의 미스매치(mismatch) 효과는 활성을 거의 없애지 않을수도 또는 활성을 완전하게 없앨 수도 있으며, 그 원인은 부분적으로만 이해되고 있으나 하나 이상의 경우에는 부분적인 상동성이 mRNA 번역을 억제하기 때문일 것이다. 일반적으로, 원형의 마이크로RNA-표적 상호작용을 흉내내도록 설계된 표적-미스매치 siRNA는 mRNA에서의 특이적인 상호작용 및 표적 부위의 수에 따라 달라지는 번역 억제 정도를 매개할 수 있다. RNAi는 미리 형성된 siRNA의 외부에서의 전달에 의해 또는 siRNA 또는 shRNA의 프로모터-기재의 발현을 통해 활성화될 수 있다.
짧은 간섭 RNA(siRNA)는 화학적으로 합성되거나 DNA-기재의 벡터 시스템에 의해 생성될 수 있다. 일반적으로, 이는 효율적으로 프로세싱되어 세포에서 siRNA를 형성하는 짧은 헤어핀(sh)RNA의 전사를 포함한다(문헌 [Paddison P, Caudy A, Hannon G: Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 99: 1443-1448(2002)]; [Paddison P, Caudy A, Bernstein E, Hannon G, Conklin D: Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes ＆ Dev, 16:948-958(2002)]; [Sui G, et al., Proc Natl Acad Sci, 8:5515-5520(2002)]; [Brummelkamp T, et al., Science, 296:550-553(2002)]). 따라서, 본원에서는, siRNA를 조직-특이적인 표적화 및 유전자 발현의 조절에 효과적인 전략으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오티드는 보통 통상적으로 공지된 고상 합성 기술을 통해 제조될 수 있다. 상기 합성에 이용되는 장치는 당업계에 공지된 몇몇 판매자에 의해 시판되고 있다. 상기 합성에 사용되는 임의의 다른 수단도 사용될 수 있으며, 올리고뉴클레오티드의 실제 합성법은 당업계에 공지되어 있다. 2'-O-메톡시에틸 올리고뉴클레오티드를 비롯한 올리고뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 및 2'-알콕시 또는 21-알콕시알콕시 유도체를 제조하는 데 유사한 기술을 사용하는 것도 공지되어 있다(문헌 [Martin, P. Helv. Chim. Acta, 78, 486-504(1995)]). 형광 표지된, 바이오티닐화되거나 또는 다른 것이 접합된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해, 유사한 기술, 및 시판되는 개질된 아미디트 및 세공-제어된 유리(CPG) 생성물, 예컨대 바이오틴, 플루오레세인, 아크리딘 또는 프소랄렌-개질된 아미디트 및/또는 CPG(글렌 리서치사(Glen Research; 버지니아주, 스털링)로부터 시판됨)를 사용하는 것도 공지되어 있다.
<방법>
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 화합물을 투여함으로써 대상체(예를 들어, 환자), 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포를 치료하는 방법을 포함한다.
특정 실시양태는 혈관 장애가 있는 대상체에게 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 코넥신 헤미채널의 발현, 형성 또는 활성을 억제할 수 있는 본원에 제공된 다른 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관 장애가 있는 대상체, 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다. 혈관 장애에는, 예를 들어 동맥, 혈관, 및 혈관 및/또는 심혈관계와 연관된 장애 또는 상태, 및 기관 또는 조직과 연관된 장애 또는 상태가 포함된다. 대표적인 예에는, 아테롬성동맥경화증, 미세혈관 장애, 대혈관 장애, 졸중, 뇌혈관 질환(뇌허혈), 혈전증, 외상(예를 들어, 피하 상처, 스텐트 설치술, 재협착, 또는 혈관성형술)으로부터 생긴 혈관 손상, 글루코스 수준의 증가(당뇨병)로 인해 생긴 혈관 손상, 당뇨성 망막병증, 사지의 혈관 질환, 기관 허혈 및 내피세포 혼란이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
또다른 실시양태는 염증성 장애를 가진 대상체, 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포에 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 코넥신 헤미채널의 발현, 형성 또는 활성을 억제할 수 있는 본원에 제공된 다른 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시양태는 이식조직 또는 이식편 수술과 연관된 환자에게 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 코넥신 헤미채널의 발현, 형성 또는 활성을 억제할 수 있고 이식조직 또는 이식편 수술과 연관된 조직 부종을 억제하거나 예방할 수 있는 본원에 제공된 다른 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 이식조직 또는 이식편 수술과 연관된 대상체, 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시양태는 심근 경색증 및 이와 연관된 심장 질환이 있는 대상체에게 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 코넥신 헤미채널의 발현, 형성 또는 활성을 억제할 수 있는 본원에 제공된 다른 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 심근 경색증 및 이와 연관된 심장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시양태는 관상동맥 질환이 있는 대상체, 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포에 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 코넥신 헤미채널의 발현, 형성 또는 활성을 억제할 수 있는 본원에 제공된 다른 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 관상동맥 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시양태는 초기 허혈성 손상 및 속발성 재관류 손상을 비롯한 허혈과 연관된 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시양태는 심근 경색증 및 이와 연관된 심장 질환이 있는 대상체에게 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 코넥신 헤미채널의 발현, 형성 또는 활성을 억제할 수 있는 본원에 제공된 다른 화합물을 심장과 연관된 허혈성 상태의 치료를 위한 다른 공지된 치료법 또는 절차(예를 들어, 이 거명을 통해 전문이 본원에 포함되어 있는 문헌 [Baker D.W. et al.(ACC/AHA Guidelines for the Evaluation and Management of Chronic Heart Failure in the Adult, 2001; American College of Cardiology and the American Heart Association]에 기술되어 있는 것)와 병용하여 공동-투여하는 것을 포함하는, 심근 경색증 및 관련 심장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 절차에는, 예를 들어 심장 이식술, 수술 및 기계적 방법, 승모판막 수리 또는 혈류역학 대체 및 임상 개선, 순환기 보조를 위한 체외 장치, 좌심실 보조 장치, 기계적 감압술, 좌심실축소술(바티스타(Batista) 절차), 심근성형술 및 허혈성 심근병증을 가진 환자의 관리를 위한 다양한 동맥류절제 절차가 포함된다.
이식술 및 다른 수술 또는 의료 장치는, 예를 들어 (a) 항-코넥신 제제 또는 조성물을 이식물 또는 장치에 직접 부착시킴(예를 들어, 이식물 또는 장치에 중합체/약물 필름을 도포하거나, 이식물 또는 장치를 중합체/약물 용액에 담그거나, 또는 다른 공유 또는 비공유 수단으로); (b) 이식물 또는 장치를 히드로겔과 같은 물질로 코팅한 다음 항-코넥신 조성물(또는 상기 항-코넥신 인자)을 흡수시킴; (c) 항-코넥신 조성물로 코팅된 실(또는 실 내에 형성된 중합체 자체)을 이식물 또는 장치에 섞어짬; (d) 이식물 또는 장치를 항-코넥신 조성물로 구성되거나 코팅된 슬리브 똔느 메시로 삽입시킴; (e) 이식물 또는 장치 자체를 항-코넥신 제제 또는 조성물로 제작함; 또는 (f) 이식물 또는 장치를 달리 조절하여 항-코넥신 제제를 방출시킴을 포함하는 다양한 방식으로 본 발명의 제제(예를 들어, 항-코넥신 화합물 및 조성물)로 코팅(또는 방출되기에 적합한 다른 것)될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 조성물은 보관 동안 및 삽입 순간에 이식물 또는 장치에 강하게 부착되어야 한다. 항-코넥신 제제 또는 조성물은 또한 바람직하게는 보관 동안, 삽입 전 또는 체내로 삽입 후(필요시) 체온에서 가온될 때, 분해되지 말아야한다. 또한, 바람직하게는 스텐트 외곽은 변형되지 않으면서 이식물 또는 장치는 균일 분포된 항-코넥신 제제로 부드럽고 고르게 코팅되어야 한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항-코넥신 제제 또는 조성물은 투여되면 항-코넥신 인자를 이식물 또는 장치를 둘러싼 조직 내로 균일하고 예측가능하게 지속방출되어야 한다. 혈관 스텐트에 있어서, 상기 특성 외에, 조성물은 스텐트 응혈(혈병 형성을 야기함), 또는 혈류내 상당한 와류(스텐트가 코팅되지 않았을 때 일으킬 것으로 기대되는 것 초과로)를 일으키지 말아야 한다.
항-코넥신 화합물, 조성물 및 본원에 제공된 방법은 이식물, 의학 및 수술 장치 등을 사용하는 다양한 절차에서 사용할 수 있다. 한 측면에서, 이식물, 수술 장치 또는 스텐트는 본원에 제공된 임의의 항-코넥신 제제로 코팅되거나, 또는 달리 제작되어 항-코넥신 제제를 함유하고/거나 방출한다. 대표적인 예에는 심혈관 장치(예를 들어, 이식가능한 정맥 카테터, 정맥 포트, 터널화된 정맥 카테터, 간동맥 주입 카테터를 비롯한 만성 주입 라인 또는 포트, 심박조율기 와이어, 이식가능한 세동제거기); 신경학/신경수술 장치(예를 들어, 심실 복막 션트, 심실 동맥 션트, 신경 자극 장치, 추궁절제술후 경막외 섬유증을 예방하기 위한 경막 패치 및 이식물, 지속적인 지주막하 주입을 위한 장치); 위장 장치(예를 들어, 만성 내재 카테터, 영양관, 및 션트), 안과 이식물(예를 들어, 다중 이식물 및 혈관신생 녹내장을 위한 다른 이식물, 익상편을 위한 약물 용리, 누낭비강연결술(dacrocystalrhinostomy) 실패를 위한 부목, 각막 혈관신생을 위한 약물 용리 콘택트 렌즈, 당뇨성 망막병증을 위한 이식물, 고위험 각막 이식을 위한 약물 용리 콘택트 렌즈); 이비인후 장치(예를 들어, 아교이 또는 만성 이염을 위한 고막경유 배출의 별법으로서 소골 이식물, 귀인두관 부목 또는 스텐트); 성형외과 이식물(예를 들어, 흉근하 또는 유선하 방법 또는 유방절제술 후의 겔- 또는 염수-함유 유방 이식물 또는 턱 이식물에 대한 섬유성 수축 예방), 및 정형외과 이식물(예를 들어, 시멘트 정형외과 보철물)이 포함된다.
안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 본원에 제공된 다른 화합물은 특정 실시양태에서 미리정한 시간에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 코넥신 헤미채널 발현, 형성 또는 활성은 내피세포에서 억제된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 졸중을 포함하는 혈관 장애에 대해 치료될 수 있다. 대상체는 허혈을 포함하는 혈관 장애에 대해 치료될 수 있다. 상기 허혈은, 예를 들어 조직 허혈, 심근 허혈 또는 뇌허혈일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 치료되는 대상체는 허혈에 의한 신경학적 기능 손실의 위험이 있다. 다른 실시양태에서, 대상체는 허혈에 의해 야기되는 중추 신경계 또는 말초 신경계에서 세포 사멸 또는 퇴행을 치료하거나 개선시키는 것을 포함하는 혈관 장애에 대해 치료될 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드, 또는 본원에 제공된 다른 화합물을 대상체에서 수행한 혈관 또는 관상동맥 시술과 관련하여 투여한 혈관 장애에 대해 치료될 수 있다. 다른 실시양태에서, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 또는 본원에 제공된 다른 화합물은 상기 혈관 또는 관상동맥 시술 동안 투여된다.
본원에 제공된 화합물은 선별된 시점 전에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. "선별된 시점"은, 예를 들어 심혈관 장애, 염증, 혈관 장애, 또는 허혈성 사건과 같은 장애 또는 상태의 발병, 또는 혈관 또는 관상동맥 시술과 같은 의학 절차의 수행에 상응할 수 있다. 본원에 제공된 화합물(예를 들어, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 등)은, 예를 들어 선별된 시점 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 화합물은 선별된 시점 후 즉시, 및 약 24시간 이하에 투여된다. 다른 실시양태에서, 화합물은 선별된 시점 후 약 1시간 이내, 선별된 시점 후 약 2시간 이내, 선별된 시점 후 약 3시간 이내, 선별된 시점 후 약 4시간 이내, 선별된 시점 후 약 5시간 이내, 선별된 시점 후 약 6시간 이내, 선별된 시점 후 약 8시간 이내, 선별된 시점 후 약 10시간 이내, 선별된 시점 후 약 12시간 이내, 선별된 시점 후 약 14시간 이내, 선별된 시점 후 약 16시간 이내, 선별된 시점 후 약 20시간 이내, 선별된 시점 후 약 24시간 이내에 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물은 환자에서 수행된 심장 수술 또는 다른 수술과 관련하여 투여된다. 본원에서 지칭하는 "선별된 시점"은 손상 시간, 절차(예를 들어, 심장 또는 혈관 절차 등)의 수행 시간을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물은 혈관 절차를 수행하기 위한 의료 장치와 관련하여 투여한다.
특정 실시양태에서, 치료되는 혈관 장애는 1종 이상의 허혈성 졸중, 일과성 허혈성 발작, 뇌내 출혈, 지주막하 출혈, 혈전색전성 졸중, 정맥 혈전증, 폐 색전증, 색전성 졸중, 뇌혈관 장애, 말초 폐색성 동맥 질환, 동정맥 기형, 및 동맥류로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 치료되는 혈관 장애는 1종 이상의 관상동맥 심장 질환, 관상동맥 혈관 장애, 아테롬경화성 혈관 질환, 아테롬경화성 플라크 파열, 및/또는 고혈압과 연관된 혈관 장애인 혈전색전성 장애, 심근 경색증, 협심증, 허혈성 심장 질환, 대동맥 장애, 말초 동맥 질환, 섬유근 이형성증, 모야모야병(moyamoya disease), 및 혈전혈관염과 연관된다.
특정 실시양태에서, 치료되는 염증성 장애는 1종 이상의 관절염, 류마티스 관절염 (RA), 염증, 관절의 파괴 또는 손상, 염증성 장애, 그레이브병(grave's disease), 하시모토병(hashimoto's disease), 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군(shogrens syndrome), 면역성 혈소판감소성 자반증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 경피증, 건선, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 결장염, 패혈증 및 패혈성 쇼크, 및 소화계의 자가면역 질환으로부터 선택된다.
다른 특정 실시양태에서, 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포는 1종 이상의 지혈과 연관된 상태, 혈전증, 섬유소용해, 심혈관 질환, 당뇨병, 심장에 영향을 미치는 내분비 장애, 임신과 연관된 심혈관 질환, 류마티스열, HIV-감염과 연관된 심혈관 장애, 심장 질환과 연관된 혈액학적 및 종양학적 장애, 심장 질환과 연관된 신경학적 장애, 및 심장 질환과 연관된 신장 장애에 대해 치료된다.
다른 특정 실시양태에서, 대상체, 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포는 심부전, 선천성 심장 질환, 소아 후천성 심장 질환, 판막성 심장 질환, 감염성 심내막염, 심근병증, 심장 종양, 심막 심장 질환, 외상성 심장 질환, 폐 색전증, 폐 고혈압, 폐 심장증, 및 스포츠 심장 증후군, 말초 동맥 순환 장애, 기관계에 영향을 미치는 혈관 장애, 중추 신경계에 영향을 미치는 혈관 장애, 뇌에 영향을 미치는 혈관 장애, 망막에 영향을 미치는 혈관 장애, 신장에 영향을 미치는 혈관 장애, 신경에 영향을 미치는 혈관 장애, 미세혈관 장애 및 대혈관 장애와 연관된 이식조직 또는 이식편 수술과 관련하여 치료된다. 상기 대상체는 심장 이식조직, 신장 이식조직, 간 이식조직, 폐 이식조직, 췌장 이식조직, 장 이식조직, 또는 복합 기관 이식조직 중 하나 이상으로부터 선택된 것과 연관된 이식조직 또는 이식편 수술로 치료될 수 있다. 상기 대상체는 1종 이상의 눈 조직, 피부, 심장 판막, 뼈, 건, 정맥, 인대, 골수 이식조직, 치아 또는 검 조직, 성형 수술과 연관된 이식편 또는 주입물, 고관절 교체 시슬와 연관된 이식편 또는 주입물, 및 줄기 세포와 관여된 조직 이식편 또는 주입물로 치료될 수 있다.
특정 메카니즘에 결부되거나 한정되지 않고, 특정 실시양태에서 대상체, 표적 기관, 표적 조직 또는 표적 세포는 목적하는 효과, 예를 들어 허혈 또는 외상에 따른 척수내 부종 예방, 허혈 또는 외상에 따른 조직(예를 들어, 뇌, 시신경, 척수 및 심장내) 내 혈관벽 분해 예방, 부종 및 염증이 증상으로 나타나거나, 또는 혈관 지고병이 지속 염증의 결과로서 나타나는 염증성 관절염 및 다른 염증성 장애의 치료, 혈관 지고병의 예방으로 사지 허혈이 회복되는 각막의 아급성 또는 만성 상처 치료, 재상피화를 촉발시키기 위한 수단으로서의 각막의 아급성 또는 만성 상처 치료, 상피 회복을 촉발시키고 아급성 사지 허혈을 회복시키기 위한 눈에서의 화학적 화상의 치료, 지속된 혈관 지고병을 예방하여 조직 허혈로부터 회복될 아급성 또는 만성 피부 상처 또는 당뇨성 궤양의 치료, 선도연에서의 코넥신 43의 지속된 발현이 재상피화를 예방하는 만성 피부 상처 또는 당뇨성 궤양의 치료, 뇌실로 직접 또는 척주/척수를 통해 전달되는 코넥신 모방체 펩티드를 사용한 출생전후 허혈의 치료, 뇌실로 직접 또는 척주/척수를 통해 전달되는 코넥신 모방체 펩티드를 사용하는 출생전후 허혈에 따른 부종의 억제 또는 예방, 전신으로 전달되는 코넥신 모방체 펩티드를 사용하는 출생전후 허혈의 치료, 뇌실로 직접 또는 척주/척수를 통해 전달되는 코넥신 모방체 펩티드를 사용하는 졸중 또는 CNS 허혈의 치료, 전신으로 전달되는 코넥신 모방체 펩티드를 사용하는 졸중 또는 CNS 허혈의 치료, 허혈에 따른 뇌에서의 간질양 활성의 예방, 뇌에서의 간질양 활성(예를 들어, 간질)의 예방, 안티센스 폴리뉴클레오티드에 특이적인 코넥손 모방체 펩티드 또는 코넥신을 사용하는 조직 부종의 예방, 및/또는 병변 확산, 기관 이식술에 따른 재관류의 부종(및 거부반응)의 예방 중 하나 이상을 달성하기 위한 목적으로 코넥손(헤미채널)에 결합하거나 이를 조절할 수 있는 항-코넥신 화합물을 투여하여 치료된다.
또다른 측면에서, 본 발명의 화합물은코넥신, 헤미채널 또는 갭 정션의 발현, 형성 또는 활성을 조절하기에 바람직한 양으로 투여된다.
임의의 메카니즘에 결부되거나 한정되지 않으며 임의의 제한 없이, 특정 실시양태에서 표적 코넥신 헤미채널은 세포 세포질성 막에 위치하고, 상기 세포의 세포질 유래 분자를 세포외 공간으로 바람직하지 않게 전달하는 것의 억제에 영향을 미치는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 임의의 특정 메카니즘에 한정되지 않으면서, 특정 실시양태에서, 손상된 조직에 대해 세포 생존 및/또는 조직 복구 증진에 유효한 양의 혈액의 재관류를 촉진시키기 위해, 중추 신경계에 대한 졸중 또는 손상 후 내피세포 혼란을 억제시킴으로써 혈뇌 장벽을 유지하기 위해, 조직 손상에 따른 혈관 통합을 유지하기 위해, 또는 이식조직 또는 이식편 수술과 연관된 조직 부종을 억제하거나 예방하기 위해, 혈관 내피세포 통합을 유지함으로써 심장내 진행중인 경색증 및 재관류 손상을 억제 또는 예방할 수 있는 본원에 제공된 화합물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
<제약 조성물>
또다른 측면에서, 본 발명은 안티센스 화합물 및 모방체 펩티드를 비롯하여 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
본원에 제공된 안티센스 화합물은 제약상 허용되는 염 및 전구약물을 비롯하여 생물학적으로 동등한 화합물을 포함할 수 있다. 이는 임의의 제약상 허용되는 염, 에스테르, 또는 상기 에스테르의 염, 또는 인간을 비롯한 동물에게 투여하였을 때 생물학적으로 활성인 대사물 또는 잔기를(직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 펩티드는 변형되어 신체내에서 이들의 안정성을 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 합성 측쇄는 첨가 후 서로 연결되어 고리형이 되는 펩티드를 생성시킬 수 있다. 이러한 고리화는 또한, 신체내 주입후 프로테아제 활성에 의해 선형이 되는 전구약물을 함께 형성하는 N- 및 C-말단과 연결함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본 개시문은 핵산의 제약상 허용되는 염 및 상기 핵산의 전구약물도 포함한다. "제약상 허용되는 염"은 본원에 제공된 핵산의 생리학상 및 제약상 허용되는 염, 즉 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 있으나 이에 대해 원치않는 독소 효과를 나타내지 않는 염이다(예를 들어, 문헌 [Berge et al., J. of Pharma Sci., 66, 1-19(1977)] 참조).
펩티드 또는 그의 변이체는 시험관내에서, 예를 들어 고체상 펩티드 합성법 또는 효소 촉매화 펩티드 합성 또는 재조합 DNA 기술의 도움으로 합성될 수 있다. 고체상 펩티드 합성법으로는 문헌 [Stewart et al., Solid Phase Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco(1969)]; [Merrifield, J Am. Chem. Soc. 85 2149(1963)]; [Meienhofer in "Hormonal Proteins and Peptides," ed.; CH. Li, Vol.2(Academic Press, 1973), pp.48-267] 및 [Bavaay and Merrifield, "The Peptides," eds. E. Gross and F. Meienhofer, Vol.2(Academic Press, 1980) pp.3-285]에 기술되어 있는 방법이 확립되어 있고, 널리 사용된다. 이들 펩티드는 면역친화성 또는 이온-교환 컬럼상 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카상 또는 음이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스(Sephadex) G-75겔을 사용한 겔 여과; 리간드 친화성 크로마토그래피; 또는 비극성 용매 또는 비극성/극성 용매 혼합물로부터의 결정화 또는 침전에 의해 추가로 정제될 수 있다. 결정화 또는 침전에 의한 정제가 바람직하다.
본 발명의 제약 제제화는 임의의 성분으로서 제약상 허용되는 담체, 희석제, 용해제 또는 유화제 및 당업계에서 유용한 유형의 염을 포함할 수 있다. 상기 물질의 예에는 생리 식염수, 예컨대 생리적으로 완충 식염수 및 물이 포함된다. 본 발명의 제약 제제화에 유용한 담체 및/또는 희석제의 구체적인 비제한적 예에는 물 및 생리적으로 허용되는 완충 식염수, 예컨대 포스페이트 완충 식염수 pH 7.0-8.0가 포함된다. 적합한 제약 담체에는 멸균수, 염 용액(예컨대, 링거 용액), 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물(예컨대, 락토스, 아밀로스 또는 전분), 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 제약 제제는 멸균되고, 보조제, 예를 들어 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색화제 및/또는 유해하게 활성 화합물과 반응하지 않는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다. 이들은 또한 바람직한 다른 활성 물질, 예를 들어 효소 억제제와 조합하여 대사성 분해를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체의 카르복실기의 염은 펩티드를 1종 이상의 목적 염기, 예를 들어 금속성 수산화 염기(예를 들어, 수산화나트륨); 금속탄산염 또는 이탄산염 염기(예컨대, 탄산나트륨 또는 이탄산나트륨); 또는 아민 염기(예컨대, 트리에틸아민, 트리에탄올아민 등)의 등가물과 접촉시키는 통상의 방식으로 제조될 수 있다.
펩티드 또는 펩티드 변이체의 아미노기의 N-아실 유도체는 최종 축합을 위해 N-아실 보호된 아미노산을 사용하거나, 보호된 또는 비보호된 펩티드를 아실화함으로써 제조할 수 있다. O-아실 유도체는, 예를 들어 유리 히드록시 펩티드 또는 펩티드 수지를 아실화함으로써 제조할 수 있다. 아실화는 표준 아실화 시약, 예컨대 아실 할라이드, 무수물, 아실 이미다졸 등을 사용하여 수행될 수 있다. 원할 경우, N-아실화 및 O-아실화는 둘다 함께 수행될 수 있다.
펩티드 또는 펩티드 변이체, 또는 펩티드 또는 펩티드 변이체의 아미노 잔기의 산 부가 염은 펩티드 또는 아민을 1종 이상의 목적하는 무기산 또는 유기산(예를 들어, 염산)의 등가물과 접촉시킴으로써 제조할 수 있다. 펩티드의 카르복실기의 에스테르는 또한 당업계에 공지되어 있는 통상의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 경우, 제약상 허용되는 염의 예에는 (a) 양이온, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예컨대 스퍼민 및 스퍼미딘과 형성된 염 등; (b) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 형성된 산 부가 염; (c) 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 타닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 형성된 염; 및 (d) 원소성 음이온, 예컨대 염소, 브롬 및 요오드로부터 형성된 염이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 부가적으로 또는 별법으로 "전구약물" 형태로 전달되도록 제조될 수 있다. 용어 "전구약물"은 불활성 형태로 제조된 치료제를 나타내며, 이는 신체 또는 그의 세포에서 내생 효소 또는 다른 화합물 및/또는 조건의 작용에 의해 활성인 형태(즉, 약물)로 전환된다. 특히, 올리고뉴클레오티드의 전구약물 형태는 1993년 12월 3일에 공개된 고셀린(Gosselin) 등의 WO 93/24510에 개시된 방법에 따라 SATE[(S-아세틸-2-티오에틸)포스페이트] 유도체로 제조될 수 있다.
본원에 제공된 화합물은 제약 조성물로 제제화될 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오티드 이외에도 제약상 허용되는 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면활성제, 중성 또는 양이온성 지질, 지질 복합체, 리포좀, 침투 인핸서, 담체 화합물 및 다른 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 등을 포함할 수 있다.
제약 조성물은 또한 하나 이상의 활성인 성분, 예컨대 인터페론, 항미생물 제제, 소염제, 마취제 등을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수용액을 함유할 수 있으며, 이는 완충액, 리포좀, 희석제 및 다른 적합한 첨가제도 함유할 수 있다. 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물은 올리고뉴클레오티드의 영양 전달을 향상시키기 위해 침투 인핸서를 포함할 수 있다. 침투 인핸서는 5가지 광범위한 범주, 즉 지방산, 담즙산염, 킬레이팅제, 계면활성제 및 비-계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 8, 91-192(1991)]; [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 7, 1-33(1990)]). 하나 이상의 상기 광범위한 범주로부터의 하나 이상의 침투 인핸서를 포함시킬 수 있다.
침투 인핸서로서 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체로는, 예를 들어 올레산, 라우르산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 레신레에이트, 모노올레인(a k.a. 1-모노올레일-rac-글리세롤), 딜라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세릴 1-모로카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 모노- 및 디-글리세리드 및 이들의 생리학상 허용되는 염(즉, 올레에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레에이트 등)이 있다(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, page 92(1991)]; [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 7, 1(1990)]; [El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 44, 651-654(1992)]).
담즙의 생리학적 역할은 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수를 용이하게 하는 것을 포함한다(문헌 [Brunton, Chapter 38 In: Goodman ＆ Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. McGraw-Hill, New York, N. Y., pages 934-935(1996)]). 다양한 천연 담즙산염 및 이들의 합성 유도체가 침투 인핸서로서 작용한다. 따라서, 용어 "담즙산염"은 담즙의 임의의 천연 발생 성분 뿐만 아니라 이들의 임의의 합성 유도체를 포함한다.
하나 이상의 침투 인핸서를 포함하는 복합체 제제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 담즙산염은 지방산과 함께 사용하여 복합체 제제를 제조할 수 있다. 킬레이팅제로는 디나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예를 들어, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, β-디케톤(엔아민)의 라우레트-9 및 N-아미노 아실 유도체가 있으나, 이에 한정되지 않는다(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, page 92(1991)]; [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 7, 1-33(1990)]; [Buur et al., J. Control Rel. 1990, 14, 43-51(1990)]). 킬레이팅제는 DNase 억제제로서 사용할 수도 있는 추가 이점을 갖는다.
계면활성제에는, 예를 들어 나트륨 라우릴 술페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, page 92(1991)]); 및 퍼플루오로 화합물 에멀젼, 예컨대 FC-43(문헌 [Takahashi et al., J. Pharm. Phamacol., 40, 252-257(1988)])이 있다. 비-계면활성제에는, 예를 들어 불포화 시클릭 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자시클로-알칸온 유도체(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, page 92(1991)]); 및 비-스테로이드성 소염제, 예컨대 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐부타존(문헌 [Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 39, 621-626(1987)])이 있다.
본원에 사용된 "담체 화합물"은 핵산 또는 그의 동족체를 나타내는 것으로, 불활성(즉, 생물학적 활성을 갖지 않음)이지만 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생체이용가능성을 감소시키는 생체내 과정, 예를 들어 생물학적으로 활성인 핵산을 분해하거나 순환으로부터 그의 제거를 촉진하는 생체내 과정에 의해 핵산으로 인식된다. 핵산과 담체 화합물을, 통상적으로는 담체 화합물을 과량으로 하여 동시투여하면 아마도 공통적인 수용체에 대한 담체 화합물과 핵산 사이의 경쟁에 의해 간, 신장 또는 다른 순환계외 저장소에 회수된 핵산의 양을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 담체 화합물과는 달리, "제약상 허용되는 담체"(부형제)는 동물에게 하나 이상의 핵산을 전달하기 위한 제약상 허용되는 용매, 현탁화제 또는 임의의 다른 약리학상 불활성 비히클이다. 제약상 허용되는 담체는 액체 또는 고체일 수 있으며, 핵산 및 주어진 제약 조성물의 다른 성분과 조합할 때 원하는 벌크, 밀도 등이 제공되도록 계획된 투여 방식에 따라 선택된다. 통상적인 제약상 허용되는 담체로는 결합제(예를 들어, 전젤라틴화(pregelatinized) 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 등); 충전재(예를 들어, 락토스 및 다른 당, 미정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 술페이트, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트 등); 윤활제(예를 들어, 스테아르산마그네슘, 활석, 이산화규소, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 등); 붕해제(예를 들어, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 등); 또는 습윤제(예를 들어, 나트륨 라우릴 술페이트 등)가 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 제공된 조성물은 또한 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 부가 성분을 당업계에 확립된 사용량(art-established usage) 수준으로 함유할 수 있다. 따라서, 조성물은 예를 들어 부가적인 상용가능한 제약상-활성 물질, 예컨대 지양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 소염제를 함유할 수 있거나, 본 발명 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는 데 유용한 부가적인 물질, 예컨대 염료, 향미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 물질은 첨가되는 경우에 본원에 제공된 조성물 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안 된다.
올리고뉴클레오티드를 환자에게 도입하는 방법에 상관없이, 콜로이드성 분산 시스템을 전달 비히클로 사용하여 올리고뉴클레오티드의 생체내 안정성을 향상시키고/거나 올리고뉴클레오티드가 특정 기관, 조직 또는 세포 유형을 표적으로 할 수 있도록 한다. 콜로이드성 분산 시스템으로는, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 리포좀 및 구조가 특성화되지 않은 지질:올리고뉴클레오티드 복합체를 비롯한 지질-기재 시스템이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 콜로이드성 분산 시스템은 다수의 리포좀이다. 리포좀은 2층 형태로 배열된 지질로 구성된 하나 이상의 외부층에 의해 둘러싸인 수성 코어를 갖는 미소구이다(일반적으로, 문헌 [Chonn et al., Current. Biotech., 6, 698-708(1995)] 참조).
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물 및 모방체 펩티드는 1종 이상의 중합체를 비롯한 생체내 분포 지시 잔기내로 포함되거나 상기 잔기와의 조합에 사용되어 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 또는 본원에 제공된 다른 화합물의 생체내 분포가 목적하는 표적에 근접하게 하거나, 또는 그의 지속적인 방출을 가능하게 한다. 활성화제는, 예를 들어 치료 효능을 증가시키거나, 생체내 분포 및 생체이용률을 최적화하거나, 조직 손상을 감소시키거나, 치유를 증진시키거나 또는 환자의 편안함을 증가시키는데 유용한 화합물이며; 예시적인 활성화제에는 혈관활성화제, 마취제, 허혈 치료제, 성장 인자 및 사이토킨이 포함된다. 별법으로, 미세입자화 또는 나노입자화 중합체 비드 투여 형태는 본원에 제공된 조성물에 사용될 수 있다. 본원에 제공된 화합물은 활성화제와 조합되어 사용될 수 있고, 미립자 투여 형태로 다수의 리간드 또는 여기에 부착된 항-리간드 분자와 함께 캡슐화될 수 있다.
이러한 방식으로, 모방체 펩티드, 안티센스 화합물 및 본원에 제공된 다른 화합물은 단독으로 또는 다른 활성화제와 조합하여 시간이 지남에 따라 방출되어 유지된 치료 이점을 제공한다. 유지된 방출 투여 형태는 또한 본 발명의 실시에 유용한 다른 활성화제, 예컨대 성장 인자, 사이토킨 등에 대해서도 유용하다. 본 발명의 미립자 투여 형태로부터의 활성화제의 방출은 확산 및 미립자 매트릭스 미란 둘다의 결과로서 일어날 수 있다. 생분해 비율은 활성화제 방출 동력학에 직접적으로 영향을 미친다.
특정 실시양태에서, 모방체 펩티드 조성물, 안티센스 화합물 및 본 발명의 화합물의 제어 방출 비경구 제제화는 이식물, 오일성 주사 또는 미립자계로서 제조될 수 있다. 미립자계에는 미세구, 미세입자, 미세캡슐, 나노캡슐, 나노구, 및 나노입자가 포함된다. 미세캡슐은 중심 코어로서 치료 단백질을 함유한다. 미세구내에서, 치료제는 입자를 통해 분산된다. 리포좀은 제어 방출, 및 포획된 약물의 약물 표적화에 대해 유용할 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 단리된 형태로 존재할 수 있다. 생성물은 그의 의도된 목적을 방해하지 않으면서 여전히 실질적으로 단리된 것으로 간주되는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 생성물은 또한 실질적으로 정제된 형태일 수 있으며, 이러한 경우에 상기 생성물은 일반적으로 90％, 예를 들어 약 95％, 98％ 또는 99％ 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 제제의 무수질량을 포함할 것이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 모방체 펩티드를 포함하는 본 발명의 제약 조성물은 국소로, 비내로, 경구로, 위장내로, 기관지내로, 방광내로, 질내로, 자궁내로, 피하로, 근육내로, 관절주위로, 관절내로, 뇌척수액(ICSF)내로, 뇌 조직내로(예를 들어, 두개 내 투여), 척수질내로, 상처내로, 복막내로 또는 가슴막내로, 또는 전신으로, 예를 들어 정맥내로, 동맥내로, 문맥내로 또는 기관(예컨대, 심장)에 직접적으로 투여될 수 있다. 정맥내로 투여되는 제제는 다른 경로를 통해 투여되는 제제보다 빠른 생체이용이 가능하므로, 일반적으로 정맥내로 투여되는 제제는 보다 치명적이다. 별법으로, 안티센스 화합물, 모방체 펩티드 및 본 발명의 다른 화합물의 동맥내 투여는 제공하는 동맥이 접근가능한 기관 또는 조직내에 존재하는 질환 표적에 대해 제공될 수 있다. 동맥내 전달의 용도에는,예를 들어 간동맥 투여를 통한 간-관련 상태, 목동맥 투여를 통한 뇌-관련 상태, 기관지동맥 투여를 통한 폐-관련 상태 및 신장 동맥 투여를 통한 신장-관련 상태의 치료가 포함된다. 따라서, 예를 들어 특정 실시양태에서 화합물은 시스템 전달을 위한 펩티드/폴리펩티드(예를 들어, 모방체 펩티드)이고, 다른 실시양태에서, 상기 화합물은 전달(예를 들어, 뇌실 또는 척수로)을 지시하는 펩티드/폴리펩티드(예를 들어, 모방체 펩티드)이다.
예를 들어, 본원에 그 거명을 통해 포함된 해몬드(Hammond)의 미국 특허 제6,752,987호 및 미국 공개된 가출원 제20030148968호는 심장 질환에 대한 생체내 전달을 기술하며, 제약 조성물을 혈관 또는 다른 통로로 심근 또는 조직에 직접 주사함으로써 달성할 수 있다. 바람직하게는, 하나 또는 둘다의 관상동맥, 또는 다른 조직-특이적 동맥(또는 말초 조직내로의 볼루스 주사) 내로 주사하여 투여할 수 있다. 예시 방식으로서, 심근으로의 전달에 있어서, 하나 또는 둘다의 관상동맥 또는 1종 이상의 복재 정맥 또는 내부 유선 동맥 이식편 또는 심근으로 혈액을 전달하는 다른 통로의 강 내에 실질적으로(전형적으로 약 1 cm 이상) 도입된 카테터에 의해 주사한다. 바람직하게는, 상기 주사를 좌 관상동맥 및 우 관상동맥 둘다에 제공하여 심장의 모든 부위 전반에 분포하게 한다. 본 발명에 따라 활성화제와 조합된 펩티드 모방체 또는 펩티드 모방체의 국소 전달을 추가로 증대시키고, 전달 효율을 증진시키기 위해, 당업자는 혈관활성화제, 바람직하게는 히스타민 또는 히스타민 효능제 또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 단백질 또는 일산화질소 공여체(예를 들어, 나트륨 니트로프루시드)를 펩티드 모방체 또는 활성화제와 조합된 펩티드 모방체와 동시에, 바람직하게는 상기 모방체를 도입하기 수분 내에 치료될 조직내로 주입할 수 있다.
한 측면에서, 척수 투여의 방법에는 당업계에 공지되어 있는 척수 주사 기술이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 척수내 주사 또는 투여의 일반적인 방법에는, 예를 들어 경막외 주사(미측 마취 주사, 경요부 주사 및 경추간공 주사 포함); 후관절 주사(관절내 주사 및 신경 차단 주사 포함); 하드웨어 주사; 엉덩이 관절 주사, 및 분별 저급 말단 주사가 포함된다. 대부분의 척수 주사에서, 국소 마취제(마비 약제) 예컨대, 예를 들어, 리도카인(또는 크실로카인(Xylocaine)) 또는 부피바카인(Bupivacaine)(마르카인(Marcaine))은 척수의 특이 부위내로 공-주사된다.
특정 측면에서, 안티센스 화합물 또는 모방체 펩티드는 단독으로 투여되거나, 졸중 및 허혈의 일반적인 치료에 사용되는 제제와 함께 공동-투여될 수 있다. 그 예에는 방해물을 제거하고 뇌로의 혈류를 저장함으로써 치료되는 허혈 졸중, 및 2) 동맥류 및 동정맥 기형의 파열 및 출혈을 예방하는 방해물 도입을 포함하는 출혈성 졸중이 포함된다. 한 측면에서, 허혈성 졸중 치료에는 혈괴-제거제, 예컨대 tPA의 사용이 포함될 수 있다. 일반적으로, tPA는 증상의 발병으로부터 3시간 이내에 투여된다. 또다른 측면에서, 치료는 항응고제/항혈소판제를 투여하는 예방적 측정을 포함할 수 있다. 항혈소판제(예컨대, 아스피린) 및 항응고제(예컨대, 워파린)은 혈액의 응고능력을 방해하여, 졸중 개시를 예방하는 데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 허혈성 졸중의 치료에는 혈관 차단물을 목동맥으로부터 외과적으로 제거하는 절차인 목동맥 내막절제술이 포함될 수 있다. 또다른 측면에서, 허혈성 졸중의 치료에는 혈관을 막는 지방성 치료제를 사용하는 기계적 장치 내에 심혈관 질환을 치료하는 스텐트라 불리는 혈관성형술 기구 및 이식가능한 강철 스크린의 사용을 포함하는 혈관성형술/스텐트가 포함된다. 출혈성 졸중에 있어서, 수술 치료는 종종 기저부에 넥이라 불리는 금속 클립을 놓거나, 또는 동정맥 기형(AVM)을 포함하는 이상 관을 제거하는 것을 추천한다. 한가지 예는 혈관내 절차, 예를 들어 덜 침습되는 "코일"이며, 다리 또는 팔에서 주요 동맥을 통해 도입되며, 기계적 작용제, 예컨대 코일에 침착시키는 동맥류 또는 AVM으로 유도하여 파열을 예방하는 카테터의 사용을 포함한다.
특정 측면에서, 안티센스 화합물 또는 모방체 펩티드는 졸중 및 허혈의 수술 치료를 위한 조합 양식으로서 공투여될 수 있다. 졸중 치료를 위한 수술 조정에는, 뇌내 및 뇌 주변에서 졸중을 예방하거나, 급성 졸중을 치료하거나 또는 혈관 손상 또는 기형(예를 들어, AVM)을 복구하는 데 사용될 수 있는 졸중 치료용 통상의 수술 양식이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 그 예에는 목동맥이 차단되었을 때 목동맥으로부터 아테롬경화성 플라크를 제거하는 데 사용되는 절차인 목동맥 내막절제술; 및 차단된 동맥의 영향을 받는 뇌 조직 부위로 두피내 건강한 동맥 경로를 재정함으로써 뇌 조직의 혈액공급이 끊긴 부위로 혈류를 재수송하는 절차인 두개외/두개내(EC/IC) 우회술이 포함된다.
다른 측면에서, 졸중 또는 허혈에 대한 수술 양식에는, 예를 들어 지주막하 출혈을 야기하는 뇌 동맥류 치료에 유용한 클리핑 기술이 포함된다. 클리핑에는 파열되어 출혈을 야기할 혈관으로부터 동맥류를 조이는 것이 포함된다. 또다른 측면에서, 수술 양식은 매우 위험한 두개내 동맥류의 치료를 위한 "분리가능한 코일 기술"이 포함될 수 있다. 상기 기술에는 일반적으로 대퇴부내 동맥을 통해 작은 백금 코일을 삽입하고 동맥을 통해 동맥류 부위로 끼워넣는 것이 포함된다. 이어서, 상기 코일을 동맥류로 방출시켜, 체내로부터 면역 반응을 일으킨다. 신체에서는 동맥류 내부의 혈병, 동맥벽 강화 및 파열 위험 감소가 일어난다. 동맥류가 안정화되면, 신경외과 의사는 출혈과 사망의 위험을 줄이면서 환자의 동맥류를 클리핑할 수 있다. 졸중의 수술 치료는 최근 AVM 및 동맥류에 대한 정위 미세수술과 같은 발달된 기술을 포함하는 것으로 고려한다. AVM의 정확한 위치를 정확하게 나타내는데에 정교한 컴퓨터 기술 및 기하학적 원리가 사용된다. 상기 절차 동안, 통상적으로 고정된 틀이 환자의 머리에 부착되고, CT 또는 MRI를 사용하여 삼차원 참고점을 확립시킨다. 이러한 기술로 신경외과 의사는 1 또는 2 mm 내에 AVM을 위치시킬 수 있으며, 이로써 이들은 현미경-증진된 방법 및 정교한 장치를 사용하여 정상 뇌 조직에는 영향을 미치지 않으면서 수술할 수 있다. 다른 양식에는, 예를 들어 AVM에 대해, 정위 미세수술로서 AVM의 정확한 위치를 정하는 동일한 기본 기술을 사용하는, 침해를 최소화하고 상대적으로 위험이 낮은 절차인 정위 방사선수술이 포함된다. 위치를 정하면, 이는 응고를 야기시킨 후 사라지는 방사선에 촛점을 맞춤으로써 AVM을 말소시킬 수 있다. 이 기술의 정확성으로 인해, 정상 뇌 조직은 일반적으로 영향을 받지 않는다. 다른 양식에는, 예를 들어 체온저하(신체 냉각화)를 이용하여 거대 및 복합 동맥류 또는 난해한 AVM의 수술 치료 동안 졸중을 예방하는 냉각법이 포함된다. 뇌 온도를 감소시킴으로써 의사는 수술-유도 졸중의 위험을 최소로 하면서 수술에 필요한 시간을 얻는다. 종종 심폐기로서 알려진 특별한 장치를 사용하여 신체의 체온을 심하게 감소시키면서 뇌로부터의 혈류 분로를 완전하게 한다. 다른 양식에는, 예를 들어 동맥류 또는 차단된 대뇌 동맥을 치료하기 위한 수술 기술인 재혈관화가 포함된다. 상기 기술은 본질적으로 다른 혈관을 대뇌 동맥에 접목시키거나 뇌에 혈류의 새로운 근원을 제공함으로써 뇌에 새로운 혈액 경로를 제공한다.
특정 실시양태에서, 표적 투여는 안티센스 화합물 또는 모방체 펩티드를 단독으로 사용하거나, 다른 활성화제, 예컨대 효능을 증가시키거나, 조직 손상을 감소시키거나, 치유를 증진시키거나 또는 환자의 편안함을 증진시키는데 유용한 화합물과 조합하여 수행될 수 있다. 미국의 공개 특허 명세서 제20040259768호(이 거명을 통해 본원에 포함됨)에는 표적 방출에 대한 방법 및 제제가 기술되어 있다.
다양한 카테터 및 전달 경로는 당업계에 공지되어 있는 관상동맥내 전달을 통해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기에 적합한 다양한 다목적의 카테터 및 변형된 카테터는 시판 공급원, 예컨대 어드밴스드 카디오배스큘러 시스템즈(Advanced Cardiovascular Systems(ACS)), 타겟 테라퓨틱스(Target Therapeutics) 및 코디스(Cordis)로부터 입수 가능하다. 또한, 심근으로의 전달이 관상동맥(현재 가장 바람직함) 내에 직접 주사함으로써 달성될 경우, 당업자에게 공지되어 있는 다수의 방법이 관상동맥내로 카테터를 도입하는 데 사용될 수 있다. 예시 방식으로서, 카테터는 편리하게 대퇴동맥내로 도입되어 엉덩이동맥 및 복부대동맥을 통해 역행하여 관상동맥내로 끼워질 수 있다. 별법으로, 카테터는 먼저 상완동맥 또는 목동맥내로 도입되어 관상동맥으로 역행하여 끼워질 수 있다. 이러한 기술 및 기타 기술에 대한 자세한 기술은 당업계에서 찾을 수 있다(예를 들어, 문헌 [Topol, E J(ed.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed.(W.B. Saunders Co. 1994)]; [Rutherford, R B, Vascular Surgery, 3rd Ed.(W.B. Saunders Co. 1989)]; [Wyngaarden J B et al.(eds.)s The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed.(W. B. Saunders, 1992)]; 및 [Sabiston, D, The Textbook of Surgery, 14th Ed.(W.B. Saunders Co. 1991)] 참조).
본원에 제공된 화합물은 비경구로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 때로 특정 화합물을 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 배합하여 제약 조성물을 제조한다. 적합한 담체 및 희석제에는 등장성 식염수, 예를 들어 인산염-완충된 염수가 있다. 조성물은 비경구, 근육내, 뇌내, 정맥내, 피하 또는 경피 투여용으로 제형화될 수 있다. 포유동물 세포에 의한 핵산의 흡수는 몇몇 공지된 형질감염 기술, 예를 들어 형질감염제를 사용하는 기술에 의해 향상된다. 투여되는 제형은 이러한 제제를 포함할 수 있다. 이들 제제의 예에는 양이온성 제제(예를 들어, 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란) 및 리포펙턴트(lipofectant)(예를 들어, 리포펙탐(상표명) 및 트랜스펙탐(상표명))가 있다.
국소 투여용 제제는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 좌약, 스프레이, 액제 및 분제를 포함할 수 있다. 통상적인 제약 담체, 수성, 분말 또는 유성 염기, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등이 유용할 수도 있다. 경구 투여용 조성물은 분말제 또는 과립제, 물 또는 비수성 매질 중 현탁액제 또는 용액제, 캡슐, 샤세 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 멸균 수용액을 함유할 수 있으며, 이는 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제도 함유할 수 있다. 몇몇 경우에는, 치료 처방의 효율을 증가시키기 위해 환자에게 올리고뉴클레오티드 처치와 다른 치료 방법을 병행하는 것이 보다 더 효과적일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료 처방"은 치료, 경감 및 예방 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
투여량은 치료 지속 기간이 며칠 내지 몇 개월이거나, 또는 치유 효과가 나타나거나 질환 상태의 경감이 달성될 때까지 치료될 질환 상태의 중증도 및 반응성에 따라 달라질 수 있다. 본원에 제공된 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차로 측정할 수 있다. 예를 들어, LD50(개체군의 50％가 치사하는 양) 및 ED50(개체군의 50％에서의 치료적 유효량)을 측정한다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여율이 치료 지수이며, LD50/ED50 비율로서 나타낼 수 있다. 치료 지수가 높은 화합물이 바람직하다. 독성 부작용이 있는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포의 잠재적인 손상을 최소화함으로써 부작용을 줄이기 위해, 상기 화합물은 영향을 받은 조직 부위를 표적으로 하는 전달 시스템을 설계하도록 주의해야 한다.
세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 수득한 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 상기 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 아예 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내이다. 상기 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 대하여, 치료적 유효량은 초기에 세포 배양물 분석으로부터 평가될 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 공식화하여, 세포 배양물에서 측정한 IC50(즉, 증상의 최대 1/2을 억제하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성할 수 있다. 상기 정보를 사용하여 인간에서의 유용한 투여량을 더 정확하게 측정할 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피로 측정할 수 있다. 투여 일정은 환자 신체에서의 약물 축적량을 측정하여 계산할 수 있다. 투여량은 펩티드 모방체 또는 올리고뉴클레오티드를 비롯한 개별 화합물의 상대 효능에 따라 달라질 수 있고, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 EC50 실측치를 기초하여 추정할 수 있다.
적합한 투여량은, 예를 들어 투여 경로에 따라 전체 투여량이 약 0.1 ㎍ 내지 약 1 g 이하로 달라질 수 있다. 특정 투여 및 전달 방법에 대한 안내서는 문헌으로 제공되며, 일반적으로 당업자에게 유용하다. 당업자는 단백질 또는 이들의 억제제보다 뉴클레오티드에 대한 상이한 제제화를 사용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 본원에 제공된 화합물의 전달은 특정 세포, 상태 및 위치에 대해 특이적일 것이다. 일반적으로, 투여량은 체중 1 kg 당 0.01 mg/kg 내지 100 mg이며, 1일, 1주일, 1달 또는 1년 또는 2 내지 20년마다 1회 이상 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여량은 수술 직후부터 24시간 이내에 투여될 수 있으며, 다른 실시양태에서 투여량은 2시간 후 부터 24시간 이내에 제공된다. 오래 지속되는 조성물은 특정 제제의 반감기 및 제거율에 따라 매 3 내지 4일, 매주, 또는 2주 마다 투여될 수 있다. 당업자는 체액 또는 조직에서 측정된 약물 체류 시간 및 농도에 기초하여 투여 반복 비율을 용이하게 추정할 수 있다. 성공적인 치료 후에, 환자는 지속적인 치료를 받아 질환 상태가 재발하는 것을 방지하는 것이 바람직할 수 있으며, 이 때 모방체 펩티드는 1일 1회 이상에서 20년마다 1회까지 0.01 mg/체중kg 내지 100 mg/체중kg 범위의 지속적인 투여량으로 투여된다. 코넥신 조절이 필요한 상태의 치료 및 예방시, 적절한 투여량 수준은 일반적으로 1일 당 약 0.001 내지 100 mg/환자 체중kg일 것이며, 이는 단일 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 투여량 수준은 1일 당 약 1 내지 약 40 mg/kg일 수 있다. 특정 실시양태에서, 특이 안티센스 화합물 또는 모방체 펩티드를 비롯한 본원에 제공된 화합물은 손상 부위의 생체 내 농도가 약 1 μM 내지 약 1 mM, 약 10 μM 내지 약 500 μM 또는 약 30 μM 내지 약 300 μM이 되도록, 및 최종 농도가 약 25 μM 내지 약 300 μM이 되도록, 및 손상 부위의 최종 농도가 약 25 μM 또는 약 160 μM 또는 약 300 μM, 및 더 전형적으로 약 1 μM 내지 약 10 μM이 되도록 하는 양으로 투여된다.
추가 측면에서, 펩티드 억제제 및 모방체 펩티드는 손상 부위의 최종 농도가 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 1 mg/ml, 약 10 ㎍/ml 내지 약 500 ㎍/ml 또는 약 100 ㎍/ml 내지 약 500 ㎍/ml, 약 250 ㎍/ml 또는 약 300 ㎍/ml가 되도록 투여될 수 있다.
항-코넥신 화합물(예를 들어, 펩티드 모방체 분자)는 여러 상이한 농도, 바람직하게는 1x10-10 M 내지 1x10-4 M로 도입된다. 코넥신(대조군 유전자 포함) 발현을 적절하게 조절할 수 있는 최소 농도가 확인되면, 최적화된 투여량을 상채 내에서 사용하기에 적합한 투여량으로 변환한다. 따라서, 항-코넥신 화합물을 투여하여 대상체(예를 들어, 포유동물)의 특정 세포, 조직 또는 기관에서 생체내 목적하는 농도를 달성할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 모방체 펩티드 또는 다른 펩티드-기재 항-코넥신 화합물을 투여하여(예를 들어, 전신으로, 경구로 또는 비경구로, 예를 들어, IV 등), 최종 생체내 펩티드 농도가 약 0.1 μM(1 x 10-7 M), 약 1 μM(1 x 1O-6 M), 약 2 μM(2 x 10-6 M), 약 3 μM(3 x 10-6 M), 약 5 μM(5 x 10-6 M), 약 10 μM(1 x 10-5 M), 약 50 μM(5 x 10-5 M), 약 250 μM(2.5 x 10-4 M), 약 500 μM(5 x 10-4 M), 및 1 mM(1 x 10-3 M), 및 5 mM(1 x 10-3 M) 이상이 되게 한다. 생체내 농도가 약 1 내지 10 μM(1 x 10-6 M 내지 1 x 10-5 M), 예를 들어 약 5 μM(5 x 10-6 M)인 일부 모방체 펩티드가 바람직하다. 다른 측면에서, 펩티드-기재 항-코넥신 화합물을 약 0.1 μM/kg, 1 μM/kg, 10 μM/kg, 50 μM/kg, 250 μM/kg, 500 μM/kg, 1000 μM/kg, 5000 μM/kg의 양으로 직접 조직(예를 들어, 포유동물의 뇌실)에 투여한다. 예를 들어, 배양물의 억제 농도 1 x 10-7 M은 특정 화합물에 대해 대략 0.6 mg/체중kg의 투여량으로 변환된다. 실험 동물에서의 상기 화합물의 독성 시험 후, 항-코넥신 화합물(예를 들어, 안티센스 화합물 또는 모방체 펩티드 분자) 수준이 100 mg/체중kg 이상에 근접할 수 있다. 또한, 척추동물의 세포를 제거하여 모방체 펩티드로 시험하고, 척추동물내로 재도입하는 것도 고려된다.
본원에 기술된 화합물은 진단, 치료, 예방에, 및 연구 시약으로서, 및 키트에 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 코넥신을 코딩하는 핵산에 혼성화되기 때문에, 샌드위치(sandwich) 분석, 열량주사 분석 및 다른 분석은 이러한 사실을 활용하여 용이하게 구축될 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 코넥신 유전자 또는 mRNA의 혼성화를 검출하는 데 사용되는 수단은 통상적으로 제공될 수 있다. 상기 수단의 제공은 효소 접합, 방사선표지 또는 다른 적합한 검출 시스템을 포함할 수 있다. 코넥신의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트도 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 연구 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 의해 나타나는 특이적인 혼성화는 분석, 정제, 세포 생성물 제조, 및 당업자에 의해 이해될 수 있는 다른 방법에 사용될 수 있다.
이제 본 발명의 다양한 측면을 하기 실험 부분과 관련하여 기재할 것이며, 이는 단지 예시 방식으로 제공된 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
본원발명은, 예를 들어, 심혈관성, 신경학적 및 혈관성 질환, 장애 및 상태에 제한되지 않지만 이를 포함하는 다양한 질환, 장애 및 상태의 예방 및 치료에 유용한, 갭-정션(gap-junction) 및 헤미채널(hemichannel) 조절을 위한 작용제, 화합물, 조성물, 제제를 포함한 제약, 및 방법을 제공한다.
도 1은 기관형적 배양물에 넣은지 24 시간 후의 래트 척수 분절을 나타낸다. 대조군 척수에서는 (도 1a), 유의한 팽윤이 절단 말단에서 관찰된다 (점선은 최초 절단을 표시함). 코넥신 43 특이적 안티센스 ODN 처리된 분절 (도 1b)은 팽윤 또는 부종이 거의 나타나지 않는다.
도 2는 기관형적 배양물 중 24 시간 후에 대조군 척수의 수지 섹션의 코마시 블루 염색(coomassie Blue staining)을 나타낸다. 뉴런은 액포가 있고 막을 따라 "수포형성(blebbing)" 사건이 발생하는 부종성이며, 이 막에서는 헤미채널이 개방되어 세포외 유체를 세포내 (화살표 방향)로 들어가는 것을 허용한다.
도 3은 세포외 루프 (Gap7M 항체는 도 3A에서 녹색을 나타냄) 및 단백질의 세포질성 카르복실 테일(tail) (도 3A에서 적색으로 나타냄)에 결합하는 항체를 사용하여 코넥신 43을 면역조직학적으로 표지화하는 것을 나타낸다. 세포질성 항체는 모든 코넥신 43 단백질 (적색)을 표지하고, Gap7M은 단지 헤미채널의 노출된 세포외 루프 (녹색)만을 표지하는데, 이는 세포 사이에서 손상되지 않은(intact) 채널을 형성하고 있는 도킹된 코넥손으로의 결합으로부터 입체적으로 가려져 있기 때문이다. 도 3B는 압착 상처 후 24 시간에 척수에서 2개의 항체로 이중 표지화된 것을 나타낸다. 대부분의 표지는 황색으로 나타나며, 이때의 2종의 항체는 존재하는 단백질의 유의한 부분이 이웃 세포 코넥손과 함께 도킹되지 않고 헤미채널로서 잔류하는 것으로 나타나도록 공동 국부화된 것이다. 코넥신 43 특이적 안티센스 ODN는 단백질 번역을 저해하고, 처리된 척수에서는 헤미채널이 거의 보이지 않는다 (도 3C).
도 4는 5일 동안 기관형적 배양물에 있던 척수로부터 조직 슬라이스의 아이솔렉틴(Isolectin) B4 표지화를 나타낸다. 렉틴은 소교세포 및 혈관 내피 세포 둘다에 결합한다. 이러한 코넥신 43 특이적 안티센스 ODN 처리된 분절에 있는 모세 혈관은 5일 후에도 완전한 형태로 남아 있다 (화살표). 대조군 척수에서, 모세관은 2일 후에 완전히 손상되지 않은 채로 거의 남아 있지 않고; 5일까지 대조군에서 우세하게 표지화된 것은 활성화된 대식세포 표현형 신경아교세포이다.
도 5는 척수 조직 5 mm 문측에서 압착 상처까지의 섹션을 나타낸다. 척수를 압착한 후 4 시간에, FITC 태깅된 BSA를 동물 꼬리 정맥에 주사한 다음, 조직을 수거하고 섹션화하였다. 대조군 척수에서 (도 5A), 염료는 혈관으로부터, 손상 부위로부터 5 mm까지 상당히 누출되었고, 이는 혈액 모세 혈관벽의 파열 및 혈액 뇌 장벽의 붕괴를 나타낸다. 코넥신 43 특이적 안티센스 ODN 처리된 코드에서 (도 5B), 혈관 완전성을 유지하는 것으로 나타나는 모세혈관 내에 염료가 거의 함유되어 있지 않았다.
도 6은 경색증 후 24 시간에 허혈성 경색 조직에 인접하고 경색부 내에 있는 양의 심장 심실에서 양의 심장 조직을 3중 표지화한 것을 보여준다. 조직은 코넥신 43에 대한 항체 (적색) 및 Gap7M에 대한 항체 (녹색)와 함께 혈관 내피 세포 (청색)를 나타내는 아이솔렉틴 B4로 표지화된다. Gap7M 항체는 코넥신 단백질의 보존된 세포외 루프 영역을 인식하지만 (코넥신 이소형태 특이적인 것은 아님), 헤미채널을 표시한다 (이들은 손상되지 않은 채널에서 이들의 에피토프에 접근하는 것으로부터 입체적으로 가려짐). 도 6a는 모세혈관의 아이솔렉트 B4 표지를 나타내는 경색 영역으로부터 떨어진 조직 (청색 - 상위 왼쪽) 및 근세포의 삽입된 디스크에서의 코넥신 43 갭 정션 (하위 왼쪽 - 적색)으로부터의 4개의 이미지 세트를 보여준다. 헤미채널은 사실상 GAP7M 표지되지 않는다 (상위 오른쪽 - 녹색). 하위 오른쪽 이미지는 다른 3가지를 합친 것이다. 혈관은 손상되지 않은 채로 남아있고, 근세포 자체에 손상 표시는 없다. 도 6b에서는, 경색으로부터 아직 떨어져 있지만 더 근접한 영역을 보여준다. 동일한 3개의 표지 및 합쳐진 이미지는 이 4-부분 패널에 나타낸다. 대부분의 혈관은 여전히 손상되지 않은 형태이지만, 혈관 벽은 영역에서 붕괴된다. 이러한 영역에서, 헤미채널 표지는 파열된 혈관벽과 공동 국부화된다. 4개의 이미지 (도 6c) 중 마지막 패널은 경색된 영역 자체 내에 있는 것이다. 광대한 헤미채널 발현 후에 모세혈관이 명백하게 거의 손상되지 않은 채로 남아있지 않다. 코넥신 43 표지는 분산되고 있고, 근세포가 이제 심각하게 손상된 것으로 나타난 삽입 디스크에 더이상 함유되지 않는다. 모든 경우에, Gap7M 항체 표지는 코넥신 43 표지와 함께 공동 국부화되지 않고 (이것은 척수에서와 같음), 이들은 코넥신 45와 가장 유사하게 상이한 갭 정션 단백질 이소형태인 것으로 나타난다.
도 7은 허혈 후 경색 24 시간에 근세포의 근절에서 모세관 내피 세포를 표시하는 아이솔렉틴 B4 (녹색) 및 M 라인을 표시하는 마이오신 항체 표지 (적색)의 공동 국부화를 나타낸다. 이 영역은 도 6c에 나타낸 것과 동일하다. 혈액 모세관은 완전히 붕괴되고, 정상 근세포 근절 결합 패턴은 파괴되어 근육 세포 사멸이 혈관벽 붕괴와 함께 발생하는 것으로 나타난다. 패널 중 상위의 이미지는 아이솔렉틴 B4를 나타내고, 중간 이미지는 마이오신 표지화, 하위 이미지는 이러한 두가지의 병합이다.
도 8은 전체 척수 분절 영역과 비교하여 ％ 팽윤을 나타내는 막대 그래프를 나타낸다. 대조군 (매질만 있음) 분절, 펩티드 VDCFLSRPTEKT (서열 35) 및 SRPTEKTIFII (서열 36)로 처리된 분절 (이는 염료 흡수 실험에서 헤미채널을 차단하는 것으로 나타남) (도 8에서 각각 펩티드 4 및 5를 나타냄), 및 펩티드 QQPGCENVCYDK (서열 39)로 처리된 분절 (이는 헤미채널을 차단하지 않았음) (도 8에서 펩티드 8로 나타냄)을 나타낸다. 펩티드 SRPTEKTIFII (서열 36, 도 8에서 펩티드 5) (조직학적 연구에 따른 우수한 차단제)는 5가지 상이한 농도로 사용되고, 이의 가장 낮은 농도가 부종을 감소시키는 데 가장 효과적이었다.
도 9는 태아 시기에 가까운 양의 뇌에서, 코넥신 단백질의 세포외 루프 영역을 인식하는 항체를 사용하는 가상 대조군 (왼쪽) 및 30분의 대뇌 허혈 후 24시간 (오른쪽)으로부터의 코넥신 헤미채널 표지를 나타낸다. 대조군 뇌에서, 코넥신 헤미채널 표지화는 관찰되지 않았지만, 허혈 후에 헤미채널이 집중적으로 상승조절된다. 헤미채널 발현은 특히 세포체 (수평 화살표) 및 혈관 내피 세포 (수직 화살표)에서 높다. 허혈 후에 상승조절된 주요 코넥신은 코넥신 43이다.
도 10은 태아 시기에 가까운 양에서 대뇌 허혈의 30분 에피소드 후 90분에 출발하는 인공 CSF i.c.v. 주입 또는 펩티드 주입의 예를 나타낸다. 이러한 동물에서의 주입은 허혈 후 72 시간까지 계속되었다. 비히클 (인공 CSF) 주입 동물 (왼쪽)은 심각하고 연속적인 발작(seizure)의 개시가 지연되는 것으로 나타나고 (간질성 상태; 그 예는 삽입 박스에 나타냄, 상위), 그후 48 시간에 최대 피질 임피던스 (하위, 세포 팽윤 측정)로 전진적으로 상승한다. 발작은 대략 48 시간에 분석되었다. 펩티도모방체 주입 (오른쪽)은 발작을 연속적인 것에서 불연속적인 분리 발작 사건의 더 늦은 개시로 변경시켰다. 대뇌 임피던스에 있어서의 상승은 유의하게 지연되고 감쇄되었다.
도 11은 2.5, 5 및 1O μM 농도의 코넥신 43 특이적 AS-ODN에서의 시신경 (도 11A) 조직 팽윤 및 대조군에서의 세포 사멸 (도 11B)에 대한 투여량-반응 커브를 나타낸다. 두가지 파라미터는 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 나타낸다. 1O μM에서, 조직의 팽윤은 6h 후-처리만큼 초기와 같이 감소되고 대조군과 비교했을 때 69％ 만큼 감소된다. 시신경의 전면 및 중간 분절에서의 세포 사멸은 안티센스 처리로 감소된다.
도 12는 대조군 및 AS-ODN 처리된 시신경 (모든 시점에 대해 n=6)에서의 팽윤 ％를 나타내다. 부종은 대조군 조직에서 더 우세하고, 그 차이는 관찰된 모든 시점에서 통계학적으로 유의하다. 별표는 2개의 군 사이의 통계적 차이를 나타낸다.
도 13: (상위 패널) 프로피듐 요오디드는 허혈 유도 후 2, 6 및 24 시간에 대조군 (A, B, C)과 AS-ODN 처리된 (D, E, F) 시신경 분절 중간에서 사멸 세포를 염색한다. 거의 염색되지 않은 것은 모든 3개의 시점에서 대조군과 비교했을 때 코넥신 43 특이적 AS-ODN 처리된 군으로 나타난다 (하위 패널). 선 그래프는 대조군과 AS-ODN 처리된 시신경에 대한 신경의 중앙 영역에서 단위 영역 당 사멸 세포의 수를 나타낸다. 대조군에서의 세포 사멸은 초기에 증가하고, 6 시간에 최고이며, 이어서 감소한다 (단위 영역 당, 보다 적은 세포가 남아 있는 조직 부종을 반영하는 것으로 여겨짐). 배양물 중 24 시간 후에도 세포 사멸에서의 매우 약간의 증가만을 AS-ODN 처리된 조직에 대해 주의한다. 별표는 처리 간의 통계적 차이를 나타낸다.
도 14는 대조군 (녹색) 및 코넥신 43 특이적 안티센스 처리된 시신경 (청색)에서 평균 혈관 분절 길이를 나타낸다. 모든 시점에서, 아마도 헤미채널의 형태에서, 또는 갭 정션 매개의 방관자 효과를 통해, 안티센스 처리된 신경은 분절이 길수록 코넥신 발현 결과로서의 혈관 붕괴가 덜한 것으로 나타난다.
본원에 참조된 모든 색상은 상응하는 흑색- 및 백색-형상에서 흑백 스케일로 나타낸다.
하기 실시예는 설명을 위한 것으로, 본 발명을 제한하지는 않는다.
실시예 1: 중추 신경계
중추 신경계에 대한 손상은 환자 관리에 장기간에 걸쳐 막대한 비용이 들어 사회를 황폐화시킬 수 있다. 심각하게 손상된 뉴런 조직에서 일어나는 병리학적 변화는 공통적인 특징을 공유한다. 손상 후 24 내지 48 시간 이내에 손상이 확산되어 영향을 받는 영역의 크기가 상당히 증가하였다. 이러한 확산은 신경독소 및 칼슘 흐름이 갭 정션 채널을 통해 손상 부위로부터 다른 건강한 조직으로 확산되는 갭 정션-매개된 방관자 효과에 의해 전달된다(문헌 [Lin, J. H. et al. Nature Neurosci. 1:431-432(1998)]). 그러나, 이는 또한 세포외 공간을 폐쇄하여 이후의 24 내지 48 시간 동안 세포 사멸을 초래하는 염증성 종창을 수반하다. 태아 뇌손상시, 종창은 예를 들어 세포독성 부종을 측정하는 피질의 전기 임피던스의 변화로 유추할 수 있다(문헌 [Reddy, K., et al., Pediatric Research 43:674-682(1998)]). 이러한 새로운 손상은 초기 손상 후에 즉각적으로 나타나는 결과가 아니라 이후에 수반되는 사건으로, 손상 후 6 시간과 48 시간 사이에 발생하지만, 빠르면 2 시간 후에도 발생할 수 있으며, 손상의 확산을 방지하는 치료를 위한 기회 시기를 제공한다.
도 1은 동물에서 척수를 절개한 경우에도 부종 및 종창이 발생한다는 것을 보여준다(도 1A). 두 가지 모든 경우에, 갭 정션 단백질 코넥신 43의 번역을 방해하는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)를 이용하여 부종을 차단할 수 있다(도 1B). 절개된 척수 절편에서, 평가된 종창의 부피는 처치군과 대조군 사이에 상당한 차이가 있었다(상부로부터 보이는 종창의 영역을 측정하여 평가함 - p=0.001).
상기 종창이 CNS 손상 후에 관찰되고 코넥신 특이적인 안티센스 ODN의 사용으로 차단된다는 것은 갭 정션 헤미채널이 발현되었으며, 세포 세포질과 세포의 공간 사이의 직접적 경로로 유도하는 병리학적 상태하에 개방되었음을 나타낸다. 이후에 뉴런이 사멸된다. 손상 24 시간 후에 세포를 조사한 결과, 세포외 유액의 흡수에 의해 유발되는 공포 형성 및 막내부의 수포 형성 현상이 나타났다(도 2). 도 3A(컬러 사진)의 설명부에 기재된 바와 같이, 세포외 루프에 결합하는 항체(코넥신 국소 해부도의 상부 왼편의 넓은 밴드 및 표지된 Gap7M) 및 단백질의 세포질성 카르복실 말단에 대한 항체(코넥신 국소 해부도의 하부 오른편의 넓은 밴드 및 표지된 GAP1A)를 사용하여 코넥신 43을 면역조직화학적으로 표지하였다. 세포질성 항체는 모든 코넥신 43 단백질을 표지하고, 적색 형광물질 태그가 부착된 2차 항체와 함께 사용된다. Gap7M 항체는 헤미채널의 노출된 세포외 루프만을 표지할 수 있으며, 녹색 형광물질 태그가 부착된 2차 항체와 함께 사용된다. Gap7M은 세포 사이에 무손상 채널이 형성되는 도킹된 코넥손에 대한 결합을 입체적으로 방해하며, 두 가지 항체로 표지한 코넥손(이에 따라 적색 및 녹색 2차 항체가 동일한 위치에 배치된 경우에 황색으로 나타남)만이 헤미채널로 존재한다. 도 3B(컬러 사진)의 설명부에 기재된 바와 같이, 상기 영상은 압박성 상처 발생 24 시간 후에 척수 절편에 적용되는 도 3A에 기재된 두 가지 항체를 사용하여 이중 표지한 것을 보여준다. 상기 영상에는 표지된 코넥신인 작고 밝은 점 및 DAPI로 표지된 세포 핵을 마킹하는 보다 밝고 큰 그림자 점이 존재한다. 코넥신 표지의 중요한 부분은 합한 영상에서 황색으로 나타나는데, 이는 두 가지 항체(Gap7M 및 GAP1A)가 동일한 위치에 배치되었음을 나타낸다. 이는 코넥신 세포외 루프가 노출되어 있으며, 존재하는 대부분의 코넥손이 이웃하는 세포의 코넥손과 도킹되지 않아 헤미채널로 남아있음을 의미한다. 도 3C(컬러 사진)의 설명부에 기재된 바와 같이, 상기 영상은 압박성 상처 발생 24 시간 후에 척수에 적용되는 도 3A에 기재된 두 가지 코넥신 항체를 사용하여 이중 표지한 것을 보여준다. 이러한 경우에, 코넥신 43 특이적인 안티센스 ODN을 사용하는 것이 단백질 번역을 방해하는 데 적용된다. 헤미채널은 밝은 점으로 나타날 것이다(컬러 영상에서 녹색 형광물질 태그가 부착된 Gap7M 및 적색 형광물질 태그가 부착된 GAP1A가 동일한 위치에 배치된 경우에 황색으로 나타남). 보다 크고 보다 밝은 점은 DAPI로 표지된 세포핵이다. 갭 정션 단백질은 거의 표지되지 않았으며, 이들 처치된 척수에서는 헤미채널이 거의 관찰되지 않았다.
또한, 코넥신 단백질(Gap7M 항체-도 3A)의 세포외 루프에 결합하여 이를 표지하는 갭 정션 항체는 래트 척수 손상 발생 24 시간 후에 광범위한 단백질 수준을 표지하는 것으로 나타났다(도 3B). 이들 항체는 상호작용하는 헤미채널의 부분에만 결합하여 막에서 도킹될 때 다량체를 형성한다. 이러한 데이터는 CNS 손상 후 초기 단계에 관찰되는 코넥신 43 상향조절의 대부분이 헤미채널 형태로 남아있음을 나타낸다.
코넥신 단백질의 발현 및 헤미채널 형성은 상처 발생 당시 플루로닉(Pluronic) F-127(폴록사머) 겔에 적용되는 코넥신 43 특이적인 안티센스 ODN의 사용으로 차단된다(도 3C).
이러한 치료는 체외배양 모델에서의 ODN 치료가 2 시간 이내에 외관상 넉다운(knockdown)되도록 적용한지 6 내지 8 시간 후의 단백질 수준(최대 넉다운) 및 약 24 시간 후에 회복되는 단백질 수준에서 최대 효과를 갖는다는 것을 나타낸다(문헌 [Qiu et al., 2003]; [Becker et al., 1999] 참조). 뇌에서는 이와 유사하게 조직 박편을 배양 종창에 넣지만, 헤미채널 형성을 방해하는 코넥신 43 특이적인 안티센스 ODN의 사용으로 종창을 차단할 수 있다(C 녹색 - 데이터에는 나타내지 않음).
손상 후에, 코넥신 수준의 상향조절은 세포 부종 및 사멸을 유발하는 헤미채널 형성을 유도한다. 그러나 이는 신경 집단으로 한정되지 않는다. 절개된 척수 절편에서, 아이솔렉틴 B4 표지(혈관의 미세아교세포 및 내피세포의 표면 상의 탄수화물에 결합함)는 안티센스 처치된 조직의 배양물에서 5일 후 까지라도 혈액 모세혈관의 윤곽을 나탄내다(도 5). 대조군 절편에서는 2일 후에 남아있는 모세혈관이 거의 없었다(5일 후에는 활성화된 대식세포 표현형(발포체) 아교세포가 아이솔렉틴 B4로 우세하게 표지됨). 코넥신 43 안티센스 처치된 뇌 박편에서, 모세혈관은 2일 후에라도 배양물 중에 무손상 상태로 남아있었지만, 대조군 박편에서는 무손상 상태로 남아있는 것이 거의 없었다(데이터에는 나타내지 않음).
래트 척수에 대한 생체내 손상에 이어, 래트를 코넥신 특이적인 안티센스 ODN으로 처치하고, 24 시간 후에 플루오레세인화된-소 혈청 알부민(FITC 태그가 부착된 BSA)을 래트-꼬리 정맥에 주사하였다. 대조군 동물에서는 혈관계로부터 상처 부위에 심지어 5 mm 크기의 돌출부가 있는 주변 조직에까지 광범위하게 염료가 누출된 것이 관찰되었다(도 5A). 이와는 확실하게 반대로, 안티센스 처치된 동물에서는 염료 누출이 모세혈관 층으로만 제한되었을 뿐 그 징후는 거의 나타나지 않았다(도 5B). 코넥신 43을 발현하는 모세혈관 내피세포가 또한 헤미채널을 형성하여 파열된다. 중요하게는, 본원에 제공된 코넥신 43 특이적인 안티센스 ODN 치료가 혈액-뇌 장벽의 파괴, 혈관계의 파괴(재관류 및 회복에 필수적임) 및 손상의 확산을 방지한다. 이러한 결과는 모세혈관/혈관계에서의 상기와 같은 파괴가 중추 신경계로만 한정되지 않으며, 코넥신을 조절하는 것이 혈관 증상의 치료와 같은 광범위한 응용에 유익할 것임을 보여준다. 도 5A(컬러 사진)의 설명부에 기재된 바와 같이, 상기 영상은 허혈성 경색 발생 24 시간 후의 양 심장 심실벽을 3중 표지한 것을 보여준다. 상기 영상을 포함하는 4개의 패널은 조직으로부터 경색 영역까지를 보여준다. 조직을 혈관 내피세포에 결합하는 아이솔렉틴 B4(상부 왼편 패널), 및 Gap7M에 대한 항체(상부 오른편 패널) 및 코넥신 43에 대한 항체(하부 왼편 패널)로 표지하였다. Gap7M 항체는 코넥신 단백질의 보존된 세포외 루프 영역을 인식하므로 코네식 이소형에 특이적이지 않지만, 헤미채널(이들은 무손상 채널내에서의 이들의 에피토프의 접근이 입체적으로 방해됨)을 마킹하지 않는다. 상부 왼편 영상은 상기 영역에 정상적인 모세혈관 구조가 존재함을 보여준다. 활동 중인 심근의 개재판에 헤미채널은 존재하지 않지만(상부 왼편), 코넥신 43은 존재하였다(하부 왼편). 하부 오른편 패널은 다른 3 개의 영상이 중첩된 것을 보여준다. 우세하게 근육 세포와 결합된 것처럼 모세혈관벽과 중첩되는 코넥신 43 표지는 거의 없었다. 도 5B(컬러 사진)의 설명부에 기재된 바와 같이, 상기 영상은 허혈성 경색 발생 24 시간 후에 양 심장 심실벽을 3중 표지한 것을 보여준다. 보이는 영역이 경색부로부터 멀리 떨어져 있지만, 도 5B에 나타난 것보다 경색부에 보다 가깝다는 것은 조직이 혈관 내피세포에 결합하는 아이솔렉틴 B4(상부 왼편 패널)로 표지되었음을 보여준다. 대부분의 혈관은 여전히 무손상 상태였지만, 여러 영역(보다 넓게 분산된 표지 영역)에서 혈관벽이 파열되었다. Gap7M에 대한 항체(상부 오른편 패널)가 헤미채널을 표지한다. 조밀한 헤미채널 표지의 신장된 패치가 분명하게 나타났다. 하부 외편 패널은 코넥신 43의 항체 표지화를 보여준다. 이들 처음 3 개의 패널을 주의 깊게 비교하거나, 다른 3 개가 중첩된 것을 보여주는 하부 오른편 패널에 나타난 패턴을 분석한 결과, 코넥신 43이 근육 세포와 독특하게 결합되어 있다는 것을 보여준다. 그러나, 헤미채널 항체는 파열되는 것으로 나타나는 혈관벽의 동시-표지된 영역을 갖는데, 이는 이들 영역에 코넥손 헤미채널이 존재함을 나타낸다. 도 5C(컬러 사진)의 설명부에 기재된 바와 같이, 상기 영상은 허혈성 경색 발생 24 시간 후에 양 심장 심실벽을 3중 표지한 것을 보여준다. 나타난 영역은 경색 부위 그 자체내에 속한다. 조직을 혈관 내피세포에 결합하는 아이솔렉틴 B4(상부 왼편 패널)로 표지하였다. 대부분의 혈관이 파열된 것으로 나타났다(지속적이지 않은 라인으로, 보다 광범위하게 분산된 표지화 영역). Gap7M에 대한 항체(상부 오른편 패널)가 헤미채널을 표지한다. 조밀한 헤미채널 표지의 다중 패치가 전체 패널에 걸쳐 분명하게 나타났다. 하부 왼편 패널을 코넥신 43의 항체 표지를 보여준다. 이들 처음 3 개의 패널을 주의깊게 비교하거나, 다른 3 개의 패널이 중첩된 것을 보여주는 하부 오른편 패널에 나타난 패턴을 분석한 결과, 코넥신 43은 근육 세포에 결합되지만, 심장 근육의 개재판에서의 일반적인 코넥신 43의 표지와는 매우 다르게 짧은 패치 형태로 표지되었다. 이는 근세포가 또한 상기 중앙 경색 영역에서 심각하게 손상되었음을 나타낸다. 헤미채널 항체를 파열되는 것으로 나타난 혈관벽의 동시-표지된 확장된 영역을 갖는데, 이는 혈관벽에 코넥손 헤미채널이 존재함을 나타낸다. 이러한 헤미채널 발현 후에 외관상 무손상 상태로 남아있는 모세혈관은 거의 없었다. 이 때, 도 6b에서와 같이, Gap7M 항체 표지는 코넥신 43 표지와 동일한 위치에 배치되지 않으며(척수에서와 같음 도 2B), 이는 이들이 상이한 갭 정션 단백질 이소형, 가장 가능하게는 코넥신 45이어야 함을 나타낸다(문헌 [Camelliti, P., et al., Cardiovasc. Res. 62:414-425(2004)] 참조).
실시예 2: 심혈관계
본 실시예에서는 허혈성 조직 손상부에 인접한 모세혈관 층에서의 혈관 통합성을 유지하기 위한 갭 정션 헤미채널의 조절 및 역할을 조사하였다. 무균 겔 발포체를 왼쪽 두부 아래 또는 회선 동맥을 통해 전달하여 경벽성 심근 경색을 도입시켰다. 겔은 본질적으로 문헌 [Devlin, G., et al., J. An ovine model of chronic stable heart failure. J. Card. Fail. 6:140-143(2000)]의 방법에 따라 전달하였다. 모세혈관 내피세포를 아이솔렉틴-B4로 표지한 결과 허혈성 조직에 인접한 모세혈관 층이 파괴되는 것을 나타났다. 본 발명자들은 출원 당시 양 경색증 모델에서 진행성 경색증을 분석하였으며(문헌 [Camelliti et al., Spatially and temporally disctinct expression of fibroblast connexins after sheep infraction, Cardiovascular Research, 62:415-425(2004)]), 이것이 갭 정션 매개된 방관자 효과에 의해 유발된 것이라고 제안하였다. 본원에 나타낸 데이터는 갭 정션 매개된 방관자 효과의 주요 역할이 내피세포 파열 및 이에 따른 갭 정션 헤미채널의 발현과 관련이 있음을 나타낸다. 아이솔렉틴-B4, 코넥신 43 및 헤미채널 항체를 사용한 24-시간 허혈성 양 심장의 삼중 표지화의 데이터는 이러한 경우에는 헤미채널이 코넥신 43이 아니라 코넥신 45로 나타난다는 것을 보여준다(도 6a, 6b, 6c). Gap7M 항체가 코넥신 단백질의 제1 세포외 루프의 보존된 영역을 인식하고, 코넥신 특이적이지 않으며, 이것이 다수의 코넥신 군 구성원과 교차 반응함에 유의한다. 코넥신 45는 허혈성 심장 손상에 따라 상향조절되는 제1 코넥신이다(문헌 [Camelliti et al, 2004]). 이들 일련의 패널(도 6a, 6b, 6c)은 혈관벽에 대한 손상이 외관상 경색 영역으로부터 멀리 떨어져 있지 않지만(도 6a), 경색 영역에 가까워질수록 점점 악화되며(도 6b), 이 때 헤미채널도 발현된다는 것을 보여준다. 헤미채널 단백질의 발현 수준이 높은 경색 영역 자체 내에서(도 6c), 모세혈관벽이 광범위하게 파열되었으며, 근세포 개재판(코넥신 43 갭 정션이 위치함)이 분산되었다. 도 6(컬러 사진)의 설명부에 기재된 바와 같이, 상기 영상은 허혈 발생 24 시간 후에 양 심장 심실 경색부의 근세포 근절내의 모세혈관 내피세포를 마킹한 아이솔렉틴 B4(상부 패널) 및 M 라인을 마킹한 마이오메신 항체 표지(중간 패널)를 나타낸다. 이 영역은 도 6c에 도시된 바와 동일하다. 혈액 모세혈관은 완전히 파열되었고, 정상적인 근세포 근절의 밴딩 패턴이 파괴되었으며, 이는 혈관벽이 붕괴됨과 동시에 근육 세포가 사멸됨을 나타낸다. 하부 영상은 상부 2개의 영상을 중첩시킨 것으로, 파열된 모세혈관과 비정상적인 근육 밴드 표지 사이의 관계를 보여준다.
도 7은 근절의 M-밴드를 표지하는 마이오메신에 대한 항체를 사용하여 설명된 근절 파괴와 관련된 경색부내에서의 파열된 혈관의 아이솔렉틴 B4 표지를 보여준다. 신경 조직에서와 같이, 수반되는 혈관벽에 대한 손상에 따라 헤미채널이 발현되고, 세포 사멸은 일반적으로 중요해졌으며, 이는 헤미채널 개방의 결과였다.
30분 동안 감압시키고 매질 중 헵탄올(비특이적인 갭 정션 채널 차단제)로 재관류시킨 심장에서 과수축 및 근세포 사멸을 초래하는 산소 파라독스(paradox)가 저해된다고 보고된 바 있다(문헌 [Garcia-Dorada et al., Circulation 96:3579-3586(1997)]). 이들 저자는 과수축이 갭 정션을 통해 인접한 근 세포에 전달될 수 있다고 보고하였다. 본원 발명의 데이터는 30분 이내에 헤미채널 발현이 과수축에 중요한 역할을 수행할 수 있다는 의견과 일치한다.
병리학적 상태에서의 증가된 갭 정션 단백질 발현 및 헤미채널 개방은 허혈성 손상된 조직 주변의 영역에서 내피세포 파열 및 심장 혈관계의 파괴를 초래한다. 이러한 발견은 본원에 최초로 기재된 것으로, 재관류 손상의 치료에 매우 중요하며 진행성 경색증의 가능한 메카니즘인 것으로 여겨진다(문헌 [Robbins, S. and Cotran, R. 1979. Pathologic basis of disease. 2nd Edition. WB Saunders Company, Philadelphia]).
실시예 3: 모방체 펩티드 설계
모방체 펩티드 설계
이 실시예에서, 9개의 중첩 펩티드 모방체가 코넥손 도킹 과정에 포함된 것으로 여겨지는 코넥신 43 세포외 루프 영역과 동일한 아미노산 서열을 갖도록 설계하였다(문헌 [Foote et al., JCe// Biol 140(5): 1187-97,(1998)]). 이러한 특정 펩티드는 모두 11-13개의 잔기로 설계되었다. 일부 펩티드에는 증진된 기능성 억제가 나타나는 알파 나선 막횡단 서브유닛의 외부에 부합되는 아미노산이 포함된다. 이들 모든 펩티드가 세포외 루프 영역 내 코넥신 서열의 보존에 기인한 특이적 코넥신 43에 필요한 것은 아니다.
코넥손 43(헤미채널)에 표적화된 펩티드를 하기에 나타내었다. M1, 2, 3 및 4는 각각 코넥손 43 단백질의 제1 내지 제4 막횡단 영역을 나타낸다. E1 및 E2는 각각 제1 및 제2 세포외 루프를 나타낸다.
Figure pat00011
실시예 5: 모방체 펩티드의 기능성 시험
펩티드를 사용하여 2가지 기능성 시험을 수행하였다. 이들 기능성 시험은 (i) 척수 슬라이스에서 세포에 의해 흡수된 염료(루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow))의 차단, 및 (ii) 척수 절편에서의 부종 예방(양성 대조군으로서 코넥신 43 특이적 안티센스 사용)이었다. 사용된 모든 펩티드는 시그마-게노시스(Sigma-Genosys, 호주)에 의해 합성된 것이다.
척수 슬라이스에서의 세포에 의해 흡수된 염료(루시퍼 옐로우 ) 차단
루시퍼 옐로우는 수용성이며, 고정가능하고 갭 정션 채널을 통해 세포에서 세포를 통과할 수 있으나, 세포막은 가로지를 수 없는 작은 염료이다. 루시퍼 옐로우를 세포외 매질에 첨가하여 개방 갭 정션 헤미채널의 존재를 점검할 수 있다. 상기 염료는 개방 채널을 나타내는 세포의 세포질내에서 나타날 것이다.
위스타(Wistar) p7 래트를 이산화탄소로 마취한 직후 목을 베었다. 척수를 절개하고, pH 7.4에서 냉 행크(Hank) 평형염액(HBSS)으로 전달하였다. 과량의 신경 가지 및 인대를 제거하고, 척수를 수동 조직 초퍼로 전달하고, 일련의 500 마이크론 두께의 슬라이스로 절단하였다. 슬라이싱에 의한 손상은 전체 슬라이스를 통한 코넥신 43 상향조절을 유도하고(갭 정션 매개 방관 효과에 의해 악화됨), 코넥신 헤미채널의 발현을 야기한다. 슬라이스를 24 웰 플레이트 내의 직경 3 cm의 밀리포어(Millipore) 삽입물내에 위치시키고, 매질내 모방체 펩티드의 존재하에 배양하였다. 시험된 모든 9개 펩티드의 최종 농도는 500 μM이었다. 대조군은 펩티드가 첨가되지 않거나, 일부 펩티드를 이들 화합물(펩티드는 동결건조됨) 중에 재용해시켜 1％ 에탄올 또는 1％ DMSO와 함께 첨가한 것이다. 이때, 일부 슬라이스 대조군으로서 30％ 플루로닉 F-127 겔 중 코넥신 43 특이적 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 겔 만으로 처리하였다. 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드로 처리된 슬라이스는 안티센스가 코넥신 발현에 따른 염료 흡수를 예방함으로써, 양성 대조군으로서 작용하는 것을 나타낸다.
슬라이스를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 루시퍼 옐로우 2.5 mg/ml를 각 웰에 30분 동안 첨가하였다(암실에서). 이어서, 상기 조직을 PBS 중에 2회 세척한 후, 추가 10분 동안 3회 세척하고, 슬라이스를 4％ 파라포름알데히드로 고정시켰다. 이어서, 레이카(Leica) TCS4D 레이저 스캐닝 동초점 현미경을 사용하여 이들을 관찰하여 세포내로의 염료 흡수 여부를 평가하였다.
매질만으로 배양된 슬라이스, 및 DMSO, 에탄올 및 겔만 처리된 슬라이스는 유의한 염료를 흡수하는 것으로 나타났다. 코넥신 43 처리된 슬라이스는 염료 흡수성이 없었다. 펩티드 처리된 슬라이스(펩티드
Figure pat00012
(중첩 서열 포함)로 처리한 것은 제외)에서는 상당한 염료 흡수성이 나타났다.
서열
Figure pat00013
를 갖는 펩티드로 처리된 슬라이스에 대한 염료 흡수 수준을 대조군 슬라이스와 비교하였다.
요약하면, 이들 데이터는 척수 슬라이스가 손상 후 4시간 이내에 개방된 헤미채널을 나타냄을 제시한다. 중요하게는, 이 데이터는 또한 서열 35 및 36에 상응하는 펩티드가 헤미채널의 개방을 예방 및/또는 차단 및/또는 폐쇄하고, 및 종창을 에방할 수 있음을 제시한다.
척수에서의 부종 예방
실시예 1에 기술된 시스템을 사용하여 배양된 척수 절편 상의 펩티드 VDCFLSRPTEKT(서열 35) 및 SRPTEKTIFII(서열 36)의 효과를 평가하고, 종창을 차단하는 이들의 능력을 시험하였다.
펩티드 QQPGCENVCYDK(서열 39)는, 상기 기술된 슬라이스 배양물 중의 염료 흡수를 가능하게 하기 때문에 음성 대조군으로 사용하였고, 이로써 절편에서의 부종을 차단할 수 없는 것으로 여겨진다. DMSO를 다시 추가 대조군으로서 사용하였다.
5 mm 길이의 척수 절편을 HBSS 내 24 웰 플레이트의 분리 웰 상에 놓았다. 작은 슈퍼글루(Superglue) 점적제를 사용하여 웰의 바닥에 절편을 고정시켰다. HBSS를 제거하고, 500 μM 펩티드(최종 농도)를 매질(매질 단독 또는 DMSO 대조군에 대한 펩티드 없음)에 첨가하였다. 상기 플레이트를 24시간 동안 인큐베이션하고, 매질을 제거하고, 조직을 부인(Bouin) 고정물로 24시간 동안 고정시켰다. 이미지(Image) J로 상기로부터의 척수 절편 촬영을 포함하는 분석을 사용하여 절편의 절단 말단에서의 종창 부위와 비교한 척수 절편의 총 영역을 계산하였다. 종창(부종)을 측정하여(배양 영역-원 영역/원 영역) 종창률％을 구하였다. 단일 인자 분산 분석을 사용하여 통계적 유의도(유의도는 p=0.05인 수준에서 삭제)를 측정하였다.
DMSO 처리된 척수 절편은 모든 대조군 척수 절편(21-23％)에서 가장 많이 팽창(33％)하는 것으로 나타났다. 펩티드 QQPGCENVCYDK(서열 39)로 처리된 절편은 23％ 팽창하였으나, 펩티드 VDCFLSRPTEKT(서열 35) 및 SRPTEKTIFII(서열 36)로 처리된 절편은 각각 감소된 15 및 17％로 팽창하였다(도 8). 펩티드 VDCFLSRPTEKT(서열 35) 및 SRPTEKTIFII(서열 36) 처리된 척수 절편과 대조군 사이의 차이는 유의하였다(p=0.43). 다음의 조직학 시험은 펩티드 SRPTEKTIFII(서열 36)로 처리된 절편이 더 나은 형태를 보유하였으므로, 뒤이은 투여 반응 시험도 이 펩티드로 수행하였다.
동일한 프로토콜을 사용하여, 척수 절편에서 부종을 차단하기 위한 가장 효과적인 펩티드 SRPTEKTIFII(서열 36) 농도를 측정하였다. 이러한 경우에, 투여 반응은 5, 10, 50, 250 및 500 μM의 펩티드 최종 농도에서 결정하였다. 결과를 도 8에 나타내었다. 흥미롭게도, 매질 단독과 비교하였을 때, 펩티드의 최저 농도(5 μM)로 가장 우수한 결과(최소 부종)를 얻었다(p= 0.001). 중간 범위인 50 μM은 반복 실험에서 다소 덜 효과적이었다.
면역조직화학 분석은 배양 24시간 후의 펩티드 SRPTEKTIFII(서열 36)로 처리된 절편에서 성상세포증(GFAP 발현)이 감소함을 제시하였다. 사용된 농도 차이가 부종 실험에서 보다 덜 드러나긴 했지만, 염증성 반응을 예방하는 데 또다시 5 μM이 가장 효과적이었다. 모든 치료에서 신경교섬유 산성 단백질(GFAP) 발현이 유의하게 감소(이미지 J를 사용하여 분석한 단면 영역 당 표지 영역)(표 7)하는 것으로 나타났다.
본 발명자들의 실험에서는 선별된 펩티드 모방체(서열 36)의 출생전후 양 실험(이러한 태아 연령에서 평균 25 g)에 대해 인공 CSF i.c.v.(대 CSF 비히클 단독) 1 ml 중 5 μmol/뇌 중량kg을 1시간에 걸쳐 투여한 다음, 추가 1 ml/일을 72시간 동안 뇌에 주입하는 것이 상당한 효과를 가지는 것으로 나타났다. 약 5 μmol/뇌 중량kg 뇌, 50 μmol/뇌 중량kg 및 250 μmol/뇌 중량kg을 투여하는 것도 가능하다. 정맥내(전신전달) 투여에 대하여, 혈장 농도에서의 로그차(log-order) 효과 증가를 사용하여 적절한 투여량(0.5 μmol/L(평균 태아 혈액 부피는 출생 전후기 양에서 대략 350 ml임)에서 출발하여 5, 10, 50, 250, 500 및 5000 μM 달성)을 결정할 수 있다.
이미지 J는 NIH가 처음 개발한 자바 스크립트 오픈 소스, 공개 도메인 이미지 분석 소프트웨어(NIH 이미지로도 불림)이다.
처리 GFAP 표지 영역 (제곱 단위)
대조군 2450
5 μM 펩티드 5 300
50 μM 펩티드 5 950
250 μM 펩티드 5 1000
500 μM 펩티드 5 750
표 7: 슬라이싱 24시간 후 척수에서의 GFAP 표지 영역. 대조군 척수는 처리 절편에서보다 염증성 반응을 나타내는 GFAP 수준이 더 높고, 방관 효과도 더 높다. 보다 낮은 펩티드 농도가 성상세포증 제한에서 가장 효과적이다.
활성화된 미세아교 세포수는 기대한 바와 같이 24시간째에 차이를 보이지 않았다. 이러한 이차 염증성 과정(휴지 미세아교 세포 에서 대식새포 표현형으로의 분화 및 증식 현상)에는 일반적으로 3-7일이 소요된다.
실시예 6: 출생전후 양 모델에서의 허혈 및 간질양 뇌 활성을 차단하기 위한 코넥신 특이적 모방체 펩티드의 생체내 용도
대뇌 허혈로부터 야기된 뇌 손상은 모든 생명 단계에서 상당한 문제로 남아있다. 신생아에서, 출생시 심각한 손상의 완화는 1000명의 생존자 당 2 내지 3명에서 일어난다. 가장 충격적인 특징 중 하나는 손상이 시간에 걸쳐 가장 심각하게 손상된 영역에서 외향으로 및 이전에 손상되지 않은 영역으로 퍼지는 것이다. 대뇌 허혈이 일어난 직후, 몇 시간 동안 지속되는 뇌 대사가 일시적으로 회복된다. 그러나, 이러한 회복 후에, 초기 손상후 최대 36 내지 48시간에 이차 세포 종창과 커플링된 진행성 미토콘드리아 기능상실이 나타난다.
아교세포와 뉴런 사이의 갭 정션의 활성화 커플링은 세포 사멸 신호가 사멸중인 세포로부터 덜 손상되거나 건강한 세포로의 전달을 매개한다. 초기 연구에서 갭 정션 단백질 코넥신 43 특이적 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드의 생체내 국소 용도가 손상의 확장 및 외상에 따른 이차 염증을 제한할 수 있음을 밝혀냈다(문헌 [WO2000/44409 to Becker, D. and Green. C, entitled "Formulations Comprising Antisense Mucleotides to Connexins."] 참조).
양의 출생전후 허혈에 대한 생체내 모델에서 펩티드 SRPTEKTIFII(서열 36)를 사용하였다. 상기 데이터는 코넥신 특이적 모방체 펩티드가 허혈성 출생전후 뇌에서의 이차 손상 또는 졸중에 따른 이차 손상을 유의하게 감소시키는 잠재적인 치료를 제공하는 것으로 나타났다. 예비 분석은 만기 양 태아에서의 대뇌 허혈 24시간 후에 갭 정션 헤미-채널(즉, 커플링되지 않은 코넥손)의 발현이 증가함을 제시하였다(도 9).
롬니-수폴크(Romney-Suffolk) 교차 양 태아는 임신 117 내지 124일(0.85 만기) 사이에 문헌([Gerrits et al, Pediatr Res 57(3):342-6,(2005)]; [Guan et al., Neuroscience 95(3):831-839,(1999)]; [Guan et al., J Cereh Blood Flow Metab 21(5):493-502,(2001)]; [Gunn et al., J Clin Invest 99(2):248-256,(1997), Gunn et al., Pediatrics 102(5):1098-1106,(1998)]; [Gunn et al., Pediatr Res 46(3):274-280,(1999)]; [Roelfsema et al., J Cereb Blood Flow Metab 24(8):877-886,(2004)])에 자세히 기재되어 있는 바와 같이 일반적인 마취하에 기구를 설치한다. 기구에는 태아 목동맥 주변의 상완동맥 및 정맥 카테터, EKG 전극, 팽창성 차단기(문헌 [Gunn et al., 1997]; [Roelfsema et al., 2004)], 체벽 EEG 전극(정수리에서 전방 5 및 15 mm 및 측방 10 mm, 이의 측방에 위치한 전극쌍으로 피질 저항(세포독성 부종) 측정([Gunn et al., 1997]), 및 길이 17 mm-좌측 i.c.v. 정수리에서 전방 4 mm 및 측방 6 mm 캐뉼라)가 포함된다. 기구는 모체 측면, 자궁 및 폐쇄된 복벽으로 꺼내고, 태아 혈관 카테터(20 IU/ml)에 헤파린을 첨가하였다. 모체의 상처는 오래 지속되는 국소 마취성 부피바카인(100 mg/20 ml)으로 침윤시켰다.
회복 5일 후, 양쪽 목동맥을 30분 동안 폐색시켜 태아 대뇌 관류감소를 유도하였다(문헌 [Gunn et al., 1997]; [Roelfsema et al., 2004]; [Tan et al., Ann Neurol 32(5):677-682,(1992)]; [Tan et al., Pediatr Res 39(5):791-797,(1996)]). 허혈 후 90분에 코넥신 모방체 펩티드 5를 뇌심실내에 주입하고 72시간 동안 지속시켰다. 인공 CSF i.c.v. 중 펩티드 모방체 5(대 CSF 단독 비히클) 5 μmol/뇌 중량kg(이러한 태아 연령에서 평균 25 g)을 1시간에 걸쳐 투여한 다음, 1일 당 추가 1 ml를 72시간 동안 뇌에 관류시켰다. 과량의 나트륨 펜토바르비탈(30 ml, 300 mg/ml)을 모체의 정맥내 투여하여 상기 실험을 종료하였다. 조직학 및 면역조직화학적 분석을 위해 태아의 뇌를 제거하였다.
펩티드의 초기 주입이 후발성 지연 발작 활성 및 세포독성 부종을 약화시키는 결과가 나타났다(도 10).
요약하면, 이들 데이터는 코넥신 43 헤미채널의 세포외 도메인을 표적으로 하는 펩티드 모방체 단백질은 뇌 허혈에 따른 후발성 부종 및 염증을 억제할 수 있음을 나타낸다. 만기 양 태아에서, 본 발명자들은 만기 태아에게 펩티드 모방체 단백질을 i.c.v 주입하여 재관류 90분 후 후발성 발작 및 세포독성 부종이 상당한 약화되는 반면, 대뇌 허혈은 허혈 후 24시간 이내 코넥신 43 및 헤미채널의 주입과 관련이 있음을 발견하였다.
실시예 7: 코넥신 43 특이적 안티센스를 가진 인간 환자의 아급성 상처 치료 - 혈관 지고병의 예방으로 사지 허혈의 회복이 가능함
본 연구에서, 환자는 눈에 아급성의 치유되지 않은 상처(화학적 화상)를 가졌다. 눈은 염증 상태였고, 사지 허혈은 8일 후에 여전히 존재하였다(사지 혈관분포가 빈약한 것으로 나타남). 가장자리에는 각막의 상피 회복에 필요한 중기 세포가 함유되어 있다. 코넥신 43 특이적 안티센스로 치료한 후, 사지 허혈은 20시간 이내에 사라졌고 재상피화가 시작되었다. 염증이 지속되면 혈관의 지속성 지고병이 사지 허혈을 통한 손상을 악화시킨다는 결론을 내렸다. 코넥신 43 안티센스로 눈을 치료하여 염증성 반응을 감소시키고, 상피 회복(문헌 [Qiu et al., Curr Biol 13:1697-1703,(2003)])을 촉발시켰다. 그러나, 아급성 상처의 치료로 만성 상처(인간에서의 만성 상처는 상피 선도연에 높은 수준의 코넥신 43을 보유함(문헌 [Brandner et al., J Invest Dermatol 122:1310-1320,(2004)]))에 대한 치료도 가능함을 암시함에 주의한다. 또한, 상기 치료는 혈관 회복도 가능하게 하였다. 본 발명자들은 포함된 메카니즘이 혈관 벽에서의 추가 헤미채널 발현의 예방은 혈관 재성장을 가능하게 한다.
환자: 환자는 25세 남성이었다. 그는 먼저 염기성 화상을 입었고, 고압 콘크리트 호스 사고로 눈 부위에 상처가 형성되었다(응급처치 지연으로 눈에 콘크리트/염기성 상처). 손상된 눈은 눈 앞면을 덮는 표피(전체 각막 포함)가 남아있지 않았다.
초기 치료: 환자에게 10％ 아스코르베이트 점적제, 10％ 시트레이트 점적제, 1％ 프레드니손 아세테이트(스테로이드) 점적제, 1％ 시클로펜탈레이트, 클로람페니콜, 및 경구 비타민 C 및 데옥시시클린을 투여하였다. 프레드니손을 처음 5일 동안 1시간마다 전달한 후, 투여량을 1일 4회로 줄였다.
4일째, 양막을 각막 상에 봉합시켰다.
코넥신 43 안티센스 치료(0일째): 손상 후 8일째, 환자는 여전히 염증, 사지 허혈 정도가 심했고, 상피 회복의 징후는 보이지 않았다. 환자의 눈을 구할 수 있는 별법의 임의로 실행가능한 치료가 존재하지 않음을 기초로 윤리 승인을 받았다. 다른 눈은 원추각막의 징후가 보였으므로, 후기의 사지 이식에 적합하지 않았다. 손상된 눈을 수술로 제거하거나, "결막성 눈"이 되게 하였다(백색 덮개 형태의 결막은 눈 전체로 퍼져 환자가 맹인이 되게 함).
30％ F-127 플루로닉 겔 중 코넥신 43 안티센스를 각막의 다른 쪽 두 위치에서 양막하에 카테터 바늘로 주사하였다. 2 μM 항-코넥신 43 대략 100 ㎕를 주사하고, 양막 상에 면 막대를 사용하여 각막 주위로 온화하게 퍼지게 하였다. 겔을 저온에서 주사하고 곧 연질의 젤리와 같은 물질로 되었다. 8시간 동안 환자의 모든 다른 치료를 중단하여 치료상의 잠재적인 부작용을 회피하였다. 이어서, 환자에게 스테로이드 점적제(1일 당 3회), 시클로펜탈레이트(1일 당 1회) 및 아스코르베이트, 시트레이트, 클로람페니콜 점적제(1일 당 4회)를 투여하였다.
코넥신 43 안티센스 치료(1일째): 코넥신 43 안티센스 치료 후 20시간 내에, 눈은 실질적으로 잠잠해졌고(염증 감소), 표피는 3곳에서 자라났다. 가장자리에는 양호하게 혈액이 흐르는 혈관 분포가 되어 있고, 사지 허혈의 징후는 없었다(즉, 치료 후 20시간 이내에 사지로 혈류가 충분히 흐름).
코넥신 43 안티센스(3일째): 코넥신 43 안티센스 치료 후 72시간 내에, 환자는 계속해서 개선되었다. 눈은 염증이 감소되었고, 사지 혈액 공급은 훌륭했으며, 표피는 360도 주변에서 자라고 있었다. 한 면에서 적은 영역에 라멜라포디아 크롤링(lamellapodial crawling)이 나타났으나, 나머지 각막 주변에 안쪽으로의 성장도 양호하였다.
코넥신 43 안티센스 치료(6일째): 치료 후 6일(손상 후 14일째) 내에, 여기저기에 다소 과립모양과 고르지 못하거나 얇은 부분이 나타났으나(양막을 통한 외양으로 평가), 표피는 완전히 회복되었다(전체적으로 완전한 성장). 사지 영역은 충분하게 혈액이 흐르도록 혈관 분포가 잘 되어 있었다.
치료 40일째에, 환자는 비보조시력이 6/48이었고, 6/15 천공으로 화학적 화상에 대해 훌륭하게 회복되었다. 표피의 2/3가 절대적으로 건강하였고, 말초의 1/3은 일부 결막이 성장하였으나, 동공을 덮거나 혈관이 분포되지는 않았다. 사지 혈관 분포가 매우 우수하였다.
시신경 신경병증
허혈성 시각 신경병증(ION)(시신경 졸중으로도 알려져 있음)은 혈액 공급이 시신경에 영향을 미치는 질환의 일군이다. ION은 소재 또는 병인론을 기초로 분류될 수 있다. 전방 ION(AAOIN)은 사상판 앞쪽의 신경 절편에 영향을 미치는 질환을 나타내며, 반대쪽은 후방 ION(PION)이다(문헌 [Buono et al., Survey of Ophthalmology 50:15-26,(2005)]; [Collignon et al., Ophthalmology 111:1663- 1672,(2004)]). PION은 비교적 덜 관찰되며, 시신경의 안와내부 경색증에 의해, 대부분 거대 세포 동맥염(GCA) 또는 수술 절차의 후발성 합병증에 의해 야기되는 것으로 여겨진다(문헌 [Buono and Foroozan, 2005]; [Ho et al., Journal of Neurosurgical Anesthesiology 17:38-44,(2005)]). 또한, ION은 병인론을 기초로 하여 동맥성(동맥염 ION) 및 비-동맥성(NAION)으로 나뉠 수 있다. 동맥성 ION은 항상 GCA에 의해 야기되며, 일반적으로 후방 섬모 동맥의 혈전성 폐색증을 가져오는데, 이는 시신경의 다른 동맥의 동시 폐색을 일으킬 수 있다(문헌 [Galasso et al., Seminars in Ophthalmology 19:75-77,(2004)]). NAION은 연 발병율이 2.3/10,000인 비-녹내장성 시각 신경병증의 가장 일반적인 형태이다(문헌 [Collignon-Robe et al., Ophthalmology 111:1663-1672,(2004)]). GCA는 염증성 거대 세포수의 증가를 특징으로 하는, 뇌에서의 대혈관 및 중혈관의 만성 혈관염이다(문헌 [Buono et al., Survey of Ophthalmology 50:15-26,(2005)]; [Khosla et al., Journal of Postgraduate Medicine 50:219- 221,(2004)]; [Penn et al., Autoimmunity Reviews 2:199-203,(2003)]). 시력 상실은 통상적인 것이 아니라, 시신경을 공급하는 전방 혈관의 폐색으로 인한 후발성 합병증으로서 일어나며, 종종 비가역적이다(문헌 [Khosla et al., 2004]). 서방 국가에서의 GCA의 발병은 1-30/10,000의 범위이며, 50세 이상의 개체군에서 더 많이 일어난다(문헌 [Penn and Dasgupta, 2003]).
ION의 전형적인 결과는 시력 저화 또는 심지어 시력 손실을 동반한 액손관의 퇴화이다(문헌 [Buono et al., 2005]; [Khosla et al., 2004]; [Penn and Dasgupta, 2003]).
ION의 통상적 치료에는 코르티코스테로이드 및 항혈소판제가 포함되나(문헌 [Arnold et al., Seminars in Ophthalmology 17: 39-46,(2002)]), 이들 약물로 처리된 환자에서는 상기 질환의 상당한 개선이 보이지 않았다.
시신경에서, 성상세포 및 올리고가지세포는 둘다 코넥신 분자를 발현한다. 코넥신 43은 성상세포에서 풍부하게 발견되고, 잠재적으로 다양한 질환 과정에 포함된다. 시신경내 혈관 내피세포는 또한 코넥신 43도 발현한다.
이러한 연구에서, 생체외 모델에서 시신경 허혈을 유도하고, 신경 절편을 코넥신 43 특이적 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(30％ F-127 플루로닉 겔 또는 대조군 겔로 전달됨)로 처리된 기관형적 배양물에 배치하였다.
조직 제조:
생후 21일 내지 25일령 위스타 래트(p21 내지 p25)를 사용하였다. 이산화탄소를 과다투여하여 위너 래트를 희생시키고, 정중시상 방향으로 두개골을 개방하고, 소뇌 미골부의 뇌 영역으로 연습하고 폐기하였다. 이어서, 후각엽 아래를 절개하여 시신경의 두개내 영역을 드러내었다. 시각관의 시각 교차점과 종말점을 연결하는 시신경 대략 0.3 내지 0.5 mm를 이러한 방법을 통하여 수득할 수 있다. 이어서, 신경을 하기와 같이 허혈에 적용시켰다.
CNS 허혈 상에서 작용하는, ION 프로토콜의 생육가능한 기관형적 배양 모델이 문헌 [Sundstrom et al., Drug Discovery Today 10:993-1000,(2005)]에 시사되어 있다. 실험에 앞서, 배지 1O mL를 글루코스가 없는 팔콘 튜브내에서 제조하고, 글루타민을 95％ N2 및 5％ CO2 기체 혼합물로 30분 동안 버블링하여 산소를 제거하였다. 절개된 시신경을 산소 글루코스 결핍(OGD) 용액으로 전달하고, 파라필름 및 셀로판으로 밀봉하였다. 시신경을 허혈성 용액 중에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 필요한 시간 동안 기관형적 배양 조건으로 복귀시켰다.
간기 배양 방법론을 사용하였다. OGD 용액 중에 인큐베이션한 후에, 시신경을 반-다공성 막에 위치시키고, B27 보충물, D-글루코스 및 L-글루타민 및 항생제(기브코(Gibco), 미국)로 충전된 뉴로베이살(Neurobasal) 배지 1 ml를 함유하는 6웰 플레이트에 두었다. 안티센스 치료에 있어서, 코넥신 43 번역 차단에 특이적인 lO μM AS-ODN을 함유하는 플루로닉 F-127 겔(#P2443, 시그마, 미국) 7 ㎕를 투여하여, 각 시신경을 덮었다. 이러한 양은 조직을 과다하게 채우지 않고 전체 절편을 덮기에 충분한 양이다. 단지 겔 및 대조군에 있어서, 동일한 양(7 ㎕)의 플루로닉 F-127 겔 및 배지를 각각 신경에 적용시켰다. 이어서, 배양 플레이트를 5％ CO2가 있는 37℃의 온도로 고정된 인큐베이터에 넣었다. 이러한 배양 기술의 주요 이점은 영양분은 바닥부터 확산시킬 수 있고, 산소는 일정하게 상부로부터 공급할 수 있다는 것이다.
배양 후, 신경을 1xPBS(# BR14, 옥소이드, 영국) 중에서 15분 동안 세정하고, 4％ 파라포름알데히드(PFA) 중에서 대략 2시간 동안 고정시킨 후에, PBS 중 20％ 이어서 30％ 수크로스로 동결방지시켰다. 이어서, 추가 과정을 준비할 때까지, 신경을 PBS 중 15％ 수크로스 중에 저장하였다. 조직을 단면으로 절개하기 위해, 시신경을 OCT(#4583, 조직 Tek(등록상표), USA) 중에 끼워 넣고, -20℃에서 냉동시킨 다음, 길이 14 내지 18 μm 두께의 단면으로 절단하였다. 슬라이스를 히스토반드(Histobond) 슬라이드(#0810001, 마린펠트(Marienfeld), 독일) 상에서 수집하고, 추가 처리를 위해 -80℃ 냉동기 내에서 저장하였다.
상기로부터 시신경을 촬영하고,(배양 영역-원 영역/원 영역)을 측정하여 종창률％을 구함하여 종창(부종)을 평가하였다. 요오드화프로피듐을 사용하여 손상된 세포의 핵을 표지하여 세포 사멸을 평가하였다. 신경의 절단 말단 주변과 신경의 중간 영역에서 세포 사멸을 평가하였다.
도 11은 허혈성 손상 후 6시간 및 24시간 동안 배양된 안티센스 및 대조군 처리된 시신경에 대한 투여 반응 곡선을 나타낸다. 도 11A는 종창률을 나타내고, 도 11B는 요오드화프로피듐을 사용하여 신경의 말단 단면(앞) 및 중간에서의 수치로 세포 사멸을 평가하였다. 부종은 코넥신 43 안티센스가 있는 신경에서 감소하였는데, 특히 척수 연구에서의 분쇄 상처에 대해 이전에 적합한 것으로 나타났던 농도(비공개)인 10 μM에서 감소하였다. 안티센스를 사용한 절단 말단 양쪽 및 신경의 중간부에서의 세포 사멸이 감소하였는데, 투여량 의존방식으로 양쪽 영역에서 사멸 세포수가 보다 적었다.
하기 도 12는 종창(부종) 감소가 시간에 따라 유지됨을 나타낸다. 도 13은 허혈 유도 후 2, 6 및 24시간에 대조군 및 코넥신 43 특이적 AS-ODN 처리된 시신경 절편의 중간부에서의 요오드화프로피듐로 염색된 사멸 세포를 나타낸다. 세 시점에서의 대조군과 비교시, 코넥신 43 특이적 AS-ODN으로 처리된 군에서는 거의 염색되지 않은 것으로 나타난다. 도 13에서의 선 그래프는 대조군 및 AS-ODN 처리된 시신경에 대한 신경의 매질 영역에서의 단위 영역당 사멸 세포수를 나타낸다. 대조군에서의 세포 사멸은 초기에 증가하고, 6시간에 피크인데, 그 후 다소 감소한다(아마 단위 영역당 더 적은 세포를 남기는 조직 부종에 기인함). 배양물 중 24시간 후 세포 사멸이 AS-ODN 처리된 조직에 대해서만 경미하게 증가함에 주의한다.
혈관 절편 길이 - 빌레브랜트 ( Willebrand ) 인자 염색
혈관 통합이 허혈성 모델에서 대조군 및 코넥신 43 특이적 안티센스 처리된 시신경의 코넥신 발현 혈관에 의해 절충됨을 입증하기 위해, 내피세포 마커인 빌레브랜트 인자로 표지하였다. 혈관이 파손됨에 따라, 측정되는 더 작은 절편 수 및 절편 길이가 증가하였다. 단면 당 평균 길이 및 혈관수는 각 지점에 대해 두 동물로부터 수득한 6개의 분리 단면 내에 60개 보다 더 많은 것으로 나타났다.
평균적으로, 대조군내 혈관 절편의 수는 모두 코넥신 43 특이적 AS-ODN으로 처리된 신경에서 보다 더 적었다(가장 긴 연구 시간 제외)(표 8). 막대 그래프(도 14)는 코넥신 43 특이적 AS-ODN으로 처리된 시신경에서의 평균 혈관 길이가 처음 3일에 상대적으로 일정하게 남아있는 것으로 나타났으나, 6일째에 대략 30％ 감소하기 시작했다. 유사한 일시적 패턴이 대조군에서도 관찰되었으나, 모든 시점에 대해 평균 혈관 절편 길이는 안티센스로 처리된 군에서보다 유의미하게 더 짧았다.
Figure pat00014
표 8은 대조군 및 처리군에서 측정한 혈관 절편의 평균수를 나타낸다. 처음 3일에, 평균적으로 AS로 처리된 군은 대조군과 비교하여 28 내지 50％ 적은 혈관 절편을 갖는다. 기관형적 배양물 중 6일 후에, AS로 처리된 신경은 24％로 계수된 대조군에서보다 더 많은 수의 절편을 갖는다. 이에 따라, 배양 횟수 연장이 영향을 미칠 수 있다.
이들 실시예는 시신경 허혈에 따른 코넥신 43 발현의 예방이 부종 감소(종창 감소), 병변 확장 감소(원래 손상 부위로부터 멀리 떨어진 단위 영역당 사멸 세포수 감소) 및 혈관 분해 감소를 가져옴을 나타낸다. 그러므로, 실시예 1에서 보고된 것- 척수와 유사한 방식으로 나타난다. 동일한 부종 및 혈관 손실로서의 치료적 용도가 생체내 연구에서 보고되었다(문헌 [Bernstein et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 44:4153-4162,(2003)])
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다른 실시양태를 하기 특허청구범위에 포함된다. 또한, 당업자는 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠시(Markush) 군의 용어로 기재되어 있는 경우에는 본 발명이 그 마쿠시 군의 구성요소 중 임의의 개별 요소 또는 그의 하위군에 해당하는 용어로 기재된 것과 마찬가지임을 인식할 것이다.
<110> CODA THERAPEUTICS LTD <120> ANTICONNEXIN COMPOUNDS AND METHODS OF USE THEREOF <130> E3697-00085 <140> PCT/IB2006/001961 <141> 2006-02-03 <150> US 60/650075 <151> 2005-02-03 <160> 131 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtaattgcgg caagaagaat tgtttctgtc 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtaattgcgg caggaggaat tgtttctgtc 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggcaagagac accaaagaca ctaccagcat 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tcctgagcaa tacctaacga acaaata 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 catctccttg gtgctcaacc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ctgaagtcga cttggcttgg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ctcagatagt ggccagaatg c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ttgtccaggt gactccaagg 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cgtccgagcc cagaaagatg aggtc 25 <210> 10 <211> 19 <212> DNA 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aagtctatct ttgaggtggc cttcttgctg 720 atccagtggt acatctatgg attcagcttg agtgctgttt acacttgcaa aagagatccc 780 tgcccacatc aggtggactg tttcctctct cgccccacgg agaaaaccat cttcatcatc 840 ttcatgctgg tggtgtcctt ggtgtccctg gccttgaata tcattgaact cttctatgtt 900 ttcttcaagg gcgttaagga tcgggttaag ggaaagagcg acccttacca tgcgaccagt 960 ggtgcgctga gccctgccaa agactgtggg tctcaaaaat atgcttattt caatggctgc 1020 tcctcaccaa ccgctcccct ctcgcctatg tctcctcctg ggtacaagct ggttactggc 1080 gacagaaaca attcttcttg ccgcaattac aacaagcaag caagtgagca aaactgggct 1140 aattacagtg cagaacaaaa tcgaatgggg caggcgggaa gcaccatctc taactcccat 1200 gcacagcctt ttgatttccc cgatgataac cagaattcta aaaaactagc tgctggacat 1260 gaattacagc cactagccat tgtggaccag cgaccttcaa gcagagccag cagtcgtgcc 1320 agcagcagac ctcggcctga tgacctggag atctagatac aggcttgaaa gcatcaagat 1380 tccactcaat tgtggagaag aaaaaaggtg ctgtagaaag tgcaccaggt gttaattttg 1440 atccggtgga ggtggtactc aacagcctta ttcatgaggc ttagaaaaca caaagacatt 1500 agaataccta ggttcactgg gggtgtatgg ggtagatggg tggagaggga ggggataaga 1560 gaggtgcatg ttggtattta aagtagtgga ttcaaagaac ttagattata aataagagtt 1620 ccattaggtg atacatagat aagggctttt tctccccgca aacaccccta agaatggttc 1680 tgtgtatgtg aatgagcggg tggtaattgt ggctaaatat ttttgtttta ccaagaaact 1740 gaaataattc tggccaggaa taaatacttc ctgaacatct taggtctttt caacaagaaa 1800 aagacagagg attgtcctta agtccctgct aaaacattcc attgttaaaa tttgcacttt 1860 gaaggtaagc tttctaggcc tgaccctcca ggtgtcaatg gacttgtgct actatatttt 1920 tttattcttg gtatcagttt aaaattcaga caaggcccac agaataagat tttccatgca 1980 tttgcaaata cgtatattct ttttccatcc acttgcacaa tatcattacc atcacttttt 2040 catcattcct cagctactac tcacattcat ttaatggttt ctgtaaacat ttttaagaca 2100 gttgggatgt cacttaacat tttttttttt tgagctaaag tcagggaatc aagccatgct 2160 taatatttaa caatcactta tatgtgtgtc gaagagtttg ttttgtttgt catgtattgg 2220 tacaagcaga tacagtataa actcacaaac acagatttga aaataatgca catatggtgt 2280 tcaaatttga acctttctca tggatttttg tggtgtgggc caatatggtg tttacattat 2340 ataattcctg ctgtggcaag taaagcacac tttttttttc tcctaaaatg tttttccctg 2400 tgtatcctat tatggatact ggttttgtta attatgattc tttattttct ctcctttttt 2460 taggatatag cagtaatgct attactgaaa tgaatttcct ttttctgaaa tgtaatcatt 2520 gatgcttgaa tgatagaatt ttagtactgt aaacaggctt tagtcattaa tgtgagagac 2580 ttagaaaaaa tgcttagagt ggactattaa atgtgcctaa atgaattttg cagtaactgg 2640 tattcttggg ttttcctact taatacacag taattcagaa cttgtattct attatgagtt 2700 tagcagtctt ttggagtgac cagcaacttt gatgtttgca ctaagatttt atttggaatg 2760 caagagaggt tgaaagagga ttcagtagta cacatacaac taatttattt gaactatatg 2820 ttgaagacat ctaccagttt ctccaaatgc cttttttaaa actcatcaca gaagattggt 2880 gaaaatgctg agtatgacac ttttcttctt gcatgcatgt cagctacata aacagttttg 2940 tacaatgaaa attactaatt tgtttgacat tccatgttaa actacggtca tgttcagctt 3000 cattgcatgt aatgtagacc tagtccatca gatcatgtgt tctggagagt gttctttatt 3060 caataaagtt ttaatttagt ataaacat 3088 <210> 13 <211> 1308 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atgggcgact ggagctttct gggaagactc ttagaaaatg cacaggagca ctccacggtc 60 atcggcaagg tttggctgac 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ggacccacag gtggagcggg cgctggccgg catagagctt cagatggcca agatctcggt 480 ggcagaagat ggtcgcctgc gcattccgcg agcactgatg ggcacctatg tcgccagtgt 540 gctctgcaag agtgtgctag aggcaggctt cctctatggc cagtggcgcc tgtacggctg 600 gaccatggag cccgtgtttg tgtgccagcg agcaccctgc ccctacctcg tggactgctt 660 tgtctctcgc cccacggaga agaccatctt catcatcttc atgttggtgg ttggactcat 720 ctccctggtg cttaacctgc tggagttggt gcacctgctg tgtcgctgcc tcagccgggg 780 gatgagggca cggcaaggcc aagacgcacc cccgacccag ggcacctcct cagaccctta 840 cacggaccag ggtcttcttc tacctccccg tggccagggg ccctcatccc caccatgccc 900 cacctacaat gggctctcat ccagtgagca gaactgggcc aacctgacca cagaggagag 960 gctggcgtct tccaggcccc ctctcttcct ggacccaccc cctcagaatg gccaaaaacc 1020 cccaagtcgt cccagcagct ctgcttctaa gaagcagtat gtatagaggc ctgtggctta 1080 tgtcacccaa cagaggggtc ctgagaagtc tggctgcctg ggatgccccc tgccccctcc 1140 tggaaggctc tgcagagatg actgggctgg ggaagcagat gcttgctggc catggagcct 1200 cattgcaagt tgttcttgaa cacctgaggc cttcctgtgg cccaccaggc actacggctt 1260 cctctccaga 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ccggggctct 480 ggctcttacg agtacccggt ggcagagaag gcagaactgt cctgctggga ggaagggaat 540 ggaaggattg ccctccaggg cactctgctc aacacctatg tgtgcagcat cctgatccgc 600 accaccatgg aggtgggctt cattgtgggc cagtacttca tctacggaat cttcctgacc 660 accctgcatg tctgccgcag gagtccctgt ccccacccgg tcaactgtta cgtatcccgg 720 cccacagaga agaatgtctt cattgtcttt atgctggctg tggctgcact gtccctcctc 780 cttagcctgg ctgaactcta ccacctgggc tggaagaaga tcagacagcg atttgtcaaa 840 ccgcggcagc acatggctaa gtgccagctt tctggcccct ctgtgggcat agtccagagc 900 tgcacaccac cccccgactt taatcagtgc ctggagaatg gccctggggg aaaattcttc 960 aatcccttca gcaataatat ggcctcccaa caaaacacag acaacctggt caccgagcaa 1020 gtacgaggtc aggagcagac tcctggggaa ggtttcatcc aggttcgtta tggccagaag 1080 cctgaggtgc ccaatggagt ctcaccaggt caccgccttc cccatggcta tcatagtgac 1140 aagcgacgtc ttagtaaggc cagcagcaag gcaaggtcag atgacctatc agtgtgaccc 1200 tcctttatgg gaggatcagg accaggtggg aacaaaggag gctcagagaa gaaagacgtg 1260 tcccttctga actgatgctt tctcactgtc atcactgctt ggctcctttg agccccgggt 1320 ctcaatgacg ttgctcatta attctagaaa ctataaccag ggctctggga tagtaagaga 1380 ggtgacaacc cacccagact gcagttccct ccccaccctc tacccagtat acgaagcctt 1440 tcagattact catgaaacag ggtagaggga aagaagggaa gcatggcaaa agctggcctg 1500 gaagggatag ccagagggat agaatgactc tctctctaca taccagcagc ataccaaatg 1560 cgttctctaa gttcctacct ccttgacctg atcaccctcc ctcctccaag gaagagctca 1620 aagttcccag ccaatagaca gcatgaatca aggaacttgc attatatgtg ctcttgaatc 1680 tgttgtctcc atggaccatt cctcggagta gtggtgagat ggccttgggt tgcccttggc 1740 ttctcctccc tctactcagc cttaaaaagg gcttcttgga actttaccag cagcctcagc 1800 tttacaaatg ccttggtatg tacctctggc aaatgcccca ccttggtgat gttgcaacct 1860 ttccttctgc tagggtgtac acctagcctg tgcaggtgtc agccctgcta gggagtcact 1920 gtacacacaa actctactgg aattcctgcc aacatctgtc accctgcagc tcctttacag 1980 ttcaatccaa tgatagaaac catcccttcc ctttctccct tggctgttca cccagccatt 2040 ccctgaaggc cttaccaaca ggaatatcca agaagctgtt gtcccctctc gaaccctgac 2100 cagatcatca gccactgagg ccagtggaat ttccccaggc cttgttaaaa caaagaaagc 2160 attgtacctc tcagattccc cttgtggaaa aaaaaattct gctgtgaaga tgaaaataaa 2220 aatggagaga aaacactgga aaactatttt cccctcctat ttacttcctt tgctgactgc 2280 caacttagtg ccaagaggag gtgtgatgac agctatggag gcccccagat ctctctctcc 2340 tggaggcttt agcaggggca aggaaatagt aggggaatct ccagctctct tggcagggcc 2400 tttatttaaa gagcgcagag attcctatgt ctccctagtg cccctaatga gactgccaag 2460 tgggggctgt agaaaagcct tgccttcccc agggattggc ctggtctctg tattcactgg 2520 atccataatg ggttgctgtt gttttggatg aaggtaaacg atgcttggaa ttgg 2574 <210> 16 <211> 1191 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atgagttgga gctttctgac tcgcctgcta gaggagattc acaaccattc cacatttgtg 60 gggaagatct ggctcactgt tctgattgtc ttccggatcg tccttacagc tgtaggagga 120 gaatccatct attacgatga gcaaagcaaa tttgtgtgca acacagaaca gccgggctgt 180 gagaatgtct gttatgatgc gtttgcacct ctctcccatg tacgcttctg ggtgttccag 240 atcatcctgg tggcaactcc ctctgtgatg tacctgggct atgctatcca caagattgcc 300 aaaatggagc acggtgaagc agacaagaag gcagctcgga gcaagcccta tgcaatgcgc 360 tggaaacaac accgggctct ggaagaaacg gaggaggaca acgaagagga tcctatgatg 420 tatccagaga tggagttaga aagtgataag gaaaataaag agcagagcca acccaaacct 480 aagcatgatg gccgacgacg gattcgggaa gatgggctca tgaaaatcta tgtgctgcag 540 ttgctggcaa ggaccgtgtt tgaggtgggt tttctgatag ggcagtattt tctgtatggc 600 ttccaagtcc acccgtttta tgtgtgcagc agacttcctt gtcctcataa gatagactgc 660 tttatttcta gacccactga aaagaccatc ttccttctga taatgtatgg tgttacaggc 720 ctttgcctct tgcttaacat ttgggagatg cttcatttag ggtttgggac cattcgagac 780 tcactaaaca gtaaaaggag ggaacttgag gatccgggtg cttataatta tcctttcact 840 tggaatacac catctgctcc ccctggctat aacattgctg tcaaaccaga tcaaatccag 900 tacaccgaac tgtccaatgc taagatcgcc tacaagcaaa acaaggccaa cacagcccag 960 gaacagcagt atggcagcca tgaggagaac ctcccagctg acctggaggc tctgcagcgg 1020 gagatcagga tggctcagga acgcttggat ctggcagttc aggcctacag tcaccaaaac 1080 aaccctcatg gtccccggga gaagaaggcc aaagtggggt ccaaagctgg gtccaacaaa 1140 agcactgcca gtagcaaatc aggggatggg aagaactctg tctggattta a 1191 <210> 17 <211> 1362 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 agcgccaaga gagaaagagc acatatttct ccgtgggaca ctccttgtat tggtgggtga 60 gaaatgggcg actggagttt cctggggaac atcttggagg aggtgaatga gcactccacc 120 gtcatcggca gagtctggct caccgtgctt ttcatcttcc ggatcctcat ccttggcacg 180 gccgcagagt tcgtgtgggg ggatgagcaa tccgacttcg tgtgcaacac ccagcagcct 240 ggctgcgaga acgtctgcta cgacgaggcc tttcccatct cccacattcg cctctgggtg 300 ctgcagatca tcttcgtctc caccccgtcc ctgatgtacg tggggcacgc ggtgcactac 360 gtccgcatgg aggagaagcg caaaagccgc gacgaggagc tgggccagca ggcggggact 420 aacggcggcc cggaccaggg cagcgtcaag aagagcagcg gcagcaaagg cactaagaag 480 ttccggctgg aggggaccct gctgaggacc tacatctgcc acatcatctt caagaccctc 540 tttgaagtgg gcttcatcgt gggccactac ttcctgtacg ggttccggat cctgcctctg 600 taccgctgca gccggtggcc ctgccccaat gtggtggact gcttcgtgtc ccggcccacg 660 gagaaaacca tcttcatcct gttcatgttg tctgtggcct ctgtgtccct attcctcaac 720 gtgatggagt tgagccacct gggcctgaag gggatccggt ctgccttgaa gaggcctgta 780 gagcagcccc tgggggagat tcctgagaaa tccctccact ccattgctgt ctcctccatc 840 cagaaagcca agggctatca gcttctagaa gaagagaaaa tcgtttccca ctatttcccc 900 ttgaccgagg ttgggatggt ggagaccagc ccactgcctg ccaagccttt caatcagttc 960 gaggagaaga tcagcacagg acccctgggg gacttgtccc ggggctacca agagacactg 1020 ccttcctacg ctcaggtggg ggcacaagaa gtggagggcg aggggccgcc tgcagaggag 1080 ggagccgaac ccgaggtggg agagaagaag gaggaagcag agaggctgac cacggaggag 1140 caggagaagg tggccgtgcc agagggggag aaagtagaga cccccggagt ggataaggag 1200 ggtgaaaaag aagagccgca gtcggagaag gtgtcaaagc aagggctgcc agctgagaag 1260 acaccttcac tctgtccaga gctgacaaca gatgatgcca gacccctgag caggctaagc 1320 aaagccagca gccgagccag gtcagacgat ctaaccgtat ga 1362 <210> 18 <211> 966 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 atgggggaat ggaccatctt ggagaggctg ctagaagccg cggtgcagca gcactccact 60 atgatcggaa ggatcctgtt gactgtggtg gtgatcttcc ggatcctcat tgtggccatt 120 gtgggggaga cggtgtacga tgatgagcag accatgtttg tgtgcaacac cctgcagccc 180 ggctgtaacc aggcctgcta tgaccgggcc ttccccatct cccacatacg ttactgggtc 240 ttccagatca taatggtgtg tacccccagt ctttgcttca tcacctactc tgtgcaccag 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ccaggcaagt caggggctgg tccagctgat 540 ctccaaggtc cttcctaaga atctgggatc tggaggatcc cagggtcgaa cggagacggc 600 tcagggggtg cggctaaaat gcaaatgggg gatcctcccc agcacccatc ggtcccaaag 660 agaaggtaac ccatagctga gcgtcgcctg ctcccctcgg gccctcccgt ggccctccgt 720 ttcatactgg tctcatcgct aaacccgggc ctctcctacc tcacgactca ccctgaagtc 780 agagaaggtc caacggaccc caccccgata ggcttggaag gggcaggggt ccctgacttg 840 ccccatcccc tgactccccg ccccgcgtcc ccagcgccat gggggagtgg gcgttcctgg 900 gctcgctgct ggacgccgtg cagctgcagt cgccgctcgt gggccgcctc tggctggtgg 960 tcatgctgat cttccgcatc ctggtgctgg ccacggtggg cggcgccgtg ttcgaggacg 1020 agcaagagga gttcgtgtgc aacacgctgc agccgggctg tcgccagacc tgctacgacc 1080 gcgccttccc ggtctcccac taccgcttct ggctcttcca catcctgctg ctctcggcgc 1140 ccccggtgct gttcgtcgtc tactccatgc accgggcagg caaggaggcg ggcggcgctg 1200 aggcggcggc gcagtgcgcc cccggactgc ccgaggccca gtgcgcgccg tgcgccctgc 1260 gcgcccgccg cgcgcgccgc tgctacctgc tgagcgtggc gctgcgcctg ctggccgagc 1320 tgaccttcct gggcggccag gcgctgctct acggcttccg cgtggccccg cacttcgcgt 1380 gcgccggtcc gccctgcccg cacacggtcg actgcttcgt gagccggccc accgagaaga 1440 ccgtcttcgt gctcttctat ttcgcggtgg ggctgctgtc ggcgctgctc agcgtagccg 1500 agctgggcca cctgctctgg aagggccgcc cgcgcgccgg ggagcgtgac aaccgctgca 1560 accgtgcaca cgaagaggcg cagaagctgc tcccgccgcc gccgccgcca cctattgttg 1620 tcacttggga agaaaacaga caccttcaag gagagggctc ccctggtagc ccccacccca 1680 agacagagct ggatgcccct cgcttccgta gggaaagcac ttctcctgca ggatggcatt 1740 gctctctccc cttccatggc acgtagtatg tgctcagtaa atatgtgttg gatgagaaac 1800 tgaaggtgtc cccaggccta caccactgcc atgcccgaac actatccatg ctatggtggg 1860 caccatctct ctgatgacag ttctgtgtcc acaacccaga cccctccaca caaacccaga 1920 tggggctgtg ccgctgtttt ccagatgtat tcattcaaca aatatttgta gggtacctac 1980 tgtgtgtcag aagatgttca agatcagcat catccgatgg aaatagcata tgagccatgt 2040 atgtagtttc aagtttttca ttagccgcat taaaaaagta aaaggaaaca aatg 2094 <210> 28 <211> 840 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 atgtgtggca ggttcctgcg gcggctgctg gcggaggaga gccggcgctc cacccccgtg 60 gggcgcctct tgcttcccgt gctcctggga ttccgccttg tgctgctggc tgccagtggg 120 cctggagtct atggtgatga gcagagtgaa ttcgtgtgtc acacccagca gccgggctgc 180 aaggctgcct gcttcgatgc cttccacccc ctctccccgc tgcgtttctg ggtcttccag 240 gtcatcttgg tggctgtacc cagcgccctc tatatgggtt tcactctgta tcacgtgatc 300 tggcactggg aattatcagg aaaggggaag gaggaggaga ccctgatcca gggacgggag 360 ggcaacacag atgtcccagg ggctggaagc ctcaggctgc tctgggctta tgtggctcag 420 ctgggggctc ggcttgtcct ggagggggca gccctggggt tgcagtacca cctgtatggg 480 ttccagatgc ccagctcctt tgcatgtcgc cgagaacctt gccttggtag tataacctgc 540 aatctgtccc gcccctctga gaagaccatt ttcctaaaga ccatgtttgg agtcagcggt 600 ttctgtctct tgtttacttt tttggagctt gtgcttctgg gtttggggag atggtggagg 660 acctggaagc acaaatcttc ctcttctaaa tacttcctaa cttcagagag caccagaaga 720 cacaagaaag caaccgatag cctcccagtg gtggaaacca aagagcaatt tcaagaagca 780 gttccaggaa gaagcttagc ccaggaaaaa caaagaccag ttggacccag agatgcctga 840 <210> 29 <211> 672 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 atgagttgga tgttcctcag agatctcctg agtggagtaa ataaatactc cactgggact 60 ggatggattt ggctggctgt cgtgtttgtc ttccgtttgc tggtctacat ggtggcagca 120 gagcacatgt ggaaagatga gcagaaagag tttgagtgca acagtagaca gcccggttgc 180 aaaaatgtgt gttttgatga cttcttcccc atttcccaag tcagactttg ggccttacaa 240 ctgataatgg tctccacacc ttcacttctg gtggttttac atgtagccta tcatgagggt 300 agagagaaaa ggcacagaaa gaaactctat gtcagcccag gtacaatgga tgggggccta 360 tggtacgctt atcttatcag cctcattgtt aaaactggtt ttgaaattgg cttccttgtt 420 ttattttata agctatatga tggctttagt gttccctacc ttataaagtg tgatttgaag 480 ccttgtccca acactgtgga ctgcttcatc tccaaaccca ctgagaagac gatcttcatc 540 ctcttcttgg tcatcacctc atgcttgtgt attgtgttga atttcattga actgagtttt 600 ttggttctca agtgctttat taagtgctgt ctccaaaaat atttaaaaaa acctcaagtc 660 ctcagtgtgt ga 672 <210> 30 <211> 1113 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atggaaggcg tggacttgct agggtttctc atcatcacat taaactgcaa cgtgaccatg 60 gtaggaaagc tctggttcgt cctcacgatg ctgctgcgga tgctggtgat tgtcttggcg 120 gggcgacccg tctaccagga cgagcaggag aggtttgtct gcaacacgct gcagccggga 180 tgcgccaatg tttgctacga cgtcttctcc cccgtgtctc acctgcggtt ctggctgatc 240 cagggcgtgt gcgtcctcct cccctccgcc gtcttcagcg tctatgtcct gcaccgagga 300 gccacgctcg ccgcgctggg cccccgccgc tgccccgacc cccgggagcc ggcctccggg 360 cagagacgct gcccgcggcc attcggggag cgcggcggcc tccaggtgcc cgacttttcg 420 gccggctaca tcatccacct cctcctccgg accctgctgg aggcagcctt cggggccttg 480 cactactttc tctttggatt cctggccccg aagaagttcc cttgcacgcg ccctccgtgc 540 acgggcgtgg tggactgcta cgtgtcgcgg cccacagaga agtccctgct gatgctgttc 600 ctctgggcgg tcagcgcgct gtcttttctg ctgggcctcg ccgacctggt ctgcagcctg 660 cggcggcgga tgcgcaggag gccgggaccc cccacaagcc cctccatccg gaagcagagc 720 ggagcctcag gccacgcgga gggacgccgg actgacgagg agggtgggcg ggaggaagag 780 ggggcaccgg cgcccccggg tgcacgcgcc ggaggggagg gggctggcag ccccaggcgt 840 acatccaggg tgtcagggca cacgaagatt ccggatgagg atgagagtga ggtgacatcc 900 tccgccagcg aaaagctggg cagacagccc cggggcaggc cccaccgaga ggccgcccag 960 gaccccaggg gctcaggatc cgaggagcag ccctcagcag cccccagccg cctggccgcg 1020 cccccttcct gcagcagcct gcagccccct gacccgcctg ccagctccag tggtgctccc 1080 cacctgagag ccaggaagtc tgagtgggtg tga 1113 <210> 31 <211> 1632 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 atgggggact ggaacttatt gggtggcatc ctagaggaag ttcactccca ctcaaccata 60 gtggggaaaa tctggctgac catcctcttc atcttccgaa tgctggtact tcgtgtggct 120 gctgaggatg tctgggatga tgaacagtca gcatttgcct gcaacacccg gcagccaggt 180 tgcaacaata tctgttatga tgatgcattc cctatctctt tgatcaggtt ctgggtttta 240 cagatcatct ttgtgtcttc tccttctttg gtctatatgg gccatgcact ttataggctc 300 agggcctttg agaaagacag gcagaggaaa aagtcacacc ttagagccca gatggagaat 360 ccagatcttg acttggagga gcagcaaaga atagataggg aactgaggag gttagaggag 420 cagaagagga tccataaagt ccctctgaaa ggatgtctgc tgcgtactta tgtcttacac 480 atcttgacca gatctgtgct ggaagtagga ttcatgatag gccaatatat tctctatggg 540 tttcaaatgc acccccttta caaatgcact caacctcctt gccccaatgc ggtggattgc 600 tttgtatcca ggcccactga gaagacaatt ttcatgcttt ttatgcacag cattgcagcc 660 atttccttgt tactcaatat actggaaata tttcatctag gcatcagaaa aattatgagg 720 acactttata agaaatccag cagtgagggc attgaggatg aaacaggccc tccattccat 780 ttgaagaaat attctgtggc ccagcagtgt atgatttgct cttcattgcc tgaaagaatc 840 tctccacttc aagctaacaa tcaacagcaa gtcattcgag ttaatgtgcc aaagtctaaa 900 accatgtggc aaatcccaca gccaaggcaa cttgaagtag acccttccaa tgggaaaaag 960 gactggtctg agaaggatca gcatagcgga cagctccatg ttcacagccc gtgtccctgg 1020 gctggcagtg ctggaaatca gcacctggga cagcaatcag accattcctc atttggcctg 1080 cagaatacaa tgtctcagtc ctggctaggt acaactacgg ctcctagaaa ctgtccatcc 1140 tttgcagtag gaacctggga gcagtcccag gacccagaac cctcaggtga gcctctcaca 1200 gatcttcata gtcactgcag agacagtgaa ggcagcatga gagagagtgg ggtctggata 1260 gacagatctc gcccaggcag tcgcaaggcc agctttctgt ccagattgtt gtctgaaaag 1320 cgacatctgc acagtgactc aggaagctct ggttctcgga atagctcctg cttggatttt 1380 cctcactggg aaaacagccc ctcacctctg ccttcagtca ctgggcacag aacatcaatg 1440 gtaagacagg cagccctacc gatcatggaa ctatcacaag agctgttcca ttctggatgc 1500 tttctttttc ctttctttct tcctggggtg tgtatgtatg tttgtgttga cagagaggca 1560 gatggagggg gagattattt atggagagat aaaattattc attcgataca ttcagttaaa 1620 ttcaattcat aa 1632 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 32 Phe Glu Val Ala Phe Leu Leu Ile Gln Trp Ile 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 33 Leu Leu Ile Gln Trp Tyr Ile Gly Phe Ser Leu 1 5 10 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 34 Ser Leu Ser Ala Val Tyr Thr Cys Lys Arg Asp Pro Cys Pro His Gln 1 5 10 15 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 35 Val Asp Cys Phe Leu Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 36 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ile Ile 1 5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 37 Leu Gly Thr Ala Val Glu Ser Ala Trp Gly Asp Glu Gln 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 38 Gln Ser Ala Phe Arg Cys Asn Thr Gln Gln Pro Gly 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 39 Gln Gln Pro Gly Cys Glu Asn Val Cys Tyr Asp Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 40 Val Cys Tyr Asp Lys Ser Phe Pro Ile Ser His Val Arg 1 5 10 <210> 41 <211> 38 <212> 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Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 45 Arg Leu Val Lys Cys Glu Ala Phe Pro Cys Pro Asn Thr Val Asp Cys 1 5 10 15 Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 20 25 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 46 Val Lys Cys Glu Ala Phe Pro Cys Pro Asn Thr Val 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 47 Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 48 Val Cys Tyr Asp His Phe Phe Pro Ile Ser His Val Arg 1 5 10 <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 49 Val Trp Gly Asp Glu Lys Ser Ser Phe Ile 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<400> 54 Ser Arg pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ile Ile 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 55 Ile Cys Asn Thr Leu Gln Pro Gly Cys Asn Ser Val 1 5 10 <210> 56 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 56 Phe Leu Asp Thr Leu His Val Cys Arg Arg Ser Pro Cys Pro His Pro 1 5 10 15 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 57 Ser Leu Ser Ala Val Tyr Thr Cys Lys Arg Asp Pro Cys Pro His Gln 1 5 10 15 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 58 Val Cys Tyr Asp Lys Ser Phe Pro Ile Ser His Val Arg 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 59 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ile Ile 1 5 10 <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin peptide sequence <400> 60 Lys Arg Asp Pro Cys His Gln Val Asp Cys Phe Leu Ser Arg Pro Thr Glu Lys 1 5 10 15 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: connexin/anti-connexin control peptide sequence <400> 61 Ser Arg Gly Gly Glu Lys Asn Val Phe Ile Val 1 5 10 <210> 62 <211> 396 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Connexin 45 <400> 62 Met Ser Trp Ser Phe Leu Thr Arg Leu Leu Glu Glu Ile His Asn His 1 5 10 15 Ser Thr Phe Val Gly Lys Ile Trp Leu Thr Val Leu Ile Val Phe Arg 20 25 30 Ile Val Leu Thr Ala Val Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Tyr Asp Glu Gln 35 40 45 Ser Lys Phe Val Cys Asn Thr Glu Gln Pro Gly Cys Glu Asn Val Cys 50 55 60 Tyr Asp Ala Phe Ala Pro Leu Ser His Val Arg Phe 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<210> 110 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 110 Leu Gly Thr Ala Ala Glu Ser Ser Trp Gly Asp Glu Gln Ala Asp Phe 1 5 10 15 Arg Cys Asp Thr Ile Gln Pro Gly Cys Gln Asn Val Cys Thr Asp Gln 20 25 30 Ala Phe Pro Ile Ser His Ile Arg Phe Trp Val Leu Gln 35 40 45 <210> 111 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 111 Leu Gly Thr Ala Ala Glu Ser Ser Trp Gly Asp Glu Gln Ala 1 5 10 <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 112 Asp Glu Gln Ala Asp Phe Arg Cys Asp Thr Ile Gln Pro 1 5 10 <210> 113 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 113 Thr Ile Gln Pro Gly Cys Gln Asn Val Cys Thr Asp Gln 1 5 10 210> 114 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 114 Val Cys Thr Asp Gln Ala Phe Pro Ile Ser His Ile Arg 1 5 10 <210> 115 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 115 Ala Phe Pro Ile Ser His Ile Arg Phe Trp Val Leu Gln 1 5 10 <210> 116 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 116 Met Glu Val Gly Phe Ile Val Gly Gln Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Phe 1 5 10 15 Leu Thr Thr Leu His Val Cys Arg Arg Ser Pro Cys Pro His Pro Val 20 25 30 Asn Cys Tyr Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Asn Val Phe Ile Val 35 40 45 <210> 117 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 117 Met Glu Val Gly Phe Ile Val Gly Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 118 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 118 Ile Val Gly Gln Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Phe Leu 1 5 10 <210> 119 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 119 Gly Ile Phe Leu Thr Thr Leu His Val Cys Arg Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 120 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 120 Arg Arg Ser Pro Cys Pro His Pro Val Asn Cys Tyr 1 5 10 <210> 121 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 121 Leu Thr Ala Val Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Tyr Asp Glu Gln Ser Lys 1 5 10 15 Phe Val Cys Asn Thr Glu Gln Pro Gly Cys Glu Asn Val Cys Tyr Asp 20 25 30 Ala Phe Ala Pro Leu Ser His Val Arg Phe Trp Val Phe Gln 35 40 45 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 122 Leu Thr Ala Val Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Tyr Asp Glu Gln Ser 1 5 10 15 <210> 123 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 123 Asp Glu Gln Ser Lys Phe Val Cys Asn Thr Glu Gln Pro 1 5 10 <210> 124 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 124 Thr Glu Gln Pro Gly Cys Glu Asn Val Cys Tyr Asp Ala 1 5 10 <210> 125 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 125 Val Cys Tyr Asp Ala Phe Ala Pro Leu Ser His Val Arg 1 5 10 <210> 126 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 126 Ala Pro Leu Ser His Val Arg Phe Trp Val Phe Gln 1 5 10 <210> 127 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 127 Phe Glu Val Gly Phe Leu Ile Gly Gln Tyr Phe Leu Tyr Gly Phe Gln 1 5 10 15 Val His Pro Phe Tyr Val Cys Ser Arg Leu Pro Cys His Pro Lys Ile 20 25 30 Asp Cys Phe Ile Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Leu Leu 35 40 45 <210> 128 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 128 Phe Glu Val Gly Phe Leu Ile Gly Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 129 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 129 Leu Ile Gly Gln Tyr Phe Leu Tyr Gly Phe Gln Val 1 5 10 <210> 130 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 130 Gly Phe Gln Val His Pro Phe Tyr Val Cys Ser Arg Leu Pro 1 5 10 <210> 131 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Connexin domain <400> 131 Ser Arg Leu Pro Cys His Pro Lys Ile Asp Cys Phe 1 5 10

Claims (3)

  1. 서열 62 또는 서열 63의 세포외 루프 영역의 일부인 약 5 내지 약 20개의 인접 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 항-코넥신 43 또는 항-코넥신 45 헤미채널 조절 펩티드를, 중추 신경계에 영향을 미치는 혈관 장애, 뇌에 영향을 미치는 혈관 장애, 또는 망막에 영향을 미치는 혈관 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈관 장애가 시신경에서의 혈관신생 녹내장 또는 부종인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 혈관 장애가 시신경에서의 부종인 방법.
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