KR20130131342A - 헤르페스바이러스 6 글리코프로테인 q1에 대한 중화 항체의 제조 및 그의 해석 - Google Patents

Abstract

본 발명은 현재까지 제공되어 있지 않은 영유아의 돌발성 발진 등의 원인이 되는 질환 HHV-6B의 백신을 제공하는 것 및 그 치료약 개발에 유효한 스크리닝 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 상기 과제는 서열번호:2의 484~496 잔기로 나타내는 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP) 또는 그 변이서열 내에 적어도 E를 포함하는 5개의 연속적 아미노산 서열을 포함하거나 E가 Q로 변화된 경우 487번 잔기의 C 및 489번 잔기의 G가 보존된 서열을 포함하는 HHV-6B에 특이적인 에피토프를 제공하는 것에 의해 해결된다.

Description

헤르페스바이러스 6 글리코프로테인 Q1에 대한 중화 항체의 제조 및 그의 해석{Preparation of neutralizing antibody to human herpesvirus 6 glycoprotein Q1 and analysis thereof}

본 발명은 HHV-6B에 특이적인 면역학적 기술에 관한 것으로 더욱 상세하게는 중화 에피토프, 치료제의 스크리닝 및 백신과 같은 의약에 관한 것이다.

HHV-6는 AIDS 환자 및 임파증식 장애환자의 말초 혈액으로부터 분리된 스트레인으로 인간 헤르페스바이러스 7(HHV-7) 및 인간 사이토메갈로 바이러스(HCMV) 등이 속하는 β-헤르페스바이러스 (T-림포트로픽 헤르페스바이러스)으로 분류된다.

HHV-6는 2종의 변종(variant)을 지니며 이는 HHV-6A 및 HHV-6B로 분류될 수 있다. HHV-6B는 영유아의 돌발성 발진의 원인으로 알려져있다. 또한 HHV-6A는 인간 질병과의 관계가 아직 밝혀지지 않았다. 2종류의 변종은 뉴클레오타이드 서열의 차이에 근거하는 것이며 또한 면역학적 특성 및 생물학적 특성에 의해 분류되는 것이다.

HHV-6의 주요 표적은 T세포 계통의 임파구로 여겨지며 HHV-6B는 대다수의 성인에 잠복 감염되어있고 영유아기의 돌발성 발진의 원인 바이러스이다. HHV-6A에 관한 병리원성은 아직 보고되어있지 않다.

HHV-6A의 유전자인 U97, U98, U99 및 U100은 당단백질 Q1 및 Q2(gQ1 및 gQ2)를 암호화하고 또한 스플라이싱을 행하는 mRNA 전사체를 생성하는 것으로 보고되고 있다.

HHV-6에 감염된 세포에서는 gQ1은 gH/gL 복합체에 결합되어 gH/gL/gQ1/gQ2를 형성한다. 이 4가 복합체는 바이러스 엔벨로프 내에서 발견된다.

HHV-6A의 gH/gL/gQ1/gQ2 복합체는 인간 CD46에 결합되나 HHV-6B의 복합체는 결합되지 않는다 [비특허문헌 1 : Journal of Virology, 2004, Vol. 78 (15) pp. 7969-7983; 비특허문헌 2 : Journal of Virology, 2003, Vol. 77 (4) pp. 2452-2458, 도 8 참조]. 비특허문헌 1(Journal of Virology, 2004, Vol. 78 (15) pp. 7969-7983)에서는 gQ1 및 gQ2에 관한 세포 내 프로세싱에 관한 분석을 행하고 이를 개시하고 있다. 비특허문헌 2(Journal of Virology, 2003, Vol. 77 (4) pp. 2452-2458)에서는 U100 유전자 산물에 있어서 해석 및 gH 및 gL과의 복합체 형성에 관하여 분석을 행하고 이를 개시하고 있다.

HHV-6A에 있어서 현재 gQ1이라고 칭하고 있으므로 본 명세서에서는 gQ1이라고 칭하는 gp105-82는 중화 항체 작용을 지니는 것이 알려져 있다. 또한 HHV-6A는 인간 CD46을 세포 리셉터로서 사용한다. 같은 형태의 메카니즘이 HHV-6B에도 채택될 수 있는지 여부는 현재 알려지지 않고 있으며 영유아의 돌발성 발진 등의 원인이 되는 질환에 대한 HHV-6B의 백신 및 기타 치료제로 유효한 스크리닝 방법이 아직까지 제공되지 않고 있다.

비특허문헌 3(Cellular Microbiology (2009), 11 (7), 1001-1006)에는 인간 헤르페스바이러스 6(HHV-6)와 CD46과의 관계가 기재되어 있다.

비특허문헌 4(Journal of Virology, 1993, Vol. 67 (8) pp. 4611-4620)에는 gQ1의 매핑(mapping)을 개시하고 있다.

비특허문헌 5(Journal of Virology, 2004, Vol. 78 (9) pp. 4609-4616)에서는 gH-gL의 복합체 형성과 CD46에 관한 분석을 행한 것을 개시하고 있다.

비특허문헌 1 : Journal of Virology, 2004, Vol. 78 (15) pp. 7969-7983 비특허문헌 2 : Journal of Virology, 2003, Vol. 77 (4) pp. 2452-2458 비특허문헌 3 : Cellular Microbiology (2009), 11 (7), 1001-1006 비특허문헌 4 : Journal of Virology, 1993, Vol. 67 (8) pp. 4611-4620 비특허문헌 5 : Journal of Virology, 2004, Vol. 78 (9) pp. 4609-4616

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 현재까지 제공되지 않았던 영유아의 돌발성 발진(exanthema subitum) 등의 원인 질환 HHV-6B의 백신을 제공하는 것과 또한 치료제로서 유효한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 예의 노력한 결과 KH-1으로 호칭되는 HHV-6B에 대한 중화성 모노클로날 항체(MAb)를 제조하는 것을 통해 상기 과제를 해결하였다. 본 발명은 이 중화항체에 의해 인식되는 HHV-6B 단백질도 동정하였으며 항체 자체의 특징도 확인하였다.

따라서 본 발명은 다음과 같은 물질을 제공하기 위한 것이다.

(1) 서열번호:2의 484번 잔기 내지 496번 잔기로 이루어진 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP) 또는 그의 변이서열로서, 적어도 E를 포함하는 적어도 5개의 연속적 아미노산 서열을 포함하거나 E가 Q로 변환된 경우 487번 잔기의 C 및 489번 잔기의 G가 보존되는 서열을 포함하는 HHV-6B에 특이적인 에피토프.

(2) 서열번호:2의 484번 잔지 내지 496번 잔기로 이루어진 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP)인 항목 1에 기재된 에피토프.

(3) 항목 1 또는 2에 기재된 에피토프에 대한 항체 또는 항원 결합성 단편.

(4) 중화 활성을 지닌 항목 3에 기재된 항체 또는 항원 결합성 단편.

(5) 모노클로날 항체인 항목 3 또는 4에 기재된 항체 또는 항원 결합성 단편.

(6) 서열번호:10으로 표시되는 서열로 이루어진 라이트 체인 및 서열번호:12로 표시되는 서열로 이루어진 헤비 체인을 포함하는 항목 3 내지 5 중 어느 하나에 기재된 항체.

(7) 항목 1 또는 2에 기재된 에피토프를 포함하는 항원.

(8) BgQ1의 전체길이 서열인 서열번호:2 내의 적어도 아미노산 1번 잔기 내지 496번 잔기를 포함하는 항목 1 또는 2에 기재된 에피토프를 포함하는 항원.

(9) BgQ1의 전체 길이를 포함하는 항목 1 또는 2에 기재된 에피토프를 포함하는 항원.

(10) 항목 7 내지 9 중 어느 하나에 기재된 항원을 포함하는 조성물.

(11) 항목 7 내지 9 중 어느 하나에 기재된 항원을 포함하는 HHV-6B 바이러스 중화 항체를 생성하기 위한 조성물.

(12) 상기 항원은 HHV-6B gQ1인 항목 11에 기재된 조성물.

(13) HHV-6B gQ2를 더욱 포함하는 항목 11 또는 12에 기재된 조성물.

(14) 상기 HHV-6B gQ1 및 상기 HHV-6B gQ2는 복합체를 형성하는 것임을 특징으로 하는 항목 13에 기재된 조성물.

(15) 상기 HHV-6B gQ1 및 상기 HHV-6B gQ2는 세포에 동시 발현됨을 특징으로 하는 항목 13 또는 14에 기재된 조성물.

(16) 의약임을 특징으로 하는 항목 10 내지 15 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(17) 백신임을 특징으로 하는 항목 10 내지 16 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(18) HHV-6B 바이러스의 저해제를 스크리닝하는 방법에 있어서, 상기 방법은

A) HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2를 제공하는 단계;

B) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2가 결합되는 조건에서 시험 물질과 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2를 접촉시키는 단계; 및

C) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2의 결합을 관찰하는 단계에 있어서 상기 결합이 저해되는 경우 상기 시험물질이 HHV-6B 바이러스의 저해제인 것을 판정하는 단계;를 포함하는 방법.

(19) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2는 세포에 동시 발현됨을 특징으로 하는 항목 18에 기재된 방법.

(20) A) 공정에 있어서, gL 및 gH를 더욱 제공함을 특징으로 하는 항목 18 또는 19에 기재된 방법.

(21) HHV-6B 바이러스의 저해제를 스크리닝하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는

A) HHV-6B gQ1;

B) HHV-6B gQ2; 및

C) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2와 결합하는 조건을 제공하는 수단을 준비하고, 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2가 결합하는 조건 하에서 시험물질을 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2에 접촉시킬 때 상기 결합이 저해되는 경우, 상기 시험물질이 HHV-6B 바이러스의 저해제인 것을 판정하는 키트.

(22) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2는 세포에 동시 발현됨을 특징으로 하는 항목 21에 기재된 키트.

(23) gL 및 gH를 더욱 포함함을 특징으로 하는 항목 21 또는 22에 기재된 키트.

(24) HHV-6B 바이러스 중화 에피토프를 스크리닝하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은

A) 서열번호:10 및 서열번호:12에 있어서 항원 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 단계;

B) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 후보물질인 다수의 펩타이드를 에피토프가 결합하는 조건 하에서 접촉시키는 단계; 및

C) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 상기 다수의 펩타이드에 있어서 동일 또는 유사한 서열을 결정하고 상기 동일 또는 유사한 서열을 중화 에피토프로서 선택하는 단계;

를 포함하는 방법.

(25) HHV-6B 바이러스의 중화 에피토프를 스크리닝하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는

A) 서열번호:10 및 서열번호:12에 있어서 항원 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 수단;

B) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 후보물질인 다수의 펩타이드를 에피토프가 결합하는 조건 하에서 접촉시키는 수단; 및

C) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 상기 다수의 펩타이드에 있어서 동일 또는 유사한 서열을 결정하고 상기 동일 또는 유사한 서열을 중화 에피토프로서 선택하는 수단;

을 포함하는 키트.

본 발명자들은 HHV-6B 정제 바이러스 입자를 마우스에 면역시키고 HHV-6B에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다. 면역침강에 의해 수득된 항체가 인식하는 바이러스측 인자의 동정을 행하였다. 이어서 동정된 바이러스측 인자의 클로닝 및 그 변이체의 제조를 수행한다. 변이체를 293T 세포에서 발현시키고 이에 따라 본 항체의 에피토프 부위의 동정을 시도하였다. HHV-6B에 대한 중화 활성을 지닌 항체를 수득함으로서 본 항체가 gQ1을 인식하는 것을 규명하였다. gQ1 변이체를 사용하여 본 항체의 반응성을 조사함으로서 본 항체가 gQ1의 C-말단의 아미노산을 인식하는 것을 규명하였다.

C-말단 결실 gQ1 및 gQ1과 복합체를 형성하는 gQ2를 동시 발현시키고 면역침강 및 웨스턴 블로팅에 의해 상호작용을 조사한 후 본 항체가 인식하는 아미노산을 결실시킨 변이체 gQ1과 gQ2와의 상호 작용을 표시하였다. 상기한 바와 같이 HHV-6B gQ1을 인식하는 중화활성을 지닌 모노클로날 항체가 수득되는 것에 의해 HHV-6B에 침입할 경우에도 gQ1이 중요한 역할을 나타내고 있음을 시사한다. 더욱이 본 항체에 의해 인식되지 않는 gQ1 변이체와 gQ2와의 상호 작용도 나타나기 때문에 gQ1 중화 에피토프 부위와 gQ2와의 복합체 형성에 필요한 영역은 서로 다른 것임이 명백히 밝혀졌다. 이와 같은 결과로부터 gH 및 gL과의 복합체 형성 등 본 항체를 사용한 gQ1의 입체 구조 해석과 같은 상세한 분석이 수행될 수 있는 것이다.

본 발명자들은 HHV-6B, gQ1(글리코프로테인 Q1)에 대한 중화활성을 지닌 모노클로날 항체의 제조가 성취되었으며 그 중화 에피토프를 본 발명자들은 동정하였다. 이 항체는 HHV-6B gQ1에 있어서만 반응하고 HHV-6A gQ1에는 반응하지 않음을 발견하였다. 즉 이 중화활성은 HHV-6B에 특이적인 것으로 판단된다. gQ1은 HHV-6A에 있어서 gH, gL 및 gQ2로 명명되는 글리코프로테인과의 복합체를 형성하고 리셉터에 결합하는 것은 알려져있으나 HHV-6B에 있어서 그 리셉터도 동정하지 못했기 때문에 복합체가 필요한지 여부도 불명확하다. 본 발명의 결과로는 gQ1 및 gQ2를 동시에 세포 내에서 발현시키는 것과 서로가 결합하는 것이다.

HHV-6A에 있어서 gp105-82(현재는 gQ1이라고 칭함)로 불려졌던 중화항체가 제조됨은 이미 알려져있다(비특허문헌 7). 비특허문헌 7에서는 gQ1과 gQ2와의 복합체 형성이 중요한 것임을 인식하였으나 에피토프에 관해서는 보고되지 않았다. HHV-6A는 인간 CD46을 세포 리셉터로 사용한다.

HHV-6B 또는 이들 모두(HHV-6A 및 HHV-6B)의 변이체를 위한 또 다른 리셉터는 이 바이러스 세포 영향성을 결정하는 데 있어 중요한 역할을 함을 본 발명자들은 판단하였다. 바이러스 엔벨로프에의 글리코프로테인은 바이러스 감염에 있어서 필수적인 역할을 하는 것으로 특히 비리온 침입의 과정에 있어서 중요한 역할을 하는 것이다. 또한 글리코프로테인은 중화항체를 유발시키기 때문에 숙주 면역 응답의 주요한 표적이 된다. 본 발명에서 본 발명자들은 KH-1으로 명칭된 모노클로날 항체 생성 하이브리도마 클론을 분리하였다. 이 클론은 중화활성을 지니며 HHV-6B gQ1과 특이적으로 반응하는 능력을 지닌 것임을 규명한 것이다.

HHV-6는 세포내 경로에 의해 세포에 침입한다. 엔벨로프 글리코프로테인 gH/gL/gQ1/gQ2 (gH/gL/gO) 및 gB는 바이러스 접착 및 침투의 과정에 있어서 기능한다. HHV-6A는 인간 CD46을 세포 리셉터로 이용하지만 HHV-6B는 이것과는 별개의 리셉터를 매개로 하는 것을 본 발명에서 규명한 것이다(도 8).

본 발명은 돌발성 발진의 원인인 HHV-6B 바이러스 등에 대한 의약 및 그 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 작성된 모노클로날 항체가 HHV-6B gQ1을 인식하는 것을 발견하였으며 또한 이와 같은 인식은 HHV-6A gQ1을 HHV-6B gQ2와 동시 발현시키는 경우 증가되었다. 즉 gQ1과 gQ2와의 상호작용에 의한 것으로 형성된 gQ1의 입체 구조를 본 발명을 통해 제조된 중화항체가 인식하는 것으로 판단된다. gQ1과 gQ2가 결합하는 것에 의해 형성된 입체구조는 HHV-6B 감염 중화의 타겟이 된다. 따라서 이 결합을 저지하는 분자를 동정하는 것에 의해 치료약의 개발이 달성될 것이다.

도 1은 HHV-6B에 대한 모노클로날 항체에 의해 인식되는 바이러스 단백질을 나타낸 것이다. 좌측 2개의 레인은 면역침강에 사용한 모노클로날 항체 BgQ202를 나타낸 것이며 우측 2개의 레인은 KH-1을 나타낸다. 좌측 레인 및 우측 레인 모두는 HHV-6B로 감염시킨 스트레인의 결과를 나타낸다. 좌측 두 번째 레인과 우측 두 번째 레인은 목(mock) 감염시킨 스트레인을 나타내는 것이다.
도 2는 항-gQ1 모노클로날 항체에 따른 HHV-6B 감염시킨 세포에 있어서 gH/gL/gQ의 검출을 나타낸다. 좌측 2개의 레인은 KH-1으로 면역침강을 나타낸다. 우측 3개의 레인은 세포 용해물로의 면역침강을 나타낸다. 좌측 첫 번째 레인과 중앙의 레인은 목(mock) 감염 스트레인을 나타내며 좌측 두 번째 레인과 우측 두 번째 레인은 HHV-6B 감염시킨 세포를 나타내고 맨 우측 레인은 HHV-6B의 비리온 시험을 나타낸 것이다. 왼편의 숫자는 분자량(kDa)을 표시한다.
도 3은 항-gQ1 항체인 KH-1이 중화활성을 지니는 것을 나타내는 도면이다. 상측의 모식도는 본 실시예의 실험 스킴을 나타낸다. 하측 패널에서는 좌측은 간접 면역형광 에세이의 대조군(control) 결과를 나타낸 것이며 우측은 KH-1을 사용한 경우의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 gQ1 일과성(transient) 발현 시스템에 있어서 항체로 인식되는 단백질의 발현을 나타낸 것이다. 좌측 사진은 BgQ1을 나타낸 것이며 우측 사진은 BgQ1 및 BgQ2를 나타낸 것이다. 상측의 패널은 IFA로서 KH-1을 사용하는 것을 나타내며 하측의 패널은 IFA로서 BgQ를 사용하는 것을 나타낸다.
도 5는 HHV-6B gQ1 유전자의 다양한 카르복실 말단 검출 변이체의 모식적 다이아그램 및 모노클로날 항체 KH-1에 대한 반응성을 나타낸 것이다. 도 5에서는 BgQ1의 다양한 플래그먼트의 MAb 항체 KH-1에 대한 반응성을 +(반응성 있음) 및 -(반응성 없음)으로 나타낸다. 이들 플래그먼트는 HHV-6B gQ1의 첫 번째 아미노산 잔기로부터 시작되나 C-말단의 아미노산 부위는 도면에 나타난 바와 같다.
도 6(A)는 HHV-6A 및 HHV-6B의 gQ1 아미노산 서열 얼라인먼트를 나타낸 것이다. 상단에는 HHV-6B의 gQ1의 484번 잔기로부터 496번 잔기의 아미노산 서열을 나타낸다. 하단에는 HHV-6A의 gQ1의 484번 잔기로부터 496번 잔기의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 6(B)는 KH-1이 인식하는 HHV-6B gQ1의 에피토프 부위를 동정하기 위해 C-말단에 있어서 점 변이체 각각에 대한 KH-1 반응성 유무를 확인한 결과를 나타낸다. 상측으로부터 HHV-6B gQ1(야생형), E488Q (488번 잔기인 E를 Q로 변이시킨 것), C487Q E488Q (487번 잔기인 C를 Q로 변이시키고 488번 잔기인 E를 Q로 변이시킨 것) 및 E488Q G489V (488번 잔기의 E를 Q로 변이시키고 489번 잔기인 G를 V로 변이시킨 것)을 나타낸다.
도 7은 HHV-6B의 KH-1에 의해 침입 저해되는 모델을 나타낸 것이다.
도 8은 gH/gL/gQ1/gQ2 복합체의 HHV-6A 및 HHV-6B와의 반응성 차이를 나타낸 모식도이다.
도 9는 HHV-6B의 세포침입 모식도이다. gH/gL/gQ1/gQ2 복합체의 형성에 있어서 gQ1 및 gQ2가 특이적인 복합체를 형성하는 것을 나타낸다.
도 10은 중화항체의 반응 및 입체 구조의 변화를 나타낸 모식도이다. 하단 패널에는 중화 에피토프(HHV-6B) 및 이것에 대응하는 HHV-6A의 아미노산 서열을 나타낸다.

이하 본 발명을 바람직한 형태로 설명한다. 본 명세서의 전체에 있어서 단수형의 표현은 특히 언급하지 않는 한 그의 복수형 개념을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 따라서 단수형의 관사(예를 들면 영어의 경우 'a', 'an', 'the' 등은 다른 언어에 있어서 대응하는 관사, 형용사 등)는 특히 언급하지 않는 한 그의 복수형 개념을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는 특히 언급하지 않는 한 해당 분야에 통상 사용하는 의미인 것으로 이해될 수 있다. 또한 별도의 정의가 있지 않는 한 본 명세서 중에 사용되는 전체의 전문용어 및 과학기술 용어는 본 발명에 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 지닌다. 모순이 있는 경우 본 명세서(정의를 포함)가 우선한다.

(정의)

이하 본 명세서에 있어서 주로 사용되는 용어의 정의를 열거한다.

본 명세서에 있어서 사용되는 'HHV'는 인간 헤르페스바이러스(human herpesvirus)를 의미하고 그 타입에 따라 1형, 2형, 3형, 4형, 5형, 6형, 7형, 8형이 존재한다.

본 명세서에 있어서 사용되는 용어 '헤르페스바이러스'는 임의의 형을 포함하고 HHV-6A 및 HHV-6B를 포함하며 또한 특히 언급이 없는 한, 바이러스의 야생형, 재조합형 등을 포함한다. 또한 본 명세서에 있어서 사용되는 용어 'HHV-6(인간 헤르페스바이러스 6)'는 HHV-6A 및 HHV-6B를 포함하며 특히 언급되지 않는 한, 이 바이러스의 야생형, 재조합형 등을 포함한다. HHV-6는 사이토메갈로바이러스 HHV-5와 동일한 β-서브패밀리에 속하며 HHV-6B는 돌발성 발진(exanthema subitum)의 원인 바이러스이고 일본에서는 모두가 2세 이하에서 감염되는 것으로 알려져 있다. HHV-6A에 있어서는 질환과의 연관성이 알려지지 않고 있다.

본 명세서에 있어서 헤르페스바이러스의 '야생주'는 인공적인 변이를 지니지 않은 천연으로부터 분리된 헤르페스바이러스 스트레인을 말한다. 야생주의 예로서는 JI주 등을 열거할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서 HHV-6A, HHV-6B 등 헤르페스바이러스의 '야생주'로는 인공적인 변이를 지니지 않은 천연으로부터 분리된 헤르페스바이러스 스트레인(HHV-6A, HHV-6B 등)을 의미한다. HHV-6A의 야생주의 예로는 U1102주를 열거할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. HHV-6B 야생주의 예로는 HST주를 열거할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서 HHV-6A, HHV-6B 등 헤르페스바이러스의 '변이주'로는 야생주인 바이러스주에 변이 유발 또는 다수의 계대배양 등에 의해 변이 유발된 헤르페스바이러스주( HHV-6A, HHV-6B 등)를 의미한다. 헤르페스바이러스주에 변이 유발시키는 경우 이 변이 유발은 랜덤한 변이 도입 또는 부위 특이적 변이 도입도 가능하다.

본 명세서에 있어서 '에피토프'는 해당 분야에 있어서 사용되는 통상의 의미로 사용된다. 항체가 인식하는 항원성을 결정하는 영역을 말한다. 항체가 병원 미생물 등 고분자물질 등과 결합시 그 전체를 인식하지 않고 항원의 비교적 적은 일부분인 에피토프를 인식하여 결합한다. 에피토프는 통상 아미노산 서열로 표시되고 선형 에피토프의 경우 적어도 5개의 아미노산 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산, 7개의 아미노산 또는 8개의 아미노산의 아미노산 서열로 결정된다. 이러한 특정 항원의 침입에 의해 생성되는 항체는 그 항원과의 동일 또는 유사한 에피토프를 지닌 것에만 반응한다.

본 명세서에 있어서 '중화 에피토프'는 중화 활성의 부여를 수행하는 에피토프를 의미한다. 중화 에피토프를 지닌 항원을 사용함으로써 백신을 제조하는 것이 가능하기 때문에 주목된다. 중화 에피토프는 예를 들면 중화 항체, 예를 들면 본 발명의 KH-1(서열번호:10 및 12 참조)을 이용하여 스크리닝이 가능하다.

본 명세서에 있어서 '중화 활성'은 바이러스 등의 대상 객체, 대표적으로는 병원체가 세포 내에 침입하여 증식하는 것을 저해하는 활성을 의미한다. 중화 활성이 발휘되는 결과 병원성은 독성을 상실하게 되는 것이다.

본 명세서에 있어서 면역 반응에 있어서 '특이적'은 다른 대상 객체, 예를 들면 항체 또는 항원 등에 비해 반응성이 높고 바람직하게는 특정 대상에만 반응하는 것을 의미한다. 'HHV-6B에 특이적'이란 HHV-6A에서보다 HHV-6B에 대한 반응성이 높은 것으로 바람직하게는 HHV-6B에만 반응하는 것을 의미한다. 또한 본 명세서에 있어서 'HHV-6B에 특이적인 에피토프'는 HHV-6A 보다도 HHV-6B에 대한 반응성이 높고 바람직하게는 HHV-6B에만 반응하는 에피토프를 의미한다.

본 명세서에 있어서 '항체'는 면역 반응에 있어서 항원의 자극에 의해 생체 내에서 생성되는 것으로 항원과의 특이적으로 결합하는 반응을 지닌 단백질 또는 그와 동일한 서열을 지닌 화학 합성으로 생성된 물질을 총칭하는 것이다. 그 실체는 면역글로브린이고 Ab로 칭한다.

본 명세서에 있어서 항체의 '항원 결합성 단편'은 항체에 있어서 그 항체의 항원과 동일한 항원에 대해 결합성을 지닌 단편을 의미한다. 이와 같은 '항원 결합성 단편'의 범위에 속하는 지는 본 명세서에 기재된 친화성 에세이에 의해 평가될 수 있다. 본 명세서 내에서는 이와 같은 친화성은 항체에 대한 인식항원의 결합 양을 50% 저해하는 농도(IC₅₀ 치)를 지표로 사용할 때 IC₅₀ 수치를 예를 들면 로지스틱 커브에 의해 회귀 모델(Rodbard et al., Symposium on RIA and related procedures in medicine, P165, Int. Atomic Energy Agency, 1974)로 산출하는 것이 가능하다.

본 명세서에 있어서 '항-HHV-6B 항체'는 HHV-6B에 대해 유발되거나 또는 이와 동등의 결합능력을 지닌 항체를 의미한다. 항 HHV-6B 항체의 경우 에피토프(예를 들면 본 발명의 중화 에피토프)에 대한 결합능력을 유지하기 위해서 '헤비 체인 가변 도메인(VH)' 및 '라이트 체인 가변 도메인(VH)'이 특정 결합 능력을 유지시키는 것을 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에 있어서 '중화 항체'는 중화 활성을 지닌 임의의 항체를 의미한다.

본 명세서에 있어서 면역글로블린의 '헤비 체인 가변 도메인(VH)' 및 '라이트 체인 가변 도메인(VH)'은 해당 분야에 있어서 통상 사용하는 의미를 지닌다. 면역글로블린은 기본 구조는 동일한 2가닥의 L 사슬(라이트 체인)과 2가닥의 H 사슬(헤비 체인)이 S-S 결합으로 형성된 것이며 H 사슬은 C-말단측의 Fc(crystallizable fragment)와 N-말단측의 Fab(antigen binding fragment)의 2개의 단편이 힌지 부위에서 굴곡되어 있으며 전체로서는 Y자형 형상을 지닌다.

L 사슬 및 H 사슬도 N-말단으로부터 약 110개 아미노산(L 사슬의 절반정도의 길이)의 서열은 항원 특이적으로 응답하는 부위로서 양 사슬간에 일부 다른 서열을 지닌다. 이 부분이 가변부(가변 영역, V 부)이며 항원 특이성의 결정에는 L 사슬과 H 사슬 모두 가변부(VL,VH)가 관계되고 있다. 가변부 이외의 부분은 각 클래스 또는 서브클래스에 따라 거의 일정한 것으로 정상부(정상 영역, constant region, C 부)로 불리운다. 정상부는 L 사슬과 상동적 유니트(CL)인 약 110개의 아미노산으로 구성된 하나의 폴리펩타이드 유니트로 구성되어 있다. IgG, IgA 및 IgD 내의 3개 유니트(CH1, CH2, CH3)와 IgM 및 IgE 내의 4개 유니트가 H 사슬 내에서 연결되어 있다. 각 유니트 또는 상보적인 부위와 결합되어 생성된 영역을 도메인(domain)이라 칭한다. 본 발명의 항체는 도메인 등의 부분을 사용하여 표현할 수 있다.

본 명세서 내에서 특별히 다르게 의미를 지적하지 않는 한 항체 등의 임의의 폴리펩타이드 사슬은 N-말단(N-터미널 말단)부터 시작하여 C-말단(C-터미널 말단)까지 결합된 아미노산 서열을 지닌 것으로 기술한다. 항원 결합 부위는 V_H 및 V_L 도메인 모두를 포함하는 것으로 이것은 동일 폴리펩타이드 분자에 위치하여 얻어진다. 바람직하게는 각각의 도메인은 별도의 사슬에 위치하여 얻어지고 이 경우 V_H 도메인은 면역글로블린으로 된 항체의 헤비 체인 또는 그의 단편 일부로 되어 있고 한편 V_L은 면역글로블린으로 된 항체의 라이트 체인 또는 그의 단편 일부로 되어 있다. 본 발명의 항체는 이와 같은 단편 등의 부분을 사용하여 기술하는 것이 가능하다.

본 명세서에 있어서 사용되는 '항체 또는 항원 결합성 단편'의 예로는 B 세포 또는 하이브리도마에 의해 생성되는 항체 및 키메라 항체, CDR-이식 항체와 같은 인간 항체 또는 그의 임의의 단편 예를 들면 F(ab)₂ 및 Fab 단편, 단일 사슬 항체 및 단일 도메인 항체를 포함한다. 또한 HHV-6B 항체 또는 항원 결합성 단편은 HHV-6B 결합 분자로 호칭될 수 있으며 이는 B 세포 또는 하이브리도마에 의해 생성되는 항체 및 키메라 항체, CDR-이식 항체와 같은 인간 항체 또는 그의 임의의 단편 예를 들면 F(ab)₂ 및 Fab 단편, 단일 사슬 항체 및 단일 도메인 항체에 다른 분자가 결합되어 있는 것을 포함하는 것으로 이해된다.

단일 사슬 항체는 10개 내지 30개의 아미노산 바람직하게는 15개 내지 25개의 아미노산으로 된 펩타이드 링커에 의해 공유결합되는 항체의 헤비체인 및 라이트체인 가변 도메인으로 구성된다. 그 이유는 그 구조가 헤비체인 및 라이트체인의 정상 부분을 포함하지 않기 때문이며 작은 폴리펩타이드 스페이서가 전체의 정상 부분보다도 항원성이 낮은 것으로 여겨지기 때문이다. '키메라 항체'는 헤비체인 또는 라이트체인 또는 그 모두의 정상 영역이 인간 등의 특정 동물 유래인 반면, 헤비체인 및 라이트체인의 모두의 가변 도메인은 인간 등의 특정 동물 이외로부터 유래된 것으로 예를 들면 다른 인간 또는 마우스와 같은 비인간으로부터 유래되는 것이다. 또한 인간 유래인 경우 다른 인간 항체로부터 유도된 항체를 의미한다.

'CDR 이식 항체'는 초가변 부위 영역(CDR)이 비인간(예를 들면 마우스) 항체 또는 다른 인간의 항체인 도너(donor) 항체로부터 유도된 반면 면역글로블린의 다른 부분 모두는 실질적으로 모두 예를 들면 정상 영역 및 가변 도메인의 높은 보존 부분, 즉 프레임워크 영역은 억셉터(acceptor) 항체, 예를 들면 인간 유래의 항체로부터 유도된 항체를 의미한다. 그러나 CDR 이식 항체는 프레임워크 영역 중 예를 들면 초가변 영역에 인접한 프레임워크 영역의 일부에 도너 서열의 몇 개의 아미노산을 포함한다.

'인간화 항체'는 헤비체인 및 라이트체인 모두가 정상 및 가변 영역 모두를 인간 유래이거나 실질적으로 인간 유래 서열과 동일한 것으로 반드시 동일 항체 유래인 것은 필요하지 않으나 마우스 면역글로블린 가변 부분 및 정상 부분의 유전자가 인간 대응체(counterpart)로 치환되어 있는 마우스로부터 생성된 항체를 의미하는 것이다. 예를 들면 이러한 인간화 항체는 유럽특허 제 0546073B1호 또는 미국특허 제 5,545,806호에 있어서 일반적인 용어로 기재되어 있다.

본 명세서에 있어서 '항체가(titer)'는 혈청 반응에 있어서 항혈청의 단위 용량 중에 포함되어 있는 항원에 대해 결합하는 항체량을 의미한다. 실질적인 측정은 항혈청의 희석 시리즈에 대해 일정량의 항원을 가하여 수행한다. 측정치는 반응이 생성되는 종말점에 있어서 희석 배수인 것이다.

본 명세서에 있어서 '친화성(affinity)'은 항체와 그의 인식물질 간의 결합 능력을 의미한다. 본 명세서에 있어서 항체와 항원과 같은 그 인식물질 간의 해리 상수(dissociation constant)를 지표로서 친화성을 표시한다. 친화성(K_D)의 측정 방법은 이 분야의 당업자에 의해 일반적 기술이며 예를 들면 센서칩을 사용하여 측정하는 것이 가능하다.

프레임워크는 임의의 종류의 프레임워크 영역에 관련된 것으로 바람직하게는 인간 유래의 것이다. 적당한 프레임워크 영역은 Kabat E.A.의 문헌을 참작하여 선택할 수 있다. 바람직한 헤비체인 프레임워크는 인간 헤비체인 프레임워크이다. 이것은 대상이 되는 항체의 서열 정보로부터 상기 문헌을 참작하여 결정할 수 있다. FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 서열로 되어 있다. 동일한 방법으로 항-HHV-6B 라이트 체인 프레임워크에 있어서 대상이 되는 항체의 배열 정보로부터 상기문헌을 참작하여 결정할 수 있다. FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역의 서열로 되어 있다. 본 발명의 항체는 프레임워크 등의 부분을 사용하여 표현하는 것이 가능하다.

본 명세서에 있어서 사용되는 용어 '단백질', '폴리펩타이드', '올리고펩타이드' 및 '펩타이드'는 본 명세서에 있어서 동일한 의미로 사용되고 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 의미한다. 항체는 통상 단백질의 일종이다.

본 명세서에 있어서 사용되는 용어 '폴리뉴클레오타이드', '올리고뉴클레오타이드' 및 '핵산'은 본 명세서에 있어서 동일한 의미로 사용된다. 임의의 길이를 지닌 뉴클레오타이드의 폴리머이다. 특별히 다른 방법으로 표시되지 않으면 특정의 핵산 서열은 명시적으로 나타난 서열과 동일하고 그의 보존적으로 변이된 변이체 예를 들면 디제너레이트된 코돈 치환체는 하나 또는 그 이상의 선택된 또는 모든 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 작성하는 것에 의해 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).

본 명세서에 있어서 '유전자'는 유전 형질을 결정하는 인자를 의미한다. 통상 염색체 위에서 일정한 순서로 배열되어 있다. 단백질의 1차 구조를 결정하는 유전자 구조를 말한다. 이 발현을 좌우하는 영역을 조절 엘레멘트라고 칭한다. 본 명세서에서는 '유전자'는 '폴리뉴클레오타이드', '올리고뉴클레오타이드', '핵산' 또는 '단백질', '폴리펩타이드', '올리고펩타이드' 및 '펩타이드' 등으로 언급될 수 있다. 본 명세서에 있어서 유전자의 '오픈 리딩 프레임' 또는 'ORF'는 유전자의 염기 배열을 3염기 단위로 구별하는 경우 하나의 프레임으로 개시 코돈을 지니고 종료 코돈이 출현할 때까지의 염기 길이를 지닌다. 실질적으로 단백질을 코드화하는 가능성을 지닌 부위이다. 헤르페스바이러스 게놈은 그 전체 염기 서열이 결정된 것으로 적어도 101개의 유전자를 동정하였으며 이 유전자 각각이 오픈 리딩 프레임(ORF)를 지니는 것이 공지되어 있다.

본 명세서에 있어서 사용되는 gQ는 당단백질이며, HHV-6B에서는 gQ 유전자는 37kDa 당단백질을 코드화하는 것이다. 얼터너티브 스플라이싱 전사체에 유래한 것이다.

본 명세서에 있어서 사용되는 'HHV-6B gQ1' 또는 HHV-6B에 있어서 언급되는 경우 특히 'gQ1'(유전자)는 gp105-82로 호칭되는 분자이다. 젠뱅크(GenBank)에 있어서 NC-000898(게놈 서열)로 확인되는 것이다. gQ1은 구체적으로는 서열번호:2로 표시되는 서열 또는 그의 변이체를 지니는 것으로 예를 들면 이 단백질은

(a) 서열번호:2로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편인 폴리펩타이드;

(b) 서열번호:2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 치환 부가 또는 결실되어진 것에 의해 적어도 하나의 변이를 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드;

(c) 서열번호:2를 코드화하는 염기 서열의 스플라이싱 변이체 또는 대립 유전자 변이체에 의해 코드화된 폴리펩타이드;

(d) 서열번호:2에 나타난 아미노산 서열의 종(spacies) 상동체인 폴리펩타이드;

(e) (a) 내지 (d)에서 선택된 하나의 폴리펩타이드에 대한 동일성을 적어도 70% 이상 지닌 아미노산 서열을 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드; 또는

(f) (a) 내지 (d)의 적어도 하나의 폴리펩타이드를 코드화하는 폴리펩타이드와 엄중한(stringent) 하이브리다이제이션 조건 하에서 하이브리다이즈되는 폴리펩타이드에 의해 코드화된 아미노산 서열을 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드;를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 사용되는 'HHV-6B gQ2' 또는 HHV-6B에 있어서 언급되는 경우 특히 'gQ2'(유전자)는 HHV-6에 감염된 세포 및 비리온에 있어서 gH/gL/gQ1 복합체와 상호작용하는 것이다. 젠뱅크(GenBank)에 있어서 NC-000898(게놈 서열)로 확인되는 것이다. gQ2는 구체적으로는 서열번호:4로 표시되는 서열 또는 그의 변이체를 지니는 것으로 예를 들면 이 단백질은

(a) 서열번호:4로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편인 폴리펩타이드;

(b) 서열번호:4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 치환 부가 또는 결실되어진 것에 의해 적어도 하나의 변이를 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드;

(c) 서열번호:4를 코드화하는 염기 서열의 스플라이싱 변이체 또는 대립 유전자 변이체에 의해 코드화된 폴리펩타이드;

(d) 서열번호:4에 나타난 아미노산 서열의 종(spacies) 상동체인 폴리펩타이드;

(e) (a) 내지 (d)에서 선택된 하나의 폴리펩타이드에 대한 동일성을 적어도 70% 이상 지닌 아미노산 서열을 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드; 또는

(f) (a) 내지 (d)의 적어도 하나의 폴리펩타이드를 코드화하는 폴리펩타이드와 엄중한(stringent) 하이브리다이제이션 조건 하에서 하이브리다이즈되는 폴리펩타이드에 의해 코드화된 아미노산 서열을 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드;를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 사용되는 'HHV-6B gH' 또는 HHV-6B에 있어서 언급되는 경우 특히 'gH'(유전자)는 HHV-6에 감염된 세포 및 비리온에 있어서 gH/gL/gQ1 복합체를 형성하는 하나의 분자이다. 젠뱅크(GenBank)에 있어서 NC-000898(게놈 서열)로 확인되는 것이다. gH는 구체적으로는 서열번호:6으로 표시되는 서열 또는 그의 변이체를 지니는 것으로 예를 들면 이 단백질은

(a) 서열번호:6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편인 폴리펩타이드;

(b) 서열번호:6으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 치환 부가 또는 결실되어진 것에 의해 적어도 하나의 변이를 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드;

(c) 서열번호:6을 코드화하는 염기 서열의 스플라이싱 변이체 또는 대립 유전자 변이체에 의해 코드화된 폴리펩타이드;

(d) 서열번호:6에 나타난 아미노산 서열의 종(spacies) 상동체인 폴리펩타이드;

(e) (a) 내지 (d)에서 선택된 하나의 폴리펩타이드에 대한 동일성을 적어도 70% 이상 지닌 아미노산 서열을 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드; 또는

(f) (a) 내지 (d)의 적어도 하나의 폴리펩타이드를 코드화하는 폴리펩타이드와 엄중한(stringent) 하이브리다이제이션 조건 하에서 하이브리다이즈되는 폴리펩타이드에 의해 코드화된 아미노산 서열을 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드;를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 사용되는 'HHV-6B gL' 또는 HHV-6B에 있어서 언급되는 경우 특히 'gL'(유전자)는 HHV-6에 감염된 세포 및 비리온에 있어서 gH/gL/gQ1 복합체를 형성하는 하나의 분자이다. 젠뱅크(GenBank)에 있어서 NC-000898(게놈 서열)로 확인되는 것이다. gL은 구체적으로는 서열번호:8으로 표시되는 서열 또는 그의 변이체를 지니는 것으로 예를 들면 이 단백질은

(a) 서열번호:8로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편인 폴리펩타이드;

(b) 서열번호:8로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 치환 부가 또는 결실되어진 것에 의해 적어도 하나의 변이를 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드;

(c) 서열번호:8을 코드화하는 염기 서열의 스플라이싱 변이체 또는 대립 유전자 변이체에 의해 코드화된 폴리펩타이드;

(d) 서열번호:8에 나타난 아미노산 서열의 종(spacies) 상동체인 폴리펩타이드;

(e) (a) 내지 (d)에서 선택된 하나의 폴리펩타이드에 대한 동일성을 적어도 70% 이상 지닌 아미노산 서열을 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드; 또는

(f) (a) 내지 (d)의 적어도 하나의 폴리펩타이드를 코드화하는 폴리펩타이드와 엄중한(stringent) 하이브리다이제이션 조건 하에서 하이브리다이즈되는 폴리펩타이드에 의해 코드화된 아미노산 서열을 지니고 생물학적 활성을 지닌 폴리펩타이드;를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 '대응하는 아미노산 및 핵산'은 그 폴리펩타이드 및 핵산 분자에 있어서 비교의 기준이 되는 폴리펩타이드 및 핵산 분자에 있어서 소정의 아미노산 및 핵산이 동일한 형태로 작용하거나 이러한 작용이 예측되는 각각의 아미노산 및 핵산을 의미한다. 예를 들면 gQ1, gQ2, gL, gH 등에 관해서는 HHV-6B 또는 다른 변이주 등에 있어서 대응하는 유전자에 있는 얼라인먼트에 상응하여 정렬된 대응하는 서열(아미노산, 핵산 등)을 의미한다. 예를 들면 이 기준 위치로부터 동일한 위치에 존재하는 촉매 활성 등에서 동일한 형태로 기여하는 아미노산 및 그를 코딩하는 핵산이다. 예를 들면 핵산 서열의 경우 그 핵산 서열 또는 그를 코딩하는 특정 부분과 동일한 형태의 기능을 발휘하는 부분을 의미하는 것이다.

본 명세서에 있어서 '대응하는 유전자'는 예를 들면 폴리펩타이드 또는 핵산 분자 등은 비교의 기준이 되는 종(species)에 있어서 소정의 유전자가 동일한 형태로 작용하거나 이러한 작용이 예측되는 각각의 유전자를 의미한다. 이러한 작용을 지닌 유전자가 다수 존재하는 경우 진화학적으로 동일한 기원을 지닌 것을 의미한다. 따라서 이 유전자의 대응하는 유전자는 이 유전자의 오르소로그(ortholog)일 수 있다. 그러나 헤르페스바이러스 6B형의 서열, 종양항원 등의 유전자에 대응하는 유전자는 다른 생물, 예를 들면 헤르페스바이러스 6B형의 다른 변이주, 헤르페스바이러스 7형 등에 있어서 발견될 수 있다. 이와 같은 대응하는 유전자는 당해 분야에 있어서 알려진 기술을 사용하여 동정하는 것이 가능하다. 그러나 예를 들면 이 동물에 있어서 대응하는 유전자의 기준이 되는 유전자, 예를 들면 헤르페스 바이러스-6A 내의 gQ1, gQ2, gL, gH 서열 등의 서열을 퀘어리(query) 서열로 사용하는 그 미생물 또는 바이러스, 예를 들면 헤르페스바이러스 6B의 서열 데이터베이스를 검색하는 것에 의해 또는 웨트(wet) 실험으로 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 발견될 수 있다.

본 명세서에 있어서 '분리되는 물질', 예를 들면 핵산 또는 단백질 등과 같은 생물학적 인자는 그 물질이 천연으로 존재하는 환경 예를 들면 생물체 세포 내의 다른 물질, 바람직하게는 생물학적 인자 예를 들면 핵산인 경우 핵산 이외의 인자 및 목적하는 핵산 이외의 핵산 서열을 포함하는 핵산, 단백질인 경우 단백질 이외의 인자 및 목적하는 단백질 이외의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 등과 같이 실질적으로 분리 또는 정제시킨 것을 의미한다. 분리되는 핵산 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 따라서 분리된 핵산 및 단백질은 화학적으로 합성된 핵산 및 단백질을 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서 '정제되는 물질', 예를 들면 핵산 또는 단백질과 같은 생물학적 인자는 그 물질에 자연적으로 수반되는 인자를 적어도 일부 제거하는 것을 의미한다. 따라서 통상 정제된 물질에 있어서 그 물질의 순도는 그 물질이 통상 존재하는 상태보다도 높으며 즉 농축된 것이다.

본 명세서에 있어서 '정제된' 및 '분리된'은 바람직하게는 적어도 75중량% 더욱 바람직하게는 적어도 85중량% 보다 바람직하게는 적어도 95중량% 가장 바람직하게는 적어도 98중량%의 동일한 형태의 물질이 존재하는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서 유전자의 '상동성'은 2이상의 서열 예를 들면 아미노산 서열, 핵산 서열 등의 상호간에 대한 동일성의 정도를 의미한다. 따라서 이 2개의 서열 예를 들면 야생형 및 변이체간의 상동성이 높은 것은 이들간의 서열의 동일성 또는 유사성이 높은 것이다. 2종류의 서열이 상동성을 지니는지 여부는 서열을 직접 비교 또는 핵산의 경우 엄중한 조건 하에서 하이브리다이제이션 방법에 의해 조사하여 측정할 수 있다. 2개의 서열을 직접 비교하는 경우 그 서열간의 서열이 대표적으로 적어도 50% 이상 동일한 경우, 바람직하게는 적어도 70%이상 동일한 경우 더욱 바람직하게는 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경우 이들 배열은 상동성을 지닌 것이다.

본 명세서에 있어서 '하이브리다이제이션 되는 엄중한 조건'은 해당 분야에서 관용적으로 사용되는 주지의 조건을 말한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 중에서 선택된 프로브를 사용하여 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라그(plaque) 하이브리다이제이션법 또는 서던 블로트(Southern blot) 하이브리다이제이션법 등으로 수득될 수 있다. 구체적인 엄중한 조건으로 하이브리다이제이션되는 폴리뉴클레오타이드는 콜로니 또는 플라그 유래 DNA를 고정화시킨 필터를 사용하고 0.7~1.0M의 NaCl 존재 하에서 65℃로 하이브리다이제이션을 행한 후 0.1~2배 농도의 SSC(살린-소디움 시트레이트) 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mM 염화나트륨, 15mM 구연산나트륨이다)을 사용하고 65℃ 조건 하에서 필터를 세정하는 것에 의해 동정될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 하이브리다이제이션은 Molecular Cloning 2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995) 등의 시험서에 기재된 방법에 준하여 수행할 수 있다.

여기에서 엄중한 조건 하에서 하이브리다이제이션되는 서열로부터 바람직하게는 오직 A서열 또는 오직 T서열을 포함하는 서열을 제외할 수 있다. '하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오타이드'는 상기 하이브리다이제이션 조건 하에서 하이브리다이제이션 가능한 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 하이브리다이제이션 가능한 폴리뉴클레오타이드의 구체적인 예로는 본 발명에서 구체적으로 표시되는 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드를 코드화시킨 DNA 염기서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 지닌 폴리뉴클레오타이드 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 지닌 폴리뉴클레오타이드 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 지닌 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 염기서열의 동일성의 비교 및 상동성의 산출은 서열 분석용 툴인 BLAST를 사용한 디폴트 파라메타를 사용하여 산출한다. 동일성의 검색은 예를 들면 NCBI의 BLAST 2.2.9(2004년 5월 12일 발행)를 사용하여 수행할 수 있다. 본 명세서에 있어서 동일성의 수치는 통상 상기 BLAST를 사용하여 디폴트 조건 하에서 정렬시의 수치이다. 또한 파라메타의 변경에 의해 보다 높은 수치가 산출되는 경우는 가장 높은 수치를 동일성의 수치로 본다. 다수의 영역에서 동일성이 평가되는 경우는 이 중 가장 높은 수치를 동일성의 수치로 한다.

본 명세서에 있어서 '검색'은 전자적 또는 생물학적 또는 다른 방법에 의해 이 핵산 염기 서열을 이용하여 특정 기능 및/또는 성질을 지닌 다른 핵산 염기 서열을 발견하는 것을 의미한다. 전자적인 검색으로는 BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444-2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195-197 (1981)) 및 Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)) 등을 열거할 수 있으나 이것으로 한정하는 것은 아니다. 생물학적인 검색으로는 엄중한 하이브리다이제이션, 게놈 DNA를 나일론 멤브레인 등에 부착시킨 마이크로어레이 또는 글라스 판에 부착시킨 마이크로어레이(마이크로어레이 에세이), PCR 및 in situ 하이브리다이제이션 등을 열거할 수 있다. 본 명세서에서는 본 발명에 있어서 사용되는 gQ1, gQ2, gL, gH 등도 이와 같은 전자적 검색, 생물학적 검색에 의해 동정된 대응하는 서열을 포함할 수 있는 것으로 의도된다.

아미노산은 그의 일반적으로 공지된 3문자 기호로 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 권장되는 1문자 기호로 사용하여 본 명세서 중에 언급되고 있다. 뉴클레오타이드 역시 동일한 형태로 일반적으로 수용되는 1문자 코드에 의해 언급된다.

본 명세서에 있어서 '플래그먼트'는 전체 길이의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드(길이 n)에 대해 1 내지 n-1까지의 서열 길이를 지닌 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 플래그먼트의 길이는 그 목적에 따라 적정하게 변경할 수 있으며 예를 들면 그 길이의 하한으로서 폴리펩타이드의 경우 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 및 그 이상의 아미노산을 들 수 있으나 여기서 구체적으로 열거하지 않은 정수로 표현된 길이(예를 들면 11 등)도 하한으로 적절하게 사용할 수 있다. 한편 폴리뉴클레오타이드의 경우 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 및 그 이상의 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있으나 여기서 구체적으로 열거하지 않은 정수로 표현된 길이(예를 들면 11 등)도 하한으로 적절하게 사용할 수 있다.

본 명세서에 있어서 사용하는 폴리펩타이드는 천연의 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 작용 예를 들면 중화활성을 지니는 것으로 아미노산 서열 중의 하나 이상 예를 들면 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 부가 및/또는 결실된 것을 포함할 수 있으며 당사슬의 치환, 부가 및/또는 결실된 것도 가능하다.

이 아미노산과 동일한 형태의 소수성 지수를 지닌 아미노산으로 치환시키거나 이에 따라 동일한 형태의 생물학적 기능을 지닌 단백질 예를 들면 효소 활성에 있어서 등가인 단백질을 생성시켜 수득하는 것도 해당 분야에 주지된 기술이다. 이와 같은 아미노산 치환에 있어서 소수성 지수가 ±2 이내의 것이 바람직하고 ±1 이내의 것이 더욱 바람직하며 또한 ±0.5 이내의 것이 가장 바람직하다. 소수성기에 근거하여 이와 같은 아미노산의 치환은 효율적인 것으로 해당 분야에 있어서 이해된다. 소수성 지수는 또한 변이체 제조에 있어서 고려된다. 미국특허 제 4,554,101호에 기재된 바와 같이 다음의 소수성 지수가 아미노산 잔기에 할당되어 있다. 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파트산(+3.0 ± 1); 글루탐산(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 및 트리프토판(-3.4)이다. 단백질 내에서 아미노산은 동일한 형태의 친수성 지수를 지니고 또한 생물학적 등가체인 아미노산으로 치환될 수 있는 것으로 이해된다. 이와 같은 아미노산 치환에 있어서 친수성 지수가 ±2 이내의 것이 바람직하고 ±1 이내의 것이 더욱 바람직하며 또한 ±0.5 이내의 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 있어서 '보존적 치환'은 아미노산 치환에 있어서 원래의 아미노산과 치환되는 아미노산과의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수가 상기한 바와 같이 유사한 치환을 의미한다. 본 명세서에 있어서 '유사한 치환'은 친수성 지수가 ±2 이내의 것을 의미한다. 보존적 치환의 예는 당업자에게 주지되어 있으며 예를 들면 다음 각 그룹 내에서 치환 : 아르기닌 및 라이신; 글루탐산 및 아스파트산; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴 또는 발린; 류신 및 이소류신; 등을 열거할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서 '변이체'는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 등의 물질에 대해 일부가 변이된 것을 의미한다. 이와 같은 변이체로서는 치환 변이체, 부가 변이체, 결실 변이체, 단축(truncated) 변이체, 대립 유전자 변이체 등을 들 수 있다. 대립 유전자(allele)는 동일 유전자 위치에 속하며 서로간에 구별되는 유전적 변이체를 의미한다. 따라서 '대립 유전자 변이체'는 이 유전자에 대해 대립 유전자의 관계를 지닌 변이체를 의미한다. '종 상동체 또는 호몰로그(homolog)'는 같은 종 내에서 어느 유전자와 아미노산 레벨 또는 뉴클레오타이드 레벨간의 상동성이 바람직하게는 60% 이상의 상동성 더욱 바람직하게는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 상동성을 지닌 것을 의미한다. 이와 같은 종 상동체를 취득하는 방법은 본 명세서의 기재로부터 명백히 인지할 수 있다. '오르소로그(ortholog)'는 오르소로고스 유전자를 의미하며 2개의 유전자가 같은 조상으로부터 종 분화하여 유래된 유전자이다. 예를 들면 다중 유전자 구조를 지닌 헤모글로빈 유전자 패밀리를 들 수 있으며 인간과 마우스의 α-헤모글로빈 유전자는 오르소로그이지만 인간의 α-헤모글로빈 유전자와 β-헤모글로빈 유전자는 파라로그(paralog)(유전자 중복으로 생성된 유전자)이다. 오르소로그는 분자 계통 나무의 추정에 유용하기 때문에 본 발명의 오르소로그 역시 본 발명에 있어서 유용한 것이다.

본 명세서에 있어서 '기능적 변이체'는 기준이 되는 배열이 특정 생물학적 활성 특히 중화활성을 지니는 변이체를 의미한다.

본 명세서에 있어서 '보존적으로 (변이된)변이체'는 아미노산 서열 및 핵산서열 모두에 적용되는 것이다. 특정의 핵산 서열에 대해 보존적으로 변이된 변이체는 동일 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코드화시킨 핵산을 의미한다. 유전 코드의 디제너레이션을 위해 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코드화한다. 예를 들면 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코드화한다. 따라서 알라닌이 코돈에 의해 특정된 전체의 위치에서 이 코돈은 코드화된 폴리펩타이드를 변경하지 않고 기재된 대응하는 코돈의 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이와 같은 핵산의 변동은 보존적으로 변이된 변이의 하나의 종이다. '사일런트 변이'이다. 핵산에 있어서는 보존적 치환은 예를 들면 중화활성을 측정하는 것으로부터 확인될 수 있다.

본 명세서에 있어서 기능적으로 등가인 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자를 제조하기 위해서 아미노산의 치환 방법뿐만 아니라 아미노산의 부가, 결실 또는 모디피케이션을 수행할 수 있다. 아미노산 치환에는 원래의 펩타이드를 1개 이상 예를 들면 1~10개, 바람직하게는 1~5개, 더욱 바람직하게는 1~3개의 아미노산으로 치환하는 것을 들 수 있다. 아미노산의 부가에는 원래의 펩타이드 사슬에 1개 이상 예를 들면 1~10개, 바람직하게는 1~5개, 더욱 바람직하게는 1~3개의 아미노산을 부가할 수 있다. 아미노산 결실에는 원래의 펩타이드에 1개 이상 예를 들면 1~10개, 바람직하게는 1~5개, 더욱 바람직하게는 1~3개의 아미노산을 결실할 수 있다. 아미노산의 모디피케이션은 아미드화, 카르복실화, 황산화, 할로겐화, 알킬화, 글리코실화, 인산화, 수산화, 아실화(예를 들면 아실레이션) 등을 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 치환 또는 부가된 아미노산은 천연의 아미노산인 것도 좋고 비천연의 아미노산 또는 아미노산 아날로그도 좋다. 천연의 아미노산이 바람직하다.

본 발명의 항원 등의 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산은 주지의 PCT법에 의해 수득될 수도 있고 화학적으로 합성 가능하다. 이와 같은 방법의 예로는 부위 특이적 변이 유발법 또는 하이브리다이제이션법 등을 조합하여 사용할 수 있다.

본 명세서에 있어서 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 '치환, 부가 또는 결실'은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 대해 그것의 아미노산 또는 그의 대체물 또는 뉴클레오타이드 또는 그의 대체물이 치환된 것, 부가된 것, 삭제된 것을 의미한다. 이와 같은 치환, 부가 또는 결실의 기술은 해당 분야에 있어서 주지되어 있으며 이와 같은 기술의 예로서는 부위 특이적 변이 유발(site-specific mutagenesis) 기술 등을 열거할 수 있다. 치환, 부가 또는 결실은 하나 이상의 임의의 개수도 좋고 이와 같은 개수는 그의 치환, 부가 또는 결실을 지닌 변이체에 있어서 목적하는 기능을 유지하는 한 증가하여도 가능하다. 예를 들면 이와 같은 개수는 하나 또는 수개일 수 있고 바람직하게는 전체 길이의 20% 이내, 10% 이내 또는 100개 이하, 50개 이하, 25개 이하를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 사용되는 '스크리닝'은 목적하는 특정의 성질을 지닌 물질 등의 인자를 특정의 조작 및 또는 평가방법으로 다수의 후보로부터 선별하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 원하는 활성을 지닌 스크리닝에 따라 얻어지는 물질 등의 인자 역시 본 발명의 범위 내에서 포함되는 것으로 이해된다.

본 명세서에 있어서 백신, 의약 등의 '유효량'은 그 의약 등이 목적하는 약효를 발휘할 수 있는 양을 의미한다. 본 명세서에 있어서 이와 같은 유효량 내에서 최소 농도를 최소 유효량이라고 본다. 이와 같은 최소 유효량은 해당 분야에 있어서 주지되어 있고 통상 약재 등의 최소 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 또한 당업자가 적정하게 결정할 수도 있다. 이와 같은 유효량의 결정에는 실제로 투여되는 경우 동물 모델 등을 사용하여 결정 가능하다. 본 발명에서는 이와 같은 유효량을 결정하는 방법이 유용하다. 본 발명에서는 백신 등의 유효량을 적정하게 결정할 수 있다.

본 명세서에 있어서 '약학적으로 수용 가능한 캐리어'는 의약의 제조시 사용되는 물질로서 유효성분에 유해한 영향을 부여하지 않는 것이다. 이와 같은 약학적으로 수용 가능한 캐리어로서는 예를 들면 항산화제, 보존제, 착색제, 풍미제 및 희석제, 유화제, 현탁화제, 용제, 필러, 증량제, 완충제, 전달 비히클, 부형제 및/또는 농학 또는 약학적 애쥬번트 등을 열거할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 처치 방법에 있어서 사용되는 약재 등의 종류 및 양은 본 발명의 방법에 따라 얻어진 정보 예를 들면 질환에 관한 정보를 원칙적으로 사용한다. 사용 목적, 대상 질환(종류, 중증도 등), 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 투여되는 피험체의 부위의 형태 또는 종류 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명의 모니터링 방법의 피험체 또는 환자에 대해 다른 정도 또는 사용 목적, 대상 질환(종류, 중증도 등), 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력 및 치료과정을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 환자 질환을 모니터링하는 빈도로서는 예를 들면 매일 내지 수개월에 1회 예를 들면 일주일에 1회 내지 1개월에 1회의 모니터링을 열거할 수 있다. 1주간 내지 1개월에 1회 모니터링이 경과를 관찰하는 데 가장 바람직하다.

본 명세서에 있어서 '지시서'는 본 발명의 의약 등을 투여하는 방법 또는 진단하는 방법, 본 발명의 치료방법 등을 의사, 환자 등에 투여에 사용하는 것으로 진단하는 사람(환자 본인인 경우 포함), 스크리닝 실시자에 대해 기재하고 있는 것이다. 이 지시서는 본 발명의 진단약, 예방약, 의약 등의 사용방법 예를 들면 백신의 투여 횟수, 간격 등을 지시하는 문헌이 기재되어 있다. 이 지시서는 본 발명이 실시되는 나라의 감독기관 예를 들면 일본의 경우 후생노동성, 미국의 경우 식품의약품국(FDA) 등에서 규정하고 있는 양식에 따라 작성되고 그 감독관청에 의해 승인을 받았는지를 명기한다. 지시서는 이의 첨부문서(패키지 인설트)일 수 있고 통상 종이매체로 제공되며 이에 한정하는 것은 아니고 그 예로는 병에 부착된 필름, 전자매체 예를 들면 인터넷에서 제공하는 홈페이지(웹사이트), 전자메일 등의 형태로 제공될 수 있다.

필요에 따라 본 발명의 치료에는 2종류 이상의 약재 등이 사용될 수 있다. 2종류 이상의 약재 등을 사용하는 경우 유사 성질 또는 유래 물질을 사용하여도 좋고 다른 성질 또는 유래 물질을 사용하여도 좋다. 이와 같은 2종 이상의 약재 등을 투여하는 방법을 위해 환자 레벨에 관한 정보도 본 발명의 방법에 의해 입수할 수 있는 것이다.

본 발명에서 사용되는 배양 방법은 예를 들면 동물 배양세포 매뉴얼, Seno et al., Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 1993 등에 기재된 것을 들 수 있으며 본 명세서에 있어서 이 모두의 기재가 채택될 수 있다.

(폴리펩타이드의 제조방법)

본 발명의 항원, 백신 등은 폴리펩타이드이다. 이와 같은 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드(항원 등)를 코드화시킨 DNA를 재조합 시킨 벡터를 지닌 미생물, 동물세포 등으로부터 유래된 형질 전환체를 통상의 배양 방법에 따라 배양시켜 본 발명의 폴리펩타이드를 생성, 축적시켜 본 발명의 배양물로부터 본 발명의 폴리펩타이드를 채취하는 것에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 형질전환체를 배지에서 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있다. 대장균 등의 원핵생물 또는 호모 등의 진핵생물을 숙주로서 사용하여 수득된 형질전환체를 배양하는 배지로서는 본 발명의 생물이 요구하는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 포함하는 형질전환체 배지를 효율적으로 수행할 수 있는 배지, 즉 천연배지, 합성배지 등을 사용할 수 있다.

탄소원으로서는 각각의 미생물이 요구하는 것인 것이 바람직하고 글루코즈, 프락토즈, 슈크로즈, 이것을 포함하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 초산 프로피온산 등의 유기산, 에탄올 프로판올 등의 알코올 등을 사용할 수 있다.

질소원으로서는 암모니아, 염화암모니움, 황산암모니움, 초산암모니움, 인산암모니움 등의 각종 무기산 또는 유기산 암모니움염, 기타 질소함유 물질, 즉 펩톤, 소고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그의 소화물 등을 사용할 수 있다.

무기염으로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산철, 황산마그네슘, 황산동, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 배지는 진탕배지 또는 심부통기교반배지 등을 호기적 조건 하에서 사용할 수 있다.

배양온도는 15~40℃가 좋고 배양시간은 통상 5시간 내지 7일간이다. 배양중 pH는 3.0~9.0을 유지한다. pH 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 수행한다. 한편 배양액 중에 필요에 따라 암피실린 또는 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가하여도 좋다.

유도성 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가시켜도 좋다. 예를 들면 lac 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우에는 이소프로필-β-D-티오칼락토피라노사이드 등을 사용하고, trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양하는 경우에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가하여도 좋다. 유전자를 도입시킨 식물세포 또는 기관은 자(jar) 발효기를 사용하여 대량 배양할 수 있다. 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 Murashige and Skoog (MS) 배지, White 배지 또는 이 배지에 옥신, 사이토카인 등 식물호르몬 등을 첨가시킨 배지 등을 사용할 수 있다.

예를 들면 동물세포를 사용하는 경우 본 발명의 세포를 배양하는 배지는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI 1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], DMEM 배지 [Virology, 8, 396 (1959)], 199 배지 [Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] 등과 같은 배지에 우태아혈청 등을 첨가시킨 배지를 사용할 수 있다.

배지는 통상 pH 6~8, 25~40℃, 5% CO₂ 존재 하 등의 조건 하에서 1~7일간 행한다. 한편 배지 중 필요에 따라 가나마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가하여도 좋다.

본 발명의 폴리펩타이드를 코드화시킨 핵산서열로 형질전환시킨 형질전환체의 배양물로부터 본 발명의 폴리펩타이드를 분리 또는 정제하기 위해서는 해당 분야에 주지 관용된 통상의 효소 분리 또는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 폴리펩타이드가 본 발명의 폴리펩타이드 제조용 형질전환체의 세포 밖에서 본 발명의 폴리펩타이드를 분비하는 경우 이 배양물을 원심분리 등의 방법에 따라 처리하고 가용성 획분을 수득한다. 이 가용성 획분으로부터 용매 추출법, 암모니아설페이트 등에 의한 염석탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로즈, DIAION HPA-75(미쓰비시 화학) 등 수지를 사용하여 음이온 교환 크로마토그라피법, S-세파로즈 FF(Pharmacia) 등의 수지를 사용한 양이온 교환 크로마토그라피법, 부틸-세파로즈, 페닐-세파로즈 등과 같은 수지를 사용한 소수성 크로마토그라피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 어피니티 크로마토그라피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법의 수단을 사용하여 정제품을 수득할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드 제조용 형질전환체의 세포 내에서 용해상태로 축적되는 경우에는 배양물을 원심분리하여도 좋고 배양물 중의 세포를 집적시켜 이 세포를 세척시킨 후에 초음파 분쇄기, 프렌치프레스, Manton Gaulin 호모게나이저, dyno-밀 등에 의해 세포를 파쇄시켜 무세포 추출액을 수득한다. 이 무세포 추출액을 원심분리시켜 수득된 상등액으로부터 용매 추출법, 암모니아설페이트 등에 의한 염석탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로즈, DIAION HPA-75(미쓰비시 화학) 등 수지를 사용하여 음이온 교환 크로마토그라피법, S-세파로즈 FF(Pharmacia) 등의 수지를 사용한 양이온 교환 크로마토그라피법, 부틸-세파로즈, 페닐-세파로즈 등과 같은 수지를 사용한 소수성 크로마토그라피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 어피니티 크로마토그라피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법의 수단을 사용하여 정제품을 수득할 수 있다.

한편 본 발명의 폴리펩타이드가 세포 내에서 불용체로 형성되어 발현되는 경우에는 동일한 형태의 세포를 회수 후 파쇄시켜 원심분리를 행하여 수득되는 침전 획분으로부터 통상의 방법에 따라 본 발명의 폴리펩타이드를 회수 후 이 폴리펩타이드의 불용체를 폴리펩타이드 변성제로 가용화시킨다. 이 가용화액은 폴리펩타이드 변성제를 포함하지 않거나 폴리펩타이드 변성제의 농도가 폴리펩타이드가 변성되지 않을 정도로 희박한 용액으로 희석 또는 투석시켜 본 발명의 폴리펩타이드를 정상적인 입체구조로 구성시킨 후 상기와 동일한 형태로 분리 정제법에 의해 정제품을 수득할 수 있다.

한편 통상의 단백질 정제방법[J. Evan. Sadler et al.: Methods in Enzymology, 83, 458]에 준하여 정제를 행한다. 한편 폴리펩타이드를 다른 단백질과 융합단백질로서 생산하고 융합된 단백질에 친화성을 그 물질을 사용한 어피니티 크로마토그라피를 이용하여 정제할 수도 있다[Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1995)]. 예를 들면 Lowe 등의 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227-8231 (1989), GenesDevelop., 4, 1288 (1990)]에 기재된 준하여 본 발명의 폴리펩타이드를 프로테인A와 융합단백질로서 생산하고 이뮤노글로블린G를 하용한 어피니티 크로마토그라피에 따라 정제할 수도 있다.

한편 본 발명의 폴리펩타이드를 FLAG 펩타이드와 융합단백질로서 생산하고 항-FLAG 항체를 사용한 어피니티 크로마토그라피에 따라 정제할 수도 있다[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)].

또한 본 발명의 폴리펩타이드 자신에 대한 항체를 사용하여 어피니티 크로마토그라피로 정제한 것도 가능하다. 본 발명의 폴리펩타이드는 공지의 방법[J. Biomolecular NMR, 6, 129-134, Science, 242, 1162-1164, J. Biochem., 110, 166-168 (1991)]에 준하여 인 비트로 전사 번역 시스템을 사용하여 생산하는 것도 가능하다.

상기 방법으로 취득된 폴리펩타이드는 아미노산 정보를 기반으로 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카복실법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학적 합성법에 의해서도 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 한편 Advanced ChemTech, Applied Biosystems, Pharmacia Biotech, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, 시마즈제작소 등의 펩타이드 합성기를 사용하여 화학 합성하는 것도 가능하다.

정제된 본 발명의 폴리펩타이드의 구조해석은 단백질 화학을 통상 사용하는 방법, 예를 들면 유전자 클로닝을 위해 단백질 구조해석(Hisashi Hirano, Tokyo Kagaku Dojin, 1993)에 기재된 방법에 의해 실시 가능하다.

본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 결실, 치환 또는 부가는 출원 전 주지된 기술로서 부위 특이적 변이 유발법에 의해 실시할 수 있다. 또한 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가시키는 방법은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5662 (1984), Science, 224, 1431 (1984), PCT WO 85/00817 (1985), Nature, 316, 601 (1985) 등에 기재된 방법에 준하여 제조할 수 있다.

(면역치료)

본 명세서에 있어서 '백신'은 신체 중에 투여되어 활성적으로 면역을 생성한다. 통상 감염성 인자 또는 감염인자인 부분 또는 이와 같은 인자 또는 부분을 생성할 수 있는 인자(예를 들면 유전자 서열 등)를 포함하는 조성물(예를 들면 현탁액 또는 용액)을 의미한다. 백신을 구성하는 항원성 부분은 미생물 예를 들면 바이러스 또는 세포 등 또는 미생물로부터 정제된 천연의 생성물, 합성 생성물 또는 유전자 조작된 단백질, 펩타이드, 다당체 또는 이와 유사한 생성물 또는 이와 같은 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산분자 등을 들 수 있다. 백신은 중화항체를 생성하는 것에 의해 그 효과를 발현한다. 백신은 유전자 백신인 것도 가능하고 유전자 백신으로는 투여된 피험자에 있어서 발현하고 이 발현물이 백신 작용을 지니는 인자(대표적으로는 핵산분자)를 포함하는 조성물이고 예를 들면 현탁액 또는 용액 등을 들 수 있다. 대표적인 유전자 백신은 항원성을 지닌 유전자 산물을 코드화시킨 핵산 서열을 지닌 핵산 분자이며 예를 들면 벡터, 플라스미드, Naked DNA 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 백신의 면역학적인 효과는 해당 분야에 있어서 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 이와 같은 방법으로는 예를 들면 CTL 전구세포 빈도분석, ELISPOT법, 테트라머법, 실시간-PCR법 등을 열거할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 설명으로 CTL 전구세포 빈도분석법은 말초 혈액 임파구 또는 항원 펩타이드 및 IL-2 존재 하에 배양시킨 임파구를 한계 희석시키고 IL-2와 피더(feeder)세포를 동시에 배양시키고 증식된 웰을 백신 또는 그의 후보 물질로 자극시킨 후, 인터페론-γ 생성 유무를 ELISA 등으로 측정한다. 여기서 양성 웰을 Poisson 분석에 따라 CTL 전구세포의 빈도를 산출하고 백신의 효력을 평가하는 것이다. 여기서 양성 세포 수가 항원 특이적 CTL 수이며 이 수가 많을수록 백신으로서 효력이 높은 것이다.

본 명세서에 있어서 '애쥬번트'는 투여시킨 면역원과 혼합할 때 면역 응답을 증가시키거나 이를 변경시킬 수 있는 물질이다. 애쥬번트는 예를 들면 광물, 세균, 세포, 식물, 합성 또는 숙주 생성물 등으로 분류될 수 있다.

본 명세서에 있어서 '병원체'는 숙주에 대해 질환 또는 장애를 발생시키는 생물 또는 인자를 의미한다.

본 명세서에 있어서 '예방'은 이 질환 또는 장애에 있어서 이와 같은 상태를 유발하기 전에 이와 같은 상태로 발전하지 않도록 처치하는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서 '치료'는 이 질환 또는 장애에 있어서 이와 같은 상태가 된 경우 이와 같은 질환 또는 장애를 악화시키는 것을 방지하고 바람직하게는 현상 유지 더욱 바람직하게는 경감 더욱 바람직하게는 소멸시키는 것을 말한다.

이와 같은 치료활성 또는 예방활성은 본 발명의 백신에 관해서 측정되는 경우 바람직하게는 인간에 사용 전에 시험관에서 그 후 생체 내 실험을 통해 측정한다. 예를 들면 본 발명의 백신의 치료 유용성 또는 예방 유용성을 증명하기 위한 인 비트로 에세이로서 세포주 또는 환자의 조직 샘플에 대한 백신의 특이적 결합 효과를 열거할 수 있다. 당업자에 공지된 기술 예를 들면 ELISA 등 면역학적 에세이를 사용하여 결정할 수 있다. 생체 내 시험으로는 예를 들면 중화항체를 유발하는 능력을 지닌 것인지를 시험하는 방법을 열거할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서 '피험체(subject)'는 본 발명의 처치의 적용이 되는 생물을 의미한다. 환자로 일컬어지며 환자 또는 피험체로 바람직하게는 인간이다.

본 발명은 피험체에 유효량의 본 발명의 백신을 투여하여 처치, 저해 및 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 본 발명의 백신은 실질적으로 정제된 것을 사용할 수 있다. 예를 들면 이와 같은 효과를 제한하거나 원하지 않는 부작용이 생성되는 물질을 실질적으로 존재하지 않게 하는 상태로 정제하는 것을 들 수 있다.

본 명세서 내에서 '투여하는'은 본 발명의 백신 또는 이를 포함하는 의약 조성물을 단독 또는 다른 치료제와 조합시켜 처치가 의도되는 숙주에 투여하는 것을 의미한다. 조합에는 예를 들면 혼합물로서 동시에 또는 별개로 동시에 병용하거나 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 이것은 조합되는 약제 등이 치료 혼합물로서 투여되는 것을 포함한다. 따라서 조합되는 약제 등은 각각 또는 동시에 예를 들면 동일한 개체에 별도의 점막을 통하여 투여하는 경우와 같은 투여 수순을 포함할 수 있다. '조합하는' 투여는 첫 번째 투여와 연속적으로 두 번째 투여되는 화합물 또는 약제를 별도로 투여하는 것을 포함한다.

본 발명에 있어서 백신의 투여는 이와 같은 방법을 사용하여도 좋고 바람직하게는 바늘이 없는 주사를 사용하여 시행할 수도 있다. 환자의 정도에 따라 부담되는 투여가 아닌 투여를 행하는 것이 바람직하다.

이 때 본 발명에 있어서 바늘 없는 주사기로는 주사침을 사용하지 않고 가스압력 또는 탄성 부재의 탄력에 의해 피스톤을 이동시켜 약액을 경피에 분사시키고 약재 등의 성분을 피부 내로 바람직하게는 피부 내의 세포 내로 투여하는 의료 기구를 의미한다. 구체적인 예로는 상품명 ShimaJET (시마즈 제작소 제조), Medi-Jector Vision (Elitemedical 제조), PenJet (PenJet 제조) 등이 시판되고 있다.

본 발명의 방법에 의한 예방, 처치 종료의 판단은 시판되는 에세이 또는 기구 사용에 의해 유발된 항체를 확인하는 것에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 본발명의 의약을 포함하는 용기를 제공하는 약학적 패키지 또는 키트를 제공한다. 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 정한 형식의 고지는 이와 같은 용기에 임의로 부착 될 수 있으나 이 고지는 인간에 투여에 대해 제조 사용 또는 판매에 관한 정비기관의 승인을 요한다.

(본 명세서에 있어서 사용되는 일반적 기술)

본 명세서에 있어 사용되는 기술은 여기에서 구체적으로 지시되지 않는 한 해당 분야의 기술 범위 내의 것이다. 당사슬 과학, 마이크로플루이딕스, 세포 가공, 유기화학, 생화학, 유전자공학, 분자생물학, 미생물학, 유전학 및 관련 분야에 있어서 주지 관용 기술을 사용한다. 이와 같은 기술은 예를 들면 다음에 열거한 문헌 및 본 명세서에 있어서 다른 부분에서 인용하고 있는 문헌을 통해 충분히 설명될 수 있는 것이다.

세포가공에 있어서는 예를 들면 in Campbell, S.A. (1996). The Science and Engineering of Microelectronic Fabrication, Oxford University Press; Zaut, P.V. (1996). Micromicroarray Fabrication: a Practical Guide to Semiconductor Processing, Semiconductor Services; Madou, M.J. (1997). Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press; Rai-Choudhury, P. (1997). Handbook of Microlithography, Micromachining, & Microfabrication: Microlithography 등에 기재되어 있으며 이는 본 명세서에 있어서 관련된 부분에 참고로 원용되어 있다.

본 명세서에 있어서 사용하는 분자생물학적 기법, 생화학적 기법, 미생물학적 기법, 당사슬과학적 기법은 해당 분야에 있어서 주지 관용되고 있는 것으로 예를 들면 Maniatis, T. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001); Ausubel, F.M., et al. eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., NY, 10158 (2000); Innis, M.A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Innis, M.A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Sninsky, J.J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press; Gait, M.J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R.L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press; Method in Enzymology 230, 242, 247, Academic Press, 1994; and Separate Volume Experimental Medicine “Gene Introduction & Expression Analysis Experimental Method” Yodosha Co., Ltd., 1997 등에 기재되어 있고 이것은 본 명세서에 있어서 관련된 부분 또는 전부에 참고로 원용된다.

(바람직한 실시 형태의 설명)

이하 바람직한 실시 형태에 대해 설명한다. 이 실시형태는 본 발명의 예시를 위한 것으로 본 발명의 범위는 이와 같은 바람직한 실시형태로 한정되는 것은 아닌 것으로 이해된다. 당업자는 또한 이하 바람직한 실시예를 참고하여 본 발명의 범위에 대해서 변경, 모디피케이션 등을 용이하게 행할 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

(에피토프)

하나의 측면에 있어서 본 발명은 서열번호:2의 484번 잔기로부터 496번 잔기로 표시되는 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP) 또는 이의 변이서열 내에서 E를 포함하는 5개의 연속적(consecutive) 아미노산 서열을 포함하거나 E가 Q로 변화될 때 487번 잔기는 C 및 489번 잔기인 G가 보존되는 서열을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 에피토프는 서열번호:2의 484번 잔기로부터 496번 잔기로 표시되는 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP) 등 이다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 에피토프는 서열번호:2의 484번 잔기로부터 496번 잔기로 표시되는 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP) 또는 이의 변이서열 내에서 적어도 6개의 연속적 아미노산 서열, 바람직하게는 7개의 연속적 아미노산 서열, 8개의 연속적 아미노산 서열, 9개의 연속적 아미노산 서열, 10개의 연속적 아미노산 서열, 11개의 연속적 아미노산 서열, 12개의 연속적 아미노산 서열 또는 13개의 연속적 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP)을 포함한다. 바람직하게는 QALCEGGHVFYNP 내에 적어도 5개의 연속적 아미노산 서열, 바람직하게는 6개의 연속적 아미노산 서열, 바람직하게는 7개의 연속적 아미노산 서열, 8개의 연속적 아미노산 서열, 9개의 연속적 아미노산 서열, 10개의 연속적 아미노산 서열, 11개의 연속적 아미노산 서열, 12개의 연속적 아미노산 서열 또는 13개의 연속적 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP의 전체 길이)을 포함한다. 이와 같은 에피토프는 본 발명의 이 정보를 사용하여 해당 분야에 있어서 주지된 방법을 사용하는 것에 의해 특정할 수 있다.

본 발명의 에피토프는 상기에 한정하지 않는다. 즉 다음과 같이 예를 들면 Pepscan과 같은 공지 기술을 사용하여 본 명세서에 기재된 정보에 근거하여 본 발명의 중화 에피토프는 당업자가 적정하게 구체적 서열을 제조할 수 있는 것으로 이해된다.

또 다른 실시태양에는 중화활성에 있어서 gQ1과 gQ2의 복합체 형성의 중요성 역시 본 발명에 있어서 하나의 중요한 특징이다. 따라서 중화활성에 있어서 gQ1과 gQ2의 복합체 형성에 근거하여 본 발명의 중화 에피토프는 당업자가 적절하게 구체적인 서열을 작성할 수 있는 것으로 이해된다.

(항원)

하나의 측면에 있어서 본 발명은 본 발명의 에피토프를 포함하는 항원을 제공한다. 본 발명의 항원에 있어서 포함되는 모든 에피토프는 본 명세서 중(에피토프)에 기재된 임의의 실시 형태를 취할 수 있는 것으로 이해된다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 항원은 서열번호:2의 아미노산 1번 잔기 내지 484번 잔기 및 본 발명의 에피토프를 포함한다. 하나의 구체적인 실시예로는 본 발명의 항원은 서열번호:2의 아미노산 1번 잔기 내지 496번 잔기를 포함한다. 하나의 구체적인 실시예로서 본 발명의 항원은 BgQ1(서열번호:2)의 전체 길이를 지닌다.

(항체)

하나의 측면에서 본 발명은 본 발명의 에피토프에 대한 항체를 제공한다. 따라서 바람직한 항체는 이 항원 결합성 단편 또는 HHV-6B 결합 분자로 헤비체인 및 라이트체인의 가변 도메인인 인간 유래의 것이다. 본 발명에 있어서 구체적으로 기재된 항체의 변이체 (예를 들면 하나 또는 수 개의 아미노산의 치환, 삽입, 부가 또는 결실을 포함하는 것을 열거할 수 있으나 이에 한정되지 않는다)에 있어서 나타내는 서열을 지니는 것이다. 정상 영역 도메인 또는 바람직하게는 적당한 인간 정상 영역 도메인 예를 들면 Kabat E. A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health에 기재된 것을 포함한다. 가변 영역 아미노산 서열을 Kabat 등의 방법에 의해 작성된 항체 아미노산 서열의 데이터베이스(“Sequence of Proteins of Immunological Interest” US Dept. Health and Human Services, 1983)에서는 상동성을 조사하고 이것으로부터 CDR 영역을 발견할 수 있다. CDR 영역의 서열은 본 발명의 원하는 생물학적 활성(예를 들면 결합활성 또는 중화활성)이 유지되는 범위 내에서 적어도 하나의 부가, 삽입, 치환 또는 결실에 의한 변이체도 본 발명에 포함되는 것이다. 또한 각 CDR 영역과 90% 내지 100%의 상동성을 지닌 서열도 열거할 수 있다.

인간에서 자연적으로 발견되는 모든 단백질에 대해 생성시킨 모노클로날 항체는 전형적으로 비-인간 시스템 예를 들면 마우스에서 생산할 수 있다. 이의 직접 결과로서 인간에 투여하는 경우 하이브리도마에 의해 생산되는 이종개체(xenogeneic) 항체는 이종개체 면역 글로블린의 정상 부분에 의해 우세하게 전달되는 바람직하지 않은 면역 응답을 야기시킬 수 있다. 이것은 장기간에 거쳐 투여하여야 하는 항체의 사용을 명백히 제한한다. 이를 위해 단일사슬, 단일도메인, 키메라, CDR 이식 또는 특히 인간에 투여할 때 실질적인 앨러지 응답을 나타내지 않도록 하는 인간 항체의 사용이 특히 바람직하다. 바람직하게는 본 발명의 모노클로날 항체는 서열번호:10으로 표시되는 서열을 포함하는 라이트체인 및 서열번호:12로 표시되는 서열을 포함하는 헤비체인을 포함한다. 바람직하게는 이것의 서열은 전체길이 서열이다.

또 다른 실시태양에서 본 발명의 항체 또는 항체 결합 단편은 서열번호:10으로 표시되는 서열을 포함하는 라이트체인 및 서열번호:12로 표시되는 서열을 포함하는 헤비체인 내의 1 또는 다수의 CDR 및/또는 1 또는 다수의 프레임워크 영역을 포함하는 것으로 이해된다. 이와 같은 프레임워크 및 CDR에 있어서는 Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th edition, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) and Clothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917을 참조할 수 있다.

주지한 바와 같이 하나의 아미노산 또는 다수의 아미노산의 결실, 부가, 삽입 또는 치환에 의한 경미한 변경에 의해 실질적으로 동일성을 지니는 오리지널 단백질에 대응하는 단백질을 생산할 수 있다.

인간 헤비체인의 정상 부분은 γ₁, γ₂, γ₃, γ₄, μ, α₁, α₂, δ 또는 ε 타입, 바람직하게는 γ 타입, 더욱 바람직하게는 γ₁ 타입이고 한편 인간 라이트체인의 정상 부분은 κ 또는 λ 타입(λ₁, λ₂ 및 λ₃ 서브타입 포함)을 들 수 있다. 바람직하게는 κ 타입이다. 모든 이러한 정상 부분의 아미노산 배열을 Kabat에 의해 제공된다.

본 발명의 항체는 해당 분야에 있어서 주지된 임의의 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 이와 같은 방법의 예로는 실시예에 기재된 바와 같으며 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 항원에 사용한 동물을 면역시키는 것에 의해 항체가 생성된다.

여기서 항원의 제조는 재조합 DNA 방법 또는 화학합성에 의해 제조된 항원의 일부 아미노산 서열 또는 펩타이드 등을 들 수 있다. 이와 같은 방법은 실시예에서 예시되어 있다. 수득된 펩타이드는 애쥬번트와 혼합시켜 항원으로서 사용한다. 애쥬번트로서는 Freund 완전 애쥬번트, Freund 불완전 애쥬번트 등을 들 수 있다. 이들을 어떻게 혼합하여도 좋다.

한편 모노클로날 항체는 포유동물의 비장 또는 임파절을 채취한 후 이로부터 수득된 항체 생산 세포를 골수종(마이엘로마) 세포와 융합시키는 것에 의해 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 수득할 수 있다. 세포 융합의 방법은 공지의 방법을 사용할 수 있으며 예를 들면 Koehler & Milstein (Nature, 256, 495-497 (1975))에 따라 제조할 수 있다. 목적 단백질을 인식하는 특이 항체를 제작하기 위해 상기 기재한 방법에 따라 목적 동물(예를 들면 마우스)를 면역시킨다. 충분히 혈중 항체가가 상승되고 있는 것을 확인하고 채혈하거나 비장세포를 분리한다. 모노클로날 항체 특히 C-말단 또는 링을 인식하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마는 이와 같이 분리된 비장 세포와 마이엘로마 세포를 융합시켜 제조할 수 있다.

비장세포는 상기의 면역시킨 동물의 것이며 바람직하게는 마우스 유래의 것이다. 마이엘로마 세포는 포유동물 유래의 것이고 바람직하게는 마우스 마이엘로마 세포이다. 세포의 융합에는 폴리에틸렌글리콜을 사용한다. 융합에 의해 얻어진 하이브리도마를 스크리닝 및 클로닝하는 것에 의해 바람직한 하이브리도마를 선별할 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하기 위해서는 얻어진 하이브리도마를 시험관 내 또는 생체 내에서 배양한다. 바람직하게는 생체 내 배양이다. 예를 들면 마우스 모노클로날 항체를 포함한 복수를 생산하기 위해 마우스의 복강 내에 상기 하이브리도마를 투여한다. 모노클로날 항체는 생산된 복수로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 용이하게 정제할 수 있다. 최종 면역 후 3~10일 후에 면역 동물로부터 비장세포를 채취하는 것이 바람직하나 이를 한정하는 것은 아니다.

얻어진 면역세포로부터 하이브리도마를 수득하는 것은 예를 들면 '분자 세포 생물학 기초 실험법'(Takekazu Horie 등. 1994) 등에 기재된 방법에 의해 계체 배양 가능한 세포를 사용한다. 예를 들면 센다이바이러스, 폴리에틸렌글리콜 존재 하에 형질세포종세포와 항체를 생산하는 면역세포를 융합시켜 하이브리도마를 얻는다. 여기서 사용되는 형질세포종세포는 동일한 항온동물 내에서 동종의 항온동물 유래의 형질세포종세포를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 마우스를 면역동물로 사용하여 얻어진 비장세포를 융합시키는 경우 마우스 마이엘로마 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 형질세포종세포는 공지된 것을 사용할 수 있다.

하이브리도마는 HAT 배지(하이포산틴, 아미노프테린, 티미딘 첨가 배지)에 의해 선별되고 콜로니가 확인된 단계에서 배양 상등액에 분비된 항체와 항원 결합을 측정한다(스크리닝한다). 이로부터 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 수득할 수 있다.

스크리닝 방법으로는 예를 들면 스포트 방법, 응집 반응법, 웨스턴 블로트법, ELISA 법 등의 일반적인 항체 검출 방법을 사용할 수 있으며 바람직하게는 예를 들면 실시예에 예시된 바와 같이 하이브리도마 배양 상등액에서 목적하는 펩타이드와의 반응성을 지표로서 ELISA법에 따라 검출할 수 있다. 이 스크리닝에 의해 목적 펩타이드 등의 항원과 특이적으로 반응하는 목적 항체 생산주를 스크리닝 할 수 있다.

스크리닝의 결과 얻어진 목적 항체 생산주의 클로닝은 통상, 한계 희석법, 소프트 한천법 등으로 실시할 수 있다. 클로닝 된 하이브리도마는 필요에 따라 상등액 배지 또는 무혈청 배지에서 대량 배양할 수 있다. 이 배양으로는 비교적 고순도의 원하는 항체를 배양 상등액으로 얻을 수 있다. 한편 하이브리도마와 적합성을 지닌 포유동물 예를 들면 마우스 등의 복강에 하이브리도마를 접종하고 원하는 항체를 마우스 복수로서 대량 회수할 수도 있다. 본 발명의 항체 생산 하이브리도마의 배양 상등액 및 마우스의 다수는 그 자체로 항체액으로 사용할 수도 있다. 한편 이것은 통상의 방법에 따라 황산암모니움 분획, 염석, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그라피, 어피니티 크로마토그라피 방법 등으로 정제시켜 정제된 항체를 수득할 수 있다.

폴리클로날 항체는 예를 들면 면역원으로 면역화시킨 포유동물로부터 채혈한 것에 의해 수득되는 것이다. 상기 방법에 있어서 면역원으로 면역화시킨 포유동물로서는 일반적으로 토끼, 염소, 양, 마우스, 래트 등을 들 수 있다.

면역방법은 일반적인 방법에 의해 예를 들면 면역원을 포유동물에 정맥 내, 피부 내, 피하, 복강 내 주사 등으로 투여하는 것에 의해 수행할 수 있다. 보다 구체적으로는 예를 들면 면역원을 생리식염수를 포함하는 인산완충액(PBS), 생리식염수 등을 적정 농도로 희석시키고 원하는 바에 따라 통상의 애쥬번트를 병용한다. 시험동물에 2~3주간 간격으로 수 회 투여한다. 마우스를 사용하는 경우 1회 투여량을 한 마리당 50~100 ㎍ 정도로 한다. 여기에 상기 애쥬번트와 항원을 동시에 투여할 때 비특이적으로 항원에 대한 면역반응을 증가시킨 물질을 말한다. 통상 사용하는 애쥬번트로서는 백일해 백신, Freund 애쥬번트 등을 예시할 수 있다. 최종 면역 후 3~10일 후에 포유동물의 채혈을 수행하고 항-혈청을 수득할 수 있다. 항-혈청은 있는 그대로 또는 정제시킨 폴리클로날 항체로서 사용한다.

폴리클로날 항체의 정제 방법으로는 비특이적 정제방법과 특이적 정제방법을 들 수 있다. 비특이적 정제법에는 염석법, 이온교환 크로마토그라피법 등에 의한 이뮤노글로블린 획분을 취득하는 것을 목적으로 한다. 특이적 정제법으로는 고정화 항원에 의한 아피니티 크로마토그라피법을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 항체를 제조할 때 사용하는 '면역원'으로는 본 명세서에서 사용되는 경우 생물에 있어서 면역응답을 생성하거나 유도하는 능력을 지닌 동물을 의미한다. 본 발명의 항체 제조에 사용되는 면역원은 활성화 헵텐(hapten)과 캐리어 단백질을 사용한다. Antibodies: A Laboratory Manual, (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press) 등의 기재되어 있는 활성 에스테르법에 의해 제조할 수도 있다. 또한 Antibodies: A Laboratory Manual, (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press) 등에 기재된 다른 방법 예를 들면 카르보디이미드법과 글루타르알데하이드법 또는 디아조법을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 항체를 제조하는 경우에 사용되는 '캐리어 단백질'은 항원성을 높이기 위해 알려진 각종의 단백질을 사용할 수 있다. 예를 들면 우혈청알부민(BSA), 보바인 타이로글로블린(BTG), 키홀 림페트 헤모사이아닌(KLH) 등의 고분자물질과의 합성 폴리펩타이드를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 항체를 제조하는 데 사용하는 '햅텐(hapten)'은 부분적 또는 불안전한 항원이다. 햅텐은 주로 저분자량의 물질로 단독으로는 항체의 생산을 자극할 능력이 없으나 화학적 방법 및 가교제에 의해 캐리어 단백질과 결합시킨 인공 항원으로서 면역하는 것이 햅텐에 대한 항체를 얻을 수 있게 한다.

본 발명의 항체를 사용한 면역 측정 방법을 실시할 수 있다. 이와 같은 면역 측정 방법에 사용하는 단일 특이적인 항체로서는 안정적으로 공급되는 모노클로날 항체가 요망되나 이에 한정하는 것은 아니다. 임의의 분자를 사용할 수 있다. 다음 모노클로날 항체에 관하여 예시한다. 항체(제1모노클로날 항체)를 고체상에 고정시키고 항원을 포함하는 재료를 동시에 인큐베이션하는 공정, 표지된 제2모노클로날 항체를 더욱 가하여 얻어진 혼합물을 인큐베이션하는 공정 및 혼합물 중의 생성되고 표지된 항원 항체 복합체를 검출하는 공정을 포함하는 샌드위치 면역학적 측정 방법을 예시한다.

한편 본 발명의 면역학적 측정법으로는 샘플과 고체화된 제1모노클로날 항체 및 표지된 제2모노클로날 항체를 동시에 인큐베이션하는 것도 바람직하다. 샌드위치 면역학적 측정 방법으로는 그 검출방법에 따라 샌드위치 방사능면역 측정법(RIA법), 샌드위치 효소면역측정법(EIA법), 샌드위치 형광면역측정법(FIA법), 샌드위치 발광면역측정법(CLIA법), 샌드위치 발광효소면역측정법(CLEIA법), 샌드위치법에 의한 면역크로마토그라피법 등의 전부가 샌드위치 면역측정법이 응용되고 있다. 정량을 위해서는 RIA법, EIA법이 바람직하다.

본 명세서에 있어서 '교차반응성'은 면역교차 반응성을 의미한다. 어느 항원으로 면역시킨 것에 의해 얻어진 항체가 이에 대한 항원(연관항원)과 결합반응을 나타낼 때 이 반응을 교차반응이라 한다. 목적하는 항원과 이 항체의 반응량을 기준으로 한 경우 연관 항원과 이 항체와의 반응량의 정도를 교차반응성으로 나타낼 수 있다. 본 명세서 내에서 대표적으로는 1%, 2%, 3% 또는 0.5%, 0.2%, 0.1% 등의 친화성의 상대치(%)로 표시할 수 있으며 교차반응성은 낮아야 한다. 수치가 낮을수록 교차반응성이 낮게되고 목적항원에 대한 특이성을 지니는 것을 나타낸다. 주로 목적항원과 연관항원의 구조가 상당히 유사한 경우에 발생하는 것이 대부분이다.

본 발명의 항 HHV-6B 항체, 그 항원 결합성 단편 또는 HHV-6B 결합 분자는 마이크로타이터 플레이트, 비드, 튜브, 멤브레인, 필터 페이퍼, 플라스틱 컵 등의 담체에 고형화시킬 수 있다. 특히 폴리에틸렌 비드가 바람직하게 사용된다. 측정하는 샘플은 인간의 혈장, 혈청, 혈액, 요 등과 HHV-6B를 포함하는 샘플로 이루어진다. 본 발명의 항체, 그 항원 결합성 단편 또는 HHV-6B 결합분자는 방사선 동위원소, 효소, 형광물질, 발광물질 또는 눈으로 측정 가능한 측정법 등으로는 금 콜로이드와 착색 라텍스에 의한 표지를 들 수 있다.

표지에 사용하는 방사선 동위원소로서는 ¹⁴C, ³H, ³²P, ¹²⁵I, ¹³¹I을 들 수 있고 특히 ¹²⁵I가 바람직하다. 이로부터 클로라민 T법, 퍼옥시다제법, Iodogen법, Vault Hunter법 등에 의해 모노클로날 항체에 결합시킨다. 예를 들면 β-갈락토시다제(βGAL), 알칼린 포스파타제(ALP), 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 등을 포함한다. 이것은 퍼요오드산 가교법(Nakane 법), Ishikawa 등의 (IGAKU-SHOIN Ltd.; Enzyme Immunosorbent Assay, 3rd edition, 75-127, (1987))에 기재된 방법 등에 의해서도 모노클로날 항체에 결합시킬 수 있다. 표지에 사용하는 형광물질로서는 플루오레세인, 플루오레스카민, 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 등을 들 수 있다. 표지에 사용한 발광물질로서는 루시페린, 루미놀 유도체 및 아크리디니움 에스테르 등을 들 수 있다. 간단한 측정법으로는 금 콜로이드와 착색 라텍스를 사용하는 것이 바람직하다.

바람직한 실시태양에서 샌드위치 RIA법이 수행될 수 있다. 샌드위치 RIA법은 구체적으로는 표준용액 또는 샘플에 제1모노클로날 항체를 고형화시킨 비드를 가하여 혼화시키고 4℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃에서 1~4시간, 바람직하게는 2시간 인큐베이션시킨다(제1반응). 세정 후 예를 들면 ¹²⁵I로 표지시킨 제2모노클로날 항체를 포함하는 용액을 가하여 4℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃에서 1~4시간, 바람직하게는 2시간 인큐베이션시켜 비드 상에 항체/항체 복합체를 형성시킨다(제2반응). 세정 후 비드에 결합된 항원항체복합체의 방사능 활성을 감마 카운터 등으로 검출하는 것에 의해 양을 측정한다.

다른 바람직한 실시태양으로는 샌드위치 EIA법을 들 수 있다. 샌드위치 EIA법은 구체적으로는 표준용액 또는 샘플에 제1모노클로날 항체를 고정화시킨 비드를 가하여 혼화시키고 4℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃에서 1~4시간, 바람직하게는 2시간 인큐베이션시킨다(제1반응). 세정 후 효소 표지 예를 들면 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 표지시킨 제2모노클로날 항체를 포함하는 용액을 가해 4℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃에서 1~4시간, 바람직하게는 2시간 인큐베이션시키고 비드 위에 항체-항체 등으로 된 면역복합체를 형성시킨다(제2반응). 비드 상에 효소 활성을 효소에 특이적인 물질 예를 들면 표지효소가 HRP라면 테트라메틸벤지딘(TMB)을 매개로 비색법에 의해 측정한다. 이와 같이 비드 위에 포획된 양을 측정한다. 비색 정량은 통상 분광광도계 등으로 행할 수 있다.

항원 결합능의 측정은 다음과 같이 측정할 수 있다. 항원 결합 측정을 위한 셀 ELISA 플레이트는 다음과 같이 제조한다. 적정의 세포를 세포배양용 96-웰 플레이트의 60웰에 1 × 10⁶ 개 세포수로 분주한다. 이것을 CO₂ 인큐베이터로 1일간 배양하고(10% 우태아혈청(GIBCO)을 포함한 RPMI1640 배지) 세포를 부착시킨다. 배양액을 이송시키고 300 ㎕ 의 PBS로 각각의 웰을 2회 세정한다. 4% 파라포름알데하이드를 포함한 PBS(이하 PFA/PBS라 칭함)를 각각의 웰에 100 ㎕ 씩 첨가하여 얼음 상에서 10분간 정치시키고 세포를 고정화시킨다. PFA/PBS를 이송시키고 300 ㎕ PBS로 각각의 웰을 2회 세정 후 250 ㎕ 의 DB로 블로킹한다. 항체 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션시키고 RB로 세정 후 DB로 1000배 희석시킨 알칼린 포스페이트 결합 제2항체 100 ㎕를 첨가한다. 실온에서 1시간 인큐베이션시키고 TB로 세척한 후 기질 용액을 가한다. 이어서 405/655 nm의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad)로 측정한다.

하나의 실시태양에서 본 발명의 항체는 중화항체이다. 중화항체는 항체의존성 세포독성을 지표로 측정하는 것이 가능하다. 항체의존성 세포독성은 다음과 같이 측정할 수 있다. 즉 클로미움 유리 시험에 의해 항체의존성 세포독성을 해석하는 것이 가능하다. 인간 말초 혈액구(human peripheral mononuclear cell (PBMC))는 건강한 사람의 말초 혈액으로부터 Ficoll-Paque PLUS(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여 첨부문헌에 따라 분리한다. 분리된 PBMC가 4 × 10⁶ 개가 되도록 10% FCS를 포함한 DMEM을 가한다.

적절한 수(예를 들면 1 × 10⁶개)의 세포를 포함하는 DMEM에 ⁵¹Cr(Perkin Elmer사 제조)를 포함하는 생리식염수를 가하고 37℃에서 1시간 반응시킨다. 그 후 DMEM으로 적절히 세정시키고 규정화된 양(예를 들면 5 × 10⁴/ml)으로 된 DMEM을 가한다. 이 세포에 본 발명의 항체 또는 대조항체(예를 들면 마우스 IgG2a; SIGMA-ALDRICH사 제조)를 가하고 37℃에서 1시간 반응시켜 적량, 예를 들면 100 ㎕/웰이 되도록 9웰 v-바텀 플레이트에 가한다. 그 후 적량 예를 들면 100 ㎕의 PBMC를 가하고 37℃에서 2시간 반응시킨다. 그 후 플레이트를 5분간 500 × g 실온에서 원심분리시키고 100 ㎕의 상등액을 γ선 측정기(예를 들면 ARC-7001, Aloka사 제조)로 측정한다. 항체 특이적인 세포독성(cytotoxicity)(%)은 다음 계산 식을 사용한다.

세포독성(%) = (실험치 - 자연 유리)/(최대 유리 - 자연 유리) × 100

해당 분야의 기술 상식으로 당업자는 예를 들면 CDR 그라프트법(예를 들면 유럽특허 제 239400호)에 의해 인간화 항체를 제작할 수 있다.

본 발명의 항체는 키메라 항체로서 제조하는 것이 가능하다. 이와 같은 키메라 항체의 발현 벡터는 H 사슬 V 영역을 코드화하는 DNA 단편이 클로닝된다면 이와 같은 마우스 V 영역을 코드화하는 DNA를 인간 항체 정상영역을 코드화하는 DNA와 연결하여 발현되는 것에 의한 키메라-항인간 항체를 얻을 수 있다. 키메라 항체를 제조하기 위한 기본적 방법은 클론화된 cDNA에 존재하는 리더(leader) 서열 및 V영역 서열을 포유류 세포의 발현 벡터 내에 이미 존재하는 인간 항체 C영역을 코드화하는 서열에 연결하는 것을 포함한다. 또는 클론화된 cDNA에 존재하는 마우스 리더 서열 및 V영역 서열을 인간 항체 C영역을 코드화하는 서열에 연결시킨 후 포유류 세포 발현 벡터에 연결하는 것을 포함한다. 인간 항체 C영역의 단편은 임의의 인간 항체 H사슬 C 영역 및 인간 항체 L 사슬 C 영역의 것일 수 있으며 예를 들면 인간 H사슬에 있어서는 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4 및 L 사슬의 것에 있어서는 Cλ 또는 Cκ를 각각 열거할 수 있다.

하나의 실시태양에서 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 하나의 실시태양에서는 본 명세서에 기재된 모노클로날 항체 MAb KH-1이다.

본 발명의 항체는 HHV-6B에 대한 반응성을 지니고 HHV-6A에 대한 교차 반응성을 지니지 않는다.

(조성물 및 의약)

하나의 측면에 있어서 본 발명은 본 발명의 항원을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에 있어서 포함되는 항원은 본 명세서 중 (에피토프), (항원)의 항목에 있어서 기재된 임의의 실시태양을 사용하는 것이 가능한 것으로 이해된다.

하나의 실시태양에서 이 조성물은 HHV-6B 바이러스의 중화항체를 생성하기 위한 조성물이다.

바람직한 실시태양에서 본 발명에 있어서 사용되는 항원은 HHV-6B gQ1이다. 이론에 구속받기를 원하는 것은 아니지만 이 전체 길이를 사용하는 것에 의해 이와 같은 중화활성이 현저하게 자극되는 것을 확인할 수 있었다.

하나의 실시태양에서는 본 발명의 조성물은 또한 HHV-6B gQ2를 포함한다. 이론에 구속받기를 원하는 것은 아니지만 gQ2를 가하는 것이 바람직하며 이는 HHV-6B gQ1을 인식하는 것은 HHV-6A gQ1 및 HHV-6B gQ2와 동시 발현하는 것으로 그 인식이 강하게되기 때문인 것이다. 즉 gQ1과 gQ2가 상호작용하는 것에 의해 형성된 gQ1의 입체 구조를 본 발명에 있어서 제조하는 중화항체가 인식하는 것으로 사료된다. gQ1과 gQ2가 결합하는 것에 의해 형성된 입체 구조는 HHV-6B 감염중화 타겟이 되고 따라서 이 결합을 저지하는 분자를 동정하는 것에 의해 치료제의 개발도 가능하다는 점에서 유용한 것이다.

하나의 바람직한 실시태양에서 본 발명의 조성물에 있어서 포함되는 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2는 복합체를 형성시킨 것이다. 이론에 구속받기를 원하는 것은 아니지만 gQ1과 gQ2 복합체 형성이 감염 중화 타겟에 있어서 중요하게 가능성을 높이는 것이 본 발명에 의해서 발견된 것이다. 이론에 구속받기를 원하는 것은 아니지만 HHV-6는 세포 내 경로에 의해 세포에 침입한다. 엔벨로프 단백질 gH/gL/gQ1/gQ2 (gH/gL/gO) 및 gB는 바이러스 접착 및 관통의 과정에 있어서 기능한다. HHV-6A는 인간 CD46을 세포 리셉터로 이용하며 HHV-6B는 이와 같은 것은 아니다.

하나의 실시태양에는 본 발명의 조성물에 있어서 포함하는 HHV-6B gQ1 및HHV-6B gQ2는 세포에 동시발현된다. 이론에 구속받기를 원하는 것은 아니지만 본 발명에서 제조하는 모노클로날 항체는 HHV-6B gQ1을 인식하는 것으로 HHV-6A gQ1 및 HHV-6B gQ2를 동시발현하는 것이 그 인식을 강하게 유지할 수 있기 때문에 복합체 형성에는 동시발현이 바람직한 것으로 판단된다. 본 발명의 조성물은 의약이다.

또 다른 측면에 있어서 본 발명은 본 발명의 항원을 포함하는 의약을 제공한다. 본 발명의 의약에 있어서 포함되는 항원은 본 명세서 중 (에피토프), (항원), (조성물 및 의약) 내의 조성물에 관한 항목에 있어서 기재된 임의의 실시 형태를 사용하는 것이 가능한 것으로 이해된다. 본 발명의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허영되는 염은 그 자체 단독으로 투여하는 것이 가능하지만 통상 각종의 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다. 또한 이와 같은 의약제제는 동물 및 인간에 사용하는 것이다.

(치료활성 및 예방활성의 증명)

본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물은 바람직하게는 인간의 사용 전에 인 비트로에서 그 후에 인 비보에서 원하는 치료 활성 또는 예방 활성에 관한 시험을 행한다. 예를 들면 화합물 또는 약학적 조성물의 치료 유용성 또는 예방 유용성을 증명하기 위해서 인 비트로 에세이로는 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대해 화합물의 효과는 당업자에 공지된 기술(세포 용해 에세이 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아님)을 이용하여 결정할 수 있다. 본 발명에 따른 특정 화합물의 투여가 효과를 나타내는지 여부를 결정하기 위해 사용되는 방법은 인 비트로 에세이로는 인 비트로 세포배양 에세이를 들 수 있으며 이 에세이는 환자 조직 샘플 배양물을 증식시켜 여기서 화합물의 효과를 관찰하는 것이다. 또한 조직 샘플에 대해 화합물의 효과를 관찰 할 수 있다.

본 발명은 피험체에 유효량의 백신 등의 성분 또는 조성물의 투여에 따른 처치, 저해 및 예방 방법을 제공한다. 바람직하게는 본 발명의 성분은 실질적으로 정제된 것을 사용한다(예를 들면 그 효과를 제한하거나 원하지 않는 부작용의 생성물질이 실질적으로 존재하지 않는 상태). 피험체는 바람직하게는 소, 돼지, 말, 치킨, 고양이, 개 등의 동물을 들 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니고 바람직하게는 포유동물이며 가장 바람직하게는 인간이다.

본 발명의 의약으로서 사용되는 경우 이와 같은 조성물은 약학적으로 수용 가능한 캐리어 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 의약에 포함되는 약학적으로 수용 가능한 캐리어는 해당 분야에 있어서 공지된 임의의 물질을 들 수 있다.

본 발명의 조성물, 의약, 백신 등의 투여 경로는 치료에 최고로 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 경구 또는 예를 들면 직장내, 구강내, 피하내, 근육내, 정맥내 등과 같은 비경구적으로 투여할 수 있다. 투여 형태로서는 캅셀제, 정제, 과립제, 산제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제 등을 들 수 있다. 경구 투여에 적절한 예로는 유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은 물, 슈크로즈, 솔비톨, 과당 등과 같은 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜과 같은 글리콜류, 세사미 오일, 올리브유, 대두유 등과 같은 유류, p-하이드록시벤조산 에스테르 등의 방부제, 딸기향, 페퍼민트향과 같은 향료 등을 사용하여 제조할 수 있다. 한편 캅셀제, 정제, 산제, 과립제 등은 유당, 포도당, 슈크로즈, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕해제, 스테아르산마그네슘, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 하이드록시프로필셀룰로오즈, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 사용하여 제조할 수 있다.

이와 같은 적절한 처방 재료 또는 약학적으로 수용 가능한 캐리어로서는 항산화제, 보존제, 착색제, 풍미제 및 희석제, 유화제, 현탁화제, 용매, 필러, 증량제, 완충제, 전달비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학적 애쥬번트 등을 열거할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 대표적인 본 발명의 의약은 분리된 다기능성 줄기세포 또는 그의 개변된 유도체를 하나 이상의 생리적으로 수용 가능한 캐리어 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물의 형태로 투여한다. 예를 들면 적절한 비히클은 주사용수, 생리용액 또는 인공척수액 등이고 이와 같은 비경구 전달을 위한 조성물에 일반적인 다른 물질을 보충 할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 수용 가능한 캐리어 부형제로서는 안정화제는 리시피언트에 대해 비독성이고 바람직하게는 사용하는 투여량 및 농도에 있어서 불활성인 것이다. 예를 들면 인산염, 구연산염 또는 다른 유기산; 아스콜빈산, 알파-토코페롤; 저분자량 폴리펩타이드; 단백질(예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노 글로블린); 친수성 폴리머(예를 들면 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 알기닌 또는 라이신); 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물(예를 들면 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린); 킬레이트화제(예를 들면 EDTA); 당알코올(예를 들면 만니톨 또는 솔비톨); 염형성 카운터이온(예를 들면 나트륨); 및/또는 비이온성 계면활성제(예를 들면 트윈, 플루로닉 또는 폴리에틸렌글리콜) 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

예시한 적절한 캐리어로서는 중성 완충화생리식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 생리식염수 등을 들 수 있다. 바람직하게는 이 생성물은 적절한 부형제(예를 들면 슈크로즈)를 사용하여 동결 건조제로서 처방한다. 다른 표준적인 캐리어는 캐리어, 희석제 및 부형제는 필요에 따라 포함할 수 있다. 다른 예시적인 조성물은 pH 7.0 내지 8.5의 Tris 완충액 또는 pH 4.0 내지 5.5의 초산 완충액을 포함하며 여기에 솔비톨 또는 그의 적절한 대체물을 포함할 수 있다.

비경구투여에 적당한 제제는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장인 활성화물을 포함하는 멸균 수용액 제제이다. 예를 들면 주사제의 경우 염 용액, 포도당 용액 또는 염과 포도당의 혼합용액 등을 담체로 사용하여 주사용 용액을 제조한다.

국수 제제는 활성화합물을 1종 또는 그 이상의 매질 예를 들면 광물류, 석유, 다가 알코올 또는 국소 의약 제제에 사용되는 다른 용매 중에 용해 또는 현탁시켜 제조한다. 장 내 투여를 위한 제제는 통상의 담체 예를 들면 카카오류, 수소화지방, 수소화지방카르본산 등을 사용하여 제조하고 좌제로서 제공된다.

본 발명에는 비경구제에 있어서 또 경구제에서 예시된 글리콜류, 유지방류, 향료, 방부제(항산화제 포함), 부형제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제, 가소제 등에서 선택된 1종 또는 그 이상의 보조 성분을 첨가할 수 있다.

본 발명의 의약, 백신 등은 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 선택적으로 본 발명의 의약품은 정맥 내 또는 피하 내에 투여할 수 있다. 전신투여되는 경우 본 발명에 있어서 사용되는 의약 등은 발열물질을 포함하지 않고 약학적으로 수용 가능한 수용액의 형태이다. 이와 같은 약학적으로 수용 가능한 조성물 제제는 pH, 등장성, 안정성 등을 고려하는 것에 의해 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 본 명세서에 있어서 투여 방법은 경구투여, 비경구투여(예를 들면 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하투여, 피내투여, 점막투여, 직장내 투여, 질내 투여, 환자에의 국소투여, 피부투여 등)인 것이다. 이와 같은 투여를 위해 처방으론 임의의 제제 형태로 제공될 수 있다. 이와 같은 제제형태로서는 액제, 주사제, 서방제 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약 등은 필요에 따라 생리학적으로 수용 가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제(일본 약국방 제16개정판, 그 추보 또는 최신판, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990 등 참조)와 원하는 정도의 순도를 지닌 당사슬 조성물을 혼합하는 것에 의해 동결건조시킨 케익 또는 수용액 형태로 제조 보존할 수 있다.

본 발명의 처치 방법에 있어서 사용되는 당사슬 조성물의 양은 사용 목적, 대상 질환(종류, 중증도 등), 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 세포의 형태 또는 종류 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명의 처치 방법을 피험체(또는 환자)에 대해 시행하는 빈도는 사용 목적, 대상 질환(종류, 중증도 등), 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력 및 치료 경로 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 빈도는 예를 들면 매일 내지 수개월에 1회, 1주일에 1회, 1개월에 1회 투여할 수 있다. 1주일 내지 1개월에 1회 투여는 경과를 관찰하여 시행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화합물 또는 그의 약제학 상의 허용가능한 염의 유효용량 및 투여횟수는 투여형태, 환자의 연령, 체중, 치료시 증상의 성질 또는 중증도 등에 의해 변할 수 있으나 통상 투여량은 1일 당 0.01 ~ 1000 ㎍/인, 바람직하게는 5 ~ 500 ㎍/인이다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 분할하여 투여하는 것이 바람직하다.

이 측면에 있어서 본 발명은 본 발명의 항원을 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명의 백신에 있어서 포함된 항원은 본 명세서 중 (에피토프), (항원), (조성물 및 의약) 내의 조성물 및 의약에 관한 항에 있어서 기재된 임의의 실시형태를 사용하는 것이 가능한 것으로 이해된다.

본 명세서에 있어서 백신의 면역학적 효과는 해당 분야에 있어서 공지의 임의의 방법을 이용하여 확인하는 것이 가능하다. 이와 같은 방법으로는 예를 들면 CTL 전구세포 빈도 분석, ELISPOT법, 테트라머법, 실시간-PCR법 등을 열거할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 설명으로 CTL 전구세포 빈도분석법은 말초 혈액 임파구 또는 항원 펩타이드 및 IL-2 존재 하에 배양시킨 임파구를 한계 희석시키고 IL-2와 피더(feeder)세포를 동시에 배양시키고 증식된 웰을 백신 또는 그의 후보 물질로 자극시킨 후, 인터페론-γ 생성 유무를 ELISA 등으로 측정한다. 여기서 양성 웰을 Poisson 분석에 따라 CTL 전구세포의 빈도를 산출하고 백신의 효력을 평가하는 것이다. 여기서 양성 세포 수가 항원 특이적 CTL 수이며 이 수가 많을수록 백신으로서 효력이 높은 것이다.

본 발명의 백신은 애쥬번트와 함께 제조하는 것이 바람직하다. 애쥬번트는 해당 분야에 있어서 공지된 것을 이용하는 것이 가능하고 알럼(alum) 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 백신은 HHV-6B에 기인한 질환(예를 들면 돌발성 발진 등)의 예방 또는 치료 또는 그 모두를 위해 사용할 수 있다.

(스크리닝)

하나의 측면에 있어서 본 발명의 HHV-6B 바이러스 저해제를 스크리닝 하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 A) HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2을 제공하는 단계; B) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2가 결합하는 조건 하에서 피험물질을 접촉하여 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2에 접촉시키는 단계; 및 C) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2의 결합을 관찰하는 단계에 있어서, 상기 결합이 저해되는 경우 상기 피험물질이 HHV-6B 바이러스 저해제인 것을 판정하는 단계를 포함하는 것이다.

본 발명의 실시예에 있어서 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2는 해당 분야에 있어서 임의의 방법으로 제공할 수 있다. 예를 들면 천연물로부터 분리된 것을 사용할 수도 있고 본 명세서에 개시된 공지의 서열을 이용한 재조합 방법에 의해 발현되는 것을 사용하는 것도 바람직하다. 또한 세포에서 발현시킨 것 그 자체를 사용하여도 좋다.

본 발명에 있어서 사용하는 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2가 결합하는 조건은 해당 분야에 있어서 공지의 임의의 조건을 사용해도 좋고 면역침강하는 임의의 조건이 전형적인 것이다. 예를 들면 실시예에 있어서 기재된 것을 예시할 수 있으며 실시예에 기재된 조건을 적정 변형하여 사용하여도 좋다.

본 발명에 있어서 실시되는 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2와의 결합을 관찰하는 것은 해당 분야에 있어서 공지된 임의의 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 이와 같은 관찰의 기술로서는 예를 들면 실시예에 있어서 기재된 것(예를 들면 웨스턴 블러팅 등)이 예시되어 있고 또는 실시예에 기재된 조건을 적정 변형하여 사용하여도 좋다.

하나의 실시형태에는 본 발명에 사용하고 있는 상기 HHV-6B gQ1 및 상기 HHV-6B gQ2는 세포에 동시 발현되는 형태로 사용하는 것이 가능하다.

하나의 실시형태로는 본 발명의 스크리닝 방법은 A) 단계에 있어서 더욱 gL 및 gH가 제공되는 것이다. 이론에 구속되는 것을 바라지는 않지만 입체 구조의 형성에 gL 및 gH가 존재하는 것이 천연 상태에 가깝고 천연 상태를 모방한 스크리닝인 것을 고려하고 있기 때문이며 본 발명에서는 이것에 한정하지는 않는다. gL 및 gH 없이도 스크리닝 자체는 실시할 수 있는 것으로 이해된다.

또 다른 측면에서는 본 발명은 HHV-6B 바이러스 중화 에피토프를 스크리닝 하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 A) 서열번호:10 및 서열번호:12에 있어서 항원 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 단계; B) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 후보물질인 다수의 펩타이드를 에피토프가 결합하는 조건 하에서 접촉시키는 단계; 및 C) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 상기 다수의 펩타이드에 있어서 동일 또는 유사한 서열을 결정하고 상기 동일 또는 유사한 서열을 중화 에피토프로서 선택하는 단계;를 포함하는 방법이다.

이 방법은 해당 분야에 있어서 공지의 임의의 기술을 사용하여 실시하는 것이 가능하다. 이와 같은 에피토프가 결합하는 조건 및 접촉되는 기술로서는 예를 들면 실시예에 있어서 기재된 것을 예시할 수 있으나 또는 실시예에 기재된 조건을 적정 변형시켜 사용하여도 좋다. 이와 같은 관찰의 기술로서는 예를 들면 실시예에 기재된 것(예를 들면 웨스턴 블러팅 등)을 예시할 수 있으나 또는 실시예에 기재된 조건을 사용하여도 좋다. 항체 또는 그 항원 결합 단편에 결합된 다수의 펩타이드에 있어서 동일 또는 유사성을 지닌 서열의 결정도 해당 분야에 있어서 공지의 임의의 기술(예를 들면 펩스칸)을 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명에서는 서열번호:10 및 서열번호:12에 있어서 항원결합영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 필요에 따라 프레임워크 서열 또는 항체의 전체 길이를 포함하여도 좋다.

(키트)

하나의 측면에 있어서 본 발명의 HHV-6B 바이러스 저해제를 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다. 이 키트는 A) HHV-6B gQ1; B) HHV-6B gQ1; 및 C) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2가 결합하는 조건을 제공하는 수단을 준비한 후, 상기 HHV-6B gQ1과 상기 HHV-6B gQ2가 결합하는 조건에서 피험물질을 상기 HHV-6B gQ1과 상기 HHV-6B gQ2와 접촉 시 결합력이 저해되는 경우 상기 피험물질이 HHV-6B 바이러스의 저해제인 것으로 판정하는 것이다. 본 발명의 키트로는 (스크리닝)의 항에 기재된 임의의 실시형태를 이용하는 것으로 이해된다.

하나의 실시형태에서는 본 발명의 키트에 있어서 본 발명으로 사용하는 상기 HHV-6B gQ1과 상기 HHV-6B gQ2는 세포에 동시발현된 형태를 제공하는 것이다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 키트는 gL 및 gH를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

별도의 측면에서 본 발명은 HHV-6B 바이러스 중화 에피토프를 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다. 이 키트는 A) 서열번호:10 및 서열번호:12에 있어서 항원결정영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원결합단편을 제공하는 수단; B) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 후보물질인 다수의 펩타이드를 에피토프가 결합하는 조건 하에서 접촉시키는 수단; 및 C) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 상기 다수의 펩타이드에 있어서 동일 또는 유사한 서열을 결정하고 상기 동일 또는 유사한 서열을 중화 에피토프로서 선택하는 수단;을 포함하는 키트이다. 본 발명의 키트에는 (스크리닝) 항에 기재된 임의의 실시형태를 이용하는 것으로 이해된다. 본 발명에는 서열번호:10 및 서열번호:12에 있어서 항원결정영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원결합단편은 필요에 따라 프레임워크 서열 또는 항원의 전체 길이를 포함하여도 좋다.

상술한 바와 같은 측면에서 실시형태에 있어서도 본 발명의 키트는 지시서를 포함하여도 좋다. 이 지시서는 본 발명의 스크리닝 방법 등을 실시자에 대해 기재한 것이다. 이 지시서는 본 발명의 스크리닝 하는 순서를 지시하는 문헌이 기재되어 있다. 이 지시서는 필요에 따라 본 발명이 실시되는 국가의 감독관청의 규정된 양식에 따라 작성되고 이 감독관청에 의해 승인을 받은 것인지를 명기한다. 지시서는 또한 첨부문서이고 통상 종이매체로 제공되지만 이에 한정하는 것은 아니다. 예를 들면, 병에 부착된 필름, 전자매체 예를 들면 인터넷에서 제공하는 홈페이지(웹사이트), 전자메일 등의 형태로 제공될 수 있다.

본 명세서에 있어서 사용되는 과학문헌, 특허, 특허출원 등의 참고문헌은 그 전체가 각각 구체적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 있어서 참고문헌으로 원용된다.

이상 본 발명을 용이하게 이해하기 위해 바람직한 실시 형태를 나타내는 설명이었다. 다음에는 실시예에 근거하여 본 발명을 설명하지만 자세한 설명 및 다음의 실시예는 예시적 목적으로만 제공되고 본 발명을 한정하는 목적으로 제공되지 않는다. 따라서 본 발명의 범위는 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시형태 또는 실시예로만 한정되는 것은 아니고 특허청구범위에 의해서만 한정되는 것이다.

실시예

이하 실시예에 사용되는 동물의 취급은 오사카 대학교에 있어서 규정된 기준을 준수한다.

(실시예 1) HHV-6B에 대한 모노클로날 항체의 제조

본 실시예에서는 모노클로날 항체 BgQ202(HHV-6B gQ1) 또는 KH-1(항-HHV-6B)을 제조한다. 이하 그 개요를 설명한다.

1. HHV-6B (HST주) 감염세포 상등액 중에 바이러스 입자의 정제.

2. UV 및 불활성화 바이러스 입자를 BALB/c 마우스에 면역.

3. 바이러스 입자 구성인자에 대해 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조.

4. 이들 중 HHV-6B에 대한 중화 능력을 지닌 항체를 다수 분리.

이하 그 순서 등을 나타낸다.

(재료 및 방법)

<마우스>

자성 BALB/c 마우스(근친교배계, 일본 SLC 주식회사)의 4주령을 사용한다.

<바이러스>

HHV-6B 바이러스는 단핵세포(CBMCs)를 사용한 HST주(K. Takahashi et al., J. Virol., 3161-3163, 1989)의 배양 상등액으로부터 정제하였다. 구체적으로는 감염세포로부터의 비리온을 포함하는 상등액을 수집하고 2500 × g, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 이 바이러스를 0.9% NaCl 존재 하에서 20% 폴리에틸렌글리콜(분자량 20kDa)을 사용하여 침강시켰다. 침전물을 재현탁하고 5~50% Histodenz (Sigma)의 층 구배(gradient)의 상층에 배치시키고 27,000 rpm으로 1시간 원심분리시켜(Hitachi P40ST-1689 rotor, Hitachi High-Technologies) HHV-6B 바이러스의 입자를 분리정제하였다(Virology, vol. 378, 269, cell and viruses 참조).

<불활성화>

상기 정제된 HHV-6B 바이러스를 UV 조사에 의해 불활성화시킨다. 구체적으로는 적절한 UV 광원을 사용하여 상기 정제된 HHV-6B 바이러스 입자를 UV광에 노광시키는 것에 의해 바이러스의 불활성화를 수행하였다. 바이러스 스톡(500 ㎕)를 35mm 조직배양 디쉬(IWAKI)에 배치하고 2,500 J/m²의 UV광을 조사시켰다.

<면역>

상기 불활성화 HHV-6B의 바이러스 입자를 적정량의 항원량으로 복강 내 주사에 의해 BALB/c 마우스에 투여시켜 면역시켰다.

<하이브리도마의 제조>

상기 불활성화 HHV-6B 바이러스 입자 구성인자에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 제작하였다. 하이브리도마는 통상의 방법에 따라 골수세포종과 항체생산세포를 융합시킨 것에 의해 제조하였다. 항체생산세포로서는 상기 면역된 BALB/c 마우스의 비장세포를 사용하였다. 골수세포 종으로는 동일한 종의 마우스의 것을 사용하였다.

보다 상세하게는 하이브리도마는 과잉면역 마우스로부터의 비장세포를 비-생산 골수종 세포주 Sp2/0-Ag14를 융합시키는 것에 의해 수립되었다. 하이포잔틴/아미노프테린, 티미딘을 포함하는 배지 중에서 선별 후 모노클로날 항체(mAb)를 분비하는 세포를 간접 면역형광법 에세이(IFA)에 의해 스크리닝하였다. HHV-6B(HST주)에 감염시킨 MT 세포 및 바큘로바이러스 ±REP-(Bac±REP)에 감염시킨 Sf9 세포에 대한 반응성 항체를 분비하는 클론을 확대시키고 한계희석법에 의해 클로닝하였다. 연이어 고도의 항체 역가를 지니는 복수를 pristane (Sigma)로 처치시킨 마우스에 복강내로 클로닝시킨 하이브리드 세포를 주입하는 것에 의해 축적시켰다(J of General Virology, vol. 83, P848, establishment of mAbs 참조).

절차를 구체적으로는 각각 매쉬화된 상기 골수종세포와 상기 항체생산세포를 적절한 비율로서 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 혼합시키고 원심분리시켜 배지를 제거한 후 세포융합 촉진물질로서 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 골수세포종과 항체생산세포를 융합시켰다. 그 후 원심분리시켰다. 여기서 상등액을 제거시켜 적정의 배지로 배양시켰다. 비장세포 농도는 적절한 세포수/ml이 되도록 조정한다.

연이어 항원(HHV-6B 바이러스)을 코팅시킨 플레이트의 각각의 웰에 상기 배지에서 배양된 하이브리도마의 상등액을 분주시켰다. 이 플레이트를 배양기로 사용하고 실내 배양시켰다. 적정 배지 양의 반을 흡인 제거시키고 배지를 가하였다. 이와 같은 조건을 적정하게 반복하였다. 항체 활성은 필요시 효소 항체법에 의해 측정하였다. 한편 모노클론성을 보존하기 위해 한계희석법에 의해 순차 클로닝을 수행하였다.

또한 상기에 있어서 배양된 하이브리도마의 상등액은 이온교환 크로마토그라피에 의해 본리 정제시켜 회수하였다. 이와 같은 하이브리도마의 상등액을 정제시켜 모노클로날 항체생산재료로서 사용하였다.

<항체>

상기와 같은 방법으로 얻어진 모노클로날 항체생산재료 내에서 HHV-6B에 대한 중화활성을 지닌 항체를 적절한 방법으로 분리하였다.

상기 중화능력 또는 중화활성은 공지의 방법에 의해 분석하였다. 예를 들면 항체의존성 세포독성을 지표로 측정하는 것이 가능하다. 항체의존성 세포독성은 다음과 같이 측정할 수 있다. 즉 크로미움(chromium) 유리 시험에 의해 항체의존성 세포독성을 해석하는 것이 가능하다. 인간 말초혈액 단핵구(PBMC)는 건강한 자의 말초혈액으로부터 Ficoll-paque PLUS(GE Healthcare사 제조)를 사용하여 첨부문서에 따라 분리하였다. 분리된 PBMC는 4 × 10⁶/ml이 되도록 10% FCS를 포함하는 DMEM을 가하고 관찰하는 것에 의해 분석한다.

(BgQ202A-1의 제조방법)

모노클로날 항체 BgQ202A-1은 HHV-6B(HST주) gQ1의 N-말단 영역을 재조합시킨 단백질로서 대장균에서 발현시켜 정제시킨 단백질을 BALB/c 마우스에 면역시키고 비장을 채취한 후 비장세포와 마이엘로마 세포인 SP2 세포를 폴리에틸렌글리콜에 의해 융합시켜 하이브리도마를 제조하고 그 후 스크리닝을 행하여 HHV-6B gQ1을 특이적으로 인식하는 것으로 확인된 항체로서 분리시켰다.

본 항체를 수득하기 위하여 HHV-6B gQ1의 N-말단 영역의 재조합된 단백질의 제조를 행하였다. 구체적인 방법으로는 BU100-bamF 및 BU100pstR 프라이머를 사용하여 HHV-6B HST주의 cDNA를 템플레이트로 하여 PCR을 수행하고 HHV-6B gQ1 N-말단 영역을 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 제한효소 BamHI 및 PstI으로 절단시키고 같은 방법으로 제한효소로 절단된 대장균 발현용 플라스미드 pQE30 (QIAGEN)에 클로닝시켰다. 본 플라스미드를 대장균 BL21주에 도입시키고 N-말단에 히스티딘을 부가시켜 재조합 단백질 BgQ1-N을 발현시켰다. 대장균 내에서 대량으로 발현된 BgQ1-N은 니켈 컬럼을 이용하여 정제시켰다.

(결과)

그 결과 모노클로날 항체 BgQ202 (HHV-6B gQ1) 또는 KH-1 (항-HHV-6B)을 제조하였다.

(KH-1의 특징부인 서열 결정)

중화항체인 KH-1을 더욱 특정시키기 위해 이 항체의 유전자 서열을 결정하였다. 아미노산 서열 결정은 하이브리도마로부터 얻어진 항체를 코드화하는 유전자 서열을 포함한 핵산 서열에 근거하여 결정하였다.

이하 그 아미노산 서열을 나타낸다.

ㆍ라이트체인(서열번호:10)

LIRLTIGQAVVSTQSTWGLMRIAVISXGPKFKDKMDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNMESEDAATYYCHQRSRYHTFGGGTRLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGS

(X는 임의의 아미노산이다)

ㆍ헤비체인(서열번호:12)

NTTHYRASSGINAEYMGINICPMSSPQSLKTLTITMGWTWIFILILSVTTGVHSEVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNWVKQSNGKRLEWIGNIDPYYGGASYNQKFKGKATLTVDKSSTTAYMQLQSLTSEDSAVYYCARGGYGRYFDVWGAGTAVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYF

이와 같은 상기 서열을 지닌 항체가 중화활성을 지니는 것을 나타낸다.

(실시예 2) HHV-6B에 대한 모노클로날 항체에 의해 인식된 바이러스 단백질의 결정

본 실시예는 HHV-6B에 대한 모노클로날 항체에 의해 인식된 바이러스 단백질을 결정하는 것이다.

(재료 및 방법)

HST로 감염시킨 MT4 세포는 감염 후(p.i.) 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후에 수집하였다. 이 세포를 1차 항체와 함께 냉각된 아세톤 내에서 고정화시키고 37℃에서 1시간 인큐베이션 시켰다. 항-REPmAb인 OHV-2는 초기단계에서 발현하는 핵단백질인 OHV-3를 인식하고 후기단계에서 발현하는 HHV-6B 글리코프로테인 H(gH)를 인식한다.

해당 분야에 있어서 통상 사용되는 PBS로 10분간 세정 후 마우스 IgG에 대한 플루오레세인 결합된 고트(goat) 항체를 가하여 이것에 포화 4’,6’-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 1:100 희석률로 가하였다. 이 세포를 20분간 인큐베이션시킨다. 상기와 같이 세정시킨 후 시그날을 공초점 현미경으로 검출하였다(J of General Virology, vol. 83, P848, Immunohistochemical analysis of HST-infected MT4 cells 참조).

HST-감염시킨 HMT4 세포에 있어서 목(mock) 및 HHV-6B 주를 16시간 대사표지(³⁵S 메티오닌)시키고 용해시켜 모노클로날 항체 BgQ202 (HHV-6B gQ1) 또는 KH-1 (항-HHV-6B)로 면역침강시켰다(IP). 모든 경우에 항체는 실시예 1에서 생산된 것을 사용하였다.

면역침강은 SDS-PAGE에 의해 해상화(4-12% Tris-글라이신 겔; Invitrogen)시켰다. 겔을 고정시키고 건조시킨 후 노출하는 것에 의해 행한다. 이 결과 항-HHV-6B 모노클로날 항체는 글리코프로테인 Q1을 인식하는 것을 나타낸다.

(결과)

결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 HHV-6B에 대한 모노클로날 항체에 의해 인식되는 바이러스 단백질을 나타낸 것이다. 도 1에 나타난 바와 같이 글리코프로테인 Q1을 인식하는 항-HHV-6B 비리온 모노클로날 항체는 KH-1으로 명명하였다.

(실시예 3) 항-gQ1 모노클로날 항체에 의해 HHV-6B로 감염시킨 세포에 있어서 gH/gL/gQ의 검출

본 실시예는 항-gQ1 모노클로날 항체에 의해 HHV-6B로 감염시킨 세포에 있어서 gH/gL/gQ의 검출하는 실험을 행한 것이다.

(재료 및 방법)

목(mock) 또는 HHV-6B에 감염시킨 세포용해물을 항-gQ1 모노클로날 항체인 KH-1으로 면역침강시키고 이어서 환원조건 하에서 SDS-PAGE에 놓이게 한다. SDS-PAGE 겔을 전기적으로 PVDF 막에 이송시키고 gQ1, gH 및 rgL에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 검출을 수행하였다.

구체적으로는 HHV-6에 감염시킨 세포 및 목(mock)감염시킨 세포를 방사선 면역침강 에세이(RIPA) 완충액(0.01 M Tris-HCl [pH 7.4], 0.15 M NaCl, 1% 소디움 데옥시콜레이트, 1% Nonidet P-40, 0.1% 소디움 도데실설페이트 [SDS], 1 mM EDTA, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드) 내에서 용해시켰다. 용해된 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기연동(PAGE)에 의해 분리시키고 면역블로팅을 위해 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막에 전기적으로 트랜스퍼시켰다(J of Virology, vol. 78, no. 15, P4610, Immunoblotting, and J of Virology, vol. 78, no. 9, P7972, Preparation of pulse-chase and metabolically labeled proteins and immunoprecipitation experiments 참조).

(결과)

결과를 도 2에 나타낸다. 도 2는 항-gQ1 모노클로날 항체에 의해 HHV-6B로 감염시킨 세포에 있어서 gH/gL/gQ의 검출을 나타낸다. 목(mock) 또는 HHV-6B에 감염된 세포용해물을 항-gQ1 모노클로날 항체인 KH-1으로 면역침강시키고 이어서 환원조건 하에 SDS-PAGE에 적용시켰다. 겔을 전기적으로 PVDF 막에 트랜스퍼시키고 gQ1, gH 및 rgL에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 검출을 행하였다. KH-1의 반응성의 결과 gQ1, gL 및 gH와 공침전하는 것에 의해 KH-1은 HHV-6B gQ1과 특이적으로 반응하는 것을 나타내었다.

본 실시예에는 항-gQ1 모노클로날 항체에 의해 HHV-6B에 감염시킨 세포에 있어서 gH/gL/gQ가 검출되고 이로부터 복합체를 형성하고 있는 것을 판명하였다.

(실시예 4) 항-gQ1 항체인 KH-1의 중화활성 확인

본 실시예는 항-gQ1 항체인 KH-1의 중화활성을 확인하는 실험을 행하였다.

(재료 및 방법)

중화 에세이를 위해 타이터(titer)화된 HHV-6B 주 HST 바이러스를 콘트롤 항체 또는 KH-1에 30분간 37℃에서 가하였다. 인큐베이션 후 얻어진 용액을 MT4 세포와 1시간 37℃에서 혼합시켰다. 바이러스 용액을 채취하여 세정시키고 세포를 12시간 신선한 배지 내에서 인큐베이션시켜 항-IE1 토끼 혈청을 사용하여 간접 면역형광에세이(IFA)에 의해 염색시켰다.

(결과)

도 3에 결과를 나타낸다. 도 3은 항-gQ1 항체인 KH-1이 중화활성을 지니는 것을 나타낸 결과이다.

(실시예 5) gQ1 일과성 발현 시스템에 있어서 항체에 의해 인식된 단백질의 발현

본 실시예는 gQ1 일과성 발현 시스템에 있어서 항체에 의해 인식된 단백질의 발현을 확인한 것이다.

(재료 및 방법)

293T 세포를 gQ1 및 gQ2를 발현하는 플라스미드와 함께 공동 트랜스펙션시켰다. 세포를 IFA에 관해서 트랜스펙션시킨 후 72시간 항-gQ1 항체를 사용하여 공동 염색시켰다.

(결과)

결과를 도 4에 나타낸다. 도 4는 gQ1 일과성 발현 시스템에 있어서 항체에 의해 인식된 단백질의 발현을 나타낸다. KH-1 항체에 의해 인식된 gQ1의 발현양은 gQ2의 첨가에 의해 증가되었다.

(실시예 6) 각종의 카르복시 말단검출 변이체를 사용한 HHV-6B gQ1 유전자의 모식적 다이아그램 및 모노클로날 항체인 KH-1에 대한 반응성

본 실시예는 각종의 카르복시 말단검출 변이체를 사용한 HHV-6B gQ1 유전자의 모식적 다이아그램 및 모노클로날 항체인 KH-1에 대한 반응성을 조사한 것이다.

(재료 및 방법)

293T 세포를 gQ1 또는 각종의 gQ1 검출 변이체를 발현하는 플라스미드 및 gQ2를 발현하는 플라스미드와 함께 공동 트랜스펙션시켰다. 구체적인 수법은 실시예 5의 것과 동일한 방법이었다. 세포를 IFA에 관해서 항-gQ1 항체를 사용한 트랜스펙션 후 72시간 공동 염색시켰다. 구체적인 수법은 실시예 5의 것과 동일한 방법이었다.

(결과)

도 5에 결과를 나타낸다. 도 5는 각종의 카르복실 말단 검출 변이체를 사용한 HHV-6B gQ1 유전자의 모식적인 다이아그램 및 모노클로날 항체인 KH-1에 대한 반응성을 나타낸다. 293T 세포를 gQ1 또는 각종의 gQ1 검출 변이체를 발현하는 플라스미드 및 gQ2를 발현하는 플라스미드와 공동 트랜스펙션시켰다. 세포를 IFA에 관해서 항-gQ1 항체를 사용하여 트랜스펙션시킨 후 72시간 공동 염색시켰다. 도 5에 나타난 바와 같이 1~496 잔기, 1~504 잔기, 1~516 잔기의 것은 KH-1에 대한 반응성을 나타낸다. 1~483 잔기, 1~466 잔기, 1~451 잔기의 것은 KH-1에 대한 반응성을 지니지 않았다. 따라서 KH-1이 인식하는 부위는 HHV-6B의 gQ1의 484~496 잔기 내에 존재하는 것이다.

도 5에 나타난 바와 같이 각종의 카르복실 말단 검출 변이체를 사용한 HHV-6B gQ1 유전자의 모식적 다이아그램 및 모노클로날 항체인 KH-1에 대한 반응성을 나타낸다.

(실시예 7) HHV-6A 및 HHV-6B의 gQ1의 중화부위 동정

본 실시예는 HHV-6A 및 HHV-6B의 gQ1의 중화부위를 동정한 것이다.

본 실시예에 있어서 발명자들은 실시예 6에서 확인한 정보에 근거하여 중화부위를 매핑하였다. 도 6A에 HHV-6A 및 HHV-6B의 gQ1 아미노산 배열 정렬을 나타낸다. 도 6A로부터 명확해지는 바와 같이 gQ1의 카르복실 말단 결실에 의해 HHV-6B gQ1 서열에 있어서 아미노산 잔기 484~496 부위가 모노클로날 KH-1에 의해 인식되는 것으로 판명되었다. 따라서 이 영역에 있어서 HHV-6B 특이적 아미노산 잔기에 관해서 검색하기 위해 본 발명자들은 HHV-6A 및 HHV-6B의 gQ1 아미노산 서열을 비교하였다. 서열 비교를 행한 것에 의해 아미노산 488번 잔기는 HHV-6B에는 특이적으로 Glu이었다. 한편 HHV-6A에 대해서는 대응하는 잔기는 Gln이었다.

한편 KH-1이 인식하는 HHV-6B gQ1 에피토프 부위의 동정을 위해 C-말단에 있어서 점돌연변이체의 KH-1 반응성 유무를 확인하였다. 293T 세포에서 HHV-6B gQ1 야생형 및 점돌연변이체를 발현시키기 위해 KH-1을 사용한 IFA에 의해 그 반응 유무를 확인하였다. 그 도면을 도 6B에 나타내었다.

도 6B에 나타난 바와 같이 HHV-6B gQ1 및 E488Q에는 반응성이 유지되었으나 C487W E488Q 및 E488Q G489V에서는 반응성이 소실하였다. 따라서 KH-1이 인식하는 gQ1의 에피토프 부위는 488 잔기의 아미노산을 포함하는 영역인 것으로 판명되었다.

(실시예 8) 백신

본 실시예는 본 발명의 중화항체를 사용한 백신을 생산한다. 이 백신은 면역학적 방어량의 항원을 포함하고 따라서 관용적인 기술에 의해 제조할 수 있다.

백신의 제제는 예를 들면 일반적으로 Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Power and Newman, Plenurn Press, 1995; New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978 등에 기재되어 있다. 각 백신의 제형 내의 단백질 양은 전형적인 백신에 있어서 의미있는 유해한 부작용 없이 면역 방어 응답을 유도하는 양으로 선정된다. 이 양은 그 특이적인 면역원을 사용하는 것에 의존하여 변화될 수 있다. 일반적으로 각 제형은 1~1000 ㎍의 단백질, 바람직하게는 2~100 ㎍, 더욱 바람직하게는 4~40 ㎍의 단백질을 포함하는 것이나 이에 한정하는 것은 아니다.

본 실시예는 실시예 1~7의 실험에 근거하여 결정된 에피토프 부위를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(예를 들면 서열번호:2의 1~496 잔기를 포함하는 것)를 해당 분야에 있어서 공지된 수법에 의해 keyhole limpet hemocyanin (KLH) 등의 단백질을 콘쥬게이팅하는 것에 의해 단백질 결합 백신을 제조할 수 있다.

따라서 이와 같은 백신은 예를 들면 알럼(alum) 또는 수산화알루미늄 등과 같은 적절한 애쥬번트와 합하여 백신 제재로서 제조하는 것이 가능하다.

특정 백신에 있어서 최적의 양은 항체 역가 및 피험체에 관한 그 기타 응답의 검토를 포함하는 표준시험에 의해 확인할 수 있다. 최초의 접종에 연이어 피험체에 약 4주간 후에 추가면역을 부여하는 것이 바람직하다. 이와 같은 백신의 항체 역가는 상기 백신 제재를 마우스 등에 접종한 시험에 의해 확인할 수 있다.

이상과 같이 본 발명의 바람직한 실시형태를 사용하여 본 발명을 예시할 수 있으며 본 발명은 특허청구범위에 의해서만 범위를 해석할 수 있는 것으로 이해된다. 본 명세서에 있어서 인용된 특허, 특허 출원 및 문헌은 그 내용 자체가 구체적으로 본 명세서에 기재된 것과 동일한 형태로 그 내용이 본 명세서에 대해 참고로서 원용될 수 있는 것으로 이해된다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명에 의해 HHV-6B의 유효한 백신 및 유효한 치료약 및 그 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 제약업에 있어서 이용 가능한 것으로 판단된다.

[서열 목록 프리 텍스트]

서열번호:1은 HHV-6B gQ1의 전체 길이 아미노산 서열을 코드화하는 핵산서열이다.

서열번호:2는 HHV-6B gQ1의 전체길이 아미노산 서열이다.

서열번호:3은 HHV-6B gQ2의 전체 길이 아미노산 서열을 코드화하는 핵산서열이다.

서열번호:4는 HHV-6B gQ2의 전체길이 아미노산 서열이다.

서열번호:5는 HHV-6B gH의 전체 길이 아미노산 서열을 코드화하는 핵산서열이다.

서열번호:6는 HHV-6B gH의 전체길이 아미노산 서열이다.

서열번호:7은 HHV-6B gL의 전체 길이 아미노산 서열을 코드화하는 핵산서열이다.

서열번호:8은 HHV-6B gL의 전체길이 아미노산 서열이다.

서열번호:9는 항체 KH-1의 라이트체인 핵산서열이다.

서열번호:10은 항체 KH-1의 라이트체인 아미노산 서열이다.

서열번호:11은 항체 KH-1의 헤비체인 핵산서열이다.

서열번호:12은 항체 KH-1의 헤비체인 아미노산 서열이다.

서열번호:13은 서열번호:2의 484~496 잔기에 대한 부분의 인간 헤르페스바이러스 6A형(HHV-6A)의 아미노산 서열이다(도 6, 도 10).

서열번호:14는 서열번호:2의 484~496 잔기에 대한 부분의 인간 헤르페스바이러스 6B형 E488Q 변이서열의 아미노산 서열이다(도 6).

서열번호:15는 서열번호:2의 484~496 잔기에 대한 부분의 인간 헤르페스바이러스 6B형 C487W E488Q 변이 아미노산 서열이다(도 6).

서열번호:16은 서열번호:2의 484~496 잔기에 대한 부분의 인간 헤르페스바이러스 6B형 E488Q G489V 변이 아미노산 서열이다(도 6).

<110> National Institute of Biomedical Innovation The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University <120> Production of neutralizing antibody against Human herpesvirus type 6 glycoprotein Q1 and analysis thereof <130> OBK010PCT <150> JP 2010-249219 <151> 2010-11-05 <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1617 <212> DNA <213> Human herpesvirus type 6B <400> 1 ttcctcccgc ggatacgcat tttcgcaaga ctaagacgga gaacggcgac cgcaacgcta 60 agcgctatga gaccgccgag atgttctgcg ccgatactcg tgtgcgcgat ttccatggcg 120 acagccctgt cgaatgctac ggtctaccga gatgcgggaa ccgtggaatc cacaccgccg 180 ccggacgacg aagacaacta taccgcaaaa tactatgacg acagcattta ttttaacatt 240 tacgacggta caaatcctac gcccagaaga cgaacgctac ccgaaatcat ctctaaattt 300 tctacctccg aaatgtcacg tctaggaggc cttaaagttt ttgtccccgt agattatacc 360 ccaactacta ccttagaaga tatagaagac ctcctgaact acgccatttg cgatgataac 420 agctgcggtt gtctcataga gacagaggca cgcatcatgt tcggagatat cataatctgc 480 gttcctctct cggccgaaag cagaggagtg agaaatttga aaaacagatt aatgcctatg 540 ggtctatcac agattctctc tagcggcctc ggccttcact tctctctgct atatggcgct 600 ttcgggagca actataatag tttggcctat atggagcgcc tgaaaccact aaccgcgatg 660 acggcgatag ctttttgtcc aatgactagt aaattggagc tacgccaaaa ctacagactg 720 gaaaaggctc gatgcgaact gatcgtcaat atcgaactct tgaagataca aaaccatggc 780 ggacagacta tcaaaacgtt aacctcgttt gcgatcgttc gaaaagacaa cgacgggcaa 840 gattgggaaa cctgcacgcg cttcgcgtcc gttagcatag aggacatatt gaagtctaaa 900 cctgccgcca atggcacatg ttgtcctccc cgagacgtgc accatgatcg tcctacgtta 960 caatcttcta actcatggac tcggactgag tatttcgaac cgtggcagga cgtcgttgac 1020 gcatacgtcc ctataaacga taatcattgt ccaaacgata gctacgtcgt atttcaaacc 1080 ctgcaaggtc acgaatggtg ttcacgtttg aataagaacg acacgaagaa ttatttatct 1140 tccgtactag cgtttaaaaa tgcactgtac gaaactgagg aactgatgga aaccatcgga 1200 atgcgacttg cctcacaaat attgtcactg gtcggacagc gaggaacatc tatacgcaac 1260 atagatccgg ccatcgtaag cgcattgtgg cactctttgc cagaaaaact gacaacgact 1320 aatattaaat acgatatagc cagtccgacc catatgagtc ccgcattatg caccatcttt 1380 gtacagaccg gaacttcaaa acaacgtttc agaaatgcgg gactactgat ggttaacaac 1440 atcttcactg tccaagcgag atatagtaaa caaaatatgt tcgaaaaaaa aatatatgga 1500 tatgaacacc tcggacaagc tttatgcgag ggtgggcacg tattttacaa cccgagagat 1560 gtatactttc agaacatcaa aatggcagct acagaaccta ctgtcgtgag aacctga 1617 <210> 2 <211> 516 <212> PRT <213> Human herpesvirus type 6B <400> 2 Met Arg Pro Pro Arg Cys Ser Ala Pro Ile Leu Val Cys Ala Ile Ser 1 5 10 15 Met Ala Thr Ala Leu Ser Asn Ala Thr Val Tyr Arg Asp Ala Gly Thr 20 25 30 Val Glu Ser Thr Pro Pro Pro Asp Asp Glu Asp Asn Tyr Thr Ala Lys 35 40 45 Tyr Tyr Asp Asp Ser Ile Tyr Phe Asn Ile Tyr Asp Gly Thr Asn Pro 50 55 60 Thr Pro Arg Arg Arg Thr Leu Pro Glu Ile Ile Ser Lys Phe Ser Thr 65 70 75 80 Ser Glu Met Ser Arg Leu Gly Gly Leu Lys Val Phe Val Pro Val Asp 85 90 95 Tyr Thr Pro Thr Thr Thr Leu Glu Asp Ile Glu Asp Leu Leu Asn Tyr 100 105 110 Ala Ile Cys Asp Asp Asn Ser Cys Gly Cys Leu Ile Glu Thr Glu Ala 115 120 125 Arg Ile Met Phe Gly Asp Ile Ile Ile Cys Val Pro Leu Ser Ala Glu 130 135 140 Ser Arg Gly Val Arg Asn Leu Lys Asn Arg Leu Met Pro Met Gly Leu 145 150 155 160 Ser Gln Ile Leu Ser Ser Gly Leu Gly Leu His Phe Ser Leu Leu Tyr 165 170 175 Gly Ala Phe Gly Ser Asn Tyr Asn Ser Leu Ala Tyr Met Glu Arg Leu 180 185 190 Lys Pro Leu Thr Ala Met Thr Ala Ile Ala Phe Cys Pro Met Thr Ser 195 200 205 Lys Leu Glu Leu Arg Gln Asn Tyr Arg Leu Glu Lys Ala Arg Cys Glu 210 215 220 Leu Ile Val Asn Ile Glu Leu Leu Lys Ile Gln Asn His Gly Gly Gln 225 230 235 240 Thr Ile Lys Thr Leu Thr Ser Phe Ala Ile Val Arg Lys Asp Asn Asp 245 250 255 Gly Gln Asp Trp Glu Thr Cys Thr Arg Phe Ala Ser Val Ser Ile Glu 260 265 270 Asp Ile Leu Lys Ser Lys Pro Ala Ala Asn Gly Thr Cys Cys Pro Pro 275 280 285 Arg Asp Val His His Asp Arg Pro Thr Leu Gln Ser Ser Asn Ser Trp 290 295 300 Thr Arg Thr Glu Tyr Phe Glu Pro Trp Gln Asp Val Val Asp Ala Tyr 305 310 315 320 Val Pro Ile Asn Asp Asn His Cys Pro Asn Asp Ser Tyr Val Val Phe 325 330 335 Gln Thr Leu Gln Gly His Glu Trp Cys Ser Arg Leu Asn Lys Asn Asp 340 345 350 Thr Lys Asn Tyr Leu Ser Ser Val Leu Ala Phe Lys Asn Ala Leu Tyr 355 360 365 Glu Thr Glu Glu Leu Met Glu Thr Ile Gly Met Arg Leu Ala Ser Gln 370 375 380 Ile Leu Ser Leu Val Gly Gln Arg Gly Thr Ser Ile Arg Asn Ile Asp 385 390 395 400 Pro Ala Ile Val Ser Ala Leu Trp His Ser Leu Pro Glu Lys Leu Thr 405 410 415 Thr Thr Asn Ile Lys Tyr Asp Ile Ala Ser Pro Thr His Met Ser Pro 420 425 430 Ala Leu Cys Thr Ile Phe Val Gln Thr Gly Thr Ser Lys Gln Arg Phe 435 440 445 Arg Asn Ala Gly Leu Leu Met Val Asn Asn Ile Phe Thr Val Gln Ala 450 455 460 Arg Tyr Ser Lys Gln Asn Met Phe Glu Lys Lys Ile Tyr Gly Tyr Glu 465 470 475 480 His Leu Gly Gln Ala Leu Cys Glu Gly Gly His Val Phe Tyr Asn Pro 485 490 495 Arg Asp Val Tyr Phe Gln Asn Ile Lys Met Ala Ala Thr Glu Pro Thr 500 505 510 Val Val Arg Thr 515 <210> 3 <211> 549 <212> DNA <213> Human herpesvirus type 6B <400> 3 atgcatttcg tggctgtgta tattttaaca catttccatg catatcctgg agtggctgcg 60 ctaccgtttt ttagcacgtt accgaagatt acttcgtgct gtgatcacta tgtcgttctt 120 aattcactga gttctgtatc ttcctcgact ccgacctgcc tagacggtga aattctgttt 180 caaaatgcag gccagaaatt ttgtcgacct ttcacggaca atagaacaat tgtatatact 240 atgcaagacc aagtccaaag accctggtcc gtaacatgga tggatttcaa tctagtcatt 300 agtgactacg ggagagctgt gatagaaaat ttaaccgaaa gtgctatgtc agcacacaaa 360 aacgggccaa gatatctgca gatggaaacg tttatatcgg atttattccg gtatgaatgt 420 catcgagata atcgttatgt tttagaaaaa aaactacaaa tgttttatcc gactactcat 480 atgaacgaat tactttttta tccctcagac cctacgttgc cctcacctta tggcaacgga 540 cattattaa 549 <210> 4 <211> 182 <212> PRT <213> Human herpesvirus type 6B <400> 4 Met His Phe Val Ala Val Tyr Ile Leu Thr His Phe His Ala Tyr Pro 1 5 10 15 Gly Val Ala Ala Leu Pro Phe Phe Ser Thr Leu Pro Lys Ile Thr Ser 20 25 30 Cys Cys Asp His Tyr Val Val Leu Asn Ser Leu Ser Ser Val Ser Ser 35 40 45 Ser Thr Pro Thr Cys Leu Asp Gly Glu Ile Leu Phe Gln Asn Ala Gly 50 55 60 Gln Lys Phe Cys Arg Pro Phe Thr Asp Asn Arg Thr Ile Val Tyr Thr 65 70 75 80 Met Gln Asp Gln Val Gln Arg Pro Trp Ser Val Thr Trp Met Asp Phe 85 90 95 Asn Leu Val Ile Ser Asp Tyr Gly Arg Ala Val Ile Glu Asn Leu Thr 100 105 110 Glu Ser Ala Met Ser Ala His Lys Asn Gly Pro Arg Tyr Leu Gln Met 115 120 125 Glu Thr Phe Ile Ser Asp Leu Phe Arg Tyr Glu Cys His Arg Asp Asn 130 135 140 Arg Tyr Val Leu Glu Lys Lys Leu Gln Met Phe Tyr Pro Thr Thr His 145 150 155 160 Met Asn Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Ser Asp Pro Thr Leu Pro Ser Pro 165 170 175 Tyr Gly Asn Gly His Tyr 180 <210> 5 <211> 2085 <212> DNA <213> Human herpesvirus type 6B <400> 5 atgctcttcc gactctgggt ctttgttctg ttgactccct gttacagttg gagaccgtgg 60 accatatcga acgagagcca ttgtaaaaat ggaaactctg aaaatccaat tgttcgcccg 120 ggctttataa cttttaactt ttatacaaaa aacgacactc ggatatatca agtccctaaa 180 tgcttactcg gatccgatat cacgtaccat ctgtttgatg ccatcaacac gacagaatcg 240 ttaaccaatt atgaaaaacg cgttacacgt ttctatgagc cgccaatgaa cgatatttta 300 agactttcta ccgtacctgc ggtcaagcaa tttaacctgg atcactctat ccaaccgcag 360 attgtctatt ccttaaacct gtacccttca cacggaattt attacatcag ggttgtggaa 420 gtccgacaga tgcaatacga caacgtttcc tgtaagctgc ctaattctct caacgaactg 480 atctttccag tccaagttag atgcgctaaa attacacgct atgcgggcga aaacatctat 540 acccatttct ttactccgga ctttatgata ctgtacatcc aaaatcccgc aggagatctg 600 actatgatgt atggaaatac caccgacata aactttaaag ccccttatag gaaaagttca 660 ttcatattca aacagacatt gacagacgat ctactattga tagtcgaaaa agacgtagtc 720 gatgaagaat accgtttcat atcagatgcg acattcgtag acgaaacgtt ggatgacgta 780 gatgaagtag aagctctact actcaaattt aataacctag gaatccaaac cctattaagg 840 ggagactgta aaaaacccga ctatgccggc ataccgcaga tgatgtttct ttacggtatc 900 gtacatttct catatagcac aaaaaacaca ggaccgatgc ccgtgttaag agtgttaaag 960 acacacgaaa atctcttgtc catcgactca tttgtcaacc gatgtgtgaa cgtctcggaa 1020 ggtacgatac aatacccaaa aatgaaggaa tttttaaaat acgagccctc ggactatagc 1080 tacatcacca aaaacaaatc cattcccgta tctacgctgc tcacgtactt agcgacagcg 1140 tacgaaacca atgtaacgat ttccaggtac aagtggtctg acattgccaa cactctacaa 1200 aagatctatg aaaaacacat gttttttacg aatctgacat tttccgatag ggaaactcta 1260 ttcatgctag ccgaaatagc gaatttcatc cctgccgatg aacgcatgca gaggcacatg 1320 caactactaa ttggaaacct gtgtaacccc gtagaaatag tttcatgggc ccacatgctt 1380 acagctgaca aggcaccgaa tctagaaaat atttattcgc cttgtgcctc tcccgtacgc 1440 agagatgtaa caaattcttt tgtaaaaaca gttctcacgt acgcttccct cgaccgttat 1500 cgatcagaca tgatggagat gctatccgta tacagaccgc cagatatggc gagagtagcg 1560 gccattcagt gtctctctcc aagtgagcca gcagcttctc tgcctctgcc gaatgtgaca 1620 tttgtaattt ctccctctta tgtgattaaa ggagtgagtt taacaattac aacgacaatc 1680 gtggctacga gtataataat cacagccata cctctcaatt ctacctgcgt ttcaacaaat 1740 tataaatatg caggacaaga tctgcttgtg ctacgaaaca tatcatctca aacatgcgag 1800 ttttgtcaga gcgtagtcat ggaatatgat gatatcgacg gtcccttaca atacatctac 1860 ataaaaaaca tagacgaact aaaaacactg accgatccca acaacaattt acttgttccc 1920 aacaccagga cgcactacct tttgttagcc aaaaacggct ctgtttttga gatgtctgaa 1980 gtcggaatcg atatagacca agtatctatc atattggtta tcatttatgt tctgatcgca 2040 ataattgctt tattcggctt atatagactc atcagattgt gttga 2085 <210> 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Met Met Tyr Gly Asn Thr Thr 195 200 205 Asp Ile Asn Phe Lys Ala Pro Tyr Arg Lys Ser Ser Phe Ile Phe Lys 210 215 220 Gln Thr Leu Thr Asp Asp Leu Leu Leu Ile Val Glu Lys Asp Val Val 225 230 235 240 Asp Glu Glu Tyr Arg Phe Ile Ser Asp Ala Thr Phe Val Asp Glu Thr 245 250 255 Leu Asp Asp Val Asp Glu Val Glu Ala Leu Leu Leu Lys Phe Asn Asn 260 265 270 Leu Gly Ile Gln Thr Leu Leu Arg Gly Asp Cys Lys Lys Pro Asp Tyr 275 280 285 Ala Gly Ile Pro Gln Met Met Phe Leu Tyr Gly Ile Val His Phe Ser 290 295 300 Tyr Ser Thr Lys Asn Thr Gly Pro Met Pro Val Leu Arg Val Leu Lys 305 310 315 320 Thr His Glu Asn Leu Leu Ser Ile Asp Ser Phe Val Asn Arg Cys Val 325 330 335 Asn Val Ser Glu Gly Thr Ile Gln Tyr Pro Lys Met Lys Glu Phe Leu 340 345 350 Lys Tyr Glu Pro Ser Asp Tyr Ser Tyr Ile Thr Lys Asn Lys Ser Ile 355 360 365 Pro Val Ser Thr Leu Leu Thr Tyr Leu Ala Thr Ala Tyr Glu Thr Asn 370 375 380 Val Thr Ile Ser Arg Tyr Lys Trp Ser Asp Ile Ala Asn Thr Leu Gln 385 390 395 400 Lys Ile Tyr Glu Lys His Met Phe Phe Thr Asn Leu Thr Phe Ser Asp 405 410 415 Arg Glu Thr Leu Phe Met Leu Ala Glu Ile Ala Asn Phe Ile Pro Ala 420 425 430 Asp Glu Arg Met Gln Arg His Met Gln Leu Leu Ile Gly Asn Leu Cys 435 440 445 Asn Pro Val Glu Ile Val Ser Trp Ala His Met Leu Thr Ala Asp Lys 450 455 460 Ala Pro Asn Leu Glu Asn Ile Tyr Ser Pro Cys Ala Ser Pro Val Arg 465 470 475 480 Arg Asp Val Thr Asn Ser Phe Val Lys Thr Val Leu Thr Tyr Ala Ser 485 490 495 Leu Asp Arg Tyr Arg Ser Asp Met Met Glu Met Leu Ser Val Tyr Arg 500 505 510 Pro Pro Asp Met Ala Arg Val Ala Ala Ile Gln Cys Leu Ser Pro Ser 515 520 525 Glu Pro Ala Ala Ser Leu Pro Leu Pro Asn Val Thr Phe Val Ile Ser 530 535 540 Pro Ser Tyr Val Ile Lys Gly Val Ser Leu Thr Ile Thr Thr Thr Ile 545 550 555 560 Val Ala Thr Ser Ile Ile Ile Thr Ala Ile Pro Leu Asn Ser Thr Cys 565 570 575 Val Ser Thr Asn Tyr Lys Tyr Ala Gly Gln Asp Leu Leu Val Leu Arg 580 585 590 Asn Ile Ser Ser Gln Thr Cys Glu Phe Cys Gln Ser Val Val Met Glu 595 600 605 Tyr Asp Asp Ile Asp Gly Pro Leu Gln Tyr Ile Tyr Ile Lys Asn Ile 610 615 620 Asp Glu Leu Lys Thr Leu Thr Asp Pro Asn Asn Asn Leu Leu Val Pro 625 630 635 640 Asn Thr Arg Thr His Tyr Leu Leu Leu Ala Lys Asn Gly Ser Val Phe 645 650 655 Glu Met Ser Glu Val Gly Ile Asp Ile Asp Gln Val Ser Ile Ile Leu 660 665 670 Val Ile Ile Tyr Val Leu Ile Ala Ile Ile Ala Leu Phe Gly Leu Tyr 675 680 685 Arg Leu Ile Arg Leu Cys 690 <210> 7 <211> 753 <212> DNA <213> Human herpesvirus type 6B <400> 7 atggaacttt tactatttgt aatgtcactc atattactaa ccttctcgaa agcgatgcct 60 cttttcgacc acaattcttt ctattttgaa aaacttgacg actgtatcgc agctgtaata 120 aattgcacga gatccgaagt acctctatta ctagaaccaa tctaccaagc tccggtatat 180 aatgaagacg ttatgtcaat actgctaaaa cccccaacaa aaaaaaagcc ttttagccgt 240 ataatggtaa ccaatgaatt cctcagcgac ttcttacttc tgcaggataa cccagagcaa 300 ctacgcacat tgtttgcgct gataggggac ccagaatctc gggacaattg gctaaacttt 360 ttcaatggct tccagacatg ttcgccttcc gtcggaataa caacctgcat cagcgataac 420 tgtagaaaat atttgcctga aagaattacg tacgtcaata acttttttgt tgataacatt 480 gcaggtctcg agtttaacat ttcagaaaac acagacagtt tttacagcaa cattggtttt 540 ttattatact tggagaatcc tgctacaggc atcacaaaaa ttatcaggtt cccttttaac 600 tctttgactc tctttgatac gattttgaat tgtttaaagt atttccactt gaaaaccgga 660 gtagaattcg acctgctaaa acagatggaa gcctacaatt ctaaactacc tttccgaagt 720 tcccgcccta cgattctgat tagaaacaca taa 753 <210> 8 <211> 250 <212> PRT <213> Human herpesvirus type 6B <400> 8 Met Glu Leu Leu Leu Phe Val Met Ser Leu Ile Leu Leu Thr Phe Ser 1 5 10 15 Lys Ala Met Pro Leu Phe Asp His Asn Ser Phe Tyr Phe Glu Lys Leu 20 25 30 Asp Asp Cys Ile Ala Ala Val Ile Asn Cys Thr Arg Ser Glu Val Pro 35 40 45 Leu Leu Leu Glu Pro Ile Tyr Gln Ala Pro Val Tyr Asn Glu Asp Val 50 55 60 Met Ser Ile Leu Leu Lys Pro Pro Thr Lys Lys Lys Pro Phe Ser Arg 65 70 75 80 Ile Met Val Thr Asn Glu Phe Leu Ser Asp Phe Leu Leu Leu Gln Asp 85 90 95 Asn Pro Glu Gln Leu Arg Thr Leu Phe Ala Leu Ile Gly Asp Pro Glu 100 105 110 Ser Arg Asp Asn Trp Leu Asn Phe Phe Asn Gly Phe Gln Thr Cys Ser 115 120 125 Pro Ser Val Gly Ile Thr Thr Cys Ile Ser Asp Asn Cys Arg Lys Tyr 130 135 140 Leu Pro Glu Arg Ile Thr Tyr Val Asn Asn Phe Phe Val Asp Asn Ile 145 150 155 160 Ala Gly Leu Glu Phe Asn Ile Ser Glu Asn Thr Asp Ser Phe Tyr Ser 165 170 175 Asn Ile Gly Phe Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Pro Ala Thr Gly Ile Thr 180 185 190 Lys Ile Ile Arg Phe Pro Phe Asn Ser Leu Thr Leu Phe Asp Thr Ile 195 200 205 Leu Asn Cys Leu Lys Tyr Phe His Leu Lys Thr Gly Val Glu Phe Asp 210 215 220 Leu Leu Lys Gln Met Glu Ala Tyr Asn Ser Lys Leu Pro Phe Arg Ser 225 230 235 240 Ser Arg Pro Thr Ile Leu Ile Arg Asn Thr 245 250 <210> 9 <211> 622 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(622) <223> Light chain of KH-1 antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(621) <220> <221> misc_feature <222> (79)..(81) <223> n is a, c, g or t <400> 9 cta ata cga ctc act ata ggg caa gca gtg gta tca acg cag agt aca 48 Leu Ile Arg Leu Thr Ile Gly Gln Ala Val Val Ser Thr Gln Ser Thr 1 5 10 15 tgg gga ctt atg aga ata gca gta att agc nnn gga cca aaa ttc aaa 96 Trp Gly Leu Met Arg Ile Ala Val Ile Ser Xaa Gly Pro Lys Phe Lys 20 25 30 gac aaa atg gat ttt cag gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt 144 Asp Lys Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser 35 40 45 gcc tca gtc ata ctg tcc aga gga caa att gtt ctc acc cag tct cca 192 Ala Ser Val Ile Leu Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 50 55 60 gca atc atg tct gca tct cca ggg gag aag gtc acc atg acc tgc agt 240 Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser 65 70 75 80 gcc agc tca agt ata agt tac atg cac tgg tac cag cag aag cca ggc 288 Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 85 90 95 acc tcc ccc aaa aga tgg ata tat gac aca tcc aaa ctg gct tct gga 336 Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly 100 105 110 gtc cct gct cgt ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc tct tat tct ctc 384 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 115 120 125 aca atc agc aac atg gag tct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cat 432 Thr Ile Ser Asn Met Glu Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 130 135 140 cag cgg agt cgt tac cac acg ttc gga ggg ggg acc agg ctg gaa ata 480 Gln Arg Ser Arg Tyr His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile 145 150 155 160 aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt 528 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser 165 170 175 gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac 576 Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn 180 185 190 ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt 621 Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser 195 200 205 g 622 <210> 10 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 10 Leu Ile Arg Leu Thr Ile Gly Gln Ala Val Val Ser Thr Gln Ser Thr 1 5 10 15 Trp Gly Leu Met Arg Ile Ala Val Ile Ser Xaa Gly Pro Lys Phe Lys 20 25 30 Asp Lys Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser 35 40 45 Ala Ser Val Ile Leu Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 50 55 60 Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser 65 70 75 80 Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 85 90 95 Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly 100 105 110 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 115 120 125 Thr Ile Ser Asn Met Glu Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 130 135 140 Gln Arg Ser Arg Tyr His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser 165 170 175 Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn 180 185 190 Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser 195 200 205 <210> 11 <211> 619 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(619) <223> Heavy chain of KH-1 antibody <220> <221> CDS <222> (3)..(617) <400> 11 ct aat acg act cac tat agg gca agc agt ggt atc aac gca gag 44 Asn Thr Thr His Tyr Arg Ala Ser Ser Gly Ile Asn Ala Glu 1 5 10 tac atg ggg atc aac ata tgt cca atg tcc tct cca cag tcc ctg aag 92 Tyr Met Gly Ile Asn Ile Cys Pro Met Ser Ser Pro Gln Ser Leu Lys 15 20 25 30 aca ctg act ata act atg gga tgg acc tgg atc ttt att tta atc ctg 140 Thr Leu Thr Ile Thr Met Gly Trp Thr Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu 35 40 45 tca gta act aca ggt gtc cac tct gag gtc cag ctg cag cag tct gga 188 Ser Val Thr Thr Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 50 55 60 cct gag ctg gag aag cct ggc gct tca gtg aag atc tcc tgc aag gct 236 Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala 65 70 75 tct ggt tac tca ttc act ggc tac aac atg aac tgg gtg aag cag agc 284 Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser 80 85 90 aat gga aag aga ctt gag tgg att gga aat att gat cct tac tat ggt 332 Asn Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly 95 100 105 110 ggt gct agc tac aac cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gta 380 Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val 115 120 125 gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg cag ctc cag agc ctg aca tct 428 Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Gln Ser Leu Thr Ser 130 135 140 gag gac tct gca gtc tat tac tgt gca aga ggg ggg tat ggt agg tac 476 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Arg Tyr 145 150 155 ttc gat gtc tgg ggc gca ggg acc gcg gtc acc gtc tcc tca gcc aaa 524 Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Lys 160 165 170 aca aca ccc cca tca gtc tat cca ctg gcc cct ggg tgt gga gat aca 572 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr 175 180 185 190 act ggt tcc tcc gtg act ctg gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cc 619 Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe 195 200 205 <210> 12 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 12 Asn Thr Thr His Tyr Arg Ala Ser Ser Gly Ile Asn Ala Glu Tyr Met 1 5 10 15 Gly Ile Asn Ile Cys Pro Met Ser Ser Pro Gln Ser Leu Lys Thr Leu 20 25 30 Thr Ile Thr Met Gly Trp Thr Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val 35 40 45 Thr Thr Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu 50 55 60 Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 65 70 75 80 Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly 85 90 95 Lys Arg Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Ala 100 105 110 Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys 115 120 125 Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Gln Ser Leu Thr Ser Glu Asp 130 135 140 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Arg Tyr Phe Asp 145 150 155 160 Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly 180 185 190 Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe 195 200 205 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Human herpesvirus type 6A <400> 13 Gln Ala Leu Cys Gln Gly Gly His Val Phe Tyr Asn Pro 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> HHV-6B E488Q mutant sequence <400> 14 Gln Ala Leu Cys Gln Gly Gly His Val Phe Tyr Asn Pro 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> HHV-6B C487W E488Q mutant sequence <400> 15 Gln Ala Leu Trp Gln Gly Gly His Val Phe Tyr Asn Pro 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> HHV-6B E488Q G489V mutant sequence <400> 16 Gln Ala Leu Cys Gln Val Gly His Val Phe Tyr Asn Pro 1 5 10

Claims (25)

1. 서열번호:2의 484번 잔기 내지 496번 잔기로 이루어진 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP) 또는 그의 변이서열로서, E를 포함하는 적어도 5개의 연속적 아미노산 서열을 포함하거나 E가 Q로 변환된 경우 487번 잔기의 C 및 489번 잔기의 G가 보존된 서열을 포함하는 HHV-6B에 특이적인 에피토프.
   
2. 제 1항에 있어서, 서열번호:2의 484번 잔지 내지 496번 잔기로 이루어진 아미노산 서열(QALCEGGHVFYNP)임을 특징으로 하는 에피토프.
   
3. 제 1항의 에피토프에 대한 항체 또는 항원 결합성 단편.
   
4. 제 3항에 있어서, 중화 활성을 지님을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합성 단편.
   
5. 제 3항에 있어서, 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합성 단편.
   
6. 서열번호:10으로 표시되는 서열로 이루어진 라이트 체인 및 서열번호:12로 표시되는 서열로 이루어진 헤비 체인을 포함하는 제 5항의 항체.
   
7. 제 1항의 에피토프를 포함하는 항원.
   
8. BgQ1의 전체길이 서열인 서열번호:2 내의 적어도 아미노산 1번 잔기 내지 496번 잔기로 이루어진 제 1항의 에피토프를 포함하는 항원.
   
9. BgQ1의 전체 길이로 이루어진 제 1항의 에피토프를 포함하는 항원.
   
10. 제 7항의 항원을 포함하는 조성물.
    
11. 제 7항의 항원을 포함하는 HHV-6B 바이러스 중화 항체를 생성하기 위한 조성물.
    
12. 제 11항에 있어서, 상기 항원은 HHV-6B gQ1임을 특징으로 하는 조성물.
    
13. 제 12항에 있어서, HHV-6B gQ2를 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물.
    
14. 제 13항에 있어서, 상기 HHV-6B gQ1 및 상기 HHV-6B gQ2는 복합체를 형성함을 특징으로 하는 조성물.
    
15. 제 13항에 있어서, 상기 HHV-6B gQ1 및 상기 HHV-6B gQ2는 세포에 동시 발현됨을 특징으로 하는 조성물.
    
16. 제 10항에 있어서, 의약임을 특징으로 하는 조성물.
    
17. 제 10항에 있어서, 백신임을 특징으로 하는 조성물.
    
18. HHV-6B 바이러스의 저해제를 스크리닝하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    A) HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2를 제공하는 단계;
    B) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2가 결합되는 조건에서 시험 물질과 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2를 접촉시키는 단계; 및
    C) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2의 결합을 관찰하는 단계에 있어서 상기 결합이 저해되는 경우 상기 시험물질이 HHV-6B 바이러스의 저해제인 것을 판정하는 단계;를 포함하는 방법.
    
19. 제 18항에 있어서, 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2는 세포에 동시 발현됨을 특징으로 하는 방법.
    
20. 제 18항에 있어서, A) 공정에 있어서, gL 및 gH를 더욱 제공함을 특징으로 하는 방법.
    
21. HHV-6B 바이러스의 저해제를 스크리닝하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는
    A) HHV-6B gQ1;
    B) HHV-6B gQ2; 및
    C) 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2와 결합하는 조건을 제공하는 수단을 준비하고, 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2가 결합하는 조건 하에서 시험물질을 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2에 접촉시킬 때 상기 결합이 저해되는 경우, 상기 시험물질이 HHV-6B 바이러스의 저해제인 것을 판정하는 키트.
    
22. 제 21항에 있어서, 상기 HHV-6B gQ1 및 HHV-6B gQ2는 세포에 동시 발현됨을 특징으로 하는 키트.
    
23. 제 21항에 있어서, gL 및 gH를 더욱 포함함을 특징으로 하는 키트.
    
24. HHV-6B 바이러스 중화 에피토프를 스크리닝하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
    A) 서열번호:10 및 서열번호:12에 있어서 항원 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 단계;
    B) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 후보물질인 다수의 펩타이드를 에피토프가 결합하는 조건 하에서 접촉시키는 단계; 및
    C) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 상기 다수의 펩타이드에 있어서 동일 또는 유사한 서열을 결정하고 상기 동일 또는 유사한 서열을 중화 에피토프로서 선택하는 단계;
    를 포함하는 방법.
    
25. HHV-6B 바이러스의 중화 에피토프를 스크리닝하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는
    A) 서열번호:10 및 서열번호:12에 있어서 항원 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 수단;
    B) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 후보물질인 다수의 펩타이드를 에피토프가 결합하는 조건 하에서 접촉시키는 수단; 및
    C) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합된 상기 다수의 펩타이드에 있어서 동일 또는 유사한 서열을 결정하고 상기 동일 또는 유사한 서열을 중화 에피토프로서 선택하는 수단;
    을 포함하는 키트.

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