KR20130088576A - Ａｆｐ에 특이적으로 결합하는 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 및 이를 이용한 간암 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AFP에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 포함하는 간암 진단용 키트, 및 상기 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 간암 환자의 시료에서 AFP를 검출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 두 가지 모노클로날 항체를 함께 사용함으로써, 기존의 간암 진단법보다 정확하고 간편하게 간암을 진단할 수 있다.

Description

ＡＦＰ에 특이적으로 결합하는 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 및 이를 이용한 간암 진단용 키트{Antibody specifically binding to AFP, hybridoma cell producing the same, and kit for diagnosing liver cancer using the same}

본 발명은 AFP에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 포함하는 간암 진단용 키트, 및 상기 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 간암 환자의 시료에서 AFP를 검출하는 방법에 관한 것이다.

현대의학의 눈부신 발전에도 불구하고 암 발생 및 사망은 지속적으로 증가하고 있어 이의 진단 및 치료에 소모되는 개인가계 및 국가적, 사회적인 커다란 손실이 발생하고 있다. 이를 위한 예방, 진단, 치료기술의 개발은 국제적으로 대두되고 있는 과제이다. 종합적인 암 관리를 통한 암 발생, 암 사망의 최소화로 암 부담의 획기적 감소를 위한 방법은 암의 조기검진이다. 암의 스크리닝(screening) 및 모니터링(monitoring)의 개념에서 다수의 사람을 빠르게 암을 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 간암 진단 스크리닝 및 모니터링을 위한 AFP(Alpha Feto Protein) 모노클로날 항체들의 개발이 요구되고 있다. 암 중에서 국내외적으로 사망률 국내 2위, 발병율 세계 1위이며, 재발율도 매우 높은 간암은 현재 국내 종합병원 등에선 미국 료슈에서 개발한 고가의 장비인 MODULAR ANALYTICS E170 장비를 이용하여 AFP(Alpha Feto Protein) 진단 검사를 하고 있다. 그러나 장비의 국산화뿐만 아니라 진단 시약의 국산화를 위하여 AFP(Alpha Feto Protein) 암표지자를 검출할 수 있는 매칭 가능한 모노클로날 항체들의 개발이 필요하다.

AFP(Alpha Feto Protein)는 4%의 탄수화물을 포함하는 분자량 70kD의 당단백질으로 간세포 암종(non-seminon)의 종양표지자이다. AFP(Alpha Feto Protein)는 구조상 알부민과 상동성이 높으며, 태생 간기 및 난황에서 생성되어 태령 13-14주에 최고치에 달하며 생후 감소하기 시작하여 12개월이 지나면 성인치(<10ug/L)까지 감소한다. AFP(Alpha Feto Protein)는 간염이나 간경변증 등의 양성질환에서도 상승되는데, 이들의 95%에서 AFP(Alpha Feto Protein)치는 200ug/L이하이다. 비임신 상태에서 AFP(Alpha Feto Protein)치가 1,000ug/L 이상이면 암이라고 할 수 있다. 아주 작고 절제 가능한 간세포암을 검출하기 위한 AFP의 cut-off 치는 10-20ug/L 이다. 인간에서 발생하는 암의 대부분은 여러 종류의 생성물을 분비하여, 이중 일부는 환자에서 징후 및 증상을 일으킨다. 이러한 생성물은 혈액이나 기타 체액에 출현하게 되는데 이를 종양표지자(암표지자)라고 일컫는다.

대부분의 종양표지자는 진단적 유용성보다는 추적검사로서의 유용성이 강조되고 있다. 그러나, 종양표지자의 검사의 목적을 조사한 연구에 의하면 54%에서 의심되는 종양을 선별하기 위해서 혹은 발견된 종양의 기원을 알아내기 위해 종양표지자 검사를 시행하며 32%에서만 기존 종양의 추적검사를 위해 시행한다고 한다. 국내 대다수의 건강검진센터에서도 종양표지자 검사를 종양에 대한 선별검사로서 널리 시행하고 있다.

대부분의 종양표지자와는 달리 AFP는 선별검사에 매우 유용하며, 한국을 비롯한 중국, 일본, 알라스카 및 아프리카 등의 간세포암 유병율이 높은 지역에서 간세포암의 고위험군을 선별하는데 이용되고 있다. 종양표지자가 감소하면 성공적인 치료를 의미하고 반대로 상승하면 재발이나 전이를 의미하므로 종양표지자는 종양의 예후 및 크기와 밀접한 관련이 있다.

이에 본 발명자들은 효과적인 모노클로날 항체의 동정방법을 개발하는 한편, 상기 방법을 이용하여 간암 개체를 진단할 수 있을 정도로 증가하는 모노클로날 항체를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 AFP(Alpha Feto Protein)를 특이적으로 결합하는 신규한 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 포함하는 간암 진단용 키트, 및 상기 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 간암 환자의 시료에서 AFP를 검출하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 기탁번호가 KCTC 12101BP 또는 KCTC 12102BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 AFP(Alpha Feto Protein)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC 12101BP 또는 KCTC 12102BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 AFP 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 간암 환자의 시료에서 AFP를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 AFP에 특이적으로 결합하는 항체를 간암 진단키트로 사용하는 경우, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액과 같은 비 침습적 생물학적 시료를 이용하는 것만으로도 높은 특이도와 민감도를 가지고 간암의 발병 여부를 진단할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 KCTC 12101BP 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체를 캡쳐로 KCTC 12102BP 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체를 탐지자로 이용하여 용이하게 높은 예측도로 간암을 진단할 수 있어, 간암 진단 키트 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 AFP 모노클로날 항체를 만드는 전체적인 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 기존에 판매되고 있는 AFP 항체, KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)와 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체에 의한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 마우스의 복수에서 정제한 AFP 모노클로날 항체의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 Direct ELISA에 의한 KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC) 또는 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체와 AFP 항원에 대한 상관관계를 나타낸 도이다.
도 5는 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 캡쳐(capture)로, KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 탐지자(detector)로 사용한 Sandwich ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 캡쳐로, KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 탐지자로 사용한 Sandwich ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 AFP 항원 농도에 따른 표준 곡선을 나타낸 도이다.

본 발명의 다른 목적은 기탁번호가 KCTC 12101BP 또는 KCTC 12102BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체를 제공하는 것이다.

모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합을 이용한 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 매우 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예컨대, 모노클로날 항체는 당해 기술 분야에서 공지된 기법 등의 하이브리도마 기법을 이용하여 제조할 수 있으며, 이는 예를 들면, Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(이들 문헌은 참조에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다. 본원에서 "모노클로날 항체"라는 용어는, 하이브리도마 기법을 통해 생산되는 항체만을 한정하는 것은 아니다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵 생물, 원핵 생물 또는 파지 클론 등의 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 지칭하며, 이의 생산 방법을 지칭하는 것은 아니다.

하이브리도마 기법을 이용한 특이 항체의 생산 및 스크리닝 방법은 당해 기술 분야에서 일상적이며 잘 공지되어 있다. 비제한적인 예로, 마우스를 목적 항원 또는 이러한 항원을 발현하는 세포로 면역화할 수 있다. 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 마우스 혈청에서 항원에 특이적인 항체가 검출되면, 마우스 비장을 회수하여 비장세포를 분리한다. 그 후, 비장세포를 주지의 기법으로 임의의 적합한 골수종 세포(예, P3U1, P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2/0-Ag14, P3X63-Ag8-653 등)와 융합한다. 하이브리도마를 선별하고, 제한 희석에 의해

클로닝한다. 그 후, 하이브리도마 클론에 대해 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 항원에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포인지를 평가한다. 일반적으로 항체를 높은 수준으로 포함하는 복수는, 양성의 하이브리도마 클론을 마우스 복강에 접종함으로써 만들 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 기탁된 하이브리도마 세포로부터 생성된 AFP에 특이적인 모노클로날 항체를 ELISA와 웨스턴 블랏을 통해서 확인하였다.

본 발명은 AFP(Alpha Feto Protein)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC 12101BP 또는 KCTC 12102BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.

본 발명의 용어 "하이브리도마 세포"란 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포를 의미한다. 하이브리도마 세포주는 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 특정 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포를 융합시킴으로써 제조되는데, 하이브리도마를 형성시킴으로써 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포에 통합시킬 수 있게 된다. 이러한 하이브리도마 세포는 일반적으로 시험관 내에서도 증식이 되는 암세포와 생체로부터 추출한 어느 특정의 분화 형질을 가진 대형 세포를 융합시켜 제조될 수 있다. 대표적인 하이브리도마는 림프구 하이브리도마로서, 골수종 세포와 B 세포를 융합시킨 하이브리도마 세포, T 세포와 그 종양세포인 하이브리도마 세포, 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T 세포와 그 종양세포인 하이브리도마 세포등이 있으며, 본 발명의 하이브리도마 세포주는 당업자의 선택에 따라 본 발명의 자가면역 항체를 효과적으로 생산하기 위한 최적의 조건으로 융합 및 배양될 수 있음은 자명하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 간암으로 확인된 마우스의 지라(spleen)에서 B 세포를 확보하고 이를 마우스 골수종 세포(Sp2/0 세포)와 융합하여 배양한 후, 간암세포 반응성 항체가 확인된 B 세포 하이브리도마만을 선택하여 h-AFP-mAb-2C5h-JYC, h-AFP-mAb-4B1h-JYC으로 명명하였으며, 이를 한국 생명공학 연구원 생물자원센터에 2011년 12월 12일자로 기탁하였고 각각 수탁번호 KCTC 12101BP와 KCTC 12102BP를 부여받았다.

본 발명의 또 다른 목적은 기탁번호가 KCTC 12101BP 또는 KCTC 12102BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체와 동일한 에피토프 특이성을 가지는 모노클로날 항체를 제공하는 것이다. 특이적으로 인식되고 항체에 의해 결합되는 항원의 부분은 "에피토프"로 지칭된다. 기탁번호가 KCTC 12101BP 또는 KCTC 12102BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체와 동일한 에피토프 특이성을 가진다면 유사한 항원 항체 반응을 일으키는 것으로 볼 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 AFP에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간암 발병 여부를 확인하는 것이다. 본 발명의 AFP를 간암 진단 마커로 사용하는 경우, 개체의 시료 내에 본 발명의 AFP의 발현 수준을 측정함으로써 개체에 간암이 발병했는지 여부를 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커", "진단하기 위한 마커" 또는 "진단 마커(diagnosis marker)"란 간암 세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 간암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 간암진단 마커는 정상 간을 가진 개체의 전혈, 혈액, 혈청 또는 혈장에 비하여, 간암을 나타내는 개체의 전혈, 혈액, 혈청 또는 혈장에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 항-AFP 항체이다.

본 발명에서 용어 "간암 (liver cancer)"이란 일반적으로 간세포에서 기원하는 암을 의미한다. 간암에는 처음부터 간에서 생기는 원발성 간암과 다른 조직에서 발생한 암이 간에 전이되어 발병하는 전이성 간암이 있다. 원인은 대부분 불분명하나, 간경변이 있는 경우가 많으며, 간경변이 있는 환자와 만성 활동성 B형 간염, 또는 B형 간염 보균자에서 간암이 잘 발생하는 것으로 밝혀지고 있다. 본 발명의 자가항체 마커를 사용하는 경우, 개체로 부터 간암의 발병여부에 대해 높은 수준의 민감도 및 특이도를 가지고 진단할 수 있다.

본 발명에서 자가면역 항체에 특이적으로 결합하는 항원 단백질은 개체의 전혈, 혈청 및 혈장, 림프액 및 세포간액에서 발현이 증가하는 마커인 AFP의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 항원-항체 분석 방법으로는 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay), 방사선면역분석(otA: badioimmunoassay), 방사 면역 확산법(badioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony)면역 확산법, 로케트(bocket)면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(mentein Chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 분석 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 간암 의심 개체에서의 항원-항체 복합체 형성량을 비교할 수 있으며, 이를 통해 실제 간암 환자에서의 간암 발병 여부에 대해 진단할 수 있게 된다.

본 발명의 항-AFP 항체에 특이적으로 결합하는 항원(또는 항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드)이란, 상기 항체 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 모두 포함하며, 특정 단백질 또는 폴리펩타이드에 제한되지 않는다. 바람직하게 상기 항원은 상기 항-AFP 항체에 의해 인식될 수 있으면 그의 단편 또는 그의 변형체등을 모두 포함할 수 있다. 이러한 항원은 최소 7개의 아미노산으로 이루어질 수 있

고, 바람직하게는 9개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 또한 상기 항원은 본 발명의 자가면역 항체 마커에 의해 인식될 수 있는 에피토프 서열일 수 있다. 상기 에피토프 서열은 본 발명의 항체에 의해 인식 가능한 서열이면, 서열의 크기나 종류에 제한되지 않는다.

간암 진단용 키트 중에서 KCTC 12101BP 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체와 KCTC 12102BP 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체를 함께 이용하면, 하나의 항체를 사용하는 경우보다 정확하게 암을 진단할 수 있다. 즉, KCTC 12101BP와 KCTC 12102BP 하이브리도마 세포에서 생성되는 모노클로날 항체를 이용하여, 두 가지 중 하나의 모노클로날 항체가 AFP와 항원-항체 반응을 일으켜 이를 붙잡게 되면 나머지 하나의 항체가 탐지자로 작용하여 두 가지 모노클로날 항체가 함께 항원 항체 반응을 일으켜 정확하게 암을 진단할 수 있게 한다.

상기 간암 진단용 키트는 KCTC 12101BP 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체를 캡쳐로 KCTC 12102BP 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체를 탐지자로 이용하는 간암 진단용 키트인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 Sandwich ELISA에 의하여 캡쳐(capture)로서는 4B1 모노클로날 항체, 탐지자(detector)로서는 2C5 모노클로날 항체를 사용하여 AFP 단백질과 반응시켰다.

본 발명의 또 다른 목적은 AFP에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 간암 환자의 시료에서 AFP를 검출하는 방법을 제공한다. 즉, (a) 간암이 의심되는 개체의 시료로부터 AFP의 발현 수준을 측정하는 단계, (b) 상기 AFP 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 AFP의 발현 수준과 비교하는 단계, 및 (c) 상기 (a)단계의 AFP의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 AFP 발현 수준보다 높게 발현되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.

상기 항체의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법 중 어느 하나인 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어, “시료”란 간암 마커인 AFP의 발현 수준이 차이나는 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 AFP를 검출하는 방법은 간암 의심 개체의 시료로부터 AFP의 발현 수준을 측정하는 한편, 이를 정상개체의 시료로부터의 AFP 발현 수준과 비교함으로써 수행될 수 있는데, 간암 의심 개체의 시료에서 정상 대조군에 비해 높은 수준의 AFP가 검출되는 경우, 해당 개체를 간암 환자로 결정할 수 있다.

본 발명의 검출 또는 진단 방법에서는 상기의 방법 중 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며, 필요에 따라 1차 검사와 확인 검사의 두 단계를 수행함으로써 간암을 진단할 수 있다. 이처럼 두 단계에 의해 본 발명의 자가면역 항체를 검출함으로써 간암을 진단하고자 하는 경우, 1차 검사로 혈청 스크리닝법(allogenic sera screening)을 사용할 수 있고, 양성반응과 위양성 반응을 구별하기 위한 확인 검사로 웨스턴 분석법(Western analysis)을 이용할 수 있다.

본 발명의 검출 또는 진단 방법은, 동일한 개체로부터 수득한 시료에 대해 상기의 어느 방법을 사용하는지와 무관하게 각 결과들의 일치도가 높기 때문에, 정확하게 AFP를 검출할 수 있고, 간암의 발병 여부를 진단할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 모노클로날 항체 형성

전체적인 모노클로날 항체 제조 방식은 도 1에 나타내었다.

(1) 면역화 단계(Immunization)

AFP 항원(30㎍/㎕) 150㎕를 같은 부피의 complete Freund's adjuvant(Sigma) 150㎕와 잘 섞어서 유상액(emulsion)을 만들어 생후 6주령 된 암컷 BALB/C mouse의 복강 내에 주입하였다. 1차 면역화 단계(immunization) 2주 후에 항원 150㎕과 동량의 incomplete Freund's adjuvant(Sigma) 150㎕를 잘 섞은 유상액을 만들어 복강 주사하였다. 2주 간격으로 3차까지 면역하였다. 마지막 면역 1주일 후 융합(fusion)하기 3일 전에 항원 10~30㎍/㎕를 꼬리 정맥에 주사하였다.

(2) 융합 단계(Fusion)

골수종 세포(SP2/0 세포)를 2.5~5×10⁴/㎖ 밀도로 준비하고 융합하기 24시간 전에 1/3으로 희석을 하여 준비하였다. 융합을 위해서 표 1의 시약을 사용하였다.

세포 융합에 사용되는 시약의 조성

SF-DMEM1	DMEM + 1X AA
SF-DMEM2	DMEM + 2X AA
RBC LB	Red blood Cell lysis Buffer(sigma)
HT 50X	HT(sigma) 1vial + SF-DMEM1 10ml
HAT 50X	HAT(sigma) 1vial _ SF-DMEM 10ml
HT media	HT 50X 1ml + FBS 10ml + SF-DMEM1 30ml
HAT media	HAT 50X 4ml + FBS 40ml +SF-DMEM1 105ml+ Blood 1~1.5ml + Thymus Cell suspension 50ml
PEG	PEG(sigma)

세포 융합을 위하여, 하기의 실험을 실시하였다.

면역된 쥐의 심장에서 채혈하였다. 혈액은 4℃에서 밤새 보관하고 원심 분리 후 시럽을 분리하여 적당히 나눠 -80℃에 보관하고 면역된 쥐의 비장을 적출하였다. SF-DMEM2으로 세척 후 비장 세포를 용출시켰다. 정치시켜 무거운 덩어리들을 가라앉히고 상층액을 취하고 이를 1500rpm, 5분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리된 비장 세포의 상층액을 제거하고 SF-DMEM2를 채웠다. 비장 세포와 SP2/0 세포는 원심 분리하여 세척하였다. SP2/0 세포의 상층액을 제거하고 SF-DMEM2를 채웠다. LB 1㎖에 RBC를 넣어 처리 후 SF-DMEM2를 채웠다. 비장 세포와 SP2/0 세포는 원심 분리하였다. 원심 분리된 비장 세포와 SP2/0 세포는 상층액을 제거하고 SF-DMEM2 10㎖을 채웠다. 비장 세포와 SP2/0 세포는 100배 희석하여 계수하여 농도를 결정하였다. 비장 세포와 SP2/0 세포는 10:1의 비율로 결정하였다. 결정된 농도의 비장 세포와 SP2/0 세포를 튜브에 함께 넣고 원심 분리하였다. 원심 분리된 세포의 상층액을 제거 후 알콜솜 위에 엎어 놓고 30초~1분 동안 말린 후 PEG를 천천히 넣었다. 1분 동안 그대로 반응시키고 SF-DMEM2를 넣고 원심 분리하였다. 원심 분리 후 상층액을 제거하고 HT 배지를 50㎖를 채웠다. 그 후 뚜껑을 열어 37℃, 5% CO²배양기에서 3시간 배양하였다. 쥐 3마리를 마취 후 헤파린 처리된 주사기로 심장 채혈과 흉선조직 적출을 하였다. SF-DMEM2로 세척 후 흉선 세포를 용출시켰다. 배양이 끝난 세포는 500rpm, 10분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리된 융합세포(fusion cell)의 상층액은 제거하고 HAT 배지를 이용하여 천천히 섞어주었다. 96웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO²배양기에서 배양하였다.

융합 후 8~9일에 배지를 바꾸고 96웰에서부터 24웰까지 잘 자랄 때까지

cDMEM2에서 배양하였다. 배지를 바꾼 후 5~7일에 색이 변한 웰의 상층액을 거두고 cDMEM2로 채운 후 ELISA를 수행하였다. ELISA로 확인 후 웰을 선택하여 24웰로 옮겨 배양하였으며 다시 ELISA를 수행하였다.

ELISA는 항원를 코팅 후에 Blocking 용액을 처리하고 1차 항체와 2차 항체를 시간을 두고 차례로 처리 후에 450nm 파장에서 확인하였다.

(3) 모노클로날 항체 선택 및 복수(ascites) 생산

모노클로날 항체를 선택하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

24웰의 세포 농도를 확인한 후, 96웰 플레이트에 0.5cell/well이 될 수 있도록 15㎖의 배양액에 세포를 희석하였다. 희석된 세포를 웰 당 150㎕씩 분주하고 현미경으로 검경해서 1개의 세포가 들어있는 웰을 체크하였다. 세포가 어느 정도 자란 웰의 상층액을 거둬 ELISA 확인 후 24웰로 옮겨 배양하였다. 24웰에서 잘 자란 웰의 상층액을 떠서 ELSIA, Western Blot을 실시하여 확인하였다. 복수(ascites)를 만들 세포를 선택하고 나머지는 얼려서 보관하였다. 확인된 세포는 25T/C 플라스크에 옮겨서 배양하였다.

복수 생산 후 항체의 정제를 위하여 하기의 실험을 수행하였다. Balb/C 마우스 7~8주령 암컷을 여러 마리 준비하였다. 2마리의 마우스 복강에 pristane 500㎕를 주입하였다. 7~10일 이후에 75T/C 배양 플라스크에 가득 키운 세포를 수거하여 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 PBS를 500㎕씩 나눠 마우스 복강에 주사하였다. 5~7일 후 마우스의 복부가 부푼 것을 확인 후 주사기를 이용하여 복수를 뽑아내었다. 복수는 4℃에서 하루 두었다가 다음날 원심분리해서 상층액만 분리하여 -20℃에 보관하였다. 20% 에탄올에 저장되어 있는 Protein G Fast Flow Bed 적당량을 컬럼(Column) 에 채운 뒤 20% 에탄올을 흘려 내린 후 5 Bed Volum의 Binding Buffer로 세척하였다. 복수를 PBS 로 적당량 희석시킨 후 Protein G Column에 로딩하였다. 3 Bed Volum 의 Binding Buffer 로 결합 한 후 3 Bed Volum 의 Elution Buffer 로 0.5 ml 분획으로 희석하였다.. 각 분획을 35ul 의 Neutrazing Buffer로 중화시켰다. 70% 에탄올로 냉장온도에서 하룻밤 정치시킨 후 다시 20% 에탄올에 처리하여 다음 번 사용시까지 냉장 보관하였다.

모노클로날 항체 정제에 사용되는 시약 조성

Buffer	Composition
Binding Buffer	20mM sodium phosphate, pH 7.0
Elution Buffer	0.1M glycine buffer, pH 3.0-2.5
Neutralizing Buffer	1M Tris-HCl, pH 9.0
Storaging Solution	20% ethanol

2. 실험 결과

(1)모노클로날 항체의 항원 항체 반응 확인

하이브리도마 세포주를 만드는 과정에서 AFP에 대한 모노클로날 항체로 성능이 좋은 2 가지의 세포주를 분리하였다. 분리한 세포주는 기탁번호가 KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC) 또는 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)인 하이브리도마 세포주에 해당한다. 해당 세포주에서 생성된 모노클로날 항체를 이용하여 실제 상업적으로 사용되는 항체와 비교하는 실험을 진행하였다. 상업적으로 사용하는 항체(Mouse monoclonal (AFP-01) to alpha 1 Fetpprotein , Abcam co.)와 KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC) 또는 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)인 하이브리도마 세포주에서 나온 항체를 AFP 항원과 환자 샘플에 처리하여 결과를 얻었으며, 이는 도 2에 제시된 바와 같다.

상업적으로 판매되고 있는 항체(Mouse monoclonal (AFP-01) to alpha 1 Fetpprotein , Abcam co.)의 경우에는 간암 환자 샘플에서 AFP 항원과 항원-항체 반응을 하지 못하고 있지만, KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC) 또는 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)인 하이브리도마 세포주에서 생산된 모노클로날 항체는 AFP 항원과 간암 환자 샘플에서 항원-항체 반응을 일으키는 것을 명확하게 확인할 수 있다.

복수에서 생성된 모노클로날 항체도 AFP 항원과 항원-항체 반응을 일으키는 것을 도 3에서 확인할 수 있다. 도 3에서 첫 번째 라인인 C는 대조군로 상업적으로 판매되는 항체이며, 1 내지 4는 KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC) 세포를 주입한 마우스의 복수에서 취한 모노클로날 항체이며, 5 내지 8은 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC) 세포를 주입한 마우스의 복수에서 취한 모노클로날 항체에 해당한다.

(2) Direct ELISA에 의한 KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)또는 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체와 AFP 항원에 대한 상관관계

Direct ELISA를 이용하여 AFP 항원과 모노클로날 항체의 상관 관계를 확인하였다. 항원을 0에서 100ng/100ul로 코팅한 후, 복수에서 나온 모노클로날 항체를 처리하여 ELISA를 수행하였다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, AFP 항원에 대하여 100ng까지 농도 의존적으로 OD 값이 올라가는 상관 관계를 볼 수 있다.

(3) KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)와 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 이용한 Sandwich ELISA

KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)와 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 이용한 Sandwich ELISA를 수행하였다. 두 가지 종류의 모노클로날 항체 중 하나를 항원에 대한 탐지자로 사용하고 나머지 하나를 캡쳐로 사용하여 sandwich ELISA를 실시하였다. 　

Sandwich ELISA 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 캡쳐로, KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 탐지자로 사용하였다. 그 결과 농도 의존적으로 OD 값이 올라가는 것을 볼 수 있었으며, KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 캡쳐로, KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 탐지자로 사용한 도 6의 결과보다 친화력이 더 큰 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이 KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 캡쳐로, KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 탐지자로 사용한 결과 친화성 측면에서 도 5의 결과보다 떨어지는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 상기 두 가지 모노클로날 항체를 이용하여 Sandwich ELISA를 실행함으로써, 기존의 간암 검사 방법보다 더 정확하게 간암 여부를 확인할 수 있으며, 현재 보편적인 간암 검사 방법인 MODULAR ANALYTICS E170 장비를 이용하여 AFP(Alpha Feto Protein)를 진단하는 방법보다 저렴한 가격과 간편한 방법으로 간암을 정확히 진단할 수 있음을 확인하였다.

(4) 환자 샘플에 대한 Sandwich ELISA

도 5에 제시된 바와 같이, 캡쳐로 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를, 탐지자로 KCTC 12101BP(h-AFP-mAb-2C5h-JYC)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 사용하는 것이 AFP 항원에 대하여 가장 높은 친화성을 보였다. 따라서, 실제 환자 샘플에 대해서도 동일한 결과를 보이는지 여부를 확인하기 위하여 환자 샘플에 대하여 Sandwich ELISA를 실시하여 AFP 정량 실험을 수행하였다. 혈액 샘플은 경북대학교 병원 진단검사의학과에서 제공된 환자 및 정상인의 혈액 샘플에 해당한다. 캡쳐로 KCTC 12102BP(h-AFP-mAb-4B1h-JYC)에 의해 생성된모노클로날 항체를 100ng/100ul로 4℃에서 밤새 코팅한 후에 블락킹 버퍼(1% BSA/DPBS) 100ul로 블락킹하였다.환자 crude serum을 25ul와 탐지자 모노클로날 항체인 2C5h-HRP 1:1000, 100ul를 넣고 상온에서 2시간 동안 처리하였다. 기질 용액100ul 넣고 20분 처리 후 정지 용액 50ul 넣고 발색을 정지시켰다. 그 후 450nm 파장에서 OD 값을 측정하였다.

실험결과는 도 7 및 표 3에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 항원 농도에 따른 표준 곡선은 y = 0.019x + 0.1355가 도출되었다. 이를 이용하여 실제 환자 샘플에서 AFP의 농도를 상대적으로 측정하여 구할 수 있다. 그 결과는 표 3과 같다.

표 3은 정상인과 간암 환자의 샘플을 채취하여 AFP의 양을 OD 값을 통하여 확인한 결과이다. 총 25 개의 실험군과 대조군을 구하여 실험을 하였으며 실험 결과 민감도 44%, 특이도 80%를 나타내었다. 이 결과를 통해서 상기 2가지의 모노클로날 항체를 함께 사용함으로써 간암에 대한 특이도와 민감도가 높은 간암 진단용 키트를 만들 수 있으며, 모노클로날 항체들 자체로도 높은 친화성을 가지는 바이오마커로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC12101BP 20111212 한국생명공학연구원 KCTC12102BP 20111212

Claims (9)

1. 기탁번호가 KCTC 12101BP 또는 KCTC 12102BP인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 AFP에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
2. 제 1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체와 동일한 에피토프 특이성을 가지는 모노클로날 항체.
3. AFP(Alpha Feto Protein)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC 12101BP 또는 KCTC 12102BP인 하이브리도마 세포주.
4. 제 1항 또는 제 2항의 AFP에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단용 키트.
5. 제 4항에 있어서, 상기 키트는 KCTC 12101BP 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체를 캡쳐로 KCTC 12102BP 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체를 탐지자로 이용하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.
6. AFP에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합 반응을 통해 간암 환자의 시료에서 AFP를 검출하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 방법은
   (a) 간암이 의심되는 개체의 시료로부터 AFP의 발현 수준을 측정하는 단계;
   (b) 상기 AFP의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 AFP의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
   (c) 상기 (a)단계의 AFP의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 AFP 발현 수준 보다 높게 발현되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 AFP의 발현 수준의 측정 방법은 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 6항에 있어서, 상기 시료는 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.

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