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KR20130049196A - 항-mhc 항체 항-바이러스성 사이토카인 융합 단백질 - Google Patents

항-mhc 항체 항-바이러스성 사이토카인 융합 단백질 Download PDF

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KR20130049196A
KR20130049196A KR1020137002652A KR20137002652A KR20130049196A KR 20130049196 A KR20130049196 A KR 20130049196A KR 1020137002652 A KR1020137002652 A KR 1020137002652A KR 20137002652 A KR20137002652 A KR 20137002652A KR 20130049196 A KR20130049196 A KR 20130049196A
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South Korea
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amino acid
seq
antibody
acid sequence
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KR1020137002652A
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스테판 예네바인
에르하드 코페츠키
스테판 리스
게오르그 티펜탈러
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Publication date
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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체, 및 항-바이러스성 사이토카인을 포함하는 융합 단백질 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-MHC 항체 항-바이러스성 사이토카인 융합 단백질{ANTI-MHC ANTIBODY ANTI-VIRAL CYTOKINE FUSION PROTEIN}
본 발명은 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC)에 결합하는 항체 및 항-바이러스성 사이토카인을 포함하는 융합 단백질 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 상기 융합 단백질은 B형 간염 바이러스 감염과 같은 바이러스 감염의 치료에 사용될 수 있다.
HBV는 I형 및 II형 인터페론의 항바이러스 효과에 민감하지만, 만성 HBV 감염시 상기 카이토카인의 효과는 감소되는데, 그 이유는 만성 HBV가 억제된 항-바이러스성 선천성 및 후천성 면역반응과 관련되기 때문이다. 이러한 면역 결핍을 피하고 만성 HBV 감염에 대한 현행 인터페론 치료법의 효능을 증가시키기 위해, HBV-특이성 CD8 T 세포의 효과적인 특이성을 간 억제에 내성인 구성으로 사이토카인의 항바이러스 효과와 결합시키는 새로운 도구를 제조하였다.
인터페론, 특히 인터페론 2α는 항-바이러스 및 항-증식 활성을 갖는 약학적으로 활성인 단백질이다. 예를 들면, 인터페론은 모발상 세포 백혈병 및 카포시(Kaposi) 육종을 치료하기 위해 사용되며, 간염에 대해 활성이다. 안정성 및 용해도를 개선하고 면역원성을 감소시키기 위해, 인터페론과 같은 약학적 활성 단백질을 중합체 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 접합시킬 수 있다(EP 0 809 996 호 참조).
노이(Noy, R.) 등은 T-세포 수용체-유사 항체가 임상적 암 면역학 및 면역치료를 위한 새로운 시약인 것으로 보고하였다(문헌 [Expert Review of Anticancer Therapy 5, 523-536 (2005)]).
WO 2009/136874 호에는 HBV 에피토프 반응성 외인성 T-세포 수용체(TCR) 및 그의 용도가 기재되어 있다.
사스트리(Sastry, K.S.) 등은 HBV 감염된 간세포를 표적화하는 T-세포 수용체-유사 항체를 보고하였다(문헌 [J. Hepatol. 52, S5-S6 (2010)]). WO 03/068201 호에는 T-세포 수용체-유사 특이성 및 보다 높은 친화도를 갖는 항체, 및 암, 바이러스 감염 및 자가면역 질환의 검출 및 치료에서 그의 용도가 보고되어 있다. 가용성 TCR-유사 분자 및 그의 용도가 WO 2005/077980 호에 보고되어 있다. WO 2009/136874 호에는 HBV 에피토프 반응성 외인성 T-세포 수용체(TCR) 및 그의 용도가 보고되어 있다.
본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 HBV-감염된 표적 세포에 네이키드(naked) 또는 PEG화된 인터페론보다 높은 효능을 갖는 인터페론-α를 전달할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 인터페론의 잠재적으로 감소된 다형질발현성 효과하에 HBV-감염 환자에게 치료를 제공하기 위한 새로운 목표가 되고 있는 치료적 전달 기반이다.
본 발명은 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 태양에서, 상기 사이토카인은 항-바이러스성 사이토카인이다.
한 태양에서, B형 간염 바이러스 단백질은 B형 간염 바이러스 외피(envelope)(env) 단백질 또는 B형 간염 바이러스 코어 단백질이다.
한 태양에서, B형 간염 바이러스 단백질은 B형 간염 바이러스 외피(표면) 단백질이고 펩티드 단편은 그의 아미노산 잔기 172 내지 180에 상응하거나, B형 간염 바이러스 단백질은 B형 간염 바이러스 외피(표면) 단백질이고 펩티드 단편은 그의 아미노산 잔기 183 내지 191에 상응하거나, B형 간염 바이러스 단백질은 B형 간염 바이러스 코어 단백질이고 펩티드 단편은 그의 아미노산 잔기 18 내지 27에 상응한다. 한 태양에서, 펩티드 단편은 서열번호 1의 아미노산 잔기 172 내지 180의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 1의 아미노산 잔기 182 내지 190의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 2의 아미노산 잔기 18 내지 27의 아미노산 서열을 갖는다. 한 태양에서, 펩티드 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖거나, 펩티드 단편은 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는다.
한 태양에서, 상기 항체는 B형 간염 바이러스로 감염된 대상의 간세포에 특이적으로 결합한다.
한 태양에서, 항-바이러스성 사이토카인은 인터페론이다. 한 태양에서, 항-바이러스성 사이토카인은 천연 항-바이러스성 사이토카인의 변이체이다. 한 태양에서, 상기 변이체는 천연 사이토카인, 또는 공통(consensus) 아미노산 서열을 갖는 항-바이러스성 사이토카인의 절두된(truncated) 변이체이다. 다른 태양에서, 항-바이러스성 사이토카인은 I형 인터페론 또는 II형 인터페론 또는 III형 인터페론으로부터 선택된다. 한 태양에서, 인터페론은 인간 인터페론 α-2a이다. 또한, 한 태양에서, 항-바이러스성 사이토카인은 인간 인터페론 α-2a의 절두된 변이체이다. 한 태양에서, 인터페론은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 3의 폴리펩티드의 필적하는 생물 활성을 갖는 그의 단편이다.
한 태양에서, 융합 단백질은 CD8 함유 T-세포와 동일한 특이성을 갖는다.
한 태양에서, 항체는 혈청 B형 간염 바이러스 항원에 의해 저해되지 않는다.
한 태양에서, 항체는 단클론성 항체이다.
한 태양에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다.
한 태양에서, 항체는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체와 결합하는 항체 단편이다.
한 태양에서, 사이토카인은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, 사이토카인은 항체 중쇄의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체, 및 항-바이러스성 사이토카인은 링커 펩티드에 의해 융합된다. 한 태양에서, 링커 펩티드는 서열번호 22 내지 서열번호 27로부터 선택된다. 한 태양에서, 링커 펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는다.
한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, (c) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열 또는 그의 인간화 변이체; 또는 (b) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열 또는 그의 인간화 변이체; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 서열번호 7의 VH 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 서열번호 11의 VL 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체 중쇄는 서열번호 12의 아미노산 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 갖는다.
한 태양에서, 항체 중쇄는 서열번호 13의 아미노산 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 갖는다.
한 태양에서, 항체 경쇄는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 갖는다.
한 태양에서, 항체 경쇄는 서열번호 15의 아미노산 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 갖는다.
한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, (c) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 (a) 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열 또는 그의 인간화 변이체; 또는 (b) 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열 또는 그의 인간화 변이체; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 서열번호 35의 VH 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 서열번호 39의 VL 서열, 또는 그의 인간화 변이체를 포함한다.
한 태양에서, 항체는 전장(full length) 인간 IgG1 항체이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 항체 중쇄를 암호화하는 단리된 핵산도 또한 제공된다. 본원에 기재된 바와 같은 항체 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산도 또한 제공된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
융합 단백질이 생성되도록 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 생성하는 방법이 또한 제공된다. 한 태양에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 본원에 기재된 바와 같은 세포를 제공하고, (b) 제공된 세포를 배양하고, (c) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수함으로써 융합 단백질을 생성하는 단계.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
본 발명은 또한 약제로 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 B형 간염 바이러스 감염을 치료하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 B형 간염 바이러스로 감염된 간세포에 항-바이러스성 사이토카인을 전달하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 용도를 제공한다. 한 태양에서, 상기 약제는 B형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 것이다. 다른 태양에서, B형 간염 바이러스 감염은 만성 감염이다. 또한, 한 태양에서, 상기 약제는 항-바이러스성 사이토카인을 B형 간염 바이러스 감염 간세포에 전달하기 위한 것이다.
본 발명은 개인에게 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 효과량을 투여하는 것을 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 개인을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항-바이러스성 사이토카인을 B형 간염 바이러스 감염 간세포에 전달하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 효과량을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인에서 B형 간염 바이러스 감염된 간세포에 항-바이러스성 사이토카인을 전달하는 방법을 제공한다.
도 1은 (a) 인터페론 α-2a에 대해서 및 (b) 항체(인간 Fc-영역)-인테페론 α-2a 융합 단백질에 대해 측정된 SPR 결합 곡선을 나타낸 것이다(실시예 3).
도 2는 중쇄 발현 플라스미드 9924의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다(실시예 1).
도 3은 경쇄 발현 플라스미드 9922의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다(실시예 1).
도 4는 상이한 인터페론 α-2a 변이체들을 사용하여 수득된 표준 RLU를 나타낸다.
도 5는 HBV-감염 세포에 대한 상이한 항체들의 결합 특이성을 나타낸 것이다; 두 패널 모두에서 시험된 항체는 다음과 같다: i) B형 간염 바이러스 단백질의 서열번호 30의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체, ii) B형 간염 바이러스 단백질의 서열번호 31의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체, iii) 2개의 상이한 항-MAGE 항체, iv) 2개의 상이한 항-HBV 항체, v) 항-hCMV 항체, vi) 2개의 상이한 항-EBV 항체, 및 vii) 2개의 상이한 항-인플루엔자 바이러스 항체; 도(A)에서는 B형 간염 바이러스 단백질의 서열번호 31의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체만이 결합을 나타내며; 도(B)에서는 B형 간염 바이러스 단백질의 서열번호 30의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체만이 결합을 나타낸다.
도 6은 (A) i) B형 간염 바이러스 단백질의 서열번호 31의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체, ii) B형 간염 바이러스 단백질의 서열번호 30의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체에 의한, 감염된 간세포(HepG2 세포) 표면상의 펩티드-MHC 복합체의 인식을 나타낸 것이다.
도 7은 간 생검체의 HBV 감염된 간세포 상의 펩티드-MHC 복합체의 인식을 나타낸 것이다.
도 8은 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질이 HBV 발현 표적 세포에 대한 그의 결합을 유지하는 것을 나타낸 것이다; 1: 대조군 항체; 2: 대조군 펩티드; 3: 인터페론-알파, 및 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체를 포함하는 융합 단백질; 4: B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체.
도 9는 서열번호 30의 펩티드로 사전-차단하는 것이 도 8에 나타낸 바와 같은 증대된 인터페론-알파 활성을 저해함을 보여준다.
I. 정의
"수용체 인간 골격(framework)"은 하기에서 정의하는 바와 같이, 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 공통 골격으로부터 유도된 경쇄 가변 도메인(domain)(VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 인간 항체 골격을 의미한다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 공통 골격"으로부터 유도된" 수용체 인간 골격은 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 태양에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 태양에서, VL 수용체 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 공통 골격 서열에 대해 서열상 동일하다.
용어 "친화도"는 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비-공유적 상호작용의 총합을 의미한다. 분자 X의 그 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여, 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 결정될 수 있다.
"친화도 증가(affinity matured)" 항체는, 항원에 대한 항체의 친화도에 개선, 즉, 항체 결합 부위와 그의 결합 파트너(항원) 사이의 해리 상수의 감소를 야기하는 변형을 갖지 않는 모 항체에 비해, 하나 이상의 초가변 영역(hypervariable region, HVR) 또는 상보성 결정 영역(CDR)에 하나 이상의 상기 변형을 갖는 항체를 말한다.
용어 "아미노산"은 직접 또는 전구체의 형태로 핵산에 의해 암호화될 수 있는, 카복시 α-아미노산의 기를 의미한다. 개개 아미노산은 3개의 뉴클레오티드, 소위 코돈 또는 삼중 염기(base triplet)로 이루어진 핵산에 의해 암호화된다. 각각의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 암호화된다. 이것은 "유전자 코드의 변성"으로 알려져 있다. 상기 용도내에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산을 의미한다.
용어 "B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체"는, 항체가 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체를 나타내는 세포를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 하는 충분한 친화도하에 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체와 결합할 수 있는 항체를 말한다. 특정 태양에서, B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체는 ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
본원에서 용어 "항체"는 광의로 사용되며, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 항체 단편(목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한)을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. 천연 항체는 다양한 구조를 갖는 분자이다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 여기서 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인(VH)에 이어서, 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인(VL)에 이어서, 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ)(서열번호 16) 및 람다(λ)(서열번호 17)로 불리는 2가지 유형중 하나로 지정될 수 있다.
"항체 단편"은 비손상(intact) 항체가 결합하는 항원과 결합하는 비손상 항체의 일부를 포함하는 비손상 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자(예를 들면, scFv) 및 항체 단편으로부터 생성된 다중특이성 항체가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
참조 항체로서 "동일 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 그의 항원에 대한 참조 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 말하며, 반대로, 참조 항체는 경쟁 분석에서 그 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 분석이 본원에 제공되어 있다.
용어 "항-바이러스성 사이토카인"은 감염후 항-바이러스 반응의 형성을 매개하고 감염 부위에 염증 세포를 공급하는 사이토카인을 의미한다. 항-바이러스성 사이토카인은 I형(인터페론(INF)-α 및 INF-β), II형(IFN-γ) 및 III형(INF-λ 또는 인터류킨(IL)-28/29) 인터페론을 포함한다. 인터페론 α, β, γ 및 λ는 바이러스 감염에 대한 선천성 면역 반응에서 생성되는 중요한 인터페론이다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 의미한다. 특정 태양에서, 키메라 항체는 제 1 공급원 또는 종으로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 한편, 중쇄 및 경쇄의 나머지 부분은 제 2의 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된다.
항체의 "부류"는 그 중쇄가 가진 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 인간 항체의 5가지 주 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러 개가 서브클래스(이소타입(isotype)), 예를 들면, IgG1(서열번호 18 및 19), IgG2, IgG3, IgG4(서열번호 21), IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
"작동인자 기능"은 항체 이소타입에 따라 달라지는, 항체의 Fc-영역에 기인하는 그의 생물 활성을 의미한다. 항체 작동인자 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC), Fc 수용체 결합(FcRn), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 대식세포-매개 세포독성(ADMC), 세포 표면 수용체(예를 들면, B-세포 수용체)의 하향 조절, 및 B-세포 활성화.
약제, 예를 들면, 약학 제형의 "효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과 또는 효과를 달성하기 위해 필수적인 투여량에서 및 필수적인 시간동안 효과적인 양을 의미한다.
용어 "Fc-영역"은 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 상기 용어는 천연 서열 Fc-영역 및 Fc-영역 변이체를 포함한다. 한 태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 대략 아미노산 잔기 226(Cys)으로부터 또는 대략 아미노산 잔기 230(Pro)으로부터 중쇄의 카복시-말단까지 연장되어 있다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신 잔기(Lys447)는 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시하지 않는 한, 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 잔기의 번호는 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Vols. 1-3, Public Health Service, National Institutes of Health, Publication No. 91-3242, Bethesda, MD (1991)]에 기술된 바와 같은, EU 인덱스로도 불리는 EU 번호지정 시스템에 따른다.
용어 "인간 기원으로부터 유래된 불변 영역"은 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역(예를 들면, CH1 도메인, 힌지(hinge) 영역, CH2 도메인, CH3 도메인 및 선택적으로 CH4 도메인 포함) 및/또는 불변 경쇄 κ 또는 λ 영역(CL 도메인)을 의미한다. 상기 불변 영역들은 최신 기술에서 공지되어 있으며, 예를 들면, 카밧(Kabat, E.A.)에 의해 기술되었다(예를 들면, 문헌 [Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28, 214-218 (2000); Kabat, E.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 2785-2788 (1975)] 참조). IgG4 서브클래스의 항체들은 감소된 Fc 수용체(FcγIIIa) 결합을 나타내는 반면, 다른 IgG 서브클래스의 항체들은 강한 결합을 나타낸다. 그러나, Pro239, Asp265, Asp270, Asn297(Fc 탄수화물의 소실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435는, 변형되는 경우, 또한 감소된 Fc 수용체 결합을 나타내는 잔기들이다(문헌 [Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604 (2001); Lund, J., et al., FASEB J. 9, 115-119 (1995); Morgan, A., et al., Immunology 86, 319-324 (1995)]; EP 0 307 434 호). 한 태양에서, 융합 단백질의 항체는 인간 기원으로부터 유래된 불변 영역을 갖는다. 또 다른 태양에서, 융합 단백질의 항체는 서열번호 18 내지 서열번호 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 불변 영역을 갖는다. 또한, 한 태양에서, 융합 단백질의 항체는 서열번호 18 또는 19의 아미노산 서열을 갖는 불변 영역을 갖는다.
"골격" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 또는 상보성 결정 영역(CDR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR(CDR) 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체(full length antibody)", "비손상 항체(intact antibody)" 및 "전항체(whole antibody)"는 본원에서, 천연 항체 구조에 구조적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 상기 세포들의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 그 안에 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체", "형질전환 세포" 및 "형질감염 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는, 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열과 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체에 대한 상기 정의는 특별히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다.
"인간 공통(consensus) 골격"은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택에서 가장 보편적으로 존재하는 아미노산 잔기를 대표하는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 아형(subgroup)으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 아형은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD, vols. 1-3 (1991)]에서와 같은 아형이다. 한 태양에서, VL의 경우, 아형은 상기 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD, vols. 1-3 (1991)]에서와 같은 아형 카파 I이다. 한 태양에서, VH의 경우, 아형은 상기 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD, vols. 1-3 (1991)]에서와 같은 아형 III이다.
용어 "인간화 항체"는 비-인간 HVR, 특히 CDR로부터의 아미노산 잔기, 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 태양에서, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가면 도메인의 실질적으로 전부를 포함하며, 이때 HVR(CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 그것과 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 그것과 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 기원으로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화 변이체"는 인간화된 항체를 말한다. 인간화 항체, 또는 항체의 인간화 변이체는 FR 및 불변 영역에 아미노산 변화를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR을 포함하며, 이중 3개는 VH(H1, H2, H3)에 존재하고 3개는 VL(L1, L2, L3)에 존재한다. HVR은 일반적으로 최고 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 수반되는, 초가변 루프로부터 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 루프는, 한 태양에서, VL 도메인의 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 및 VH 도메인의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에서 발생한다[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917(1987)]. CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은, 한 태양에서, VL 도메인의 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3) 및 VH 도메인의 31-35B(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)에서 발생한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Vols. 1-3, Public Health Service, National Institutes of Health, Publication No. 91-3242, Bethesda, MD (1991)]). VH에서 CDR1은 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 생략형-CDR 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역내에 함유된다. a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은, 한 태양에서, VL 도메인의 아미노산 잔기 31-34(L1), 50-55(L2), 89-96(L3) 및 VH 도메인의 31-35B(H1), 50-58(H2) 및 95-102(H3)에서 일어난다(예를 들면, 문헌 [Almargo, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13, 1619-1633 (2008)] 참조). 달리 언급하지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인내 다른 잔기들(예를 들면, FR 잔기)은 본원에서 상기 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Vols. 1-3, Public Health Service, National Institutes of Health, Publication No. 91-3242, Bethesda, MD (1991)]에 따라 번호를 지정한다. "면역접합체"는 세포독성제를 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 하나 이상의 이종 분자에 접합된 항체이다.
"개인" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 영장류(예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정 태양에서, 개인 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 한 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 태양에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동(예를 들면, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법으로 측정할 때 95% 또는 99% 이상의 순도로 정제된다. 항체 순도 평가 방법에 대한 검토를 위해서, 예를 들면, 문헌 [Flatman, S., et al., J. Chromatogr. B 848, 79-87 (2007)]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 한 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. (단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.)
"B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 별도의 벡터들내의 상기 핵산 분자 및 숙주 세포내 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자를 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자(또는 그의 단편)을 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 상기 집단을 구성하는 개개 항체는, 예를 들면, 천연 돌연변이를 포함하거나 단클론성 항체 제제의 제조시 발생하는 가능한 변이 항체, 예를 들면, 일반적으로 소량으로 존재하는 변이체는 제외하고, 동일하고/하거나 동일 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체와 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, "단클론성"이란 수식어는 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는, 하이브리도마 방법, 단일 항체 생성 세포 분리 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자전이(transgenic) 동물을 사용하는 방법을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단클론성 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 기타 예시적인 방법들은 본원에 기술되어 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종 잔기(예를 들면, 세포독성 잔기) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 말한다. 네이키드 항체는 약학 제형에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는, 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로-사량체성 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH), 및 이어서 3 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인(VL), 및 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2가지 유형중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료용 생성물의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여법, 병용 요법, 금기사항 및/또는 주의사항에 대한 정보를 함유하는, 치료용 생성물의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 칭하기 위해 사용된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열중 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalin)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 창시되었으며, 소스 코드는 워싱턴 D.C., 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함하여, 유닉스 작업 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(양자택일적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)는 하기 수학식 1과 같이 산출된다:
Figure pct00001
상기 식에서,
X는 A와 B의 ALIGN-2 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이고;
Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다.
아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 %는 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술한 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되도록 하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상에게 무독성인, 약학 제형내, 활성 성분 이외의 다른 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)은 치료되는 개인의 자연 경과를 변화시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과로는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행율의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 태양에서, 본 발명의 항체는 질환의 진전을 지연시키기 위해 또는 질환의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.
용어 "I형 인터페론"은 IFNAR1 및 IFNAR2 단백질 쇄(IFN-α 수용체, IFNAR)로 이루어진 세포 표면 수용체 복합체에 결합하는 인터페론을 의미한다. 인간에 존재하는 I형 인터페론은 인터페론 α, 인터페론 β 및 인터페론 ω를 포함한다.
용어 "II형 인터페론"은 인터페론-감마 수용체(IFNGR)에 결합하는 인터페론을 의미한다. 인간에 존재하는 II형 인터페론은 인터페론 γ를 포함한다.
용어 "III형 인터페론"은 부류 II 사이토카인 수용체(CIICR) IL10R2 및 IFNLR1으로 이루어진 수용체 복합체를 통해 신호를 전달하는 인터페론이다. III형 인터페론 군은 IFN-λ1, IFN-λ2 및 IFN-λ3(각각 인터류킨-29, 인터류킨-28A 및 인터류킨 28B로도 불린다)으로 불리는 3가지 IFN-λ 분자로 이루어진다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌 [Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원과 결합하는 항체는, 상보성 VL 또는 VH 도메인 각각의 라이브러리를 검색하기 위해 항원과 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Portolano, S., et al., J. Immunol. 150, 880-887 (1993)]; Clarkson, T., et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조).
용어 "벡터"는 본원에서 사용된 바와 같이, 그것이 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐 아니라, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 언급된다.
II . 조성물 및 방법
본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 치유된 간염 환자로부터 얻은 HBV-특이적 CD8 T 세포에 유사한 민감도를 나타내었다. 이들은 또한 만성 HBV 환자로부터 얻은 생체외 HBV-감염 간세포를 인식한다. 상기 인식은 순환 HBV 항원의 존재에 의해 영향받지 않았다. 중요하게, 인터페론-알파에 대한 항체의 융합은 HBV 항원을 발현하는 세포에 대한 항체의 민감도를 변화시키지 않았지만, 융합된 인터페론-알파의 그 자체 수용체에 대한 친화도는 감소되었다. 인터페론-알파 활성은 HBV 항원을 발현하는 세포상에서 현저하게 증대된 것으로 나타났다. TCRL에 의한 MHC/펩티드 부위의 사전-차단은 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 증대된 인터페론-알파 활성을 저해하였다(도 9).
HBV 감염 세포에 대한 항체의 특이성은 도 5에 나타내었다. 도 5(A)에서는, B형 간염 바이러스 단백질의 서열번호 31의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체만이 결합을 나타내며; 도 5(B)에서는, B형 간염 바이러스 단백질의 서열번호 30의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체만이 결합을 나타낸다.
감염된 간세포에 대한 펩티드-MHC 복합체의 인식은 도 6 및 7에 나타내었다.
도 8은 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질이 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 비-접합 항체의 특이성을 유지함을 보여준다.
한 양태에서, 본 발명은, 부분적으로, B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체 및 항-바이러스성 사이토카인을 포함하는, 예를 들면, B형 간염 바이러스 감염 간세포에 항-바이러스성 사이토카인을 전달하기 위한 융합 단백질의 개발에 기초한다. 본 발명의 융합 단백질은, 예를 들면, B형 간염 바이러스로 감염된 대상의 치료에 유용하다.
한 양태에서, HBV 감염 세포상에 제공된 HBV 외피(외피 183-191/A201) 및 HBV 코어(코어 18-27/A201) 항원의 펩티드/MHC-1에 대한 특이성을 갖는 항체를 포함하는 융합 단백질이 기재되어 있다. 항체는 HBV-특이적 CD8 T-세포의 T-세포 수용체 인식을 모방한다.
A. B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체 및 항-바이러스성 사이토카인을 포함하는 예시적인 융합 단백질
한 양태에서, 본 발명은 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체 및 항-바이러스성 사이토카인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 HVR을 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 포함하는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 HVR을 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 포함하는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 전부를 포함하는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 태양에서, 상기 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 태양에서, 상기 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 태양에서, 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 전부를 포함하는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 태양에서, 상기 항체는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 태양에서, 상기 항체는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 태양에서, 항체는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 전부를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 전부를 포함하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 (a) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 전부를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 전부를 포함하는 VL 도메인을 갖는 항체를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 (a) (i) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 전부를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 전부를 포함하는 VL 도메인을 갖는 항체를 포함한다.
한 양태에서, B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체 및 항-바이러스성 사이토카인을 포함하는 융합 단백질은, 서열번호 7 또는 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열 또는 그의 인간화 변이체를 포함하는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체를 포함한다. 특정 태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열은 기준 서열에 대한 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 능력은 유지한다. 특정 태양에서, VH는 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 특정 태양에서, VH는 (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 양태에서, B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체 및 항-바이러스성 사이토카인을 포함하는 융합 단백질은, 서열번호 11 또는 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 그의 인간화 변이체를 포함하는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체를 포함한다. 특정 태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대한 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 능력은 유지한다. 또 다른 특정 태양에서, VL은 (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, VL은 (a) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 양태에서, B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체, 및 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체를 포함하는 항-바이러스성 사이토카인을 포함하는 융합 단백질이 제공되며, 이때 상기 항체는 상기에 나타낸 임의의 태양에서와 같은 VH, 및 상기에 나타낸 임의의 태양에서와 같은 VL을 포함한다. 한 태양에서, 상기 항체는 상기 서열들의 번역후 변형 또는 그의 인간화 변이체를 포함하여, 서열번호 7 및 서열번호 11 각각의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 한 태양에서, 상기 항체는 상기 서열들의 번역후 변형 또는 그의 인간화 변이체를 포함하여, 서열번호 35 및 서열번호 39 각각의 VH 및 VL 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 VH 또는 서열번호 11의 VL을 갖는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 35의 VH 또는 서열번호 39의 VL을 갖는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 결합하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 태양들 및 양태들의 어느 하나에 따른 융합 단백질의 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하여, 단클론성 항체이다. 한 태양에서, 상기 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 한 태양에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들면, 비손상 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소타입이다.
한 양태에서, 상기 태양들 및 양태들중 어느 하나에 따른 융합 단백질은 하기 부분에서 기술하는 바와 같은 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다:
1. 친화도
특정 태양에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질 또는 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질에 포함된 항체는 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체로부터 ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
한 태양에서, Kd는 표면 플라즈몬 공명 방법에 의해 측정된다.
인터페론 α-2a, 또는 인터페론 α-2a를 함유하는 융합물의 인간 인터페론-알파/베타 수용체 베타 쇄(IFNAR2)에 대한 결합 친화도는 25 ℃에서 비아코어(BIAcore, 등록상표) 3000 기기(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정할 수 있다. IFNAR2는 IFNAR1/2 및 리간드로서 인터페론 α-2a로 이루어지는 헤테로이량체 인터페론 수용체 복합체의 고-친화성 초기 결합 성분이다.
비아코어(등록상표) 시스템은 분자 상호작용 연구에 대해 잘 확립되어 있다. 상기 시스템은 리간드/분석물 결합의 연속적 실시간 모니터링을 가능하게 하며, 따라서 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 평형 해리 상수(Kd)의 측정을 가능하게 한다. SPR-기술은 금 코팅된 바이오센서 칩의 표면에 근접한 굴절률의 측정을 기초로 한다. 굴절률의 변화는 고정화된 리간드와 용액중에 주입된 분석물과의 상호작용에 의해 야기된 표면상의 질량 변화를 나타낸다. 분자가 표면상의 고정화된 리간드와 결합하면, 질량이 증가하고, 해리의 경우에는 질량이 감소한다.
포착 시스템(예를 들면, 인간 IgG에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 포착, 잭슨 임뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))의 약 750 공명 단위(RU)의 아민 커플링은 GE 헬쓰케어에서 공급하는 아민 커플링 키트를 이용하여 pH 4.5에서 CM5 칩상에서 수행할 수 있다. huFc-표적화 IFNAR2(RnD 시스템즈, 카탈로그 번호 4015-AB)는 5 ㎍/ml의 농도에서 포착될 수 있다. 잉여 결합 부위는 인간 Fc-부분(huFc) 혼합물을 1.25 μM의 농도(바이오디자인(Biodesign), 카탈로그 번호 50175)로 주입하여 차단할 수 있다. 0.1 내지 50 nM 범위의 상이한 농도의 인터페론 또는 인터페론 융합 단백질을 10 ㎕/분의 유량하에 298 K에서 120 내지 240 초동안 유동 셀에 통과시켜 결합 상을 기록할 수 있다. 해리 상은 600 초 이하동안 모니터링할 수 있으며, 샘플 용액으로부터 전기영동 완충액으로 교환시켜 유발시킬 수 있다. 표면은 30 ㎕/분의 유량에서 100 mM 인산 용액으로 1 분 세척하여 재생될 수 있다. 실험을 위해, GE 헬쓰케어에서 공급하는 HBS-P+ 완충제를 선택할 수 있다(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) 계면활성제 P20).
벌크 굴절률 차이는 블랭크-커플링된 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정될 수 있다. 블랭크 주입도 또한 감한다(= 이중 참조).
ka/kd로 정의된 평형 해리 상수(Kd)는 비아이벨류에이션(BIAevaluation) 4.1 소프트웨어 패키지를 사용하여, 여러 상이한 농도하에 수득된 센소그램(sensogram) 곡선을 분석하여 결정할 수 있다. 데이터 적합화(fitting)는 적합한 결합 모델을 따랐다.
인간 야생형 인터페론 α-2a의 Kd 측정을 위해, 0.1 내지 50 nM의 인터페론 α-2a를 IFNAR2 코팅된 센서 칩 위에 주입할 수 있다. 상응하는 센소그램은 도 1a)에 나타내었다. 인간 기원의 Fc-영역에 C-말단에 융합된 인간 인터페론 α-2a의 경우, 상기 융합 단백질은 IFNAR2 코팅된 표면위에 0.5 내지 50 nM의 농도로 주입할 수 있다. 복합체 안정성은 인터페론 α-2a에 대해 35 초로부터 인터페론 α-2a Fc-부분-융합 단백질에 대해 23 분으로 증가한다. 각각, 친화도는 인터페론 α-2a에 대해 4 nM으로부터 융합 단백질에 대해 0.3 nM의 겉보기 친화도로 증가한다. 활성을 위해 IFNAR1이 필수적이기 때문에, 초기 결합만을 처리할 수 있다. 상기 분석에 의해 인터페론 신호전달 활성은 처리될 수 없다. 한 태양에서, 융합 단백질은 1 nM 이하의 IFNAR2에 대한 결합 친화도를 갖는다.
2. 항체 단편
특정 태양에서, 융합 단백질의 항체는 항체 단편이다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에 기술된 다른 단편들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해, 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9, 129-134 (2003)]를 참조하시오. scFv 단편에 대한 검토를 위해, 예를 들면, 문헌 [Plueckthun, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Spring-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; WO 93/16185 호; US 5,571,894 및 5,587,458 호를 참조하시오. 재생 수용체 결합 에피토프(salvage receptor binding epitope) 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 고찰을 위해, US 5,869,046 호를 참조하시오.
디아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예를 들면, EP 0 404 097 호; WO 1993/01161 호; 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9, 129-134 (2003); Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993)] 참조). 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9, 129-134 (2003)]에 기술되어 있다.
단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인 전체 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc., 매사추세츠 월탐); 예를 들면, US 6,248,516 호 참조).
항체 단편은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 숙주 세포(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 생성을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 태양에서, 융합 단백질의 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체가, 예를 들면, US 4,816,567 호; 및 문헌 [Morrison, L.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)]에 보고되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(즉, 마우스로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 기원의 불변 영역을 포함한다. 다른 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 서브클래스가 모 항체의 그것으로부터 변화된 "부류 전환" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 태양에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화도는 유지시키면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는, HVR, 예를 들면, CDR(또는 그의 일부)가 비-인간 항체로부터 유도되고 FR(또는 그의 일부)가 인간 항체 서열로부터 유도된 가변 도메인을 하나 이상 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 기원의 불변 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 태양에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화도를 회복 또는 개선시키기 위해, 비-인간 항체(예를 들면, 그로부터 HVR 잔기가 유도되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌 [Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13, 1619-1633 (2008)]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Riechmann, L., et al., Nature 332, 323-327 (1988); Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)]; US 5,821,337 호, US 7,527,791 호, US 6,982,321 호 및 US 7,087,409 호; [Kashmiri, S.V., et al., Methods 36, 25-34 (2005)](SDR(a-CDR) 그래프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28, 489-498 (1991)]("표면치환(resurfacing)" 기재); [Dall' Acqua, W.F., et al., Methods 36, 43-60 (2005)]("FR 셔플링(shuffling)" 기재); 및 [Osbourn, J., et al., Methods 36, 61-68 (2005)] 및 [Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83, 252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법 기재)에 더 보고되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 다음을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다: "최적-적합(best-fit)" 방법을 이용하여 선택된 골격 영역(예를 들면, 문헌 [Sims, J.E., et al., J. Immunol. 151, 2296-2308 (1993)] 참조). 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 아형의 인간 항체의 공통 서열로부터 유도된 골격 영역(예를 들면, 문헌 [Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289 (1992); Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151, 2623-2632 (1993)] 참조), 인간 성숙(체세포 돌연변이) 골격 영역 또는 인간 생식선 골격 영역(예를 들면, 문헌 [Almagro, J.C. and Fransson, J., Fornt. Biosci. 13, 1619-1633 (2008)] 참조), 및 FR 라이브러리 검색으로부터 유도된 골격 영역(예를 들면, 문헌 [Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272, 10678-10684 (1997); Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271, 22611-22618 (1996)] 참조).
4. 인간 항체
특정 태양에서, 융합 단백질의 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 368-374 (2001); Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20, 450-459 (2008)]에 기술되어 있다.
인간 항체는, 항원 자극에 대해 인간 가변 영역을 갖는 비손상 인간 항체 또는 비손상 항체를 생성하도록 변형된 유전자전이 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대신하거나 염색체외에 존재하거나 동물 염색체내에 무작위적으로 통합되는 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 상기 유전자전이 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 유전자전이 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법에 대한 개관은, 문헌 [Lonberg, N., Nat. Biotech. 23, 1117-1125 (2005)]을 참조하시오. 또한, 예를 들면, 제노마우스(XENOMOUSE, 등록상표) 기술을 보고한 US 6,075,181 호 및 US 6,150,584 호 휴맵(HuMab, 등록상표) 기술을 보고한 US 5,770,429 호; K-M 마우스(등록상표) 기술을 보고한 US 7,041,870 호; 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE, 등록상표) 기술을 보고한 US 2007/0061900 호를 참조하시오. 상기 동물에 의해 생성된 비손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과의 결합에 의해 더 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기초 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 뮤린-인간 헤테로골수종 세포주가 보고되었다(예를 들면, 문헌 [Kozbar, D., J. Immunol. 133, 3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniquis and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987); Boerner, P., et al., J. Immunol. 147, 86-95 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체도 또한 문헌 [Li, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 3557-3562 (2006)]에 기술되어 있다. 또 다른 방법으로는, 예를 들면, US 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터 단클론성 인간 IgM 항체의 생성 기재) 및 문헌 [Ni, J., Xiandai Mianyixue 26, 265-268 (2006)](인간-인간 하이브리도마 기재)에 기술된 것들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20, 927-937 (2005); Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27, 185-191 (2005)]에 보고되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 분리함으로써 생성될 수 있다. 상기 가변 도메인 서열은 이어서 목적하는 인간 불변 도메인과 결합된다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기술되어 있다.
5. 라이브러리-유도된 항체
본 발명의 융합 단백질에 포함된 항체는 목적 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 검색하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하고 상기 라이브러리를 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 검색하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (2001)(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ)]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [McCafferty, J. et al., Nature 348, 552-554 (1990); Clackson, T. et al., Nature 352, 624-628 (1991); Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991); Marks, J.D. et al., Methods in Molecular Biology 248, 161-176 (2003); Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338, 299-310 (2004); Lee, C.V., et al., J. Mol. Biol. 340, 1073-1093 (2004); Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 12467-12472 (2004); Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284, 119-132 (2004)]에 더 보고되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 따로따로 클로닝하고, 파지 라이브러리에서 무작위적으로 재조합시킨 후, 이것은 문헌 [Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 검색할 수 있다. 파지는 전형적으로 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 면역화 공급원으로부터 얻은 라이브러리는 하이브리도마를 제조할 필요없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 또는, 미접촉(naive) 레퍼토리를 클로닝하여(예를 들면, 인간으로부터) 문헌 [Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993)]에 기술된 바와 같은 임의의 면역화없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 미접촉 라이브러리도 또한, 문헌 [Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227, 381-388 (1992)]에 보고된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 비-재배열 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도 가변성 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 보고한 특허 공개공보로는, 예를 들면, US 5,750,373 호, US 2005/0079574 호, US 2005/0119455 호, US 2005/0266000 호, US 2007/0117126 호, US 2007/0160598 호, US 2007/0237764 호, US 2007/0292936 호, 및 US 2009/0002360 호가 포함된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이성 항체
특정 태양에서, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 다중특이성 항체, 예를 들면, 이중특이성 항체인 항체를 포함한다. 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 기술로는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현(문헌 [Milstein, C. and Ceullo, A.C., Nature 305, 537-540 (1983)]; WO 93/08829 호; 및 문헌 [Traunecker, A. et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작처리(예를 들면, US 5,731,168 호 참조)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한, 항체 Fc-헤테로이량체 분자를 제조하기 위한 정전 스티어링(steering) 효과를 조작처리하고(WO 2009/089004 호); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시키고(예를 들면, US 4,676,980 호; 및 문헌 [Brennan, M. et al., Science 229, 81-83 (1985)] 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생성하고(예를 들면, 문헌 [Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 사용하고(예를 들면, 문헌 [Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448(1993)] 참조); 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하고(예를 들면, 문헌 [Gruber, M. et al., J. Immunol. 152, 5368-5374 (1994) 참조); 예를 들면, 문헌 [Tutt, A. et al., J. Immunol. 147, 60-69 (1991)]에 기술된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스(Octopus) 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작처리된 항체도 또한 본원에 포함된다(예를 들면, US 2006/0025576 호 참조).
상기 항체 또는 단편은 또한 제 1 항원 뿐 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들면, US 2008/0069820 호 참조).
상기 항체 또는 항체 단편은 또한 WO 2009/080251 호, WO 2009/080252 호, WO 2009/080253 호, WO 2009/080254 호, WO 2010/112193 호, WO 2010/115589 호, WO 2010/136172 호, WO 2010/145792 호 및 WO 2010/145793 호에 기술된 다중특이성 항체들을 포함한다.
7. 항체 변이체
특정 태양에서, 본원에 제공된 융합 단백질에 포함된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열내에 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기 변형으로는, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 삽입, 및/또는 상기 서열내 잔기의 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물을 수득할 수 있으나, 단, 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들면, 항원-결합 특성을 가져야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 해당 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환이 표 1에 "바람직한 치환"의 제목하에 제공되어 있다. 표 1에 "예시적 치환"의 제목하에, 및 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에 더 기술하는 바와 같이 더 많은 치환 변화들이 제공되어 있다. 아미노산 치환이 항체내에 도입될 수 있으며, 생성물들은 목적 활성, 예를 들면, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별될 수 있다.
원래 잔기 예시적 치환 바람직한 치환
Ala(A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn(N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp(D) Glu; Asn Glu
Cys(C) Ser; Ala Ser
Gln(Q) Asn; Glu Asn
Glu(E) Asp; Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile(I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu(L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys(K) Arg; Gln; Asn Arg
Met(M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Try(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val(V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 통상적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Gln;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 포함한다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체(예를 들면, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성 변이체는 모 항체에 대해 특정 생물학적 성질(예를 들면, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서 변형(예를 들면, 개선)을 갖고/갖거나 모 항체의 실질적으로 유지된 특정 생물학적 성질을 가질 것이다. 예시적 치환 변이체는 친화도 증가 항체로, 이것은, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 파지-디스플레이-기초 친화도 증가 기술을 이용하여 편리하게 제조될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고 변이 항체는 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물 활성(예를 들면, 결합 친화도)에 대해 선별된다.
변이(예를 들면, 치환)는, 예를 들면, 항체 친화도를 개선하기 위해, HVR에서 일어날 수 있다. 상기 변이는 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 돌연변이 과정(예를 들면, 문헌 [Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207, 179-196, (2003)] 참조)동안 높은 빈도로 돌연변이가 일어나는 코돈에 의해 암호화된 잔기, 및/또는 SDR(a-CDR)에서 일어날 수 있으며, 이때 생성 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터 구성하고 재선택함으로써 수행된 친화성 돌연변이는, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (2001)(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ)]에 보고되었다.
친화성 돌연변이의 일부 태양에서, 임의의 다양한 방법(예를 들면, 오류-유발(error-prone) PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-유도성 돌연변이유발)에 의한 돌연변이에 대해 선택된 다양한 유전자내에 다양성이 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리를 제조한다. 그 다음, 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 상기 라이브러리를 검색한다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 여러 HVR 잔기(예를 들면, 한번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위배정되는 HVR-유도성 접근방법을 포함한다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는 특히, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 이용하여 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 흔히 표적화된다.
특정 태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 상기 변이가 그 항원과 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변이(예를 들면, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)는 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변이는 HVR "핫스팟" 또는 SDR 이외에서 일어날 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 태양에서, 각각의 HVR은 변이되지 않거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역들을 확인하기에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244, 1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 상기 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군(예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기들)을 확인하고, 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체한다. 추가의 치환이 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치들에 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환에 대한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 성질을 갖는지 여부를 측정하기 위해 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합물, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다.
b) 글리코실화 변이체
특정 태양에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변이된 항체를 포함한다. 항체에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변이시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc-영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물이 변이될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 결합된 분지된 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들면, 문헌 [Wright, A. et al., TIBTECH 15, 26-32 (1997) 참조). 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산(NANA, Neu5Ac) 뿐 아니라, 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 항체중 올리고사카라이드의 변형은 특정한 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 수행될 수 있다.
한 태양에서, 항체는 Fc-영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는다. 예를 들면, 상기 항체중 푸코스의 양은 1 내지 80%, 1 내지 65%, 5 내지 65%, 5 내지 20% 또는 20 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들면, WO 2008/077546 호에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정할 때 Asn297에 결합된 모든 글리코구조(예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 만노스 고함량 구조)의 합에 대한, Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균량을 산출함으로써 측정된다. Asn297은 Fc-영역에서 대략 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 말한다(Fc-영역 잔기의 Eu 번호지정). 그러나, Asn297은 또한, 항체내 부차적 서열 변화로 인해 위치 297의 약 ± 3개 아미노산의 상류 또는 하류에, 즉, 위치 294와 300 사이에 위치할 수도 있다. 상기 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들면, US 2003/0157108 호 및 US 2004/0093621 호 참조). "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 공개공보의 예로는 다음이 포함된다: US 2003/0157108 호; WO 2000/61739 호; WO 2001/29246 호; US 2003/0115614 호; US 2002/0164328 호; US 2004/0093621 호; US 2004/0132140 호; US 2004/0110704 호; US 2004/0110282 호; US 2004/0109865 호; WO 2003/085119 호; WO 2003/084570 호; WO 2005/035586 호; WO 2005/035778 호; WO 2005/053742 호; WO 2002/031140 호; 문헌 [Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336, 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87, 614-622 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포주(문헌 [Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249, 533-545 (1986)]; US 2003/0157108 호; WO 2004/056312 호, 특히 실시예 11), 및 녹아웃(knockout) 세포주, 예를 들면, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들면, 문헌 [Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87, 614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94, 680-688 (2006)]; WO 2003/085107 호 참조)가 포함된다.
예를 들면, 항체의 Fc-영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는 항체를 포함하는 다른 융합 단백질이 제공된다. 상기 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체의 예는, 예를 들면, WO 2003/011878 호; US 6,602,684 호; 및 US 2005/0123546 호에 기술되어 있다. Fc-영역에 결합된 올리고사카라이드에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체를 포함하는 융합 단백질도 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들면, WO 1997/30087 호; WO 1998/58964 호; 및 WO 1999/22764 호에 기술되어 있다.
c) Fc -영역 변이체
특정 태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 융합 단백질의 항체의 Fc-영역내에 도입됨으로써 Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들면, 치환)을 포함하는, 인간 기원의 Fc-영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역)을 포함할 수 있다.
특정 태양에서, 본 발명은, 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정한 작동인자 기능(예를 들면, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보가 되게하는, 전부는 아니지만 일부의 작동인자 기능을 갖는 항체 변이체를 포함하는 융합 단백질을 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행하여 항체가 FcγR 결합이 결여(따라서 ADCC 활성이 결여되기 쉬운)되지만, FcRn 결합 능력은 보유하는지를 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현시키는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch, J.V. and Kinet, J.P. (Annu. Rev. Immunol. 9, 457-492 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비-제한 예는 US 5,500,362 호(예를 들면, 문헌 [Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I. et al., Porc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1499-1502 (1985)]; US 5,821,337 호(문헌 [Brueggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166, 1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법, 예를 들면, 유동세포분석을 위한 악티(ACTI, 등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아 마운틴뷰) 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 위스콘신 매디슨)을 이용할 수 있다. 상기 분석에 유용한 작동인자 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(Natural Killer, NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 해당 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 문헌 [Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q와 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되는지를 확인하기 위해 C1q 결합 분석을 또한 수행할 수 있다(예를 들면, WO 2006/029879 호 및 WO 2005/100402 호에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202, 163-171 (1997); Cragg, M.S., et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); and Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정도 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18, 1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 작동인자 기능을 갖는 항체는 Fc-영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 항체를 포함한다(예를 들면, US 6,737,056 호 참조). 상기 Fc 돌연변이체로는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체가 포함된다(US 7,332,581 호 참조).
FcR에 대해 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 보고되어 있다(예를 들면, US 6,737,056 호; WO 2004/056312 호; 문헌 [Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 9, 6591-6604 (2001)] 참조)
특정 태양에서, 항체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc-영역의 위치 298, 333 및/또는 334에서의 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다(잔기들의 EU 번호지정).
일부 태양에서, 변이된(즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 야기하는 변이는, 예를 들면, US 6,194,551 호, WO 99/51642 호 및 문헌 [Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164, 4178-4184 (2000)]에 보고된 바와 같이, 항체의 Fc-영역에서 이루어진다.
증가된 반감기, 및 태아에게 엄마의 IgG 전달을 책임지는 신생아 Fc 수용체(FcRn)(문헌 [Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117, 587-593 (1976); and Kim, J.K. et al., Eur. J. Immunol. 24, 2429-2434 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체는 US 2005/0014934 호에 보고되어 있다. 상기 항체들은 그 중에 FcRn에 대한 Fc-영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체로는 Fc-영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362,376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에 치환, 예를 들면, Fc-영역 잔기 434의 치환을 갖는 변이체들이 포함된다(US 7,371,826 호).
Fc-영역 변이체의 다른 예에 관하여, 또한 문헌 [Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 332, 738-740 (1988)]; US 5,648,260 호; US 5,624,821 호; 및 WO 94/29351 호를 참조하시오.
B. 재조합 방법 및 조성물
융합 단백질 및 항체는, 예를 들면, US 4,816,567 호에 보고된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조할 수 있다. 한 태양에서, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 한 태양에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 한 태양에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 상기 태양에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다(예를 들면, 그에 의해 형질전환 또는 형질감염되었다). 한 태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포 또는 베이비 햄스터 신장(Baby Hamster Kidney, BHK) 세포 또는 인간 태아 신장(Human Embryonic Kidney, HEK) 세포, 또는 림프계 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp2/0 세포)이다. 한 태양에서, 상기 제공된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 융합 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 선택적으로 융합 단백질을 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 제조 방법이 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 재조합 생성을 위해, 예를 들어, 전술한 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 분리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터내에 삽입시킨다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 분리하고 서열화할 수 있다.
융합 단백질-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포로는 본원에 기재된 바와 같은 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들면, 융합 단백질은, 특히 글리코실화 및 Fc 작동인자 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성될 수 있다. 세균에서 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들면, US 5,648,237 호, US 5,789,199 호 및 US 5,841,523 호, 또한 에스케리키아 콜라이에서 항체 단편의 발현을 기재한 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, pp. 245-254 (2003)]을 참조하시오. 발현 후에, 융합 단백질은 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 분리할 수 있으며 더 정제될 수 있다.
원핵세포 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 융합 단백질의 생성을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 융합 단백질-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌 [Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22, 1409-1414 (2004); Li, H. et al., Nat. Biotech. 24, 210-215 (2006)] 참조).
글리코실화 융합 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들면, US 5,959,177 호, US 6,040,498 호, US 6,420,548 호, US 7,125,978 호 및 US 6,417,429 호(유전자전이 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES, 상표) 기술 기재) 참조).
척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 태아 신장 세포주(예를 들면, 문헌 [Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36, 59-74 (1977)]에 보고된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌 [Mather, J.P., Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방암 세포(MMT 060562); 예를 들면, 문헌 [Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 DHFR_ CHO 세포[Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)]를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 및 골수종 세포주, 예를 들면, Y0, NS0 및Sp2/0가 포함된다. 융합 단백질 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Yazaki, P.J. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조하시오.
C. 약학 제형
본원에 보고된 바와 같은 약학 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 융합 단백질을 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A.(ed.) (1980)]) 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산, 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제, 방부제(예를 들면, 옥타데실 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸), 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드, 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린, 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리 비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신, 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA, 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨, 염-생성 상대-이온, 예를 들면, 나트륨, 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체), 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체로는 또한 간질성(intersitial) 약물 분산제, 예를 들면, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들면, rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX, 등록상표), 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))이 포함된다. rhuPH20을 포함하여, 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 호 및 US 2006/0104968 호에 기재되어 있다.
한 양태에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제와 혼합된다.
대표적인 동결건조 항체 제형이 US 6,267,958 호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형으로는 US 6,171,586 호 및 WO 2006/044908 호에 기재된 것들이 포함되며, 상기 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분, 바람직하게는 서로에게 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적 활성을 갖는 성분들을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분은 함께 의도한 목적에 효과적인 양으로 적절하게 존재한다.
활성 성분은, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸 셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구(microsphere), 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 융합 단백질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들면, 멸균 여과 부재를 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
D. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서 융합 단백질의 용도를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 B형 간염 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은, 예를 들면, 상기 임의의 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 예를 들면, 하기에 기술하는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질은 단독으로 또는 다른 약제와 함께 치료에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 추가의 치료제와 공-투여될 수 있다.
상기 언급된 상기 병용 요법은 복합 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별도의 제형에 포함된다), 및 별개의 투여를 포함하며, 이 경우 본 발명의 융합 단백질의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다.
본 발명의 융합 단백질(및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내, 및 경우에 따라, 국소 치료를 위해 병변내 투여를 포함하여, 임의의 적합한 수단에 의애 투여될 수 있다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 부분적으로 투여가 단기인지 또는 만성인지 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 일시(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 융합 단백질은 우수한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제형화되고 투약되고 투여된다. 이와 관련하여 고려할 요인들로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 융합 단백질은 문제의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 선택적으로 함께 제형화된다. 상기 다른 약제의 효과량은 제형에 존재하는 융합 단백질의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 동일한 투여 경로하에, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 융합 단백질의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 융합 단백질이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 융합 단백질에 대한 환자의 임상적 병력 및 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 융합 단백질은 환자에게 한번에 또는 일련의 치료과정 동안 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 내지 10 mg/kg)의 융합 단백질이, 예를 들면, 한번 이상의 별도의 투여에 의하든지 또는 연속 주입에 의하든지, 환자에게 투여하기 위한 초기 유망 투여량일 수 있다. 한 전형적인 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상동안 반복 투여하기 위해, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 융합 단백질의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다(예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들면, 약 6개 용량의 항체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 투입 용량에 이어, 하나 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다.
E. 제품
본 발명의 한 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상에 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 용기는 조성물을 단독으로 또는 증상의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택되는 증상을 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기, 및 (b) 추가의 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 태양에서 제품은 또한 조성물이 특정 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 주사용수(WFI), 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3)의 용기를 또한 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 또한 포함할 수 있다.
III . 서열 설명
서열번호 1 B형 간염 바이러스 외피 단백질 아미노산 서열(B형 간염 바이러스 유전자형 C 아형 adr(분리균 일본/A4/1994)(HBV-C))
서열번호 2 B형 간염 바이러스 코어 단백질 아미노산 서열(B형 간염 바이러스 유전자형 C 아형 adr(분리균 일본/A4/1994)(HBV-C))
서열번호 3 성숙 인간 인터페론 α-2a 아미노산 서열
서열번호 4 c18/A2 mAb의 CDR-H1 아미노산 서열
서열번호 5 c18/A2 mAb의 CDR-H2 아미노산 서열
서열번호 6 c18/A2 mAb의 CDR-H3 아미노산 서열
서열번호 7 뮤린 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
서열번호 8 c18/A2 mAb의 CDR-L1 아미노산 서열
서열번호 9 c18/A2 mAb의 CDR-L2 아미노산 서열
서열번호 10 c18/A2 mAb의 CDR-L3 아미노산 서열
서열번호 11 뮤린 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열
서열번호 12 c18/A2 mAb의 키메라성 뮤린-인간 중쇄 아미노산 서열
서열번호 13 C-말단 c18/A2 항체 중쇄 인터페론-α2a 항체 융합의 키메라성 뮤린-인간 아미노산 서열
서열번호 14 c18/A2 mAb의 키메라성 뮤린-인간 경쇄 아미노산 서열
서열번호 15 C-말단 c18/A2 항체 경쇄 인터페론-α2a 항체 융합 단백질의 키메라성 뮤린-인간 아미노산 서열
서열번호 16 인간 Ig 카파 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열
서열번호 17 인간 Ig 람다 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열
서열번호 18 인간 IgG1 불변 영역(백인 알로타입(caucasian allotype)) 아미노산 서열
서열번호 19 인간 IgG1 불변 영역(아프로아메리칸(afroamerican) 알로타입) 아미노산 서열
서열번호 20 인간 IgG1 불변 영역 변이체 아미노산 서열
서열번호 21 인간 IgG4 불변 영역 아미노산 서열
서열번호 22 인간 IgG4 불변 영역 변이체 아미노산 서열
서열번호 23 링커 1 아미노산 서열
서열번호 24 링커 2 아미노산 서열
서열번호 25 링커 3 아미노산 서열
서열번호 26 링커 4 아미노산 서열
서열번호 27 링커 5 아미노산 서열
서열번호 28 링커 6 아미노산 서열
서열번호 29 HBV-외피 유도된 펩티드 단편
서열번호 30 HBV-코어 유도된 펩티드 단편
서열번호 31 HBV-외피 유도된 펩티드 단편
서열번호 32 e183/A2 mAb의 CDR-H1 아미노산 서열
서열번호 33 e183/A2 mAb의 CDR-H2 아미노산 서열
서열번호 34 e183/A2 mAb의 CDR-H3 아미노산 서열
서열번호 35 서열번호 1의 아미노산 잔기 182 내지 190의 HBV 외피 펩티드 단편에 대한 항체의 뮤린 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열
서열번호 36 e183/A2 mAb의 CDR-L1 아미노산 서열
서열번호 37 e183/A2 mAb의 CDR-L2 아미노산 서열
서열번호 38 e183/A2 mAb의 CDR-L3 아미노산 서열
서열번호 39 서열번호 1의 아미노산 잔기 182 내지 190의 HBV 외피 펩티드 단편에 대한 항체의 뮤린 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열
IX . 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적 설명을 고려할 때 다양한 다른 태양들이 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
재료 및 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., vols. 1-3, Public Health Service, NIH Publication No 91-3242 (1991)]에 나와 있다.
항체 쇄들의 아미노산은 EU 번호지정에 따라 번호를 매긴다(문헌 [Edelman, G.M., et al., PNAS 63, 78-85 (1969); Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., vols. 1-3, Public Health Service, NIH Publication No 91-3242 (1991)]).
재조합 DNA 기술
표준 방법을 이용하여 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약은 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
DNA 서열 결정
DNA 서열은 세퀴서브 게엠베하(SequiServe GmbH)(독일 바테르스테텐)에서 수행된 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신 매디슨) 소프트웨어 패키지 변형 10.2 및 인포맥스 벡터 NTI 어드밴스 스윗(Infomax's Vector NTI Advance suite) 변형 8.0을 서열 생성, 지도작성, 분석, 주해 및 예시에 사용하였다.
유전자 합성
마우스 c18/A2 mAb 및 e183/A2 mAb의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 목적하는 유전자 절편을 제네아트 게엠베하(Geneart GmbH)(독일 레겐스부르크)에 의해 제조하였다. 유전자 절편은 하기에 기술하는 바와 같이 발현 구조물 클로닝을 촉진하기 위해 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 측면에 위치하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다.
실시예 1
키메라성 뮤린 -인간 c18 /A2 TCR -유사 항체 인터페론-α2a 융합 단백질에 대한 발현 플라스미드의 제조
성숙 인간 IFN-α2a를 암호화하는 화학적으로 합성된 DNA 단편, 및 2개의 Gly4Ser 반복서열로 이루어진 글리신-세린 링커(중쇄...LSPG--GGGSGGGGS--IFNa2a)를 약간 절두된 인간 감마-1 중쇄 불변 영역(마지막 천연 아미노산 Lys의 제거)을 암호화하는 c18/A2 TCR-유사 항체 중쇄 유전자의 3' 말단에 융합시켜 키메라성 뮤린-인간 c18/A2 TCR-유사 항체 중쇄 인터페론-α2a 융합 유전자를 조립하였다.
키메라성 뮤린 -인간 c18 /A2 TCR -유사 모항체에 대한 발현 플라스미드의 제조
마우스 c18/A2 TCR-유사 mAb 카파 경쇄(VK) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 유전자 절편을 인간 카파 경쇄 불변 영역(CK) 또는 인간 감마-1 중쇄 불변 영역(CH1-힌지-CH2-CH3) 각각에 연결시켰다. 두 항체 모두의 쇄 유전자들을 항체 유전자의 게놈 엑손-인트론 구조를 포함하는 2개의 별도의 발현 플라스미드로부터 발현시켰다.
항체 쇄의 발현은, 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역(UTR), 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열, 및 소 성장 호르몬으로부터의 강한 폴리아데닐화 신호를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)로부터의 단축 인트론 A-결실된 즉시 초기(immediate early) 인핸서 및 프로모터에 의해 조절된다. 발현 플라스미드는 또한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 플라스미드 증폭을 위한 벡터 pUC18로부터의 복제 기점 및 β-락타마제 유전자, 및 안정하게 형질감염된 포유동물 세포주의 제조/선택을 위한 선택적 네오마이신 내성 유전자를 함유한다.
a) 플라스미드 9924
플라스미드 9924는 HEK293 세포에서 키메라성 뮤린-인간 c18/A2 TCR-유사 항체 γ1-중쇄 IFN-α2a 융합 단백질의 일시 발현을 위한 발현 플라스미드(게놈적으로 구성된 발현 카세트; 엑손-인트론 구조)이다.
c18/A2 TCR-유사 항체 γ1-중쇄 IFN-α2a 발현 카세트 이외에, 상기 벡터는 다음을 함유한다:
- 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및
- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 제공하는 베타-락타마제 유전자.
서열번호 13에 나타낸 바와 같은 성숙한 c18/A2 TCR-유사 항체 γ1-중쇄 IFN-α2a 융합 단백질을 암호화하는 c18/A2 TCR-유사 항체 γ1-중쇄 IFN-α2a 융합 유전자에 대한 전사 단위는 하기의 요소들을 포함한다:
- 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역(UTR),
- 신호 서열 인트론을 포함하는 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열(선호 서열 1, 인트론, 신호 서열 2[L1-인트론-L2]),
- 5'-말단에 유일한 BsmI 제한효소 부위(L2 신호 서열) 및 스플라이스 공여 부위 및 3'-말단에 유일한 XhoI 제한효소 부위를 갖도록 정렬된 가변 중쇄 암호화 단편(서열번호 7),
- 마우스 중쇄 인핸서 요소(파트 JH3, JH4)를 포함하는 절두된 마우스/인간 중쇄 하이브리드 인트론 2(예를 들면, 문헌 [Neuberger, M.S., EMBO J. 2, 1373-1378 (1983)] 참조),
- C-말단 Lys를 암호화하는 마지막 코돈이 결실된 게놈 구조에서 인간 γ1-중쇄 유전자 불변 영역,
- 글리신-세린 링커(서열번호 23),
- 성숙한 인간 IFNa2a 유전자(서열번호 3), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH pA) 신호 서열.
중쇄 발현 플라스미드 9924의 플라스미드 지도는 도 2에 나타내었다.
b) 플라스미드 9922
플라스미드 9922는 HEK293 세포에서 키메라성 뮤린-인간 c18/A2 TCR-유사 항체 경쇄의 일시 발현을 위한 발현 플라스미드(게놈적으로 구성된 발현 카세트; 엑손-인트론 구조)이다.
c18/A2 TCR-유사 항체 κ-경쇄 발현 카세트 이외에, 상기 벡터는 다음을 함유한다:
- SV40 프로모터,
- 선택성 마커로서 네오마이신 내성 유전자,
- 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및
- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 제공하는 베타-락타마제 유전자.
서열번호 14에 나타낸 바와 같은 성숙한 c18/A2 TCR-유사 항체 κ-경쇄 단백질을 암호화하는 c18/A2 TCR-유사 항체 κ-경쇄 유전자에 대한 전사 단위는 하기의 요소들을 포함한다:
- 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역(UTR),
- 신호 서열 인트론을 포함하는 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열(선호 서열 1, 인트론, 신호 서열 2[L1-인트론-L2]),
- 5'-말단에 유일한 BsmI 제한효소 부위(L2 신호 서열) 및 스플라이스 공여 부위 및 3'-말단에 유일한 BamHI 제한효소 부위를 갖도록 정렬된 가변 경쇄 암호화 단편(서열번호 11),
- 절두된 인간 카파 경쇄 인트론 2,
- 인간 카파 경쇄 유전자 불변 영역, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH pA) 신호 서열.
경쇄 발현 플라스미드 9922의 플라스미드 지도는 도 3에 나타내었다.
실시예 2
키메라성 뮤린 -인간 e183 /A2 TCR -유사 항체 IFN -α2a 융합 단백질에 대한 발현 플라스미드의 제조
키메라성 뮤린-인간 c18/A2 TCR-유사 항체 중쇄 IFN-α2a 융합 유전자에 대해 기술한 바와 동일한 방법으로 키메라성 뮤린-인간 e183/A2 TCR-L 항체 IFN-α2a 융합 유전자를 조립하여, 발현 플라스미드 9976(항체 중쇄-IFN-α2a 융합 유전자) 및 9977(항체 경쇄 유전자)를 수득하였다.
실시예 3
HEK293 세포에서 면역글로불린-인터페론 알파 융합 단백질의 일시 발현, 정제 및 분석적 특성화
F17 배지(인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.))에서 배양된 HEK293 세포(인간 태아 신장 세포주 293-유래)의 일시적 형질감염에 의해 면역글로불린-인터페론 알파 융합 단백질을 제조하였다. 형질감염을 위해 "293-프리" 형질감염 시약(노바겐(Novagen))을 사용하였다. 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 동몰비의 경쇄 대 중쇄 암호화 플라스미드를 사용하여 2개의 상이한 플라스미드로부터 발현시켰다. 형질감염은 "293-프리" 제조사의 지시에 명시된 바와 같이 수행하였다. 융합 단백질-함유 세포 배양 현탁액을 형질감염 7일 후에 수거하였다. 상등액을 정제시까지 감온에서 저장하였다.
예를 들어, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반 정보는 문헌 [Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75, 197-203 (2001)]에 나와 있다.
항체-함유 배양 상등액을 여과시키고 2 단계의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 0.1M 포스페이트 완충제(pH 7.0)로 평형화시킨 단백질 A 세파로스(등록상표) CL-4B(GE 헬쓰케어)를 사용하여 친화성 크로마토그래피로 항체를 포착하였다. 미결합 단백질을 평형 완충제로 세척하고, 항체를 0.1M 시트레이트 완충제(pH 3.5)로 용출시킨 다음, 즉시 1M 트리스-염기를 사용하여 pH 6.0으로 중화시켰다. 슈퍼덱스(Superdex) 200(등록상표)(GE 헬쓰케어) 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 2차 정제 단계로 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피는 20mM 히스티딘 완충제, 0.14M NaCl(pH 6.0) 중에서 수행하였다. 용출된 항체를 바이오맥스(Biomax)-SK 막(밀리포어(Millipore), 매사추세츠 빌레리카)이 장착된 울트라프리-CL 원심분리 필터를 사용하여 농축시키고 -80 ℃에서 저장하였다.
아미노산 서열을 기준으로 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여, 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정함으로써 항체 및 항체 융합물의 단백질 농도를 측정하였다. 항체 및 항체 융합물의 순도 및 적절한 사량체 형성은 환원제(5mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에 SDS-PAGE를 수행하고 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색시켜 분석하였다. 항체 및 항체 융합물 제제의 응집체 함량은 SK3000SWx1 분석용 크기-배제 컬럼(토소하스(Tosohaas), 독일 스투트가르트)을 사용하여 고성능 SEC에 의해 분석하였다. 감소된 항체 및 항체 융합물 경쇄 및 중쇄의 아미노산 주쇄의 보전성은 펩티드-N-글리코시다제 F(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals))를 사용한 효소 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 나노 일렉트로스프레이(Nano Electrospray) QTQF 질량 분석에 의해 확인하였다.
실시예 4
결합 친화도의 측정
GE 헬쓰케어에서 공급하는 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 4.5에서 CM5 칩 상에서 약 750 공명 단위(RU)의 포착 시스템(인간 IgG에 특이적인 mAb 포착, 잭슨 임뮤노리서치)의 아민 커플링을 수행하였다. HuFc-표지화된 IFNAR2(RnD 시스템즈, 카탈로그 번호 4015-AB)를 5 ㎍/ml의 농도로 포착하였다. 잉여 결합 부위는 huFc 혼합물을 1.25 μM의 농도(바이오디자인, 카탈로그 번호 50175)로 주입하여 차단하였다. 0.1 내지 50 nM 범위의 상이한 농도의 인터페론 또는 인터페론 융합물을 10 ㎕/분의 유량하에 298 K에서 120 내지 240 초동안 유동 셀에 통과시켜 결합 상을 기록하였다. 해리 상은 600 초 이하동안 모니터링하였으며, 샘플 용액으로부터 전기영동 완충액으로 교환시켜 유발시켰다. 표면은 30 ㎕/분의 유량에서 100 mM 인산 용액으로 1 분 세척하여 재생시켰다. 모든 실험을 위해, GE 헬쓰케어에서 공급하는 HBS-P+ 완충제를 선택하였다(10 mM HEPES((4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산)), pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) 계면활성제 P20).
벌크 굴절률 차이는 블랭크-커플링된 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 블랭크 주입도 또한 감한다(= 이중 참조).
ka/kd로 정의된 평형 해리 상수(Kd)는 비아이벨류에이션 4.1 소프트웨어 패키지를 사용하여, 여러 상이한 농도하에 수득된 센소그램 곡선을 분석하여 결정하였다. 데이터 적합화는 적합한 결합 모델을 따랐다.
야생형 IFN α-2a를 위해, 0.1 내지 50 nM의 IFN α-2a를 도 1a)에 도시된 바와 같이 IFNAR2 코팅된 센서 칩 위에 주입하였다. huFc 단편에 C-말단에 융합된 IFN α-2a의 경우, 상기 단백질은 IFNAR2 코팅된 표면위에 0.5 내지 50 nM의 농도로 주입하였다. 2가 결합으로 인해, 복합체 안정성은 IFN α-2a에 대해 35 초로부터 Fc-IFN α-2a 융합물에 대해 23 분으로 증가하였다. 각각, 친화도는 IFN α-2a에 대해 4 nM로부터 0.3 nM의 겉보기 친화도로 증가하였다. 활성을 위해 IFNAR1이 필수적이기 때문에, 상기 분석에 의해 인터페론 신호전달 활성은 없이, 초기 결합만이 처리될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Anti-MHC antibody anti-viral cytokine fusion protein <130> 26948 <140> PCT/EP2011/063362 <141> 2011-08-03 <150> EP10172054.8 <151> 2010-08-05 <150> EP10191498.4 <151> 2010-11-17 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 388 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 1 Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp Gln Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly 50 55 60 Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile 85 90 95 Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser 100 105 110 Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr 115 120 125 Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr 130 135 140 Ile Val Ser Pro Ile Ser Ser 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Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 22 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 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Gly 1 5 10 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 6 <400> 28 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 29 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 30 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 31 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Ser Gly Tyr Asp Val Gly Val Asp Tyr 1 5 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Phe Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Ser Gly Tyr Asp Val Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Ile Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ile Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asp Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (35)

  1. B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체에 특이적으로 결합하는 항체, 및 항-바이러스성 사이토카인을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편이 서열번호 1의 아미노산 잔기 182 내지 190의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 2의 아미노산 잔기 18 내지 27의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체가 B형 간염 바이러스로 감염된 간세포에 특이적으로 결합하는 융합 단백질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-바이러스성 사이토카인이 I형 및/또는 II형 인터페론으로부터 선택되는 융합 단백질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD8 함유 T-세포와 동일한 특이성을 갖는 융합 단백질.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 혈청 B형 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하지 않는 융합 단백질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 단클론성 항체인 융합 단백질.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 융합 단백질.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 B형 간염 바이러스 단백질의 펩티드 단편을 제시하는 인간 주조직적합성 복합체와 결합하는 항체 단편인 융합 단백질.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함하거나, 항체가 (a) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (b) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함하는 융합 단백질.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나, 항체가 (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 융합 단백질.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나, 항체가 (a) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 융합 단백질.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열 또는 그의 인간화 변이체; 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열 또는 그의 인간화 변이체; 또는 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열 및 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열 또는 그의 인간화 변이체; 또는 (ii) 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열 또는 그의 인간화 변이체; 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열 또는 그의 인간화 변이체; 또는 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열 및 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열 또는 그의 인간화 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 서열번호 7 또는 서열번호 35의 VH 서열 또는 그의 인간화 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 서열번호 11 또는 서열번호 39의 VL 서열 또는 그의 인간화 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 또는 2개의 항체 중쇄가 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 또는 2개의 항체 경쇄가 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 또는 2개의 항체 경쇄가 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 전장 인간 IgG1 항체이거나, 절두된(truncated) 인간 감마-1 중쇄 불변 영역을 포함하는 융합 단백질.
  20. 제 1 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산.
  21. 제 16 항 또는 제 18 항에 정의된 항체 쇄를 암호화하는 단리된 핵산.
  22. 제 17 항에 정의된 항체 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  24. 융합 단백질이 제조되도록 제 23 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 융합 단백질의 제조 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    (a) 제 23 항에 따른 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 제공된 세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수함으로써 융합 단백질을 제조하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.
  27. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로 사용하기 위한 융합 단백질.
  28. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    B형 간염 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위한 융합 단백질.
  29. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-바이러스성 사이토카인을 B형 간염 바이러스 감염 간세포에 전달하는데 사용하기 위한 융합 단백질.
  30. 약제의 제조에 있어서, 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 용도.
  31. 제 30 항에 있어서,
    약제가 B형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 것인 용도.
  32. 제 31 항에 있어서,
    B형 간염 바이러스 감염이 만성 B형 간염 바이러스 감염인 용도.
  33. 제 30 항에 있어서,
    약제가 항-바이러스성 사이토카인을 B형 간염 바이러스 감염 간세포에 전달하기 위한 것인 용도.
  34. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 효과량을 개인에게 투여함을 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 개인을 치료하는 방법.
  35. 항-바이러스성 사이토카인을 B형 간염 바이러스 감염 간세포에 전달하기 위해 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 효과량을 개인에게 투여함을 포함하는, 개인에서 B형 간염 바이러스 감염 간세포에 항-바이러스성 사이토카인을 전달하는 방법.
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