KR20130023312A

KR20130023312A - 초기유방암의 예후 예측용 유전자 및 이를 이용한 초기유방암의 예후예측 방법

Info

Publication number: KR20130023312A
Application number: KR1020130009394A
Authority: KR
Inventors: 신영기; 최윤라; 김영덕; 오은설; 김시은
Original assignee: 주식회사 젠큐릭스
Priority date: 2013-01-28
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2013-03-07
Also published as: KR101725985B1

Abstract

본 발명은 암의 예후(prognosis) 예측을 위한 유전자의 선정방법, 선정된 암의 예후예측용 유전자 및 이를 이용한 유방암 환자의 전이 예측용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 초기 유방암의 유전적 특성을 분석함으로써 환자의 예후를 간단한 방법을 통해 높은 신뢰도로 예측함으로써 불필요한 항암치료를 줄일 수 있는 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

초기유방암의 예후 예측용 유전자 및 이를 이용한 초기유방암의 예후예측 방법{Prognostic Genes for Early Breast Cancer and Prognostic Model for Early Breast Cancer Patients}

본 발명은 초기유방암의 예후 예측 유전자의 발굴 및 이를 이용한 초기유방암의 예후예측 방법에 관한 것이다.

인간 유전체정보가 활발하게 활용되면서 암연구는 유전체 수준에서 메카니즘을 밝히는 방향으로 나아가고 있다. 특히 마이크로어레이를 이용하여 수만 개의 유전자의 발현패턴이나 유전자 개수의 증가 혹은 감소에 대한 정보를 바탕으로 거시적인 관점에서 암세포의 특성을 규명할 수 있게 되었다. 이러한 유전체수준의 정보를 분석하는 것은 유기적이고 복잡한 생명현상을 이해하는데 매우 획기적인 방법으로, 앞으로 더욱더 활성화될 것이다. 특히 암과 같은 복합질병(complex disease)의 경우, 소수의 특정유전자에 대한 분석으로는 편협한 결과를 얻기 쉬우며, 암의 발생 및 발달에 대한 큰 행동패턴을 포착하는 것이 중요하기 때문에 유전체 정보 분석이 반드시 필요하다. 이처럼 암 연구에 기본이 되는 대부분의 유전체 정보는 마이크로어레이와 같은 유전체 칩을 이용하여 생성되는데, 수만 개의 유전자에 대한 정보를 한꺼번에 얻을 수 있는 기술은 날로 진화하고 있으며, 고비용의 단점에도 불구하고 마이크로어레이를 이용한 연구 활동이 활발하게 전개되면서 관련정보의 양도 폭발적으로 증가하고 있다. 2000년도 중반부터 이러한 유전체 정보가 수집되어 데이터베이스화되기 시작하였고, 이렇게 수집된 정보를 이용하여 2차, 3차 분석을 수행하는 일은 생명현상 연구의 구심점이 되어가고 있다.

일반적인 발현(expression) 유전자 칩의 경우, 약 2만-3만개의 유전자를 나타내는 수만 개의 probe가 심어져있고, SNP와 같은 정밀한 정보를 측정하는 마이크로어레이는 백만 개 이상의 probe를 가지고 있는 경우도 있다. 이러한 마이크로어레이는 실험법이 비교적 간단하고 표준화가 되어있으며, 대량의 정보를 짧은 시간에 한꺼번에 얻어 매우 효율적이나, 얻어진 결과를 분석하는 일이 핵심이자 어려운 병목지점이 되었다. 기존의 소수의 유전자를 분석하는 것과는 비교가 되지 않는 수만 개의 유전자에 대한 종합적 분석은, 통계적 분석기술뿐 만 아니라 유전체에 대한 해박한 지식이 뒷받침되어야 비로소 유용한 정보를 캐낼 수 있는 것이다. 뿐만 아니라 대량의 정보를 저장하고 분석을 수행할 수 있는 고성능 전산장비도 필요하며, 관련 전산기술 역시 필수이다. 전통적인 생물학적 연구범위와 실험방법에만 익숙한 연구자가 수행하기 어렵기 때문에, 유전체정보가 엄청난 속도로 증가하더라도 이를 유용하게 활용하지 못하고 있는 것이 국내의 현실이다. 북미나 유럽에 비해 부족한 자본과 연구기술력에 대한 국내 사정을 감안한다면, 공개된 유전체 정보를 적극 활용하는 것이야말로 생물정보학에서 선두 지휘해야 할 부분이다. 특히 암에 대한 연구는 가장 활발하게 유전체 분석을 도입해 왔으며, 관련 정보가 상당한 양으로 축적되어 있다.

유방암은 자가진단이 가능하고 자가진단의 중요성이 많이 홍보되면서 초기에 발견되는 경우가 많다. 이러한 초기 유방암 환자들에 대해 수술 후 항암치료의 여부를 결정하기가 어려웠다. 병리학적 관찰로 대략적인 예후를 예측할 수 있으나, 관찰결과에 대한 표준화와 정량화가 어렵고 예후예측에 대한 신뢰성이 낮아, 실제 임상에서는 대부분의 초기 유방암 환자에게 항암치료를 권하고 있다. 항암치료의 특성상 환자가 겪는 고통이 매우 크고 경제적 지출이 요구되는데, 초기 유방암의 경우, 항암치료가 필요하지 않은 환자가 절반 이상일 것으로 추측된다. 따라서, 초기 유방암의 특성을 분석하여 환자의 예후를 예측하여 불필요한 항암치료를 줄인다면, 환자의 삶의 질에 큰 도움이 될 것이다. 마이크로어레이를 이용하여 유방암의 수만 개의 유전자의 발현량에 대한 정보를 한 번에 얻을 수 있게 되면서, 분자수준에서 유방암을 분류하고 암의 발생과 발달에 대한 메커니즘을 밝히고자 하는 연구가 활발하게 수행되고 있다. 초기유방암 환자의 예후를 예측하는 것은 임상에서 중요한 일이고, 마이크로어레이를 이용하여 예후를 예측하는 유전자를 발굴하는 일은 이미 2000년대 초부터 시작되었다. 마이크로어레이를 이용한 연구가 고비용임에도 불구하고, 상당한 수의 유방암조직에 대한 발현 profiles이 생산되었고, 연구자들에게 공개되어왔다. 2002년, 78명의 초기유방암 조직과 10여년 동안 추적된 환자의 생존정보를 분석하여 70개의 예후예측유전자가 발굴된 것을 시작으로 하여, 이후 십여 가지의 예후예측 유전자들이 발표되었고, 그 중 몇 가지는 이미 상용화되어 임상에서 활용되고 있다(1-13). 대표적으로 mammaprint(Agendia)와 Oncotype DX(genomic health)가 있으며 임상에서 현재 활용되고 있지만, 여전히 예후에 대한 하나의 참고 자료로서 사용되는 경우가 많은 실정이다 (2, 7).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 초기 유방암 환자에 대한 항암치료 여부를 결정하기 위하여 유방암의 예후를 예측하는 신뢰도 있는 유전자 진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 초기 유방암 조직으로부터 얻은 마이크로어레이 데이터와 임상정보를 수집, 분석하여 예후와 관련된 유전자를 발굴하고, 이를 이용한 초기유방암환자의 예후예측 모델을 개발하였다.

따라서 본 발명의 목적은 암의 예후(prognosis) 예측을 위한 유전자 선정 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암의 예후예측을 위해 발굴된 유전자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암의 예후(prognosis) 예측을 위한 유전자 선정 방법을 제공한다:

(a) 임상정보를 알고 있는 환자 군으로부터 암 조직을 수집하는 단계;

(b) 상기 환자군 내에서 기준시점이 경과하기 전에 전이가 발생한 환자를 예후가 나쁜 집단으로 분류하고, 기준시점이 경과한 이후에 전이가 발생하지 않은 환자를 예후가 좋은 집단으로 분류하는 단계;

(c) 상기 수집한 암 조직으로부터 유전자의 발현 프로파일을 수집하는 단계;

(d) 상기 예후가 나쁜 집단 및 예후가 좋은 집단 간 발현량의 차이를 보이는 유전자를 선정하는 단계;

(e) 상기 선정된 유전자를 발현패턴에 대한 군집분석을 통하여 발현패턴별로 분류하는 단계;

(f) 상기 발현패턴별로 분류된 유전자 군집에 대한 기능분석을 수행하여 특정한 기능과 유의적인 연관성을 가지는 발현패턴을 선정하는 단계; 및

(g) 상기 선정된 발현패턴에 속하는 유전자들 중, 발현량이 많고 예후가 나쁜 집단 및 예후가 좋은 집단 간 발현량의 차이가 큰 유전자를 선정하는 단계.

본 발명자들은 초기 유방암 환자에 대한 항암치료 여부를 결정하기 위하여 유방암의 예후를 예측하는 신뢰도 있는 유전자 진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 암 조직으로부터 얻은 마이크로어레이 데이터와 임상정보를 수집, 분석하여 예후와 관련된 유전자를 발굴하고, 이를 이용하여 암 환자의 예후예측모델을 개발하였다.

본 명세서에서 용어“예후(prognosis)”는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후의 예측은 특히 초기유방암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 (a) 단계의 상기 임상정보는 암의 전이상태에 대한 정보를 포함한다.

본 명세서에서 용어“전이(metastasis)”는 어떤 종양이 그 원발 부위에서 여러 경로를 따라 다른 신체의 부위에 이식되어 그곳에 정착 및 증식하는 상태를 말한다. 암의 전이여부는 해당 암의 고유의 특성에 의하여 결정될 뿐만 아니라 암의 예후 결정에 있어서 가장 중요한 단서가 되는 사건이므로, 암 환자의 생존과 관련된 가장 중요한 임상정보로 다루어진다. 본 발명에 따르면, 암 조직을 수집한 환자의 전이에 대한 정보를 확보하고 있는 상태에서, 전이여부가 서로 다른 집단 간의 유전자 발현 프로파일의 차이를 분석함으로써 예후 예측의 마커가 되는 유전자를 선정할 수 있다.

본 발명의 (b) 단계에 있어서, 상기 기준시점은 통상적으로 당업계에서 암 환자의 예후 판단의 기준으로 삼는 기간으로서, 발병 후 전이가 발생하기까지의 경과기간을 의미한다. 기준시점은 바람직하게는 발병 후 3-12년이며, 보다 바람직하게는 5-10년이다. 또한 예후가 나쁜 집단으로 분류하기 위한 기준시점과 예후가 좋은 집단으로 분류하기 위한 기준시점은 동일한 기간일 수도 있으며, 상이한 기간일 수도 있다. 가장 바람직하게는, 상기 환자군 내에서 발병 후 5년 이내에 전이가 발생한 환자를 예후가 나쁜 집단으로 분류하고, 발병 후 10 년 이상 전이가 발생하지 않은 환자를 예후가 좋은 집단으로 분류한다.

본 발명의 (c) 단계에 있어서, 용어“발현 프로파일(expression profile)”이란 생체 세포, 조직 또는 기관의 기능에 대한 전반적인 정보를 얻기 위하여 수많은 유전자의 활성을 동시에 측정하는 것을 말한다. 유전자의 활성이란 전사 활성, 번역 활성, 생성된 단백질의 발현량 및 이의 생체 내 활성을 모두 포함한다.

유전자의 발현 프로파일을 수집하는 단계는 예를 들어 마이크로어레이 분석, 멀티플렉스 PCR(multiplex polymerase chain reaction), 정량 RT-PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction), 타일링 어레이(tiling array)를 이용한 전사체(transcriptome) 해석, 쇼트 리드 시퀀싱(short read sequencing)를 이용하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 다양한 방법으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 마이크로어레이 분석에 의하여 실시될 수 있다. 수집된 마이크로어레이 발현 프로파일을 통계적으로 분석하기 위해서, 당업계에서 통상적으로 사용하는 다양한 방법의 표준화방법을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 RMA(Robust Multi-array Average) 표준화(normalization) 방법을 이용한다.

본 발명의 (d) 단계에 있어서, 용어“발현량의 차이”란 상기 분석된 마이크로어레이 발현프로파일을 이용하여 비교한 결과 각 예후집단 간 특정 유전자의 발현정도가 통계적으로 유의하게 (FDR < 0.01) 차이가 나는 것을 말한다.

발현량 차이의 분석은 당업계에서 통상적으로 사용하는 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 SAM(Significant Analysis of Microarray) 분석을 통해서 수행한다.

SAM 분석은 마이크로어레이 분석 알고리듬인 SAM을 이용한 분석으로서, 집단간 발현량의 차이를 T-검정과 유사한 방법으로 계산하고, 발현량의 차이의 유의성을 FDR(false discovery rate, q-값)로 나타낸다. q-값이 작을수록 유전자 발현의 차이가 유의한 것을 뜻한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 유방암이며, 보다 바람직하게는 초기 유방암이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 (b) 단계와 (c) 단계의 사이에 상기 환자군을 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)의 기준 발현량 미만의 환자군 및 기준 발현량 이상의 환자군으로 분류하는 단계를 추가적으로 포함한다.

에스트로겐 수용체의 발현 여부는 유방암 환자를 서브타입으로 분류할 때 가장 보편적으로 사용하는 기준이며, 에스트로겐 수용체의 발현수준이 낮을수록 유방암의 전이 위험도가 높아지는 것으로 알려져 있다. 보통 임상에서는 병리학자에 의한 ER IHC(immuno-histochemistry)의 판독결과에 의해 에스트로겐 수용체 양성(ER+) 혹은 음성(ER-)으로 나눈다. 본 발명에 따르면, 대상 환자군을 에스트로겐 수용체의 발현량에 따라 분류하되, 예후가 나쁜 집단과 예후가 좋은 집단에 대해 각각 에스트로겐 수용체 양성군 및 에스토겐 수용체 음성군으로 분류하여 분석을 수행함으로써 각 예후 집단 간 유의한 차이를 보이는 유전자를 보다 신뢰도 있게 선별할 수 있다.

가장 바람직하게는 본 발명의 에스트로겐 수용체에 대한 타입(ER+ 또는 ER-)을 분류하기 위한 기준 발현량은 수집된 ER IHC(estrogen receptor immuno-histochemistry) 판독결과를 기준으로 ESR 1(estrogen receptor 1) mRNA의 발현량에 대한 ROC(receiver-operating characteristics) 분석을 이용하여 결정한다.

본 명세서에서 용어“군집분석(clustering analysis)”은 분석대상들 간의 구조적인 관계를 확인할 목적으로 이들을 집단(cluster)으로 분류하는 다변량 분석방법을 말한다.

본 발명의 (e) 단계에 있어서, 군집분석은 당업계에서 통상적으로 사용하는 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA)를 통해서 수행된다. PCA 분석은 여러 유전자 변수들의 정보를 선형결합하여 소수의 재조합된 새로운 유전자 변수(super-gene)들을 생성한다. 즉 원자료의 정보의 손실을 적게 하면서 변수의 수를 줄여서 차원을 축소하는 방법이다.

본 명세서에서 용어“기능분석(function analysis)”은 상기 (e) 단계에서 선정된 주성분과 관련이 높은 유전자들에 대한 생물학적 기능을 알아보는 것을 의미한다.

본 발명의 (f) 단계에 있어서, 기능분석은 당업계에서 통상적으로 사용하는 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 GO(Gene Ontology) 분석을 통해서 수행된다.

본 발명의 (g) 단계에 있어서, 예후예측 유전자 선택은 통계적 유의성에 따라 선택할 수 있으며, 바람직하게는 예후 집단간 평균 발현량의 차이 이외에도 선택된 주성분과의 상관성, 평균 발현량, 사분위수 범위를 추가적으로 고려하여 선택한다. 본 발명에서 용어“발현량이 많다”는 상기 선정된 발현패턴에 속하는 유전자 중에서 평균 발현량이 통계적 분석이 용이할 만큼 높은 경우를 가리키며, 바람직하게는 선정된 유전자군 중 발현량이 최상위에 랭크된 유전자 순으로 선정한다. 발명에서 용어“발현량의 차이가 크다”는 상기 선정된 발현패턴에 속하는 유전자 중에서 예후 집단간 평균 발현량의 차이가 실험적 분석이 용이할 만큼 뚜렷한 경우를 가리키며, 바람직하게는 선정된 유전자군 중 예후 집단간 평균 발현량의 차이가 최상위에 랭크된 유전자 순으로 선정한다. 가장 바람직하게는 선정된 유전자군 중 발현량이 최상위에 랭크된 유전자 및 예후 집단간 평균 발현량의 차이가 최상위에 랭크된 유전자 순으로 선정한다.

바람직하게는, 본 발명의 상기 (g)단계 이후에 상기 선정된 예후 예측용 유전자를 이용하여 생존확률에 대한 수학적 모델을 개발하는 단계를 추가적으로 포함시킬 수 있다. 이러한 모델 개발은 선정된 예후예측 유전자들을 변수(covariate)로 하는 생존 회귀분석을 통해 전이가 일어나는데 걸리는 시간과 예후예측 유전자들간의 관계를 수식화함으로써 수행할 수 있다. 다양한 생존모델을 이용하여 환자의 전이 시간과 예후예측 유전자의 관계를 밝힐 수 있으며, 바람직하게는 모수적 생존분석인 가속화 시간고장 모델(AFT)를 이용하여 예후예측모델링을 수행한다. 바람직하게는 선정된 예후예측 유전자를 이용하여 개발한 생존모델을 독립적인 데이터세트에서 검증할 수 있다. 검증 방법은 생존확률과 실제 관찰된 생존확률을 비교할 수 있으며, 또는 생존모델을 이용하여 예후집단(예후가 좋은 집단 또는 예후가 나쁜 집단)을 분류하였을 때 실제로 관찰된 예후집단과 비교함으로써 생존모델의 정확성을 평가할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열 내지 제 9 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 유방암 환자의 전이 위험도 예측용 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 유방암 환자의 전이 위험도 예측용 키트는 본 발명의 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프로브를 이용한 마이크로어레이 또는 본 발명의 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용한 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 키트에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 인간(예컨대, 비만 또는 당뇨 환자)으로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 키트에 있어서, 상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 뉴클레오타이드들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 뉴클레오타이드들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 DM 또는 MS 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 뉴클레오타이드 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 유방암의 전이 위험성이 높은 환자로부터 고발현되고, 본 발명의 서열목록 제 5 서열 내지 제 9 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 5 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현량에 유의적인 차이가 없는 유방암의 전이 위험성이 높은 환자로부터 저발현된다.

본 발명에 따르면, 예후 집단별로 발현량의 차이를 보이는 각 유전자에 대해 기능 분석을 수행한 결과 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열의 뉴클레오타이드는 암세포의 증식에 관여하는 유전자이고, 서열목록 제 5 서열 내지 제 9 서열의 뉴클레오타이드는 면역반응에 관여하는 유전자이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 암의 예후(prognosis) 예측을 위한 유전자의 선정방법, 선정된 암의 예후예측용 유전자 및 이를 이용한 유방암 환자의 전이 예측용 키트를 제공한다.

(b) 본 발명은 초기 유방암의 유전적 특성을 분석함으로써 환자의 예후를 예측하여 불필요한 항암치료를 줄일 수 있는 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1는 예후예측유전자 발굴, 모델 개발 및 검증을 위해 수집된 마이크로어레이 데이터세트에 대한 설명을 나타낸 그림이다.
도 2a는 유방암조직의 마이크로어레이데이터의 큐레이션(curation) 및 전처리(pre-processing)에 의한 표준화 과정을 나타낸 모식도이다. 도 2b는 디스커버리 데이터 세트로부터 예후 예측유전자를 발굴하는 과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 디스커버리 데이터세트에서 전이가 일어난 환자들의 타장기 전이 시간의 분포를 나타낸 그림이다.
도 4a는 예후집단간 발현량의 차이가 유의한 302개의 유전자에 대한 주성분분석 결과이다. 도 4b는 주성분1과 주성분2와 상관관계가 높은 상위 유전자 70개씩에 대한 발현량패턴이다.
도 5a는 주성분1과 상관관계가 높은 상위 유전자 70개에 대한 GO기능분석결과이다. 도 5b는 주성분2와 상관관계가 높은 상위 유전자 70개에 대한 GO기능분석결과이다.
도 6a는 선택된 예후 예측유전자를 이용하여 유방암을 ER+ 와 ER- 로 분류하여 증식과 면역반응의 정도를 비교한 모식도이다. 도 6b는 증식과 면역반응의 정도를 3구간으로 각각 나누었을 때, 증식이 증가할수록, 면역반응이 증가하는 것을 보여주고 있다.
도 7a는 디스커버리 데이터 세트의 생명표를 이용하여 계산한 해저드함수의 모양을 대략적으로 알아본 그림이다. 도 7b는 대수정규분포를 가정하였을 때, 생존확률의 직선성과 평행성을 본 그림이다.
도 8은 예후예측 모델을 3가지 분포에 대해 적합시킨 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 개발된 예후예측모델을 디스커버리데이터 세트에서 검증한 결과이다. 9a는 예후예측모델을 이용한 전체환자의 예후예측지수를 4등분하여 4개의 예후집단으로 분류한 뒤, 각 예후집단의 관찰된 생존확률이 잘 분리되었는지 보는 것이다. 관찰된 생존확률과 예측된 생존확률도 비교하였다. 9b는 전체환자의 관찰된 생존확률과 예후예측모델을 이용하여 예측된 생존확률을 비교한 것이다. 9c는 가장 영향력이 높은 p.mean에 대해 전체 환자를 4개의 집단으로 나눈 뒤 각 집단의 관찰된 생존확률이 예후예측모델을 이용하여 예측된 생존확률과 잘 일치하는 지 알아본 그림이다. 9d는 5년생존률에 대해 관찰된 생존확률과 예측된 생존확률이 얼마나 잘 일치하는지 알아본 그림이다.
도 10은 개발된 예후예측모델을 검증세트 1에서 검증한 결과이다. 디스커버리데이터 세트에서 검증한 방법과 동일하다. 10a는 판별에 대한 검증결과이고, 10b는 전체 관찰된 시간에 대한 교정에 대한 검증결과이다. 10c는 5년 생존률에 대한 교정에 대한 검증결과이다.
도 11은 개발된 예후예측모델을 검증세트 2에서 검증한 결과이다. 디스커버리데이터 세트에서 검증한 방법과 동일하다. 11a는 판별에 대한 검증결과이고, 11b는 전체 관찰된 시간에 대한 교정에 대한 검증결과이다. 11c는 5년 생존률에 대한 교정에 대한 검증결과이다.
도 12는 개발된 예후예측모델을 검증세트 3에서 검증한 결과이다. 디스커버리데이터 세트에서 검증한 방법과 동일하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

초기유방암조직의 발현 프로파일의 수집

초기 유방암 환자의 냉동 암 조직을 이용하여 얻은 발현 프로파일과 임상정보를 공개 데이터베이스인 GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)에서 수집하였다. 총 9개의 독립된 발현 프로파일 세트들은 각각 100개 이상의 샘플로 구성된 비교적 큰 데이터 세트이며 모두 초기유방암환자의 예후와 관련된 연구를 수행하기 위해서 만들어졌다(2, 4, 9, 10, 13, 25, 32, 33). 이중 8개의 데이터 세트는 Affymetrix U133A라는 마이크로어레이 플랫폼으로 만들었고, 나머지 하나만 Agilent Hu25K로 제작하였다. 대부분의 경우 환자의 중요 임상정보(나이, 성별, 암의 크기, 전이상태 및 암의 분화정도)와 생존정보가 함께 수집되어있다. 8개의 Affymetrix U133A로 제작된 데이터 세트들 중에서 6개의 데이터 세트는 생존정보가 외부조직으로의 전이(distant-metastasis free survival)에 대한 것이며, 나머지 2개는 생존기간(overall survival)이였다. Agilent 데이터는 외부조직 전이에 대한 생존정보를 가지고 있었다. 외부조직의 전이가 예후 결정에 있어 가장 결정적인 사건인 점, 외부조직 전이는 암의 고유의 특성에 의해 결정된다는 점, 수집된 데이터에 가장 많은 환자가 외부조직전이에 대한 정보를 가지고 있다는 점을 기반으로 외부조직 전이여부를 기초로 하여 생존분석을 수행하기로 하였다. 수집된 모든 환자의 정보를 비교하여 중복된 186명의 환자의 발현 프로파일을 제거하였고, 총 1,861명의 유일한(unique) 환자들에 대해서 연구를 수행하였다. 동일한 플랫폼(Affymetrix U133A)으로 제작된 7개의 데이터 세트에 대해, 해당하는 모든 환자의 발현 프로파일의 원본파일(.CEL)을 모아서 한꺼번에 표준화를 시켰다. 표준화 방법은 rma(background correction : rma, normalization : quantile, summarization : medianpolish) 방법으로 수행하였다. 표준화 수행시 Manhong Dai 등이 개발한 custom CDF(http://brainarray.mbni.med.umich.edu/Brainarray/) ENTREZG version 13를 이용하였다(34). 표준화를 수행한 후, 각 프로브의 발현량은 디스커버리 데이터 세트 내의 프로브 별 평균값을 뺌으로써 1-색(color) 발현량을 2-색 발현량과 같은 형태로 변환시켰다. 총 8개의 표준화된 데이터세트에서 5개의 데이터세트는 하나로 묶어서 디스커버리 데이터 세트로 사용하였고, 2개는 따로 묶어서 검증(validation) 데이터 세트 1로, 나머지 1개는 검증 데이터 세트 2로 이용하였다. Agilent 데이터 세트도 검증 데이터 세트 3으로 사용하였다.

환자의 예후 및 ER 상태에 대한 정의 설정

환자의 예후와 관련된 유전자를 발굴하기 위해서 수집된 환자를 예후가 좋은 집단과 예후가 나쁜 집단으로 분류하였다. 일반적으로 임상에서는 5년 생존 혹은 전이 정보를 이용하여 분류한다. 즉, 5년 내에 전이가 발생하거나 사망을 할 경우 예후가 나쁘다고 말하고, 5년 이상 전이가 없거나 생존하였을 경우 예후가 좋다고 말한다. 디스커버리 데이터세트의 환자정보를 이용하여 전이가 일어난 환자들의 생존시간의 분포를 알아보았다. 전이가 발생한 환자의 73% 이상이 5년 이내에 전이가 발생하였으며, 10년 이후에 전이가 관찰된 경우는 7% 미만이었다. 이를 바탕으로 디스커버리 데이터세트의 환자 중에서 5년 이내에 전이가 발생한 217명의 환자를‘예후가 나쁜 집단’으로 10년 이상 전이가 발생하지 않은 281명의 환자를‘예후가 좋은 집단’으로 분류하였다. 분류 결과, 예후가 좋은 집단의 생존 시간 중앙값은 2.4년이었고, 예후가 나쁜 집단의 생존 시간 중앙값은 12.9년 이었다. 예후가 나쁜 집단과 좋은 집단을 명확하게 구분함으로써 불확실한 생존정보에 의한 오류를 최소한으로 줄일 수 있었다. 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor, ER)의 발현 여부는 유방암 환자를 서브타입으로 분류할 때 가장 보편적으로 사용하는 기준이다. 보통 임상에서는 병리학자에 의한 ER IHC(immuno-histochemistry)의 판독결과에 의해 ER+ 혹은 ER-로 나눈다. 수집된 디스커버리 데이터 세트에서 200여명의 환자가 ER IHC 정보가 없었고, 디스커버리 데이터 세트를 구성하는 5개의 데이터 세트마다 독립적으로 ER IHC의 결정이 이루어진 점을 고려하여, 환자별 발현 프로파일 내의 ESR1 유전자의 mRNA 발현량을 이용하여 ER 상태를 결정하였다. ER IHC 정보가 있는 환자에 대해, ER IHC 정보와 ESR1 mRNA 발현량을 이용하여 ROC(region of convergence) 분석을 수행하였다. ER IHC 결과와 ESR1 mRNA 발현량을 비교하여 가장 정확도(0.88)가 높은 발현량 지점을 컷 오프로 잡았고, 컷 오프 이상의 발현량을 보이는 경우는 ER+로, 컷 오프 이하의 발현량을 보이는 경우는 ER-로 분류하였다. 디스커버리 데이터 세트에서 864명을 ER+로, 240명을 ER-로 배치하였다.

예후 예측 유전자의 선택

디스커버리 데이터 세트에서 예후가 좋은 집단과 예후가 나쁜 집단을 ER+, ER-의 경우로 나누었다. 예후가 좋은 환자는 총 275명 이였으며, 예후가 나쁜 환자는 218명 이였다. SAM(Significant Analysis of Microarray) 분석을 통해 예후집단 간 발현량이 차이가 나는 유전자를 알아보았다. SAM 분석결과의 q-값을 이용하여 예후가 좋은 집단에서 과발현된 유전자 182개, 예후가 나쁜 집단에서 과발현된 유전자 120개를 선택하였다. 선택된 유전자를 하나로 합친 결과 총 302개의 중복되지 않는 유전자세트가 만들어졌고, 이 유전자들의 발현패턴을 알아보기 위한 군집분석을 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA) 방법을 이용하여 수행하였다. 2개의 주성분을 선택하여 각 주성분에 대해, 관련된 생물학적 기능을 알아보기위하여, 군집별로 GO 기능분석을 수행하였다(표 1 내지 3).

예후가 나쁜집단에서 과발현한 유전자

유전자심벌	유전자 명칭
PRC1	protein regulator of cytokinesis 1
CCNB2	cyclin B2
UBE2C	ubiquitin-conjugating enzyme E2C
CDC20	cell division cycle 20 homolog (S. cerevisiae)
KIF4A	kinesin family member 4A
TOP2A	topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa
RACGAP1	Rac GTPase activating protein 1
ASPM	asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila)
BUB1B	budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (yeast)
CDC45	cell division cycle 45 homolog (S. cerevisiae)
PTTG1	pituitary tumor-transforming 1
CENPF	centromere protein F, 350/400kDa (mitosin)
FOXM1	forkhead box M1
KIF11	kinesin family member 11
BLM	Bloom syndrome, RecQ helicase-like
ZWINT	ZW10 interactor
CDC7	cell division cycle 7 homolog (S. cerevisiae)
KIF20A	kinesin family member 20A
TRIP13	thyroid hormone receptor interactor 13
FANCI	Fanconi anemia, complementation group I
MAD2L1	MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast)
MCM2	minichromosome maintenance complex component 2
RRM2	ribonucleotide reductase M2
NCAPG	non-SMC condensin I complex, subunit G
KIF15	kinesin family member 15
MLF1IP	MLF1 interacting protein
GINS1	GINS complex subunit 1 (Psf1 homolog)
OIP5	Opa interacting protein 5
NUSAP1	nucleolar and spindle associated protein 1
ADM	adrenomedullin
HMMR	hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM)
AURKA	aurora kinase A
CCNA2	cyclin A2
NME1	non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in
DLGAP5	discs, large (Drosophila) homolog-associated protein 5
ZDHHC13	zinc finger, DHHC-type containing 13
HMGB3	high-mobility group box 3
TMED9	transmembrane emp24 protein transport domain containing 9
MT1H	metallothionein 1H
MMP11	matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3)
TTK	TTK protein kinase
ENO2	enolase 2 (gamma, neuronal)
GPR56	G protein-coupled receptor 56
SPAG5	sperm associated antigen 5
PBK	PDZ binding kinase
MMP1	matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase)
MST4	serine/threonine protein kinase MST4
EZH2	enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila)
CDC25B	cell division cycle 25 homolog B (S. pombe)
DSCC1	defective in sister chromatid cohesion 1 homolog (S. cerevisiae)
CDCA8	cell division cycle associated 8
CEP55	centrosomal protein 55kDa
HPSE	heparanase
CENPM	centromere protein M
CDK1	cyclin-dependent kinase 1
EYA2	eyes absent homolog 2 (Drosophila)
TMSB15B	thymosin beta 15B
GGH	gamma-glutamyl hydrolase (conjugase, folylpolygammaglutamyl hydrolase)
PSMD3	proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3
FGD1	FYVE, RhoGEF and PH domain containing 1
ASF1B	ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae)
SPAG16	sperm associated antigen 16
SMC4	structural maintenance of chromosomes 4
C11orf80	chromosome 11 open reading frame 80
LSM1	LSM1 homolog, U6 small nuclear RNA associated (S. cerevisiae)
PMEPA1	prostate transmembrane protein, androgen induced 1
CDKN3	cyclin-dependent kinase inhibitor 3
TOPBP1	topoisomerase (DNA) II binding protein 1
CCT5	chaperonin containing TCP1, subunit 5 (epsilon)
RAD51AP1	RAD51 associated protein 1
GPSM2	G-protein signaling modulator 2
LIG1	ligase I, DNA, ATP-dependent
NMU	neuromedin U
KIAA1199	KIAA1199
DTL	denticleless homolog (Drosophila)
KIF2C	kinesin family member 2C
WDR45L	WDR45-like
SLC16A3	solute carrier family 16, member 3 (monocarboxylic acid transporter 4)
MT1F	metallothionein 1F
C18orf8	chromosome 18 open reading frame 8
STMN1	stathmin 1
HSPA1A	heat shock 70kDa protein 1A
PUS7	pseudouridylate synthase 7 homolog (S. cerevisiae)
GPR172A	G protein-coupled receptor 172A
SCRN1	secernin 1
AURKB	aurora kinase B
GALNT14	UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 14 (GalNAc-T14)
SPP1	secreted phosphoprotein 1
NUP107	nucleoporin 107kDa
C21orf45	chromosome 21 open reading frame 45
CTPS	CTP synthase
GINS2	GINS complex subunit 2 (Psf2 homolog)
CCNE2	cyclin E2
GSDMB	gasdermin B
RIPK4	receptor-interacting serine-threonine kinase 4
TMSB15A	thymosin beta 15a
MYBL1	v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog (avian)-like 1
KIF14	kinesin family member 14
TK1	thymidine kinase 1, soluble
ABCC10	ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 10
CIAPIN1	cytokine induced apoptosis inhibitor 1
TXNRD1	thioredoxin reductase 1
GLDC	glycine dehydrogenase (decarboxylating)
SAP30	Sin3A-associated protein, 30kDa
TYMS	thymidylate synthetase
LLGL2	lethal giant larvae homolog 2 (Drosophila)
EPN3	epsin 3
DONSON	downstream neighbor of SON
NCAPG2	non-SMC condensin II complex, subunit G2
C1orf135	chromosome 1 open reading frame 135
CDCA3	cell division cycle associated 3
MKI67	antigen identified by monoclonal antibody Ki-67
F12	coagulation factor XII (Hageman factor)
ELMO3	engulfment and cell motility 3
TMEM132A	transmembrane protein 132A
SCRIB	scribbled homolog (Drosophila)
EXO1	exonuclease 1
AP3M2	adaptor-related protein complex 3, mu 2 subunit
CYCS	cytochrome c, somatic
NPM3	nucleophosmin/nucleoplasmin 3

예후가 좋은 집단에서 과발현한 유전자

유전자심벌	유전자 명칭
TRBV20-1	T cell receptor beta variable 20-1
CCL19	chemokine (C-C motif) ligand 19
CD52	CD52 molecule
SRGN	serglycin
CD3D	CD3d molecule, delta (CD3-TCR complex)
IGJ	immunoglobulin J polypeptide, linker protein for immunoglobulin alpha and mu polypeptides
HLA-DRA	major histocompatibility complex, class II, DR alpha
LOC91316	glucuronidase, beta/immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 pseudogene
IGF1	insulin-like growth factor 1 (somatomedin C)
CYBRD1	cytochrome b reductase 1
TMC5	transmembrane channel-like 5
ALDH1A1	aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1
OGN	osteoglycin
PDCD4	programmed cell death 4 (neoplastic transformation inhibitor)
FRZB	frizzled-related protein
CX3CR1	chemokine (C-X3-C motif) receptor 1
IGFBP6	insulin-like growth factor binding protein 6
GLA	galactosidase, alpha
LOC96610	BMS1 homolog, ribosome assembly protein (yeast) pseudogene
IGLL3	immunoglobulin lambda-like polypeptide 3
ITPR1	inositol 1,4,5-triphosphate receptor, type 1
SERPINA1	serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 1
EPHX2	epoxide hydrolase 2, cytoplasmic
MFAP4	microfibrillar-associated protein 4
RNASET2	ribonuclease T2
CCNG1	cyclin G1
FBLN5	fibulin 5
SORBS2	sorbin and SH3 domain containing 2
CCBL2	cysteine conjugate-beta lyase 2
BTN3A2	butyrophilin, subfamily 3, member A2
TFAP2B	transcription factor AP-2 beta (activating enhancer binding protein 2 beta)
LTF	lactotransferrin
ITM2A	integral membrane protein 2A
HLA-DPB1	major histocompatibility complex, class II, DP beta 1
HLA-DMA	major histocompatibility complex, class II, DM alpha
RPL3	ribosomal protein L3
LOC100130100	similar to hCG26659
FAM129A	family with sequence similarity 129, member A
ELOVL5	ELOVL family member 5, elongation of long chain fatty acids (FEN1/Elo2, SUR4/Elo3-like, yeast)
GBP2	guanylate binding protein 2, interferon-inducible
RARRES3	retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 3
GOLM1	golgi membrane protein 1
RTN1	reticulon 1
ICAM3	intercellular adhesion molecule 3
LAMA2	laminin, alpha 2
CXCL13	chemokine (C-X-C motif) ligand 13
ZCCHC24	zinc finger, CCHC domain containing 24
CD37	CD37 molecule
VTCN1	V-set domain containing T cell activation inhibitor 1
PYCARD	PYD and CARD domain containing
CORO1A	coronin, actin binding protein, 1A
SH3BGRL	SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like
TPSAB1	tryptase alpha/beta 1
TNFSF10	tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10
ACSF2	acyl-CoA synthetase family member 2
TGFBR2	transforming growth factor, beta receptor II (70/80kDa)
DUSP4	dual specificity phosphatase 4
ARHGDIB	Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta
TMPRSS3	transmembrane protease, serine 3
DCN	decorin
LRIG1	leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1
FMOD	fibromodulin
ZNF423	zinc finger protein 423
SQRDL	sulfide quinone reductase-like (yeast)
TPST2	tyrosylprotein sulfotransferase 2
CD44	CD44 molecule (Indian blood group)
MREG	melanoregulin
GIMAP6	GTPase, IMAP family member 6
GJA1	gap junction protein, alpha 1, 43kDa
IFITM3	interferon induced transmembrane protein 3 (1-8U)
BTG2	BTG family, member 2
PIP	prolactin-induced protein
RPS9	ribosomal protein S9
HLA-DPA1	major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1
IMPDH2	IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2
TNFRSF17	tumor necrosis factor receptor superfamily, member 17
C14orf139	chromosome 14 open reading frame 139
SPRY2	sprouty homolog 2 (Drosophila)
XBP1	X-box binding protein 1
THYN1	thymocyte nuclear protein 1
APOD	apolipoprotein D
C10orf116	chromosome 10 open reading frame 116
VAV3	vav 3 guanine nucleotide exchange factor
FAS	Fas (TNF receptor superfamily, member 6)
MYBPC1	myosin binding protein C, slow type
CFB	complement factor B
TRIM22	tripartite motif-containing 22
ARID5B	AT rich interactive domain 5B (MRF1-like)
PTGDS	prostaglandin D2 synthase 21kDa (brain)
TGFBR3	transforming growth factor, beta receptor III
TNFAIP8	tumor necrosis factor, alpha-induced protein 8
SEMA3C	sema domain, immunoglobulin domain (Ig), short basic domain, secreted, (semaphorin) 3C
TMEM135	transmembrane protein 135
ARHGEF3	Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 3
PTGER4	prostaglandin E receptor 4 (subtype EP4)
ABCA8	ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 8
ICAM2	intercellular adhesion molecule 2
HLA-DQB1	major histocompatibility complex, class II, DQ beta 1
HSPA2	heat shock 70kDa protein 2
CD27	CD27 molecule
ARMCX1	armadillo repeat containing, X-linked 1
POU2AF1	POU class 2 associating factor 1
IGBP1	immunoglobulin (CD79A) binding protein 1
PDE4B	phosphodiesterase 4B, cAMP-specific
ADH1B	alcohol dehydrogenase 1B (class I), beta polypeptide
WLS	wntless homolog (Drosophila)
SUCLG2	succinate-CoA ligase, GDP-forming, beta subunit
PGR	progesterone receptor
STARD13	StAR-related lipid transfer (START) domain containing 13
SORL1	sortilin-related receptor, L(DLR class) A repeats-containing
ATP1B1	ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide
IFT46	intraflagellar transport 46 homolog (Chlamydomonas)
SIK3	SIK family kinase 3
LIPT1	lipoyltransferase 1
OMD	osteomodulin
HBB	hemoglobin, beta
C3	complement component 3
FGL2	fibrinogen-like 2
PECI	peroxisomal D3,D2-enoyl-CoA isomerase
RAC2	ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 (rho family, small GTP binding protein Rac2)
PDZRN3	PDZ domain containing ring finger 3
CXCL12	chemokine (C-X-C motif) ligand 12
DPYD	dihydropyrimidine dehydrogenase
TXNDC15	thioredoxin domain containing 15
STOM	stomatin
EMCN	endomucin
SCGB2A2	secretoglobin, family 2A, member 2
FAM176B	family with sequence similarity 176, member B
HIGD1A	HIG1 hypoxia inducible domain family, member 1A
ACSL5	acyl-CoA synthetase long-chain family member 5
RPS24	ribosomal protein S24
RGS10	regulator of G-protein signaling 10
RAI2	retinoic acid induced 2
CNN3	calponin 3, acidic
FBXW4	F-box and WD repeat domain containing 4
SEPP1	selenoprotein P, plasma, 1
SLC44A4	solute carrier family 44, member 4
MGP	matrix Gla protein
ABCD3	ATP-binding cassette, sub-family D (ALD), member 3
SETBP1	SET binding protein 1
APOBEC3G	apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3G
LCP2	lymphocyte cytosolic protein 2 (SH2 domain containing leukocyte protein of 76kDa)
HLA-DRB1	major histocompatibility complex, class II, DR beta 1
SCUBE2	signal peptide, CUB domain, EGF-like 2
DEPDC6	DEP domain containing 6
RPL15	ribosomal protein L15
SH3BP4	SH3-domain binding protein 4
MSX2	msh homeobox 2
CLU	clusterin
DPT	dermatopontin
ZNF238	zinc finger protein 238
HBP1	HMG-box transcription factor 1
GSTK1	glutathione S-transferase kappa 1
ZBTB16	zinc finger and BTB domain containing 16
CCDC69	coiled-coil domain containing 69
ALDH2	aldehyde dehydrogenase 2 family (mitochondrial)
SLC1A1	solute carrier family 1 (neuronal/epithelial high affinity glutamate transporter, system Xag), member 1
ARMCX2	armadillo repeat containing, X-linked 2
HMGCS2	3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 (mitochondrial)
TSPAN3	tetraspanin 3
FTO	fat mass and obesity associated
PON2	paraoxonase 2
C16orf62	chromosome 16 open reading frame 62
QDPR	quinoid dihydropteridine reductase
LRP2	low density lipoprotein receptor-related protein 2
PSMB8	proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 8 (large multifunctional peptidase 7)
HCLS1	hematopoietic cell-specific Lyn substrate 1
FXYD1	FXYD domain containing ion transport regulator 1
OAT	ornithine aminotransferase
SLC38A1	solute carrier family 38, member 1
MAOA	monoamine oxidase A
LPL	lipoprotein lipase
C10orf57	chromosome 10 open reading frame 57
SPARCL1	SPARC-like 1 (hevin)
ERAP2	endoplasmic reticulum aminopeptidase 2
PDGFRL	platelet-derived growth factor receptor-like
RBP4	retinol binding protein 4, plasma
LRRC17	leucine rich repeat containing 17
LHFP	lipoma HMGIC fusion partner
BLNK	B-cell linker
HBA2	hemoglobin, alpha 2
CST7	cystatin F (leukocystatin)

GO 분석결과 주성분 1은 증식에 집중되어 있고 주성분 2는 면역반응에 집중되어 있는 것으로 나타났다. 증식과 면역반응에 관여하는 2개의 주성분에 속하는 유전자를 대상으로 예후 집단간 발현량이 가장 큰 유전자를 각각 4개와 5개를 선택하였다. 각 유전자세트는 유전자는 증식의 발현패턴을 대표하는 의미에서 p-gene, 면역반응의 발현패턴을 나타내는 i-gene으로 명명하였다.

모수적 생존분석을 이용한 예후예측모델 구성

모수형 생존모델 중 가속화 고장시간모델(accelerated failure time model, AFT)을 이용하여 p-gene과 i-gene의 발현량을 공변수로 하는 회귀분석을 수행하였다. 4개의 p-gene은 환자별로 평균값을 구하여 p.mean으로 변환하였고, 5개의 i-gene도 역시 환자별로 평균값을 구하여 i.mean으로 변환하여 적용하였다. 가속과 고장시간모델은

T _i= T ₀exp(β ₁ χ ₁+β ₂ χ ₂+ … +β _q χ _q )·ε_i (1)

로서 여기서 T _i는 i번째 개체의 생존시간, T ₀는 기저선 생존시간, χ _i 는 공변수의 벡터 (j=1,2, ...,q), β는 대응하는 공변수의 계수이고 ε는 오차이다. 이 모델에서는 공변수가 기저선 생존시간에 상승적인 영향을 미치기 때문에 이것을 자주 이용하는 산업계에서 가속화 고장시간 모델이라고 부른다. 생존시간에 상승적으로 작용하는 효과 Ф=β ₁ χ ₁+β ₂ χ ₂+ … + β _q χ _q 를 가속요인이라고 칭한다. 식(1)의 자연대수를 얻으면

logT _i= logT ₀+β ₁ χ ₁+β ₂ χ ₂+ … + β _q χ _q +ε^* (2)

이 되어 AFT모델은 일반 선형회귀 모델과 동일한 형태를 갖는다. 그러나 종속변수 logT는 정규분포를 하지 않을 뿐더러 생존분석 자료에는 선형회귀 모델에서 용납되지 않는 중도절단예가 존재하기 마련이이서 식(2)를 선형회귀모델과 같이 처리할 수 없다. 식(2)의 ε^*는 일반 선형회귀모델에서 정규분포를 가정하는 것과 달리 데이터세트에 따라 경우마다 분포가 다를 수 있기 때문에 실제적인 통계처리가 번거롭다. 이를 극복하기 위하여 logT ₀와 ε^*를 변형하여 다음과 같이 표현한다.

logT = β ₀+β ₁ χ ₁+β ₂ χ ₂+ … + β _q χ _q +σW (3)

여기서 W는 logT의 분포를 따르며 그 분산은 표준화 분포의 값으로 고정되어 있다. σ는 척도모수로서 상수인데 그 값은 다루는 데이터 세트에 따라 결정된다.

AFT모델을 이용하여 다양한 후보 예후예측모델에 대해, 와이블(weibull) 분포, 대수로지스틱(loglogistic) 분포, 대수정규(lognormal) 분포에 맞추어 보고, 가장 적합한 모델을 선택하였다. AFT모델에 맞출 위험도 분포는 디스커버리 데이터 세트의 생존정보의 세대생명표를 작성하여 얻을 수 있는 해저드함수를 이용하였다. 세대생명표로 얻은 해저드함수는 단봉(unimodal)형태를 보이므로, 와이블, 대수로지스틱, 대수정규 분포가 잘 적합할 것으로 예측되었다. 최종 모델의 선택은 Akaike's information criterion(AIC)과 R square(R²)를 고려하여 선택되었다.

예후예측모델의 검증

선택된 모델에 대한 검증은‘교정(calibration)’과‘판별(discrimination)’에 대해 수행하였다. ‘교정’은 만들어진 예후예측모델을 이용하여 예측된 생존확률과 실제 관찰된 생존확률이 얼마만큼 일치하는지를 알아보는 것이고,‘판별’은 예후 예측모델에 의해 주어진 환자집단을 예후집단으로 분류하였을 때의 분리성을 알아보는 것이다. 여기서 말하는 실제 관찰되는 생존확률은 Kaplan-Meier 법에 의해 구해진 값을 뜻한다. AFT 기반의 예후예측 모델은 환자별 생존확률을 모든 시간대에 대해 구할 수 있다. 모델에 의해 예측된 생존확률과 Kaplan-Meier법에 의한 생존확률을 비교하였다. Kaplan-Meier와 같이 전체 시간에 따른 예측 생존확률을 얻기 위해, 전체 환자들의 생존확률곡선은 0yr-25yrs까지 0.1 단위로 구하여 각 시간별 평균생존확률을 계산하여 구하였다. 전체 생존시간에 대한 생존확률비교와 함께, 5년 생존확률도 비교하였다. 주어진 데이터세트에서 환자들의 5년 생존확률을 예후 예측모델을 이용하여 예측한 생존확률을, 해저드회귀분석인 Hare을 이용하여 계산되는 5년 생존확률을 관측값으로 하여 비교하였다.

‘판별’은 주어진 데이터세트의 모든 환자의 예후예측지수(prognostic index)를 4구간으로 나눈 뒤, 각 구간에 속하는 환자들의 생존확률을 KM 그래프로 비교하였다. 예후예측지수는 생존모델의 종속변수이다. 4개의 예측된 예후집단에 대한 KM 그래프가 분명하게 나뉠수록 판별의 기능이 좋은 모델이다.

디스커버리 데이터세트와 3개의 독립적인 검증 데이터 세트들에 대해 모두‘교정’과‘판별’을 알아보았다.

통계분석에 사용된 중요 R 패키지들은 다음과 같다:

affy : .CEL 파일에 대해 rma 알고리듬을 이용한 전 처리(pre-processing).

samr : 예후집단간 발현량에 차이가 있는 유전자 발굴.

GOstats : 선택된 유전자세트와 관련된 기능을 알아봄.

KMsurv : 디스커버리 데이터 세트의 생존자료를 이용하여 생명표를 작성함.

rma : AFT 모델을 이용하여 예후예측모델의 계수를 추정함. 모델에 대한‘교정’수행.

실험 결과

예후 예측모델을 위한 예후유전자의 선택

초기 유방암 조직의 발현 프로파일로 이루어진 5개의 데이터 세트를 모두 합쳐서 1,104개 샘플의 디스커버리 데이터 세트를 구성하였다. 모든 환자들은 화학치료를 받지 않았고, 거의 대부분 액와절 전이가 전혀 없거나(N0 or N-) 유방암초기 (1기 또는 2기)이다. 이 중, 외부조직 전이에 대한 생존정보를 가지는 1,072명을 대상으로 통계적 분석을 수행하였다. 예후와 관련된 유전자를 찾기 위하여 예후가 좋은 집단(10년이상 전이가 없는 경우)과 예후가 나쁜 집단(5년 이내에 전이가 있는 경우)의 발현 프로파일로 나누어 비교하였다. 예후가 좋은 집단에서 높은 발현량을 보인 182개의 유전자와 예후가 나쁜 집단에서 높은 발현량을 보인 120개의 유전자를 선택하였다(FDR < 0.001).

선택된 302개의 유전자의 발현량에 대해 주성분 분석을 수행하였다. 주성분 1과 주성분 2에 대해 GO 기능분석을 수행하였다. 주성분 1은 매우 뚜렷하게 증식에 관련되어 있었고, 주성분 2는 면역반응과 관련이 강하게 나타났다. 이를 기반으로 주성분 1에 속하는 4개의 유전자를 선택하였고, 주성분 2에 속하는 5개의 유전자를 선택함으로써 2개의 발현패턴을 예후 예측모델에 반영하도록 하였다.

선택된 9개의 유전자들은 예후와 관련이 있을 뿐만 아니라, 예후집단간 발현차이가 가장 큰 유전자들로 선택하였다. 증식을 나타내는 주성분 1에서 선택된 유전자 4개는 p-gene로 면역반응을 나타내는 주성분 2에서 선택된 유전자 5개는 i-genes로 명하였다.

ER+ 유방암과 ER- 유방암의 비교

에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)의 발현유무는 유방암의 발생 및 발달과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 예후와 관련하여 선택된 유전자들이 나타내는 2가지 기능, 즉 증식과 면역반응은 암의 메카니즘에 있어 흥미로운 기능이다. 선택된 16개의 유전자들(p-genes 및 i-genes)을 이용하여 ER- 유방암과 ER+ 유방암을 비교하여 보았다. 각 기능의 강도를 나타내기 위하여 p-genes 과 i-genes는 평균 발현량에 따라 3단계(p1, p2, p3 또는 i1, i2, i3)로 층화하였다. p1은 p-gene의 발현량이 가장 낮은 집단이고 증식이 가장 느릴 것으로 가정하였다. p3는 p-genes의 발현량이 가장 높은 집단이고 증식이 가장 활발하게 일어날 것으로 가정하였다. p2는 중간 발현량을 보이고 중간수준의 증식을 가정하였다. i1은 i-genes가 가장 적게 발현하는 집단이고 약한 면역반응이 있다고 가정하였다. i3는 i-genes가 가장 많이 발현하는 집단이고 매우 강한 면역반응이 있다고 보았다. i2는 중간수준의 발현량과 활동을 보일 것으로 간주하였다.

디스커버리 데이터 세트 내의 1,072 명에 대해 p-gene과 i-gene의 발현량에 따라 분류를 하고 ER 상태별로 각 기능의 강도에 대한 구성을 살펴보았다. ER- 유방암은 ER+ 유방암에 비해 매우 활발히 증식하는 p3 타입의 비율이 매우 높았다. 약 62%의 ER- 유방암이 매우 높은 p-genes 발현량 (p3)을 보인 반면, 18%의 ER+ 유방암만이 높은 p-genes 발현량을 보임으로써, ER- 유방암이 ER+ 유방암보다 훨씬 공격적인 성향을 보인다고 알려진 바와 같았다. 약 35%의 ER+ 유방암이 약한 p-genes (p1)을 보였고, ER-의 경우는 p1의 비율이 9%밖에 되지 않았다. 활발한 면역반응 기능은 ER- 유방암의 또 다른 특징으로서 38% 이상의 ER- 유방암은 i-genes (i3)의 발현량이 매우 높았다. 반면 ER+ 유방암은 21% 정도가 높은 i-genes 발현량을 보였다. ER+와 ER- 모두 증식이 활발해질수록 면역반응 역시 활발해지는 것이 관찰되었지만, ER- 유방암이 면역반응을 더욱 적극적으로 보이는 것으로 나타났다.

이 외에, 유방암의 분화 (grade)정도도 증식과 밀접한 관계가 있는 것으로 나타났다. 분화가 잘 안되어 있는 유방암 (G3)일수록 빠른 증식을 보였고, 분화가 잘된 유방암 (G1)은 대부분 약한 증식을 보였다. 환자의 예후도 증식과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 5년 내에 전이가 일어난 예후가 나쁜 환자의 많은 수가 증식이 빠른 집단에 더 많이 몰려있는 것이 관찰되었다.

종합적으로 ER- 유방암은 증식과 면역반응 모두 ER+ 유방암에 비해 매우 활발하였고, ER의 발현량이 유방암의 발생 및 발달의 메카니즘에 영향을 주는 것으로 추측된다.

예후 예측모델의 확립

디스커버리 데이터 세트의 생존정보와 선택된 p-gene과 i-gene을 이용하여 초기 유방암 환자의 전이에 대한 AFT 예후예측모델을 만들었다. 디스커버리 데이터 세트의 생존정보를 이용하여 1년 단위의 세대생명표를 작성하여 대략적인 위험도를 계산하였다

세대생명표로 얻은 사망확률은 단봉 (unimodal)형태를 보이므로, 와이블, 대수로지스틱, 대수정규 분포가 잘 적합할 것으로 예측되었다. 예후예측모델에 포함될 공변수는 p.mean와 i.mean이다. p.mean 은 4개의 p-genes의 평균값이면, i.mean은 i-genes의 평균값이다.

3개의 모델에 대해 와이블, 대수로지스틱, 대수정규 분포에 대해 적용을 시킨 결과, 대수정규분포와 가장 잘 적합하였다. AIC(Akaike’s information criterion)을 이용하여 최종모델 ③을 선택하였다.

log(T)= -0.689 x p.mean + 0.274 x i.mean + 3.219

위의 추정된 모델에 의하면, p.mean, 즉 증식은 생존시간 (T)과 음의 상관관계(-0.689, p값 = 2.47 x e^-17)를 가지므로 증식이 활발할수록 생존시간은 짧아지게 된다. 반대로, i.mean은 생존시간과 양의 상관관계 (0.274, p값 = 3.69 x e^-11)를 가지는데, 면역반응이 활발할수록 생존시간이 길어지는 것을 뜻한다. 위의 추정된 변수들을 해석하면, 증식이 유방암의 예후에 결정적인 역할을 하며 활발할수록 예후가 나쁜 반면, 면역반응이 빠른 증식에 대한 방어 메커니즘으로 활동하는 것으로 결론지을 수 있다.

예후예측모델의 검증

디스커버리 데이터세트의 1,072명의 초기유방암 환자의 발현 프로파일을 이용하여 만든 예후 예측모델에 대한 검증은‘교정’과‘판별’에 대해 수행되었다. ‘교정’은 모델을 통해 예측된 생존확률이 실제 관찰된 생존확률과 얼마나 비슷한지를 알아보는 것인데, 이때 실제 관찰된 생존확률은 Kaplan-Meier 방법을 이용하여 얻은 생존확률을 말한다. ‘판별’은 모델을 이용하여 환자를 예후집단으로 잘 분류하는가 이다. 두 가지 성능에 대한 검증은 모델을 개발한 디스커버리 데이터세트와 3개의 독립된 검증 데이터세트에 대해 수행하였다.

예후 예측모델을 개발한 디스커버리 데이터 세트에 대해 예후예측지수 (prognostic index, PI)를 4등분하여 4개의 예후집단으로 분류하였다. 예후예측지수에 의해 분류된 4개의 예후그룹에 대해 관찰된 생존확률인 KM 그래프를 이용하여 비교하였다. 그 결과, 4개의 예후그룹이 매우 잘 분류된 것을 볼 수 있었으며, 각 예후집단의 예측된 생존확률과 관찰된 생존확률이 잘 일치하는 것을 볼 수 있다.

KM 생존확률과 예후예측모형에 의해 예측된 생존확률을 그래프를 이용하여 비교하였다. 예후 예측모델은 모든 환자에 대해 모든 시간별 생존확률을 구하기 때문에, KM 생존곡선과 같이 전체 생존시간에 대한 확률곡선을 얻기 위해, 각 환자들의 시간별(0년-25년, 0.1 간격) 평균 생존확률을 이용하여 생존확률그래프를 그렸다. 예측된 생존확률이 KM에 의한 생존확률보다 약간 높게 나오기는 했지만 전체적으로 비슷하였다. 전체 생존시간에 대한 생존확률 비교 외에 5년차 생존확률에 대해서도 비교하였다. 모델에 의한 5년 생존확률도 실제 관찰된 5년 생존확률과 유사하였고 특히 예측된 5년 생존확률이 높을수록 예측확률과 관찰확률이 잘 일치하였다.

보다 객관적인 검증을 위하여 3개의 독립적인 검증 데이터 세트들을 이용하여 예후예측모델을 검증하였다. 첫 번째 검증 데이터 세트는 Affymetrix U133A 플랫폼으로 생성된 2개의 데이터 세트를 합친 것이다. 두 번째 검증 데이터 세트는 Affymetric U133A 플랫폼으로 생성된 데이터로서 모두 tamoxifen을 5년간 복용한 ER+ 환자이다. 세 번째 검증 데이터 세트는 70개의 예후 예측유전자(현재 mammaprint로 상용화)의 발굴 및 검증을 위하여 사용된 데이터세트로 Agilent Hu25K 플랫폼으로 생성되었다. 검증 데이터세트 1과 2의 경우 디스커버리 데이터 세트와 같은 Affymetrix U133A 플랫폼으로 제작된 것으로 디스커버리 데이터 세트와 함께 발현량을 표준화하였다. 검증 데이터 세트 1과 2는 교정과 판별의 성능을 평가하였고, 검증 데이터 세트 3은 발현량 표준화 문제로 판별의 성능만 평가하였다.

검증 데이터세트 1의 경우, 4개의 예후집단이 분명하게 분류되었고, 각 예후집단의 관측된 생존확률과 모델에 의해 예측된 생존확률이 잘 일치하는 편이였다. 전체시간에 대한 예측된 생존확률은 관찰된 KM 그래프와 잘 일치하였고, 5년 생존률의 경우 예측된 생존확률이 약 2% 정도 관찰확률보다 높게 나왔다.

검증 데이터세트 2의 경우, 4개의 예후집단이 분명하게 분류되지는 않았지만, 전체적으로 예측된 생존확률이 높을수록 관찰된 생존확률도 높았다. 전체 생존확률에 대해서도, 예측된 생존확률그래프는 관찰된 KM 그래프와 잘 일치하였다. 5년 생존률의 경우, 예측된 생존확률이 약 2%정도 관찰된 생존확률에 비해 높게 나왔다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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gaggagtttg tcagtataaa gagacagatc atactgtgta tggaagaatt 720 agaccacacc ccagacacaa gctttgaaag agatgtggtg tgtgaagacg aagatgcctt 780 ttgtttgtct ttggagaata ttgcaacact acaaaagttg ctacggcagc tggaaatgca 840 gaaatcacaa aatgaagcag tgtgtgaggg gctgcgtact caaatccgag agctctggga 900 caggttgcaa atacctgaag aagaaagaga agctgtggcc accattatgt ctgggtcaaa 960 ggccaaggtc cggaaagcgc tgcaattaga agtggatcgg ttggaagaac tgaaaatgca 1020 aaacatgaag aaagtgattg aggcaattcg agtggagctg gttcagtact gggaccagtg 1080 cttttatagc caggagcaga gacaagcttt tgcccctttc tgtgctgagg actacacaga 1140 aagtctgctc cagctccacg atgctgagat tgtgcggtta aaaaactact atgaagttca 1200 caaggaactc tttgaaggtg tccagaagtg ggaagaaacc tggaggcttt tcttagagtt 1260 tgagagaaaa gcttcagatc caaatcgatt tacaaaccga ggaggaaatc ttctaaaaga 1320 agaaaaacaa cgagccaagc tccagaaaat gctgcccaag ctggaagaag agttgaaggc 1380 acgaattgaa ttgtgggaac aggaacattc aaaggcattt atggtgaatg ggcagaaatt 1440 catggagtat gtggcagaac aatgggagat gcatcgattg gagaaagaga gagccaagca 1500 ggaaagacaa ctgaagaaca aaaaacagac agagacagag atgctgtatg gcagcgctcc 1560 tcgaacacct agcaagcggc gaggactggc tcccaataca ccgggcaaag cacgtaagct 1620 gaacactacc accatgtcca atgctacggc caatagtagc attcggccta tctttggagg 1680 gacagtctac cactcccccg tgtctcgact tcctccttct ggcagcaagc cagtcgctgc 1740 ttccacctgt tcagggaaga aaacaccccg tactggcagg catggagcca acaaggagaa 1800 cctggagctc aacggcagca tcctgagtgg tgggtaccct ggctcggccc ccctccagcg 1860 caacttcagc attaattctg ttgccagcac ctattctgag tttgcgaagg atccgtccct 1920 ctctgacagt tccactgttg ggcttcagcg agaactttca aaggcttcca aatctgatgc 1980 tacttctgga atcctcaatt caaccaacat ccagtcctga gaagccctga tcagtcaacc 2040 agctgtggct tcctgtgcct agactggacc taattatatg ggggtgactt tagtttttct 2100 tcagcttagg cgtgcttgaa accttggcca ggttccatga ccatgggcct aacttaaaga 2160 tgtgaatgag tgttacagtt gaaagcccat cataggttta gtggtcctag gagacttggt 2220 tttgacttat atacatgaaa agtttatggc aagaagtgca aattttagca tatggggcct 2280 gacttctcta ccacataatt ctacttgctg aagcatgatc aaagcttgtt ttatttcacc 2340 actgtaggaa aatgattgac tatgcccatc cctgggggta attttggcat gtatacctgt 2400 aactagtaat taacatcttt tttgtttagg catgttcaat taatgctgta gctatcatag 2460 ctttgctctt acctgaagcc ttgtccccac cacacaggac agccttcctc ctgaagagaa 2520 tgtctttgtg tgtccgaagt tgagatggcc tgccctactg ccaaagaggt gacaggaagg 2580 ctgggagcag ctttgttaaa ttgtgttcag ttctgttaca cagtgcattg ccctttgttg 2640 ggggtatgca tgtatgaaca cacatgcttg tcggaacgct ttctcggcgt ttgtcccttg 2700 gctctcatct cccccattcc tgtgcctact ttgcctgagt tcttctaccc ccgcagttgc 2760 cagccacatt gggagtctgt ttgttccaat gggttgagct gtctttgtcg tggagatctg 2820 gaactttgca catgtcacta ctggggaggt gttcctgctc tagcttccac gatgaggcgc 2880 cctctttacc tatcctctca atcactactc ttcttgaagc actattattt attcttccgc 2940 tgtctgcctg cagcagtact actgtcaaca tagtgtaaat ggttctcaaa agcttaccag 3000 tgtggacttg gtgttagcca cgctgtttac tcatacagta cgtgtcctgt ttttaaaata 3060 tacaattatt cttaaaaata aattaaaatc tgtatactta catttcaaaa agaaaaaaaa 3120 aaaaaaaa 3128 <210> 2 <211> 823 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aaacgcgggc gggcgggccc 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aatcctggaa caaggctaca gcgtcgaaga tccccagcgc tgcgggctcg gagagcagtc 60 ctaacggcgc ctcgtacgct agtgtcctcc cttttcagtc cgcgtccctc cctgggccgg 120 gctggcactc ttgccttccc cgtccctcat ggcgctgctc cgacgcccga cggtgtccag 180 tgatttggag aatattgaca caggagttaa ttctaaagtt aagagtcatg tgactattag 240 gcgaactgtt ttagaagaaa ttggaaatag agttacaacc agagcagcac aagtagctaa 300 gaaagctcag aacaccaaag ttccagttca acccaccaaa acaacaaatg tcaacaaaca 360 actgaaacct actgcttctg tcaaaccagt acagatggaa aagttggctc caaagggtcc 420 ttctcccaca cctgaggatg tctccatgaa ggaagagaat ctctgccaag ctttttctga 480 tgccttgctc tgcaaaatcg aggacattga taacgaagat tgggagaacc ctcagctctg 540 cagtgactac gttaaggata tctatcagta tctcaggcag ctggaggttt tgcagtccat 600 aaacccacat ttcttagatg gaagagatat aaatggacgc atgcgtgcca tcctagtgga 660 ttggctggta caagtccact ccaagtttag gcttctgcag gagactctgt acatgtgcgt 720 tggcattatg gatcgatttt tacaggttca gccagtttcc cggaagaagc ttcaattagt 780 tgggattact gctctgctct tggcttccaa gtatgaggag atgttttctc caaatattga 840 agactttgtt tacatcacag acaatgctta taccagttcc caaatccgag aaatggaaac 900 tctaattttg aaagaattga aatttgagtt gggtcgaccc ttgccactac acttcttaag 960 gcgagcatca aaagccgggg aggttgatgt tgaacagcac actttagcca agtatttgat 1020 ggagctgact ctcatcgact atgatatggt gcattatcat ccttctaagg tagcagcagc 1080 tgcttcctgc ttgtctcaga aggttctagg acaaggaaaa tggaacttaa agcagcagta 1140 ttacacagga tacacagaga atgaagtatt ggaagtcatg cagcacatgg ccaagaatgt 1200 ggtgaaagta aatgaaaact taactaaatt catcgccatc aagaataagt atgcaagcag 1260 caaactcctg aagatcagca tgatccctca gctgaactca aaagccgtca aagaccttgc 1320 ctccccactg ataggaaggt cctaggctgc cgtgggccct ggggatgtgt gcttcattgt 1380 gccctttttc ttattggttt agaactcttg attttgtaca tagtcctctg gtctatctca 1440 tgaaacctct tctcagacca gttttctaaa catatattga ggaaaaataa agcgattggt 1500 ttttcttaag gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1530 <210> 4 <211> 1697 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gaggcgtaag ccaggcgtgt taaagccggt cggaactgct ccggagggca cgggctccgt 60 aggcaccaac tgcaaggacc cctccccctg cgggcgctcc catggcacag ttcgcgttcg 120 agagtgacct gcactcgctg cttcagctgg atgcacccat ccccaatgca ccccctgcgc 180 gctggcagcg caaagccaag gaagccgcag gcccggcccc ctcacccatg cgggccgcca 240 accgatccca cagcgccggc aggactccgg gccgaactcc tggcaaatcc agttccaagg 300 ttcagaccac tcctagcaaa cctggcggtg accgctatat cccccatcgc agtgctgccc 360 agatggaggt ggccagcttc ctcctgagca aggagaacca gcctgaaaac agccagacgc 420 ccaccaagaa ggaacatcag aaagcctggg ctttgaacct gaacggtttt gatgtagagg 480 aagccaagat ccttcggctc agtggaaaac cacaaaatgc gccagagggt tatcagaaca 540 gactgaaagt actctacagc caaaaggcca ctcctggctc cagccggaag acctgccgtt 600 acattccttc cctgccagac cgtatcctgg atgcgcctga aatccgaaat gactattacc 660 tgaaccttgt ggattggagt tctgggaatg tactggccgt ggcactggac aacagtgtgt 720 acctgtggag tgcaagctct ggtgacatcc tgcagctttt gcaaatggag cagcctgggg 780 aatatatatc ctctgtggcc tggatcaaag agggcaacta cttggctgtg ggcaccagca 840 gtgctgaggt gcagctatgg gatgtgcagc agcagaaacg gcttcgaaat atgaccagtc 900 actctgcccg agtgggctcc ctaagctgga acagctatat cctgtccagt ggttcacgtt 960 ctggccacat ccaccaccat gatgttcggg tagcagaaca ccatgtggcc acactgagtg 1020 gccacagcca ggaagtgtgt gggctgcgct gggccccaga tggacgacat ttggccagtg 1080 gtggtaatga taacttggtc aatgtgtggc ctagtgctcc tggagagggt ggctgggttc 1140 ctctgcagac attcacccag catcaagggg ctgtcaaggc cgtagcatgg tgtccctggc 1200 agtccaatgt cctggcaaca ggagggggca ccagtgatcg acacattcgc atctggaatg 1260 tgtgctctgg ggcctgtctg agtgccgtgg atgcccattc ccaggtgtgc tccatcctct 1320 ggtctcccca ttacaaggag ctcatctcag gccatggctt tgcacagaac cagctagtta 1380 tttggaagta cccaaccatg gccaaggtgg ctgaactcaa aggtcacaca tcccgggtcc 1440 tgagtctgac catgagccca gatggggcca cagtggcatc cgcagcagca gatgagaccc 1500 tgaggctatg gcgctgtttt gagttggacc ctgcgcggcg gcgggagcgg gagaaggcca 1560 gtgcagccaa aagcagcctc atccaccaag gcatccgctg aagaccaacc catcacctca 1620 gttgtttttt atttttctaa taaagtcatg tctcccttca tgtttttttt ttaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaa 1697 <210> 5 <211> 771 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agagaagcag acatcttcta gttcctcccc cactctcctc tttccggtac ctgtgagtca 60 gctaggggag ggcagctctc acccaggctg atagttcggt gacctggctt tatctactgg 120 atgagttccg ctgggagatg gaacatagca cgtttctctc tggcctggta ctggctaccc 180 ttctctcgca agtgagcccc ttcaagatac ctatagagga acttgaggac agagtgtttg 240 tgaattgcaa taccagcatc acatgggtag agggaacggt gggaacactg ctctcagaca 300 ttacaagact ggacctggga aaacgcatcc tggacccacg aggaatatat aggtgtaatg 360 ggacagatat atacaaggac aaagaatcta ccgtgcaagt tcattatcga atgtgccaga 420 gctgtgtgga gctggatcca gccaccgtgg ctggcatcat tgtcactgat gtcattgcca 480 ctctgctcct tgctttggga gtcttctgct ttgctggaca tgagactgga aggctgtctg 540 gggctgccga cacacaagct ctgttgagga atgaccaggt ctatcagccc ctccgagatc 600 gagatgatgc tcagtacagc caccttggag gaaactgggc tcggaacaag tgaacctgag 660 actggtggct tctagaagca gccattacca actgtacctt cccttcttgc tcagccaata 720 aatatatcct ctttcactca gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 771 <210> 6 <211> 1270 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 attttctaaa agggacagag agcaccctgc tacatttcct aatcaagaag ttggcgtgca 60 gctgggagag ctagactaag ttggtcatga tgcagaagct actcaaatgc agtcggcttg 120 tcctggctct tgccctcatc ctggttctgg aatcctcagt tcaaggttat cctacgcgga 180 gagccaggta ccaatgggtg cgctgcaatc cagacagtaa ttctgcaaac tgccttgaag 240 aaaaaggacc aatgttcgaa ctacttccag gtgaatccaa caagatcccc cgtctgagga 300 ctgacctttt tccaaagacg agaatccagg acttgaatcg tatcttccca ctttctgagg 360 actactctgg atcaggcttc ggctccggct ccggctctgg atcaggatct gggagtggct 420 tcctaacgga aatggaacag gattaccaac tagtagacga aagtgatgct ttccatgaca 480 accttaggtc tcttgacagg aatctgccct cagacagcca ggacttgggt caacatggat 540 tagaagagga ttttatgtta taaaagagga ttttcccacc ttgacaccag gcaatgtagt 600 tagcatattt tatgtaccat ggttatatga ttaatcttgg gacaaagaat tttatagaaa 660 tttttaaaca tctgaaaaag aagcttaagt tttatcatcc ttttttttct catgaattct 720 taaaggatta tgctttaatg ctgttatcta ttttattgtt cttgaaaata cctgcatttt 780 ttggtatcat gttcaaccaa catcattatg aaattaatta gattcccatg gccataaaat 840 ggctttaaag aatatatata tatttttaaa gtagcttgag aagcaaattg gcaggtaata 900 tttcatacct aaattaagac tctgacttgg attgtgaatt ataatgatat gccccttttc 960 ttataaaaac aaaaaaaaaa ataatgaaac acagtgaatt tgtagagtgg gggtatttga 1020 catattttac agggtggagt gtactatata ctattacctt tgaatgtgtt tgcagagcta 1080 gtggatgtgt ttgtctacaa gtatgattgc tgttacataa caccccaaat taactcccaa 1140 attaaaacac agttgtgctg tcaatacctc atactgcttt accttttttt cctggatatc 1200 tgtgtatttt caaatgttac tatatattaa agcagaaata taaccaaagg ttaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa 1270 <210> 7 <211> 523 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ctcctggttc aaaagcagct aaaccaaaag aagcctccag acagccctga gatcacctaa 60 aaagctgcta ccaagacagc cacgaagatc ctaccaaaat gaagcgcttc ctcttcctcc 120 tactcaccat cagcctcctg gttatggtac agatacaaac tggactctca ggacaaaacg 180 acaccagcca aaccagcagc ccctcagcat ccagcaacat aagcggaggc attttccttt 240 tcttcgtggc caatgccata atccacctct tctgcttcag ttgaggtgac acgtctcagc 300 cttagccctg tgccccctga aacagctgcc accatcactc gcaagagaat cccctccatc 360 tttgggaggg gttgatgcca gacatcacca ggttgtagaa gttgacaggc agtgccatgg 420 gggcaacagc caaaataggg gggtaatgat gtaggggcca agcagtgccc agctgggggt 480 caataaagtt acccttgtac ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 523 <210> 8 <211> 684 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cattcccagc ctcacatcac tcacaccttg catttcaccc ctgcatccca gtcgccctgc 60 agcctcacac agatcctgca cacacccaga cagctggcgc tcacacattc accgttggcc 120 tgcctctgtt caccctccat ggccctgcta ctggccctca gcctgctggt tctctggact 180 tccccagccc caactctgag tggcaccaat gatgctgaag actgctgcct gtctgtgacc 240 cagaaaccca tccctgggta catcgtgagg aacttccact accttctcat caaggatggc 300 tgcagggtgc ctgctgtagt gttcaccaca ctgaggggcc gccagctctg tgcaccccca 360 gaccagccct gggtagaacg catcatccag agactgcaga ggacctcagc caagatgaag 420 cgccgcagca gttaacctat gaccgtgcag agggagcccg gagtccgagt caagcattgt 480 gaattattac ctaacctggg gaaccgagga ccagaaggaa ggaccaggct tccagctcct 540 ctgcaccaga cctgaccagc caggacaggg cctggggtgt gtgtgagtgt gagtgtgagc 600 gagagggtga gtgtggtcag agtaaagctg ctccaccccc agattgcaat gctaccaata 660 aagccgcctg gtgtttacaa ctaa 684 <210> 9 <211> 293 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ggtgctgtcg tctctcaaca tccgagctgg gttatctgta agagtggaac ctctgtgaag 60 atcgagtgcc gttccctgga ctttcaggcc acaactatgt tttggtatcg tcagttcccg 120 aaacagagtc tcatgctgat ggcaacttcc aatgagggct ccaaggccac atacgagcaa 180 ggcgtcgaga aggacaagtt tctcatcaac catgcaagcc tgaccttgtc cactctgaca 240 gtgaccagtg cccatcctga agacagcagc ttctacatct gcagtgctag aga 293

Claims

다음의 단계를 포함하는 암의 예후(prognosis) 예측을 위한 유전자 선정 방법:
(a) 임상정보를 알고 있는 환자 군으로부터 암 조직을 수집하는 단계;
(b) 상기 환자군 내에서 기준시점이 경과하기 전에 전이가 발생한 환자를 예후가 나쁜 집단으로 분류하고, 기준시점이 경과한 이후에 전이가 발생하지 않은 환자를 예후가 좋은 집단으로 분류하는 단계;
(c) 상기 수집한 암 조직으로부터 유전자의 발현 프로파일을 수집하는 단계;
(d) 상기 예후가 나쁜 집단 및 예후가 좋은 집단 간 발현량의 차이를 보이는 유전자를 선정하는 단계;
(e) 상기 선정된 유전자를 발현패턴에 대한 군집분석을 통하여 발현패턴별로 분류하는 단계;
(f) 상기 발현패턴별로 분류된 유전자 군집에 대한 기능분석을 수행하여 특정한 기능과 유의적인 연관성을 가지는 발현패턴을 선정하는 단계; 및
(g) 상기 선정된 발현패턴에 속하는 유전자들 중, 발현량이 많고 예후가 나쁜 집단 및 예후가 좋은 집단 간 발현량의 차이가 큰 유전자를 선정하는 단계.
제 1 항에 있어서, (a) 단계의 상기 임상정보는 암의 전이상태에 대한 정보를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (d) 단계는 SAM(Significant Analysis of Microarray) 분석을 통해서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, (a) 단계와 (b) 단계의 사이에 상기 환자군을 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)의 기준 발현량 미만의 환자군 및 기준 발현량 이상의 환자군으로 분류하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 에스트로겐 수용체의 기준 발현량은 ER IHC(estrogen receptor immuno-histochemistry) 판독결과 또는 ESR 1(estrogen receptor 1) mRNA의 발현량을 기준으로 한 ROC(receiver-operating characteristics) 분석을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
서열목록 제 1 서열 내지 제 6 서열, 제 8 서열 및 제 9 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 유방암 환자의 전이 위험도 예측용 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 유방암의 전이 위험성이 높은 환자로부터 고발현되고, 상기 서열목록 제 5 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 및 제 9 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현량에 유의적인 차이가 없는 유방암의 전이 위험성이 높은 환자로부터 저발현되는 것을 특징으로 하는 유방암 환자의 전이 위험도 예측용 키트.
서열목록 제 1 서열 내지 제 6 서열, 제 8 서열 및 제 9 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편을 포함하는 유방암 환자의 전이 위험도 예측용 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 유방암의 전이 위험성이 높은 환자로부터 고발현되고, 상기 서열목록 제 5 서열, 제 6 서열, 제 8 서열 및 제 9 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현량에 유의적인 차이가 없는 유방암의 전이 위험성이 높은 환자로부터 저발현되는 것을 특징으로 하는 조성물.