KR20120135530A - 항체의 농축 방법 및 이의 치료용 생성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약 30℃ 초과와 같은 고온에서의 한외여과, 투석여과 및 2차 한외여과 순서를 포함하는 단백질의 농축 방법을 제공한다. 본 발명은 고도로 농축된 항체 조성물의 제조 방법, 및 고도로 농축된 항체 생성물을 또한 포함한다.
Description
일반적인 용어로, 본 발명은 일반적으로 단백질의 농축 방법, 예컨대 항체 제제의 농축 방법, 이같은 제제를 함유하는 제약 제형, 및 인간 치료법 또는 동물 치료법에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
생물학적 재료의 단리, 정제 및 농축 방법이 공지되어 있고, 예를 들어 크로마토그래피, 한외여과, 및 동결건조가 포함되며, 일반적으로 문헌 [R. Hatti-Kaul et al., "Downstream Processing in Biotechnology," in Basic Biotechnology, Chap. 9, pages 187-211, 2nd ed., Cambridge University Press (2001)]을 참조한다. 인간에게 투여하기 위한 농축된 모노클로날 항체 제제의 제조 방법이 공지되어 있으며, 예를 들어 한외여과가 사용되고 생성된 여액이 재순환되는 미국 특허 6,252,055를 참조한다.
이용가능한 항체 농축 방법과 관련된 일부 난점에는, 예를 들어 낮은 유량, 긴 공정 시간, 넓은 막 면적, 기계적 회수율 및 손실, 조작자-집약적 개입 또는 취급, 낮은 물질 이동 속도, 에너지 비효율성, 및 농축 설비에 대한 유압 제한이 포함된다. 이러한 및 기타 난점들은 높은 전체 제작 비용, 및 궁극적으로 치료용 약물 소비자에게의 더 높은 비용의 원인이 될 수 있다.
고도로 농축된 단백질 제형, 예컨대 액체 항체 제제의 제조를 위한 개선된 방법 및 이의 치료용 생성물이 요구된다.
발명의 개요
일반적인 용어로, 본 발명은 일반적으로 단백질의 농축 방법, 예컨대 항체 제제의 농축 방법, 이같은 제제를 함유하는 제약 제형, 및 인간 치료법 또는 동물 치료법에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
실시양태에서, 본 발명은 고도로 농축된 단백질, 예컨대 항체 제제의 제조 방법; 및 이러한 방법에 의해 제조된 치료용 생성물, 예컨대 치료용 항체 생성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 제1 항체 제제를 1차 한외여과하여 제2 항체 제제를 제공하는 단계; 제2 항체 제제를 투석여과하여 투석여과된 중간 항체 제제를 제공하는 단계; 및 투석여과된 중간 항체 제제를 2차 한외여과하여 제3 항체 제제를 제공하는 단계를 포함하는 단백질의 농축 방법으로, 1차 한외여과, 2차 한외여과 및 투석여과 중 1가지 이상이 고온, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 50℃에서 수행되는 방법을 제공한다.
본 발명은, 실시양태에서, 제1 단백질 혼합물을 1차 한외여과하여 제2 단백질 혼합물을 제공하는 단계; 제2 단백질 혼합물을 투석여과하여 투석여과된 단백질 혼합물을 제공하는 단계; 및 투석여과된 단백질 혼합물을 2차 한외여과하여 제3 단백질 혼합물을 제공하는 단계를 포함하는 단백질의 농축 방법으로, 1차 한외여과, 투석여과 및 2차 한외여과 중 1가지 이상이 예를 들어 약 45℃에서 수행되는 방법을 제공한다.
본 발명은, 실시양태에서, 상기 방법들에 의해 제조된 고도로 농축된 항체 조성물을 또한 제공한다.
도 1은 본 발명의 실시양태에서 정제용(preparative) 공정을 수행하기 위한 장치를 도해한다.
도 2 내지 17은 본 발명의 실시양태에서 공정의 다양한 단계 또는 모드에 걸친 다양한 관측 또는 측정된 공정 값들을 도해한다.
도 18 및 19는 본 발명의 실시양태에서 생성물 품질에 대한 고온의 효과를 도해한다.
도 20 및 21은 본 발명의 실시양태에서 미생물부하(bioburden) 제어에 대한 고온의 효과를 도해한다.
도 22는 본 발명의 실시양태에서 공정 유량 및 공정 시간에 대한 고온의 효과를 도해한다.
도 23 내지 25는 본 발명의 실시양태에서 규모가 증진된 공정의 다양한 단계 또는 모드에 걸친 다양한 관측 또는 측정된 공정 값들을 도해한다.
도 2 내지 17은 본 발명의 실시양태에서 공정의 다양한 단계 또는 모드에 걸친 다양한 관측 또는 측정된 공정 값들을 도해한다.
도 18 및 19는 본 발명의 실시양태에서 생성물 품질에 대한 고온의 효과를 도해한다.
도 20 및 21은 본 발명의 실시양태에서 미생물부하(bioburden) 제어에 대한 고온의 효과를 도해한다.
도 22는 본 발명의 실시양태에서 공정 유량 및 공정 시간에 대한 고온의 효과를 도해한다.
도 23 내지 25는 본 발명의 실시양태에서 규모가 증진된 공정의 다양한 단계 또는 모드에 걸친 다양한 관측 또는 측정된 공정 값들을 도해한다.
본 발명의 다양한 실시양태가 도면 (존재하는 경우)을 참조로 상세하게 기술될 것이다. 다양한 실시양태에 대한 참조는 본 발명의 범주를 제한하지 않고, 이는 본원에 첨부된 청구항의 범주에 의해서만 제한된다. 추가적으로, 본 명세서에 기재된 모든 실시예는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 단지 청구된 발명의 많은 가능한 실시양태 중 일부를 기재한다.
달리 기술되지 않는 한, 하기의 것들이 사용된다.
"한외여과하기", "한외여과", "한외여과된", "UF" 등의 용어는, 예를 들어 적합한 물리적 및 화학적 성질을 갖는 합성 반-투과 막을 사용하여, 주로 분자 크기 및 형상을 기초로, 혼합물 내의 분자들을 구별하고, 상이한 분자들의 분리를 수행하거나 또는 유사한 분자들의 농축을 수행하는 것을 지칭한다.
"투석여과하기", "투석여과", "투석여과된", "DF" 등의 용어는, 예를 들어 한외여과막을 사용하여, 단백질, 펩티드, 핵산 또는 기타 생체분자를 함유하는 용액 또는 혼합물로부터 염 또는 용매를 제거하거나, 대체하거나 또는 이의 농도를 저하시키는 것을 지칭한다.
"막횡단 압력(transmembrane pressure)" 또는 "TMP"는 막의 공급물 측면에서 여액 측면으로의 평균 가압을 지칭하고, TMP [bar] = [(PF + PR )％2] - Pf [식중 PF는 공급물 압력이고, PR은 보전물 압력이며, Pf는 여액 압력이다]로 계산된다.
"접면 유동(tangential flow) 여과", "횡류(cross flow) 유동 여과", "TFF" 등의 용어는 압력을 적용함으로써 용질을 함유하는 용액이 접면방식으로 UF 막을 유동하고, 분자량이 더 낮은 염 또는 용질은 통과하는 여과 모드를 지칭한다.
"항체"는 광범위한 의미로 사용되고, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2개 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체), 및 항체 단편이 특히 포함된다. 항체는 특정 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 면역계에 의해 생성된 단백질이다. 구조적인 면에서, 항체는 중쇄 2개 및 경쇄 2개의 4개의 아미노산 사슬로 구성된 Y-형 단백질이다. 이러한 정의에 충분한 단순화된 모델에서, 각각의 항체는 주로 2개의 영역을 갖는다: 가변 영역 및 불변 영역. Y의 팔의 끝쪽에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하여 이와 상호작용한다. 이러한 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하여 이에 결합하는 상보성 결정 영역 (CDR: complementary determining region)을 포함한다. Y의 꼬리 상에 위치한 불변 영역은 면역계에 의해 인식되어 이와 상호작용한다 ([Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York]). 일반적으로 표적 항원은 다중 항체 상의 CDR에 의해 인식되는, 에피토프로 또한 칭해지는 수많은 결합 부위를 갖는다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 한 항원은 1개를 초과하는 상응하는 항체를 가질 수 있다.
기본적인 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 이종사량체성(heterotetrameric) 당단백질이다 (IgM 항체는 J 사슬로 칭해지는 추가적인 폴리펩티드와 함께 기본적인 이종사량체 단위 5개로 구성되는 항체이고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하고, 분비된 IgA 항체는 중합하여 J 사슬과 함께 기본적인 4쇄 단위 2-5개를 포함하는 다가의 조립체(assemblage)를 형성할 수 있다). IgG의 경우에, 4쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 H 사슬에 연결되고, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소형(isotype)에 따라 1개 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적인 간격의 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 여기에 α 및 γ 사슬 각각에 대해서는 3개의 불변 도메인 (CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대해서는 4개의 CH가 이어진다. 각각의 L 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 여기에 불변 도메인 (CL)이 다른쪽 말단에서 이어진다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 첫번째 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL이 함께 쌍을 이루는 것으로 단일 항원-결합 부위가 형성된다. 상이한 클래스의 항체들의 구조 및 성질에 대해서는, 예를 들어 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, D. Stites, A. Terr and T. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6] 참조.
임의의 척추동물 종으로부터의 L 사슬은 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 및 람다로 칭해지는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나로 지정될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 여러 클래스 또는 이소형으로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 5가지 부류가 있다: 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능에서의 비교적 작은 차이를 기초로 서브클래스로 추가로 분류되고, 예를 들어 인간은 하기의 서브클래스를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편의 서열이 항체들 간에서 크게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 아미노산 약 110개 길이에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 길이가 각각 아미노산 9-12개인 "초가변 영역"으로 칭해지는 극도의 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리되는 아미노산 15-30개의 프레임워크(framework) 영역 (FR)으로 칭해지는 비교적 불변성인 신축물로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-시트 배열이 채택된 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른쪽 사슬로부터의 초가변 영역들과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포성 세포 독성 (ADCC: antibody dependent cellular cytotoxicity)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어 VL 내의 대략 캐벗(Kabat) 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 주변, 및 VH 내의 대략 캐벗 잔기 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 주변 ([Kabat et al., 상기 문헌] 참조) 및％또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어 VL 내의 대략 코티아(Chotia) 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 주변 및 VH 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) ([Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 일반적으로 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는, 일반적으로 미량으로 존재하는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하고％하거나 동일한 에피토프(들)에 결합한다. 이같은 모노클로날 항체에는 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체가 전형적으로 포함되고, 이때 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선별하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득되었다. 예를 들어 선별 방법은 다수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀(pool)로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열을, 예를 들어 표적에 대한 친화력 증가, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양에서의 생산 개선, 생체 내에서의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변형시킬 수 있다는 것과 변형된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해하여야 한다. 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 이들이 다른 면역글로불린에 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 (예를 들어 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas, 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전체를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (예를 들어 WO 1998％24893; WO 1996％34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; [Jakobovits, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits, et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann, et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 미국 특허 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; WO 1997/17852; 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks, et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]; [Lonberg, et al., Nature. 368:856-859 (1994)]; [Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild, et al., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)] 참조)이 예를 들어 포함되는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
"키메라" 항체 (면역글로불린)는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 중쇄 및/또는 경쇄 부분을 갖고, 사슬(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 포함된다 (미국 특허 4,816,567; 및 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 사용되는 바와 같은 인간화 항체는 키메라 항체의 부분집합이다.
비-인간 (예를 들어 마우스) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종으로부터의 초가변 영역 (공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 성능 예컨대 결합 친화력을 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은, 비록 FR 영역이 결합 친화력을 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있지만, 인간 면역글로불린 서열의 것이다. FR 내의 이러한 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 사슬 내에서 6개 이하, L 사슬 내에서 3개 이하이다. 또한 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 임의로 포함할 것이다. 추가적인 상세사항은 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 참조.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부분, 바람직하게는 무손상 항체의 항원-결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체 (미국 특허 5,641,870, 실시예 2; [Zapata, et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)] 참조); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
항체를 파파인(papain)으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 칭해지는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생성되는데, Fc라는 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 영역 도메인 (VH)과 함께 전체적인 L 사슬, 및 한 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)으로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가이고, 즉 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신으로 처리하면, 2가의 항원-결합 활성을 갖는 디술피드로 연결된 2개의 Fab 단편에 대략 상응하고, 여전히 항원과 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 산출된다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카르복시 말단에 추가적인 몇개의 잔기들을 갖는다는 점에서 Fab 단편과 다르다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 시스테인을 사이에 갖는 Fab' 단편들의 쌍으로서 본래 생산되었다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 유지되는 양쪽 H 사슬의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 또한 이 영역은 특정 세포 유형 상에서 발견된 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 지닌 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 영역 가변 도메인이 단단한 비공유결합으로 결합되어 있는 이량체로 구성된다. 이러한 두 도메인의 폴딩으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항원 결합 특이성을 항체에 부여하는 6개의 초가변 루프 (H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 생성된다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변성 영역만을 포함한 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화력이지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로 또한 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 개관을 위해서는, [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조.
본 발명의 방법에서 사용된, 조성물 내의 성분의 양, 활성물질의 농도, 완충제 부피, 투석부피(diavolume), 세공 크기, 겉보기 분자량, 분자량 차단(cut-off), 공정 온도, 공정 시간, 수율, 유속, 압력, 미생물부하 등의 값 및 이의 범위를 예를 들어 수식하는 "약"은 농축물 또는 사용된 용액을 제조하기 위해 사용된 전형적인 측정 및 취급 절차에 의해; 이러한 절차에서의 무의식적인 실수에 의해; 조성물의 제조 또는 방법의 수행에 사용된 성분들의 제작, 공급원 또는 순도에서의 차이에 의해; 및 유사한 고려사항에 의해 예를 들어 발생할 수 있는 수적인 양에서의 변화를 지칭한다. 또한 용어 "약"은 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물의 숙성(aging)으로 인해 상이한 양을 포함한다. 또한 용어 "약"은 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물의 혼합 또는 가공으로 인해 상이한 양을 포함한다. 용어 "약"에 의해 수식되는 것의 여부와 상관없이, 청구항은 양에 대한 등가물을 포함한다.
"본질적으로 구성되는"은 청구항에 열거된 단계들 및 성분들에 더하여, 조성물의 기본적이고 신규한 성질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 단계들 및 성분들, 예컨대 완충제 매체 및 단계들의 중복을 포함하는, 농축된 단백질 조성물 또는 항체 조성물을 수득하는 방법을 지칭한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 기본적인 성질에 실질적으로 영향을 미치는 성분은 미생물부하, 예컨대 오염물과 관련된 바람직하지 않은 독성 또는 과민성이 예를 들어 포함되는 바람직하지 않은 특성을 부가한다.
본원에서 사용된 부정 관사 및 이의 상응하는 정관사는 달리 명시되지 않는 한 1개 이상을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명은, 실시양태에서, 상기 언급된 방법들 및 이의 농축된 항체 생성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태에서, 정제용 공정 및 이의 생성물은 고도로 농축된 항체 제제 및 유사한 제제의 제조, 예컨대 천연 또는 합성 공급원으로부터의 단백질 등의 물질의 정제 및 농축에 사용될 수 있고, 이러한 생성물은 병리학적 상태, 예컨대 천식, 암, 건선, 혈관신생 억제 등의 병리학적 상태의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 고도로 농축된 항체 조성물의 제조를 위한 상기 언급된 방법의 실시양태에서, 본 발명의 정제용 방법 및 생성물의 제조 및 사용 방법이 하기에 추가로 예시된다.
본 발명의 실시양태에서, 예를 들어 하기의 단계들을 언급된 순서대로 수행하는 것에 따라, 하기의 단계들을 포함하는 고도로 농축된 항체 조성물을 제조하기 위한 방법이 제공된다:
농도가 예를 들어 약 0.1 내지 약 10 g/ℓ인 제1 항체 제제를 1차 한외여과하여, 항체 농도가 예를 들어 약 10 내지 약 50 g/ℓ로 더 높은 제2 항체 제제를 보전물로서 제공하는 단계;
생성된 제2 항체 제제를 투석여과하여, 생성된 제2 항체 제제 보전물과 농도가 거의 동일한, 투석여과된 중간 항체 제제를 보전물로서 제공하는 단계, 즉 투석여과하여 일정 부피로 완충제 교환을 수행하는 단계; 및
투석여과된 중간 항체 제제를 2차 한외여과하여, 항체 농도가 예를 들어 약 150 내지 약 200 g/ℓ로 더 높은 제3 항체 제제를 보전물로서 제공하는 단계.
본 발명의 제조 방법은, 예를 들어 그리고 본원에 개시 및 설명된 바와 같이, 임의의 생성물 회수 단계(들)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 언급된 방법의 실시양태에서, 1차 한외여과, 투석여과 및 2차 한외여과 중 1가지 이상은, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 7O℃에서 수행될 수 있다. 실시양태에서, 이러한 단계들은, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 50℃에서 또한 수행될 수 있다. 실시양태에서, 이러한 단계들은, 예를 들어 약 35℃ 내지 약 50℃에서 또한 수행될 수 있다. 실시양태에서, 이러한 단계들은, 예를 들어 약 45℃, 예컨대 약 45℃ ± 5℃에서 또한 수행될 수 있다. 항체 제제의 유형에 따라, 약 70℃를 초과하는 온도에서 수행된 공정에 대해, 제제는 열화, 예컨대 변성, 응집 등의 현상의 증상을 나타낼 수 있다. 약 30 내지 약 35℃ 미만의 온도에서 수행된 공정에 대해서는, 유속이 전형적으로 바람직하지 않게 낮고, 공정 시간이 바람직하지 않게 길어, 더 낮은 온도에서의 공정이 효율적인 상업적 제조에 대해 덜 매력적이도록 한다.
실시양태에서, 제1 항체 제제의 항체 농도는, 예를 들어 약 0.1 내지 약 100 g/ℓ일 수 있다. 항체 농도는, 예를 들어 기타 예비 단백질 또는 항체 정제 단계 또는 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 크로마토그래피 등의 절차로부터 전형적으로 입수가능한 통상적인 농도이다. 1차 한외여과로부터 수득가능한 생성된 제2 항체 제제의 항체 농도는, 예를 들어 약 10 내지 약 50 g/ℓ, 및, 예를 들어 약 20 내지 약 40 g/ℓ, 예컨대 30 g/ℓ일 수 있다. 중간 항체 제제의 항체 농도에 대한 범위는, 예를 들어 제2 항체 제제를 함유하는 특정 완충제로 달성가능한 샘플 부피 및 샘플 유속과 같은 인자들의 균형에 좌우될 수 있다. 중간 항체 제제의 항체 농도는, 예를 들어 약 25 내지 약 35 g/ℓ일 수 있고, 제3 항체 제제의 항체 농도는, 예를 들어 약 170 내지 약 200 g/ℓ일 수 있다. 실시양태에서, 제3 항체 제제의 항체 농도는, 예를 들어 약 50 내지 약 250 g/ℓ, 예컨대 약 100 내지 약 230 g/ℓ, 및 약 170 내지 약 200 g/ℓ, 예컨대 185 g/ℓ일 수 있다.
본 발명을 이해하는데 있어서, 중간 항체 제제 및 제3 항체 제제가 예를 들어 1차 및 2차 한외여과 농도로부터 생성된 항체 농도에서의 차이, 및 투석여과 완충제 교환으로부터 생성된 현탁 완충제 매체에서의 차이를 제외하고는 동일한 한외여과된 보전물을 포함한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실시양태에서, 표적 단백질 또는 항체 생성물의 조성 변화, 예컨대 분해는, 존재하는 경우, 매우 적다.
통상적인 한외여과 농축 방법은 일반적으로 시간이 더 길고 처리량 비능률이 더 낮을 수 있어, 공정 시간이 수일 내지 수주와 같이 상당히 더 길거나, 상당히 더 적은 부피가 가공되거나, 또는 양쪽 모두이다.
실시양태에서, 본 발명의 단백질 농축 방법은, 예를 들어 약 1 내지 10 시간 동안, 바람직하게는 약 2 내지 5 시간 동안, 더욱 바람직하게는 약 3 시간 동안 수행될 수 있다. 바람직함은 더 높은 유량 처리량 및 더 작은 막 면적을 유리하게 한다.
실시양태에서, 1차 한외여과는, 예를 들어 전체 공정 시간의 약 35％ 동안 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어 전체 공정 시간이 약 3 시간인 본 발명의 농축 및 정제 공정에서, 1차 한외여과는 약 45 분 동안 수행될 수 있다. 실시양태에서, 2차 한외여과는, 예를 들어 전체 공정 시간의 약 15％ 동안 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어 전체 공정 시간이 약 3 시간인 본 발명의 공정에서, 2차 한외여과는 약 15 분 동안 수행될 수 있다. 투석여과는, 예를 들어 전체 공정 시간의 약 50％ 동안 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어 전체 공정 시간이 약 3 시간인 본 발명의 공정에서, 투석여과는 약 90 내지 약 120 분 동안 수행될 수 있다.
실시양태에서, 1차 한외여과 및 2차 한외여과는, 예를 들어 공칭 세공 크기 또는 분자량 차단이 약 5 내지 약 50 킬로달톤인 한외여과막으로 수행될 수 있다. 또다른 적절한 공칭 세공 크기는, 예를 들어 약 10 내지 약 40 킬로달톤이다. 또다른 적절한 공칭 세공 크기 또는 분자량 차단은 약 30 킬로달톤이다.
실시양태에서, 제1 항체 제제는, 예를 들어 겉보기 분자량이 예를 들어 약 100 내지 약 200 킬로달톤인 항체를 함유할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항체 제제가 항-IgE 항체 또는 IgE를 포함하는 경우와 같이, 제1 항체 제제는 겉보기 분자량이 예를 들어 약 150 킬로달톤인 항체를 함유할 수 있고, 예를 들어 미국 특허 6,172,213 (Genentech, Inc.)을 참조한다.
본 발명에서 사용하기에 적절한 기타 항체에는 암 치료용 항체가 포함되고, 일반적으로, 예를 들어 PCT/US02/19592; PCT/US01/20118; PCT/US01/25464; PCT/US01/26626; PCT/US02/28859; PCT/US02/41798; PCT/US02/12206; PCT/US03/11148; PCT/US02/12619; 및 PCT/US02/33050를 참조한다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 또다른 항체에는 인간, 비-인간, 마우스, 하이브리드 및 키메라 형태를 포함하는 항-CD20 항체 등의 항체가 포함된다. 예를 들어 미국 특허 6,582,959 (VEGF) 및 미국 특허 출원 2002/0122797 A1 (인간 VEGF) 참조.
실시양태에서, 본 발명의 범주 내에 포함되는 항체에는 기원 종 또는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스 명칭과 상관없이 하이브리드 및 재조합 항체 (예를 들어 "인간화" 및 "인간" 항체), 뿐만 아니라 항체 단편 (예를 들어 Fab, F(ab')2, 및 Fv)가 포함된다. 미국 특허 4,816,567; [Mage and Lamoyi, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)] 참조.
모노클로날 항체 또한 사용될 수 있고, 예를 들어 [Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628] 및 [Marks, et al. (1991) J. Mol. Biol, 222:581-597]에 기술된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 사슬(들)의 나머지 부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 포함된다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 [Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]). 키메라 항체에는 비-인간 영장류 (예를 들어 구대륙 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화(primitized)" 항체가 포함될 수 있다.
모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원성 부위에 대해 지시된다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체 제제는 이들이 다른 항체에 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 이같은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 가리키며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어 본 발명에서 사용하기 위한 모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법으로 제조할 수 있다. 또다른 공지된 항체 생산 방법은, 예를 들어 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103, Academic Press (1986)]; [Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984)]; [Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)]에 기술되어 있다.
모노클로날 항체 (MAb)를 생산하기 위해 다양한 방법들이 사용되어 왔다. 단일 유형의 항체를 생산하는 클로닝된 세포주를 지칭하는 하이브리도마 기술에서는 마우스, 햄스터, 래트 및 인간을 포함하여 다양한 종의 세포가 사용된다. MAb를 제조하기 위한 또다른 방법에서는 재조합 DNA 기술을 포함하는 유전자 조작이 사용된다. 이러한 기술들로부터 제조된 모노클로날 항체에는, 특히, 키메라 항체 및 인간화 항체가 포함된다. 키메라 항체에서는 1가지를 초과하는 유형의 종으로부터의 DNA 코딩 영역이 조합된다. 예를 들어 키메라 항체의 가변 영역은 마우스로부터, 불변 영역은 인간으로부터 유래될 수 있다. 인간화 항체는, 비록 비-인간 부분을 함유하지만, 주로 인간으로부터 유래된다. 키메라 항체와 유사하게, 인간화 항체는 완전하게 인간형인 불변 영역을 함유할 수 있다. 그러나 키메라 항체와는 다르게, 가변 영역이 부분적으로 인간으로부터 유래될 수 있다. 인간화 항체의 비-인간 합성 부분은 마우스 항체의 CDR로부터 종종 유래된다. 모든 경우에, 이러한 영역은 항체가 특정 항원을 인식하여 이에 결합하도록 하는데 결정적이다.
언급된 바와 같이, 마우스 항체는 항체 기술에서 중요한 역할을 한다. 진단 및 단기 치료법에 유용하지만, 마우스 항체는 해로운 면역원성 응답의 위험을 증가시키지 않으면서 인간에게 장기간 투여될 수 없다. 인간 항-마우스 항체 (HAMA: Human Anti-Mouse Antibody)로 칭해지는 이러한 응답은 인간 면역계가 마우스 항체를 외래물로 인식하고 이를 공격할 때 발생한다. HAMA 응답은 독성 쇼크 또는 심지어는 사망을 야기할 수 있다. 키메라 및 인간화 항체는 투여된 항체의 비-인간 부분을 최소화시킴으로써 HAMA 응답의 가능성을 감소시킨다. 또한, 키메라 및 인간화 항체는 2차 인간 면역 응답, 예컨대 항체 의존성 세포성 세포독성을 활성화시키는 추가적인 이점을 갖는다.
"무손상" 항체는 항원-결합 가변 영역, 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 무손상 항체는 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하는 "이펙터 기능"을 1가지 이상 가질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체 (BCR))의 하향 조절 등이 포함된다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체는 여러 클래스로 지정될 수 있다. 무손상 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 주요 5개 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε,γ 및 μ로 칭해진다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 주지되어 있다.
실시양태에서, 1차 한외여과에서 제1 항체 제제가 농축되어 항체 농도가 약 30 g/ℓ인 제2 항체 제제가 제공되고, 2차 한외여과에 의해 중간 항체 제제 (투석여과로부터 수득됨)가 농축되어 항체 농도가 예를 들어 약 170 내지 약 200 g/ℓ인 제3 항체 제제가 제공된다. 1차 한외여과 및 2차 한외여과는 동일한 한외여과막으로 수행될 수 있고, 원한다면, 동일한 용기 또는 공정 회로 내에서 수행되어, 예를 들어 수율에 대한 취급, 손실, 누수 등의 영향, 효율, 및 경제성을 최소화시킬 수 있다. 1차 한외여과 및 2차 한외여과는 임의의 적절한 한외여과 장치 또는 한외여과막으로 수행될 수 있다. 한외여과 및 투석여과를 수행하기 위한 접면 유동 여과 (TFF: tangential flow filtration) 작업이 가능한 많은 적절한 한외여과 장치 및 한외여과막이 시판되고, 예컨대 Millipore, Pall Corp., Sartorius 등의 판매자들로부터 시판된다. 실시양태에서, 적절한 한외여과막은, 예를 들어 임의의 재생 셀룰로스 복합체일 수 있고, 이러한 복합체는 다른 이용가능한 한외여과막, 예컨대 폴리에테르술폰과 비교하여 단백질 흡착 프로파일이 비교적 낮다.
투석여과 작업에서는 제1 및 제2 항체 제제 내에 존재하는 제1 완충제 조성물이 제3 항체 제제에서 원하는 제2 완충제로 교환된다. 실시양태에서, 제1 완충제는, 예를 들어 수성 염화나트륨 및 트리스(TRIS) 완충제의 혼합물을 포함할 수 있고, 제2 완충제는, 예를 들어 수성 염화히스티딘과 염화아르기닌의 혼합물을 포함할 수 있다. 투석여과로 일정 부피, 또는 일정 농도, 또는 일정 부피와 일정 농도로 완충제 교환이 수행될 수 있다. 실시양태에서, 투석여과로 일정 부피와 일정 농도로 완충제 교환이 수행된다. 투석여과로, 예를 들어 약 5배 내지 약 15배 부피 (즉, 투석부피)의 완충제 교환이 수행될 수 있다. 또한 투석 여과로, 예를 들어 약 8배 부피 (8 투석부피)의 완충제 교환이 수행될 수 있고, 즉 항체 제제를 함유하는 샘플의 8배 부피가 교환될 수 있다. 예를 들어 10 ℓ의 항체 제제가 5배 (투석부피) 또는 50 ℓ 부피의 교환 완충제로 투석여과될 수 있다. 교환 부피 및 바람직한 교환 부피는, 예를 들어 공정 처리량 효율, 생산물 순도, 정부 및 소비자-허용 이용가능성 기준 등의 기준과 같은 인자들의 균형이 고려되고, 예를 들어 제1 항체 제제 내의 완충제 (예를 들어 제1 완충제)의 농도 및 유형 등의 고려사항에 좌우될 수 있다.
바람직하게는 1차 한외여과, 2차 한외여과, 및 투석여과는 한외여과막에 대한 접면 유동 여과 (TFF 모드)로 수행되고, 바람직하게는 한외여과막은 각각의 단계에 대해 동일한 막이다. 최종 풀 (즉, 제3 항체 제제) 내의 생성물의 수율은, 예를 들어 제1 항체 제제 중의 항체 중량을 기준으로 약 70 중량％ 초과, 예컨대 약 80 내지 약 100 중량％일 수 있다. 제3 항체 제제의 수율은, 제1 항체 제제 중의 항체 중량을 기준으로 실시양태에서 약 90 중량％ 초과일 수 있고, 실시양태에서 약 95 중량％ 초과일 수 있으며, 실시양태에서 약 98 중량％ 초과일 수 있다.
1차 한외여과의 재순환 속도는, 예를 들어 약 50 내지 1,000 ㎖/분, 바람직하게는 약 100 내지 1,000 ㎖/분일 수 있다. 재순환 속도는 이용가능한 막 면적에 비례할 수 있고, 예를 들어 5, 20, 200, 1,000 제곱 피트 등의 막 면적으로 점점 더 높은 재순환 속도가 허용된다. 따라서, 적절한 비례 재순환 속도는, 실시양태에서, 예를 들어 약 0.5 ℓ/분/ft2 내지 약 5 ℓ/분/ft2일 수 있다. 한외여과 및 투석여과는, 예를 들어 약 5 내지 약 50 p.s.i.의 막횡단 압력으로 수행될 수 있다. 한외여과 및 투석여과는, 예를 들어 약 10 내지 약 50 p.s.i.의 막횡단 압력으로 수행될 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 더욱 희석된 항체 제형물을 위한, 미생물부하가 최소인, 예를 들어 검출가능 한계 미만인, 예컨대 약 100 CFU/㎖ 미만인 항체 농축물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 항체 조성물은, 예를 들어 농도가 약 100 g/ℓ (㎎/㎖) 이상, 예컨대 약 120 내지 약 170 g/ℓ인 인간에게의 투여를 위한 농축된 모노클로날 항체 제제일 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은, 예를 들어 면역글로불린, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 군; 이의 서브클래스; 이의 재조합체; 이의 단편; 및 임의의 상기 기술된 것들의 혼합물일 수 있다. 바람직한 본 발명의 항체 조성물은 재조합 인간 항-IgE 항체를 포함한다. 본 발명의 항체 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 바람직한 완충제는, 예를 들어 수성 염화히스티딘과 염화아르기닌의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 정제용 공정은 동일한 장치에서 작업자의 개입 없이 또는 작업자의 최소한도의 개입으로, 예를 들어 도 1에 도해된 바와 같이, 수행되는 것이 바람직하다.
다양한 화학적, 물리적, 기계적 또는 비-기계적, 또는 생화학적 방법, 예컨대 분쇄, 초음파처리, 균질화, 효소 소화, 용매 추출, 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법, 및 이들의 조합을 사용하여 제1 항체 제제를 제공하거나 또는 제조할 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 [R. Hatti-Kaul et al., "Downstream Processing in Biotechnology," in Basic Biotechnology, Chap. 9]를 참조한다. 원한다면, 예를 들어 나노여과 (예를 들어 2가 이온을 제거하기 위해), 역삼투압 (예를 들어 1가 이온을 제거하기 위해) 등의 액체 정제 방법을 사용하여, 제3 항체 제제를 추가로 가공할 수 있다. 본 발명의 제3 항체 제제를 포장하거나, 보관하거나, 또는 직접 사용할 수 있다. 원한다면, 예를 들어 추가적인 농축 단계, 예컨대 건조, 동결건조, 동결건조-재구성 등의 방법을 사용하여 제3 항체 제제를 추가로 가공할 수 있다. 원한다면, 생성된 농축된 제3 항체 생성물을 적절한 액체로 추후에 재구성시킬 수 있다.
도면들을 참조로 하면, 도 1에는 주요 공급원 및 보전물 저장소로 작용하는 재순환 탱크 (120)와 통신하는, UF-DF 막 (115)이 있는 TFF 한외여과-투석여과 (UF-DF) 유닛 (110)이 있는 한외여과-투석여과 시스템 (100)을 포함하는 정제용 공정을 수행하기 위한 본 발명의 실시양태에서의 장치가 도해된다. 실시양태에서, 탱크 (120)에, 예를 들어 단열 재킷 (125), 자동온도조절 또는 온도 제어 가열 요소 (126), 예컨대 가변저항기 저항성 히터 요소 또는 히터 (제시되지 않음)를 포함하는 순환형 가열 액체 시스템, 유동 조절기 (127), 예컨대 재순환 펌프, 및 적절한 열 전달 유체, 예컨대 물, 글리콜 또는 이의 혼합물을 포함하는 온도 제어 시스템이 있을 수 있다. 모든 회로내 성분 또는 회로내 유동 또는 프로세싱에 기여하는 성분, 예컨대 파이프, 밸브, 펌프, 탱크 등의 성분은 온도 규격에 걸쳐 정밀한 제어를 유지하기 위해서 및 필터 챔버 (110)와 재순환 탱크 (120) 내의 또는 이들 사이의 재순환 유체 루프 내의 온도 탈선을 방지하기 위해서 임의로 단열될 수 있거나 또는 외부 가열에 대해 임의로 개조될 수 있다. 실시양태에서, 예를 들어 시스템 (100)에서 1차 한외여과 또는 1차 한외여과가, 예컨대 공급-뱃치(fed-batch) 모드로 수행되는 경우, 재순환 공급물 탱크 (120)와 유체에 의해 통신되고 재순환 탱크 (120)으로부터 고갈된 액체 상을 채우거나, 보급하거나, 또는 보충하는데 예를 들어 사용될 수 있는 선택적인 공급물 탱크 (128)를 시스템이 포함할 수 있다.
펌프 (130)은 공급물 액체를 탱크 (120)으로부터 UF/DF 유닛 (110)을 지나도록 펌핑하고, 그 후, 생성된 보전물 (공급물 액체의 여과되지 않거나 막에서 차단된 부분)을 재순환 탱크 (120)으로 재순환시킨다. 제2 탱크 (140)는 완충제를 보유하고, 일정 부피 투석여과 동안 임의로 완충제를 주요 회로 (110-120 루프) 내로 펌핑한다 (펌프는 제시되지 않음). 예를 들어 주요 회로 내로 도입되는 완충제의 첨가 속도 및 부피는 여액이 막 (115)을 통과하여 주요 회로를 떠나는 속도 및 부피와 동일한 것이 바람직하다. 완충제 탱크 (140)는 임의로 재킷 (143)으로 단열될 수 있고, 상기 언급된 가열 요소 및 재순환 펌프 (제시되지 않음)의 등가물을 포함할 수 있다. 선택적인 불활성 기체 공급원 (145), 예컨대 질소, 또는 기타 압축 기체 공급원이 예를 들어 생성물 회수, 보전물 복원 가압, 산소 차단, 플러싱(flushing), 세정, 막 통합성 테스트 등의 작업을 위해 사용될 수 있다. 제3 탱크 (160)는 유닛 (110)에서 나온 여액을 수집 및 회수하기 위해 사용된다. 밸브 (150, 170)를 적절하게 사용하여 시스템 내의 방향 및 임의로 액체 유속을 조절할 수 있다. 모든 밸브 및 펌프는 수동으로, 코디네이션된 컴퓨터 제어에 의해, 또는 양쪽 모두에 의해 작동될 수 있다. 예를 들어 선택적인 모니터링 장비 (180), 예컨대 광학 밀도 측정기, 선택적인 필터(들) (185) 예컨대 가드(guard) 필터, 생성물 필터 등의 선택적인 서브시스템이 장착된 경우, 선택적인 제4 탱크 (190) 및 출구 스트림(stream)은 보조적인 폐기물-플러시, 생성물 회수, 또는 모니터링 시스템을 제공할 수 있다. 실시양태에서, 주요 유체 회로 (110-120 루프)에 인-라인(in-line) 모니터링 시스템이 장착될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 농축된 항체 제제는 근육내 (IMIG) 또는 정맥내 (IVIG) 투여를 위한 면역글로불린 생성물을 포함하는 인간 치료용 투여에 사용될 수 있다. 본 발명의 농축된 항체 제제는 안정화제, 예를 들어 완충제가 첨가된 아미노산 염 용액, 단순당 등의 안정화제, 적절한 이온 킬레이터, 예컨대 EDTA 또는 시트레이트 이온, 및 이들의 배합물을 포함할 수 있고, 예를 들어 [Wang, Y.-C. J. et al., "Parenteral formulations of proteins and peptides: stability and stabilizers," J. Parenteral Sd. Technol, 42, Suppl. S3-S26 (1988)]을 참조한다. JP01268646A의 더웬트(Derwent) 요약서 (AN89-359879)에는 상기 출원에 농도가 0.1 ㎍/㎖ 내지 100 ㎎/㎖인 IgG3 모노클로날 항체의 주사용 제제가 기술되어 있다는 것이 보고되어 있다. 이러한 간행물들에 개시된 내용은 본 발명의 범주 밖인 것으로 여겨진다.
본 발명에 따른 제제에는 응집물이 실질적으로 없을 수 있다. 응집된 오염물의 허용가능한 수준은, 예를 들어 약 5 중량％ 미만일 수 있고, 이상적으로는 2 중량％ 미만일 수 있다. 0.2 중량％ 정도로 낮은 수준이 달성될 수 있지만, 약 1 중량％의 응집된 오염물이 전형적이다. 또한 실시양태에서의 제제에는 폴리클로날 제형을 안정화시키기 위해 전형적으로 사용되는 부형제, 예를 들어 글리신 및/또는 말토스가 바람직하게 없을 수 있다.
본 발명은 제제 내의 항체가 재조합 항체이고 항체의 농도가 100 ㎎/㎖ 이상, 바람직하게는 150 ㎎/㎖ 이상일 수 있는 것을 특징으로 하는 인간에게 투여하기 위한 모노클로날 항체 제제를 제공할 수 있다. 바람직하게는 제제는 임의의 단백질 응집물이 실질적으로 없는 형태이다.
본 발명의 제약 제형의 pH는 특정 투여 경로에 좌우될 것이다. 그러나, 농축된 용액 내의 항체의 용해도를 최대화시키기 위해, 용액의 pH는 항체의 등전점 (pI)의 pH와 상이하여야 한다.
본 발명의 실시양태에서, 모노클로날 제제가 인간 치료법에서의 사용에 대해 구현될 수 있다. 암 또는 감염성 질환, 예를 들어 상기 언급된 것들, 및 면역 기능장애 예컨대 중증 혈관염이 포함되는 T-세포-매개 장애, 류머티스성 관절염, 전신성 루푸스, 또한 자가면역 장애 예컨대 다발성 경화증, 이식편 대 숙주 질환, 건선, 연소성 발병 당뇨병, 쇼그렌 질환, 갑상선 질환, 중증근무력증, 이식 거부, 염증성 장 질환, 천식, IgE 매개 장애 등의 장애 또는 상태, 또는 이들의 조합과 같은 다양한 인간 장애가 치료될 수 있다.
따라서 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 농축된 모노클로날 항체 제제의 임의의 상기 언급된 장애 등의 장애의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 용도를 실시양태에서 제공한다. 개인에게 치료적 유효량의 본 발명에 따른 제제를 투여하는 것을 포함하는, 임의의 이같은 장애를 앓고 있는 인간의 치료 방법이 또한 제공된다. 이같은 항체 제제의 투여량은 치료될 상태 및 치료 수용자에 따라 다를 것이지만, 예를 들어 매일 또는 1주일에 한번씩 1 내지 30일의 기간 동안 성인 환자에게 약 50 내지 약 2,000 ㎎, 바람직하게는 약 100 내지 약 1,000 ㎎의 범위로 투여될 수 있고, 필요하다면 반복될 수 있다. 용량은 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
공정 기술. 전형적으로 제형 단계에서 이온 교환 크로마토그래피로부터 예를 들어 생성된 정제된 벌크(bulk) 약물 물질이 최종 부형제 조성물 및 농축물로 교환된다. 소형 분자 제거 이외에는 전형적으로 이러한 단계에서 정제가 수행되지 않았다. 고수율, 완충제 교환, 및 제형 단계 로버스트니스(robustness)가 강조되었다. TFF (접면 유동 여과)에 의한 제형 동안, 단백질-함유 공급물 용액이 막 시스템을 지나 펌핑되었고, 재생 (재순환) 용기로 되돌려졌다. TFF 막에 단백질이 유지되었고 (보전물의 일부로서), 여액 (또는 투과물)은 압력에 의해 막을 통과하여 구동되었다. 압력은 막횡단 압력 (TMP)으로 칭해지고, 보전물 압력 제어 밸브를 사용하여 전형적으로 제어된다. 일련의 1차 한외여과 (농축), 투석여과 (일정 부피 완충제 교환), 및 2차 한외여과 (추가적인 농축)에 의해 공정이 일반적으로 수행되었다. 공정 완충제 성분을 제거하는데 필요한 투석부피의 수 (부피 당량)는 실험적으로 쉽게 결정하거나 계산할 수 있다.
일반적으로 항- IgE 을 위한 UF / DF 공정. 크로마토그래피로부터의 음이온 교환 풀의 pH를 0.5 M 수성 인산을 사용하여 약 6의 pH로 조정하였다. pH가 조정된 음이온-교환 풀을 공칭 분자량 차단이 10,000 - 30,000 달톤인 막을 사용하여 본 발명의 한외여과/투석여과 (UF/DF) 방법에 의해 제형하였다. 프로세싱 전에, UF 막을 투석여과 완충제 (0.02 M 히스티딘, 0.2 M 아르기닌-HCl, pH 6)로 평형화시켰다.
그 후, 음이온 교환으로부터의 생성물 (음이온-교환 풀)을 시스템 상에 로딩하고, 1차 한외여과에 의해 중간 농축물로 농축시켰다. 그 후, 풀을 이의 제형 (0.02 M 히스티딘, 0.2 M 아르기닌-HCl, pH 6)으로 투석여과하였다 (8× 또는 투석부피). 그 후, 2차 한외여과에 의해 풀을 170g/ℓ를 초과하는 최종 벌크 농도로 농축하고, 0.22 ㎛ 무균 필터로 회수하였다. 전체 UF/DF 공정은 약 45℃의 온도 설정점에서 수행하였다. 이러한 온도 제어는 도입되는 음이온-교환 풀의 온도 제어, 투석여과 완충제, 및 본원에 설명된 바와 같은 UF/DF 공정용 재킷형 재순환 용기를 사용하여 수행하였다.
UF/DF 후, 회수된 풀을 0.02 M 히스티딘, 0.2 M 아르기닌-HCl, 0.04％ 폴리소르베이트-20, pH 6 내의 약 150 g/ℓ의 벌크 농도로 희석 (즉, 컨디셔닝)하였다 (최종 제형). 컨디셔닝 단계 동안, 벌크의 온도가 주위 온도로 돌아오도록 하였다. 컨디셔닝 후, 제형된 벌크를 다시 0.22 ㎛ 무균 필터로 회수하였다.
UF/DF 시스템은 0.1 N 수산화나트륨으로 재생될 수 있고, 1.4％ Minncare®로 위생처리될 수 있다. 사용되지 않을 때, 시스템을 0.1N 수성 수산화나트륨 내에서 보관할 수 있다. 조작 기간 사이에 UF/DF 막을, 예를 들어 0.1％ Roccal®/20％ 글리세롤-물 용액 내에서 보관할 수 있다.
일반적인
한외여과
/
투석여과
공정 절차
작업 파라미터: 0.5 ℓ/분/ft2의 유속. 일정한 보전물 압력 (예를 들어 10 psig) 제어를 세정 및 사용전 평형화에 사용하였고, C벽, 일정 보전물 압력 또는 일정 TMP를 프로세싱에 사용하였다.
사용전 평형화: 하기의 준비들을 세정된 펠리콘(Pellicon)-2 카셋트 막 상에서 사용 전에 달성하여, 막이 적당하게 평형화된 것을 확실하게 하였다.
공정 사용: 선행 분리 단계, 예를 들어 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 수득된 생성된 초기 음이온-교환 풀 (Q-풀) 상에서 하기를 수행하였다:
약 5 g/ℓ 내지 투석여과용 농도 (CDF)의 농도로의 1차 한외여과 (UF1);
DF 완충제로의 4 투석여과 부피 (DV)로의 투석여과 (DF1);
4 투석여과 부피 (DV)의 DF 완충제로의 지속적인 투석여과 (DF2);
최종 농도 (C최종)로의 2차 한외여과 (UF2); 및
임의의 생성물 회수.
상기의 단계들은 낮은 dP 재생 (mix)에서, 예를 들어 15 분 동안 전형적으로 수행되었다.
사용 후 세정: 사용 직후 펠리콘-2 카셋트 상에서의 세정에 하기의 표에 제시된 순서 및 조건을 사용하였다.
TFF에서의 작업 모드에 대한 정의.
여액이 개방된 단일 통과 (SPFO: Single Pass with Filtrate Open). 보전물 및 여액이 배수되도록 지시된다. 여액 밸브는 개방된다.
여액이 개방된 전체 재생 (TRFO: Total Recycle with Filtrate Open). 보전물 및 여액이 재생 용기로 지시된다. 여액 밸브는 개방된다.
공급-뱃치 한외여과 (FB-UF: Fed-Batch Ultrafiltration). 보전물은 재생 탱크로 지시되고, 여액은 배수되도록 지시되며, 도입되는 풀은 재생 탱크 내로 전달된다.
뱃치 한외여과 (B-UF: Batch Ultrafiltration). 보전물은 재생 탱크로 지시되고, 여액은 배수되도록 지시된다.
투석여과 (DF: Diafiltration). 보전물은 재생 탱크로 지시되고, 여액은 배수되도록 지시되며, 투석여과 완충제는 재생 탱크 내로 전달된다.
dP는 차압을 지칭한다.
생성물 전달. 한외여과막 유닛 및 재생 탱크가 풀 탱크에 대해 개방된다. 질소 오버레이(overlay) 압력이 제어된다. 풀을 먼저 재생 펌프를 사용하여 전달한 후, 수동 연동 펌프를 사용하여 전달한다.
공급물 전달. 도입되는 풀을 재생 탱크 내로 펌핑한다.
여액이 폐쇄된 전체 재생 (TRFC: Total Recycle with Filtrate Closed). 보전물은 재생 용기에 지시된다. 여액 밸브는 폐쇄된다.
"Q-풀"은 완충제로 컨디셔닝된 선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 예를 들어 생성된 단백질 풀을 지칭하고, "컨디셔닝된 풀"로 또한 지칭된다..
WFI는 주사용수를 지칭한다.
<실시예>
하기의 실시예들에서 상기 기술된 본 발명을 사용하는 방식이 더욱 상세하게 기술되고, 본 발명의 다양한 양상을 수행하기 위해 구현된 최상의 모드가 기재된다. 이러한 실시예들이 본 발명의 진정한 범주를 어떠한 방식으로도 제한하지 않고, 설명적인 목적을 위해 제시되는 것으로 이해된다.
실시예
1
rhuMAb E25 의 고농축 제형 파일럿 규모의 UF 시스템을 사용하여 rhuMAb E25 (IgE를 표적으로 하는 재조합 인간 모노클로날 항체, 미국 특허 6,172,213)를 농축/제형하였다. 밀리포어 펠리콘 한외여과/투석여과(Millipore Pelicon Ultrafiltration/Diafiltration) 시스템을 5.7-ft2, 10,000-달톤 재생 셀룰로스 복합체 막과 조립하였다. 시스템은 막 홀더(holder), 워키쇼(Waukeskaw) 모델 6 회전식 로브(lobe) 공급물 펌프, ½" 316L 스테인레스 스틸 재순환 파이핑, 및 재순환 용기로 구성되었다. 압력 지시기/전달기 (Anderson)가 막 홀더의 입구 (공급물), 출구 (보전물) 및 투과물 (여액)에 놓였다. 유동 측정기 (Yokogawa ADMAG)가 막 홀더의 입구 (공급물) 및 투과물 (여액)에 놓였다. 배압 조절 밸브 (Mikroseal)가 막 홀더의 출구에 놓여, 보전물 압력을 제어하고 막횡단 압력 (TMP)을 실행시켰다. 40-ℓ 316L 스테인레스 스틸 재킷형 탱크를 재순환 용기용으로 사용하였다. 이러한 탱크에는 수준 지시기, 상부에 설치된 진탕기 (Lightnin), 볼텍스 파쇄기 및 하부 밸브 (NovAseptic)가 설비되었다. 온도 제어는 탱크의 재킷에 공급되는 온도 조정된 글리콜을 사용하여 수행ㄹ하였다.
이러한 러닝(running) 동안, 공급물 유속은 2.85 ℓ/분 (0.5 ℓ/분/ft2)의 일정 속도로 설정하였다. 모든 사용전 및 사용후 작업 동안, 보전물 압력 제어를 10 psig로 일정하게 설정하였다. 한외여과 및 투석여과 작업 동안, 시스템에서 C벽 제어 계획을 사용하여 막을 지나는 유량을 제어하였고, 예를 들어 [R. van Reis, et al., Constant Cwall Ultrafiltration Process Control, J. of Membrane Science, 130 (1997), 123-140]을 참조한다.
공정 전에, 시스템 보관 용액 (0.1N NaOH)을 단일 통과 배수 모드로 먼저 2 ℓ/ft2 정제수 (PW)로, 그 후 1 ℓ/ft2 투석여과 완충제 (50 mM 히스티딘 / pH 6.0)로 플러싱하였다. 플러싱 후, 0.5 ℓ/ft2 투석여과 완충제를 10분 동안 재순환시킴으로써 시스템을 평형화시켰다. 재순환된 용액의 pH를 점검하여, 평형화를 확인하였다. 그 후, 탱크 내의 수준을 최소한도의 측정가능한 값으로 감소시켜, 도입되는 단백질 풀의 희석을 최소화하였다. 선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 3.2 g E25/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 43.1 ℓ였다. 단백질은 25 mM 트리스 완충제 및 약 200 mM NaCl의 용액 내에 존재하였고, pH는 6.2로 조정되었다. 러닝을 시작하기 위해, 단백질 풀을 재순환 용기로 전달하였다. 용기 내에서, 풀을 상부에 설치된 임펠러(impeller)를 통해 진탕하고, 온도는 주위 온도 (20-25℃)에서 유지시켰다.
공정 동안, 풀이 UF1 모드에서 50 g E25/ℓ로 농축되었다 (약 2.8 ℓ). 투석여과를 시작할 때, 재순환 용기의 온도 설정점을 4O℃로 증가시켰다. 온도 증가 및 제어는 따뜻한 글리콜을 탱크의 외부 재킷에 유동시킴으로써 실행되었다. 그 후, 풀을 8 투석부피의 투석여과 완충제로 투석여과하였다. 투석여과는 일정 부피로 수행되었고, 이는 재순환 탱크 내로 전달되는 완충제 용액의 유속을 시스템으로부터 제거되는 여액의 유속에 맞춤으로써 달성되었다. 투석여과 말기에, 풀을 UF2 모드로 추가로 농축하였다. 이러한 단계 또한 40℃의 고온 설정점을 사용하여 수행하였다. 이러한 최종 농축의 표적은 110 g/ℓ였다. 이는 공급물 유속을 감소시킬 필요 없이 달성되었다. 다음으로, 공급물 채널을 가로질러 5-10 psig 압력 하락이 유지되도록 공급물 펌프를 제어하여, 낮은 압력 하락 혼합을 수행하였다. 재순환 탱크로부터 샘플을 풀링(pulling)하였고, 약 120 g/ℓ의 최종 벌크 농도가 측정되었다. 표 1에 UF1, DF (DF1+DF2), 및 UF2의 처리량 및 유량 결과가 요약된다.
| 공정 단계 | 표준화 처리량 (g/ft2/시) |
표준화 유량 (LMH/psig) |
| UF1 | 13.8 | 4.97 |
| DF | 13.8 | 2.92 |
| UF2 | 181.4 | 1.64 |
도 2는 UF1 (10), DF (20), UF2 (30)를 포함하는 공정의 다양한 단계 또는 모드 동안 공급물 유속 (210), 탱크 온도 (220), 공급 dP (230), TMP (240), 및 여액 유속 (250) 파라미터에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 3은 E25 농도 (310), 유량 (320), 및 TMP (240)에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 4는 37℃에서 UF1 (410) 및 UF2 (420)에 대해 관측된 압력 하락 대 단백질 농도에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
단백질 풀을 일련의 단계에 의해 회수하였다. 먼저, 회전식 로브 공급물 펌프를 사용하여 재순환 탱크 내의 풀을 탱크로부터 0.22 마이크론 멸균 등급 필터인 Millipac 200을 통과하여 펌핑하였다. 다음으로, 재생물 라인 상의 최고점에 적용된 5 psig 질소 기체로 단백질 용액을 파이핑 및 막 유닛으로부터 변위시켰다. 최종 단계는 5 psig 질소 기체를 또한 사용하여 탱크 및 공급물 라인을 송풍시키는 것이었다.
한외여과, 투석여과 또는 회수 단계 중 한가지 이상에서 사용된 고온이 점성 효과를 감소시켰기 때문에 생성물 회수는 주위 온도에서 수행된 비교예 2와 비교하여 개선되는 것으로 여겨졌다. 예를 들어 생성물 회수 동안 온도 제어가 꺼졌을 때, 이러한 작업 동안 시스템이 천천히 냉각되어, 막 유닛으로부터의 회수에 난점을 야기하였다. 별법적으로, 회수가 먼저 막 홀더로부터 수행된 후, 재순환 용기로부터 수행될 수 있다.
회수 동안의 질량 손실을 결정하기 위해, 상기 기술된 것과 동일한 순서를 사용하여 1.74 ℓ의 DF 완충제를 시스템에 첨가하고, 약 5분 동안 재순환시키고, 회수하였다. 그 후, 이러한 부피를 다른 풀과 함께 단백질 농도에 대해 분석하였다. 표 2에 결과가 요약된다.
| 부피 (ℓ) | 농도 (g/ℓ) | 질량 (g) | 수율 또는 {손실} (％) | |
| Q-풀 | 43.1 | 3.2 | 137.9 | 100 |
| 회수된 풀 | 0.99 | 120 | 118.8 | 86.1 |
| 완충제 플러시 | 1.74 | 9.8 | 17.1 | 12.4 |
| 여액 | 65.3 | 0.04 | 2.6 | 1.9 |
가공 후, 0.1N NaOH를 사용하여 1 ℓ/ft2 단일 통과 플러싱에 이어 0.5 ℓ/ft2 전체 재순환으로 30분 동안 막을 재생시켰다. 이어서 1 ℓ/ft2 PW (정제수)로 플러싱하였다. 이어서 300 ppm Minncare® 용액을 30분 동안 전체 재순환시켰다. 시스템을 1 ℓ/ft2 PW로 다시 플러싱하고, 마지막으로 15분 동안 0.1N NaOH로 플러싱하고, 보관하였다. 회수된 풀을 80 g E25/ℓ로 희석하고, 50 mM 히스티딘/150 mM 트레할로스/0.02％ 폴리소르베이트 20/pH 6.0의 최종 제형 내로 컨디셔닝하였다. 도입되는 Q-풀 및 최종적으로 회수된 벌크 모두에 대해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 생성물 품질을 평가하였다. 이러한 데이타가 표 3에 요약된다.
| 풀 | SEC 결과 (％ 단량체) |
| Q-풀 | 99.8 |
| 최종 벌크 | 99.8 |
비교예
2
주위 온도에서의 rhuMAb E25 의 고농축 제형 하기를 제외하고 실시예 1을 수행하였다. 공정 전에, 시스템 보관 용액 (0.1N NaOH)을 단일 통과 배수 모드로 먼저 2 ℓ/ft2 정제수 (PW)로, 그 후 1 ℓ/ft2 투석여과 완충제 (20 mM 히스티딘/pH 6.0)로 플러싱하였다. 플러싱 후, 0.5 ℓ/ft2 투석여과 완충제를 10분 동안 재순환시킴으로써 시스템을 평형화시켰다. 재순환된 용액의 pH를 점검하여, 평형화를 확인하였다. 그 후, 탱크 내의 수준을 최소한도의 측정가능한 값으로 감소시켜, 도입되는 단백질 풀의 희석을 최소화하였다.
선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 3.3 g E25/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 33.3 ℓ였다. 단백질은 25 mM 트리스 완충제 및 약 200 mM NaCl의 용액 내에 존재하였고, pH는 6.2로 조정되었다. 러닝을 시작하기 위해, 단백질 풀을 재순환 용기로 전달하였다. 용기 내에서, 풀을 상부에 설치된 임펠러를 통해 진탕하고, 온도는 주위 온도 (20-25℃)에서 유지시켰다. 공정 동안, 풀이 UF1 모드에서 50 g E25/ℓ로 농축되었다 (약 2.2L). 그 후, 풀을 8 투석부피의 투석여과 완충제로 투석여과하였다. 투석여과는 일정 부피로 수행되었고, 이러한 부피는 재순환 탱크 내로 전달되는 완충제 용액의 유속을 시스템으로부터 제거되는 여액의 유속에 맞춤으로써 달성되었다. 투석여과 또한 주위 온도에서 수행하였다. 투석여과 말기에, 풀을 UF2 모드로 추가로 농축하였다. 이러한 최종 농축의 표적은 110 g/ℓ였다. 그러나, 공급물 채널에 걸친 높은 압력 하락으로 인해, 이러한 농도가 달성되지 않았다. 이러한 농도를 달성하기 위한 시도에서, 공급물 채널에 대한 압력 하락이 50 psig에 도달하였기 때문에, 약 80 g E25/ℓ의 벌크 농도에서 공급물 유속이 1.4 ℓ/분으로 감소되었다. 50 psig의 높은 압력 하락이 다시 도달할 때까지 UF2가 계속되었고, 공정이 정지되었다. 다음으로, 공급물 펌프를 사용하여 공급물 채널을 가로질러 5 psig 압력 하락을 유지시키면서, 낮은 압력 하락 혼합이 시도되었다. 다시, 회전식 로브 펌프가 과도한 압력에 도달하였기 때문에, 단백질 용액의 점성 성질이 이를 달성하기 어렵게 하였다. 재순환 탱크로부터 샘플을 풀링하였고, 약 104 g/ℓ의 최종 벌크 농도가 측정되었다. 표 4에 UF1, DF (DF1+DF2), 및 UF2 단계 동안 측정된 처리량 및 유량이 요약된다.
| 공정 단계 | 표준화 처리량 (g/ft2/시) |
표준화 유량 (LMH/psig) |
| UF1 | 14.5 | 5.31 |
| DF | 9.5 | 1.47 |
| UF2 | 144.6 | 0.78 |
도 5는 UF1 (10), DF (20), UF2 (30)를 포함하는 공정의 다양한 단계 또는 모드 동안 공급물 유속 (210), 탱크 온도 (220), 공급 dP (230), TMP (240), 및 여액 유속 (250) 파라미터에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 6은 E25 농도 (310), 유량 (320), 및 TMP (240)에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 7은 24℃에서 UF1 (410) 및 UF2 (420)에 대해 관측된 압력 하락 대 단백질 농도에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
단백질 풀을 단계들에서 회수하였다. 먼저, 회전식 로브 공급물 펌프를 사용하여 재순환 탱크 내의 풀을 탱크로부터 0.22 마이크론 멸균 등급 필터인 Millipac 200을 통과하여 펌핑하였다. 다음으로, 재생물 라인 상의 최고점에 적용된 5 psig 질소 기체로 단백질 용액을 파이핑 및 막 유닛으로부터 변위시켰다. 용액의 점성 성질로 인해 이로부터의 단백질 회수는 매우 불량하였다. 최종 단계는 5 psig 질소 기체를 또한 사용하여 탱크 및 공급물 라인을 송풍시키는 것이었다.
회수 동안의 질량 손실을 결정하기 위해, 실시예 1의 순서를 사용하여 1.85 ℓ의 DF 완충제를 시스템에 첨가하고, 약 5분 동안 재순환시키고, 회수하였다. 그 후, 이러한 부피를 다른 풀과 함께 단백질 농도에 대해 분석하였다. 표 5에 결과가 요약된다.
| 부피 (ℓ) | 농도 (g/ℓ) | 질량 (g) | 수율 또는 {손실} (％) | |
| Q-풀 | 33.3 | 3.3 | 109.9 | 100 |
| 회수된 풀 | 0.77 | 104.4 | 80.4 | 73.1 |
| 완충제 플러시 | 1.85 | 14.7 | 27.2 | 24.7 |
| 여액 | 52.2 | 0.03 | 1.6 | 1.5 |
가공 후, 0.1N NaOH를 사용하여 1 ℓ/ft2 단일 통과 플러싱에 이어 0.5 ℓ/ft2 전체 재순환으로 30분 동안 막을 재생시켰다. 이어서 1 ℓ/ft2 PW (정제수)로 플러싱하였다. 이어서 300 ppm Minncare® 용액을 30분 동안 전체 재순환시켰다. 시스템을 1 ℓ/ft2 PW로 다시 플러싱하고, 마지막으로 15분 동안 0.1N NaOH로 플러싱하고, 보관하였다. 회수된 풀을 80 g E25/ℓ로 희석하고, 20 mM 히스티딘/250 mM 수크로스/0.02％ 폴리소르베이트 20/pH 6.0의 최종 제형 내로 컨디셔닝하였다. 도입되는 Q-풀 및 최종적으로 회수된 벌크 모두에 대해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 생성물 품질을 평가하였다. 이러한 데이타가 표 6에 요약된다.
| 풀 | SEC 결과 (％ 단량체) |
| Q-풀 | 99.8 |
| 최종 벌크 | 99.8 |
실시예
3
초기 공급- 뱃치 모드로의 rhuMAb E26 의 고농축 제형 하기를 제외하고는 실시예 1을 반복하였다. rhuMAb E26 (IgE를 표적으로 하는 재조합 인간 모노클로날 항체)이 농축/제형되었다. 이러한 실시예로부터의 생성물은 독성학 평가에서 사용되었다. 밀리포어 펠리콘 한외여과/투석여과 시스템을 11.4-ft2 30,000-달톤 재생 셀룰로스 복합체 막과 조립하였다. 공급물 유속은 5.0 ℓ/분 (0.44 ℓ/분/ft2)의 일정 속도로 설정하였다. 한외여과 및 투석여과 작업 동안, 보전물 압력을 약 6-8 psig 사이에서 유지시켰다. 선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 6.7 g E26/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 59.3 ℓ였다.
도입되는 풀이 재순환 용기보다 크기 때문에, UF1 공정은 공급-뱃치 모드로 시작되었다. 이러한 모드에서, 여액이 TFF 막을 통과하여 배수되는 것과 대략 동일한 속도로 Q-풀이 재순환 용기로 첨가되었다. 나머지 Q-풀이 재순환 용기로 전달된 후, UF1 공정이 뱃치 모드로 계속되었다. UF1 동안, 풀이 50 g E26/ℓ로 농축되었다 (약 7.9 ℓ). 투석여과를 시작할 때, 재순환 용기의 온도 설정점을 4O℃로 증가시켰다. 온도 증가 및 제어는 따뜻한 글리콜을 탱크의 외부 재킷에 유동시킴으로써 실행되었다. 그 후, 풀을 8 투석부피의 투석여과 완충제로 투석여과하였다. 투석여과는 일정 부피로 수행되었고, 이는 재순환 탱크 내로 전달되는 완충제의 유속을 시스템으로부터 제거되는 여액의 유속에 맞춤으로써 달성되었다. 투석여과 말기에, 풀을 109 g E26/ℓ의 최종 농도로 UF2 모드로 추가로 농축하였다 (3.6 ℓ). 이러한 단계 또한 40℃의 고온 설정점을 사용하여 수행하였다. 다음으로, 공급물 채널을 가로질러 5-10 psig 압력 하락이 유지되도록 공급물 펌프를 제어하여, 낮은 압력 하락 혼합을 수행하였다. 표 7에 UF1, DF (DF1+DF2), 및 UF2의 처리량 및 유량 결과가 요약된다.
| 공정 단계 | 표준화 처리량 (g/ft2/시) |
표준화 유량 (LMH/psig) |
| UF1 | 26.1 | 3.71 |
| DF | 19.2 | 2.34 |
| UF2 | 174.2 | 1.80 |
도 8은 공급물 유속 (210), 탱크 온도 (220), 공급 dP (230), TMP (240), 및 여액 유속 (250)에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 9는 E26 농도 (910), 유량 (920), 및 TMP (940)에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 10은 UF1 (1010) 및 UF2 (1020)에 대해 관측된 압력 하락 대 단백질 농도에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
생성물 회수 직전에, 10 ㎖ 샘플을 미생물부하 검출 및 역가에 대해 분석하였다. 전형적인 불합격 한계는 1 ㎖ 당 1,000 콜로니 형성 유닛 (CFU: Colony Forming Unit)이었다. 이러한 테스트의 결과는 1.8 CFU/㎖로, 이러한 단계에서 적절한 값이고, 불합격 한계보다 한참 아래였다. 회수 동안의 질량 손실을 결정하기 위해, 상기 기술된 것과 동일한 순서를 사용하여 908.1 ㎖의 DF 완충제를 시스템에 첨가하고, 약 5분 동안 재순환시키고, 회수하였다. 그 후, 이러한 부피를 다른 풀과 함께 단백질 농도에 대해 분석하였다. 표 8에 결과가 요약된다.
| 부피 (ℓ) | 농도 (g/ℓ) | 질량 (g) | 수율 또는 {손실} (％) | |
| Q-풀 | 59.3 | 6.7 | 397.3 | 100 |
| 회수된 풀 | 3.41 | 109.1 | 372.0 | 93.6 |
| 완충제 플러시 | 0.908 | 20.4 | 18.5 | 4.7 |
| 여액 | 120 | n/d | n/d | n/d |
회수된 풀을 80 g E26ℓ로 희석하고, 50 mM 히스티딘/150 mM 트레할로스/0.02％ 폴리소르베이트 20/pH 6.0의 최종 제형 내로 컨디셔닝하였다. 도입되는 Q-풀, UF1 후의 보전물 풀, DF 후의 보전물 풀, 및 최종적으로 회수된 벌크에 대해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 생성물 품질을 평가하였다. 이러한 데이타가 표 9에 요약된다.
| 풀 | SEC 결과 (％ 단량체) |
| Q-풀 | 99.8 |
| UF1 말기 | 99.8 |
| DF 말기 | 99.8 |
| 최종 벌크 | 99.8 |
실시예
4
독성학 평가용 rhuMAb E26 의 고농축 제형 - 10 kD 및 30 kD 의 비교 하기를 제외하고는 실시예 3을 반복하였다. 2개의 파일럿 규모 UF 시스템을 사용하여 rhuMAb E26을 농축/제형하였다. 2개의 밀리포어 펠리콘 한외여과/투석여과 시스템을 11.4-ft2의 재생 셀룰로스 복합체 막과 조립하였고, 이때 하나는 세공 크기가 10,000-달톤이고, 다른 하나는 세공 크기가 30,000-달톤이었다. 보전물 압력은 약 6-9 psig에서 유지시켰다.
10
kD
공정
선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 5.85 g E26/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 62.4 ℓ였다. UF1 동안, 풀이 50 g E26/ℓ로 농축되었다 (약 7.3 ℓ). 투석여과 말기에, 풀을 107.5 g E26/ℓ의 최종 농도로 UF2 모드로 추가로 농축하였다 (3.4 ℓ). 표 10에 UF1, DF, 및 UF2의 처리량 및 유량 결과가 요약된다.
| 공정 단계 | 표준화 처리량 (g/ft2/시) |
표준화 유량 (LMH/psig) |
| UF1 | 21.8 | 3.6 |
| DF | 15.9 | 2.6 |
| UF2 | 137.4 | 1.93 |
회수 동안의 질량 손실을 결정하기 위해, 상기 기술된 것과 동일한 순서를 사용하여 987 ㎖의 DF 완충제를 시스템에 첨가하고, 약 5분 동안 재순환시키고, 회수하였다. 그 후, 이러한 부피를 다른 풀과 함께 단백질 농도에 대해 분석하였다. 표 11에 결과가 요약된다.
| 부피 (ℓ) | 농도 (g/ℓ) | 질량 (g) | 수율 또는 {손실} (％) | |
| Q-풀 | 62.4 | 5.85 | 365.4 | 100 |
| 회수된 풀 | 3.38 | 107.5 | 361.7 | 98.9 |
| 완충제 플러시 | 0.987 | 19.9 | 19.6 | 5.4 |
| 여액 | 125 | n/d | n/d | n/d |
도 11은 10 kD 공정에 대해, UF1 (10), DF (20), UF2 (30), 및 낮은 dP (40)를 포함하는 공정의 다양한 단계 또는 모드에 걸쳐 공급물 유속 (210), 탱크 온도 (220), 공급 dP (230), TMP (240), 및 여액 유속 (250)에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 12는 10 kD 공정에 대해, UF1 (10), DF (20), UF2 (30), 및 낮은 dP (40)를 포함하는 공정의 다양한 단계 또는 모드에 걸쳐 E26 농도 (1210), 유량 (1220), 및 TMP (1240)에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 13은 10 kD 공정에 대해, UF1 (1310) 및 UF2 (1320)에 대해 관측된 압력 하락 대 단백질 농도에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
30
kD
공정
선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 5.85 g E26/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 64.5 ℓ였다. UF1 동안, 초기 풀이 50 g E26/ℓ로 농축되었다 (약 7.5 ℓ). 투석여과 말기에, 풀을 117.5 g E26/ℓ의 최종 농도로 UF2 모드로 추가로 농축하였다 (3.2 ℓ). 표 12에 UF1, DF, 및 UF2의 처리량 및 유량 결과가 요약된다.
| 공정 단계 | 표준화 처리량 (g/ft2/시) |
표준화 유량 (LMH/psig) |
| UF1 | 25.5 | 4.01 |
| DF | 17.6 | 2.39 |
| UF2 | 180.5 | 1.57 |
회수 동안의 질량 손실을 결정하기 위해, 상기 기술된 것과 동일한 순서를 사용하여 918 ㎖의 DF 완충제를 시스템에 첨가하고, 약 5분 동안 재순환시키고, 회수하였다. 회수된 풀을 80 g E26/ℓ로 희석하고, 50 mM 히스티딘/150 mM 트레할로스/0.02％ 폴리소르베이트 20/pH 6.0의 최종 제형 내로 컨디셔닝하였다. 표 13에 결과가 요약된다.
| 부피 (ℓ) | 농도 (g/ℓ) | 질량 (g) | 수율 또는 {손실} (％) | |
| Q-풀 | 64.5 | 5.85 | 377.3 | 100 |
| 회수된 풀 | 3.20 | 117.5 | 376.0 | 99.6 |
| 완충제 플러시 | 0.918 | 22.7 | 20.8 | 5.5 |
| 여액 | 125 | n/d | n/d | n/d |
도 14는 30 kD 공정에 대해, UF1 (10), DF (20), UF2 (30), 및 낮은 dP (40)를 포함하는 공정의 다양한 단계 또는 모드에 걸쳐 공급물 유속 (210), 탱크 온도 (220), 공급 dP (230), TMP (240), 및 여액 유속 (250)에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 15는 30 kD 공정에 대해, UF1 (10), DF (20), UF2 (30), 및 낮은 dP (40)를 포함하는 공정의 다양한 단계 또는 모드에 걸쳐 E26 농도 (1510), 유량 (1520), 및 TMP (1540)에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 16은 30 kD 공정에 대해, UF1 (1610) 및 UF2 (1620)에 대해 관측된 압력 하락 대 단백질 농도에 대해 경시적으로 관측 또는 측정된 공정 값들을 나타낸다.
실시예
5
액체 rhuMAb E25 규모 증진 하기를 제외하고는 실시예 1을 반복하였다.
생산 규모의 UF 시스템을 사용하여 액체 rhuMAb E25 (IgE를 표적으로 하는 재조합 인간 모노클로날 항체)를 농축/제형하였다. 생성물은 치료 용도 및 인간 생물학적 동등성(bio-equivalency) 시험에서 사용될 수 있다. 밀리포어 펠리콘 한외여과/투석여과 시스템을 세공 크기가 30,000-달톤인 226-ft2 재생 셀룰로스 복합체 막과 조립하였다. 각각의 시스템은 막 홀더, 바이킹(Viking) S3S 회전식 로브 공급물 펌프, 1½" 316L 스테인레스 스틸 재순환 파이핑, 및 250-ℓ 재순환 용기로 구성되었다.
1개의 250-ℓ 316L 스테인레스 스틸 재킷형 탱크를 재순환 용기용으로 사용하였다. 이러한 탱크에 대한 온도 제어는 탱크의 재킷에 공급되는 온도 조정된 글리콜을 사용하여 수행하였다. 탱크 재킷에 공급되는 글리콜의 온도는 각각 증기-공급 열 교환기 또는 저온 글리콜 공급을 사용하여 상승 또는 저하되었다.
이러한 러닝 동안, 공급물 유속은 114 ℓ/분 (0.5 ℓ/분/ft2)의 일정 속도로 설정하였다. 투석여과 완충제 (20 mM 히스티딘/200 mM 염화아르기닌/pH 6.0)를 별도의 탱크에서 제조하였다. 이러한 완충제의 온도는 공정 전에 45℃로 설정하였다. 이는 공정 전반에 걸쳐 정확한 온도 제어를 가능하게 하였다.
공정 전에, 시스템 보관 용액 (0.1N NaOH)을 단일 통과 배수 모드로 먼저 1 ℓ/ft2 주사용수 (WFI)로, 그 후 1 ℓ/ft2 투석여과 완충제로 플러싱하였다. 플러싱 후, 0.5 ℓ/ft2 투석여과 완충제를 10분 동안 재순환시킴으로써 시스템을 평형화시켰다. 재순환된 용액의 pH를 점검하여, 평형화를 확인하였다.
선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 5.2562 g E25/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 1,141 ℓ였다. 단백질은 25 mM 트리스 완충제 및 약 200 mM NaCl의 용액 내에 존재하였고, pH는 6.2로 조정되었다. 러닝을 시작하기 직전에, 이러한 풀의 온도 설정점을 45℃로 설정하였다. 러닝을 시작하기 위해, 단백질 풀을 0.22 마이크론 멸균 등급 필터를 지나 탱크 내 약 200 ℓ의 수준으로 재순환 용기로 전달하였다. 용기 내에서, 풀을 상부에 설치된 임펠러를 통해 진탕하고, 온도는 약 (40-50℃)에서 유지시켰다. 도입되는 풀이 재순환 용기보다 크기 때문에, UF1 공정은 공급-뱃치 모드로 시작되었다. 이러한 모드에서, 여액이 TFF 막을 통과하여 배수되는 것과 대략 동일한 속도로 Q-풀이 재순환 용기로 첨가되었다. 나머지 Q-풀이 재순환 용기로 전달된 후, UF1 공정이 뱃치 모드로 계속되었다. UF1 모드 동안, 풀이 약 30 g E25/ℓ로 농축되었다 (약 200 ℓ). 그 후, 풀을 8 투석부피의 투석여과 완충제로 투석여과하였다. 투석여과 동안, 온도는 40℃와 50℃ 사이에서 유지되었다. 투석여과는 일정 부피로 수행되었고, 이는 재순환 탱크 내로 전달되는 완충제의 유속을 시스템으로부터 제거되는 여액의 유속에 맞춤으로써 달성되었다. 투석여과 말기에, 풀을 170 g E25/ℓ를 초과하는 최종 농도 설정점으로 UF2 모드로 추가로 농축하였다 (35 ℓ). 이러한 UF2 모드 단계 또한 45℃ ± 5℃의 고온 설정점에서 수행하였다. 다음으로, 공급물 채널을 가로질러 5-10 psig 압력 하락이 유지되도록 공급물 펌프를 제어하여, 낮은 압력 하락 혼합을 수행하였다. 샘플을 풀링하고, 세부사항 조사를 수행하여, 회수 전 농도를 확인하였다. 이러한 샘플의 농도는 219 g E25/ℓ였다. 표 14에 UF1, DF (DF1+DF2), 및 UF2 단계 동안 측정된 처리량 및 유량 결과가 요약된다.
| 공정 단계 | 표준화 처리량 (g/ft2/시) |
표준화 유량 (LMH/psig) |
| UF1 | 43.8 | 3.34 |
| DF | 25.9 | 2.46 |
| UF2 | 78.9 | 0.66 |
생성물 회수 직전에, 30 ㎖ 샘플을 미생물부하 검출 및 역가에 대해 분석하였다. 결과는 0.13 CFU/㎖ 미만이었다. 단백질 풀을 일련의 단계에 의해 회수하였다. 먼저, 보전물 라인에 첨가된 5ℓ의 DF 완충제를 사용하여 단일 통과 모드로 생성물을 막으로부터 변위시켰다. 생성물을 회수 탱크 내로 7.4 ft2, 0.22 마이크론 멸균 등급 가드 필터에 이어서 2 ft2, 0.22 마이크론 멸균 등급 최종 필터를 통해 여과하였다. 회전식 로브 공급물 펌프를 사용하여 재순환 탱크 내의 풀을 탱크로부터 펌핑하였다. 다음으로, 5 psig 질소 기체 송풍으로 잔류 단백질 용액을 탱크 및 공급물 라인으로부터 변위시켰다. 최종 단계는 막 유닛을 송풍시키는 것인데, 이제 이는 초기 생성물 변위로부터 DF 완충제를 대부분 함유하였다. 이러한 단계에서 보전물 라인 상의 최고점에 적용된 5 psig 질소 기체가 또한 사용되었다. 회수된 풀을 DF 완충제를 사용하여 먼저 약 153 g E25/ℓ로 희석하였다. 마지막으로, 풀을 20 mM 히스티딘/200 mM 아르기닌-HCl/0.04％ 폴리소르베이트 20/pH 6.0의 최종 제형 내로 컨디셔닝하였다. 회수된 풀, 희석된 풀, 및 컨디셔닝된 풀 (Q-풀)의 부피를 각각 단백질 농도에 대해 분석하였다. 표 15에 결과가 요약된다.
| 부피 (ℓ) | 농도 (g/ℓ) | 질량 (g) | 수율 또는 {손실} (％) | |
| Q-풀 | 1,141 | 5.2562 | 5,997.3 | 100 |
| 회수된 풀 | 35.0 | 170.0 | 5,950.0 | 99.2 |
| 희석된 풀 | 39.0 | 147.0 | 5,726 | 95.5 |
도 17은 UF1 (10), DF1 (20), DF2 (25), UF2 (30), 및 낮은 dP (50)를 포함하는 공정의 다양한 단계 또는 모드 동안의 공급물 유속 (210), 탱크 온도 (220), 공급 dP (230), TMP (240), 및 여액 유속 (250) 파라미터를 나타낸다.
실시예
6
액체 rhuMAb E25 제조 하기를 제외하고 실시예 5를 반복하였다. 생산 규모의 UF 시스템을 사용하여 액체 rhuMAb E25 (IgE를 표적으로 하는 재조합 인간 모노클로날 항체)를 농축/제형하였다. 밀리포어 펠리콘 한외여과/투석여과 시스템을 세공 크기가 30,000-달톤인 226-ft2 재생 셀룰로스 복합체 막과 조립하였다. 각각의 시스템은 막 홀더, 바이킹 S3S 회전식 로브 공급물 펌프, 1½" 316L 스테인레스 스틸 재순환 파이핑, 및 250-ℓ 재순환 용기로 구성되었다. 1개의 250-ℓ 316L 스테인레스 스틸 재킷형 탱크를 재순환 용기용으로 사용하였다. 공급물 유속은 114 ℓ/분 (0.5 ℓ/분/ft2)의 일정 속도로 설정하였다. 모든 사용전 및 사용후 작업 동안, 보전물 압력 제어를 10 psig로 일정하게 설정하였다. 한외여과 및 투석여과 작업 동안, 시스템에서 C벽 제어 계획을 사용하여 막을 지나는 유량을 제어하였다. 투석여과 완충제 (20 mM 히스티딘/200 mM 염화아르기닌/pH 6.0)를 별도의 탱크에서 제조하였다. 이러한 완충제의 온도는 공정 전에 45℃로 설정하였다. 이는 공정 전반에 걸쳐 정확한 온도 제어를 가능하게 하였다. 선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 5.5438 g E25/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 1,082 ℓ였다. 단백질은 25 mM 트리스 완충제 및 약 200 mM NaCl의 용액 내에 존재하였고, pH는 6.2로 조정되었다. 러닝을 시작하기 직전에, 이러한 풀의 온도 설정점을 45℃로 설정하였다. 러닝을 시작하기 위해, 단백질 풀을 0.22 마이크론 멸균 등급 필터를 지나 탱크 내 약 200 ℓ의 수준으로 재순환 용기로 전달하였다. 용기 내에서, 풀을 상부에 설치된 임펠러를 통해 진탕하고, 온도는 약 (40-50℃)에서 유지시켰다. 도입되는 풀이 재순환 용기보다 크기 때문에, UF1 공정은 공급-뱃치 모드로 시작되었다. 이러한 모드에서, 여액이 TFF 막을 통과하여 배수되는 것과 대략 동일한 속도로 Q-풀이 재순환 용기로 첨가되었다. 나머지 Q-풀이 재순환 용기로 전달된 후, UF1 공정이 뱃치 모드로 계속되었다. UF1 동안, 풀이 약 30 g E25/ℓ로 농축되었다 (약 200 ℓ). 그 후, 풀을 8 투석부피의 투석여과 완충제로 투석여과하였다. 투석여과 동안, 온도는 40℃와 50℃ 사이에서 유지되었다. 투석여과는 일정 부피로 수행되었고, 이는 재순환 탱크 내로 전달되는 완충제의 유속을 시스템으로부터 제거되는 여액의 유속에 맞춤으로써 달성되었다. 투석여과 말기에, 풀을 170 g E25/ℓ를 초과하는 최종 농도 설정점으로 UF2 모드로 추가로 농축하였다 (35 ℓ). 이러한 단계 또한 45℃ ± 5℃의 고온 설정점에서 수행하였다. 다음으로, 공급물 채널을 가로질러 5-10 psig 압력 하락이 유지되도록 공급물 펌프를 제어하여, 낮은 압력 하락 혼합을 수행하였다. 샘플을 풀링하고, 세부사항 조사를 수행하여, 회수 전 농도를 확인하였다. 이러한 샘플의 농도는 191 g E25/ℓ였고, 풀 부피는 31.9 ℓ였다. 경시적인 공정 파라미터들의 그래프는 상기 도 17에 대해 관측되고 요약된 것들에 필적하였다.
[표 14(2)]
생성물 회수 직전에, 30 ㎖ 샘플을 미생물부하 검출 및 역가에 대해 분석하였다. 이러한 테스트의 결과는 검출 한계 미만이었다 (0.13 CFU/㎖ 미만).
단백질 풀을 일련의 단계에 의해 회수하였다. 먼저, 보전물 라인에 첨가된 5ℓ의 DF 완충제를 사용하여 단일 통과 모드로 생성물을 막으로부터 변위시켰다. 생성물을 회수 탱크 내로 7.4 ft2, 0.22 마이크론 멸균 등급 가드 필터에 이어서 2 ft2, 0.22 마이크론 멸균 등급 최종 필터를 통해 여과하였다. 회전식 로브 공급물 펌프를 사용하여 재순환 탱크 내의 풀을 탱크로부터 펌핑하였다. 다음으로, 5 psig 질소 기체 송풍으로 잔류 단백질 용액을 탱크 및 공급물 라인으로부터 변위시켰다. 최종 단계는 막 유닛을 송풍시키는 것인데, 이는 초기 생성물 변위로부터 DF 완충제를 대부분 함유하였다. 이러한 단계에서 보전물 라인 상의 최고점에 적용된 5 psig 질소 기체가 또한 사용되었다. 회수된 풀을 DF 완충제를 사용하여 먼저 약 153 g E25/ℓ로 희석하였다. 마지막으로, 풀을 20 mM 히스티딘/200 mM 아르기닌-HCl/0.04％ 폴리소르베이트 20/pH 6.0의 최종 제형 내로 컨디셔닝하였다. 회수된 풀, 희석된 풀, 및 컨디셔닝된 풀의 부피를 단백질 농도에 대해 분석하였다. 표 15(2)에 결과가 요약된다. 공정 후에, 막을 상기 기술된 바와 같이 재생시켰다.
[표 15(2)]
실시예
7
생성물 품질에 대한 고온의 효과 히스티딘 및 Q 완충제 내의 30 g/ℓ 및 150 g/ℓ의 E25 샘플을 다양한 온도에서 24 시간 동안 유지시켰다. 탁도 측정 및 SEC 분석을 위해 샘플을 취하였다. Q 완충제 내의 30 g/ℓ의 E25에 대한 탁도 대 온도의 결과가 도 18에 제시된다. 도 19에서는 경시적으로 23℃, 4O℃, 50℃, 60℃ 및 70℃의 온도에 관측된 E25 (50 mM 히스티딘 완충제, pH 6.0 내의 150 g/ℓ)의 가용성 응집물의 양이 제시된다. 도 18 및 19에서, 각각의 이러한 온도에 대한 4가지 시간 간격 (0 시간, 4 시간, 7.5 시간 및 24 시간)이 1810 및 1910과 같이 왼쪽에서 오른쪽으로의 4개의 막대의 클러스터로 제시된다. 용액 탁도는 60℃에서 24시간 후 본질적으로 변하지 않았다. E25의 현저한 가용성 응집물이 70℃ 미만에서 관측되지 않았고, 이는 생성물 샘플이 적어도 60℃까지 및 적어도 24시간 동안 실질적으로 안정적이었음을 시사한다.
실시예
8
미생물부하에 대한 고온의 효과 아르기닌 및 히스티딘 완충제 내의 30 g/ℓ의 E25 샘플에 103 콜로니 형성 유닛/㎖으로 2가지 공격 생물을 접종하였다: 그람 양성 균주 (스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)); 및 그람 음성 균주 (슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)). 샘플을 1.5시간 및 6시간 후에 취하였다. 도 20 및 21의 막대 그래프에 제시된 결과들은 온도가 증가되면 이러한 공격 생물 모두가 감소되었음을 가리킨다. 도 20 및 21에서, 각각의 관측된 시간 간격에 대해 3가지 온도 간격 (25℃, 40℃ 및 50℃의 온도)이 2010 및 2110과 같이 왼쪽에서 오른쪽으로의 3개의 막대의 클러스터로 제시된다. 제시된 접종은 아르기닌 완충제에서 30 g/ℓ의 단백질 농도로 수행되었다.
실시예
9
공정 유량에 대한 고온의 효과 0.2M 아르기닌, 25 mM 히스티딘, pH 6.0 완충제 내의 10 g/ℓ의 E25 샘플을 유량 대 막횡단 압력 (TMP)에 대한 영향에 대해 평가하였다. 도 22는 시스템 온도를 증가시키는 것이 UF/DF 작업 동안 공정 유량을 또한 증가시켰다는 것을 나타낸다. 다양한 벌크 농도 및 23℃ (2210), 40℃ (2220), 및 46℃ (2230)의 3가지 상이한 온도에서의 유량 탈선이 수행되었다. 질량 전달 계수 및 여액 유량이 약 2 내지 3배 증가하여, 상당히 감소된 공정 시간을 제공하였다.
실시예
10
rhuMAB 항- CD20 ("2 H7 ")의 고농축 제형 파일럿 규모의 UF 시스템을 사용하여 rhuMAb 항-CD20 (2H7; 재조합 인간 모노클로날 항체)을 농축 및 제형하였다. 하기를 제외하고는 실시예 1을 반복하였다. 밀리포어 펠리콘 한외여과/투석여과 시스템을 세공 크기가 30,000-달톤인 17.5-ft2 재생 셀룰로스 복합체 막과 조립하였다. 시스템은 막 홀더, 바이킹 S1 L 회전식 로브 공급물 펌프, ½" 316L 스테인레스 스틸 재순환 파이핑, 및 40-ℓ 재순환 용기로 구성되었다. 배압 조절 밸브는 H.D. Baumann, Inc.이었다. 탱크 재킷에 공급되는 글리콜의 온도는 전기 열 교환기, 저온 글리콜 공급, 또는 양쪽 모두를 사용하여 필요에 따라 더 높게 또는 더 낮게 조절되었다.
이러한 러닝 동안, 공급물 유속은 8.5 ℓ/분 (약 0.5 ℓ/분/ft2)의 일정 속도로 설정하였다. 도 23은 UF1 (10), DF1 (20), 및 UF2 (30)를 포함하는 공정의 다양한 단계 또는 모드 동안의 0 내지 20 규모의 공급물 유속 (210), 2 내지 12 규모의 pH (212), 0 내지 5 규모의 여액 유속 (250), 0 내지 45 규모의 재생 탱크 수준 (2320), 및 0 내지 100 규모의 보전물 dP (2350)에 대한 경시적인 값들의 경향을 나타낸다.
한외여과 및 투석여과 작업 동안, 시스템에서 일정한 보전물 압력에 이어서 일정한 공급물/보전물 델타 압력 제어 계획을 사용하여, 막을 지나는 유량을 제어하였다. 투석여과 완충제 (30 mM 아세트산나트륨/pH 4.9)를 별도의 탱크에서 제조하였다. 이러한 완충제의 온도는 전체 공정에 걸친 정확한 온도 제어를 위해 공정 전에 45℃로 설정하였다. 공정 전에, 시스템 보관 용액 (0.1N NaOH)을 단일 통과 배수 모드로 먼저 1 ℓ/ft2 주사용수 (WFI)로, 그 후 1 ℓ/ft2 투석여과 완충제로 플러싱하였다. 플러싱 후, 0.5 ℓ/ft2 투석여과 완충제를 10분 동안 재순환시킴으로써 시스템을 평형화시켰다. 재순환된 용액의 pH를 점검하여, 평형화를 확인하였다.
선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 2.31 g 2H7/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 356 ℓ였다. 단백질은 0.5 M 아세트산으로 pH가 5.3으로 조정된 6 mM HEPES 유리 산/19 mM HEPES 나트륨 염 및 25 mM 아세트산나트륨의 용액 내에 존재하였다. 러닝을 시작하기 직전에, 이러한 풀의 온도 설정점을 45℃로 설정하였다. 러닝을 시작하기 위해, 단백질 풀을 0.22 마이크론 멸균 등급 필터를 지나 탱크 내 약 40 ℓ의 수준으로 재순환 용기로 전달하였다. 용기 내에서, 풀을 상부에 설치된 임펠러를 통해 진탕하고, 온도는 40-50℃에서 유지시켰다.
도입되는 풀이 재순환 용기보다 크기 때문에, UF1 공정은 공급-뱃치 모드로 시작되었다 (도 23 참조). 이러한 모드에서, 여액이 TFF 막을 통과하여 배수되는 것과 대략 동일한 속도로 Q-풀이 재순환 용기로 첨가되었다. 나머지 Q-풀이 재순환 용기로 전달된 후, UF1 공정이 뱃치 모드로 계속되었다. UF1 동안, 풀이 약 50 g 2H7/ℓ로 농축되었다 (약 16 ℓ). 그 후, 풀을 10 투석부피의 투석여과 완충제로 투석여과하였다. 투석여과 동안, 온도는 40℃와 50℃ 사이에서 유지되었다. 투석여과는 일정 부피로 수행되었고, 이는 재순환 탱크 내로 전달되는 완충제의 유속을 시스템으로부터 제거되는 여액의 유속에 맞춤으로써 달성되었다. 투석여과 말기에, 풀을 190 g 2H7/ℓ의 최종 농도 표적 설정점으로 UF2 모드로 추가로 농축하였다 (4.3 ℓ). 도 23에서, 이러한 단계의 말기에서의 50 psig의 일정한 dP 제어의 혼입 참조. 이러한 단계 또한 45℃ ± 5℃의 고온 설정점에서 수행하였다. 다음으로, 공급물 채널을 가로질러 20 psig 압력 하락이 유지되도록 공급물 펌프를 제어하여, 낮은 압력 하락 혼합을 수행하였다. 샘플을 풀링하고, 밀도 측정을 수행하여, 회수 전 농도를 확인하였다. 이러한 샘플의 농도는 189 g 2H7/ℓ였다. 표 16에 처리량 및 유량 결과가 요약된다.
| 공정 단계 | 표준화 처리량 (g/ft2/시) |
표준화 유량 (LMH/psig) |
| UF1 | 32 | 4.8 |
| DF | 56 | 2.4 |
| UF2 | 267 | 1.6 |
단백질 풀을 일련의 단계에 의해 회수하였다. 먼저, 보전물 라인에 첨가된 0.2ℓ의 DF 완충제를 사용하여 단일 통과 모드로 생성물을 막으로부터 변위시켰다. 생성물을 회수 탱크 내로 0.22 마이크론 멸균 등급 최종 필터를 통해 여과하였다. 그 후, 회전식 로브 공급물 펌프를 사용하여 재순환 탱크 내의 풀을 탱크로부터 펌핑하였다. 다음으로, 5 psig 질소 기체 송풍으로 잔류 단백질 용액을 탱크 및 공급물 라인으로부터 변위시켰다. 최종 단계는 막 유닛을 송풍시키는 것인데, 이는 이제 초기 생성물 변위로부터 DF 완충제를 대부분 함유하였다. 이러한 단계에서 보전물 라인 상의 최고점에 적용된 5 psig 질소 기체가 또한 사용되었다.
필요하다면, 회수된 풀을 희석 완충제 (30 mM 아세트산나트륨, pH 5.3)를 사용하여 먼저 약 175 g 2H7/ℓ로 희석하였다. 마지막으로, 풀을 150 g 2H7/ℓ의 표적 농도로 희석하고, 30 mM 아세트산나트륨, 7％ 트레할로스, 0.03％ 폴리소르베이트 20, pH 5의 최종 제형 내로 7× 컨디셔닝 완충제 (30 mM 아세트산나트륨, 49％ 트레할로스, 0.21％ 폴리소르베이트 20, pH 5.3)를 통해 컨디셔닝하였다.
회수된 풀, 희석된 풀, 및 컨디셔닝된 풀의 부피를 단백질 농도에 대해 분석하였다. 표 17에 결과가 요약된다.
| 부피 (ℓ) | 농도 (g/ℓ) | 질량 (g) | 수율 또는 {손실} (％) | |
| Q-풀 | 355.81 | 2.31 | 821.92 | 100.0 |
| 회수된 풀 | 4.64 | 180.02 | 835.3 | 101.6 |
| 최종 풀 | 4.871 | 149.40 | 727.7 | 88.5 |
| 주: 수율은 샘플링으로 인한 손실을 포함한다. 회수된 풀 부피 및 농도는 완충제 변위의 첨가를 포함한다. | ||||
공정 후, 막을 0.1 N NaOH를 사용하여 1 ℓ/ft2 단일 통과 플러싱에 이어서 30 분 동안의 0.5 ℓ/ft2 전체 재순환에 의해 재생시켰다. 이어서 1 ℓ/ft2 PW를 플러싱하였다. 이어서 0.5 ℓ/ft2 1.4％ Minncare 용액을 30 분 동안 전체 재순환시켰다. 시스템을 다시 1 ℓ/ft2 PW로 플러싱하고, 마지막으로 15 분 동안 0.1 N NaOH로 재순환시키고, 보관하였다.
실시예
11
rhuMAb 항- CD20 의 고농축 제형 파일럿 규모의 UF 시스템을 사용하여 GMP 제작 시설에서 인간 I단계 임상 연구에서 사용하기 위한 rhuMAb 항-CD20 (2H7)을 농축 및 제형하였다. 실시예 10을 하기를 제외하고 반복하였다.
선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 3.729 g 2H7/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 262 ℓ였다. 단백질은 0.5 M 아세트산으로 pH가 5.3으로 조정된 6 mM HEPES 유리 산/19 mM HEPES 나트륨 염 및 25 mM 아세트산나트륨의 용액 내에 존재하였다. 러닝을 시작하기 직전에, 이러한 풀의 온도 설정점을 45℃로 설정하였다. 러닝을 시작하기 위해, 단백질 풀을 0.22 마이크론 멸균 등급 필터를 지나 탱크 내 약 40 ℓ의 수준으로 재순환 용기로 전달하였다. 용기 내에서, 풀을 상부에 설치된 임펠러를 통해 진탕하고, 온도는 40-50℃에서 유지시켰다.
UF1 동안, 풀이 약 50 g 2H7/ℓ로 농축되었다 (약 20 ℓ). 도 24는 공정 동안의 -0.713963 내지 295.989 규모의 재생 탱크 수준 (210), -0.237899 내지 98.6629 규모의 보전물 dP (2420), -0.356981 내지 147.994 규모의 공급물 유속 (250), 및 -0.118994 내지 49.3315 규모의 여액 유속 (2450)에 대한 경시적인 값들의 경향을 나타낸다. 그 후, 풀을 10 투석부피의 투석여과 완충제로 투석여과하였다. 투석여과 동안, 온도는 40℃와 50℃ 사이에서 유지되었다. 투석여과는 일정 부피로 수행되었고, 이는 재순환 탱크 내로 전달되는 완충제의 유속을 시스템으로부터 제거되는 여액의 유속에 맞춤으로써 달성되었다. 투석여과 말기에, 풀을 190 g 2H7/ℓ의 최종 농도 표적 설정점으로 UF2 모드로 추가로 농축하였다 (5.25 ℓ). 도 24에서, 이러한 단계의 말기에서의 40 psig 제어로의 일정한 dP의 혼입 참조. 이러한 단계 또한 45℃ ± 5℃의 고온 설정점에서 수행하였다. 다음으로, 공급물 채널을 가로질러 20 psig 압력 하락이 유지되도록 공급물 펌프를 제어하여, 낮은 압력 하락 혼합을 수행하였다. 샘플을 풀링하고, 밀도 측정을 수행하여, 회수 전 농도를 확인하였다. 이러한 샘플의 농도는 194 g 2H7/ℓ였다. 표 18에 처리량 및 유량 결과가 요약된다.
| 공정 단계 | 표준화 처리량 (g/ft2/시) |
표준화 유량 (LMH/psig) |
| UF1 | 51 | 3.8 |
| DF | 46 | 2.2 |
| UF2 | 286 | 1.6 |
생성물 회수 직전에, 30 ㎖ 샘플을 풀링하여, 미생물부하 검출 및 역가에 대해 제출하였다. 결과는 음성이었다 (즉, 0.13 CFU/㎖ 미만). 단백질 풀을 실시예 10의 일련의 단계에 의해 회수하였다. 회수된 풀, 희석된 풀, 및 컨디셔닝된 풀의 부피를 단백질 농도에 대해 분석하였다. 표 19에 결과가 제시된다. 막을 실시에 10에서와 같이 재생시켰다.
| 부피 (ℓ) | 농도 (g/ℓ) | 질량 (g) | 수율 또는 {손실} (％) | |
| Q-풀 | 262 | 3.72 | 977 | 100 |
| 회수된 풀 | 5.0 | 174.0 | 863.0 | 88.3 |
| 희석된 풀 | 5.421 | 149.6 | 811.0 | 83.0 |
실시예
12
rhuMAb 항- CD20 GMP 의 고농축 제형 실시예 11을 하기를 제외하고 반복하였다. 선행 Q-세파로스 크로마토그래피 단계로부터 생성된 단백질 풀은 5.106 g 2H7/ℓ인 것으로 측정되었고, 부피가 196 ℓ였다. 단백질은 0.5 M 아세트산으로 pH가 5.3으로 조정된 6 mM HEPES 유리 산/19 mM HEPES 나트륨 염 및 25 mM 아세트산나트륨의 용액 내에 존재하였다. 러닝을 시작하기 직전에, 이러한 풀의 온도 설정점을 45℃로 설정하였다. 러닝을 시작하기 위해, 단백질 풀을 0.22 마이크론 멸균 등급 필터를 지나 탱크 내 약 40 ℓ의 수준으로 재순환 용기로 전달하였다. 용기 내에서, 풀을 상부에 설치된 임펠러를 통해 진탕하고, 온도는 40-50℃에서 유지시켰다.
UF1 동안, 풀이 약 50 g 2H7/ℓ로 농축되었다 (약 20 ℓ). 도 25는 공정 동안의 0 내지 300 규모의 재생 탱크 수준 (210), 0 내지 100 규모의 보전물 dP (2520), 0 내지 150 규모의 공급물 유속 (250), 및 0-50 규모의 여액 유속 (2550)에 대한 경시적인 값들의 경향을 나타낸다. 풀을 10 투석부피 (10×)의 투석여과 완충제로 투석여과하였다. 투석여과 동안, 온도는 40℃와 50℃ 사이에서 유지되었다. 투석여과는 일정 부피로 수행되었고, 이는 재순환 탱크 내로 전달되는 완충제의 유속을 시스템으로부터 제거되는 여액의 유속에 맞춤으로써 달성되었다. 투석여과 말기에, 풀을 190 g 2H7/ℓ의 최종 농도 표적 설정점으로 UF2 모드로 추가로 농축하였고 (5.26 ℓ), 이때 다시 이러한 단계의 거의 말기에 일정한 dP 제어를 사용하였다 (도 25 참조). 이러한 단계 또한 45℃ ± 5℃의 고온 설정점에서 수행하였다. 다음으로, 공급물 채널을 가로질러 20 psig 압력 하락이 유지되도록 공급물 펌프를 제어하여, 낮은 압력 하락 혼합을 수행하였다. 샘플을 풀링하고, 밀도 측정을 수행하여, 회수 전 농도를 확인하였다. 이러한 샘플의 농도는 191 g 2H7/ℓ였다. 표 20에 처리량 및 유량 결과가 요약된다.
| 공정 단계 | 표준화 처리량 (g/ft2/시) |
표준화 유량 (LMH/psig) |
| UF1 | 67 | 3.6 |
| DF | 47 | 2.1 |
| UF2 | 292 | 1.8 |
생성물 회수 직전에, 30 ㎖ 샘플을 풀링하여, 미생물부하 검출 및 역가에 대해 제출하였다. 결과는 음성이었다 (즉, 0.13 CFU/㎖ 미만). 단백질 풀을 실시예 11의 일련의 단계에 의해 회수하였다. 그 후, 회수된 풀, 희석된 풀, 및 컨디셔닝된 풀의 부피를 단백질 농도에 대해 분석하였다. 표 21에 결과가 제시된다. 막을 실시에 11에서와 같이 재생시켰다.
| 부피 (ℓ) | 농도 (g/ℓ) | 질량 (g) | 수율 또는 {손실} (％) | |
| Q-풀 | 196 | 5.106 | 1000 | 100 |
| 회수된 풀 | 4.9 | 187.1 | 918.0 | 91.8 |
| 희석된 풀 | 6.075 | 150.9 | 916.9 | 91.7 |
모든 간행물, 특허, 및 특허 문헌은 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다. 본 출원은 다양한 구체적이고 바람직한 실시양태 및 기술을 참조로 기술되었다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범주 내에서 많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
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- 인간 치료법에서의 농축된 단백질의 용도.
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