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KR20120102733A - 질병 치료용 제제 - Google Patents

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KR20120102733A
KR20120102733A KR1020127016947A KR20127016947A KR20120102733A KR 20120102733 A KR20120102733 A KR 20120102733A KR 1020127016947 A KR1020127016947 A KR 1020127016947A KR 20127016947 A KR20127016947 A KR 20127016947A KR 20120102733 A KR20120102733 A KR 20120102733A
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Abstract

본 발명은 CD4에 결합할 수 있으며 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 분자를 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화시킬 수 있는 항체 또는 항체 단편과 상기 항체 또는 항체 단편을 이용하는 방법 및 용도를 제공한다.

Description

질병 치료용 제제{AGENTS FOR TREATING DISEASE}
본 발명은 질병 치료용 제제, 구체적으로는 T-세포의 표면 수용체 CD4를 경유한 CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 활성화를 통해 구현되는 치료용 제제에 관한 것이다. 본 발명은 상기한 제제를 동정하기 위한 스크리닝 방법, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화시킬 수 있는 제제, 및 상기 제제의 질환, 특히 자가면역 질환의 치료에 있어서의 용도, 및 아울러 시험관내에서의 수행되는 방법에 있어서의 용도에 관한 것이다.
T-세포는 림프구에 속하며, 면역계에서 여러가지 중요한 기능을 담당하고 있다. 포유류에서, T-세포(흉선세포)는 골수에서 만들어진 조혈 전구 세포로부터 흉선에서 분화한다. 분화 과정의 일부는 특징적인 표면 수용체, 주로 당단백질 CD4 및 CD8의 발현이다. CD4를 발현하는 T 세포, 소위 CD4+ T 세포는 MHC 클래스 II 복합체에 결합하며(Reinerz and Schlossman, Cell 19, 821-827 (1980); Reinerz et al., PNAS USA 77, 1588-1592 (1980)), CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I 복합체에 결합한다(Fitch, Microbiol. Rev. 50, 50-69 (1986)). T-세포는 혈액과 림프로 분비된다.
CD4 양성 세포는 T 헬퍼 아집단(Th1 및 Th2)으로 분화될 수 있으며, 아울러 조절성 T 세포로도 분화될 수 있다. 조절성 T 세포는 다시 아집단으로 분류할 수 있는데, 흉선 유래 (nTreg) 유발성 아집단(iTregs)에 대해 가장 많은 연구가 이루어지고 있다.
Tr1 또는 Th3과 같이 다른 Treg 아집단들도 있지만, 본 발명은 Foxp3 전사 인자를 발현하는 2가지 아집단, 즉, CD4 양성인 흉선 유래 Treg(nTreg)와 유발성 Treg에 대한 것이다. 이들 아집단의 주된 차이는, Foxp3가 nTreg에서는 안정적이고 지속적으로 발현되어 비가역적인 Treg 표현형으로 나타나는 반면, 유발성 Treg에서는 Foxp3가 유도성 발현되거나 일시적으로 발현되어 가역적이다.
Treg는 IL-10, TGF β 또는 IL-35 등의 면역조절성 사이토카인을 분비하며, 여러가지 기전, 예컨대 전염증성 사이토카인의 생산 억제, 직접적인 세포-세포 접촉 및 항원 제시 세포(APC)에 대한 활성화 상태 또는 작용의 조절을 통해, 작동자 T 세포에 대해 억제성 활성을 표출한다 (Shevach et al., Immunity (2009) 30; 636-645). CD4+ CD25 Treg 세포의 주요 특징은 아네르기(anergic) 표현형으로, 그 의미는 상기 세포가 TCR 자극화가 이루어졌을 때 증식되지 않는다는 것인데, 이는 외인성 IL-2의 부가를 통해 회복시킬 수 있다.
Treg의 주된 역할은 면역 반응과 자기 허용성(self tolerance)에 대한 항상성 유지이다. Treg의 기능부전은 자가면역 질환과 연관되어 있다.
일반적으로, 조절 T 세포는 표면 수용체 당단백질인 CD4, CD25를 이용하여 분리되며, FOXP3을 세포내 염색시켜 특정화할 수 있다. 다른 표면 단백질로는 CD127 (IL-7 R)이 있는데, 이것은 Treg 세포에서 하향-조절(downregulate)되므로, Treg를 더욱 정제하는데 이를 활용할 수 있다. 부가적으로, CD39 (엔도뉴클레오티다제(endonucleotidase)) (Borselino et al., Blood (2007) 110, 1225-1232) 또는 GARP (당단백질 A 반복체 다량 함유) (GARP, 또는 LRRC32) (Wang et al., PNAS (2009) 106, 32. 13439-13444)의 발현도 이용할 수 있다.
인간 CD4는 12번 염색체에 코딩되어 있으며, 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리에 속한다. 이것의 T 세포 표면 수용체로서의 본래 기능은, MHC 클래스 II 복합체와의 결합을 통한 T 세포의 활성화와 관련있다. 아울러, CD4는 HIV-1 gp120 단백질, P4HB/CDI 단백질, 및 인간 헤르페스 바이러스 HHV-7 캡시드 단백질과도 결합할 수 있다. 또한, HIV-1 gp120 및 Vpu 단백질과의 상호작용도 보고되고 있다. CD4는 458개의 아미노산으로 이루어져 있다. 이의 펩타이드 서열은 도 1에 나타낸다.
UniProt entry P01730에는 아래 표 1과 도 6에 나타낸 CD4의 도메인 구조가 개시되어 있다. 앞에서 25개의 아미노산은 신호 펩타이드이며, 생물학적 활성 형태에서는 절단되어 없어진다. 26번에서 396번까지는 세포외 도메인이고, 그 다음 397 - 418번은 막관통 영역이다. Asn296과 Asn325은 당화 부위로 확인되었다 (Konig et al., J. Biol. Chem. 263, 9502-9507 (1988); Carr et al., J. Biol. Chem. 264, 21286-21295 (1989)).
끝부분, 즉 419 - 458번 영역은 세포질 도메인이다. 이 도메인은 티로신 단백질 키나제가 결합하는 부위 LCK (p56lck)이며(Rudd et al., PNAS USA 85, 5190-5194 (1988); Veillette et al., Cell 55, 301 (1988)), CD4에 리간드가 결합됨으로써 활성화되는 신호 전달 경로의 일환이다.
표 1. CD4의 도메인 구조 (UniProt P01730에 따름)
특징 위치 길이 설명
신호 펩타이드 1 - 25 25
체인 26 - 458 433 T-세포 표면 당단백질 CD4
위상적 도메인 26 - 396 371 세포외
막관통 영역 397 - 418 22 추정
위상적 도메인 419 - 458 40 세포질 (추정)
도메인 26 - 125 100 Ig-유사 V-타입
도메인 126 - 203 78 Ig-유사 C2-타입 1
도메인 204 - 317 78 Ig-유사 C2-타입 2
도메인 318 - 374 78 Ig-유사 C2-타입 3
영역 427 - 455 29 HIV-1 Vpu-감수성 도메인
당화 부위 296 1 NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
당화 부위 325 1 NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
이황화 결합 41 ↔ 109
이황화 결합 155 ↔ 184
이황화 결합 328 ↔ 370
지질화(Lipidation) 부위 419 1 S-팔미토일 시스테인
지질화 부위 422 1 S-팔미토일 시스테인
세포외 부분은 4개의 면역글로불린-유사 도메인으로 구성되어 있다. 첫번째 N-말단 도메인은 26번 - 125번이며, Ig-유사 V-타입 도메인이다. 항체에 대한 상동성을 기초로, 여기에는 항원-상보성-결정부에 대한 상동체 3가지, CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다 (Ashkenazi et al., PNAS USA 87, 7150-7154 (1990)) (도 6 참조). CDR1 및 CDR2 전장(span)은 MHC 클래스 II 분자 (Moebius et al., PNAS USA 89, 12008-120012 (1992)), gp120 HIV-1 외막 단백질(envelope protein) (Moebius et al., J. Exp. Med. 176, 507-517 (1992)) 및 항-CD4 항체 (Lanza et al., PNAS USA 90, 11683-11687 (1993))의 결합에 관여한다. CDR2의 Phe68은 MHC 클래스 II 분자와 gp120 HIV-1 외막 단백질의 인지와 결합에 중요한 역할을 한다 (Sharma et al., Biochemistry 44, 16192-16202 (2005)). CD4에 대해 알려져 있는 리간드들 모두 N-말단의 Ig-유사 V-타입 도메인에 결합한다.
조절성 T 세포의 작동 기전은 완전히 규명되진 않았다. CD4+CD25+ Treg는 다클론성 및 항원-특이적인 T 세포의 활성화를 저해한다. 이러한 저해는, 예컨대 TCR을 통한 CD4+CD25+ Treg의 활성화가 요구되는 세포 접촉-의존적인 기전에 의해 매개될 수 있지만, Treg는 TCR가 활성화되거나 또는 미토겐 항체에 의해 자극이 이루어졌을 때 증식 반응을 나타내지 않는다(아네르기) (Shevach, Nature Rev. Immunol 2 : 389 (2002). 일단 자극화가 이루어지면, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 반응을 항원-비의존적인 방식으로 억제시키고, 아울러 B 세포의 활성화와 클론 확대(clonal expansion)를 저해할 수 있는 능력을 갖추게 된다.
면역계의 활성에 대해 통제적인 영향력을 가지는 CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 능력은, 이 세포가, 면역계를 통제하는 것이 바람직한, 자가 면역 질환 등의 질환을 치료하기 위한 잠재적인 타겟으로 인지된다는 의미를 내포한다.
자가면역성은 유기체가 자신을 구성하고 있는 부분(분자 이하의 수준까지)을 "자기"로 인지하지 못하여, 자신의 세포와 조직에 대해 면역 반응을 나타내는 현상이다. 이러한 비정상적인 면역 반응이 원인인 질환들 모두 자가면역 질환으로 칭해진다. 자가면역 질환으로는 다발성 경화증(MS), 류마티스 관절염(RA), 건선, 건선성 관절염, 궤양성 대장염, 크론 질환, 1형 당뇨병(T1D), 중증 근무력증(MG), II형 다선 자가면역 증후군(APS-II), 하시모토 갑상선염(HT), 전신 홍반성 낭창(SLE), 쇼그렌 증후군 및 자가면역성 림프증식 증후군(ALS)이 있다.
자가면역 질환은, T 세포가 '자기' 분자, 즉 숙주의 세포에 의해 생성되는 분자를 인지하여 반응할 때 발병한다. 항원 제시 세포(APC)에 의해 처리된 자기항원이 제시되고, 이로써 '자기반응성' T 세포의 활성화가 이루어지게 되면, T 세포의 클론 확대와 특정 조직으로의 이동이 이루어지고, 상기 조직에서 염증과 조직 파괴가 유도된다.
자가면역 질환의 치료에 성공을 거두고 있는 주된 치료 전략은, 면역억제제를 이용하여 이러한 작동자 T 세포 기능을 억제하는 것이다. 그러나, 이들 약물은 선택성이 불량하여 전체적으로 면역 억제를 유도하게 되며, 그 결과 면역계의 잘못된 작용 뿐만 아니라 유용한 작용도 저해된다. 그래서, 감염, 암 및 약물 독성과 같은 몇가지 위험성들이 발생할 수 있다.
CD4+ T 세포가 자가면역성 개시와 유지에 주된 역할을 한다는 것이 일반 통념이다. 그래서, CD4+ T 세포 표면 분자에 대한 mAb, 구체적으로 항-CD4 mAb를 면역억제제로서 사용하는 방안이 제시되어 왔다. 여러가지 임상적인 연구를 통해, 이러한 방법들이 유용할 수 있다는 것이 검증되었음에도 불구하고, 이러한 방법들 역시 항-CD4 mAb를 일상적인 임상 실무에 사용할 수 있도록 보다 적합하게 만들기 위해서는 해결해야할 몇가지 문제들이 드러나고 있다.
CD4 mAb에 대한 몇가지 작용 기전들이 제시되었는데, 그 기전으로는, (1) CD4-MHC II 상호작용에 대해 길항 작용함으로써 T 세포가 활성화되는 것을 저해함, (2) CD4의 세포 표면 발현 감소로 나타나는 CD4 수용체의 조절, (3) T 세포의 활성화를 억제하고 CD4 T 세포의 세포자살을 촉발시킬 수 있는, T 세포 수용체의 교차-결합(cross-linking) 없이 CD4 수용체를 통한 부분적인 신호전달, (4) CD4 T 세포의 고갈을 유도하는, Fc-매개 보체-의존적인 세포독성(CDC) 또는 항체-의존적인 세포성 세포독성(ADCC), 및 (5) 조절성 T 세포의 자극화가 있다.
T 세포를 표적으로 하는 몇가지 항-CD4 항체들이 임상적으로 개발되고 있는데 (Schulze-Koops et al., J Rheumatol. 25(11): 2065-76 (1998); Mason et al., J Rheumatol. 29(2): 220-9 (2002); Choy et al., Rheumatology 39(10): 1139-46 (2000); Herzyk et al., Infect Immun. 69(2): 1032-43 (2001); Kon et al., Eur Respir J. 18(1): 45-52 (2001); Mourad et al., Transplantation 65(5): 632-41 (1998); Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-9 (2003); Jabado et al., J Immunol. 158(1): 94-103 (1997)), 이들 대부분은 CD4 세포를 고갈시키기 위한 것으로, TRX-1, TNX-355, IDEC-151, OKTcdr4A와 같이 다른 기전에 따른 CD4 항체는 수 종에 불과한 실정이다.
자가면역 질환을 치료하기 위해 조절성 T 세포를 활성화시키고자 하는 제제를 사용하는 방법은, 매우 어려운 것으로 입증되고 있다. 작용제 활성(agonistic)의 항-CD3 항체 OKT-3 (Abramowicz et al, N Engl. J Med. 1992 Sep 3;327(10):736)를 이용하여 TCR을 통해, 또는 슈퍼작용제 활성의(superagonistic) 항-CD28 항체 TGN 1412를 이용하여 공동-자극성 분자인 CD28을 통해, Treg를 활성화시키면, 조절성 T 세포 집단 뿐만 아니라 다른 일반적인 T 세포도 고갈되고, IFN-γ, TNF-α, IL-1 및 IL-2 등의 전염증성 사이토카인이 전신으로 유도 및 과량 분비됨으로써, 인간의 경우 임상적으로 명백한 사이토카인 분비 증후군(CRS)이 발생하게 된다 (Suntharalingam et al, N Engl. J Med. 2006 Sep 7;355(10):1018-28).
그러나, 최근, WO2004/083247에서는, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 인간화된 항-CD4 항체를 개시하였다. WO2004/083247에서 기술된 항체들은 Racadot et al. (Clin. Exp. Rheum., 10, 365-374 (1992))에서 언급된, 인간화된 버전의 마우스 항체 mB-F5, 뮤라인 IgG1 항-인간 CD4이다. mB-F5의 에피토프는 도 6에 나타낸 바와 같이 인간 CD4의 162번에서 232번 아미노산까지의 Ig-유사 C2 타입 1 및 타입 2 도메인을 망라하는 것으로, Racadot 등이 보고한 바 있다.
이후, WO2009/112502, WO2009/121690, WO2009/124815 및 WO2010/034590에 기재된, BT061(인간화된 단일클론 IgG1)으로 명명된 이러한 항체들 중 하나를 이용한 임상 실험에서, 건선 및 류마티스 관절염 환자를 성공적으로 치료한 결과를 달성하였고, 이러한 결과는 이들 항체로 자가면역 질환들을 안전하고 매우 효과적으로 치료할 수 있다는 증거로 제공된다.
지금까지 달성된 훌륭한 임상 결과들은 유사한 특징을 가진 추가적인 치료제를 개발하는데 관심을 증폭시켜 주었다. 이에, 본 발명의 목적은 이러한 제제를 동정하는 스크리닝 방법과 추가적인 치료제를 제공하는 것이다.
이에, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, CD4에 결합할 수 있는 분자의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 하나 이상의 후보 분자를 제공하는 단계;
(b) 상기 하나 이상의 후보 분자가 인간 CD4의 아미노산 148 - 154번, 164 - 168번 및 185 - 192번 영역들 중 하나 이상의 영역에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 결정된 분자를 CD4에 결합가능한 것으로 선택하는 단계.
본 발명자들은 예상치 못하게도 인간화된 항체 BT061이 리간드 결합부로서 인지하지 못하였던 CD4의 도메인에 결합한다는 것을 발견하게 되었다. 이러한 사실은 당해 기술 분야에서 BT061의 기원인 뮤라인 항체, 즉 mB-F5에 대한 에피토프로 알려져 있다는 점을 감안하면 특히 놀랍다. 또한, 본 발명자들은 CD4 분자와의 결합에 참여하는 BT061의 잔기들을 결정하였고, BT061의 모든 CDR이 CD4 결합에 참여하는 것은 아님을 놀랍게도 알게 되었다.
결합부의 동정 및 결합 기전에 대한 상세한 내용을 통해, 추가적인 스크리닝 방법, 및 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 항체 및 항체 단편을 개발할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, CD4와 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) BT061 경쇄의 CDR1 및 CDR2와 BT061 중쇄의 CDR1 및 CDR3를 포함하며, 선택적으로 상기 CDR의 서열은 하기 아미노산 치환을 가지는, 항체 또는 항체 단편을 제공하는 단계;
(i) 경쇄 CDR1은 Ser32; Gly33; 및 Tyr34를 포함함;
(ii) 경쇄 CDR2는 Leu54; 및 Ile57을 포함함;
(iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
(iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His110 또는 Tyr110을 포함함,
(b) 상기 항체 또는 항체 단편이 CD4에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계, 및
(c) 단계 (b)에서 결정된 항체 또는 항체 단편을 CD4에 결합가능한 것으로 선택하는 단계를 포함하며,
상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명은, BT061 경쇄의 CDR1과 CDR2, 및 BT061 중쇄의 CDR1과 CDR3을 포함하며, 상기 CDR의 서열은 하기 아미노산 치환을 선택적으로 포함하는, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 제공하며,
(i) 경쇄 CDR1은 Ser32; Gly33; 및 Tyr34를 포함함;
(ii) 경쇄 CDR2는 Leu54; 및 Ile57을 포함함;
(iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
(iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His 110 또는 Tyr110을 포함함,
상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 예시적으로 설명된다.
도 1은 인간 CD4 (UniProt ID P01730)의 펩타이드 서열(서열번호 1)과 이황화 결합을 나타낸다.
도 2A는 인간화된 항체 BT061의 경쇄 펩타이드 서열(서열번호 2)이다. CDR의 잔기들은 박스 표시되어 있다 (CDR1: 서열번호 4, CDR2: 서열번호 5 및 CDR3: 서열번호 6). 점선 프래임으로 둘러싸인 잔기는 결정 구조에 나타나지 않는다.
도 2B는 인간화된 항체 BT061의 중쇄의 펩타이드 서열(서열번호 3)이다. CDR의 잔기들은 박스 표시되어 있다 (CDR 1: 서열번호 7, CDR2: 서열번호 8 및 CDR 3: 서열번호 9). 점선 프래임으로 둘러싸인 잔기는 결정 구조에서 표시되지 않는다.
도 3은 CD4-BT061 결정 구조의 비대칭 유닛을 나타낸 것이다.
도 4는 CD4-BT061 결정 구조를 CD4와 MHC II 분자의 복합체(PDB code 1JL4)의 결정 구조와 겹쳐 나타낸 것이다.
도 5는 CD4-BT061 결정 구조를 CD4와 gp120 HIV-1 단백질의 복합체(PDB code 2NY1)의 결정 구조와 겹쳐 나타낸 것이다. 상기 복합체는 항체 17b에 결합되어 있다.
도 6은 인간 CD4(Uniprot ID P01730)의 펩타이드 서열(서열번호 1)과 도메인 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 CD4의 표면 상의 BT061 결합부를 도시한 것이다. 표시된 아미노산 모두, N-말단 Ig-유사 V-타입 도메인 다음에 위치한, Ig-유사 C2-타입 1 도메인의 일부이다.
도 8은 BT061의 아미노산 경쇄 서열(서열번호 2)을 나타낸 것이다. CD4와의 결합에 참여하는 아미노산은 둥근 프래임으로 표시되어 있다.
도 9는 BT061의 아미노산 중쇄 서열(서열번호 3)을 나타낸 것이다. CD4와의 결합에 참여하는 아미노산은 둥근 프래임으로 표시되어 있다.
도 10은 CD4의 표면 상의 BT061 결합부를 나타낸 것이다. BT061 중쇄의 Tyr105에 대해 결합 포켓을 형성하는 아미노산은 원으로 표시되어 있다.
도 11은 CD4의 표면 상의 BT061 결합부를 나타낸 것이다. BT061 중쇄의 Arg104 - Asp106에 대해 결합 포켓을 형성하는 아미노산은 원으로 표시되어 있다.
도 12는 CD4의 표면 상의 BT061 결합부를 나타낸 것이다. BT061 경쇄의 Tyr34에 대해 결합 포켓을 형성하는 아미노산은 원으로 표시되어 있다.
스크리닝 방법
본 발명은 CD4, 바람직하게는 인간 CD4에 결합할 수 있는 하나 이상의 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, 본원에 제공된 정보는 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 항체 BT061과 CD4 간의 상호작용을 기술한다. 특히, BT061은 T 헬퍼 세포와 조절성 T 세포 둘다와 결합하지만, T 헬퍼 세포는 활성화되지 않으며 조절성 T 세포만 선택적으로 활성화된다. BT061의 구조와 CD4의 세포외 영역과 상호작용하는 방식에 대한 지식은, CD4 결합성과 조절성 T 세포의 선택적인 활성화 측면에서 BT061과 비슷한 특성을 가진 제제를 설계하고 제조하는 방법을 제공해 준다.
본 발명은, 일 측면에서, (a) 하나 이상의 후보 분자를 제공하는 단계; (b) 상기 하나 이상의 후보 분자가 인간 CD4의 아미노산 148 - 154 영역, 아미노산 164 - 168 영역 및 아미노산 185, 187, 189, 190 및 192로 이루어진 영역 중 하나 이상의 영역에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 결정된 분자를 CD4에 결합할 수 있는 것으로 선택하는 단계를 포함하는, CD4에 결합할 수 있는 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 인간 CD4의 영역은 아미노산 148 - 154 영역, 아미노산 164 - 168 영역 및 아미노산 185 - 192 영역이다.
일 구현예에서, 단계 (a) - (c)는 컴퓨터 시스템으로 수행할 수 있으며, BT061과 인간 CD4 간의 상호작용에 대한 본원에 기술된 정보를 기반으로 제작한 하나 이상의 후보 분자와 CD4 간의 상호 작용은, 즉 스크리닝은 컴퓨터를 이용한 분자 설계를 통해 이루어진다. 특히, CD4의 3차 구조 모델, 특히 이의 세포외 영역의 3차 구조 모델은, CD4의 일정 부분 이상의 아미노산 서열을 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 소프트웨어, 예컨대, Discovery Studio (Accelrys®) 또는 Benchware 3D Explorer (Tripos)에서 실행시켜 컴퓨터 시스템으로 제작한다. 또한, 이러한 프로그램으로 하나 이상의 후보 분자에 대한 서열 및/또는 구조 정보의 입력 또는 신규 생성을 달성할 수 있다. 그런 후, BT061과의 결합에 중요한 것으로 확인된 CD4의 영역(아래에서 추가로 논의됨)에 대한 후보 분자의 결합력을 조사할 수 있다.
특히, CD4에 결합할 수 있는 분자의 스크리닝 방법은 단계 (a) 및 (b)로서, (i) 적어도 아미노산 148 - 154, 164 - 168 및 아미노산 185, 187, 189, 190 및 192를 포함하는, CD4 유래 아미노산 서열을, 컴퓨터 시스템 또는 프로그램에 입력하는 단계; (ii) 상기 아미노산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 3차원 모델을 제작하는 단계; (iii) 하나 이상의 후보 분자의 3차원 구조를 제작 및 입력하는 단계; 및 (iv) 상기 CD4 아미노산과 후보 분자간의 상호작용을 시뮬레이션하여, 상기 후보 분자가 아미노산 148 - 154, 164 - 168 및 185, 187, 189, 190 및 192를 통해 CD4에 결합할 수 있는지를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
후보 분자의 선택은 실시예 1에서 후술하는 CD4 - BT061 상호작용의 특징들을 고려하여 더욱 좁힐 수 있다. 특히, 후보 분자는 염 브릿지 없이 CD4의 영역에 결합하는 것 및/또는 CD4의 표면에서, 하기로 구성되는 하나 이상의 결합 포켓에 수용되는, 하나 이상의 구성 성분을 포함하는 것으로 한정할 수 있다:
(i) CD4의 아미노산 잔기 S152, V153, Q154, Q164, G165, T185, V186, L187 및 K192 (도 10);
(ii) CD4의 아미노산 잔기 S150, S152, G165 및 G166 (도 11); 및/또는
(iii) 아미노산 잔기 S150, P151, S152 및 K167 (도 12).
이러한 컴퓨터 구현법은 (d) 단계 (c)에서 선택된 분자를 제작하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 선택된 분자가 펩타이드인 경우, 펩타이드의 아미노산 서열을 컴퓨터에서 입수하여, 시험관내에서 제조한다. 그런 후, 선택된 분자를 CD4의 해당 영역/아미노산을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 접촉시키거나, 또는 선택된 분자를 CD4 발현 세포와 접촉시킴으로써, 시험관내에서 선택된 분자의 활성을 평가할 수 있다. 이러한 시험관내 단계는, 단계 (a) - (c)를 시험관내에서 수행하는 제1 측면의 구현예에 대해 하기에서 추가적으로 설명한다.
특히, 전술한 컴퓨터를 이용한 구현예에 대한 대안책으로서, 스크리닝 방법의 단계 (a) - (c)는 시험관내에서 수행할 수 있으며, 단계 (b)는 하나 이상의 후보 분자를 CD4의 해당 영역/아미노산과 접촉시키는 단계 및 상기 후보 분자가 상기 영역들 중 하나 이상의 영역에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 구현예의 예로, (a) 하나 이상의 분자를 인간 CD4의 아미노산 148 - 154 영역, 아미노산 164 - 168 영역, 및 아미노산 185 - 192 영역 중 하나 이상 영역을 포함하는 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 하나 이상의 분자가 상기 펩타이드의 하나 이상의 영역에 결합하는지를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 분자가 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, CD4에 결합할 수 있는 하나 이상의 분자의 스크리닝 방법을 포함한다.
본 발명의 방법은, 바람직하게는 분자의 라이브러리 스크리닝 방법을 포함한다. 특히, 라이브러리는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 제조된 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 라이브러리는 다수의 여러가지 아미노산/펩타이드를 체계적으로 조합한 펩타이드 라이브러리일 수 있다. 일반적으로, 펩타이드 라이브러리는 고상, 대체로 평평한 표면 또는 비드로서 제작될 수 있는 수지 상에서 합성한다 (고상 펩타이드 합성). 이러한 라이브러리는 단백질-단백질 상호작용, 약물 개발, 단백질 정제 및 다양한 친화성을 가진 항체 변이체를 제작하기 위한 항체 인지 서열의 변이에 활용할 수 있다.
아울러, 라이브러리는 파지 디스플레이 외에도 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, mRNA 디스플레이, 리보솜 및 폴리솜 디스플레이를 포함한다. 리보솜 디스플레이는, 선택 단계에서 복합체로서 사용되는 고정된 리간드에 결합된 mRNA 전구체에 대해 번역된 단백질을 만드는 프로세스를 포함한다. mRNA 디스플레이는 퓨로마이신 결합을 통해 이의 mRNA 전구체와 이에 대한 번역된 펩타이드 또는 단백질을 만든다.
박테리아 디스플레이는 유세포 측정 또는 반복적인 선택 과정(바이오패닝(biopanning))을 이용하여 박테리아의 표면 상에 제시되는 폴리펩타이드를 스크리닝할 수 있는 라이브러리 기법이다.
효모 디스플레이(Abbott) 기법에서는, 관심 단백질을 효모 표면에 Aga2p 단백질에 대한 융합체(fusion)로서 제시한다. Aga2p 단백질은 천연적으로 효모 세포 접합(yeast cell mating)이 이루어지는 동안 세포-세포 접촉을 매개하기 위해 효모가 이용하는 것이다. 이처럼, Aga2p 단백질을 통한 단백질 디스플레이는 단백질을 세포 표면으로부터 멀리 돌출시켜, 효모 세포벽에서 다른 분자들과의 상호작용이 발생할 가능성을 최소화한다. 자기 분리 및 유세포 측정법을 효모 디스플레이 라이브러리와 조합하는 방법은, 방향성 진화(directed evolution)를 통해 거의 모든 수용체에 대하여 고친화성의 단백질 리간드를 분리하기 위한 매우 효과적인 방법이다.
폴리솜 디스플레이는 박테리아 폴리솜에 제시되는 매우 큰 펩타이드 라이브러리이다 (Mattheakis et al., 1994). 또한, MULTIPIN® 펩타이드 기법을 이용하여 라이브러리를 제작할 수 있다 (Tribbick et al., J Immunl. Methods (2002) 267: 27-35).
시험관내 접촉 단계에서, 선택된 분자 또는 후보 분자를 인간 CD4의 하기 영역 또는 아미노산들("CD4의 해당 영역들/아미노산들), 도 6에 나타낸 바와 아미노산의 번호가 지정된, 아미노산 148 - 154 영역, 아미노산 164 - 168 영역 및 아미노산 185, 187, 189, 190 및 192의 영역 중 하나 이상의 영역을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 접촉시킬 수 있다. 바람직하게는, 인간 CD4의 영역은 아미노산 148 - 154의 영역, 아미노산 164 - 168의 영역 및 아미노산 185 - 192의 영역이다. 보다 바람직하게는, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 이들 영역들을 모두 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 인간 CD4의 아미노산들 Lys26, Arg156, Arg159, Lys161 및 Lys192 중 하나 이상을 더 포함한다. 가장 바람직하게는, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 인간 CD4의 Ig-유사 C2-타입 1 도메인(즉, 아미노산 126 - 205)과, 선택적으로 Ig-유사 V-타입 도메인을 포함한다. 특히, CD4의 D1을 이용하여 에피토프를 안정화한다. 즉, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 경쟁적인 결합 분석에 사용하여야 하는 경우, D1을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 이들 영역들에서 하나 또는 2개의 아미노산이 결손될 수 있다는 점에도 유념한다. 바람직하게는, 펩타이드는 아미노산 50개 미만의 길이이고, 더 바람직하게는 아미노산 20개 미만의 길이이다.
펩타이드는 천연 펩타이드, 예컨대 CD4의 효소적 절단 또는 직접 숙주 세포 발현에 의해 제조된 것이거나 또는 합성 펩타이드일 수 있다. 또한, 펩타이드는, 예컨대 페길화(PEGylation), 인산화, 아미드화(amydatio), 아세틸화, 바이오틴 또는 FITC 등의 형광 염료로의 표지, 또는 동위원소로의 표지를 통해 변형될 수 있다. 다른 변형으로는 "다중 항원 펩타이드의 사용"과 같은 기법을 이용할 수도 있다. 이러한 기법으로, 고역가(high-titer) 또는 항-펩타이드 항체 및 합성 펩타이드 백신을 제조할 수 있다. 이 시스템은, 다중 펩타이드 체인들을 부착시킬 수 있는 백본을 제작하는데 라이신의 α- 및 ε-아미노기를 활용한다. 라이신 층(tier)의 갯수에 따라, 다양한 수의 펩타이드 분지를 합성할 수 있다. 이러한 방법은 항원을 단백질 캐리어에 접합시킬 필요성을 생략시킨다 (Briand et al., J Immunol Methods (1992). 156; 2: pp 255-265).
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 바람직하게는 인간 CD4의 펩타이드 서열들로 수행된다. 그러나, 다른 포유류의 CD4 단백질의 상동 영역 또는 Ig-유사 C2-타입 1 도메인을 포함하는 다른 분자로도 동일하게 수행할 수 있다.
하나 이상의 분자, 선택된 분자 또는 후보 분자를 펩타이드와 접촉시키는 단계, 및 하나 이상의 분자가 펩타이드의 하나 이상의 영역에 결합하는지를 검출하는 단계는, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 구현예에서, 펩타이드는 막에 고정되어 있거나 또는 스팟팅된 선형 펩타이드이다. 접촉 단계 중에, CD4 펩타이드 서열에 결합할 수 있는 분자가 포획된다.
다른 구현예로서, 야생형 인간 CD4 외막의 구조를 모방할 수 있는 펩타이드를 제작한다. 이는 당해 기술 분야에 공지된 구조 기반의 분자 설계법으로 행할 수 있다.
스크리닝을 하기 위해 사용가능한 디스플레이 방법을 아래에 기술한다.
선형 에피토프를 스크리닝하기 위해, 에피토프 맵핑 기법을 사용할 수 있다. 아미노산 하나가 중복되는, 타겟 에피토프의 절편(part)들(예, 아미노산 10-15개)을 구성하는 아미노산 서열들을, 막(예, 셀룰로스)에 스팟팅한다. 그런 후, 스팟팅된 아미노산 서열을 인지하는 단백질 또는 펩타이드를 스크리닝할 수 있다. 수차례의 선택 과정을 다양한 엄격 조건에서 수행하여, 고친화성 결합체(binder)를 선별할 수 있다.
불연속 에피토프를 스크리닝하기 위해, 파지 디스플레이 등의 기법들이 개발되었다. 선형 또는 환형 펩타이드에 대한 현행 표준 라이브러리들은 약 109개의 독립 클론들로 구성된 다양성을 갖추고 있으며, 이는 랜덤 포지션이 최대 7개인 라이브러리가 잠재적인 서열 레페토리에 대해 광범위한 커버리지를 이론적으로 보증한다는 의미이다. 시험관내 번역 시스템의 경우, 펩타이드와 이의 mRNA의 커플링은 RNA/펩타이드/리보솜 또는 단순히 mRNA/펩타이드 복합체로 구성된 소형 입자들이 참여하는 무세포성 시스템에서 이루어지기 때문에, 다양성이 보다 큰 펩타이드 라이브러리가 제작된다. 다른 라이브러리로는 폴리솜 또는 리보솜 디스플레이 (Mattheakis et al., PNAS 1994; 91(19):9022-6) 또는 PROfusion 기법 (Roberts and Szostak, PNAS (1997) 94(23):12297-302)이 있다. 후자 기법은, 3' 말단에 펩티딜 어셉터 항생제인 퓨로마이신을 가지고 있는 합성 mRNA를 시험관내에서 번역함으로써 제조할 수 있는, mRNA와 이를 코딩하는 펩타이드 또는 단백질 간의 공유적 융합체를 포함한다.
미니셀 디스플레이(Minicell display) (미국 특허 7,125,679)도 또한 가능한데, 이것은 외표면에서 발현되는, 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 포함하는 스크리닝용 펩타이드 조제물이다. 이와 마찬가지로, 박테리아 플라젤라 단백질인 FliC와 티오레독신을 이용하는 Flitrix (Invitrogen Corp.) 랜덤 펩타이드 라이브러리도 이용할 수 있다.
아울러, 전술한 디스플레이 방법 외에도, 질량 분광측정법 또는 고상 에피토프 회수법(SPHERE) (Genzyme)도 적용할 수 있다 (Lawendowski et al., J Immunol., (2002) 169: 2414-2421).
일 구현예에서, 결합의 검출은 X선 결정학 또는 NMR의 수행으로 이루어진다. 구체적으로, 당해 기술 분야에 공지된 X선 결정법을 이용하여 염 브릿지 없이 펩타이드에 결합하는 분자를 선별할 수 있다.
다른 예로 또는 부가적으로, 본 방법은, 일 측면으로, 선택된 분자 또는 후보 분자를, CD4를 발현하는 세포, 구체적으로 CD4+CD25+ 조절성 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는, 구체적으로, 선택된 분자 또는 후보 분자가, CD4 발현 세포, 특히 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포의 활성을 조절하는 능력(바람직하게는 T 헬퍼 세포를 활성화시키지 않고 Treg 세포만을 선택적으로 활성화함)을 결정하거나, 또는 선택된 분자 또는 후보 분자가 CD4 수용체 발현, 특히 시험관내 PBMC(말초 혈액 단핵구 세포) 배양물의 특정 림프구 집단에서의 CD4 수용체 발현을 감소 또는 하향 조절하는 능력을 결정하기 위해 행해질 수 있다. 이러한 구현예들에서, 선택된 분자 또는 후보 분자는 항체 또는 항체 단편, 특히 후술하는 바와 같이 IgG1 타입의 항체 또는 항체 단편인 것이 바람직하다.
조절을 분석하기 위해, Treg를 일반적으로 상업적으로 입수가능한 CD25, CD27, CD62L 및/또는 CD127 분류용 분리 키트(자기 비드 분리)와 Fox3에 대한 추가적인 세포내 염색을 이용하여 분리할 수 있다. Treg는 CD127 음성, CD25와 Foxp3 양성이다. 또한, 세포 표면에 조합되어 있는 엑토뉴클레오티다제인 CD39를 사용하여, 억제자 기능이 강력한 Treg를 분리할 수 있다 (Mandapathil et al., J Immunol. Methods (2009). 346 (1-2), 55-63). 상업적으로 입수가능한 키트들은 CD4+ 음성 선별과 이후 CD25+ 양성 선별을 조합 이용하여, CD4와 CD25가 양성인 세포 집단을 분리한다. 이들 세포는 다시 가공처리할 수 있다. CD25와 전사인자 Foxp3는 Treg의 억제 기능과 관련있는 발현 마커들이다. Foxp3에 의한 세포내 염색을 통해 조절 표현형은 확인되지만, 세포내 염색으로 인해 세포는 추가적으로 치료학적 용도로 사용할 수 없게 된다. Foxp3는 활성화된 Treg/기능적으로 활성형인 Treg의 세포내 마커로서 통상적으로 사용되고 있다.
게다가, BT061과, 스크리닝 중인 분자는, 다른 상업적으로 입수가능한 항체에 결합하는 에피토프와는 구별되는 에피토프에 결합하기 때문에, Treg를 상업적으로 입수가능한 분리 키트(자가 비드 분리)와, 추가적으로, CD4 상의 BT061 결합부와 경쟁하지 않는 다른 CD4 항체(예, SK-3 OKT4)를 이용하여 정제할 수 있으며, 그런 후 후보 분자 또는 선택된 분자를 이용한 Treg의 활성화 분석으로, Treg를 정제할 수 있다.
후보 분자의 Treg 활성화 능력은, Treg를 후보 분자와 접촉시킨 다음, CD4+ CD25- 작동자 T 세포와 공동-배양하고, Treg의 억제 활성을 조사함으로써 분석할 수 있다. 활성화된 Treg는, CFSE로 표지될 수 있는(CFSE 희석 분석을 통한 세포 확대 평가), CD4+ CD25- 작동자 T 세포의 증식을 저해할 수 있다. 다른 예로, 작동자 세포의 증식은 [3H] 티미딘 병합으로 측정할 수 있다.
보다 구체적으로, 억제력은, 예를 들어 혼성 림프구 반응(MLR)으로 분석할 수 있다. Treg의 억제 작용에 의해 작동자 T 세포의 세포 분열이 저해될 수 있다. 이를 위해, 나이브(naive) 자가(autologous) CD4+ CD25- T 반응자 세포를 방사선 조사된 동종이계(allogenic) 자극제인 PBMC로 자극한다. 배양물에 Treg 또는 통상적인 T 세포들을 적정(titration)하여 접종하고, 증식을 티미딘 병합을 통해 평가할 수 있다.
또한, Treg의 활성화는 환형 AMP의 생성 확인(WO 2008/092905)을 통해 평가할 수도 있다.
공동-배양시 활성화된 Treg에 의해 영향을 받은 사이토카인들을 측정하여, 작동자 세포에 대한 상기 세포의 활성을 결정할 수 있다. 예를 들어, Treg는 IL-2를 소비하여 억제 활성을 발휘하며, 이로써 T 작동자 세포는 증식이 저해된다. 또한, 공동-배양 분석에서 IL-4 또는 IFNγ를 결정할 수 있으며, 이들은 Treg가 활성화된 경우에 감소될 수 있다. 아울러, T 작동자 세포 표면의 활성화 마커, 예컨대 CD25는 Treg 세포가 활성화되어 억제 활성을 발휘할때, 감소된다.
부가적으로, 공동-배양에서 활성화된 Treg에 의해 유발되는 작동자 세포(또한 CD4+일 수 있음)의 (Bim과 같은 인자를 통한) 세포 사멸을 결정하는 방법 역시 Treg의 활성화 여부를 조사하기 위한 다른 방법이다 (Pandiyan et al., Nature Immunol. (2007) 8 1353-1362).
Treg는 혈중 낮은 (2-10%) 비율로 존재하기 때문에, 이의 확장 전략들이 공지되어 있다. 예컨대, 항-CD3을 이용한 TCR 자극화 및 항-CD28과 라파마이신에 의한 공동-자극을 수행하여, T 세포의 수를 증가시킬 수 있다. 라파마이신은 T 작동자 세포가 아닌 Treg의 선별적인 생존을 촉진시킨다.
몇가지 다클론 확장 프로토콜들이 이용가능하다. 예컨대, CD4/CD25에 대한 양성 선택을 수행한 후, (자극을 위해) 항-CD3 및 항-CD28 항체를 Treg의 수를 늘릴 수 있는 IL-2 및/또는 IL-15와 조합하여 사용함으로써, Treg 세포를 억제력을 유지하면서 다클론적으로(polyclonally) 확장시킬 수 있다 (Earle et al., Clin. Immunol. (2005) 115: 3-9).
CD4 발현의 조절과 관련하여, 항-CD4 항체를 첨가함으로써, 세포 표면에서의 CD4 수용체의 발현을 낮출 수 있다. 이러한 특징은 CD4 결합 수준을 결정하기 위한 효능 분석의 토대로서 사용할 수 있다. 구체적으로, 이러한 분석에서, 접촉 단계는 (i) 후보 분자 또는 선택된 분자를 인간 공여 혈액 유래의 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)와 함께 37℃에서 인큐베이션하는 단계; (ii) CD4와의 결합에 대해 BT061과 경쟁하지 않는 항-CD4의 표지된 항체로 상기 인큐베이션한 세포를 염색(staining)시키는 단계; 및 (iii) 염색 수준을 검출하여, CD4 수용체의 점유율(occupation)을 결정하고, 따라서 세포 표면에 존재하는 CD4 분자의 양을 정량하는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 분석은 인간 공여 혈액으로부터 PBMC(즉, 림프구 및 단핵구)를 분리한 다음, 이를 37℃에서 다양한 농도의 후보 분자 또는 선택 분자 (바람직하게는 항체 또는 항체 단편)와 함께 인큐베이션하는 과정을 포함한다. 3시간 인큐베이션한 후, BT061와 결합하는 에피토프와는 다른 CD4의 에피토프에 결합하는 피코에리트린 항-CD4와 같은 형광색소-표지된 항체를 첨가함으로써, 세포를 염색한다. 이러한 염색 항체는 특정 림프구 집단의 CD4 수용체에 표지된다. BT061 에피토프와 사용한 형광 색소-표지된 CD4 항체는 CD4 분자 상의 각각 다른 에피토프를 인지하며, 경쟁하지 않기 때문에, 이러한 기법으로, 후보 분자 또는 선택 분자에 의한 CD4와의 결합과는 독립적으로, 세포 표면에 있는 CD4 수용체의 양을 측정할 수 있다. 이러한 측정은 항체-표지된 세포에 레이저 빔을 통과시켜 자극하는 유세포 측정기로 수행한다. 레이저 빔에 의해 자극을 받으면, 결합된 항체에 비례하여 염색된 세포는 형광을 방출하며, 방출되는 광을 유세포 측정기로 포착하여, 당해 기술 분야에 공지된 소프트웨어, 예컨대 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc)를 이용하여 평가할 수 있다. 소프트웨어(예, Parallel Line Assay software, Stegmann Systems)를 이용하여, 그래서 병행하는 표준 실험에 대한 샘플의 상대적인 활성(효능)으로 계산할 수 있다.
본 발명의 본 측면에 대한 추가적인 구현예에서, 접촉 단계는 CD4 펩타이드 또는 폴리펩타이드 (바람직하게는 CD4의 D1 및 D2를 포함함) 또는 CD4를 발현하는 세포, 및 후보/선택된 분자를, 경쟁 항체 또는 BT061의 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인을 가진 항체 단편과 접촉시켜, 상기 후보/선택된 분자가 CD4에 대한 상기 경쟁 항체 또는 항체 단편의 결합을 차단할 수 있는지를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
제1 측면에서, 하나 이상의 후보 분자는 펩타이드 또는 비-펩타이드성일 수 있다. 구체적으로, 하나 이상의 분자는 미모토프(mimotope), 펩티드 모방체, 소형 분자, 천연 또는 조작된 리포칼린 기반의 인지 단백질, 올리고뉴클레오티드, siRNA, DARPin, 파이브로넥틴, 어피바디(affibody), 쿠니츠-타입 저해제, 펩타이드 앱타머, 리보자임, 독소, 카멜리드(camelid), 항체, 항체 단편 또는 항체 유래 분자일 수 있다.
미모토프는 단백질, 탄화수소 또는 지질 에피토프를 모방하는 펩타이드로서, 파지 디스플레이 기법에 의해 제작할 수 있다. 항체를 이용한 선별시, 미모토프는 오직 B 세포의 에피토프이고, 항원/알레르겐-특이 T 세포의 에피토프는 결여되어 있다. 담체가 커플링되어 있거나 또는 다중 항원성 펩타이드 형태로 제시되는 미모토프는 면역원성을 획득하며, 백신 접종시 에피토프-특이 항체를 유도한다.
펩타이드 모방체는 펩타이드를 모방하도록 설계된 소형 단백질-유사 체인이다. 이것은 전형적으로 분자의 특성을 바꾸기 위해 기존 펩타이드를 변형시켜 제작한다. 예를 들어, 펩타이드 모방체는 분자의 안정성 또는 생물 활성에 변화를 주기 위한 변형을 통해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 자연적으로는 발생하지 않는 펩타이드에 대한 변화(예, 백본 변형 및 비-천연 아미노산의 병합)를 수반한다.
펩타이드 모방체의 예는, 암 세포가 세포자살이라고 하는 프로그래밍된 세포 사멸 형태로 유도되도록, 타겟 단백질에 결합시키기 위한 목적으로 설계 및 합성된 것들이었다. 본질적으로, 이것은 세포내 세포자살 경로를 활성화시키는 주요 상호작용을 모방함으로써 작동한다.
폴다머(foldamer)는 비공유 상호작용에 의해 안정화된 2차 구조를 취하는 개개 체인 분자 또는 올리고머이다 (Gellman, Acc. Chem. Res (1998) 31 (4): 173-180; Hill et al., Chem. Rev. (2001) 101 (12): 3893-4012). 이것은 단백질, 핵산 및 다당류의 잘 정의된 구조, 예컨대 나선 구조 및 β-시트로 폴딩되는 능력을 모방하는 인공 분자이다. 폴다머는 분자의 자가-조합, 분자 인지 및 숙주-게스트 화학 등의 흥미로운 초분자 특징들 다수를 나타내는 것으로 입증되었다. 이는 생물 분자의 모델로서 연구되고 있으며, 항미생물 활성을 보이는 것으로 입증되었다. 또한, 이것은 새로운 기능성 물질 개발에 있어 엄청난 잠재적인 유용성을 가진다.
소형 분자는 정의상 폴리머가 아닌 저분자량의 유기 화합물이다. 소형 분자의 분자량 상한은 세포막을 통해 신속하게 분산하여 세포내 작용 부위에 도달할 가능성이 있는 약 800 달톤이다. 소형 분자는 단백질, 핵산 또는 다당류와 같은 바이오폴리머에 대해 고친화성을 발휘하며, 아울러 바이오폴리머의 활성 또는 기능을 변이시킨다.
DARPin (Designed Ankyrin Repeat Proteins)은 항원 또는 항원 구조도 인지할 수 있는 인공 단백질이다. 이것은 구조적으로 Ankyrin 단백질로부터 유래되며, 약 14 kDa (아미노산 166개)이고, 3개 반복 모티프로 구성되어 있다. 이것은 항원에 대해 항체와 유사한 수준의 친화성을 나타낸다 (Stumpp et al., Drug Discov. Today (2008) 13, Nr. 15-16, S. 695-701).
어피바디(Affibody)® 분자는, 매우 많은 수의 타겟 단백질에 특이적으로 결합되도록 조작될 수 있는 작고 강건한 고친화성 단백질 분자이다.
용어 "카멜리드"는 카멜리드에서 생산되며 중쇄 동형이량체와 이들 분자의 유도체를 포함하는 항체를 지칭한다 (Muyldermans et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 128; 1-3; pp.178-183 (2009)).
후보 분자는, 바람직하게는, 항체 또는 항체 단편이다. "항체, 항체 단편 또는 항체 유래 분자"라는 표현은 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중-특이 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 용어 "항체 단편"은 구체적으로 Fab, Fab', F(ab)'2, Fv 및 scFv 단편, 그리고 디아바디 또는 트리바디를 포함하는 단편을 포함한다. 바람직하게는, 이것은 인간화된 또는 인간 항체를 기반으로 한다. 보다 바람직하게는, 항체는 불변 영역/도메인, 즉 Fc 영역을 포함한다. 항체가 인간 불변부를 포함하는 경우, 이 불변부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 등의 면역글로불린의 임의 클래스 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 등의 임의 이소형으로부터 불변 도메인들 중에서 선택될 수 있다. 바람직한 불변부는 IgG, 구체적으로 IgG1의 불변 도메인들 중에서 선택된다.
여러가지 Ig 서브클래스의 Fc 영역들은 개별 서브클래스에 특이적인 세포 FcR과 결합한다. 다양한 친화성, CD16, CD32 및 CD64을 가진 IgG 이소형과 결합하는, 3종의 FcR 클래스들이 공지되어 있다. 다양한 패턴의 FcγR는 단핵구, B 세포, 천연 살상(NK) 세포 등과 같은 다양한 여러가지 면역 세포들에서 발현된다. 본 발명자들은, 항체 BT061의 불변부가 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 능력이 T 세포에서 항체가 CD4의 하향 조절을 유발하는 능력에 중요하다는 것을 시험관내에서 확인하였다. 특히, 시험관내 연구에서는, 주로 단핵구에서 발현되는 Fcγ 수용체, Fcγ1 수용체가 주로 참여하는 것으로 나타났으며, PBMC의 배양시 단핵구가 존재하는 것은 BT061-처리된 T 세포에서의 CD4의 하향 조절을 부여하는데 필수 충분 조건이다.
아울러, 본 발명의 일 구현예에서, 후보 분자는 Fc 수용체, 바람직하게는 FcγRI (즉, CD64)에 결합할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 후보 분자는 IgG1 항체의 Fc 부분을 포함한다. 또한, 또는 다른 예로, 후보 분자는 Fc 수용체를 통해 단핵구에 결합할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면에서, 스크리닝 중인 분자는 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 항체 또는 항체 단편이 아니다. 이들 CDR들의 서열은 도 2A 및 2B로 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 스크리닝 중인 분자는 Racadot et al. (Clin. Exp. Rheum., 10, 365-374 (1992))에 의해 언급된 뮤라인 B-F5 분자가 아니다.
본 발명의 제1 측면에 따른 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 후보 분자가 항체 또는 항체 단편인 경우, 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄의 CDR1과 CDR3, 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1과 CDR2를 포함하며, 선택적으로 상기 CDR에는 하기 아미노산 치환을 포함한다:
(i) 경쇄 CDR1은 Ser32; Gly33; 및 Tyr34를 포함함;
(ii) 경쇄 CDR2는 Leu54; 및 Ile57을 포함함;
(iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
(iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His 110 또는 Tyr110를 포함함.
다른 예로, 후보 분자는, BT061의 V 도메인(즉, 서열번호 2 및 서열번호 3)과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 가진 V 도메인을 포함하며, 경쇄 V 도메인의 CDR1에 서열 모티프 SGYSY (서열번호 10), 경쇄 V 도메인의 CDR2에 서열 모티프 LASILE (서열번호 11) 및 중쇄 V 도메인의 CDR3에 서열 모티프 SYY/F/HRYD (서열번호 13)를 포함하는, 항체 또는 항체 단편이다.
본 방법에서, 스크리닝되는 하나 이상의 분자는, 항체 BT061에 대한 유사성으로 특정되는 후보 분자들과, 본 발명자에 의해 BT061 항체와 CD4의 상호작용에 중요한 것으로 동정된 BT061 내부 잔기로 구성된 세트이다. 특히, 본 방법은, BT061과 비교하여 거의 비슷하거나 우수한 결합 친화성/특이성을 가지며, Treg 활성화 활성을 가진 분자를 동정하는 방법이다.
인간화된 항체 BT061의 경쇄 및 중쇄의 펩타이드 서열들은 각각 도 2A와 도 2B에 나타낸다. 경쇄 및 중쇄의 CDR은 도에 표시되어 있다. 도에서, 이들 CDR의 내부 아미노산 잔기들은 잔기의 종류와 번호로 식별되며, 번호는 도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이 BT061 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변부의 내부 아미노산 위치를 표시한다. 잔기의 종류와 번호는 BT061 CDR에서 언급되는 아미노산 잔기를 명확하게 식별하기 위한 목적이다. 그러나, 잔기의 번호는 본 방법으로 스크리닝 중인 후보 항체 또는 단편의 위치에 있는 잔기로 한정하고자 하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 구현예의 항체에서, Ser32는, 비필수 아미노산 잔기가 경쇄의 섹션 1 - 30까지 결손된 경우에는 경쇄 CDR1내 31번 위치에 있을 수도 있다.
바람직한 구현예에서, BT061 경쇄의 CDR1과 CDR2 및 BT061 중쇄의 CDR1과 CDR3의 서열에서, 아미노산 치환은, 하기 표 4 및 표 5에 기술된 치환들로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 항체 또는 항체 단편은 Tyr53 또는 Phe53을 포함하는 경쇄와 Ser28을 포함하는 중쇄를 포함한다(실시예 1에서 표 7에 언급됨). 다른 예로 또는 부가적으로, 항체 또는 항체 단편은 Asp64를 함유하는 경쇄를 포함하거나, 및/또는 항체 또는 항체 단편은 Asp31 및 Glu56 중 적어도 하나를 가지는 중쇄를 포함한다(실시예 1에서 표 8에 언급됨). 항체 또는 항체 단편은 BT061 경쇄의 CDR3 및/또는 BT061 중쇄의 CDR2와, 선택적으로 이들 CDR의 서열에 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 치환은 표 4 및 표 5에 기술된 것으로부터 선택된다.
스크리닝 방법에 사용하기 위한 후보 항체 또는 항체 단편은, BT061의 공지 서열을 돌연변이시킴으로써 제조할 수 있다. 특히, 이들 돌연변이가 CDR 내부 돌연변이인 경우, 이는 바람직한 치환이 이루어지거나 또는 전술한 아미노산이 유지되도록 타겟화된 돌연변이일 수 있다.
스크리닝 방법의 단계 (a)가 시험관내에서 수행되는 경우, 타겟화된 돌연변이 유발을 이용하여 CDR내 정해진 위치에서 아미노산 교체가 일어나도록 할 수 있다. 아미노산에 대한 대응되는 DNA 서열을 인지함으로써, 다양한 바람직한 아미노산 치환을 포함하는 특이적인 돌연변이 라이브러리를 만들 수 있다. 스크리닝 방법의 (a) - (c) 단계를 컴퓨터 시스템에서 수행하는 경우, CD4에 대한 전술한 방식과 유사한 방식으로 아미노산 서열을 입력하여, 후보 항체 또는 항체 단편의 3차 구조를 수득할 수 있다.
표 4. BT061 경쇄 CDR의 서열 변이를 나타낸 표
위치 BT061 서열 등가 변이(Isosteric Variation)
CDR1 24 Arg 24 Lys Gln Asn
25 Ala 25 Gly
26 Ser 26 Thr
27 Lys 27 Arg Glu
28 Ser 28 Gly Pro
29 Val 29 Ala Ile
30 Ser 30
31 Thr 31 Ser Asn Gln Asp
32 Ser 32
33 Gly 33
34 Tyr34
35 Ser 35
36 Tyr 36
37 Ile 37 Val Leu
38 Tyr 38
CDR2 54 Leu 54
55 Ala 55
56 Ser 56
57 Ile 57
58 Leu 58
59 Glu 59
60 Ser 60 Asn Gln Thr Glu Asp
CDR3 93 Gln 93
94 His 94
95 Ser 95
96 Arg 96 Lys
97 Glu 97 Asp Arg
98 Leu 98 Gly Ile
99 Pro 99
100 Trp 100
101 Thr 101 Ser
표 5. BT061 중쇄 CDR의 서열 변이를 나타낸 표
위치 BT061 서열 등가 변이
CDR1 31 Asp 31 Glu Thr Cys Pro Met Tyr
32 Cys 32 Ser Ala Gly Val
33 Arg 33 Lys Ser Thr Glu
34 Met 34 Ile Leu Ala Val
35 Tyr 35
CDR2 51 Ile 51 Ala Val Gly
52 Ser 52 Asp Gly Ala Thr
53 Val 53 Ser Gly Thr Ile
54 Lys 54 Arg Tyr
55 Ser 55 Asn Gln Thr Glu
56 Glu 56 Asp Arg
57 Asn 57 Asp Tyr Gln Glu
58 Tyr 58 His Lys
59 Gly 59 Ser
60 Ala 60 Ser Thr
61 Asn 61 Gln Asp
62 Tyr 62 Phe His
63 Ala 63 Gly Ser
64 Glu 64 Asp Gln Asn Arg
65 Ser 65 Gly Ala Asn
66 Val 66 Ile Ala Ser Gly
67 Arg 67 Lys Gln Tyr His Glu
68 Gly 68
CDR3 101 Ser 101
102 Tyr 102
103 Tyr 103 Phe His
104 Arg 104
105 Tyr 105
106 Asp 106
107 Val 107 Ile Pro Asp Thr Glu
108 Gly 108 Ala
109 Ala 109 Ser
110 Trp 110 Phe His Tyr
111 Phe 111
112 Ala 112 Ser
113 Tyr 113 Phe His Asn
등가 변이는 입체 효과(steric effect)를 야기하기 않는 변이, 즉, 이것은 어떠한 방식으로도 항체의 구조를 변화시키지 않는다.
제2 측면에서, 본 발명은, CD4에 결합할 수 있는, 항체 또는 항체 단편인, 후보 분자를 스크리닝하는 방법으로서,
(a) BT061 경쇄의 CDR1 및 CDR2와, BT061 중쇄의 CDR1 및 CDR3를 포함하며, 상기 CDR의 서열에 선택적으로 하기 아미노산 치환을 포함하는, 항체 또는 항체 단편을 제공하는 단계:
(i) 경쇄 CDR1은 Ser32; Gly33; 및 Tyr34를 포함함;
(ii) 경쇄 CDR2는 Leu54; 및 Ile57을 포함함;
(iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
(iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His 110 또는 Tyr110을 포함함,
(b) 상기 항체 또는 항체 단편이 CD4에 결합하는지 여부를 결정하는 단계, 및
(c) 상기 (b)에서 결정된 항세 또는 항체 단편을 CD4에 결합할 수 있는 것으로 선택하는 단계를 포함하며,
상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명의 제2 측면에 따른 스크리닝 방법의 단계 (a) - (c)는, 본 발명의 제1 측면과 관련하여 전술한 방법과 유사한 방식으로 컴퓨터 시스템으로 수행할 수 있다. 구체적으로, 다수의 BT061 변이체를, BT061와 이의 CD4 에피토프 간의 상호작용 및 이들 변이체와 시뮬레이션한 CD4와의 상호작용에 중요한 잔기에 대한, 본원에서 제공되는 정보를 기반으로, 인 실리코(in silico)로 제작할 수 있다.
본 구현예에서, 본 방법은 후보 분자 또는 항체 단편을 CD4를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템 수행에 대한 다른 구현예에서, 본 발명의 제2 측면에 따른 스크리닝 방법의 단계 (a) - (c)는 시험관내에서 수행할 수 있으며, 단계 (b)는 후보 항체 또는 항체 단편을 CD4를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, CD4에 대한 결합력은 후보 분자의 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화시키는 능력을 기반으로 결정한다.
구체적으로, 본 발명의 이러한 측면은 CD4+CD25+조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 항체 또는 항체 단편의 스크리닝 방법일 수 있으며, 이 방법은
(a) 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 CD4+CD25+ 조절성 T 세포와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 항체 또는 항체 단편의 상기 CD4+CD25+ 조절성 T 세포 활성화 능력을 평가하는 단계; 및
(c) CD4+CD25+조절성 T 세포를 활성화하는 항체 또는 항체 단편을 동정하는 단계를 포함하며,
상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 경쇄의 CDR1 및 CDR2와, BT061 중쇄의 CDR1 및 CDR3를 포함하며, 선택적으로 제공되는 CDR 서열에 하기 아미노산 치환을 포함하며:
(i) 경쇄 CDR1은 Ser32; Gly33; 및 Tyr34를 포함함;
(ii) 경쇄 CDR2는 Leu54; 및 Ile57을 포함함;
(iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
(iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His 110 또는 Tyr110을 포함함,
상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는다.
본 발명의 제1 측면에 따른 스크리닝 방법과 관련하여 상기에서 제공된 구현예들에 대한 설명과 바람직한 특징들은, 본 발명의 제2 측면에 따른 스크리닝 방법에도 적용됨에 유의한다.
본 발명의 이러한 측면들은, 추가적인 사용 또는 하위 분석을 위해, 선택된 분자, 구체적으로 선택된 항체 또는 항체 단편의 생산 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이에, 본 발명은 치료 조성물의 제조 방법 및 이 방법으로 수득가능한 치료 조성물을 추가로 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은,
(a) 전술한 스크리닝 방법에 따른 방법을 이용하여, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 것으로 결정된 분자를 선택하는 단계; 및
(b) 상기 분자를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 단계.
구체적으로, 치료 조성물은 상기 분자를 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 조합함으로써 제조할 수 있다.
항체 및 항체 단편
본 발명자의 연구로, CD4+ CD25+ 조절성 T 세포와의 상호작용 및 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포의 활성화에 중요한, BT061의 특징을 동정할 수 있었다. 이로써, CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는, BT061 항체의 특이적인 돌연변이/변이체들이 동정되었다.
이에, 본 발명은, 제3 측면에서, BT061 경쇄의 CDR1 및 CDR2와, BT061 중쇄의 CDR1 및 CDR3, 및 선택적으로 제공되는 CDR의 서열은 하기 아미노산 치환을 포함하는, CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 제공하며:
(i) 경쇄 CDR1은 Ser32; Gly33; 및 Tyr34를 포함함;
(ii) 경쇄 CDR2는 Leu54; 및 Ile57을 포함함;
(iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
(iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His 110 또는 Tyr110을 포함함,
상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는다.
다른 예로, 제3 측면은 BT061 경쇄의 CDR1 및 CDR2와, BT061 중쇄의 CDR1 및 CDR3, 및 선택적으로 제공되는 CDR의 서열은 하기 아미노산 치환을 포함하는, CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 제공하며:
(i) 경쇄 CDR1은 Ser32 또는 Pro32; Gly33 또는 Ala33; 및 Tyr34를 포함함;
(ii) 경쇄 CDR2는 Leu54, Ile54 또는 Thr54; 및 Ile57 또는 Leu57; Val57 또는 Thr57을 포함함;
(iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
(iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His 110 또는 Tyr110을 포함함,
상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는다.
전술한 바와 같이, 인간화된 항체 BT061의 경쇄 및 중쇄의 펩타이드 서열을 도 2A 및 도 2B로 각각 나타낸다. 경쇄 및 중쇄의 CDR들은 이들 도면에 표시된다. 전술한 바와 같이, 이들 CDR 내부 아미노산 잔기들은 잔기의 종류와 번호로 식별되며, 번호는 도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이 BT061 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변부의 내부 아미노산 위치를 표시한다. 잔기의 종류와 번호는 BT061 CDR에서 언급되는 아미노산 잔기를 명확하게 식별하기 위한 목적으로 기재한다. 그러나, 잔기의 번호는 본 발명의 항체 또는 단편내 동일 위치에 있는 잔기로 한정하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체에서, Ser32는, 비필수 아미노산 잔기가 경쇄의 섹션 1 - 30까지 결손된 경우에는 경쇄 CDR1내 31번 위치에 있을 수도 있다.
바람직한 구현예에서, BT061 경쇄의 CDR1과 CDR2 및 BT061 중쇄의 CDR1과 CDR3의 서열에서, 아미노산 치환은, 상기 표 4 및 표 5에 기술된 치환들로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 항체 또는 항체 단편은 Tyr53 또는 Phe53을 포함하는 경쇄와 Ser28을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 예로 또는 부가적으로, 항체 또는 항체 단편은 Asp64를 함유하는 경쇄를 포함하거나, 및/또는 실시예 1의 표 8에서 상호작용에 중요한 것으로 표시된 하나 이상의 아미노산을 가지는 중쇄를 포함한다. 구체적으로, 중쇄는 Asp31 및/또는 Glu56을 포함한다. 항체 또는 항체 단편은 BT061 경쇄의 CDR3 및/또는 BT061 중쇄의 CDR2를 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 상기 CDR의 서열에 표 4 및 표 5에 기술된 것으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
구체적으로, BT061 항체에 의해 수행되는 CD4 에피토프의 인지와 결합은, 3가지 상보성 결정부 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 구체적인 조성 및 구조를 토대로 한다. 경쇄의 CDR1 및 CDR2와 중쇄의 CDR1 및 CDR3만 CD4와 직접 접촉하지만, 6종의 CDR 모두 매우 조밀하게 밀집되어 있고, 서로 다른 구조를 상호 지탱할 수 있다. 그래서, CDR내 다수 위치들에서는, BT061의 친화성과 효능을 유의하게 감소시키지 않는 임의의 아미노산 치환은 허용되지 않는다. 그러나, 일부 위치에서의 치환은 구조를 불안정하게 만들지 않는다.
이러한 보존적인 치환의 예를 표 4와 5에 나타낸다. 이들 표에서, 서열 변이는 전체적인 상호작용 네트워크가 유지되도록 선택된다. 유인성 상호작용 뿐만 아니라 반발성 상호작용의 신택스(syntax)가 유지된다. 방향성 극성 상호작용(Directed polar interaction)이 역위될 수 있으며, 예컨대 수소 결합의 도너-어셉터 쌍, 염 브릿지의 이온성 파트너, 또는 단극-사극(dipole-quadrupole) 상호작용의 파트너가 교체될 수 있다.
다른 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 하기 서열(서열번호 14)을 포함하며, 추가로 서열(서열번호 15)를 더 포함한다.
서열번호 14:
10 20 30 40 50 60
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCXXXXXXS XSGYSYXYWY QQKPGQPPKL LIYLASILEX
70 80 90 100 110 120
GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSXXXPW XFGQGTKVEI KRTVAAPSVF
130 140 150 160 170 180
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
190 200 210 218
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
상기 서열에서, "X"로 표시된 24 - 29, 31, 37, 60, 96 - 98 및 101번 위치의 아미노산은 표 4에 기재된 대응 위치로 표시된 아미노산으로부터 선택된다.
서열번호 15:
10 20 30 40 50 60
EEQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFSFS XXXXYWLRQA PGKGLEWIGV XXXXXXXXXX
70 80 90 100 110 120
XXXXXXXGRF TISRDDSKNT VYLQMNSLKT EDTAVYYCSA SYXRYDXXXX FXXWGQGTLV
130 140 150 160 170 180
TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV
190 200 210 220 230 240
LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE
250 260 270 280 290 300
LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
310 320 330 340 350 360
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
370 380 390 400 410 420
SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
430 440 450 454
KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
상기 서열에서 "X"로 표시된 31 - 34, 51 - 67, 103, 107 - 110, 111 및 112번 위치의 아미노산은 표 5에 기재된 대응 위치로 표시된 아미노산으로부터 선택된다.
구체적으로, BT061의, 경쇄 CDR1 및 CDR2와 중쇄 CDR3의 내부 특정 아미노산 모티프들이 CD4와의 결합에 중요하다. 즉, 항체 또는 항체 단편은 BT061 경쇄의 CDR1 유래 서열 SGYSY (서열번호 10) 및/또는 BT061 경쇄의 CDR2 유래 서열 LASILE (서열번호 11), 및/또는 BT061 중쇄의 CDR3 유래 서열 YYRYD (서열번호 12)를 포함할 수 있다.
아울러, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 항체 또는 항체 단편은, 항체 BT061의 V 도메인과 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상 동일한 V 도메인을 가질 수 있으며, 이 V 도메인은:
(i) 경쇄 V 도메인의 CDR1내 서열 모티프 SGYSY (서열번호 10);
(ii) 경쇄 V 도메인의 CDR2내 서열 모티프 LASILE (서열번호 11); 및
(iii) 중쇄 V 도메인의 CDR3내 서열 모티프 SYXRYD(X = Y, F 또는 H) (서열번호 13)을 포함하나,
단, 상기 항체 또는 항체 단편은 항체 BT061의 V 도메인과 100% 동일한 V 도메인은 포함하지 않는다.
본 발명의 제3 측면에 따른 구체적인 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 경쇄의 CDR 서열 및 BT061 중쇄의 CDR 서열과 하기 하나의 단일 아미노산 치환을 포함하거나:
(i) 중쇄내 A63G;
(ii) 중쇄내 R33K; 또는
(iii) 경쇄내 L98I,
또는, 상기 항체 또는 항체 단편은, BT061 경쇄의 CDR 서열 및 BT061 중쇄의 CDR 서열과 하기 2개의 아미노산 치환을 포함한다:
(i) 중쇄내 R33K와 A63G; 또는
(ii) 경쇄내 L98I와 중쇄내 R33K.
본 발명의 이러한 구체적인 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄 및 경쇄의 나머지 가변성 도메인 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은, 구체적으로, 뮤라인 B-F5 항체 및 BT061 항체의 가변 도메인들을 코딩하는 공지된 폴리뉴클레오티드 서열에 돌여변이를 유발함으로써 제조할 수 있다(WO2004/083247).
또한, 본 발명의 제1 측면과 제2 측면과 관련하여 상기에 기술된 항체 및 항체 단편에 대한 정의 및 바람직한 구현예들은 본 발명의 제3 측면에도 적용됨에 유념한다. 구체적으로, 항체 및 항체 단편은 바람직하게는 IgG1 항체이거나, 및/또는 바람직하게는 항체 또는 항체 단편이 Fc 수용체, 바람직하게는 FcγRI (즉, CD64)에 결합할 수 있도록 Fc 영역을 포함한다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 항체 단편은 IgG1 항체의 Fc 영역을 포함한다. 또한, 또는 다른 예로, 항체 또는 항체 단편은 Fc 수용체를 통해 단핵구에 결합할 수 있다.
아울러, 본 발명은, 인간 CD4 단백질의 아미노산을 50개 미만으로 포함하며, 인간 CD4의 아미노산 148 - 154, 아미노산 164 - 168, 및 아미노산 185 - 192 중 하나 이상의 영역을 포함하는, 분리된 펩타이드를 제공한다. 바람직하게는, 상기 분리된 펩타이드는 이들 영역들 중 2곳, 보다 바람직하게는 3곳을 포함한다. 추가적으로 또는 다른 예로, 분리된 펩타이드는 30개 미만의 아미노산, 가장 바람직하게는 20개 미만의 아미노산을 포함한다.
아울러, 본 발명은 전술한 분리된 펩타이드의 미모토프 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 바람직하게는 DNA이고, 가장 바람직하게는 항체 또는 항체 단편의 H 쇄 또는 L 쇄의 V 도메인을 코딩한다. 폴리뉴클레오티드는 완전한 H 쇄와 L 쇄를 발현시킬 목적으로 인간 H 쇄 또는 L 쇄의 불변부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 융합될 수 있다.
아울러, 본 발명은, 전술한 폴리뉴클레오티드가 선택된 숙주 세포내에서의 전사 및 번역을 조절할 수 있도록 적정 조절 서열과 연결되어 있는, 발현 카세트를 이용한다. 추가적인 구현예는 전술한 발현 카세트 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터이다.
전술한 폴리뉴클레오티드는, 발현 벡터 내부에서, 선택한 숙주 세포에서의 이의 전사 및 번역을 조절할 수 있는 적정 조절 서열과 연결될 수 있다. 잘 알려져 있는 재조합 DNA 및 유전자 조작 기법으로 이러한 재조합 DNA 구조체를 수득하여 숙주 세포에 도입시킬 수 있다.
사용가능한 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 적합한 진핵 세포는 식물 세포, 사카로마이세스와 같은 효모 세포, 드로소필라 또는 스포도프테라와 같은 곤충 세포, 및 HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS 등의 포유류 세포이다. 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편은, 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 발현에 적합한 조건에서 배양하고, 상기 숙주 세포 배양물로부터 상기 항체를 회수함으로써, 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 숙주 세포는 또한 본 발명의 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 수득하는 하이브리도마일 수 있다.
항체 또는 항체 단편은 후술하는 바와 같이 의학적 및 비의학적 용도를 가진다.
의학적인 용도 측면에서, 본원의 항체 또는 항체 단편은 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 항체 또는 항체 단편과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
아울러, 항체 또는 항체 단편은 표지를 더 포함할 수 있다. 항체의 표지 기법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 즉, 예로서, 항체를 GFP 또는 형광 염료(예, FITC, 고성능 dyLight), 방사성 동위원소, 바이오틴, HRP 등으로 표지할 수 있다.
항체 및 에피토프의 용도
본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 이용한 치료 방법을 추가로 제공한다. 항체 또는 항체 단편은 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 선택적으로 활성화할 수 있기 때문에, 치료에 있어 특별한 용도를 가진다. 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편을 자가면역 질환 개체 또는 이식 거부 반응을 보이는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 마찬가지로, 본 발명은 또한 의약제로 사용하기 위한, 구체적으로 자가면역 질환 또는 이식 거부 반응의 치료에 사용하기 위한, 본원의 항체 또는 항체 단편을 제공하다. 즉, 본 발명은 자가면역 질환 또는 이식 거부 반응의 치료에 사용하기 위한 약제 제조에 있어서의 본원의 항체 또는 항체 단편의 용도를 제공한다. 적합한 의학적 용도 및 치료 방법은 BT061에 대한 2009/112502, WO2009/121690, WO2009/124815 및 WO2010/034590에 기술된 용도 및 방법이며, 그 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직한 구현예에서, 자가면역 질환은 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 염증성 장 질환, 크론 질환, 자가면역성 갑상선염, 자가면역성 중근 근무력증, 전신 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 아토피성 피부염, 신근염 및 이식 관련 질환, 예컨대 이식 편대 숙주 거부 반응 또는 숙주 편대 이식 거부반응, 또는 일반적인 장기 허용성 문제로부터 선택된다. 건선 및 류마티스 관절염의 치료가 특히 바람직하다.
아울러, 본 발명은, 개체로부터 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 포함하는 샘플을 취하는 단계, 상기 샘플을 본원의 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜, CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 활성화하는 단계, 및 상기 개체에게 상기 활성화된 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환 또는 이식 거부 반응을 앓고 있는 개체를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 부가적으로, Treg 세포의 수를 늘리는 시험관내 단계를 포함할 수 있다. 이는 본원에 기술된 확장 전략을 이용하여 수행할 수 있다 (Peters et al., 2008).
마찬가지로, 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 이용하여 시험관내에서 활성화시킨 활성화된 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 제공한다. 이들 활성화된 T 조성 세포는 의학적인 용도, 특히 자가면역 질환 또는 이식 거부 반응의 치료 용도일 수 있다. 마찬가지로, 본 발명은 자가면역 질환 또는 이식 거부 반응의 치료에 사용하기 위한 약제 제조에 있어서의 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 이용하여 활성화시킨 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포의 용도를 제공한다.
류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환을 가진 환자는, TNFα와 같이 전염증성 사이토카인이 원인일 수 있는, 억제력이 낮은 Treg를 보여준다. 본 발명은, 자가면역 질환을 앓고 있으며 무력한(disabled) Treg 집단을 (필수적이지는 않으나) 나타낼 수 있는 환자로부터, Treg를 스크리닝하는 방법, 분리 방법 및/또는 활성화하는 방법을 포함한다. 본 발명의 항체 및 항체 단편의 특이적인 결합 방식은, 항체가 CD4에 결합할 수 있게 해 줄 뿐만 아니라 보다 중요하게는 Treg를 활성화시킨다. Treg의 분리는 BT061 또는 본 발명의 항체나 항체 단편을 이용하여 이루어질 수 있다. 활성화 단계가 후속될 예정인 경우, CD4와의 결합에 대해 BT061과 경쟁하지 않는 CD4 항체에 의해 CD4의 선별이 이루어져야 한다. 다른 예로, 확장 전략은 활성화 단계 전에 포함될 수 있다.
본 발명에서, Treg는 BT061 및/또는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 이용하여 분리할 수도 있으며, "Treg 세포 기반의 면역치료"로 환자에게 다시 전달할 수 있다. 다른 예로, Treg는 환자에게 정맥내 또는 피하로 투여함으로써 직접 자극시킬 수 있다.
Treg 기반의 면역치료는 자가면역 질환이나 이식체에 대해 관용성을 유도하는 대중적인 관심이 큰 치료법이다. FoxP3의 발현을 유도하는 레티노산의 사용, 또는 골수 유래 DC와의 공동 배양 및 항-CD3 및 항-CD28 항체를 이용한 자극과 같이, 시험관내에서 유도성 Treg(Tregs)를 만들기 위한 몇가지 방법들이 공지되어 있다. 예를 들어, PCT 출원 PCT/US2009/054631에서는 LAP 및 CD121b를 이용하여 자가면역 질환을 치료하기 위한("Treg 기반의 면역치료") FoxP3 Treg의 정제 방법이 기술되어 있다.
치료적 적용에는 다량의 Treg가 필요하며, 이들 세포는 이의 조절 표현형을 유지하여야 한다. 이는, 천연 Treg의 선택에 의해서만 현재 달성된다. 시험관내 방법에 의해 제조되는 유도성 Treg는, 이의 표현형이 작동자 세포로 복원되어 환자에게 예측할 수 없는 위험성을 초래할 수 있다는 문제점을 가지고 있다.
그러나, BT061은 혼성 림프구 반응에서 Treg를 활성화시키는 것으로 확인되었다 (WO 2009112502 A1). 이는 본원에 기술된 CD4에 대한 예상하지 못했던 특이적인 결합 방식이 그 원인이다.
시험관내 용도
본 발명의 항체 및 항체 단편과 분리된 펩타이드는 또한 시험관내에서 여러가지 용도를 가진다. 구체적으로, 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편은 시험관내에서 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 활성화하거나 또는 시험관내에서 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 동정하기 위해 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 샘플내 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포의 존재를 스크리닝하는 방법에 사용할 수 있다. 이러한 방법은, 표지된 항체 또는 항체 단편을 샘플과 접촉시키는 단계, 상기 샘플을 헹구어 비결합된 항체를 제거하는 단계 및 샘플내 표지물의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
특히, 이러한 스크리닝 방법에서, CD4+ CD25+ 조절성 T 세포는 활성화된 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포이다. 샘플은 바람직하게는 자가면역 질환을 앓고 있는 개체로부터 취한 혈액 샘플이다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편으로 코팅된 자기 비드를 포함하는 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포의 분리용 키트를 개시한다. 이 키트는, 제2의 항-CD항체 및/또는 항-CD+ 항체를 더 포함할 수 있다. 추가적인 선별 단계, 예컨대 CD39에 대한 양성 선별, CD127에 대한 음성 선별, CD19 양성 세포의 고갈을 수행하기 위한 부가적인 항체들 역시 포함할 수 있다. LAP (잠복 관련 펩타이드(latency associated peptide)), GARP 또는 CD121b (Il-1 수용체 타입 2)를 Treg 표현형의 특정화에 사용할 수 있다.
Treg를 분리한 다음, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 이용하여 분리한 세포는 또한 저온보존할 수 있다 (Peters et al., PLoS One (2008) 3; 9: e 3161).
아울러, 본 발명은, CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 본원의 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관내 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포의 활성화 방법을 제공한다. 활성화된 Treg의 억제력을 평가하는 방법은, (전술한 MLR 외에도) 사이토카인 분비를 통한 작동자 T 세포의 활성화 상태를 결정하거나, 또는 T 작동자 세포 상에서의 활성화 마커의 발현을 결정하는 MLR 분석을 포함한다 (예, WO 2009112592 A1에 기술된 증식 및 사이토카인 분석, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 이러한 방법들은, 부가적으로, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 분리하는 첫번째 단계를 포함할 수 있다. 이 단계가 항체를 이용하여 수행된다면, 이 항체는 비-경쟁성 CD4 항체(예, OKT4 또는 SK3)이어야 한다. 이로써, 세포를 CD4 상의 구분되는 에피토프에 결합하는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 이용하여 메인 단계에서 활성화시킬 수 있다. 다른 시나리오로, 세포는 CD25 또는 CD39와 같이 CD4와는 구분되는 Treg의 다른 표면 발현 마커들을 이용하거나 또는 CD127을 이용한 음성 선별에 의해 분리할 수도 있다.
본 발명의 항체는 Treg를 자극할 수 있는 것으로 종래에 알려져 있어, T 작동자 세포와의 공동-배양에 의해 검증할 수 있다. Treg는 동종이계 반응성 CD8 양성 T 세포에 의한 IL-2 및 IFN 감마의 생산을 저해함으로써 CD8 양성 T 세포의 증식을 억제시킬 수 있다. 아울러, 사전 활성화된 CD4+ CD25+ Treg는, 억제된 CD8+ 세포가 재자극되었을 때 CD25를 발현할 수 없게 하는 것으로 확인되었다 (WO 2009112592).
본 발명은 아래 구체적인 예를 들어 더욱 설명된다.
실시예
실시예 1 BT061과 CD4 복합체의 결정 구조
인간 CD4와 BT061 Fab 단편의 복합체의 결정 구조를 X선 회절로 입수하였다.
BT061 (Fab):CD4의 결정화 공정
재조합 인간 CD4는 통상적인 방법으로 제조한다: CD4의 여러가지 구조체들을 곤충 세포에서의 이종 발현을 위한 벡터에 표준 방법에 의해 클로닝한 다음, NiNTA로 정제하였다. BT061의 Fab 단편을 프로테아제 파파인을 이용하여 곤충 항체로부터 잘라, 단백질 A로 정제하였다. 그런 후, Fab 단편을 크기 배제 크로마토그래피로 추가로 정제하였다.
정제된 단백질의 과량의 CD4와 혼합하여 CD4-Fab 복합체를 형성시킨 다음, 크기 배제 크로마토그래피로 더욱 정제하였다.
CD4:BT061 복합체의 결정은, 공동-결정화 방법으로 준비하였는데, 즉 정제된 복합체를 약 1200가지의 상이한 조건을 이용한 표준 스크리닝과 문헌 데이타를 이용하여 동정한 결정화 조건 둘다를 사용한 결정화 실험에 사용하였다. 최초로 구한 조건은 온도, 단백질 농도, 점적율 등과 같이 결정화에 중요한 영향을 미치는 파라미터들을 변경시키면서 체계적으로 표준 전략을 이용하여 최적화하였다. 또한, 이러한 조건은 pH 또는 석출 농도를 체계적으로 달리하면서 추가로 정밀화하였다.
결정을 즉각 냉동시키고, 100K 온도에서 측정하였다.
CD4:BT061 복합체의 X선 회절 데이타를 저온 조건에서 SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Switzerland)으로 수집하였다. 구조물을 분석하여, 2.9A의 최종 해상도에서 개선시켰다.
결정은 2개의 복합체가 비대칭적인 단위로 존재하는 공간군 P21에 속하였다. 데이타를 프로그램 XDS와 XSCALE를 이용하여 처리하였다. 데이타 수집 조건을 하기 표 6에 요약하였다.
데이타 수집 조건 및 처리
복합체 CD4:BT061
X선 소스 PX(SLS1)
파장 [Å] 1.0000
검출기 PILATUS 6M
온도 [K] 100
공간군 P 21
셀: a; b; c [Å]
α; β; γ [°]		 110.18; 78.94; 132.85
90.0; 94.8; 90.0
해상도[Å]2 2.88(3.15-2.99)
고유 반사2 50962(6585)
멀티플리시티2 2.9(2.8)
완결도[%]2 98.2(98.3)
Rsym[%]2,3 8.4(44.3)
Rmeas[%]2,4 10.3(54.7)
I/σI2 -(-)
평균(I)/시그마2,5 11.60(2.72)
1 SWISS LIGHT SOURCE(SLS, Villigenm Switzerland)
2 괄호안 번호는 Rsym = 44.3%의 해상도 Bin임
구조 결정과 분석에 필수적인 위상 정보는 분자 치환에 의해 수득하였다. CD4 및 Fab 단편의 공개된 모델을 검색 모델로서 사용하였다.
이후 모델 구축 및 정밀화를 소프트웨어 패키지 CCP4 및 COOT로 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 비대칭 단위(도 3)는 이들 2가지 복합체로 구성되는 전체 RMS 해상도 2.9Å이다.
결정 구조에서, 신호 펩타이드는 CD4 분자에 존재하지 않으며, 펩타이드 체인은 Ig-유사 V-타입 도메인, Ig-유사 C2-타입 1 도메인 및 Ig-유사 C2-타입 도메인의 일부로만 구성된다. 결정 구조에서 정확한 체인은 도 1에 나타낸 바와 같이 아미노산 26에서 아미노산 258번 잔기까지이며, 여기서 결정 구조로 표시되지 않는 아미노산은 점선 프래임으로 표시한다. 즉, CD4 분자만 먼저 2개의 이황화 결합을 가지며, 하나는 Cys41와 Cys109 사이이고, 다른 하나는 Cys155와 Cys184 사이이다.
결정 구조에서 2개의 BR061 단위내 경쇄는 도 2A에 나타낸 바와 같이, 하나의 유닛에서는 1번에서 215번까지이고, 다른 단위에서는 1번에서 182번까지이다. BT061 경쇄에는, 2개의 이황화 결합 Cys23 - Cys92 및 Cys138 - Cys198이 있다.
결정 구조에서 2개의 BR061 단위내 중쇄는 도 2B에 나타낸 바와 같이, 하나의 유닛에서는 2번에서 219번까지이고, 다른 단위에서는 2번에서 220번까지이다. 또한, 중쇄에는, Cys22와 Cys98 사이에, Cys151과 Cys207 사이에 2개의 이황화 결합이 있다.
결정 구조 분석에서, 다른 공지된 CD4 리간드와 대조적으로, BT061의 결합에는 Ig-유사 C2-타입 1 도메인만 참여하는 것으로 보인다. 이는 부록에 제공된 결정 구조에 의해 확인된 완전히 새로운 결합 모드이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, BT061은 CD4의 N-말단 도메인에 결합하지 않아, BT061이 MHC II 분자, 또는 gp120 HIV-1 외막 단백질와 동시에 결합할 가능성이 있다(도 4 및 5).
결정 구조를 상세히 분석한 결과, CD4와 BT061 둘다에서 상호작용하는 아미노산들이 확인되었다. 선정은 거리 기준을 토대로 하였다. 결정 구조의 해상도를 계산하여, BT061 아미노산의 임의의 비-수소 원자 주위 반경 d = 4.5Å의 구 안에 비-수소 원자를 가지고 있는 CD4 아미노산들 모두 상호작용하는 파트너로서 선정하였다. 반경 d는 비결합성 상호작용의 전형적인 거리 3Å로서 선정하였고, 결정 구조 해상도 2.9Å 까지 확장하였다 (d = 3Å + ½ x 2.9Å = 4.45Å).
그래서, 결정 구조에서, CD4의 표면 상의 결합부는, 도 7에 나타낸 바와 같이, 7개의 연속적인 아미노산으로 구성된 클러스터 (Gly148 - Gln154), 6개의 연속적인 아미노산으로 구성된 클러스터 (Gln164 - Thr168), + Thr185, Leu187, Asn189, Gln190, 및 Lys192로 이루어진다.
하기 표 7은 CD4와 BT061의 상호작용 파트너들의 매트릭스를 나타낸다. 소수만 1:1 상호작용이었고, CD4 및 BT061의 열거된 아미노산들 대부분은 2 이상의 파트너와 상호작용한다. 상호작용은 주로 수소결합이며, 반데르 발스 작용 및 극성 상호작용을 수반한다.
표 7의 1번 열에, BT061의 아미노산과 상호작용하는 CD4의 아미노산을 나타낸다. 좌측 끝에 CD4와 상호작용하는 BT061의 아미노산을 기재한다. 각 "x"는 하나 이상의 상호작용에 해당된다. 몇개만 1:1 상호작용으로 쌍을 이루기 때문에, 행 또는 열들에서 확장된 패턴이 확인된다. CD4의 Ser150과 Pro151은 둘다 BT061의 경쇄 및 중쇄와 상호작용한다. BT061 중쇄의 Tyr105에 대한 결합 포켓의 중요한 부분인 Val186은, BT061의 아미노산들과의 직접적인 상호작용하지 않기 때문에, 여기에 표시하지 않았다. 확인된 상호작용들은 모두 수소 결합, 극성 상호작용, 반데르 발스 작용 또는 이들 상호작용 타입들의 조합이다. 상호작용하는 아미노산은 부록으로 제공된 결정 구조를 기초로 동정한다. 다른 분자 파트너의 비-수소 원자에 d=4.5Å 보다 더 가까운 거리에 하나 이상의 비-수소 원자를 가지고 있는 아미노산들을 모두 고려하여, 거리 기준을 적용하였다. 개략적으로, d는 비공유적 상호작용의 전형적인 거리 3Å로서 선정하였고, 결정 구조 전체 해상도 2.9Å의 절반을 더한 것이다.
표 7 CD4와 BT061 간에 상호작용하는 아미노산들.
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도 7은 BT061 결합부의 CD4 아미노산들을 각각의 해당 위치로 도식화한 것이다. 전술한 거리 기준을 직접 만족시키는 아미노산들 외에도, 다수의 아미노산들이 BT061 및 CD4의 경미한 구조 변경시 BT061과의 부가적인 상호작용에 사용될 수 있다. 이들 아미노산, Arg156, Gln188, Asn189, Gln190, 및 Lys192은 CD4의 신호 전달 기전에 참여하는 것으로 보인다.
BT061은 경쇄와 중쇄 둘다가 CD4에 결합한다. 경쇄의 해당 아미노산들은 도 8에 나타낸다. CD4와의 결합에 참여하는 중쇄 아미노산은 도 9에 나타낸다.
BT061 중쇄의 Tyr105은 CD4와의 상호작용에 매우 중요한 역할을 한다. 이의 측쇄는 CD4 표면의 포켓에 완벽하게 딱 들어맞는다 (도 10).
염 브릿지가 항체들 간의 상호작용에 일반적인 요소이지만, CD4와 BT061 간에는 결정 구조에서 염 브릿지가 존재하지 않는다. 흥미롭게도, BT061은 다수개의 분자내 염 브릿지를 보여준다. 이들 중 하나는 Arg104과 Asp106 간에 형성된 것으로, 이것은 CD4의 표면에 있는 포켓과의 극성 상호작용을 부여한다 (도 11). 분자내 염 브릿지의 형성은 완충 작용을 가진 기질에 의해 영향을 받을 수 있으며, 그래서 BT061과 CD4와의 복합체의 구조적 변화를 유도함으로써, CD4의 신호 전달에 기여할 수 있다.
CD4와의 상호작용에 더 중요한 다른 잔기는 BT061 경쇄의 Tyr34이다. 중쇄의 Tyr105과 매우 유사하게, Tyr34는 CD4의 표면에 있는 포켓내에 수용된다 (도 12).
CD4와 BT061 복합체의 결정 구조를, CD4와 MHC II 분자의 복합체 및 CD4와 gp120 HIV-1 외막 단백질과의 복합체의 결정 구조와 비교하면, BT061이 CD4 표면의 전혀 다른 부분에 결합하는 것을 바로 알 수 있다. CD4의 다른 리간드들에 비해, BT061은 CD4의 세포외 부분의 반대쪽에 결합하고(도 4 및 5). 다른 리간드의 결합부들을 방해하지 않는다.
CD4 아미노산 Lys26, Arg156, Lys161, 및 Lys192은 아래 표 8에 표기된 바와 같이 BT061의 전하 상보성 아미노산들과의 추가적인 상호작용에 이용될 수 있다.
표 8. CD4와 BT061 간의 추가적인 상호작용들
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표 8의 제1열은 BT061 아미노산과 염 브릿지를 형성할 수 있는 아미노산을 기재한다. 좌측 끝 부분에는 BT061의 염 브릿지 파트너로 가능성 있는 아미노산을 기재한다. 각 "x"는 염 브릿지를 형성할 가능성이 있는 부분을 표시한다. 표시된 썅은 전술한 거리 기준 d=4.5Å에 부합하지 않는다. 그러나, CD4와 BT061 둘다에서의 경미한 일련의 구조 변화에 의해, 표시된 염 브릿지가 형성될 수 있다. BT061의 경우, 서열 가닥, 즉 경쇄의 Ser56 - Gly68 및 Ser25 - Cys32 뿐만 아니라 중쇄의 Ser52 - Gly59 가닥의 쉬프트로 CD4의 Asp31과 Glu56을 이용하여 염 브릿지를 형성시킬 수 있다.
실시예 2 BT061 돌연변이 제작 및 실험
DNA 조작 및 항체 제조에 대한 표준 기법을 이용하여, BT061의 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특정 돌연변이를 도입하고, 돌연변이된 아미노산 서열, 즉 항체 또는 항체 단편을 발현시켜, BT061 가변 도메인 돌연변이를 제작하였다.
하기 BT061 변이체들을 제작하였다:
(1) 모두 6곳의 CDR 각각에 하나의 돌연변이가 있는 변이체 6종 : 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3에서의 돌연변이는 각각 G33A, A55G 및 L98I이고; 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3에서의 돌연변이는 각각 R33K, A63G 및 S101T임;
(2) 하나의 가변 도메인에 2개의 돌연변이가 있는 변이체 1종 : 중쇄 가변 도메인에서의 R33K와 A63G; 및
(3) 중쇄와 경쇄 모두에 병렬 돌연변이(parallel mutation)가 있는 변이체 3종 (예, (1)번의 중쇄 변이체와 경쇄 변이체의 조합) : 경쇄 L98I + 중쇄 R33K; 경쇄 A55G + 중쇄 R33K; 및 경쇄 G33A + 중쇄 R33K.
BT061 변이체의 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화하는 능력은 시험관내 분석으로 결정하였다. CD4에 결합하지 않는 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 중쇄에 돌연변이가 있는 BT061 CDR3 (Y105W)도 음성 대조군으로 제작하였으며, 실시예 1에서 수득한 결과를 토대로, 이 아미노산이 BT061 결합에 중요한지를 예측하였다. 양성 대조군으로서 마스터 경쇄 및 중쇄 서열로부터 제작한 항체와 임상 실험용으로 제작한 BT061 유래 샘플을 사용하였다.
시험관내 분석:
건강한 공여자로부터 입수한 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포 (Tregs)의, 항체 BT061 변이체에 의한 억제력 유도를, 동종이계 혼성 림프구 반응물(간접 공동-배양)에서 평가하였다
제1 공여자(A 공여자)로부터 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포를 신선하게 분리하였다. PBMC를 EDTA-혈액으로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 입수하였다. Treg, 반응자 T 세포 (Tresp) 및 APC를 기존 방법에 따라 PBMC에서 면역자기 방식으로 분리하였다 (Haas et al., J Immunol. 2007 Jul 15; 179(2):1322-30). Treg를 플레이트-결합된 항체를 첨가하거나 첨가하지 않고 2일간 미리 배양하였다. Treg의 수와 표현형을 기존 방법에 따라 6색 유세포 측정으로 결정하였다 (Haas et al., 2007). 미리-배양한 Treg를 T 세포가 고갈되고 방사선 처리된 PBMC(제1 공여체 A)가 존재하는 조건 하에 반응자 T 세포(제2 공여체 B)로 이동시켰다. 자극을 가한 후, [3H] 티미딘을 첨가하고, 반응자 T 세포의 증식을 5일 후에 측정하였다.
결과:
시험관내 분석의 결과를 아래 표 9에 나타낸다. 반응자 T 세포 저해율을 각 변이체에 대해 3번 측정하여 평균을 구하였다.
표 9. BT061 변이체의 시험관내 분석 결과
변이체 % Inh1 % Inh2 % Inh3 평균 표준 편차
LC 마스터 HC 마스터 27,7% 25,4% 25,9% 26,3% 1,0%
BT61 Lot 52690 26,7% 24,1% 27,8% 26,2% 1,6%
LC 마스터 HC A63G 33,1% 25,5% 19,5% 26,0% 5,6%
LC 마스터 HC R33K-A63G 15,7% 21,5% 21,9% 19,7% 2,8%
LC L98I HC R33K 9,2% 24,3% 24,6% 19,4% 7,2%
LC 마스터 HC R33K 19,8% 18,8% 15,0% 17,9% 2,1%
HC 마스터 LC L98I 12,2% 8,4% 18,2% 12,9% 4,0%
LC A55G HC R33K 12,1% 6,4% 19,3% 12,6% 5,3%
LC G33A HC R33K 6,5% 7,9% 9,0% 7,8% 1,0%
음성 대조군 3,0% 7,0% 5,2% 5,1% 1,6%
LC 마스터 HC Y105W 5,3% 2,0% 7,0% 4,8% 2,0%
LC 마스터 HC S101T 3,1% -3,6% 0,0% -0,2% 2,7%
예상한 바와 같이, LC 마스터 HC Y105W의 낫아웃 돌연변이는 CD4에 결합하지 않았고, 조절성 T 세포를 활성화시킬 수 없었다. 또한, 그 결과, 중쇄내 단일 위치들을 표 5에 나타낸 하나 이상의 치환으로 변형시킬 수 있는 것으로 나타났다 (단일 변이체 HC R33K, A63G 및 이중 변이체 HC R33K 및 A63G는 활성을 유지함). 아울러, 결정 구조 연구에서 예측된 바와 같이, 루프를 구성하는 경쇄내 Tyr34를 둘러싼 잔기들이 결합에 중요한 것으로 드러났다.
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SEQUENCE LISTING <110> Biotest AG <120> Agents for Treating Disease <130> 322239WO/JND <140> PCT/EP2010/068579 <141> 2010-11-30 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 458 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser 35 40 45 Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95 Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 100 105 110 Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 160 Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu 165 170 175 Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys 180 185 190 Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser 195 200 205 Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220 Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu 245 250 255 Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu 260 265 270 Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu 275 280 285 Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350 Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365 Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380 Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile 385 390 395 400 Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile 405 410 415 Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met 420 425 430 Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro 435 440 445 His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile 450 455 <210> 2 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain BT-061 <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 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Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Ala Ser Tyr Tyr Arg Tyr Asp Val Gly Ala Trp Phe Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BT-061 light chain CDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BT-061 light chain CDR2 <400> 5 Leu Ala Ser Ile Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BT-061 light chain CDR3 <400> 6 Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BT-061 heavy chain CDR1 <400> 7 Asp Cys Arg Met Tyr 1 5 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BT-061 heavy chain CDR2 <400> 8 Ile Ser Val Lys Ser Glu Asn Tyr Gly Ala Asn Tyr Ala Glu Ser Val 1 5 10 15 Arg Gly <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BT-061 heavy chain CDR3 <400> 9 Ser Tyr Tyr Arg Tyr Asp Val Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain V domain sequence motif <400> 10 Ser Gly Tyr Ser Tyr 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain V domain sequence motif <400> 11 Leu Ala Ser Ile Leu Glu 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain V domain sequence motif <400> 12 Tyr Tyr Arg Tyr Asp 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain V domain sequence motif <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Tyr, Phe or His <400> 13 Ser Tyr Xaa Arg Tyr Asp 1 5 <210> 14 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain V domain sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Arg, Lys, Gln or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Ala or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Lys, Arg or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ser, Gly or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Val, Ala or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Thr, Ser, Asn, Gln or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa is Ile, Val or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa is Ser, Asn, Gln, Thr, Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96) <223> Xaa is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa is Glu, Asp or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Xaa is Leu, Gly or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> Xaa is Thr or Ser <400> 14 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Xaa Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ile Leu Glu Xaa Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Pro Trp Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 15 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain V domain sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Asp, Glu, Thr, Cys, Pro, Met or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Cys, Ser, Ala, Gly or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is Arg, Lys, Ser, Thr or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is Met, Ile, Leu, Ala or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is Ile, Ala, Val or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is Ser, Asp, Gly, Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa is Val, Ser, Gly, Thr or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa is Lys, Arg or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Ser, Asn, Gln, Thr or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa is Glu, Asp or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa is Asn, Asp, Tyr, Gln or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa is Tyr, His or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa is Gly or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa is Ala, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa is Asn, Gln or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa is Tyr, Phe or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa is Ala, Gly or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa is Glu, Asp, Gln, Asn or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa is Ser, Gly, Ala or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa is Val, Ile, Ala, Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa is Arg, Lys, Gln, Tyr, His or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103)..(103) <223> Xaa is Tyr, Phe or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa is Val, Ile, Pro, Asp, Thr or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa is Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> Xaa is Trp, Phe, His or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (112)..(112) <223> Xaa is Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (113)..(113) <223> Xaa is Tyr, Phe, His or Asn <400> 15 Glu Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Ala Ser Tyr Xaa Arg Tyr Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa 100 105 110 Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450

Claims (78)

  1. CD4에 결합할 수 있는 분자의 스크리닝 방법으로서,
    (a) 하나 이상의 후보 분자를 제공하는 단계;
    (b) 상기 하나 이상의 후보 분자가 인간 CD4의, 아미노산 148 - 154, 아미노산 164 - 168 및 아미노산 185 - 192 중 하나 이상의 영역에 결합하는지 여부를 결정하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 결정된 분자를 CD4에 결합할 수 있는 것으로 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 하나 이상의 후보 분자가 인간 CD4의 26, 156, 159 및 161번 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 하나 이상의 후보 분자가 염 브릿지(salt bridge) 없이 CD4에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하나 이상의 후보 분자가 항체, 항체 유래 분자, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 미모토프(mimotope), 펩타이드 모방체(peptidomimetic), 폴다머(foldamer), 소형 분자, 천연 또는 조작된 리포칼린(lipocalin) 기반의 인지 단백질, DARPin, 파이브로넥틴(fibronectin), 어피바디(affibody), 쿠니츠-타입 저해제(Kunitz-type inhibitor), 펩타이드 앱타머(peptidic aptamer), 리보자임(ribozyme) 또는 독소인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체 또는 카멜리드(camelid) 항체인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하나 이상의 후보 분자는 BT061 경쇄의 CDR1과 CDR2 및 BT061 중쇄의 CDR1과 CDR3를 포함하며, 선택적으로 상기 CDR 서열은 하기 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법:
    (i) 경쇄 CDR1은 Ser32; Gly33; 및 Tyr34를 포함함;
    (ii) 경쇄 CDR2는 Leu54; 및 Ile57을 포함함;
    (iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
    (iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His 110 또는 Tyr110을 포함함.
  7. 제6항에 있어서, BT061 경쇄의 CDR1과 CDR2 및 BT061 중쇄의 CDR1과 CDR3의 서열에서의 상기 아미노산 치환은 표 4 및 표 5에 기재된 치환들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 Tyr53 또는 Phe53을 포함하는 경쇄와, Ser28을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 Asp64를 포함하는 경쇄 및/또는 Glu56을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 경쇄의 CDR3 및/또는 BT061 중쇄의 CDR2를 포함하며, 선택적으로 상기 CDR은 표 4 및 표 5에 기재된 치환들로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 단계 (a) - (c)는 컴퓨터 시스템으로 수행하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단계 (c)에서 선택된 분자를 제조하는 단계 (d)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단계 (d)에서 제조된 분자를 CD4+ 세포 또는 인간 CD4의 아미노산 148 - 154, 164 - 168 및 185 - 192 중 하나 이상의 영역을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 시험관내에서 접촉시키는 단계 (e)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단계 (e)는, 단계 (d)에서 제조된 분자가,
    (i) 인간 CD4의 아미노산 148 - 154, 164 - 168 및 185 - 192 중 하나 이상의 영역을 포함하는 펩타이드에 결합하는지;
    (ii) CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화하는지; 및/또는
    (iii) CD4 발현 세포에서의 CD4 수용체의 발현을 감소시키는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서,
    단계 (a) - (c)는 시험관내에서 수행되며,
    단계 (b)는 상기 하나 이상의 후보 분자를 인간 CD4의 아미노산 148 - 154, 164 - 168 및 185 - 192 영역 중 하나 이상의 영역을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 후보 분자는 분자들로 구성된 라이브러리인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 X선 결정학 또는 NMR을 수행하고, 염 브릿지 없이 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 결합하는 분자를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서,
    (d) 단계 (c)에서 선택된 분자를 CD4+CD25+ 조절성 T 세포 활성화 능력에 대해 스크리닝하는 단계, 및/또는
    (e) 단계 (c)에서 선택된 분자를 CD4 발현 세포에서의 CD4 수용체 발현을 감소시키는 능력에 대해 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 막 또는 등가의 적정 표면에 고정되거나, 또는 자기(magnetic) 비드에 커플링되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 인간 CD4의 Ig-유사 C2-타입 1 도메인을 포함하거나, 또는 인간 CD4의 Ig-유사 V-타입 도메인과 Ig-유사 C2-타입 1 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 야생형 CD4 에피토프의 구조를 모방하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 펩타이드 및 분자를 BT061의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 가진 경쟁 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜, 상기 후보 분자 또는 선택된 분자가 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 영역에 대한 경쟁적인 항체 또는 항체 단편의 결합을 차단할 수 있는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  24. (a) 제14항 또는 제19항의 방법을 이용하여, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 것으로서 결정된 분자를 선택하는 단계; 및
    (b) 상기 선택된 분자를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 치료 조성물의 제조 방법.
  25. 제24항의 방법에 따라 수득가능한 치료 조성물로서,
    상기 분자는 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 치료 조성물.
  26. CD4에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편의 스크리닝 방법으로서,
    (a) BT061 경쇄의 CDR1 및 CDR2와 BT061 중쇄의 CDR1 및 CDR3를 포함하며, 선택적으로 상기 CDR의 서열은 하기 아미노산 치환을 가지는, 항체 또는 항체 단편을 제공하는 단계;
    (i) 경쇄 CDR1은 Ser32; Gly33; 및 Tyr34를 포함함;
    (ii) 경쇄 CDR2는 Leu54; 및 Ile57을 포함함;
    (iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
    (iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His110 또는 Tyr110을 포함함,
    (b) 상기 항체 또는 항체 단편이 CD4에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계, 및
    (c) 단계 (b)에서 결정된 항체 또는 항체 단편을 CD4에 결합가능한 것으로 선택하는 단계를 포함하며,
    상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  27. 제26항에 있어서, BT061 경쇄의 CDR1 및 CDR2와, BT061 중쇄의 CDR1 및 CDR3의 서열에서의 상기 아미노산 치환은 표 4 및 표 5에 기재된 치환으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 Tyr53 또는 Phe53을 포함하는 경쇄와 Ser28을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 Asp64를 포함하는 경쇄 및/또는 Glu56를 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 경쇄의 CDR3 및/또는 BT061 중쇄의 CDR2를 포함하며, 선택적으로 상기 CDR의 서열은 표 4 및 표 5에 기재된 치환으로부터 선택되는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한항에 있어서, 단계 (a) 내지 (c)는 컴퓨터 시스템으로 수행하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  32. 제31항에 있어서, 단계 (c)에서 선택된 항체 또는 항체 단편을 제조하는 단계 (d)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  33. 제32항에 있어서, 단계 (d)에서 제조된 항체 또는 항체 단편이,
    (i) CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화하는지;
    (ii) 인간 CD4의 아미노산 148 - 154, 164 - 168 및 185 - 192 중 하나 이상의 영역에 결합하는지; 및/또는
    (iii) CD4 발현 세포에서 CD4의 발현을 하향-조절(down-regulation)하는지를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  34. 제26항 내지 제31항 중 어느 한항에 있어서, 단계 (a) - (c)는 시험관내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  35. 제34항에 있어서, 단계 (b)는, 상기 항체 또는 항체 단편이,
    (i) CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화하는지;
    (ii) 인간 CD4의 아미노산 148 - 154, 164 - 168 및 185 - 192 중 하나 이상의 영역에 결합하는지; 및/또는
    (iii) CD4 발현 세포에서 CD4의 발현을 하향-조절(down-regulation)하는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  36. 제14항, 제19항, 제33항 또는 제35항 중 어느 한항에 있어서, 상기 CD4 발현 세포는 PBMC인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  37. (a) 제33항 또는 제35항의 방법으로 동정된 항체 또는 항체 단편을, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 것으로서 선택하는 단계; 및
    (b) 상기 선택된 분자를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 치료 조성물의 제조 방법.
  38. 제37항의 방법에 의해 수득가능한 치료 조성물.
  39. CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 항체 또는 항체 단편으로서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 경쇄의 CDR1 및 CDR2와, BT061 중쇄의 CDR1 및 CDR3를 포함하며, 선택적으로 상기 CDR의 서열은 하기 아미노산 치환을 포함하며:
    (i) 경쇄 CDR1은 Ser32; Gly33; 및 Tyr34를 포함함;
    (ii) 경쇄 CDR2는 Leu54; 및 Ile57을 포함함;
    (iii) 중쇄 CDR1은 Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 또는 Tyr31을 포함함; 및
    (iv) 중쇄 CDR3는 Tyr103, Phe103 또는 His103; Arg104; Tyr105; Asp106; 및 Trp110, Phe110, His 110 또는 Tyr110을 포함함,
    상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3와 BT061 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 항체 및 항체 단편.
  40. 제39항에 있어서, 하기 서열을 포함하며:
    10 20 30 40 50 60
    DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCXXXXXXS XSGYSYXYWY QQKPGQPPKL LIYLASILEX
    70 80 90 100 110 120
    GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSXXXPW XFGQGTKVEI KRTVAAPSVF
    130 140 150 160 170 180
    IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
    190 200 210 218
    STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
    상기 24 - 29, 31, 37, 60, 96 - 98 및 101번 위치의 아미노산은 표 4의 해당 위치에 나타낸 아미노산들로부터 선택되며,
    하기 서열을 추가로 포함하며:
    10 20 30 40 50 60
    EEQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFSFS XXXXYWLRQA PGKGLEWIGV XXXXXXXXXX
    70 80 90 100 110 120
    XXXXXXXGRF TISRDDSKNT VYLQMNSLKT EDTAVYYCSA SYXRYDXXXX FXXWGQGTLV
    130 140 150 160 170 180
    TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV
    190 200 210 220 230 240
    LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE
    250 260 270 280 290 300
    LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
    310 320 330 340 350 360
    EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
    370 380 390 400 410 420
    SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
    430 440 450 454
    KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
    상기 31 - 34, 51 - 67, 103, 107 - 110, 111 및 112번 위치의 아미노산은 표 5의 해당 위치에 기재된 아미노산들로부터 선택되는 것을 특징으로하는 항체 및 항체 단편.
  41. 제39항에 있어서, BT061 경쇄의 CDR1 유래 서열 SGYSY, BT061 경쇄의 CDR2 유래 서열 LASILE, 및/또는 BT061 중쇄의 CDR3 유래 서열 YYRYD를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  42. 제39항에 있어서, 상기 CDR 서열의 아미노산 치환은 등가 변이(isosteric variation)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  43. CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화할 수 있는 항체 또는 항체 단편으로서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 항체 BT061의 V 도메인과 80% 이상 동일한 V 도메인을 포함하며,
    상기 V 도메인은:
    (i) 경쇄 V 도메인의 CDR1내 서열 모티프 SGYSY;
    (ii) 경쇄 V 도메인의 CDR2내 서열 모티프 LASILE; 및
    (iii) 중쇄 V 도메인의 CDR3내 서열 모티프 SYXRYD(X = Y, F 또는 H)을 포함하나,
    단, 상기 항체 또는 항체 단편은 항체 BT061의 V 도메인과 100% 동일한 V 도메인은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  44. 제39항에 있어서, BT061 경쇄의 CDR1 및 CDR2 서열 및/또는 BT061 중쇄의 CDR1 및 CDR3 서열에서의 아미노산 치환은 표 4 및 표 5에 기재된 치환으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  45. 제39항 또는 44항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 Tyr53 또는 Phe53을 포함하는 경쇄 및/또는 Ser28을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  46. 제39항, 제44항 또는 제45항 중 어느 한항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 Asp64를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  47. 제39항 또는 제44항 내지 제46항 중 어느 한항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 Glu56을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  48. 제39항 또는 제44항 내지 제47항 중 어느 한항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 BT061 경쇄의 CDR3 및/또는 BT061 중쇄의 CDR2를 추가로 포함하며, 선택적으로 상기 CDR의 서열은 표 4 및 표 5에 기재된 아미노산 치환으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  49. 제39항 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한항에 있어서, BT061 경쇄의 CDR 서열 및 BT061 중쇄의 CDR 서열을 포함하며, 상기 CDR은 하기 단일 아미노산 치환을 가지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편:
    (i) 중쇄에 A63G;
    (ii) 중쇄에 R33K; 또는
    (i) 경쇄에 L98I.
  50. 제39항 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한항에 있어서, BT061 경쇄의 CDR 서열 및 BT061 중쇄의 CDR 서열을 포함하며, 상기 CDR은 하기 이중 아미노산 치환을 가지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편:
    (ii) 중쇄에 R33K와 A63G; 또는
    (iii) 경쇄에 L98I와 중쇄에 R33K.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, BT061의 나머지 가변 도메인 서열들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  52. 제39항 내지 제51항 중 어느 한항에 있어서, CD64에 결합할 수 있는 Fc 수용체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  53. 제39항 내지 제52항 중 어느 한항에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  54. 인간 CD4의 아미노산 148 - 154, 아미노산 164 - 168, 및 아미노산 185 - 192 영역 중 2 또는 3개의 영역을 포함하며,
    인간 CD4 단백질의 아미노산을 50개 미만으로 포함하는
    분리된 펩타이드.
  55. 인간 CD4의 아미노산 148 - 154, 아미노산 164 - 168, 및 아미노산 185 - 192 중 하나 이상의 영역을 포함하며,
    인간 CD4 단백질의 아미노산을 20개 미만으로 포함하는
    분리된 펩타이드.
  56. 인간 CD4의 아미노산 148 - 154, 아미노산 164 - 168, 및 아미노산 185 - 192 중 하나 이상의 영역을 포함하며,
    인간 CD4 단백질의 아미노산을 50개 미만으로 포함하는
    분리된 펩타이드의 미모토프.
  57. 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산.
  58. 제57항의 핵산을 포함하는 벡터.
  59. 제57항의 핵산 또는 제58항의 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 하이브리도마.
  60. 제60항에 따른 숙주 세포를, 항체 또는 항체 단편의 발현이 가능한 조건 하에 배양 배지에서 배양하는 단계 및
    상기 배양 배지로부터 상기 항체 또는 항체 단편을 분리하는 단계를 포함하는,
    제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편의 제조 방법.
  61. 제39항 내지 53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편과, 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  62. 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 있어서, 표지 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  63. CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 시험관내 활성화 방법.
  64. 자가면역 질환 또는 이식 거부 반응을 보이는 환자에게, 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는,
    자가면역 질환 또는 이식 거부 반응을 치료 또는 예방하는 방법.
  65. 의약제로 사용하기 위한, 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편.
  66. 제65항에 있어서, 자가면역 질환 또는 이식 거부 반응을 치료하기 위한 용도인 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
  67. 자가면역 질환 또는 이식 거부 반응을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 제65항에 따른 항체 또는 항체 단편의 용도.
  68. 시험관내에서 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화하기 위한, 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편의 용도.
  69. 시험관내에서 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 동정하기 위한, 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편의 용도.
  70. CD4에 결합가능한 분자를 스크리닝하기 위한, 및/또는 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화하기 위한, 제54항 또는 제55항의 분리된 펩타이드 또는 제56항의 미모토프의 용도.
  71. 제62항에 따른 표지된 항체 또는 항체 단편을 샘플과 접촉시키는 단계,
    상기 샘플을 헹구어 결합되지 않은 항체를 제거하는 단계, 및
    상기 샘플에서 표지 물질의 존재를 검출하는 단계를 포함하는,
    샘플에서 CD4+CD25+ T 조적 세포의 존재를 스크리닝하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 CD4+CD25+ T 조절 세포가 활성화되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 샘플은 자가면역 질환을 앓거나 또는 이식 거부 반응을 보이는 개체로부터 취한 생물 샘플인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  74. 자가면역 질환을 앓고 있거나 이식 거부 반응을 보이는 개체로부터 CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 포함하는 샘플을 취하는 단계,
    상기 샘플을 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜, CD4+CD25+ 조절성 T 세포를 활성화하는 단계, 및
    상기 활성화된 세포를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는,
    자가면역 질환 또는 이식 거부 반응을 치료 또는 예방하는 방법.
  75. 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편으로 활성화된, 의약제 용도의, CD4+CD25+ 조절성 T 세포.
  76. 제75항에 있어서, 자가면역 질환의 치료용인 것을 특징으로 하는 CD4+CD25+ 조절성 T 세포.
  77. 자가면역 질환 또는 이식 거부 반응의 치료용 약제를 제조하기 위한, 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편으로 활성화된 CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 용도.
  78. 제39항 내지 제53항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체 단편으로 코팅된 자기 비드 및 항-CD4 항체 또는 항-CD25 항체를 포함하는, CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 분리용 키트.
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