KR20120102674A

KR20120102674A - 중합체 분석물을 검출하는 다용도의 가시적인 방법

Info

Publication number: KR20120102674A
Application number: KR1020127014224A
Authority: KR
Inventors: 제임스 피. 란더스; 다니엘 씨. 레슬리; 브라이어니 캐서린 스트라찬; 징이 리
Original assignee: 유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2010-11-03
Publication date: 2012-09-18
Also published as: AU2010315867A1; WO2011056215A1; US20130084565A1; EP2496716A1

Abstract

본 발명은, 자성 기재를 사용하고, 샘플 및 자성 기재에 에너지 형태를 적용하여 응집물 형성을 유도하는, 샘플 내 중합체 분석물의 존재 또는 양을 검출하거나 측정하는 방법을 제공한다.

Description

중합체 분석물을 검출하는 다용도의 가시적인 방법{VERSATILE, VISIBLE METHOD FOR DETECTING POLYMERIC ANALYTES}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2009년 11월 3일에 출원한 미국 출원 번호 제61/257,679호 및 2010년 9월 20일에 출원한 미국 출원 번호 제61/384,534호의 우선일의 이점을 청구하며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.

중합체 분석물은 크로마토그래피, 전기영동, 결합 검정, 분광광도법 등과 같은 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, DNA 검출은, 흡광도에 기초한 기술 또는 인터칼레이티-염료 형광에 기초한 기술을 위한 고가의 거대한 렌즈를 필요로 할 수 있다. DNA 농도는 통상 260/280 nm에서 샘플의 흡광도 비를 측정함으로써 분광학적으로 검출되지만, 상기 방법은 저농도의 DNA에서의 불량한 민감도라는 문제를 갖는다.

DNA 검출을 위한 다른 방법으로는 DNA를 형광 염료와 결합시켜 형광광도계를 이용하여 형광을 검출하는 방법을 들 수 있다. 이러한 염료의 예로는 인비트로겐(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 통해 시판되는 피코그린(PicoGreen)^® (문헌 [Ahn et al., Nucl. Acids Res., 24:2623 (1996)]; [Vitzthum et al., Anal. Biochem., 276:59 (1999)] 참조), 및 미국 특허 제6,664,047호; 동 제5,582,977호 및 동 제5,321,130호에 개시된 염료가 있다. 추가적인 형광에 기초한 DNA 정량화 방법이 개발되고 있으며, 올리고뉴클레오티드 혼성화 (문헌 [Sanchez et al., J. Clin. Microbiol., 40:2381 (2002)]) 및 실시간 정량적 PCR (문헌 [Heid et al., Genome Res., 6:986 (1996)])이 포함된다. 형광광도계에 기초한 방법은 매우 민감하지만, 시약 제조 및 취급, 및 여기 및 형광-방출의 측정을 위한 특수 형광광도계가 요구되어 일반적으로 귀찮은 방법이다.

하퀴(Haque) 등 (문헌 [BMC Biotech., 3:20 (2003)])은 3가지의 일반적인 DNA 정량화 방법을 정확성에 대해 비교하였다: OD₂₆₀/OD₂₈₀ (OD), 피코그린^® 이중 가닥 DNA (PG), 및 5' 엑소뉴클레아제 검정으로부터의 형광 신호의 검출 (태크만(TaqMan)^® 검정에 기초한 정량적 게놈 방법 (QG)). 이들의 철저한 분석 (거의 15,000번의 측정 포함) 결과, OD 측정이 DNA 농도를 추정하는 데 있어서 가장 정확하며 가장 덜 편향된 방법이었음이 밝혀졌다. 이 방법의 이점 중 하나는 형광광도계와 달리 흡광도 분광광도계의 비교적 다양한 이용가능성이며, 형광발색단을 사용하는 경우와 마찬가지로 OD 측정은 샘플 또는 추가의 시약을 소모하지 않고, 인큐베이션 또는 반응 시간을 필요로 하지 않는다. 한편, OD 측정에는 다량의 샘플이 필요하고, 상기 방법은 단일 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA를 구별하지 못하거나 (PG로 구별함) (Singer et al., Anal. Biochem., 249:228 (1997)), 오염된 DNA를 구별하지 못한다 (서열 특이적 QG 방법으로 구별함). 또한, 단백질, RNA 및 염의 존재로 인해 OD 측정으로부터 DNA 농도가 과다 추정될 수 있다.

형광분석법의 이점 중 하나는 이 방법의 높은 민감성으로 인해 매우 소량의 샘플을 사용한다는 점이며, 형광 검출은 소형 장치에서 용이하게 수행된다. 그러나, 일부 시약은 신호 켄칭으로 인해 형광에 기초한 DNA 정량화에 적합하지 않다.

<발명의 개요>

본 발명은, 중합체 분자, 예컨대 복합적인 생물학적 샘플에서 발견되는 DNA 및 기타 분자, 및 회전 자기장 (RMF)의 존재 하에서의 고체 기재 (예를 들어, 자기 비드 (입자)) 응집, 및 이에 따른 시각적으로 검출되고/거나 정량화될 수 있는 핀휠(pinwheel) 모양의 구조물 형성에 기초한 표지-무함유 검출 기술을 제공한다. 한 실시양태에서, 농축된 무질서유발 염(chaotropic salt) 조건 하에, 예를 들어 구아니딘 히드로클로라이드, 구아니딘 티오시아네이트, 암모늄 퍼클로레이트 등과 같은 염에서, 핀휠의 형성은 샘플 내 DNA 및/또는 RNA (핵산)의 존재에 대해 특이적이며, 이러한 핀휠 형성은 핵산, 예를 들어 DNA의 농도를 크게 초과하는 농도의 단백질을 첨가하더라도 (또는 단백질이 존재하더라도) 억제되지 않는다. 한 실시양태에서, 핀휠 형성은 30 pg까지의 DNA에서 관찰되었다. 한 실시양태에서, 핀휠 형성은 150 fM까지의 DNA에서 관찰되었다. 한 실시양태에서, 핀휠 형성은 보다 작은 분획, 즉, 약 5,000개 미만 내지 약 10,000개의 염기 쌍 또는 대략 몇백개의 염기 쌍 길이, 예를 들어 약 900, 700, 500, 300 또는 200개 미만의 염기 쌍 길이의 분획으로 초음파처리된 고분자량 DNA에서 약 4 내지 약 12 ㎛ 직경의 입자를 사용하는 경우에는 관찰되지 않았다. 따라서, 본 방법은 무질서유발 조건 하에 풍부한 단백질의 존재 하에서 고분자량 DNA (ss 및 dsDNA), 예를 들어 게놈 DNA 또는 RNA를 검출하고 정량화하는 데 유용하다. 한 실시양태에서, 본 발명은 DNA-결합된 자기 비드에 회전 자기장을 적용하는 표지-무함유 미세유체 기술을 제공한다. 또한, 핀휠 형성은 핵산으로만 제한되지 않는다; 낮은 이온 강도 조건 하에 실리카-코팅된 비드와 정전기적으로 결합하는 (+) 하전된 고분자량 다당류 중합체인 키토산도 또한 회전 외부 자기장에 적용되는 경우 핀휠을 형성하였다. 핀휠 형성은 시각적으로 검출될 수 있어 고가의 광학 장치나 공간을 최소로 필요로 하고, 이를 이용하여 샘플, 예컨대 복합적인 생물학적 샘플, 예를 들어 단백질, 탄수화물, 예컨대 다당류, 핵산 및/또는 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 샘플 내 중합체 분석물의 양을 정량화할 수 있다. 응집물 형성은 현미경, 사진촬영, 스캐너, 마그네틱 센싱 등을 이용하여 검출될 수 있다.

따라서, 본 발명은 복합적인 생물학적 샘플 내 핵산 분석물의 존재 또는 양을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 분석물과 비드의 결합으로 혼합물의 형성이 가능한 조건 하에 복합적인 생물학적 샘플을 자기 비드, 예를 들어 직경이 약 1 nm 내지 약 300 ㎛인 자기 비드와 접촉시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 비드는 상자성 금속을 포함한다. 상기 혼합물에 에너지, 예를 들어 회전 자기장 또는 음향 에너지를 적용하여, 혼합물 내 핀휠 또는 응집물의 존재 또는 양을 검출하거나 측정한다. 한 실시양태에서, 상기 혼합물을 자석과 접촉시켜 핀휠 또는 응집물 형성을 유도한다. 한 실시양태에서, 핀휠 또는 응집물을 혼합물로부터 단리함으로써 분석물을 단리한다. 예를 들어, 핀휠 또는 응집물은 자성으로 단리될 수 있다. 한 실시양태에서, 핀휠 또는 응집물 형성이 검출되거나 측정된 후, 자석 또는 회전 자기장 (예를 들어, 자기장이 꺼짐) 또는 다른 실용 에너지와의 접촉 없이 핀휠 또는 응집물을 갖는 혼합물 내 수용액을 제거하고, 용리 완충액을 첨가하여 핀휠 또는 응집물을 갖는 제2 혼합물을 형성한다. 한 실시양태에서, 제2 혼합물에 회전 자기장 또는 다른 실용 에너지를 적용한다.

한 실시양태에서, 샘플 내 중합체 분석물의 존재 또는 양을 검출하는 방법은 자기 비드를 이용하지만, 회전 자기장은 이용하지 않는다. 상기 실시양태에서, 중합체 분석물 및 자기 비드를 갖는 샘플에 다른 형태의 에너지, 예를 들어 진동, 예컨대 스피커로부터의 진동 (음향 에너지)을 적용하여 응집물을 형성한다. 한 실시양태에서, 샘플은 복합적인 생물학적 샘플이다. 이어서, 응집물 형성을 검출하거나 측정한다.

따라서, 본 발명의 정량적인 방법을 제공한다. 분석물, 예컨대 DNA를 정제한 후 정량화하는 방법과는 달리, 본원에 기재된 방법은 사전 정제 없이 정량화하는 것이 가능하다.

한 실시양태에서, 본 발명은 복합적인 생물학적 샘플 내 핵산 분석물의 존재 또는 양을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 핵산 분석물과 비드의 결합으로 혼합물의 형성이 가능한 조건 하에 복합적인 생물학적 샘플을 자기 비드와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 혼합물에 회전 자기장, 자석 또는 다른 실용 에너지를 적용하고, 혼합물 내 핀휠 또는 응집물의 존재 또는 양을 검출함으로써 샘플 내 분석물의 존재 또는 양을 검출한다.

또한, 예를 들어 복합적인 샘플로부터 분석물을 단리하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 분석물과 비드의 결합으로 혼합물의 형성이 가능한 조건 하에 용액, 예컨대 수용액에서 샘플을 지기 비드와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 혼합물에 회전 자기장, 자석 또는 다른 실용 에너지를 적용하여, 결합된 분석물은 갖지만 복합적인 샘플 내 다른 분자는 갖지 않는 비드의 응집을 유발한다. 예를 들어, 핵산이 단리될 분석물인 세포 샘플의 경우, 비드의 응집은 핵산을 다른 세포 성분, 예컨대 단백질, 지질, 탄수화물 등으로부터 단리한다. 응집물-함유 혼합물로부터 용액을 제거하여 세포 잔해를 제거할 수 있고, 완충액, 예를 들어 트리스-EDTA 함유-완충액을 응집물에 첨가하여 핵산을 용리할 수 있으며, 분석물-함유 완충액을 수집하였다.

한 실시양태에서, 본 발명은 자기 비드, 예를 들어 실리카-코팅된 자기 비드를 사용하여 용액 내 분석물의 구체적인 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이는 카메라 및 통상의 이미지 처리 소프트웨어로 수행될 수 있다. 상기 방법은 중합효소 연쇄 반응, 예를 들어 회전 순환 증폭 및 전체 게놈 증폭이 일어나는 핵산을 정량화하는데 적용할 수 있으며, 여기서 생성물은 몇몇 다른 핵산 증폭 방법, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 방법을 이용하여 생성된 생성물에 비해 보다 큰 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 20 μL의 용액 내 약 20개 인간 세포에 민감하다. 정량화 방법은 또한 비-핵산 중합체 분석물, 예컨대 다당류 키토산에 적용할 수 있으며, 여기서 용량-의존성 응집은 또한 비-무질서유발 조건 하의 비드 상의 DNA 유도된 핀휠 형성과 유사한 방식으로 관찰되었다. 이러한 조건 하에서, (-) 하전된 실리카 비드 표면은 생리학적 pH에서 낮은 이온 강도 조건 하에서 양이온성 키토산 (양성자화된 아민)을 정전기적으로 유인한다. 상기 방법은 형광 표지된 자기 비드, 또는 응집물의 자기 민감성의 측정치를 포함하도록 변경되어, 검정의 민감성을 증가시킬 수 있다. 게다가, 상기 방법은 비드에 결합된 분자, 예를 들어 핵산의 정제 중의 소정의 단계로서 이용될 수 있다.

추가적으로, 혼성화 유도된 응집 검정, 예를 들어 균질한 검정이 제공된다. 무질서유발 조건 하의 고분자량 (긴 분자)의 DNA를 이용한 핀휠 형성의 유도와는 달리, 본 발명은 또한 생리학적 조건 하의 핀휠 형성을 통해 서열-특이적 DNA (또는 적절한 길이의 다른 핵산)의 검출 및/또는 정량화를 제공한다. 혼성화-유도 응집 검정의 한 실시양태에서 이용되는 자기 비드 (또는 다른 자성 기재)는 표적 핵산 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어 비-공유 상호작용을 통해 비드에 결합되는 올리고뉴클레오티드 쌍은 '커넥터(connector)' (표적) 서열이 존재하는 경우에 응집한다. 비-공유 상호작용의 사용은 표적 서열 및/또는 올리고뉴클레오티드의 보다 쉬운 커플링 및 핀휠 후 방출을 가능하게 할 수 있다. 표적 핵산 서열의 길이는 짧게는 10개 염기 내지 길게는 비드 결합된 올리고뉴클레오티드에서의 서열과 함께 각 말단 상에 4개 염기의 결합 서열을 갖는 길이가 수억개인 염기일 수 있다. 비드 및 표적 핵산 서열과의 혼합물은, 적절한 온도 (어닐링 T)로 가열되는 경우에, 혼성화 (어닐링)된 서열을 생성하며, 이는 후속적으로 응집을 유도한다. 비록 서열-특이적 유도된 핀휠화를 사용하여 긴 DNA 분자, 예를 들어 게놈 DNA에서의 표적 서열을 검출할 수 있지만, 효율적인 혼성화 유도된 응집은 보다 짧은 표적 핵산 분자로 비-무질서유발 조건 하에 일어난다. 고분자량 핵산 (원형 세포 DNA)의 보다 짧은 단편을 제공하기 위해, 수류 전단력(hydrodynamic shear force)을 사용하여 공유 결합 파괴를 유발할 수 있다. DNA 함유 용액의 단순 혼합, 주입, 피펫팅 또는 원심분리, 또는 고분자량 DNA의 초음파처리, 또는 바늘 또는 뉴클레아제 처리를 통한 전단은 보다 짧은 단편을 생성할 수 있다.

혼성화에 기초한 검정은, 이들로 한정되지는 않지만, 암 마커, 유전자 변형 식품, 유전자 변형 유기체, (다른 DNA에 대한) 인간 게놈 마커 또는 박테리아 게놈 마커를 비롯한 마커를 검출하는 데 특히 유용하다. 균질한 검정은 다양한 올리고뉴클레오티드를 갖는 동일한 유형의 비드 부류 (여기서, 비드의 각 쌍은 상이한 어닐링 온도를 갖는 상이한 표적 서열에 특이적인 서열을 가짐)를 함유할 수 있거나, 또는 샘플에서 상이한 표적 서열의 존재를 구별할 수 있도록 하는 (예컨대, 크기 또는 표면 화학에서) 상이한 특성을 갖는 비드를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 소정의 온도 (T)에서의 핀휠화의 검출은, 샘플이 어닐링 T의 온도 범위를 가로지르기 때문에 특정 DNA 서열의 존재의 검출을 가능하게 한다.

도 1. 2 mm 폭 챔버를 갖는 유리 마이크로칩을 모든 실험에 대하여 (A) 자기 교반 플레이트에 두었다. (B) REMF 위의 미세유체 챔버의 사진 (황색 자취는 회전 자석의 외부 경로이고, 백색 점선 자취는 마이크로챔버의 윤곽임).
도 2. 미세한 질량의 자기 실리카 비드 (B, 백색 점선)를 함유하는 미세유체 챔버 상에 중심을 둔 REMF (A)는 비드 응집 및 '핀휠'의 형성 (C)을 통해 샘플 내 소정의 중합체 분석물의 존재를 나타낸다. 샘플에 특이적 중합체 분석물이 없는 경우에, 비드는 '분산된' 형성물 (D)로 남아있다. [A, B - 사진; C, D - 20배 배율의 현미경사진].
도 2. 완충액 (A), 인간 게놈 DNA 15 ng (B), 1 mg/mL BSA (C), 및 무질서유발 고 염 용액 중의 DNA 15 ng 및 1 mg/mL BSA 둘 모두 (D)인 경우의 회전 자기장에서의 5 ㎛ 자기 비드.
도 3. 무질서유발 고 염 용액 중의 각각 4, 2, 1, 0.2 및 0.2 μL의 비드를 갖는, 30 ng (A), 15 ng (B), 3 ng (C), 300 pg (D) 및 30 pg (E)의 인간 게놈 DNA인 경우의 회전 자기장에서의 5 ㎛ 자기 비드.
도 4. 무질서유발 고 염 용액 중의 초음파처리 전의 DNA 40 ng (A), 초음파처리 후의 DNA 40 ng (B), 및 임의의 DNA의 부재인 경우의 회전 자기장에서의 5 ㎛ 자기 비드.
도 5. 저 염 완충액 (A), 저 염 완충액 중의 다중 (+) 하전된 다당류인 키토산 20 ng (B), 및 고 염 무질서유발 완충액 중의 DNA 20 ng (C)인 경우의 회전 자기장에서의 5 ㎛ 자기 비드.
도 6. (A) 웰의 사진 (B)에서 나타난 핀휠을 갖는 샘플에서의 DNA의 질량에 대한 어두운 영역 백분율 (픽셀)의 그래프. 6-8 M 구아니딘 히드로클로라이드 용액 내의 샘플 및 실리카-코팅된 초상자기 비드 (마그네실(Magnesil)™) (이는 핵산 (NA)을 비드 표면으로 강제함)를 혼합하였다. 사진 (각 데이터 지점에 대하여 5개, 에러 바(error bar)는 1 표준 편차를 나타냄)을 이미지제이(imageJ) 소프트웨어 (http://rsbweb.nih.gov/ij/)로 분석하여, 웰 노출물(well exposure)에서의 어두운 픽셀 (비드의 영역)을 정량화하였다 (A). 샘플을 음성 대조군에서의 어두운 영역의 값에 대하여 표준화하고, 어두운 영역의 백분율로서 표현하였다. 검정은 다수의 샘플에 대하여 재현가능한 것으로 나타난다 (C).
도 7. 핀휠 형성은 무질서유발 용액 내의 DNA에 대해 특유적이지 않다. 양이온성 다당류인 키토산 (MW 약 310 kDa)은 저-염 완충액 내에서 동일한 실리카 비드와 뚜렷한 핀휠을 형성한다 (A - F, 중합체 증가). 키토산과 비드와의 결합은 정전기 인력에 의해 통제되는데, 이는 이러한 검출 방법이 상이한 결합 화학을 갖는 다양한 중합체 분석물에 추정 적용될 수 있음을 입증한다.
도 8. 검정의 민감도는 DNA의 양에 대한 비드의 양의 함수인 것으로 나타난다 (A). 검정의 민감도는 비드의 양의 증가에 따라 감소된다. 최대량의 비드를 사용한 검정을 0.9869 R² 값을 갖는 선형 핏(linear fit)으로 재플로팅하였다 (B).
도 9. EDTA (항응고제)로 처리된 인간 혈액의 임상 샘플의 검정에서 핀휠 효과가 관찰되었다 (B). 이미지 분석은 혈액 부피의 증가에 따라 대수적 신호 정도를 나타내었다 (A). DNA 메카니즘을 나타내면서, 핀휠 효과는 혈장 추가와는 무관하게 주로 원심분리된 혈액 샘플의 연막 부분에서 관찰되었지만, 순수한 혈장에서는 관찰되지 않았다 (C).
도 10. 회색 수준에 대한 픽셀의 수의 그래프. 회색 수준은 소프트웨어에 의해 설정되어, 삼각형 알고리즘을 사용한 역치값 아래에 최대 거리가 있도록 한다.
도 11. 헬라(HeLa) 세포를 마그네실™ 상자성 입자와 혼합하고, 이미징을 사용하여 샘플에서의 어두운 영역의 표준화된 퍼센트를 측정한다.
도 12. (a) 혼성화 유도 응집의 도식도 및 예시적인 올리고뉴클레오티드 및 표적 서열. (b) 혼성화 유도 응집 검정에서의 커넥터의 양의 변경의 효과.
도 13. 혼성화 유도 응집을 이용한 PCR 생성물의 검출.

정의

"검출가능한 잔기"는 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 고체 기재에 부착되거나 또는 그 일부로서 합성되는 표지 분자이다. 이러한 검출가능한 잔기에는 방사성동위원소, 비색, 형광 또는 화학발광 분자, 효소, 합텐, 산화환원-활성 전자 전달 잔기, 예컨대 전이 금속 착물, 금속 표지, 예컨대 은 또는 금 입자, 또는 심지어 독특한 올리고뉴클레오티드 서열이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "표지"는 광자적, 전자적, 광전자적, 자기적, 중량적, 음향적, 촉매적, 자기적, 상자기적, 또는 다른 물리적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 마커를 나타낸다. 용어 "표지된"은, 예를 들어 방사성 동위원소 표지된 분자의 도입에 의한 이러한 마커의 도입, 또는 용액 중에 현탁될 수 있는 고체 기재, 예컨대 비드에의 부착을 나타낸다.

"생물학적 샘플"은 유기체로부터 얻을 수 있으며, 예를 들어 이는 생리학적 유체 또는 조직 샘플, 예컨대 혈액 샘플, 가래 샘플, 척수액 샘플, 소변 샘플, 직장 표본, 직장 주변 표본, 비내 표본, 인후 표본, 또는 상기 샘플의 배양물의 채취에 의한 인간 환자, 실험실 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 돼지, 원숭이 또는 다른 영장류 구성원으로부터의 생리학적 유체 또는 조직 샘플, 또는 식물 또는 식물 세포의 배양물로부터의 생리학적 유체 또는 조직 샘플일 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플에는 전혈 또는 그의 성분, 혈액 또는 그의 성분, 혈액 또는 그의 성분, 정액, 세포 용해물, 타액, 눈물, 소변, 배설물, 땀, 구강내, 피부, 뇌척수액 및 모발이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포를 포함한다.

"분석물" 또는 "표적 분석물"은 본 발명을 사용하여 생물학적 샘플, 예컨대 생리학적 샘플에서 검출되는 물질이다. 본원에서 사용되는 "중합체 분석물"은 동일하거나 또는 동일하지 않을 수 있는 반복 구조 단위로 구성된 거대분자를 나타낸다. 중합체 분석물에는 생중합체 또는 비-생중합체가 포함될 수 있다. 생중합체에는 핵산 (예컨대, DNA 또는 RNA), 단백질, 폴리펩티드, 다당류 (예컨대, 전분, 글리코겐, 셀룰로스 또는 키틴) 및 지질이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다.

"포획 잔기(capture moiety)"는 또다른 분자 (리간드)의 결합이 가능한 특이적 결합 구성원이며, 이 잔기 또는 그의 리간드는 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해 기재 (비드)에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 두 종의 상호작용이 비-공유 결합된 복합체를 생성하는 경우에, 일어나는 결합은 정전기 상호작용, 수소-결합, 또는 친유성 상호작용의 결과일 수 있다. 용어 "리간드"는 수용체 또는 다른 결합 분자가 자연적으로 존재하거나 또는 제조될 수 있는 임의의 유기 화합물을 나타낸다. 포획 잔기 및 리간드에 유용한 결합 쌍에는 적합한 조건 하에서 안정한 혼성물을 형성할 수 있는 상보적 핵산 서열, 그에 따른 항체 및 리간드, 그에 따른 효소 및 기질, 그에 따른 수용체 및 효능제, 렉틴 및 탄수화물, 아비딘 및 바이오틴, 스트렙타비딘 및 바이오틴, 및 이들의 조합물이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 포획 잔기 및 그의 리간드의 친화도는 약 10^-8 M 초과 및 약 10^-9 M 초과를 비롯하여, 약 10^-5 M 초과, 예컨대 약 10^-6 M 초과일 수 있다. 한 실시양태에서, 바이오틴 표지를 갖는 올리고뉴클레오티드는 스트렙타비딘에 커플링된 비드에 결합된다.

용어 "상동성"은 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 가리킨다. 비교 목적으로 정렬할 수 있는 각 서열의 위치를 비교하여 상동성을 결정할 수 있다. 비교 서열의 위치가 동일한 염기로 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성의 정도는 매칭(matching)의 수 또는 서열들이 공유하는 상동성 위치의 함수이다.

"동일성"은, 경우에 따라, 이러한 서열의 스트링 사이의 매칭에 의해 측정되는 폴리뉴클레오티드 서열들 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 공지된 방법으로 "동일성" 및 "상동성"을 용이하게 계산할 수 있다. 2개의 서열 사이의 동일성 및 상동성을 측정하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램 방법은, 여기에 제한되는 것은 아니지만, GCG 프로그램 패키지 (문헌 [Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12:387 (1984)]), BLASTN, 및 FASTA (문헌 [Atschul et al., J. Molec. Biol., 215:403 (1990)])를 포함한다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 기타 공급원들로부터 공개적으로 이용가능하다 (문헌 [BLAST Manual, Altschul et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894]; [Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403 (1990)]).

본원에서 사용된 용어 "양"은 분자의 수준을 의미하기 위한 것이다. 샘플 중 분자의 절대량 또는 대조군 분자에 대한 상대적인 양을 가리키기 위해서 상기 용어를 사용할 수 있다. 예를 들어, 특정 서열을 검출하는 경우, 기준량 또는 대조량은 보통의 기준 수준 또는 질환-상태 기준 수준일 수 있다. 보통의 기준 수준은 비-질환 대상체 또는 대상체들에서 생체마커의 발현량일 수 있다. 질환-상태 기준 수준은 질환 또는 상태에 대한 양성 진단의 대상체에서 생체마커의 발현량일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "대상체"는 대상체가 포유동물, 예를 들어 인간인 것을 의미하나, 또한 동물, 예를 들어 애완 동물 (예를 들어, 개, 고양이 등), 농경용 동물 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실용 동물일 수도 있다.

"상자성 금속"은 홀전자가 있는 금속이다. 적합한 상자성 금속은 전이 원소 및 란탄 계열 내부 전위 원소를 포함한다. 추가로 적합한 상자성 금속은, 예를 들어 이트륨 (Y), 몰리브덴 (Mo), 테크네튬 (Tc), 루테늄 (Ru), 로듐 (Rh), 텅스텐 (W) 및 금 (Au)을 포함한다. 추가로 적합한 특정 상자성 금속은, 예를 들어 Y(III), Mo(VI), Tc(IV), Tc(VI), Tc(VII), Ru(III), Rh(III), W(VI), Au(I) 및 Au(III)를 포함한다.

"란타나이드", "란타나이드 계열 원소" 또는 "란타나이드 계열 내부 전이 원소"는 세륨 (Ce), 프라세오디뮴 (Pr), 네오디뮴 (Nd), 프로메튬 (Pm), 사마륨 (Sm), 유로퓸 (Eu), 가돌리늄 (Gd), 테르븀 (Tb), 디스프로슘 (Dy), 홀뮴 (Ho), 에르븀 (Er), 툴륨 (Tm), 이테르븀 (Yb) 또는 루테튬 (Lu)을 가리킨다. 적합한 특정 란타나이드에는, 예를 들어 Ce(III), Ce(IV), Pr(III), Nd(III), Pm(III), Sm(II), Sm(III), Eu(II), Eu(III), Gd(III), Tb(III), Dy(III), Ho(III), Er(III), Tm(III), Yb(II), Yb(III) 및 Lu(III)이 포함된다.

전이 금속 산화물의 예에는, 이들로 한정되지는 않지만, CrO₂, COFe₂O₄, CuFe₂O₄, Dy₃Fe₅O₁₂, DyFeO₃, ErFeO₃, Fe₅Gd₃O₁₂, Fe₅HO₃O₁₂, FeMnNiO₄, Fe₂O₃, γ-Fe₃O₄ (자철석), α-Fe₃O₄ (적철석), FeLaO₃, MgFe₂O₄, Fe₂MnO₄, MnO₂, Nd₂O₇Ti₂, Al₀2Fe₁8NiO₄, Fe₂Ni₀ _.5O₄Zn₀ _.5, Fe₂Ni₀ _.4Zn₀ _.6, Fe₂Ni₀ _.8Zn₀ _.2, NiO, Fe₂NiO₄, Fe₅O₁₂Sm₃, Ag_0.5Fe₁₂La_0.5O₁₉, Fe₅O₁₂Y₃ 및 FeO₃Y가 포함된다. 하기 2종 이상의 금속 이온의 산화물도 사용할 수 있다: Al(+3), Ti(+4), V(+3), Mn(+2), Co(+2), Ni(+2), Mo(+5), Pd(+3), Ag(+1), Cd(+2), Gd(+3), Tb(+3), Dy(+3), Er(+3), Tm(+3) 및 Hg(+1).

본원에서 사용된 "핵산 서열," "핵산 분자" 또는 "핵산"은 본원에서 정의된 1종 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다. 본원에서 사용된 "표적 핵산 분자" 또는 "표적 핵산 서열"은 본 발명의 방법의 사용자가 샘플에서 검출하고자 하는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다.

본원에서 지칭된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 복수의 뉴클레오티드로 구성된 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 중합체를 의미한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 둘 중 어느 하나의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 염기 변형, 예를 들어 브로모우리딘, 리보스 변형, 예를 들어 아라비노시드 및 2',3'-디데옥시리보스 및 뉴클레오티드간 연결기 변형, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 구체적으로 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.

본원에서 지칭된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 연결기에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 단일-가닥이고 200개 이하의 염기 길이를 갖는 구성원을 포함하는 폴리뉴클레오티드 하위집합이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2 내지 60개의 염기 길이이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 내지 40개의 염기 길이이다. 기타 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 25개 이하의 염기 길이이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단백질-코딩 서열과 관련하여 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

용어 "자연 발생 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형되거나 또는 치환된 당 기 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드 연결기"는 올리고뉴클레오티드 연결기, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트, 포스포로아미데이트 등을 포함한다. 예를 들어, 임의의 목적을 위해 개시내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [LaPlanche et al., Nucl. Acids Res., 14:9081 (1986)]; [Stec et al., J. Am. Chem. Soc., 106:6077 (1984)]; [Stein et al., Nucl. Acids Res., 16:3209 (1988)]; [Zon et al., Anti-Cancer Drug Design, 6:539 (1991)]; [Zon et al., OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England (1991)]; 미국 특허 제5,151,510호; 문헌 [Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90:543 (1990)]을 참조한다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 혼성화를 검출할 수 있게 하는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다.

용어 "고도로 엄격한 조건"은 서열이 고도로 상보적인 핵산 가닥의 혼성화를 허용하고, 유의하게 미스매칭된 서열의 혼성화를 제외하도록 설계된 조건을 가리킨다. 혼성화 엄격성은 온도, 이온 강도 및 변성제, 예를 들어 포름아미드의 농도에 의해 주로 결정된다. 용액 (예를 들어, 비드 응집 없이) 혼성화 및 세척에 대한 "고도로 엄격한 조건"의 예는 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 (65 내지 68℃) 또는 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 및 50％ 포름아미드 (42℃)이다. 문헌 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach Ch. 4 (IRL Press Limited)]을 참조한다.

또한, 더욱 엄격한 조건 (예를 들어, 더 높은 온도, 더 낮은 이온 강도, 더 많은 포름아미드, 또는 기타 변성제)을 이용할 수 있으나, 혼성화의 속도에 영향을 미칠 것이다. 비-특이적 및/또는 백그라운드 혼성화를 감소시키기 위한 목적으로 기타 작용제들이 용액 혼성화 및 세척 완충제 중에 포함될 수 있다. 비록 기타 적합한 작용제들도 사용할 수 있으나, 예로는 0.1％ 소혈청 알부민, 0.1％ 폴리비닐-피롤리돈, 0.1％ 나트륨 피로포스페이트, 0.1％ 나트륨 도데실술페이트, NaDodSO₄, (SDS), 피콜(ficoll), 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 초음파처리된 연어 정자 DNA (또는 또다른 비-상보적 DNA) 및 덱스트란 술페이트가 있다. 혼성화 조건의 엄격성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 이러한 첨가제의 농도 및 유형을 변경할 수 있다. 혼성화 실험은 보통 pH 6.8 내지 7.4에서 실시하지만, 전형적인 이온 강도 조건에서 혼성화의 속도는 거의 pH와 무관하다. 문헌 [Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach Ch. 4 (IRL Press Limited)]을 참조한다.

이중나선의 안정성에 영향을 미치는 요인은 염기 조성, 길이 및 염기 쌍 미스매칭의 정도를 포함한다. 당업자는 상기 변수들을 수용하여 상이한 서열 관련성의 핵산이 혼성체를 형성하도록 혼성화 조건을 조정할 수 있다. 예를 들어, 완벽하게 매칭된 DNA 이중나선의 용융 온도는 다음 식으로 추정할 수 있다: T_m(℃)=81.5+16.6(log[Na⁺])+0.41(％ G+C)-600/N-0.72(％ 포름아미드) (여기서, N은 형성되는 이중나선의 길이이고, [Na⁺]는 혼성화 또는 세척 용액 중 나트륨 이온의 몰 농도이고, ％ G+C는 혼성체 중 (구아닌+시토신) 염기의 백분율임). 완전하지 않게 매칭된 혼성체의 경우, 용융 온도는 1％의 미스매칭에 대해 각각 대략 1℃씩 감소된다.

용어 "중등도의 엄격한 조건"은 "고도로 엄격한 조건" 하에서 일어날 수 있는 것보다 더 높은 정도의 염기 쌍 미스매칭을 갖는 이중나선이 형성될 수 있는 조건을 가리킨다. 용액 중 전형적인 "중등도의 엄격한 조건"의 예로는 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 (50 내지 65℃), 또는 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 및 20％ 포름아미드 (37 내지 50℃)가 있다. 예를 들어, 0.015 M 나트륨 이온 중 50℃의 "중등도의 엄격한 조건"은 약 21％ 미스매칭을 허용할 것이다.

당업자는 "고도로 엄격한 조건" 및 "중등도의 엄격한 조건" 사이의 절대적인 차이점이 없다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 0.015 M 나트륨 이온 (포름아미드 없음)에서, 완전하게 매칭된 긴 DNA의 용융 온도는 약 71℃이다. 65℃에서 세척하면 (동일한 이온 강도에서) 대략 6％의 미스매칭을 허용할 것이다. 더욱 멀리 관련된 서열을 포획하기 위해서, 당업자는 단순히 온도를 낮추거나 이온 강도를 높일 수 있다.

약 20 nt까지의 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 1 M NaCl^*에서의 용융 온도는 T_m=2℃/A-T 염기 쌍+4℃/G-C 염기 쌍에 의해 추정된다. ^*6배의 시트르산나트륨 염 (SSC) 중 나트륨 이온 농도는 1 M이다. 문헌 [Suggs et al., Developmental Biology Using Purified Genes 683 (Brown and Fox, eds., 1981)]을 참조한다.

올리고뉴클레오티드에 대한 높은 엄격성 세척 조건은, 예를 들어 6×SSC, 0.1％ SDS에서 올리고뉴클레오티드의 T_m보다 0 내지 5℃ 낮은 온도일 수 있다.

예시적인 방법

효율적인 분자 분석은 통상적으로 매우 작은 샘플 내 매우 낮은 농도의 분석물의 존재를 검출하는 것을 필요로 한다. 자기 비드 제어를 수행하기 위해 소형 장치에서 외부 자기장을 사용하는 것은, 이전에 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,452,726호; 제6,664,104호; 제6,632,655호; 및 제6,344,326호에 개시되어 있다. 응집을 유도하는 모든 에너지원, 예컨대 음향 에너지 또는 진동을 사용할 수 있으나, 한 실시양태에서, 본 발명은 회전 자기장에서 자기 비드를 사용하여 중합체 분석물, 예컨대 핵산, 지질, 다당류, 단백질 등의 존재 또는 양의 가시적 검출을 제공한다. 상기 방법은 중합체 분석물이 자기 비드에 결합하는 경우, 회전 자기장이 상기 비드에 적용되어 고유한 핀휠-유사 형성을 초래하는 관찰로부터 비롯된다. 중합체 분석물이 존재하지 않는 경우, (응집되지 않은) 회전 자기장에 의해 유도된 자기 비드의 이동 및 형상은 핀휠 형성과 상당히 상이하다. 따라서, 핀휠 형성은 중합체 분석물과 자기 비드 사이의 결합, 및 회전 자기장의 존재에 대해 특이적이므로, 분석물의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 응집체 형성은 회전 자이장에 대해 특이적이지 않고, 다른 방법, 예를 들어 외부의 음향력 또는 진동에 의해 유도될 수 있다. 중합체 분석물과의 혼합물에서 핀휠 형성은 다른 형태의 에너지를 적용함으로써, 예를 들어 샘플을 진동시킴으로써 증진될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 복합 생물학적 샘플을 자기 비드, 또는 용액에 현탁될 수 있는 다른 자기 고체 기재와 접촉시키고, 자기 비드를 회전 자기장에 노출시켜 샘플 내 중합체 분석물의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 핀휠 형성의 존재는 결합된 중합체 분석물의 존재를 나타낸다. 한 실시양태에서, 자기 비드는, 중합체 분석물에 특이적으로 결합하거나 또는 자기 비드에 대한 중합체 분석물의 결합을 증진시키기 위해 코팅 또는 유도체화된다. 또한, 자기 비드에 대한 중합체 분석물의 결합을 증진시키기 위해서 환경을 조작할 수 있다.

본 발명은 또한 복합 액체 생물학적 샘플 내 중합체 분석물의 존재를 검출하기 위한 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 회전가능한 자석, 예를 들어 모터 상에 탑재된 자석을 함유하여, 활성화될 때 모터가 자석을 회전시켜 회전 자기장을 생성한다. 상기 시스템은 또한 대략 자석의 N극과 S극 사이의 중심에 위치하는 내부에 자기 비드를 함유하는 검출 챔버를 함유한다. 사용시 샘플을 검출 챔버에 둔다. 이어서, 모터를 활성화시켜 자석을 검출 챔버 주위로 회전시킨다. 챔버 내 핀휠 형성의 존재는 샘플 내 중합체 분석물의 존재를 나타낸다.

본 발명의 방법 및 장치를 기존의 검정 또는 장치, 특히 마이크로-종합 분석 시스템(micro-total analysis system;μ-TAS)에 추가하여 중합체 분석물 검출기로서 작동시킬 수 있다. 예를 들어, 항체/항원 반응의 존재는 핵산의 커플링을 개시할 수 있고, 핀휠 형성의 존재/부재는 항체/항원 결합이 일어났는지 여부를 결정한다. 이는 면역-PCR 방법과 유사하며, 여기서 핵산의 검출을 위해 PCR 및 형광 프로브를 사용하는 대신 핀휠 형성을 이용한다.

본 발명은 중합체 분석물이 자기 비드에 결합하며 회전 자기장의 존재 하에 있는 경우 고유한 핀휠 형성을 초래한다는 관찰을 기초로 한다. 핀휠 효과는 정자기장에서는 나타나지 않으며, 회전 자기장에 특이적인 것으로 보인다. 본원에서 사용되는 "핀휠 형성"은 원형 또는 디스크형 단면을 갖는 회전 덩어리(rotating mass)를 지칭한다. 상기 덩어리는 중합체 분석물에 의해 연결된 자기 비드의 집단(clump) 또는 응집물로 이루어져 있다. 스틸 사진으로 관찰하는 경우, 핀휠 형성은 자기 비드의 응집물로 이루어진 디스크형 대상체로 보인다. 그러나, 가시적으로 또는 이미지화에 의해 관찰하는 경우에, 디스크형 대상체는 실제로 회전 핀휠의 경우와 유사하게 그의 중심축 주위를 회전한다. 검출 챔버 내에서, 핀휠 형성은 때때로 서로 충돌하여 보다 큰 핀휠을 형성하며, 때때로 챔버 벽과 충돌하여 보다 작은 핀휠로 분열한다.

본 발명의 방법을 수행하기 위한 장치에는 바람직하게는 모터에 장착된 회전가능한 자석, 및 대략 자석의 N극과 S극 사이의 중심에 위치하는 검출 챔버가 포함된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 장치는 교반 플레이트 (그 안에 회전가능한 자석을 가짐) 및 교반 플레이트의 중심에 위치하는 검출 챔버를 함유한다. 교반 플레이트는 탑 커버를 가지며, 이의 상부에 검출 챔버가 있다. 한 실시양태에서, 탑 커버의 하부에 N극 및 S극을 갖는 자석이 있다. 자석은 U자 모양의 각각의 단부에 극을 갖는 U-형 자석일 수 있으나, 다른 자석 형태, 예를 들어 I-형 또는 반원형 자석을 사용할 수 있다. 자석은 그의 중심축 주위에서 자석을 회전시킬 수 있는 모터일 수 있다. 자석은 검출 챔버 바로 아래에 위치할 수 있지만, 검출 챔버가 대략 자석의 두 극 사이에 위치하는 한, 이러한 형태가 사용될 수 있다. 자기장은 검출 챔버에 평행하게, 직각으로, 또는 임의의 각도 중 하나로 위치시킬 수 있다. 비드는 정해진 형태로 이동하며, 여기서 이들은 핀휠 구조를 형성하고, 자기장의 방향성 회전에 상호관련하는 고유한 방향으로 회전한다. 회전 자기장을 생성할 수 있는 회전가능한 자석 또는 다른 장치를 사용할 수 있다. 이러한 장치는 회전 자석 또는 전자기 유도에 의해 생성되는 것과 유사한 회전 자기장을 생성할 수 있는 전자석 또는 전자 회로일 수 있다.

검출 챔버는 대략 자석의 중심 (자석이 회전하는 경우 대략 자기장의 중심)에 위치할 수 있는 임의의 유체 용기일 수 있다. 검출 챔버는 미세유체 장치 또는 마이크로-종합 분석 시스템(μ-TAS)의 부품 또는 성분일 수 있다. 일반적으로, 미세유체 장치 또는 μ-TAS는 하나 이상의 마이크로-채널을 함유한다. μ-TAS의 제작을 위한 많은 형태, 물질 및 크기 규모가 존재한다. 통상적인 μ-TAS 장치는 미국 특허 제6,692,700호 (한디크(Handique) 등); 제6,919,046호 (오'코너(O'Connor) 등); 제6,551,841호 (윌딩(Wilding) 등); 제6,630,353호 (파르세(Parce) 등); 제6,620,625호 (워이크(WoIk) 등); 및 제6,517,234호 (코프-실(Kopf-Sill) 등)에 개시되어 있으며, 이들 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 통상적으로, μ-TAS 장치는 서로 결합된 2개 이상의 기재로 이루어진다. 유체 가공을 위한 마이크로규모 성분을 기재 중 하나 이상의 표면에 배치한다. 이들 마이크로규모 성분에는 반응 챔버, 전기영동 모듈, 마이크로채널, 유체 저장부, 검출기, 벨브 또는 혼합기가 포함되나, 이로 제한되지는 않는다. 기재가 서로 결합된 경우, 마이크로규모 성분이 기재 사이에 둘러싸여지며 샌드위칭된다. 검출 챔버는 마이크로채널을 포함할 수 있다. 마이크로채널의 양쪽 단부에는 샘플을 마이크로채널에 첨가하고, 마이크로채널로부터 제거하기 위한 주입구 및 배출구 포트가 있다. 검출 챔버는 분석을 위한 일체화된 시스템의 부분으로서 μ-TAS의 다른 마이크로규모 성분에 연결될 수 있다.

검출 챔버는 샘플의 첨가 전에 자기 비드를 함유하거나, 또는 자기 비드를 샘플과 함께 검출 챔버에 첨가할 수 있다. 자기 비드는 중합체 분석물의 자기 비드에의 결합, 또는 결합 증진을 위한 물질로 코팅 또는 유도체화된 표면을 함유할 수 있다. 몇몇 코팅 또는 유도체화에는 아민-기재 전하 스위치, 보론산, 실란화(silanization), 역상, 올리고뉴클레오티드, 렉틴, 항체-항원, 펩티드-핵산 (PNA)-올리고뉴클레오티드, 고정된 핵산 (LNA)-올리고뉴클레오티드 및 아비딘-바이오틴이 포함되나, 이로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 핵산의 검출에 대하여, 자기 비드는 고 이온 농도, 무질서유발제에 노출된 경우 핵산을 특이적으로 결합시키도록 코팅된 실리카일 수 있다. 또한, 비드는 핵산과의 결합을 위한 양전하 아민 또는 올리고머로 코팅될 수 있다.

탄수화물을 결합시키기 위해, 자기 비드는 보론산-개질된 표면을 함유할 수 있다. 보론산은 글루코스를 비롯한 특정 탄수화물에서 공통의 잔기인 -시스 디알콜에 공유적으로 및 특이적으로 결합한다.

지질을 결합시키기 위해, 자기 비드는 소수성 기, 예컨대 벤질기, 다양한 길이 (6-20)의 알칸, 또는 비닐기로 개질될 수 있다. 지질은 소수성 결합력에 의해 비드에 결합된다.

단백질을 결합시키기 위해, 자기 비드는 단백질 개질된 표면을 함유할 수 있다. 예를 들어, 비드의 표면은 관심 단백질에 대한 특이적인 항체로 코팅될 수 있다. 일반적인 단백질 검출에 대해, 비드 표면은 아비딘 또는 바이오틴으로 코팅될 수 있고, 관심 단백질은 바이오틴 또는 아비딘으로 유도체화될 수 있다. 따라서, 아비딘-바이오틴 결합으로 인해 단백질이 비드에 결합할 수 있다.

자기 비드의 유도체화 또는 코팅 이외에, 중합체 분석물이 자기 비드와 접촉하는 물리적 환경이 또한 조작되어 비드가 중합체 분석물에 특이적으로 결합되거나 또는 상기에의 자기 비드의 결합이 증진될 수 있다. 예를 들어, 실리카 코팅된 비드는 사용되는 조건에 따라 핵산, 탄수화물 또는 단백질을 특이적으로 결합시키도록 조작될 수 있으며; DNA의 결합은 무질서유발 염 용액에서 일어나고, 양전하 탄수화물의 결합은 저 이온 농도 용액에서 일어나고, 단백질의 결합은 변성 조건 하에서 (우레아, 열 등의 존재 하에) 일어난다.

검출되는 중합체 분석물의 농도에 따라, 가시적 검출을 위한 채널에서의 비드의 수는 약 100 내지 약 10⁸ 개, 예컨대 약 10⁴ 내지 10⁷ 개일 수 있다. 보다 작은 수의 비드, 예를 들어 약 10개의 비드에 형광 검출을 사용할 수 있다. 샘플에서 분석물의 농도가 높을수록, 사용되어야 하는 자기 비드의 양은 더 많아진다.

x-축 및 z-축에서의 자기장의 성분은 본질적으로 자기장의 중심에서는 무시할 수 있으며, 따라서 핀휠 형성에 결정적인 것은 아닐 것이다. y-축에서의 자기장은 약 1 내지 5,000 가우스(gauss), 보다 바람직하게는 약 10 내지 1000 가우스의 세기를 가질 수 있다. 또한, 자석의 형상과 관계없이, y-축에서의 자기장 성분은 회전의 중심에서 그의 최대 세기를 수득할 수 있고, 자석의 두 개의 극에서 최소 세기로 존재한다. 이러한 자기장 성분은 자석의 길이에 따라 최대화될 수 있고, 극에서 갑작스럽게 그의 최소값으로 떨어질 수 있다. 이러한 자기장 성분은 자석의 어느 한 측면을 유의하게 감소시키지는 않는다. 검출 챔버에서의 자기장 라인은 검출 챔버가 놓여진 xy-면에 평행일 수 있다.

샘플에서 중합체 분석물을 검출하기 위해, 샘플을 검출 챔버에 첨가한다. 검출 챔버는 내부에 이미 자기 비드를 함유하거나, 또는 자기 비드가 샘플과 함께 챔버에 첨가될 수 있다. 챔버를 대략 자석의 중심에 (자석의 두 극 사이에) 위치시키면서, 자석을 회전시켜 챔버가 회전 자기장을 경험하게 하였다 (회전 자기장은 또한 자석보다는 오히려 전자 회로를 사용하여 수행될 수 있음). 자석은 약 10 내지 10,000 rpm, 예컨대 약 1000 내지 3000 rpm으로 회전할 수 있다. 채널에서의 핀휠 형성의 관찰은 샘플에서 중합체 분석물의 존재를 나타낸다. 핀휠의 평균 크기 (직경)는 샘플에서 중합체 분석물, 예를 들어 핵산의 농도에 비례할 수 있다. 교정 곡선을 수득하여 핀휠의 평균 크기를 중합체 분석물 농도와 관련시킬 수 있다. 이러한 교정 곡선은, 예를 들어 공지된 농도의 중합체 분석물을 회전 자기장에 적용시키고, 각 농도에 대한 핀휠 형성의 평균 크기를 측정함으로써 생성될 수 있다.

핀휠 형성의 존재는 가시적으로 또는 광학 또는 이미지 장비를 사용하여 검출할 수 있다. 핀휠 형성을 검출하기 위한 하나의 방식은 검출 챔버의 비디오를 촬영 또는 기록하는 것이다. 이는 동시에 한 챔버 또는 여러 챔버의 이미지 또는 기록에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 사진 또는 비디오에서 핀휠 형성을 검출할 수 있다. 프로그램을 먼저 업로드하고, 검출 챔버만이 나타나도록 이미지 (사진 또는 비디오 프레임)를 자를 수 있다. 이어서, 잘려진 이미지를 그레이 스케일로 전환시킬 수 있다. 이어서, 약 40 내지 70의 한계로 확장된 최소 변환을 수행하여 배경 픽셀로부터 자기 미세입자를 단리한다. 각 대상체 내의 홀이 채워지면, 각 대상체를, 예를 들어 개별적 RGB 색으로 라벨링할 수 있다. 이어서, 경계가 각각의 별개의 대상체 주위에 생성된다. 각 경계에 대해, 측정치 m = 4πa/p²를 계산한다 (여기서 a는 대상체의 면적이고, p는 대상체의 둘레임). 측정치 m은 대상체의 원형정도의 척도이고, 완전한 원의 경우 m은 1이다. 각 대상체에 대해, m이 약 0.8 초과, 예컨대 약 0.95 초과인 경우, 대상체는 핀휠로서 정의된다. 이어서, 약 0.8 초과의 m을 갖는 각 대상체 (핀휠)에 대해 도심(centroid)을 플롯팅한다. 이어서, 사진이 사용되는 경우, 핀휠의 수를 계수한다. 비디오가 사용되는 경우, 단계를 비디오의 각 프레임에 대해 반복하고, 프레임 당 핀휠의 평균 개수를 계산한다. 핀휠의 개수 또는 프레임 당 핀휠의 평균 개수가 0.5 내지 10의 설정값 (중합체 분석물 및 비드 농도에 좌우됨) 초과인 경우, 중합체 분석물이 샘플에 존재한다는 결과로 프로그램을 되돌린다. 예를 들어, 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 WO 2009/114709를 참조한다.

자동화 검출에 기초한 소프트웨어에 있어서, 한가지 가능한 시스템은 하나 이상의 카메라, 및 컴퓨터 프로그램 작동을 위한 컴퓨터를 함유한다. 상기 시스템에서, 카메라는 검출 챔버의 사진 또는 비디오를 찍고, 카메라로부터의 이미지는 컴퓨터에 의해 분석한다. 상기 컴퓨터는 바람직하게는 상기 언급한 바와 같이 카메라로부터의 이미지를 자동적으로 다운로딩(downloading)하고 처리하기 위해 카메라에 전자적으로 연결된다. 자동화 검출은 검출 챔버가 μ-TAS의 부품인 경우에 특히 효율적이고, 여기서 컴퓨터는 또한 μ-TAS의 다른 면, 예컨대 온도, 유체 흐름, 통문(gating), 반응 모니터링 등을 제어하고 감지하는 데 사용될 수 있다.

입자

본 발명의 실시에서 유용한 입자에는 금속 (예를 들어, 금, 은, 구리 및 백금), 반도체 (예를 들어, CdSe, Cds, 및 ZnS로 코팅된 CdS 또는 CdSe) 및 콜로이드 물질로서 자성체 (예를 들어, 강자성체), 또한 ZnS, ZnO, TiO2, AgI, AgBr, HgI2, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In2S3, In2 Se3, Cd3 P2, Cd3 As2, InAs, 및 GaAs, 및 실리카 및 중합체 (예를 들어, 라텍스) 입자가 포함된다. 입자는 임의의 형상, 예를 들어 구체 (일반적으로 비드로서 지칭됨) 또는 막대형, 또는 불규칙한 형상을 가질 수 있고, 입자의 그룹은 형상 또는 크기가 다양한 입자들을 가질 수 있으며, 예를 들어 비드의 그룹에서 비드는 균일한 형상 또는 직경을 갖지 않을 수 있다. 입자의 크기는 약 1 nm 내지 약 300 ㎛ (막대 또는 구체의 평균 직경), 예컨대 약 0.5 내지 약 250 ㎛, 또는 약 2 내지 약 10 ㎛일 수 있다. 입자는, 예를 들어 선택된 분석물의 결합을 증진시키는 제제로 코팅하거나 유도체화할 수 있다. 예를 들어, 입자는 실리카 코팅을 포함하거나 또는 스트렙타비틴으로 유도체화할 수 있다.

다양한 측면에서, 제공되는 방법에는 약 1 ㎛ 내지 약 250 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 240 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 230 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 220 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 210 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 200 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 190 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 180 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 170 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 160 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 150 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 140 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 130 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 120 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 110 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 90 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 80 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 70 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 60 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 50 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 40 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 30 ㎛ (평균 직경), 또는 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛ (평균 직경), 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛ (평균 직경)의 크기의 입자를 이용하는 것이 포함된다. 다른 측면에서, 입자의 크기는 약 5 ㎛ 내지 약 150 ㎛, 약 5 내지 약 50 ㎛, 약 10 내지 약 30 ㎛이다. 입자의 크기는 약 5 ㎛ 내지 약 150 ㎛, 약 30 내지 약 100 ㎛, 약 40 내지 약 80 ㎛이다. 한 실시양태에서, 자기 입자는 약 0.5 내지 약 1.5 ㎛ 또는 약 3 내지 약 15 ㎛를 비롯한 약 0.25 내지 50 ㎛의 유효 직경을 가질 수 있다. 비드의 크기는 검출되는 중합체 분석물, 예를 들어 핵산의 예상되는 크기에 필적할 수 있다. 보다 작은 비드는 보다 짧은 중합체 분석물이 있는 핀휠을 형성하고, 보다 작은 비드는 보다 짧은 중합체 분석물에 보다 민감할 수 있다. 비드 크기는 광학 특성 또는 유도체화될 수 있는 표면적의 양을 비롯한 식별하기 위해 요구되는 크기의 특정 컷오프로 조율될 수 있다.

한 실시양태에서, 마그네실 입자 (프로메가 코포레이션(Promega Corp); 미국 위스콘신주 매디슨 소재)가 사용된다. 마그네실 입자는, 전체 약 4 내지 약 12 ㎛ 범위의 직경을 갖으며 약 8 ㎛의 평균 직경을 갖는 상자성 입자 (철심형 이산화규소 비드)이다. 이러한 입자는 마이크로칩 챔버에 로딩되어 샘플 DNA와 접촉된 다음, 외부 자석으로부터의 자기장에 적용될 수 있다.

올리고뉴클레오티드

소정의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) and F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991)]을 참조한다. 고체상 합성 방법은 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드 둘 모두에 대해 고려된다 (널리 공지되어 있는 DNA 합성 방법 또한 RNA 합성에 유용함). 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 또한 효소적으로 제조될 수 있다. 또한, 비자연 발생 핵염기가 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951)]; [Yamane, et al., J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961)]; [Kosturko, et al., Biochemistry, 13:3949 (1974)]; [Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954)]; [Zhang, et al., J. Am. Chem. Soc., 127:74-75 (2005)]; 및 [Zimmermann, et al., J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685 (2002)]를 참조한다.

본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 본원에 논의된 바와 같은 변형 형태뿐만 아니라 유전자 발현 조절에 사용되는 당업계에 공지된 다른 형태들이 포함된다. 유사하게, 본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 본원에 논의된 바와 같은 변형 형태 및 당업계에 공지된 다른 형태들과 상호교환적이다. 특정 예에서, 자연 발생 뉴클레오티드뿐만 아니라 중합될 수 있는 뉴클레오티드의 변형체를 포함하는 용어 "핵염기"가 당업계에서 사용된다. 본원에서, 용어 "뉴클레오티드" 및 "핵염기"는 달리 언급되지 않는 한 동일한 범주를 포함하도록 상호교환적으로 사용된다.

다양한 측면에서, 상기 방법은 DNA 올리고뉴클레오티드, RNA 올리고뉴클레오티드 또는 두 유형의 조합인 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 올리고뉴클레오티드의 변형 형태가 또한 고려된다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 전부 또는 부분적으로 펩티드 핵산 (PNA)이거나, 또는 LNA를 포함한다 (문헌 [Koskin et al., Tetrahedron, 54:3607 (1998)] 참조). 다른 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결기를 포함한다. 또다른 변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 범용 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. "범용 염기"는, 유의한 구조 탈안정화 없이 수소 결합을 형성함으로써 핵산 내 A, C, G, T 및 U 중 어느 하나에 결합하도록 치환될 수 있는 분자를 지칭한다. 범용 염기 유사체가 혼입된 올리고뉴클레오티드는 혼성화에서 프로브로서, PCR 및 DNA 서열분석에서 프라이머로서 작용할 수 있다. 범용 염기의 예에는 5'-니트로인돌-2'-데옥시리보시드, 3-니트로피롤, 이노신 및 히포크산틴이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

변형된 주쇄 . 올리고뉴클레오티드의 특정 예에는 변형된 주쇄 또는 비자연 뉴클레오시드간 연결기를 함유하는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 변형된 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드에는, 주쇄에 인 원자를 보유하는 올리고뉴클레오티드 및 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 뉴클레오시드간 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 "올리고뉴클레오티드"의 의미 내에 있는 것으로 간주된다.

인 원자를 함유하는 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄에는, 예를 들어 정상적인 3'-5' 연결기, 이들의 2'-5' 연결 유사체를 갖는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트 (3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 포함) 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트 (3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트 포함), 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트, 및 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결기가 3'-3', 5'-5' 또는 2'-2' 연결기인 역극성을 갖는 상기 화합물이 포함된다. 또한, 3'-대부분의 뉴클레오티드간 연결기에서 단일의 3'-3' 연결기, 즉 무염기(abasic) (뉴클레오티드가 손실되거나 또는 그 대신에 히드록실 기를 가짐)일 수 있는 단일의 역전된 뉴클레오시드 잔기를 포함하는 역극성을 갖는 올리고뉴클레오티드가 고려된다. 염, 혼합 염 및 유리산 형태가 또한 고려된다. 상기의 인-함유 연결기의 제법을 교시하고 있는 대표적인 미국 특허에는, 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,194,599호; 제5,565,555호; 제5,527,899호; 제5,721,218호; 제5,672,697호 및 제5,625,050호가 포함된다.

그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄는, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결기, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결기, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자성 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결기에 의해 형성된 주쇄를 갖는다. 이들에는 모르폴리노 연결기를 갖는 주쇄; 실록산 주쇄; 술피드, 술폭시드 및 술폰 주쇄; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 리보아세틸 주쇄; 알켄 함유 주쇄; 술파메이트 주쇄; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 주쇄; 술포네이트 및 술폰아미드 주쇄; 아미드 주쇄; 및 혼합된 N, O, S 및 CH₂ 성분 부분을 갖는 다른 주쇄가 포함된다. 예를 들어, 그 개시내용 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 제5,792,608호; 제5,646,269호 및 제5,677,439호를 참조한다.

변형된 당 및 뉴클레오시드간 연결기 . 또다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 모방체에서는 뉴클레오티드 단위의 하나 이상의 당 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결기가 "비자연 발생" 기로 대체된다. 한 측면에서, 이러한 실시양태에서는 펩티드 핵산 (PNA)이 고려된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-주쇄는 아미드 함유 주쇄로 대체된다. 예를 들어, 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호, 및 문헌 [Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]을 참조한다.

또다른 실시양태에서, 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드가 제공되며, 헤테로원자 주쇄 (미국 특허 제5,489,677호 및 제5,602,240호에 기재된 -CH₂-NH-O-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-, -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂- 및 -O-N(CH₃)-CH₂-CH₂- 포함)를 갖는 올리고뉴클레오시드가 제공된다. 또한, 미국 특허 제5,034,506호에 기재된 모르폴리노 주쇄 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드가 고려된다.

다양한 형태에서, 올리고 내 2개의 연속적 단량체 사이의 연결기는, -CH₂-, -O-, -S-, -NR^H-, C=O, C=NR^H, >C=S, -Si(R")₂-, -SO-, -S(O)₂-, -P(O)₂-, -PO(BH₃)-, -P(O,S)-, -P(S)₂-, -PO(R")-, -PO(OCH₃)- 및 -PO(NHR^H)- (여기서, R^H는 수소 및 C₁ _-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C₁ _-6-알킬 및 페닐로부터 선택됨)로부터 선택된 2 내지 4개, 바람직하게는 3개의 기/원자로 이루어진다. 이러한 연결기에 대한 예시적인 예는

이고; 이들 중에서 -CH₂-CO-NR^H-, -CH₂-NR^H-O-, -S-CH₂-O-, -O-P(O)₂-O-O-P(-O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -NR^HP(O)₂-O-, -O-P(O,NR^H)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH₃)-O- 및 -O-PO(NHR^N)-O- (여기서, RH는 수소 및 C₁ _-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C₁ _-6-알킬 및 페닐로부터 선택됨)가 고려된다. 추가의 예시적인 예는 문헌 [Mesmaeker et. al., Current Opinion in Structural Biology, 5:343-355 (1995)] 및 [Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 25:4429-4443 (1997)]에 주어진다.

올리고뉴클레오티드의 또다른 변형된 형태는, 그 개시내용 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공보 제20040219565호에 상세하게 기재되어 있다.

변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 특정 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서, OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 (여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀ 알킬 또는 C₂ 내지 C₁₀ 알케닐 및 알키닐일 수 있음) 중 하나를 포함한다. 다른 실시양태는 O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂ 및 O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]₂ (여기서, n 및 m은 1 내지 약 10임)를 포함한다. 다른 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서, C₁ 내지 C₁₀ 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터컬레이터(intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 향상시키기 위한 기 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 향상시키기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체 중 하나를 포함한다. 한 측면에서, 변형체는 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH₂CH₂OCH₃; 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 공지되어 있음) (문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 78:486-504 (1995)]), 즉 알콕시알콕시 기를 포함한다. 다른 변형체는 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉 O(CH₂)₂ON(CH₃)₂ 기 (2'-DMAOE로도 공지되어 있음) 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당업계에서 2'-O-디메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE로도 공지되어 있음), 즉 2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₃)₂ (하기 본원 실시예에도 기재되어 있음)를 포함한다.

또다른 변형체는 2'-메톡시 (2'-O-CH₃), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂), 2'-알릴 (2'-CH₂-CH=CH₂), 2'-O-알릴 (2'-O-CH₂-CH=CH₂) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 2'-변형체는 아라비노 (상위) 위치 또는 리보 (하위) 위치에 존재할 수 있다. 한 측면에서, 2'-아라비노 변형체는 2'-F이다. 유사한 변형체가 또한, 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치에서, 예를 들어 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치에서 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 생길 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 당 모방체를 가질 수 있는데, 예컨대 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 모이어티를 가질 수 있다. 예를 들어, 그 개시내용 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 제5,792,747호; 및 제5,700,920호를 참조한다.

한 측면에서, 당의 변형체에는, 2'-히드록실 기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어 비시클릭 당 모이어티를 형성하는 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid) (LNA)이 포함된다. 연결기는 특정 측면에서, 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 가교시키는 메틸렌 (-CH₂-)_n 기 (여기서, n은 1 또는 2임)이다. LNA 및 그의 제법은 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기재되어 있다.

자연 염기 및 변형된 염기. 올리고뉴클레오티드는 또한 염기 변형체 또는 치환체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "비변형" 또는 "자연" 염기는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 염기는 다른 합성 염기 및 자연 염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알킬 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (유사(pseudo)우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 변형된 염기는 트리시클릭 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘 (예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 염기는 또한, 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클로 대체된 염기, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈을 포함할 수 있다. 추가의 염기는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 염기, 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley ＆ Sons, 1990]에 개시된 염기, 문헌 [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30:613 (1991)]에 개시된 염기, 및 문헌 [Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T.] 및 [Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993]에 개시된 염기를 포함한다. 이러한 염기 중 특정 염기는 결합 친화도를 증가시키는 것에 유용하고, 이에는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린 (2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신 포함)이 포함된다. 5-메틸시토신 치환체는 핵산 이중나선 안정도를 0.6 내지 1.2℃만큼 증가시키는 것으로 나타났고, 특정 측면에서 이는 2'-O-메톡시에틸 당 변형체와 조합된다. 예를 들어, 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제3,687,808호, 미국 특허 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,645,985호; 제5,830,653호; 제5,763,588호; 제6,005,096호; 제5,750,692호 및 제5,681,941호를 참조한다.

"변형된 염기" 또는 다른 유사 용어는 자연 염기 (예를 들어, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 및/또는 티민)와 쌍을 이룰 수 있고/거나 비자연 발생 염기와 쌍을 이룰 수 있는 조성물을 지칭한다. 특정 측면에서, 변형된 염기는 15, 12, 10, 8, 6, 4 또는 2℃ 또는 그 미만의 T_m 차이를 제공한다. 예시적인 변형된 염기는 EP 1 072 679 및 WO 97/12896에 기재되어 있다.

올리고뉴클레오티드 또는 그의 변형된 형태는 약 20 내지 약 100개 길이의 뉴클레오티드로부터의 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 5 내지 50개 또는 그 사이 임의의 정수의 길이의 뉴클레오티드로부터의 올리고뉴클레오티드이다. 또한, 약 20 내지 약 90개 길이의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 80개 길이의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 70개 길이의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 60개 길이의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 길이의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 45개 길이의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 40개 길이의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 35개 길이의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 30개 길이의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 25개 길이의 뉴클레오티드, 또는 약 15 내지 약 90개 길이의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 80개 길이의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 70개 길이의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 60개 길이의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 50개 길이의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 45개 길이의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 40개 길이의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 35개 길이의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 30개 길이의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 25개 길이의 뉴클레오티드, 또는 약 15 내지 약 20개 길이의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드, 및 특히 올리고뉴클레오티드가 원하는 결과를 달성할 수 있을 정도로 개시된 크기의 길이를 갖는 모든 올리고뉴클레오티드 중간체가 고려된다. 따라서, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및 100개 길이의 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드가 고려된다.

본원에서 용어 "복합체 형성"과 상호교환적으로 사용되는 "혼성화"는 왓슨-크릭(Watson-Crick) DNA 상보성 규칙에 따른, 수소 결합에 의한 2 또는 3개 가닥의 핵산 사이의 상호작용, 후그스테인(Hoogstein) 결합, 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 서열-특이적 결합을 의미한다. 혼성화는 당업계에 공지되어 있는 상이한 엄격한 조건하에 수행될 수 있다.

다양한 측면에서, 상기 방법은, 또다른 서열과 100％ 상보적인, 즉 완벽히 매칭되는 한편, 다른 측면에서 개별 올리고뉴클레오티드는 또다른 서열의 모든 부분 또는 일부분에 적어도 (보다 크거나 또는 동등함을 의미함) 약 95％ 상보적이고, 올리고뉴클레오티드가 표적 서열에 혼성화될 수 있는 한, 상기 서열에 적어도 약 90％, 적어도 약 85％, 적어도 약 80％, 적어도 약 75％, 적어도 약 70％, 적어도 약 65％, 적어도 약 60％, 적어도 약 55％, 적어도 약 50％, 적어도 약 45％, 적어도 약 40％, 적어도 약 35％, 적어도 약 30％, 적어도 약 25％, 적어도 약 20％ 상보적인 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다.

상기 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열이 특이적 혼성화가 가능하기 위해 표적 서열에 100％ 상보적일 필요는 없다는 것이 당업계에서는 이해된다. 게다가, 올리고뉴클레오티드는 개입 또는 인접 세그먼트가 혼성화 사건에 관련되지 않도록 (예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조), 하나 이상의 세그먼트에 걸쳐 표적 서열에 혼성화될 수 있다. 임의의 주어진 올리고뉴클레오티드와 표적 서열 사이의 상보성 백분율은 당업계에 공지되어 있는 블라스트(BLAST) 프로그램 (기본적인 로컬 얼라이먼트 조사 도구) 및 파워블라스트(PowerBLAST) 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다 (문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)]; [Zhang and Madden, Genome Res., 7:649-656 (1997)]).

혼성체의 안정도는 검정 조건과 융화될 수 있도록 선택된다. 이는, T_m을 검정에서 사용되는 표준 조건에 적절하게 하는 방식으로 뉴클레오티드 서열을 디자인함으로써 달성될 수 있다. 미스매칭이 발생하는 위치는 혼성체의 불안정성을 최소화하도록 선택될 수 있다. 이는, 보통 완벽히 상동성인 염기 서열의 가장 긴 신장(stretch)이 혼성체 안정성에 대한 주요 결정자이기 때문에, 미스매칭된 부분 중 어느 한 면 상에서 완벽한 상보성의 길이를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 상보성 구역은 상동성의 G:C 풍부한 구역을 포함할 수 있다. 상기 서열의 길이는, 입자와 함께 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 선택할 때의 하나의 인자일 수 있다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 100개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어 15 내지 50개, 20 내지 40개, 15 내지 30개, 또는 15 내지 50의 임의의 정수의 뉴클레오티드를 갖는다. 광범위한 자기 상보성(self-complementarity)을 갖는 올리고뉴클레오티드는 피해야 한다. 15개 미만의 뉴클레오티드는, 상기 개시된 방법에 적합하기에는 너무 낮은 용융점을 가진 올리고뉴클레오티드 복합체를 유발할 수 있다. 100개 초과의 뉴클레오티드는, 상기 개시된 방법에 적합하기에는 너무 높은 용융점을 갖는 올리고뉴클레오티드 복합체를 유발할 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20 내지 약 70개, 약 22 내지 약 60개 또는 약 25 내지 약 50개 길이의 뉴클레오티드를 갖는다.

혼성화 유도된 응집을 위한 입자

관능화된 입자는 적어도, 예를 들어 올리고뉴클레오티드로 개질된 이의 표면의 일부분을 갖는다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드가 부착된 임의의 입자는 검출 검정에 사용하기에 적합하고, 올리고뉴클레오티드 복합체 형성, 즉 혼성화를 방해하지 않아 이중-가닥 복합체를 형성한다.

혼성화 유도된 응집 검정을 위해, 표적 핵산 서열 (a' 및 b'를 가짐)에 상보적인 서열 (a 및 b)을 갖는 올리고뉴클레오티드가 부착된 갖는 적어도 2가지 유형의 입자를 제조한다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 a 및 b는, 올리고뉴클레오티드 a는 3' OH 기에 의해 상기 입자에 부착되고 올리고뉴클레오티드 b는 5' PO₄ ³- 기에 의해 상기 입자에 부착되는 방식으로, 2가지 유형의 입자에 관능화된다.

다양한 측면에서, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 스페이서(spacer)를 통해 상기 입자에 결합된다. 이러한 측면에서, 스페이서는 유기 모이어티, 중합체, 수용성 중합체, 핵산, 폴리펩티드 및/또는 올리고당이다. 올리고뉴클레오티드를 입자의 표면에 부착되도록 관능화시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 문헌 [Whitesides, Proceedings of the Robert A. Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry, Houston, Tex., pages 109-121 (1995)]를 참조한다. 또한, 문헌 [Mucic et al., Chem. Comm. 555-557 (1996) (3' 티올 DNA를 평평한 금 표면에 부착시키는 방법을 기재함; 이 방법은 올리고뉴클레오티드를 입자에 부착시키는 데 사용될 수 있음)]을 참조한다. 알칸티올 방법은 또한 올리고뉴클레오티드를 다른 금속, 반도체 및 자성 콜로이드 및 상기 나열된 다른 입자에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 고체 표면에 부착시키기 위한 다른 작용기에는 포스포로티오에이트 기 (예를 들어, 금 표면에 대한 올리고뉴클레오티드-포스포로티오에이트의 결합에 대한 미국 특허 제5,472,881호를 참조), 치환된 알킬실록산 (예를 들어, 실리카 및 유리 표면에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합에 대한 문헌 [Burwell, Chemical Technology, 4:370-377 (1974)] 및 [Matteucci and Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191 (1981)], 및 아미노알킬실록산의 결합 및 머캅토알킬실록산의 유사 결합에 대한 문헌 [Grabaretal, Anal. Chem., 67:735-743] 참조)이 포함된다. 또한, 5' 티오뉴클레오시드 또는 3' 티오뉴클레오시드로 종결된 올리고뉴클레오티드가, 올리고뉴클레오티드를 고체 표면에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 하기 참고문헌은 올리고뉴클레오티드를 입자에 부착시키기 위해 사용될 수 있는 다른 방법들을 기재하고 있다: 문헌 [Nuzzo et al., J. Am. Chem. Soc., 109:2358 (1987)] (금 상의 디설파이드); [Allara and Nuzzo, Langmuir, 1:45 (1985)] (알루미늄 상의 카르복실산); [Allara and Tompkins, J. Colloid Interface Sci., 49:410-421 (1974)] (구리 상의 카르복실산); [Iler, The Chemistry Of Silica, Chapter 6, (Wiley 1979)] (실리카 상의 카르복실산); [Timmons and Zisman, J. Phys. Chem., 69:984-990 (1965)] (백금 상의 카르복실산); [Soriaga and Hubbard, J. Am. Chem. Soc., 104:3937 (1982)] (백금 상의 방향족 고리 화합물); [Hubbard, Acc. Chem. Res., 13:177 (1980)] (백금 상의 술포란, 술폭시드 및 다른 관능화된 용매); [Hickman et al., J. Am. Chem. Soc., 111:7271 (1989)] (백금 상의 이소니트릴); [Maoz and Sagiv, Langmuir, 3:1045 (1987)] (실리카 상의 실란); [Maoz and Sagiv, Langmuir, 3:1034 (1987)] (실리카 상의 실란); [Wasserman et al., Langmuir, 5:1074 (1989)] (실리카 상의 실란); [Eltekova and Eltekov, Langmuir, 3:951 (1987)] (이산화티타늄 및 실리카 상의 방향족 카르복실산, 알데히드, 알콜 및 메톡시 기); [Lec et al., J. Phys. Chem., 92:2597 (1988)] (금속 상의 단단한 포스페이트).

입자, 올리고뉴클레오티드 또는 둘 모두가 올리고뉴클레오티드를 입자에 부착시키기 위해 관능화된다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다.

각각의 입자는 이에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드를 가질 것이다. 결과적으로, 각각의 입자-올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는 상보적 서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산에 결합할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 주어진다. 본 발명은 이러한 실시예에 기재된 특정 조건 또는 세부사항에 제한되지 않는 것으로 이해해야 한다.

실시예 I

극미량의 질량을 갖는 자성 실리카 비드를 함유하는 미세유체 챔버 상에 집중된 RMF (도 1)는, 비드 응집 및 '핀휠'의 형성 (도 2B)을 통해 샘플 내 선택된 중합체 분석물의 존재를 나타낸다. 샘플이 특정 중합체 분석물을 전혀 함유하지 않는 경우, 비드는 '분산된' 형태 (도 2A)로 남아있다.

DNA 및 단백질의 존재 시의 핀휠 효과를 특징화하고, 핀휠 형성에 대한 중합체 크기-의존성의 증거를 제공하기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 미세유체 챔버에 부착된, 4 내지 8 M 구아닌 히드로클로라이드 중의 상용되는 실리카-코팅된 철심형 자기 비드, 핵산을 실리카 표면에 결합시키기 위한 조건을 사용하는 경우, RMF는 비드가 상당히 분산되도록 (도 2A) 하는 방식으로 이를 자유롭게 순환시킨다. 1000배 초과 질량의 단백질을 나타내는 소혈청 알부민 10 mg/mL의 첨가 시 (도 2C), 분산 형태는 안정적이고, 재현가능하다. 그러나, 나노그램 수준의 인간 게놈 DNA (hgDNA)의 첨가 시, 단백질이 존재하는 경우에도 (각각, 도 2D 및 2B), '핀휠' 형성으로의 분명한 전이가 관찰되었다. 이는 단백질이 (매우 고농도인 경우에도) 핵산-유도된 핀휠 형성을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.

도 3은 3 자리수(order of magnitude) 이상의 hgDNA-유도된 핀휠 형성의 동적 범위 10 ng/μL 내지 10 pg/μL를 나타낸다. 챔버 내 비드의 질량을 핀휠 형성에 필요한 hgDNA 질량에 매칭되도록 조정하였다.

DNA가 무질서유발 염 조건하에 핀휠 형성을 유발하는 유일한 분석물이라는 전제를 추가로 지지하기 위해, 전단 및 비전단 hgDNA를 평가하였다. 도 4는 예를 들어, 추출한 hgDNA는 핀휠 형성 (도 4A)을 일으킨 반면, 동일한 질량의 초음파처리한 DNA (도 4B)는 음성 대조군 (분산형) (도 4C)과 유사하였음을 나타낸다. 흥미롭게도, 도 5는 핀휠 형성이 DNA 또는 무질서유발 조건에 한정되는 것은 아니라는 것을 나타낸다. 키토산, 양이온성 다당류 (약 310 kDa의 MW)에, 저-염 완충액 (pH 5에서 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산]) 중의 매우 동일한 실리카 비드를 사용했을 때 뚜렷한 핀휠을 형성하였다. 여기서, 결합은 정전기적 인력에 의해 조절되며, 이는 이러한 검출 방법이 상이한 결합 화학을 갖는 것으로 추론될 수 있음을 입증한다. 이는, 이러한 효과가, 폭넓게 다양한 중합체 분석물에 적용가능한 일반적인 현상이라는 입장을 지지한다.

상기 기재된 시스템은 특정 조건, 예를 들어 결합 화학과 관련된 조건 하에서, 자기 비드에 결합하는 중합체 분자를 검출하고 정량화하기 위한 다용도의 가시적인 검출 기법 및 관련 장비를 제공한다. 게다가, 상기 기법은 극미량의 질량, 예를 들어 검정마다 몇 개만의 비드만큼의 적은 질량을 갖는 자기 비드를 사용하여 미세유체 챔버 내에서 수행될 수 있다.

실시예 II

일례의 물질 및 방법

자기 비드: 프로메가 코포레이션으로부터 구입한 마그네실 상자성 입자, 직경 = 8±4 ㎛.

PMMA 어레이: 레이저 조각기(engraver)에 의해 제조된 4×4 어레이, 각각의 웰의 직경 = 0.2 인치, 각각의 웰의 용량 = 20 μL

카메라: 캐논(Canon) EOS 레벨(Rebel) XS

현미경: 라이카(Leica) S8 APO

교반 플레이트: 피셔 사이언티픽, 인크.(Fisher Scientific, Inc.)로부터 구입한 써믹스 스터러 모델(Thermix Stirrer Model) 120S

일례의 절차

1. 8 M의 농도를 갖는 1×TE 완충액 중의 GuHCl 용액을 제조하였다. 약 100 mM 내지 약 8 M의 농도를 사용할 수 있었다. 다른 농도의 구아니딘 히드로클로라이드, 및 기타 무질서유발 염을 사용하여, 핵산이 자성 입자, 예컨대 본원에 개시된 직경을 갖는 자성 입자의 결합을 유도할 수 있었다. 또한, 상이한 농도의 염은 특정 직경의 자기 비드의 증강된 응집을 유발할 수 있는데, 예를 들어 보다 낮은 농도의 염은 보다 작은 직경의 자기 비드의 증강된 응집을 유발할 수 있었다.

2. 자기 비드 현탁액을 제조하였다: 스톡 비드 현탁액 30 μL를 취하고, 물 및 GuHCl 용액으로 세척하고, 1 mL의 GuHCl 용액에 재현탁시켰다.

3. DNA 샘플을 제조하였다:

a. 예비-정제된 DNA: 8 M GuHCl 용액을 사용하여 적당한 농도로 희석하였다.

b. 세포 또는 혈액: 세포가 용해되고 모든 DNA가 방출되도록, 세포 또는 혈액을 다량의 8 M GuHCl (예를 들어, 부피비 = 1:100)과 혼합하였다.

4. 알려진 농도를 갖고, 미지의 DNA와 동일한 크기를 갖는 DNA를 표준물로서 사용하고, 일련의 희석에 의해 표준 DNA 용액을 제조하였다.

5. PMMA 플레이트의 웰 내에서 소정 개수의 비드 (예를 들어, 목적하는 검출 한도, 감도 및 동적 범위에 따라 2-15 μL의 현탁액)와 소정 부피의 표준 DNA 용액 (전형적으로 5 μL)을 혼합하였다. 총 부피를 20 μL로 조절하고, GuHCl 및/또는 H₂O를 사용하여 GuHCl 농도를 6 M로 조정하였다.

6. 미지의 DNA 샘플에 대해 단계 5를 반복하였다. PMMA 플레이트를 사용하여, 16개 이하의 DNA-자기 비드 혼합물을 제조하고, 함께 측정할 수 있었다.

7. 교반 플레이트 상에 PMMA 어레이를 놓고, 교반 플레이트를 켜서, 혼합물 시스템이 평형에 도달할 때까지 비드와 DNA를 혼합하였다 (약 5분).

8. 웰 중 하나가 교반 플레이트의 중심에 있도록 교반 플레이트 상의 PMMA 어레이 위치를 조절하였다. 교반 플레이트를 켜서 중심 웰 내의 비드를 분산시키고 사진을 찍었다.

9. 샘플을 함유하는 다른 모든 웰에 대해 단계 8을 반복하였다.

10. 각각의 웰에 대해 5개의 사진을 수집하였다.

11. 이미지제이를 사용하여 사진을 분석하였다 (이미지 프로세싱 참조).

12. DNA 없는 분산된 비드 구역에 의해 이미지제이로부터 획득한 어두운 구역의 값들을 정규화하고, DNA 농도에 대한 구역 (％)을 플롯팅하였다.

일례의 이미지 프로세싱

소프트웨어: 이미지제이 v 1.41 (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2009)와 다중한계(multithresholder) 플러그인 (http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/multi-thresholder.html, Nov 2^nd, 2009).

8-비트 이미지를 열고, 다중한계에서 삼각형법을 사용하여 한계를 설정하고, 분석->분석 입자를 클릭하여, 비드가 바탕보다 어둡기 때문에 한계보다 낮은 픽셀의 수를 얻었다.

삼각형 알고리즘으로, 소프트웨어에 의해 아래에 나타낸 바와 같이 한계인 최대 거리를 제공하는 회색 수준의 값을 설정하였다 (Zack et al., J. Histochem. Cytochem., 25:741 (1977)).

결과

도 10은 다양한 양의 헬라 세포와 혼합된 마그네실 상자성 입자 현탁액 5 및 10 μL의 결과를 나타낸다. 그래프는 세포 당 6.25 pg의 DNA가 있다는 가정에 기초한 것이다.

실시예 III

혼성화 유도 응집

방법

각각의 웰 내부: 17 μL의 1 x PCR 완충액

1 μL의 샘플 (특이적 표적 서열을 갖는 것으로 의심되는 것). 벽을 유리 조각으로 덮어 증발을 방지하면서, 가열된 교반 플레이트를 사용하여 최대 RPM에서 샘플을 가열할 수 있고, 이후에 다음을 첨가하였다:

5' 프라이머 (올리고뉴클레오티드) 함유 비드 1 μL

3' 프라이머 (올리고뉴클레오티드) 함유 비드 1 μL

상보적 커넥터를 프라이머 서열에 어닐링하고 RMF를 적용할 때, 웰 중심에 핀휠이 형성되었고 (비드들을 결합시킴), 이어서 사진을 찍었다.

A. 커넥터 (표적) 서열

(서열 3)을

(서열 1) 및

(서열 2)를 갖는 비드와 혼합할 때 100 bp의 연결부가 형성되었고, 상기 혼합물에 25℃의 어닐링 온도를 적용하였다. 도 11은 얻어진 결과를 나타낸다.

핀휠의 크기는 농도에 따라 변화되지 않았고, 단지 형성된 핀휠의 양이 변화되었다. 따라서, 혼성화 유도 응집 방법은 연결부의 양을 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 연결부의 길이 범위를 제공할 수 있었다.

B. λ-DNA PCR 생성물을 검출하기 위해, 상이한 작업 온도를 이용하였다 (70℃). 프라이머 람다_프로브_

(서열 4) 람다_프로브_

(서열 5)를 사용하여 500 bp의 PCR 생성물

을 검출하였다.

그러나, 더 긴 서열 (전장 λ 게놈 DNA)은 반응이 없었고, 이는 따라서 특이성을 입증한다. 핀휠 크기는 A (상기)의 핀휠 크기와 상이하였는데, 이는 혼성화를 통해 연결된 비드들 사이의 서열 길이가 더 길어, 덜 조밀 (밀집)하고 이에 따라 더 커 보이는 핀휠이 유발되기 때문이다.

C. 전형적으로 qPCR에 사용되는 프라이머 서열을 스트렙타비딘-바이오틴 연결기를 통해 실리카-유사 비드에 결합시켰다. 상기 연결기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 갖는 비드를 제조하였다; 정방향 프라이머:

(서열 7); 및 역방향 프라이머:

(서열 8). 이들 서열은 인간 TPOX 유전자좌 (

; 서열 9)의 68 bp 표적 영역에 대해 특이적이다. hgDNA의 첨가시 핀휠이 형성되었다. 일부 혼성화 유도 응집 검정의 경우, 제한효소 또는 기타 뉴클레아제를 사용하여 더 작은 hgDNA 단편을 생성할 수 있었다.

혼성화 유도 응집 검정에 대한 일례의 적용

혼성화 유도 응집 검정을 사용하여, 복합적인 매트릭스, 예를 들어 전혈(whole blood) 내 특이적 DNA, 암 생체마커와 같은 DNA, 종 특이적 DNA를 검출할 수 있었다 (예를 들어, 미지의 샘플 내 인간 대 동물 검출, 미지의 샘플 내 수컷 대 암컷 검출, 또는 범죄 수사에서의 용의자 DNA의 배제). 상기 검정은 특이적 서열의 형광 표지-무함유 검출을 가능케 하고, 신속하며 (5분), 예를 들어 최소의 장비로 인해 비용이 낮다. 상기 검정은 다양한 길이 및 어닐링 온도의 특이적 서열을 결정하는데 사용될 수 있어, 다중화(multiplexing)에 적합한 포맷이다.

모든 공개물, 특허 및 특허출원이 본원에 참고로 포함된다. 상기 명세서에서, 본 발명을 그의 바람직한 특정 실시양태에 대해 기재하였고, 예시를 목적으로 많은 세부사항을 기술하였지만, 본 발명은 추가의 실시양태가 가능하고, 본 발명의 기본 원리에 벗어나지 않는다면 본원의 특정의 세부사항은 상당히 변할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> University of Virginia Patent Foundation Landers, James P. Finkler, David M Barker, Nicolas Scott Leslie, Daniel C. <120> VERSATILE, VISIBLE METHOD FOR DETECTING POLYMERIC ANALYTES <130> 1036.136WO1 <150> US 61/257,679 <151> 2009-11-03 <150> US 61/384,534 <151> 2010-09-20 <160> 9 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 1 ttttttatgt ggtctatgtc gtcgttcgct agtagttcct gggctgcac 49 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 2 tcgaggcgta gaattccccc gatgcgcgct gttcttactc attttt 46 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 3 aaatacgcct cgagtgcagc ccattt 26 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 4 ccagttgtac gaacacgaac tcatcttttt t 31 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 5 ttttttggtt atcgaaatca gccacagcgc c 31 <210> 6 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic DNA PCR product <400> 6 gatgagttcg tgttcgtaca actggcgtaa tcatggccct tcggggccat tgtttctctg 60 tggaggagtc catgacgaaa gatgaactga ttgcccgtct ccgctcgctg ggtgaacaac 120 tgaaccgtga tgtcagcctg acggggacga aagaagaact ggcgctccgt gtggcagagc 180 tgaaagagga gcttgatgac acggatgaaa ctgccggtca ggacacccct ctcagccggg 240 aaaatgtgct gaccggacat gaaaatgagg tgggatcagc gcagccggat accgtgattc 300 tggatacgtc tgaactggtc acggtcgtgg cactggtgaa gctgcatact gatgcacttc 360 acgccacgcg ggatgaacct gtggcatttg tgctgccggg aacggcgttt cgtgtctctg 420 ccggtgtggc agccgaaatg acagagcgcg gcctggccag aatgcaataa cgggaggcgc 480 tgtggctgat ttcgataacc 500 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 7 cgggaaggga acaggagtaa g 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 8 ccaatcccag gtcttctgaa ca 22 <210> 9 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 9 cgggaaggga acaggagtaa gaccagcgca cagcccgact tgtgttcaga agacctggga 60 ttgg 64

Claims

a) 중합체 분석물과 자기 비드의 결합으로 혼합물의 형성이 가능한 조건 하에 복합적인 생물학적 샘플을 자기 비드와 접촉시키는 단계;
b) 상기 혼합물에 비드의 응집을 유발하는 에너지량을 적용하는 단계; 및
c) 상기 혼합물 내 응집물의 존재 또는 양을 검출함으로써 분석물의 존재 또는 양을 검출하는 단계
를 포함하는, 복합적인 생물학적 샘플 내 중합체 분석물의 존재 또는 양을 검출하는 방법.
a) 중합체 분석물과 자기 비드의 결합으로 수성 혼합물의 형성이 가능한 조건 하에 복합적인 생물학적 샘플을 자기 비드와 접촉시키는 단계;
b) 상기 혼합물에, 결합된 분석물은 갖지만 복합적인 혼합물 내 다른 분자는 갖지 않는 비드의 응집을 유발하는 에너지량을 적용하는 단계; 및
c) 응집물로부터 다른 분자를 분리함으로써 분석물을 단리하는 단계
를 포함하는, 복합적인 생물학적 샘플 내 중합체 분석물을 단리하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 혼합물에 회전 자기장, 음향 에너지 또는 진동을 적용하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 자석이 에너지를 제공하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 응집물의 핀휠 형성이 검출되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 핵산 및 단백질을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 게놈 DNA인 방법.
제7항에 있어서, 게놈 DNA에 초음파처리, 전단 또는 뉴클레아제를 적용하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 핵산이고, 결합이 서열 특이적이지 않은 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 용해된 세포를 포함하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 샘플이 용해된 세포의 하위분획을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 증폭된 DNA를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 생리학적 유체 샘플인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액 샘플인 방법.
제1항 내지 제9항 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 세포를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 인간 세포를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 비드가 실리카, 아민-기재 전하 스위치, 보론산, 실란, 올리고뉴클레오티드, 렉틴, PNA, LNA, 항체, 항원, 아비딘 또는 바이오틴으로 코팅되거나 유도체화된 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 비드가 형광 표지를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 조건이 농축된 무질서유발 염(chaotropic salt)의 존재 하에 샘플을 비드와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물이 미세유체 장치의 일부를 형성하는 검출 챔버 내에 있는 것인 방법.
제2항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물의 수성 부분을 제거함으로써 다른 분자가 응집물로부터 분리되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 분석물을 비드로부터 용리시키는 것을 더 포함하는 방법.
a) 제1 표적 핵산을 갖는 것으로 의심되는 샘플을, 제1 표적 핵산이 샘플 내에 존재하는 경우 올리고뉴클레오티드 내 상보적 서열과 제1 표적 핵산의 결합으로 혼합물의 형성이 가능한 조건 하에, 표적 핵산 내 서열과 상보적인 서열을 갖는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 자기 비드의 제1 집단 및 표적 핵산 내 서열과 상보적이면서 상기 제1 뉴클레오티드 서열 내 상보적 서열과는 상이한 서열을 갖는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 자기 비드의 제2 집단과 접촉시키는 단계;
b) 상기 혼합물에 비드의 응집 또는 핀휠화를 유발하는 에너지량을 적용하는 단계; 및
c) 혼합물 내 응집물 또는 핀휠의 존재 또는 양을 검출함으로써 샘플 내 제1 표적 핵산의 존재 또는 양을 검출하는 단계
를 포함하는, 샘플 내 표적 핵산의 존재 또는 양을 검출하는 방법.
제23항에 있어서, 혼합물에 회전 자기장 또는 음향 에너지를 적용하는 것인 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 표적 핵산이 암 생체마커, 종 특이적 서열 또는 성별 특이적 서열을 포함하는 것인 방법.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 게놈 DNA를 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 게놈 DNA가 자기 비드와 접촉하기 전에 전단되거나 뉴클레아제 처리되는 것인 방법.
제27항에 있어서, 뉴클레아제가 제한 엔도뉴클레아제인 방법.
제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 증폭된 핵산을 포함하는 것인 방법.
제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 비-공유 상호작용을 통해 비드와 결합하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 비-공유 상호작용이 스트렙타비딘 또는 아비딘과 바이오틴 사이에 존재하는 것인 방법.
제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 생리학적 유체 샘플인 방법.
제32항에 있어서, 샘플이 혈액 샘플인 방법.
제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 세포를 포함하는 것인 방법.
제34항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을, 제2 표적 핵산 서열이 샘플 내에 존재하는 경우 제2 표적 핵산 서열과의 상보적 서열과 제2 표적 핵산 서열의 결합이 가능한 조건 하에, 제2 표적 핵산 서열 내 서열과 상보적인 서열을 갖는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 자기 비드의 제3 집단 및 제2 표적 핵산 서열 내 서열과 상보적이면서 제1 뉴클레오티드 서열 내 서열과는 상이한 서열을 갖는 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 자기 비드의 제4 집단과 추가로 접촉시키고, 여기서 비드의 제1 또는 제2 집단은 비드의 제3 또는 제4 집단과 구별될 수 있는 것인 방법.