KR20120088009A

KR20120088009A - ｍｉＲＮＡ를 타겟으로 한 신경퇴행성 질환 치료

Info

Publication number: KR20120088009A
Application number: KR1020100089651A
Authority: KR
Inventors: 노재규; 이상건; 김만호; 주건; 정근화; 이순태
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2012-08-08
Also published as: CN103189069A; CN103189069B; US9301969B2; EP2617433A2; US20130184331A1; JP2013542921A; WO2012036433A2; WO2012036433A3; KR101235256B1; EP2617433A4; JP5710001B2; EP2617433B1

Abstract

본 발명은 특정 miRNA를 타겟으로 한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신경퇴행성 질환의 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 발굴된 miR-206 타겟은 알쯔하이머 동물 모델 및 인간 뇌 시료에서 공통적으로 고발현 된 것으로서 실험적 오차(artifact errors) 없이 선택된 실질적인 치료 타겟이다. miR-206의 억제제로서 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miRNA를 타겟으로 한 신경퇴행성 질환 치료에 있어서 최초로 성공적인 결과를 제시한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-206의 기능을 억제하여 BDNF 및 IGF-1의 레벨을 크게 증가시키며 시냅스 재생을 증가시켜 결국 신경퇴행성 질환 특히 알쯔하이머 질환을 치료한다.

Description

ｍｉＲＮＡ를 타겟으로 한 신경퇴행성 질환 치료{Treatment of Neurodegenerative Diseases by Targeting a miRNA}

본 발명은 특정 miRNA를 타겟으로 한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신경퇴행성 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.

알쯔하이머 질환(AD)은 점진적 인지기능 감소, 신경 퇴화, 아밀로이드의 세포외 침착(노인성반)과 세포내 봉입(신경원섬유; NFT)의 증가로 특징 지워지는 노인들에서의 치매의 가장 일반적인 형태이다(Braak and Braak, 1996; Querfurth and LaFerla, 2010). 현재, AD에 대한 치료방법은 없다. AD의 주요한 분자 기전은 미스폴딩 단백질, 산화성 손상 및 염증성 손상 및 에너지 부전을 포함하며, 이는 궁극적으로 시냅스 기능이상을 초래한다(Querfurth and LaFerla, 2010). 시냅스는 AD 발병의 초기 타겟이며 시냅토파이신(synaptophysin)의 변화는 인지 기능 감소와 연관되어 있다(Selkoe, 2002). AD의 뇌는 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)의 낮은 레벨을 나타내며, BDNF는 시냅스 유연성, 시냅스 생성 및 신경생성의 주요한 조절자이다(Phillips et al., 1991; Bramham and Messaoudi, 2005; Ernfors and Bramham, 2003). 이에, BDNF의 조절을 통하여 AD를 치료하려는 노력이 있으나(Nagahara et al., 2009), 안전하고 효과적인 치료방법은 개발되어 있지 않다.

MicroRNAs(miRNA)는 21- 내지 23-뉴클레오타이드의 작은 RNA 분자이며, 타겟 mRNA의 파쇄 또는 해독단계에서의 억제를 통하여 유전자 발현을 조절한다(Kim et al., 2009). miRNAs는 다양한 생리학적 현상 및 질환에 관여를 한다(Kim et al., 2009). 중추신경계에서, miRNA 생성의 주요한 조절자인 Dicer가 소실되면 신경퇴화가 유도되는데, 이는 균형있는 miRNAs 발현이 신경계에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다(Schaefer et al, 2007; Cueller et al., 2008). 몇 개의 miRNAs, 예컨대 miR-8, 9/9* 및 133b는 신경퇴화에 관여하는 것으로 알려져 있다(Karres et al., 2007 Kim et al., 2007; Packer et al., 2008). AD 연구에 있어서, 몇 몇의 microRNA 발현 변화 및 이들의 AD 관여 또한 알려져 있다(Maes et al., 2009; Hebert and De Strooper, 2009). 비록 이러한 연구들은 AD의 병인에 대한 이해를 넓히기는 하지만, AD에서 miRNAs의 직접적 치료 용도는 아직까지 시도된 바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신경퇴행성 질환 특히 알쯔하이머 질환을 치료할 수 있는 타겟 분자를 발굴하고 이를 타겟으로 하는 의약을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 miR-206이 신경퇴행성 질환의 뇌에서 특이적으로 고발현 되며 이를 타겟으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 시냅스를 재생하고 기억력을 회복시키는 등 신경퇴행성 질환을 치료할 수 있음을 실질적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신경퇴행성 질환의 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 중 2번째부터 7번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 약제학적 유효량; 및

(b) 약제학적으로 허용되는 담체.

본 발명자들은 신경퇴행성 질환 특히 알쯔하이머 질환을 치료할 수 있는 타겟 분자를 발굴하고 이를 타겟으로 하는 의약을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 miR-206이 신경퇴행성 질환의 뇌에서 특이적으로 고발현 되며 이를 타겟으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 시냅스를 재생하고 기억력을 회복시키는 등 신경퇴행성 질환을 치료할 수 있음을 실질적으로 확인하였다.

본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 타겟으로 하는 miRNA, 특히 miRNA의 씨드 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 “상보적 핵산-기반 억제제”로 기재될 수 있다.

서열목록 제1서열은 miR-206의 성숙 서열을 나타낸다. 서열목록 제1서열에서 2번째부터 7번째까지의 뉴클레오타이드 서열은 miR-206의 씨드 서열이다. 일반적으로 miRNA의 씨드 서열은 타겟 인지에 매우 중요한 서열로서(Krenz, M. et al., J. Am . Coll . Cardiol . 44:2390-2397(2004); H. Kiriazis, et al., Annu . Rev . Physiol . 62:321(2000)), 다양한 종에 대하여 보존적(conserved)이다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-206의 씨드 서열인 서열목록 제1서열의 2번째부터 7번째까지의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지며, 이 상보적인 서열만에 의해서도 miR-206을 억제할 수 있다.

본 명세서에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 언급하면서 사용되는 용어 “상보적”은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-206 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열(즉, miR-206의 성숙 서열) 중에서 1-8번째나 2-8번째, 또는 2-7번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열(즉, miR-206의 성숙 서열) 전체에 상보적인 서열을 갖는다.

본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 분자를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자이며, 보다 바람직하게는 RNA 분자이다. 선택적으로 , 본 발명에서 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드(RNA), 디옥시리보뉴클레오타이드(DNA), 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)이다. 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2’-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2’-O-C₁ _-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2’-O-C₁ _-3 메틸 올리고뉴클레오타이드이다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-206에 상보적인 서열을 가지는 핵산-기반 억제제를 포함하는 포괄적인 의미를 갖는다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 포함되는 것은, 예를 들어 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앤타고미어 및 억제 RNA 분자를 포함한다.

용어 “앤타고미어는 단일-가닥 화학적-변형 리보뉴클레오타이드로서 miR-206에 적어도 부분적으로 바람직하게는 완전하게 상보적인 서열을 갖는다. 앤타고미어는 하나 또는 그 이상의 변형 뉴클레오타이드(예컨대, 2'-O-메틸-당 변형)를 포함한다. 어떤 구현예에 따르면, 앤타고미어는 변형 뉴클레오타이드만을 포함한다. 앤타고미어는 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하며 이에 부분적으로 또는 완전히 포스포로티오에이트 백본을 갖게 된다. 인 비보 운반 및 안정성을 개선하기 위하여, 앤타고미어는 그의 3‘-말단에 콜레스테롤 또는 다른 부위를 결합시킬 수 있다. miR-206을 억제하기 위하여 적합하여 앤타고미어의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10-40 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 20-25 뉴클레오타이드이다.

miR-206 기능의 억제는 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 달성될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 그 이상의 LNAs(Locked nucleic acids)를 포함할 수 있다. LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2‘ 내지 4’ 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다. 택일적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 PNAs(peptide nucleic acids)를 포함할 수 있으며, 이는 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 포함할 수 있는 다른 화학적 변형은, 2'-O-알킬(예컨대, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸), 2'-플루오로 및 4'-티오 변형과 같은 당 변형; 포스포로티오에이트, 모포리노 또는 포스포노카복실레이트 결합과 같은 백본 변형(예컨대, 미국 특허 제6,693,187호 및 제7,067,641호)을 포함한다. 다른 구현예에서, 적합한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸 "갭머"이며 이는 5‘-말단 및 3’-말단에 2'-O-메톡시에틸-변형 리보뉴클레오타이드를 포함하며 중앙에 적어도 10개의 디옥시리보뉴클레오타이드를 갖는다. 이 "갭머"는 RNA 타겟의 RNase I 의존성 파쇄 기전을 촉발시킬 수 있다. 안틴센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10-40 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 20-25 뉴클레오타이드이다.

miR-206의 기능을 억제하는 다른 접근 방식은 억제 RNA 분자를 투여하는 것이며, 상기 억제 RNA 분자는 miR-206의 성숙 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 이러한 억제 RNA 분자는 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 라이보자임을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환은 다양한 신경퇴행성 질환을 포함하며, 바람직하게는 알쯔하이머 질환, 치매, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 또는 근위축성 측삭 경화증이며, 가장 바람직하게는 알쯔하이머 질환이다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-206의 기능을 억제하여 BDNF 및 IGF-1의 레벨을 크게 증가시키며 시냅스 재생을 증가시켜 결국 신경퇴행성 질환 특히 알쯔하이머 질환을 치료한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 국소 주입, 뇌실내 주입, 척수강 주입, 피하 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

miR-206의 억제제로서 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miRNA를 타겟으로 한 신경퇴행성 질환 치료에 있어서 최초로 성공적인 결과를 제시한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-424^*, miR-18b^*, miR-135a^*, miR-1228, miR-320, miR-296-5p, miR-557, miR-338-5p, miR-206, miR-92a, miR-1238, miR-513a-5p, miR-423-5p, miR-188-5p, miR-140-3p, miR-575, miR-640, miR-1237, miR-191^* 또는 miR-134의 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보적 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는 신경퇴행성 질환의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 신경퇴행성 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 miR-424^*, miR-18b^*, miR-135a^*, miR-1228, miR-320, miR-296-5p, miR-557, miR-338-5p, miR-206, miR-92a, miR-1238, miR-513a-5p, miR-423-5p, miR-188-5p, miR-140-3p, miR-575, miR-640, miR-1237, miR-191^* 또는 miR-134의 발현을 검출하는 방법을 통해 신경 퇴행성 질환 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 miRNA 분자들의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다.

가장 바람직하게는, 상기 miRNA 분자는 miR-206이다.

본 발명의 진단 키트는 다양한 신경퇴행성 질환, 바람직하게는 알쯔하이머 질환, 치매, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 또는 근위축성 측삭 경화증이며, 가장 바람직하게는 알쯔하이머 질환의 진단에 이용될 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 PRDX 1 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어“상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적 (perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명의 miRNA의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 키트 또는 방법에 의해 분석된 상기 miRNA의 발현 정도, 예컨대, RT(reverse transcriptase)-PCR 또는 실시간(real-time)-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 의해 측정된 발현 정도가 정상 대조군과 비교하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 가장 바람직하게는 3배 이상의 발현도를 나타내는 경우에는 분석 시료를 채취한 대상(subject)이 신경퇴행성 질환 특히 알쯔하이머 질환을 가지고 있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 신경퇴행성 질환, 특히 알쯔하이머 질환에 대한 치료 타겟으로서 miR-206를 제공한다.

(b) 본 발명에서 발굴된 miR-206 타겟은 알쯔하이머 동물 모델 및 인간 뇌 시료에서 공통적으로 고발현 된 것으로서 실험적 오차(artifact errors) 없이 선택된 실질적인 치료 타겟이다.

(c) miR-206의 억제제로서 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miRNA를 타겟으로 한 신경퇴행성 질환 치료에 있어서 최초로 성공적인 결과를 제시한다.

(d) 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-206의 기능을 억제하여 BDNF 및 IGF-1의 레벨을 크게 증가시키며 시냅스 재생을 증가시켜 결국 신경퇴행성 질환 특히 알쯔하이머 질환을 치료한다.

도 1a는 Tg2576 AD 마우스의 miRNA 프로파일이다. WT-7mo, WT-12mo, Tg2576-7mo, 및 Tg2576-12mo의 마이크로어레이 분석은 분별적으로 조절되는 miRNAs를 보여준다. 적색은 고발현 및 녹색은 저발현을 나타낸다.
도 1b는 상기 miRNA들 중 miR-206는 Tg2576-7mo 또는 Tg2576-12mo 마우스에서 가장 크게 증가하였다. RT-PCR을 실시하여 Tg2576-12mo 마우스에서 miR-206의 증가된 레벨을 검증하여다.
도 1c는 정량적 실시간 PCR 결과로서, miR-206이 상당히 상향조절됨을 보여준다.
도 1d는 miR-206에 대한 in situ 혼성화 결과이다. miR-206의 증가된 발현은 뇌 세포 전체(화살표 머리) 및 특히 혈관주변 내피 부위(화살표)에 분포되었다.
도 2는 miR-206의 타겟 mRNA를 보여준다. TargetScan, PicTar 및 microT 프로그램을 이용하여 miR-206의 타겟으로서 BDNF, IGF1, Notch3, 및 MEOX2의 3‘-UTR 부위를 찾아 내었다. miR-206은 5’씨드 서열로서 GGAAUGA(밑줄)를 갖는다.
도 3은 Tg2576 마우스의 3번째 뇌실로 주입된 앤타고미어-206의 분포를 보여주는 이미지이다. 뇌의 DAPI-염색 섹션은 해마 부위에서 Cy3-표지 앤타고미어-206이 다량 수용되었음을 보여준다(패널 A). 주입된 앤타고미어-206의 많은 양이 렉틴-양성 내피세포에 의해 수용되었다(패널 B). 막대 = 100μm in 패널 A, 50μm in 패널 B.
도 4a-4b는 앤타고미어-206의 처리후 타겟 단백질의 발현 변화를 보여준ㄴ다. Tg2576-대조군 마우스는 proBDNF, BDNF 및 IGF-1의 감소된 레벨을 보여주며, 반면에 Notch3 및 MEOX2는 변화가 없었다(도 4a). 앤타고미어-206의 주입은 proBNDF, 성숙 BDNF 및 IGF-1의 레벨을 증가시켰고(도 4a), 광학밀도의 측정에 따르면 Tg2576-대조군 마우스와 비교하여 Tg2576-앤타고미어-206 마우스에서 상기 분자들이 상당히 증가하였다(도 4b). ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs. WT 마우스. ^†P < 0.05, ^††P < 0.01 vs. Tg2576-대조군 마우스.
도 5a-5c는 앤타고미어-206의 처리에 의해 행동학적 효과를 보여준다. 맥락적 공포 조건화 실험에서, Tg2576-대조군 마우스는 김소된 위축 시간을 나타내었고, 앤타고미어-206 처리 후 1주일째에 증가된 위축 시간을 나타내었다(도 5a). 앤타고미어-206의 치료학적 효과는 최소 3주 동안 지속되었고 이는 Tg2576-대조군 마우스와 비교한 Tg2576-앤타고미어-206-3w 군에서 증가된 위축 시간으로 확인할 수 있다. 단서적 조건화 시험에서, 실험군 사이의 차이는 없었다(도 5b). Y-미로 실험에서, Tg2576-앤타고미어-206-1w 마우스는 Tg2576-대조군 마우스와 비교하여 개선된 교차 행동을 나타내었다(교차 %는 유사함)(도 5c). * P <0.05. 도 5b에서 밑줄 막대는 음향 단서를 나타낸다. †
도 6a-6d는 Aβ 로드 측정 결과이다. Aβ40 (도 6a) 및 Aβ42 (도 6b)의 ELISA-기반 측정에서, 앤타고미어-206 처리는 대조군 (CTR) 처리와 비교하여 Aβ40 및 Aβ42 레벨의 차이가 없었다. 피질 및 해마 조직의 티오플라빈-S 염색 정량화에서(도 6c), 앤타고미어-206 처리는 총 Aβ 플라크 면적에 영향을 미치지 않았다. 대표도는 각 실험군에서 Aβ 플라크를 보여준다. ns = not significant.
도 7a-7b는 해마 시냅스 밀도 측정 결과이다. 해마에서의 시냅토파이신 발현의 광학밀도를 측정하였다(도 7a). Tg2576-앤타고미어-206-1w 및 Tg2576-앤타고미어-206-3w 마우스에서, Tg2576-대조군 마우스와 비교하여 증가된 시냅토파이신 발현이 관찰되었으며(도 7b), 이는 상기 처리에 의해 시냅스 밀도가 증가하였음을 보여주는 것이다.
도 8a-8b는 인간 중측두피질 시료의 miRNA 프로파일을 보여준다. 3명의 대조군 대상(CTR1, CTR2, CTR3) 및 3명의 AD 환자(AD1, AD2, AD3)의 마이크로어레이 분석을 실시하여 AD 뇌에서의 miRNA 변화를 분석하였다(도 8a). 이들 중에서, miR-206이 Tg2576 마우스와 유사하게 AD 뇌에서 상향조절되는 것으로 검출되었다. 통계분석은 인간 AD 뇌에서 miR-206이 상당히 높게 발현됨을 보여준다(도 8b).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

AD 모델

본 실험들은 AAALAC(Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)에 의해 인가된 서울대학교 병원의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 허가를 받고 실시하였다. 스웨덴 이중 변이(스웨덴 변이; Lys670→Asn, Met671→Leu)를 포함하는 인간 아밀로이드 전구체 단백질의 695-아미노산 이소폼을 프리온 프로모터의 조절 하에서 발현하는 Tg2576 마우스(Taconic, Hudson, NY, USA)(Hsiao et al., 1996)를 AD 형질전환 모델로 이용하였다. 형질전환 및 야생형 마우스를 독립된 케이지 및 실온(25℃)에서 음수에 자유롭게 접근할 수 있도록 하면서 12시간 광-암 사이클 조건 하에서 유지하였고, 7개월령 또는 12개월령에서 miRNA 분석에 이용하였다.

miRNA 마이크로어레이

마취한 마우스를 단두로 희생시키고, 뇌를 즉시 적출하였다. 총 RNA를 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 각각의 마우스 뇌로부터 분리하였다. 실험에 이용되는 마우스의 편차로부터 발생되는 오차를 감소시키기 위하여, RNAs를 풀링하여 각각의 실험군에 대하여 두 마우스로부터 얻은 뇌 시료를 합하여 하나의 시료를 만들었다. NanoDrop ND-1000 스펙트로포토미터(NanoDrop Tech., Rockland, DE, 미국) 및 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, 미국)으로 RNA의 농도 및 질을 결정하였다.

miRNA에 대한 발현 프로파일은 Agilent Mouse miRNA Microarray 815K 키트(Agilent Technologies)를 이용하여 분석하였으며, 상기 키트는 567개 마우스 miRNAs를 검출할 수 있는 것이다. Agilent 하드웨어 플랫폼을 이용하여 스캐닝 및 분석을 실시하였고, GeneSpring GX, version 7.3.1(Agilent Technologies)을 제조회사의 프로토콜에 따라 이용하여 데이터를 정규화 하고 분석하였다. 0.01 미만의 측정은 0.01로 세팅하였다.

보스톤 VA Healthcare System (Boston, MA, 미국)의 Brain Bank로부터 인간 측두피질의 냉동 시료를 수득하였고, Agilent human miRNA Microarray 815K 키트(Agilent Technologies)를 이용하여 miRNA에 대한 발현 프로파일을 분석하였다. 상기 키트는 723개 인간 miRNAs를 검출할 수 있는 것이다. 스캐닝 및 데이터의 분석은 상술한 마우스 시료와 유사한 방법으로 실시하였다.

miRNA 및 mRNA의 실시간 PCR

mirVana qRT-PCR miRNA 검출 키트(Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 선별적으로 변화되는 miRNAs를 분석하였다. 모든 RT(real-time) 반응들은 3세트씩 하였고 ABI 7300(Applied Biosystems)을 이용하였다.

비교 역치 사이클(Ct)을 이용하여 상대적 발현 정도를 계산하였고, 로딩 에러를 제거하기 위하여 내재성 snoRNA 검출 키트(Ambion)를 이용하여 동일 시료들에서 대조군 snoRNA202를 측정하고 miRNA 레벨을 정규화 하였다. miRNA를 가시화 하기 위하여, RT-PCR를 동일한 키트를 이용하여 실시하였고 35-사이클 증폭된 miRNAs를 1.0% 아가로스 젤에서 가시화 하였다.

miRNA 의 인 시투 혼성화

록킹된 핵산(LNAs)을 이용하여 miRNA 인 시투 발현을 분석하였다. 상기 LNAs는, miRNA 검출에 필요한 짧은 프로브에 대하여 혼성화 온도를 크게 증가시켜 강화된 엄격조건(stringency)이 이용되도록 하는 바이-사이클릭 RNA 유사체이다 (Obernosterer et al., 2007). miRNA 검출에 이용되는 LNA 프로브는 Exiqon에서 구입하였고, DIG 30 end 레이블링 키트(Roche)를 이용하여 냉동-절편화 조직을 레이블링 하였다(Obernosterer et al., 2007).

miRNAs 의 타겟 유전자 예측

miRNA 성숙 서열 데이터베이스를 miRBase(http://www.mirbase.org)로부터 얻었다. 마우스 유전자 3′- 비해독 부위(UTR)에 있는 miRNA 타겟 위치를 규명하기 위하여, 3종의 타겟 예측 프로그램을 이용하였다: TargetScan (http://www.targetscan.org),(Lewis, 2005) PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/), (Krek, 2005) 및 microT (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/) (Kiriakidou, 2004).

AD 마우스에서 앤타고미어의 처리

miRNA-206의 억제는 서열-특이적 앤타고미어 (2'-O-메틸화 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 서열: 5’-cca cac acu ucc uua cau ucc a-3’), 또는 스크램블-서열 앤타고미어(서열: 5’-aag gca agc uga ccc uga agu u-3’)((주)바이오니어, 대한민국)의 주입으로 유도하였다. 1% 케타민(30 mg/kg) 및 자일라진 하이드로클로라이드(4 mg/kg)를 복강내 주입하여 마우스를 마취시키고, 스테레오탁식 장치에 위치시켰다. 30-게이지 해밀톤 주사기를 이용하여, 0.5 nmole 앤타고미어 또는 스크램블-앤타고미어 in PBS 1 ㎕를 세 번째 뇌실에 다음과 같은 좌표로 주입하였다: 전정으로부터 전-후 -1.06 mm, 중측방: 0.00 mm, 등-배: -2.4 mm. 앤타고미어를 5분 동안 천천히 주입하였다. 추가적 5분 동안 바늘을 주입 위치에 위치시킨 다음 부드럽게 제거하였다. 앤타고미어를 추적하기 위하여, Cy3-표지 앤타고미어((주)바이오니어, 대한민국)를 뇌실에 주입하였다.

맥락적 및 단서적 공포 조건화( Contextual and cued fear conditioning )

공포 조건화는 종래방법(Jeon et al., 2008)에 따라, 공포-조건화 쇼크 챔버 시스템(Coulbourn Instruments, Whitehall, PA, 미국)에서 실시하였다. 조건화를 위하여, 마우스를 공포-조건화 장치 챔버에 5분 동안 놓은 다음, 28-s 어쿠스틱 조건화 자극을 준 후, 비조건화 자극으로서 바닥 그리드에 2초 동안 0.7-mA 쇼크를 인가하였다. 상기 과정을 60 초 간격으로 3회 반복하였다. 맥락적 기억을 평가하기 위하여, 조건화 24시간 후 마우스를 아쿠스틱 자극 없이 훈련 장치에 다시 옮긴 다음 위축 행동을 5분 동안 관찰하였다. 단서적 기억을 평가하기 위하여, 조건화 24시간 후 다른 냄새, 바닥 및 시각을 갖는 챔버에 마우스를 옮기고 그의 행동을 5분 동안 모니터링 하였다. 상기 시험의 최종 3분 동안, 동물을 아쿠스틱 자극에 노출시켰다. 호흡 운동을 제외한 운동의 결여를 나타내는 크라우칭 위치로 정의 되는 위축 행동의 길이를 측정하여 공포 반응을 정량화 하였다(Jeon et al., 2008).

Y 미로 시험

Y-미로 시험을 종래의 방법에 따라 실시하였다(Sarter et al., 1988). 미로를 검정색 플라스틱으로 제작하였고 각각의 암을 35 cm 길이, 15 cm 높이, 5 cm 폭으로 제작하였고 동일한 각도에 위치시켰다. 마우스를 하나의 암의 말단에 위치시키고 미로를 통하여 5분 동안 자유롭게 이동하도록 하였다. 암 진입의 시리즈를 시각적으로 기록하였으며 마우스의 발뒤꿈치가 암 내에 완전하게 위치한 경우를 암 진입이 이루어진 것으로 평가하였다. 교차횟수(Alternation)는 오버래핑 트리플렛 세트의 3개의 암으로의 연속적인 진입으로 정의하였다. % 교차횟수는 실제 대 가능성(actual to possible)의 비로 계산하였다.

웨스턴 블롯팅

마취된 마우스를 단두로 희생시키고, 뇌를 즉시 적출하였다. 각 뇌의 균질액에 대하여 종래의 방법에 따라 처리하여 웨스턴 블롯팅을 실시할 수 있도록 하였으며(Lee et al., 2009), 이 경우 BDNF(brain-derived neurotrophic factor, Abcam), IGF-1(insulin-like growth factor-1, Abcam), Notch3 (Abcam), MEOX2 (Abcam) 또는 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체를 이용하였다. 인핸스드 화학발광 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)으로 블롯들을 발전시키고 디지털적으로 스캐닝 하였다(GS-700; Bio-Rad, Hercules, CA, 미국). 각각의 밴드의 β-액틴에 대한 상대적 광학 밀도를 Molecular Analyst^TM 소프트웨어(Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 뇌 균질액에서 Aβ40 및 Aβ42의 레벨은 Aβ Ultrasensitive ELISA 키트(Invitrogen)를 이용하여 측정하였다.

Tg2576 마우스의 조직학적 분석

마우스를 깊게 마취시키고 10 ml 콜드 염수 및 10 ml 4% 파라포름알데하이드 in 0.1 M PBS로 심장을 통하여 관류시켰다. 연속적 섹션들(20 μm 두께)을 DAPI로 염색하여 Cy3-표지 앤타고미어-206을 검출하거나, 또는 항-렉틴 또는 항-시냅토파이신 항체(Abcam, Cambridge, MA, 미국)로 염색하였다. Aβ 플라크 로딩을 분석하기 위하여, 마우스의 6개의 200-μm 간격 연속적 두정 조직 섹션(해마의 입쪽시작 부위로부터 미측말단까지, 전정 전후 -1.5부터 -2.5 mm까지)을, 종래의 방법(Tsai et al., 2007)에 따라 실온에서 8분 동안 1% 티오플라빈 S(Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 섹션들을 100% 에탄올로 한번 세척하고 80% 에탄올/물로 2회 세척한 다음 물로 10분 동안 세척한 다음 마운팅 하였다. 뇌 부위(해마 또는 피질) 윤곽을 표시하고 표시된 구조들에서의 플라크 면적을 Image Pro-Plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD, 미국)로 측정하였다. 각각의 섹션에서 퍼센트 플라크 면적을 평균화 하여 각 마우스에서 총 플라크 면적을 계산하였다.

500-μm 간격 3개 연속적 두정 조직 섹션(전정 전후 -1.5부터 -2.5 mm까지)을 이용하여, 해마에서 시냅토파이신 발현의 광학밀도(OD)를 이미지 분석 시스템(Image-Pro Plus, Media Cybernetics)을 이용하여 정량적으로 분석하였으며, 이를 대조군 Tg2576 마우스의 값과의 상대적 값으로 나타내었다.

데이터 분석 및 통계

본 연구에서 모든 데이터는 평균± SD로 제시된다. miRNA 발현의 열지도는 Z-score로 가시화 하였고, 이는 (miRNA 발현의 개별적 값 - miRNA 발현의 평균)/miRNA 발현의 표준편차 이다. 선택적 상향조절은 miRNA가 야생형 또는 정상 동물과 비교하여 2.0-배 이상인 경우로 정의하였고, 선택적 하향조절은 야생형 또는 정상 동물과 비교하여 0.5-배 이하인 경우로 정의하였다. Student’s t-test는 그룹간 비교에서 이용되었다. 3개 이상의 언페어링 그룹 간 비교에서, 일원배치 ANOVA(analysis of variance) 및 사후검증(Dunnett’s and Turkey’s tests)을 이용하였다. SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, 미국)를 통계적 분석에 이용하였고, 0.05 미만의 양쪽-꼬리 확률 값은 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

실험 결과

AD 마우스의 miRNA 스그네이쳐

miRNA 조절의 치료학적 타겟을 발굴하기 위하여, 7개월령 또는 12개월령의 야생형(WT) 및 Tg2576 AD 형질전환 마우스를 이용하여 miRNA 마이크로어레이를 실시하였다(WT-7mo, WT-12mo, Tg2576-7mo, 및 Tg2576-12mo) (도 1a). 총 Aβ (Aβ40 및 Aβ42)에 대한 Aβ42 레벨의 백분율은 7개월령 후 상당히 증가하였고, Tg2576-12mo 마우스의 경우 맥락적 기억이 손상되었으며 시냅스 수상돌기가 감소하고 아밀로이드 플라크가 증가하였다(Jacobsen et al., 2006). Tg2576-12mo 마우스에서, WT-12mo와 비교하여 총 8개의 miRNAs(miR-206, miR-697, miR-744*, miR-540-3p, miR-187, miR-540-5p, miR-146a, 및 miR-467b*)이 높게 나타났고, 6개의 miRNAs (miR-466f-3p, miR-801, miR-20a*, miR-466g, miR-302c*, 및 miR-706)가 낮게 나타났다(표 1).

Tg2576-12mo 마우스에서 변화된 miRNAs

miRNAs	Tg2576-7mo에서의 변화(배)	Tg2576-12mo에서의 변화(배)
상향조절
mmu-miR-206	4.64	19.45
mmu-miR-697	0.46	3.01
mmu-miR-744*	1.02	2.70
mmu-miR-540-3p	1.00	2.52
mmu-miR-187	1.00	2.26
mmu-miR-540-5p	1.44	2.06
mmu-miR-146a	1.13	2.04
mmu-miR-467b*	0.79	2.04
하향조절
mmu-miR-466f-3p	0.16	0.43
mmu-miR-801	0.29	0.42
mmu-miR-20a*	1.00	0.41
mmu-miR-466g	0.07	0.41
mmu-miR-302c*	1.00	0.27
mmu-miR-706	0.33	0.19

Tg2576-7mo 및 Tg2576-12mo에서 공통적으로 이상조절(dysregulated)된 miRNAs를 조사한바, 하나의 miRNA, miR-206이 공동적으로 이상조절 되었고 4개의 miRNA (miR-466f-3p, miR-801, miR-466g, 및 miR-706)이 공통적으로 하향조절 되었다. Tg2576-12에서 miR-206의 배율 변화가 가장 크기 때문에, RT-PCR(도 1b) 및 실시간 PCR(도 1c)를 실시하여 이러한 증가를 검증하였다. Tg2576-12mo 마우스는 WT-12mo 마우스와 비교하여 miR-206의 상당한 이상조절을 나타내었다(배율 변화 = 9.93± 1.30 vs. WT-12mo, P<0.05; n=3 per group). miR-206에 대한 인 시투 혼성화 실험에 따르면, miR-206의 증가된 발현이 전체 뇌 세포에 걸쳐 관찰 되었고 특히 혈관주변 내피 부위에서 그러하였다(도 1d).

이어, AD와 연관된 것으로 알려진 mRNA 타겟 중에서 miR-206 타겟을 TargetScan, PicTar 및 microT 프로그램으로 검색하였다. BDNF, IGF-1, Notch3, 및 MEOX2가 miR-206 결합의 잠정적으로 타겟으로 분석되었고(도 2), 이러한 결과는 BDNF (Phillips et al., 1991), IGF-1 (Carro et al., 2002), MEOX2 (Wu et al., 2005) 및 Notch 3 (Chabriat, 2009)가 신경퇴행에 실질적 또는 예측적 기여를 고려하면 타당한 결과이다.

AD 모델에서 앤타고미어 -206의 치료학적 응용

증가된 miR-206이 BDNF, IGF-1, Notch3 및 MEOX2의 발현을 감소시켜 AD의 발전을 촉진시킬 수 있다는 가설에 기초하여, 본 발명자들은 2’-O-메틸화 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 miR-206의 억제제 (앤타고미어-206)을 디자인 하여다. Cy3-표시 앤타고미어-206를 Tg2576-12mo 마우스의 3번째 뇌실에 주입한 1일 후, 앤타고미어-206을 해마 및 피질에서 검출하였다(도 3a). Cy3-형광의 분포는 모세혈관에서 가장 높게 나타났고, 이는 cy3-앤타고미어-206 및 렉틴의 이중 레이블링으로 검증하였다(도 3b).

그런 다음, Tg2576-12mo 마우스에 앤타고미어-206을 뇌실내 주입한 후 1주일 시점에 예상의 타겟 단백질의 변화를 관찰하였다. 스크램블 앤타고미어로 처리된 Tg2576-대조군 마우스는 proBDNF, BDNF 및 IGF-1의 감소된 레벨을 보였으며, Notch3 및 MEOX2 레벨은 변화가 없었다(도 4a). 반대로, 앤타고미어-206의 뇌실내 주입은 proBNDF, 성숙 BDNF 및 IGF-1의 레벨을 변화시켰으며, 광학밀도 측정 결과에 따르면 Tg2576-앤타고미어-206 마우스에서 이들 분자들의 상당한 증가가 관찰되었다(도 4b). Tg2576-대조군 마우스와 비교하여 Tg2576-앤타고미어-206 마우스에서 proBDNF는 3.6 배 (P < 0.05), 성숙 BDNF는 4.1 배 (P < 0.05), 및 IGF-1은 4.0 배 (P < 0.05) 증가하였다.

앤타고미어 -206은 AD 마우스에서 기억력 및 스냅스 재생을 증가시켰다

증가된 BDNF 및 IGF-1의 치료학적 효과를 평가하기 위하여, 기억력 실험을 실시하였다. 12개월째, 행동 실험 1주(Tg2576-앤타고미어-206-1w) 또는 3 주(Tg2576-앤타고미어-206-3w) 전에 앤타고미어-206을 처리하였다. 맥락적 공포 조건화 실험에서, 스크램블 앤타고미어로 처리한 Tg2576-대조군 마우스는 WT 마우스와 비교하여 낮은 위축 시간을 나타내었으며, 이는 Tg2576 마우스의 손상된 해마 기억을 보여주느 것이다(도 4a). 한편, Tg2576-앤타고미어-206-1w 마우스는 Tg2576-대조군 마우스와 비교하여 증가된 위축 시간을 나타내었다. 또한 Tg2576-앤타고미어-206-3w 마우스도 Tg2576-대조군 마우스와 비교하여 증가된 위축 시간을 나타내었으며, 이러한 결과는 앤타고미어-206 처리의 치료학적 효과가 적어도 3주는 유지됨을 보여주는 것이다. 단서적 조건화 실험에서, 실험군 간의 차이는 없었다(도 4b). Y-미로 실험에서, Tg2576-앤타고미어-206-1w 마우스는 Tg2576-대조군 마우스와 비교하여 보다 개선된 교차 행위를 보여 주었으며(P < 0.05), Tg2576-앤타고미어-206-3w 마우스는 Tg2576-대조군 마우스와 비교하여 유사한 교차 % 레벨을 나타냈다(도 4c).

앤타고미어-206이 Aβ 레벨에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위하여, ELISA-기반 방법으로 Aβ40 및 Aβ42의 레벨을 분석하였다. 앤타고미어-206 처리는 대조군과 비교하여 Aβ40 및 Aβ42의 레벨에 영향을 미치지 않았다(도 5a). Aβ 플라크의 로드를 피질 및 해마 조직의 티오플라빈-S 염색에서 정량화 하였으며, 앤타고미어-206 처리는 총 플라크 면적에 영향을 미치지 않았다(도 5c-d). 따라서, Tg2576-앤타고미어-206 마우스에 관찰된 개선된 기억력은 Aβ 레벨의 조절 보다는 다른 기전에 의한 것으로 평가되었다.

따라서, 본 발명자들은 증가된 BDNF 발현을 고려하여 해마 시냅토파이신 레벨을 분석하였다. Tg2576-앤타고미어-206-1w 및 Tg2576-앤타고미어-206-3w 마우스는 Tg2576-대조군 마우스와 비교하여 증가된 시냅토파이신 발현을 나타내었으며(도 6), 이는 앤타고미어-206 처리에 의한 증가된 시냅스 밀도(앤타고미어-206 처리에 의한 증가된 BDNF 발현에 대응됨)를 보여주는 것이다. 결론적으로, 앤타고미어-206은 BDNF 발현 및 시냅스 밀도를 회복하여 AD 형질전환 마우스의 기억력 회복을 유발하였다.

인간 AD 뇌 시료에서 miRNA 마이크로어레이

인간 조건화에서 상기 실험결과들을 검증하기 위하여, 인간 중측두피질 시료의 miRNA 발현을 프로파일링 하였다. 표 2는 공여자의 간단한 특성이다.

인간 뇌 시료의 특성

대상	연령	성	Braak 스테이지	CDR
대조군
#1	101	F	I	0
#2	87	F	I	0
#3	88	M	I	0
AD
#1	90	F	V	3
#2	100	F	V	3
#3	75	M	V	3

3개의 대조군 뇌(CTR1, CTR2, CTR3) 및 2개의 AD 뇌 (AD1, AD2, AD3)의 마이크로어레이 분석 결과에 따르면, AD 뇌에서 이상조절된 miRNA 프로파일을 볼 수 있었다(도 8a). 이 들 중에서, miR-206가 대조군 뇌와 비교하여 AD 뇌에서 상당히 이상조절 되는 것으로 검출되었으며(3.48± 0.62 fold increment, P < 0.001, 도 8b), 이는 Tg2576 마우스에서 얻은 실험결과의 재현이다.

추가 토의사항

본 연구에서, 본 발명자들은 AD 형질전환 마우스에서 miR-206가 상향조절 되며, miR-206의 억제는 Tg2576 마우스에서 BDNF 및 IGF-1의 레벨을 증가시키고 기억력 및 시냅스 밀도를 증가시킴을 발견하였다. 인간 AD 뇌가 대조군 정상 뇌와 비교하여 miR-206을 고발현 한다는 사실을 고려하면, 앤타고미어-206의 치료학적 응용성은 인간에서 매우 유용하다.

종래의 연구들은 AD 뇌에서 miRNA 발현 변화가 있음을 기재하고 있고 AD의 miRNA-기반 발병을 제안하고 있다. AD 뇌에서 miR-29a/b-1의 감소된 발현은 증가된 BACE1/β-secretase 발현과 관련이 있다(Hebert et al., 2008). AD 뇌에서 miR-107의 발현은 초기에 감소하며 그의 타겟 mRNA, BACE1의 이상조절을 유발한다(Wang et al., 2008). miR-298 및 miR-328은 BACE1(β-amyloid precursor protein-converting enzyme 1)의 발현을 조절한다(Boissonneault et al., 2009). miR-146a는 AD 발병에서 NF-κB-유도 염증을 중재한다(Lukiw et al., 2008). 이중 형질전환 AD 마우스에서 miR-34a의 상향조절은 bcl2의 트랜스로케이션을 억제하고 AD 발명에 관여한다(Wang et al., 2009). miR-9, miR-125b, 및 miR-146a은 AD 환자의 측두신생피질에서 고발현 된다(Sethi et al., 2009). 상술한 miRNA 연구들은 AD 발병에 대한 이해를 확대하기는 하지만, miRNA의 치료학적 응용성은 본 발명이 처음으로 제시하는 것이다.

종래의 몇 몇 연구들은 인간 AD 뇌를 이용하여 miRNA 마이크로어레이를 실시하였지만(Cogswell et al., 2008; Het al., 2008), 이들 실험결과들은 서로 일치되지 않고 있는바 어떤 논문에서는 특정의 miRNA가 상향조절 되는 것으로 규명되었으나 다른 논문에서는 변화가 없거나 하향조절 되는 것으로 발표된 것도 있다(Hebert and De Strooper, 2009). 이러한 불일치는 신경병인적 변이, 질환 단계의 불일치, 상이한 피질 위치, 사후 조작과정에서의 miRNA 파쇄 및 마이크로어레이 칩의 비민감성 때문에 발생하는 것으로 판단된다(Hebert and De Strooper, 2009). 따라서, 종래의 연구는 miR-206의 레벨에 초점을 두지 않았다. 본 발명자들은, 균일하게 조절된 시료를 제공하는 Tg2576 AD 형질전환 마우스를 이용하여 miRNA 마이크로어레이를 실시하였고 AD에 miR-206이 관여함을 규명하였다. 우리의 분석 결과를 뒷받침 하는 것으로서, 낮은 대뇌 BDNF 레벨을 가지는 정신분열병과 miR-206이 관련되어 있고(Hansen et al., 2007; Angelucci et al., 2005), 전두측두엽 치매를 가지는 근위축성측생경화증 환자의 뇌에서 miR-206이 고발현 되는 것으로 알려져 있다(Shioya et al., 2010).

가장 중요하게는, 본 발명은 앤타고미어-206의 치료학적 응용을 성공시켜 BDNF의 레벨을 증가시키고 기억력을 개선하였다는 것이다. 따라서, AD 마우스에서 miR-206의 고발현에 대한 본 발명자들의 실험은 신규한 것이고 새로운 치료학적 타겟을 제공한다.

특정의 miRNAs 및 그의 앤타고미어의 응용은 in vivo 실현성을 갖는다(Bonauer et al., 2009). 예컨대, miR-122를 블록킹 하는 록킹-핵산의 이용은 영장류에서 HCV(hepatitis C virus) 감염을 치료하는 데 성공하였다(Elmen et al., 2008; Lanford et al., 2010). 따라서, 앤타고미어-206을 이용한 치료제 개발도 실현성이 있다. BDNF는 시냅스 유연성 및 시냅스생성의 주 조절자이다(Bramham and Messaoudi, 2005). BDNF의 운반은 AD 모델에서 시냅스 유연성 및 신경보호를 개선하고(Bramham and Messaoudi, 2005; Nagahara et al., 2009), AD 뇌는 BDNF의 낮은 레벨을 갖는다(Phillips et al., 1991). IGF-1의 운반은 AD의 진전을 늦추고 (Carro et al., 2002), 파손된 IGF-1 시그널은 AD-유사 병을 유발한다(Carro et al., 2006). 한편, Notch3는 내피세포-주위세포 상호작용(Liu et al., 2009)에 매우 중요하며, γ-세크레타아제의 타겟이다 (Das et al., 2004). 호미오박스 유전자 MEOX2의 결여는 신경혈관 기능이상을 초래하며 AD 뇌에서 손상된 Aβ 유출을 초래한다(Wu et al., 2005). 그러나, 앤타고미어-206은 상기 두 생체분자의 레벨에 영향을 미치지 않는다. 대신에, miR-206은 본 발명자들의 연구에서 BDNF 및 IGF-1을 타겟팅 하는 것으로 규명되었고 앤타고미어-206은 BDNF 및 IGF-1의 감소된 발현을 회복시키고 AD 마우스의 시냅스 밀도 및 기억력을 증가시켰다. 신경성장인자의 직접적인 운반은 바이러스 벡터를 필요로 하거나(Nagahara et al, 2009) 또는 중화항체를 생성하는 연속적 주입방법을 필요로 하기(Lang et al, 2006) 때문에, 앤타고미어-206의 이용은 BDNF 또는 IGF-1의 직접적인 이용보다 훨씬 유리하다.

miR-206은 근육 조직에서 최초로 검출되고(Rao et al., 2006) 근위축성측생경화증과 같은 탈신경 조건에서 신경근육 시냅스 형성에 관여하는 것으로 알려져 있지만(Williams et al., 2009), 뇌에서의 miR-206의 역할은 본 연구에서 본격적으로 시작되고 그 가능성이 제시된다. AD 환자에서의 miR-206의 상향조절을 고려하면, miR-206과 BDNF/IGF-1의 상호작용은 AD 발병학 및 의약 개발에 대한 신규한 타겟을 제공한다.

참고자료

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Treatment of Neurodegenerative Diseases by Targeting a miRNA <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uggaauguaa ggaagugugu gg 22

Claims

다음을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
(a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 중 2번째부터 7번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 약제학적 유효량; 및
(b) 약제학적으로 허용되는 담체.
제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드, 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알쯔하이머 질환, 치매, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 또는 근위축성 측삭 경화증인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
miR-424^*, miR-18b^*, miR-135a^*, miR-1228, miR-320, miR-296-5p, miR-557, miR-338-5p, miR-206, miR-92a, miR-1238, miR-513a-5p, miR-423-5p, miR-188-5p, miR-140-3p, miR-575, miR-640, miR-1237, miR-191^* 및 miR-134로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA의 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보적 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는 알쯔하이머 질환의 진단용 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-206인 것을 특징으로 하는 키트.
신경퇴행성 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 miR-424^*, miR-18b^*, miR-135a^*, miR-1228, miR-320, miR-296-5p, miR-557, miR-338-5p, miR-206, miR-92a, miR-1238, miR-513a-5p, miR-423-5p, miR-188-5p, miR-140-3p, miR-575, miR-640, miR-1237, miR-191^* 또는 miR-134의 발현을 검출하는 방법을 통해 알쯔하이머 질환 마커를 검출하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-206인 것을 특징으로 하는 방법.