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KR20120041821A - Proteinic markers for diagnosing alzheimer's disease - Google Patents

Proteinic markers for diagnosing alzheimer's disease Download PDF

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KR20120041821A
KR20120041821A KR1020100083508A KR20100083508A KR20120041821A KR 20120041821 A KR20120041821 A KR 20120041821A KR 1020100083508 A KR1020100083508 A KR 1020100083508A KR 20100083508 A KR20100083508 A KR 20100083508A KR 20120041821 A KR20120041821 A KR 20120041821A
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gly
thr
disease
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KR1020100083508A
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김찬화
김남희
박승아
박혜원
이현경
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

PURPOSE: A proteinic marker for diagnosing Alzheimer's disease and a composition containing a material for detecting marker change are provided to diagnose and treat Alzheimer's disease. CONSTITUTION: A proteinic marker for diagnosing Alzheimer's disease includes: secernin-1 of 45-47 kD, containing an amino acid sequence of sequence number 1; V-type proton ATPase subunit E1(Atp6v1e1) of 25-27 kD, containing an amino acid sequence of sequence number 2; carbonic anhydrase II of 28-30 kD, containing an amino acid sequence of sequence number 3; glutathione S-transferase of 23-25 kD, containing an amino acid sequence of sequence number 4. A composition for diagnosing Alzheimer's disease contains a material for detecting the presence, amount, or pattern of the proteinic marker.

Description

알츠하이머병 진단용 단백질성 마커 {Proteinic markers for diagnosing Alzheimer's disease}Protein markers for diagnosing Alzheimer's disease

본 발명은 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 정상 개체의 대뇌 피질에서 보다 알츠하이머병 개체의 대뇌 피질에서 더 적게 또는 더 많이 존재하는 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커, 및 이를 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease, and more specifically, to a protein marker for diagnosing Alzheimer's disease, which is present in fewer or more cerebral cortex of an individual with Alzheimer's disease than in a cerebral cortex of a normal individual, and Alzheimer's disease comprising the same. It relates to a diagnostic composition.

알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 임상적으로 노년에서 다른 원인 없이 점차 진행되는 비가역적 치매(irreversible dementia) 현상으로 나이가 들어감에 따라 뇌에서 선택적으로 대뇌 피질의 신경세포가 죽어서 대뇌의 전두엽과 측두엽의 뇌회가 위축되거나 줄어드는 것이 특징인 대표적인 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease)이며, 50세 이전에 증상이 나타나는 경우가 드물지만 60세 이후로는 나이가 들어감에 따라 발생 빈도가 점진적으로 증가하기 때문에 노인 인구가 증가하고 있는 현 시점에서 중요한 의료, 사회 및 경제적 문제를 야기하고 있다.Alzheimer's disease (AD) is a clinically progressive irreversible dementia phenomenon that causes no other cause in old age, and the brain's frontal and temporal lobes are selectively killed in the brain as it ages. Is a typical neurodegenerative disease characterized by atrophy or contraction of the brain, and rarely occurs before the age of 50, but since the age of 60, the incidence increases gradually with age. At the present time of the increase, there are significant medical, social and economic problems.

알츠하이머 질병은 초로치매(노령 이전에 생기는 치매)의 주원인이고, 또한 노인성 치매의 주요 요인 중의 하나이다. 이 병에 걸리면 언어장애, 심한 단기 기억상실, 정신기능의 진행성 상실에 이르는 지남력상실(地南力喪失) 등이 나타나며, 아직까지 효과적인 치료법은 없는 상태이다.Alzheimer's disease is a major cause of elderly dementia (a dementia that occurs before old age) and is also one of the main causes of senile dementia. The disease manifests as language impairment, severe short-term memory loss, and mental loss leading to progressive loss of mental function, and there are no effective treatments yet.

알츠하이머 질병의 원인은 아직까지 밝혀지지 않았지만 노인판과 신경섬유농축제와 같은 신경 독성물질이 대뇌에 축적은 신경전달물질인 아세틸콜린의 결핍에 영향을 미치며 알츠하이머 질병에 걸린 환자의 대부분의 뇌에서는 이 물질이 정상의 40~90% 감소한다.The cause of Alzheimer's disease is not yet known, but the accumulation of neurotoxic substances in the cerebrum, such as senile plaques and nerve fiber concentrates, affects the deficiency of acetylcholine, a neurotransmitter, in most brains of patients with Alzheimer's disease. The substance is reduced by 40-90% of normal.

현재 알츠하이머병의 진단 기준의 개발과 뇌 자기공명영상촬영(MRI)이나 양성자단층촬영(PET) 등의 검사를 통한 알츠하이머병의 진단법 개발 등 많은 연구가 진행되고 있지만, 알츠하이머병은 일단 발병하면 계속 진행되고 근본적인 치료법이 없는 악성 질환으로 간주되므로 병의 진행을 완화시키기 위한 타겟(target)이 되는 물질 개발에 대한 연구가 필요하다. 알츠하이머 질병의 발병 원인 및 치료제 개발을 위한 연구는 전 세계적으로 학계는 물론 제약회사들에 의해 활발히 진행되고 있으나 현개까지 개발된 알츠하이머 질병의 치료 약물들에는 아세틸콜린 합성전구체(acetylcholine precursor)로 레시틴, 수용체 활성제(Receptor agonist)로 RS-86, 니코틴 등이 있으며, 아세틸콜린 분해 억제제(Acetylcholin-esterase inhibitor)로 FDA의 승인을 받아 국내에서도 시판사용중인 타크린(Tacrine)과 최근에 승인된 아리셉트(Aricept; donepezil)가 있으며 이런 약물들은 아세틸콜린이라고 하는 신경전달물질의 분해를 막아 주어 감퇴된 인지기능을 개선시켜 주는 효과를 가지고 있다. 하지만 이들도 근본적인 치료제라기보다는 단지 발병 초기에 인지기능 손상을 개선시키는 효능만이 인정된 정도이다. 게다가 안전성과 효능면에서도 문제가 많이 보고되고 있어 AD 치료제로 인정을 받기에는 아직도 여러 가지 개선이 필요한 약물들이다.Currently, many studies are being conducted on the development of diagnostic criteria for Alzheimer's disease and the development of diagnostic methods for Alzheimer's disease through tests such as brain magnetic resonance imaging (MRI) and protonographic tomography (PET). It is regarded as a malignant disease that does not have a fundamental treatment, and therefore, research on the development of a target material for mitigating disease progression is needed. Research into the causes and treatment of Alzheimer's disease is being actively conducted by academia as well as pharmaceutical companies all over the world, but therapeutic drugs for Alzheimer's disease developed until now are acetylcholine precursors such as lecithin and receptors. The active agent (Receptor agonist) is RS-86, nicotine, etc., and approved by the FDA as the acetylcholin-esterase inhibitor (Tacrine) in the market in Korea and recently approved Aricept (Acept); donepezil) and these drugs have the effect of improving the degradation of cognitive function by preventing the breakdown of neurotransmitter called acetylcholine. However, these are not fundamental treatments, but only the effect of improving cognitive impairment in the early stage of the onset is recognized. In addition, there are many reported problems in terms of safety and efficacy, and these drugs still need various improvements to be recognized as AD treatments.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 2차원 전기영동기술을 이용하여 알츠하이머병이 진행되는 장소인 대뇌 피질에서 병이 진행됨에 따라 발현 정도가 급격히 변화하는 단백질을 확인하였으며, 이는 알츠하이머 치료제의 개발을 위한 타겟 단백질로 사용될 수 있다고 판단되어, 본 발명을 완성하게 되었다.
Thus, the present inventors have made a thorough research to overcome the problems of the prior art, using a two-dimensional electrophoresis technique, the expression of the protein rapidly changes as the disease progresses in the cerebral cortex where Alzheimer's disease progresses It was confirmed that this can be used as a target protein for the development of Alzheimer's therapeutics, the present invention was completed.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 정상 개체의 대뇌 피질과 알츠하이머병 개체의 대뇌 피질에서 얻은 단백질 사이의 발현 차이를 확인할 수 있는 단백질 연구를 통해 알츠하이머병의 진단 및 치료에 적용하기 위한, 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 제공하는 데 있다.Therefore, the main object of the present invention, Alzheimer's disease diagnostic protein for applying to the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease through protein studies that can identify the expression difference between the cerebral cortex of normal subjects and the cerebral cortex of Alzheimer's disease individuals To provide sex markers.

본 발명의 다른 목적은, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing Alzheimer's disease, comprising a substance for detecting a change in the proteinaceous marker.

본 발명의 다른 목적은, 상기 알츠하이머병 진단용 조성물을 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing Alzheimer's disease, comprising the composition for diagnosing Alzheimer's disease.

본 발명의 다른 목적은, 상기 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease.

본 발명의 다른 목적은, 상기 단백질성 마커를 활용한 알츠하이머병 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
Another object of the present invention is to provide a screening method for treating Alzheimer's disease using the proteinaceous marker.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커:According to one aspect of the invention, the present invention is a proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease, characterized in that one or more combinations selected from the group consisting of the following polypeptides:

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 45-47 kD의 분자량을 갖는 Secernin-1;Secernin-1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a molecular weight of 45-47 kD;

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 25-27 kD의 분자량을 갖는 V-type proton ATPase subunit E1(Atp6v1e1);V-type proton ATPase subunit E1 (Atp6v1e1) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a molecular weight of 25-27 kD;

서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 28-30 kD의 분자량을 갖는 carbonic anhydrase II; 및 Carbonic anhydrase II having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having a molecular weight of 28-30 kD; And

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 23-25 kD의 분자량을 갖는 Glutathione S-transferase P1.
Glutathione S-transferase P1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a molecular weight of 23-25 kD.

본 발명에서, 상기 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커는 알츠하이머병의 진행에 따라 생화학적 변화가 일어나는 대외 피질의 단백질 분석을 통하여 선별된 알츠하이머병 진단용 마커로서, 본 발명자들은 정상 개체의 대뇌 피질과 알츠하이머병 개체의 대뇌 피질에서 얻은 단백질들의 프로테옴을 분석하여 정상 개체에 비하여 알츠하이머병 개체에서 특징적으로 발현이 증가 또는 감소하는 단백질들을 검출하여 알츠하이머병의 진단 또는 치료에 사용될 수 있는 단백질성 마커들을 발굴하였다. In the present invention, the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease is a marker for diagnosing Alzheimer's disease selected through protein analysis of the external cortex in which biochemical changes occur with the progression of Alzheimer's disease, and the present inventors have identified individuals with cerebral cortex and Alzheimer's disease in normal individuals. By analyzing the proteome of proteins obtained from the cerebral cortex, we identified protein markers that can be used for the diagnosis or treatment of Alzheimer's disease by detecting proteins whose expression is increased or decreased in Alzheimer's disease as compared to normal individuals.

본 발명에 사용된 용어, 알츠하이머의 “초기 단계” 또는 초기 증상은 모호한 경우가 많기 때문에 이상한 점을 발견해 내는 것이 매우 어렵다. 주로 최근 기억이 장애를 받게 되는데, 같은 질문을 반복하거나 대화 도중 주제를 잊거나 적절한 단어를 찾아내는데 어려움을 느낀다. 기억력 저하가 뚜렷해지는 것을 느끼며 자신에 대한 분노, 좌절, 무력감 등으로 이어지며 우울증이 흔히 이 시기에 발생한다. 또한 용어, “중기 단계”는 증상이 분명히 나타나므로 환자는 기억력 감퇴와 더불어 판단력이 흐려진다. 이 시기부터 언어장애가 시작되며 대화를 유지하는 것이 힘들다. 이 외에 계산력이 필요하거나 계획성이 요구되는 일 처리가 힘들어진다. 본 발명에서는, 알츠하이머를 유발시킨 Transgenic mice의 6개월과 12개월 초기와 중기 사이에 알츠하이머 질병의 대표적인 원인 물질인 tau 단백질의 발현이 증가하는 것을 기준으로 알츠하이머의 초기 단계와 중기 단계로 구분하였다. 최근 연구에 따르면, 알츠하이머를 유발시킨 Transgenic mice에서 tau 단백질의 발현된 정도를 통하여 6개월과 12개월 초기와 중기로 판단하고 있다 (S. B. Shim., et al., Neuroscience 146 (2007) 730-740).The term used in the present invention, the "early stage" or early symptoms of Alzheimer's, is often ambiguous, so it is very difficult to find out something strange. Memory is often impaired lately, and it is difficult to repeat the same questions, forget topics, or find the right words during a conversation. Feeling less pronounced, leading to anger, frustration, and helplessness about yourself, and depression often occurs at this time. In addition, the term "middle stage" manifests itself clearly, so that the patient loses judgment and loses judgment. At this point, language disorders begin and it is difficult to maintain conversation. In addition, it becomes difficult to handle tasks that require computational power or require planning. In the present invention, the early and middle stages of Alzheimer's disease were classified based on the increase in the expression of tau protein, which is a representative cause of Alzheimer's disease, between the early and middle months of Alzheimer's-induced transgenic mice. According to recent studies, the expression level of tau protein in Alzheimer's-induced transgenic mice has been judged to be 6 months and 12 months early and mid-term (SB Shim., Et al., Neuroscience 146 (2007) 730-740). .

상기 Glutathione S-transferase P1은 알츠하이머병의 초기 단계, 상기 carbonic anhydrase II은 알츠하이머병의 중기 단계, 그리고 상기 Secernin-1 및 V-type proton ATPase subunit E1(Atp6v1e1)은 알츠하이머병의 초기 단계 및 중기 단계에서 발현 변화가 나타나므로, 정상 개체에 비하여 발현이 변화하는 상기 단백질들을 검출함으로써 알츠하이머병을 진단할 수 있다 (도 3b 참조).The Glutathione S-transferase P1 is an early stage of Alzheimer's disease, the carbonic anhydrase II is an intermediate stage of Alzheimer's disease, and the Secernin-1 and V-type proton ATPase subunit E1 (Atp6v1e1) is an initial stage of Alzheimer's disease. Since expression changes appear, Alzheimer's disease can be diagnosed by detecting the proteins whose expression changes compared to normal individuals (see FIG. 3B).

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 단백질성 마커들은 알츠하이머가 의심되는 환자에서 알츠하이머병 진단용 마커로 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 병의 진행정도를 진단할 수 있는 마커로도 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 Glutathione S-transferase P1은 정상 개체와 비교하여 알츠하이머병 초기 단계의 대뇌 피질에서 상대적으로 발현이 감소하기 때문에, 진단 개체에서 이들 단백질의 감소가 확인된다면 초기 단계의 알츠하이머로 진단할 수 있다. 또한, 상기 carbonic anhydrase II는 정상 개체와 비교하여 알츠하이머병 중기 단계의 대뇌 피질에서 상대적으로 발현이 감소하기 때문에, 진단 개체에서 이 단백질의 감소가 확인된다면 중기 단계의 알츠하이머로 진단할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the proteinaceous markers can be used not only as a marker for diagnosing Alzheimer's disease in a patient suspected of Alzheimer's disease, but also as a marker for diagnosing disease progression. For example, since the expression of Glutathione S-transferase P1 is decreased in the cerebral cortex of the early stage of Alzheimer's disease in comparison with normal subjects, it can be diagnosed with early stage Alzheimer's disease if a decrease in these proteins is found in the diagnostic subject. have. In addition, since the expression of carbonic anhydrase II is relatively decreased in the cerebral cortex of the middle stage of Alzheimer's disease in comparison with the normal subject, it can be diagnosed by the middle stage of Alzheimer's disease if a decrease in the protein is confirmed in the diagnostic subject.

본 발명에 사용된 용어, ‘프로테옴(proteome)’이란 유전체로부터 만들어질 수 있는 모든 단백질의 총체를 의미하는데, 이는 한 세포 또는 조직에서 특이적인 생리 상태나 병리 상태에 따라 프로테옴의 양상이 항상 변화하게 되는 동적인 개념이다. 프로테오믹스(proteomics)는 이러한 프로테옴을 연구하는 방법과 기술을 포괄적으로 지칭하는 것으로, 단백질의 성질을 유전자의 발현, 번역 후 변형(post-translational modification), 다른 단백질과의 결합에 초점을 두어 연구함으로써 세포내 변형 과정과 네트워크 형성을 질병의 진행 과정과 연계시켜서 총체적으로 이해하고자 하는 연구 분야를 뜻한다. 이와 같이 프로테옴은 한 세포 또는 조직에서의 생리 상태나 병리 상태를 대변하므로, 질병의 진단에 직접 쓰일 수 있는 진단의 마커를 찾는 방법으로는 가장 적합한 것이다. 또한, 알츠하이머병과 같은 경우 특정 유전자의 발현이 질병의 진행 정도에 관여하여 알츠하이머병을 촉진하는 것으로 확인된다면, 그 단백질의 존재를 확인 및 동정하여 알츠하이머병 저해제 개발의 표적 단백질로 삼을 수도 있다. 게노믹스(Genomics)의 뛰어난 민감도와 유전자의 쉬운 증폭 등의 장점으로 이를 이용한 진단 및 치료제 개발 역시 많이 진행되고 있으나, DNA나 mRNA 단계에서의 변화가 실제로 세포 내에서 활성을 갖는 단백질의 변화로 곧바로 연결되지는 않을 수 있다는 점에서 이론상의 문제점이 남아있으며, 나아가 현실적으로는 유전물질이 없는 체액의 경우 프로테오믹스가 유일한 연구방법이다. 현재 비-침습적 접근(non-invasive approach)으로 진단에 쓰이고 있는 것은 혈장, 혈청, 뇨, 뇌척수액, 양수, 분비액 등의 체액인데, 많은 연구자들이 진단 마커로 질병 특이적인 단백질을 발굴하기 위해 프로테오믹스 방법을 도입하고 있다.As used herein, the term 'proteome' refers to the totality of all proteins that can be made from the genome, so that the pattern of the proteome always changes depending on the specific physiological or pathological condition in a cell or tissue. Being a dynamic concept. Proteomics is a generic term for methods and techniques for studying these proteomes. Cellular cells are studied by studying the properties of proteins, focusing on gene expression, post-translational modification, and binding to other proteins. It refers to the field of research that you want to understand holistically by linking my transformation process and network formation with the course of disease. As such, the proteome represents a physiological or pathological condition in a cell or tissue, and thus is most suitable as a method of finding a diagnostic marker that can be directly used for diagnosis of a disease. In addition, in the case of Alzheimer's disease, if the expression of a specific gene is found to promote Alzheimer's disease by participating in the degree of disease progression, the presence of the protein may be identified and identified as a target protein for the development of an inhibitor of Alzheimer's disease. The development of diagnostics and therapeutics using them has been progressing due to the superior sensitivity of Genomics and the easy amplification of genes, but changes in DNA or mRNA levels do not directly lead to changes in proteins that are actually active in cells. Theoretical problems remain in that it is not possible, and in reality, proteomics is the only research method for body fluids without genetic material. Currently, non-invasive approaches are used for diagnosis of body fluids such as plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, and secretion, and many researchers use proteomic methods to identify disease-specific proteins as diagnostic markers. I introduce it.

본 명세서에서 “알츠하이머병 진단용 단백질성 마커”는 정상 개체의 대뇌 피질과 알츠하이머병 개체의 대뇌 피질을 구분해내는 기준이 되는 물질 중에서 이 물질이 특히 단백질을 주요 구성물질로 하고 있는 것을 지칭한다. 본 발명에서 이 단백질성 마커는 알츠하이머병 개체의 대뇌 피질에서의 존재량이 정상 개체의 조직에서의 존재량과 비교할 때 특징적으로 많거나 적다.As used herein, the term “proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease” refers to a substance that is a protein as a main component, among the substances which are a standard for distinguishing the cerebral cortex of normal individuals from the cerebral cortex of individuals with Alzheimer's disease. In the present invention, the proteinaceous marker is characteristically high or small in the cerebral cortex of an individual with Alzheimer's disease compared with the amount in the tissue of a normal individual.

본 발명은 알츠하이머병 개체의 조직의 프로테옴을 정상 개체의 조직의 프로테옴과 분석한 것이기 때문에, 이렇게 확인된 단백질성 마커는 알츠하이머병에 대하여 특이적이라고 할 수 있으며, 따라서 알츠하이머병을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 이렇게 확인된 단백질성 마커가 알츠하이머병에서 변화 양상이 두드러지는 것이라는 점을 감안한다면, 이 단백질성 마커의 생리학적 기능은 알츠하이머병의 발병에 직접적으로 관계된 것일 가능성이 있으며, 따라서 이 단백질성 마커는 알츠하이머병 발병의 메커니즘을 연구하거나 알츠하이머병 치료제의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용될 수 있다.Since the present invention is to analyze the proteome of the tissues of individuals with Alzheimer's disease with the proteome of the tissues of normal individuals, the protein markers thus identified can be said to be specific for Alzheimer's disease, and thus can be usefully used to diagnose Alzheimer's disease. Can be. Furthermore, given that the proteinaceous markers thus identified are prominent in Alzheimer's disease, the physiological function of the proteinaceous markers may be directly related to the onset of Alzheimer's disease, and thus the proteinaceous markers. May be usefully used as a target protein for studying the mechanism of the development of Alzheimer's disease or for the development of Alzheimer's disease therapeutics.

특히 본 발명의 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커는 실제의 알츠하이머병 개체의 대뇌 피질에서 프로테옴 수준에서 발굴해낸 것이기 때문에, 종래 DNA 또는 mRNA 수준에서 발견되는 알츠하이머병의 특이적 마커들에 비하여 더욱 임상적으로 활용 가치가 높은 마커들이며, 알츠하이머병에만 한정되어 있다는 점에서 알츠하이머병의 치료제의 표적으로서도 매우 유용한 것이다.In particular, since the protein marker for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention is found at the proteome level in the cerebral cortex of an actual Alzheimer's disease individual, it is used more clinically than the specific markers of Alzheimer's disease found at the DNA or mRNA level. It is a valuable marker and is very useful as a target of Alzheimer's disease in that it is limited to Alzheimer's disease.

본 발명에서, 상기 단백질성 마커는 상기 분자량을 가지는 한 상기 서열번호를 가지는 전장 단백질의 일부일 수 있으며, 이 경우 도 6a 내지 도 6d의 MS/MS 결과에서 빨간색으로 표시된 트립신 분해된 펩티드 서열들을 가진다. 상기 트립신 분해된 펩티드란 프로테옴 분석의 방법으로서 MALDI-TOF 또는 MS/MS 분석을 위해 트립신(trypsin)으로 분해된 단백질의 펩티드를 의미한다. 또한 상기 분자량은 2차원 전기영동(two-dimensional electrophoresis) 상에서 확인된 값으로서 일반적으로 허용되는 실험상의 오차범위를 포함한다.
In the present invention, the proteinaceous marker may be part of the full-length protein having the sequence number as long as it has the molecular weight, in which case it has trypsin digested peptide sequences shown in red in the MS / MS results of FIGS. 6A-6D. The trypsin digested peptide refers to a peptide of protein digested with trypsin for MALDI-TOF or MS / MS analysis as a method of proteome analysis. The molecular weight also includes a generally accepted experimental error range as a value identified on two-dimensional electrophoresis.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질성 마커의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질을 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for diagnosing Alzheimer's disease comprising a substance for detecting the presence of the proteinaceous marker and its amount, pattern, or both.

본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물에서, 상기 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴의 특이적인 검출은 생물학적 시료 내에 본 발명의 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커가 존재하는지 여부 및 그 양과 패턴을 확인하는 과정을 의미하며, 예를 들어, 상기 단백질성 마커에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 그 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 확인하는 과정이 활용될 수 있다. 본 명세서에서 “생물학적 시료”란 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴이나, 이 단백질성 마커에 관한 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 검출할 수 있는 세포나 조직 등을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 “항체”란 항원의 항원결정기(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하는 개념이다.In the composition for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention, the presence or absence of the proteinaceous marker and specific detection of the pattern or the pattern may be performed to determine whether the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention is present in the biological sample and the amount and pattern thereof. For example, using an antibody that specifically binds to the proteinaceous marker, a process of checking the presence and amount or pattern thereof may be utilized. As used herein, the term "biological sample" refers to the presence and amount or pattern of a proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease, the presence or absence of the expression of a gene related to the proteinaceous marker, a cell or tissue capable of detecting the expression amount or expression pattern, etc. Means. In addition, in the present specification, "antibody" refers to a protein that can specifically bind to epitopes of antigens, and is a concept including both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.

본 발명에서, 상기 다클론 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 항원인 단백질성 마커 또는 그 항원결정기를 갖는 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리?정제한다.In the present invention, the polyclonal antibody may be prepared by injecting an antigenic proteinaceous marker or a fragment having the epitope into an external host according to conventional methods known to those skilled in the art. External hosts include mammals such as mice, rats, sheep, rabbits. Immunogens are injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection and are usually administered with an adjuvant to increase antigenicity. Blood is collected periodically from external hosts to collect serum that shows improved titers and specificity for antigen or to separate and purify antibodies from it.

또한 상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술(Koeher and Milstein (1975) Nature, 256:495)에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 20 μg을 얻어서 Balb/C 쥐에 면역화를 시키거나 펩티드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화 시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리?정제한다.In addition, the monoclonal antibodies can be prepared by the technology of generating immortalized cell lines by fusion known to those skilled in the art (Koeher and Milstein (1975) Nature, 256: 495). The manufacturing method is briefly described as follows. First, 20 μg of pure protein is immunized to Balb / C mice or the peptide is synthesized and combined with bovine serum albumin to immunize mice. Thereafter, antigen-producing lymphocytes isolated from mice are fused with myeloma in humans or mice to produce immortalized hybridomas, and the ELISA method is used to select and propagate only hybridoma cells that produce the desired monoclonal antibody. The monoclonal antibody is isolated and purified from the culture.

상기 항체를 이용하여 단백질의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 측정하는 방법으로는, 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.Methods for measuring the presence and amount or pattern of the protein using the antibody, Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, oukterroni (Ouchterlony) immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, etc., but are not limited thereto. no.

이 분석 방법들을 통하여, 정상 개체의 생물학적 시료에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 알츠하이머병 개체의 생물학적 시료에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 이로부터 본 발명의 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 판단할 수 있으며, 궁극적으로 알츠하이머병이 의심되는 환자의 발병 여부를 진단할 수 있게 된다.Through these assay methods, it is possible to compare the amount of antigen-antibody complex formation in a biological sample of a normal individual with the amount of antigen-antibody complex formation in a biological sample of an Alzheimer's disease individual. The presence of sex markers and their amount or pattern can be determined, and ultimately, the diagnosis of patients suspected of Alzheimer's disease can be diagnosed.

여기서 “항원-항체 복합체”란 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커와 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량이나 형성 패턴은 통상 2차 항체에 연계된 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기 및 패턴을 검출함으로써 측정이 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 레독스 분자, 방사선 동위원소 등을 예로 들 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 형광물이 사용되는 경우 이용 가능한 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 리간드가 사용되는 경우 이용 가능한 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 발광물이 사용되는 경우 이용 가능한 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 미소입자가 사용되는 경우 이용 가능한 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 레독스 분자가 사용되는 경우 이용 가능한 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+ , [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 방사성 동위원소가 사용되는 경우 이용 가능한 방사성 동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.Here, the term “antigen-antibody complex” means a combination of a protein marker for diagnosing Alzheimer's disease and an antibody specific thereto. The amount or pattern of formation of the antigen-antibody complex is usually a detection label associated with a secondary antibody. Measurements can be made by detecting the magnitude and pattern of the signal. Such detection labels include, but are not limited to, enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, radioisotopes, and the like. When enzymes are used as detection labels, available enzymes include β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholinese Therapase, glucose oxidase, hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase, luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphphenolpyruvate deca Carboxylase, β-latamase, and the like, but are not limited thereto. When fluorescent materials are used as detection labels, available fluorescent materials include fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, fluorescamine, etc. However, this is not limiting. When a ligand is used as a detection label, available ligands include, but are not limited to, biotin derivatives. When a luminescent material is used as the detection label, available luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like. When the microparticles are used as the detection label, the microparticles available include, but are not limited to, colloidal gold and colored latex. When redox molecules are used as detection labels, the available redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K 4 W (CN ) 8 , [Os (bpy) 3 ] 2+ , [RU (bpy) 3 ] 2+ , [MO (CN) 8 ] 4-, etc., but are not limited to these. When radioisotopes are used as detection labels, the available radioisotopes include 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131. I or 186 Re and the like, but is not limited thereto.

본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물에서, 상기 “알츠하이머병 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질”은 해당 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 검출하기 위한 분석 방법에서 해당 단백질성 마커에 대하여 특이적으로 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있으며, 반드시 항체로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물은 정상 개체의 생물학적 시료와 알츠하이머병이 의심되는 개체의 생물학적 시료에서 상기 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴의 차이를 검출하는 것에 기술적 특징이 있는 것이기 때문에, 이렇게 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 가능하게 하는 물질이라면 어떠한 것이라도 “알츠하이머병 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질”로서 사용될 수 있고 발명이 목적하는 기술적 효과를 달성할 수 있으며, 당업자라면 당업계의 평균적인 지식 및 공지기술을 참고하여 구체적인 실시양상에 따라 적당한 물질을 특별한 어려움 없이 선택하여 사용할 수 있을 것이다.
In the composition for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention, the "substance that specifically detects the presence or absence and the amount or pattern of the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease" is for detecting the presence and the amount or pattern of the proteinaceous marker It can be any substance that can be used specifically for the proteinaceous marker in the assay, and is not necessarily limited to antibodies. Since the composition for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention has a technical feature in detecting the difference between the presence of the proteinaceous marker and its amount or pattern in a biological sample of a normal individual and a biological sample of a suspected Alzheimer's disease, Any substance which enables the presence and amount or pattern of proteinaceous markers can be used as "a substance which specifically detects the presence and amount or pattern of proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease" and the object of the invention A technical effect can be achieved, and a person skilled in the art will be able to select and use a suitable material without particular difficulty according to specific embodiments by referring to average knowledge and well-known technology in the art.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와, 그 발현량, 발현 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질을 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for diagnosing Alzheimer's disease, including a substance for detecting the expression of the gene encoding the proteinaceous marker, and an amount of expression, an expression pattern, or both.

본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물에서, 상기 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴은, 상기 단백질 자체를 검출하는 방법을 사용하는 것 외에도, 조직 내에서 해당 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 검출함으로써 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 유추하는 방법을 사용할 수도 있다.In the composition for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention, the presence and amount or pattern of the proteinaceous marker, in addition to using the method for detecting the protein itself, whether the gene encoding the proteinaceous marker in the tissue is expressed or not And a method for inferring the presence or absence and the amount or pattern of the proteinaceous marker by detecting the expression amount or expression pattern thereof.

여기서 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 검출은 통상적으로 해당 유전자의 전사로 인해 생성된 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 확인하는 과정으로써 수행될 수 있다. 이러한 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 확인하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯, DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.Here, whether the gene is expressed and the amount of expression or expression pattern detection can be generally performed by a process of confirming the presence and amount or pattern of mRNA generated by the transcription of the gene. Assays to determine the presence and amount or pattern of these mRNAs include RT-PCR, competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, and RNase protection assays. RNase protection assays, northern blots, DNA chips, and the like, but is not limited thereto.

이 분석 방법들을 통하여, 정상 개체의 생물학적 시료에서의 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 알츠하이머병이 의심되는 개체의 생물학적 시료에서의 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴과 비교할 수 있고, 이로부터 본 발명의 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 차이를 판단하며, 궁극적으로 알츠하이머병이 의심되는 환자의 조직에서 알츠하이머병의 발병 여부를 진단하는 것이 가능하게 된다.
Through these assay methods, the presence and amount or pattern of mRNA in a biological sample of a normal individual can be compared with the presence or amount or pattern of mRNA in a biological sample of an individual suspected of Alzheimer's disease, It is possible to determine whether the gene encoding the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention and the difference in its expression amount or expression pattern, and ultimately diagnose the onset of Alzheimer's disease in the tissues of patients suspected of Alzheimer's disease. Done.

본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물에서, 상기 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 본 발명의 단백질성 마커에 관한 mRNA에 특이적인 프라이머를 포함한다. 본 명세서에서 “프라이머”는 템플레이트(template)와 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 템플레이트의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 특정 유전자의 핵산 서열에 상보적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이가 사용될 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 구체적인 실시 양상에 따라 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPCwater), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시시킬 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 다른 염기 서열을 포함할 수도 있다. 프라이머는 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.In the composition for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention, the kit for measuring the presence and amount or pattern of the mRNA by RT-PCR includes a primer specific for mRNA related to the proteinaceous marker of the present invention. As used herein, a "primer" refers to a nucleic acid sequence having a free 3 'hydroxyl group capable of complementarily binding to a template and allowing reverse transcriptase or DNA polymerase to initiate replication of the template. Means. A primer is a nucleotide having a sequence complementary to the nucleic acid sequence of a particular gene, and may be used in a length of about 7 bp to 50 bp, preferably about 10 bp to 30 bp. Other RT-PCR kits may include test tubes or other suitable containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC-water (DEPCwater), depending on the specific embodiment. , Sterile water and the like. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures. The primer may also include additional other base sequences that do not change the basic properties of the primer that serve as the starting point for DNA synthesis. Primers can be chemically synthesized using well known methods, and such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art.

본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물에서, 상기 “알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질”은 해당 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 분석 방법에 있어서 해당 단백질성 마커에 특이적으로 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있으며, 반드시 RT-PCR용 프라이머에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물은 정상 개체의 생물학적 시료와 알츠하이머병이 의심되는 개체의 생물학적 시료에서 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 차이를 검출하는 것에 기술적 특징이 있는 것이기 때문에, 이러한 차이의 검출을 가능하게 하는 물질은 어떠한 것이라도 “알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질”로서 사용될 수 있고 발명이 목적하는 기술적 효과를 달성할 수 있으며, 당업자라면 당업계의 평균적인 지식을 참고하여 구체적인 실시양상에 따라 적당한 물질을 선택하여 사용할 수 있을 것이다.
In the composition for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention, the "substance that specifically detects expression of the gene encoding the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease and its expression amount or expression pattern" is the expression of the gene encoding the proteinaceous marker. It may be any substance that can be specifically used for the proteinaceous marker in whether or not, its expression amount or expression pattern analysis method, and is not necessarily limited to primers for RT-PCR. The composition for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention is for detecting the expression of a gene encoding the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease in a biological sample of a normal individual and a subject suspected of Alzheimer's disease, and for detecting a difference in the expression amount or expression pattern thereof. Because of the technical features, any substance that enables detection of such a difference is a substance that specifically detects the expression of the gene encoding the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease and its expression amount or expression pattern. It can be used and the invention can achieve the desired technical effect, those skilled in the art will be able to select and use a suitable material according to the specific embodiments with reference to the average knowledge in the art.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 알츠하이머병 진단용 조성물을 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a kit for diagnosing Alzheimer's disease comprising the composition for diagnosing Alzheimer's disease.

본 발명의 알츠하이머병 진단용 키트는, 상기 알츠하이머병 진단용 조성물에 포함되는 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질, 또는 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질 외에 단백질 존재 여부와 그 양 또는 패턴의 분석 방법 또는 유전자 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 진단 키트가 단백질의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 검출하기 위한 진단 키트인 경우에는, 이 진단 키트는 예를 들어 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 성분들, 예를 들어 표지된 2차 항체, 발색단 (chromopores), 효소 (예를 들어, 항체와 접합된 효소) 및 그의 기질, 및 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 진단 키트가 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴을 검출하기 위한 진단 키트인 경우에는, 이 진단 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이러한 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 구체적인 실시 양상에 따라 예를 들어 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPCwater), 멸균수, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 등을 포함할 수 있다. 또한, 구체적인 실시 양상에 따라서는, 상기 알츠하이머병 진단용 키트는 DNA 칩 또는 단백질 칩을 포함할 수 있다.
The kit for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention is a substance which specifically detects the presence or absence and the amount or pattern of the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease included in the composition for diagnosing Alzheimer's disease, or a gene encoding a proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease. One or more kinds suitable for the presence or absence of a protein and a method for analyzing the amount or pattern, or for the expression of a gene and the method for analyzing the expression amount or expression pattern, in addition to a substance specifically detecting the expression and its expression amount or expression pattern. It may further comprise other components, solutions or devices. For example, if the diagnostic kit is a diagnostic kit for detecting the presence of the protein and its amount or pattern, the diagnostic kit may be, for example, a diagnostic kit including essential components necessary for performing an ELISA. Such ELISA kits include components capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromopores, enzymes (eg, enzymes conjugated with antibodies) and substrates thereof, and quantitative control proteins. It may include an antibody specific to, and the like. On the other hand, when the diagnostic kit is a diagnostic kit for detecting the expression of the gene and its expression amount or expression pattern, the diagnostic kit may be a diagnostic kit containing the essential components necessary to perform RT-PCR, These RT-PCR kits can be used in addition to individual primers specific for the marker gene, depending on the specific embodiment, such as, for example, test tubes or other suitable containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases. Enzymes, DNAse, RNAse inhibitor DEPC-water (DEPCwater), sterile water, primer pairs specific for the gene used as a quantitative control, and the like. In addition, according to a specific embodiment, the Alzheimer's disease diagnostic kit may include a DNA chip or a protein chip.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자로부터 본 발명의 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 검출하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting a proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention in order to provide information necessary for diagnosing Alzheimer's disease.

상기 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 검출하는 방법은, 상기 본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물을 알츠하이머병이 의심되는 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하고, 그 처리 결과로부터 본 발명의 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 또는 패턴의 차이를 검출함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물을 알츠하이머병이 의심되는 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하고, 그 처리 결과로부터 본 발명의 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 또는 발현 패턴의 차이를 검출함으로써 수행될 수 있다.
The method for detecting a protein marker for diagnosing Alzheimer's disease comprises treating the Alzheimer's disease diagnostic composition of the present invention to a biological sample collected from a patient suspected of Alzheimer's disease, and from the treatment result, the protein marker for diagnosing Alzheimer's disease Can be performed by detecting the presence of and the difference in the amount or pattern thereof. In addition, the Alzheimer's disease diagnostic composition of the present invention is treated to a biological sample collected from a patient suspected of Alzheimer's disease, and the expression of the gene encoding the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease according to the present invention and its expression amount Or by detecting differences in expression patterns.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질성 마커를 발현하는 세포 및 동물에 시험 화합물을 처리하는 단계, 및 시험 화합물이 상기 단백질성 마커의 생리학적 활성을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method of treating a protein and a cell expressing a protein marker, the method comprising the steps of treating the test compound and whether the test compound promotes or inhibits physiological activity of the protein marker. It provides a screening method for treating Alzheimer's disease comprising the step.

본 발명에서, 상기 시험 화합물이 상기 단백질성 마커의 생리학적 활성을 촉진 또는 억제하는지 여부는 단백질성 마커의 발현을 증가 또는 감소시키는지 여부를 확인함으로써 판단할 수도 있다.In the present invention, whether the test compound promotes or inhibits the physiological activity of the proteinaceous marker may be determined by checking whether the expression of the proteinaceous marker is increased or decreased.

상기 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커는 알츠하이머병 개체의 혈액에서 변화 양상이 두드러지는 것이기 때문에 알츠하이머병의 발병에 직접 관여하는 단백질일 가능성이 있으며, 따라서 알츠하이머병 발병의 메커니즘을 연구하거나 알츠하이머병의 치료제의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용될 수 있는 것이다. 즉, 본 발명의 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커는 알츠하이머병의 치료제 개발의 중요한 전제를 해결한 것이므로, 따라서 이 단백질성 마커를 이용하여 알츠하이머병의 치료제를 스크리닝하는 방법도 본 발명의 범주에 속한다.The proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease may be a protein directly involved in the development of Alzheimer's disease because of the prominent change in the blood of Alzheimer's disease individuals. Therefore, the mechanism of the development of Alzheimer's disease or the development of a treatment for Alzheimer's disease It can also be usefully used as a target protein for. That is, since the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention solves an important premise of the development of a therapeutic agent for Alzheimer's disease, a method for screening a therapeutic agent for Alzheimer's disease using this proteinaceous marker also belongs to the scope of the present invention.

이런 치료제를 스크리닝하는 방법으로는, 본 발명의 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 어피니티 칼럼에 고정시키고 이를 시료와 접촉시켜 정제하는 방법 [Pandya et al, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투-하이브리드 방법을 이용하는 방법 [Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴 블랏["Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al.(1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝 방법 [Aviezer et al, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 을 비롯한 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자라면 구체적인 실시 양상에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 스크리닝에 사용하기 위한 시험 화합물을 포함하는 시료로서는 조직 추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성 화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.
As a method of screening such a therapeutic agent, a method of fixing the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention in an affinity column and contacting the sample to purify it [Pandya et al, Virus Res 87: 135-143, 2002], Methods using the hybrid method [Fields, S and Song, O., Nature 340: 245-246, 1989], Western Blot ["Molecular Cloning-A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al) (1982) section 18.30-18.74], a high throughput screening method [Aviezer et al, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] and the like can be used a number of known methods, and those skilled in the art according to specific embodiments You can choose the appropriate method. Samples containing test compounds for use in screening include, but are not limited to, tissue extracts, expression products of gene libraries, synthetic compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물, 상기 알츠하이머병 진단용 조성물을 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트, 상기 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 검출하는 방법, 및 상기 단백질성 마커를 활용한 알츠하이머병 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
As described above, according to the present invention Alzheimer's disease diagnostic protein comprising a proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease, a substance for detecting a change in the proteinaceous marker, Alzheimer's disease diagnostic kit comprising the composition for diagnosing Alzheimer's disease, the Alzheimer's disease Provided are a method for detecting a diagnostic proteinaceous marker and a screening method for treating Alzheimer's disease using the proteinaceous marker.

도 1a는 6개월된 정상 마우스의 대되 피질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,
도 1b는 6개월된 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌 피질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,
도 1c는 12개월된 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌 피질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,
도 1d는 12개월된 정상 마우스의 대되 피질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,
도 2는 6개월 정상군(6-NTg), 6개월 알츠하이머군(6-Tg), 12개월 알츠하이머군(12-Tg), 및 12개월 정상군(12-NTg)에서 노화와 관계없이 질병이 진행됨에 따라 증가 또는 감소하는 단백질을 상세하게 보여주는 확대 이미지이고,
도 3a 내지 3d는 도 2의 상대적인 강도를 각각 나타낸 결과로서, 도 3a는 Secernin-1, 도 3b는 V-type proton ATPase subunit E1(Atp6v1e1), 도 3c는 carbonic anhydrase II, 그리고 도 3d는 Glutathione S-transferase P1 단백질의 전기영동 이미지의 상대적인 강도를 나타낸 결과이고,
도 4는 도 2에서 동정된 단백질의 발현량을 확인한 웨스턴 블롯한 실험 결과 이미지 이고,
도 5a 내지 5d는 도 4의 상대적인 강도를 나타낸 결과이다.
도 6a 내지 6d는 정상 대조군과 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌 피질에서 다르게 발현되는 단백질들을 ESI-Q-TOF를 이용하여 동정한 결과이다.1A is a 2-D electrophoresis image showing decreased and increased protein in the basal cortex of 6 month old normal mice,
FIG. 1B is a 2-D electrophoresis image showing reduced and increased protein in cerebral cortex of 6 month old Alzheimer's disease-induced mice,
1C is a 2-D electrophoresis image showing reduced and increased protein in the cerebral cortex of 12-month-old Alzheimer's disease-induced mice,
FIG. 1D is a 2-D electrophoresis image showing decreased and increased protein in the thigh cortex of 12 months old normal mice,
Figure 2 shows the disease-free disease in aging in the 6 months normal group (6-NTg), the 6 months Alzheimer group (6-Tg), the 12 months Alzheimer group (12-Tg), and the 12 months normal group (12-NTg). Is an enlarged image detailing the protein that increases or decreases as it progresses,
3A to 3D show the relative intensities of FIG. 2, respectively, FIG. 3A shows Secernin-1, FIG. 3B shows V-type proton ATPase subunit E1 (Atp6v1e1), FIG. 3C shows carbonic anhydrase II, and FIG. 3D shows Glutathione S. The relative intensity of the electrophoretic image of the -transferase P1 protein,
4 is an image of Western blot experiment confirming the expression level of the protein identified in FIG. 2,
5A to 5D show the relative strengths of FIG. 4.
6A to 6D show results of identifying proteins expressed differently in the cerebral cortex of a normal control group and Alzheimer's disease-induced mice using ESI-Q-TOF.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예 1. 시료준비 (Sample preparation)Example 1. Sample preparation

알츠하이머 질병의 주요 원인 물질인 타우(tau) 단백질을 과다 발현시켜 알츠하이머 질병을 유발시킨 마우스(S. B. Shim., et al., Neuroscience 146 (2007) 730-740 논문 참조)는 식품의약품안전청에서 제공되었다. 타우 형질전환 마우스는 NSE 프로모터에 인체 wild type 타우 cDNA (htau23) (GenBank accession No. J03778)를 연결한 pNSE/htau23 유전자를 BDF1 마우스의 수정된 난자내의 남성 전핵(male pronucleus)에 미세주입(microinjection)하고 가임신시킨 ICR 마우스에 착상시킨 후 태어난 새끼를 wild type BDF1 마우스와 교배하여 제작되었다. 인체 타우 유전자가 과발현 되도록 제작된 형질전환 마우스는 알츠하이머병이 유발되게 되며 이는 형질전환 유전자의 발현과 행동학적 증상의 관찰 등에 의해 확인되었다.Mice that caused Alzheimer's disease by overexpressing the tau protein, a major causative agent of Alzheimer's disease (see S. B. Shim., Et al., Neuroscience 146 (2007) 730-740), were provided by the Food and Drug Administration. Tau transgenic mice microinject the pNSE / htau23 gene, which connects the human wild type tau cDNA (htau23) (GenBank accession No. J03778) to the NSE promoter, into the male pronucleus in the fertilized egg of BDF1 mice. The pups born after implantation in the ICR mice fertility were produced by crossing wild type BDF1 mice. Transgenic mice designed to overexpress human Tau genes cause Alzheimer's disease, which was confirmed by expression of the transgene and observation of behavioral symptoms.

알츠하이머 질병이 진행되는 초기와 중기 단계의 단백질 발현을 확인하기 위하여 마우스가 6개월과 12개월이 되었을 때 마우스의 대뇌에서 피질 부분만을 분리하였다 (S. B. Shim., et al., Neuroscience 146 (2007) 730-740 - tau 단백질의 발현된 정도를 통하여 6개월과 12개월 초기와 중기로 판단하여 구분). 분리된 마우스의 대뇌 피질부분에서 PlusOne Sampe Grinding Kit (GE Healthcare, USA)를 이용하여 단백질을 추출하였다. Grinding resin이 포함되어 있는 튜브를 4℃, 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 실시하고 상층액을 제거한 후 샘플 버퍼 (8 M urea, 2 % CHAPS, 40 Mm DTT, 0.5 % IPF buffer, 및 2 % protease inhibitor) 500 μl와 조직 100 mg을 넣고 막자를 이용하여 1분간 조직을 파쇄시킨 후 4℃, 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 실시히였다. 상층액만을 새로운 튜브에 옮기고 Bradford 방법을 이용하여 단백질 농도를 분석하고 -70℃에 보관하였다. 시료 완충액의 조성은 다음과 같다: 8 M urea, 2 % CHAPS, 40 Mm DTT, 0.5 % IPF buffer, and 2 % protease inhibitor.
To identify protein expression in the early and mid-stage stages of Alzheimer's disease, only the cortex of the mouse was isolated at 6 and 12 months of age (SB Shim., Et al., Neuroscience 146 (2007) 730). 6, 12 months and early and mid-term based on the expression level of tau protein). Proteins were extracted from the cerebral cortex of isolated mice using PlusOne Sampe Grinding Kit (GE Healthcare, USA). The tube containing the grinding resin was centrifuged at 4 ° C., 3000 rpm for 10 minutes and the supernatant removed, followed by sample buffer (8 M urea, 2% CHAPS, 40 Mm DTT, 0.5% IPF buffer, and 2%). 500 μl of protease inhibitor) and 100 mg of tissue were added and the tissues were crushed for 1 minute using a pestle, followed by centrifugation at 4 ° C and 3000 rpm for 10 minutes. Only the supernatant was transferred to a new tube and the protein concentration was analyzed using the Bradford method and stored at -70 ° C. The composition of the sample buffer is as follows: 8 M urea, 2% CHAPS, 40 Mm DTT, 0.5% IPF buffer, and 2% protease inhibitor.

실시예 2: 이차원 전기영동(Two-Dimensional Electrophoresis)Example 2: Two-Dimensional Electrophoresis

2-1. 일차원 전기영동(Isoelectroforcusing, IEF)2-1. Isoelectroforcusing (IEF)

시료 완충액으로 처리된 시료의 단백질 양을 100 μg으로 하여 일차원 전기영동을 실시하였다. 시료의 총 부피가 450 μl가 되게 rehydration 완충액(8 M urea, 2% CHAPS, 13 mM DTT, 1 % IPG buffer)을 섞어 일차원 전기영동을 할 수 있는 24㎝ 스트립 홀더(strip holder)에 넣은 뒤 pH 4-7 범위의 Drystrip(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 스트립 홀더에 장착하였다. 20℃에서 5시간가량 스트립(strip)을 rehydration 완충액으로 불려준 뒤 다음과 같은 조건으로 일차원 전기영동을 수행하였다: 200 V 30분, 500 V 1분, 8,000 V 45분, 8,000 V 72000 Vhrs, 11시간 30분. 총 146 kVhr. 일차원 전기영동은 IPGphore(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 수행하였다.
One-dimensional electrophoresis was performed with a protein amount of 100 μg of the sample treated with the sample buffer. Mix the rehydration buffer (8 Murea, 2% CHAPS, 13 mM DTT, 1% IPG buffer) to a total volume of 450 μl and place it in a one-dimensional electrophoretic 24 cm strip holder. Drystrip (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) in the 4-7 range was mounted in the strip holder. The strip was soaked in rehydration buffer for 5 hours at 20 ° C and subjected to one-dimensional electrophoresis under the following conditions: 200 V 30 minutes, 500 V 1 minute, 8,000 V 45 minutes, 8,000 V 72000 Vhrs, 11 30 minutes. 146 kVhr total. One-dimensional electrophoresis was performed with IPGphore (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).

2-2. 이차원 전기영동(SDS-PAGE)2-2. Two-dimensional Electrophoresis (SDS-PAGE)

이차원 전기영동을 하기 위해, 일차원 전기영동이 끝난 스트립을 캡튜브(cap tube)에 넣고 일차 평형화 용액[6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT] 10 ml에 15분간 반응시킨 후 버리고, 다시 이차 평형화 용액 [6 M urea, 50 mM Tris-cl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1.5% IAA] 10 ml을 넣고 10분간 재반응시켰다. 11~16%로 만들어진 폴리아크릴아마이드 젤(Polyacylamide gel, 25×30 ㎝) 위에 반응이 끝난 스트립을 장착하고 0.5% 아가로즈로 실링(sealing)하였다. 이차원 전기영동은 Ettan Dalt(Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 전기영동 완충액(24 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)을 넣고 전기영동을 실시하였다. 전기영동 조건은 다음과 같다: 55 V 1시간, 160 V 1시간, 360 V 4시간.
For two-dimensional electrophoresis, one-dimensional electrophoretic strips were placed in a cap tube and the first equilibration solution [6 M urea, 50 mM Tris-cl (pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT] was reacted with 10 ml of 15 minutes and discarded. Then, 10 ml of secondary equilibration solution [6 M urea, 50 mM Tris-cl (pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1.5% IAA] was added again. Reacted. The reaction strip was mounted on a polyacrylamide gel (25 × 30 cm) made of 11-16% and sealed with 0.5% agarose. Two-dimensional electrophoresis was performed by adding electrophoresis buffer (24 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS) to Ettan Dalt (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). The electrophoretic conditions are as follows: 55 V 1 hour, 160 V 1 hour, 360 V 4 hours.

2-3. 염색(Staining)2-3. Staining

이차원 전기영동이 끝난 뒤 젤을 가시화시키기 위해 은(silver) 염색을 하였다. 은 염색과정은 다음과 같다. 50% 메탄올, 12% 아세트산으로 이루어진 용액에 3시간가량 반응시켜 고정화(Fixation)하고, 50% 에탄올로 20분간 3회 세척하고, 0.2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate) 용액으로 1분간 반응시켜 민감화(Sensitizing)하고, 증류수(distilled water, DW)로 세척하고, 0.1% 질산은(Silver nitrate), 0.075% 포름알데히드(formaldehyde, 37%) 용액으로 20분간 반응시켜 반응화(Improving)하고, 증류수로 다시 세척하고, 미리 차게 만든 6% 탄산나트륨(Sodium carbonate), 0.075% 포름알데히드(37%) 용액으로 약 7분간 반응시켜 가시화(Developing)하고, 50% 메탄올, 12% 아세트산 용액으로 처리하여 반응을 정지시켰다.
After two-dimensional electrophoresis, silver staining was performed to visualize the gel. The silver staining process is as follows. Fix by reacting with a solution of 50% methanol and 12% acetic acid for about 3 hours, rinsing three times with 50% ethanol for 20 minutes, and sensitizing by reacting with 0.2% sodium thiosulfate solution for 1 minute. ), Washed with distilled water (DW), reacted with 0.1% silver nitrate, 0.075% formaldehyde (37%) solution for 20 minutes to react, and washed again with distilled water. The reaction was stopped by reacting with pre-chilled 6% sodium carbonate and 0.075% formaldehyde (37%) solution for about 7 minutes, and treated with 50% methanol and 12% acetic acid solution.

2-4. 이미지 분석(Image Analysis)2-4. Image Analysis

실험한 젤들을 분석하기 위해 먼저 ImageScanner(Amersham Pharmacia Bio-tech, Uppsala, Sweden)로 스캔하였다. 단백질 발현이 차이나는 점들을 분석하기 위해 이차원 전기영동 분석 전용 프로그램인 ImageMaster(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 분석을 수행하였다.The gels tested were first scanned with ImageScanner (Amersham Pharmacia Bio-tech, Uppsala, Sweden). In order to analyze the differences in protein expression, the analysis was performed by ImageMaster (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), a program dedicated to two-dimensional electrophoresis analysis.

도 1a는 6개월된 정상 마우스의 대되 피질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고, 도 1b는 6개월된 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌 피질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고, 도 1c는 12개월된 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌 피질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고, 도 1d는 12개월된 정상 마우스의 대되 피질에서 감소 및 증가한 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이다. 2-D 전기영동 이미지 결과에서 발현의 차이가 있는 점(spot)들을 이하에서 분석하였다.
FIG. 1A is a 2-D electrophoresis image showing reduced and increased protein in the basal cortex of 6 month old normal mice, and FIG. 1B is a 2-D electrophoresis showing reduced and increased protein in cerebral cortex of 6 month old Alzheimer's disease-induced mice. FIG. 1C is a 2-D electrophoresis image showing decreased and increased protein in the cerebral cortex of 12-month-old Alzheimer's disease-induced mice, and FIG. 1D shows reduced and increased protein in the thigh cortex of 12-month-old normal mice. 2-D electrophoresis image. Spot differences in expression in the 2-D electrophoresis image results were analyzed below.

실시예 3: 질량분석 (ESI-Q-TOF/MS/MS Analysis)Example 3: Mass Spectrometry (ESI-Q-TOF / MS / MS Analysis)

이미지 분석프로그램으로 찾아낸 점들을 동정하기 위해 이차원 전기영동이 끝난 젤로부터 점(spot)들을 오려냈다. 먼저 은을 없애기 위해 30 mM 페리시안화칼륨(Potassium Ferricyanide)과 100 mM 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate) 용액이 1:1로 섞인 탈염색 용액 100 μl을 젤 조각에 5분간 처리하였다. 이후에 400 μl의 물로 3번 세척하였다.In order to identify the spots found with the image analysis program, the spots were cut out from the gel after two-dimensional electrophoresis. First, 100 μl of a destaining solution mixed with 30 mM Potassium Ferricyanide and 100 mM Sodium Thiosulfate solution in a 1: 1 ratio was applied to the gel pieces for 5 minutes to remove silver. It was then washed three times with 400 μl of water.

다시 200 mM 탄화수소암모늄(ammonium bicarbonate)으로 반응한 뒤 물로 세척하였다. 아세토나이트릴(Acetonitrile)을 넣어 젤이 하얗게 변할 때까지 탈수시켰다. 이 젤을 진공 원심분리기(Speed vacuum centrifuge)에 넣어서 젤로부터 용액을 완전히 없앴다. 건조된 젤 조각은 0.2 μg의 트립신(promega)이 들어있는 50 mM의 탄화수소암모늄 20 μl로 얼음(ice)상에서 45분간 함수시켰다. 반응용액을 제거 후 50 mM의 탄화수소암모늄 30 μl을 넣은 후 37℃로 밤새 반응시켰다. 그 펩티드 용액은 C18 나노 칼럼(nano column, home made)를 이용하여 염분을 제거하였다.The reaction was again performed with 200 mM ammonium bicarbonate and washed with water. Acetonitrile was added and dehydrated until the gel turned white. The gel was placed in a speed vacuum centrifuge to completely remove the solution from the gel. The dried gel pieces were incubated for 45 minutes on ice with 20 μl of 50 mM ammonium hydrocarbon containing 0.2 μg of trypsin (promega). After removing the reaction solution was added 30 μl of 50 mM ammonium hydrocarbon and reacted overnight at 37 ℃. The peptide solution was desalted using a C18 nano column (home made).

크로마토그래피 칼럼(Custom-made chromatographic columns)은 질량분석 이전에 펩티드 염분제거와 농축용으로 사용되었다. Poros reverse R2 material(20-30 um bead size, PerSeptive Biosystems)의 100-300 nL로 구성된 칼럼은 단단히 조여진 GELoader tip(Eppendorp, hamburg, Germany)에 팩킹하였다. 10 mL 실린지(syringe)는 공기압으로 칼럼을 통해 물질을 통과시켰다. 펩티드 용액 30 μl은 5% 포름산(formic acid) 용액 내에서 희석되어 칼럼 안으로 이동되었다. 그리고 30 μl은 5% 포름산 용액으로 세척되었다. MS/MS분석을 위해 펩티드는 borosilicate nanoelectrospray needle(Micromass, Manchester, UK)에 50% methnol/49% H20/1% formic acid와 섞여 용출시켰다.Custom-made chromatographic columns were used for peptide desalination and concentration prior to mass spectrometry. A column consisting of 100-300 nL of Poros reverse R2 material (20-30 um bead size, PerSeptive Biosystems) was packed in a tightly tightened GELoader tip (Eppendorp, hamburg, Germany). A 10 mL syringe passed the material through the column at pneumatic pressure. 30 μl of the peptide solution was diluted in 5% formic acid solution and transferred into the column. And 30 μl were washed with 5% formic acid solution. For MS / MS analysis, peptides were eluted with 50% methnol / 49% H 2 0/1% formic acid in a borosilicate nanoelectrospray needle (Micromass, Manchester, UK).

MS/MS는 Q-TOF2 mass spectrometer(Micromass, Mancheser, UK)상에서 nano-ESI로 수행되어진다. 그 소스(source) 온도는 80℃이다. 1 kV의 전압는 안정된 flow rate(10-30 nL/min)를 생성하기 위해 0-5 psi의 nitrogen back-pressure와 혼합되어진 이온 소스(ion source)에서 borosilicate nanoelectrospray needles(EconoTipTM, New Objective, USA)에 적용하였다. 그 원뿔(cone) 전류는 40 V이다. Quardrupole analyser는 hexapole collision cell에서 분절화를 하기 위해 전구 이온(precursor ion)을 선택하는데 사용되었다. 충돌가스(collision gas)는 6-7 x 10-5 mbar의 아르곤(Ar)이며 출동 에너지(collision energy)는 20-30 V이다. 생성 이온은 반사기(reflector)와 작은 통로판 검사기(micro channel plate detector) 그리고 time-to-digital 변환기에 맞추어지는 TOF 분석기를 이용하여 분석된다. 그 자료는 Mass Lynx Widows NT PC system을 이용하여 진행되었다.MS / MS is performed with nano-ESI on a Q-TOF2 mass spectrometer (Micromass, Mancheser, UK). The source temperature is 80 ° C. A voltage of 1 kV was applied to borosilicate nanoelectrospray needles (EconoTip, New Objective, USA) in an ion source mixed with nitrogen back-pressure of 0-5 psi to produce a stable flow rate (10-30 nL / min). Applied. Its cone current is 40 volts. Quardrupole analyser was used to select precursor ions for segmentation in hexapole collision cells. Collision gas is argon (Ar) of 6-7 x 10 -5 mbar and collision energy is 20-30V. The generated ions are analyzed using a reflector, a micro channel plate detector and a TOF analyzer fitted to a time-to-digital transducer. The data was processed using the Mass Lynx Widows NT PC system.

단백질을 동정하기 위해 모든 MS/MS 스펙트럼은 MASCOT search program(www.matrixscience.com)을 이용하여 NCBInr 데이터베이스에서 단백질 서열을 조사하였다.
To identify proteins, all MS / MS spectra were examined for protein sequences in the NCBInr database using the MASCOT search program (www.matrixscience.com).

실시예 4. 웨스턴 블롯팅(Western blotting)Example 4. Western blotting

4-1. SDS-PAGE 전기영동4-1. SDS-PAGE Electrophoresis

정상 및 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌 피질 단백질 10 μg을 12% SDS-PAGE (Carbonic anhydrase II, Glutathione S-transferase P1, Secerin-1)와 8% SDS-PAGE (ATP6V1E) 전기영동을 실시하였다. 대뇌 피질에서 분리한 단백질 시료 10 μg에 SDS-PAGE loading 완충액 (60 mM Tris-Cl, 2% SDS, 25% Glycerol, 14.4 mM 2-Mercaptoethnol, 0.1% Bromophenol Blue, pH 6.8) 2.5 μl을 섞어 mini gel (6×8 ㎝)에서 분자량별(separating gel상에서 100 V로 로딩)로 분리하였다. 이때 사용한 running 완충액의 조성은 0.025 M Tris-Cl, 0.192 M Glycine, 1% SDS(pH 8.3)이다.
10 μg of cerebral cortical proteins in normal and Alzheimer's disease-induced mice were subjected to 12% SDS-PAGE (Carbonic anhydrase II, Glutathione S-transferase P1, Secerin-1) and 8% SDS-PAGE (ATP6V1E) electrophoresis. 10 μg of protein samples from cerebral cortex were mixed with 2.5 μl of SDS-PAGE loading buffer (60 mM Tris-Cl, 2% SDS, 25% Glycerol, 14.4 mM 2-Mercaptoethnol, 0.1% Bromophenol Blue, pH 6.8) (6 × 8 cm) at molecular weight (loading at 100 V on a separating gel). The composition of the running buffer used was 0.025 M Tris-Cl, 0.192 M Glycine, 1% SDS (pH 8.3).

4-2. 블롯팅(Blotting)4-2. Blotting

SDS-PAGE가 끝난 뒤 젤의 단백질을 Semi-dry 형태의 transfer kit(Bio-rad)을 이용하여 NitroCellulose 막 (Carbonic anhydrase II, Glutathione S-transferase P1, Secerin 1)과 PVDF(polyvinylidene fluoride)막 (ATP6V1E)으로 옮겼다. 50 mA에서 1시간 30분 동안 실시하였다.
After the SDS-PAGE, the gel protein was transferred to the NitroCellulose membrane (Carbonic anhydrase II, Glutathione S-transferase P1, Secerin 1) and PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane (ATP6V1E) using a semi-dry transfer kit (Bio-rad). ). This was done at 50 mA for 1 hour 30 minutes.

4-3. 항체반응4-3. Antibody reaction

1) Glutathione S-transferase P1은 막(membrane)을 5% w/v nonfat dry milk로 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)시켰다. 일차 항체로는 Goat polyclonal Glutathione S-transferase를 사용하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 일차항체의 희석농도는 1/3000으로 하였다. TBS/T(0.1%, Tris-buffered saline-tween 20)로 세척한 후에 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시켰다. 이차항체는 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG를 사용하고, 희석농도는 1/20,000이였다. 이차항체 반응 후에 TBS/T로 세척하고 난 뒤, ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.)로 가시화 시켰다.1) Glutathione S-transferase P1 blocked the membrane with 5% w / v nonfat dry milk for 1 hour at room temperature. The primary antibody was Goat polyclonal Glutathione S-transferase and reacted at room temperature for 1 hour. The dilution concentration of the primary antibody was 1/3000. After washing with TBS / T (0.1%, Tris-buffered saline-tween 20), the mixture was reacted with a secondary antibody at room temperature for 1 hour. The secondary antibody was horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG and the dilution concentration was 1 / 20,000. After the secondary antibody reaction was washed with TBS / T, and then visualized by ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.).

2) Carbonic anhydrase II membrane을 5% w/v nonfat dry milk로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 일차 항체로는 Rabbit polyclonal carbonic anhyydrase II를 사용하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 일차항체의 희석농도는 1/20,000으로 하였다. TBS/T(0.1%, Tris-buffered saline-tween 20)로 세척한 후에 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시켰다. 이차항체는 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG를 사용하고, 희석농도는 1/20,000이였다. 이차항체 반응 후에 TBS/T로 세척하고 난 뒤, ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.)로 가시화 시켰다.2) Carbonic anhydrase II membrane was blocked with 5% w / v nonfat dry milk for 1 hour at room temperature. The primary antibody was Rabbit polyclonal carbonic anhyydrase II and reacted at room temperature for 1 hour. The dilution concentration of the primary antibody was 1 / 20,000. After washing with TBS / T (0.1%, Tris-buffered saline-tween 20), the mixture was reacted with a secondary antibody at room temperature for 1 hour. The secondary antibody was horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG and the dilution concentration was 1 / 20,000. After the secondary antibody reaction was washed with TBS / T, and then visualized by ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.).

3) V-type proton ATPase subunit E 1 (Atp6v1e1) Membrane을 5% w/v nonfat dry milk로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 일차 항체로는 Chicken polyclonal ATP6V1E1를 사용하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 일차항체의 희석농도는 1/5000으로 하였다. TBS/T(0.1%, Tris-buffered saline-tween 20)로 세척한 후에 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시켰다. 이차항체는 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-chicken IgY를 사용하고, 희석농도는 1/10,000이였다. 이차항체 반응 후에 TBS/T로 세척하고 난 뒤, ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.)로 가시화 시켰다.3) V-type proton ATPase subunit E 1 (Atp6v1e1) Membrane was blocked with 5% w / v nonfat dry milk for 1 hour at room temperature. The primary antibody was Chicken polyclonal ATP6V1E1 and reacted at room temperature for 1 hour. The dilution concentration of the primary antibody was 1/5000. After washing with TBS / T (0.1%, Tris-buffered saline-tween 20), the mixture was reacted with a secondary antibody at room temperature for 1 hour. The secondary antibody was horseradish peroxidase-conjugated goat anti-chicken IgY, and the dilution concentration was 1 / 10,000. After the secondary antibody reaction was washed with TBS / T, and then visualized by ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.).

4) Secernin-1 Membrane을 5% w/v nonfat dry milk로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 일차 항체로는 Rabbit polyclonal secernin-1이며 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 일차항체의 희석농도는 1/500으로 하였다. TBS/T(0.1%, Tris-buffered saline-tween 20)로 세척한 후에 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시켰다. 이차항체는 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG를 사용하고, 희석농도는 1/1000이였다. 이차항체 반응 후에 TBS/T로 세척하고 난 뒤, ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.)로 가시화 시켰다.4) Secernin-1 Membrane was blocked with 5% w / v nonfat dry milk for 1 hour at room temperature. The primary antibody was Rabbit polyclonal secernin-1 and reacted at room temperature for 1 hour. The dilution concentration of the primary antibody was set to 1/500. After washing with TBS / T (0.1%, Tris-buffered saline-tween 20), the mixture was reacted with a secondary antibody at room temperature for 1 hour. The secondary antibody was horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG, and the dilution concentration was 1/1000. After the secondary antibody reaction was washed with TBS / T, and then visualized by ECL (Pierce Biotechnology, Inc., USA.).

상기와 같이 이차원 전기영동실험을 수행한 결과, 다음과 같이 정상 개체의 대뇌 피질에서 보다 알츠하이머병 유발 개체의 대뇌 피질에서 발현량이 감소 또는 증가하는 단백질들이 동정되었다.
As a result of performing the two-dimensional electrophoresis experiment as described above, proteins with reduced or increased expression in the cerebral cortex of Alzheimer's disease-induced individuals were identified as follows.

1. 알츠하이머병 유발 개체의 대뇌 피질에서 발현이 현저히 감소 또는 증가하는 단백질1. Proteins with markedly decreased or increased expression in the cerebral cortex of individuals with Alzheimer's disease

알츠하이머병이 진행되는 초기 단계인 6개월과 중기 단계인 12개월에 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌 피질을 대상으로 전기영동을 수행한 결과, 초기 단계에서 발현이 증가 또는 감소한 단백질(감소:#1140, 증가:724)과 중기 단계에서 발현이 감소한 단백질(#986, 1039)을 찾을 수 있었다 (도 1a 내지 1d).Electrophoresis of the cerebral cortex of Alzheimer's disease-induced mice at 6 months and 12 months of early stages of Alzheimer's disease resulted in increased or decreased expression of proteins in the early stages (decrease: # 1140, increased). : 724) and proteins with reduced expression (# 986, 1039) in the mid-term phase (Figs. 1A-1D).

ESI-Q-TOF를 수행한 결과 초기 및 중기 단계의 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌 피질에서 발현이 감소 또는 증가한 단백질을 하기 표 1과 같이 동정하였다.
As a result of performing ESI-Q-TOF, proteins with reduced or increased expression in cerebral cortex of early and middle stage Alzheimer's disease-induced mice were identified as shown in Table 1 below.

[표 1][Table 1]

Figure pat00001

Figure pat00001

2. 단백질의 아미노산 서열의 결정2. Determination of the amino acid sequence of a protein

상기와 같이 정상 대조군과 알츠하이머병 유발 마우스의 대뇌 피질에서 발현량이 현저히 감소 또는 증가하는 단백질들을 ESI-Q-TOF를 이용하여 동정하여 도 6a 내지 도 6d의 결과를 얻었다. 도면에서 빨간색은 매치된 트립신 분해 펩티드의 서열을 나타낸다.As described above, proteins with significantly decreased or increased expression levels in the cerebral cortex of the normal control group and Alzheimer's disease-induced mice were identified using ESI-Q-TOF to obtain the results of FIGS. 6A to 6D. Red in the figure shows the sequence of matched trypsin digesting peptides.

이들 단백질의 아미노산 서열은 NCBInr 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 서치하여 Secernin-1 (서열번호 1), V-typeprotonATPasesubunitE1(Atp6v1e1) (서열번호 2), carbonicanhydraseII (서열번호 3), GlutathioneS-transferaseP1 (서열번호 4)을 가짐을 확인하였다.
The amino acid sequences of these proteins were searched in the NCBInr database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) for Secernin-1 (SEQ ID NO: 1), V-typeprotonATPasesubunitE1 (Atp6v1e1) (SEQ ID NO: 2), carbonicanhydraseII (SEQ ID NO: 3), GlutathioneS-transferaseP1 (SEQ ID NO: 4) was confirmed to have.

3. 웨스턴 블롯팅 시험결과3. Western blotting test results

상기 발현이 변화된 단백질들로 동정된 Secernin-1, V-typeprotonATPasesubunitE1(Atp6v1e1), carbonicanhydraseII, 및 GlutathioneS-transferaseP1을 웨스턴 블롯 실험 결과를 도 4에 나타내고, 그 상대적인 강도를 도 5a 내지 5d에 나타내었다. 결과에서 보는 바와 같이, 알츠하이머병의 진행정도에 따라 단백질 발현 변화가 초기 단계에서는 Glutathione S-transferase P1이 감소하고 Secernin-1이 증가하였으며, 중기 단계에서는 V-type proton ATPase subunit E1(Atp6v1e1)과 carbonicanhydrase II이 감소하는 것으로 나타났다.Western blot test results of Secernin-1, V-typeprotonATPasesubunitE1 (Atp6v1e1), carbonicanhydraseII, and GlutathioneS-transferaseP1 identified as proteins with altered expression are shown in FIG. 4, and the relative strengths are shown in FIGS. As shown in the results, changes in protein expression according to the progression of Alzheimer's disease decreased Glutathione S-transferase P1 and increased Secernin-1 in the early stage, and V-type proton ATPase subunit E1 (Atp6v1e1) and carbonicanhydrase in the middle stage II was shown to decrease.

이것으로 보아 Secernin-1, V-type proton ATPase subunit E1(Atp6v1e1), carbonicanhydrase II, 및 Glutathione S-transferase P1은 알츠하이머병 초기 단계 또는 중기 단계의 치료제로서의 사용과 연구에 매우 유용할 것으로 생각된다.This suggests that Secernin-1, V-type proton ATPase subunit E1 (Atp6v1e1), carbonicanhydrase II, and Glutathione S-transferase P1 may be very useful for the study and use as a therapeutic agent in the early or middle stage of Alzheimer's disease.

<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Proteinic markers for diagnosing Alzheimer's disease <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1777 <212> PRT <213> Tau transgenic mouse <400> 1 Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ala Ala Ala Cys Cys Gly Gly Ala Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys 20 25 30 Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Gly 35 40 45 Gly Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Thr Ala Ala 50 55 60 Cys Cys Thr Ala Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly 65 70 75 80 Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Gly Cys Ala Gly Thr 85 90 95 Cys Gly Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly 100 105 110 Thr Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly 115 120 125 Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly 130 135 140 Ala Thr Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Thr Cys 145 150 155 160 Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys Thr Thr Thr Thr Gly Thr 165 170 175 Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr Cys Gly Ala 180 185 190 Gly Cys Thr Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly 195 200 205 Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly 245 250 255 Thr Thr Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys 260 265 270 Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Gly Cys Thr 275 280 285 Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Gly Thr 290 295 300 Gly Cys Ala Cys Thr Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Cys Ala Ala Thr 305 310 315 320 Cys Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala 340 345 350 Thr Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly 355 360 365 Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Ala 370 375 380 Ala Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys 385 390 395 400 Ala Thr Gly Gly Gly Gly Thr Ala Thr Gly Cys Ala Thr Ala Gly Cys 405 410 415 Cys Ala Ala Cys Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Thr 420 425 430 Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly 435 440 445 Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Thr 450 455 460 Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly 465 470 475 480 Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr Thr Gly Gly Cys Thr Thr Ala Gly 485 490 495 Ala Ala Cys Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys 500 505 510 Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Ala Gly Ala Cys 515 520 525 Ala Thr Cys Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Thr Thr Ala Thr 530 535 540 Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Cys Gly Gly Ala Cys Ala 545 550 555 560 Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Thr 565 570 575 Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Cys Cys Thr 580 585 590 Gly Cys Cys Ala Thr Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly 595 600 605 Thr Gly Cys Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly 610 615 620 Gly Ala Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr 625 630 635 640 Gly Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Thr 645 650 655 Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr 660 665 670 Gly Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly 675 680 685 Ala Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr 690 695 700 Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys 705 710 715 720 Cys Thr Cys Gly Cys Gly Ala Cys Thr Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly 725 730 735 Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala 740 745 750 Ala Cys Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr Ala Thr Gly Cys Thr 755 760 765 Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Thr 770 775 780 Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala 785 790 795 800 Ala Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly 805 810 815 Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly 820 825 830 Ala Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Cys Thr Gly 835 840 845 Cys Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys 850 855 860 Ala Gly Cys Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly 865 870 875 880 Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr 885 890 895 Gly Cys Ala Gly Ala Cys Gly Ala Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ala Cys 900 905 910 Ala Thr Cys Thr Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly 915 920 925 Cys Cys Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Thr Thr Gly Cys Ala Thr 930 935 940 Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala Gly Thr Cys Thr Thr Thr Cys 945 950 955 960 Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Thr Ala 965 970 975 Thr Ala Gly Thr Gly Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr Gly Cys Cys 980 985 990 Thr Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala 995 1000 1005 Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Thr 1010 1015 1020 Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala 1025 1030 1035 1040 Thr Cys Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Thr Ala 1045 1050 1055 Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr 1060 1065 1070 Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr Ala Ala Ala 1075 1080 1085 Ala Cys Thr Thr Gly Thr Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala 1090 1095 1100 Cys Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Thr Gly 1105 1110 1115 1120 Gly Thr Gly Ala Cys Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys 1125 1130 1135 Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Gly Gly 1140 1145 1150 Thr Thr Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly 1155 1160 1165 Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr 1170 1175 1180 Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys Ala Cys Gly Ala Gly 1185 1190 1195 1200 Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Cys Ala 1205 1210 1215 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala 1220 1225 1230 Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly 1235 1240 1245 Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr Gly Cys Thr Gly Gly 1250 1255 1260 Ala Gly Thr Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly 1265 1270 1275 1280 Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys 1285 1290 1295 Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys 1300 1305 1310 Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys 1315 1320 1325 Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys 1330 1335 1340 Cys Thr Ala Thr Thr Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Gly 1345 1350 1355 1360 Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala 1365 1370 1375 Gly Thr Thr Cys Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Gly Thr 1380 1385 1390 Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Thr 1395 1400 1405 Ala Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Ala Cys 1410 1415 1420 Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Ala Ala Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly 1425 1430 1435 1440 Cys Ala Gly Ala Thr Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Cys Thr Thr Cys 1445 1450 1455 Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ala Gly Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Ala 1460 1465 1470 Gly Ala Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Gly Gly Cys Cys 1475 1480 1485 Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Ala Ala Ala Thr Gly 1490 1495 1500 Thr Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr 1505 1510 1515 1520 Thr Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys 1525 1530 1535 Thr Thr Thr Gly Cys Thr Ala Thr Gly Thr Ala Ala Cys Gly Cys Gly 1540 1545 1550 Ala Thr Cys Cys Cys Ala Thr Thr Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr 1555 1560 1565 Gly Cys Thr Cys Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ala Thr Ala 1570 1575 1580 Ala Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly 1585 1590 1595 1600 Ala Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala 1605 1610 1615 Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Thr 1620 1625 1630 Thr Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr Gly Ala Gly Gly Ala 1635 1640 1645 Ala Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Thr Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly 1650 1655 1660 Cys Cys Thr Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys 1665 1670 1675 1680 Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly 1685 1690 1695 Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr 1700 1705 1710 Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Cys Thr 1715 1720 1725 Cys Thr Cys Thr Ala Gly Ala Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr 1730 1735 1740 Cys Thr Thr Thr Ala Gly Gly Gly Thr Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala 1745 1750 1755 1760 Ala Gly Gly Cys Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Ala Cys 1765 1770 1775 Cys <210> 2 <211> 420 <212> PRT <213> Tau transgenic mouse <400> 2 Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly 1 5 10 15 Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Ala Cys Gly Cys Ala Ala 20 25 30 Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly 35 40 45 Ala Ala Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala 50 55 60 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly 65 70 75 80 Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Cys 85 90 95 Ala Gly Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Gly Ala Thr 100 105 110 Gly Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Cys 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys 145 150 155 160 Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly 165 170 175 Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala 180 185 190 Gly Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala 195 200 205 Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Cys Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Ala 210 215 220 Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr 245 250 255 Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly 260 265 270 Cys Cys Thr Cys Gly Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala 290 295 300 Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly 305 310 315 320 Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly 325 330 335 Cys Ala Ala Thr Cys Cys Cys Thr Ala Thr Gly Thr Ala Thr Ala Ala 340 345 350 Ala Ala Thr Thr Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly 355 360 365 Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala 370 375 380 Thr Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Ala 385 390 395 400 Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala 405 410 415 Gly Cys Thr Gly 420 <210> 3 <211> 1807 <212> PRT <213> Tau transgenic mouse <400> 3 Ala Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys Thr 1 5 10 15 Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly 20 25 30 Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly Thr Cys Gly Gly 35 40 45 Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly 50 55 60 Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys 65 70 75 80 Cys Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly 85 90 95 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Thr Cys Gly Ala Ala Cys Ala 100 105 110 Cys Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Cys Cys Thr Gly 115 120 125 Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Ala 130 135 140 Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr 145 150 155 160 Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys 165 170 175 Thr Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Cys Thr Cys 180 185 190 Gly Gly Thr Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys 195 200 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               1205 1210 1215 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala            1220 1225 1230 Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly        1235 1240 1245 Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr Gly Cys Thr Gly Gly    1250 1255 1260 Ala Gly Thr Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly 1265 1270 1275 1280 Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Gly Aly Cys                1285 1290 1295 Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys            1300 1305 1310 Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys        1315 1320 1325 Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys    1330 1335 1340 Cys Thr Ala Thr Thr Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Gly 1345 1350 1355 1360 Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala                1365 1370 1375 Gly Thr Thr Cys Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Gly Thr            1380 1385 1390 Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Thr        1395 1400 1405 Ala Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Ala Cys    1410 1415 1420 Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Ala Ala Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly 1425 1430 1435 1440 Cys Ala Gly Ala Thr Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Cys Thr Thr Cys                1445 1450 1455 Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ala Gly Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Ala            1460 1465 1470 Gly Ala Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Gly Gly Cys Cys        1475 1480 1485 Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Ala Ala Ala Thr Gly    1490 1495 1500 Thr Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr 1505 1510 1515 1520 Thr Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys                1525 1530 1535 Thr Thr Thr Gly Cys Thr Ala Thr Gly Thr Ala Ala Cys Gly Cys Gly            1540 1545 1550 Ala Thr Cys Cys Cys Ala Thr Thr Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr        1555 1560 1565 Gly Cys Thr Cys Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ala Thr Ala    1570 1575 1580 Ala Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly 1585 1590 1595 1600 Ala Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala                1605 1610 1615 Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Thr            1620 1625 1630 Thr Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr Gly Ala Gly Gly Ala        1635 1640 1645 Ala Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Thr Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly    1650 1655 1660 Cys Cys Thr Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys 1665 1670 1675 1680 Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly                1685 1690 1695 Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr            1700 1705 1710 Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Cys Thr        1715 1720 1725 Cys Thr Cys Thr Ala Gly Ala Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr    1730 1735 1740 Cys Thr Thr Thr Ala Gly Gly Gly Thr Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala 1745 1750 1755 1760 Ala Gly Gly Cys Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Ala Cys                1765 1770 1775 Cys     <210> 2 <211> 420 <212> PRT <213> Tau transgenic mouse <400> 2 Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly   1 5 10 15 Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Ala Cys Gly Cys Ala Ala              20 25 30 Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly          35 40 45 Ala Ala Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala      50 55 60 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly  65 70 75 80 Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Cys                  85 90 95 Ala Gly Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Gly Ala Thr             100 105 110 Gly Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Cys         115 120 125 Ala Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala     130 135 140 Gly Gly Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys 145 150 155 160 Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly                 165 170 175 Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala             180 185 190 Gly Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ala         195 200 205 Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Cys Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Ala     210 215 220 Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr                 245 250 255 Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly             260 265 270 Cys Cys Thr Cys Gly Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys         275 280 285 Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala     290 295 300 Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly 305 310 315 320 Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly                 325 330 335 Cys Ala Ala Thr Cys Cys Cys Thr Ala Thr Gly Thr Ala Thr Ala Ala             340 345 350 Ala Ala Thr Thr Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly         355 360 365 Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala     370 375 380 Thr Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Ala 385 390 395 400 Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala                 405 410 415 Gly Cys Thr Gly             420 <210> 3 <211> 1807 <212> PRT <213> Tau transgenic mouse <400> 3 Ala Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys Thr   1 5 10 15 Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly              20 25 30 Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly Thr Cys Gly Gly          35 40 45 Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly      50 55 60 Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys  65 70 75 80 Cys Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly                  85 90 95 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Thr Cys Gly Ala Ala Cys Ala             100 105 110 Cys Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Cys Cys Thr Gly         115 120 125 Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Ala     130 135 140 Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr 145 150 155 160 Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys                 165 170 175 Thr Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Cys Thr Cys             180 185 190 Gly Gly Thr Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys         195 200 205 Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly     210 215 220 Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr Ala Thr Ala 225 230 235 240 Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Thr Gly Cys Gly                 245 250 255 Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Ala Cys Ala Cys Ala Cys Thr             260 265 270 Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Gly Cys Thr Ala Gly Ala Cys Gly         275 280 285 Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr     290 295 300 Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly 305 310 315 320 Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala Cys                 325 330 335 Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala             340 345 350 Ala Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala         355 360 365 Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys     370 375 380 Thr Thr Cys Cys Cys Cys Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly 385 390 395 400 Gly Ala Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Thr Cys Cys Cys Cys                 405 410 415 Thr Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala             420 425 430 Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Gly         435 440 445 Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys     450 455 460 Thr Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Thr Ala Thr Cys Thr Thr Ala Thr 465 470 475 480 Gly Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala                 485 490 495 Ala Gly Ala Gly Cys Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala             500 505 510 Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr Thr Ala Ala Cys         515 520 525 Gly Thr Thr Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr     530 535 540 Cys Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Thr 545 550 555 560 Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys                 565 570 575 Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Ala             580 585 590 Gly Ala Thr Thr Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Thr Thr Thr Cys Ala         595 600 605 Cys Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr Cys Ala     610 615 620 Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr 625 630 635 640 Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala                 645 650 655 Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Cys Thr             660 665 670 Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Thr Thr Gly Gly         675 680 685 Thr Thr Cys Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala     690 695 700 Ala Thr Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Gly Ala 705 710 715 720 Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys                 725 730 735 Cys Gly Gly Ala Thr Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Thr Gly Thr             740 745 750 Thr Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly         755 760 765 Ala Ala Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr     770 775 780 Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Ala Ala 785 790 795 800 Ala Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly                 805 810 815 Cys Ala Thr Thr Cys Cys Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala             820 825 830 Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys         835 840 845 Cys Thr Thr Thr Gly Cys Thr Ala Ala Cys Thr Thr Cys Gly Ala Thr     850 855 860 Cys Cys Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys 865 870 875 880 Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Cys Thr Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala                 885 890 895 Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys             900 905 910 Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr Cys Cys Gly Cys         915 920 925 Cys Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Gly Thr     930 935 940 Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Cys 945 950 955 960 Ala Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly                 965 970 975 Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr             980 985 990 Gly Thr Cys Thr Cys Ala Thr Thr Thr Cys Cys Gly Thr Ala Cys Gly         995 1000 1005 Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Gly    1010 1015 1020 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala 1025 1030 1035 1040 Ala Gly Cys Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys                1045 1050 1055 Thr Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys            1060 1065 1070 Cys Gly Cys Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Ala Ala        1075 1080 1085 Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Thr Thr Thr    1090 1095 1100 Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly 1105 1110 1115 1120 Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Ala Gly                1125 1130 1135 Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly            1140 1145 1150 Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly Thr Ala Gly Cys Thr Ala Ala Gly        1155 1160 1165 Cys Ala Cys Ala Gly Thr Thr Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr    1170 1175 1180 Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys Cys Gly Ala Cys Thr 1185 1190 1195 1200 Cys Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Gly Thr Ala                1205 1210 1215 Gly Ala Cys Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Thr Cys Ala            1220 1225 1230 Thr Cys Cys Gly Thr Thr Gly Thr Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala        1235 1240 1245 Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys    1250 1255 1260 Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys 1265 1270 1275 1280 Ala Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala                1285 1290 1295 Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Gly Thr            1300 1305 1310 Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala Gly Gly Gly Cys Ala Thr Cys Thr Thr        1315 1320 1325 Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Cys Ala Gly    1330 1335 1340 Cys Gly Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala 1345 1350 1355 1360 Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr Gly Cys Thr                1365 1370 1375 Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr Ala            1380 1385 1390 Gly Gly Ala Thr Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Cys Ala        1395 1400 1405 Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ala Ala Ala Ala    1410 1415 1420 Thr Gly Cys Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Cys Cys 1425 1430 1435 1440 Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Gly Gly Ala Thr Ala                1445 1450 1455 Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Ala            1460 1465 1470 Cys Ala Thr Cys Ala Thr Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Cys Thr        1475 1480 1485 Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Cys Thr Thr Ala Gly Gly Cys Ala Ala    1490 1495 1500 Ala Ala Cys Ala Gly Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly Thr Cys 1505 1510 1515 1520 Ala Thr Ala Gly Thr Thr Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr                1525 1530 1535 Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Thr Gly Thr Thr            1540 1545 1550 Cys Ala Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr        1555 1560 1565 Thr Ala Thr Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala    1570 1575 1580 Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Thr Ala 1585 1590 1595 1600 Thr Ala Thr Thr Thr Gly Thr Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr                1605 1610 1615 Ala Thr Thr Cys Thr Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Thr            1620 1625 1630 Thr Ala Thr Gly Thr Thr Ala Thr Ala Ala Cys Thr Thr Ala Gly Thr        1635 1640 1645 Gly Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Thr Ala Gly    1650 1655 1660 Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr 1665 1670 1675 1680 Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Gly Ala Thr Ala Thr Ala Gly                1685 1690 1695 Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr            1700 1705 1710 Ala Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Ala Thr Ala Ala        1715 1720 1725 Cys Ala Thr Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Ala Thr    1730 1735 1740 Gly Gly Ala Thr Ala Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Gly 1745 1750 1755 1760 Ala Thr Ala Thr Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Ala Ala Thr Ala Ala                1765 1770 1775 Ala Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala Ala            1780 1785 1790 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala        1795 1800 1805 <210> 4 <211> 300 <212> PRT <213> Tau transgenic mouse <400> 4 Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys   1 5 10 15 Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly              20 25 30 Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys Gly Thr          35 40 45 Gly Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly      50 55 60 Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Thr Thr Thr Gly  65 70 75 80 Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala                  85 90 95 Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Ala Ala             100 105 110 Gly Cys Thr Thr Thr Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Gly Gly Thr Gly         115 120 125 Ala Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys Thr Thr Thr Gly Cys     130 135 140 Cys Gly Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly 145 150 155 160 Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Cys                 165 170 175 Ala Cys Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Cys             180 185 190 Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys         195 200 205 Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly     210 215 220 Cys Cys Thr Ala Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Cys Gly Cys Cys Thr 225 230 235 240 Cys Ala Gly Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly                 245 250 255 Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr             260 265 270 Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Ala Thr Gly Thr         275 280 285 Gly Ala Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr     290 295 300

Claims (10)

하기 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커:
서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 45-47 kD의 분자량을 갖는 Secernin-1;
서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고 25-27 kD의 분자량을 갖는 V-type proton ATPase subunit E1(Atp6v1e1);
서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고 28-30 kD의 분자량을 갖는 carbonic anhydrase II; 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고 23-25 kD의 분자량을 갖는 Glutathione S-transferase P1.
Protein marker for diagnosing Alzheimer's disease, characterized in that one or two or more combinations selected from the group consisting of the following polypeptides:
Secernin-1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a molecular weight of 45-47 kD;
V-type proton ATPase subunit E1 (Atp6v1e1) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a molecular weight of 25-27 kD;
Carbonic anhydrase II having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having a molecular weight of 28-30 kD; And
Glutathione S-transferase P1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a molecular weight of 23-25 kD.
제 1항에 있어서, 상기 Glutathione S-transferase P1은 정상 개체와 비교하여 알츠하이머병 초기 단계의 대뇌 피질에서 상대적으로 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커.
The protein marker for diagnosing Alzheimer's disease according to claim 1, wherein the Glutathione S-transferase P1 has a decreased expression in the cerebral cortex of the early stage of Alzheimer's disease as compared to normal individuals.
제 1항에 있어서, 상기 carbonic anhydrase II는 정상 개체와 비교하여 알츠하이머병 중기 단계의 대뇌 피질에서 상대적으로 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커.
[Claim 2] The proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease according to claim 1, wherein the carbonic anhydrase II has a decreased expression in cerebral cortex in the mid-stage Alzheimer's disease compared to normal individuals.
제 1항의 단백질성 마커의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질을 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물.
A composition for diagnosing Alzheimer's disease comprising a substance for detecting the presence or absence of the proteinaceous marker of claim 1 and an amount, a pattern, or both.
제 4항에 있어서, 상기 단백질성 마커의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질은 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단용 조성물.
The composition for diagnosing Alzheimer's disease according to claim 4, wherein the substance which detects the presence of the proteinaceous marker and its amount, pattern, or both is an antibody that specifically recognizes a proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease.
제 1항의 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와, 그 발현량, 발현 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질을 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물.
A composition for diagnosing Alzheimer's disease, comprising a substance for detecting whether the gene encoding the proteinaceous marker of claim 1 is expressed and its expression amount, expression pattern, or both.
제 6항에 있어서, 상기 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와, 그 발현량, 발현 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질은 알츠하이머병 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 mRNA를 검출하기 위한 RT-PCR용 프라이머인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단용 조성물.
The method of claim 6, wherein whether the gene encoding the proteinaceous marker is expressed, and the amount of expression, expression pattern, or a substance for detecting both is RT for detecting mRNA of the gene encoding the proteinaceous marker for diagnosing Alzheimer's disease. -Alzheimer's disease diagnostic composition, characterized in that the primer for PCR.
제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 알츠하이머병 진단용 조성물을 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트.
Alzheimer's disease diagnostic kit comprising the composition for diagnosing Alzheimer's disease according to any one of claims 4 to 7.
알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자로부터 제 1항의 단백질성 마커를 검출하는 방법.
A method for detecting the proteinaceous marker of claim 1 in order to provide information necessary for diagnosing Alzheimer's disease.
제 1항의 단백질성 마커를 발현하는 세포 또는 동물에 시험 화합물을 처리하는 단계, 및 시험 화합물이 상기 단백질성 마커의 생리학적 활성을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 치료제의 스크리닝 방법.A method of screening an Alzheimer's disease therapeutic agent comprising the step of treating a test compound to a cell or animal expressing the proteinaceous marker of claim 1 and confirming whether the test compound promotes the physiological activity of the proteinaceous marker.
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