KR20120031041A

KR20120031041A - 이고들빼기로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 약학적 조성물 및 간 기능 개선용 건강기능 식품조성물

Info

Publication number: KR20120031041A
Application number: KR1020120024051A
Authority: KR
Inventors: 노주원; 이샛별; 윤지호; 정상훈; 이희주; 강경수; 유지혜; 김명수; 안수용; 김종환
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2009-02-09
Filing date: 2012-03-08
Publication date: 2012-03-29
Also published as: WO2010090498A2; KR101236233B1; CN102186488A; KR20100091131A; WO2010090498A3; CN102186488B; KR101209574B1

Abstract

본 발명은 이고들빼기(Youngia denticulata)로부터 분리한 화합물인 영지아사이드 A(Youngiaside A), 영지아사이드 B(Youngiaside B), 영지아사이드 C(Youngiaside C)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 이고들빼기로부터 분리된 화합물은 암 예방 지표효소인 퀴논 리덕타아제(Quinone reductase, QR)와 항산화 반응인자인 항산화반응인자(Antioxidant response element, ARE)를 비롯한 간의 해독효소의 활성을 증진시키고, 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 에탄올과 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간손상으로부터 간을 보호하므로, 본 발명에 따른 조성물은 간 기능 개선을 위한 의약품, 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이고들빼기로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 약학적 조성물 및 간 기능 개선용 건강기능 식품조성물 {Pharmaceutical compositions and health functional foods compositions for the improvement of liver functions containing compound isolated from Youngia denticulata as an active ingredient}

본 발명은 이고들빼기(Youngia denticulata)로부터 분리한 화합물인 영지아사이드 A(Youngiaside A), 영지아사이드 B(Youngiaside B), 영지아사이드 C(Youngiaside C)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 약학적 조성물 또는 건강기능 식품 조성물에 관한 것이다.

암에 대한 연구가 30년 이상 심도 있게 이루어진 현재에도 환경오염, 잘못된 식생활습관 등으로 인하여 암 발생률은 계속 증가하여 전 세계적으로 매년 1,000만 명 정도 발생하며 세계보건기구(WHO)는 사망의 주요원인 중 하나로 암을 꼽고 있다. 암은 중년층의 질환으로서 새로운 임상예의 70% 이상이 60세 이상에서 진단되어 세계인구가 고령화됨에 따라 암 발생률이 증가하게 되는 것은 피할 수 없는 현상이다. 국내에서도 보건복지부에 따르면 매년 10만 명 정도의 암 환자가 발생하는 것으로 알려져 있다.

일반적인 암의 치료법으로는 수술, 방사선 치료, 항암제 치료 등이 있다. 암의 확실한 치료를 위해서는 조기에 암을 진단하여 수술하고, 방사선 또는 항암제 치료를 병행하는 것이 필요하다. 그러나 암의 진단이 늦어지거나 암이 전이된 경우에는 치료 방법이 복잡해지며 치료에 소요되는 정신적, 경제적 부담이 훨씬 커지게 된다. 따라서 안전한 화학물질을 사용하여 정상세포가 암세포로 전환되지 못하도록 사전에 방지하는 화학적 암 예방(cancer chemoprevention)과 암을 초기에 발견하기 위한 진단방법 개발이 최근 암 연구의 중요 분야이다.

항암 분야는 기발생한 암세포를 사멸시켜 암을 치료하는 분야와 발암물질이 세포내 표적물과 반응하거나 목적물에 도달하는 것을 억제하거나 발암물질을 체외로 방출시킴으로써 암 발생 자체를 억제하여 암을 예방하는 분야로 나눌 수 있다. 암 치료 용도로 사용될 수 있는 것으로 알려진 물질의 경우 암 예방 용도로 사용될 수 없는 경우가 있으며, 반대로 암 예방 용도로 사용될 수는 있으나 암 치료 용도로 사용될 수 없는 물질이 있어, 최근에는 각각을 구체적으로 나누어 접근하고 있는 추세이다.

기존의 항암제는 암 치료용도로 사용되었는데, 이는 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 손상을 입혀 심각한 독성 및 부작용을 나타내는 단점이 있다.

이에 반하여 암 예방 용도의 조성물은 비교적 독성이 없는 안전한 화학물질을 이용하여 발암과정을 인위적으로 억제하거나 지연 또는 역전시킴으로써 정상세포가 암세포로 전환하는 것을 예방하려는 암 연구의 새로운 전략이다. 화학적 암 예방 물질의 후보군이 되기 위해서는 독성이 없거나 미약해야 하며 다수에게 널리 보급될 수 있도록 천연물로부터 분리나 합성이 용이한 화학물질들이 이용되므로 몇몇 비타민 대사물질들을 제외하고는 주로 식물성 화합물이 이용되고 있다(Surh YJ, Nature Rev Cancer, 3, 768-780, 2003).

암은 개시단계(initiation), 촉진단계(promotion), 진행단계(progression), 전이단계(metastasis)와 같은 다단계로 되어있는데 화학적 암 예방은 주로 개시단계와 촉진단계에서 암 발생을 억제하는 것을 목표로 하며 그 기전에 따라 크게 두 가지로 구분된다. 즉, 발암물질이 표적세포에 도달하는 것을 원천적으로 봉쇄하거나 대사활성화(metabolic activation)를 거쳐 표적세포의 DNA를 공격하여 구조적 손상과 돌연변이를 유발하는 것을 억제하는 블록킹 에이전트(blocking agent)와 발암물질에 노출되어 이미 개시화된 세포가 촉진 및 진행단계를 거쳐 양성암과 악성암으로 각각 발전되어가는 과정을 저해하는 서프레싱 에이전트(suppressing agent)이다(Surh YJ, Nature Rev Cancer, 3, 768-780, 2003).

블록킹 에이전트로는 사이토크롬 P-450(cytochrome P-450) 효소의 억제물질인 디알릴 설파이드(diallyl sulfide), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 에라직 액시드(ellagic acid) 등이 알려져 있으며, 2상 해독효소계의 유도제인 페닐에틸 이소티오시아네이트(phenylethyl isothiocyanate), 설포라판(sulforaphane), 올티프라즈(oltipraz) 등이 알려져 있다.

서프레싱 에이전트로는 폴리아민(polyamine) 대사 억제물질로 DFMO, 세포분화촉진제로 레티노이드(retinoid) 계열, 프로틴 키나아제 C(protein kinase C) 억제물질로 제니스테인(genistein), 산화성 DNA 손상억제물질로 EGCG 등이 알려져 있다.

2상 해독효소는 각종 암세포에 대한 특이적인 세포독성을 나타내어 항암기능을 갖는 등의 발암물질, 변이원성 물질, 활성산소종에 의한 DNA손상으로부터의 보호작용을 갖는다고 알려져 있다. 2상 해독효소 중에서, 퀴논 리덕타아제(Quinone reductase, QR)는 간세포에서 주로 생성되는 제2상 효소계의 한 종류로, 퀴논을 환원시켜 무독하게 만들고 세포내에 유도되어 여러 돌연변이 물질에 의해 일어나는 돌연변이와 종양화를 막아주고 발암물질을 무독하게 하는 역할을 한다. 더욱 구체적으로 퀴논 리덕타아제는 돌연변이 또는 발암물질 등에 의한 DNA와의 상호작용을 차단하는 효소이며, NADP(H)를 이용하여 퀴논류의 환원을 촉매하는 효소이다. 분자량은 54,000 Da이고 동일한 구조가 2개 결합된 호모다이머(homodimer)로, 그 각각은 273개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 활성부위에는 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(flavin adenine dinucleotide, FAD)를 함유하고 있으며, 메나디온 리덕타아제(menadione reductase), 비타민 K 리덕타아제(vitamin K reductase), DT-디아포라아제(DT-diaphorase) 등으로 불린다. 따라서 퀴논 리덕타아제는 간의 해독기능을 증진시킴으로써 간 기능을 개선시키고, 암을 발생시킬 수 있는 발암물질의 작용을 사전에 차단하여 암을 예방할 수 있다.

화학적 암 예방에 의한 해독효소계의 유전자 조절에는 항산화반응인자(Antioxidant response element; ARE)와 생체이물반응인자(Xenobiotics-responsive element; XRE)의 두 개 조절인자가 관여하는 것으로 보고되었다(Okey AB et al., Toxicol Lett, 70, 1-22). 그 중 항산화반응인자(ARE)는 2상 해독효소계의 활성유도를 조절하기 때문에 단일기능 유도제의 효과 검정에 이용될 수 있다.

이러한 2상해독효소의 활성의 증진을 통한 간의 해독기능을 증진시키는 기전을 통해서 에탄올 섭취로 인한 간의 손상을 막음으로써 간을 보호할 수 있다. 한편, 생체 내에서 퀴논계 화합물로 대사되는 약물인 아세트아미노펜 (acetaminophen)은 아스피린을 대체하여 빈번하게 사용되는 대표적인 해열진통제이다. 그러나, 아세트아미노펜을 장기 투여하는 경우에는 심한 간독성이 초래되는 문제점이 있다(A. J. Ware et al., Int. Med., 88:267(1978); 및 H. L. Bonkowsky et al., Lancet, 2:1016(1978)). 퀴논 리덕타아제를 비롯한 간 해독효소의 증진을 통해서 아세트아미노펜과 같은 퀴논계열 약물로 인한 간독성으로부터 간을 보호할 수 있다.

현재 전 세계적으로 해독효소계의 활성을 유도하는 암 예방용 또는 간 기능 개선용 조성물을 찾아내기 위한 시도가 진행 중이며, 대표적으로 식물로부터 천연 조성물을 분리하는 연구가 진행 중이다. 그러나 우리나라를 비롯한 동북아시아 지역에서는 주로 약용식물에 국한되어 연구가 되고 있는 경향이며, 각국에 자생하는 산채류, 채소류 및 과일류에 대한 연구는 아직까지 보고된 바가 거의 없는 실정이다. 본 발명자들 또한 종래 전혀 알려진 바 없는 식물로부터 암 예방 또는 간 기능 개선 용도를 갖는 물질을 개발하고자 노력하였으며, 그 중에서도 우리나라에서 자생하는 이고들빼기에 관심을 가지게 되었다.

이고들빼기(Youngia denticulata)는 쌍떡잎식물 합판화군 초롱꽃목 국화과의 한해살이 또는 두해살이풀로 산과 들의 건조한 곳에서 자라며, 높이 30?70 ㎝이고, 줄기는 가늘고 자줏빛이다. 가지가 퍼지며 자르면 즙이 나온다. 뿌리에 달린 잎은 주걱 모양이며 꽃이 필 때 스러지고 줄기에 달린 잎은 어긋나며 잎자루가 없다. 잎 길이는 6-11 ㎝, 나비는 3-7 ㎝이며 끝은 둔하다. 밑부분은 귀처럼 되어 줄기를 반쯤 감싸고, 가장자리에 이 모양의 톱니가 드문드문 있다. 꽃은 8-9월에 노란색으로 피고 두화는 지름 15 ㎜ 정도로서 산방꽃차례로 달리는데, 꽃이 필 때는 곧게 서고 진 다음 밑으로 처진다. 총포는 좁은 통처럼 생기고 총포조각은 긴 타원 모양 바소꼴로서 2줄로 늘어서고, 안조각은 줄 모양이며 8개이다. 열매는 수과(瘦果)로서 갈색이나 검은색이며 12개의 능선이 있다. 관모는 흰색이며 길이 약 3.5 ㎜이며, 어린순을 나물로 먹고, 한국?일본?중국?인도차이나에 분포한다.

그러나, 종래 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물의 암 예방 용도 또는 간 보호 효과는 전혀 알려진 바 없으며, 또한 구체적으로 어떤 경로를 통해 이러한 활성을 갖는지에 대해서도 전혀 개시된 바 없다. 이에 본 발명자들은 인체 독성이 없거나 미약한 화학적 암 예방제 또는 간 기능 개선제를 개발하기 위하여 식용 가능한 천연물에서 해독효소 활성을 검색하던 중, 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물이 간의 해독효소이자 암 예방 지표효소인 퀴논 리덕타아제의 활성을 유도하며 세포독성이 없고, 해독효소계의 활성을 유도함으로써 간기능을 보호하고, 나아가 화학적 암 예방 효과를 나타내어 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 암 예방 또는 간 기능 개선을 위한 의약품 및 건강기능식품으로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 하기 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

본 발명의 다른 목적은 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 상기 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 상기 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적은 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 상기 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퀴논 리덕타아제의 활성을 유도하고 항산화반응인자(ARE)의 활성을 증가시키고 에탄올과 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간손상으로부터 간을 보호하는 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 상기 화학식 1의 클로로제닉엑시드, 상기 화학식 2의 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드, 상기 화학식 3의 영지아사이드 A, 상기 화학식 4의 영지아사이드 B 및 상기 화학식 5의 영지아사이드 C로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 퀴논 리덕타아제의 활성을 유도하고 항산화반응인자(ARE)의 활성을 증가시키고 에탄올과 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간손상으로부터 간을 보호하는 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 상기 화학식 1의 클로로제닉엑시드, 상기 화학식 2의 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드, 상기 화학식 3의 영지아사이드 A, 상기 화학식 4의 영지아사이드 B 및 상기 화학식 5의 영지아사이드 C로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 퀴논 리덕타아제의 활성을 유도하고 항산화반응인자(ARE)의 활성을 증가시키고 에탄올과 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간손상으로부터 간을 보호하는 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 상기 화학식 1의 클로로제닉엑시드, 상기 화학식 2의 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드, 상기 화학식 3의 영지아사이드 A, 상기 화학식 4의 영지아사이드 B 및 상기 화학식 5의 영지아사이드 C로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 퀴논 리덕타아제의 활성을 유도하고 항산화반응인자(ARE)의 활성을 증가시키고 에탄올과 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간손상으로부터 간을 보호하는 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 상기 화학식 1의 클로로제닉엑시드, 상기 화학식 2의 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드, 상기 화학식 3의 영지아사이드 A, 상기 화학식 4의 영지아사이드 B 및 상기 화학식 5의 영지아사이드 C로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 상기 화학식 1의 클로로제닉엑시드, 상기 화학식 2의 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드, 상기 화학식 3의 영지아사이드 A, 상기 화학식 4의 영지아사이드 B 및 상기 화학식 5의 영지아사이드 C로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 암 예방 지표효소인 퀴논 리덕타아제의 활성을 유도시키고, 2상 해독효소계 활성을 유도하는 항산화반응인자(ARE)를 활성화시키며, 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 에탄올과 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간손상으로부터 간을 보호하므로, 본 발명에 따른 추출물, 이의 분획물 또는 상기 화학식 1 내지 5의 화합물은 암의 예방 또는 간 기능 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물의 퀴논 리덕타아제 상대 비활성과 세포생존율을 나타낸 그래프이고;
도 2는 본 발명에 따른 이고들빼기 분획물 4종의 퀴논 리덕타아제 상대 비활성을 나타낸 그래프이고;
도 3은 본 발명에 따른 이고들빼기 분획물 4종의 세포생존율을 나타낸 그래프이고;
도 4는 본 발명에 따른 화학식 1 내지 5의 화합물의 퀴논 리덕타아제 상대비활성을 나타낸 그래프이고;
도 5는 본 발명에 따른 화학식 1의 클로로제닉엑시드의 퀴논 리덕타아제 상대 비활성과 세포생존율을 나타낸 그래프이고;
도 6은 본 발명에 따른 화학식 2의 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드의 퀴논 리덕타아제 상대 비활성과 세포생존율을 나타낸 그래프이고;
도 7은 본 발명에 따른 화학식 3의 영지아사이드 A의 퀴논 리덕타아제 상대 비활성과 세포생존율을 나타낸 그래프이고;
도 8은 본 발명에 따른 화학식 4의 영지아사이드 B의 퀴논 리덕타아제 상대 비활성과 세포생존율을 나타낸 그래프이고;
도 9는 본 발명에 따른 화학식 5의 영지아사이드 C의 퀴논 리덕타아제 상대 비활성과 세포생존율을 나타낸 그래이고;
도 10은 본 발명에 따른 이고들빼기의 에틸아세테이트 분획물의 항산화반응인자(Antioxidant response element;ARE)에 대한 효과를 나타낸 그래프이고;
도 11은 본 발명에 따른 화학식 1의 클로로제닉엑시드, 화학식 2의 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드, 화학식 3의 영지아사이드 A, 화학식 4의 영지아사이드 B, 화학식 5의 영지아사이드 C의 항산화반응인자(Antioxidant response element;ARE)에 대한 효과를 나타낸 그래프이고;
도 12는 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물의 CYP2E1 과발현세포에서 에탄올에 의해 유도된 독성을 감소시키는 효과를 나타낸 그래프이고;
도 13은 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물의 아세트아미노펜에 의해 유도된 독성을 감소시키는 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 이고들빼기 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물은 이고들빼기 또는 이의 건조물로부터 추출하여 얻을 수 있으며, 상기 이고들빼기는 채취한 것, 양식한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물은 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출될 수 있다. 상기 유기용매는 C₁ 내지 C₄의 알코올, 초산에틸, 염화메틸렌 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용매인 것이 바람직하고, C₁ 내지 C₄의 알코올인 것이 더욱 바람직하고, 메탄올 또는 에탄올로 추출하는 것이 가장 바람직하다.

일례로 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물은 이고들빼기 건조물을 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 추출용매를 넣고 용액을 끓이며 환류 추출한 후, 일정시간 방치한 다음 거름종이 등으로 여과하여 알코올 추출물을 얻을 수 있다. 추출시간은 2 내지 12시간인 것이 바람직하며, 3 내지 5시간인 것이 더욱 바람직하다. 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.

또한, 본 발명은 이고들빼기 분획물을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 이고들빼기 분획물은 상기 이고들빼기 추출물을 n-헥산, 에틸아세티이트 및 n-부탄올을 사용하여 순차적으로 계통분획을 수행하여 얻을 수 있다.

나아가, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 클로로제닉엑시드, 화학식 2로 표시되는 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드, 화학식 3으로 표시되는 영지아사이드 A, 화학식 4로 표시되는 영지아사이드 B 및 화학식 5로 표시되는 영지아사이드 C로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물은

이고들빼기를 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 가하여 이고들빼기 추출물을 수득하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 수득한 추출물을 n-헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 순차적으로 계통분획하여 분획물을 얻는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 수득한 분획물에 대해 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물을 분리하고 정제하는 단계(단계 3)를 포함하여 이루어지는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

이하 본 발명에 따른 상기 제조방법을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.

먼저, 본 발명에 따른 상기 단계 1은 추출용매로 이고들빼기 추출물을 수득하는 단계이다. 상기 이고들빼기는 채취한 것, 양식한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 건조된 이고들빼기를 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣는다. 추출용매로는 C₁ 내지 C₄의 알코올, 초산에틸, 염화메틸렌, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있고, 이들 중에서 메탄올 또는 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 이를 상온에서 초음파로 4시간 동안 추출한 후 거름종이 등으로 여과하여 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물을 수득할 수 있다.

다음으로, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 이고들빼기 추출물을 극성을 달리하는 용매로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는 단계이다. 상기 용매로는 n-헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 n-부탄올(butanol)을 순차적으로 사용할 수 있다.

다음으로, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 얻은 분획물에 대해 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물을 분리하고 정제하는 단계이다.

상기 실리카겔 크로마토그래피는 크키 배제 크로마토그래피용 컬럼을 사용하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 세파덱스 LH-20을 충진한 컬럼을 사용할 수 있다. 상기 단계 2에서 수득한 분획물에 대하여 100% 메탄올을 이동상으로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼을 이용한 실리카겔 크로마토그래피를 수행한다. 이때 수득한 분획물에 대하여 고속액체 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물을 분리할 수 있다.

상기 고속액체 크로마토그래피는 20 부피%에서 30 부피%, 25 부피%에서 40 부피%, 25 부피% 아세토니트릴로 농도 구배된 물과 아세토니트릴의 혼합용매를 전개용매로 사용하여 수행될 수 있다. 이때, 상기 이동상의 유속은 2 내지 15 ㎖/분인 것이 바람직하고, 수행 시간은 0.5 내지 1시간이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 이고들빼기 추출물, 분획물 또는 상기 화학식 1 내지 5의 화합물은 퀴논 리덕타아제의 효소활성을 증가시켜 발암물질을 해독함으로써 암의 예방 또는 간 기능 개선 용도로 사용될 수 있다. 이들의 암의 예방 또는 간 기능 개선 용도를 구체적인 실험결과들을 근거로 설명한다.

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물에 대하여 흰쥐의 간암세포주(Hepa1clc7)를 대상으로 암 예방 지표효소인 퀴논 리덕타아제 활성 유도 효과를 측정하는 실험(실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3 참조), 세포독성을 측정하여 이를 바탕으로 암예방지표를 도출하는 실험(실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6 참조), 인간의 대장암세포주(HCT116)를 대상으로 2상 해독효소계 활성을 유도하는 ARE 활성을 측정하는 실험(실시예 7, 실시예 8 참조) 및 인간의 간암세포주(HepG2)를 대상으로 에탄올과 아세트아미노펜에 의해 유도되는 독성에 대한 영향을 측정하는 실험(실시예 9, 실시예 10 참조)을 수행한 결과를 정리하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물은 12.5, 25, 50 ㎍/㎖의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.3배, 2.7배, 2.4배 증가시키며(도 1 참조), 퀴논 리덕타아제 활성의 증가를 2배 이상 유도하는 12.5 ㎍/㎖의 농도에서 세포독성을 유발하지 않음을 알 수 있다(도 1 참조).

또한, 본 발명에 따른 이고들빼기의 에틸아세테이트 분획물은 12.5, 25, 50 ㎍/㎖의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.1배, 2.7배, 3.2배 증가시키며(도 2 참조), 퀴논 리덕타아제 활성의 증가를 2배 이상 유도하는 12.5 ㎍/㎖의 농도에서 세포독성을 유발하지 않으며(도 3 참조), 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 2상 해독효소계 활성을 유도하는 ARE 활성에 농도 의존적으로 영향을 미침을 알 수 있다(도 10 참조).

또한, 화학식 1의 클로로제닉엑시드는 250 μM의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 1.54배 증가시키며(도 5 참조), 퀴논 리덕타아제 활성의 증가를 1.5배 이상 유도하는 250 μM의 농도에서 세포독성을 유발하지 않으며(도 5 참조), 50 μM의 농도에서 2상 해독효소계 활성을 유도하는 ARE 활성을 1.17배 증가시키는 것을 알 수 있다(도 11 참조).

또한, 화학식 2의 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드는 250 μM의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 1.39배 증가시키며(도 6 참조), 퀴논 리덕타아제 활성의 증가를 1.3배 이상 유도하는 250 μM의 농도에서 세포독성을 유발하지 않으며(도 6 참조), 50 μM의 농도에서 2상 해독효소계 활성을 유도하는 ARE 활성을 1.22배 증가시키는 것을 알 수 있다(도 11 참조).

또한, 화학식 3의 영지아사이드 A는 125 μM과 250 μM의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.96, 3.91배 증가시키며(도 7 참조), 퀴논 리덕타아제 활성의 증가를 2배 이상 유도하는 위의 농도에서 세포독성을 유발하지 않으며(도 7 참조), 50 μM의 농도에서 2상 해독효소계 활성을 유도하는 ARE 활성을 1.65배 증가시키는 것을 알 수 있다(도 11 참조).

또한, 화학식 4의 영지아사이드 B는 125 μM과 250 μM의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.71, 3.61배 증가시키며(도 8 참조), 퀴논 리덕타아제 활성의 증가를 2배 이상 유도하는 위의 농도에서 세포독성을 유발하지 않으며(도 8 참조), 50 μM의 농도에서 2상 해독효소계 활성을 유도하는 ARE 활성을 1.22배 증가시키는 것을 알 수 있다(도 11 참조).

또한, 화학식 5의 영지아사이드 C는 62.5μM, 125 μM, 250 μM의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.26, 3.19, 3.88배 증가시키며(도 9 참조), 퀴논 리덕타아제 활성의 증가를 2배 이상 유도하는 위의 농도에서 세포독성을 유발하지 않으며(도 9 참조), 50 μM의 농도에서 2상 해독효소계 활성을 유도하는 ARE 활성을 1.67배 증가시키는 것을 알 수 있다(도 11 참조).

또한, 에탄올 250 mM을 처리한 경우에는 세포 생존율이 약 32% 감소하고, 본 발명의 이고들빼기 추출물을 3.125, 6.25, 12.5 및 25 ㎍/㎖의 농도로 처리한 경우에는 세포 생존율이 약 100% 이상으로 증가함으로써 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물이 에탄올에 의한 간세포의 사멸을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있다(도 12 참조).

또한, 아세트아미노펜 40 mM을 처리한 경우에는 세포 생존율이 약 60% 감소하고, 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물을 처리하는 경우에는 농도의존적으로 세포 생존율이 약 120%까지 증가하고, 본 발명에 따른 이고들빼기 에틸아세테이트 분획물이 부탄올 분획물보다 높은 세포 생존율을 나타냄으로써 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물 및 분획물이 아세트아미노펜에 의한 간세포의 사멸을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있다(도 13 참조).

따라서, 본 발명에 따른 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물은 암 예방 지표효소인 퀴논 리덕타아제를 비롯한 간의 해독효소의 활성을 증진시키고 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 에탄올과 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간손상으로부터 간을 보호하므로, 이들을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 화학적 암 예방 효과를 나타내어 암을 예방하거나 간 기능을 개선하는데 유용하게 사용될 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 간암 또는 대장암을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상술한 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상술한 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술한 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 약학적 조성물, 간 기능 개선용 약학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제. 액제. 현탁제, 유화제, 시럽제. 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트. 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스. 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.

또한 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 약학적 조성물, 간 기능 개선용 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사제, 정맥주사제, 근육 내 주사제 또는 흉부 내 주사제를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 다라 제제화할 수 있다.

본 발명의 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 약학적 조성물, 간 기능 개선용 약학적 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 유효성분으로서 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 약 0.1-1,500 ㎎의 단위용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다. 그러나, 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1-500 ㎎ 범위가 보통이다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일 회 투여량으로는 분리하여 하루에 보통 약 5-300 ㎎의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.

본 발명에 따른 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 암의 예방 또는 개선, 간 기능의 개선을 목적으로 식품, 음료 등의 건강보조 또는 건강기능성 식품에 첨가할 수 있다. 이 경우, 이고들빼기의 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 식품 첨가물로 사용시에 원료에 대하여 0.01-20 중량%, 바람직하게는 0.1-5 중량%의 양으로 첨가할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 추출물, 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 추출물, 이로부터 분리한 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 보조 첨가제는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 솔비톨, 에르트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 조성물 100 중량부당 일반적으로 약 0.01-0.04 중량부, 바람직하게는 0.02-0.03 중량부이다.

상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명에 따른 조성물 100 중량부당 0.01-ow0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

<제조예 1> 이고들빼기 추출물의 제조

강원도 평창 산채시험장에서 채취한 이고들빼기를 그늘에서 건조하여, 적당한 크기로 세절하여 추출용기에 이고들빼기 1 ㎏과 94% 에탄올 5 L를 가하여 초음파로 추출하였고, 거름종이로 여과하여 추출물을 얻었다. 추출과정을 3회 반복하였고, 이후 용매를 감압 농축 및 건조하여 70 g의 에탄올 추출물을 수득하였다.

<제조예 2> 이고들빼기 분획물의 제조

상기 에탄올 추출물을 계통분획을 실시하여 n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올로 순차적으로 분획하여 각각 n-헥산에서 18.7 g, 에틸아세테이트에서 2.3 g, n-부탄올에서 5.8 g 및 물에서 34.4 g의 분획물을 수득하였다.

<제조예 3> 이고들빼기 분획물로부터 화합물의 제조

<3-1> 클로로제닉엑시드(Chlorogenic acid)의 제조

상기 제조예 2에서 수득한 에틸아세테이트 분획물에 100% 메탄올을 이동상으로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 수행하여 분획물 1 내지 9를 수득하였다. 상기 분획물 중 분획물 4(324 ㎎)를 메탄올에 녹인 후, 고속액체 크로마토그래피를 수행하여 클로로제닉엑시드를 얻었다. 이때, 이동상으로 물과 아세토니트릴의 혼합용매를 사용하였고, 40분 동안 20 부피%에서 30 부피% 아세토니트릴로 순차적으로 극성을 주어 농도구배하였고, 유속은 10 ㎖/분, YMC Hydrosphere ODS(φ20×250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼을 사용하였다.

¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 2.02-1.74 (4H, m, H-2,6), 3.54 (1H, m, H-3), 3.92 (1H, m, H-4), 5.07 (1H, m, H-5), 6.98 (1H, dd, J=8.2, 2.0 Hz, H-2'), 6.77 (1H, d, J=8.2 Hz, H-3'), 7.03 (1H, d, J=2 Hz, H-6'), 7.43 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7'), 6.16 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8')

¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ 73.96 (C-1), 36.76 (C-2), 70.74 (C-3), 68.49 (C-4), 71.35 (C-5), 37.64 (C-6), 126.04 (C-1'), 121.79 (C-2'), 116.17 (C-3'), 148.75 (C-4'), 145.98 (C-5'), 115.21 (C-6'), 145.37 (C-7'), 114.75 (C-8'), 166.20 (C-9'), 175.42 (COOH)

<3-2> 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드(3,5-Di-O-caffeoylquinic acid)의 제조

상기 제조예 3-1에서 얻은 분획물 5(584 g)를 메탄올에 녹인 후, 100% 메탄올을 이동상으로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 수행한 후, 고속액체 크로마토그래피를 수행하여 3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드를 얻었다. 이때, 이동상으로 물과 아세토니트릴의 혼합용매를 사용하였으며, 40분 동안 25 부피% 아세토니트릴로 농도구배하였고, 유속은 2 ㎖/분, YMC Hydrosphere ODS(φ10×250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼을 사용하였다.

¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 2.23-2.04 (4H, m, H-2,6), 5.27 (1H, m, H-3), 3.90 (1H, m, H-4), 5.20 (1H, m, H-5), 7.08 (2H,dd, J= 2.3, 8.3 Hz, H-2',2"), 6.86 (2H, d, J= 8 Hz, H-3',3"), 7.13 (2H, d, J=2 Hz, H-6',6"), 7.57 (1H, d, J=16.2 Hz, H-7'), 6.33 (1H, d, J=16.0 Hz, H-8'), 7.53 (1H, d, J=16.3 Hz, H-7"), 6.25 (1H, d, J=16.0 Hz, H-8")

¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ 73.04 (C-1), 36.44 (C-2), 71.47 (C-3), 68.10 (C-4), 71.48 (C-5), 35.29 (C-6), 126.12 (C-1'), 121.72 (C-2'), 116.38 (C-3'), 148.96 (C-4'), 146.14 (C-5',5"), 115.31 (C-6',8'), 145.32 (C-7'), 166.67 (C-9'), 126.20 (C-1"), 121.96 (C-2"), 116.37 (C-3"), 148.83 (C-4"), 115.40 (C-6"), 145.69 (C-7"), 114.69 (C-8"), 166.14 (C-9"), 175.94 (COOH)

<3-3> 영지아사이드 A(Youngiaside A)의 제조

상기 제조예 3-1에서 얻은 분획물 3(621 ㎎)을 메탄올에 녹인 후, 고속액체 크로마토그래피를 수행하여 영지아사이드 A를 얻었다. 이때, 이동상으로 물과 아세토니트릴의 혼합용매를 사용하였으며, 40분 동안 25 부피%에서 40 부피% 아세토니트릴로 순차적으로 극성을 주어 농도구배하였고, 유속은 10 ㎖/분, YMC Hydrosphere ODS(φ20×250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼을 사용하였다.

¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 2.12 (1H, dd, J=2.4, 13.9 Hz, H-2) 2.45 (1H, d, J=13.9 Hz, H-2), 5.96 (1H, m, H-3), 3.67-3.59 (4H, m, H-5,6,9,Glc-6), 2.93 (1H, m, H-7), 3.06 (2H, m, H-8), 6.11 (1H, dd, J=1.7, 3.0 Hz, H-13), 5.97 (1H, m, H-13), 1.69 (3H, s, H-14), 4.35 (2H, quar, J=1.6, 14.3 Hz, H-15), 4.13 (1H, d, J=7.8 Hz, Glc-1), 3.00 (1H, m, Glc-2), 3.12 (1H, m, Glc-3), 3.06 (2H, m, Glc-4,5), 3.45 (1H, m, Glc-6)

¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ 136.51 (C-1), 45.81 (C-2), 128.49 (C-3), 141.26 (C-4), 51.88 (C-5), 82.24 (C-6), 57.70 (C-7), 37.28 (C-8), 68.06 (C-9), 126.56 (C-10), 139.23 (C-11), 169.73 (C-12), 121.35 (C-13), 23.42 (C-14), 67.52 (C-15), 102.22 (Glc-1), 73.95 (Glc-2), 77.09 (Glc-3), 70.46 (Glc-4), 77.23 (Glc-5), 61.43 (Glc-6)

<3-4> 영지아사이드 B(Youngiaside B)의 제조

상기 제조예 3-1에서 얻은 분획물 3(621 ㎎)을 메탄올에 녹인 후, 고속액체 크로마토그래피를 수행하여 영지아사이드 B를 얻었다. 이때, 이동상으로 물과 아세토니트릴의 혼합용매를 사용하였으며, 40분 동안 25 부피%에서 40 부피% 아세토니트릴로 순차적으로 극성을 주어 농도구배하였고, 유속은 10 ㎖/분, YMC Hydrosphere ODS(φ20×250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼을 사용하였다.

¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 2.14 (1H, dd, J=2.4, 13.9 Hz, H-2) 2.45 (1H, d, J=13.9 Hz, H-2), 5.96 (1H, m, H-3), 3.67-3.63 (4H, m, H-5,6,9,Glc-6), 2.93 (1H, m, H-7), 3.00 (2H, m, H-8), 6.12 (1H, dd, J=1.7, 3.0 Hz, H-13), 5.98 (1H, m, H-13), 1.72 (3H, s, H-14), 4.37 (2H, quar, J=1.6, 14.3 Hz, H-15), 4.25 (1H, d, J=7.8 Hz, Glc-1), 3.21-3.17 (1H, m, Glc-2,5), 4.79 (1H, t, J=9.4 Hz, Glc-3), 3.30 (1H, m, Glc-4), 3.49 (1H, m, Glc-6), 3.35 (2H, s, H-β), 7.06 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2',6'), 6.68 (2H, d, J=8.6 Hz, H-3',5')

¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ 136.49 (C-1), 45.90 (C-2), 129.06 (C-3), 139.23 (C-4), 51.73 (C-5), 82.24 (C-6), 57.70 (C-7), 37.31 (C-8), 68.06 (C-9), 126.58 (C-10), 136.49 (C-11), 167.74 (C-12), 121.36 (C-13), 23.42 (C-14), 67.53 (C-15), 101.64 (Glc-1), 71.85 (Glc-2), 78.46 (Glc-3), 68.22 (Glc-4), 76.90 (Glc-5), 61.09 (Glc-6), 171.47 (C-α), 40.14 (C-β), 125.18 (C-1'), 130.80 (C-2',6'), 115.43 (C-3',5'), 156.48 (C-4')

<3-5> 영지아사이드 C(Youngiaside C)의 제조

상기 제조예 3-1에서 얻은 분획물 3(621 ㎎)을 메탄올에 녹인 후, 고속액체 크로마토그래피를 수행하여 영지아사이드 C를 얻었다. 이때, 이동상으로 물과 아세토니트릴의 혼합용매를 사용하였으며, 40분 동안 25 부피%에서 40 부피% 아세토니트릴로 순차적으로 극성을 주어 농도구배하였고, 유속은 10 ㎖/분, YMC Hydrosphere ODS(φ20×250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼을 사용하였다.

¹H-NMR δ 2.15 (1H, dd, J=2.4, 13.9 Hz, H-2) 2.46 (1H, d, J=13.9 Hz, H-2), 5.97 (1H, m, H-3), 3.67-3.61 (3H, m, H-5,6,9), 2.93 (1H, m, H-7), 3.00 (2H, m, H-8), 6.12 (1H, dd, J=1.3, 3.0 Hz, H-13), 5.98 (1H, m, H-13), 1.70 (3H, s, H-14), 4.37 (2H, quar, J=1.6, 14.3 Hz, H-15), 4.24 (1H, d, J=7.8 Hz, Glc-1), 3.11-3.07 (1H, m, Glc-2), 3.40-3.31 (3H, m, Glc-3,5,6), 4.58 (1H, t, J=9.6 Hz, Glc-4), 3.30 (1H, m, Glc-4), 3.24 (1H, m, Glc-6), 3.53 (2H, d, J=2.6 Hz, H-β), 7.05 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2',6'), 6.69 (2H, d, J=8.6 Hz, H-3',5')

¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ 136.46 (C-1), 45.81 (C-2), 128.57 (C-3), 141.06 (C-4), 51.90 (C-5), 82.23 (C-6), 57.69 (C-7), 37.31 (C-8), 68.05 (C-9), 126.58 (C-10), 139.24 (C-11), 169.72 (C-12), 121.35 (C-13), 23.43 (C-14), 67.73 (C-15), 102.13 (Glc-1), 74.04 (Glc-2), 74.27 (Glc-3), 72.05 (Glc-4), 74.53 (Glc-5), 61.03 (Glc-6), 171.26 (C-α), 40.01 (C-β), 124.87 (C-1'), 130.74 (C-2',6'), 115.51 (C-3',5'), 156.58 (C-4')

<실시예 1> 이고들빼기 추출물의 퀴논 리덕타아제 활성 유도 효과 측정

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물의 암 예방 지표효소인 퀴논 리덕타아제 활성 유도 효과를 측정하기 위하여 흰쥐의 간암세포주(Hepa1clc7)를 대상으로 하기의 실험을 수행하였다. 먼저, 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 a-MEM(최소 필수 배지; minimum essential medium) 용액을 간암세포배양액과 혼합하여 세포의 수를 1×10⁵ cells/㎖로 조제한 후에 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 처리하여 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 된 후에, 상기 제조예 1에서 수득한 추출물을 2배 농도구배로 3.125 내지 200.000㎍/㎖ 사이의 7개의 농도로 처리한 뒤, 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후, 세포를 인산버퍼식염수(PBS; phosphate buffered saline) 용액으로 씻어낸 후 0.08% 디지토닌(digitonin)과 2 mM EDTA를 포함한 용액 80 ㎕로 세포막을 용해시키고 단백질 용액을 얻었다. 상기 단백질 용액 50 ㎕와 반응용액 A(49 ㎖의 25 mM Tris 버퍼, 34 ㎎의 BSA, 0.34 ㎖의 1.5% 트윈-20 용액, 0.34 ㎖의 조효소용액, 100 유닛(units)의 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 15 ㎎ MTT, 50 ㎕의 50 mM 메나디온) 200 ㎕를 혼합하여 마이크로플레이트 리더로 610 ㎚에서 흡광도 증가율을 측정하였으며, 단백질의 양은 브래드포드(Bradford) 용액을 사용하여 595 ㎚에서 측정하여 구하였다. 상기의 반응용액 A 중 조효소용액은 150 mM 글루코즈-6-포스페이트(glucose-6-phosphate), 4.5 mM NADP, 0.75 mM FAD로 구성되었으며, 상기의 MTT는 3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide의 약어이다. 퀴논 리덕타아제의 활성은 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.

[수학식 1]

퀴논 리덕타아제의 활성 = A/B

A : nmol MTT/min (시험 시료를 처리한 세포내 퀴논 리덕타아제의 610 ㎚에서의 흡광도 증가율)

B : ㎎ protein (시험 시료를 처리한 세포 전체의 단백질 양)

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 이고들빼기 추출물은 6.25, 12.5, 25 ㎍/㎖의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.2배, 2.3배, 2.6배 증가시켰다.

한편, 하기 수학식 2에 의해 상기 추출물의 암 예방지표(Chemoprevention Index, CI)를 계산하였다. 계산결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[수학식 2]

암 예방지표(CI) = A/B

A : IC₅₀(시험시료를 처리한 세포의 생존률이 50%가 되는 시료의 농도)

B : CD(시험시료를 처리한 세포의 퀴논리덕타아제 활성이 두 배가 되는 시료의 농도)

산채류	Hepa1clc7
산채류	CD(㎍/㎖)	IC₅₀(㎍/㎖)	CI
이고들빼기	9.43	〉200.00	21.20
설포라판	1.17	14.96	12.83

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물에 대한 암예방지표(CI)는 21.20으로 기존의 암예방 기능성 식품소재로 알려진 설포라판(Sulforaphane, CI = 12.83)과 비교하였을 때 매우 좋은 효능을 가짐을 알 수 있으며, 도 1에도 나타나 있는 바와 같이, 퀴논 리덕타아제 활성을 두 배 이상 증가시키는 농도에서 독성이 거의 없음을 확인하였다.

<실시예 2> 이고들빼기 분획물의 퀴논 리덕타아제 활성 유도 효과 측정

본 발명에 따른 이고들빼기 분획물의 암 예방 지표효소인 퀴논 리덕타아제 활성 유도 효과를 측정하기 위하여 흰쥐의 간암세포주(Hepa1clc7)에 실시예 1과 동일한 방법으로 처리한 다음, 상기 제조예 2에서 수득한 분획물들을 2배 농도구배로 3.125 내지 200.000㎍/㎖ 사이의 7개의 농도로 처리한 뒤, 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후, 세포를 인산버퍼식염수(PBS; phosphate buffered saline) 용액으로 씻어낸 후 0.08% 디지토닌(digitonin)과 2 mM EDTA를 포함한 용액 80 ㎕로 세포막을 용해시키고 단백질 용액을 얻었다. 상기 단백질 용액을 실시예 1과 동일한 방법으로 퀴논 리덕타아제 단백질 활성을 측정하였다. 측정결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 이고들빼기 에틸아세테이트 분획물은 12.5, 25, 50 ㎍/㎖의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.1배, 2.7배, 3.2배 증가시켰다.

한편, 상기 수학식 2를 이용하여 상기 분획물의 암 예방지표(Chemoprevention Index, CI)를 계산하였다. 계산결과를 하기 표 2에 나타내었다.

산채류	분획물	Hepa1clc7
산채류	분획물	CD(㎍/㎖)	IC₅₀(㎍/㎖)	CI
이고들빼기	헥산(Hex)	26.26	89.12	3.39
	에틸아세테이트(EA)	9.90	151.10	15.27
	부탄올(BuOH)	16.81	〉200.00	11.90
	물(H₂O)	123.82	〉200.00	1.62

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 이고들빼기 분획물들 중 에틸아세테이트 분획물에 대한 암예방지표(CI)는 15.27로 다른 용매의 분획물보다 좋은 효능을 가짐을 확인하였다.

<실시예 3> 화학식 1 내지 5의 화합물의 퀴논 리덕타아제 활성 유도 효과 측정

본 발명에 따른 화학식 1 내지 5의 화합물의 암 예방 지표효소인 퀴논 리덕타아제 활성 유도 효과를 측정하기 위하여 흰쥐의 간암세포주(Hepa1clc7)에 실시예 1과 동일한 방법으로 처리한 다음, 상기 제조예 3에서 수득한 화합물들을 2배 농도구배로 7.81 내지 250.00 ㎍/㎖ 사이의 7개의 농도로 처리한 뒤, 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후, 세포를 인산버퍼식염수(PBS; phosphate buffered saline) 용액으로 씻어낸 후 0.08% 디지토닌(digitonin)과 2 mM EDTA를 포함한 용액 80 ㎕로 세포막을 용해시키고 단백질 용액을 얻었다. 상기 단백질 용액을 실시예 1과 동일한 방법으로 퀴논 리덕타아제 단백질 활성을 측정하였다. 측정결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1 내지 5의 화합물 중 영지아사이드 A는 125.00, 250.00 μM의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.96배, 3.92배 증가시켰다(도 7 참조). 또한, 영지아사이드 B는 125.00, 250.00 μM의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.71, 3.61배 증가시켰다(도 8 참조). 또한, 영지아사이드 C는 62.50, 125.00, 250.00 μM의 농도에서 무처리의 대조군에 비하여 퀴논 리덕타아제 활성을 각각 2.26배, 3.18배, 3.88배 증가시켰다(도 9 참조).

한편, 상기 수학식 2를 이용하여 상기 화합물의 암 예방지표(Chemoprevention Index, CI)를 계산하였다. 계산결과를 하기 표 3에 나타내었다.

화합물	CD(㎍/㎖)	IC₅₀(㎍/㎖)	CI
클로로제닉엑시드	〉500.00	〉500.00	0.27
3,5-다이-오-카페오일퀴닉엑시드	〉500.00	〉500.00	0.64
영지아사이드 A	54.30	〉500.00	9.21
영지아사이드 B	61.51	〉500.00	8.13
영지아사이드 C	38.26	〉500.00	13.07

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 화학식 1 내지 5의 화합물 중 영지아사이드 A, 영지아사이드 B, 영지아사이드 C의 암예방지표(CI)는 각각 9.21, 8.13, 13.07로 다른 두 개의 화합물에 비해서 퀴논 리덕타아제 활성을 증가시키는 효과가 매우 탁월하였으며, 이 중 영지아사이드 C가 가장 좋은 효능을 가짐을 확인하였다. 또한, 도 7, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이 퀴논 리덕타아제 활성을 두 배 이상 증가시키는 농도에서 독성이 거의 없음을 확인하였다.

<실시예 4> 이고들빼기 추출물의 세포독성 측정

상기 제조예 1에서 제조한 이고들빼기 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 흰쥐의 간암세포주(Hepa1c1c7)를 대상으로 하기의 실험을 수행하였다. 먼저, 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 a-MEM(최소 필수 배지; minimum essential medium) 용액을 간암세포배양액과 혼합하여 세포의 수를 1×10⁵ cells/㎖로 조제한 후에 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 처리하여 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화된 후에, 상기 제조예 1에서 수득한 추출물을 2배 농도구배로 3.125 내지 200 ㎍/㎖의 7개의 농도로 처리하고 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 CCK-8(Dojindo laboratory, Japan)시약을 첨가하여 1시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양한 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

이고들빼기 추출물에 대한 측정결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 이고들빼기 추출물은 퀴논 리덕타아제 활성화 효과를 유도하는 12.5 내지 50 ㎍/㎖의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.

<실시예 5> 이고들빼기 분획물의 세포독성 측정

상기 제조예 2에서 제조한 이고들빼기 분획물의 세포독성을 측정하기 위하여 흰쥐의 간암세포주(Hepa1c1c7)에 상기 실시예 4와 동일하게 처리한 후에, 상기 제조예 2에서 수득한 분획물을 2배 농도구배로 3.125 내지 200 ㎍/㎖의 7개의 농도로 처리하고 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 CCK-8(Dojindo laboratory, Japan)시약을 첨가하여 1시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양한 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

이고들빼기 분획물에 대한 측정결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 이고들빼기 분획물 중 가장 퀴논 리덕타아제 활성화 효과가 우수한 에틸아세테이트 분획물은 퀴논 리덕타아제 활성화 효과를 유도하는 12.5 내지 50 ㎍/㎖의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.

<실시예 6> 화학식 1 내지 5의 화합물의 세포독성 측정

본 발명에 따른 화학식 1 내지 5의 화합물의 세포독성을 측정하기 위하여 흰쥐의 간암세포주(Hepa1c1c7)에 상기 실시예 4와 동일하게 처리한 후에, 상기 제조예 3에서 분리한 화합물들을 2배 농도구배로 7.81 내지 250.00㎍/㎖ 사이의 7개의 농도로 처리하고 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 CCK-8(Dojindo laboratory, Japan)시약을 첨가하여 1시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양한 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

측정결과를 도 5, 도 6, 도 ,7 도 8 및 도 9에 나타내었다.

화학식 1 내지 5의 화합물 중 퀴논 리덕타아제 활성화 효과가 가장 우수한 영지아사이드 C는 퀴논 리덕타아제 활성화 효과를 유도하는 250.00 μM까지의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 확인되었다(도9 참조).

<실시예 7> 이고들빼기 분획물의 항산화반응인자(ARE)에 대한 효과 측정

본 발명에 따른 이고들빼기 분획물의 2상 해독효소계의 활성을 유도하는 항산화반응인자(antioxidant response element, ARE)에 대한 효과를 측정하기 위하여 인간의 대장암세포주(HCT116)를 대상으로 항산화반응인자의 리포터 진 어세이(reporter gene assay)를 수행하였다. 먼저, 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 a-MEM(최소 필수 배지; minimum essential medium) 용액을 대장암세포배양액과 혼합하여 세포의 수를 1×10⁵ cells/㎖로 조제한 후에 96-웰 플레이트에 100 ㎖씩 처리하여 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화된 후에 항산화반응인자를 포함한 프로모터와 루시퍼레이즈(luciferase) 단백질 발현 유전자가 삽입된 벡터 phARE-luc 를 퓨젠(Fugene6, Roche Biochemicals)을 이용하여 형질전환시켰다. 벡터는 루시퍼라제 단백질 발현 유전자가 삽입되어 있는 pGL3-Basic 벡터(Promega)에 사람의 퀴논리덕타제 유전자의 항산화반응인자를 포함한 프로모터 부위를 삽입하여 제작하였다. 세포가 안정화 된 후에 상기 제조예 1에서 수득한 에틸아세테이트 분획물을 10, 50, 100 μM의 농도로 처리하고 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양한 다음, 루시퍼레이즈 분석 키트(Luciferase assay Kit; Promega)를 사용하여 세포 용해물(cell lysate)을 분석하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 분획물의 처리 농도가 증가할수록 항산화반응인자(ARE)의 활성이 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명의 에틸아세테이트 분획물은 해독효소계의 활성을 증가시킴으로써 간 기능 개선 효과 및 화학적 발암 예방 효과를 가지는 것을 알 수 있다.

<실시예 8> 화학식 1 내지 5의 화합물의 항산화반응인자(ARE)에 대한 효과 측정

본 발명에 따른 화학식 1 내지 5의 화합물의 2상 해독효소계의 활성을 유도하는 항산화반응인자(antioxidant response element, ARE)에 대한 효과를 측정하기 위하여 인간의 대장암세포주(HCT116)를 대상으로 상기 실시예 7과 동일하게 처리한 후에, 제조예 3에서 분리한 화합물들을 50 μM의 농도로 처리하고 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 루시퍼레이즈 분석 키트(Luciferase assay Kit; Promega)를 사용하여 세포 용해물(cell lysate)을 분석하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 화학식 1 내지 5의 화합물들은 50 μM의 농도에서 항산화반응인자(ARE)의 활성이 무처리의 대조군에 비해 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 화학식 1 내지 5의 화합물들은 해독효소계의 활성을 증가시킴으로써 간 기능 개선 효과 및 화학적 발암 예방 효과를 가지는 것을 알 수 있다.

<실시예 9> 이고들빼기 추출물의 CYP2E1 과발현세포에서 에탄올에 의해 유도되는 독성에 대한 영향 측정

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물의 에탄올에 의해 유도되는 독성에 대한 영향을 사람의 간암세포주(HepG2)를 대상으로 측정하였다. 사람의 간암세포주(HepG2)에 CYP2E1유전자를 과발현시킨 세포주를 만들고, 에탄올 250 mM을 처리하여 간 손상을 유도함과 동시에 상기 제조예 1에서 제조한 추출물을 2배 농도구배로 3.125 내지 50.000 ㎍/㎖ 사이의 4개의 농도로 처리하고 48시간 동안 5% 이산화탄소 및 37 ℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 MTT 시약을 첨가하여 1시간 동안 5% 이산화탄소 및 37 ℃의 조건에서 배양한 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에서 알 수 있는 바와 같이, 에탄올 250 mM을 처리한 경우에는 세포 생존율이 약 32% 감소하고, 본 발명의 이고들빼기 추출물을 3.125, 6.25, 12.5 및 25 ㎍/㎖의 농도로 처리한 경우에는 세포 생존율이 약 100% 이상으로 증가함을 확인하였다. 또한 이를 통해 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물이 에탄올에 의한 간세포의 사멸을 효과적으로 억제함을 확인하였다.

<실시예 10> 이고들빼기 추출물 및 분획물의 아세트아미노펜에 의해 유도되는 독성에 대한 영향 측정

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물 및 분획물의 아세트아미노펜에 의해 유도되는 독성에 대한 영향을 사람의 간암세포주(HepG2)를 대상으로 측정하였다. HepG2 세포주를 FBS가 제외된 배지에 이고들빼기 추출물 및 분획물을 2배 농도 구배로 5 내지 40 ㎍/㎖을 24 시간 동안 처리하였다. 이때 양성대조군으로 설포라판 (5 μM), 글루타치온 (1 mM) 도 처리하여 활성 정도를 비교하였다. 배지를 제거 후 PBS로 2회 세척한 다음, FBS가 포함되지 않은 배지에 40 mM의 아세트아미노펜을 첨가하여 추가로 24 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 MTT 시약을 첨가하여 1시간 동안 5% 이산화탄소 및 37 ℃의 조건에서 배양한 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 아세트아미노펜 40 mM을 처리한 경우에는 세포 생존율이 약 60% 감소하고, 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물을 처리하는 경우에는 농도의존적으로 세포 생존율이 약 120%까지 증가함을 확인하였고, 본 발명에 따른 이고들빼기 에틸아세테이트 분획물이 부탄올 분획물보다 높은 세포 생존율을 나타냄을 확인하였다. 또한, 이를 통해 본 발명에 따른 이고들빼기 추출물 및 분획물이 아세트아미노펜에 의한 간세포의 사멸을 효과적으로 억제함을 확인하였다.

이로부터, 본 발명의 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물은 대표적인 제2상 해독효소이며 암 예방지표효소인 퀴논 리덕타아제의 활성을 증가시키는 효과를 나타내고, 항산화반응인자(ARE)를 활성화시키는 동시에, 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 에탄올과 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간손상으로부터 간을 보호하므로, 암 예방용 의약품, 간 기능 개선용 의약품, 건강기능식품에 안전한 물질로 유용하게 이용될 수 있다.

하기에 본 발명의 암의 예방제 또는 간 기능 개선제를 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1: 약학적 제제의 제조

1-1. 산제의 제조

이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2. 정제의 제조

이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3. 캡슐제의 제조

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

1-4. 주사제의 제조

만니톨 180 ㎎

Na₂HPO₄ㆍ2H₂O 26 ㎎

증류수 2974 ㎎

통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

제제예 2: 건강기능 식품의 제조

1-1. 음료의 제조

꿀 522 ㎎

치옥토산아미 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물

0.48-1.28 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

1-2. 츄잉껌의 제조

껌베이스 20%

설탕 76.36-76.76%

0.24-0.64%

후르츠향 1%

물 2%

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

1-3. 캔디의 제조

설탕 50-60%

물엿 39.26-49.66%

0.24-0.64%

오렌지향 0.1%

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

1-4. 밀가루 식품의 제조

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

1-5. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명에 따른 이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

1-6. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입고 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검은콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

상기에서 제조한 곡물류 및 종실류와 본 발명에 따른 이고들빼기의 추출물, 또는 분획물, 또는 화학식 1 내지 5의 화합물을 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.

현미 30%

율무 15%

보리 20%

들깨 7%

검정콩 7%

검은깨 7%

이고들빼기 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 내지 5의 화합물 3%

영지 0.5%

지황 0.5%

Claims

하기 화학식 3, 4 및 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 약학적 조성물:
[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]
하기 화학식 3, 4 및 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 건강기능 식품 조성물:
[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 3, 4 및 5의 화합물은
이고들빼기를 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 가하여 이고들빼기 추출물을 수득하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 수득한 추출물을 n-헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 분획하여 분획물을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 수득한 분획물을 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여 화합물을 분리하고 정제하는 단계(단계 3)를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 단계 1의 유기용매는 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 3, 4 및 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물은 퀴논 리덕타아제의 활성을 증가시켜 발암물질을 해독하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 3, 4 및 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물은 2상 해독효소계 활성을 유도하는 항산화반응인자(ARE)의 활성을 증가시켜 발암물질을 해독하는 것을 특징으로 하는 조성물.